JPH02219595A - ハプテンである抗原に対し高親和性を持つ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医療診断分野、化学分析などに有用な免疫的
検出方法において最も重要な働きをする抗体の高性能化
に関するものである。特に、それ自体では免疫反応を引
き起こすことのできない低分子化合物すなわちハプテン
に対して、高いアフィニティーを持つ抗体の作製に関す
る。

さらに詳細には、中枢神経興奮作用を有し覚醒剤の一種
であるメタンフェタミンに対して、高い親和力を持つ抗
体及びモノクローナル抗体の作製に関する。

従来の技術 血液中の微量成分や、大気中の特定成分の検出を行なう
際には、非常に多くの不純物から特定の極微量成分を確
実に検出する必要がある。このような目的のために、近
年抗体の反応に基づく免疫的検出方法が盛んに研究され
ている。

免疫的検出方法は放射性同位体を用いるラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）と、酵素を用いるエンザイムイムノア
ッセイ（ＥＩＡ）に大別される。安全性や簡便性の点か
らは、ＥＩＡが有利である。

ここでＥＩＡとして一般的なエンザイムリンクトイムノ
ンルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法について説明する
。第１図においてｌはタンパク質を非特異的に吸着する
プラスチック（ポリスチレン等）のマイクロプレートで
ある。２は被測定物質である抗原に適当な官能基を導入
し、これを介してタンパク質と化学的に結合した固相抗
原で、マイクロプレート！に吸着している。３は非測定
物質に対して結合能を持つ抗体であり、固相抗原２と平
衡的に結合している。すなわち抗体３は固相抗原２を介
してマイクロプレートｌに固定化されている。この状態
で、４の被測定物質である抗原を導入すれば抗体３に対
して固相抗原２と被測定物質である抗原４が競争的に結
合する。したがって抗体３の一部が被測定物質である抗
原４と結合することになり、結果的に一部の抗体３はマ
イクロプレートロこ固定化されていない状態になる。当
然被測定物質である抗体４が多いほどマイクロプレート
ｌに固定化されていない抗体３は増加する。ここで洗浄
を行なうことにより、マイクロプレート１に固定化され
ていない抗体３を除去することができる。マイ、クロプ
レートｌに固定化されていない抗体３を除去した後、抗
体３に対して結合能を持つ抗体５を加える。ただし、抗
体５は６の酵素と一定の比で化学的に結合している。抗
体３に未結合の抗体５を洗浄によって除去した後、酵素
６の活性を測定する。活性と酵素Ｂの量との間には正の
相関があるので、活性を測定することにより酵素６の量
を定量する事ができる。酵素６の量がわかれば、遡って
マイクロプレート！に固相抗原２を介して固定化された
抗体３の量が定量可能であり、さらに被測定物質である
抗原４が定量できる。この際、検出感度を決定する第一
の要因は抗体３の被測定物質である抗原４に対する親和
力である。

抗体とは生物が産生ずるタンパク質の一種で、特定の物
質すなわち抗原とのみ選択的に結合する性質がある。抗
原は、それに結合する抗体の作製方法の違いから２種類
に大別される。１つは直接動物体内に注射することによ
り抗体を産生ずることができるもので、通常分子量致方
以上の巨大分子がこれに相当する。他方は比較的分子量
の小さいもので、適当なタンパク質に化学結合して初め
て抗体の産生を誘導する免疫原となり得る。特に後者の
ような抗原はハプテンと呼ばれている。ハプテンである
抗原に対する抗体の作製方法に関しては、例えば以下の
文献（ハプテンズ　アンド　キャリアーズ、ｏ、マケラ
　アンド　１．　　Ｊ、　　Ｔ。

セパラ、ハンドブック　オブ　エクスペリメンタル　イ
ムノロジー　フォース　エデイシーン、Ｖ。

１．１１Ｃｈａｐ　３、ｘデイティー／ド　バイ　Ｄ、
　　Ｍ。

ヴエイアー　ブラックウェル　サイエンティフィック　
パブリケーシｅンズ、オックスフォード、１９８Ｂ、　
　Ｈａｐｔｅｎｓ　ａｎｄ　Ｃａｒｒｌｅｒｓ、　Ｏ，
Ｍａｋｅｌａ　ａｎｄ　１、Ｊ、Ｔ、５ｅｐｐａｌａ、
　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｌｍｅｎｔａｌ
　Ｉｍ＋ａｕ−ｎｏｌｏｇｙ　４ｔｈ　ｅｄｌ−ｔｌｏ
ｎ、　Ｖｏｌ、１．　Ｃｈａｐ　３．　ｅｄ　ｂｙ　Ｄ
。

Ｍ、Ｗｅｉｒ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　　５ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ　　Ｐｕｂｌｌｆｌｃａｔｌｏｎｓ。

０ｘｆｏｒｄ、　１９８Ｇ、）に記載されている。すな
わち、ハプテンに化学結合が可能な官能基が存在すれば
、その官能基を用いてタンパク質と結合して免疫原とす
る。もし、対象とするハプテンに官能基が存在しなけれ
ば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の適切な官能
基と、炭素数１から！０程度アルキル鎖からなるスペー
サーを導入したハプテンの誘導体を合成した後、架橋試
薬等で適当なタンパク質と結合して免疫原を得るのが一
般的である。より具体的な例を示せば、タカミらは覚醒
剤の一種であるメタンフェタミン（ＨＡ）をハプテンで
ある抗原とする抗体の作製に関して報告している（タカ
ミ、フタダ　アンド　タカハシ、ジャパニーズジャーナ
ル　オブ　ジーガル　メディスン、Ｔａｋａｍｌ、　Ｆ
ｕｋｕｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋａｈａｓｈｌ、　Ｊｐｎ、
　Ｊ、ｌ　Ｌｅｇａｌ　Ｍｅｄ、、　３７（４）、　４
１７．１９８３）。すなわち、ＨＡの第二アミンにアミ
ノブチル基を導入してアミノブチルメタンフェタミン（
ＡＢＭＡ）とし、これをタンパク質と結合して免疫原と
している。

発明が解決しようとする課題 しかしながら上記の免疫原で作製した抗体は、目的抗原
であるＨＡよりもむしろ抗原誘導体であるＡＢＭＡに対
して高い親和力を有していることが発明者らの検討によ
り明かになった。即ち従来の方法で得られる抗体はあく
まで抗原誘導体に対する抗体である。抗原誘導体は、官
能基、スペーサー等の導入により、本来目的とする抗原
とは異なった構造なので、本来目的とする抗原に対して
高い親和力の抗体を作るのは困難であるという課題が浮
き彫りにされた。

また、このため、従来の方法によって得られる抗体を用
いて、例えば上記ＥＬＩＳＡ法で本来目的とする抗原を
被測定物質として測定を行う際、多量の被測定物質であ
る抗原が導入されてもマイクロプレートに固定化されて
いない抗体が増加しないので、被測定物質である抗原を
高感度に検出することが不可能となる。

課題を解決するための手段 上記課題を解決するため、官能基及びスペーサーを導入
した状態で目的抗原と類似性の高い物質を抗原誘導体合
成の出発物質とすることを考えた。

具体的には、目的抗原分子中のアルキル基が水素原子と
置換した物質を出発物質として、この水素原子の位置に
タンパク質と結合可能な官能基及びスペーサーを導入し
、この官能基を介してタンパク質と結合させて得られる
免疫原を作製することが考えられる。

より具体的には、中枢神経興奮作用を有し覚醒剤の一種
であるメタンフェタミン（ＨＡ）を目的抗原とし、かか
る抗原に対して高い親和力を持つ抗体を作製するために
、ＭＡのトアルキル基であるメチル基が水素原子に置換
された構造を有するアンフェタミン（ＡＰ）にタンパク
質と結合可能な官能基及びスペーサーとしてアミノブチ
ル基を導入した抗原誘導体であるアミノブチルアンフェ
タミン（ＡＢＡＰ）を用いた。以下にＡＰ、　ＡＢＡＰ
ｌ　鮎、ＡＢＭＡの化学構造を示す。

［ＡＰ］ ［ＡＨＭＡ］ ［ＡＢＡＰ］ ［ＭＡ］ ■ ＩＩＡとＡＢＡＰとに化学構造上の高い類似性があるこ
と分かる。

他の好ましい抗原誘導体としては、以下の構造式（ｎは
整数を示す）で示されるアンフェタミン誘導体が挙げら
れる。ｎは整数であり、特にｎは１から１０の整数が好
ましい。ｎが４の場合には、以下の構造式はＡＢＡＰを
示す。

これらのアンフェタミン誘導体は、ＡＰに、例えばトブ
ロモブチルフタルイミドなどのトハロアルキルフタルイ
ミドを反応させてト（４−フタルイミジルアルキル をヒドラジンで処理することによって容易に得ることが
できる。

次にアミノブチル基を介して、ＡＢＡＰをスカシ貝由来
のヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合し、免疫原とした。Ｋ
ＬＨ以外にも、例えばニワトリ等から得られるガンマグ
ロブリン、牛血清アルブミンなどのタンパク質を用いて
もよい。また他のアンフェタミン誘導体もその分子中の
アルキル基を介してＫｌ，Ｈ等のタンパク質に結合させ
ることができる。ＡＢＡＰなとのアンフェタミン誘導体
とタンパク質との結合は通常の方法によって行なうこと
ができる。すなわち、例えばトサクシイミジル３−（２
−ピリジルジチオ）−プロピオネート（　ＳＰＤＰ）　
、）リレン−２，４−ジイソシアネート、グルタルアル
デヒド、過ヨウ素酸、！，５ージフルオロー２，４−ジ
ニトロベンゼン（　ＤＦＤＮＢ）　、サクシニミジル４
−（トマレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルホ
キシレー）　（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γーマレイミドブチ
リロキシ）サクシニミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレ
イミドカプロイロキシ）サクシニミド（ＥＭＣＳ）など
の通常の結合試薬を用いて実施できる。

かくして得られる免疫原は、目的抗原であるＭＡと化学
構造上の類似性の高い構造を含んでいる。

この免疫原を動物体内に注射して抗体を作製し、さらに
得られた抗体を用いてＭＡを被測定物質とするＥＬＩＳ
Ａを行なった。

なお、免疫に用いる動物はは乳類であればすべて適用で
きるが、実験の簡便さからマウスを選択した。マウスの
系統はＡ／Ｊが最も免疫応答が高く、好適であった。

作用 上記の如く、官能基及びスペーサーを導入した状態で目
的抗原と化学構造上の類似性の高い物質を出発物質とし
、これに官能基及びスペーサーを導入した抗原誘導体を
該官能基を介してタンパク質と結合させて作製した免疫
原を用いれば、その免疫原は目的抗原と化学構造上の類
似性の高い構造を含む。従って、このような免疫原を動
物体内に注射すれば、動物の血清中から目的抗原に対し
て高い親和力を持つ抗体が得られる。

また、上記免疫原で感作した動物の脾臓細胞とミエロー
マ細胞とを融合することによって、目的抗原に対して高
い親和力を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイブ
リドーマを得ることもできる。ハイブリドーマの調整は
、ケーラーとミルシュタインの方法（ケーラー　エト　
アール、ネイチ＋　−２５８，４９５（１Ｂ７５）、Ｋ
ｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５８
．４９５（１９７５））として知られている通常の手法
により行なうことができる。

具体的には、　　ＡＢＡＰとＫＬＨをＡＢＡＰのアミノ
ブチル基を介して結合した免疫原をＡ／Ｊ系統のマウス
の体内に注射し、その血清からＡＢＭＡに比べＭＡに対
してより高い親和力を持つ抗体を得ることができた。

さらに、該マウスの脾臓細胞と８−アザグアニン耐性株
の一つであるマウスミエローマ細胞Ｘ８３−Ａｇ３・６
５３を、ポリエチレングリコールなどの融合促進剤の存
在下で融合せしめ、得られる融合細胞をＩＩＡＴ培地中
で培養して、ＡＢＭＡに比べＭＡに対してより高い親和
力を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マを作製することができた。

また、このハイブリドーマを適当な培地中で培養し、そ
の上清からＡＢＭＡに比べＨＡに対してより高い親和力
を有するモノクローナル抗体を得ることができた。

得られたＡＨＭＡに比べＭＡに対してより高い親和力を
有する抗体及びモノクローナル抗体を用いて、ＨＡを被
測定物質とするＥＬＩＳＡを行なったところ、従来に方
法で得られた抗体を用いた場合に比べて、ＨＡの検出感
度が約１０００倍向上した。従って、これら抗体は診断
分野、化学分析などにおいて極めて有用である。

実施例 本発明の一実施例として中枢神経興奮作用を有し覚醒剤
の一つであるＭＡを目的抗原とし、かかる抗原に対して
高い親和力を持つ抗体を作製した。

以下、操作手順に従って実施例の詳細な説明を行なう。

実施例１ 最初に、抗血清の作製方法について述べる。

（１）　ＡＢＡＰの合成法 ＡＰ　２．ｏｏｇ、　　Ｎ−ブロモブチルフタルイミド
（アルドリッチ　ケミカル　カンパニー　Ｉ　ｎ　ｃ、
　　製）４．１７ｇおよび炭酸水素ナトリウム３．１４
ｇをベンゼン１０１中で１６時間還流した。反応液から
溶媒を除去した後、シリカゲルを担体とした分取用薄層
クロマトグラフィー（ＴＬＣ）　　（メルク　アンド　
Ｃｏ、。

Ｉｎｃ、　　製）を用いて精製した。展開溶媒は、メタ
ノールとクロロホルムを体積比で５＝９５に混合したも
のをアンモニアで飽和して用いた。ＡＢＡＰのＲｆ値は
０．７であった。メタノールでシリカゲル中のＡＢＡＰ
を抽出した結果、１．５９ｇのト（４−フタルイミジル
ブチル）アンフェタミン（ＰＩＢＡＰ）が得られた。

ＰＩＢＡＰ　１．５０ｇを５ｓ１１７）９５％ｚタノー
ルニ溶解し、０．２５ｇのヒドラジン菫永和物を加えて
ｌ゛、５時間還流したところ、少量の白色沈澱が生じた
。再び濾過した後、濾液をＩＮ塩酸で酸性にし、生じた
白色沈澱を除去した。さらに、この溶液を水酸化ナトリ
ウムでアルカリ性にすると、油層が分離した。油層をジ
エチルエーテルで抽出し、溜去後、前項と同条件のＴＬ
Ｃで精製した。目的物はニンヒドリン試薬と反応して青
紫色を呈する。この反応を利用してＴＬＣ上の目的物を
確認した。最終的に０．７５ｇのト（４−アミノブチル
）アンフェタミン（ＡＢＡＰ）が得られた。

（２）免疫原の作製法 ＡＢＡＰ　１９．１Ｂを２００μｌノ０．５Ｎ塩酸に溶
解し、０゜１Ｍ　リン酸バッファー溶液（ｐＨ７，５）
　４．８ｍｌで希釈した。この溶液に、チオール基導入
試薬であるＮ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネイト（ＳＰＤＰ）　　（ファルマシア
　ＬＫＢ　　バイオテクノロジー製）　１２．５Ｍｇを
１１のエタノールに溶解したものを加え、３０分間攪拌
し反応させた。反応の進行状況を確認するため、反応液
をＴＬＣ上に展開した。展開溶媒は前項と同じ物を用い
た。５ＰＤＰはＴＬＣ上で、２５４ｎ＋ｓの紫外光を吸
収する黒いスポットとして確認される。３０分間攪拌を
行なった反応液ではＴＬＣ上の黒いスポットが消失して
おり、５ＰＤＰは完全にＡＢＡＰと反応していた。この
ようにして５ＰＤＰとＡＢＡＰの結合物（ＡＰ−ＳＰＤ
Ｐ）を得た。

一方、ＫＬＨを０．１ＭのＮａＣ１を含む０．１Ｍ　リ
ン酸バッファー（ｐＨ７，０）に溶解し、２．２＋＋ｇ
／ｍｌのＫＬ■溶液を調整した。５ＰＤＰ　５１．６Ｂ
をエタノール４．２１に溶解したものを、ＫＬＨ溶液に
滴下し、１２時間攪拌し反応させた。その後、セファデ
ックスＧ−２５（ファルマシア　ＬＫＢ　　バイオテク
ノロジー製）を用いたゲル濾過により、反応液中の未反
応の５ＰＤＰを分離し、ＫＬＩＩと５ＰＤＰの結合物（
ＫＬＨ−ＳＰＤＰ）を得た。セファデックスＧ−２５は
、直径４ｃ＋ｓ長さ５０ｃｍのカラムに充填し、毎分６
．９１の流速で用いた。ジチオスレイトールを０．１Ｍ
　リン酸バッファーに溶解し、この溶液！、８１をＫＬ
Ｈ−ＳＰＤＰに加え、還元をおこなった。混合溶液を、
再び上記と同条件でセフ１デックスＧ−２５カラムでゲ
ル濾過した後、この溶液１０１０１ＥにＡＰ−ＳＰＤＰ
溶液を徐々に加えた。３０分後、上記と同条件でセファ
デックスＧ−２５カラムによるゲル濾過をおこなったと
ころ、ＫＬＨＩ分子あたりＡＰ　Ｉ４．３分子が導入さ
れた。このようにして得られたＫＬＨとＡＰの結合物（
ＡＰ−ＫＬＨ）を免疫原として用いた。

（３）免疫方法 ＡＰ−ＫＬＨ溶液を０．ＩＭ　ＮａＣ１を含むＯ，１Ｍ
　リン酸バッファー溶液（ｐＨ７，０）で希釈し、ＫＬ
Ｈ濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整した。このＡＰ−ＫＬＲ溶
液とコンプリートフロインドアジュバントを等量混合し
、ホモジナイザーで乳化したものを、８週齢のマウスの
腹腔に注射した。注射量は一匹のマウスについて１００
μｌとした。なお、マウスの系統は前述したようにＡ／
Ｊを用いた。

（４）　ＥＬＩＳＡによる抗血清の評価ＡＰ−ＫＬＨに
よる免疫後１８週を経過した時点で、マウスの血清を採
取した。この血清を用いてＥＬＩＳＡをおこない、ＭＡ
及びムＢＭＡを被測定物質とした際の測定感度を求めた
。ＥＬＩＳＡは、以下の条件でおこなった。

牛血清アルブミン（ＢＳＡ）　１分子に対して抗原誘導
体であるＡＢＭＡ　０．４分子が導入されたＢＳＡとＡ
ＢＭＡの化学的結合物（ＭＡ−ＢＳＡ）を固相抗原とし
て、ポリスチレンでできた９Ｂ穴（９８ｗｅｌｌ）　Ｅ
ＬＩＳＡ用プレート（コースタ−コーボレーシ１ン製）
上に吸着固定した。マウスより採取した抗血清をフォス
フェートバッフアートセライン（ＰＢＳ）でｔｏ　、ｏ
ｏｏ倍に希釈し、各種濃度のＭＡまたはＡＢＭＡ溶液と
１：ｌに混合した。この混合溶液を９６穴ＥＬＩＳＡ用
プレートに１穴あたり１００μｍ分注した。３時間経過
後、混合溶液を除去し、９Ｇ穴ＥＬＩＳＡ用プレートを
ＰＢＳで洗浄した。

この操作によって、プレート上のＨＡ−ＢＳＡに未結合
の抗血清中の抗体は除去される。ついで、抗血清中に含
まれるマウス抗体に結合能を持つ抗体を上記と同量分注
した。この抗体は、ペロキシダーゼ（ＰＯＤ）と化学的
に結合された、いわゆるＰＯＤ標識抗体である。３０分
経過後、ＰＯＤ標識抗体溶液を除去し、再びＰＢＳで９
６穴ＥＬＩＳＡ用プレートの洗浄をおこなった。この操
作で、プレート上の固相抗原に結合したマウス抗体に未
結合ＰＯＤ標識抗体は除去される。一方、ＰＯＤの基質
である０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）　４０ｍｇを
０．ＩＭ　リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５，０）　
ｌ１０ｍ１ｋ溶解し、４１１１ノ３０％　Ｈａｒ２を混
合した。この混合溶液を、未結合のＰＯＤ標識抗体を除
去後ＰＢＳで洗浄済みの９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに
、１穴あたり１００μｍ分注した。１〜２分後、プレー
ト上に結合したＰＯＤ標識抗体のＰＯＤの働きによりＯ
ＰＤが酸化され、４９２ｎｍに極大を持つ発色が観察さ
れた。４Ｎ硫酸を１穴あたり２５μ１分注して酵素反応
を停止した後、分光光度計によって各人の溶液の４９２
ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を第２図に実線で示
す。

また比較例として、上記ＡＰ−ＫＬＩＩと同様に合成し
たＭＡとＫＬＨの化学的結合物（ＭＡ−ＫＬＩＩ）を用
いて免疫したマウスの、免疫後１８週経過した時点で採
取した血清について、上記と同条件でＥＬＩＳＡをおこ
なった結果を第２図に点線で示す。

第２図において縦軸は４９２ｎｍの相対吸光度であり、
酵素活性を示す。すなわち、固相抗原に結合した抗血清
中のマウス抗体の相対量を示しており、あるＨＡ濃度で
の相対吸光度の低下があれば、その濃度のＨＡが検出可
能であると言える。横軸は、測定に用いた抗血清とＭＡ
またはＡＢＭＡの混合溶液の、ＭＡまたはＡＢＭＡの濃
度を示す。横に引いた点線は相対吸光度５０％を表わす
。

第２図の結果について検討を加える。

曲線ａは従来法で作製した抗体によるＨＡの検出曲線、
曲線すは従来法で得られた抗体によるＡＢＭＡの検出曲
線、曲線Ｃは本実施法で作製した抗体によるＭＡの検出
曲線、曲線ｄは本実施法で作製した抗体によるＡＢＭＡ
の検出曲線を示す。

まずＭＡ−ＫＬＨで免疫して得られた抗血清について、
相対吸光度が５０％に減少するＨＡ濃度を曲線ａで見る
と、１０１・６Ｍであった。ＡＲＩＡについては曲線Ｂ
を見ると、１０−８・２Ｍで相対吸光度が５０％に減少
している。

すなわち、ＡＢＭＡはＨＡに比べ一　抗血清中のマウス
抗体の固相抗原への結合を約５０倍強く阻害するといえ
る。言い替えれば、ＭＡ−ＫＬＨの免疫によって得られ
た抗体は、ＭＡよりＡＢＭＡに対して約５０倍強く結合
する。一方、ＥＬＩＳＡに用いた固相抗原がＡＢＭＡと
ＢＳムの化学的結合物であり、ＡＢＭＡと同じ構造を含
んでいることを考えれば、ＭＡ−ＫＬＨの免疫によって
得られた抗体はＭＡより固相抗原に強く結合することが
予想される。前述したように、ＥＬＩＳＡの測定原理は
、固相抗原と被測定物質である抗原が抗体に競争的に結
合する結果、抗体の固相抗原への結合が阻害され、抗体
の固相抗原への結合量が減少することを利用している。

抗体が固相抗原により強く結合すれば、被測定物質であ
る抗原による抗体の固相抗原への結合の阻害が起こりに
りく、結果として測定感度の低下を招く。

一方、ＡＰ−ＫＬＨこよって免疫した抗血清では、相対
吸光度が５０％に減少するとぎのＭＡ濃度は曲線Ｃより
１Ｏ−６・６本　ＡＤＭＡでは曲線ｄよりｌＯ−＠・６
Ｍであった。

つまり、ＡＰ−ＫＬＨで免疫して得られる抗体はＭＡ−
ＫＬＨで免疫したときとは逆に、抗原誘導体ＡＢＮＡよ
りもＨＡに対して約５０倍強く結合する。したがって、
前述したような測定感度の低下は考えられない。事実、
ＡＰ−ＫＬＩＩによる免疫で得られた抗血清を用いたＥ
ＬＩＳＡで、相対吸光度が５０％に減少するＨＡ濃度で
ある１Ｏ−６・６Ｍは、ＨＡ−ＫＬＨによる免疫で得ら
れた抗血清を用いた場合に比べ約１０００分の１の低濃
度であった。

なお、上記の考え方に基づく免疫原は本実施例に示した
ＨＡ以外についても、分子量１０００以下のハプテンに
対する抗体を作製する際、−船釣に適用可能である。さ
らに、本実施例で感作した動物の膵臓細胞とミエローマ
細胞を融合したハイブリドーマ細胞から産生される抗体
、いわゆるモノクローナル抗体も、当然抗血清と同様の
性質を示す。

すなわち、目的抗原であるハプテンに対し最も強く結合
するモノクローナル抗体を得ることができる。以下、モ
ノクローナル抗体の作製方法について述べる。

実施例２ 実施例１で、ＡＢＭＡに比べＭＡに強く結合する抗体の
産生が確認されたマウスを用いてモノクローナル抗体の
作製をおこなった。以下手順を追って、実施例の説明を
おこなう。

（１）マウスのブースト ＡＰ−ＫＬＨによる免疫後７週の時点で、膵臓を肥大さ
せるためにマウスにブースト処理を施した。すなわち、
ＡＰ−ＫＬＨをＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈し、マウス
１匹あたり１００μｌを腹腔内に注射した。

（２）細胞融合 ブースト後３臼目にマウスの膵臓細胞を取り出し、マウ
スミエローマ細胞Ｘ８３−Ａｇ３・８５３と融合した。

以下手順を詳細に示す。

（１）マウスを屠殺、消毒後クリーンベンチ内に移動し
た。以下の操作はすべてクリーンベンチ内で無菌的にお
こなった。

（ＩＩ）マウスの膵臓を摘出し、予め５１のイシコフ改
変ダルベッフ培地（ＩＭＤＭ）　　（シグマ　ケミカル
カッハニー製）に浸漬していたステンレスメツシュ上に
移した。ハサミでＮｉｌに約ＩＯカ所の切り目を入れ、
細胞摘出用のガラス棒を用いて注意深く脾臓を押しつぶ
した。この操作により、膵臓細胞はＩＭＤＨに懸濁され
る。膵臓細胞を懸濁したＩＭＤＭを１５ｍ１遠心管に移
した後、メツシュ上に残った細胞をさらに５１のＩＮＤ
Ｈで洗浄し、これも遠心管に加えた。以下（１ｘ）まで
の操作は、極力細胞の温度を４℃に保つよう、遠心機を
冷却し、随時水浴を用いた。

（Ｈｌ）ｍ臓細胞の懸濁液を、８００ｇで７分間遠心分
離をおこない、上清をアスピレータで除去した。

（１ｖ）不要成分である赤血球を破壊するため、ＮＢ４
Ｃ１を含むトリスバッファー１ｈ＋を加え、管底に付着
している細胞をピペットで攪拌してほぐした。

５〜ＩＯ分氷上で放置した後、８００ｇで７分間遠心分
離をおこない、上清をアスピレータで除去した。

（Ｖ）ハンクス平衡塩液（大阪大学微生物病研究所製）
　１０ａ＋１を加え、遠心管底部の細胞を撹拌してほぐ
した後、氷上で５〜ｌＯ分放置した。組織断片が沈降し
た場合は、この断片を取らないよう細胞懸濁液のみを別
の遠心管に移した。８００ｇで７分間遠心分離をおこな
い、上清をアスピレータで除去した。

（ｖｉ）再びハンクス平衡塩液１０ｍ１を加え、管底部
の細胞を攪拌してほぐした。８００ｇで７分間遠心分離
をおこない、上清をアスピレータで除去した。

（ｖｌｌ）ハンクス平衡塩液１３〜１４ｍ１を加えて、
管底部の細胞を攪拌してほぐした。

（Ｙｌｉｌ）前項で得た脾臓細胞懸濁液５０μｍに、細
胞染色液であるニグロシン溶液を５０μｌを加え、約１
分後に血球計算盤を用いて細胞数を求めた。細胞数は５
．１ｘｌＯ”ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。

（ｌｘ）　　（以降の操作は前記（ｖｌ）項からの遠心
時間を利用して交互におこない、膵臓細胞とミエローマ
細胞の計数を同時におこなうようにするのが好ましい。

また、以降の操作はミエローマ細胞を常温以下に冷却す
ることのないよう、異なる温度設定の遠心機を用いた。

）培養中のミエローマ細胞４５１を５０１遠心管に移し
、８００ｇで７分間遠心した。上清をアスピレータで除
去した。

（Ｘ）ハンクス平衡塩液１０１を加え、管底部のミエロ
ーマ細胞を攪拌してほぐした。８００ｇで７分間遠心分
離した後、上清をアスピレータで除去した。この操作を
２回繰り返した。

（ｘｌ）ハンクス平衡塩液１３ｍ１を加え、管底部のミ
エローマ細胞を攪拌してほぐした。

（ｘｌｌ）　（ｖｌｌｌ）項と同様の方法で細胞数の計
測をおこなった。細胞数は、１．５ｘｌＯ”ｃｅｌｌｓ
／＋＋＋Ｉであった。

（Ｘｉｉｉ）　（ｖｉｉｌ）で得た脾臓細胞懸濁液を常
温に戻したちの９ｍｌと（ｘｉｉ）で得たミエローマ細
胞懸濁液ｆｉＩ１１をよく混合し、２０００ｇで５分間
遠心分離した後、上清をアスピレータで除去した。

（ｘｌｖ）　　（以降の操作はクリーンベンチ内に置い
た約４０℃の水浴中でおこなった。）前項で得られた沈
降細胞上に、平均分子量１５００のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）　０．５ｍｌをピペットで緩やかに撹拌
しながら１分かけて加えた。さらに１．５分間攪拌を続
けた。

（ｘｙ）さらにＩＮＤＩＩをＩｓｌ／ｗｉｎの速度で５
１加えた後、続く１分間でＩＭＤＭを５１を加えた。最
後にＩＭＤＭｌｏｍｌを加えた後１０００ｇで７分間遠
心分離し、ＰＥＧを含む上清をアスピレータで完全に除
去した。

（ｘｖｌ）前項で得られた沈降細胞にフィーダー細胞と
して（Ｖ目Ｉ）の膵臓細胞懸濁液を３ｍｌ加え、さらに
１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＨＡＴ培地（シグ
マケミカル　カンパニー製）を加えて、総量を２３ｍ１
とした。ピペットで細胞をほぐした後、培養用の９Ｂ穴
プレートに１穴あたり１００μｍずつ分注した。以上の
操作を２匹のマウスについておこない、計Ｂ枚のプレー
トに細胞懸濁液を分注した。

（ｘｖｌｌ）　００ｗインキュベータ内にプレートを移
動し、培養を開始した。インキュベータ内のＣＯ２濃度
は５％、温度は３７℃に保った。

（ｘｖｌｌｌ）　１日後、！穴あたり！００μｌのＩＩ
ＡＴ培地を加え、！週間培養を続けた。

（３）抗体のモノクローン化 ＨＡＴ培地中での、ハイブリドーマ細胞の培養開始後１
週間を経過したプレートについて、以下の操作をおこ、
なった。

（１）各人の培養上清を１穴あたり１００μｌ採取し、
ＰＢＳで希釈して２〜１０，０００倍の希釈系列を作製
した後、これを用いたＥＬＩＳＡをおこなった。固相抗
原とじてＢＳＡ　１分子あたりＨＡ　０．４分子が化学
的に結合したもの（ＭＡ−ＢＳＡ）を用い、被測定物質
を加えなかった。

その他の操作法は前述したＥＬＩＳＡと同様である。こ
のようなＥＬＩＳＡでは、各培養上清中の抗体の固相抗
原に対する結合能を比較することができる。すなわち、
より大きな希釈度で高い吸光度を示す培養上清中には、
固相抗原に対して高い親和力を持つ抗体が含まれている
可能性が高い。吸光度の高いものからいくつかの培養上
清を選び、それらの培養上清を採取した大中の細胞のみ
培養を続けた。

培養のスケールは、適宜大きくしていった。

（１１）前項で選んだ培養上清について、さらに厳密な
ＥＬＩＳＡをおこなった。培養上清をＰＢＳで適当に希
釈し、固相抗原としてＨＡ−ＢＳＡを用いた。被測定物
質としてはＭＡを加えた。その他の操作は前述したＥＬ
ＩＳＡと同様である。ＩＩＩＡの測定感度の高いものか
ら１３の培養上清を選び、それらの培養上清を採取した
穴中の細胞の培養を続けた。

（Ｉｌｉ）選択した１３の培養上清を産生じた細胞をそ
れぞれＩＭＤＨに懸濁し、ニグロシンを用いて細胞数を
計測した。

（Ｉｖ）それぞれの細胞懸濁液をＢＴ培地（シグマ　ケ
ミカル　カンパニー製）で希釈し、細胞が１００μｌあ
たり１個含まれるように調整した。

ｈ）生後５週のマウスから胸腺を摘出し、胸腺細胞をＩ
Ｔ培地中に懸濁して、！００μｌあたり２Ｘ１０’個の
胸腺細胞が含まれるように調整した。

（ｙｉ）　（ｖ）の胸腺細胞懸濁液を１０枚の９８穴培
養用プレートに、ｌ穴あたり１００μｍ分注した。さら
に、（１ｖ）の細胞懸濁液を１穴あたり１００μ！加え
た。

（ｖｌｌ）　ＧＯ＋インキエベータ内で培養を続けなが
ら、培養上清のＥＬ　ＩＳＡをおこなった。条件は（ｌ
ｌ）項と同様とした。ＭＡの測定感度の高い培養上清が
得られた細胞については、適宜培養サイズを大きくしな
がら培養を続けた。ＥＬＩＳＡによる選別を続けた結果
、最終的に５穴を選択した。すなわち、５種のモノクロ
ーナル抗体産生細胞ラインを得た。これらの細胞を２０
０ｍ１のＩＭＤＭ中で、１ｍｌあたり５ｘｌＧ’個の細
胞が含まれるまで培養を続けた。

５８Ｉ！のモノクローナル細胞産生細胞ラインのうち、
ＭＡに対して最も高い親和力を有するモノクローナル抗
体を産生ずる細胞ライン２Ｄ５５Ａを、ブダペスト条約
に基づき、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号：微工研
条寄第２５６４号（ＦＥＲＭＢＰ−２５８４））。

（４）細胞の保存 最終的に選別された細胞ラインの培養液を遠心管に移し
、８００ｇで７分間遠心分離し、上清をアスピレータで
除去した。管底部の細胞を、Ｆｅ２とジメチルスルホキ
シドを３対ｌに混合した溶液に懸濁し、１１あたり５Ｘ
ｌＯ”個の細胞が存在するように調整した。この懸濁液
を一８０℃で凍結した後、液体窒素内に移して長期保存
状態にした。

（５）抗体の精製 プロティンＡセフ１０−ス４Ｂ（ファルマ７ア　ＬＫＢ
　　バイオテクノロジー製）を用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーにより、細胞の培養上清からモノクロ
ーナル抗体を精製した。精製したモノクロ−ナール抗体
は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分
斬量約５０．０００のＨ鎖と２０，０００のし鎖からな
るＩｇＧであることが確認された。

（６）抗体の各種ハプテンに対するアフィニティーの比
較 精製したモノクローナル抗体の内、２Ｄ５５Ａから産生
されたものについてＥＬＩＳＡをおこなった。固相抗原
は舅Ａ−ＢＳＡを用い、鮎、ＡＢＭＡ、　　ＡＰｌＡＢ
ＡＰの４種のハプテンについて測定をおこなった。他の
測定条件は前述のＥＬＩＳＡと同様とした。４９２ｎ＋
ｍの相対吸光度が５０％に減少する濃度を、上記の４種
のハプテンについて比較したところ、ＡＰが最も高濃度
であり、次いでＡＢＭＡ、　　ＡＢＡＰｌＭＡの順であ
った。４９２ｎｍの吸光度を５０％に減少させるために
、ＡＰではＭＡに比べ約１００倍の濃度が必要であった
。すなわち、ＡＰ−ＫＬＨを免疫原として用いることに
より、上記４種のハプテンの内ＭＡに対して最も高いア
フィニティーを有する抗体が作製できたことが証明され
た。

び本実施法で得られた抗血清でＥＬＩＳＡを行なった際
の、ＭＡおよびＡＢＭＡの検出感度を比較した図である
。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）ハプテンとスペーサーとしてのアルキル鎖を介し
   て前記ハプテンと結合されたタンパク質とからなる免疫
   原であって、前記ハプテン分子中のアルキル基が水素原
   子で置換された化合物に相当する物質を出発物質として
   用いて、この出発物質の該水素原子に相当する位置にス
   ペーサーとしてのアルキル鎖及び官能基を導入し、この
   アルキル鎖及び官能基を介して該タンパク質に結合させ
   て得られる免疫原がハプテンの化学構造と類似性の高い
   構造を保持している免疫原。
2. （２）ハプテンがメタンフェタミンであり、このハプテ
   ンの分子中のＮ−メチル基が水素原子で置換された化合
   物に相当するアンフェタミンを出発物質とし、アンフェ
   タミンの第一アミンにスペーサーとしてのアルキル鎖及
   び官能基を導入し、このアルキル鎖及び官能基を介して
   該タンパク質に結合させて得られる、メタンフェタミン
   に対して高い親和性を有する能力のある請求項１記載の
   免疫原。
3. （３）以下の構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で示されるアンフェタミン誘導体の末端第１アミン部分
   を介してアンフェタミンとタンパク質を結合させた、メ
   タンフェタミンに対して高い親和力を有する抗体の産生
   を誘導する能力のある請求項１記載の免疫原。ただしｎ
   は整数を示す。
4. （４）ｎが１から１０の整数である請求項３記載の免疫
   原。
5. （５）アミノブチルアンフェタミンとタンパク質とを結
   合せしめた、メタンフェタミンに対して高い親和力を有
   する抗体の産生を誘導する能力のある請求項１記載の免
   疫原。
6. （６）タンパク質が、スカシ貝由来のヘモシアニン、ニ
   ワトリ由来のガンマグロブリン、牛血清アルブミンのい
   ずれかである請求項１記載の免疫原。
7. （７）請求項１記載の免疫原により感作された動物の血
   清から得られる該ハプテンに対して高い親和力を有する
   抗体。
8. （８）免疫原が請求項５記載の免疫原である請求項７記
   載の抗体。
9. （９）請求項１記載の免疫原により感作された動物の脾
   臓細胞とミエローマ細胞を融合してなる、該ハプテンに
   対して高い親和力を有するモノクローナル抗体を産生す
   るハイブリドーマ。
10. （１０）請求項５記載の免疫原により感作された動物の
    脾臓細胞を用いる請求項９記載のハイブリドーマ。
11. （１１）受託番号微工研条寄第２５８４号（ＦＥＲＭＢ
    Ｐ−２５６４）を有する請求項９記載のハイブリドーマ
    。
12. （１２）請求項９記載のハイブリドーマより産生される
    モノクローナル抗体。
13. （１３）分子量約５０，０００のＨ鎖と約２０，０００
    のｆ鎖からなるＩｇＧである請求項１２記載のモノクロ
    ーナル抗体。