MX2012009759A

MX2012009759A - Derivados de pirazolopiridazina para el tratamiento de la hepatitis c.

Info

Publication number: MX2012009759A
Application number: MX2012009759A
Authority: MX
Inventors: John F Kadow; Richard Pracitto
Original assignee: Squibb Bristol Myers Co
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2012-09-07
Also published as: WO2011106340A1; EP2539340A1; CN102858777A; US8324212B2; AU2011220915A1; JP2013520507A; KR20130008570A; CN102858777B; US20120046294A1; EP2539340B1

Abstract

La presente invención proporciona compuestos de la fórmula (I), incluyendo sus sales, así como las composiciones y métodos de uso de los compuestos. Los compuestos tienen actividad contra el virus de la hepatitis C (VHC) y pueden ser útiles en el tratamiento de aquellas personas infectadas con el VHC.

Description

DERIVADOS DE PIRAZOLOPIRIDAZINA PARA EL TRATAMIENTO DE LA HEPATITIS C Descripción de la Invención La descripción se refiere en general a los compuestos novedosos de la fórmula I, incluyendo sus sales, que tienen actividad contra el virus de la Hepatitis C (VHC) y son útiles en el tratamiento de aquellas personas infectadas con el VHC. La descripción también se refiere a las composiciones y métodos de uso de estos compuestos .

El virus de la Hepatitis C (VHC) es un patógeno humano principal, que infecta a un estimado de 170 millones de personas en todo el mundo - aproximadamente cinco veces el número de personas infectadas por el tipo 1 del virus de inmunodeficiencia humana. Una fracción substancial de estos individuos infectados por el VHC desarrolla serias enfermedades del hígado progresivas, incluyendo la cirrosis y el carcinoma hepatocelular (Lauer, G. M.; Walker, B. D. N. Engl. J. Med. 2001, 345, 41-52) .

El VHC es un virus del ARN de hebra positiva.

Basado en una comparación de la secuencia de aminoácidos deducida y la semejanza extensa en la región 5' -no traducida, el VHC ha sido clasificado como un género separado de la familia Flaviviridae . La totalidad de los miembros de la familia Flaviviridae tienen viriones envueltos que contienen REF.233859 un genoma del ARN de hebra positiva que codifica todas las proteínas específicas para el virus por medio de la traducción de un marco de lectura abierta, no interrumpido, único.

Se encuentra una heterogeneidad considerable dentro del nucleótido y la secuencia de aminoácidos codificada a través del genoma de VHC. Al menos seis genotipos principales han sido caracterizados, y más de 50 subtipos han sido descritos. Los genotipos principales del VHC difieren en su distribución en todo el mundo, y el significado clínico de la heterogeneidad genética del VHC permanece elusivo a pesar de los numerosos estudios del posible efecto de los genotipos sobre la patogénesis y la terapia.

El genoma del ARN de VHC de una sola hebra es de aproximadamente 9500 nucleótidos de longitud y tiene un marco de lectura abierta, único (ORF, por sus siglas en inglés) que codifica una poliproteína larga única de aproximadamente 3000 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteína es escindida en sitios múltiples por las proteasas celulares y virales para producir las proteínas estructurales y no estructurales (NS, por sus siglas en inglés) . En el caso del VHC, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2 , NS3, NS4A, NS4B, NS5A, y NS5B) es efectuada por dos proteasas virales. La primera se cree que va a ser una metaloproteasa y se segmenta en la unión NS2-NS3; la segunda es una serina proteasa contenida dentro de la región N-terminal del NS3 (también referida como una proteasa de NS3) y tiene un papel mediador en todas las escisiones subsiguientes corriente abajo de NS3 , tanto en cis, en el sitio de escisión NS3-NS4A, y en trans, para los sitios NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B restantes. La proteína de NS4A parece que sirve para funciones múltiples, actuando como un cofactor para la proteasa de NS3 y posiblemente para ayudar a la localización de la membrana de NS3 y otros componentes de la replicasa viral. La formación del complejo de la proteína NS3 con NS4A parece necesaria para los eventos de procesamiento, mejorando la eficiencia proteolítica en la totalidad de los sitios. La proteína NS3 también exhibe actividades de trifosfatasa del nucleósido y de helicasa de ARN. El NS5B (también referido como una polimerasa de VHC) es una polimerasa de la ARN dependiente del ARN que está involucrada en la replicación del VHC. La proteína de NS5B del VHC se describe en "Structural Analysis of the Hepatitis C Virus RNA Polymerase in Complex with Ribonucleotides (Bressanelli; S. et al., Journal of Virology 2002, 3482-3492; y Defrancesco y Rice, Clinics in Liver Disease 2003, 7, 211-242.

Comúnmente, la terapia contra el VHC más efectiva emplea una combinación de alfa-interferón y ribavirina, conduciendo a una eficacia sostenida en el 40 % de los pacientes (Poynard, T. et al. Lancet 1998, 352, 1426-1432) . Los resultados clínicos recientes demuestran que el alfa-interferon pegilado es superior al alf -interferón no modificado como una tnonoterapia (Zeuzem, S. et al . N. Engl . J. Med. 2000, 343, 1666-1672) . Sin embargo, aún con regímenes terapéuticos experimentales que involucran las combinaciones del alfa-interferón pegilado y la ribavirina, una fracción substancial de pacientes no tienen una reducción sostenida en la carga viral. Por consiguiente, existe una necesidad clara e importante de desarrollar substancias terapéuticas efectivas para el tratamiento de la infección provocada por VHC.

El VHC-796, un inhibidor de NS5B del VHC, mostró una capacidad para reducir los niveles del ARN del VHC en los pacientes. Los niveles del ARN viral se redujo transitoriamente y luego rebotaron durante la dosificación cuando el tratamiento fue con el compuesto como un agente único pero los niveles cayeron más fuertemente cuando se combinan con el estándar del cuidado que es una forma del interferón y la ribavirina. El desarrollo de este compuesto fue suspendido debido a la toxicidad hepática observada durante la dosificación extendida de los regímenes de combinación. La patente US 7,265,152 y la solicitud de patente PCT O2004/041201A2 , correspondiente, describe los compuestos de la clase VHC-796.

La invención proporciona ventajas técnicas, por ejemplo, los compuestos son novedosos y son efectivos contra la hepatitis C. Adicionalmente, los compuestos proporcionan ventajas para usos farmacéuticos, por ejemplo, con respecto a uno o más de sus mecanismos de acción, la aglutinación, la eficacia de inhibición, la selectividad objetivo, la solubilidad, las perfiles de seguridad, o la biodisponibilidad.

Un aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I, en donde : R1 es halo, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, dioxotiazinilo, (R5) (R6)N, o fenilo, está substituido con 1-2 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, ( (R7) (R8) ) alquilo, hidroxi, alcoxi, (R7)(R8)N, carboxi, alcoxicarbonilo, y CON (R16) (R1 ) , y en donde el piridinilo o fenilo también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, alcoxi, piridinilo, fenilo, halofenilo, (halo) (CON) (R7) (R8) ) fenilo, o (alcoxi) (CON) (R7) (R8) ) fenilo; R2 es hidrógeno, halo, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, o (R5) (R6)N; R3 es ciano, alcoxicarbonilo, (cicloalquil) oxicarbonilo, (alquilsulfonil) aminocarbonilo, CO (R11) (R12) , (R13) (R14)NCONH, triazolilo, tiazolilo, o tetrazolilo; R4 es fenilo substituido con 0-2 substituyentes de halo, alcoxi, fenoxi, o halofenoxi; R5 es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil) alquilo, bencilo, alquilcarbonilo, haloalquilcarbonilo, fenilcarbonilo, (alcoxifenil) carbonilo, alquilsulfonilo, fenilsufonilo, (alcoxifenil) sulfonilo o (haloalcoxifenil) sulfonilo; R6 es hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo, o alcoxialquilo; o R5 y R6 tomados conjuntamente con el nitrógeno al cual los mismos están fijados es dioxotiazinilo,- R7 es hidrógeno o alquilo; R8 es hidrógeno o alquilo; R9 es hidrógeno o alquilo; R10 es hidrógeno o alquilo; o R9 y R10 tomados conjuntamente son etileno, propileno, butileno, o pentileno, y está substituido con 0-2 átomos de fluoro; R11 es hidrógeno o alquilo; R es hidrógeno o alquilo; o R11 y R12 tomados junto con el nitrógeno al cual los mismos están unidos, son azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo; R13 es hidrógeno o alquilo; R14 es hidrógeno o alquilo; o R13 y R14 tomados junto con el nitrógeno al cual los mismos están fijados, son azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo ; R15 es alquilo o cicloalquilo; R es hidrógeno, alquilo, R17 es hidrógeno o alquilo; R18 es hidrógeno, halo, alquilo o alcoxi; y Ar1 es isoxazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, o fenilo; y está substituido con 0-3 substituyentes de halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi, (R7) (R8)N, o fenilo; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde : R1 es piridinilo o fenilo y está substituido con 1 substituyente seleccionado del grupo que consiste de carboxi, alcoxicarbonilo, y CON(R16) (R17) , y también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo o alcoxi; R2 es hidrógeno, halo, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, o (R5) (R6)N; R3 es CONÍR11) (R12) ; R4 es fenilo substituido con 0-2 substituyentes de halo, alcoxi, fenoxi, o halofenoxi; R9 es hidrógeno o alquilo; R10 es hidrógeno o alquilo; o R9 y R10 tomados conjuntamente son etileno, propileno, butileno, o pentileno; R11 es hidrógeno o alquilo; R12 es hidrógeno o alquilo; o R11 y R12 tomados junto con el nitrógeno al cual los mismos están fijados es azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo; R1S es hidrógeno, alquilo, o R17 es hidrógeno o alquilo; R18 es hidrógeno; y Ar1 es isoxazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, o fenilo; y está substituido con 0-3 substituyentes de halo, alquilo, haloalquxlo, o alcoxi; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde : R1 es fenilo substituido con 1 substituyente de CON(R16) (R17) y también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, o alcoxi; R2 es hidrógeno; R3 es CO ÍR11) (R12) ; R4 es fenilo substituido con 0-2 substituyentes de halo, alcoxi, fenoxi, o halofenoxi; R9 es hidrógeno o alquilo; R10 es hidrógeno o alquíleo R9 y R10 tomados conjuntamente son etileno, propileno, butileno, o pentileno; R11 es hidrógeno o alquilo; R12 es hidrógeno o alquilo; o R11 y R12 tomados conjuntamente con el nitrógeno al cual los mismos están fijados, son azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo; R17 es hidrógeno o alquilo; y Ar1 es isoxazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, o fenilo; y está substituido con 0-3 substituyentes de halo, alquilo, haloalquilo, o alcoxi; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R1 es fenilo substituido con 1 substituyente de CO (R16) (R17) y también substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo o alcoxi; R2 es hidrógeno; R3 es CON(Ri:L) (R12) ; R4 es fenilo substituido con 0-2 substituyentes de halo, alcoxi, fenoxi, o halofenoxi; R9 y R10 tomados conjuntamente son etileno; R11 es alquilo; R12 es hidrógeno; R16 es R17 es hidrógeno y Ar1 es isoxazol, oxazolilo, oxadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, o fenilo; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R1 es fenilo substituido con 1 substituyente de CON(R16) (R17) y 1 substituyente de alquilo y 0-1 substituyentes de alcoxi; R2 es hidrógeno; R3 es CONH e; R4 es monofluorofenilo; R16 es r9 Y r1° tomados conjuntamente son etileno; hidrógeno; y Ar1 es pirimidinilo o fenilo; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable .

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R1 es piridinilo o fenilo y está substituido con 1-2 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, ( (R7) (R8)N) alquilo, hidroxi, alcoxi, (R7)(R8)N, carboxi, alcoxicarbonilo, y CON(R16) (R17) , y en donde el fenilo o piridinilo también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, alcoxi, piridinilo, fenilo, halofenilo, (halo) (CON (R7) (R8) ) fenilo, o (alcoxi) (CO (R7) (R8) ) fenilo .

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R1 es fenilo y está substituido con l substituyente de C0N(R16) (R17) y también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, alcoxi, piridinilo, fenilo, halofenilo, (halo) (CO (R7) (R8) ) fenilo, o (alcoxi) (CON(R7) (R8)) fenilo.

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R1 es fenilo y está substituido con 1 substituyente de C0N(R1S) (R17) y también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, o alcoxi.

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R3 es CONÍR11) (R12) .

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R3 es CON(H) (alquilo) .

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R4 es halofenilo.

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde R4 es fenilo o monofluorofenilo .

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula I en donde Ar1 es fenilo.

Otro aspecto de la invención es un compuesto de la fórmula la. la Cualquier alcance de cualquier variable, incluyendo R16, R17, R18, o Ar1 puede ser utilizado independientemente con el alcance de cualquier otro caso de una variable.

A menos que se especifique de otra manera, estos términos tienen los siguientes significados. "Alquilo" significa un grupo alquilo, recto o ramificado, compuesto de 1 a 6 carbonos. "Alquenilo" significa un grupo alquilo, recto o ramificado, compuesto de 2 a 6 carbonos ' con al menos un doble enlace. "Cicloalquilo" significa un sistema de anillo monocíclico compuesto de 3 a 7 carbonos. "Hidroxialquilo" , "alcoxi" y otros términos con una porción de alquilo substituida incluyen los isómeros rectos y ramificados compuestos de 1 a 6 átomos de carbono para la porción alquilo. "Halo" incluye todos los isómeros halogenados desde monohalo substituido hasta perhalo substituido en los substituyentes definidos con halo, por ejemplo, "haloalquilo" y "haloalcoxi " , "halofenilo" , "halofenoxi" . "Arilo" incluye los substituyentes aromáticos carbocíclicos y heterocíclicos . Los términos parentético y multiparentético están propuestos para aclarar las relaciones de unión para aquellos expertos en el arte. Por ejemplo, un término tal como (( (R) alquilo) significa un substituyente de alquilo substituido adicionalmente con el substituyente R. Los substituyentes que son ilustrados por las estructuras químicas para unirse en las posiciones variables sobre un sistema de anillos múltiples (por ejemplo un sistema de anillos bicíclico) están propuestos para unirse al anillo en donde los mismos se ha establecido que van a anexarse. Por ejemplo, los substituyentes R1 y R2 de la fórmula IV están propuestos para unirse al anillo de benceno de la fórmula IV y no al anillo de benceno.

Etileno significa etandiilo o -CH2CH2-; propileno significa propandiilo o -CH2CH2CH2- ; butileno significa butandiilo o -CH2CH2CH2CH2- ; pentileno significa pentandiilo o -CH2CH2CH2CH2CH2- .

Dioxatiazmilo significa La invención incluye todas las formas de la sal farmacéuticamente aceptables de los compuestos . Las sales farmacéuticamente aceptables son aquellas en las cuales los contraiones no contribuyen significativamente a la actividad o toxicidad fisiológica de los compuestos y como tales funcionan como equivalentes farmacológicos. Estas sales se pueden hacer de acuerdo con las técnicas orgánicas comunes empleando los reactivos disponibles comercialmente . Algunas de las formas de la sal iónica incluyen el acetato, acistrato, besilato, bromuro, camsilato, cloruro, citrato, fumarato, glucuronato, bromhidrato, clorhidrato, yodhidrato, yoduro, lactato, maleato, mesilato, nitrato, pamoato, fosfato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato, y xinofoato. Algunas de las formas de sales catiónicas incluyen amonio, aluminio, benzatina, bismuto, calcio, colina, dietilamina, dietanolamina, litio, magnesio, meglumina, 4-fenilciclohexilamina, piperazina, potasio, sodio, trometamina, y zinc.

Algunos de los compuestos de la invención poseen átomos de carbono asimétricos (véase, por ejemplo, las estructuras posteriores) . La invención incluye todas las formas estereoisométricas , incluyendo los enantiómeros y diastereómeros así como las mezclas de los estereoisómeros tales como los racematos . Algunos estereoisómeros se pueden hacer utilizando los métodos conocidos en el arte. Las mezclas estereoisoméricas de los compuestos y los compuestos intermedios relacionados pueden ser separadas en los isómeros individuales de acuerdo con los métodos conocidos comúnmente en el arte. El uso de cuñas o líneas de trazos interrumpidos en las ilustraciones de las estructuras moleculares en los siguientes esquemas y tablas están propuestos solamente para indicar la estereoquímica relativa, y no debe ser interpretada como una implicación de asignaciones estereoquímicas absolutas.

La invención está propuesta para incluir todos los isótopos de los átomos que están presentes en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa. A manera de ejemplo general y sin limitación, los isótopos del hidrógeno incluyen deuterio y tritio. Los isótopos del carbono incluyen 13C y 14C. Los compuestos etiquetados isotópicamente de la invención generalmente pueden ser preparados por las técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en el arte o por procesos análogos a aquellos descritos aquí, utilizando un reactivo etiquetado isotópicamente, apropiado, en lugar del reactivo no etiquetado empleado de otra manera. Tales compuestos pueden tener una variedad de usos potenciales, por ejemplo como estándares y reactivos en la determinación de la actividad biológica. En el caso de los isótopos estables, tales compuestos pueden tener el potencial de modificar favorablemente las propiedades biológicas, farmacológicas, o farmacocinéticas .

Métodos Sintéticos Los compuestos se pueden hacer por los métodos conocidos en el arte incluyendo aquellos - descritos posteriormente. Algunos reactivos y compuestos intermedios ya son conocidos en el arte. Otros reactivos y compuestos intermedios se pueden hacer por los métodos conocidos en el arte utilizando los materiales disponibles. Las variables (por ejemplo los substituyentes numerados "R" ) utilizados para describir la síntesis de los compuestos, están propuestas solamente para ilustrar cómo hacer y no van a ser confundidos con las variables utilizadas en las reivindicaciones o en otras secciones de la descripción. Las abreviaturas utilizadas dentro de los esquemas generalmente siguen las conversiones utilizadas en el arte .

Los compuestos se pueden hacer por los métodos conocidos en el arte incluyendo aquellos descritos posteriormente. Algunos reactivos y compuestos intermedios ya son conocidos en el arte. Otros reactivos y compuestos intermedios se pueden hacer por los métodos conocidos en el arte utilizando los materiales disponibles comercialmente . Las variables (por ejemplo los substituyentes numerados "R") utilizados para describir la síntesis de los compuestos, están propuestos solamente para ilustrar cómo hacer y no van a ser confundidos con las variables utilizadas en las reivindicaciones o en otras secciones de la descripción. Las abreviaturas utilizadas dentro de los esquemas generalmente siguen las convenciones utilizadas en el arte.

Las abreviaturas utilizadas en los esquemas de reacción generalmente siguen las convenciones utilizadas en el arte. Las abreviaturas químicas utilizadas en la descripción y los ejemplos están definidas como sigue: "NaHMDS" por la bis (trimetilsilil) amida de sodio; "D F" para la N, -dimetilformamida; "MeOH" para el metanol; "NBS" para la N-bromosuccinimida; "Ar" para el arilo; " TFA" para el ácido trifluoroacético; "LAH" para el hidruro de litio y aluminio; "BOC", "DMSO" para el sulfóxido de dimetilo; "h" para horas; "ta" para temperatura ambiente o tiempo de retención (el contexto dictará lo apropiado; "min" para minutos; "EtOAc" para el acetato de etilo; "THF" para el tetrahidrofurano; "EDTA" para el ácido etilendiamintetraacético; "Et20" para el éter dietílico; "DMAP" para la 4 -dimetilaminopiridina ; "DCE" para el 1 , 2 -dicloroetano ; "ACN" para el acetonitrilo ; "DME " para el 1 , 2 -dimetoxietano; "HOBt" para el hidrato de 1-hidroxibenzotriazol ; "DIEA" para la diisopropilamina; "Nf" para el CF3 (CF2 ) 3SO2- ; y "TMOF" para el ortoformiato de trimetilo .

Como se muestra en el Esquema de Reacción 1, algunos compuestos de la invención pueden ser preparados por la aminación con una piridazina apropiada y luego ciclización con un acetileno funcionalizado adecuadamente. La remoción estándar de los grupos protectores como se describe en la sección experimental proporciona los productos. Otros socios de la unión, técnicas y condiciones, son conocidas en el arte como lo son otras reacciones de formación de enlaces de carbono- carbono . Los ácidos y ésteres pueden ser convertidos a las amidas por los métodos conocidos en el arte.

Esquema de Reacción 1 Métodos Biológicos Los compuestos demostraron actividad contra el NS5B del VHC como se determina en los siguientes ensayos de RdRp del VHC.

Clonación, expresión, y purificación del RdRp del NS5B del VHC. El ADNc que codifica la proteína NS5B del VHC, el genotipo Ib, fue clonado en el vector de expresión de pET21a. La proteína fue expresada con un corte C-terminal de 18 aminoácidos para mejorar la solubilidad. La línea celular BL21 del componente de E. coli (DE3) fue utilizada para la expresión de la proteína. Los cultivos se hicieron crecer a 37 °C durante ~4 horas hasta que los cultivos alcanzaron una densidad óptica de 2.0 a 600 nm. Los cultivos fueron enfriados hasta 20 °C y se indujeron con IPTG 1 mM. Se agrega ampicilina fresca a una concentración final de 50 pg/ml y las células se hicieron crecer toda la noche a 20 °C.

Las pelotillas celulares (3 1) fueron lisadas para purificación para dar 15-24 mg de NS5B purificado. El amortiguador de la lisis consistió de Tris-HCl 20 mM, pH 7.4, NaCl 500 mM, tritón X-100 al 0.5 %, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, glicerol al 20 %, 0.5 mg/ml de lisozima, MgCl2 10 mM, 15 ug/ml desoxirribonucleasa, y tabletas inhibidoras de la proteasa de TM Completa (Roche) . Después de la adición del amortiguador de la lisis, las pelotillas celulares congeladas fueron resuspendidas utilizando un homogeneizador del tejido. Para reducir la viscosidad de la muestra, las alícuotas del lisado fueron sonicadas sobre hielo utilizando una micropunta fijada a un sonicador Branson. El lisado sonicado se centrifuga a 100,000 x g durante 1 h a 4 °C y se filtra a través de una unidad de filtración de 0.2 im (Corning) .

La proteína fue purificada utilizando tres etapas de cromatografía consecutivas: Heparina sefarosa CL-6B, poliU sefarosa 4B, y Hitrap SP sefarosa (Farmacia) . Los amortiguadores para la cromatografía fueron idénticos al amortiguador de la lisis pero no contuvieron lisozima, desoxirribonucleasa I, MgC12 o el inhibidor de la proteasa y la concentración de NaCl del amortiguador fue ajustada de acuerdo con los requerimientos para la carga de la proteína sobre la columna. Cada columna fue eluida con un gradiente de NaCl que varió en la longitud desde 5-50 volúmenes de la columna dependiendo del tipo de la columna. Después de la etapa de cromatografía final, la pureza resultante de la enzima es de >90 % basado en el análisis de SDS-PAGE. La enzima fue convertida en alícuotas y se almacena a -80 °C.

Ensayo de la enzima de RdRp del NS5B del VHC estándar. Los ensayos del genotipo Ib del RdRp de VHC se corrieron en un volumen final de 60 µ? en las placas de 96 cavidades (Costar 3912) . El amortiguador del ensayo está compuesto de Hepes 20 mM, pH 7.5, 2.5 mM KC1, 2.5 mM MgC12, y 1 mM DTT, 1.6 U del inhibidor de la ARNsa (Promega N2515), 0.1 mg/ml del BSA (Promega R3961), y 2 % de glicerol. Todos los compuestos fueron diluidos en serie (3 veces) en DMSO y se diluyeron adicionalmente en agua de tal modo que la concentración final del DMSO en el ensayo fue del 2 % . La enzima del genotipo Ib de RdRp del VHC fue utilizada a una concentración final de 28 nM . Un molde de poliA fue utilizado a 6 nM, y un cebador oligo-dTl2 biotinilado fue utilizado a una concentración final de 180 nM. El molde fue obtenido comercialmente (Amersham 27-4110) . El cebador biotinilado fue preparado por Sigma Genosys. El 3H-UTP fue utilizado a 0.6 uCi (0.29 µ? de UTP total) . Las reacciones fueron iniciadas por la adición de la enzima, se incubaron a 30 °C durante 60 minutos, y se detuvieron por la adición de 25 µ? de EDTA 50 mM que contiene perlas de SPA (4 pg/µ?, Amersham RPNQ 0007). Las placas fueron leídas sobre un aparato Packard Top Count NST después de >1 h de incubación a temperatura ambiente.

Ensayo de la enzima de RdRp de NS5B de VHC modificado . Un ensayo de la enzima modificado fue efectuado esencialmente como se describió para el ensayo de la enzima estándar excepto por lo siguiente: el cebador dT12 de oligo biotinilado fue precapturado sobre las perlas de SPA recubiertas con estreptavirina mezclando el cebador y las perlas en el amortiguador de ensayo e incubando a temperatura ambiente durante una hora. El cebador no unido fue removido después de la centrifugación. Las perlas unidas al cebador fueron resuspendidas en el amortiguador Hepes 20 mM, pH 7.5 y utilizadas en el ensayo a las concentraciones finales de 20 nM del cebador y 0.67 g/pl de las perlas. Orden de adición en el ensayo: la enzima (14 nM) fue agregada a los compuestos diluidos seguido por la adición de una mezcla del molde (0.2 nM) , 3H-UTP 0.6 Ci, 0.29 µ?) , y las perlas unidas al cebador, para iniciar la reacción; las concentraciones dadas son las finales. Las reacciones se dejaron que procedan durante 4 horas a 30 °C.

Los valores de IC50 para los compuestos fueron determinados utilizando siete diferentes [I] . Los valores de IC50 fueron calculados a partir de la inhibición utilizando la fórmula y = A+ ( (B-A) / ( 1+ ( (C/x) ??) ) ) .

Preparación del Ensayo de FRET. Para efectuar el ensayo de selección de FRET del VHC, se utilizaron placas de cultivo de las células de 96 cavidades. El péptido de FRET (Anaspec, Inc.) (Taliani et al., Anal. Biochem. 1996, 240, 60-67) contiene un donador fluorescente, EDANS , cerca de uno de los extremos del péptido y un aceptor, DABCYL, cerca del otro extremo. La fluorescencia del péptido es apagada por la transferencia de energía de resonancia intermolecular (RET, por sus siglas en inglés) entre el donador y el aceptor, pero cuando la proteasa de NS3 se segmenta del péptido, los productos son liberados del apagado con RET y la fluorescencia del donador llega a ser evidente. El reactivo del ensayo se hace como sigue: el reactivo de la lisis del cultivo de las células de luciferasa de la célula 5X de Promega (#E153A) se diluyó hasta IX con dH20, se agregó NaCl hasta 150 mM final, el péptido de FRET se diluyó hasta 20 µ? final a partir de una materia prima 2 tnM.

Para preparar las placas, las células del replicón de VHC, con o sin un gen informador de la luciferasa de Renilla, fueron tripsinizadas y se colocan en cada cavidad de una placa de 96 cavidades con los compuestos de prueba titulados agregados en las columnas 3 hasta 12; las columnas 1 y 2 contuvieron un compuesto de control (el inhibidor de la proteasa VHC) , y las células contenidas en la hilera inferior sin el compuesto. Las placas fueron colocadas entonces en un incubador de C02 a 37 °C.

Ensayos. De manera subsiguiente a la adición de los compuestos de prueba descrita anteriormente (Preparación del Ensayo de FRET) , en varios instantes del tiempo la placa fue removida y se agregó la solución azul de Alamar (Trek Diagnostics, #00-100) por cavidad como una medida de la toxicidad celular. Después de la lectura en un instrumento Citofluor 4000 (PE Biosystems) , las placas fueron enjuagadas con PBS y luego utilizadas para el ensayo de FRET por la adición de 30 ul del reactivo de ensayo del péptido FRET descrito anteriormente (Preparación del Ensayo de FRET) por cavidad. La placa fue colocada entonces en el instrumento Cytofluor 4000 el cual ha sido ajustado a 340 excitaciones/490 emisiones, modo automático durante 20 ciclos y la lectura de la placa en un modo cinético. Típicamente, la señal con respecto al ruido utilizando un análisis del punto final después de las lecturas fue de al menos tres veces. Alternativamente, después de la lectura de azul de Alamar, las placas fueron enjuagadas con PBS, 50 ul de DMEM (con alto contenido de glucosa) sin rojo de fenol fueron agregados y las placas se utilizaron entonces para el ensayo de la luciferasa utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega Dual-Glo .

El análisis del compuesto se determinó por la cuantificación de la inhibición del replicón de VHC relativa y los valores de la citotoxicidad relativos. Para calcular los valores de la citotoxicidad, las señales de fluorescencia del azul de Alamar promedio de las cavidades de control fueron fijadas como 100% no tóxicas. Las señales individuales en cada una de las cavidades de prueba del compuesto fueron divididas entonces entre la señal de control promedio y se multiplicaron por 100% para determinar el porcentaje de citotoxicidad. Para calcular los valores de inhibición del replicón de VHC, un valor del fondo promedio fue obtenido de las dos cavidades que contienen la cantidad más elevada del inhibidor de la proteasa de VHC al final del período de ensayo. Estos números fueron semejantes a aquellos obtenidos de las células Huh-7 naturales.

Los números del fondo fueron restados entonces de la señal promedio obtenida de las cavidades de control y este número fue utilizado como una actividad del 100%. Las señales individuales en cada una de las cavidades del compuesto de prueba se dividieron entre los valores del control promediados después de la resta del fondo y se multiplicaron por 100% para determinar la actividad porcentual. Los valores de EC50 para una titulación del inhibidor de la proteasa fueron calculados como la concentración que provocó una reducción del 50% en FRET o la actividad de la luciferasa. Los dos números generados para la placa del compuesto, la citotoxicidad porcentual y la actividad porcentual fueron utilizados para determinar los compuestos de interés para un análisis adicional.

Ensayo del Gen Informador de Luciferasa del Replicón de VHC El ensayo de luciferasa del replicón de VHC fue desarrollado para verificar los efectos inhibidores de los compuestos descritos en la descripción sobre la replicación viral de VHC. El uso de un ensayo del gen informador de luciferasa del replicón fue descrito primero por Krieger et al (Krieger N, Lohmann V, y Bartenschlager R, J. Virol. 75 (10) :4614-4624 (2001)). Las células HUH-7, que expresan cons itutivamente el replicón de VHC, se hicieron crecer en el medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) (Gibco-BRL) que contiene 10% de suero de bovino fetal (FCS, por sus siglas en inglés) (Sigma) y 1 mg/ml de G418 (Gibco-BRL) . Los compuestos fueron diluidos en serie 3 veces en DMSO para una titulación de veinte puntos y subsiguientemente se transfirieron a placas tratadas con el cultivo-tejido de 384 cavidades, estériles (Corning Cat # 3571) . Las placas fueron sembradas entonces con 50 µ? de las células a una densidad de 3.0 x 103 células/cavidad en DMEM que contiene 4% de FCS (concentración de DMSO final al 0.5%). Después de 3 días de incubación a 37 °C, las células fueron analizadas para verificar la actividad de la Luciferasa de la Renilla utilizando el EnduRen como el sustrato (Promega cat # G8082) el sustrato EnduRen fue diluido en DMEM y luego se agrega a las placas a una concentración final de 7.5 µ?. Las placas fueron incubadas durante 2 horas a 37 °C y luego se leen inmediatamente durante 30 segundos con un aparato Viewlux Imager (PerkinElmer) utilizando un programa de luminiscencia. Para evaluar la citotoxicidad de los compuestos, los valores de CC50 fueron generados multiplexando las placas que contienen EnDuren con el azul para la titulación de las células (Promega, cat # G8082) . 3 µ? del Azul para la Titulación de las Células fueron agregados a cada cavidad y se incubaron durante 8 horas a 37 °C. La señal de fluorescencia de cada cavidad fue leída, con una longitud de onda de excitación a 525-10 nm y una longitud de onda de emisión de emisión de 598/10 nm, utilizando el aparato Viewlux Imager.

Los datos representativos para los compuestos son representados en la tabla 1.

Tabla 1.

Si ningún dato es introducido, utilice la siguiente clave: un 0.002 o menor hasta 0.25 µ?; B >0.25 µ? - <1.0 µ?; C 1,0 µ? - 10.00 µ?; D >0.67 µ? pero un valor exacto no fue determinado; E >10.0 µ?; F >0.4 µ? pero un valor exacto no. fue determinado; G >1.39 µ? pero un exacto no fue determinado; H >0.62 µ? pero un valor exacto no fue determinado; I >4 µ? pero un valor exacto no fue determinado; J >3.7 µ? pero un valor exacto no fue determinado; K >1.23 µ? pero un valor exacto no fue determinado; L >4.17 µ? pero un valor exacto no fue determinado; M >0.5 µ? pero un valor exacto no fue determinado.

Composiciones Farmacéuticas y Métodos de Tratamiento Los compuestos demuestran actividad contra NS5B de VHC y pueden ser útiles en el tratamiento de VHC y la infección provocada por VCH. Por lo tanto, otro aspecto de la invención es una composición que comprende un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es una composición que comprende además un compuesto que tiene una actividad anti-VHC .

Otro aspecto de la invención en una composición en donde el compuesto que tiene una actividad de anti-VHC es un interferón. Otro aspecto de la invención es en donde el interferón es seleccionado del interferón alfa 2B, el interferón alfa pegilado, el interferón de consenso, el interferón alfa 2A, y el interferón tau linfoblastoide .

Otro aspecto de la invención es una composición en donde el compuesto que tiene la actividad de anti-VHC es una ciclosporina . Otro aspecto de la invención es en donde la ciclosporina es la ciclosporina A.

Otro aspecto de la invención es una composición en donde el compuesto que tiene una actividad anti-VHC se selecciona del grupo que consiste de interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, un compuesto que mejora el desarrollo de una respuesta de la célula T auxiliadora del tipo 1, el ARN de interferencia, el ARN de anti - sentido , Imiqimod, ribavirina, un inhibidor de la inosina 5 ' -monofosfato deshidrogenasa, amantadina y rimantadina .

Otro aspecto de la invención es una composición en donde el compuesto que tiene una actividad anti-VHC es efectiva para inhibir la función de un objetivo seleccionado de VHC metaloproteasa, la serina proteasa de VHC, la polimerasa de VHC, la helicasa de VHC, la proteína NS4B de VHC, la entrada de VHC, el ensamblaje de VHC, la salida de VHC, la proteína NS5A DE VHC, IMPDH, y un análogo del nucléosido para el tratamiento de una infección provocada por VHC.

Otro aspecto de la invención es una composición que comprende un compuesto, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, un portador farmacéuticamente aceptable, un interferón y ribavirina.

Otro aspecto de la invención es un método de inhibición de la función del replicón de VHC que comprende poner en contacto el replicón de VHC con un compuesto o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es un método de inhibición de la función de la proteína de NS5B de VHC que comprende poner en contacto la proteína de NNS5B de VHC con un compuesto o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable .

Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de una infección provocada por VHC en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, el compuesto es efectivo para inhibir la función del replicón de VHC. En otra modalidad, el compuesto es efectivo para inhibir la función de la proteína NS5B de VHC.

Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de una infección provocada por VHC en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en conjunción con (previo a, después de, o concurrentemente con) otro compuesto que tiene una actividad anti-VHC.

Otro aspecto de la invención es el método en donde el otro compuesto que tiene una actividad de anti-VHC es un interferón.

Otro aspecto de la invención es el método en donde el interferón se selecciona del interferón alfa 2B, el interferón alfa pegilado, el interferón de consenso, el interferón alfa 2A, y el interferón tau linfoblastoide .

Otro aspecto de la invención es el método en donde el otro compuesto que tiene una actividad anti-VHC es una ciclosporina.

Otro aspecto de la invención es el método en donde la ciclosporina es la ciclosporina A.

Otro aspecto de la invención es el método en donde el otro compuesto que tiene la actividad anti-VHC se selecciona de la interleucina 2, interleucina 6, interleucina 12, un compuesto que mejora el desarrollo de una respuesta de la célula auxiliadora T del tipo 1, el ARN de interferencia, el ARN de anti-sentido, Imiquimod, ribavirina, un inhibidor de la inosina 5 ' -monofosfato deshidrogenasa, amantadina, y rimantadina .

Otro aspecto de la invención es el método en donde el otro compuesto que tiene actividad anti-VHC es efectivo para inhibir la función de un objetivo seleccionado de VHC metaloproteasa, la serina proteasa de VHC, la polimerasa de VHC, la helicasa de VHC, la proteína NS4B de VHC, la entrada de VHC, el ensamblaje de VHC, la salida de VHC, la proteína NS5A DE VHC, IMPDH, y un análogo del nucléosido para el tratamiento de una infección provocada por VHC.

Otro aspecto de la invención es el método en donde el otro compuesto que tiene la actividad de anti-VHC es efectivo para inhibir la función de objetivo en el ciclo de vida de VHC diferente que la proteína de NS5B de VHC.

"Terapéuticamente efectivo" significa la cantidad del agente requerido para proporcionar un beneficio significativo al paciente como se entiende por los especialistas en el campo de la hepatitis y la infección provocada por VHC.

"Paciente" significa una persona infectada con el virus de VHC y adecuado para terapia como es entendida por los especialistas en el campo de la hepatitis y la infección por VHC.

"Tratamiento" "terapia", "régimen", "infección provocada por VHC" y los términos relacionados, son utilizados como es entendido por los especialistas en el campo de la hepatitis y la infección provocada por VHC.

Los compuestos de esta invención son provistos generalmente como composiciones farmacéuticas comprendidas de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o su sal farmacéuticamente aceptable y un portador farmacéuticamente aceptable, y pueda contener excipientes convencionales. Los portadores farmacéuticamente aceptable son aquellos que son los portadores conocidos convencionalmente que tienen perfiles de seguridad aceptables. Las composiciones abarcan todas las formas sólidas y líquidas comunes incluyendo por ejemplo cápsulas, tabletas, pastillas, y polvos así como suspensiones líquidas, jarabes, elíxires y soluciones. Las composiciones se hacen utilizando técnicas de formulación comunes y excipientes. convencionales (tales como agentes aglutinantes y humectantes) y vehículos (tales como agua y alcoholes) son utilizados generalmente para las composiciones. Véase por ejemplo, Remington's Farmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 17/a. edición, 1985.

Las composiciones sólidas son formuladas normalmente en unidades de dosificación y las composiciones que proporcionan desde aproximadamente 1 hasta 1000 mg del ingrediente activo por dosis son preferidas. Algunos ejemplos de las dosificaciones son 1 mg, 10 mg, 100 mg, 250 mg, 500 mg, y 1000 mg. Generalmente, otros agentes estarán presentes en un intervalo unitario semejante a aquellos de la clase utilizada clínicamente. Típicamente, este es de 0.25-1000 mg/unidad .

Las composiciones líquidas son usualmente en intervalos unitarios de la dosificación. En general, la composición líquida estará en un intervalo de dosificación unitaria de 1-100 mg/mL. Algunos ejemplos de las dosificaciones son 1 mg/mL, 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL y 100 mg/mL. En general, otros agentes estarán presentes en un intervalo unitario semejante a los agentes de esta clase utilizados clínicamente. Típicamente, este es de 1-100 mg/mL.

La invención abarca todos los modos convencionales de administración; se prefieren los métodos orales y parenterales . En general, el régimen de dosificación será semejante a otros agentes utilizados clínicamente. Típicamente, la dosis diaria será de 1-100 mg/kg de peso corporal diariamente. En general, más compuesto es requerido oralmente y menos parenteralmente. Sin embargo, el régimen de dosificación específico será determinado por un médico utilizando el juicio médico sano.

La invención también abarca métodos en donde el compuesto está dado en una terapia combinada. Es decir, el compuesto puede ser utilizado en conjunción con, pero separadamente de, otros agentes útiles en el tratamiento de la hepatitis y de la infección provocada por VHC. En estos métodos combinados, el compuesto será provisto generalmente en una dosis diaria de 1-100 mg/kg de peso corporal diariamente en conjunción con otros agentes . Los otros agentes generalmente serán provistos en las cantidades utilizadas terapéuticamente. Sin embargo, el régimen de dosificación específico será determinado por un médico utilizando el juicio médico sano.

Algunos ejemplos de los compuestos adecuados para las composiciones y métodos son listados en la Tabla 2.

Tabla 2.

Descripción de las modalidades específicas Compuesto Intermedio I 3- (4 -fluorofenil) -N-metilpropiolamida . La preparación de la N-metilpropiolamida se describe en WO1998022429A1 , la preparación de la página 27 fue utilizada para preparar este compuesto intermedio. La 3- (4-fluorofenil) -N-metilpropiolamida podría ser preparada de manera análoga de acuerdo con los métodos para la preparación de la 3 - (3 -fluorofenil) -N-metilpropiolamida o 3- (2, 5-difluorofenil) -N-metilpropiolamida en J. Org. Chem. Vol. 63, No. 15, 1998, 5050-5058 o para la unión del 4-fluoro iodo benceno al TMS acetileno como se encuentra en Organic Letters vol 7, No. 21, 2005, 4753 información suplementaria, página 1. Por consiguiente, el l-fluoro-4-yodobenceno disponible comercialmente , la N-metilpropiolamida, Pd (PPh3) 2C12, yoduro de cobre (I), y trietilamina podrían ser combinados y calentados para proveer el producto deseado después del trabajo de la manera habitual. 1H RMN (400 MHz , CLOROFORMO-d) d ppm 7.45 - 7.54 (m, 2H) , 6.99-7.11 (m, 2H) , 6.02 (s amp . , 1H) , 2.93 (d, J=5.02 Hz, 3H) . Tiempo de retención por LCMS : 1.405 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna de 10 micrones, C18, de 3.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 4 mL/min, un gradiente de 100% el solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 4 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 mM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado . m/z 178 (MH+) .

Compuesto intermedio 2 (4-fluorofenil)propioloil (metil) ca.rha.ma.to terce-butilo. A una solución que contiene la 3-(4-fluorofenil) -N-metilpropiolamida (10.0 g, 56 mmol), dicarbonado de di- tere-butilo (13.5 g, 62 mmol) y THF (282 raL) se agrega a dimetilaminopiridina (0.69 g, 5.6 mmol) en una porción. La solución fue mantenida durante 1 h, se concentra para remover todo el solvente y se purifica sobre gel de sílice (0-80% de acetato de etilo/hexanos , gradiente de 60 minutos) para dar un sólido blanco. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) d ppm 7.59 (dd, J=9.03, 5.27 Hz, 2 H) , 7.08 (t, J=8.78 Hz, 2 H) , 3.23 (s, 3 H) , 1.54 - 1.61 (m, 9 H) . Tiempo de Retención de LCMS: 2.397 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 10 micrones, C18, de 3.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 4 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 4 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 nM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado . m/z 300 (MNa+) .

Compuesto intermedio 3 Acido 4-metil-3- (piridazin-4 -il)benzoico. A una mezcla desgasificada que contiene la 4-bromopiridazina (0.10 g, 0.63 mmol) , ácido 4-metil-3- (4 , 4 , 5 , 5-tetrametil-l, 3 , 2-dioxaborolan-2-il)benzoico (0.18 g, 0.69 mmol), carbonato de sodio (0.27 g, 2.52 mmol), dioxano (5.2 mL) y agua (1.01 mL) se agrega el tetraquis (tifenilfosfino)paladium(O) (0.02 g, 0.02 mmol) en una porción bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla se calienta con agitación rápida a 95 °C durante 4 h, se enfría a temperatura ambiente y se filtra. La solución filtrada se acidifica hasta abajo de pH 4 con HC1 1N (5.0 mL) . El precipitado resultante fue recuperado por filtración, se lava con agua (3x 3.0 mL) y se seca con aire. El sólido color canela resultante se suspende en n-pentano (4 mL) , se agita durante 20 minutos, se recupera por filtración y se seca con aire para dar el ácido 4-metil-3-(piridazin-4 -il) benzoico como un sólido color canela el cual fue utilizado sin purificación adicional. Tiempo de Retención de LCMS: 1.325 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Sunfire, 5 micrones, C18, de 3.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 4 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 4 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% CH3CN/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 215 (MH+) .

Compuesto intermedio 4 4-metil-N- (l-fenilciclopropil) -3- (piridazin~4-il)benza ida. A una solución que contiene el clorhidrato de 2-fenilciclopropanamina (0.13 g, 0.76 mmol) , diisopropiletilamina (0.88 mL, 5.0 mmol), ácido 4-metil-3- (piridazin-4-il) benzoico (0.14 g, 0.63 mmol) y DMF (4.2 mL) se agrega HATU (0.48 g, 1.3 mmol) en . una porción. La solución se mantiene a temperatura ambiente durante 40 min. y se concentra hasta un residuo. El residuo así obtenido se purifica sobre gel de sílice (0-8% de metanol/diclorometano, gradiente de 45 minutos) para dar la 4-metil-N- (l-fenilciclopropil) -3- (piridazin-4-il) benzamida. 1H RM (500 MHz, CLOROFORMO-D) d ppm 9.22-9.28 (m, 1 H) , 9.18 (d, J=1.22 Hz, 1 H) , 7.75-7.85 (m, 1H) , 7.70 (d, J=1.83 Hz, 1H) , 7.51 (dd, J=5.19, 2.44 Hz, 1 H) , 7.37-7.42 (m, 1 H) , 7.23-7.33 (m, 5 H) , 7.15-7.21 (m, 2H) , 3.70 (dt, J=13.12, 6.56 Hz, 3 H) , 3.17 (c, J=7.32 Hz, 3 H) , 2.30-2.40 (m, 3 H) . Tiempo de Retención de LCMS: 1.655 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Sunfire, de 5 micrones, C18, de 4.6 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 4 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 4 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 mM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 330 (MH+) .

Compuesto intermedio 5 y Compuesto intermedio 6 2- (4-fluorofenil) -5- (2-retil-S- (1- fenilciclopropi1carbamoi1) fenil)pirazolo[l,5-b]piridazina-3-carbonil (metil) carbamato de tere-butilo y 2- (4-fluorofenil) -4- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil)pirazolo [1,5-b]piridazina-3-carbonil (metil) carbamato de tere-butilo. Parte A: a una solución enfriada (0 ° C, baño de hielo) que contiene la 4-metil-N- (1-fenilciclopropil) -3- (piridazin-4-il) benzamida (0.21 g, 0.55 mmol) y diclorometano (4 mL) se agrega - la O-(mesitilsulfonil) hidroxilamina (0.23 g, 0.58 mmol) en diclorometano (3 mL) rápidamente, por goteo. La solución se mantiene a 0 °C durante 5 minutos, se remueve del baño de enfriamiento y se mantiene a temperatura ambiente durante 45 minutos . La solución se concentra hasta una espuma y se suspende en n-pentano (5 mL) con agitación durante 20 minutos. El sólido fue colectado por filtración y se seca con aire para dar el 2,4, 6-trimetilbencenosulfonato de l-amino-4- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil) piridazin-l-nio como un polvo amarillo (345 MH+) . Parte B: El producto así obtenido en la parte A se suspende en THF (3.7 mL) . Se agrega el 3-4-fluorofenil) ropioloil (metil) carbamato de tere-butilo (0.19 g, 0.69 mmol) y la suspensión se enfría a -78 °C (baño de hielo seco/acetona). Se agrega por goteo DBU (0.17 g, 1.14 mmol) en THF (2 mL) por goteo durante 5 minutos. La mezcla se deja en el baño de enfriamiento y se deja que proceda durante 20 h a temperatura ambiente. La mezcla se concentra. La purificación sobre gel de sílice (30-100% de acetato de etilo/hexanos, gradiente de 60 minutos) produjo el 2- (4-fluorofenil) -5- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil) irazolo [1, 5-b] piridazina-3-carbonil (metil) carbamato de tere-butilo y 2- (4-fluorofenil) -4- (2-metil-5- (1-fenilciclpropilcarbamoil) fenil) irazolo [1,5-b] iridazina-3-carbonil (metil) carbamato de tere-butilo como regioisómeros separados. El 2- (4-fluorofenil) -5- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil) pirazolo [1, 5-b] piridazina-3-carbonil (metil) carbamato de tere-butilo: 1H RM (400 MHz, CLOROFORMO-d) d ppm 8.35 (d, .7=2.26 Hz, 1 H) , 8.12 (d, J=2.51 Hz, 1 H) , 7.70 - 7.83 (m, 4 H) , 7.42 (d, J=8.03 Hz, 1 H) , 7.28 - 7.37 (m, 5 H) , 7.13 - 7.24 (m, 3 H) , 6.91 (s, 1 H) , 3.29 (s, 3 H) , 2.40 (s, 3 H) , 1.40 (d, J=6.27 Hz, 4 H) , 1. 10 (s, 9 H) . LCMS tiempo de retención: 2.731 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 10 micrones, C18, de 3.0 x -50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 mM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 4mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 4 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 mM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 620 (MH+) . 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) d ppm 8.68 (d, .7=2.51 Hz, 1 H) , 8.43 (d, J=2.26 Hz, 1 H) , 7.85 (dd, J=7.91, 1.88 Hz, 1 H) , 7.72 - 7.81 (m, 3 H) , 7.45 (d, J=8.03 Hz, 1 H) , 7.28 - 7.36 (m, 5 H) , 7.16 - 7.27 (m, 3 H) , 5.90 (d, J=4.52 Hz, 1 H) , 2.90 (d, J=5.02 Hz, 3 H) , 2.43 (s, 3 H) , 1.42 (s, 2 H) , 1.35 - 1.41 (m, 2 H) . 2- (4-fluorofenil) -4- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil) pirazolo [1, 5-b] piridazina-3-carbonil (metil) carbamato de tere-butilo: 1H MN (400 MHz, CLOROFOR O-d) d ppm 8.41 (t, J=5.14 Hz, 1 H) , 7.79 -7.92 (m, 3 H) , 7.46 - 7.58 (m, 2 H) , 7.41 (d, J=8.03 Hz, 1 H) , 7.28 - 7.39 (m, 4 H) , 7.10 - 7.23 (m, 3 H) , 6.88 -6.97 (m, 1 H) , 2.59 (s, 1 H) , 2.49 (s, 2 H) , 2.39 (s, 1 H) , 2.12 (s, 2 H) , 1.30 1.43 (m, 4 H) , 0.96 - 1.06 (m, 9 H) . Tiempo de Retención de LCMS: 2.616 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 10 micrones, C18, de 3.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 4 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100 del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de l minuto, y un tiempo de análisis de 4 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 620 (MH+) .

Ejemplo 1 2- (4 -fluorofenil) -N-metil-5- (2-metil-S- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil)pirazolo [i, 5-b]piridazina-3-carboxamida. A una solución que contiene el 2- (4-fluorofenil) -5- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) -fenil) pirazolo [1, 5-b] piridazina-3-carbonil (metil) carbamato de tere-butilo (0.044 g, 0.065 mmol) y diclorometano (4 mL) se agrega TFA (0.41 mL, 5.3 mmol) a temperatura ambiente. La solución fue mantenida durante 15 minutos y se concentra. El residuo resultante se purifica utilizando HPLC preparativa (columna Waters-Xbridge , 50 x 100 mm, 5 micrones, C 18; acetato de amonio, 0-100% B (B = 5% H20/CH3CN) / A (A = 95% H20/CH3CN) , gradiente de 15 min.) para dar la 2- (4-fluorofenil) -N-metil-5- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil) pirazolo [1, 5-b] iridazina-3-carboxamida como un sólido blanco. HPLC Preparativa: tiempo de retención: 12.6 min. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) S ppm 8.68 (d, .7=2.51 Hz, 1 H) , 8.43 (d, J=2.26 Hz, 1 H) , 7.85 (dd, J=7.91, 1.88 Hz, 1 H) , 7.72 - 7.81 (m, 3 H) , 7.45 (d, J=8.03 Hz, 1 H) , 7.28 - 7.36 (m, 5 H) , 7.16 - 7.27 (m, 3 H) , 5.90 (d, J=4.52 Hz, 1 H) , 2.90 (d, J=5.02 Hz, 3 H) , 2.43 (s, 3 H) , 1. 42 (s, 2 H) , 1. 35 - 1.41 (m, 2 H) . Tiempo de Retención de LC S: 2.310 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-IOAS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 10 micrones, C18, de 3.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 4 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 4 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de ¾0/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 520 (MH+) .

Ejemplo 2 2- (4 -flúorofenil) -N-metil-4- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarhamoil) fenil)pirazolo [1, 5-b]piridazina carboxamida. A una solución que contiene el 2 fluorofenil) -4- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil) irazolo [1, 5-b] piridazina-3 -carbonil (metil) carbamato de tere-butilo (0.054 g, 0.087 mmol) y diclorometano (4 mL) se agrega TFA (0.54 mL, 7.6 mmol) a temperatura ambiente. La solución fue mantenida durante 15 minutos y se concentra. El residuo resultante se purifica utilizando HPLC preparativa ( aters-Xbridge, 50 x 100 mm, 5 micrones, columna C 18; acetato de amonio, 0. 1 M acetato de amonio, 10-100% B (B = 5% H20/CH3CN)/ A (A = 95% H2O/CH3CN) , gradiente de 15 min.) para dar la 2- (4-fluorofenil) -N-metil-4- (2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil) pirazolo [1 , 5-b] piridazina-3 -carboxamida como un sólido blanco. HPLC Preparativa: Tiempo de retención: 11.8 min. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 8.92 (S, 1 H) , 8.63 (d, J=4.52 Hz, 1 H) , 7.98 (d, .7=4.77 Hz, 1 H) , 7.88 - 7.95 (m, 2 H) , 7.85 (dd, J=7.91, 1.63 Hz , 1 H) , 7.82 (s, 1 H) , 7.47 (d, J=8.28 Hz , 1 H) , 7.34 (t, .7=8.91 Hz, 2 H) , 7.19 - 7.31 (m, 5 H) , 7.11 - 7.19 (m, 1 H) , 2.23 (s, 3 H) , 2.08 (d, .7=4.52 Hz, 3 H) , 1.21 - 1.34 (m, 4 H) . Tiempo de Retención de LCMS: 2.188 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 10 micrones, C18, de 3.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 4 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100 del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 4 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado . m/z 520 (MH+) .

Compuesto Intermedio 7 2-metoxi-4 -metil-5- (piridazin-4-il)benzoato de metilo. A una mezcla que contiene el bromhidrato de 4-bromopiridazina (0.20 g, 0. 83 mol) , carbonato de cesio (1. 1 g, 3.3 mmol) y ácido 4-metoxi-5- (metoxicarbonil) -2-metilfenilborónico (0.22 g, 1.0 mmol) se carga con dioxano (8.3 mL) . El nitrógeno se purga a través de la mezcla durante 15 minutos con agitación. La agitación se detiene y se agrega tris (dibencilidenoacetona) dipaladio(O) (0.38 g, 0.04 mmol) seguido por triciclohexilfosfina (0.04 g, 0. 13 mmol) en tolueno (0. 15 mL) . La agitación fue reasumida y la mezcla se calienta a 80 °C durante 105 minutos bajo gas nitrógeno. La reacción se enfria a TA, se filtra y se concentra hasta un residuo. El residuo se purifica sobre gel de sílice (5-100% acetato de etilo/hexano) para dar el 2-metoxi-4-metil-5- (piridazin-4-il)benzoato de metilo como un sólido blanco. ¾ RMN (400MHz, CLOROFORMO-d) 9.32 - 9.14 (m, 2H) , 7.75 (s, 1H) , 7.46 (dd, J=5.0, 2.3 Hz, 1H) , 6.95 (s, 1H) , 3.98 (s, 3H) , 3.90 (s, 3H) , 2.39 (s, 3H) . Tiempo de Retención de LCMS: 2.805 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 10 micrones, C18, de 2.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 0.8 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 4 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo dé análisis de 5 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 259 (MH+) .

Compuesto Intermedio 8 y Compuesto Intermedio 9 5- (3- (terc-butoxicarbonil (metil) carbamoil) -2- (4-fluorofenil)pirazolo[l, 5-b]piridazin-5-il) -2-metoxi -4-metilbenzoato de metilo y 5-(3-(terc-butoxicarbonil (metil) carbamoil) -2- (4- fluorofeniDpirazolo [1 , 5-b]piridazin-4 -il) -2-metoxi -4-metilbenzoato de metilo. Parte A: A una solución enfriada (0 °C, baño de hielo) que contiene el 2-metoxi-4 -metil-5- (piridazin-4-il) benzoato de metilo (0.16 g, 0.66 mmol) y diclorómetaño (3 mL) se agrega la O- (mesitilsulfonil) hidroxilamina (0.32 g, 0.90 mmol) en diclorometano (3 mL) rápidamente, por goteo. La solución se mantiene a 0 °C durante 5 minutos, se remueve del baño de enfriamiento y se mantiene a temperatura ambiente durante 5 h. La solución se concentra para dar el 2,4,6-trimetilbencenosulfonato de l-amino-4- (4-metoxi-5- (metoxicarbonil) -2-metilfenil) piridazin-l-io como una espuma (274 MH+) . Parte B: Sl producto así obtenido en la parte A se suspende en THF (2.0 mL) . Se agrega el 3-(4-fluorofenil) propioloil (metil) carbamato de tere-butilo (0.17 g, 0.60 mmol) y la suspensión se enfría a -78 °C (hielo seco/acetona) . Se agrega por goteo el DBU (0.27 g, 1.8 mmol) en THF (1.0 mL) por goteo durante 2 min. La mezcla se deja en el baño de enfriamiento durante 20 minutos, luego se remueve del enfriamiento y se deja que proceda durante 20 h a temperatura ambiente. La mezcla se fija y se concentra. La purificación sobre gel de sílice (acetato de etilo/hexanos al 20-80%, gradiente de 60 min.) produjo el 5-(3-(terc-butoxicarbonil (metil) carbamoil) -2- (4-fluorofenil) pirazolo [1, 5-b] piridazin-5-il) -2-metoxi-4-metilbenzoato de metilo y 5-(3-(terc-butoxicarbonil (metil) carbamoil) -2- (4-fluorofenil) irazolo [1 , 5-b] piridazin-4-il) -2-metoxi-4 -metilbenzoato de metilo como regioisómeros separados. 5- (3- (terc-butoxicarbonil ( etil) carbamoil) -2- (4-fluorofenil)pirazolo [1, 5-b]piridazin-5-il) -2-metoxi-4-metilbenzoato: XH RM (400MHz, CLOROFORMO-d) d 8.35 (d, .7=2.3 Hz, 1 H) , 8.10 (d, J=2.5 Hz, 1 H) , 7.82 - 7.73 (m, 3H) , 7.17 (t, J=8.7 Hz, 2H) , 6.95 (s, 1H) , 5.31 (s, 2H) , 3.99 (s, 3H) , 3.93 -3.89 (m, 3H) , 3.28 (s, 3H) , 2.42 (s, 3H) , 1.10 (s, 10H) . Tiempo de Retención de LCMS: 4.360 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 3 micrones, C18, de 2.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 0.8 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 4 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 5 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma M cromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 549 (MH+) . 5- (3- (terc-butoxicarbonil (metil) carbamoil) -2- (4-fluorofenil)pirazolo[l, 5-b]piridazin-4-il) -2-metoxi-4-metilbenzoato: XH RM (400MHz, CLOROFORMO-d) d 8.37 (d, J=4.8 Hz, 1H) , 7.72 (dd, J=9.0, 5.3 Hz, 2H) , 7.66 (s, 1H) , 7.11 (t, J=8.8 Hz, 2H) , 6.96 (s, 1H) , 6.91 (d, .7=4.5 Hz, 1H) , 3.99 (s, 3H) , 3.82 (s, 2H) , 2.82 (s, 2H) , 2.30 - 2.26 (m, 3H) , 1.04 (s, 9H) . Tiempo de Retención de LCMS: 4.086 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatografo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 10 micrones, C18, de 2.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon un análisis de flujo de 0.8 ml/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 4 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 5 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 mM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 549 (MH+) .

Compuesto Intermedio 10 5- (2- (4-fluorofenil) -3- (metilcarbamoil)pirazolo [1, 5-b]piridazin-il) -2-metoxi-4-metilbenzoato de metilo. A una solución que contiene el 5- (3- (terc-butoxicarbonil (metil) carbamoil) -2- (4-fluorofenil) irazolo [1, 5-b] piridazin-5-il) -2-metoxi-4-metilbenzoato de metilo (0.75 g, 0.13 mmol) y diclorometano (3 mL) se agrega TFA (0.2 mL, 2.7 mmol) a temperatura ambiente. La solución se mantiene durante 15 minutos y se concentra a sequedad para dar el 5- (2- (4-fluorofenil) -3- (metilcarbamoil) irazolo [1, 5-b] piridazin-il) -2-metoxi-4-metilbenzoato de metilo como un sólido de color blanco mate que se utiliza sin purificación adicional. 1H RMN (400MHz, CLOROFORMO-d) d 8.63 (d, J"=2.3 Hz , 1H) , 8.45 (d, J=2.3 Hz, 1H) , 7.85 (s, 1H) , 7.80 - 7.69 (m, 2H) , 7.33 - 7.25 (m, 2H) , 6.98 (s, 1H) , 5.97 (s amp . , 1H) , 3.99 (s, 3H) , 3.96 - 3.85 (m, 3H) , 2.92 (d, J=5.0 Hz, 3H) , 2.45 (s, 3H) . Tiempo de Retención de LCMS: 3.758 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 3 micrones, C18, de 2.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon un análisis de flujo de 0.8 ml/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 4 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 5 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado. m/z 449 ( H+) .

Compuesto Intermedio 11 Ácido 5- (2- (4-fluorofenil) -3- ( etilcarbamoil) -pirazolo [1, 5-b]piridazin-5-il) -2-metoxi-4- etilbenzoico. A una solución que contiene el 5- (2- (4-fluorofenil) -3-(metilcarbamoil) pirazolo [1, 5-b] piridazin-5-il) -2-metoxi-4-metilbenzoato de metilo (0.061 g, 0. 14 mmol) y dioxario (0.7 mL) se agrega hidróxido de sodio acuoso (0.7 mL, 2.0 M) . La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 2 h. La solución se ajusta abajo de pH 4 con el HCl acuoso (1.5 mL, 1.0 N) . El ácido 5- (2- (4-fluorofenil) -3- (metilcarbamoil) pirazolo [1,5-b] iridazin-5-il) -2-metoxi-4-metilbenzoico se precipitó como un sólido de color canela. El mismo se retira por filtración, se lava con agua (3 x 4 mL) y se seca con aire. ¾ RM (400MHz, CLOROFORMO- d) d 8.66 (d, J=2.5 Hz, 1H) , 8.38 (d, J=2.5 Hz, 1H) , 8.16 (s, 1H) , 7.83 - 7.73 (m, 2H) , 7.29 - 7.22 (m, 2H) , 7.05 (s, 1H) , 5.68 (s amp., 1H) , 4.17 (s, 3H) , 2.89 (d, J=5.0 Hz, 3H) , 2.48 (s, 3H) . Tiempo de Retención de LCMS: 3.508 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 3 micrones, C18, de 2.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 0.8 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 4 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 5 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H20/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado . m/z 435 ( H+) .

Ejemplo 3 2- (4-fluorofenil) -5- (4-metoxi-2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil)fenil) -N-metilpirazolo [1 , 5-b]piridazina-3-carboxamida. A una solución que contiene el clorhidrato de 1-fenilciclopropanamina (0.008 g, 0.05 mmol) , diisopropiletilamina (0.05 mL, 0.28 mmol), el ácido 5- (2- (4-fluorofenil) -3 (metilcarbamoil)pirazolo [1, 5-b] piridazin-5-il) - 2-metoxi-4-metilbenzoico (0.015 g, 0.04 mmol) y DMF (0.23 mL) se agrega HATU (0.026 g, 0.07 mmol) en una porción. La solución se mantiene a temperatura ambiente durante 1 h. El producto se purifica utilizando HPLC preparativa (Waters-Xbridge, columna de 50 x 100 mm, 5 micrones, C18; acetato de amonio 0.1 M, 0-100% B (B = 5% H20/CH3CN) / A (A = 95% H20/ CH3CN) , gradiente de 15 minutos) para dar la 2- (4-fluorofenil) -5- (4 -metoxi-2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbamoil) fenil) -N-metilpirazolo [1, 5-b] piridazina-3 -carboxamida como un sólido blanco. Tiempo de retención de HPLC preparativa: 12.6 min. 1H RMN (400MHz, CLOROFORMO- d) d 8.61 (d, J=2.5 Hz, 1H) , 8.43 - 8.36 (m, 2H) , 8.19 (S, 1H) , 7.83-7.72 (m, 2H) , 7.35-7.29 (m, 4H) , 7.27-7.15 (m, 3H) , 6.97 (s, 1H) , 5.65 (s amp., 1H) , 4.07 (s, 3H) , 2.88 (d, J=4.8 Hz, 3H) , 2.45 (s, 3H) , 1.40 (s, 3H) . Tiempo de Retención de LCMS : 2.230 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatógrafo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 3 micrones, C18, de 2.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 1.0 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 2 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 3 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado . m/z 550 (MH+) .

Ejemplo 4 2- (4-fluorofenil) -5- (4-metoxi-2-metil-5- (piri idin-2-il) ciclopropilcarbamoil) fenil) -N-metilpirazolo [1,5-b]piridazin-3-carboxamida. A una solución que contiene el clorhidrato de 1- (pirimidin-2-il) ciclopropanamina (0.008 g, 0.05 mmol) , diisopropiletilamina (0.05 mL, 0.28 mmol) , ácido 5- (2- (4-fluorofenil) -3- (metilcarbamoil) pirazolo [1,5-b] piridazin-5-il) -2-metoxi-4-metilbenzoico (0.015 g, 0.04 mmol) y DMF (0.23 mL) se agrega HATU (0.026 g, 0.07 mmol) en una porción. La solución se mantiene a temperatura ambiente durante 1 h. El producto fue purificado utilizando HPLC preparativa (columna Waters-Xbridge, 50 x 100 mm, 5 micron, C18; 0.1 M acetato de amonio, 0-100% B (B = 5% H20/CH3CN) / A (A = 95% H20/CH3CN) , gradiente de 15 min.) para dar la 2- (4-fluorofenil) -5- (4-metoxi-2-metil-5- (1- (pirimidin-2 -il) ciclopropilcarbamoil) fenil) -N-methilpirazolo [1, 5- b] piridazin-3-carboxamida como un sólido blanco. Tiempo de retención de HPLC preparativa: 10.5 min. a? RMN (400MHz, CLOROFORMO-d) d 8.72 - 8.58 (ra, 4H) , 8.41 (d, J=2.3 Hz, 1H) , 8.23 (s, 1H) , 7.83 - 7.74 (m, 2H) , 7.26 - 7.20 (m, 1H) , 7.10 - 7.03 (m, 1H) , 6.98 (s, 1H) , 5.66 (s amp., 1H) , 4.09 (s, 3H) , 2.88 (d, J=4.8 Hz, 3H) , 2.46 (s, 3H) , 1.88 - 1.81 (m, 2H) , 1.59 - 1.52 (m, 2H) . Tiempo de Retención de LCMS : 2.057 min. Los datos de LC fueron registrados sobre un cromatografo de líquido Shimadzu LC-10AS equipado con una columna Phenomenex-Luna, de 3 micrones, C18, de 2.0 x 50 mm utilizando un detector de UV-Vis SPD-10AV a una longitud de onda del detector de 220 nM. Las condiciones de la elución emplearon una velocidad de flujo de 1.0 mL/min, un gradiente de 100% del solvente A/0% del solvente B hasta 0% del solvente A/100% del solvente B, un tiempo del gradiente de 3 minutos, un tiempo de retención de 1 minuto, y un tiempo de análisis de 3 minutos en donde el solvente A fue 10% de metanol/90% de' H20/TFA 10 nM y el solvente B fue 10% de H2O/90% de metanol/TFA 10 mM. Los datos de MS se determinaron utilizando una Plataforma Micromass para LC en un modo de electrorrociado . m/z 552 (MH+) .

Será evidente para un experto en el arte que la presente invención no está limitada a los ejemplos ilustrativos precedentes, y que puede ser incluida en otras formas específicas sin apartarse de los atributos esenciales de la misma. Por lo tanto se desea que los ejemplos sean considerados en todos los aspectos como ilustrativos y no como restrictivos, haciéndose referencia a las reivindicaciones anexas, en lugar de a los ejemplos precedentes, y todos los cambios que lleguen a estar considerados dentro del significado y gama de equivalencia de las reivindicaciones están propuestos por lo tanto para que sean abarcados allí.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un compuesto de la fórmula I I caracterizado porque: R1 es halo, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, dioxotiazinilo, (R5) (Re)N, CON(R 6)(R17) ¦ piridinilo o fenilo, en donde el piridinilo o fenilo está substituido con 1-2 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo, hidroxialquilo, alcoxialquilo, ( (R7) (R8) N) alquilo, hidroxi , alcoxi, (R7)(R8)N, carboxi, alcoxicarbonilo, y CON (R16) (R17) , y en donde el piridinilo o fenilo también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, alcoxi, piridinilo, fenilo, halofenilo, (halo) (CON) (R7) (R8)) fenilo, o (alcoxi) (CON) (R7) (R8) ) fenilo; R2 es hidrógeno, halo, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, o (R5) (R6)N; es ciano, alcoxicarbonilo, (cicloalquil) oxicarbonilo, (alquilsulfonil) aminocarbonilo, CON (R11) (R12) , (R13) (R14) NCONH, triazolilo, tiazolilo, o tetrazolilo; R4 es fenilo substituido con 0-2 substituyentes de halo, alcoxi, fenoxi, o halofenoxi; R5 es hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil) alquilo, bencilo, alquilcarbonilo, haloalquilcarbonilo, fenilcarbonilo, (alcoxifenil) carbonilo, alquilsulfonilo, fenilsufonilo, (alcoxifenil) sulfonilo o (haloalcoxifenil) sulfonilo; R6 es hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo, o alcoxialquilo; o R5 y R6 tomados conjuntamente con el nitrógeno al cual los mismos están fijados es dioxotiazinilo ; R7 es hidrógeno o alquilo; R8 es hidrógeno o alquilo; R9 es hidrógeno o alquilo; R10 es hidrógeno o alquilo; o R9 y R10 tomados conjuntamente son etileno, propileno, butileno, o pentileno, y está substituido con 0-2 átomos de flúor; R11 es hidrógeno o alquilo; R12 es hidrogenó o alquilo; o R11 y R12 tomados junto con el nitrógeno al cual los mismos están unidos, son azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo; R13 es hidrógeno o alquilo; R14 es hidrógeno o alquilo; o R13 y R14 tomados junto con el nitrógeno al cual los mismos están fijados, son azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo; R1S es alquilo o cicloalquilo; R16 es hidrógeno, alquilo, R17 es hidrógeno o alquilo; R18 es hidrógeno, halo, alquilo o alcoxi; y Ar1 es isoxazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, o fenilo; y está substituido con 0-3 substituyentes de halo, alquilo, haloalquilo, alcoxi, (R7) (R8)N, o fenilo; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: R1 es piridinilo o fenilo y está substituido con 1 substituyente seleccionado del grupo que consiste de carboxi, alcoxicarbonilo, y CON(R16) (R17) , y también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo o alcoxi; R2 es hidrógeno, halo, alquilo, cicloalquilo, alcoxi, o (R5) (R6)N; R3 es CON(R11) (R12) ; R4 es fenilo substituido con 0-2 substituyentes de halo, alcoxi, fenoxi, o halofenoxi; R9 es hidrógeno o alquilo; R10 es hidrógeno o alquilo; o R9 y R10 tomados conjuntamente son etileno, propileno, butileno, o pentileno; R11 es hidrógeno o alquilo; R12 es hidrógeno o alquilo; o R11 y R12 tomados junto con el nitrógeno al cual los mismos están fijados son azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo; R16 es hidrógeno, alquilo, o R17 es hidrógeno o alquilo; R18 es hidrógeno; y Ar1 es isoxazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, o fenilo; y está substituido con 0-3 substituyentes de halo, alquilo, haloalquilo, o alcoxi; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

3. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque: R1 es fenilo substituido con 1 substituyente de CON(R16) (R17) y también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, o alcoxi; R es hidrógeno; R3 es CO ÍR11) (R12) ; R4 es fenilo substituido con 0-2 substituyentes de halo, alcoxi, fenoxi, o halofenoxi; R9 es hidrógeno o alquilo; R10 es hidrógeno o alquilo; o R9 y R10 tomados conjuntamente son etileno, propileno, butileno, o pentileno; R11 es hidrógeno o alquilo; R12 es hidrógeno o alquilo; o R11 y R12 tomados conjuntamente con el nitrógeno al cual los mismos están fijados, son azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, o morfolinilo; R17 es hidrógeno o alquilo; y Ar1 es isoxazolilo, oxazolilo, oxadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, o fenilo; y está substituido con 0-3 substituyentes de halo, alquilo, haloalquilo, o alcoxi; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

4. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque R1 es fenilo substituido con 1 substituyente de CON (R16) (R17) y también substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo o alcoxi; R2 es hidrógeno; R3 es CONÍR11) (R12) ; R4 es fenilo substituido con 0-2 substituyentes de halo, alcoxi, fenoxi, o halofenoxi; R9 y R10 tomados conjuntamente son etileno; R11 es alquilo; R12 es hidrógeno; R16 es R17 es hidrógeno; y Ar1 es isoxazol, oxazolilo, oxadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, o fenilo,-o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

5. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque, R1 es fenilo substituido con 1 substituyente de CON(R16) (R17) y 1 substituyente de alquilo y 0-1 substituyentes de alcoxi; R2 es hidrógeno; R3 es CONHMe ; R4 es monofluorofenilo; R16 es r9 Y r1° tomados conjuntamente son etileno; hidrógeno; y Ar1 es pirimidinilo o fenilo; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

6. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 es piridinilo o fenilo y está substituido con 1-2 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo, hidroxialquilo, alcoxialquiló, ( (R7) (R8) ) alquilo, hidroxi, alcoxi, (R7) (R8)N, carboxi, alcoxicarbonilo, y CON (R16) (R17) , y en donde el fenilo o piridinilo también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, alcoxi, piridinilo, fenilo, halofenilo, (halo) (CON (R7) (R8) ) fenilo, o (alcoxi) (C0N(R7) (R8) ) fenilo.

7. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 es fenilo y está substituido con 1 substituyente de CON(R16) (R17) y también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, alcoxi, piridinilo, fenilo, halofenilo, (halo) (CO (R7) (R8) ) fenilo, o (alcoxi) (CON (R7) (R8) ) fenilo .

8. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R1 es fenilo y está substituido con 1 substituyente de CON(Rls) (R17) y también está substituido con 0-2 substituyentes de halo, alquilo, o alcoxi .

9. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R3 es CON(H) (alquilo) .

10. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R4 es halofenilo.

11. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R4 es fenilo o monofluorofenilo .

12. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: 2- (4-fluorofenil) -N-metil-5- (2-metil-5- (1- fenilciclopropilcarbamoil) fenil) pirazolo [1, 5-b] piridazin-3 -carboxamida; 2- (4-fluorofenil) -5- (4-metoxi-2-metil-5- (1-fenilciclopropilcarbaraoil) fenil) -N-metilpirazolo [1,5-b] iridazin-3 -carboxamida; y 2- (4-fluorofenil) -5- (4-metoxi-2-metil-5- (1-pirimidin-2-il) ciclopropilcarbamoil) fenil) -N-metilpirazolo [1, 5-b] piridazin-3 -carboxamida; o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

13. Una composición, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, o una sal de la misma farmacéuticamente aceptable, y un portador farmacéuticamente aceptable .

14. Uso de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la infección provocada por la hepatitis C.