MX2012014025A - Conjugados para ala prevencion o el trataiento de la adiccion a la nicotina. - Google Patents

Conjugados para ala prevencion o el trataiento de la adiccion a la nicotina.

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Abstract

La presente invención se refiere en parte a conjugados de vehículo-hapteno derivado de nicotina de fórmula (III) (Ver Formula) en la que m, n, W, -(espaciador)-, X' e Y son como se ha definido en la descripción; en determinadas realizaciones, dichos conjugados de vehículohapteno derivado de nicotina se pueden usar para preparar vacunas para el tratamiento y/o la prevención de la adicción a la nicotina.

Description

CONJUGADOS PARA LA PREVENCIÓN O EL TRATAMIENTO DE LA ADICCIÓN A LA NICOTINA CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a haptenos derivados de nicotina, conjugados con espaciador de hapteno y conjugados con vehículo de hapteno que sirven como componente antigénico en vacunas anti-nicotina. La invención también se refiere a composiciones de vacuna que contienen dichos antigenos de conjugado de vehículo de hapteno derivado de nicotina formulados con adyuvantes. Dichas composiciones se usan para mejorar las tasas de abandono o disminuir las tasas de recaída en los procedimientos de abandono de la práctica de fumar y los esfuerzos en los tratamientos de dependencia del tabaco/nicotina.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Fumar presenta varios efectos nocivos graves sobre la salud y junto con las iniciativas promovidas por muchos gobiernos para reducir o prevenir dicha práctica, el tabaquismo ha ido perdiendo aceptación social. Por consiguiente, muchos fumadores desean abandonar el hábito, y al tiempo que muchos lo intentan cada año, únicamente una minoría de ellos consiguen abandonar sin recaídas. La elevada tasa de fallo es consecuencia de la naturaleza adictiva de la nicotina junto con la sencilla disponibilidad de cigarrillos.
Con la práctica de fumar, o con el uso de nicotina en otras formas (por ejemplo, seno, parches, chicles), la nicotina penetra en el torrente sanguíneo y a continuación llega rápidamente al cerebro, donde estimula los receptores de acetilcolina nicotínicos, provocando la liberación de dopamina, lo que a su vez activa los centros de recompensa. Durante el intento de abandonar la práctica de fumar, existe una pérdida de la respuesta de recompensa, así como síntomas de abstinencia que incluyen una disminución en la función cognitiva. La principal razón de la recaída es que la pérdida de recompensa y los síntomas desagradables de la abstinencia se pueden aliviar de forma inmediata con la práctica de fumar.
Existen varias terapias no basadas en vacunas para abandonar la práctica de fumar. Las terapias de sustitución de la nicotina, tales como chicles masticables que contienen nicotina o parches cutáneos, pueden ayudar a los fumadores a abandonar los cigarrillos sin romper el ciclo de adicción provocado por la nicotina. Otro enfoque es el uso de fármacos que actúan sobre los receptores de acetilcolina nicotínicos, tales como la vareniclina. Dichos fármacos, que normalmente reducen la recompensa frecuente debida al hábito de fumar, han resultados relativamente satisfactorios en cuanto a su contribución para el abandono de la práctica de fumar, aunque las tasas de recaída una vez que el tratamiento con el fármaco finaliza son elevadas ya que una caída (por ejemplo, fumar un único cigarrillo) puede a su vez dar lugar a una recaída completa con reactivación de los centros de recompensa.
Las estrategias más recientes para el abandono de la nicotina se han centrado en vacunas que estimulan el sistema inmunológico para producir anticuerpos anti-nicotina que se unen a la nicotina en el torrente sanguíneo, reduciendo la cantidad de y la tasa de nicotina que penetra en el cerebro. Esto a su vez evita que los centros de recompensa se reactiven y contribuye a romper el ciclo de adicción. Debido a que los anticuerpos inducidos por vacunas pueden tener una larga vida, las vacunas anti-nicotina resultan útiles tanto para contribuir al abandono de la práctica de fumar como para la prevención frente a recaídas. De manera adicional, debido a que los anticuerpos actúan en la periferia, no existe riesgo alguno de efectos nocivos sobre el sistema nervioso central (CNS). Ejemplos de tales vacunas se describen en los documentos WO 00/32239, WO 02/49667, WO 03/82329 y US 2006/1 1 1271. Los derivados de la nicotina se describen en los documentos EP-A-421762, WO 01/70730, WO 01/80844 y US 2005/1 19480. Se han identificado otros derivados de nicotina con números de registro 136400-02-7, 250683-10-4, 861023-80-5 y 861025-04-9. Los haptenos de nicotina se describen en los documentos WO 99/61054, WO 02/58635, WO 03/82329, WO 2005/40338 y EP-A-1849780.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a haptenos derivados de nicotina, conjugados con espaciador de hapteno y procedimientos de conjugación que se pueden usar para preparar conjugados inmunogénicos de hapteno-vehículo para usarse en vacunas designadas para mejorar las tasas de abandono o para reducir las tasas de recaída en los esfuerzos de tratamientos para el abandono de la práctica de fumar. La invención también se refiere a formulaciones de vacuna que contienen los conjugados mencionados anteriormente junto con adyuvantes o excipientes, que se usan para la inmunización de fumadores con el fin de obtener anticuerpos frente a los haptenos, que a su vez reconocerán y se unirán de forma específica a la nicotina. La invención además se refiere a un procedimiento para mejorar las tasas de abandono o reducir las tasas de recaída en los esfuerzos de los tratamientos para el abandono de la práctica de fumar que comprende administrar el conjugado de hapteno-vehículo al fumador con deseo de abandonar la práctica. En otras realizaciones, se puede usar la vacuna en no fumadores para evitar que se conviertan en adictos a la nicotina si se encuentran posteriormente expuestos a ella por medio de la práctica de fumar o de otros medios.
Los conjugados de hapteno derivado de nicotina-vehículo de la invención pueden tener la ventaja de que resultan más inmunogénicos, son más específicos, más estables o presentas otras propiedades más útiles que los conjugados de hapetno-vehículo derivados de nicotina conocidos en la técnica.
Los conjugados de hapteno derivado de nicotina-vehículo de la invención pueden ser antígenos inmunogénicos más intensos que otros conjugados de hapteno derivado de nicotina-vehículo conocidos para usarse en vacunas anti-nicotina. Asimismo, las formulaciones de vacuna que contienen los conjugados de hapteno derivado de nicotina-vehículo de la invención como antígenos junto con adyuvantes pueden ser resultar más inmunogénicos que otras formulaciones de vacuna anti-nicotina, que normalmente suelen estar coadyuvadas con hidróxido de aluminio, y dan lugar a tasas de abandono más elevadas y a tasas de recaída menores entre pacientes que son dependientes de la nicotina/tabaco y que desean abandonar la práctica de fumar. Debido al mejor carácter inmunogénico inherente al antígeno, así como a la mejora que aportan los adyuvantes, las formulaciones de vacuna de la invención también pueden lograr valores de anticuerpo anti-nicotina más elevados, de forma más rápida y con dosis más bajas, dando como resultado un mejor cumplimiento terapéutico en comparación con las formulaciones de vacuna conocidas en la técnica.
Las rutas sintéticas de los compuestos de hapteno derivados de nicotina de la invención pueden presentar la ventaja de que proporcionan un mejor rendimiento sintético total (preferentemente un aumento de hasta 20 veces en el rendimiento sintético total), implican un menor número de etapas sintéticas, dan lugar a una mayor pureza de los haptenos resultantes derivados de nicotina (por ejemplo > 99% de pureza) o presentan otras propiedades más útiles que las rutas sintéticas de los compuestos de hapteno derivados de nicotina conocidos en la técnica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas que comprenden los conjugados de hapteno derivados de nicotina de la invención junto con adyuvantes, sobre los niveles de anticuerpos anti-nicotina en plasma en varios momentos de tiempo. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (de las Preparaciones 4, 7, 8 y 12) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 g) mediante vacunación ¡ntra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 g Al3+) y CpG 24555, un agonista de TLR-9 21 -mer que contenía motivos inmuno-estimuladores CpG (50 pg). Se midieron los niveles de anticuerpo anti-nicotina (IgG total) en el plasma mediante ELISA.
La Figura 2 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina que contienen antígenos de conjugados que comprenden los haptenos de la invención sobre la avidez de los anticuerpos anti-nicotina resultantes en el plasma en varios momentos de tiempo. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (de las Preparaciones 4, 7, 8 y 12) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 pg) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). El índice de avidez corresponde a la concentración de tiocianato de amonio necesaria para eluir 50% de los anticuerpos anti-nicotina de las pocilios revestidas con nicotina-BSA y el requerimiento de concentraciones elevadas es indicativo de anti-cuerpos con una avidez mayor.
La Figura 3 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina que contienen antígenos de conjugado que comprenden los haptenos de la invención sobre la distribución de nicotina 3H administrada por vía intravenosa (IV) en el cerebro y en la sangre. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 6 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (de las Preparaciones 4, 7, 8 y 12) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 pg) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Dos semanas después del último refuerzo, se administró nicotina 3H (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pC 3H-nic) por medio de inyección IV, se recogió la sangre, se perfundieron los animales, se retiraron los cerebros, se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó la proporción de 3H en plasma/cerebro.
La Figura 4 muestra la interacción de los anticuerpos antinicotina con la nicotina después de la inmunización de ratones con vacunas obtenidas a partir de los haptenos de la invención. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (de las Preparaciones 4, 7, 8 y 12) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 pg) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Dos semanas después del último refuerzo, se demostró la interacción de los anti-cuerpos anti-nicotina con la nicotina por medio de ELISA competitivo.
La Figura 5 muestra la especificidad de los anticuerpos antinicotina tras la inmunización de ratones con vacunas que contiene los haptenos de la invención. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (de las Preparaciones 4 y 12) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 pg) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Dos semanas después del último refuerzo, se determinó la especificidad de los anticuerpos anti-nicotina frente a la nicotina, cotinina, acetilcolina y vareniclina por medio de ELISA competitiva.
La Figura 6 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina usando distintos espaciadores para conjugar el hapteno derivado de nicotina de la invención con el vehículo sobre los niveles de anticuerpo anti-nicotina en plasma en varios momentos de tiempo. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (Preparación 4; 5'-aminopropilnicotina) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 pg) con conjugados usando distintos agentes de enlace (Preparaciones 24-34) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg).Se midieron los niveles de IgG Ab anti-nicotina en plasma por medio de ELISA.
La Figura 7 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina usando diferentes espaciadores para conjugar el hapteno derivado de nicotina de la invención con el vehículo sobre los niveles y avidez de los anticuerpos anti-nicotina en plasma y sobre la distribución de nicotina-3H en plasma y cerebro. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (Preparación 4; 5'-aminopropilnicotina) conjugados con toxoide diftérico (DT¡ 10 pg) con conjugados usando distintos agentes de enlace (Preparaciones 24-34) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg).A las 2 semanas después de la 3a inmunización, se midieron los niveles de IgG Ab anti-nicotina en plasma por medio de ELISA y se midió la avidez por medio de ensayo de tiocianato de amonio. Se administró nicotina-3H (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi nic-3H) por medio de inyección IV, se recogió sangre, se perfundieron los animales, se retiraron los cerebros, se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó la proporción de 3H en plasma/cerebro.
La Figura 8 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina usando distintos espaciadores para conjugar el hapteno derivado de nicotina de la invención con el vehículo sobre los niveles de anticuerpo anti-nicotina en plasma en varios momentos de tiempo. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (Preparación 12; 5'-aminoetoxinicotina) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 pg) con conjugados usando distintos agentes de enlace (Preparaciones 24-34) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Se midieron los niveles de anticuerpo (IgG total) en plasma por medio de ELISA.
La Figura 9 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina usando distintos espaciadores para conjugar el hapteno derivado de nicotina de la invención con el vehículo sobre los niveles de avidez de los anticuerpos anti-nicotina en plasma y sobre la distribución de nicotina-3H en plasma y cerebro. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con haptenos derivados de nicotina (Preparación 12; 5 -aminoetoxinicotina) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 pg) con conjugados usando distintos agentes de enlace (Preparaciones 24-34) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). A las dos semanas después de la 3a inmunización, se midieron los niveles de IgG Ab anti-nicotina en plasma por medio de ELISA y se midió la avidez por medio de ensayo con tiocianato de amonio. Se administró nicotina-3H (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi nic-3H) por medio de inyección IV, se recogió sangre, se perfundieron los animales, se retiraron los cerebros, se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó la proporción de 3H en plasma/cerebro.
La Figura 10 muestra el efecto de succinilación de los conjugados de hapteno-vehiculo de la invención sobre los niveles de anticuerpo anti-nicotina en plasma en varios momentos de tiempo. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con hapteno derivado de nicotina (Preparación 4; 5 -aminopropilnicotina) conjugado con toxoide diftérico (DT; 10 pg) con conjugados preparados usando 2 condiciones diferentes, cada una con o sin etapa de anhídrido succínico, mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Se midieron los niveles de anticuerpo de anti-nicotina (IgG total) en plasma por medio de ELISA.
La Figura 1 1 muestra el efecto de succinilación de los conjugados de hapteno-vehiculo de la invención, sobre la distribución de nicotina-3H en sangre y cerebro. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con hapteno derivado de nicotina (Preparación 4; 5'-aminopropilnicotina) conjugados con toxoide diftérico (DT; 10 pg) con conjugados preparados usando dos condiciones, cada una con o sin etapa de anhídrido succínico, mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). A las dos semanas después del último refuerzo, se administró nicotina-3H (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi de nic-3H) por medio de inyección IV, se recogió sangre, se perfundieron los animales, se retiraron los cerebros, se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó la proporción de 3H en plasma/cerebro.
La Figura 12 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina usando diferentes espaciadores para conjugar el hapteno derivado de nicotina de la invención con el vehículo sobre los niveles de anticuerpo anti-nicotina en plasma en varios momentos de tiempo. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con hapteno derivado de nicotina (Preparación 12; 5'-aminoetoxinicotina) conjugado con toxoide diftérico (DT; 10 pg) o CRM197 (10 pg) con conjugados usando distintos agentes de enlace (Preparaciones 24-34) mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Se midieron los niveles de anticuerpos anti-nicotina (IgG) en plasma por medio de ELISA.
La Figura 13 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina sobre la distribución de nicotina-3H. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con hapteno derivado de nicotina (Preparación 12; 5 -aminoetoxinicotina) conjugado con toxoide diftérico (DT; 10 pg) o CRM197 (10 pg), mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). A las dos semanas después de la 3a inmunización, se administró nicotina-3H (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi nic-3H) por medio de inyección IV, se recogió sangre, se perfundieron los animales, se retiraron los cerebros, se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio en nicotina-3H en cerebros con respecto a animales de control.
La Figura 14 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina sobre los niveles de de anticuerpo anti-nicotina en plasma en varios momentos de tiempo. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con hapteno derivado de nicotina (Preparación 12; 5'-aminoetoxinicotina) conjugado con toxoide diftérico (DT; 10 pg) o CRM197 (10 pg), mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Se evaluó un intervalo de distintas concentraciones de hapteno, Se midieron los niveles de anticuerpo anti-nicotina (IgG total) en plasma por medio de ELISA.
La Figura 15 muestra el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina sobre la distribución de nicotina-3H en ratones. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con hapteno derivado de nicotina (Preparación 12; 5 -aminoetoxinicotina) conjugado con toxoide diftérico (DT; 10 pg) o CRMi97 (10 pg), mediante vacunación intra-muscular (en los días 0, 28, 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Se evaluó un intervalo con diferentes concentraciones de hapteno. A las dos semanas después de la 3a inmunización, se administró nicotina-3H (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi nic-3H) por medio de inyección IV, se recogió sangre, se perfundieron los animales, se retiraron los cerebros, se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio en nicotina-3H en cerebros con respecto a animales de control.
Las Figuras 16A-18 muestran el efecto de inmunización de ratones con vacunas anti-nicotina sobre los niveles de anticuerpos antinicotina y la avidez en plasma en varios momentos de tiempo. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 10 por grupo) con hapteno derivado de nicotina (Preparación 12; 5 -aminoetoxinicotina) conjugado con CRM 97 (10 pg), mediante vacunación intra-muscular en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg), o en presencia de ISCOMATRIX (IMX; de 0.1 a 3.0 Unidades). Los niveles de anticuerpo anti-nicotina (IgG total) en plasma se midieron por medio de ELISA (días 21 y 28) y la avidez se midió por medio de ELISA de inhibición. La Figura 16A muestra el resultado 3 semanas después de la 1a dosificación; y la Figura 16B muestra el resultado 1 semana después de la 2o dosificación. La Figura 17 muestra la avidez (IC50) 1 semana después de la 2a dosificación. La Figura 18 muestra el secuestro de nicotina en plasma (parte superior); y la captación de nicotina por parte del cerebro (parte inferior).
Las Figuras 19 y 20 muestran el efecto de las condiciones de conjugación de los conjugados de hapteno derivado de nicotina-vehículo de la Tabla 6 sobre los niveles de anticuerpo anti-nicotina y los correspondientes valores IC50. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 10 por grupo) con hapteno derivado de nicotina, mediante vacunación intra-muscular en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 \ g) . Se midieron los niveles de anticuerpo anti-nicotina (IgG total) en plasma por medio de ELISA y la avidez por medio de ELISA de inhibición.
Las Figuras 21 y 22 muestran la distribución de nicotina-3H en sangre y cerebro para los conjugados hapteno-vehículo de la Tabla 6. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 10 por grupo) con hapteno derivado de nicotina, mediante vacunación intra-muscular en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y CpG 24555 (50 pg). Una semana después de la segunda inmunización, se administró nicotina-3H (0.05 mg/kg de nicotina que contenia 3 pCi nic-3H) por medio de inyección IV, se recogió sangre, se perfundieron los animales, se retiraron los cerebros, se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio en nicotina-3H en sangre y cerebros con respecto a animales de control.
La Figura 23 muestra los resultados de ensayo para la unión de los conjugados de hapteno-vehlculo con diferentes porcentajes de proteína portadora monomérica a CpG/Alhydrogel. Se determinó la unión incubando CpG/Alhydrogel con una cantidad conocida de conjugado de hapteno-vehículo y posteriormente midiendo la concentración del conjugado que quedaba en solución tras la incubación. El% de disminución de la concentración del conjugado es equivalente al% de unión del conjugado al CpG/Alhydrogel. Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 10 por grupo) con 10 pg de distintos conjugados, mediante inyección intra-muscular, en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhygrogel-85; 40 pg Al3+) y 10 pg de CpG 24555. Una semana después de la 2a inmunización, se administró nicotina-3H (0.05 mg/kg de nicotina que contenia 3 pCi nic-3H) por medio de inyección IV, se recogió sangre, se perfundieron los animales, se retiraron los cerebros, se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio en nicotina-3H en cerebros y sangre con respecto a animales de control.
Listado de secuencias SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótido del oligonucleótido inmunoestimulador ODN CpG 24555.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención se refiere a un hapteno de fórmula (I): en la que W es -CH2- o -O-; y X es -NH2 o -SH.
En una realización, W está en posición 2, 5 o 6 del anillo piridina. En otra realización, W está en posición 5 del anillo de piridina. En otra realización, W es -O-.
En otra realización, W es -O-; y W está en posición 5 del anillo de piridina.
En otra realización, el hapteno es En otra realización el hapteno es En otra realización el hapteno es En un segundo aspecto, la invención se refiere a un conjugado spaciador de fórmula (II): (ll) en la que W es -CH2- o -O-; -(espaciador)- es un grupo alquileno C^Ce, un grupo cicloalquileno C3-C10 o un grupo alquileno C Ci2 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno e interrumpido de manera opcional por un -N(H)C(0)-; y X es -NH2 o -SH.
Según se usa en el presente documento, el "grupo alquileno" significa un grupo -(CH2)n en el que n es el número necesario de átomos de carbono. Según se usa en el presente documento, el "grupo alquileno interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno" es por ejemplo, -CH2CH20 CH2l -CH2CH2OCH2CH2OCH2- o -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-. Según se usa en el presente documento, el "grupo alquileno interrumpido por 1 a 4 átomos de carbono e interrumpido por un -N(H)C(0)"- es por ejemplo, -CH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NHCOCH2CH2-.
En una realización, W está en posición 2, 5 o 6 del anillo piridina. En otra realización, W está en posición 5 del anillo de piridina. En otra realización, W es -O-.
En otra realización, W es — O-; y W está en posición 5 del anillo de piridina.
En una realización, -(espaciador)- es un grupo alquileno Ci-C6. En otra realización, -(espaciador)- es un grupo alquileno C1-C10 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno.
En otra realización, -(espaciador)- es un grupo alquileno C 1-C 12 interrumpido por 3 átomos de oxigeno e interrumpido por -N(H)C(0)-.
En una realización, el conjugado de hapteno-espaciador es Se conciben las siguientes realizaciones: (i) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (II) descrito anteriormente, en el que W es -O-; (¡i) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (II) descrito anteriormente, en el que W es -CH2-; (iii) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (II) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) y (ii), en el que X es -SH. (iv) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (II) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) a (iii), en el que W está en posición 2, 5 o 6 del anillo de piridina; (v) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (II) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) a (iv), en el que W está en posición 5 del anillo de piridina; (vi) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (II) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) a (v), en el que -(espaciador) es un grupo alquileno Ci-C8, un grupo cicloalquileno o un grupo alquileno C1-C12 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxigeno y de manera opcional interrumpido por -N(H)C(0)-; y (vii) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (II) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) a (vi), en el que -(espaciador)- es un grupo alquileno CrC8.
En los siguientes esquemas, que muestran procedimientos generales de obtención de los compuestos de fórmula (I), los sustituyentes son como se ha definido anteriormente para los compuestos de fórmula (I) o sus derivados, a menos que se indique lo contrario: ESQUEMA 1 (i) (ü) (iii) Se puede formar éster de boronato (ii) a partir de la reacción de S-(-)-nicotina (i) con un catalizador de iridio apropiado, típicamente metoxi(ciclooctadien)iridio(l) dímero, un ligando, tal como 4,4 -di-terc-butil- 2,2 '-dipiridilo y una fuente de boro, tal como bis(pinacolato)diboro o 4,4,5,5- tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolano, en un disolvente apropiado, tal como 1 ,4- dioxano o THF, a una temperatura entre temperatura ambiente y reflujo. Posteriormente se puede convertir el éster de boronato (ii) en bromuro (iii) usando bromuro de cobre (II) en un sistema de disolvente apropiado, tal como metanol/agua o etanol/agua, a una temperatura de, típicamente, entre 60°C y reflujo.
ESQUEMA 2 ( üi) (vi) Posteriormente se puede convertir el bromuro (iii) en cianuro insaturado (iv) con acrilonitrilo, en condiciones de acoplamiento de paladio, usando una fuente de paladio apropiada, tal como acetato de paladio (II) o tetraquis(trifenilfosfina)paladio, en presencia de un ligando de fosfina apropiado, tal como tri(o-tolil)fosfina o trifurilfosfina, en presencia de una base apropiada, tal como carbonato de sodio, trietilamina o N-diisopropiletilamina, en un disolvente apropiado, tal como acetonitrilo o 1 ,4-dioxano, a una temperatura, típicamente, de reflujo.
Típicamente, la hidrogenación de (iv) para dar (v) se lleva a cabo usando un catalizador apropiado, tal como paladio sobre carbono, hidróxido de paladio sobre carbono o platino sobre carbón vegetal activado, en atmósfera de hidrógeno en un disolvente apropiado, tal como metanol, etanol o acetato de etilo, a una temperatura típicamente alrededor de temperatura ambiente.
Típicamente, la reducción de nitrilo (v) hasta amina (vi) se lleva a cabo usando un catalizador apropiado, tal como níquel Raney, en atmósfera de hidrógeno (típicamente a una presión de alrededor de 344.74-689.48 kPa) en un disolvente apropiado, tal como metanol o etanol, en presencia de amoníaco concentrado, a una temperatura de típicamente aproximadamente 40-70°C.
La formación de amidas de tipo (viii) se lleva a cabo en las condiciones estándar de la bibliografía. El ácido (vii) se puede convertir en cloruro de ácido usando un agente clorante apropiado, tal como cloruro de oxatilo o cloruro de tionilo, en un disolvente apropiado, tal como diclorometano o tolueno, de manera opcional en presencia de un DMF catalítico, a una temperatura apropiada, típicamente entre 0 °C y temperatura ambiente. Posteriormente, el cloruro ácido se puede hacer reaccionar con la amina (vi) en presencia de una base, tal como trietilamina o diisopropiletilamina, en un disolvente apropiado, tal como diclorometano o tolueno, a una temperatura de entre 0 °C y temperatura ambiente. De manera alternativa, el ácido (vii) se puede convertir en una especie activada apropiada con un agente de acoplamiento, tal como T3P, EDCI HCI, EDCI.Mel, HBTU, HATU, PyBop, DCC o CDI, en un disolvente apropiado, tal como diclorometano o DMF. En presencia de EDCI HCI o EDCI Mel, se añade HOBT de manera opcional.
También se usa una base apropiada, tal como trietilamina o diisopropiletilamina y la reacción se lleva a cabo típicamente a temperatura ambiente.
ESQUEMA 3 La desprotonación de (i) se puede llevar a cabo con una base apropiada, tal como la super-base nBuLi-LiDMAE (formada por medio de la reacción de n-butillitio con dimetilaminoetanol), en un disolvente apropiado, tal como hexano, tolueno, hexano/tolueno o hexano/THF, a una temperatura apropiada, típicamente entre -78°C y 0°C.EI anión resultante puede ser enfriando con una fuente de cloro, tal como hexacloroetano o N-clorosuccinimida, a una temperatura de entre -78°C y temperatura ambiente, para dar los dos análogos de cloropiridina (ix) e (x).
Los análogos de cloropiridina (ix) y (x) se pueden convertir en aminas (xi) y (xii) usando etanolamina, preferentemente como disolvente y como reactante y usando una base fuerte apropiada, tal como hidruro de sodio o terc-butóxido de potasio, a una temperatura de típicamente entre 50-100°C.
ESQUEMA 4 El bromuro (iii) se puede hacer reaccionar con un alcohol que transporta un grupo protector (por ejemplo alcohol bencílico o, preferentemente, alcohol p-metoxibencílico) usando una base apropiada, típicamente hidruro de sodio, en un disolvente apropiado, tal como DMF o NMP, a una temperatura de típicamente aproximadamente 90-130°C. La retirada del grupo protector para dar (xiv) se puede llevar a cabo usando procedimientos estándar de la bibliografía (por ejemplo, para el alcohol p-metoxibencílico, se puede usar un ácido apropiado tal como ácido trifluoroacético).
El alcohol (xiv) se puede convertir en una amina protegida (xv) (el grupo protector es preferentemente BOC) usando un agente alquilante apropiado (xvi), tal como un haluro, mesilato o toxilato, y una base, tal como carbonato de potasio o carbonato de cesio, en un disolvente apropiado, tal como acetonitrilo o DMF, a una temperatura de típicamente de entre 80°C y reflujo. La desprotección de la amina se puede llevar a cabo, usando los procedimientos estándar de la bibliografía, para dar (xvii) (por ejemplo, para el caso del grupo protector BOC, la desprotección se puede llevar a cabo usando una fuente de ácido apropiada tal como ácido trifluoroacético o ácido clorhídrico en un disolvente apropiado tal como 1 ,4-dioxano, THF o diclorometano).
La formación de amidas del tipo (xviii) se puede llevar a cabo en las condiciones estándar de la bibliografía. Se puede convertir del ácido (víi) en ácido clorhídrico usando un agente de cloración apropiado, tal como cloruro de oxalilo o cloruro de tionilo, en un disolvente apropiado, tal como diclorometano o tolueno, de manera opcional en presencia de DMF catalítico, a temperatura apropiada, típicamente entre 0°C y temperatura ambiente. Posteriormente se puede hacer reaccionar el ácido clorhídrico con la amina (xvii) en presencia de una base, tal como trietilamina o diisopropiletilamina, en un disolvente apropiado, tal como diclorometano o tolueno, a una temperatura de entre 0°C y temperatura ambiente. De manera alternativa, el ácido (vii) se puede convertir en una especie activada apropiada con un agente de acoplamiento tal como T3P, EDCI, HCI, EDCI.Mel, HBTU, HATU, PyBop, DCC o CDI, en un disolvente apropiado, tal como diclorometano o DMF. En presencia de EDCI HCI o EDCI Mel, se añade HOBT de manera opcional. También se usa una base apropiada, tal como trietilamina o diisopropilamina y la reacción se lleva a cabo típicamente a temperatura ambiente. De manera alternativa, la amina (xvii) se puede hacer reaccionar con anhídridos de ácido o lactonas para preparar otros derivados de fórmula general (xviü). Por ejemplo, se puede usar g-butirolactona o g-tiobutirolactona como fuente de acilo en esta etapa, o por ejemplo un anhídrido tal como anhídrido succínico o itálico para proporcionar derivados (xviü).
ESQUEMA 5 (ii) (xiv) También se puede preparar el alcohol (xiv) por medio del éster de boronato (ii) usando un agente oxidante apropiado, típicamente agua oxigenada, y un ácido apropiado, tal como ácido acético, en un disolvente apropiado, tal como THF o 1 ,4-dioxano.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un conjugado de hapteno-vehículo de fórmula (III): en la que W es -CH2- o -O-; -(espaciador)- es un grupo alquileno CrC8, un grupo alquileno C 1-C 12 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno y de manera opcional interrumpido por -N(H)C(0)-, o un grupo cicloalquileno C3-C10; m es 0 o 1 ; X* es -N(H)- o -S-; n es un número entero de 1 a 1000; e Y es una proteína portadora opcionalmente modificada que se escoge entre toxoides bacterianos, sustancias inmunogénicas, virus, partículas parecidas a los virus, complejos de proteina, proteínas, polipéptidos, liposomas y complejos inmuno-estimuladores.
En determinadas realizaciones, Y es un toxoíde diftérico o CRM197.
Para la unión de los haptenos a las proteínas portadoras, los siguientes procedimientos resultan ilustrativos. Por ejemplo, la proteína portadora, tal como toxoíde diftérico (DT) o CRM 97, se puede activar por medio de tratamiento con un anhídrido, por ejemplo anhídrido suceínico, para producir una versión desactivada de la proteína portadora (xíx). Posteriormente, este derivado se pueden acoplar a un hapteno (xvii) en presencia de un reactivo de acoplamiento estándar por medio de conversión a una especie activada apropiada con, por ejemplo, T3P, EDCI HCI, EDCI Mel, HBTU, HATU, PyBop, DCC o CDI, en un disolvente apropiado o tampón (tal como solución salina de tampón de fosfato de Dulbeccos). En presencia de EDCI HCI o EDCI Mel, se añade de manera opcional HOBT o N-hídroxisuccinimida (o sus versiones sulfatadas) y se lleva a cabo la reacción típicamente a temperatura ambiente para proporcionar los conjugados (xx). De manera alternativa, se puede omitir la etapa de succinilación/derivación y se puede llevar a cabo el acoplamiento directo del hapteno a los grupos carboxilo libres sobre la proteína portadora usando los procedimientos anteriores para proporcionar los conjugados (xxiv). De manera alternativa, la proteína portadora se puede tratar con una reactivo alternativo de formación de derivados tal como N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético para dar lugar a especies derivatizadas (xxi), que se pueden tratar con un hapteno que contiene tiol (xxii) para proporcionar el conjugado (xxiii).
ESQUEMA 6 Se conciben las siguientes realizaciones: (i) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (III) descrito anteriormente, en el que W es -O-; (ii) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (III) descrito anteriormente, en el que W es -CH2-; (iii) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (III) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) a (ii), en el que W está en posición 2, 5 o 6 del anillo de piridina; (iv) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (III) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) a (iii), en el que W está en posición 5 del anillo de piridina; (v) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (III) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) a (iv), en el que -(espaciador) es un grupo alquileno Ci-C8, un grupo cicloalquileno C6 o un grupo alquileno C C12 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno y de manera opcional interrumpido por -N(H)C(0)-; (vi) el conjugado hapteno-espaciador de fórmula (III) descrito anteriormente o en las realizaciones (i) a (iv), en el que -(espaciador)- es un grupo alquileno Ci-Ce; (vii) el conjugado de hapteno-vehículo de fórmula (III) descrito anteriormente o de acuerdo con las realizaciones (i) a (vi), en el que m es 0; (viii) el conjugado de hapteno-vehículo de fórmula (III) descrito anteriormente o de acuerdo con las realizaciones (i) a (vii), en el que el vehículo es una proteína modificada de manera opcional escogida entre toxoide tetánico, toxoide diftérico o sus derivados tales como toxoide CRMi97 diftérico mutante no tóxico, hemocianina de lapa de bocallave (KLH), hemocianina, albúmina, complejo de proteína de membrana externa (OMPC) de Neisseria meningitídis, la subunidad B de Escherichia coli termo-lábil, exoproteína A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) y partículas similares a virus tales como las ensambladas a partir de proteina de recubrimiento recombinante de bacteriófago Qb; (ix) el conjugado de hapteno-vehiculo de fórmula (III) descrito anteriormente o de acuerdo con las realizaciones (i) a (viii), en el que el vehículo es una proteína que se escoge entre toxoide diftérico y CRM197, que están modificados de manera opcional; (x) el conjugado de hapteno-vehiculo de fórmula (III) descrito anteriormente o de acuerdo con las realizaciones (i) a (ix), en el que el vehículo es de manera opcional CRM197 modificado; (xi) el conjugado de hapteno-vehiculo de fórmula (III) descrito anteriormente o de acuerdo con las realizaciones (i) a (x), en el que n es un número entero dentro del intervalo de 1 a 40; (xii) el conjugado de hapteno-vehiculo de fórmula (III) descrito anteriormente o de acuerdo con las realizaciones (i) a (x), en el que n es un número entero dentro del intervalo de 10 a 18; (xiii) el conjugado de hapteno-vehiculo de fórmula (III) descrito anteriormente o de acuerdo con las realizaciones (i) a (xii) o como se han descrito anteriormente, en el que la proteína transportadora es una proteína succinilada modifcada.
La toxina diftérica es convertida en toxoide diftérico mediante incubación a 37°C en presencia de formaldehído y de otros excipientes durante entre 4 y 6 semanas. Este tratamiento crea una proteína altamente reticulada o peso molecular heterogéneo que da lugar a la proteína no tóxica pero que retiene el carácter inmunogénico. El uso de esta proteína como proteína de portadora de vacuna se encuentra bien documentado, y se ha usado como vacuna de factor liberador anti-gonadotropina (GnRF) en cerdos, como alternativa frente a la castración química (Improvac™, Pfizer). También se encuentra disponible comercialmente en forma no conjugada como vacuna humana contra la difteria, formando parte de la vacuna DTaP para el tratamiento de difteria, tétanos y tos ferina acelular respectivamente.
CR 197 es una versión detoxificada genéticamente de la toxina diftérica, convertida en no tóxica mediante una mutación de punto único de un resto de glicina en la posición 52 para un resto de ácido glutámico. La mutación retira la capacidad de la proteína para unirse a NAD+, y como tal, la proteína es enzimáticamente inactiva. Debido a la ausencia de reticulación, la proteina es un producto de peso molecular más homogéneo que el toxoide diftérico, una preparación de toxina diftérica inactivada en formaldehído. CRMi97 se ha usado como proteina portadora en tratamientos con vacunas anti-neumocócicas disponibles comercialmente (Prevna®, Pfizer).
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para preparar conjugados de vehículo-hapteno derivado de nicotina como se ha descrito anteriormente, que comprende acoplar una proteína de vehículo opcíonalmente modificada con una hapteno derivado de nicotina de fórmula (I) o un conjugado de hapteno-espaciador de fórmula (II), como se ha descrito anteriormente.
En determinadas realizaciones, la unión de los haptenos a las proteínas portadoras puede llevarse a cabo de tal manera que se minimice el número de proteínas portadoras que se unen juntas. En determinadas realizaciones, el número de proteínas portadoras unidas juntas es menor que 5%, menor que 10%, menor que 15%, menor que 20%, menor que 25% o menor que 30% del número total de proteínas portadoras.
En una realización preferida, la invención se refiere a un procedimiento para preparar un conjugado de vehículo-hapteno derivado de nicotina de fórmula (II), como se ha descrito anteriormente, en el que X* es -NH-, que comprende tratar una proteína portadora modificada opcionalmente con sulfo-N-hidroxisuccinimida, seguido de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropíl)carbodiimida, posteriormente añadir un hapteno de fórmula (I) o un conjugado de hapteno-espaciador de fórmula (II), como se ha descrito anteriormente, en el que X es -NH2.
En una realización alternativa, la invención se refiere a un procedimiento para preparar un conjugado de vehículo y hapteno de fórmula (III), como se ha descrito anteriormente, en el que X* es -NH-, que comprende tratar la proteína portadora con anhídrido succinico para dar una proteína portadora succinílada modificada; tratar la proteína portadora succinílada modificada con sulfo-N-hidroxisuccinimida, seguido de hidrocloruro de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, añadir posteriormente un hapteno de fórmula (I) o un conjugado de hapteno-espaciador de fórmula (II), como se ha descrito anteriormente, en el que X es -NH2.
En una realización alternativa, la invención se refiere a un procedimiento para preparar un conjugado de vehículo y hapteno de fórmula (III), como se ha descrito anteriormente, en el que X* es -S-, que comprende tratar la proteína portadora con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético, añadir posteriormente un hapteno de fórmula (I) o un conjugado de vehículo y hapteno de fórmula (II), como se ha descrito anteriormente, en el que X es -SH.
En un quinto aspecto, la invención se refiere a vacunas (o composiciones de vacunas) que comprenden una pluralidad de conjugados de vehiculo-hapteno de fórmula (III), como se ha definido anteriormente, y uno o mas adyuvantes.
Ejemplos de adyuvantes apropiados son los conocidos por mejorar la respuesta de los anticuerpos frente a antígenos, incluyendo las respuestas de anticuerpos frente a hapteno de nicotina cuando se acopla con una molécula de vehículo. Los adyuvantes son bien conocidos en la técnica (J.C. Aguilar, E.G. Rodríguez, Review: Vaccine Adjuvants Revisited, 2007, Vaccine, 25, 3752-3762). El adyuvante puede actuar por medio de uno o más mecanismos que incluyen la activación inmune innata directa, la creación de un depósito o la actuación en forma de vehículo de suministro para el antígeno. El adyuvante que actúa por medio de activación inmune innata directa puede ser un agonista del receptor parecido a Toll (TLR) que incluye, pero no se limita a, poli I C estabilizado que activa TLR3, una derivado de lipopolisacárido tal como monofosforil-lípido A (MPL) o adyuvante de lípido de glucopiranosilo (GLA) que se activa por medio de TLR4, flagelina que se activa por medio de TLR5, pequeñas moléculas de la familia de imidazoquinolina tal como Imiquimod o resiquimod que se activan por medio de TLR7 o TLR8 o ambos TLR7 y TLR8, oligonucleótidos (ORN) que se activan vía TLR7 y/o TLR8 y oligodesoxinucleótidos (ODN) que contienen motivos CpG que se activan vía TLR9. Los agonistas de CpG ODN TLR9 puede ser de la clase-A, clase-B, clase-C o clase-P, con o sin halogenación de 5T conocida como modificación E, y pueden estar preparados con una cadena principal completa de fosfodiéster, una cadena principal completa de fosforotioato, una cadena principal quimérica, una cadena principal "semi-blanda" que es completamente de fosforotioato exceptuando entre las citosinas y las guanosinas del motivo CpG. El adyuvante que actúa por medio de activación inmune innata directa puede actuar a través de un mecanismo que no ocurre vía TLR, tal como QS21 u otras saponinas.
El adyuvante puede ser una sal de aluminio que actúe tanto como sistema de depósito como de activador inmune innato a través del inflamasoma. Preferentemente, la sal de aluminio se escoge entre hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio. Preferentemente, el hidróxido de aluminio es Alhydrogel original o Alhydrogel 85.
El adyuvante que actúa a través tanto de activación inmune como de vehículo de suministro puede ser un complejo estimulador inmune (ISCOM) tal como ISCOMATRIX.
El adyuvante que tiene propiedades de vehículo de suministro puede ser un complejo macromolecular, nanocápsulas, nanopartículas, microesferas, micropartículas o virosomas, y estos pueden tener restos sobre sus superficies con el fin de actuar sobre tipos celulares específicos. El adyuvante puede ser un sistema basado en lípidos que incluye emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite, micelas, micelas mixtas y liposomas. Los liposomas pueden ser uni-lamelares o multi-lamelares. La emulsión puede estar basada en escualeno tal como MF-69.
El adyuvante puede ser un virosoma.
Adyuvantes preferidos se escogen entre CpG oligodesoxinucleótidos (CpG ODN), sales de aluminio, QS21 y ISCOMS.
Los CpG ODN preferidos son los de la clase B que preferentemente activan células B. En aspectos de la invención, el CpG ODN presenta la secuencia de ácido nucleico 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3 (SEQ ID N°. 1) en la que * indica un enlace fosforotioato. El CpG ODN de esta secuencia es conocido como CpG 24555.
Según se usa en el presente documento, el término "oligodesoxinucleótido" (ODN) significa nucleótidos múltiples (es decir, moléculas que comprenden un azúcar de desoxiribosa unido a grupo fosfato y una base orgánica intercambiable, que es bien pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C) o timidina (T)) o bien una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G)). Se pueden obtener moléculas de ácido nucleico a partir de fuentes existentes de ácido nucleico (por ejemplo, genómico o ADNc), pero preferentemente sintético (por ejemplo, producido mediante síntesis de ácido nucleico). Los oligonucleótidos que presentan uniones de fosforotioato son relativamente resistentes a la degradación in vivo (por ejemplo, vía endo- y exo-nucleasas), proporcionando una actividad mejorada in vivo.
Los procedimientos para la síntesis y modificación química de oligonucleótidos resultan conocidos por los expertos y se describen, por ejemplo en Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S Agrawal, Ed. Humana Press, Totowa, Estados Unidos 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36: 107-129; y Hunzinker J. et al. (1995), Mod. Synth. Methods 7:331 -417. Los oligonucleótidos de la invención se pueden sintetizar de novo usando cualquiera de un número de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el procedimiento de b-cianoetíl fosforamidita (Beaucage, S.L. y Caruthers, M. H., (1981) Tet. Let. 22:1859); procedimiento de nucleósido H-fosfonato (Garegg et al., (1986) Tet. Let. 27:4051 -4054; Froehler et al., (1986) Nucí. Acid. Res. 14:5399-5407; Garegg et al., (1986) 27:4055-4058; Gaffney et al, (1988) Tet Let. 29:2619-2622). Estos procedimientoss químicos se pueden llevar a cabo por parte de una variedad de sintetizadores automatizados de ácido nucleico disponibles en el mercado. Estos oligonucleótidos son denominados oligonucleótidos sintéticos. Las cadenas principales tales como fosforotioatos se pueden sintetizar usando técnicas automatizadas que emplean procedimientoss químicos bien de fosforoamidato o de H-fosfonato. Los fosfonatos de arilo y alquilo pueden prepararse, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N°. 4.469.863, y los alquilfosfotriésteres (en los que el resto de oxígeno cargado se alquila como se describe en la patente de Estados Unidos N°. 5.023.243) se pueden preparar por medio de síntesis automatizada en fase sólida usando reactivos disponibles comercialmente. Se han descrito procedimientos para preparar modificaciones de cadena principal de ADN y sustituciones (por ejemplo Uhlmann, E. y Peyman A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem., 1 : 165, 1990).
Los adyuvantes más preferidos son CpG 24555 (como se describe en las solicitud co-pendiente número PCT/IB2009/055444, incorporada en su totalidad en el presente documento por referencia) usados junto con una sal de hidróxido de aluminio tal como Alhydrogel. De este modo, en una realización, se proporciona una vacuna (o composición de vacuna) que comprende un conjugado de hapteno-vehículo de fórmula (III) como se ha definido anteriormente y CpG 24555. En otra realización se proporciona una vacuna (o composición de vacuna) que comprende un conjugado de hapteno-vehículo de fórmula (III) como se ha comentado anteriormente, CpG 24555 y una sal de hidróxido de aluminio. En otra realización, se proporciona una vacuna (o composición de vacuna) que comprende CpG 24555 y una pluralidad de conjugados de hapteno-vehículo de fórmula (IV): en la que Y es toxoide diftérico o CRM197 y n es un número entero dentro del intervalo de 1 a 40. otra realización se proporciona una vacuna (o composición de vacuna) que comprende CpG 24555, una sal de hidróxido de aluminio pluralidad de conjugados de hapteno-vehiculo de fórmula (IV). en la que Y es toxoide diftérico o CRMig7 y n es un número entero dentro del intervalo de 1 a 40.
En otra realización se proporciona una vacuna (o composición de vacuna) que comprende una sal de hidróxido de aluminio (por ejemplo Alhydrogel) y una pluralidad de conjugados de hapteno-vehiculo de fórmula (IV).
(IV) en la que Y es toxoide diftérico o CRM197 y n es un número entero dentro del intervalo de 1 a 40.
En determinadas realizaciones, n es un número entero dentro del intervalo de 1 a 30 ambos incluidos. En determinadas realizaciones, n es un número entero dentro del intervalo de 5 a 23 ambos incluidos. En determinadas realizaciones, n es un número entero dentro del intervalo de 10 a 18 ambos incluidos. En determinadas realizaciones, n es 10. En determinadas realizaciones, n es 11. En determinadas realizaciones, n es 12. En determinadas realizaciones, n es 13. En determinadas realizaciones, n es 14. En determinadas realizaciones, n es 15. En determinadas realizaciones, n es 16. En determinadas realizaciones, n es 17. En determinadas realizaciones, n es 18.
Variando las condiciones de acoplamiento que forman el conjugado hapteno-vehiculo, véase Ejemplo siguiente, se puede minimizar el acoplamiento-cruzado de las proteínas portadoras. Cuando las proteínas portadoras experimentan acoplamiento-cruzado, el conjugado de hapteno-vehiculo resultante comprende proteínas portadoras múltiples unidas de forma covalente o no covalente y son denominadas en el presente documento "especies de masa molecular elevada". Por el contrario una "especie de masa molecular reducida", según se usa en el presente documento, se refiere a conjugados de hapteno-vehiculo en los que una parte de la proteína portadora se pierde durante la preparación del conjugado. En determinadas realizaciones, se ha observado que las especies de alto peso molecular dan lugar a vacunas menos eficaces. Por tanto, in determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a cualquiera de las composiciones de vacuna mencionadas anteriormente en las que menos que 5%, menos que 10%, menos que 15%, menos que 20%, menos que 25% o menos que 30% de las proteínas portadoras que son parte de los conjugados de hapteno-vehículo se encuentran acopladas-cruzadas (es decir, son especies de masa molecular elevada).
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a cualquiera de las composiciones de vacuna mencionadas anteriormente en las que al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de las proteínas portadoras que son parte de los conjugados de hapteno-vehículo no se encuentran acopladas-cruzadas.
En determinadas realizaciones, más que 70%, más que 75%, más que 80%, más que 85%, más que 90% o más que 95% de los componentes antigénicos de cualquiera de las composiciones de vacuna mencionadas anteriormente son conjugados de hapteno-vehículo de fórmula IV.
En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a cualquiera de las composiciones de vacuna mencionadas anteriormente en las que al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de las proteínas portadas presentan pesos moleculares entre 50.000 Daltons y 70.000 Daltons. En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a cualquiera de las composiciones de vacuna mencionadas anteriormente en las que al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de las proteínas portadoras presenta un peso molecular de aproximadamente 58.000 Daltons.
Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden contener de manera opcional uno o más excipientes aceptables farmacéuticamente. Excipientes apropiados incluyen agua esterilizada, soluciones salinas y tampones. En una realización, el conjugado de hapteno-vehículo se disuelve en una solución salina acuosa a un valor de pH aceptable farmacéuticamente. La composición de vacuna también puede contener de manera opcional al menos un agente auxiliar, tal como un medio de dispersión, revestimientos, tensioactivos, conservantes y estabilizadores. Preferentemente, la composición de vacuna de la presente invención es estéril.
De manera general, la composición de vacuna de la presente invención se administra tanto en dosis de estimulación previa como de refuerzo. Se espera que la serie inicial incluya varias dosis que será espaciadas varias semanas con dosis de refuerzo adicionales espaciadas meses o años, o el tiempo en el cual los niveles de anticuerpo circulante caigan a un nivel deseado en el cual se haya demostrado clínicamente la correlación con tasas de abandono mejoradas. Preferentemente, la composición de vacuna de la presente invención se administra en forma de una serie final de 3 a 6 dosis administradas durante 6 a 24 semanas y dosis de refuerzo que se administran cada 3 a 12 meses después.
La composición de vacuna de la presente invención se puede administrar por ruta parenteral, por ejemplo vía inyección intramuscular (IM), intradermica (ID) o subcutánea (SC), o, si se usa el dispositivo apropiado, mediante administración tópica sobre la piel (transdérmica) o sobre una superficie de mucosa.
En determinadas realizaciones, los conjugados de hapteno y vehículo y/o las vacunas de la invención se pueden administrar intradérmicamente (ID) a través del uso de dispositivos de microaguja. En un aspecto, la invención proporciona un dispositivo de microaguja que comprende una o más microagujas que se encuentran revestidas con, contienen o resultan eficaces para suministrar el conjugado de vehículo-hapteno derivado de nicotina o la composición de vacuna de la invención. En determinadas realizaciones, la microaguja o las microagujas se pueden preparar en forma de parches en los que las microagujas simplemente permiten una administración cutánea no invasiva. Otro aspecto de la invención contempla el uso de una tecnología de microaguja para el suministro del conjugado de vehículo-hapteno derivado de nicotina o la composición de vacuna de la invención.
Las tecnologías de suministro de microaguja pueden facilitar el suministro de composiciones de vacuna que contienen un conjugado de vehículo-hapteno derivado de nicotina a profundidades específicas y deseadas de la piel usando conjuntos de agujas cortas (por ejemplo, de longitud menor que 4 mm). Dichas microagujas atraviesan el estrato córneo y las capas subyacentes de la epidermis para suministrar directamente el fármaco en el interior de la epidermis o de la dermis adyacente. Debido al pequeño tamaño de las microagujas, la aplicación no supone dolor y da lugar a un sangrado o reacción en el punto de aplicación mínimos (si lo hay). En el presente documento, el término "microaguja" se refiere a una estructura alargada que es suficientemente larga para penetrar a través del estrato córneo de la capa de la piel y en el interior de la capa epidérmica/dérmica, pero suficientemente corto como para no dar lugar a dolor considerable debido a la activación de las terminaciones nerviosas.
Las microagujas que facilitan el suministro transdérmico se describen en Prausnitz, Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004) 581-587; Zahn et al., Biomed. Microdevices 6 (2004) 183-190; Shirkhanden J. Materials Sci. 16 (2005) 37-45; Park, J. Controlled Reléase 104 (2005) 51-66; las patentes de Estados Unidos Nos. 3.964.482, 6.503.231 , 6.745.211 ; 6.61 1.707; 6.334.856 y las solicitudes de patente de Estados Unidos Nos. de publicación 2005/0209565, 2004/0106904, 2004/01864 9, 2002/0193754 y 2010/0196445; todas ellas incorporadas en su totalidad en el presente documento por referencia. Se han fabricado microagujas apropiadas a partir de muchos materiales, incluyendo silicio, metales y polímeros. Davis et al., describen la mecánica de inserción de la microaguja en la piel (Davis et al., J. Biomech. 37 (2004) 1155-1 63).
Se pueden usar microagujas sólidas o huecas en las realizaciones descritas en el presente documento. En una realización, las microagujas para usarse en la invención son sólidas. Por ejemplo, se pueden preparar canales atravesando la piel con un conjunto de microagujas, seguido de la retirada de las agujas y la posterior aplicación del fármaco (véase, por ejemplo, Martanto et al., Pharm. Res. 21 (2004) y McAllister et al., PNAS 100 (2003) 13755-13760). La formulación que comprende el agente terapéutico de acuerdo con la invención se puede aplicar al punto tratado con la microaguja en forma de gel, hidrogel, crema de aplicación tópica, ungüento, pomada u otra formulación de aplicación tópica; y/o mediante el uso de dispositivos de suministro tales como vendas, curas oclusivas, parches y/o similares.
En otra realización, las microagujas sólidas (no porosas) se encuentran revestidas con un conjugado de vehículo-hapteno derivado de nicotina o composición de vacuna de acuerdo con la invención antes de su aplicación cutánea. Posteriormente, se atraviesa la epidermis usando las microagujas, que se mantienen en contacto con la superficie de la piel durante un periodo de tiempo suficiente, permitiendo la difusión del conjugado de hapteno-vehiculo o composición de vacuna en el interior del tejido cutáneo de los alrededores. (Para la administración de un agente terapéutico de este modo véase Prausnitz, Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004) 581 -587). En otra realización, se usan microagujas huecas (porosas), que contienen conductos que permiten el almacenamiento de los conjugados de hapteno-vehiculo o de la composición de vacuna de la invención. Tras la aplicación cutánea, el conjugado de hapteno-vehiculo o la composición de vacuna penetra en el interior del tejido cutáneo por medio de difusión o flujo inducido por presión. (Para la administración de un agente terapéutico de este modo, véase Zahn et al., Biomed. Microdevices 6 (2004) 183-190).
En otra realización, al contrario que las tecnologías convencionales de aguja hueca, determinados aspectos de la invención se refieren a microagujas formadas a partir de una matriz sólida de material susceptible de solución y/o biodegradable que se puede usar para suministrar las composiciones de vacuna de la invención. Para ejemplos de microagujas sólidas véanse las solicitudes de patente publicadas Nos. 6.945.952, 7.61 1.481 , 2002/0082543, 2005/0197308 y 2008/0269685, todas ellas describen conjuntos de microagujas fabricadas de polímeros bio-degradables y se incorporan en su totalidad por referencia.
En determinadas realizaciones, las microagujas pueden estar formadas por materiales que se hinchan y/o disuelven de forma rápida, incluyendo materiales poliméricos termo-conformables de origen natural y/o sintético. En determinadas realizaciones, las microagujas sólidas se pueden formar a partir de polímeros bio-compatibles y bio-degradables tales como poli(lactida)s, poli(glucolide)s, poli(lactida-co-glucolide)s, polianhídridos, poliortoésteres, poli-éter-ésteres, policaprolactonas, poli-éster-amidas, poli(ácido butírico), poli(ácído valérico), poliuretanos y copolímeros y sus mezclas. En otras realizaciones, las microagujas sólidas se pueden conformar a partir de polímeros no bio-degradables tales como poliacrilatos, polímeros de etileno-acetato de vinilo y otros acetatos de celulosa con sustitución acilo, poliuretanos no degradables, poliestirenos, poli(cloruro de vinilo), poli(fluoruro de vinilo), poli(vinil imidazol), poliolefinas de clorosulfonato, poli(óxido de etileno), mezclas y sus copolímeros.
Las microagujas se pueden usar solas o en conjunto de más de una microaguja. Varios tamaños de conjunto resultan apropiados para usarse en la invención. En una realización, se usan 1 -10 microagujas. En otras realizaciones, se usa un conjunto de microagujas que comprende 10-25, 10-50, 25-50, 25-200, 25-100 o 50-100 agujas. El conjunto de microagujas puede variar sobre la base de varios factores, incluyendo pero no limitándose a, longitud, diámetro, distancia entre agujas, finura y número total de microagujas usado. En una realización ejemplar, el conjunto de microagujas comprende una matriz de 10 x 10. En otra realización, el conjunto de microagujas comprende una matriz de 20 x 20. En algunas realizaciones, la distancia entre cada microaguja en el conjunto es de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 400 pm. En una realización, las dimensiones particulares del conjunto se escogen dependiendo de la mejora deseada de permeabilidad de la piel.
En algunas realizaciones, la microaguja tiene una longitud de 20 µ?t? a aproximadamente 1000 pm, por ejemplo de aproximadamente 50 pm a aproximadamente 150 pm, o de aproximadamente 150 pm a aproximadamente 500 pm, o de 500 pm a aproximadamente 1000 pm, o de 600 pm a aproximadamente 800 pm. En otra realización, la microaguja tiene una longitud de aproximadamente 50, 100, 250, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 µ?t?. En otra realización, la longitud de la microaguja es de aproximadamente 50, 100, 250, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 pm. En otras realizaciones, la longitud de la microaguja es menor que 50, 100, 250, 500, 600, 700, 800 900 o 1000 pm. En una realización, la longitud de la microaguja es de aproximadamente 700 pm. En algunas realizaciones, la microaguja penetra en la piel una profundidad de aproximadamente 400 pm hasta aproximadamente 700 pm. En una realización, la microaguja penetra en la piel a una profundidad que corresponde aproximadamente a la parte inferior del estrato córneo. En otra realización, la microaguja penetra en la piel hasta aproximadamente la parte superior de la capa dérmica. En otras realizaciones, la microaguja penetra en la piel hasta una profundidad de aproximadamente entre la parte inferior del estrato córneo y la parte superior de la capa dérmica. La microaguja puede presentar cualquier variedad de diámetros según sea necesario para mantener su eficacia. En algunas realizaciones, el diámetro externo de la microaguja puede ser de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 100 pm. En otra realización, el diámetro externo de la microaguja puede ser de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 50 pm. El diámetro interno de la microaguja hueca puede ser de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 70 pm en algunas realizaciones. Además, los diámetros externo o interno de las microagujas pueden ser de hasta 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 pm. Se puede usar cualquier combinación de dimensiones de microaguja según sea necesario, con los sistemas y los procedimientos descritos en el presente documento.
Se puede fabricar una microaguja a partir de varios materiales, incluyendo pero no limitándose a, silicio, un metal, un polímero y vidrio. En algunas realizaciones, se usan microagujas de silicio. Las microagujas de silicio, tanto sólidas como huecas, se pueden grabar a partir de láminas de silicio. Por ejemplo, se marca la ubicación de cada microaguja y se graba el silicio que rodea, dando lugar a un conjunto de microagujas unidas a una base común. En algunas realizaciones, el espesor de la lámina de silicio es de aproximadamente 300-600 µ?t?.
En otras realizaciones, las microagujas son de metal, incluyendo pero no limitándose a, níquel, titanio y aleaciones tales como acero inoxidable. En algunas realizaciones, las microagujas de metal están fabricadas a partir de moldes de epoxi que posteriormente se someten a electro-deposición con un metal escogido, al tiempo que el molde epoxí es posteriormente grabado. La microagujas resultantes pueden ser re-utilizables o desechables. Las microagujas también se pueden obtener a partir de fuentes comerciales, incluyendo Zosano Pharma, Inc., Corium y 3M. Ambos, Zosano y 3M, han desarrollado parches que contienen microagujas revestidas. Corium ha desarrollado microagujas bio-degradables. 3M ha desarrollado microagujas huecas (por ejemplo lntanza®/Dflu®).
El conjugado de hapteno-vehiculo o la composición de vacuna se puede aplicar a las microagujas usando una variedad de procedimientos. En una realización, se prepara una solución que comprende el conjugado de hapteno-vehiculo o la composición de vacuna y se deposita sobre o en el interior de las microagujas, seguido de secado de la solución. De manera alternativa, el microconjunto se sumerge en una solución que comprende el conjugado de hapteno-vehiculo o la composición de vacuna, dando lugar al revestimiento de las microagujas con el conjugado de hapteno-vehiculo o la composición de vacuna. Cuando es preciso revestir proteínas adicionales o componentes sobre o en el interior de las microagujas de la invención, se pueden llevar a cabo etapas adicionales de revestimiento. De manera alternativa, se mezclan varios o todos los componentes de la solución en el interior de una solución que posteriormente se deposita sobre o en el interior de la microaguja. Se puede usar revestimiento de inmersión en baño, revestimiento por pulverización u otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en PCT Pub. N°.WO 2006/138719, que se incorpora en su totalidad por referencia. Los revestimientos pueden ser sólidos o semi-sólidos.
La cantidad de proteína portadora de hapteno-conjugado en cada dosis de vacuna se escoge como cantidad que induce una respuesta inmuno-protectora sin que se produzcan los efectos secundarios no deseados importantes de las vacunas típicas. Intervalos de dosificación apropiados son de 0.01 a 0 mg/dosis, preferentemente de 0.1 a 1.0 mg/dosis. Generalmente, una persona tarde dos semanas o más en generar los anticuerpos frente a un antígeno extraño tras una única dosis de una vacuna, y generalmente se requieren varias dosis de vacuna administradas durante varias semanas para inducir niveles elevados de anticuerpos de forma sostenida tal como los que se desean para una vacuna anti-nicotina para contribuir al abandono de la práctica de fumar. La producción de anticuerpos en la sangre de una persona se puede controlar usando técnicas que son bien conocidas por el experto artesano, tal como ELISA, radio-inmunoensayo, resonancia de plasma superficial y procedimientos de inmuno-electrotransferencia.
De esta forma, en un sexto aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de hapteno-vehículo o a una composición de vacuna como se ha definido anteriormente, para usarse como un medicamento.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de hapteno-vehículo o a una composición de vacuna como se ha definido anteriormente, para usarse con el fin de aumentar las tasas de abandono y disminuir las tasas de recaída en fumadores que desean abandonar el hábito, en ex-fumadores para evitar la recaída o para la prevención de la adicción a la nicotina.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de vehículo-hapteno derivado de nicotina, o a una composición de vacuna, como se ha definido anteriormente, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o la prevención de la dependencia nicotínica en una persona que requiere dicho tratamiento.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de vehículo-hapteno derivado de nicotina o a una composición de vacuna, como se ha descrito anteriormente, para usarse en el tratamiento o prevención de la adicción nicotínica en una persona que requiere dicho tratamiento.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento que sirva de ayuda para abandonar la práctica de fumar en fumadores que desean hacerlo, o evitar la recaída en fumadores que quieran abandonar la práctica, o evitar la adicción nicotínica en personas que están expuestas al humo o a la nicotina de otra fuente, comprendiendo el procedimiento administrar a la persona una cantidad eficaz de un conjugado de hapteno-vehículo o de una composición de vacuna, como se ha definido anteriormente.
En una realización, el procedimiento además comprende administrar a la persona otro producto para dejar de fumar que no es una vacuna. Productos apropiados incluyen productos de fármaco-terapia que actúan sobre los receptores de acetilcolina nicotinicos, tal como vareniclina o bupropion, de manera opcional en forma de liberación prolongada. Otros productos que se pueden usar en el procedimiento de la invención incluyen clonidina y nortriptilina. Productos adicionales apropiados incluyen productos de terapia de sustitución de la nicotina (NRT), en forma, por ejemplo, de parche (16 h y 24 h), chicle, pulverizador nasal o inhalador.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar el conjugado de hapteno y vehículo de acuerdo con la invención, que comprende acoplar una proteína portadora opcionalmente modificada con el hapteno de acuerdo con la invención o con el conjugado de hapteno-vehículo de acuerdo con la invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un conjugado de hapteno y vehículo de fórmula (III): en el que W es -CH2- o -O-; -(espaciador)- es un grupo alquileno C C8, un grupo cicloalquileno C3-C10 o un grupo alquileno C1-C12 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno y de manera opcional interrumpido por un -N(H)C(0)-; X* es -NH-; m es 0 o 1 ; n es un número entero de 1 a 1000; e Y es una proteína portadora opcionalmente modificada que se escoge entre toxoides, sustancias inmunogénicas, virsus, partículas similares a virus, complejos de proteínas, proteínas, polipéptidos, liposomas y complejos inmuno-estimuladores; que comprende tratar una proteína portadora opcionalmente modificada con sulfo-N-hidroxisuccinimida, seguido de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, posteriormente añadir bien un hapteno de fórmula (I): en la que W es -CH2- o -O-; y X es -NH2; o un conjugado de hapteno-espaciador de acuerdo con la fórmula (II): X-(espaciador) N \ CH3 (II) en la que W es -CH2- o -O-; -(espaciador)- es un grupo alquileno C^Cs, un grupo cicloalquileno C3-C10 o un grupo alquileno Ci-C 2 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno e interrumpido de manera opcional por un -N(H)C(0)-, y X es -NH2.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una procedimiento para preparar un conjugado de fórmula (III): en el que W es-CH2- o -O-; -(espaciador)- es un grupo alquileno CrCs, un grupo cicloalquileno C3-C10 o un grupo alquileno C1-C12 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno e interrumpido de manera opcional por un -N(H)C(O)-; X* es -NH-; m es 0 o 1 ; n es un número entero de 1 a 1000; e Y es una proteína portadora opcionalmente modificada que se escoge entre toxoides bacterianos, sustancias inmunogénicas, virsus, partículas similares a virus, complejos de proteína, proteínas, polipéptidos, liposomas y complejos inmuno-estimuladores; que comprende tratar una proteína portadora con anhídrido succínico para dar una proteína portadora succinilada; tratar la proteína portadora succinilada con sulfo-N-hidroxisuccinimida, seguido de hidrocloruro de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, posteriormente añadir bien un hapteno de fórmula (I): en la que W es -CH2- o -O-; y X es -NH2; o un conjugado de hapteno-espaciador de acuerdo con la fórmula (II): X-(espaciador) ("O en la que W es -CH2- o -O-; -(espaciador)- es un grupo alquileno C Ce, un grupo cicloalquileno C3-C 10 o un grupo alquileno C C12 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxigeno e interrumpido de manera opcional por un -N(H)C(0)-; y X es -NH2.
Ensayos biológicos ELISA de anticuerpo de anti-nicotina Se cuantificaron los niveles de anticuerpos de anti-nicotina en plasma de ratón usando un ensayo de ELISA como se muestra a continuación. Dado que la molécula de nicotina no resulta apropiada para el revestimiento de pocilios ELISA, se unió a una molécula de gran tamaño (albúmina de suero bovino) con propiedades bio-adhesivas. Se conjugó el derivado de nicotina (rac-trans3'-tio metil nicotina) con la albúmina de suero bovino y el conjugado obtenido nicotina-BSA se usó para revestir pocilios de Maxi-Sorp ELISA de 96 pocilios (VWR) (100 µ?/pocillo) a una concentración final de 1 pg/ml, en tampón de carbonato (Sigma-Aldrich) y se incubó durante la noche a 4°C. Posteriormente se sometieron las pocilios a aspirado y se lavaron con solución salina de tampón de fosfato que contenía 0.05% Tween® 20 (Sigma-Aldrich, P3563). Se bloquearon las pocilios con 200 µ? de solución de bloqueo (tampón de carbonato + 10% de suero de cria bovina, Fisher) a 37°C durante 1 h y posteriormente se lavaron como anteriormente. Se diluyeron de forma seriada las muestras y el plasma de referencia en el tampón de dilución (1X PBS con 0.05% Tween® 20 + 10% BCS) y se añadieron a las pocilios (100 µ?/pocillo). Se incubaron las pocilios a 37°C durante 2 horas. Se lavaron de nuevo y se incubaron otra vez con IgG-HRP anti-ratón de cabra (Southern Biotech), diluido con tampón de dilución (1X PBS con 0.05% Tween® 20 + 10% BCS) durante 1 hora a 37°C. Posteriormente se lavaron las pocilios de nuevo y se incubaron con substrato de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD) (1 x 5 mg de comprimido de OPD disuelto en tampón de citrato y fosfato, Sigma-Aldrich) en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción mediante la adición de 50 µ? de ácido sulfúrico 4N (VWR) a cada pocilio y se registró la lectura a 450 nm usando un lector de pocilio automático. Se cuantificaron las muestras como la dilución de plasma más elevada que dio lugar a un valor de absorbancia de anticuerpo (OD 450) dos veces mayor que el valor de plasma no inmune, con un valor de corte de 0.05.
Medición de la avidez de los anticuerpos anti-nicotina Se midió la avidez de los anticuerpos anti-nicotina usando un procedimiento ELISA con elución de tiocianato de amonio como se muestra a continuación. Se revistieron pocilios ELISA Inmuno Maxi-Sorp de 96 pocilios (VWR) (100 µ?/pocillo) con solución de antígeno nicotina-BSA a una concentración de 1 pg/ml en tampón de carbonato (Sigma-Aldrich) y se incubó durante la noche a 4°C. Se lavaron las pocilios con solución salina de tampón de fosfato (PBS) que contenía 0.05% Tween® 20 (Sigma-Aldrich) y posteriormente se bloquearon con 200 µ? de tampón de carbonato + 10% suero de cría bovina (Fisher) durante 1 hora a 37°C. Se lavaron las pocilios de nuevo. Se diluyeron las muestras de plasma, cuyo contenido en anticuerpos anti-nicotina se había determinado previamente, en PBS que contenía 0.05% Tween® 20 10% de suero de cría bovina (BCS) para conseguir valores de absorbancia de anticuerpos de aproximadamente 1.0 a 450 nm, y posteriormente se añadieron a las pocilios a 100 µ?/pocillo. Se incubaron las pocilios durante 2 horas a 37°C y posteriormente se lavaron. A continuación, se llevó a cabo la elución añadiendo tiocianato de amonio (NH4SCN) (100 µ?/pocillo) en concentraciones que variaron de 0 a 2.0M diluido en PBS/0.05% Tween® 20 y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente se lavaron las pocilios y se detectó la unión de anticuerpo usando IgG-HRP anti-ratón de cabra (Southern Biotech) diluido con tampón de dilución (1 x PBS con 0.05% Tween® 20 + 10% BCS) durante 1 hora a 37°C. Posteriormente se lavaron las pocilios de nuevo y se incubaron con substrato de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD) (1 x 5 mg de comprimido de OPD disuelto en tampón de citrato y fosfato, Sigma-Aldrich) en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción mediante la adición de 50 µ? de ácido sulfúrico 4N (VWR) a cada pocilio y se registró la lectura a 450 nm usando un lector de pocilio automático. Posteriormente se expresaron los resultados como disminución del porcentaje de unión de antigeno-anticuerpo (% de disminución de OD) en presencia de NH4SCN y se representó en un diagrama frente a la concentración molar de NH4SCN. Se calculó el índice de avidez como la concentración de NH4SCN necesaria para producir una disminución de 50% en la unión.
Evaluación de la distribución de nicotina en plasma y cerebro Se determinó el efecto de inmunización sobre la distribución de nicotina en plasma y en cerebro administrando a los animales (pre-inmunizados con vacuna de anti-nicotina) 0.05 mg/kg de hidrogeno tartrato de nicotina (-) que contenía 3 pCi de nicotina-3H en 100 µ? de PBS durante 10 segundos por medio de venoclisis final. Se obtuvo sangre 5 minutos después por medio de inyección cardiaca y se recogió plasma. Se sometió el ratón a perfusión de forma inmediata con PBS mediante inyección de 20 mi en el interior del ventrículo izquierdo del corazón durante 1 a 2 minutos y se recogió el cerebro y se pesó. Se sometió a digestión el cerebro a = 50°C durante 72 horas en 1 mi de tampón de digestión (cloruro de sodio 100 mM, Tris 25 mM, EDTA 25 mM, Igepal 0.5% CA-630 y 0.3 mg/ml de proteinasa K por cada 100 mg de tejido). Se mezclaron alícuotas de 100 µ? de fracción digerida de cerebro o de plasma con 5 mi de fluido de centelleo líquido y se determinaron los niveles de nicotina radio-marcada por medio de conteo por centelleo líquido.
ELISA de competición para determinar la especificidad de anticuerpos inducida por vacunas de nicotina Se determinó la especificidad de anticuerpos anti-nicotina usando ELISA de competición como se muestra a continuación. Se revistieron pocilios de ELISA Imuno Maxi-Sorp de 96 pocilios (VWR) (100 µ?/pocillo) con solución de nicotina-antígeno BSA a una concentración de 1 g/ml en tampón de carbonato (Sigma-Aldrich) y se incubó durante la noche a 4°C. Se lavaron las pocilios con solución salina de tampón fosfato (PBS) que contenía 0.05% Tween® 20 (Sigma-Aldrich), se bloquearon con 200 µ? de tampón de carbonato + 10% de suero de cría bovina (Fisher) durante 1 hora a 37°C y posteriormente se lavaron de nuevo. Durante esta incubación, se diluyeron las muestras de plasma, cuyo contenido en anticuerpos anti-nicotina se había determinado previamente, en PBS que contenía 0.05% Tween® 20 + 10% de suero de cría bovina (BCS) para conseguir los valores óptimos de absorbancia de anticuerpos de aproximadamente 1.0 a 1.5, a 450 nm, y se diluyeron de forma seriada distintos inhibidores (nicotina, cotinina, acetilcolina, vareniclina) comenzando a 20.000 µ?. Se añadieron volúmenes iguales (65 µ?) de las muestras diluidas y del inhibidor escogido a los pocilios de una pocilio de 96 pocilios no revestida y se permitió la incubación durante 1 hora a 37°C. Tras la incubación, se añadieron las mezclas de plasma/inhibidor, con una concentración de 100 µ?/pocillo, a las pocilios revestidas con nicotina-BSA sometidas a bloqueo previamente. Se incubaron las pocilios durante 30 minutos a 37°C y posteriormente se lavaron de nuevo. Se detectó la unión de anticuerpo usando un IgG-HRP anti-ratón de cabra (Southern Biotech) diluido con tampón de dilución (1 x PBS con 0.05% Tween® 20 + 10% BCS) durante 1 hora a 37°C. Posteriormente se lavaron las pocilios de nuevo y se incubaron con substrato de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD) (1 x 5 mg de comprimido de OPD disuelto en tampón de citrato y fosfato, Sigma-Aldrich) en oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción por medio de la adición de 50 µ? de ácido sulfúrico 4N (VWR) a cada pocilio y se registró la lectura a 450 nm usando un lector de pocilio automático. Las lecturas de OD a 450 nm se representaron gráficamente frente a la concentración molar de inhibidor y se extrapoló la inhibición de 50% para cada muestra sometida a ensayo.
EJE PLIFICACIÓN La presente invención se ilustra por medio de, pero no limitándose a, las siguientes preparaciones y ejemplos, en los cuales se usan las siguientes abreviaturas: En todos los casos el espectro 1H RMN resultó coherente con las estructuras propuestas. Los cambios químicos característicos (d) se aportan en partes por millón a partir de tetrametilsilano usando abreviaturas convencionales para la designación de los picos principales: por ejemplo, s, singlete; d, doblete; t, triplete; q, cuartete; m, multiplete; a, ancho; ma, multiplete ancho; ta, triplete ancho.
CLEM, a menos que se especifique lo contrario, se llevó a cabo en las siguientes condiciones: columna Waters x Bridge C18 5 nm x 2.1 x 30 mm, 0: 100 a 95:5 durante 3.1 min, MeCN: (10mM (NH4)2HCO3 ac).
Preparaciones Preparación 1 : (S)-3-bromo-5-(1-metilpirrolidin-2-il)piridin (o 5-bromonicotina) Se preparó este compuesto siguiendo el procedimiento descrito en J. Am. Chem. Soc, 2007, 50, 15434-15435.
Se disolvió bis(pinacolato)diboro (7.16 g, 28.21 mmol) en 1 ,4-dioxano (60 mi) se desgasificó burbujeando argón. Se añadió (S)-(-)-nicotina (6.48 mi, 40.3 mmol), seguido de 4,4'-di-terc-butil-2,2'-dipiridilo (650 mg, 2.42 mmol). Se continuó la desgasificación durante 10 min y posteriormente se añadió dimero de metoxi(cicloocatadien)iridio(l) (753 mg, 1.21 mmol). Se calentó la mezcla de reacción a temperatura de reflujo durante 18 horas. Se evaporó el disolvente y se disolvió el residuo en MeOH (100 mi). Se añadió bromuro de cobre (II) (27.0 g, 120.9 mmol) en agua (100 mi) y se calentó la mezcla de reacción a 80°C durante 3 horas. Se añadió solución de amoníaco (10% ac, 100 mi) a la mezcla de reacción y posteriormente se sometió a extracción con acetato de etilo y se secó sobre MgSO4. Se evaporó el disolvente y se purificó el producto bruto por medio de cromatografía instantánea (5% MeOH en DCM) para dar el compuesto del título en forma de aceite de color naranja (6.14 g, 63%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1 .68-1.70 (m, 1 H), 1 .80-1.82 (m, 1 H), 1.92-1.94 (m, 1H), 1.99-2.02 (m, 1H), 2.03 (2, 3H), 2.20-2.34 (m, 1 H), 3.08 (t, 1 H), 3.20 (t, 1H), 7.86 (s, 1 H), 8.42 (s, 1 H), 8.54 (s, 1 H).
Preparación 2j (S)-3-(5-(1-metilpirrolidin-2-¡l)piridin-3- ¡Dacrilonitrilo Mediante burbujeo de argón, se desgasificó una mezcla de (S)-3-bromo-5-(1 -metilpirrolidin-2-il)piridina (preparación 1 ) (300 mg, 1.24 mmol), acetato de paladio (II) (14 mg, 0.06 mmol), tri(o-tolil)fosfina (75 mg, 0.25 mmol) y trietilamina (0.35 mi, 2.48 mmol) en MeCN (10 mi). A continuación se añadió acrilonitrilo (0.12 mi, 1.87 mmol) y se calentó la mezcla de reacción a temperatura de reflujo durante 18 horas. Se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente, se filtró a través de Celite, y se evaporaron los disolventes para dar lugar a un sólido de color marrón. Se purificó el producto bruto por medio de cromatografía instantánea (2%[20% amoníaco en MeOH] en DCM) para dar el compuesto del título en forma de aceite de color rojo-marrón (188 mg, 71%, mezcla de isómeros c/'s y trans).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.60-1.79 (m, 1H), 1.80-1.90 (m, 1H), 1.90-2.04 (m, 1H), 2.17 y 2.19 (2xs, 3H), 2.16-2.40 (m, 2H), 3.11-3.30 (m, 2H), 5.57 y 6.00 (2xd, 1H), 7.16 y 7.40 (2xd, 1H), 7.80 y 8.26 (2xs, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.60 y 871 (2xs, 1H).
Preparación 3: (S)-3-(5-(1-metilpirrolidin-2-il)piridin-3-il)propanonitrilo Se agitaron en atmósfera de hidrógeno durante 72 horas (S)-3-(5-(1-metilpirrolidin-2-il)piridin-3-il)acrilonitrilo (preparación 2) (185mg, 0.87 mmol) y Pd/C 5% (50 mg) en MeOH (5 mi). Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y se evaporó el disolvente. Se purificó el producto bruto por cromatografía instantánea (5% [20% de amoníaco en MeOH] en DCM) para dar el compuesto del título en forma de aceite de color amarillo claro (141 mg, 75%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.66-1.78 (m, 1H), 1.78-1.89 (m, 1H), 1.89-2.02 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.17-2.25 (m, 1H), 2.31 (q, 1H), 2.65 (t, 2H), 2.97 (t, 2H), 3.10 (t, 1H), 3.24 (t, 1H), 7.61 (d, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.44 (s, 1H).
Preparación 4: (S)-3-(5-(1 -metilpirrolidin-2-il)piridin-3-il)propan-1 -arnina Se agitaron a una presión de 344.74 kPa de hidrógeno, 50°C durante 4 horas (S)-3-(5-(1 -metilpirrolidin-2-¡l)piridin-3-¡l)propanonitrato (preparación 3) (140 mg, 0.65 mmol) y níquel Raney (50 mg) en amoníaco 20% en MeOH (50 mi). Se filtró la mezcla de reacción a través de Celite y posteriormente se evaporó el disolvente. Se purificó el producto bruto por medio de cromatografía instantánea (7%[amoniaco 20% en MeOH]en DCM) para dar el compuesto del título en forma de aceite de color amarillo claro (126 mg, 88%).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) d = 1 .70-1 .85 (m, 3H), 1 .85-2.03 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.35 (q, 2H), 2.59-2.78 (m, 4H), 3.12-3.37 (m, 2H), 7.70 (s, 1 H), 8.31 (sa, 2H).
CLEM: 1 .91 min (97%), m/z = 220.16 [M+H]+ Preparaciones 5 y 6: (S)-2-cloro-5-(1 -metilpirrolidin-2-il)piridina (o 6-cloronicotina) y (S)-2-cloro-3-(1 -metilpirrolidin-2-il)piridin (o 2-cloronicotina) Se prepararon estos compuestos siguiendo el procedimiento descrito en Eur. J. Org. Chem., 2006, 3562-3565.
Se añadió butil-litio (2M en hexanos, 83 mi, 166 mmol) a una solución de dimetilaminoetanol (9.3 mi, 92.5 mmol) en hexanos (70 mi) a -20°C. Se añadió (S)-(-)-n¡cotina (5.0 g, 30.8 mmol) en hexanos (30 mi) y se agitó la mezcla de reacción a -20°C durante 1 hora. Posteriormente se enfrio la solución de color verde hasta -78°C y se añadió hexacloroetano (29.1 g, 123 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante 30 min a -78°C, se enfrió mediante la adición de cloruro de amonio (ac. Sat.). Se añadieron DCM y HCI 2M (ac). Se lavó la fase acuosa con DCM (x2) y posteriormente se elevó el pH mediante al adición de hielo/amoníaco (ac). Se sometió a extracción la fase acuosa con DCM (x2), se secó sobre MgS04 y se evaporó. Se purificaron los productos brutos por medio de cromatografía instantánea (acetato de hexilo 20% en hexanos) para dar 6-cloronicotina (preparación 5) (2.2 g, 36%) y 2-cloronicotina (preparación 6) (120 mg, 2%), ambos en forma de aceites de color amarillo. 6-cloronicotina: RMN H (300 MHz, CDCI3) d = 1.58-2.01 (m, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.10-2.23 (m, 1 H), 2.28 (q, 1 H), 3.05 (t, 1 H), 3.19 (dt, 1 H), 7.26 (d, 1 H), 7.64 (dd, 1 H), 8.27 (d, 1 H). 2-cloronicotina: RMN H (300 MHz, CDCI3) d = 1.45-1.60 (m, 1 H), 1.76-1.98 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 2.31-2.49 (m, 2H), 3.24 (t, 1 H), 3.55 (t, H), 7.20-7.29 (m, H), 7.93 (d, H), 8.2 (dd, 1 H).
Preparación 7: (S)-2-(5-(1 -metilpirrolidin-2-il)piridin-2-iloxQetanamina Se añadió hidruro de sodio (60% en aceite, = 500 mg) a 6-cloronicotina (preparación 5) (690 mg, 3.5 mmol) en etanolamina (3 mi). Tras 15 min a temperatura ambiente se calienta la mezcla de reacción a 80°C durante 16 horas. Se sometió a partición la mezcla de reacción entre acetato de etilo y agua. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo, se secó sobre MgS04 y se evaporó. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía instantánea (5% [20% de amoníaco en MeOH] en DCM] para dar el compuesto del título en forma de aceite incoloro (44 mg, 6%).
RMN H (400 MHz, CD3OD) d = 1.70-2.00 (m, 3H), 2.17 (s, 3H) 2.17-2.23 (m, 1 H), 2.31 (q, 1 H), 2.99 (t, 2H), 3.09 (t, 1 H), 3.20 (t, 1H), 4.26 (t 2H), 6.83 (d, 1 H), 7.68 (d, 1 H), 8.02 (d, 1 H).
CLEM: 2.02 min (100%), m/z = 222.1 [M+H]+ Preparación 8j (S)-2-(3-(1-metilpirrolidin-2-il)piridin-2-iloxi)etanamina Se añadió hidruro de sodio (60% en aceite, = 200 mg) a 2-cloronicotina (preparación 6) (120 mg, 0.61 mmol) en etanolamina (2 mi). Tras 15 min a temperatura ambiente se calienta la mezcla de reacción a 80°C durante 16 horas. Se sometió a partición la mezcla de reacción entre acetato de etilo y agua. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo, se secó sobre MgSO4 y se evaporó. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía instantánea (5% [20% de amoníaco en MeOH] en DCM] para dar el compuesto del título en forma de aceite incoloro (8.5 mg, 6%).
RMN 1H (400 MHz, CD3OD) d = 1.60-1.70 (m, 1 H), 1.81 -1.99 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.23-2.40 (m, 2H), 3.03 (t, 2H), 3.19 (t, 1 H), 3.53 (t, 1 H), 4.27-4.41 (m, 2H), 6.96 (d, 1 H), 7.74 (d, 1 H), 8.00 (d, 1 H).
CLEM: 2.03 min (99%), m/z = 222.1 [M+H]+ Preparación 9: (S)-3-(4-metoxibenciloxi)-5-(1-metilpirrolidin-2- ¡Qpiridina (Más isómero 4 ó 6) Se añadió hidruro de sodio (60% en aceite, 650 mg, 32.5 mmol) a alcohol 4-metoxibencilíco (1.4 g, 11.6 mmol) en DMF (10 mi). Tras 30 min a temperatura ambiente se añadió 5-bromonicotina (preparación 1) (1.4 g, 11.6 mmol) en DMF (2 mi). Se calentó la mezcla de reacción a 90°C durante 16 horas. Se sometió a partición la mezcla de reacción entre acetato de etilo y agua. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo, se combinaron las fase orgánicas, se secó sobre MgS04 y se evaporó. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía instantánea (2.5%? 5% MeOH en DCM) para dar el compuesto del título en forma de aceite de color amarillo, mezclado con ~ 30% de otro isómero (402 mg, 23%).
Preparación 10: (S)-5-(1-metilp¡rrolidin-2-il)piridin-3-ol (o 5-hidroxinicotina) Preparación 10a: Se agitó (S)-3-(4-metoxibenciloxi)-5-(1 -met¡lpirrolidin-2-¡l)piridina (preparación 9) (400 mg, 1.34 mmol) en ácido trifluoroacético (2 mi) y DCM (5 mi) durante 2 horas. Se evaporó la mezcla de reacción, posteriormente se co-evaporó con DCM (x5) y amoniaco 20% en MeOH. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía instantánea (10% MeOH en DCM) para dar el compuesto del título en forma de aceite de color amarillo (225 mg, 94%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 2.20-2.39 (m, 3H), 2.48-2.59 (m, 1 H), 2.76 (s, 3H), 3.83 (sa, 1 H), 4.38 (sa, 1 H), 7.42 (d, 1 H), 8.16 (s, 1H), 8.20 (s, 1 H).
CLEM: 1.26 min (100%), m/z = 179.1 [M+H]+ Preparación 10b: Se añadió (S)-nicotina (54 mi. 336.2 mmol) y 4.4'-di-tercbutil-2.2 -dipiridil (5.41 g. 20.2 mmol) sucesivamente a una solución de bis(pinacolato)diboro (59.8 g. 235.5 mmol) en 1 ,4-dioxano (218 mi) Se desgasificó la solución resultante a vacio, a temperatura ambiente, durante 15 a 20 minutos y posteriormente se liberó a nitrógeno. Se repitió el procedimiento dos veces más.
Se introdujo [lr(cod)(OMe)]2 (6.7 g, 10.1 mmol) en el recipiente de reacción y se desgasificó la mezcla de reacción a vacío, a temperatura ambiente, durante 5 minutos y se liberó a nitrógeno. Se repitió el procedimiento dos veces más.
Se calentó la solución resultante a 85°C durante 16 horas, después de lo cual el análisis de tiempo indicó la reacción completa. Se enfrió la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se concentró hasta sequedad a presión reducida, de 50 a 55°C. Se disolvió el residuo naranja resultante en tetrahidrofurano (740 mi) y se enfrió la solución hasta una temperatura de entre 0 y 5°C. Se introdujo ácido acético (52.1 mi, 908.8 mmol) en el recipiente, seguido de la adición lenta de una solución de agua oxigenada (30%, 43.1 mi, 454.4 mmol), manteniendo la temperatura entre 0 y10°C. Se agitó la mezcla resultante durante 16 horas a temperatura ambiente, tras lo cual el análisis de tiempo indicó la reacción completa.
Posteriormente se enfrió la mezcla de reacción hasta una temperatura de entre 0 y 5°C y se enfrió mediante la adición de una solución acuosa de metabisulfito de sodio (30%, 50 mi). Se ajustó el pH de la reacción mediante la adición de una solución de hidróxido de amonio concentrado (130 mi). Se separaron las fases de la mezcla bifásica resultante y se sometió a re-extracción la fase acuosa con tetrahidrofurano (300 mi). Se concentraron las fases orgánicas combinadas para dar lugar a un compuesto bruto en forma de goma de color naranja. Se purificó ésta mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (MeOH en DCM, de 5 a 20%) para retirar la mayoría de las impurezas, seguido de cromatografía en columna (100% THF) para retirar las impurezas isoméricas. Se aisló 5-hidroxinicotina pura en forma de sólido de color amarillo (26 g, 48% de rendimiento).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.70-2.05 (m, 4H), 2.21 (s, 3H), 2.31 (m, 1 H), 3.1 1 (t, 1 H), 3.25 (m, 1 H), 7.32 (d, 1 H), 8.01 (s, 1 H), 8.05 (s, 1 H).
Preparación 1 1 : (S)-terc-butil-2-(5-(1-metilpirrolidin-2-il)piridin-3-iloxi)etilcarbamato Se calentaron (S)-5-(1-metilpirrolidin-2-il)piridin-3-ol (preparación 10) (175 mg, 0.98 mmol), 2-bromoetilcarbamato de tere-butilo (550 mg, 2.45 mmol) y carbonato de potasio (676 mg, 4.9 mmol) en DMF (7 mi) a 90°C durante 16 horas. Se sometió a partición la mezcla de reacción entre acetato de etilo y agua. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo, se secó sobre MgSO4 y se evaporó. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía instantánea (5%?10% MeOH en DCM) para dar el compuesto del título en forma de aceite amarillo (108 mg, 34%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.42 (s, 9H), 1 .70-2.00 (m, -3H), 2.17 (s, 3H), 2.09-2.20 (m, 1 H), 2.20-2.30 (q, 1H), 3.15-3.26 (m, 2H), 3.45 (t, 2H), 4.08 (t, 2H), 7.43 (d, 1 H), 8.07 (s, 1 H), 8.13 (s, 1 H).
CLEM: 2.62 min (100%), m/z = 322.15 [M+H]+ Preparación 12: (S)-2-(5-( 1 -metilpirrolidin-2-il)piridin-3-iloxi)etanamina Preparación 12a: Se agitó (S)-terc-butil2-(5-(1-metilpirrolidin-2-il)piridin-3-iloxi)etilcarbamato (preparación 1 1) (105 mg, 0.33 mmol) en ácido trifluoroacético (1 mi) en DCM (5 mi) durante 1.5 h. Se evaporó la mezcla de reacción, posteriormente se co-evaporó con DCM (x5) y amoniaco al 20% en MeOH. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía instantánea (5%[20% amoníaco en MeOH] en DCM) para dar el compuesto del título en forma de aceite de color amarillo (62 mg, 85%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.70-2.01 (m, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.18-2.30 (m, 1 H), 2.30-2.40 (m, 1 H), 3.03 (t, 2H), 3.14-3.28 (m, 2H), 4.08 (t, 2H), 7.44 (d, 1 H), 8.08 (s, 1 H), 8.16 (s, 1 H).
CLEM: 1.87 min (100%), m/z = 222. 2 [M+H]+ Preparación 12b: se añadió metóxido de potasio (3.37 g, 46.2 mmol) en metanol (40 ml) a una solución de 5-hidroxinicotina (preparación 10b) (8.0 g, 44 mmol) en metanol (40 ml) a una temperatura entre 0 y 5°C. Se agitó la mezcla resultante durante 90 minutos y posteriormente se concentró hasta sequedad a presión reducida a 45°C.
Se calentó boc-1-amino-bromoetano (14.8 g, 66.0 mmol) en dimetil formamida (80 ml) hasta 50°C en presencia de nitrógeno y se añadió al recipiente la sal de potasio de 5-hidroxinicotina preparada anteriormente, seguido inmediatamente de carbonato de potasio (6.7 g, 48.4 mmol).
Se calentó la mezcla resultante a 85°C durante 4 horas y posteriormente se enfrió hasta temperatura ambiente. Se concentró a presión reducida a 50°C y se agitó la mezcla resultante de color naranja en 1 ,4- dioxano (50 mi) durante 15 minutos. Posteriormente se filtró la solución y se enfriaron los licores hasta una temperatura de entre 0 y 5°C, posteriormente se acidificó con HCI 4M en 1.,4-dioxano (65 mi). Se concentró la mezcla a presión reducida a 50°C y se disolvió el residuo resultante en tetrahidrofurano (30 mi). Posteriormente se enfrió la mezcla hasta una temperatura entre 0 y 5°C, se ajustó el pH con una solución de hidróxido de sodio (10M, 45 mi). Se separaron las fases de la mezcla bifásica resultante y se sometió a reextracción la fase acuosa con tetrahidrofurano (2 x 50 mi). Se concentraron las fases orgánicas combinadas para dar el compuesto bruto en forma de aceite de color rojo. Se disolvió el producto bruto en DCM y se agitó durante 10 minutos, posteriormente se filtró y se introdujeron los líquidos en una columna de sílice y se purificó eluyendo con metanol de 5 a 30% (que contiene hidróxido amonio 20%) en acetato de etilo. Se obtuvo el compuesto del título en forma de aceite de color amarillo, 7.15 g (73% de rendimiento) RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.65-1.80 (m, 3H), 1.85 (m, 1 H), 1.95 (m, 1 H), 2.19 (s, 3H), 2.21 (m, 1 H), 2.35 (q, 1 H), 3.12 (m, 3H), 3.28 (t, 1 H), 4.08 (t, 2H), 7.28 (s, 1 H), 8.15 (s, 1 H), 8.23 (s, 1 H).
Preparación 13: (trans-4-[(3-(5-[(2S)1-metilpirrolidin-2-inpiridin-3-il)propil)carbamoillciclohex¡llcarbamato de tere-butilo quiral Se trató una solución de 3-{5-[(2S)-1-metilp¡rrol¡din-2-¡l]piridin-3-il}propan-1 -amina (preparación 4) (100 mg, 0.45 mmol) en metiltetrahidrofurano (2 mi), con agitación, con ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano carboxílico (132 mg, 0.502 mmol) seguido de T3P (580 µ?, 0.91 mmol) y posteriormente Et3N (1 18 µ?, 0.91 mmol). Tras agitar durante 3 horas, se trató la solución con T3P (240 µ?, 0.38 mmol). Tras agitar durante 18 horas se concentró la solución a vacío, se disolvió el residuo con MeOH y se aplicó a un cartucho de SCX-2 que se eluyó con MeOH seguido de amoníaco en MeOH (=2M). Se concentraron las fracciones que contenían el producto a vacío y se purificó el residuo por medio de cromatografía en columna sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:MeOH:NH3 (gradiente de 1 :0:0 hasta 90:10:1 ) para dar el compuesto del título en forma de goma (130 mg, 64%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.04-1.14 (m, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.48-1.59 (m, 2H), 1.65-1.74 (m, H), 1.79-2.02 (m, 7H), 1.65-1.74 (m, H), 1.79-2.02 (m, 7H), 2.05-2.09 (ma, 2H), 2.13-2.22 (m, 4H), 2.26-2.33 (m, H), 2.60-2.64 (t, 2H), 3.04-3.08 (t, H), 3.20-3.30 (m, 3H), 3.40 (ma, H), 4.39 (ma, H), 5.56 (ta, H), 7.50 (t, H), 8.30-8.31 (d, H), 8.34-8.35 (d, H).
MS, m/z = 568 ES+ [M+H]+, 567 Cl [M+HJ+ Preparación 14: (19-{5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-inpiridin-3-il)-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azanonadec-1-il)carbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido 3-(2-{2-[2-(2-terc-butoxicarbonilamino-etoxi)-etoxi)-etoxi}-etoxi)propiónico en lugar de ácido trans-4-terc-butoxicarbonil-ciclohexan-carboxílico, para dar lugar a una goma de color amarillo claro (180 mg, 70%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.41 (s, 9H), 1.65-1.76 (m, H), 1.78-1.86 (m, 3H), 1.88-2.01 (m, H), 2.13-2.21 (m, 4H), 2.25-2.32 (m, H), 2.44-2.47 (t, 2H), 2.61-2.65 (t, 2H), 3.03-3.07 (t, H), 3.19-3.29 (m, 6H), 3.49-3.52 (t, 2H), 3.57-3.62 (m, 1 1 H), 3.70-3.73 (t, 2H), 5.21 (ma, H), 6.66 (ma, H), 7.51 (t, H), 8.30-8.31 (d, H), 8.33 (d, H).
MS, m/z = 445 ES+ [M+H]+, 445 Cl [M+H]+.
Preparación 15: (2-í(3-(5-r(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)propil)aminol-2-oxoetil)carbamato de tere-butilo quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido terc-butoxicarbonilamino-acético en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano carboxílico, para dar lugar a una goma de color amarillo pálido (133 mg, 77%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.45 (s, 9H), 1.66-1.77 (m, H), 1.79-1.90 (m, 3H), 1.91-2.02 (m, H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.34 (q, H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.04-3.09 (t, H), 3.21 -3.26 (m, H), 3.28-3.34 (m, 2H), 3.75-3.76 (d, 2H), 5.21 (ma, H), 6.29 (ma, H), 7.52 (t, H), 8.31 -8.32 (d, H), 8.34-8.35 (d, H).
MS, m/z = 377 ES+ [M+H]+, 377 Cl [M+H]+.
Preparación 16: (3-f (3-I5-K2S -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)propil)am¡nol-3-oxopropil)carbamato de tere-butilo quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido terc-butoxicarbonilamino-propiónico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar a una goma de color amarillo pálido (130 mg, 73%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.41 (s, 9H), 1.67-1.75 (m, H), 1.79-1.88 (m, 3H), 1.91-2.00 (m, H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.33 (q, H), 2.37-2.40 (t, 2H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.04-3.08 (t, H), 3.20-3.30 (m, 3H), 3.37-3.41 (q, 2H), 5.26 (ma, H), 6.00 (ma, H), 7.52 (t, H), 8.31-8.32 (d, H), 8.34 (d, H).
MS, m/z = 391 ES+ [M+H]+, 391 Cl [M+H]+.
Preparación 17: (4-f (3-(5-f(2S)-1 -metilpirrolidin-2-il1piridin-3-il)propillam¡no1-4-oxobutil)carbamato de tere-butilo quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido terc-butoxicarbonilamino-butanoico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxilico, para dar lugar a una goma de color amarillo pálido (140 mg, 76%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.40 (s, 9H), 1.64-1.72 (m, H), 1 74-1.87 (m, 5H), 1.87-1 .89 (m, H), 2.12-2.20 (m, 6H), 2.24-2.31 (q, H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.02-3.06 (t, H), 3.11-3.16 (q, 2H), 3.18-3.29 (m, 3H), 4.91 (ma, H), 6.57 (ma, H), 7.51 (t, H), 8.30 (d, H), 8.32 (d, H).
MS, m/z = 405 ES+ [M+H]+, 405 Cl [M+H]+.
Preparación 18: f2-(2-(2-í(3-(5-r(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)propil)amino1-2-oxoetoxi}etoxi)etillcarbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido [2-(2-terc-butoxicarbonilamino-etoxi)-etoxi]acético (preparado como se describe en Angew. Chemie. Int. Ed. (2006), 45(30), 4936-4940) en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar a una goma incolora (60 mg, 28%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.42 (s, 9H), 1.67-1.98 (m, 7H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.33 (q, H), 2.64-2.68 (m, 2H), 3.04-3.09 (t, H), 3.21-3.26 (m, H), 3.29-3.37 (m, 3H), 3.53-3.56 (t, 2H), 3.62-3.68 (m, 4H), 3.98 (s, 2H), 4.99 (ma, H), 6.88 (ma, H), 7.53 (t, H), 8.33 (d, H), 8.35 (d, H).
MS, m/z = 465 ES+ [M+H]+, 465 Cl [M+H]+.
Preparación 19: (2-(2-i(3-(5-f(2S)-1 -metilpirrolidin-2-il1piridin-3-il)propil)aminol-2-oxoetoxi)etil)carbamato de terc-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido (2-terc-butoxicarbonilamino-etoxi)-acético en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar a una goma incolora (105 mg, 55%). 2.31 (q, 4H), 2.66 (t, 1 H), 3.07 (t, 2H), 3.24 (t, 1H), m, 1 H), 3.32-3.37 (m, 4H), 3.56 (t, 2H), 3.94 (s, 2H), 4.98 (a, 1 H), 6.69 (a, 1 H), 7.54 (t, 1 H), 8.33-8.36 (m, 2H).
MS m/z=421 ES+ [M+H]+ Preparación 20: (5-[(3-(5-[(2S)-1-metilpirrolidin-2-il1piridin-3-illpropil)aminol-5-oxopentil|carbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-pentanoico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar a una goma de color amarillo pálido (191 mg, 64%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.43 (s, 9H), 1.47-1.53 (m, 2H), 1.63-1.75 (m, 3H), 1.80-1.89 (m, 4H), 1.94-2.05 (m, H), 2.16 (s, 3H), 2.16-2.23 (m, 2H), 2.31 (q, H), 2.65 (t, 2H), 3.07 (t, H), 3.14-3.16 (m, 2H), 3.22-3.30 (m, 3H), 5.30 (br, H), 5.80 (br, H), 7.53 (t, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).
MS m/z=420 ES+ [M+H]+ Preparación 21 : (6-[(3-(5-[(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)propil)amino)-6-oxohexil)carbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido 2-terc- butoxicarbonilamino-hexanoico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil- ciclohexano-carboxílico, para dar lugar a una goma de color amarillo pálido (197 mg, 50%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.32-1.37 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.46-1.54 (m, 2H), 1.61-1.69 (m, 2H), 1.69-1.77 (m, H), 1.81-1 89 (m, 5H), 1 .95-2.00 (m, H), 2.14-2.22 (m, 5H), 2.30 (q, H), 2.65 (t, 2H), 3.05-3.13 (m, 3H), 3.22-3.33 (m, 3H), 4.62 (a, H), 5.63 (a, H), 7.53 (t, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).
MS m/z=434 ES+ [M+H]+ Preparación 22: (7-f(3-(5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-il1piridin-3- il)propil)aminol-7-oxoheptillcarbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido 2-terc- butoxicarbonilamino-heptanoico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil- ciclohexano-carboxílico, para dar lugar a una goma de color amarillo pálido (204 mg, 55%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.31-1.35 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.44-1.49 (m, 2H), 1.60-1 .67 (m, 2H), 1.70-1.77 (m, H), 1.81 -1.89 (m, 5H), 1.94-1.99 (m, H), 2.13-2.23 (m, 5H), 2.30 (q, H), 2.65 (t, 2H), 3.05-3.12 (m, 3H), 3.22-3.33 (m, 3H), 4.37 (a, H), 5.68 (a, H), 7.53 (t, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).
MS m/z=448 ES+ [M+H]+ Preparación 23: (22-(5-i(2S 1-metilDirrolidin-2-illpihdin-3-il)-15. 18-dioxo-4,7, 10-trioxa-14, 19-diazadocos-1 -iDcarbamato de terc-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 13, usando ácido N-(3-{2-[2-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)-etoxi]-etoxi}-propil)-succinámico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar a una goma de color amarillo pálido (284 mg, 53%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.43 (s, 9H), 1.71-1.77 (m, 9H), 1.87-2.02 (m, 4H), 2.16-2.22 (m, 4H), 2.30 (q, H), 2.63 (t, 2H), 3.06 (t, H), 3.19-3.28 (m, 5H), 3.33-3.37 (m, 2H), 3.51-3.65 (m, 12H), 5.09 (a, H), 6.59 (a, H), 6.64 (a, H), 7.52 (t, H), 8.32 (m, H), 8.35 (m, H).
MS m/z=622 ES+ [M+H]+ Preparación 24: trans-4-amtno-N-(3-(5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il}propil)ciclohexanocarboxamida quiral Se trató una solución de {trans-4-[(3-{5-[(2S)-1-metilpirrolidin-2-il]piridin-3-il}propil)carbamoil]ciclohexi}carbamato de tere-butilo (preparación 13) (130 mg, 0.29 mmol) en DCM (3 mi) con ácido trifluoroacético (1 mi). Se agitó la solución resultante a temperatura ambiente durante 2 horas, después de lo cual se concentró a vacío. Se disolvió el residuo en MeOH y se aplicó a un cartucho de SCX-2 y se eluyó con MeOH seguido de amoníaco en MeOH (2M). Se concentraron a vacío las fracciones que contenían producto para dar el compuesto del título en forma de goma incolora (98 mg, 97%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.02-1.12 (m, 2H), 1.45-1.76 (m, 5H), 1.77-2.03 (m, 9H), 2.12-2.21 (m, 4H), 2.25-2.32 (q, H), 2.59-2.68 (m, 3H), 3.02-3.06 (t, H), 3.19-3.29 (m, 3H), 5.66 (br, H), 7.49 (t, H), 8.29 (d, H), 8.33 (d, H).
MS, m/z= 345 y 367 ES+ [M+H]+ y [M+Na]+, 345 Cl [M+H]+ Preparación 25: 1-amino-N-(3-{5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-il1piridin- S-illpropiD-S.S.g. ^-tetraoxapentadecan-I S-amida Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando a partir de la preparación 14, para dar lugar a una goma incolora (149 mg, 100%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.64-1.75 (m, H), 1 .77-1.99 (m, 7H), 2.12-2.21 (m, 4H), 2.25-2.32 (q, H), 2.44-2.46 (t, 2H), 2.60-2.64 (t, 2H), 2.82-2.85 (t, 2H), 3.02-3.06 (t, H), 3.19-3.29 (m, 3H), 3.47-3.50 (t, 2H), 3.59- 3.61 (m, 11 H), 3.69-3.72 (t, 2H), 6.76 (brm, H), 7.50 (t, H), 8.30-8.31 (d, H), 8.33 (d, H).
MS, m/z= 467 y 489 ES+ [M+H]+ y [M+Na]\ 467 Cl {M+H]+ Preparación 26: N-(3-(5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3- il)propil)qlucinamida quiral Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 15, para dar lugar a una goma incolora (99 mg, 100%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.66-2.01 (m, 7H), 2.13-2.22 (m, 4H), 2.27-2.33 (q, H), 2.62-2.66 (t, 2H), 3.05-3.09 (t, H), 3.21-3.26 (t, H), 3.29-3.34 (m, 4H), 7.35 (MA, H), 7.53 (t, H), 8.32 (d, H), 8.33-8.34 (d, H).
MS, m/z= 277 y 291 ES+ [M+H]+ y [M+Na]+, 277 Cl [M+H]+ Preparación 27: N-(3-(5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)propil)-beta-alaninamida Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 16, para dar lugar a una goma incolora (99 mg, 100%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.65-1.76 (m, H), 1 .77-2.00 (m, 6H), 2.13-2.22 (m, 4H), 2.26-2.32 (m, 3H), 2.62-2.66 (t, 2H), 2.98-3.01 (t, 2H), 3.03-3.08 (t, 2H) 3.20-3.31 (m, 3H), 7.26 (ma, H), 7.51 (t, H) 8.31-8.32 (d, H), 8.33-8.34 (d, H).
MS, m/z= 291 y 313 ES+ [M+H]+ y [M+Na]+, 291 Cl [M+H]+ Preparación 28: 4-amino-N-(3-{5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)propil)butanamida Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 17, para dar lugar a una goma incolora (104 mg, 99%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.65-2.00 (m, 9H), 2.13-2.32 (m, 7H), 2.61-2.65 (t, 2H), 2.72-2.76 (t, 2H) 3.03-3.07 (t, H) 3.20-3.30 (m, 3H), 6.22 (ma, H), 7.50 (t, H), 8.30-8.31 (d, H) 8.33-8.34 (d, H).
MS, m/z= 305 y 327 ES+ [M+H]+ y [M+Na]+, 305 Cl [M+H]+ Preparación 29: 2-f2-(2-aminoetoxi)etoxi1N-(3-(5-r(2S)-1-metilpirrolidin-2-il]piridin-3-il)propil)acetamida Se preparó el compuesto del compuesto por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 18, para dar lugar a una goma incolora (49 mg, 100%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.67-1.78 (m, H), 1.79-2.02 (m, H), 2.15-2.34 (m, 7H), 2.64-2.67 (t, 2H), 288-2.91 (t, 2H), 3.06-3.10 (t, 1 H), 3.22-3.27 (t, 1 H), 3.31-3.36 (q, 2H), 3.54-3.57 (t, 2H), 3.63-3.70 (m, 4H), 3.99 (s, 2H), 7.02 (dm, 2H), 7.54 (t, H), 8.33-8.34 (d, H), 8.35 (d, H).
MS, m/z= 365 y 387 ES+ [M+H]+ y [M+Na]\ 365 Cl [M+H]+ Preparación 30: 2-(2-aminoetoxi)-N-(3-(5-f(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)propil)acetamida Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 19, dando lugar a una goma de color amarillo pálido (87 mg, 100%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.70-1.97 (m, 6H), 2.17 (s, 3H), 2.18-2.23 (m, H), 2.31 (q, H), 2.67 (t, 2H), 2.94 (m, 2H), 3.08 (t, H), 3.26 (m, H), 3.35 (q, 2H), 3.56 (t, 2H), 3.98 (s, 2H), 7.35 (a, H), 7.55 (t, H), 8.34 (d, H), 8.35 (d, H).
MS, m/z= 321 ES+ [M+H]+ Preparación 31 : 5-amino-N-(3-{5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il}propil)pentanamida quiral Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 20, dando lugar a una goma de color amarillo pálido (78 mg, 54%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.46-1.52 (m, H), 1.64-1.72 (m, 3H), 1.81-2.02 (m, 7H), 2.15-2.24 (m, 5H), 2.31(q, H), 2.65 (t, 2H), 2.72 (t, H), 3.07 (t, H), 3.20-3.32 (m, 4H), 5.79 (a, H), 6.25 (a, H), 7.53 (s, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).
MS, m/z= 319 ES+ [M+H]+ Preparación 32: 6-amino-N-(3-(5-f(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin- 3-il)propil)hexanamida Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 21 , dando lugar a una goma de color amarillo pálido (70 mg, 46%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.32-1.41 (m, 2H), 1 .50-1.57 (m, H), 1 .59-1.70 (m, 4H), 1.81-1.85 (m, 3H), 1.87-2.01 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.15-2.23 (m, 3H), 2.30 (q, H), 2.63 (t, 2H), 2.765 (t, H), 3.06 (t, H), 3.19-2.29 (m, 3H).
MS, m/z= 333 ES+ [M+H]+ Preparación 33: 7-amino-N-(3-(5-f (2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin- 3-il)propil)heptanamida Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 22, dando lugar a una goma de color amarillo pálido (59 mg, 37%). 1H NMR (400 MHz, CDCt3) d = 1.32-1.29 (m, 3H), 1 .46-1.50 (m, H), 1.61 -1.66 (m, 2H), 1.70-1.74 (m, H), 1.82-1.89 (m, 3H), 1.94-2.04 (m, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.15-2.23 (m, 3H), 2.32 (q, H), 2.65 (t, 2H), 2.71 (t, H), 3.08 (t, H), 3.18-3.33 (m, 4H), 5.58 (br, H), 5.65 (a, H), 7.53 (d, H), 8.34 (m, H), 8.36 (m, H).
MS, m/z= 347 ES+ [M+H]+ Preparación 34: N-(3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxnetoxi)-N '-(3-f 5-[(2S)-1-metil-pirrolidin-2-il1piridin-3-il)propil)succinamida Se preparó el compuesto por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 24, comenzando con la preparación 23, dando lugar a una goma de color amarillo pálido (120 mg, 51 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.71-1.87 (m, 6H), 1.90-2.02 (m, H), 2.16 (s, 3H), 2.17-2.24 (m, H), 2.30 (q, H), 2.40-2.51 (m, 6H), 2.61-2.67 (m, 2H), 2.87 (t, 2H), 3.22-3.29 (m, 3H), 3.31 (q, 2H), 3.51-3.65 (m, 12H), 6.85 (a, H), 6.95 (a, H), 7.53 (s, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).
MS, m/z= 522 ES+ [M+H]+ Preparación 35: (trans-4-([2-({5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin- 3-il)oxi)etillcarbamoil)ciclohexil)carbamato de tere-butilo Se trató una solución de 2-({5-[(2S)-1-metilpirrolidin-2-il]piridin-3-il}oxi)etanamina (preparación 12) (55 mg, 0.25 mmol) en 2- metiltetrahidrofurano (2 mi), con agitación, con ácido trans-4-terc-butoxicarbonil-ciclohexano carboxílico (91 mg, 0.373 mmol) seguido de T3P (317 µ?, 0.498 mmol) y Et3N (1 18 µ?, 0.91 mmol). Tras agitación durante 3 horas, se trató la solución con T3P (69 µ?, 0.498 mmol). Tras agitación durante 18 horas, se concentró la solución a vacío y se disolvió el residuo en MeOH y se aplicó a un cartucho de SCX-2 y se eluyó con metanol seguido de amoníaco con MeOH (= 2M). Se concentraron las fracciones que contenían producto a vacio y se purificó el residuo en una columna cromatográfica sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc:MeOH:NH3 (gradiente de 1 :0:0 a 90: 10: 1 ). Posteriormente, se disolvió este material en DCM y se trató con resina de PS-isocianato durante 3 horas, a continuación se filtró y se evaporó a vacío para dar el compuesto del título en forma de goma de color amarillo (35 mg, 35%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.14-1.25 (m, 2H), 1.42 (d, 9H), 1.47-1.58 (m, 2H), 1.75-1.85 (m, 3H), 1.87-2.06 (m, 4H), 2.09-2.18 (m, 1 H), 2.21 (s, 3H), 2.23-2.32 (m, 1 H), 2.38-2.45 (q, 1 H), 3.24-3.29 (m, 3H), 3.55-3.58 (t, 2H), 4.1 1 -4.14 (t, 2H), 7.45-7.43 (m, 1 H), 8.10 (d, 1 H), 8.15-8.16 (d, 1 H).
MS m/z = 447 ES+ [M+H]+, 447 Cl [M+H]+ Preparación 36: (2-[2-(2-(f2-((5-f(2S)-1 -metilpirrolidin-2-¡npiridin-3-il)oxi)etillamino)-2-oxoetoxi)etoxiletil}carbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido [2-(2-terc-butoxicarbonilamino-etoxi)-etoxi]acético (preparado como se ha descrito en Angew. Chemie. Int. Ed. (2006), 45(30), 4936-4940) en lugar de ácido trans-4-terc-butoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar a una goma de color amarillo pálido (50 mg, 43%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.41 (s, 9H), 1.72-1.81 (m, 1 H), 1.84-2.01 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21-2.30 (m, 1 H), 2.33-2.40 (q, 1 H), 3.16-3.26 (m, 4H), 3.50-3.52 (t, 2H), 3.62-3.69 (m, 6H), 4.01 (s, 2H), 4.16-4.19 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1 H), 8.10 (d, 1 H), 8.15-8.16 (d, 1 H).
MS m/z = 467 ES+ [M+H]+, 467 Cl [M+H]+ Preparación 37: (2-([2-((5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)oxi)etillamino)-2-oxoetil)carbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido terc-butoxicarbonilamino-acético en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxilico, para dar lugar una goma de color amarillo pálido (50 mg, 53%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.42 (s, 9H), 1.87-2.09 (m, 3H), 2.30-2.38 (m, 4H), 2.60-2.67 (q, 1 H), 3.37-3.43 (ta, 1 H), 3.52-3.56 (ta, 1 H), 3.61-3.64 (t, 2H), 3.70 (s, 2H), 4.14-4.17 (t, 2H), 7.49-7.50 (m, 1 H), 8.14-8.15 (d, 1 H), 8.20-8.21 (d, 1 H).
MS m/z = 379 ES+ [M+H]+, 379 Cl [M+H]+ Preparación 38: (3-(f2-((5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)oxi)etillamino)-3-oxopropil)carbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido terc- butoxicarbonilamino-propiónico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil- ciclohexano-carboxílico, para dar lugar una goma de color amarillo pálido (70 mg, 72%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1 .39 (s, 9H), 1 75-1 .84 (m, 1 H), 1 .87-2.04 (m, 2H), 2.21 (s, 3H), 2.23-2.31 (m, 1 H), 2.37-2.47 (m, 3H), 3.24- 3.33 (m, 4H), 3.58-3.61 (t, 2H), 4.12-4.1 5 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1 H), 8.10-8.1 1 (d, 1 H), 8.16-8.17 (d, 1 H).
MS m/z = 393 ES+ [M+H]+, 393 Cl [M+H]+ Preparación 39: (4-(í2-({5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-inpiridin-3- il)oxi)etillamino)-4-oxobutil)carbamato de tere-butilo quira| Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido terc- butoxicarbonilamino-butanoico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil- ciclohexano-carboxílico, para dar lugar una goma de color amarillo pálido (43 mg, 42%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.41 (s, 9H), 1.70-1.78 (m, 2H), 1 .96-2.12 (m, 3H), 2.21 -2.24 (t, 2H), 2.33-2.42 (m, 4H), 2.69-2.76 (q, 1 H), 3.02-3.07 (m, 2H), 3.43-3.49 (ta, 1 H), 3.58-3.61 (t, 2H), 3.64-3.69 (ta, 1 H), 4.15-4.18 (t, 2H), 7.51 -7.52 (m, 1 H), 8.16-8.17 (d, 1 H), 8.23-8.24 (d, 1 H).
MS m/z = 407 ES+ [M+H]+, 407 Cl [M+H]+ Preparación 40: (5-(f2-((5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)oxi)etil]amino)-5-oxopentil)carbamato de terc-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido terc-butoxicarbonilamino-pentanoico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar una goma de color amarillo pálido (49 mg, 47%).
RMN 1H (400 Hz, CDCI3) d = 1 .41-1.50 (m, 1 1H), 1.57-1.65 (m, 2H), 2.01 -2.18 (m, 3H), 2.20-2.24 (t, 2H), 2.37-2.44 (m, 1 H), 2.46 (s, 3H), 2.78-2.85 (q, 1 H), 3.00-3.05 (m, 2H), 3.49-3.55 (m, 1 H), 3.58-3.61 (t, 2H), 3.76-3.80 (ta, 1 H), 4.15-4.16 (t, 2H), 7.55-7.56 (m, 1 H), 8.18-8.19 (d, 1 H), 8.25-8.26 (d, 1 H).
MS m/z = 421 ES+ [M+H]\ 421 Cl [M+H]+ Preparación 41 : (6-([2-((5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)oxi)etillamino)-6-oxohexil)carbamato de tere-butilo quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido terc-butoxicarbonilamino-hexanoico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar una goma de color amarillo pálido (65 mg, 60%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.29-1.35 (m, 2H), 1.42-1.49 (m, 1 1 H), 1.57-1.65 (m, 2H), 2.05-2.15 (m, 3H), 2.19-2.23 (t, 2H), 2.38-2.46 (m, 1 H), 2.48 (s, 3H), 2.82-2.89 (m, 1 H), 2.96-3.00 (t, 2H), 3.53-3.61 (m, 3H), 3.62-3.66 (ta, 1 H), 4.15-4.18 (t, 2H), 7.55-7.56 (m, 1 H), 8.19-8.20 (d, 1 H), 8.26-8.27 (d, 1 H).
MS m/z = 435 ES+ [M+H]+, 435 Cl [M+H]+ Preparación 42: (7-(f2-((5-r(2S)-1-metilpirrolidin-2-il1piridin-3-il)oxi)etillamíno)-7-oxoheptil)carbamato de tere-butilo quiral Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido terc-butoxicarbonilamino-heptanoico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar una goma de color amarillo pálido (67 mg, 60%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.28-1.34 (m, 4H), 1.39-1.45 (m, 1 1 H), 1.55-1.64 (m, 2H), 2.03-2.15 (m, 3H), 2.19-2.22 (t, 2H), 2.38-2.46 (m, 1 H), 2.48 (s, 3H), 2.81-2.88 (m, 1 H), 2.97-3.00 (t, 2H), 3.51-3.57 (m, 1 H), 3.58-3.61 (t, 2H), 3.80-3.84 (m, 1 H), 4.15-4.18 (t, 2H), 7.55-7.57 (m, 1 H), 8.19 (d, 1 H), 8.16 (d, 1H).
MS m/z = 449 ES+ [M+H]\ 449 Cl [M+H]+ Preparación 43: f2-(2-ff2-((5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-inpir¡d¡n-3-il)oxi)etillamino)-2-oxoetoxi)etil1carbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrit o anteriormente para la preparación 35, usando ácido (2-terc-butox¡carbonilamino-etoxi)-acético en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxilico, para dar lugar una goma de color amarillo pálido (42 mg, 42%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.42 (s, 9H), 2.15-2.32 (m, 3H), 2.43-2.52 (s, 1 H), 2.61 (s, 3H), 3.03-3.10 (m, 1 H), 3.24-3.29 (m, 2H), 3.52-3.55 (t, 2H), 3.66-3.69 (m, 3H), 3.98 (s, 2H), 4.06-4.13 (m, 1 H), 4.21-4.24 (t, 2H), 7.62-7.63 (m, 1 H), 8.24 (d, 1 H), 8.32-8.33 (d, 1 H).
MS m/z = 423 ES+ [M+H]\ 423 Cl [M+H]+ Preparación 44: [21-g5-r(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)oxi)- 15,18-dioxo-4,7, 10-trioxa-14, 19-diazahenicos-1 -illcarbamato de terc-butilo Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido N-(3-{2-[2-(3-terc-butoxicarbonilamino-propoxi)-etoxi]-etoxi}-propil)-succinámico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar una goma de color amarillo pálido (80 mg, 51 %).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.42 (s, 9H), 1.68-1 .76 (m, 4H), 1.97-2.15 (m, 3H), 2.35-2.52 (m, 9H), 2.71-2.80 (m, 1 H), 3.09-3.14 (m, 2H), 3.20-3 26 (m, 2H), 3.48-3.51 (t, 5H), 3.55-3.64 (m, 10H), 3.66-3.76 (m, 1 H), 4.14-4.17 (t, 2H), 7.53-7.54 (m, 1 H), 8.17-8.18 (d, 1 H), 8.24-8.25 (d, 1 H).
MS m/z = 625 ES+ [M+H]+, 625 Cl [M+H]+ Preparación 45: [18-((5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)oxi)-15-0X0-3,6,19, 12-tetraoxa-16-azaoctadec-1-illcarbamato de tere-butilo Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 35, usando ácido 3-(2-{2-[2-2-terc-butoxicarbonilamino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico en lugar de ácido trans-4-tercbutoxicarbonil-ciclohexano-carboxílico, para dar lugar una goma de color naranja (80 mg, 56%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.42 (s, 9H), 2.03-2.20 (m, 3H), 2.38-2.50 (m, 6H), 2.85-2.91 (m, 1 H), 3.19-3.22 (m, 2H), 3.47-3.50 (t, 2H), 3.53-3.63 (m, 15H), 3.71-3.74 (t, 2H), 3.84-3.92 (m, 1 H), 4.17-4.19 (t, 2H), 7:58-7.59 (m, 1 H), 8.20-8.21 (d, 1 H), 8.28 (d, 1 H).
MS m/z = 570 ES+ [M+H]+, 570 Cl [M+H]+ Preparación 46: trans-4-amino-N-[2-((5-[(2S)-1-metilpirrolidin-2-il1piridin-3-il)oxi)etillciclohexanocarboxamida quiral Se trató una solución de (trans-4-{[2-({5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2-il]piridin-3-il}oxi)etil]carbamoil}ciclohexil)carbamato de tere-butilo (preparación 35) (35 mg, 0.078 mmol) in DCM (3 mi) con ácido trifluoroacético (1 mi). Se agitó la solución resultante a temperatura ambiente durante la noche, después de lo cual se concentró a vacío. Se disolvió el residuo en MeOH y se aplicó sobre un cartucho de SCX-2 y se eluyó con MeOH seguido de amoniaco en MeOH (2M). Se concentraron las fracciones que contenían producto a vacío para dar el compuesto del título en forma de goma de color naranja (17 mg, 62%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.16-1.26 (m, 2H), 1.47-1.57 (m, 2H), 1.71-2.01 (m, 8H), 2.13-2.30 (m, 4H), 2.33-2.40 (q, 1 H), 2.68-2.76 (m, 1 H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.56-3.59 (t, 2H), 4.12-4.14 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1 H), 8:09-8.10 (d, 1 H), 8.14-8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 347 ES+ [M+H]+, 347 Cl [M+H]+ Preparación 47: 2-[2-(2-aminoetoxi)etoxfl-N-[2-((5-(2S)-1-metilpirrolidin-2-inpiridin-3-illoxi)etillacetamida quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 36, para dar lugar una goma de color naranja (37 mg, 95%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.72-1.81 (m, 1 H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.22-2.30 (m, 1 H), 2.34-2.41 (q, 1 H), 2.83-2.86 (t, 2H), 3.19- 3.26 (m, 2H), 3.54-3.57 (t, 2H), 3:65-3.71 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 4.16-4.19 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1 H), 8.10-8.1 1 (d, 1 H), 8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 367 ES+ [M+H]+, 367 Cl [M+H]+ Preparación 48: N-[2-((5-f(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il}oxi)etil1glucinamida quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 37, para dar lugar una goma de color naranja (37 mg, 100%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.74-1.84 (m, 1H), 1.87-2.05 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.23-2.32 (m, 1 H), 2.38-2.44 (q, 1 H), 3.23-3.28 (m, 2H), 3.37 (s, 2H), 3.63-3.66 (t, 2H), 4.15-4.17 (t, 2H), 7.45-7.47 (m, 1 H), 8.10-8.1 1 (d, 1 H), 8.15-8.16 (d, 1 H).
MS m/z = 279 ES+ [M+H]\ 279 Cl [M+H]+ Preparación 49: N-f2-((5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)oxi)etill-beta-alaninamida quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 38, para dar lugar una goma de color naranja (52 mg, 100%).
RMN ?? (400 MHz, CDCI3) d = 1.72-1.81 (m, 1 H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21-2.30 (m, 1 H), 2.33-2.44 (m, 3H), 2.93-2.96 (t, 2H), 3.16-3.26 (m, 2H), 3.60-3.62 (t, 2H), 4.13-4.16 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1 H), 8.10 (d, 1 H), 8.14-8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 293 ES+ [M+H]+, 293 Cl [M+H]+ Preparación 50: 4-amino-N-f2-((5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il)oxi)etil1butanamida quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 39, para dar lugar una goma de color naranja (28 mg, 88%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1 .73-1.82 (m, 3H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21 -2.30 (m, 3H), 2.33-2.40 (q, 1 H), 2.68-2.72 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.58-3.61 (t, 2H), 4.12-4.15 (t, 2H) 7.43-7.44 (m, 1 H), 8.10 (d, 1 H), 8.14-8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 307 ES+ [M+H]+, 307 Cl [M+H]+ Preparación 51 : 5-amino-N-[2-({5-[(2S)-1 -metilpirrolidin-2- illpiridin-3-il)oxi)etiHpentanamida Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 40, para dar lugar una goma de color naranja (30 mg, 81 %).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.48-1.56 (m, 2H), 1.61 -1.68 (m, 2H), 1.71-1.81 (m, 1 H), 1.85-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.22-2.30 (m, 3H), 2.33-2.40 (q, 1 H), 2.68-2.72 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.58-3.61 (t, 2H), 4.12- 4.15 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1 H), 8.10 (d, 1 H), 8.14-8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 321 ES+ [M+H]+, 321 Cl [M+H]+ Preparación 52: 6-amino-N-[2-((5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2- inpiridin-3-il)oxi)et¡Nhexanamida quiral Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 41 , para dar lugar una goma de color naranja (38 mg, 76%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.31-1.39 (m, 2H), 1 .48-1.55 (m, 2H), 1.59-1 .66 (m, 2H), 1.72-1.81 (m, 1 H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21-2.30 (m, 3H), 2.33-2.40 (q, 1 H), 2.65-2.69 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.57-3.60 (t, 2H), 4.15-4.12 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1 H), 8.09-8.10 (d, 1 H), 8.14-8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 335 ES+ [M+H]+, 335 Cl [M+Hf Preparación 53: 7-amino-N-|2-((5-(2S)-1 -metilpirrolidin-2-illpiridin- 3-il)oxi)etil1heptanamida Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 42, para dar lugar una goma de color naranja (37 mg, 72%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.32-1.37 (m, 4H), 1.44-1.51 (m, 2H), 1.57-1.65 (m, 2H), 1.72-1.82 (m, 1 H), 1.83-2.03 (m, 2H), 2.18-2.30 (m, 6H), 2.33-2.40 (q, 1 H), 2.65-2.68 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 2H), 3.57-3.60 (t, 2H), 4.12-4.15 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1 H), 8.09-8.10 (d, 1 H), 8.14-8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 349 ES+ [M+H]+, 349 Cl [M+H]+ Preparación 54: 2-(2-aminoetoxi)-N-[2-((5-[(2S)-1-metilpirrolidin- 2-illpiridin-3-illoxi)etillacetamida Se preparó el compuesto del título por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 43, para dar lugar una goma de color naranja (27 mg, 84%).
RMN H (400 MHz, CDCI3) d = 1.72-1.82 (m, 1 H), 1 .84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.22-2.30 (m, 1 H), 2.34-2.40 (q, 1 H), 2.86-2.89 (t, 2H), 3.18- 3.26 (m, 2H), 3.55-3.58 (t, 2H), 3.66-3.68 (t, 2H), 4.00 (s, 2H), 4.16-4.19 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1 H), 8.10 (d, 1 H), 8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 323 ES+ [M+Hf, 323 Cl [M+H]+ Preparación 55: N-(3-{2-[2-(3-aminopropoxi)etoxiletoxi)propil)-N '- [2-({5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-illpiridin-3-il}oxi)etillsuccinamida Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 44, para dar lugar una goma de color naranja (59 mg, 88%).
RMN 1H (400 MHz, CDC ) d = 1.70-1.80 (m, 5H), 1 .86-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.21 -2.30 (m, 1 H), 2.33-2.40 (q, 1 H), 2.44-2.52 (m, 4H), 2.76-2.80 (t, 2H), 3.18-3.26 (m, 4H), 3.48-3.51 (t, 2H), 3.55-3.63 (m, 12H), 4.11-4.14 (t, 2H), 7.43-7.44 (m, 1 H), 8.10 (d, 1 H), 8.15 (d, 1 H).
MS m/z = 524 ES+ [M+H]+, 524 Cl [M+H]+ Preparación 56: 1-amino-N-[2-((5-f(2S)-1 -metilpirrolidin-2-inpiridin-3-il)oxi)etill-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida Se preparó el compuesto del titulo por medio del procedimiento general descrito anteriormente para la preparación 46, comenzando con la preparación 45, para dar lugar una goma de color naranja (55 mg, 85%).
RMN 1H (400 MHz, CDCI3) d = 1.71-1.81 (m, 1H), 1.84-2.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.22-2.30 (m, 1 H), 2.33-2.40 (q, 1 H), 2.45-2.48 (t, 2H), 2.78-2.80 (t, 2H), 3.18-3.25 (m, 2H), 3.50-3.53 (t, 2H), 3.58-3.62 (m, 14H), 3.71-3.74 (t, 2H), 4.13-4.15 (t, 2H), 7.44-7.45 (m, 1H), 8.10 (d, 1H), 8.15-8.16 (d, 1 H).
MS m/z = 469 ES+ [M+H]\ 469 Cl [M+H]+ Preparación 57: 4-mercapto-N-[2-((5-f(2S)-1-metilpirrolidin-2-inpiridin-3-il|oxi)et¡nbutanamida Se trató una solución de 2-({5-[(2S)-1-metilpirrolidin-2-il]piridin-3-il}oxi)etanamina (preparación 12) (1100 mg, 4.971 mmol) in agua (10 mi) con ?-tioburirolactona (861 ul, 9.94 mmol) y se calentó la mezcla de reacción a 60°C durante la noche. Posteriormente se evaporó a vacío para dar lugar a una goma incolora, que se sometió a pre-adsorción sobre sílice a partir de MeOH. A continuación se analizó por cromatografía sobre una columna ISCO de 40 g, eluyendo con EtOAc hasta EtOAc:MeOH:NH3 80:20:1. Se evaporaron las fracciones apropiadas a vacío para dar el compuesto del titulo en forma de goma incolora, 690 mg. Rendimiento = 43%.
RMN 1H (400Mhz, CD3OD): 5=1.77-2.06 (m, 6H), 2.22-2.35 (m, 6H), 2.41 -2.51 (m, 3H), 3.26-3.32 (m, H), 3.58-3.61 (t, 2H), 4.13-4.15 (t, 2H), 7.45-7.47 (m, H), 8.11-8.12 (d, H), 8.17 (d, H). MS m/z=324 ES+ [M+H]+ y 322 Cl- [M-H]" EJEMPLOS EJEMPLO 1 Se acopló el hapteno de la preparación 4 a proteína de toxoide diftérico usando el siguiente procedimiento a) Se obtuvo el hapteno en forma de aceite de color amarillo y se almacenó a 2-8°C hasta el día de uso (hasta una semana, el almacenamiento más largo tuvo lugar a -20°C). Se disolvió el aceite bien en Disolución Salina Tampón de Fosfato de Dulbecco con Ca o Mg (DPBS) o bien en agua desionizada a 50 mg de hapteno por mi de solución. El resultado fue una suspensión o solución de color amarillo-marrón. b) Por separado, se obtuvo una alícuota de toxoide diftérico concentrado (DT) y usando una columna de desalado de filtración sobre gel (Bio-Rad), se cambió el tampón del DT por DPBS. La fracción eluída de la columna fue una solución de 4 mi de aproximadamente 1 1 mg/ml, determinado por medio de ensayo de Bradfor (reactivo Coomassie Brilliant Blue, Pierce Chemical) usando una curva estándar de albúmina de suero bovino. Se diluyó una alícuota de éste con más DPBS para dar lugar a una solución de 4 mi a una concentración de 5 mg/ml de proteína en DPBS. c) Se hizo reaccionar la alícuota de DT con anhídrido succínico para crear un toxoide diftérico succinilado concentrado. Se combinó la alícuota de 4 mi de DT en DPBS con 80 mg de anhídrido succínico en forma de sólido, y se colocó en un cilindro con forma de tubo para proporcionar agitación suficiente a temperatura ambiente durante 3h. Se apreció que por medio del uso de este procedimiento, el producto final no fue una solución transparente. Al final del tiempo de reacción de 3 h, se aplicó la alícuota a una columna de desalado de filtración sobre gel y se eluyó con DPBS, para retirar los componentes moleculares pequeños que no habían reaccionado. Esto aumentó el volumen de la muestra hasta un total de 6 mi. d) Se añadieron 28 mg de sulfo-N-hidroxisuccinimida (s-NHS), en forma de sólido, a una alícuota de 6 mi de DT succinilado y se dejó disolver s-NHS invírtiendo el tubo y agitando de forma suficiente. Posteriormente, se añadieron a la mezcla 28 mg de hidrocloruro de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), en forma sólida, y se dejó disolver invirtiendo el tubo y agitando de forma suficiente. Se incubó la mezcla de reacción (DT succinilado/EDC/s-NHS) a temperatura ambiente durante 10 min., se añadieron 200 µ? de solución de hapteno preparada anteriormente y se agitó brevemente la mezcla de reacción usando un Vortex para mezclar. e) Se hizo reaccionar la mezcla de reacción durante 3 o 4 h con agitación suficiente en un cilindro con forma de tubo, a temperatura ambiente. Al final del tiempo de reacción, se aplicó la alícuota a una columna de desalado con filtración de gel y se eluyó con DPBS, para retirar los componentes de moléculas pequeñas que no habían reaccionado. Esto aumento el volumen de la muestra de conjugado hasta un total de 8 mi. Esta fracción eluída de 8 mi se concentró posteriormente usando ultra-filtro centrífugos MWCO 3k (Millipore) hasta aproximadamente 3.0-3.5 mi. f) Usando albúmina de suero bovino estándar, se analizó el contenido de proteína del conjugado final usando el ensayo de Bradford (reactivo Pierce Coomassie Brilliant Blue) y se determinó que la concentración final fue de 2.3 mg/ml. Se analizó la incorporación de hapteno del conjugado usando espectroscopia ultravioleta dentro de la zona 250-270 nm frente a un control no conjugado normalizado del contenido de proteína y se encontró una absorción de anticuerpo más intensa en esta zona en comparación con el toxoide nativo. También se analizó el conjugado por medio de electroforesis SDS-PAGE y el contenido de endotoxina usando el ensayo LAL. Finalmente, se hidrolizó una muestra de 100 pg del conjugado y se analizó usando HPLC de fase inversa para determinar el número de haptenos incorporados por cada molécula de proteína. Se encontró que el hapteno-conjugado DT tenía 19 haptenos por monómero de proteina. g) Finalmente, se filtró de forma estéril la muestra a través de un filtro de jeringa de 0.22 pm y se sub-dividió de forma aséptica en alícuotas de 0.5 mi. Se almacenaron las alícuotas asépticas a -80°C hasta su transporte al lugar de estudio en hiero seco.
EJEMPLO 2 Se acopló el hapteno de la preparación 12 a proteina de toxoide diftérico usando el procedimiento general descrito anteriormente para el ejemplo 1 , con los siguientes cambios: en la etapa d), se añadieron 186 pl de solución de hapteno a la mezcla de reacción; y en la etapa f) se determinó al concentración final como 3.3 mg/ml y se encontró que el hapteno-conjugado DT presentó 13 haptenos por cada monómero de proteína.
EJEMPLO 3 Se acopló el hapteno de la preparación 7 a proteína de toxoide diftérico usando el procedimiento general descrito anteriormente para el ejemplo 1 , con los siguientes cambios en las etapas c, e y f.
En la etapa c), se aplicó una parte de 3 mi de la alícuota a una columna de desalado de filtraciones sobre gel y se eluyó en DPBS, pare retirar los componentes de moléculas de pequeño tamaño que no habían reaccionado, aumentando de este modo el volumen de la muestra purificada hasta un total de 4 mi; se llevó a cabo la etapa d) como sigue: se añadieron 80 pl de solución de hapteno sobre una alícuota de 4 mi de DT succinilado y se invirtió para mezclar de forma suficiente. Posteriormente, se añadieron a la mezcla 28 mg de sulfo-N-hidroxisuccinimida (s-NHS), en forma de sólido, y se permitió la solución invirtiendo el tubo y mezclando de manera suficiente. Finalmente, se añadieron a la mezcla 28 mg de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), en forma sólida, y se permitió la solución invirtiendo el tubo y agitando de forma suficiente.
En la etapa e), se hizo reaccionar la mezcla durante 2 h, se aumentó el volumen de la muestra de conjugado hasta un total de 6 mi tras la elución y posteriormente se concentró la fracción eluída de 6 mi usando ultra-filtros de MWCO de 10k (Millipore) hasta aproximadamente 2.5-3.0 mi.
En la etapa f). se determinó la concentración final como 2.4 mg/ml y se encontró que el hapteno-conjugado DT tenía 14.5 haptenos por cada monómero de proteína.
EJEMPLO 4 Se acopló el hapteno de preparación a proteína de toxoide diftérico usando el procedimiento general descrito anteriormente para el ejemplo 1 : se añadieron 120 µ? de solución de hapteno a 6 mi de alícuota DT succinilada. Se agitó brevemente la mezcla con un Vortex. Se añadieron 28 mg de sulfo-N-hidroxisuccinimida (s-NHS), en forma de sólido, y se permitió la solución invirtiendo el tubo y agitando suficientemente. Finalmente, se añadieron a la mezcla 28 mg de hidrocloruro de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), en forma de sólido, y se permitió disolver invirtiendo el tubo y agitando de forma suficiente; y en la etapa f), se determinó que la concentración final fue de 2.5 mg/ml y se encontró que el hapteno-conjugado DT fue de 19.3 haptenos por cada monómero de proteina.
EJEMPLO 5 Se acoplaron los conjugados hapteno-espaciador a partir dé las preparaciones 24 a 34 y 46 a 56 a proteína de toxoide diftérico como se ha descrito en el procedimiento anterior. a) Se obtuvieron los conjugados de hapteno-espaciador en forma de aceite de color amarillo y se almacenaron a 2- 8°C hasta el día de uso (durante una semana, el almacenamiento más largo fue a -20°C). Se disolvió este aceite en Disolución salina de tampón fosfato de Dulbecco sin Ca o Mg (DPBS) a 50 mg de hapteno por mi de solución. El resultado fue una suspensión o solución de color amarillo-marrón. La preparación 33 no se disolvió por completo en agua desionizada y de disolvió más hasta metanol 50% hasta una concentración final de 25 mg de conjugado de hapteno-espaciador por cada mi de solución. b) De forma separada, se obtuvo una alícuota de toxoide diftérico concentrado (DT) y, usando una columna de desalado con filtración de gel (Bio-Rad), se cambió el tampón de DT a DPBS. La fracción eluída de la columna fue de 4 mi de solución a aproximadamente 1 1 mg/ml, determinado según el ensayo de Bradfor (reactivo de Coomassie Brilliant Blue, Pierce Chemical) usando albúmina de suero bovino descrita anteriormente. Se diluyó una alícuota de este con más DPBS para dar una solución de 2 mi con un contenido de proteína de 5 mg/ml en DPBS. c) Esta alícuota se hizo reaccionar con anhídrido succínico para crear un toxoide diftérico succinilado. Se combinó la alícuota de 2 mi de DT en DPBS con 40 mg de anhídrido succínico en forma sólida, y se colocó en un cilindro con forma de tubo para proporcionar agitación suficiente a temperatura ambiente durante 3 horas. Se apreció que usando este procedimiento, el producto final no era una solución transparente. Al final de 3 horas de tiempo de reacción, se aplicó la alícuota a una columna de desalado con filtración de gel y se eluyó en DPBS, para retirar las componentes moleculares pequeños que no habían reaccionado. Esto aumentó el volumen de la muestra hasta un total de 3 mi. d) Se añadieron 9 mg de sulfo-N-hidroxisuccinimida (s- NHS), en forma de sólido, a la alícuota de DT de 3 mi, y se permitió la solución de s-NHS invirtiendo el tubo y mezclando lo suficiente. Posteriormente, se añadieron a la mezcla 9 mg de hidrocloruro de 1 -etíl-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi¡mida, en forma sólida, y se permitió la solución invirtiendo el tubo y con mezcla suficiente. Se añadieron 50 µ? de la solución de hapteno-conjugado espaciador preparada anteriormente (100 ul para la preparación 33) a la mezcla de reacción (DT succinilado/EDC/s-NHS). e) Se hizo reaccionar la mezcla de reacción durante 3 a 4 horas, con agitación suficiente, en un cilindro con forma de tubo, a temperatura ambiente. Al final de este tiempo de reacción, se aplicó la alícuota a una columna de desalado con filtración de gel y se eluyó en DPBS, para retirar los componentes moleculares pequeños que no habían reaccionado. Esto aumentó el volumen de la muestra de conjugado hasta un total de 4 mi. f) Usando albúmina de suero bovino estándar, se analizó el contenido de proteína del conjugado final usando en ensayo de Bradfor (reactivo Pierce Coomassie Brilliant Blue) y se determinó la concentración final como se indica en la Tabla 1. Se analizó la incorporación de hapteno del conjugado usando espectroscopia ultravioleta en el intervalo de 250 a 270 nm frente a un control no conjugado, se normalizó el contenido de proteina y se encontró una absorción de anticuerpos más intensa en esta zona en comparación con el toxoide nativo. De igual forma se analizó el conjugado por medio de electroforesis SDS-PAGE y el contenido de endotoxina usando el ensayo LAL Finalmente, se hidrolizó una muestra de 100 pg del conjugado y se analizó usando HPLC de fase inversa para determinar el número de haptenos incorporado por cada molécula de proteina. A continuación se detalla la carga de hapteno de las muestras de ensayo en las tablas 1 y 2. g) Finalmente, se filtró de forma estéril la muestra a través de un filtro de jeringa de 0.22 pm y se subdividió de forma aséptica en alícuotas de 1.0 mi. Se almacenaron estas alícuotas asépticas a -80°C hasta su transporte al lugar del estudio en hielo seco.
TABLA 1 TABLA 2 EJEMPLO 6 También se conjugaron los haptenos con un grupo amina reactivo hasta toxoide diftérico sin la adición de anhídrido succinico. Un ejemplo del hapteno de la preparación 12 conjugado hasta toxoide diftérico se detalla a continuación, pero esto se puede llevar a cabo con preparaciones 4, 7, 8, 24-34 y 46-56. a) Se obtuvo el hapteno en forma de aceite de color amarillo y se almacenó a 2-8°C hasta el día de uso (durante una semana, el almacenamiento más largo fue a -20°C). Se disolvió este aceite en Disolución salina de tampón fosfato de Dulbecco sin Ca o Mg (DPBS) a 50 mg de hapteno por mi de solución. El resultado fue una suspensión o solución de color amarillo-marrón. b) De forma separada, se obtuvo una alícuota de toxoide diftérico concentrado (DT) y, usando una columna de desalado con filtración de gel (Bio-Rad), se cambió el tampón de DT por DPBS. La fracción eluida de la columna fue de 4 mi de solución a aproximadamente 1 1 mg/ml, determinado según el ensayo de Bradfor (reactivo de Coomassie Brilliant Blue, Pierce Chemical) usando una curva de albúmina de suero bovino estándar. Se diluyó una alícuota de este con más DPBS para dar una solución de 2 mi con un contenido de proteína de 5 mg/ml en DPBS. c) Se añadieron 9 mg de sulfo-N-hidroxisuccinimida (s-NHS), en forma de sólido, a la alícuota de DT de 2 mi, y se permitió la solución de s-NHS invirtiendo el tubo y mezclando lo suficiente. Posteriormente, se añadieron a la mezcla 9 mg de hidrocloruro de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, en forma sólida, y se permitió la solución invirtiendo el tubo y con mezcla suficiente. Se añadieron 50 µ? de la solución de hapteno a la mezcla de reacción (DT/EDC/s-NHS). En este momento, se ajustó el pH hasta 5.6 con la adición de HCI 1 M gota a gota. d) Se hizo reaccionar la mezcla de reacción durante 3 a 4 horas, con agitación suficiente, en un cilindro con forma de tubo, a temperatura ambiente. Al final de este tiempo de reacción, se aplicó la alícuota a una columna de desalado con filtración de gel y se eluyó en DPBS, para retirar los componentes moleculares pequeños que no habían reaccionado. Esto aumentó el volumen de la muestra de conjugado hasta un total de 3 mi. e) Usando albúmina de suero bovino estándar, se analizó el contenido de proteína del conjugado final usando en ensayo de Bradfor (reactivo Pierce Coomassie Brilliant Blue) y se determinó que la concentración final fue de 3.01 mg/ml. Se analizó la incorporación de hapteno del conjugado usando espectroscopia ultravioleta en la zona de 280 nm frente a un control no conjugado, se normalizó el contenido de proteína y se encontró una absorción de anticuerpos más intensa en esta zona en comparación con el toxoide nativo. De igual forma se analizó el conjugado por medio de electroforesis SDS-PAGE y el contenido de endotoxina usando el ensayo LAL. Finalmente, se hidrolizó una muestra de 100 g del conjugado y se analizó usando HPLC de fase inversa para determinar el número de haptenos incorporado por cada molécula de proteína. Se encontró que el contenido de hapteno-DT fue de 1 1 .6 haptenos por cada monómero de proteína f) Finalmente, se filtró de forma estéril la muestra a través de un filtro de jeringa de 0.22 pm y se subdividió de forma aséptica en alícuotas de 1.0 mi. Se almacenaron estas alícuotas asépticas a -80°C hasta su transporte al lugar del estudio en hielo seco.
EJEMPLO 7 También se puede acoplar la preparación 12 a CRM197, así como a toxoide diftérico. A continuación se aporta un ejemplo de dicha conjugación. Aunque no se muestra, también se aplicó el mismo procedimientos a otros haptenos que contenían amina tal como 4, 7, 8, 24-34 y 46-56. a) Se obtuvo el hapteno de la preparación 12 en forma de aceite de color amarillo y se almacenó a 20°C. Se disolvió este aceite en Disolución salina de tampón fosfato de Dulbecco sin Ca o Mg (DPBS) a 50 mg de hapteno por mi de solución. El resultado fue una suspensión o solución de color amarillo-marrón. b) De forma separada, se descongeló una alícuota de 20 mi de CRM197 concentrado (5.91 mg/ml) de -80°C a 2.8°C. Se tomó una alícuota de 8.62 mi de material descongelado y se diluyó con 1.38 mi de DPBS para dar una solución de 10 mi con un contenido de proteína de 5 mg/ml en DPBS. c) Se añadieron 500 µ? de la solución de hapteno preparada anteriormente a la solución de CRM197, esto se añadió lentamente y gota a gota dejando posteriormente reaccionar en un cilindro con forma de tubo durante 5 minutos. d) Después de este tiempo, se añadieron 90 mg de sulfo-N-hidroxisuccinimida (s-NHS), en forma de sólido, a la solución de 10 mi de CRM197. Se permitió la solución de s-NHS invirtiendo el tubo y mezclando lo suficiente. A continuación se dejó reaccionar en un cilindro con forma de tubo durante 5 minutos. e) Transcurridos 5 minutos, se añadieron 90 mg de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) a la solución de CRM197, en forma de sólido y se permitió la solución invirtiendo el tubo con mezcla suficiente. En este momento, se ajustó el pH de la muestra a 5.6 con la adición de HCI 1 M gota a gota. f) Se transfirió la mezcla de reacción a temperatura fría (2-8°C) y se dejó reaccionar en un cilindro con forma de tubo durante 6 horas. g) Al final del tiempo de reacción, se desaló la muestra en DPBS usando columnas 5 x NAP25 para retirar el exceso de reactivos sin reaccionar (ON: 2 mi, OFF: 3 mi). Se aumentó el volumen hasta 15 mi. h) Usando albúmina de suero bovino estándar, se analizó el contenido de proteína del conjugado final usando en ensayo de Bradfor (reactivo Pierce Coomassie Brilliant Blue) y se determinó que la concentración final fue de 2.88 mg/ml. Se analizó la incorporación de hapteno del conjugado usando espectroscopia ultravioleta en la zona de 280 nm frente a un control no conjugado, con contenido de proteína normalizado y se encontró una absorción de anticuerpos más intensa en esta zona en comparación con el toxoide nativo. De igual forma se analizó el conjugado por medio de electroforesis SDS-PAGE y el contenido de endotoxina usando el ensayo LAL. Finalmente, se hidrolizó una muestra de 100 pg del conjugado y se analizó usando HPLC de fase inversa para determinar el número de haptenos incorporado por cada molécula de proteína. Se encontró que el contenido de conjugado de hapteno-CRMi97 fue de 8.0 haptenos por cada monómero de proteína. i) Finalmente, se filtró de forma estéril la muestra a través de un filtro de jeringa de 0.22 pm y se subdividió de forma aséptica en alícuotas de 1.0 mi. Se almacenaron estas alícuotas asépticas a -80°C hasta su transporte al lugar del estudio en hielo seco.
EJEMPLO 8 Se encontró que aumentando la concentración de sNHS/EDC de la mezcla de reacción, se podía controlar la cantidad de hapteno introducido en la proteína portadora. A continuación, se muestra un ejemplo de una conjugación de preparación 7 con toxoide diftérico. El procedimiento es como se ha descrito en el ejemplo 6 con los cambios siguientes en las etapas c y e.
En la etapa c); en esta etapa, se pudo variar la cantidad de N-hidroxisuccinimida (s-NHS) y de hidrocloruro de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) añadida a la alícuota de 2 mi de DT desalado. En este experimento, se añadieron 9 mg de sNHS y EDC a una alícuota (esto es denominado como condición 2) y se añadieron 36 mg de sNHS y EDC a otra alícuota (esto es denominado como condición 4). No se ajustó el pH de las muestras hasta pH 5.6 con adición de HCI 1 M gota a gota.
En la etapa e): para el conjugado preparado usando la condición 2, se determinó que la concentración final fue de 3.4 mg/ml, y se encontró que el contenido de hapteno-conjugado DT fue de 8.3 haptenos por cada monómero de proteína. Para el conjugado preparado usando la condición 4, se determinó que la concentración final fue de 2.46 mg/ml y se encontró que el hapteno-conjugado DT tenía 13.2 haptenos por cada monómero de proteina.
EJEMPLO 9 Preparación de conjugados de hapteno tiolado-espaciador sobre CRM 97 y Toxoide Diftérico inactivado con formalina (DT) por medio de química de conjugación de éster de N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético (BAANS). a) Se descongelaron 3 mi de CRM197 (17.73 mg a 5.91 mg/ml) y 3 mi de DT (24 mg a 8 mg/ml) y se desalaron en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.0, usando columnas de desalado 10 DG (Pierce) (on: 3 mi; off; 4ml). Se ajustó la concentración hasta 4 mg/ml usando el mismo tampón. b) Se tomaron una alícuota de 1 mi de CRM197 desalado y muestras y se enfriaron a 2-8°C. c) Se disolvieron 20 mg de hapteno-conjugado espaciador de preparación 57 en 300 ul de DMSO y 700 ul de dPBS hasta una concentración final de 20 mg/ml. d) Se añadieron 500 µ? (10 mg) de solución de hapteno-conjugado de espaciador a 500 µ? de gel de TCEP pre-lavado ((tris(2-carboxietil)fosfina)) (Pierce) y se incubó durante 3 horas con agitación a temperatura ambiente. Se congeló la solución de hapteno resultante a 20°C para almacenamiento a largo plazo. e) 90 minutos en la etapa (d) se disolvieron 10 mg de BAANS (Sigma) en 500 µ? de DMSO hasta una concentración final de 20 mg/ml. f) Se añadieron 1.5 mg (75 ul) de BAANS a 1 mi de DT/CRM197, lentamente y gota a gota (a 4 mg/ml). Se hizo reaccionar durante 90 minutos a < 11°C (0.375 mg de BAANS añadido por cada mg de CRM197/DT). g) Transcurridos 90 minutos, todavía a < 1 1°C, se desaló el CRM197 bromoacetilado/DT en tampón frío de carbonato de sodio 100 mM/bicarbonato, pH 9: 1 , usando una columna de NAP10 (1 mi on, 1.5 mi off). h) Se aspiró el conjugado de hapteno-espaciador a partir del gel de TCEP y se añadieron 250 ul (5 mg) de conjugado de hapteno-espaciador al interior de ambas muestras de CRM197 activado/DE, de nuevo lentamente y gota a gota, con mezcla para evitar la formación de gradientes de concentración. i) Una vez añadido el conjugado de hapteno-espaciador, se comprobó el pH y se ajustó a 9.1 mediante la adición gota a gota de NaOH 0.1 M/HCI en caso necesario. j) Se mantuvo la mezcla de reacción con los anticuerpos en ausencia de luz, con mezcla durante 18 horas. k) Trascurrido este tiempo, se añadieron 2 ul de N-acetil-cisteamina (NAC) a cada mezcla de reacción y se hizo reaccionar, de nuevo manteniendo los anticuerpos en ausencia de luz, durante 3 horas con agitación (0.5 mi por cada g de CRMig7/DT).
I) Tras la reacción, se desaló en PBS Dulbecco usando una columna de desalado 10DG (BioRad) (3 mi on, 4 mi off). m) Finalmente, se filtró de forma estéril la muestra a través de un filtro de jeringa de 0.22 pm y se tomó una alícuota de forma aséptica. Se almacenaron las alícuotas asépticas a 2-8°C hasta su transporte al lugar de estudio. n) usando albúmina de suero bovino estándar, se analizó el contenido de proteina del conjugado final usando en ensayo de Bradfor (reactivo Pierce Coomassie Brilliant Blue) y se determinó que la concentración final fue de 1.59 mg/ml. De igual forma se analizó el conjugado por medio de electroforesis SDS-PAGE y el contenido de endotoxina usando el ensayo LAL Finalmente, se hidrolizó una muestra de 150 pg del conjugado y se analizó usando HPLC de fase inversa para determinar el número de haptenos incorporado por cada molécula de proteína. Se encontró que el contenido de conjugado de hapteno-CRM 97 fue de 11 .6 haptenos por cada monómero de proteína.
EJEMPLO 10 Se encontró que aumentando la concentración de BAANS de la mezcla de reacción, se pudo controlar la cantidad de conjugado de hapteno/hapteno-espaciador introducida en la proteína portadora. A continuación se muestra un ejemplo de conjugación de preparación 57 con CRM197. a) Se descongelaron 9 mi de CRMig7 (53.19 mg a 5.91 mg/ml) y se desalaron en tampón de fosfato 100 mM, pH 8.0, usando columnas de desalado (BioRad) (on: 3ml, off: 4 mi). Se ajustó la concentración a 4 mg/ml usando el mismo tampón. b) Se disolvieron 30 mg de conjugado de hapteno-espaciador de la preparación 57 en 1.5 mi de DMSO (conc. Final de 20 mg/ml). c) Se preparó 1 mi de gel de TCEP (Pierce) mediante lavado doble en PBS Dulbecco, y antes se añadieron 1.5 mi de solución que contenía conjugado hapteno-espaciador. A continuación, se incubó a 2-8°C sobre plataforma rotante durante 2 horas. d) Trascurrida 1 hora de incubación TCEP, se dividieron los 10 mi de solución de CRM197 de 4 mg/ml en alícuotas de 5 x 2 mi, en recipientes de reacción separados, y se almacenaron en un espacio frío durante 30 minutos para ajustar la temperatura de la solución hasta 2-8°C. Se llevaron a cabo las siguientes etapas a 2-8°C. e) Al mismo tiempo, se preparó una solución de almacenamiento BAANS disolviendo 20 mg de BAANS en 1ml de DMSO. Se marcaron los 5 recipientes de reacción bien con la condición 1 , 2, 3, 4, o 5. Tras ajustar la temperatura de las alícuotas CRM197 a 2-8°C, se añadieron cantidades variables de solución de BAANS (50 ul, 100 ul, 150 ul, 225 ul y 300 ul) a los 5 recipientes de reacción de 2 mi, como se indica en la tabla 2. Se añadió la solución BAANS lentamente (gota a gota) y con mezcla. f) Se hicieron reaccionar las alícuotas durante 30 minutos a 2-8°C en una plataforma rotatoria. g) Trascurridos 30 min de incubación, se desaló 5 x 2 mi de CRM197 bromoacetilado en solución tampón de carbonato de sodio/bicarbonato 100 mM, pH 9.1 , usando columnas de NAP25 (Gibco) (ON: 2 mi, OFF: 3ml). h) Se centrifugó el gel deTCEP a partir de las muestras de hapteno y se añadieron lentamente 5.6 mg (280 ul) de conjugado de hapteno-espaciador (lentamente, gota a gota) con mezcla, a cada una de las muestras de CRM 97 bromoacetliada desalada. Se cubrieron los recipientes de reacción con papel de aluminio, para proteger los contenidos de la luz. i) Se hicieron reaccionar las mezclas durante 18 horas en una plataforma rotatoria. j) Se enfriaron los grupos BrAc que no habían reaccionado mediante la adición de NAC 0.5 mi por cada g de CRM197 (por tanto, 4 pl por reacción) a la mezcla de reacción. Se dejó que la mezcla reaccionara durante 3 horas sobre una plataforma rotatoria ( todavía cubierta con papel de aluminio para protegerla de la luz). k) Finalmente, se desaló cada reacción en PBS de Dulbecco usando columnas DG10 (ON: 3 mi, OFF: 4ml). El volumen final fue de 4 mi.
I) Se filtraron las muestras de forma estéril a través de un filtro de jeringa de 0.22 µ?t? y se tomaron alícuotas de forma aséptica. Se almacenaron las alícuotas asépticas a 2-8°C hasta su transporte al lugar de estudio. m) usando albúmina de suero bovino estándar, se analizó el contenido de proteína del conjugado final usando en ensayo de Bradfor (reactivo Pierce Coomassie Brilliant Blue) y se determinó que la concentración final fue la que se muestra en la tabla 3. De igual forma se analizaron los conjugados por medio de electroforesis SDS-PAGE y el contenido de endotoxina usando el ensayo LAL. Finalmente, se hidrolizó una muestra de 450 ig del conjugado y se analizó usando HPLC de fase inversa (N=3) para determinar el número de haptenos incorporado por cada molécula de proteína (datos de carga de haptenos mostrados en la tabla 5).
TABLA 3 TABLA 4 TABLA 5 EJEMPLO 11 Se inmunizaron ratones BALB/c (Charles River, Montreal, QC.) (n = 12 por grupo) con 10 pg de los conjugados de los ejemplos 1 a 4 por medio de inyección intra-muscular (en los días 0, 28 y 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alúm; Alhydrogel 85, 40 pg Al3+) y 50 pg de CpG 24555. Se midieron los niveles de anticuerpo IgG anti-nicotina por medio de ELISA como se ha descrito anteriormente.
La Figura 1 muestra los resultados, a partir de los cuales se puede ver que se obtiene una intensa respuesta de anticuerpos anti-nicotina, para cada conjugado sometido a ensayo, 4 semanas después de la inyección de estimulación previa, cuya respuesta se prolonga o aumenta 2 semanas después de cada de una las inyecciones de refuerzo primera y segunda.
EJEMPL0 12 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con 10 pg de los conjugados de los ejemplos 1 a 4 por medio de inyección intra-muscular (en los días 0, 28 y 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel 85, 40 pg Al3+) y 50 pg de CpG 24555. Se calcularon los índices de avidez a varios instantes de tiempo. El índice de Avidez corresponde con la concentración de tiocianato de amoníaco requerida para eluir 50% de los anticuerpos de anti-nicotina de las pocilios revestidas con Nicotina-BSA como se ha descrito anteriormente.
La Figura 2 muestra los resultados, a partir de los cuales se puede ver que los anticuerpos, en ratos sometidos a ensayo con los conjugados, muestran un elevada avidez 4 semanas después de la inyección de estimulación previa, cuya respuesta se prolonga ó aumenta 2 semanas después de cada de una las inyecciones de refuerzo primera y segunda.
EJEMPLO 13 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 6 por grupo) con 10 pg de los conjugados de los ejemplos 1 a 4 por medio de inyección intra-muscular (en los días 0, 28 y 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 pg Al3+) y 50 pg de CpG 24555. Trascurridas 2 semanas desde el último refuerzo, se administró nicotina-H3 (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi de nic-H3) por medio de inyección intravenosa, se recogió sangre y se sometieron los animales a perfusión, se retiraron los cerebros y se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó la proporción de 3H como se ha descrito anteriormente.
La Figura 3 muestra los resultados, a partir de los cuales se puede ver que la proporción de plasma/cerebro de los conjugados sometidos a ensayo es considerablemente mayor que la de los animales de control, indicando que los anticuerpos inducidos por los conjugados sometidos a ensayo son específicos para nicotina y secuestran la nicotina en sangre y evitan la captación de nicotina por parte del cerebro.
EJEMPLO 14 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con 10 pg de los conjugados de los ejemplos 1 a 4 por medio de inyección intra-muscular (en los días 0, 28 y 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 pg Al3+) y 50 pg de CpG 24555. Trascurridas 2 semanas desde el segundo refuerzo, se demostró la interacción de los anticuerpos antinicotina con la nicotina por medio de ELISA de competición como se ha descrito anteriormente.
La Figura 4 muestra los resultados, a partir de los cuales se puede ver que los anticuerpos inducidos por los conjugados sometidos a ensayo reconocen y se unen a la nicotina.
EJEMPLO 15 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con 10 pg de los conjugados de los ejemplos 1 a 2 por medio de inyección intra-muscular (en los días 0, 28 y 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 pg Al3+) y 50 pg de CpG 24555. Trascurridas 2 semanas desde el segundo refuerzo, se determinó la especificidad de los anti-cuerpos anti-nicotina frente a nicotina, cotinina, acetilcolina y vareniclina por medio de ELISA de competición como se ha descrito anteriormente.
La Figura 5 muestra los resultados, a partir de los cuales se puede ver que existe una inhibición, dependiente de la dosis, de la unión de anticuerpos anti-nicotina a las pocilios ELISA revestidas con nicotina a medida que aumenta la cantidad de nicotina añadida. No obstante, no se observa tal efecto con vareniclina, cotinina o acetilcolina, lo que indica que los anticuerpos inducidos por medio de los conjugados de ensayo son específicos para nicotina y no para cotinina, vareniclina o acetilcolina.
EJEMPLO 16 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con 10 pg de los conjugados del ejemplo 5 por medio de inyección intra-muscular (en los días 0, 28 y 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 pg Al3+) y 50 pg de CpG 24555. Se midieron los anticuerpos antinicotina (IgG total) en plasma por medio de ELISA como se ha descrito anteriormente.
Las Figuras 6, 7, 8 y 9 muestran los resultados, a partir de los cuales se obtiene una intensa respuesta anticuerpo anti-nicotina, para cada conjugado sometido a ensayo, 4 semanas después del primer ensayo terapéutico, cuya respuesta aumenta a las 2 semanas después del refuerzo. Además, tanto los niveles de anticuerpos anti-nicotina como la avidez de los anticuerpos anti-nicotina varían dependiendo del espaciador usado. Además, los conjugados sometidos a ensayo dan lugar a proporciones de plasma/cerebro más elevadas que en los animales de control, lo que indica que los anticuerpos inducidos por los conjugados sometidos a ensayo pueden secuestrar la nicotina en la sangre y evitar su captación por parte del cerebro en mayor medida que en los animales de control.
EJEMPLO 17 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con 10 pg de los conjugados de los ejemplos 6 y 7 por medio de inyección intra-muscular (en los días 0, 28 y 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 pg Al3+) y 50 pg de CpG 24555. Se midieron los niveles de anticuerpo anti-nicotina (IgG total) en plasma por medio ELISA. Trascurridas 2 semanas desde el último refuerzo, se administró nicotina-H3 (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi de nic-H3) por medio de inyección intravenosa, se recogió sangre y se sometieron los animales a perfusión, se retiraron los cerebros y se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio en los niveles de 3H con respecto a los animales de control como se ha descrito anteriormente.
Las Figuras 12 (niveles de anticuerpo de anti-nicotina) y 13 (% de cambio en los niveles de 3H) muestran los resultados, a partir de los cuales se observa que se obtiene una respuesta inmune, para cada conjugado sometido a ensayo, cuya respuesta aumenta de un modo que depende de la dosis. Esto indica que tanto DT como CRM197 son vehículos apropiados para los haptenos derivados de nicotina. Además, todos los conjugados sometidos a ensayo dan lugar a niveles de nicotina-3H que penetra en el cerebro más bajos que en el caso de los animales de control, lo que indica que los anti-cuerpos inducidos por los conjugados sometidos a ensayo pueden secuestrar la nicotina en sangre y evitar la captación por parte del cerebro en mayor medida que en los animales de control.
EJEMPLO 18 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 12 por grupo) con 10 pg de los conjugados de los ejemplos 6, 7 y 8 por medio de inyección intra-muscular (en los días 0, 28 y 42) en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 pg Al +) y 50 pg de CpG 24555. Se midieron los niveles de anticuerpo anti-nicotina IgG Ab en plasma por medio ELISA. Trascurridas 2 semanas desde el último refuerzo, se administró nicotina-H3 (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi de nic-H3) por medio de inyección intravenosa, se recogió sangre y se sometieron los animales a perfusión, se retiraron los cerebros y se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio en los niveles de 3H con respecto a los animales de control como se ha descrito anteriormente.
Las Figuras 14 (niveles de anticuerpo anti-nicotina) y 15 (% de cambio de los niveles de 3H) muestran los resultados, a partir de los cuales se observa que se obtiene una respuesta inmune, para cada conjugado sometido a ensayo, cuya respuesta aumenta con la carga de hapteno. Además, todos los conjugados sometidos a ensayo dieron lugar a niveles de nicotina-3H que penetra en el cerebro más bajos que en el caso de los animales de control, lo que indica que los anti-cuerpos inducidos por los conjugados sometidos a ensayo pueden secuestrar la nicotina en sangre y evitar la captación por parte del cerebro en mayor medida que en los animales de control.
EJEMPLO 19 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 10 por grupo) con 10 pg de conjugado del ejemplo 7 por medio de inyección intra-muscular en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 [ig Al3+) y 10 g de CpG 24555, o en presencia de ISCOMATRIX (IMX; 0.1 a 3.0 unidades). Se midieron los niveles de IgG de anti-nicotina por medio de ELISA (días 21 y 28) y la avidez por medio de ELISA de inhibición. Las Figuras 16A a 17 muestran los resultados a partir de los cuales se puede observar que se obtiene una respuesta inmune (niveles de Ab y avidez) con el uso de CpG 24555 e hidróxido de aluminio como coadyuvante de combinación, o con ISCOMATRIX como único coadyuvante, cuya respuesta aumenta con la dosis de ISOMATRIX.
Trascurrida 1 semana desde la 2a inmunización, se administró nicotina-H3 (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi de nic-H3) por medio de inyección intravenosa, se recogió sangre y se sometieron los animales a perfusión, se retiraron los cerebros y se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio de nicotina-3H en sangre y cerebros con respecto a los animales de control. La Figura 18 muestra los resultados a partir de los cuales se puede ver que el uso de CpG 24555 y de hidróxido de aluminio como coadyuvantes de combinación o de ISCOMATRIX como único coadyuvante da lugar a niveles de nicotina-3H que penetra en el cerebro más bajos que los de los animales de control, lo que indica que los anticuerpos inducidos por los conjugados sometidos a ensayo pueden secuestrar nicotina en sangre y evitar la captación por parte del cerebro en mayor medida que en los animales de control no inmunizados.
EJEMPLO 20 Se prepararon las muestras descritas en la Tabla 6 como se muestra a continuación. a) Se descongeló CRM197 (200 mi a 5.9 mg/ml) durante la noche a 4°C. b) Una vez descongelado, se concentró el CRM 97 de 200 mi a 100 mi por medio de ultra-flitración (UF) usando una membrana de polietersulfona Kvick Start (PES) con un límite de peso molecular de 10 kD. c) Se sometió a diafiltración CRM197 (DF) de 8 TOVs (volúmenes de recuperación) usando MPOS 50 mM (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), NaCI 50 mM, pH 7.2. Se filtró el post UF/DF CRM 97 usando un filtro de cápsula estéril SARTOPORE 2 150. d) Se determinó la concentración de CRM^? midiendo la absorbancia a A2eo usando un coeficiente de extinción de 0.942. Se determinó que la concentración fue de 9.65 mg/ml. e) Se diluyó el post UF/DF CRMi97 hasta 7.18 mg/ml desde 9.65 mg/ml usando MOPS 50 mM, NaCI 50 mM pH 7.2. f) En un recipiente preparado, se añadió lentamente una solución de HCI 6 M (7.46 mi) sobre 7460 mg del hapteno de la preparación 12, al tiempo que se enfriaba con un baño de hielo. Posteriormente se añadió MOPS 50 mM, NaCI 50 mM, tampón de pH 7.2 (2.00 mi) y se comprobó el pH con papel de pH. El pH fue de aproximadamente 9. Se añadió HCI 6 M, en pequeños incrementos, hasta que el pH fue de 7.5 (1.70 mi de HCI añadido). El volumen total de la solución fue de 18.65 mi, dando lugar a una concentración de 400 mg/ml del hapteno de la preparación 12. g) En un recipiente por separado, se disolvieron 7000 mg de sulfo-N-hidroxisuccinimida (sNHS) en MOPS 50 mM, NaCI 50 mM, solución de pH 7.2 (14 mi) y se añadió solución de NaOH 19.25 M en pequeños incrementos hasta alcanzar un pH de 7.13 (1.44 mi de NaOH añadido). El volumen total de la solución fue de 18.50 mi dando lugar a una concentración de 378 mg/ml de sNHS. h) En un recipiente por separado, se disolvieron 8000 mg de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) en 5 mi de MOPS 50 mM, NaCI 50 mM, pH 7.2. El volumen total de la solución fue de 12.0 mi dando lugar a una concentración de 666 mg/ml de EDC. Se preparó la solución al final, justo antes de la adición sobre las reacciones de conjugaciones. i) Se combinaron el post UF/DF CRM^/, el hapteno de la preparación 12 y las soluciones de sNHS y EDC de manera tal para generar las 24 muestras que se recogen en la Tabla 6. Para las 24 muestras, se mezclaron las cantidades calculadas de las soluciones de manera correcta de la siguiente forma: se combinaron UP/DF CRMi97, el hapteno de la preparación 12 y sNHS y se comprobó el pH de la mezcla. Para las muestras 10 y 18, se ajustó más el pH usando NaOH 1 M para llevar el pH hasta aproximadamente 7.5. Finalmente, se añadió EDC a las muestras. Se agitó cada tubo de reacción brevemente y se incubó a 5°C en un baño de agua durante 18 horas. j) Trascurridas 18 horas de incubación, se cambió el tampón de las muestras usando concentradores centrífugos Amicon ultra con un limite de peso molecular de 30 kD. El tampón usado fue fosfato de potasio 20 mM, histidina 20 mM, pH 7.0. Se determinó la concentración de proteina usando un estuche micro BCA disponibles comercialmente. k) Se disolvió sacarosa 200 mg/ml en agua y se añadió a cada una de las 24 muestras conjugadas con una proporción de 1 : 1 (volumen). Posteriormente, se añadió PS80 hasta una concentración final de 0.2 mg/ml. Se almacenaron las muestras a 4°C a corto plazo - y a 20°C a largo plazo.
TABLA 6 La metodología analítica para examinar las muestras 1-24 se muestra a continuación.
SELDI-MS. La ionización con desorción láser con superficie mejorada (SELDI) es un procedimiento de ionización de espectrometría de masas que se usa para el análisis de mezclas de proteínas. El ensayo muestra una ganancia de masa neta del andamiaje de CRMi97 por medio del procedimientos de conjugación. El cambio de masa es mostrado como aducios del andamiaje. De manera ideal, los aducios deben identificarse con el ensayo de Densidad de Epítopo específica para Haptenos. Aductos = (Masaconjugado - Masaandam¡aje) / MasaHapteno- Nótese que los valores de aducto que superen el valor de ED indican que se añade al andamiaje otra masa distinta de la del hapteno; y que las muestras con alto contenido en aducto también presentan un valor elevado de HMMS.
Cromatografía de Exclusión por Tamaños. Se desarrolló un ensayo de exclusión por tamaños para resolver HMMS (especies de alto peso molecular), dimero, monómero y LMMS (especies de baja masa molecular) hacia parámetros de procedimientos que inciden sobre la abundancia relativa de estos componentes. El procedimiento muestra los porcentajes de área relativa para el grupo de picos de HMMS, dimero, monómero y grupo de picos de LMMS. Nótese que la estequiometria del procedimientos y las proporciones de los materiales de partida incidieron sobre la distribución aparente de área de pico entre HMMS, dimero, monómero y LMMS.
Densidad de Epítopo. Se desarrolló un ensayo de cromatografía líquida de fase inversa acoplado con una preparación de muestra de hidrólisis acida para determinar la cantidad de conjugado de hapteno en la proteína portadora de CRM 97. Se conjuga la molécula de hapteno por medio de una unión amida al andamiaje de CRM197; se hidroliza este enlace para liberar el hapteno junto con los aminoácidos sustituyentes de acuerdo con la química de hidrólisis estándar. La cantidad de hapteno conjugado 7 es una medida de la consistencia del procedimientos, calidad del producto y de la eficacia.
La Tabla 7 muestra los resultados de la caracterización de las muestras 1 -24. Estos datos muestran una estrecha relación entre la eficacia y la densidad de epitopo de hapteno acoplado a CR 197 Además, se muestra que los valores óptimos de densidad de epitopo están correlacionados con aducios de elevado contenido en monómero y bajo contenido en HM S.
TABLA 7 EJEMPLO 21 Se inmunizaron ratones BALB/c (n = 10 por grupo) con 10 pg de muestras 1 -24(véase Ejemplo 20, Tablas 6 y 7) por medio de inyección intramuscular en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 pg Al3+) y 10 pg de CpG 24555. Se midieron los niveles de IgG de anti-nicotina por medio de ELISA (días 21 y 28) y la avidez por medio de ELISA de inhibición. Las Figuras 19 y 20 muestran los resultados, a partir de los cuales se puede observar que se obtiene una respuesta inmune, para cada conjugado sometido a ensayo, repuesta que aumenta con el% de monómero y que resultó óptima con una carga de hapteno de entre 10 y 18 haptenos por unidades de portador.
Trascurrida 1 semana desde la 2a inmunización, se administró nicotina-H3 (0.05 mg/kg de nicotina que contenia 3 pCi de nic-H3) por medio de inyección intravenosa, se recogió sangre y se sometieron los animales a perfusión, se retiraron los cerebros y se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio de nicotina-3H en sangre y cerebros con respecto a los animales de control. Las Figuras 21 y 22 muestran los resultados, a partir de los cuales se puede ver que todos los conjugados sometidos a ensayo dieron lugar a niveles de nicotina-3H que penetra en el cerebro más bajos que los de los animales de control, lo que indica que los anticuerpos inducidos por los conjugados pueden secuestrar nicotina en sangre y evitar la captación por parte del cerebro en mayor medida que en los animales de control no inmunizados, y que la eficacia aumentó con el% de monómero (Figura 21 ) y fue óptima con una carga de hapteno de entre 10 y 18 haptenos por unidad de vehículo (Figura 22).
EJEMPLO 22 Se sometió a ensayo la unión a Alhydrogel de las muestras 1-24 (véase Ejemplo 20, Tablas 6 y 7). Se inmunizaron ratones BÁLB/c (n = 10 por grupo) con 10 pg de estos conjugados diferentes por medio de inyección intra- muscular en presencia de hidróxido de aluminio (alumbre; Alhydrogel-85, 40 pg Al3*) y 10 pg de CpG 24555. Trascurrida 1 semana desde la 2a inmunización, se administró nicotina-H3 (0.05 mg/kg de nicotina que contenía 3 pCi de nic-H3) por medio de inyección intravenosa, se recogió sangre y se sometieron los animales a perfusión, se retiraron los cerebros y se cuantificaron los niveles de 3H y se determinó el% de cambio de nicotina-3H en sangre y cerebros con respecto a los anímales de control. La Figura 23 muestra los resultados, a partir de los cuales se puede ver que los conjugados con un mayor% de monómero presenta un mayor% de unión a Aiyhydrogel y que esto tiene una correlación con una eficacia mayor como queda demostrado por una reducción mayor de la cantidad de nicotina-3H en el cerebro.

Claims (33)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un hapteno de fórmula (I): en la que W es CH2- o -O-; y X es -NH2 o -SH.
2 - El hapteno de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque W está en posición 2, 5 o 6 del anillo piridina.
3. - El hapteno de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque W es -O y W está en posición 5 del anillo piridina.
4. - El hapteno de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el hapteno se escoge entre el grupo que consiste en
5.- Un conjugado de hapteno-espaciador de fórmula (II): X-(espaciador) en la que W es -CH2- o -O-; -(espaciador)- es un grupo alquileno C Ce, un grupo cicloalquileno C3-C10 o un grupo alquileno C Ci2 interrumpido por -N(H)C(0)-; y X es -NH2 o -SH.
6. - El conjugado de hapteno-espaciador de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque X es -SH.
7. - El conjugado de hapteno-espaciador de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque X es -NH2.
8.- El conjugado de hapteno-espaciador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado además porque -(espaciador)- es un grupo alquileno CrC8.
9.- El conjugado de hapteno-espaciador de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado además porque W es -0-¡ y W se encuentra en posición 5 del anillo piridina.
10.- Un conjugado de hapteno-vehículo de fórmula (III): en la que W es -CH2- o -O-; -(espaciador)- es un grupo alquileno CrC8, un grupo cicloalquileno C3-C10 o un grupo alquileno C Ci2 interrumpido por 1 a 4 átomos de oxígeno y de manera opcional interrumpido por un -N(H)C(O)-¡ X* es -NH- o -S-; m es 0 o 1 ; n es un número entero de 1 a 1000; e Y es una proteina portadora opcionalmente modificada que se escoge entre toxoídes bacterianos, sustancias inmunogénicas, virus, partículas similares a virus, complejos de proteínas, proteínas, polipéptidos, liposomas y complejos inmuno-estimuladores.
1. - El conjugado de hapteno-vehículo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque W se encuentra en posición 2, 5 o 6 del anillo de piridina.
12. - El conjugado de hapteno-vehículo de conformidad con la reivindicación 10 u 11 , caracterizado además porque W está en posición 5 del anillo piridina.
13. - El hapteno de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque m es 0 y X* es -NH-.
14.- El conjugado de hapteno-vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicación 10 a 13, en el que la proteina portadora es una proteina opcionalmente modificada seleccionada entre derivados de toxina de tétanos (por ejemplo, toxoide tetánico inactivado químicamente), derivados de toxoide diftérico (por ejemplo, toxoide diftérico inactivado químicamente o CRMi97 mutante genético no tóxico), hemocianina de lapa de bocallave (KLH), hemocianina complejo de proteína de membrana externa (OMPC) de Neisseria meningitidis, la subunidad B de Escherichia coli termo-lábil, exoproteina A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) y otras partículas similares a virus tales como las ensambladas a partir de proteína de recubrimiento recombinante de bacteriófago Qb, antígeno superficial de hepatitis B, antígeno de núcleo de hepatitis B o virosoma.
15 - El conjugado de hapteno-vehículo de fórmula (III) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado además porque el vehículo es una proteína que se escoge entre toxoide diftérico y CRM197, que se encuentran opcionalmente modificadas
16.- El conjugado de hapteno-vehículo de fórmula (III) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado además porque la proteína portadora es una proteína succinilada modificada.
17 - El conjugado de hapteno-vehículo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizado además porque n es un número entero dentro del intervalo de 10 a 18, ambos incluidos.
18.- Una composición de vacuna que comprende: una pluralidad de conjugados de hapteno-vehiculo como los que se reclaman en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17; y uno o más adyuvantes.
19. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque uno de uno o más adyuvantes es CpG 24555.
20. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque uno de uno o más adyuvantes es una sal de aluminio.
21. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque la sal de aluminio es hidróxido de aluminio.
22. - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque los adyuvantes son CpG 24555 e hidróxido de aluminio.
23.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque uno de uno o más adyuvantes es un complejo inmuno-estimulador (ISCOM).
24 - La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque el complejo inmuno-estimulador es ISCOMATRIX.
25.- Una composición de vacuna que comprende CpG 24555 y una pluralidad de conjugados de hapteno-vehiculo de fórmula (IV): en la que Y es toxoide diftérico o CRM197; y, n es un número entero dentro del intervalo de 1 a 40, ambos inclusives.
26.- Una composición de vacuna que comprende CpG 24555, hidróxido de aluminio y una pluralidad de conjugados de hapteno-vehiculo de fórmula (IV): en la que Y es toxoide diftérico o CRM197; y n es un número entero dentro del intervalo de 1 a 40, ambos inclusives.
27.- Una composición de vacuna que comprende ISCOMATRIX y una pluralidad de conjugados de hapteno-vehiculo de fórmula (IV): en la que Y es toxoide diftérico o CRM197; y n es un número entero dentro del intervalo de 1 a 40, ambos incluives.
28 - La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizada además porque n es un número entero dentro del intervalo de 10 a 18 ambos inclusives.
29.- La composición de vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, caracterizada además porque al menos 70% de la pluralidad de conjugados de hapteno-vehículo comprende proteínas portadoras (Y) que no son especies de alto peso molecular.
30 - Un conjugado de hapteno-vehículo como el que se reclama en las reivindicaciones 10 a 17, o una composición de vacuna como la que se reclama en las reivindicaciones 18 a 29, para usarse como medicamento.
31.- Un conjugado de hapteno-vehículo como el que se reclama en las reivindicaciones 10 a 17, o una composición de vacuna como la que se reclama en las reivindicaciones 18 a 29, para usarse con el fin de aumentar las tasas de abandono en fumadores que desean dejar el hábito y para reducir las tasas de recaída en ex-fumadores que han tenido éxito a la hora de abandonar la práctica de fumar, a través de vacunación con una vacuna antinicotina o por medio de un tratamiento previo con farmacoterapia o abandono voluntario; o para usarse en el tratamiento o prevención de la dependencia de la nicotina en una persona.
32.- El uso de una composición de vacuna como la que se reclama en las reivindicaciones 18 a 29, para preparar un medicamento para contribuir a dejar de fumar en fumadores que desean abandonar la práctica de fumar o para evitar la recaída en ex-fumadores que han tenido éxito a la hora de abandonar la práctica de fumar, a través de vacunación con una vacuna anti-nicotina o por medio de un tratamiento previo con farmacoterapia o abandono voluntario, o para prevenir la dependencia de nicotina en una persona.
33.- El uso de un conjugado con vehículo de hapteno como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, o una composición de vacuna como la que se reclama en las reivindicaciones 18 a 29, para preparar un medicamento para aumentar las tasas de abandono en fumadores que desean abandonar la práctica de fumar, reducir las tasas de recaída en ex-fumadores que han tenido éxito a la hora de abandonar la práctica de fumar, a través de vacunación con una vacuna anti-nicotina o por medio de un tratamiento previo con farmacoterapia o abandono voluntario, o para prevenir la dependencia de nicotina en una persona.
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