MX2013001673A - Tratamiento de la diabetes con celulas precursoras endocrinas pancreaticas. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para reducir los niveles de glucosa sanguínea en un animal mediante el transplante de una población de células precursoras endocrinas pancreáticas en un animal.

Description

TRATAMIENTO DE LA DIABETES CON CÉLULAS PRECURSORAS ENDOCRINAS PANCREÁTICAS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. de serie 61/373,109, presentada el 12 de agosto del 2010, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para reducir los niveles de glucosa sanguínea en un animal mediante el transplante de una población de células precursoras endocrinas pancreáticas en un animal.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances en la terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus Tipo I y la escasez de islotes de Langerhans para transplantes, han concentrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células ß, adecuadas para la funcionalidad del injerto. Un método es la generación de células funcionales ß a partir de células madres pluripotentes, tales como, por ejemplo, las células madres embrionarias.

En el desarrollo embrional de los vertebrados, una célula pluripotente da origen a un grupo de células que comprenden tres capas de gérmenes (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Los tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, páncreas, intestino e hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación de endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan varios marcadores, tales como, por ejemplo, HNF3 beta, GATA4, MIXL1 , CXCR4 y SOX17.

La formación del páncreas se origina a partir de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen de la homeosecuencia pancreático-duodenal, PDX1. En ausencia de PDX1 , el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de las yemas ventral y dorsal. Por lo tanto, la expresión de PDX1 marca un paso crítico en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos endocrino y exocrino se originan a partir de la diferenciación de endodermo pancreático.

Las células que tienen las características de células de islotes se ha informado que se derivan de células embrionarias de ratón. Por ejemplo, Lumelsky y otros (Science 292: 1389, 2001 ) informan sobre la diferenciación de células madres embrionarias de ratón en células que secretan insulina similares a los islotes pancreáticos. Soria y otros (Diabetes 49:157, 2000) describen que las células secretoras de insulina derivadas de células madres embrionarias de ratón normalizan la glicemia de ratones con diabetes inducida por estreptozotocina.

En un ejemplo, Hori y otros (PNAS 99: 16105, 2002) describen que el tratamiento de células madres embrionarias de ratón con inhibidores de fosfoinositido 3-quinasa (LY294002) produjo células que se asemejaban a las células ß.

En otro ejemplo, Blyszczuk y otros (PNAS 100:998, 2003) informan la generación de células productoras de insulina a partir de células madres embrionarias de ratón que expresan constitutivamente Pax4.

Micallef y otros informan que el ácido retinoico puede regular el compromiso de las células madres embrionarias para formar endodermo pancreático positivo para PDX1. El ácido retinoico es más eficaz para inducir la expresión del PDX1 cuando se agrega a los cultivos al cuarto día de la diferenciación de la célula madre embrionaria durante un período que corresponde al final de la gastrulación en el embrión (Diabetes 54:301 , 2005).

Miyazaki y otros informan una línea de célula madre embrionaria de ratón que sobreexpresan el Pdx1. Sus resultados muestran que la expresión exógena de Pdx1 mejoró, notablemente, la expresión de genes de insulina, somatostatina, glucocinasa, neurogenina3, p48, Pax6 y HNF6 en las células diferenciadas resultantes (Diabetes 53: 1030, 2004).

Skoudy y otros informan que la activina A (un miembro de la superfamilia TGF-ß) regula hacia arriba la expresión de genes pancreáticos exocrinos (p48 y amilasa) y genes endocrinos (Pdx1 , insulina, y glucagon) en células madres embrionarias de ratón. El efecto máximo se observó al usar 1 nM activina A. Además, se observó que el nivel de expresión del ARNm de insulina y Pdx1 no se afectó por el ácido retinoico; sin embargo, el tratamiento con 3 nM FGF7 resultó en un nivel incrementado del transcripto para Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).

Shiraki y otros estudiaron los efectos de los factores de crecimiento que mejoran específicamente la diferenciación de. células madres embrionarias en células positivas para PDX1 . Observaron que el TGF- 2 produjo, reproduciblemente, una proporción mayor de células positivas para PDX1 (Genes Cells. Junio 2005; 10(6): 503-16.).

Gordon y otros demostraron la inducción de células endodérmicas brachyura [positiva]/HNF3 beta [positiva] a partir de células madres embrionarias de ratón, en ausencia de suero y en presencia de activina A, junto con un inhibidor de señalización de Wnt (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0003446A1 ).

Gordon y otros (PNAS, Volumen 103, página 16806, 2006) afirman "Se requirió la señalización simultánea de Wnt y TGF-beta/ nodal/ activina para generar la línea primitiva anterior".

Sin embargo, el modelo de ratón de desarrollo de célula madre embrionaria puede no imitar exactamente el programa de desarrollo en los mamíferos superiores, tales como, por ejemplo, los humanos.

Thomson y otros aislaron células madres embrionarias de blastocitos humanos (Science 282:1 14, 1998). De forma coincidente, Gearhart y otros derivaron líneas de células de germen embrionario humano (hEG) a partir de tejido gonadal fetal (Shamblott y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). A diferencia de las células madres embrionarias de ratón, que se puede evitar que se diferencien simplemente cultivándolas con el Factor de inhibición de leucemia (LIF), las células madre embrionarias humanas deben mantenerse en condiciones muy especiales (Patente de los Estados Unidos núm. 6,200,806; patente núm. WO 99/20741 patente núm. WO 01/51616).

D'Amour y otros describen la producción de cultivos enriquecidos del endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una alta concentración de activina y baja de suero (Nature Biotechnology 2005). Transplantar esas células debajo de la cápsula del hígado de ratones produjo la diferenciación en células más maduras con características de algunos órganos endodérmicos. Las células de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas además pueden diferenciarse en células positivas al PDX1 después de la adición de FGF-10 (US 2005/0266554A1 ).

D'Amour y otros. (Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)) declaran: "Hemos desarrollado un proceso de diferenciación que convierte las células madre embrionarias humanas (hES) en células endocrinas con la capacidad de sintetizar las hormonas pancreáticas insulina, glucagon, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina. Este proceso imita in vivo la organogénesis pancreática al dirigir a las células a través de pasos que son similares al endodermo definitivo, endodermo de tubo de intestino, endodermo pancreático y precursor endocrino en camino a células que expresen hormonas endocrinas".

En otro ejemplo, Fisk y otros informan un sistema para producir células de islotes de pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0040387A1 ). En este caso, la vía de diferenciación se dividió en tres etapas. Las células madre embrionarias humanas se diferenciaron por primera vez del endodermo mediante el uso de una combinación de butirato de sodio y activina A. Después, las células se cultivaron con antagonistas TGF-ß tales como Nogina en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas para PDX1. La diferenciación terminal se indujo mediante nicotinamida.

En un ejemplo, Benvenistry y otros, afirman: "Concluimos que la sobreexpresión de PDX1 mejoró la expresión de genes pancreáticos enriquecidos, la inducción de la expresión de insulina puede requerir señales adicionales que están presentes únicamente in vivo" (Benvenistry y otros, Stem Cells 2006; 24:1923-1930).

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 2008/0241 107A1 reivindica un método para producir una célula que segrega insulina, el método comprende: a) obtener una célula que no produce insulina; y, b) incubar la célula con un medio que contiene glucosa alta, en donde la célula segrega insulina.

Por lo tanto, aún existe una significativa necesidad de desarrollar condiciones para establecer líneas de célula madre pluripotentes que se pueden expandir para responder a las necesidades clínicas actuales, mientras que mantienen el potencial de diferenciarse en células endocrinas pancreáticas, células que expresan la hormona pancreática, o células secretoras de hormona pancreática. Hemos seguido un enfoque alternativo para mejorar la eficiencia en diferenciar células madre embrionarias humanas frente a células endocrinas pancreáticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad la presente invención proporciona un método para reducir los niveles de glucosa sanguínea en un animal mediante el transplante de una población de células precursoras endocrinas pancreáticas en un animal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los niveles de glucosa sanguínea en ratones SCID que se hicieron diabéticos mediante 5 inyecciones de estreptozotocina y después se les transplantó debajo de la cápsula del riñon células ES humanas diferenciadas (etapa 4) en el día 0. El control de la glucosa sanguínea de los varios meses siguientes reveló una disminución gradual de la hiperglicemia a niveles pre-diabéticos. La extirpación posterior del riñon resultó en una recurrencia rápida de la diabetes.

La Figura 2 muestra las mediciones del péptido C humano en muestras de plasma en las semanas indicadas post transplante que muestran el incremento progresivo proporcional a la caída de los niveles de glucosa sanguínea.

La Figura 3 muestra niveles del péptido C comparables que se obtienen en receptores de células transplantadas debajo de la cápsula del riñon o subcutáneamente dentro de dispositivos TheraCyte.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones Las células madres son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenciarse para producir células progenitoras, que incluyen progenitoras que se autorrenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madres también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.

Las células madres se clasifican según su potencial de desarrollo como: (1 ) totipotentes, que significa que pueden producir todos los tipos celulares embrionarios y extraembrionarios; (2) pluripotentes, que significa que pueden producir todos los tipos celulares embrionarios; (3) multipotentes, que significa que pueden producir un subconjunto de linajes celulares pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, células madres hematopoyéticas (HSC) pueden producir una progenie que incluye HSC (autorrenovación), progrenitoras oligopotentes restringidas a la sangre y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquétas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, que significa que pueden producir un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madres multipotentes; y (5) unipotente, que significa ser capaz de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madres espermatogénicas).

La diferenciación es un proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada, adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula inducida a la diferenciación o diferenciada es una que toma una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto donde, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o revertir a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se utiliza en la presente, el linaje de una célula define la herencia de una célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico para el linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida para linaje de interés.

Las "células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo", o "células de la Etapa 1", o "Etapa 1", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX-17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, brachyura, proteína de homeosecuencia tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kít, CD99 u OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo incluyen células precursoras de la línea primitiva, células de la línea primitiva, células mesendodérmicas y células del endodermo definitivo.

"Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1 , HNF-1 beta, PTF1 alfa, HNF6 o HB9. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático incluyen células del endodermo pancreático, células del tubo intestinal primitivo y células posteriores del intestino anterior.

"Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancréatico", como se utiliza en la presente, se refiere a las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: NEUROD, ISL1 , PDX1 , NKX6.1 , MAFB, insulina, glucagon o somatostatina. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático incluyen las células endocrinas pancreáticas, las células que expresan hormonas pancreáticas y las células secretoras de hormonas pancreáticas y las células del linaje de las células ß.

"Endodermo definitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que portan las características de las células derivadas del epiblasto durante la gastrulación, las cuales forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan los siguientes marcadores: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, y MIXL1.

"Marcadores", como se usa en la presente descripción, son moléculas de ácidos nucleicos o de polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del marcador de ácido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por medio del uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

"La célula endocrina pancreática", o "célula que expresa la hormona pancreática", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.

"Células precursora endocrina pancreática", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula multipotencial del linaje del endodermo definitivo que expresa NGN3 y que, además, puede diferenciarse en células del sistema endocrino que incluyen, pero no se limitan a, células que expresan la hormona de islotes pancreáticos. Las células precursoras endocrinas no pueden diferenciarse en tantos tipos distintos de células, tejido y/o órganos en comparación con las células del linaje del endodermo definitivo menos diferenciadas específicamente, tales como células del endodermo pancreático positivas PDX1 .

"Célula productora de hormonas pancreáticas", como se usa en la presente descripción se refiere a una célula con la capacidad de producir al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.

"Célula secretora de hormona pancreática" como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de secretar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático.

Aislamiento, expansión y cultivo de células madres pluripotentes Caracterización de las células madres pluripotentes Las células madres pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos embrionarios específicos de etapa (SSEA) 3 y 4, y los marcadores detectables usando los anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson y otros, Science 282:1 145, 1998). La diferenciación de células madres pluripotentes in vitro resulta en la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra- 1-60, y Tra-1-81 (si está presente) y la expresión incrementada de SSEA-1 . Las células madres pluripotentes no diferenciadas tienen, típicamente, actividad de fosfatasa alcalina, la cual se puede detectar al fijar las células con paraformaldehído al 4 % y, después, desarrollarlas con Vector Red como sustrato, tal como lo describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Las células madres pluripotentes no diferenciadas también expresan típicamente Oct-4 y TERT, según se detectó por RT-PCR.

Otro fenotipo deseable de células madres pluripotentes propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madres pluripotentes puede confirmarse, por ejemplo, inyectando células en ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID, por sus siglas en inglés), fijando los teratomas que se forman usando paraformaldehído al 4 % y luego examinándolas histológicamente para ver si hay evidencias de tipos de células de las tres capas de gérmenes. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar por la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos embrioides para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

Las líneas de célula madre pluripotentes propagadas se pueden cariotipar por medio del uso de una técnica estándar de bandas G y por la comparación con los cariotipos publicados de las especies dé primates correspondientes. Es deseable la obtención de células que tengan un "cariotipo normal", lo cual significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no notablemente alterados.

Fuentes de las células madres pluripotentes Los tipos de células madres pluripotentes que se pueden usar incluyen las líneas establecidas de células pluripotentes derivadas del tejido formado después de la gestación, que incluye tejido pre-embrionario (tal como, por ejemplo, un blastocito), tejido embrionario, o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente pero no necesariamente antes de aproximadamente 10-12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son las líneas de células madre embrionarias humanas establecidas o células de germen embrionario humano, tales como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1 , H7 y H9 (WiCell). También se contempla el uso de las composiciones de esta descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización de estas células, en cuyo caso la fuente primaria de las células serían las células pluripotentes primarias tomadas directamente a partir de los tejidos fuente. También adecuadas son las células tomadas de una población de células madres pluripotentes ya cultivada, en ausencia de células alimentadoras. También son adecuadas las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, GA).

En una modalidad las células madre embrionarias humanas se preparan como lo describen Thomson y otros (patente de Estados Unidos núm. 5,843,780; Science 282: 1 145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).

Cultivo de células madres pluripotentes En una modalidad, las células madres pluripotentes son típicamente cultivadas en una capa de células alimentadoras que soportan a las células madres pluripotentes de diferentes maneras. Alternativamente, las células madres pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras pero, sin embargo, soporta la proliferación de las células madres pluripotentes sin sufrir una diferenciación sustancial. El crecimiento de las células madres pluripotentes en un cultivo libre de alimentador, sin diferenciación, es soportado usando un medio acondicionado mediante el cultivo previo de otro tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de las células madres pluripotentes en un cultivo libre de alimentador, sin diferenciación, es soportado usando un medio definido químicamente.

Por ejemplo, Reubinoff y otros (Nature Biotechnology 18: 399 -404 (2000)) y Thompson y otros (Science 6 de noviembre de 1998: Vol. 282. núm. 5391 , pág. 1 145 - 1 147) describe el cultivo de líneas de célula madre pluripotentes a partir de blastocitos humanos mediante el uso de una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón.

Richards y otros, (Stem Cells 21 : 546-556, 2003) examinaron un grupo de once capas distintas de células alimentadoras humanas adultas, fetales y neonatales por su capacidad de sustentar el cultivo de célula madre pluripotentes humanas. Richards y otros, dicen: "las líneas de célula madre embrionaria humana cultivadas sobre alimentadores de fibroblastos de piel adulta retienen la morfología de la célula madre embrionaria humana y permanecen pluripontes".

La patente de los Estados Unidos núm. 200200721 17 describe líneas de células que producen medios que soportan el crecimiento de las células madres pluripotentes de primate en un cultivo libre de alimentador.

Las líneas celulares empleadas son líneas de células mesenquimales y tipo fibroblasto, obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas a partir de células madres embrionarias. La patente de los Estados Unidos núm. 200200721 17 también describe el uso de líneas de células como una capa alimentadora de células primaria.

En otro ejemplo, Wang y otros (Stem Cells 23: 1221 -1227, 2005) describen los métodos para el crecimiento a largo plazo de células madres pluripotentes humanas sobre capas de células alimentadoras derivadas de células madre embrionarias humanas.

En otro ejemplo Stojkovic y otros (Stem Cells 2005 23: 306-3 4, 2005) describen un sistema de células alimentadoras derivadas de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas.

En un ejemplo más, Miyamoto y otros (Stem Cells 22: 433-440, 2004) describen una fuente de células alimentadoras que se obtienen a partir de la placenta humana.

Amit y otros (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) describen una capa de células alimentadoras derivadas de prepucio humano.

En otro ejemplo, Inzunza y otros (Stem Cells 23: 544-549, 2005) describen una capa de células alimentadoras a partir de fibroblastos de prepucio postnatal.

La patente de los Estados Unidos núm. 6642048 describe los medios que soportan el crecimiento de las células madres pluripotentes de primate (pPS) en un cultivo libre de alimentador y las líneas de células útiles para la producción de tales medios. La patente de los Estados Unidos núm. 6642048 establece: "Esta invención incluye líneas de células mesenquimales y tipo fibroblasto obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas a partir de células madres embrionarias. Los métodos para derivar tales líneas de células, procesar los medios y hacer crecer las células madres usando los medios acondicionados se describen e ilustran en esta descripción".

En otro ejemplo, la patente núm. WO2005014799 describe el medio acondicionado para el mantenimiento, proliferación y diferenciación de células de mamíferos. La patente núm. WO2005014799 establece: "El medio de cultivo producido de acuerdo con la presente invención está condicionado por la actividad secretora celular de las células murinas; en particular, aquellos hepatocitos transgénicos diferenciados e inmortalizados, nombrados MMH (Hepatocito Murino Met)." En otro ejemplo, Xu y otros (Stem Cells 22: 972-980, 2004) describen un medio acondicionado obtenido a partir de derivados de células madre embrionarias humanas que han sido modificadas genéticamente para sobreexpresar la transcriptasa inversa de la telomerasa humana.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 2007001001 1 describe un medio de cultivo definido químicamente para el mantenimiento de células madres pluripotentes.

Un sistema de cultivo alternativo emplea un medio libre de suero complementado con factores de crecimiento, capaz de promover la proliferación de células madres embrionarias. Por ejemplo, Cheon y otros (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 de octubre de 2005) describen sistema de cultivo libre de alimentador y libre de suero, en el cual se mantienen las células madres embrionarias en un medio de reemplazo de suero (SR) sin acondicionar, complementado con diferentes factores de crecimiento, capaz de iniciar la autorrenovación de la célula madre embrionaria.

En otro ejemplo, Levenstein y otros (Stem Cells 24: 568-574, 2006) describen métodos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos o de un medio condicionado, con el uso de medios suplementados con bFGF.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050148070 describe un método de cultivo de células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin células alimentadoras fibroblásticas; el método comprende: cultivar las células madres en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, por lo menos una transferina o sustituto de transferina, por lo menos una insulina o sustituto de insulina; el medio de cultivo está esencialmente libre de suero fetal de mamífero y contiene por lo menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento del fibroblasto capaz de activar un receptor del señalizador del factor de crecimiento del fibroblasto, en donde el factor de crecimiento se suministra de otra fuente que la capa alimentadora del fibroblasto, el medio soportó la proliferación de células madres en estado indiferenciado sin células alimentadoras o medio acondicionado.

En otro ejemplo, el documento de los Estados Unidos 20050233446 describe un medio definido útil para cultivar células madres, incluso células madres primordiales de primate indiferenciadas. En solución, el medio es sustancialmente isotónico en comparación con las células madres que se cultivan. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina y ácido ascórbico necesario para soportar el crecimiento indiferenciado de células madres primordiales.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6800480 establece: "En una modalidad, se proporciona un medio de cultivo de células para cultivar células madres primordiales derivadas de primates en un estado sustancialmente indiferenciado que incluye una baja presión osmótica, un medio básico bajo en endotoxinas efectivo para sustentar el crecimiento de células madres primordiales derivadas de primates. El medio básico se combina con un suero nutriente eficaz para soportar el crecimiento de las células madres primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo consistente de células alimentadoras y un componente de la matriz extracelular derivado de las células alimentadoras. El medio además incluye aminoácidos no esenciales, un antioxidante y un primer factor de crecimiento, seleccionado del grupo formado por nucleósidos y una sal de piruvato".

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050244962 establece: "En un aspecto, la invención proporciona un método para cultivar células madres embrionarias de primate. Se cultivan las células madres en un cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero (preferentemente también esencialmente libre de cualquier suero animal) y en presencia del factor de crecimiento de fibroblastos que se suministra desde una fuente diferente de simplemente una capa alimentadora de fibroblastos. En una forma preferida, la capa alimentadora de fibroblastos, previamente requerida para mantener un cultivo de células madres, es innecesaria por la adición de suficiente factor de crecimiento fibroblástico." En un ejemplo adicional, la patente núm. WO2005065354 describe un medio de cultivo isotónico definido, que está esencialmente libre del alimentador y libre de suero, que comprende: a. un medio basal; b. una cantidad de bFGF suficiente para apoyar el crecimiento de las células madres de mamíferos sustancialmente indiferenciadas; c. una cantidad de factor de crecimiento fibroblástico básico, suficiente para soportar el crecimiento de células madres de mamíferos sustancialmente indiferenciadas; y d. una cantidad de ácido ascórbico suficiente para soportar el crecimiento de las células madres de mamíferos sustancialmente indiferenciadas.

En otro ejemplo, la patente núm. WO2005086845 describe un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada, dicho método comprende exponer una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor transformador del crecimiento beta (TGF-ß), un miembro de la familia de proteínas de crecimiento de fibroblastos (FGF), o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante un tiempo suficiente para lograr el resultado deseado.

Las células madres pluripotentes pueden colocarse en placas sobre un sustrato de cultivo adecuado. En una modalidad, el sustrato de cultivo adecuado es un componente de matriz extracelular, tal como, por ejemplo, aquellos derivados de la membrana de base o que pueden formar parte de la adhesión molecular de los acoplamientos receptor-ligando. En una modalidad el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® es una preparación soluble de células tumorales Engelbreth-Holm Swarm que se hace gel a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.

Otros componente de la matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como alternativa. Dependiendo del tipo de célula que se está proliferando, éste puede incluir laminina, fibronectina, proteoglican, entactina, sulfato de heparán y similares, solos o en diferentes combinaciones.

Las células madres pluripotentes pueden colocarse en placas sobre el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que promueve la supervivencia, propagación y retención de las células con las características deseables. Todas estas características se benefician de la atención prestada en la distribución de sembrado y se puede determinar rápidamente mediante alguien con conocimiento en la materia.

Un medio de cultivo adecuado se puede hacer a partir de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Gibco núm. 1 1965-092; Medio Eagle modificado de Dulbecco para bloqueo (KO DMEM), Gibco núm. 10829-018; medio F12 de Ham/medio basal DMEM al 50 %; 200 mM L-glutamine, Gibco núm. 15039-027; solución de aminoácidos no esenciales, Gibco 1 1 140-050; ß-mercaptoetanol, Sigma núm. M7522; Factor de crecimiento básico humano recombinante de fibroblasto (bFGF), Gibco núm. 13256-029.

Formación de células precursoras endocrinas pancreáticas En una modalidad la presente invención proporciona un método para producir células precursoras endocrinas pancreáticas; el método comprende las siguientes etapas: a. Cultivar células madres pluripotentes, b. Diferenciar las células madres pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo; c. Diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático; y d. Diferenciar los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en células precursoras endocrinas pancreáticas.

Las células madres pluripotentes adecuadas para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, la línea de célula madre embrionaria humana H9 (código NIH: WA09), la línea de célula madre embrionaria humana H1 (código NIH: WA01 ), la línea de célula madre embrionaria humana H7 (código NIH: WA07), y la línea de célula madre embrionaria humana SA002 (Cellartis, Suecia). También son adecuadas para el uso en la presente invención las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores característicos de las células pluripotentes: ABCG2, CRIPTO, CD9, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81 .

Los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste en SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, brachyura, proteína de homeosecuencia tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea primitiva. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula del endodermo definitivo.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste en PDX1 , HNF1 beta, HNF6, HB9 y PROX1 . Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa por lo menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático.

Los marcadores característicos de las células precursoras endocrinas pancreáticas se seleccionan del grupo que consiste en NGN3, NKX6.1 , NeuroD, ISL1 , PDX1 , PAX4, NKX2.2 o ARX. Para usar en la presente invención es adecuada una célula que exprese por lo menos uno de los marcadores característicos de las células precursoras endocrinas pancreáticas. Formación de células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo Las células madres pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante cualquier método en la materia o mediante cualquier método propuesto en esta invención.

Por ejemplo, las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).

Por ejemplo, las células madres pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en Shinozaki y otros, Development 131 , 1651 - 1662 (2004).

Por ejemplo, las células madres pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en McLean y otros, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007).

Por ejemplo, las células madres pluripotentes pueden estar diferenciadas en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células madres pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo cultivando las células madres pluripotentes en un medio que contiene activina A en ausencia de suero, luego cultivando la células con activina A y suero, y luego cultivando las células con activina A y suero de una concentración diferente. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).

Por ejemplo, las células madres pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo cultivando las células madres pluripotentes en un medio que contiene activina A en ausencia de suero, luego cultivando las células con activina A y suero de diferente concentración. Un ejemplo de este método se describe D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 2005.

Por ejemplo, las células madres pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo cultivando las células madres pluripotentes en un medio que contiene activina A y un ligando Wnt en ausencia de suero, luego eliminando el ligando Wnt y cultivando la células con activina A y suero. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madres pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 11/736,908 otorgada a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madres pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 11/779,311 , otorgada a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madres pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 60/990,529.

Por ejemplo, las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madres pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 61/076,889.

Por ejemplo, las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madres pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 61/076,900.

Por ejemplo, las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madres pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 61/076,908.

Por ejemplo, las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madres pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 61/076,915.

Caracterización de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo La formación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se puede determinar por medio de pruebas en presencia de los marcadores antes y después de seguir un protocolo específico. Las células madres pluripotentes generalmente no expresan tales marcadores. Por lo tanto, la diferenciación de las células pluripotentes se detecta cuando las células comienzan a expresarlos.

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expreso mediante células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen la reacción cuantitativa de la cadena de polimerasa en transcripción inversa (RT-PCR, según su sigla en inglés), membrana de Northern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. 2001 supplement)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Transferencia (de tipo) Western y para marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Las características de las células madres pluripotentes son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y se continúan identificando las características adicionales de las células madres pluripotentes. Los marcadores de la célula madre pluripotente incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connex/n45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.

Después de tratar las células madres pluripotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas se pueden purificar mediante la exposición de una población de células tratadas en un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico, tal como CXCR4, expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático a partir de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo Las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático mediante cualquier método en la materia o cualquier método propuesto en esta invención.

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático tratando las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y el inhibidor KAAD-ciclopamina de la vía de señalización hedgehog, luego eliminando el medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblasto y la KAAD-ciclopamina y, posteriormente, cultivando las células en un medio que contiene ácido retinoico, un factor de crecimiento de fibroblasto y la KAAD-ciclopamina. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante un período de tiempo, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 1/736,908 otorgada a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante un período de tiempo, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 11/779,31 1 , otorgada a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo, de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 60/990,529.

Caracterización de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático son conocidos por aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores característicos adicionales del linaje del endodermo pancreático todavía no se han identificado. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje del endodermo pancreático. Los marcadores específicos del linaje del endodermo pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción, tales como, por ejemplo, HLXB9, PTF1 alfa, PDX1 , HNF6, HNF-1 beta.

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Northern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. 2001 supplement)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Transferencia (de tipo) Western y para marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Formación de células precursoras endocrinas pancreáticas a partir de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian en células precursoras endocrinas pancreáticas mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio suplementado con un factor con la capacidad de inhibir BMP y un receptor TGF-ß I inhibidor de quinasa.

En una modalidad, el factor con la capacidad de inhibir BMP es nogina. La nogina se puede usar a una concentración de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 500 µg/ml. En una modalidad la nogina se usa a una concentración de 100 ng/ml.

En una modalidad el receptor TGF-ß I inhibidor de quinasa es el inhibidor de ALK5 II (Calbiochem, Ca). El inhibidor II de ALK5 puede usarse a una concentración de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 10 µ?. En una modalidad, el inhibidor II de ALK5 se usa a una concentración de 1 µ?.

En una modalidad el medio es DMEM que contiene glucosa a 4500 mg/l y B27 al 1 %.

En una modalidad las células se cultivan en el medio de cultivo durante aproximadamente cuatro días.

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente a un marcador proteico expresado por células precursoras endocrinas pancreáticas.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen la reacción cuantitativa de la cadena de polimerasa en transcripción inversa (RT-PCR, según su sigla en inglés), membrana de Northern, hibridación ¡n situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. 2001 supplement)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Transferencia (de tipo) Western y para marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Las características de las células madres plunpotentes son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y se continúan identificando las características adicionales de las células madres plunpotentes. Los marcadores de la célula madre plunpotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1 -60, Tra 1-81 .

Después de tratar las células madres plunpotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas se pueden purificar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico, tal como CXCR4, expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste en PDX1 , HNF-1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HB9 y PROX1. Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa por lo menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático.

Los marcadores característicos de las células precursoras endocrinas pancreáticas se seleccionan del grupo que consiste en NGN3, NKX6.1 , NEUROD, ISL1 , PDX1 , PAX4, NKX2.2, PAX6 o ARX.

Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático a partir de células precursoras endocrinas pancreáticas En una modalidad las células precursoras endocrinas pancreáticas producidas por los métodos de la presente invención se pueden diferenciar, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.

Las células precursoras endocrinas pancreáticas se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por cualquier método en la materia o por cualquier método propuesto en esta invención.

Por ejemplo, las células precursoras endocrinas pancreáticas obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células precursoras endocrinas pancreáticas en un medio que contiene exendina 4, después, se elimina el medio que contiene exendina 4 y, posteriormente, se cultiva las células en un medio que contiene exendina 1 , IGF1 y HGF. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y col., Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células precursoras endocrinas pancreáticas obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células precursoras endocrinas pancreáticas en un medio que contiene DAPT (Sigma-Aldrich, MO) y exendina 4. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y col., Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células precursoras endocrinas pancreáticas obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células precursoras endocnnas pancreáticas en un medio que contiene exendina 4. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y col., Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células precursoras endocrinas pancreáticas obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del tratamiento de las células precursoras endocrinas pancreáticas con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 11/736,908 otorgada a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células precursoras endocrinas pancreáticas obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del tratamiento de las células precursoras endocrinas pancreáticas con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 11/779,311 , otorgada a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células precursoras endocrinas pancreáticas obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del tratamiento de las células precursoras endocrinas pancreáticas con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 60/953,178 otorgada a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células precursoras endocrinas pancreáticas obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del tratamiento de las células precursoras endocrinas pancreáticas con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 60/990,529, asignada a LifeScan, Inc.

Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste en NEUROD, ISL1 , PDX1 , NKX6.1 , PAX4, PAX6, NGN3 y NKX2.2. En una modalidad una célula endocrina pancreática tiene la capacidad de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático. Para el uso de la invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores características del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula pancreática que expresa hormonas. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula pancreática secretora de hormonas.

En un aspecto de la presente invención la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß expresa PDX1 y por lo menos uno de los factores de transcripción siguientes: NGN-3, NKX2.2, NKX6.1 , NEUROD, ISL1 , HNF3 beta, MAFA, PAX4 y PAX6. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß es una célula ß.

Terapias En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece, o corre el riesgo de desarrollar, diabetes Tipo 1. En una modalidad el método implica el cultivo de células madres pluripotentes, la diferenciación in vitro de células madres pluripotentes en un linaje de células ß y la implementación en un paciente de células de un linaje de células ß. En una modalidad alterna el método implica el cultivo de células madres pluripotentes, la diferenciación in vitro de células madres pluripotentes en células precursoras endocrinas pancreáticas y la implementación en un paciente de células precursoras endocrinas pancreáticas.

Aún en otro aspecto, esta invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece, o corre el riesgo de desarrollar, diabetes del Tipo 2. En una modalidad el método implica el cultivo de células madres pluripotentes, la diferenciación in vitro de células madres pluripotentes en un linaje de células ß y la implementación en un paciente de células de un linaje de células ß. En una modalidad alterna el método implica el cultivo de células madres pluripotentes, la diferenciación in vitro de células madres pluripotentes en células precursoras endocrinas pancreáticas y la implementación en un paciente de células precursoras endocrinas pancreáticas.

Si fuese apropiado, el paciente puede, además, ser tratado con agentes farmacéuticos o bioactivos que facilitan la supervivencia y función de las células transplantadas. Estos agentes pueden incluir, por ejemplo, insulina, miembros de la familia de TGF-ß, que incluyen TGF-ß? , 2 y 3, proteínas morfogénicas del hueso (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -1 1 , -12 y -13), factores de crecimiento de los fibroblastos -1 y -2, factor de crecimiento derivado de plaquetas -AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento insulínico (IGF-I, II), factor de diferenciación y crecimiento (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), factor de crecimiento derivado de las células endotelial vascular (VEGF), pleiotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, péptido -I y -II del tipo glucagon (GLP-1), mimetibody GLP-1 y 2, Exendin-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, inhibidores MAPK, tales como, por ejemplo, compuestos descritos en la solicitud publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0209901 y solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0132729.

Las células madres pluripotentes se pueden diferenciar en células productoras de insulina antes del transplante en un receptor. En una modalidad específica, las células madres pluripotentes son plenamente diferenciadas en células ß antes de ser trasplantadas al receptor. Alternativamente, las células madres pluripotentes se pueden transplantar en un receptor en un estado no diferenciado o parcialmente diferenciado. Otra diferenciación puede ocurrir en el receptor.

Las células endodérmicas definitivas o bien las células endodérmicas pancreáticas o bien las células ß pueden implantarse como células dispersas o formarse en grupos que puedan infundirse en la vena porta hepática. Alternativamente, las células se pueden proporcionar en soportes poliméricos degradables biocompatibles, dispositivos no degradables porosos o encapsulados para protegerlas de la respuesta inmune del huésped. Las células se pueden implantar en un lugar apropiado en un receptor. Los lugares de implante incluyen, por ejemplo, el hígado, páncreas natural, espacio subcapsular renal, omento, peritoneo, espacio subseroso, intestino, estómago o un bolsillo subcutáneo.

Para aumentar otra diferenciación, la supervivencia o actividad de las células implantadas, se pueden administrar factores adicionales tales como factores de crecimiento, agentes antioxidantes o antiinflamatorios antes de, simultáneamente con, o después de la administración de las células. En ciertas modalidades, los factores de crecimiento son utilizados para diferenciar las células administradas in vivo. Estos factores pueden secretarse por células endógenas y exponerse a las células administradas in situ. Las células implantadas se pueden inducir para diferenciarlas mediante cualquier combinación de factores de crecimiento conocidos en la materia administrados exógena y endógenamente.

La cantidad de células usadas en el implante depende de un número de factores diversos, incluso la condición y respuesta del paciente a la terapia, y puede determinarla una persona con experiencia en la materia.

En un aspecto, esta invención proporciona un método para tratar a un paciente que padece, o corre el riesgo de desarrollar diabetes. Este método implica el cultivo de células madres pluripotentes, la diferenciación de células cultivadas in vitro en un linaje celular ß y la incorporación de células en un soporte tridimensional. Las células se pueden mantener in vitro en este soporte antes de su implante en el paciente. Alternativamente, el soporte que contiene las células se puede implantar directamente en el paciente sin cultivo adicional in vitro. El soporte se puede incorporar opcionalmente con por lo menos un agente farmacéutico que facilita la supervivencia y la función de las células transplantadas.

Los materiales de soporte adecuados para uso a los fines de la presente invención incluyen patrones de tejidos, conductos, barreras, y depósitos útiles para la reparación del tejido. En particular, los materiales naturales y sintéticos en forma de espumas, esponjas, geles, hidrogeles, tejidos, y estructuras no tejidas, los cuales han sido usados in vitro e in vivo para reconstruir o regenerar tejido biológico, así como para proporcionar agentes quimiotácticos para inducir el crecimiento del tejido, son adecuados para su uso en la práctica de los métodos de la presente invención. Ver, por ejemplo, los materiales descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,770,417, patente de los Estados Unidos núm. 6,022,743, patente de los Estados Unidos núm. 5,567,612, patente de los Estados Unidos núm. 5,759,830, patente de los Estados Unidos núm. 6,626,950, patente de los Estados Unidos núm. 6,534,084, patente de los Estados Unidos núm. 6,306,424, patente de los Estados Unidos núm. 6,365,149, patente de los Estados Unidos núm. 6,599,323, patente de los Estados Unidos núm. 6,656,488, solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0062753 A1 , patente de los Estados Unidos núm. 4,557,264 y patente de los Estados Unidos núm. 6,333,029.

Para formar un soporte incorporado con un agente farmacéutico, este agente se puede mezclar con la solución polimérica antes de formar el soporte. Alternativamente, un agente farmacéutico se podría recubrir sobre un soporte prefabricado, preferentemente, en presencia de un portador El agente farmacéutico puede estar presente como un líquido, un sólido dividido con precisión, o de cualquier otra forma física apropiada. Alternativamente, los excipientes se pueden agregar al soporte para cambiar la tasa de liberación del agente farmaceútico. En una modalidad alternativa, el soporte se incorpora con por lo menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto antiinflamatorio, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,509,369.

El soporte se puede incorporar con por lo menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto antiapoptótico, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,793,945.

Además, el soporte se puede incorporar con por lo menos un compuesto farmacéutico que es un inhibidor de fibrosis, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,331 ,298.

Además el soporte se puede incorporar con por lo menos un compuesto farmacéutico que es capaz de aumentar la angiogénesis, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0220393 y solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0209901.

Además el soporte se puede incorporar con por lo menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto inmunosupresor, tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0171623.

El soporte puede también incorporarse a al menos un compuesto farmacéutico que sea un factor de crecimiento como, por ejemplo, los miembros de la familia TGF-ß, que incluyen TGF-ß? , 2 y 3, proteínas morfogénicas del hueso (B P-2, -3,-4, -5, -6, -7, -1 1 , -12 y -13), factores de crecimiento de los fibroblastos -1 y -2, factor de crecimiento derivado de plaquetas -AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento insulínico (IGF-I, II) factor de diferenciación y crecimiento (GDF-5, -6, -8, -10, -15), factor de crecimiento derivado de las células endotelial vascular (VEGF), pleiotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, factor 1-alfa inducible por hipoxia, péptido -I del tipo glucagon (GLP-1), mimetibody GLP-1 and GLP-2, y II, Exendin-4, nodal, nogina, NGF, ácido retinoico, hormona paratiroidea, tenascina C, tropoelastina, péptidos derivados de la trombina, catelicidinas, defensinas, laminina, péptidos biológicos que contienen dominios de unión a célula y a heparina de proteínas adhesivas extracelulares tales como fibronectina y vitronectina, inhibidores MAPK, tales como, por ejemplo, compuestos descritos en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0209901 y solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0132729.

La incorporación de las células de la presente invención en un supercóntigo se puede lograr mediante el depósito simple de las células en el supercóntigo. Las células pueden entrar al supercóntigo mediante simple difusión (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)). Se han desarrollado otros enfoques para aumentar la eficiencia de la propagación de la célula. Por ejemplo, los frascos de agitación se han usado en la propagación de condrocitos en supercóntigos de ácidos poliglicólicos (Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)). Otro enfoque para la propagación de las células es el uso de la centrifugación, la cual produce un esfuerzo mínimo en las células sembradas y aumenta la eficiencia de la propagación. Por ejemplo, Yang y otros desarrolló un método de sembrado de células (J.Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001)) denominado inmovilización celular centrífuga (CCI).

La presente invención se ilustra, pero no se limitada por los siguientes ejemplos.

Referencias Karvonen, M. y otros Incidence of childhood type 1 diabetes worldwide. Diabetes Mondiale (DiaMond) Project Group. Diabetes Care 23, 1516-26 (2000).

Mathis, D., Vence, L. y Benoist, C. Beta-cell death during progression to diabetes. Nature 414, 792-8 (2001 ).

Ryan, E.A. y otros. Clinical outcomes and insulin secretion after islet transplantation with the Edmonton protocol. Diabetes 50, 710-9 (2001).

Shapiro, A.M. y otros Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive régimen. N Engl J Med 343, 230-8 (2000).

Cure, P. y otros Improved Metabolic Control and Quality of Life in Seven Patients With Type 1 Diabetes Following Islet After Kidney Transplantation. Transplantation 85, 801-812 (2008).

Fung, M.A. y otros The effect of medical therapy and islet cell transplantation on diabetic nephropathy: an interim report. Transplantation 84, 17-22 (2007).

Brown, L. y Edelman, E.R. Optimal control of blood glucose: the diabetic patient or the machine? Sci Transí Med 2, 27ps18 (2010).

Guo, T. y Hebrok, M. Stem cells to pancreatic beta-cells: new sources for diabetes cell therapy. Endocr Rev 30, 214-27 (2009).

Ricordi, C. y Edlund, H. Toward a renewable source of pancreatic beta-cells. Nat Biotechnol 26, 397-8 (2008).

Rajagopal, J., Anderson, W.J., Kume, S., Martínez, O.l. y Melton, D.A. Insulin staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science 299, 363 (2003).

Kroon, E. y otros. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol 26, 443-52 (2008).

D'Amour, K.A. y otros. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 24, 1392-401 (2006).

D'Amour, K.A. y otros. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol 23, 1534-41 (2005).

Matveyenko AV, Georgia S, Bhushan A, Butler PC. Inconsistent formation and non function of insulin positive cells from pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells in athymic nude rats. Am J Physiol Endocrínol Metab. 29 de junio de 2010. [publicación electrónica antes de la impresión].

Lee SH, Hao E, Savinov AY, Geron I, Strongin AY, Itkin-Ansari P. Human beta-cell precursors mature into functional insulin-producing cells in an immunoisolation device: implications for diabetes cell therapies. Transplantation. 15 de abril de 2009;87(7):983-91.

Yang Z, Chen M, Fialkow LB, Ellett JD, Wu R, Nadler JL.

Survival of pancreatic islet xenografts in NOD mice with the theracyte device. Transplant Proc. diciembre de 2002;34(8):3349-50.

Panepinto L and Phillips RW. The Yucatán miniature pig: characterization and utilization in biomedical research. Lab Anim Sci 36: 344-347, 1986.

Larsen MO and Rolin B. Use of the Gottingen minipig as a model of diabetes, with special focus on type 1 diabetes research. llar J 45: 303-313, 2004.

Miller ER and Ullrey DE. The pig as a model for human nutrition. Annu Rev Nutr í: 361 -382, 1987 Vodicka P, Smetana K, Jr., Dvorankova B, Emerick T, Xu YZ, Ourednik J, Ourednik V, and Motlik J. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann N YAcad Sci 1049: 161 -171 , 2005.

Kurihara-Bergstrom T, Woodworth M, Feisullin S, and Beall P. Characterization of the Yucatán miniature pig skin and small intestine for pharmaceutical applications. Lab Anim Sci 36: 396-399, 1986.

Swindle MM, Smith AC, Laber-Laird K, and Dungan L. Swine in Biomedical Research: Management and Models. llar J 36: 1-5, 1994.

Bellinger DA, Merricks EP, and Nichols TC. Swine models of type 2 diabetes mellitus: insulin resistance, glucose tolerance, and cardiovascular complications. llar J AI: 243-258, 2006.

Hainsworth DP, Katz ML, Sanders DA, Sanders DN, Wright EJ, and Sturek M. Retinal capillary basement membrane thickening in a porcine model of diabetes mellitus. Comp Med 52: 523-529, 2002.

Marshall M, Oberhofer H, and Staubesand J. Early micro- and macro-angiopathy in the streptozotocin diabetic minipig. Res Exp Med (Berl) 177: 145-158, 1980.

Phillips RW, Panepinto LM, Will DH, and Case GL. The effects of alloxan diabetes on Yucatán miniature swine and their progeny. Metabolism 29: 40-45, 1980.

Eventov-Friedman S, Tchorsh D, Katchman H, Shezen E, Aronovich A, Hecht G, Dekel B, Rechavi G, Blazar BR, Feine I, Tal O, Freud E, Reisner Y. Embryonic pig pancreatic tissue transplantation for the treatment of diabetes. PLoS Med. julio de 2006;3(7):e215.

Castaing M, Péault B, Basmaciogullari A, Casal I, Czernichow P, Scharfmann R. Blood glucose normalization upon transplantation of human embryonic páncreas into beta-cell-deficient SCID mice. Diabetologia. noviembre de 2001 ;44(1 1 ):2066-76.

Larsen MO, Rolin B, Raun K, Bjerre Knudsen L, Gotfredsen CF, Bock T. Evaluation of beta-cell mass and function in the Góttingen minipig. Diabetes Obes Metab Suppl 2:170-9, 2007. van der Windt DJ, Echeverri GJ, Ijzermans JN, Cooper DK. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplant. 2008;17(9):1005-14.

Ejemplo Las células de la línea H1 de célula madre embrionaria humana se cultivaron en placas recubiertas de MATRIGEL (dilución 1 :30) y se diferenciaron en células precursoras endocrinas pancreáticas con el uso del siguiente protocolo: a. Medio RPMI (catálogo núm. 22400, Invitrogen, Ca) suplementado con BSA al 2 % (catálogo núm. 152401 , MP Biomedical, Ohio) y activina A a 100 ng/ml (R&D Systems MN) más WNT-3a a 20 ng/ml (catálogo núm. 1324-WN-002 R&D Systems, MN) más 8 ng/ml de bFGF (catálogo núm. 100-18B, PeproTech, NJ) durante un día, seguido de tratamiento con medio RPMI suplementado con BSA al 2 % y activina A a 100 ng/ml más 8 ng/ml de bFGF durante dos días adicionales (etapa 1), después, b. DMEM/F12 (catálogo núm. 11330, Invitrogen, Ca)+ BSA al FGF7 a 50 ng/ml durante tres días (etapa 2), después, c. Se usaron distintos medios básales indicados en la Tabla 1 suplementados con B27 al 1 % (#17504-044, Invitrogen, CA) + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 µ? de Ciclopamina- KAAD (#239804, Calbiochem, CA) + 2 µ? de ácido retinoico (RA) (Sigma, MO) + 100 ng/ml de nogina (R & D Systems, MN) durante cuatro días (etapa 3), después, d. Se usó distintos medios básales indicados en la Tabla 1 , suplementados con B27 al 1 % (Invitrogen, CA) + nogina a 100 ng/ml + 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (catálogo núm. 616452, Calbiochem, Ca) durante tres días (etapa 4).

Las publicaciones citadas en este documento se incorporan como referencias en su totalidad. Aunque los diferentes aspectos de la invención se ilustraron anteriormente con referencia a los ejemplos y las realizaciones preferidas, se apreciará que el alcance de la invención no se define por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones redactadas bajo los principios de la ley de patentes.

Claims (1)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES:

1. El uso de una población de células precursoras endocrinas pancreáticas encapsuladas para la fabricación de un producto farmacéutico para reducir los niveles de glucosa sanguínea en un animal, en donde el producto farmacéutico se adapta para ser implantable en el animal.