MX2012006115A

MX2012006115A - Composiciones y metodos de daclizumab (dac) del proceso de alto rendimiento (hyp).

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Publication number: MX2012006115A
Application number: MX2012006115A
Authority: MX
Inventors: J Yun Tso; Taymar Hartman; Paul W Sauer; John W Burky; Mark C Wesson; Ping Y Huang; Thomas J Robinson; Braeden Partridge; John E Burky
Original assignee: Abbott Biotherapeutics Corp
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2012-12-04
Also published as: JP2012244993A; AU2012203095B2; CN102796705A; JP6055615B2; AU2016202873B2; JP2018134091A; RU2661764C2; US20200157230A1; AU2020202298A1; BR102012012673A2; JP2016210796A; RU2018119112A; CN107090040A; US9340619B2; US20120301429A1; RU2012121876A; AU2016202873A1; BR102012012673A8; CA2777978A1; US9676860B2

Abstract

La presente descripción se relaciona con las composiciones de daclizumab convenientes para la administración subcutánea y con los métodos de fabricación de las mismas.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS DE DACLIZUMAB (PAC) DEL PROCESO DE ALTO RENDIMIENTO (HYP) 1. Antecedentes de la Invención El daclizumab (DAC, por sus siglas en inglés) es un anticuerpo monoclonal Igd humanizado que une a la subunidad alfa (CD25 o Tac) del receptor de interleucina-2 (IL-2, por sus siglas en inglés) humana de alta afinidad, que se expresa en la superficie de los linfocitos T y B activados, pero no en reposo. Cuando se une a CD25 en las células activadas, DAC bloquea la formación del complejo del receptor de IL-2 de alta afinidad, para de tal modo bloquear la proliferación de las células activadas inducida por IL-2.

Según lo medido en los análisis de unión directa en los blastos PHA, DAC une a CD25 con una afinidad de unión aproximada (KD) de 0.3 nM, e inhibe la proliferación de los blastos PHA de una manera dependiente de dosis (Hakimi y colaboradores, 1993, J. Immunol. 151 (2): 1075-85). En una dosis subóptima de IL-2 (2.5 ng/ml), 15 nM de DAC inhiben la proliferación de la línea celular dependiente de IL-2 Kit225/K6 al 50% (Pilson y colaboradores, 1997, J. Immunol. 159 (3): 1543-56). En un análisis de proliferación de células T inducida por el antígeno dependiente de IL2, 50% de inhibición de proliferación se observó con DAC en el intervalo de 0.5-1 pg/ml (3-7 nM) (Junghans y colaboradores, 1990, Cáncer Res. 50(5): 1495-502).

Una versión de DAC se comercializó previamente para el tratamiento del rechazo agudo del aloinjerto en pacientes de trasplante renal como un complemento para un régimen inmunosupresivo que incluye ciclosporina y corticosteroides de Hoffman-La Roche, Inc. bajo la marca registrada ZENAPAX™. El ZENAPAX se suministró como un concentrado para la dilución adicional y administración intravenosa. Cada frasco de concentrado contuvo 5 mi de una solución que contuvo 5 mg/ml de DAC, 3.6 mg/ml de monohidrato monobásico de fosfato de sodio, 11 mg/ml de heptahidrato dibásico de fosfato de sodio, 4.6 mg/ml de cloruro de sodio, 0.2 mg/ml de polisorbato 80 y ácido clorhídrico y/o NaOH en una cantidad suficiente para ajustar el pH a pH 6.9. La dosis recomendada para los pacientes adultos y pediátricos fue de 1-0 mg/kg, preparada mediante la dilución del volumen calculado de 25 mg/5 mi de ZENAPAX concentrado con 50 mi de solución estéril de cloruro de sodio a 0.9% y mediante la administración intravenosa a través de una vena periférica o central durante un período de 15 minutos.

El DAC también ha mostrado eficacia en el tratamiento de la uveítis (Nussenblatt y colaboradores, 2004, asamblea FOCIS del 18-23 de julio de 2004; Montreal, QC. Sinopsis 4688; Nussenblatt y colaboradores 2003, J. Autoimmun. 21:283-93) y esclerosis múltiple (ver, por ejemplo, Bielekova y colaboradores, 2004, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 101 (23):8705-8708; Rose y colaboradores, 2007, Neurology 69:785-789; Patente Norteamericana No. 7,258,859), y es actualmente el objetivo de los ensayos clínicos en curso para el tratamiento de la esclerosis múltiple. Aunque el DAC ha demostrado ser seguro y efectivo, serían deseables las formulaciones líquidas a alta concentración que tienen vidas útiles largas y que se pueden administrar convenientemente sin la formulación o manipulación adicionales, así como las nuevas moléculas de daclizumab que tienen propiedades mejoradas, tal como seguridad mejorada, con respecto al DAC ZENAPAX. 2. Breve Descripción de la Invención Según lo mencionado en la sección de los Antecedentes de la Invención, el daclizumab es un anticuerpo lgG humanizado que une específicamente la subunidad alfa (también referida como CD25 o Tac) del receptor de interleucina-2 (IL-2R, por sus siglas en inglés) humana, que es un mediador importante de la activación de los linfocitos. Una versión del daclizumab comercializada previamente por Hoffman-La Roche bajo la marca registrada ZENAPAX™ ha demostrado seguridad y eficacia en el tratamiento del rechazo del aloinjerto renal cuando se utiliza como complemento para un régimen inmunosupresivo que incluye ciclosporina y corticosteroides (ver, por ejemplo, la autorización de comercialización para ZENAPAX de la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA, por sus siglas en inglés)), y también ha demostrado eficacia en el tratamiento de la esclerosis múltiple (ver, por ejemplo, Bielekova y colaboradores, 2004, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 101 (23):8705-8708; Rose y colaboradores, 2007, Neurology 69:785-789; Patente Norteamericana No. 7,258,859). De acuerdo con la EMEA, el DAC ZENAPAX se expresa en las células GS-NSO (mieloma de murino) y se purifica al usar un proceso que implica la cromatografía en Sefarosa Q, cromatografía en Sefarosa S, diafiltración, cromatografía en Sefarosa Q II, ultrafiltración , cromatografía mediante filtración en gel S-300 y ultrafiltración. Ahora se ha descubierto que el daclizumab expresado en una línea celular NSO que se ha adaptado para crecer en un medio sin suero y sin colesterol y otros medios sin productos animales y que se aisló mediante un diferente proceso, tiene las características y propiedades que son diferentes de, y ocasionalmente, superiores a, el daclizumab ZENAPAX ("DAC ZENAPAX"). Este nuevo daclizumab, referido en la presente como DAC HYP, tiene: un diferente perfil de isoforma que el DAC ZENAPAX (según lo determinado a través de la cromatografía de intercambio catiónico); un diferente perfil de glicosilación ligada a N que el DAC ZENAPAX, aunque ambas formas de daclizumab se expresan en las células NSO; y con menos citotoxicidad ADCC que DAC ZENAPAX en los análisis biológicos.

Por ejemplo, las isoformas de daclizumab son posibles debido a la heterogeneidad en las terminales C y N de cadena pesada. La secuencia de aminoácido de la cadena madura VH del daclizumab comienza en la posición 20 de la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEC ID NO: 4). La glutamina de terminal N (Q, por sus siglas en inglés) de la cadena madura VH (en texto subrayado en negritas en la figura 2) se puede ciclizar, formando así el piroglutamato (pE, por sus siglas en inglés). En algunos casos, la secuencia del péptido señal puede estar truncado, dejando así una secuencia de valina-histidina-serina (VHS, por sus siglas en inglés) unida al residuo de glutamina de terminal N de la cadena madura VH- Debido a que cada molécula de daclizumab contiene dos cadenas VH, varias isoformas de terminal N del daclizumab pueden incluir las formas que contienen: (1) dos residuos de glutamina (Q/Q, por sus siglas en inglés); (2) un residuo de glutamina y una secuencia de VHS (Q/VHS, por sus siglas en inglés o VHS/Q, por sus siglas en inglés); (3) dos secuencias VHS (VHS/VHS, por sus siglas en inglés); (4) un residuo de glutamina y un residuo de piroglutamato (Q/pE, por sus siglas en inglés o pE/Q, por sus siglas en inglés); (5) un residuo de piroglutamato y una secuencia VHS (pE/VHS, por sus siglas en inglés o VHS/pE, por sus siglas en inglés); y (6) dos residuos de piroglutamato (pE/pE, por sus siglas en inglés). Diferentes isoformas de terminal C también son posibles, las cuales contienen 0, 1 ó 2 residuos de Usina (K, por sus siglas en inglés) de terminal C (0K, 1K o 2K), lo cual da por resultado un perfil de isoforma compleja.

Muy asombrosamente, aunque las glutaminas de terminal N de las cadenas VH del DAC ZENAPAX se ciclizaron completamente al piroglutamato, la ciclización completa no se alcanzó para el DAC HYP. Por consiguiente, el cromatógrama de intercambio catiónico de DAC HYP se caracteriza por un máximo de isoforma pE/Q y un máximo de isoforma Q/VHS. Aunque no se pretende estar limitado por cualquier teoría, se cree que estas isoformas únicas pE/Q y Q/VHS se pueden alterar mediante la secuencia principal usada para expresar el DAC HYP. Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción proporciona las composiciones de daclizumab en las cuales la isoforma pE/Q oscila de 3%-17%, 3%-15%, 5%-15%, preferiblemente de 5%-12% o 7%-12% de las isoformas de terminal N, y/o en cuáles la isoforma Q/VHS oscila de 1 % - 15 % , preferiblemente 3%-12% de las isoformas de terminal N, según lo determinado mediante la cromatografía de intercambio catiónico.

En algunas modalidades, la composición de daclizumab se caracteriza por un perfil de cromatografía de intercambio catiónico que es sustancialmente similar a la figura 18 o al perfil de DAC HYP de la figura 23.

El daclizumab tiene los oligosacáridos ligados a N unidos al residuo Asn 296 de cadena pesada. Cuando estos oligosacáridos ligados a N se liberan al usar la amidasa PNGaseF y se analizan a través de HPLC, el DAC HYP exhibe un perfil de glicosilación diferente a DAC ZENAPAX, a pesar del hecho de que ambos se producen de manera recombinante en las líneas de células NSO. De hecho, el perfil de glicosilación de DAC HYP es inusualmente homogéneo. Con referencia al panel superior de la figura 21, el perfil de glicosilación del DAC ZENAPAX se caracteriza por los máximos que representan los oligosacáridos G0-G1cNAc, GO, G1, Man5, G2, Man6, Man7 y el oligosacárido sialilado. El panel inferior de la figura 21 muestra que el perfil de glicosilación de DAC HYP es caracterizado por dos máximos principales que corresponden a las glicoformas G0-G1cNAc y glicoformas GO y un máximo menor que corresponde a una glicoforma G1. Las glicoformas G0-G1cNAc pueden oscilar de 5% a aproximadamente 20% de la AUC, más comúnmente de aproximadamente 7.2% a 14.6% de la AUC. Las glicoformas GO pueden oscilar de 70% a 99.2% de la AUC, más comúnmente de 80.9% a 99.2% de la AUC. La glicoforma G1 puede oscilar de 1% a 9% de la AUC, más comúnmente de 1.4% a 3.8% de la AUC. Los oligosacáridos sialilados son de 1.0% de la AUC total o menos.

La inmunogenicidad y los altos niveles de la función efectora pueden ser problemáticos para los fármacos administrados de manera crónica. Además, las rápidas velocidades de eliminación pueden reducir la disponibilidad del fármaco. Como es bien conocido por los expertos en la técnica, las diferencias de los patrones de glicosilación de los anticuerpos terapéuticos pueden dar lugar a las diferencias de la inmunogenicidad. Los anticuerpos que tienen patrones de glicosilación muy homogéneos tal como DAC HYP, pueden proporcionar perfiles de inmunogenicidad beneficiosos, niveles de ADCC, y velocidades de eliminación. Además, los productos biológicos que tienen patrones de glicosilación más homogéneos reducen la variación de lote a lote y pueden mejorar la consistencia y estabilidad.

Por consiguiente, en otro aspecto la presente descripción proporciona las composiciones de daclizumab que se caracterizan por un perfil homogéneo de glicosilación ligada a N. En una modalidad, la composición de daclizumab es caracterizada por un perfil de glicosilación ligada a N que incluye aproximadamente 5-20% de la AUC total de las glicoformas G0-G1cNAc, y en algunas modalidades aproximadamente 5%-18% o aproximadamente 7-15% (por ejemplo, 7.2%-14.6% o 6.9% a 14.7%) de la AUC total de las glicoformas GO-GIcNAC (y en algunas modalidades específicas 7.3% de la AUC total de las glicoformas G0-G1cNAc), y aproximadamente 70%-99.2% de la AUC total de las glicoformas GO, y en algunas modalidades aproximadamente 75%-90%, aproximadamente 75-92% o aproximadamente 81-88% de la AUC total de las glicoformas GO (y en algunas modalidades específicas 86% de la AUC total de las glicoformas GO), según lo medido por HPLC. Opcionalmente, el máximo de G1 es menor que aproximadamente 10% de la AUC total, menor que aproximadamente 5%, menor que aproximadamente 4% o menor que aproximadamente 3% de la AUC total, y en ciertas modalidades oscila de aproximadamente 1% a aproximadamente 4% (por ejemplo, 1.4% a 3.8%) o aproximadamente 1% a aproximadamente 3%. Las glicoformas Man5 son preferiblemente de aproximadamente 3% de la AUC total o menos. En otras modalidades, la composición de daclizumab es caracterizada por un perfil de glicoforma ligada a N mediante HPLC sustancialmente similar a un perfil ilustrado en la figura 19.

En ciertos aspectos, una composición de daclizumab de la descripción se caracteriza por la suma total de dos o más máximos de la glicoforma. En ciertas modalidades, las composiciones de daclizumab de la descripción se caracterizan por (a) dos máximos principales que corresponden a las glicoformas G0-G1cNAc y a las glicoformas GO que juntos oscilan de aproximadamente 75% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 100%, o aproximadamente 85% a aproximadamente 100% de la AUC total y/o (b) los máximos que corresponden a las glicoformas Man5, Man6, y Man7 que juntos son de aproximadamente 6% de la AUC total o menos y/o (c) los máximos que corresponden a las glicoformas Man6 y Man7 que juntos son de aproximadamente 2% de la AUC total o menos. En tales modalidades, el porcentaje de G0-G1cNAc G0, G1, y/o Man5 puede estar presente en las cantidades descritas en el párrafo anterior.

Las propiedades de unión e inhibición de DAC HYP, así como la potencia funcional de DAC HYP según lo evaluado en un análisis que mide la inhibición de la proliferación de células T inducida por IL-2, son similares a las de DAC ZENAPAX. Sin embargo, muy asombrosamente, el DAC HYP exhibe significativamente menos citotoxicidad ADCC que el DAC ZENAPAX, que es probablemente debido, por lo menos en parte, a las diferencias en sus niveles de glicosilación de mañosa no fucosilada (ver la figura 21). Según lo mostrado en las figuras 22A y 22B, el DAC HYP exhibe por lo menos 25% menos citotoxicidad ADCC que el DAC ZENAPAX según lo medido en un análisis celular. Como será reconocido por los expertos, la citotoxicidad ADCC reducida de DAC HYP puede ser beneficiosa para las indicaciones que implican la administración crónica donde no es deseable la muerte celular, por ejemplo, para el tratamiento de la esclerosis múltiple o uveítis. En estos contextos, en donde la terapia se aplica de manera crónica, tal como, por ejemplo, en el tratamiento de la esclerosis múltiple y otras indicaciones no oncológicas, la terapia con DAC HYP puede ser más segura que la terapia con ZENAPAX™.

Por consiguiente, en otro aspecto, la descripción proporciona las composiciones de daclizumab que se caracterizan por exhibir una citotoxicidad ADCC de menos de aproximadamente 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o incluso menos, a una concentración de 1 pg/ml según lo medido en un análisis in vitro al usar una relación de célula efectora a célula objetivo de 25:1, 40:1, 50:1 ó 60:1, por ejemplo al usar Kit225/K6 como célula objetivo y/o al usar las células efectoras PBMC de 3 o más, 6 o más, 10 o más, o 50 o más donadores sanos. En las modalidades específicas, la descripción proporciona las composiciones de daclizumab que se caracterizan por exhibir la citotoxicidad ADCC que oscila de 5-30%, 10-30%, 15-30%, 15-30%, 5-25%, 10-25%, 20-30%, 15-25%, 15-35%, o 20-35% a una concentración de 1 pg/ml según lo medido en un análisis in vitro al usar una relación de célula efectora a célula objetivo de 25:1, 40:1, 50:1 ó 60:1, por ejemplo al usar Kit225/K6 como célula objetivo y/o la usar las células efectoras PBMC de 3 o más, 6 o más, 10 o más, o 50 o más donadores sanos. Los niveles inferiores de la citotoxicidad ADCC observados con el DAC HYP con respecto al DAC ZENAPAX son asombrosos debido a que DAC HYP es una inmunoglobulina de IgG! y no contiene las mutaciones estructurales conocidas por reducir la citotoxicidad ADCC.

El perfil de seguridad de DAC HYP con respecto al DAC ZENAPAX se puede mejorar adicionalmente mediante el uso de un proceso sin suero de alta producción, que permite la producción de un producto muy puro sin albúmina de suero vacuno (BSA, por sus siglas en inglés). Por consiguiente, la presente descripción proporciona una composición de daclizumab que está libre de BSA y/o es el producto de un proceso de cultivo celular en el cual la BSA no está presente.

Las composiciones de daclizumab caracterizadas por una o más de las propiedades discutidas anteriormente (las composiciones de DAC HYP) se pueden obtener convenientemente a través de la expresión recombinante en las células mamíferas. Aunque no se pretende estar limitado por cualquier teoría particular de la operación, se cree que una o más de las propiedades y/o características únicas discutidas anteriormente se pueden deber, por lo menos en parte, al uso de un sistema de expresión recombinante de alta productividad. Esto se puede lograr por cualquier método, tal como mediante la amplificación genética al usar DHFR, o al usar un gen marcador seleccionable bajo el control de un promotor débil, preferiblemente en combinación con un promotor potente que conduce a la expresión de la proteína de interés (preferiblemente una proteína secretada). Sin limitarse por la teoría, se cree que la selección de marcadores bajo el control de un promotor débil facilita la identificación de los transfectantes estables en los cuales el vector de expresión se integra en una región cromosómica que es activa de manera transcripcional, que produce altos niveles de expresión de la proteína de interés. En una modalidad, el promotor débil que conduce la expresión de un marcador seleccionable es un promotor SV40 (Reddy y colaboradores, 1978, Science 200:494-502) en donde la actividad de una o ambas regiones intensificadoras se ha reducido o eliminado, tal como mediante la supresión parcial o completa, opcionalmente en combinación con un promotor potente, tal como el promotor IE CMV (Boshart y colaboradores, 1985, Cell 41 (2):521-30), que conduce la expresión de la proteína de interés.

Por consiguiente, en otro aspecto, la descripción proporciona los vectores útiles para generar las líneas celulares recombinantes que expresan establemente los altos niveles de un daclizumab tal como DAC HYP, en el cual la expresión del marcador de selección está bajo el control de un promotor SV40 cuya función intensificadora se ha reducido, tal como mediante la supresión parcial de una o ambas secuencias intensificadoras (referidas como dE-SV40). Una secuencia promotora específica dE-SV40 que se puede utilizar para producir las líneas celulares de expresión estable está en las posiciones 6536-6735 del vector pHAT.lgG1.rg.dE (SEC ID NO: 5), ilustrado en las figuras 3A-3D, y en la figura 3E (SEC ID NO: 12). Varias modalidades de los vectores específicos que se pueden utilizar para producir las líneas celulares de expresión estable se describen en la Solicitud Norteamericana No. 61/565,419 presentada el 30 de noviembre de 2011 y en la Solicitud Internacional No. PCT/US11 /62720 presentada el 30 de noviembre de 2011, incorporadas en la presente por referencia.

Generalmente, los vectores útiles para expresar un daclizumab tal como DAC HYP incluirán una o más de las características ejemplificadas mediante pHAT.lgG1.rg.dE (descrito posteriormente en la sección 5.1), por ejemplo un promotor. Las dos cadenas de daclizumab se pueden colocar bajo el control transcriptivo separado pero están preferiblemente en el mismo vector, y sus regiones de codificación pueden ser ADNc o ADN genómico que contiene los intrones y exones. Como una alternativa al control transcriptivo separado, las dos cadenas se pueden expresar como una sola transcripción o un solo marco de lectura abierto, con sus regiones de codificación separadas mediante un sitio de ingreso interno de ribosoma o una secuencia de inteína de auto-división, en este caso las secuencias de codificación de cadena pesada y ligera están bajo el control de un solo promotor. Un promotor ejemplar es el promotor e intensificador IE CMV (en las posiciones 0001-0623 y 3982-4604 de pHAT.lgG1.rg.dE (SEC ID NO: 5)). Las características adicionales incluyen los sitios de inicio de transcripción (si están ausentes del promotor elegido), sitios de terminación de transcripción, y orígenes de la réplica. Los ejemplos de tales características se ilustran en la tabla 1, que delinea los componentes de pHAT.lgG1.rg.dE.

Una modalidad específica útil para expresar las cadenas pesadas y ligeras de un daclizumab tal como DAC HYP de un solo ácido nucleico exógeno, en las células NS0 utiliza un marcador de selección operable en las células mamíferas, tal como fosfotransferasa de neomicina (neor, por sus siglas en inglés), fosfotransferasa de higromicina higromicina B (hygr, por sus siglas en inglés), fosfotransferasa de higromicina B (Hph, por sus siglas en inglés), puromicin-N-acetiltransferasa (puror, por sus siglas en inglés), desaminasa de blasticidina S (bsrr, por sus siglas en inglés), transferasa de fosforibosilo de xantina/guanina (gpt, por sus siglas en inglés), sintasa de glutamina (GS, por sus siglas en inglés) o cinasa de timidina de virus del herpes simple (HSV-tk, por sus siglas en inglés). En una modalidad preferida, el marcador seleccionable en un vector de la descripción es un marcador seleccionable de guanina fosforibosil transferasa de E. coli bajo el control de un promotor SV40 menos intensificador, la secuencia de codificación que se puede encontrar en las posiciones 6935-7793 de pHAT.lgG1.rg.dE (SEC ID NO: 5) se muestra en las figuras 3A-3D.

En otro aspecto, la descripción proporciona las células hospedadoras transfectadas con los vectores útiles para producir de manera recombinante el daclizumab, tal como por ejemplo, DAC HYP. La célula hospedadora puede ser cualquier célula mamífera, que incluye, las células ováricas de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), células de mieloma murino NSO, células Sp2/0, células PER.C6, células Vero, células BHK, células HT1080, células COS7, células WI38, células CV-1/EBNA, células L, células 3T3, células HEPG2, células MDCK y células 293. Una vez transfectadas, el vector puede integrarse en el genoma para proporcionar una línea celular de producción estable. Los expertos en la técnica apreciarán que es indeseable incluir los productos animales en las composiciones designadas para la administración a los humanos. Por consiguiente, son preferidas las células hospedadoras que no requieren el suero u otros productos animales para el crecimiento (tal como, por ejemplo, colesterol). Las células hospedadoras que requieren tales productos animales se pueden adaptar para utilizar un medio sin suero y otro medio sin producto animal. Un método para adaptar las células de mieloma murino NSO para crecer en el medio sin suero y sin colesterol se describe en Hartman y colaboradores, 2007, Biotech. & Bioeng. 96(2) :294-306 y Burky y colaboradores, 2007, Biotech. & Bioeng. 96(2):281 -293. Una cepa específica de las células NSO se adaptó para crecer en medio sin suero y sin colesterol transfectado de manera estable con un vector según lo descrito anteriormente, que se puede utilizar para producir el DAC HYP (clon 7A11 -5H7-14-43).

Como será reconocido por los expertos en la técnica, los medios básicos y de alimentación usados para cultivar las células para la producción recombinante de la proteína, así como otras variables tal como el itinerario de alimentación, velocidad de crecimiento, temperatura, y niveles de oxígeno, pueden afectar a la producción y calidad de la proteína expresada. Los métodos para optimizar estas condiciones están dentro del dominio de un experto en la técnica; las condiciones ejemplares se establecen en las modalidades ejemplares de la descripción. Preferiblemente, las células se adaptan para crecer en medios sin componentes originados de colesterol, suero, y otros componentes de origen animal; en tales casos los medios básicos y de alimentación incluyen preferiblemente los químicos definidos que sustituyen tales componentes. También se ha descubierto que los medios que contienen altos niveles de glucosa, por ejemplo, 10-35 g/l de glucosa, aumentan ventajosamente la productividad del cultivo celular. En una modalidad específica, el medio básico tiene aproximadamente 10-20 g/l, con mayor preferencia aproximadamente 15 g/l de glucosa y/o el medio de alimentación tiene 22-35 g/l, con mayor preferencia aproximadamente 28 g/l de glucosa. El medio de alimentación se puede agregar a las células de acuerdo con un itinerario de aumento de alimentación, como es conocido en la técnica, durante 8-15 días, 9-13 días, o más preferiblemente 10-13 días.

Para un DAC HYP expresado en la cepa productora de NSO 7A11 -5H7-14-43, se han optimizado los componentes del medio de crecimiento y alimentación, y otras variables que afectan la expresión y producción. Por consiguiente, la descripción también proporciona los medios básicos optimizados, los medios de alimentación, itinerario de alimentación y otros métodos y condiciones de cultivo útiles para producir el daclizumab en la alta producción y pureza. Estos medios y parámetros y métodos de cultivo se describen más detalladamente en la sección 5.3.

También se ha descubierto que la purificación del daclizumab a partir de un cultivo celular que utiliza una combinación de ciertas etapas de cromatografía produce las composiciones purificadas de sustancia de fármaco de daclizumab y DAC HYP y las formulaciones de fármaco líquidas de daclizumab y DAC HYP que son estables en almacenamiento en forma líquida a altas concentraciones, comúnmente a concentraciones nominales de daclizumab o DAC HYP de por lo menos aproximadamente 100 mg/ml ± 10-15% y en algunas modalidades 150 mg/ml ± 10-15% (según lo medido mediante espectroscopia UV o índice de refracción).

Las formulaciones de fármaco estables de alta concentración de daclizumab se preparan generalmente al intercambiar una formulación concentrada de daclizumab por amortiguador de intercambio que tiene una osmolalidad de aproximadamente 267-327 mOsm/kg (por ejemplo, 270-310 mOsm/kg) y un pH de aproximadamente pH 5.8-6.2 a 25°C (por ejemplo, 5.9-6.1 a 25°C) para producir una formulación intermedia, y después la dilución de la formulación intermedia con el amortiguador de dilución de polisorbato para producir una formulación líquida estable de alta concentración que comprende aproximadamente 100 mg/ml ± 10% de daclizumab (por ejemplo, DAC HYP), y en algunas modalidades por lo menos aproximadamente 150 mg/ml de daclizumab (por ejemplo, DAC HYP), según lo medido por espectroscopia UV o índice de refracción. El amortiguador de dilución es igual que el amortiguador de intercambio, pero incluye aproximadamente 0-10% (p/v) de polisorbato 80, y se utiliza en una cantidad tal que la formulación estable final de alta concentración de daclizumab tenga una concentración calculada de polisorbato 80 (concentración nominal) en un intervalo de 0.02-0.04%, en algunas modalidades de aproximadamente 0.03% (p/v). Una variedad de diferentes agentes amortiguadores y excipientes se pueden incluir en los amortiguadores de intercambio y dilución para alcanzar una osmolalidad y un pH dentro de los intervalos definidos. Un ejemplo no limitante específico de un amortiguador de intercambio conveniente para formular las formulaciones de fármaco estables líquidas de alta concentración de daclizumab y DAC HYP, contiene aproximadamente 40 mM de succinato y aproximadamente 100 mM de NaCI y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a 25°C. Un ejemplo específico no limitante de un amortiguador de dilución conveniente para el uso con este amortiguador de intercambio contiene aproximadamente 40 mM de succinato, aproximadamente 100 mM de NaCI y aproximadamente 1% (p/v) de polisorbato 80 y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a 25°C. El pH de la formulación final se puede ajustar con un ácido o base para producir un pH actual de aproximadamente 6.0 a 25°C.

Las formulaciones líquidas estables de alta concentración de daclizumab se caracterizan por un nivel bajo de agregación, que comúnmente contiene por lo menos 95% de monómero y menos de 3% de agregados, ocasionalmente menos de 1.5% de agregados, y más generalmente más de 99% de monómero y menos de 0.8% de agregados, según lo medido mediante cromatografía por exclusión de tamaño. Otras características de pureza de las formulaciones de fármaco líquidas de alta concentración de daclizumab se describen más detalladamente en la sección 5.6.

Las formulaciones de fármaco de alta concentración de daclizumab también se caracterizan por una vida útil larga, las cuales son estables contra más de 5% de degradación y contra la formación de más de 3% de agregados (según lo medido por SDS-PAGE y cromatografía por exclusión de tamaño, respectivamente) durante períodos de hasta 54 meses o más, por ejemplo, por lo menos 5 años, cuando se almacenan a 2-8°C, durante períodos de hasta 9 meses cuando se almacenan bajo condiciones aceleradas (23-27°C/60 ± 5% de humedad relativa) y durante períodos de hasta 3 meses cuando se almacenan bajo condiciones de tensión (38-42°C/75 ± 5% de humedad relativa).

Según lo observado anteriormente, las formulaciones líquidas estables de alta concentración de daclizumab se pueden preparar diluyendo una formulación intermedia con el amortiguador de dilución de polisorbato para producir la formulación de fármaco final de daclizumab. Por consiguiente, en otro aspecto, la descripción proporciona las formulaciones intermedias de daclizumab (preferiblemente DAC HYP) purificadas sin polisorbato que contienen por lo menos aproximadamente 150 mg/ml de daclizumab, en algunas modalidades aproximadamente 170-190 mg/ml de daclizumab, que se puede diluir con el amortiguador de dilución de polisorbato para producir las formulaciones de fármaco líquidas estables de alta concentración de daclizumab según lo descrito en la presente. En una modalidad específica, las formulaciones intermedias concentradas sin polisorbato contienen de manera nominal aproximadamente 155 mg/ml o aproximadamente 180 mg/ml de daclizumab (preferiblemente DAC HYP), aproximadamente 40 mM de citrato de sodio y aproximadamente 100 mN de NaCI, pH 6.0 a 25°C. En una modalidad específica, las formulaciones intermedias concentradas sin polisorbato contienen de manera nominal aproximadamente 155 mg/ml o aproximadamente 180 mg/ml de daclizumab (preferiblemente DAC HYP), aproximadamente 40 mM de succinato de sodio y aproximadamente 100 mN de NaCI, pH 6.0 a 25°C. Las composiciones de daclizumab se caracterizan por un bajo nivel de agregados, descrito detalladamente más adelante.

Se ha descubierto que concentrar el daclizumab a través de ultrafiltración induce la formación de agregados, lo cual puede dar lugar a una formulación de fármaco de alta concentración de daclizumab que contiene (por ejemplo, >3%) niveles inaceptables de agregados. Por consiguiente, es preferible utilizar una etapa de "depuración" antes de concentrar la sustancia de fármaco de daclizumab para eliminar los agregados. El nivel de agregados aceptable antes de la concentración dependerá de la concentración de la sustancia de fármaco de daclizumab que se concentrará, concentración deseada en la formulación de fármaco final de daclizumab, y del nivel aceptable de agregados en la formulación de fármaco final de daclizumab. Por ejemplo, si se desean 150 mg/ml de formulación de daclizumab que contiene menos de 3% de agregados, y la sustancia de fármaco de daclizumab debe ser concentrado de 10 a 30 veces (por ejemplo, 20 veces) para alcanzar esta formulación final de daclizumab, la composición de daclizumab que se concentrará debe contener <0.3% de agregados, preferiblemente <0.2% de agregados, y más preferiblemente los niveles incluso más bajos, por ejemplo, aproximadamente 0.1% de agregados.

Una variedad de técnicas conocidas se pueden utilizar para obtener una composición de sustancia de fármaco inicial de daclizumab que contiene niveles aceptables de agregados para la concentración en las formulaciones de fármaco intermedias y finales concentradas de daclizumab según lo descrito en la presente, que incluyen, por ejemplo, cromatografía potente de intercambio catiónico y cromatografía de interacción hidrofóbica. Sin embargo, se ha descubierto asombrosamente que la cromatografía débil de intercambio catiónico reduce los niveles de agregados de las composiciones de daclizumab que contienen 4-12 mg/ml de daclizumab y hasta 2.5% de agregados a niveles extremadamente bajos, comúnmente de aproximadamente 0.1% de agregados. El uso de intercambio catiónico débil para eliminar los agregados es más respetuoso con el medio ambiente que la cromatografía de interacción hidrofóbica, que utiliza soluciones que contienen nitrógeno (tal como soluciones de sulfato de amonio).

Por consiguiente, en otro aspecto, la descripción proporciona métodos de depuración de las composiciones de daclizumab para eliminar los agregados tal que la composición depurada resultante contenga generalmente aproximadamente 4 a 15 mg/ml de daclizumab, donde 0.3% o menos (por ejemplo, 0.2% o menos o 0.1% o menos) está en forma agregada, según lo medido mediante cromatografía por exclusión de tamaño. El método implica generalmente pasar una composición de daclizumab que contiene aproximadamente 4-10 mg/ml, comúnmente de aproximadamente 8-9 mg/ml, y de preferencia aproximadamente 8.5 mg/ml de daclizumab y >0.5% de agregados sobre una resina de intercambio catiónico débil en un amortiguador conveniente para absorber el daclizumab, y eluir el daclizumab absorbido con un amortiguador de elución. Las resinas de intercambio catiónico débil útiles incluyen, pero no se limitan a, CM-650M (Tosoh Biosiences), Sefarosa CM, CM-HyperD. Los componentes de los amortiguadores de equilibrio, lavado y elución dependerán de la resina intercambio catiónico débil usada, y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la resina CM-650M (Tosoh Bioscience, número de parte 101392), funciona bien un amortiguador de equilibrio y lavado que contiene aproximadamente 20 mM de citrato de sodio, pH 4.5 y un amortiguador de elución que contiene 20 mM de citrato de sodio y 75 mM de sulfato de sodio, pH 4.5. El caudal usado dependerá de la elección de resina y tamaño de columna. Una columna cilindrica de resina CM-650M que tiene una altura de lecho de aproximadamente 10-30 cm (por ejemplo, 17-19 cm) y un caudal en el intervalo de aproximadamente 50-200 cm/hr (por ejemplo, 90-110 cm/hr, preferiblemente de aproximadamente 100 cm/hr), funciona bien con la cromatografía que se puede realizar a la temperatura ambiente, o a una temperatura más baja, por ejemplo las temperaturas que oscila de 4, 10, 15, 20 ó 25°C. Un intervalo de temperaturas útil común es 18-25°C (por ejemplo, 18-22°C).

De acuerdo con el ZENAPAX de la EMEA, el proceso de purificación para DAC ZENAPAX implica las siguientes doce etapas: (i) concentración de caldo de cultivo; (ii) cromatografía con Sefarosa Q; (iii) cromatografía con Sefarosa S; (iv) tratamiento a pH bajo para la desactivación viral; (v) concentración/diafiltración; (vi) filtración DV50 para la eliminación de virus; (vii) cromatografía con Sefarosa Q II; (viii) cromatografía Viresolve para la eliminación de virus; (ix) concentración mediante ultrafiltración; (x) cromatografía mediante filtración en gel S-300; (XI) concentración mediante ultrafiltración; (XII) relleno aséptico de frascos.

Este proceso es ineficaz, y proporciona una producción baja de purificación. Se ha descubierto que producciones más altas se pueden alcanzar con un proceso que tiene pocas etapas, mientras que al mismo tiempo produce un grado más alto de pureza, que permite que la sustancia de fármaco de daclizumab resultante se formule en formulaciones de fármaco de alta concentración de daclizumab según lo descrito anteriormente. Por consiguiente, la presente descripción también proporciona los métodos mejorados para aislar y/o purificar la sustancia de fármaco de daclizumab y formulaciones de fármaco de alta concentración de daclizumab. El proceso utiliza la cromatografía de afinidad de proteína A en combinación con la cromatografía de intercambio aniónico potente (Sefarosa Q) y la cromatografía de intercambio catiónico débil (CM-650M), que permite el procesamiento de flujo continuo sin la dilución del intermediario de proceso. El método mejorado para obtener la sustancia de fármaco purificada de daclizumab implica las siguientes etapas: (i) cromatografía de afinidad de proteína A para aislar el daclizumab de otros componentes de cultivo celular; (ii) desactivación viral a pH bajo; (iii) cromatografía de intercambio aniónico potente (Sefarosa Q) para eliminar el ADN; (iv) cromatografía de intercambio catiónico débil (CM-650M) para reducir los agregados; y (v) filtración para eliminar los virus.

Los volúmenes, tamaños de columna y parámetros de operación exactos dependerán, en parte, de la escala de purificación, como es bien conocido en la técnica. Los volúmenes, tamaños de columna y parámetros de operación específicos útiles para las purificaciones a gran escala se describen en la sección 5.4.

El daclizumab crudo que se purificará y opcionalmente formulará a través de los métodos anteriores se puede cosechar del cultivo celular al usar una variedad de medios convencionales, por ejemplo, microfiltración , centrifugación, y filtración profunda directamente desde el biorreactor. Sin embargo, se ha descubierto que el daclizumab crudo se puede cosechar convenientemente disminuyendo el pH de cultivo celular a aproximadamente pH 5 a una temperatura menor de 15°C para aglutinar las células, que se pueden eliminar a través de la centrifugación. En una modalidad específica, el daclizumab crudo se cosecha disminuyendo el pH de cultivo celular a aproximadamente pH 5, al enfriar el cultivo a menos de 15°C, por ejemplo 4°C, durante 30-90 minutos, y al centrifugar la suspensión resultante para eliminar las células. Este proceso es generalmente aplicable a cualquier cultivo celular que secrete las proteínas recombínantes en el medio de cultivo, y no es específico para los cultivos que producen el daclizumab o anticuerpos terapéuticos. El pH del cultivo se puede ajustar al usar una variedad de diferentes ácidos, incluyendo los ácidos orgánicos débiles o potentes, o ácidos inorgánicos débiles o potentes. Para los cultivos de daclizumab, se ha descubierto que el ácido cítrico funciona bien. Una solución concentrada de ácida cítrico, por ejemplo, una solución de 0.5 M-2 M, se puede utilizar para ajustar el pH del cultivo antes de la cosecha.

La purificación de DAC HYP se realiza por medio de tres etapas de cromatografía, desactivación de virus, filtración de virus y ultrafiltración final. La cromatografía de afinidad de proteína A es la primera etapa en el proceso de purificación, que elimina la mayoría de las impurezas relacionadas al proceso. Para permitir la reutilización de la columna de afinidad de proteína A, se debe regenerar y esterilizar. Se ha descubierto que la solución acuosa de NaOH es eficaz la lograr la regeneración y esterilización de la columna. Sin embargo, el uso de las soluciones de NaOH puede degradar la resina de proteína A, lo cual aumenta los costos de producción totales. También se ha descubierto que la esterilización de las resinas de cromatografía de afinidad de proteína A con una solución que contiene NaOH y alcohol bencílico produce buenos resultados y aumenta significativamente el número de ciclos de purificación. Por consiguiente, la descripción también proporciona una solución y un método de esterilización para regenerar y esterilizar las columnas y resinas de afinidad de proteína A. El amortiguador comprende generalmente de aproximadamente 100 a 500 mM de citrato de sodio, aproximadamente 10 a 30 mM de NaOH y aproximadamente 0.5 a 3% (v/v) de alcohol bencílico, y tiene un pH de aproximadamente pH 10 a 13. El amortiguador puede también incluir opcionalmente otros componentes, tal como, por ejemplo, sales y/o detergentes. El citrato de sodio y alcohol bencílico son importantes para proteger la resina de proteína A contra la destrucción por NaOH y para mejorar las actividades microbicidas. En las modalidades específicas, el amortiguador de esterilización de la proteína A contiene aproximadamente 200 mM de citrato de sodio, aproximadamente 20 mM de NaOH, y aproximadamente 1% (v/v) de alcohol bencílico. Según lo descrito en la sección 5.4.2, las soluciones de esterilización que contienen el alcohol bencílico y hidróxido de sodio tienen efectos antimicrobianos beneficiosos, y se pueden utilizar para esterilizar las columnas de proteína A en los procesos de purificación para cualquier anticuerpo.

El amortiguador de esterilización se puede utilizar para esterilizar la resina de cromatografía de proteína A en un proceso por lotes, donde la resina se lava con exceso (por ejemplo, 1.5-2X volúmenes) de amortiguador de esterilización seguido por la incubación durante 30-45 minutos en exceso (por ejemplo, 1.5-2X volúmenes) de amortiguador de esterilización, seguido por equilibrio con amortiguador de equilibrio o amortiguador de almacenamiento. El amortiguador de esterilización también se puede utilizar para esterilizar una columna de cromatografía de proteína A preparada al lavar la columna con exceso (por ejemplo, 1.5-2X volúmenes de columna) de amortiguador de esterilización a un caudal conveniente (por ejemplo, que oscila de aproximadamente 110-190 cm/hr, o 135-165 cm/hr), mantener la columna bajo condiciones de flujo cero durante aproximadamente 30-40 minutos, y después lavar la columna con el amortiguador de equilibrio o amortiguador de almacenamiento. Los amortiguadores de equilibrio y almacenamiento convenientes se describen en la sección 5.5.

La esterilización de las columnas de proteína A con los amortiguadores de esterilización descritos en la presente, aumenta significativamente el número de purificaciones para las cuales un solo lote de resina se pueda utilizar. Por ejemplo, aunque un solo lote de resina de proteína A dure comúnmente solo aproximadamente 30 ciclos de purificación, cuando se esteriliza con los amortiguadores de NaOH convencionales (por ejemplo, 50 mM de NaOH, 0.5 M NaCI), las columnas de proteína A esterilizadas con los amortiguadores de esterilización descritos en la presente se pueden utilizar para más de 100 ciclos de purificación. Aunque no se prepone estar limitado por cualquier teoría de operación, se cree que los amortiguadores de esterilización descritos en la presente, en parte, protegen la proteína A inmovilizada contra la degradación inducida por NaOH, para de tal modo aumentar la vida útil de la resina. Por consiguiente, aunque las mejoras se esperan para todas las resinas de proteína A, que incluyen aquellas que utilizan las cepas mutantes de proteína A diseñadas para ser resistentes a la degradación por NaOH (por ejemplo, la resina MabSuRe), los amortiguadores de esterilización descritos en la presente son especialmente beneficiosos cuando se utilizan al esterilizar las resinas y columnas que utilizan la proteína A inmovilizada sin modificar como, o proteína A que no se ha diseñado para ser estable a NaOH. La descripción además proporciona los métodos que comprenden usar una resina de afinidad de proteína A durante más de 30, más de 35 o más de 40 ciclos de purificación de anticuerpo, y ocasionalmente hasta 50 o hasta 100 ciclos de purificación de la proteína, que comprende conducir las operaciones de purificación y lavar la resina con una solución de esterilización según lo descrito en la presente.

Según lo mencionado anteriormente, el daclizumab une específicamente a CD25 expresado en los linfocitos T y B activados y no en reposo, y bloquea la unión de IL-2 a CD25, para de tal modo inhibir la formación del complejo de IL-2 de alta afinidad, que inhibe la proliferación de las células T y B. Las composiciones y formulaciones de DAC descritas en la presente, y particularmente las composiciones y formulaciones de DAC HYP, asimismo específicamente unen CD25 y exhiben propiedades biológicas similares. Las composiciones y formulaciones de DAC descritas en la presente, y particularmente de DAC HYP, por lo tanto, son útiles en cualquiera de los análisis y métodos terapéuticos descritos generalmente para el daclizumab, y específicamente para ZENAPAX. Por consiguiente, la presente descripción también proporciona los métodos para usar las composiciones y formulaciones de DAC descritas en la presente, y particularmente las composiciones y la formulación líquida estable de alta concentración de DAC HYP, para inhibir la proliferación de las células T y B activadas, en las aplicaciones in vitro e in vivo como un método terapéutico hacia el tratamiento de las enfermedades en las cuales la proliferación de células T y/o B activadas desempeña una función, tal como el tratamiento y prevención del rechazo de aloinjerto, tratamiento de uveítis, y tratamiento de la esclerosis múltiple.

Los métodos implican generalmente el contacto de una célula T y/o B activada con una cantidad de una composición o formulación de daclizumab descrita en la presente suficiente para inhibir su proliferación.

Para los métodos de tratamiento, los métodos implican generalmente administrar a un sujeto una cantidad de una composición de daclizumab, por ejemplo una composición de DAC HYP o una formulación de alta concentración de DAC según lo descrito en la presente, para proporcionar el beneficio terapéutico. En una modalidad específica, las composiciones y formulaciones de daclizumab se pueden utilizar para tratar la esclerosis múltiple, solo o en combinación con otros agentes tal como interferón beta. Las composiciones de DAC descritas en la presente se pueden administrar de manera subcutánea a un paciente de manera semanal o mensual (por ejemplo, semanalmente, cada dos semanas, dos veces al mes, cada cuatro semanas o mensualmente) en dosis que oscila de 75 mg a 300 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg o 300 mg) o que oscilan de 1 mg/kg a 4 mg/kg. Las composiciones se pueden proporcionar en jeringas llenadas previamente convenientes para el uso subcutáneo, preferiblemente a las concentraciones nominales de daclizumab de 100 mg/ml ± 10-15% o 150 mg/ml ± 10-15%. Las composiciones concentradas de DAC se pueden también diluir para la administración intravenosa. 3. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 proporciona el ADNc de cadena ligera de DAC-HYP (SEC ID NO: 1) y las secuencias de aminoácido traducidas (SEC ID NO: 2). El residuo de aspartato (D, por sus siglas en inglés) subrayado en negritas es el primer aminoácido en la proteína madura procesada correctamente; la secuencia de aminoácido en la dirección ascendente de este residuo corresponde a la secuencia señal.

La figura 2 proporciona el ADNc de cadena pesada de DAC-HYP (SEC ID NO: 3) y las secuencias de aminoácido traducidas (SEC ID NO: 4). El residuo de glutamina (Q, por sus siglas en inglés) subrayado en negritas es el primer aminoácido en la proteína madura procesada correctamente; la secuencia de aminoácido en la dirección ascendente de este residuo corresponde a la secuencia señal.

Las figuras 3A-3D juntas proporcionan la secuencia de nucleótido completa para el vector pHAT.IgGI .rg.dE (SEC ID NO: 5).

La figura 3E proporciona una modalidad específica de un promotor dESV40 (SEC ID NO: 12) que se puede utilizar para seleccionar las cepas productoras de alto rendimiento.

La figura 4A-4B proporcionan un diagrama esquemático del vector pHAT.IgGI .rg.dE (figura 4A), que se deriva de pABX.gpt, un vector que se puede adaptar para expresar cualquier gen de cadena pesada y ligera o incluso un polipéptido distinto a un anticuerpo (figura 4B).

La figura 5 proporciona un proceso de producción ejemplar para DAC HYP.

La figura 6 muestra la supervisión de UV (280 nm), pH y conductividad de las fracciones de producto durante la cromatografía de afinidad de proteína A.

La figura 7 muestra la supervisión de UV (280 nm), pH y conductividad de las fracciones de producto durante la cromatografía con Sefarosa Q.

La figura 8 muestra la supervisión de UV (280 nm), pH y conductividad de la cromatografía de intercambio catiónico con CM de las fracciones de producto.

La figura 9 proporciona una ilustración esquemática del sistema de ultrafiltración de DAC HYP.

La figura 10 proporciona un cromatógrama del mapa de péptido de DAC HYP durante 0-60 minutos. El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote 1 y lote 2 corresponden a las preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP.

La figura 11 proporciona un cromatógrama del mapa de péptido de DAC HYP durante 55-115 minutos. El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote 1 y lote 2 corresponden a preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP.

La figura 12 proporciona un cromatógrama del mapa de péptido de DAC HYP durante 110-170 minutos. El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote 1 y el lote 2 corresponden a las preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP.

La figura 13 proporciona espectros de dicroísmo circulares sobrepuestos de DAC HYP, 150 mg/ml de los lotes 1 y 2. La referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP.

Las figuras 14A-14B proporcionan espectros ultravioletas sobrepuestos del orden cero y segundos espectros ultravioletas derivados sobrepuestos, respectivamente. El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote 1 y el lote 2 corresponden a las preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP. Los tres espectros están presentes en cada una de las figuras 14A y de 14B, pero aparecen como un solo espectro sobrepuesto una vez en el otro.

Las figuras 15A-15B proporcionan los cromatogramas de exclusión de tamaño de escala completa y escala expandida, respectivamente. El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote 1 y el lote 2 corresponden a las preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP.

La figura 16 es un diagrama de agregación de DAC HYP en función del tiempo.

La figura 17 muestra la SDS-PAGE reducida y no reducida (paneles izquierdo y derecho, respectivamente). El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote 1 y el lote 2 corresponden a las preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP.

La figura 18 muestra los cromatogramas de intercambio catiónico de DAC HYP. El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote 1 y el lote 2 corresponden a las preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP. Las etiquetas máximas corresponden a las diferentes isoformas de terminal N y C.

La figura 19 muestra los cromatogramas de HPLC de los oligosacáridos ligados a N divididos de manera enzimática a partir de DAC HYP. El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote 1 y el lote 2 corresponden a las preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP.

La figura 20 muestra las curvas de respuesta de ADCC de DAC HYP. El perfil de referencia es una preparación de 100 mg/ml de DAC HYP y el lote.1 y el lote 2 corresponden a las preparaciones de 150 mg/ml de DAC HYP.

La figura 21 muestra los cromatogramas de HPLC para los oligosacáridos ligados a N liberados a partir de DAC HYP (panel inferior) y DAC ZENAPAX (panel superior) que ilustra sus diferentes perfiles de glicosilación.

Las figuras 22A-22B proporcionan una comparación entre la actividad de ADCC de dos preparaciones de DAC HYP (referidas como lote 3 de DAC HYP y lote 4 de DAC HYP), DAC Penzuburg, y DAC ZENAPAX al usar el formato de análisis variable de ADCC de la relación de la célula efectora a la célula objetivo (figura 22A) y el formato de análisis variable de ADCC de la concentración de anticuerpo (figura 22B).

La figura 23 proporciona una comparación de las isoformas de carga de DAC HYP, DAC Penzberg y DAC ZENAPAX. 4. Descripción Detallada de la Invención La presente descripción proporciona, entre otras cosas, las composiciones de DAC que tiene las propiedades especificadas, las formulaciones de alta concentración de DAC especialmente útiles para ciertos modos de administración que son estables en almacenamiento a diferentes temperaturas, vectores y células hospedadoras útiles para producir las composiciones de DAC, caldos de cultivo y condiciones de cultivo optimizados útiles para producir las composiciones de DAC, métodos para purificar las composiciones de DAC y formulaciones de alta concentración, y métodos para usar las composiciones de DAC y las formulaciones de alta concentración, por ejemplo para inhibir la proliferación de las células T y/o B activadas y para tratar y/o prevenir enfermedades transmitidas por las células T y/o B activadas, tal como, por ejemplo, la esclerosis múltiple.

El daclizumab (DAC, por sus siglas en inglés) según lo utilizado en la presente se refiere a un anticuerpo monoclonal lgG1 humanizado que tiene la secuencia de cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés) ilustrada en la figura 1 (posiciones 21-233 de la SEC ID NO: 2) y la secuencia de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) ilustrada en la figura 2 (posiciones 20 a 465 de la SEC ID NO: 4). Las secuencias de CDR del DAC son como sigue: VLCDR#1: S A S S S I S Y M H (SEC ID NO: 6) VLCDR#2: T T S N L A S (SEC ID NO: 7) VLCDR#3: H Q R S T Y P L T (SEC ID NO: 8) VHCDR#1: S Y R M H (SEC ID NO: 9) VHCDR#2: Y I N P S T G Y T E Y N Q K F K D (SEC ID NO: 10) VHCDR#3: G G G V F D Y (SEC ID NO: 11) Ciertas moléculas de daclizumab se han reportado en la literatura, y una versión específica de DAC se ha comercializado previamente bajo la marca registrada ZENAPAX por Hoffman-La Roche para la prevención del rechazo de aloinjerto en pacientes de trasplante renal como un complemento para la inmunoterapia que incluye ciclosporina y corticosteroides. La versión de DAC vendida bajo la marca registrada ZENAPAX es referida en la presente como "DAC ZENAPAX".

Otra versión de DAC, producida en una instalación en Penzberg, Alemania, aunque nunca se vendió comercialmente, se ha utilizado en ciertos ensayos clínicos. Esta versión de DAC es referida en la presente como "DAC Penzberg".

Según lo descrito en la presente, la presente descripción se refiere, en parte, a una nueva versión de DAC que tiene las características y propiedades que son diferentes, y en algunos casos superiores, a las características y propiedades del DAC ZENAPAX y DAC Penzberg. Por consiguiente, la presente descripción en parte se refiere a las composiciones de DAC que son nuevas. Las nuevas composiciones de DAC se caracterizan por una o más de las siguientes características, según lo descrito más completamente en la sección de la Breve Descripción de la Invención: (1) Isoformas de terminal N pE/Q y/o Q/VHS características; (2) Un perfil de oligosacárido ligado a N homogéneo caracterizado por dos máximos principales y un máximo menor; (3) Citotoxicidad ADCC reducida con respecto a DAC ZENAPAX y DAC Penzberg; y (4) Un nivel bajo de las formas agregadas (<3%) cuando se formulan a concentraciones nominales de hasta 150 ± 10-15%.

Las composiciones de DAC que tienen uno o más de estas características y/o propiedades son referidas en la presente como composiciones de "DAC HYP". Para los propósitos de ejemplificación de varios aspectos y características de las invenciones descritas en la presente, un DAC HYP específico que tiene cuatro de las propiedades anteriores se describe, así como las composiciones y métodos específicos para su producción y purificación. Sin embargo, se debe entender que una composición de DAC HYP no necesita tener todas las cuatro propiedades anterior para ubicarse dentro del alcance de la descripción. En las modalidades específicas, el DAC HYP tiene por lo menos dos de las propiedades (1 ) a (4) anteriores (por ejemplo, por lo menos una combinación de (1 ) y (2); (1 ) y (3); (1 ) y (4); (2) y (3); (2) y (4); o (3) y (4)) o por lo menos tres de las propiedades (1 ) a (4) anteriores (por ejemplo, por lo menos una combinación de (1 ), (2) y (3); (1 ), (2) y (4); (1 ), (3), y (4); y (2), (3), (4)). Tales composiciones de DAC HYP pueden también tener <3% de agregados, <2% de agregados e incluso niveles más bajos, por ejemplo, <1 % de agregados, cuando se formulan a concentraciones de 100 mg ± 10-1 5% o incluso 1 50 ± 10-15%.

Por otra parte, aunque ciertos aspectos y modalidades de las invenciones descritas en la presente se ilustran y ejemplifican con DAC HYP, los expertos en la técnica apreciarán que no se limiten a DAC HYP, y sean generalmente útiles para las composiciones de daclizumab, y también para los anticuerpos anti-CD25 lgG2, lgG3, y lgG4 que tienen las propiedades de unión específica a CD25 similares al DAC, y los anticuerpos anti-CD25 convenientes para la adm inistración a los humanos que no se han humanizado. Estos varios y diferentes anticuerpos anti-CD25 son referidos en la presente como "análogos de DAC". Tales análogos de DAC pueden incluir generalmente las seis CDR de DAC mencionadas anteriormente, pero pueden incluir otras secuencias CDR.

Las características y propiedades de las composiciones de DAC HYP se pueden confirmar al usar los análisis y métodos estándar. Por ejemplo, los perfiles de isoforma de N y terminal C se pueden determinar la usar la cromatografía de intercambio catiónico con la detección a 220 nm. En un método específico, 100 µ? de la muestra de prueba (1 mg/ml de anticuerpo disuelto en el amortiguador A) se disuelven nuevamente a temperatura ambiente en una columna ProPac WCX-10 (Dionex Coporation) equipada con una columna de protección ProPac WCX-10G (Dionex Corporation) al usar el siguiente gradiente de separación (la columna se equilibra con el amortiguador A): % Amortiguador % Amortiguador Tiempo (min.) Caudal (ml/min) A B 0.0 100 0 1 60.0 40 60 1 80.0 0 100 1 85.0 0 100 1 85.1 100 0 1 100.0 100 0 Amortiguador A = 15 mM de fosfato de sodio, pH 5.9 Amortiguador B = 250 mM de NaCI, 15 mM de fosfato de sodio, pH 5 Los perfiles de glicosilación ligada a N se pueden determinar al dividir los oligosacáridos ligados a N con la amidasa PNGaseF, al derivar los oligosacáridos con una etiqueta fluorescente y al analizar la mezcla resultante a través de HPLC de fase normal con la detección fluorescente. En un método específico, los glicanos ligados a N divididos derivados mediante ácido antranílico son determinados a 50°C en una columna Asahipak Amino NH2P-504E de 250 x 4.6 mm unida a amina polimérica (5 pm de tamaño de partícula, Phenomenex, cat. No. CHO-2628) al usar el siguiente gradiente de elución (al usar un volumen de inyección de muestra de 100 µ?; la columna se equilibra con 85% de amortiguador A/15% de amortiguador B): Tiempo (min.) % Amortiguador A % Amortiguador B Caudal (ml/min) 2 85 15 1 10 80 20 1 60 55 45 1 70 5 95 1 75 5 95 1 76 85 15 1 90 85 15 1 Amortiguador A = 1% v/v de tetrahidrofurano, 2% v/v de ácido acético en acetonitrilo Amortiguador B = 1% v/v de tetrahidrofurano, 5% v/v de ácido acético, 3% v/v de trietilamina en agua La pureza se puede confirmar al usar la SDS-PAGE reducida (14% de minigeles de gradiente de Tris-Glicina prefabricado, número de parte de Invitrogen 601632) y tinción azul coloidal, y/o cromatografía por exclusión de tamaño con detección a 280 nm. Particularmente, 15 µ? de muestra de prueba (20 mg/ml de anticuerpo en el amortiguador de elución) se pueden disolver nuevamente a temperatura ambiente en una columna TSK G3000SWXL de 7.8 mm x 30 cm (Tosoh Biosciences, número de parte 601342) equipada con filtros de pre-columna de 0.5 pm (Upchurch, número de parte A-102X) al usar un gradiente ¡socrático de amortiguador de elución (200 mM de KP04, 150 mM de KCI, pH 6.9) a un caudal de 1 ml/min.

Las composiciones de DAC HYP y otras formulaciones de DAC descritas en la presente, tal como las formulaciones líquidas estables de alta concentración de DAC descritas en la presente, son útiles para tratar una variedad de trastornos y condiciones probablemente mediadas, por lo menos en parte, por el células T y/o B activadas, que incluyen, por ejemplo, el rechazo de los trasplantes de aloinjerto y esclerosis múltiple. Las poblaciones de pacientes, formulaciones, modos de administración y cantidades de dosificación y itinerario específicos útiles para tratar o prevenir el rechazo de aloinjerto se describen en la Patente Norteamericana No. 6,013,256 , y son incorporados en la presente por referencia. Las poblaciones de pacientes, formulaciones, modos de administración, cantidades de dosificación y itinerario específicos útiles para tratar a los pacientes con esclerosis múltiple se describen en la Patente Norteamericana No. 7,258,859 y se incorporan en la presente por referencia. Todas estas formulaciones, modos de administración, cantidades de dosificación y itinerarios, así como las poblaciones de pacientes específicas y las terapias de combinación descritas, se adaptan igualmente a las composiciones de DAC HYP y, en el caso pertinente, a las formulaciones de alta concentración de DAC, descritas en la presente.

Las composiciones y formulaciones de DAC HYP descritas en la presente se administran en cantidades que proporcionan el beneficio terapéutico. El beneficio terapéutico incluye, pero no se limita, al tratamiento del trastorno subyacente. El beneficio terapéutico puede también incluir la mejora o reducción de los síntomas o efectos secundarios de una enfermedad particular según lo determinado al usar las pruebas de diagnóstico y otras pruebas estándar. Para la esclerosis múltiple, varios medios para determinar el beneficio terapéutico, que incluyen, por ejemplo, el uso de las imágenes por resonancia magnética para determinar lesiones cerebrales y/o para determinar la progresión de la discapacidad, se describen en la Patente Norteamericana No. 7,258,859, incorporada en la presente por referencia. Todas estas varias pruebas se pueden utilizar para determinar el beneficio terapéutico en el contexto de los pacientes que sufren de esclerosis múltiple.

Las formulaciones estables de alta concentración de DAC, hechas con DAC HYP, generalmente DAC o un análogo de DAC, son particularmente útiles para la administración subcutánea en el tratamiento de las enfermedades crónicas tal como esclerosis múltiple. Las formulaciones se pueden administrar convenientemente como una sola inyección subcutánea de bolo o diluidas para la administración intravenosa. Las formulaciones se pueden administrar de manera subcutáneo a un paciente semanalmente a mensualmente (por ejemplo, semanalmente, cada dos semanas, dos veces al mes, cada cuatro semanas o mensualmente) en dosis que oscilan de 75 mg a 300 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg o 300 mg) o que oscilan de 1 mg/kg a 4 mg/kg. Las composiciones se pueden proporcionar en jeringas llenadas previamente convenientes para el uso subcutáneo. Las formulaciones diluidas se pueden administrar de manera intravenosa en dosificaciones convenientes a las mismas frecuencias que para la administración subcutánea. 5. Modalidades ejemplares Varios aspectos y características de las invenciones descritas en la presente se describen adicionalmente por las siguientes modalidades ejemplares. Será apreciado que aunque las modalidades ejemplares utilizan medios de cultivo celular, condiciones de cultivo celular, resinas de cromatografía en columna y amortiguadores de equilibrio, lavado y elución específicos, se pueden hacer los cambios rutinarios. Por otra parte, aunque varios métodos de cultivo celular se ejemplifican con una cepa productora específica (clon 7A11 -5H7-14-43), se espera que otras cepas productoras de DAC o cepas productoras de DAC análogas se puedan utilizar con éxito, con o sin la optimización rutinaria. Por otra parte, las características que se describen en asociación con una modalidad particular (ya sea en la Breve Descripción de la Invención anterior o en las siguientes modalidades ejemplares) se pueden desviar sin afectar sustancialmente las propiedades deseables de los métodos y composiciones de la descripción, y por otra parte esas diferentes modalidades se pueden combinar y utilizar de varias maneras juntas a menos que sean claramente exclusivas de manera mutua. Por consiguiente, se debe entender que las siguientes modalidades ejemplares proporcionadas son pensadas para ser ilustrativas y no limitativas, y no se deben interpretar como una limitación de las reivindicaciones que siguen a estas modalidades.

El método de fabricación ejemplificado a continuación se utilizó para producir una sustancia de fármaco de DAC HYP a 150 mg/ml. Para hacer una sustancia de fármaco de DAC HYP a 100 mg/ml, se introducen pequeños cambios de proceso: El cultivo celular usado para producir un DAC HYP (ver la sección 5.3) a 100 mg/ml, no incluye una emulsión antiespuma, mientras que el cultivo celular de DAC HYP a 150 mg/ml utiliza un Dow Corning Antifoam C de baja concentración en el biorreactor de 10,000 I para minimizar la formación de espuma. La columna de CM-650M (ver la sección 5.4.5) se esteriliza con un amortiguador de 0.5 M de NaOH, 0.5 M de sulfato de sodio para producir una formulación de DAC HYP que tiene una concentración de anticuerpo final de 100 mg/ml; el sulfato de sodio se omite del amortiguador de esterilización para producir una formulación de DAC HYP que tiene una concentración de anticuerpo final de 150 mg/ml. Para hacer el DAC HYP a 100 mg/ml, la ultrafiltración/diafiltración (UF/DF, por sus siglas en inglés) de una etapa se utiliza en al final del proceso descendente inmediatamente antes de la adición del polisorbato 80 y de la dilución de la sustancia de fármaco al volumen final (ver la sección 5.4.7), mientras que para hacer la sustancia de fármaco a una concentración de 150 mg/ml, se utiliza una UF/DF de dos etapas. Los siguientes ejemplos muestran los análisis comparativos entre varias porciones de DAC HYP a 100 mg/ml y a 150 mg/ml. En varios estudios, el lote de DAC HYP a 150 mg/ml se comparó contra un lote de DAC HYP a 100 mg/ml manufacturado en la escala de 10,000 I, referida a continuación como lote estándar de referencia RS0801. 5.1 Constructo de expresión de DAC HYP El anti-Tac de producción de hibridoma, un anticuerpo monoclonal lgG2a de murino, se generó fusionando la línea celular de mieloma de murino NS-1 con los esplenocitos de un ratón inmunizado con una línea de células T humana desarrollada a partir de un paciente con leucemia de células T (Uchiyama y colaboradores, 1981, J. Immunol. 126(4): 1393-7). El anti-Tac se seleccionó por su reactividad con las células T activadas, pero no con los células T o células B en reposo. El anti-Tac posteriormente mostró reaccionar con la subunidad alfa del receptor IL-2 humano (Leonard y colaboradores, 1982, Nature 300(5889):267-9).

Las secuencias de aminoácido para las regiones variables de cadena ligera y pesada del anti-Tac de murino, se determinaron a partir del ADNc respectivo (Queen y colaboradores, 1989, Proc. Nat'l Acad. Sci. E.E.U.U. 86(24):10029-33). La afinidad de unión del anti-Tac de ratón se conservó en la forma humanizada según lo descrito en Queen y colaboradores. Las regiones de determinación de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) del anti-Tac de murino, primero se injertaron en la estructura aceptora del anticuerpo humano Eu. Con la ayuda de un modelo tridimensional, los residuos esenciales de la estructura de ratón críticos para la conformación de las CDR y así la afinidad de unión, se identificaron y sustituyeron por las contrapartes humanas en las estructuras aceptoras. Además, los aminoácidos anormales en las estructuras aceptoras se sustituyeron por los residuos humanos de consenso de las posiciones correspondientes para eliminar la inmunogenicidad potencial. 4 Los genes de DAC HYP de VL y VH se construyeron como mini-exones por la hibridación y extensión de los oligonucleótidos traslapados según lo descrito en Queen y colaboradores (1989). Para la expresión de DAC HYP en la forma Igd, los genes de VL y VH resultantes se clonaron en un solo vector de expresión, según lo delineado en Colé y colaboradores (1997, J. Immunol. 159(7):3613-21) y Kostelny y colaboradores (2001, Int. J. Cáncer 93(4):556-65), para el constructo pHAT.lgG1.rg.dE (ver las figuras 3 y 4A). El plásmido pHAT.lgG1.rg.dE contiene los genes para la cadena pesada de I gG y para las cadenas ligeras kappa del daclizumab, cada uno bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) humano. El plásmido contiene el gen de guanina fosforibosil transferasa (gpt, por sus siglas en inglés) de E. coli como marcador seleccionable. Los componentes genéticos en pHAT.lgG1.rg.dE se describen en la siguiente tabla 1.

Tabla 1: Componentes genéticos de pHAT.lgG1.rg.dE El promotor dESV40 abarca las posiciones 6536-6735 de pHAT.lgG1.rg.dE (6536-6562 son 27 residuos del intensificador A de 72 bp; 6566-6629 son tres repeticiones de 21 bp. 6536-6735 son el complemento inverso de 5172-1 y 1-133 en GenBank: J02400.1 (genoma completo del virus de simio 40)). Las secuencias de nucleótido de los genes de cadena ligera y pesada de DAC HYP en el vector de expresión, se confirmaron mediante la secuenciación de ADN. 5.2. Línea celular estable de DAC HYP La línea celular de mieloma de ratón NSO se obtuvo de la colección Europea de cultivos celulares (catálogo de ECACC # 85110503, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido). Un frasco de estas células NSO se descongeló en DMEM complementado con 10% de FBS. Las células se mantuvieron en una incubadora humedecida a 37°C y 7.5% de C02. Las células se cultivaron posteriormente en medio básico SFM-3 complementado con 1 mg/ml de BSA. SFM-3 es una mezcla 1 :1 de DMEM y F-12 de Ham complementado con 10 mg/ml de insulina y 10 pg/ml de transferrina. Durante aproximadamente 3 meses, las células NSO se adaptaron a SFM-3 sin suplementos, reduciendo gradualmente la cantidad de FBS presente en el medio de cultivo hasta se eliminó, y después finalmente se eliminó el BSA en una sola etapa. La línea de células hospedadoras resultante se pasó 15-20 veces en SFM-3 y se preparó un bloque congelado.

Las células adaptadas a SFM-3 se transfectaron con pHAT.lgG1.rg.dE (linealizado con enzima Fspl (New England Biolabs, cat. No. R0135L, lote 43)) mediante la electroporación. Brevemente, 30-40 pg de pHAT.lgG1.rg.dE se agregaron a 1 x 107 células NSO adaptadas que crecieron exponencialmente y pulsadas dos veces a 1.5 kV, 25 iF al usar un instrumento Gene Pulser (BioRad, Richmond, CA). Después de la electroporación, las células se colocaron en DMEM ± 10% de FBS en cinco placas de 96 pozos a 20,000 células/pozo, una densidad que favoreció una sola colonia por pozo después de la selección de ácido micofenólico (MPA, por sus siglas en inglés). Según lo descrito en Hartman y colaboradores, 2007, Biotech. & Bioeng 96(2):294-306, los transfectantes que habían integrado establemente el vector se seleccionaron en presencia de ácido micofenólico. A partir de un transfectante estable de NSO que produjo un alto nivel de DAC HYP, tres ciclos sucesivos de subclonación se realizaron mediante clonación de dilución limitada o separación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) en PFBM-1 que contuvo 2.5% o 5% de suero vacuno fetal (FBS; HyClone, Logan, UT). En cada ciclo de subclonación, utilizaron uno de los mejores productores para el siguiente ciclo de subclonación. Después del tercer ciclo de subclonación, se eligió la línea celular de producción final (7A11 -5H7-14-43). Un banco de siembra de la línea celular de producción final entonces se preparó mediante congelamiento de 1 x 107 células por frasco en 1 mi de 90% de FBS/10% de DMSO (Sigma, St. Louis, MO). 5.3. Producción recombinante de DAC HYP 5.3.1. Cultivo celular y recuperación Las células se descongelan de un solo frasco de banco celular y se expanden en volúmenes progresivamente más grandes dentro de los matraces T, botellas giratorias, matraces de agitación, y biorreactores hasta que se alcance la escala de producción. Al completar el cultivo de producción, el fluido de cultivo celular se enjuago mediante centrifugación y filtración profunda, y transfirió a un tanque de contención de cosecha. La duración del cultivo de producción es de aproximadamente 10 días.

El cultivo celular y la recuperación se pueden realizar en una variedad de diferentes instalaciones de cultivo celular al usar el equipo estándar, como se conoce en la técnica. En otro ejemplo, las células se descongelan de un solo frasco de banco celular y se expanden en volúmenes progresivamente más grandes dentro de los matraces oscilantes y biorreactores hasta que se alcance la escala de producción. Al terminar el cultivo de producción, el fluido del cultivo celular se clarifica mediante centrifugación y filtración profunda, y transfiere a un tanque de contención de cosecha. La duración del cultivo de producción es de aproximadamente 10 días. 5.3.1.1. Preparación de inoculo Los lotes de producción se inician descongelando un solo frasco de banco celular. Las células se transfieren a un matraz T que contiene un medio definido de manera química, medio 2 básico sin proteína (PFBM-2, por sus siglas en inglés). El polvo adaptado para hacer el PFBM-2 se puede pedir a Invitrogen solicitando el polvo de medio de hibridoma-SFM preparado sin NaCI, rojo de fenol, transferrina, e insulina, que incluye una cantidad de EDTA-sal de sodio de hierro(lll), cuando se reconstituye, produce una concentración de 5 mg/l, y que tiene las cantidades de los componentes restantes ajustadas tal que, cuando se reconstituyen, sus concentraciones son iguales que el hibridoma-SFM reconstituido. El medio PFBM-2 preparado contiene los siguientes componentes: 8 g/l de polvo adaptado; 2.45 g/l de bicarbonato de sodio; 3.15 g/l de NaCI; y 16.5 g/l de monohidrato de D-glucosa (15 g/l de glucosa).

Las células se expandieron mediante el paso serial en las botellas giratorias o matraces de agitación cada dos días después de lo anterior. Los matraces T, botellas giratorias, y matraces de agitación se colocan en una incubadora que opera bajo un punto de ajuste de temperatura de 37°C bajo una atmósfera de 7.5% de C02 para los matraces T y botellas giratorias y 5% de C02 para los matraces de agitación.

Los matraces de agitación se complementan con 5% de C02 o por el recubrimiento en el espacio libre o mediante aspersión en el cultivo, dependiendo del volumen del cultivo celular, y la velocidad del propulsor se controla a revoluciones por minuto constantes (RPM, por sus siglas en inglés). La densidad de siembra objetivo en todos los pasos de expansión de inóculo es de aproximadamente 2.5 x 105 células viables/ml.

Además, la preparación del inóculo se puede realizar de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, al usar una variedad de recipientes de cultivo, volúmenes, y condiciones estándar. Por ejemplo, los lotes de producción se pueden iniciar al descongelar un solo frasco de banco celular. Las células se pueden transferir a un matraz oscilante que contiene un medio definido de manera química, medio 2 básico sin proteína (PFBM-2, por sus siglas en inglés). El polvo adaptado para hacer el PFBM-2 se puede pedir de Invitrogen solicitando que el polvo de medios de hibridoma-SFM sea preparado sin NaCI, rojo de fenol, transferrina, e insulina, que incluye una cantidad de EDTA-sal sódica de hierro(lll) que, cuando se reconstituye, produce una concentración de 5 mg/l, y que tiene las cantidades de los componentes restantes ajustadas tal que, cuando se reconstituye, sus concentraciones son iguales que el hibridoma-SFM reconstituido. El medio PFBM-2 preparado contiene los siguientes componentes: 8 g/l de polvo adaptado; 2.45 g/l de bicarbonato de sodio; 3.15 g/l de NaCI; y 16.5 g/l de monohidrato de D-glucosa (15 g/l de glucosa). Opcionalmente, en la etapa del biorreactor, el heptahidrato de sulfato cúprico se puede agregar, por ejemplo, a una concentración de 0.04 mg/l.

Las células se expanden mediante el paso serial en los matraces oscilantes cada dos días después de lo anterior. Los matraces oscilantes se colocan en una incubadora que opera bajo un punto de ajuste de temperatura de 37°C bajo una atmósfera de 7.5% de C02.

Los matraces oscilantes se agitan a revoluciones por minuto constantes (RPM, por sus siglas en inglés) en una plataforma oscilante en las incubadoras. La densidad de siembra objetivo en todos los pasos de expansión de inoculo es de aproximadamente 2.2-2.5 x 105 células viables/ml.

Aproximadamente 14 días después del descongelamiento del banco celular, cuando un suficiente número de células viables se ha producido, se inoculan los primeros de varios, comúnmente tres o cuatro, biorreactores de siembra de tanque agitado de acero inoxidable. Antes del uso, los biorreactores de siembra se limpian en el lugar, vaporizan en el lugar, y cargan con el volumen apropiado de medio de cultivo PFBM-2. El pH y sondas de oxígeno disueltas se calibran antes de que el biorreactor se vaporice en el lugar. El primer biorreactor de siembra se inocula con un suficiente número de células para alcanzar una densidad celular inicial de 2.0-2.5 x 10s células viables/ml. La transferencia secuencial al volumen más grande (comúnmente, biorreactores de siembra de 100 I a 300 I y entonces 1,000 I, o biorreactores de siembra de 60 I a 235 I, 950 I, y ,3750 I) se realiza después de aproximadamente dos días de crecimiento en cada reactor y densidades celulares iniciales objetivo de 2.0-2.5 x 105 células viables/ml. El pH de cultivo se mantiene mediante la adición de gas de C02 o 1 M de carbonato de sodio (Na2C03) a través de control automático. Las condiciones de operación objetivo de siembra y de los biorreactores de producción incluyen un punto de ajuste de temperatura de 37°C, pH 7.0 y 30% de oxígeno disuelto (como un porcentaje de saturación de aire). Los biorreactores de 100 I, 300 I y 1,000 I se agitan a 100 RPM, 80 RPM y 70 RPM, respectivamente. Ocasionalmente, las condiciones de operación objetivo de la siembra y de los biorreactores de producción incluyen un punto de ajuste de temperatura de 37°C, un pH de 7.0 con aspersión de C02 y control de adición de base y 30% de oxígeno disuelto (como un porcentaje de saturación de aire). Los biorreactores de volumen más grande se pueden agitar a velocidades de 100 RPM, 80 RPM, 70 RPM, o 40 RPM. 5.3.2. Biorreactor de producción de cultivo celular Después de aproximadamente 2 días en el biorreactor de siembra de 1,000 I, el inoculo se transfiere a un biorreactor de producción de tanque agitado de acero inoxidable. El biorreactor de producción tiene un volumen de operación de aproximadamente 10,000 I. Antes del uso, el biorreactor se limpia en el lugar, vaporiza en el lugar, y carga con aproximadamente 4,000 I de medio PFBM-2. El pH y sondas de oxígeno disuelto se calibran antes de que el biorreactor se vaporice en el lugar.

En otro ejemplo, el inóculo crece en un biorreactor de siembra de 3750 I antes de la transferencia a un biorreactor de producción de tanque agitado de acero inoxidable con un volumen de operación de aproximadamente 15,000 I, que se limpia en el lugar, vaporiza en el lugar, y carga con aproximadamente 4,000-7,000 I de medio PFBM-2 antes del uso.

La densidad de siembra objetivo del biorreactor de producción está en el intervalo de 2.0-2.5 x 105 células viables/ml. Un concentrado de medio de alimentación sin proteína (PFFM-3, por sus siglas en inglés) definido de manera química (un medio alimentación concentrado definido de manera química hecho reconstituyendo los subcomponentes 1 y 2 de PFFM3, L-glutamina, D-glucosa, heptahidrato dibásico de fosfato de sodio, L-tirosina, ácido fólico, ácido clorhídrico, e hidróxido de sodio) se agrega durante el cultivo. El PFFM3 contiene los componentes mostrados en la tabla 4.

Tabla 4: Componentes del medio PFFM3 Componente Concentración Sub-componente 1 de PFFM3 (aminoácidos) 20.4 g/l preparados Sub-componente 2 de PFFM3 (vitaminas y 4.93 g/l preparados oligoelementos) L-Glutamina 11.0 g/l preparados D-Glucosa 28.0 g/l preparados L-Tirosina, sal de disodio 1.32 g/l preparados Ácido Fólico 0.083 g/l preparados Na2HPCv7H20 1.74 g/l preparados Hidróxido de Sodio Variable, pH control Ácido Clorhídrico Glacial Variable, pH control Agua WFI El subcomponente 1 de PFFM3 contiene los componentes mostrados en la siguiente tabla 5.

Tabla 5: subcomponente 1 de PFFM3 Componentes Medios MW (g/mol) Conc. (mg/l) Conc. (mM) L-Arginina HCI 211. 1,900 9.00E+00 L-Asparagina Anhidra 132.1 1,320 9.99E+00 Ácido L-Aspártico 133.1 119 8.94E-01 L-Cisteína HCI-H20 176.0 2,030 1.15E+01 Ácido L-Glutámico 147.1 510 3.47E+00 Glicina 75.1 157 2.09E+00 L-Histidina HCI«H20 210.0 864 4.11E+00 L-lsoleucina 131.2 1,440 1.10E+01 Componentes Medios MW (g/mol) Conc. (mg/l) Conc. (mM) L-Leucina 131.2 3,130 2.39E+01 L-Lisina HCI 183.0 2,160 1.18E+01 L-Metionina 149.2 1 ,260 8.45E+00 L-Fenilalanina 165.2 918 5.56E+00 L-Prolina 115.1 806 7.00E+00 L-Serina 105.1 709 6.75E+00 L-Treonina 119.1 1 ,220 1.02E+01 L-Triptofano 204.2 408 2.00E+00 L-Valina 117.1 1 ,450 1.24E+01 El su bcom ponente 2 de P F F M 3 contiene los componentes mostrados en la sig u ie nte tabla 6.

Tabla 6 : su bcom ponente 2 de PF FM 3 Componentes Medios MW g/mol) Conc. (mg/l) Conc. (mM) Vitamina B-12 1 ,355.0 10.72 7.91 E-03 Biotina 244.0 0.156 6.39E-04 Cloruro de Colina 140.0 140 1.00E+00 l-lnositol 180.0 197 1.09E+00 Niacinamida 122.0 31.5 2.58E-01 Pantotenato de calcio 477.0 103.1 2.16E-01 Clorhidrato de Piridoxina 206.0 0.484 2.35E-03 Clorhidrato de Tiamina 337.0 99.8 2.96E-01 Putrescina 2HCI 161.1 6.66 4.13E-02 Ácido DL-Lipoico tióctico 206.0 4.84 2.35E-02 Componentes Medios MW g/mol) Conc. (mg/l) Conc. (mM) Piruvato de Sodio 110.0 1,716 1.56E+01 Etanolamina HCI 97.54 76.1 7.80E-01 ß -Mercaptoetanol 78.13 60.9 7.80E-01 Ácido Linoleico 280.48 0.655 2.34E-03 F-68Plurónico 8,350.0 780 9.34E-02 Cloruro de Potasio 74.55 432 5.79E+00 Riboflavina 376.0 3.42 9.09E-03 Chloride de Magnesio Anhidro 95.21 446 4.69E+00 Sulfato de Magnesio Anhidro 120.4 762 6.33E+00 Selenita de Sodio 172.9 0.140 8.12E-04 Sulfate Cúprico'5H20 249.7 0.1069 4.28E-04 Sulfato Ferroso»7H20 278.0 6.51 2.34E-02 Nitrato de Potasio 101.1 0.593 5.86E-03 Sulfato de Zinc7H20 287.5 15.0 5.23E-02 Sulfato de Manganeso, 169.01 0.00264 1.56E-05 Monohidrato Cloruro Niqueloso, 6-Hidrato 237.7 0.00186 7.81 E-06 Cloruro Estañoso 2H20 225.63 0.001130 5.01 E-06 Molibdato de Amonio 4H20 1,235.86 0.00193 1.57E-06 meta-Vanadato de Amonio 116.98 0.00913 7.80E-05 meta-Silicato de Sodio 9H20 284.2 2.22 7.79E-03 EDTA, Hierro(lll), Sal de Sodio 367.05 31.2 8.50E-02 El tiempo y cantidad de adición de PFFM-3 al cultivo ocurre según lo mostrado en la siguiente tabla 7.

Tabla 7: Itinerario ejemplar de la alimentación biorreactor de DAC HYP Día Cantidad de PFFM-3 (% de masa inicial) 1 0 2 4-4.14 3 7.8-8.08 4 7.8-8.08 5 7.8-8.08 6 11-11.38 7 13-13.46 8 15-15.52 9 15-15.52 10 0 El pH de cultivo se mantiene a aproximadamente pH 7.0, preferiblemente entre pH 7.0 y pH 7.1, mediante el control automático de la adición de gas de C02 y 1 M de carbonato de sodio (Na2C03). El contenido de oxígeno disuelto se deja disminuir a aproximadamente 30% de saturación de aire. Una mezcla de oxígeno/aire rociado en el cultivo para alcanzar un caudal de gas y oxígeno disuelto total constante es controlado al ajustar la relación del aire a gases de oxígeno según lo necesitado y aumentando la velocidad de agitación después de alcanzar una relación máxima de oxígeno a aire. En otro ejemplo, la agitación se ajusta para mantener una relación constante de potencia/volumen. Una emulsión antiespuma basada en simeticona se agrega al biorreactor según sea necesario basada de acuerdo con el nivel de espuma. Las muestras se recolectan periódicamente para probar la densidad celular, viabilidad celular, concentración de producto, concentraciones de glucosa y lactato, 02 disuelto, C02 disuelto, pH, y osmolalidad. El cultivo de biorreactor se cosecha aproximadamente 10 días después de la inoculación. Antes de la cosecha, el contenido del biorreactor se muestrea como volumen sin procesar. 5.3.3. Retiro de la cosecha y células Justo antes de la cosecha, el biorreactor de producción primero se enfría <15°C, después se ajusta a un pH de 5.0 ± 0.1 al usar 0.5 M o 1 M o 2 M de ácido cítrico, y se mantiene durante un período de aproximadamente 30-90 o 45-60 minutos para aglomerar las células y desechos celulares antes de la transferencia al recipiente de cosecha. La cosecha con pH ajustado entonces se clarifica mediante centrifugación continua operada bajo parámetros predefinidos para la velocidad de giro y caudal según lo definido en la documentación de registro de lote.

El centrifugado se filtra a través de un filtro profundo seguido por un filtro de membrana de 0.22 pm y se recolecta en un tanque esterilizado previamente. La cosecha sin células se ajusta a un pH aproximado de 6.4 al usar una solución de 1-2 M de Tris y se almacena a 2-8°C para el procesamiento posterior. En algunos casos, este ajuste de pH ocurre en un periodo de 12 horas del ajuste pH original del biorreactor a pH 5.0. 5.4. Purificación de DAC HYP 5.4.2. Sinopsis El proceso de purificación y formulación de DAC HYP se diseñó para mejorar la eficacia con relación al proceso de producción de ZENAPAX y para asegurar la separación constante de las impurezas relacionadas al producto y proceso. Las siguientes subdivisiones describen el proceso de purificación. La purificación se basa en tres técnicas de cromatografía (cromatografía de afinidad de proteína A, cromatografía de intercambio aniónico en Sefarosa Q, y cromatografía de intercambio catiónico en CM-650(M)) en combinación con las etapas de desactivación viral a pH bajo, filtración viral, ultrafiltración/diafiltración, y formulación. Todas las etapas ocurren en el equipo incluido. Un esquema del proceso de purificación para DAC HYP se presenta en la figura 5 y se describe posteriormente. 5.4.2. Cromatografía de proteína A La etapa de la cromatografía de afinidad de proteína A es la primera etapa de la purificación en la secuencia de las operaciones descendentes. Esta etapa ocurre en uno o más ciclos dependiendo del tamaño de columna, comúnmente dos o tres ciclos para la columna descrita en la tabla 8A (es decir, la cosecha sin células se divide en dos alícuotas, y después cada alícuota se carga y eluye por separado en la columna de proteína A). La resina de cromatografía de afinidad de proteína A recombinante une específicamente a IgG, separando el anticuerpo de otros componentes de cosecha del cultivo celular.

Después del equilibrio de la columna de proteína A con un amortiguador de equilibrio, la cosecha sin células neutralizada se pasa a través de la columna para unir el anticuerpo a la resina de columna. El amortiguador de equilibrio es 20 mM de citrato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7.0. La columna se carga a una capacidad no mayor de 35 gramos de anticuerpo (proteína) por litro de resina rellenada. Después de la carga, la columna se lava con amortiguador de equilibrio para eliminar las impurezas no unidas y poco unidas de la resina, así como un lavado de pre-elución con un amortiguador de citrato para ajustar la concentración de citrato y cloruro de sodio de la columna. El amortiguador de citrato es 10 mM de citrato de sodio a pH 7.0. El anticuerpo unido entonces se eluye de la columna con una etapa que cambia el pH al usar un amortiguador de elución de 10 mM de citrato de sodio a pH 3.5. Una sinopsis de las condiciones de la cromatografía de proteína A se establece en la tabla 8A.

Tabla 8A: Parámetros ejemplares de la cromatografía de proteína A de DAC HYP PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Resina MabSelect Altura de lecho de columna, cm 10-25, comúnmente 14 Diámetro de columna, cm 1 -120, dependiendo de escala Temperatura de operación 5°C 20 mM de NaCitrato, 150 mM de NaCI, pH Amortiguador de equilibrio/lavado 7.0 Volumen de equilibrio, CV 5-7 Caudal de equilibrio, cm/hr 150-300 Caudal de carga, cm/hr 150-300 Capacidad de carga, gramos de <35 IgG/L de resina Caudal de lavado, cm/hr 150-300 Volumen de lavado, CV 7 Seguir el lavado de 7 CV con CV 2 de 10 Acondicionamiento Pre-Elución mM de NaCitrato, de pH 7.0 y Caudal de 150-300 cm/hr Amortiguador de elución 10 mM de NaCitrato, pH 3.5 Caudal de elución, cm/hr 150-300 250 mAU - 250 mAU Criterios de recolección (Longitud de trayectoria de detector UV: 5.0 mm) Volumen de amortiguador de elución 2 después de la elución, CV Dirección de flujo, equilibrio, Abajo PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE esterilización y almacenamiento 20 mM de NaCitrato, 150 mM de NaCI, pH Equilibrio 7.0 Volumen de equilibrio, CV 2-3 Caudal de equilibrio, cm/hr 150-300 200 mM de NaCitrato, 20 mM de NaOH, 1% Amortiguador de Esterilización de alcohol bencílico 150 cm/hr para CV 1.8, entonces se Caudal de Esterilización, cm/hr mantiene durante 30 minutos.

Equilibrio para el siguiente ciclo 5-7 CV 200 mM de citrato de sodio, 1% de alcohol Amortiguador de almacenamiento bencílico, pH 7.0 Caudal de almacenamiento, cm/hr 150-300 Volumen de amortiguador de CV 4 almacenamiento, CV Temperatura de almacenamiento de 5°C columna, °C Mientras el producto se eluye de la columna, la absorbancia del efluente en una longitud de onda de 280 nm se supervisa y utiliza para dirigir la recolección de la fracción de producto (ver la figura 6).

El uso de un amortiguador de esterilización que contiene hidróxido de sodio y alcohol bencílico elimina ventajosamente una amplia gama de organismos microbianos mientras que afecta mínimamente la calidad de la resina de proteína A. Para ilustrar esto, varias soluciones de esterilización se adicionaron con varios microorganismos e incubaron durante un periodo de tiempo. En diferentes intervalos de tiempo de incubación, los lotes de las soluciones de esterilización adicionadas se neutralizaron y los títulos de microorganismo se midieron y compararon con el control. Las actividades microbicidas se expresan en la reducción de registro de los microorganismos durante el transcurso del tiempo. La tabla 8B muestra la reducción de los títulos de microorganismo en función del tiempo de contacto con el amortiguador de esterilización de 20 mM de hidróxido de sodio, 200 mM de citrato de sodio y 1% de alcohol bencílico.

Tabla 8B: Reducción de los títulos de microorganismo en función del tiempo de contacto con el amortiguador de esterilización de 20 mM de hidróxido de sodio, 200 mM de citrato de sodio y 1% de alcohol bencílico LRVa LRVa LRVa LRVa LRVa Organismo 0 min 15 min 30 min 60 min 120 min E. coli (Gram negativo) >5.7 >5.7 >5.7 >5.7 >5.7 S. aureus (Gram positivo) 1.1 >5.1 >5.1 >5.1 >5.1 B. subtilis (formación de esporas) (Gram negativo) 2.8 2.7 3.2 3.1 3.6 LRVa LRVa LRVa LR a LRVa Organismo 0 min 15 min 30 min 60 min 120 min P. aeruginosa (Gram negativo) >5.0 >5.0 >5.0 >5.0 >5.0 C.albicans (levadura) 4.2 >5.5 >5.5 >5.5 >5.5 A. niger (hongo) -0.2 0.4 0.5 0.8 1.4 La tabla 8C muestra la reducción de microorganismos mediante diferentes soluciones de esterilización.

Tabla 8C: Reducción log 0 de microorganismos mediante diferentes soluciones A B C D A B C D Candida albicans 3.1 >5.5 O >4.8 (levadura) Aspergillus niger 0.01 0.8 O >4.7 A = 50 mM de NaOH, 0.5 M de NaCI (60 minutos) B = 20 mM de NaOH, 200 mM de citrato de sodio, 1% de alcohol bencílico (60 minutos) C = 200 mM de citrato de sodio, 0.5% de alcohol bencílico (48 horas) D = 2% de alcohol bencílico (24 horas) Los datos anteriores muestran que las soluciones de esterilización que contienen el alcohol bencílico e hidróxido de sodio son muy eficaces en eliminar una gran variedad de microorganismos, que incluyen las bacterias gram-negativas y gram-positivas, las bacterias de formación de esporas, levaduras y hongos. Después de 30 minutos de esterilización común, más de 5 reducciones log10 se observaron en E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, y Candida albicans. Aunque la eliminación de hongos (A. Niger) tomó más tiempo, es raro tener infección por hongos en los fluidos del cultivo celular. Los microorganismos más comunes aislados en la instalación de Biotech son Bacillus, Pseudomonas y Staphylococcus. Éstos son eliminados con eficacia por la solución de esteriNzación después de 30 minutos de tiempo de contacto. En la comparación, el hidróxido de sodio o alcohol bencílico solos no son eficaces en la eliminación de todos los microorganismos. Por otra parte, la solución de esterilización de hidróxido de sodio no elimina el Bacillus de formación de esporas. 5.4.3. Retención del pH bajo para la desactivación viral Esta etapa se diseña para desactivar las partículas y virus similares al virus endógeno sensible al pH bajo. El eluído de proteína A de cada ciclo de proteína A se eluye en un tanque de recolección, donde se agrega 0.5 M de ácido clorhídrico hasta que se alcance un pH de 3.5 ± 0.1. El producto se transfiere a un tanque de contención donde el pH se verifica por otro medidor de pH. La etapa de retención a pH bajo se controla rigurosamente a pH 3.5 ± 0.1 o ± 0.2 (por ejemplo, pH 3.35-3.64) durante 30-120 minutos, o 30-240 minutos. Después de la retención durante 30-120 minutos, el eluído desactivado viral se neutralizan a un pH de 7.8 ± 0.1 o ± 0.3 (por ejemplo, pH 8.05-8.34) al usar la base de 1 M de Tris, y después se transfiere a través de un filtro de 0.22 µ?? en un tanque de recolección de producto. Una sinopsis de las condiciones de desactivación viral a pH bajo se establecen en la tabla 9.

Tabla 9: Parámetros de desactivación viral a pH bajo de DAC HYP PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Desactivación por pH 3.5 Dilución de eluído Diluir a <13 mg/ml y sobre punto de PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE muestra de tanque Amortiguador de dilución 17 mM de NaCI o amortiguador de elución Amortiguador del ajuste de pH 0.5 M de Ácido clorhídrico 120 minutos a 5°C o 30 minutos a Tiempo de desactivación temperatura ambiente.

Amortiguador de neutralización 1 M de Tris pH objetivo después de la 7.8 medidos a 25°C* neutralización 'Alternativamente, el pH objetivo después de la neutralización puede ser de 8.2 a 25°C. 5.4.4. Cromatografía de flujo directo de intercambio aniónico en Sefarosa Q La etapa de cromatografía de intercambio aniónico en Sefarosa Q se utiliza para reducir las impurezas relacionadas al producto y proceso (por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas de célula hospedadora, agregados de producto, ligando lixiviado de proteína A, etc.) y para proporcionar la capacidad de eliminación viral adicional al proceso de purificación. La conductividad y pH de la carga se eligen de una forma tal que el anticuerpo atraviese la columna y las impurezas cargadas negativamente, tal como las proteínas de célula hospedadora y ADN celular, se unan a la resina cargada positivamente.

La columna de intercambio aniónico se equilibra con un amortiguador de equilibrio de 20 mM de Tris, 20 mM de cloruro de sodio, pH 7.8. El producto con pH ajustado de la etapa de retención a pH bajo, se carga en la columna a una capacidad de no mayor de 60 gramos de anticuerpo (proteína), o no mayor de 30-60 gramos de anticuerpo (proteína), por litro de resina rellenada. Después de completar la carga, el anticuerpo e impurezas no unidas se retiran de la columna con el amortiguador de equilibrio.

La recolección del producto se dirige supervisando la absorbancia del efluente a una longitud de onda de 280 nm (ver la figura 7).

El caudal de esterilización es de 100 cm/hr y el tiempo de retención es de 60 minutos.

Una sinopsis de las condiciones de la cromatografía en Sefarosa Q se establece en la tabla 10.

Tabla 10: Parámetros de la cromatografía en Sefarosa Q de DAC HYP PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Resina Sefarosa FF Q Altura de lecho de columna (cm) 10-30, comúnmente 19 1 - 120, dependiendo de Diámetro de columna (cm) escala Temperatura de operación 5°C - 25°C Dirección de flujo para el Abajo equilibrio/carga/lavado/regeneración/esterilización PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE 20 mM de Tris, 20 mM de Amortiguador de equilibrio/lavado NaCI, pH 7.8 Volumen de equilibrio (CV) 8 Caudal (cm/hr) 100 Capacidad de carga (g/l) <60 Caudal de lavado (cm/hr) 100 0.25 AU - 0.25 AU (longitud de Criterios de recolección trayectoria de detector UV: 5.0 mm) Amortiguador de regeneración/esterilización 0.5 M de NaOH, 1 M de NaCI Volumen de regeneración/esterilización (CV) 1.8 Amortiguador de regeneración/retención de 0.5 M de NaOH, 1 M de NaCI esterilización Tiempo de regeneración/esterilización (minutos) 60 Amortiguador de almacenamiento 12 mM de NaOH Volumen de amortiguador de almacenamiento A (CV) Temperatura de almacenamiento de columna. 5°C (°C) Para algunos usos, el punto de ajuste de volumen del amortiguador de almacenamiento es 3 y la temperatura de almacenamiento de la columna se fija a 5°-25°C. 5.4.5. Cromatografía de intercambio catiónico en CM-650(M) Esta etapa de cromatografía es la última etapa usada en el proceso para reducir los niveles de trazas de impurezas relacionadas al proceso y producto. Además de reducir los agregados y fragmentos de división del anticuerpo, esta etapa también reduce las impurezas relacionadas al proceso tal como ácidos nucleicos y proteínas de célula hospedadora, y proteína A lixiviada.

La columna se equilibra con un amortiguador de equilibrio de 20 mM de citrato de sodio, pH 4.5. La agrupación de eluído de intercambio aniónico se ajusta a un pH de 4.5 ± 0.1 o ± 0.2 (por ejemplo, 4.35-4.64) al usar 0.5 de ácido cítrico y se carga en la columna a una capacidad de carga objetivo de no mayor de 25 ó 30 gramos de anticuerpo (proteína) por litro de resina rellenada. Después de la etapa de unión, la columna se lava con amortiguador de equilibrio para eliminar las impurezas no unidas o poco unidas de la resina. El anticuerpo unido entonces se eluye de la columna en un modo de elución de la etapa con un amortiguador de elución de 20 mM de citrato de sodio, 75 mM de sulfato de sodio, pH 4.5. La recolección máxima se dirige supervisando la absorbancia del efluente a una longitud de onda de 280 nm (ver la figura 8).

Una sinopsis las condiciones de cromatografía en CM-650(M) se establecen en la tabla 11.

Tabla 11: Parámetros de la cromatografía en CM-650(M) de DAC HYP PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Resina CM650 (M) Altura de lecho de columna (cm) 10-30, comúnmente 18 Diámetro de columna (cm) 1 - 140, dependiendo de escala Temperatura de operación 20°C Amortiguador de equilibrio/lavado 20 mM de NaCitrato, pH 4.5 Volumen de equilibrio (CV) 5 Caudal (cm/hr) 100 Ajustar el pH de carga a 4.5 con 0.5 M Preparación de carga de ácido cítrico Capacidad de carga (g/l) =30 Volumen de la avado (CV) CV 3 con amortiguador de equilibrio 20 mM de NaCitrato, 75 mM de Na2S04, Amortiguador de elución pH 4.5 Criterios de recolección de agrupamiento 1.25 AU hasta 1.25 AU piscina de producto de intercambio (Basado en la longitud de trayectoria de catiónico detector UV de 5.0 mm) Concentración de IgG diluida 8.5 Amortiguador de Dilución* 20 mM de NaCitrato, pH 4.5 Amortiguador de 0.5 NaOH de M regeneración/esterilización Volumen de regeneración/esterilización 1.8 (CV) PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Tiempo de regeneración/retención de 60 esterilización (minutos) Amortiguador de almacenamiento 12mMde NaOH Volumen de amortiguador de 4 almacenamiento (CV) *Opcionalmente, el amortiguador de dilución no se utiliza. 5.4.6. Nanofiltración El propósito de la etapa de nanofiltración es proporcionar la capacidad de eliminación viral adicional al proceso de purificación. La eliminación de virus y partículas similares al virus en esta etapa ocurre a través de un mecanismo de exclusión de tamaño. Los poros del filtro se diseñan tal que el anticuerpo pase a través del filtro mientras las partículas similares al virus y virus se conservan en el lado ascendente del filtro.

El eluído de intercambio catiónico que se ha filtrado a través de filtros de 0.22 µ?t? o 0.1 µ?t? se pasa a través de un pequeño nanofiltro de retención de virus, seguido por un enjuague del filtro con amortiguador de formulación de DAC HYP sin polisorbato 80 (40 mM de succinato, 100 mM de cloruro de sodio, pH 6.0). La etapa de enjuague con amortiguador se aplica para recuperar el anticuerpo que permanece en el alojamiento de la línea y filtro.

Una sinopsis de los parámetros de nanofiltración se establece en la tabla 12.

Tabla 12: Parámetros de nanofiltración PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Pre-filtro Filtros de nilón Ultipor Filtro de virus V-Pro Magnus 2.2 o NFP Presión, psig 20-30, comúnmente 25 Enjuague con WFI 100 l/m2** Amortiguador de equilibrio y amortiguador 40 mM de succcínato de sodio, 100 mM de lavado después de la carga de NaCI, pH 6.0 Equilibrio (I) 33 l/m2** Volumen de amortiguador de lavado (I) 33 l/m2† Capacidad de proceso Hasta 371 l/m2 *o >50 l/m2 **o >50 l/m2 †o aproximadamente 50 l/m2 5.4.7. Ultraf iltración/diafiltración (UF/DF, por sus siglas en inglés) Esta etapa de proceso se diseña para concentrar el producto e intercambiar el amortiguador en el producto por el amortiguador de formulación de DAC HYP sin polisorbato 80. Se opera en un modo de flujo tangencial al usar una membrana de corte nominal de peso molecular de 30 kDa. Dos etapas de ultrafiltración/diafiltración se utilizan para producir 150 mg/ml de formulación debido al volumen previsto del producto a la concentración final y al volumen mantenido relativo de cada sistema de UF.

La primera fase se procesa al usar un sistema de UF grande (ver la figura 9). El filtrado de nanofiltración primero se concentra a aproximadamente 30 mg/ml y en seguida se diafiltra en el amortiguador de intercambio (amortiguador de formulación sin polisorbato 80). La solución de anticuerpo diafiitrada se concentra adicionalmente a aproximadamente 100 mg/ml, después se recupera a una concentración de aproximadamente 55 mg/ml del sistema de UF/DF y se transfiere a través de un filtro de 0.22 m. La solución de anticuerpo diafiitrada también se puede recuperar a una concentración de aproximadamente 20-60 mg/ml. Una sinopsis de los parámetros de la primera fase se establece en la tabla 13.

Tabla 13: Parámetros de la etapa 1 de UF/DF PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Capacidad de carga de membrana (g/m2) = 300 Presión de entrada (psig) 25 Presión de salida (psig) 15 Presión permeada (psig) No restringido/restringido 40 mM de succcinato de sodio, 100 mM Amortiguador de equilibrio/diafiltración de NaCI pH 6.0 Concentración durante la diafiltración (g/l) 30 PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Volumen de diafiltración (volúmenes de 10 intercambio) Concentración final antes de la -100 recuperación de producto (g/l) Reutilización de membrana Sí 40 mM de succcinato, 100 mM de NaCI Enjuague de filtro pH 6.0 Amortiguador de Esterilización (pre-uso) 0.5 M de NaOH* Tiempo de Esterilización (minutos) (pre- 60 uso) Temperatura de Esterilización (°C) (pre- Temperatura ambiente uso) Enjuague de Esterilización WFI Solución de Esterilización (post-uso) 0.1 M de NaOH Tiempo de Esterilización (minutos) (post¬ 60** uso) Temperatura de Esterilización (°C) (post¬ Temperatura ambiente uso) Amortiguador de almacenamiento 0.1 M de NaOH Concentración de producto (g/l) 70í Almacenamiento de producto (°C) 2-20, comúnmente 20 *o 0.1 M de NaOH ** o 2 veces durante 40 minutos †o que oscila de 20-70 La segunda etapa se procesa al usar un sistema de UF más pequeño, pero con la misma membrana de corte de 30 kDa. La solución de DAC HYP (comúnmente de 55 mg/ml ) se concentra a aproximadamente 180 mg/ml, se recupera del sistema de UF, y después se transfiere a través de un filtro de 0.22 µ??. El sistema de UF se enjuaga con el amortiguador de formulación sin polisorbato 80 y se transfiere a través de un filtro de 0.22 µ?t? que obtiene la sustancia de fármaco purificada a aproximadamente 170 mg/ml o aproximadamente 150-170 mg/ml. Una sinopsis de los parámetros de la segunda etapa se establece en la tabla 14. Tabla 14: Parámetros de la etapa 2 de UF/DF de DAC HYP; Membrana de UF/DF: Millipore (Pellicon 2 o Pellicon 3, MWCO 30 KD) PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Superficie de la membrana (m ) 0.005 a 20.5, dependiendo de escala Presión de entrada (psig) 20 Presión de salida (psig) Sin restricción Presión permeada (psig) Sin restricción 40 mM de succcinato de sodio, 100 mM Amortiguador de equilibrio de NaCI pH 6.0 Concentración final antes de la 180 recuperación de producto (g/l) PARAMETRO PUNTO DE AJUSTE Recirculación/volumen de sistema de 2 mi a 5 I, dependiendo de la escala enjuague (I) Recirculación/amortiguador de sistema de 40 mM de succcinato de sodio, 100 mM enjuague de NaCI, pH 6.0 Enjuague de Esterilización WFI Solución de Esterilización (post-uso) 0.1 M de NaOH Tiempo de Esterilización (minutos) (post60* uso) Amortiguador de almacenamiento 0.1 Mde NaOH filtro multimedia de 0.2 µ?? para después de filtros de 1x30 pulgadas (2.5x75 cm) la concentración final **o 2 veces durante 40 minutos 5.5. Formulación de DAC HYP La etapa de proceso final es la dilución de la sustancia de fármaco purificada a una concentración objetivo final de 150 ó 100 mg/l ± 10%, es decir, una concentración objetivo final de 150 ± 15 mg/ml (en el caso de 150 mg/ml de formulación) o 100 ± 10 mg/ml (en el caso de 100 mg/ml de formulación) en el amortiguador que contiene una concentración apropiada de polisorbato 80. La formulación se realiza en etapas.

Por ejemplo, primero, el amortiguador de formulación sin polisorbato 80 (40 mM de succinato de sodio, 100 mM de cloruro de sodio, pH 6.0) se agrega a la sustancia de fármaco purificada para alcanzar 90% de volumen objetivo de la sustancia de fármaco formulada. Entonces, una cantidad calculada del amortiguador de dilución de polisorbato 80 (40 mM de succinato, 100 mM de cloruro de sodio, 1% de polisorbato 80, pH 6.0 ) se agrega para alcanzar la concentración objetivo de 0.03% (p/v) de polisorbato 80 en la formulación final. Finalmente, el volumen de producto se ajusta, al usar el amortiguador de formulación (hecho de succinato y ácido succínico para 150 mg/ml de formulación, y succinato y ácido clorhídrico para 100 mg/ml de formulación) sin polisorbato 80, para alcanzar una concentración final de anticuerpo de 150 ± 15 mg/ml (preferiblemente 150 ± 8 mg/ml). 100 mg/ml de producto de fármaco se formulan de una manera similar a una concentración final de 100 ± 10 mg/ml (preferiblemente 100 ± 5 mg/ml).

La sustancia de fármaco formulada se filtra a través de un filtro de 0.22 µ?t? en una bolsa BioProcess Container TM (BPC®) (o equivalente) que se pone dentro de un soporte cilindrico semi-rígido. El soporte incluye la BPC con una tapa y proporciona una barrera protectora entre la bolsa flexible y el ambiente externo. La sustancia de fármaco formulada se almacena a 2-8°C en un refrigerador de acceso controlado para el llenado de producto de fármaco/operaciones finales.

Una sinopsis de las condiciones de formulación se establecen en la tabla 15.

Tabla 15: Condiciones de formulación de 150 mg/ml de DAC HYP; filtro de 0.2 µ?t? para la agrupación después de la formulación 1 mi de producto de fármaco se llena en frascos o una jeringa. Una sinopsis de los componentes de los producto finalizados a 150 mg/ml y 100 mg/ml tienen los componentes mostrados en la tabla 16 (todas las cantidades son valores nominales).

Tabla 16: Composición de las formulaciones de producto de fármaco de DAC HYP a 150 mg/ml y 100 mg/ml 5.6. Caracterización de la sustancia de fármaco de DAC HYP El DAC HYP se glicosila en el aminoácido 296 de ambas subunidades de cadena pesada, con la forma principal de oligosacárido que existe como una estructura biantenaria fucosilada en el núcleo que carece de la galactosa terminal.

Las terminales N de la cadena pesada de DAC HYP existen como tres formas principales: 1) glutamina de terminal N (prevista de la secuencia de ADN), 2) piroglutamato de terminal N (de la ciclización de la glutamina de terminal N), y 3) residuos de valina, de histidina y serina de terminal N además del residuo de glutamina de terminal N previsto (resultantes de la división incompleta del péptido señal).

Las terminales C de cadena pesada de DAC HYP existen con y sin el residuo de lisina de terminal C. La forma principal carece del residuo de lisina de terminal C, que da por resultado la glicina de terminal C.

El DAC HYP tiene un peso molecular calculado de 144 kDa basado en la composición de aminoácido primaria definida por la secuencia de nucleótido. El peso molecular correspondiente de la cadena pesada reducida es 48.9 kDa y la cadena ligera reducida es de 23.2 kDa; estos pesos no explican el contenido de carbohidratos o modificaciones después de la traducción.

La unión de DAC HYP es muy específica para CD25, que se expresa en los linfocitos T y B activados pero no en los que están en reposo. DAC HYP que une a CD25 en estas células activadas bloquea la unión de IL-2 a CD25 y la formación subsecuente del complejo de receptor IL-2 de alta afinidad. Por lo tanto, se bloquea la proliferación de células activadas inducida por IL-2. La eficacia terapéutica observada y potencial de DAC HYP se cree que se basa en gran parte en su efecto inhibitorio sobre la proliferación de las células T auto-reactivas activadas. Sin embargo, DAC HYP puede también ejercer un efecto terapéutico a través de su efecto de bloqueo sobre otros tipos de células que contienen CD25 tal como eosinófilos.

Para confirmar que las formulaciones de alta concentración de DAC HYP de 150 mg/ml fueron convenientes para las investigaciones clínicas, una evaluación fisicoquímica y biológica comprensiva se realizó para caracterizar y comparar dos lotes de sustancia de fármaco de DAC HYP a 150 mg/ml, referidos en la presente como lote 1 y lote 2 (o lote 150-1 o lote 150-2, respectivamente), para un lote de referencia estándar RS0801, que es de un lote de DAC HYP a 100 mg/ml fabricado a la escala de 10,000 I.

Los resultados demuestran que los lotes de producto de fármaco de DAC HYP a 150 mg/ml de pureza elevada, son comparables con los lotes de 100 mg/ml, y son convenientes para el uso en estudios clínicos. Una sinopsis de estas características se muestra en la tabla 17.

Tabla 17: Características de pureza de DAC HYP (todas las concentraciones son nominales) 5.6.1 Color, aspecto, y claridad El aspecto de la sustancia de fármaco de DAC HYP es determinado visualmente al examinar el color y claridad de la solución a luz directa contra un fondo negro y fondo blanco sin ampliación. La solución también se evalúa para determinar la presencia de partículas visibles. El aspecto común de varios lotes de producto de fármaco de DAC HYP se describe en la tabla 17. 5.6.2. Determinación de pH El pH de DAC HYP se determina de acuerdo con el Protocolo de Farmacopea Norteamericana No. (791). Los intervalos de pH de varios lotes de producto de fármaco de DAC HYP se presentan brevemente en la tabla 17. 5.6.3. Concentración de producto mediante espectroscopia UV La concentración de DAC HYP se determina por espectroscopia UV. Las muestras de DAC HYP se diluyen de manera gravimétrica con el amortiguador. La absorbancia UV de cada solución de muestra diluida se mide a 278 nm contra un blanco de amortiguador. La concentración de protefna de la muestra se calcula al usar el coeficiente de absorbancia para DAC HYP. Las concentraciones de proteína de varios lotes de producto de fármaco de DAC HYP se presentan brevemente en la tabla 17. 5.6.4. Secuencia de terminal N Los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml se evaluaron mediante la secuenciación de terminal N. Las muestras se analizaron al usar un instrumento automatizado de secuenciación de degradación de Edman.

La secuencia de aminoácido de cadena ligera prevista a través de los primeros 15 residuos, DIQMTQSPSTLSASV (SEC ID NO: 13), se confirmó para todas las muestras.

La mayoría de la cadena pesada en DAC HYP se bloque mediante un residuo de piroglutamato (pE, por sus siglas en inglés) que no producirá una secuencia de cadena pesada de terminal N. La siguiente secuencia de cadena pesada de terminal N más frecuente en DAC HYP comienza con una secuencia de valina, histidina, serina (VHS, por sus siglas en inglés), que resulta de la carencia del procesamiento de los tres residuos terminales del péptido señal de cadena pesada. Catorce de los primeros quince residuos de terminal N se confirmaron para la secuencia de cadena pesada VHS (VHSQVQLVQSGAEVK (SEC ID NO: 14)) en todas las muestras. El cuarto residuo, glutamina, no se pudo confirmar debido a la gran cantidad de glutamina detectada a partir de LC en el ciclo de secuenciación anterior. La evidencia de la cadena pesada con glutamina de terminal N estuvo también presente en todas las muestras. Esta secuencia es un resultado del residuo nativo de glutamina de cadena pesada de terminal N que no experimenta la ciclización a la forma piroglutamato. Los resultados de la secuenciación de terminal N para los lotes de 150 mg/ml son coherentes con las secuencias previstas de las secuencias de codificación de cadena pesada y ligera. Los resultados comparables se obtuvieron para los lotes de 100 mg/ml. 5.6.5. Análisis de la masa de cadena pesada y ligera Las masas moleculares de la cadena pesada y cadena ligera de los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y del estándar de referencia RS0801, se evaluaron mediante el análisis de cromatografía liquida-espectrometría de masa (LC- S, por sus siglas en inglés). Todos los lotes se desglicosilaron con la amidasa PNGaseF, redujeron con ditiotreitol, alquilizaron con ácido yodoacético, y separaron mediante cromatografía inversa. Las masas teóricas de cadena pesada y ligera se calcularon a partir de la secuencia de proteína. Las masas observadas de las muestras estuvieron dentro de 1 Da de las masas calculadas, según lo mostrado en la siguiente tabla 18.

Tabla 18: Resultados de la masa de cadena pesada y ligera Según lo descrito en la sub-sección anterior, las dos formas de cadena pesada de DAC HYP más frecuentes se conocen por contener un residuo de piroglutamato (pE, por sus siglas en inglés) de terminal N o una secuencia de valina, histidina, serina (VHS, por sus siglas en inglés) serina y carece de una lisina de terminal C. Los pesos moleculares obtenidos para las dos variantes de cadena pesada y cadena ligera predominantes en los lotes de 150 mg/ml fueron comparables con los del estándar de referencia RS0801 y fueron coherentes con las masas previstas de las secuencias de proteína.

Junto con los resultados de mapeo de péptido presentados en la siguiente sub-sección, los resultados de masa de cadena pesada y ligera confirman la presencia de las estructuras primarias de cadena ligera y cadena pesada previstas en los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml. 5.6.6. Mapeo de péptido Los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y el estándar de referencia RS0801 (DAC HYP producido del lote de sustancia de fármaco de 100 mg/ml manufacturado a la escala de 10,000 I) se evaluaron al usar el mapeo de péptido de HPLC de fase inversa. Todos los lotes se redujeron con ditiotreitol, alquilizaron con ácido yodoacético, y digirieron de manera enzimática con tripsina. Los péptidos resultantes se separados por cromatografía de fase inversa y detectaron por absorbancia UV a 215 nm para generar los mapas de péptido.

Para verificar la secuencia de aminoácido primaria, los mapas de péptido de los lotes de 150 mg/ml se compararon con los del estándar de referencia RS0801. Los péptidos que correspondieron al noventa y ocho por ciento de los residuos de cadena pesada y ligera previstos, se han identificados previamente por espectrometría de masa en el mapa de péptido del estándar de referencia RS0801. Los residuos que no se han presentado en el mapa de péptido son aminoácidos simples o residen en dipéptidos muy polares, y no se espera que se conserven por la columna de fase inversa. Las masas coherentes con el piroglutamato, glutamina, y la secuencia VHS en las terminales N del péptido de terminal N de cadena pesada, se han identificado en el estándar de referencia. El DAC HYP contiene un sitio de consenso para la glicosilación ligada a N en la porción Fe de la cadena pesada en Asn296 y las masas coherentes con las estructuras de oligosacárido biantenarias de núcleo complejo ligadas se han identificado para el péptido que contuvo el residuo Asn296.

Los mapas de péptido que comparan los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml con el estándar de referencia RS0801 se muestran en la figura 10 (0 a 60 minutos), figura 11 (55 a 115 minutos), y figura 12 (110 a 170 minutos). Los mapas de péptido de los lotes DAC HYP a 150 mg/ml son comparables con los del estándar de referencia y confirman la presencia de la estructura primaria prevista en los lotes de 150 mg/ml. 5.6.7. Espectroscopia de dicroísmo circular Los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y el estándar de referencia RS0801 se analizaron mediante espectroscopia de dicroísmo circular ultravioleta lejano (CD UV lejano) para evaluar la estructura secundaria. Antes del análisis, las muestras se diluyeron con agua a una concentración final de proteína de 0.2 mg/ml. Los espectros se adquirieron de 195 a 260 nM al usar 0.1 cm/células y la señal obtenida se convirtió a la elipticidad molar después de la sustracción del amortiguador.

Los espectros CD UV lejano sobrepuestos de los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml, lote 1 y lote 2 y estándar de referencia RS0801, se muestras en la figura 13. Los espectros de todos los lotes muestran una banda positiva a aproximadamente 202 nm y una banda negativa a aproximadamente 217 nm. La banda negativa a 217 nM es característica de una conformación de hoja ß, la conformación predominante de las moléculas de IgG. Los espectros CD UV lejano de los lotes fueron similares, lo cual soporta una estructura secundaria uniforme entre los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y el estándar de referencia RS0801. 5.6.8. Espectroscopia ultravioleta Los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y el estándar de referencia RS0801 se analizaron por espectroscopia ultravioleta (UV, por sus siglas en inglés) para evaluar la estructura terciaria. Antes del análisis, las muestras se diluyeron con el amortiguador de formulación (40 mM de succinato, 100 mM de cloruro de sodio, 0.03% de polisorbatos 80, pH 6.0) a una concentración final de proteína de 0.5 mg/ml. Los espectros se adquirieron de 250 a 350 nm al usar una cubeta de cuarzo de longitud de trayectoria de 1 cm y se normalizaron a una absorbancia de 1.0 a 280 nm.

El orden cero sobrepuesto y los segundos espectros UV derivados (calculados de los datos ajustados del orden cero) se muestran en las figuras 14A y 14B, respectivamente. El orden cero y los segundos espectros derivados de todos los lotes evaluados se sobrepusieron, lo cual apoya una estructura terciaria uniforme entre los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml, lote 1 y lote 2 y estándar de referencia RS0801. 5.6.9. Cromatografía mediante exclusión de tamaño La cromatografía mediante exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) se realizó al usar una columna porosa de sílice con una fase móvil acuosa y detección de absorbancia ultravioleta a 280 nm. Particularmente, 15 µ? de muestra de prueba (20 mg/ml de anticuerpo en amortiguador de elución) se analizaron a temperatura ambiente en una columna TSK G3000SWXL de 7.8 mm x 30 cm (Tosoh Biosciences, número de parte 601342) equipada con un filtro de pre-columna de 0.5 pm (Upchurch, número de parte A-102X) al usar un gradiente ¡socrático del amortiguador de elución (200 mM de KP04, 150 mM de KCI, pH 6.9) a un caudal de 1 ml/min.

Según lo mostrado en la figura 15A (escala completa) y figura 15B (escala ampliada), los perfiles cromatográficos de los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml fueron comparables con los del estándar de referencia RS0801. Todos los lotes exhibieron el mismo máximo principal que correspondió al monómero de daclizumab y un máximo menos de agregado. Los resultados de agregados para los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml fueron comparables con los de los lotes de DAC HYP a 100 mg/ml según lo mostrado en la siguiente tabla 19.

Tabla 19: Resultados del porcentaje de agregados Los lotes de 150 mg/ml y el estándar de referencia RS0801 se analizaron al usar la SEO con la detección de dispersión luminosa de ángulos múltiples (SEC-MALS, por sus siglas en inglés) para determinar el peso molecular del máximo de agregados. Para todos los lotes, el peso molecular obtenido para el máximo de agregados fue de aproximadamente 300 kDa, que es coherente con el dímero de anticuerpo.

La formación de agregados en DAC HYP se supervisó durante un período de dieciocho meses. El nivel de agregados en la formulación, pero el porcentaje de agregados se estabilizó y no excedió de aproximadamente 1.5% cuando se almacenaron a 5°C durante 18 meses (ver la figura 16). Los nuevos datos con nuevos lotes indican que aproximadamente 1.8-1.9% de agregados pueden aparecer en 6 semanas cuando se almacenan a 5°C, pero para todas las muestras probadas, menos de 3% de agregados se formaron durante 5 años cuando se almacenaron a 5°C. 5.6.10. Ultracentrifugación analítica a la velocidad de sedimentación El monómero y agregados en los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y 100 mg/ml se caracterizaron al usar la ultracentrifugación analítica a la velocidad de sedimentación (SV-AUC, por sus siglas en inglés). El valor del coeficiente de sedimentación y la abundancia relativa para el monómero y cada uno de los agregados, se presenta en las siguientes tablas 20 y 21.

Tabla 20: Valores del coeficiente de sedimentación para el monómero y agregados (en Svedbergs) El monómero fue el componente principal observado en cada uno de los lotes. El coeficiente de sedimentación del máximo de monómero fue muy coherente entre los lotes lo cual indica que la conformación del monómero es comparable entre los lotes de 150 mg/ml y 100 mg/ml. El contenido de monómero de los lotes de 150 mg/ml fue comparable con el de los lotes de 100 mg/ml.

Las especies de agregados predominantes en cada uno de los lotes tuvo un coeficiente de sedimentación coherente con el dímero de anticuerpo. Esto es coherente con los resultados de SEC-MALS, que indican que el máximo de agregados de la SEC está compuesto principalmente del dímero de anticuerpo (ver la sub-sección anterior). Los niveles bajos de dos especies de agregados más grandes que tuvieron coeficientes de sedimentación coherentes con el trímero y tetrámero, también se observaron en cada uno de los lotes mediante AUC. El contenido de dímero, trímero, y tetrámero de los lotes de 150 mg/ml fueron comparables con los de los lotes de 100 mg/ml. 5.6.11. SDS-PAGE reducida cuantitativa La pureza se determinó por SDS-PAGE al usar 4-20% de geles de tris-glicina (comúnmente 14%) con tinción azul coloidal. Las muestras se analizaron bajo condiciones de reducción con una carga de muestra de 10 g. La pureza se calculó dividiendo la suma del área de banda de cadena pesada y cadena ligera por el área de banda total según lo medido por la densitometría.

Según lo mostrado en la siguiente tabla 22, los lotes de 150 mg/ml son de pureza elevada y comparable con los lotes de 100 mg/ml.

Tabla 22: Resultados de SDS-PAGE reducida cuantitativa 5.6.12. SDS-PAGE cualitativa La pureza de DAC HYP se determinó mediante electroforesis en gel reducida y no reducida. 14% o 8-16% de geles de Tris-glicina prefabricados se utilizaron para el análisis. Las alícuotas de los dos lotes de formulación de DAC HYP a 150 mg/ml se compararon con un lote de referencia, según lo descrito previamente. Los geles reducidos y no reducidos que analizan la pureza de DAC HYP se muestran en la figura 17. El patrón de banda de los lotes de 150 mg/ml fue comparable con el del estándar de referencia RS0801, sin nuevas bandas detectadas en los lotes de 150 mg/ml. 5.6.13. Cromatografía de intercambio catiónico La distribución de la isofornia de carga del los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y 100 mg/ml se evaluaron al usar la cromatografía de intercambio catiónico (CEX, por sus siglas en inglés). La CEX se realizó al usar una columna de intercambio catiónico débil no porosa funcionalizada con carboxilato con detección a 220 nm. 100 µ? de muestra de prueba (1 mg/ml de anticuerpo disuelto en el amortiguador A) se disolvieron nuevamente a temperatura ambiente en una columna ProPac WCX-10 (Dionex Coporation) equipada con una columna de protección ProPac WCX-10G (Dionex Corporation) al usar el siguiente gradiente de separación (la columna se equilibra con el amortiguador A).

Tiempo (min.) %de %de Caudal (ml/min) amortiguador A amortiguador B 0.0 100 0 1 60.0 40 60 1 80.0 0 100 1 85.0 0 100 1 85.1 100 0 1 100.0 100 0 1 Amortiguador A = 15 mM de fosfato de sodio, pH 5.9 Amortiguador B = 250 mM de NaCI, 15 mM de fosfato de sodio, pH 5 Según lo mostrado en la figura 18, los cromatogramas de la CEX de los lotes de 150 mg/ml son coherentes con los del estándar de referencia RS0801, sin nuevos isoformas de carga detectados en los lotes de 150 mg/ml. Las cinco isoformas principales presentes en los cromatogramas de CEX son debido a la heterogeneidad en las terminales N de cadena pesada e incluyen: 1) dos residuos de piroglutamato (pE/pE, por sus siglas en inglés); 2) un residuo de piroglutamato y un residuo de glutamina (pE/Q, por sus siglas en inglés); 3) un residuo de piroglutamato y una secuencia VHS (péptido señal de VHS truncado que precede el residuo de glutamina de terminal N de la cadena pesada madura) (pE/VHS, por sus siglas en inglés); 4) un residuo de glutamina y una secuencia VHS (Q/VHS, por sus siglas en inglés); 5) dos secuencias VHS (VHS/VHS, por sus siglas en inglés). Las isoformas de Usina (K, por sus siglas en inglés) de terminal C también se disuelven nuevamente y se identifican en la figura 18. Cada una de las isoformas de terminal N descritas anteriormente pueden existir como diferentes isoformas de terminal C (0, 1, o 2 K). Debido a la complejidad de la mezcla, las isoformas de Usina de terminal C son solamente disueltas nuevamente de manera clara y mensurable para las isoformas principales pE/pE y pE/VHS al usar el método descrito.

Los resultados cuantitativos de la isoforma de terminal N y C se proporcionan para los lotes de 150 mg/ml y 100 mg/ml en las tablas 23 y 24, respectivamente, donde el porcentaje reportado se basa en el porcentaje del área debajo de la curva (AUC, por sus siglas en inglés) del máximo específico con respecto a la AUC total de todos los máximo.

Tabla 23: Resultados de CEX - Isoformas de terminal N pE/pE = Dos residuos de piroglutamato; pE/Q = Un residuo de piroglutamato, un residuo de glutamina; pE/VHS = Un residuo de piroglutamato, uno péptido señal truncado; Q/VHS = Un residuo de glutamina, un péptido señal truncado; y VHS/VHS = dos péptidos señal truncados.

Tabla 24: Resultados de CEX— Isoformas de terminal C 0K = Ningún residuo de lisina de terminal C en la cadena pesada 1K = Residuo de lisina de terminal C en una cadena pesada 2K = Residuo de lisina de terminal C en ambas cadenas pesadas 5.6.14. Mapeo de oligosacárido Las distribuciones de oligosacárido de los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y 100 mg/ml se evaluaron mediante el mapeo de oligosacárido. Los oligosacáridos ligados a N se liberaron de manera enzimática de la cadena pesada Asn296 al usar la amidasa PNGaseF. Los oligosacáridos se derivaron con una etiqueta fluorescente (en este caso ácido antranílico) y separaron posteriormente del anticuerpo a través de una membrana de nilón. Los glicanos ligados a N derivados divididos se disolvieron nuevamente a 50°C en una columna de 250 x 4.6 Asahipak Amino NH2P-504E unida a amida polimérica (5 pm de tamaño de partícula, Phenomenex, cat. No. CHO-2628) con detección fluorescente, al usar el siguiente gradiente de elución (al usar un volumen de inyección de muestra de 100 µ?; la columna se equilibra con 85% de amortiguador A/15% de amortiguador B).

Tiempo (min.) %de %de Caudal (ml/min) amortiguador amortiguador A B 2 85 15 10 80 20 60 55 45 70 5 95 75 5 95 76 85 15 90 85 15 Amortiguador A = 1% v/v de tetrahidrofurano, 2% v/v de ácido acético en acetonitrilo Amortiguador B = 1% v/v de tetrahidrofurano, 5% v/v de ácido acético, 3% v/v de trietilamina en agua Los cromatogramas que comparan los lotes de 150 mg/ml con el estándar de referencia RS0801 se muestran en la figura 19. Los máximo de oligosacárido que constituyen por lo menos 1.0% del área máxima total se etiquetan y reportan a continuación en la tabla 25.

Tabla 25: Resultados del oligosacárido G0-G1cNAc: Estructura de núcleo biantenario con fucosa unida a la N-acetilglucosamina ligada a N, una N- acetilglucosamina en una ramificación de la estructura de núcleo y ninguna galactosa terminal.

GO: Estructura de núcleo biantenario con fucosa unida a la N-acetilglucosamina ligada a N, una N-acetilglucosamina en cada ramificación de la estructura de núcleo y ninguna galactosa terminal.

G1: Estructura de núcleo biantenario con fucosa unida a la N-acetilglucosamina ligada a N, una N-acetilglucosamina en cada ramificación de estructura de núcleo y galactosa terminal en una ramificación de la estructura de núcleo.

Todos los lotes consisten principalmente de G0 y G0-GlcNAc (G0 que carece GIcNAc en una ramificación de la estructura biantenaria), que es representativa del proceso de DAC HYP. Los oligosacáridos sialilados se eluyen a aproximadamente 68 minutos y están por debajo de 1.0% en todos los lotes probados. El oligosacárido no caracterizado referido como el máximo 3 estuvo presente en abundancia similar en todos los lotes probados. 5.6.15. Oxidación Los lotes de DAC HYP se evaluaron para determinar la oxidación potencial de metionina, mediante la supervisión de los péptidos trípticos oxidados y no oxidados presentes en los mapas de péptido. Las áreas máximas de las formas no oxidadas y oxidadas de cada péptido que contuvo metionina se determinaron la usar los cromatogramas iónicos extraídos de los espectros de masa. Para cada residuo de metionina, el porcentaje de metionina oxidada se calculó al dividir el área máxima de los espectros de masa del péptido oxidado por la suma de las áreas máximas de los péptidos oxidados y no oxidados.

Según lo mostrado en la siguiente tabla 26, fueron comparables los resultados de oxidación de metionina para los lotes de 150 mg/ml y cinco lotes de 100 mg/ml.

Tabla 26: Resultados de oxidación (LC = cadena ligera; HC = cadena pesada; M = metionina) La cadena pesada Met251 y Met427 es la más propensa y exhibe el grado de oxidación más grande. Entre los lotes probados concurrentemente para evaluar la comparabilidad, los niveles de oxidación para Met251 y Met427 no excedieron de 4.8% y 1.8%, respectivamente. 5.6.16. Potencia de unión (unión de CD25) Los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y 100 mg/ml se evaluaron para unir a la subunidad alfa del receptor IL-2 (CD25) a través de ELISA como una medición de la potencia como parte de la prueba de liberación. Las placas de microtítulo se inmovilizaron con CD25 soluble e incubaron con cantidades variables de DAC HYP. El DAC HYP unido se detectó al usar un anticuerpo IgG anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante con sustrato de 3,3',5,5'-tetra-metilbencidina. Los valores de absorbancia resultantes se trazaron contra log i0 de la concentración de DAC HYP al usar un ajuste de parámetros y los valores de potencia relacionados al porcentaje se generaron al usar el análisis de línea paralela.

Los resultados de sustancia de fármaco se presentan brevemente en la siguiente tabla.

Tabla 27: Potencia mediante los resultados de ELISA Los resultados de potencia de unión de los lotes de 150 mg/ml fueron comparables con los de los lotes de 100 mg/ml. 5.6.17. Resonancia de plasmón superficial (unión a CD25) El análisis de resonancia de plasmón superficial se realizó para determinar la constante de afinidad (KD, por sus siglas en inglés) para la interacción de unión de DAC HYP a la subunidad alfa del receptor IL-2 (CD25).

El anticuerpo IgG Fe anti-humano de cabra se inmovilizó en una superficie de chip para capturar las muestras de DAC HYP, después de lo cual CD25 soluble se inyectó a varias concentraciones en duplicado sobre el DAC HYP capturado al usar un método automatizado. Los datos de unión se recolectaron y corrigieron al usar una célula de flujo de referencia y un blanco de amortiguador, y se ajustan con el software BIA Evaluation al usar un modelo de Langmuir 1:1 para obtener las constantes de equilibrio.

Los resultados para los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y para el estándar de referencia RS0801 se presentan brevemente en la tabla 28.

Tabla 28: Resultados de la resonancia de plasmón superficial Los valores de la constante de asociación (ka, por sus siglas en inglés), constante de disociación (kd, por sus siglas en inglés), y constante de afinidad (KD, por sus siglas en inglés) de los lotes de 150 mg/ml, fueron comparables a los del estándar de referencia RS0801. 5.6.18. Potencia funcional Los lotes de DAC HYP a 150 mg/ml y 100 mg/ml se evaluaron para determinar la potencia funcional como parte de la prueba de liberación. El análisis de potencia funcional mide la inhibición de la proliferación de células T inducida por IL-2 mediante la unión de DAC HYP a la subunidad alfa del receptor IL-2 (CD25). En presencia de IL-2, las cantidades variantes de DAC HYP se incubaron con las células KIT-225 K6 (Hori y colaboradores, 1987, Blood 70:1069-1072) que expresan el receptor IL-2. La inhibición de la proliferación de células T por DAC HYP se detectó posteriormente al usar azul de Alamar. Los valores de fluorescencia resultantes se trazaron contra log10 de las concentraciones de DAC HYP al usar un ajuste de 4 parámetros y los valores de potencia relacionados con el porcentaje se generaron al usar el análisis de línea paralela.

Los resultados de potencia funcional se presentan brevemente en la tabla 29.

Tabla 29: Resultados de potencia funcional Los resultados de potencia funcional de los lotes de 150 mg/ml fueron comparables a los de los lotes de 100 mg/ml. 5.6.19. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo Dos lotes de formulaciones de DAC HYP a 150 mg/ml se evaluaron con relación a las del estándar de referencia RS0801 de DAC HYP a 100 mg/ml.

Las células KIT-225 K6 que expresan el receptor IL-2 se etiquetaron con 51Cr, e incubaron posteriormente con DAC HYP. Las células efectoras humanas (PBMC, por sus siglas en inglés) se agregaron en cantidades variantes para alcanzar diferentes relaciones de la célula efectora a la célula objetivo (KIT-225 K6). Los monocitos que contienen el receptor Fe interactúan con el dominio de Fe de DAC HYP y posteriormente causan la lisis de la célula objetivo. El grado de citotoxicidad se determinó midiendo la liberación de 51Cr de las células objetivo y se expresó como el porcentaje de lisis celular máxima.

Las PBMC de múltiples donadores se utilizaron para cada muestra. Para cada donador, el porcentaje de actividad de ADCC de la muestra se calculó con relación al del estándar de referencia RS0801 basado en el porcentaje de citotoxicidad. Los resultados de ADCC se presentan brevemente en la siguiente tabla 30.

Tabla 30: Resultados de ADCC Las curvas de respuesta para los lotes de 150 mg/ml, estándar de referencia RS0801, anticuerpos de control positivos y negativos y un control sin anticuerpo (para la citotoxicidad celular independiente del anticuerpo (AlCC, por sus siglas en inglés)) se muestran en la figura 20.

La actividad de ADCC de los lotes de 150 mg/ml fue comparable con la del estándar de referencia RS0801. 5.6.20. Proteína A residual La proteína A residual se puede determinar mediante un método de ELISA, donde los estándares, controles de muestra, blancos de placa, y muestras de prueba se diluyen con un amortiguador de desnaturalización y se colocan en un baño de agua hirviendo para disociar la proteína A y desnaturalizar y precipitar el daclizumab. Después de hervir, los estándares, controles, y muestras se enfrían, centrifugan, y agregan a una placa de microtítulo recubierta con anticuerpo de captura anti-Proteína A policlonal. La proteína A residual presente en las muestras entonces se detecta al usar un anticuerpo anti-proteína A biotinilado en tándem con sustrato de estreptavidina de fosfatasa alcalina y fosfato de p-nitrofenilo (PNPP, por sus siglas en inglés). La placa se analiza en un lector de placa espectrofotométrico y se genera una curva estándar log-log, contra la cual se determina la concentración de proteína A. Los resultados de la muestra de prueba se reportan en unidades de partes por millón (ppm, por sus siglas en inglés). Los resultados de las partes por millón se calculan al dividir el resultado de ng/ml de proteína A por la concentración de anticuerpo de la muestra de prueba en mg/ml. 5.6.21. Contenido de ADN La detección de ADN de ratón se determina en un laboratorio contratado al usar un método de prueba cuantitativo de reacción en cadena de polimerasa (Q-PCR, por sus siglas en inglés). En el método, la muestra se somete a la extracción de ADN. El extracto de muestra entonces se analiza mediante Q-PCR al usar los cebadores y sondas específicas de ratón para amplificar un fragmento específico de un elemento repetitivo del ADN de ratón. La amplificación de ADN da lugar a una señal de fluorescencia que se se detecta. El ADN en la muestra se mide de manera cuantitativa mediante la comparación con una curva estándar generada al usar cantidades conocidas de ADN de ratón. Los resultados se expresan en maximogramos de ADN por miligramo de anticuerpo. El contenido promedio de ADN en varios lotes de producto de fármaco de DAC HYP se presenta brevemente en la tabla 17. 5.6.22. Proteínas de célula hospedadora (HCP, por sus siglas en inglés) Las proteínas de célula hospedadora residuales en el producto se cuantifican al usar un kit comercialmente disponible. Un anticuerpo policlonal de cabra purificado por afinidad para el Usado de células NSO, se utiliza para la captura y detección de HCP de NSO. El estándar de HCP se produce al recolectar el material de cosecha sin células de una operación de producción simulada. Una curva estándar se prepara al usar un estándar de trabajo de HCP y las muestras que contienen la HCP se diluyen en serie para alcanzar el intervalo de la curva estándar. Los estándares, controles de muestra, y muestras de prueba se agregan a una placa recubierta con anticuerpo policlonal anti-NSO HCP. Las proteínas de célula hospedadora entonces se detectan con un anticuerpo policlonal anti-NSO HCP conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) en tándem con sustrato de 3,3',5,5'-tetra-metilbencidina (TMB, por sus siglas en inglés). La placa entonces se analiza en un lector de placa espectrofotométrico y un ajuste de curva de cuatro parámetros se genera para cuantificar la cantidad de MCP en las muestras.

Los resultados para el análisis ELISA de las HCP de NSO se reportan en unidades de partes por millón (ppm, por sus siglas en inglés). Los resultados de las partes por millón se calculan dividiendo el resultado de ng/ml de HCP por la concentración de anticuerpo en mg/ml. Las HCP promedio de varios lotes de producto de fármaco de DAC HYP se presentan brevemente en la tabla 17. 5.6.23. Concentración de polisorbato 80 El polisorbato 80 se cuantifica al usar un método espectrofotométrico que se basa en la formación de un de cobalto-tiocianato coloreado con polisorbato 80. Una curva estándar se construye al usar una serie de estándares de polisorbato 80. La concentración de polisorbato 80 en la muestra se determina a partir de la curva estándar. Los intervalos de concentraciones de polisorbato de varios lotes de producto de fármaco de DAC HYP se presentan brevemente en la tabla 17. 5.6.24. Osmolalidad La osmolalidad se mide al usar un osmómetro de reducción de presión de vapor. Antes del análisis de muestra, el osmómetro se calibra al usar los estándares de osmolalidad que soportan la osmolalidad prevista de la muestra. Los intervalos de osmolalidad de varios lotes de producto de fármaco de DAC HYP se presentan brevemente en la tabla 17. 5.6.25. Conclusiones Los análisis fisicoquímicos y biológicos conducidos proporcionan una evaluación comprensiva de las formulaciones de DAC HYP a 150 mg/ml y DAC HYP a 100 mg/ml. Las características fisicoquímicas y biológicas de todos los lotes probados hasta la fecha son comparables.

Para todos los lotes de DAC HYP, los primeros 15 aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras determinados mediante la secuenciación de terminal N, mapas de péptido y análisis del peso molecular, fueron coherentes con las secuencias genéticas del daclizumab.

Los niveles de agregados y distribución dimensional de las especies de agregados en los lotes de 150 mg/ml y 100 mg/ml probados, fueron comparables según lo determinado por SEC-MALS y SV-AUC, al igual que su pureza según lo probado mediante electroforesis en gel.

La distribución de isoforma de carga de los lotes de 150 mg/ml fue similar a la de los lotes de 100 mg/ml, con solamente diferencias leves en las cantidades relativas de las isoformas de terminal N pE/VHS (lotes de 150 mg/ml = 31% de pE/VHS; lotes de 100 mg/ml = 34 a 42% de pE/VHS) y Q/VHS (lotes de 150 mg/ml = 11 a 12% de Q/VHS; lotes de 100 mg/ml = 4 a 9% de Q/VHS). Las características de DAC HYP son como sigue: Isoformas de terminal N mediante CEX: pE/pE: 31-46% pE/Q: 7-12% pE/VHS: 31-42% Q/VHS: 3-12% VHS/VHS: 1-17% Isoformas de terminal C mediante CEX: OK: 53-80% 1K: 14-28% 2K: 5-19% La distribución de glicanos ligados a N de DAC HYP es como sigue: G0-G1cNAc: 7.2-14.6% GO: 80.9-88.2% Máximo 3: 1.3-1.7% G1: 1.4-3.8 Los niveles de oxidación medidos para DAC HYP fueron bajos.

El DAC HYP es biológicamente activo, según lo confirmado en ELISA y los experimentos de unión a CD25 mediante resonancia de plasmón superficial, así como funcional para inhibir la proliferación de células T inducida por IL-2. El DAC HYP también es caracterizado por un bajo nivel de agregación durante el almacenamiento. 5.7. Estabilidad de DAC HYP Las formulaciones de alta concentración de DAC HYP son estables durante el almacenamiento. Las siguientes tablas proporcionan los datos de estabilidad para lotes de de sustancia de fármaco de DAC HYP a 150 mg/ml.

La siguiente tabla 31 proporciona los datos de estabilidad después del almacenamiento en bolsas de 50 mi a las condiciones recomendadas (2-8°C). La siguiente 32 proporciona los datos de estabilidad acelerada después del almacenamiento en bolsas de 50 mi a 23-27°C. La siguiente tabla 33 proporciona los datos de estabilidad bajo tensión.

Tabla 31: Estabilidad primaria en tiempo real de la sustancia de fármaco de DAC HYP, 150 mg/ml (lote A) Tabla 31 (continuación) a. Criterios de paso: Líquido sin color, claro a ligeramente opalescente, esencialmente libre de partículas visibles. b. Criterios de paso: Perfil de cromatógrama coherente con la referencia.

*SDS-PAGE (tinción azul coloidal) Tabla 32: Estabilidad acelerada primaria de la sustancia fármaco de DAC HYP, 150 mg/ml (lote A) Tabla 32 (continuación) a. Criterios de paso: Líquido sin color, claro a ligeramente opalescente, esencialmente libre de partículas visibles. b. Criterios de paso: Perfil de cromatógrama coherente con la referencia.

*SDS-PAGE (tinción azul coloidal) Tabla 33: Estabilidad primaria bajo tensión de la sustancia de fármaco de DAC HYP, 150 mg/ml (lote A) Tabla 33 (continuación) a. Criterios de paso: Líquido sin color, claro a ligeramente opalescente, esencialmente libre de partículas visibles. b. Criterios de paso: Perfil de cromatógrama coherente con la referencia.

*SDS-PAGE (tinción azul coloidal) 5.8. Comparación entre diferentes formas de daciizumab Hoffman-La Roche, Inc. ("Roche") fabricó una formulación intravenosa de un daciizumab comercializada como ZENAPAX™ para el tratamiento del rechazo de aloinjerto que se se ha discontinuado. DAC Penzberg es una formulación subcutánea de daclizumab a 100 mg/ml usada en ensayos clínicos por PDL BioPharma (ver el estudio CHOICE descrito en la siguiente sección 5.9.1).

Una comparación entre las formulaciones de DAQ HYP, DAC ZENAPAX y DAC Penzberg se muestra en la tabla 34. En la tabla, el amortiguador de formulación es el amortiguador en el cual el DAC se diafiltró para producir la última formulación. Por consiguiente, las concentraciones conocidas son concentraciones nominales.

Tabla 34: DAC HYP contra DAC ZENAPAX y DAC Penzberg Varias características de DAC HYP se compararon con las de DAC ZENAPAX y DAC Penzberg.

Una comparación entre la glicosilación de DAC HYP contra DAC ZENAPAX se muestra en la figura 21. El análisis de los lotes ejemplares de las tres formas de daclizumab se establece en la tabla 35.

Tabla 35: Comparación de la glicosilación de DAC HYP contra DAC ZENAPAX contra DAC Penzberg DAC HYP también tiene niveles significativamente más bajos de los glicosilos de mañosa (por ejemplo, Man5, Man6, Man7) y niveles más bajos de glicosilos sialilados que DAC ZENAPAX (ver, por ejemplo, la figura 21).

La citotoxicidad mediada por las células dependiente del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) es un análisis ¡n vitro que se puede utilizar para determinar la actividad dependiente de Fe y los efectos citotóxicos potenciales de la unión de anticuerpo-objetivo. Al usar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) de seis donadores sanos como las células efectoras y la línea celular KIT225/K6 que expresa CD25 como las células objetivo, la actividad de ADCC de varias preparaciones de daclizumab se probó en un formato variable de la relación de célula efectora a célula objetivo o un formato variable de la concentración de anticuerpo.

Para el formato de la relación de la célula efectora a la célula objetivo, las células KIT225/K6 etiquetadas con 51Cr (12,500 células/pozo) se pre-incubaron con 1 pg/ml de anticuerpo (concentración final) durante 30 minutos a 4°C en placas de 96 pozos con fondo en V en un volumen de 100 µ? de medio de análisis de ADCC (que contiene 435 mi de RPMI-1640; 5.0 mi de L-glutamina; 50 mi de suero vacuno fetal desactivado por calor; 500 µ? de 1000x 2-mercaptoetanol; 5.0 mi de penicilina-estreptomicina (100x); y 5.0 mi de HEPES (1 M de solución madre) por 500 mi); las células de control se incubaron en medio de análisis de ADCC en ausencia de anticuerpo para la determinación subsecuente de la liberación de 5 Cr independiente del anticuerpo.

Las PBMC (efectoras) se diluyeron en serie en medio de análisis de ADCC en una placa de polipropileno de 96 pozos separados, que produce concentraciones de células por 100 µ? de 6.25 x 105 células, 3.13 x 105 células, 1.56 x 105 células, 7.81 x 104 células, o 3.91 x 104 células. Un volumen de 100 µ? por pozo de la suspensión de PBMC se agregó a las placas que contuvieron las KIT225/K6 etiquetadas con 5 Cr, que produjo relaciones de efectoras a objetivo (E:T, por sus siglas en inglés) de 50:1, 25:1, 12.5:1, 6.25:1 y 3.13:1. Además, un volumen de 100 µ? por pozo de medio de análisis de ADCC solo (no efector) se agregó a KIT225/K6 etiquetadas con 51Cr + mAbs, para determinar la liberación espontánea de 51Cr. Las placas de análisis se hicieron girar a 50 RCF durante 2 minutos e incubaron a 37°C en una incubadora a 7.5% de C02 durante 4 horas.

Treinta minutos antes del final de la incubación de cuatro horas, un volumen de 25 µ? de 8% de TritonX-100 se agregó a los pozos de control apropiados para determinar la liberación máxima de 51Cr de las células objetivo. Al completar la incubación de cuatro horas, las placas se hicieron girar a 350 RCF durante 5 minutos y un volumen de 100 µ? de sobrenadante de cada pozo se transfirió a los mini-tubos. Cada mini-tubo se insertó en un frasco de centelleo y contó durante 1 minuto en un contador Beckman Gamma 5500B, o equivalente.

Para el formato variable de concentración de anticuerpo, las células KIT225/K6 etiquetadas con 5 Cr (12,500 células/pozo; objetivo) se pre-incubaron con varias dosis de anticuerpos (5, 1, 0.2, 0.04, 0.008, y 0.0016 pg/ml) de mAbs (concentración final) durante 30 minutos a 4°C en placas de 96 pozos de fondo en V en un volumen de 100 µ? de medio de análisis de ADCC. Las células de control se incubaron con el medio de análisis de ADCC solo (sin mAbs) para la determinación subsecuente de la liberación 51 Cr independiente del anticuerpo.

Las PBMC (efectoras) se diluyeron en serie en medio de análisis de ADCC, en una placa de polipropileno de 96 pozos separados a una concentración de 3.13 x 105 células/100 µ?. Un volumen de 100 µ? por pozo de la suspensión de PBMC se agregó a las placas que contuvieron las KIT225/K6 etiquetadas con 51Cr + mAbs, que produjo una relación de efectora a objetivo (E:T, por sus siglas en inglés) de 25:1. Además, un volumen de 100 µ? por pozo de medio de análisis de ADCC solo (sin efectoras) se agrego a las KIT225/K6 etiquetadas con 51Cr + mAbs, para determinar la liberación espontánea de 51Cr. Las placas de análisis se hicieron girar a 50 RCF durante 2 minutos e incubaron a 37°C en una incubadora a 7.5% de C02 durante 4 horas.

Treinta minutos antes del final de la incubación de cuatro horas, un volumen de 25 µ? de 8% de TritonX-100 se agregó a los pozos de control apropiados para determinar la liberación máxima de 51Cr de las células objetivo. Al completar la incubación de cuatro horas, las placas se hicieron girar a 350 RCF durante 5 minutos y un volumen de 100 µ? de sobrenadante de cada pozo se transfirieron a los mini-tubos. Cada mini-tubo se insertó en un frasco de centelleo y contó durante 1 minuto en un Beckman Gamma 5500B, o equivalente.

Los resultados de ADCC se muestran en la figura 22A (formato variable de la relación de la célula efectora a la célula objetivo) y figura 22B (formato variable de la concentración de anticuerpo). Estos datos muestran que la actividad máxima de ADCC alcanzada con DAC HYP probada a las concentraciones evaluadas, fue aproximadamente 30-40% más baja que la actividad producida por la misma concentración de DAC ZENAPAX y DAC Penzberg.

Una comparación de los perfiles de isoforma de carga (que corresponden a las variantes de terminal N) de DAC HYP contra DAC ZENAPAX contra DAC Penzberg se muestra en la figura 23. 5.9. Ensayos clínicos de DAC HYP 5.9.1. Estudio CHOICE El ensayo CHOICE fue un ensayo controlado por placebo, doble ciego, aleatorio, de 2 fases del daclizumab agregado a la terapia del interferón beta en 230 pacientes con MS recidivante. El ensayo probó dos regímenes de dosificación de 100 mg/ml de DAC Penzberg (ver la sección 5.8 anterior para una descripción del producto) administrado como inyección subcutánea: 1 mg/kg de daclizumab administrado cada cuatro semanas y 2 mg/kg de daclizumab administrado cada dos semanas. Los resultados del estudio mostraron que la adición de daclizumab, administrado a 2 mg/kg cada dos semanas a la terapia del interferón beta, las nuevas o agrandadas lesiones con intensificación de gadolinio en la semana 24, en comparación con la terapia de interferón beta sola.

Los resultados del estudio CHOICE se describen en Wynn y colaboradores, 2010, Lancet Neurol. 9(4):381-90. El tratamiento con daclizumab fue generalmente bien tolerado. Los acontecimientos adversos comunes fueron similares en todas las ramificaciones del tratamiento. Los acontecimientos adversos de grado 3 se observaron en el 24 por ciento de los pacientes tratados con DAC/IFNp y en el 14 por ciento de los pacientes tratados con placebo/IFNp. Los acontecimientos adversos de grado 3 más frecuentes fueron las infecciones, que ocurrieron en el 7 por ciento de los pacientes tratados con DAC/IFNP y en el 3 por ciento de los pacientes tratados con placebo/???ß. No hubo infecciones oportunistas o muertes, y todas las infecciones se resolvieron con terapias estándar.

El ensayo CHOICE demostró que, en los pacientes con MS en un antecedente de terapia con IFN -a1, el daclizumab fue bien tolerado y causó una reducción dependiente de la dosis en las nuevas/agrandadas lesiones con intensificación de gadolinio (Gd + ) del 72% en comparación con IFN -a1 solo. La eficacia clínica se asoció con a expansión notable de las células inmunoreguladoras de eliminación natural (NK, por sus siglas en inglés) de CD56 right. 5.9.2. Estudio SELECT Un estudio de oscilación de dosis controlado por placebo doble ciego aleatorio (SELECT) se condujo para determinar la seguridad y eficacia de dos diferentes niveles de dosificación de DAC HYP.

Descripción. El estudio se condujo en 76 centros en la República Checa, Alemania, Hungría, India, Polonia, Rusia, Ucrania, y Reino Unido. El cuidado de cada paciente implicó un neurólogo tratante, una enfermera tratante (o coordinador de estudio), un neurólogo examinador, un técnico de MRI, y un farmacéutico (o encargado autorizado). Un sistema interactivo centralizado de respuesta por voz se utilizó para la distribución aleatoria a través de todos los sitios. Un análisis temporal de futilidad definido por protocolo se realizó después de que 150 pacientes completaron la visita de la semana 24.

Pacientes. Los criterios de elegibilidad incluyeron a los pacientes con 18-55 años de edad con esclerosis múltiple recidivante-remitente definida clínicamente (de acuerdo con los criterios de 2005 de McDonald #1-4; ver, Polman y colaboradores, 2005 Ann Neurol 58:840-846), una escala de estado de discapacidad expandida (EDSS, por sus siglas en inglés) de línea base de 0-0.50 (Kurtzke, 1983, Neurology 33(11 ):1444-52) y por lo menos una recaída de MS 12 meses antes de la distribución aleatoria o una nueva lesión Gd+ en la MRI cerebral realizada en el periodo de 6 semanas antes de la distribución aleatoria, que se seleccionaron de manera aleatoria para recibir DAC HYP (150 mg o 300 mg) o placebo como inyección subcutánea una vez cada 4 semanas durante 52 semanas. Los Pacientes con potencial de maternidad necesitaron practicar la contracepción eficaz.

Se excluyeron a los pacientes si tuvieron MS primaria progresivo, secundaria progresivo, o progresiva recidivante, un historial de afección, reacciones alérgicas o anafilácticas severas o hipersensibilidad conocida al fármaco, u otras condiciones médicas significativas que, de acuerdo con la opinión del investigador, imposibilitarían la administración de DAC HYP. Los criterios de exclusión adicionales incluyeron el tratamiento previo con DAC HYP o ZENAPAX™, irradiación linfoide total, cladribina, mitoxantrona, células T o vacunación del receptor de células T o cualquier mAb terapéutico, excepto natalizumab o rituximab. Al momento de la distribución aleatoria, los pacientes no pudieron haber recibido el tratamiento con ciclofosfamida o rituximab en un periodo previo de un año; natalizumab, ciclosporina, azatioprina, metotrexato, inmunoglobulina intravenosa, plasmaféresis o citaféresis en un periodo previo de 6 meses; o vacuna de virus vivo, tratamiento con acetato de glatirámero, I F N ß , interferón-alfa, 3 meses antes de la distribución aleatoria; o corticosteroides, 4-aminopiridina o productos relacionados en un periodo previo de 30 días.

Las características de los grupos fueron como sigue: Placebo 150 mg 300 mg (n=204) (n=208) (n=209) Datos demográficos Edad, años, promedio (SD) 36.6 (9.0) 35.3 (8.9) 35.2 (8.7) Género, femenino, n (%) 128 (63) 140 (67) 134 (64) Raza, caucásico, n (%) 197 (97) 202 (97) 200 (96) Características de la enfermedad MS Ninguna terapia anterior para MS, n 155 (76) 155 (75) 162 (78) Placebo 150 mg 300 mg (n=204) (n=208) (n=209) Años desde la diagnosis de MS, promedio (medio) 4.1 (2.0) 4.5 (3.0) 3.7 (3.0) Número de recaídas más allá de un año, promedio (SD) 1.3 (0.6) 1.4 (0.7) 1.3(0.7) EDSS de línea base, promedio (SD) 2.7 (1.2) 2.8(1.2) 2.7 (1.2) Lesiones cerebrales en MRI =1 lesiones de Gd+, n (%) ** 90 (44) 106 (51) 74 (35) No. de lesiones de Gd+, promedio (SD) 2 (4.5) 2.1 (3.5) 1.4 (3.3) No. de lesiones hiperintensas en T2, promedio (SD) 40 (32) 45 (35) 36 (31) DAC, daclizumab; HYP, proceso de alto rendimiento; SD, desviación estándar; MS, esclerosis múltiple; EDSS, escala ampliada del estado de discapacidad; Gd + , intensificación de gadolinio.

*Pacientes que no habían recibido el tratamiento previo de MS a excepción de los esteroides.

**Placebo n = 203, DAC HYP 150 a mg n = 206, n = 206, DAC HYP a 300 mg (todos los valores p fueron >0.05 para la comparación entre grupos).

Puntos finales. El objetivo primario de este estudio fue determinar si la monoterapia de DAC HYP redujo la recurrencia de MS según lo definido por la tasa de recurrencia anual (ARR, por sus siglas en inglés) en la semana 52. Las recaídas se definieron como nuevos o recurrentes síntomas neurológicos (no asociados a la fiebre o infección), últimas >24 horas, y acompañados por nuevos hallazgos neurológicos durante la evaluación por el neurólogo examinador. Un Comité Independiente de Evaluación Neurológica (INEC, por sus siglas en inglés), que consiste de tres neurólogos de evaluación ciega de MS, evaluaron todas las recaídas sospechosas para juzgar si la definición de protocolo de la recaída de MS fue cumplida. Solamente las recaídas aprobadas por el INEC fueron incluidas en el análisis primario.

Los objetivos secundarios fueron determinar si el DAC HYP fue eficaz en la reducción del número de nuevas lesiones acumulativas de Gd+ en las exploraciones cerebrales de MRI realizadas en las semanas 8, 12, 16, 20 y 24 en un subconjunto de pacientes; reducción del número de nuevas o recientemente agrandadas lesiones hiperintensas en 12 en la semana 52; reducción de la proporción de pacientes recidivantes entre la línea base y la semana 52; y mejora de la calidad de vida (QoL, por sus siglas en inglés), según lo medido por el cambio del conteo de impacto físico de la línea base en la escala de impacto de esclerosis múltiple de 29 artículos (MSIS-29, por sus siglas en inglés) (Hobart y colaboradores, 2001, Brain 124(Pt 5):962-73) en la semana 52. La progresión de discapacidad confirmada se determinó por el cambio del conteo en EDSS entre la línea base y la semana 52 (aumento de 1.0 punto en EDSS para EDSS de línea base =1.0 o aumento de 1.5 puntos para EDSS de línea base = 0 que se mantuvo durante 12 semanas). Las evaluaciones de EDSS se condujeron cada 12 semanas, y en las semanas 20, 52, 60 y 72.

Las puntos finales adicionales de QoL fueron la evaluación global del sujeto del bienestar, según lo determinado por la escala análoga visual de EQ (EQ-VAS, por sus siglas en inglés) (EuroQol una nueva instalación para la medición de la calidad de vida relacionada a la salud, 2011, obtenida el 17.11.11, en http://www.euroqol.org/); y cambio en el examen con respecto a la salud EQ-5D (EuroQol una nueva instalación para la medición de la calidad de vida relacionada con la salud, 2011, obtenida el 17.11.11, en http://www.euroqol.org/); examen SF-12 con respecto a la salud de la forma corta de 12 artículos (Ware y colaboradores, 1996, Medical Care 34(3):220-33) y la escala psicológica MSIS-29 en la semana 52 (Hobart y colaboradores, 2001, Brain 124(Pt 5):962-73).

Las puntos finales adicionales de MRI fueron el número de lesiones Gd+ en la semana 52, el volumen de las lesiones hiperintensas en T2 totales y nuevas o recientemente agrandadas en las semanas 24 y 52, el volumen de lesiones hipointensas en T1 totales y nuevas "agujeros negros" (definidas como lesiones que fueron iso/hipointensas en la materia gris y que no mejoraron después de la administración de gadolinio) en las semanas 24 y 52, y el cambio de porcentaje en el volumen total del cerebro determinado por el método SIENA (Smith y colaboradores, 2001, J Comput Assist Tomogr 25(3):466-75).

Los subconjuntos de linfocitos se midieron en múltiples puntos de tiempo al usar un análisis validado FACS. Las células NK CD56briQht se definieron como linfocitos CD3-/CD16+/CD56bright. La inmunogenicidad a DAC HYP se determinó al usar un ELISA estándar para analizar los anticuerpos antifármaco y un análisis celular entonces se utilizó para probar los anticuerpos de neutralización en todas las muestras positivas.

Análisis estadísticos. Un tamaño de muestra de aproximadamente 600 pacientes se seleccionó para tener 90% de capacidad de detectar una reducción del 50% en ARR entre un grupo de tratamiento de DAC HYP y el grupo de placebo, calculado a partir de simulaciones si se asume una distribución binomial negativa con 10% de tasa de abandono, 5% de tasa de error del tipo 1 y una prueba bilateral. ARR en el grupo de placebo se asumió como 0.476, basado en los ensayos recientemente completados en los sujetos con RRMS. Todos los valores p reportados son de dos vías.

El análisis primario evaluó las diferencias en ARR entre cada grupo de DAC HYP contra el placebo. Se omitieron las recaídas que ocurrieron después del tratamiento de rescate con la medicación alternativa de MS. La diferencia se evaluó al usar un ajuste de modelo de regresión binomial negativo para el número de recaídas en el año antes del ingreso al estudio, EDSS de línea base (EDSS =2.5 contra EDSS >2.5) y edad de línea base (=35 contra >35 años). Análisis secundarios probados para las diferencias de tratamiento al usar la regresión binomial negativa (número de nuevas lesiones de Gd+ entre las semanas 8 y 24; el número de lesiones hiperintensa en T2 nuevas o recientemente agrandadas), modelo de peligros proporcionales de Cox (tiempo hasta la primera recaída, tiempo hasta la progresión de la enfermedad), y un análisis del modelo de variación (cambio en EDSS, volumen de las lesiones en T2 nuevas o recientemente agrandadas, volumen de las nuevas lesiones hipointensas en T1, QoL) y un modelo de probabilidades proporcionales (número de nuevas lesiones de Gd+ en la semana 52). La proporción de los pacientes que estuvieron libres de recaídas se calculó de la distribución de curva de supervivencia de Kaplan-Meier.

Para el número acumulativo de nuevas lesiones de Gd + entre las semanas 8 y 24, si un paciente careció de 1 ó 2 exploraciones consecutivas, o todas exploraciones, la última observación distinta a la línea base se continuó, o se utilizó el número promedio de lesiones dentro de cada grupo de tratamiento, respectivamente. Para otros puntos finales de MRI, los datos carentes se atribuiron al usar el promedio dentro del grupo de tratamiento. Para MSIS-29, si el paciente careció de <10 artículos, el promedio de los artículos no carentes se utilizó para atribuir el conteo. Para los pacientes que carecieron de = 10 artículos y para otras medidas de QoL, un modelo aleatorio de gradiente e intercepción se utilizó para calcular los datos faltantes.

La prueba estadística para los puntos finales de eficacia utilizó las comparaciones separadas del grupo de DAC HYP a 300 mg contra placebo y del grupo de DAC HYP a 150 mg contra placebo. Un procedimiento de prueba cerrado secuencial se utilizó para controlar la tasa de error de tipo 1 total debido a las comparaciones múltiples.

Los análisis de eficacia se evaluaron en la población con intención a tratar (ITT, por sus siglas en inglés) que incluyó todos los pacientes que experimentaron la distribución aleatoria. Sin embargo, 21 pacientes de un solo centro de estudio se excluyeron de manera anticipada de la población ITT antes de completar el estudio debido a la evidencia de dosificación incorrecta en el centro, lo cual fue identificado antes de la conclusión del estudio (todos los pacientes en el centro recibieron el tratamiento activo). En un análisis de sensibilidad, todos los análisis de eficacia primarios y secundarios se repitieron al usar todos los pacientes seleccionados de manera aleatoria. Todos los análisis de seguridad se basaron en la población de seguridad, que se definió como todos los pacientes que recibieron por lo menos una dosis de la medicación del estudio y que tuvieron por lo menos una evaluación después de la distribución aleatoria.

Un análisis de futilidad planeado previamente se realizó después de que 150 sujetos completaran la visita de la semana 24, para proporcionar una oportunidad de detenerse si los efectos presumidos del DAC HYP no fueron evidentes. Puesto que la eficacia puede cambiar a través de la duración del estudio, no hubo la intención de detener el estudio de manera temprana debido a la evidencia de superioridad al momento del análisis de futilidad. La futilidad se determinó al calcular por separado la capacidad condicional para el número acumulativo de nuevas lesiones de Gd+ entre las semanas 8 y 24 y el punto final de ARR para cada grupo de dosis. El Comité de Supervisión de Seguridad reviso los datos al momento del análisis y basado en la coherencia total de los datos y de la evaluación del benefició-riesgo, recomendó continuar el estudio.

Resultados de síntesis. Los participantes elegibles se distribuyeron de manera aleatoria de 2/15/2008 a 5/14/2010. Las características de línea base fueron similares a través de los tres grupos de tratamiento, aunque hubo una tendencia de que los pacientes en el grupo de DAC HYP a 150 mg tuvieran más lesiones de Gd+ en T2 y T1 que aquellos en el grupo de DAC HYP a 300 mg. A través de todos los pacientes asignados de manera aleatoria, un total de 577 (93%) completaron el período de tratamiento con proporciones similares de pacientes tratados con DAC HYP y con placebo que completaron el estudio.

Resultados detallados— Eficacia clínica. ARR a 52 semanas (punto final primario) fue menor para los pacientes asignados de manera aleatoria a DAC HYP a 150 mg (0.21) o 300 mg (0.23), comparado con el placebo (0.46; Tabla 36), que representan una reducción de 54% contra el placebo con DAC HYP a 150 mg (95% de Cl, 31% a 69%, p<0.0001), y una reducción de 50% contra el placebo para DAC HYP a 300 mg (95% de Cl, 26% a 66%, p = 0.0002; Tabla 36). Durante 52 semanas, la proporción de pacientes recidivantes en los grupos de DAC HYP a 150 mg (19%) y 300 mg (20%) recayeron contra el 36% en el grupo de placebo (p=0.001 para ambas comparaciones) (tabla 36). En comparación con el placebo, el riesgo de progresión de discapacidad continua de tres meses en la semana 52 se redujo 57% (relación de peligro = 0.43; 95% de Cl, 0.21 a 0.88; p = 0.021) en el grupo de DAC HYP a 150 mg y 43% (relación de peligro = 0.57; 95% de Cl, 0.30 a 1.09; p = 0.091) en el grupo de DAC HYP a 300 mg.

Una mejora relativa de 4.0 en el conteo físico de MSIS-29 en la semana 52, se observó para DAC HYP a 150 mg contra placebo con un cambio menos notable en los pacientes de DAC HYP a 300 mg, (p<0.0008 y p = 0.1284 contra el placebo, respectivamente; Tabla 36). También se observaron las mejoras similares en otras mediciones de calidad de vida relacionada a la salud que incluyen las mediciones de la función física y psicológica y salud total (tabla 36).

Tabla 36. Puntos finales clínicos y de MRI del grupo de tratamiento " DAC HYP Valor P DAC DAC HYP HYP a a150mg 300 mg Placebo 150 mg 300 mg contra contra (n=196) (n=201) (n=203) placebo placebo Clínico Número de recaídas 0 127 (65) 163 (81) 163 (80) 1 52 (27) 33 (16) 33(16) 2 15(8) 5(2) 5(2) 3 2(1) 0 K<D =3 0 0 0 <0.0001 0.0002 0.46 0.21 0.23 ARR durante 52 (0.37- (0.16- (0.17-semanas (95% de Cl) 0.57) 0.29) 0.31) 0.46 0.50 Relación de tasa (95% (0.32- (0.35-de Cl)* 0.67) 0.72) <0.0001 0.0002 DAC HYP Valor P DAC DAC HYP HYP a a 150 mg 300 mg Placebo 150 mg 300 mg contra contra (n=196) (n=201 ) (n=203) placebo placebo % de pacientes que recayeron a 52 semanas 19 20 0.45 0.50 Relación de peligro (0.30- (0.35-(95% de CI)† 0.67) 0.72) <0.0001 0.0003 Progresión de discapacidad en 3 meses, % 5.9 7.8 0.43 0.57 Relación de tasa (95% (0.21- (0.30-de CI)†† 0.88) 1.09) 0.021 0.0905 Cambio promedio de EDSS de línea base en la semana 52 -0.08 0.05 0.0102 0.4874 MRI Nuevas lesiones de Gd+ entre las semanas 8-24 # pacientes con datosU 104 101 102 DAC HYP Valor P DAC HYP HYP a a 150 mg 300 mg Placebo 150 mg 300 mg contra contra (n=196) (n=201 ) (n=203) placebo placebo No. promedio (95% de 4.8 (3.6- 1.5 (1.1- 1.0 (0.7- i)|| 6.4) 2.0) 1.5) <0.0001 <0.0001 % de reducción contra 69 (52.4- 78 (66-placebo (95% de Cl) 80.4) 86.4) Nuevas lesiones de Gd+ en la semana 52 No. de pacientes con datos 195 199 200 No. promedio 1.4 0.3 0.2 <0.0001 <0.0001 Relación de 0.15 0.12 probabilidades (95% de (0.09- (0.07- Cl) 0.25) 0.20) <0.0001 <0.0001 Nuevas/recientemente agrandadas lesiones hiperintensas en T2 en la semana 52 # pacientes 195 199 200 No. promedio (95% de 8.1 (6.7- 2.4 (2.0- 1.7 (1.4- Cl) ** 9.9) 3.0) 2.2) <0.0001 <0.0001 DAC HYP Valor P DAC HYP HYP a a 150 mg 300 mg Placebo 150 mg 300 mg contra contra (n=196) (n=201 ) (n=203) placebo placebo % de reducción contra 70 (59.4- 79 (71.3-placebo, (95% de Cl) 77.9) 84.2) Cambio de porcentaje de línea base en el volumen de las lesiones hiperintensas en T2 en la semana 52 # pacientes 193 198 197 27.3 -11.1 -12.5 Promedio (SD) ** (107.8) (12.1) (12.5) <0.0001 O.0001 Cambio de porcentaje de línea base del volumen de nuevas lesiones hiperintensas en T1 en la semana 52 # pacientes 195 199 200 218.7 116.7 54.8 Promedio (SD) ** (400.2) (276.6) (153.1) <0.0001 <0.0001 Cambio de porcentaje promedio del volumen cerebral completo en la semana 24 # pacientes 194 198 200 -0.32 -0.41 -0.31 Promedio (SD)8 (0.729) (0.769) (0.678) 0.0635 0.6261 Cambio de porcentaje promedio del volumen cerebral completo en la semana 52 # pacientes 194 198 200 DAC HYP Valor P DAC DAC HYP HYP a a 150 mg 300 mg Placebo 150 mg 300 mg contra contra (n=196) (n=201 ) (n=203) placebo placebo -0.74 -0.79 -0.70 Promedio (SD)8 (0.90) (0.83) (0.91 ) 0.3263 0.4117 Calidad de vida MSIS-29, cambio de línea base en la semana 52, promedio (SD) § Conteo de impacto -1.0 físico 3.0 (13.5) (1 1.8) 1.4 (13.5) 0.0008 0.1284 Conteo de impacto -1.8 -0.5 psicológico 0.6 (14.4) (15.8) (15.3) 0.0683 0.4338 Escala análoga EQ- Visual, cambio de linea base en la semana 52, -1.8 promedio (SD) § (13.2) 2.9 (13.3) 1.0 (12.8) <0.0001 índice de salud sumario de EQ-5D, cambio de línea base en la semana -0.04 0.01 -0.02 52, promedio (SD) § (0.20) (0.18) (0.20) 0.0091 0.3538 SF-12, cambio de línea base en la semana 52, promedio (SD) § DAC HYP Valor P DAC HYP HYP a a 150 mg 300 mg Placebo 150 mg 300 mg contra contra (n=196) (n=201) (n=203) placebo placebo Componente físico -0.4 (7.0) 1.2 (7.3) 0.5(7.3) 0.0116 0.1018 Componente mental -1.4 (9.2) 0.7 (9.6) -0.1 (8.6) 0.0118 0.2342 ARR, tasa recidivante anual; MSIS, escala de impacto de esclerosis múltiple; Gd + , intensificación de gadolinio. *los valores P calculados de un modelo de regresión binomial negativo ajustado para el número de recaídas en un período de un año antes del ingreso al estudio, EDSS de línea base (=2.5 contra >2.5), y edad (=35 contra >35).

†Valor P calculado del ajuste de modelo de peligros proporcional de Cox para el número de recaídas en un periodo de un año antes del ingreso al estudio, EDSS de línea base, y edad.

*Conteos más bajos indican la mejora. § alor P calculado al usar el análisis de covariación para la diferencia entre los grupos de tratamiento, controla para el conteo de línea base.

^Sub-estudio de MRI, N = 307 (placebo, n = 104; DAC HYP a 150 mg, n = 101; DAC HYP a 300 mg, n = 102).

"Valor P calculado de un modelo binomial negativo ajustado para el número de línea base de las lesiones de Gd + .

**Valor P calculado de un modelo binomial negativo ajustado para el número de línea base de lesiones en T2.

Valor P calculado del ajuste de modelo de peligro proporcional de Cox para EDSS de línea base y edad.

AValor P calculado de un análisis del modelo de covariación ajustado para EDSS de línea base.

**Valor P calculado de un modelo de probabilidad proporcional ajustado para el número de línea base de las lesiones de Gd + .

"Valor P basado en el análisis de covariación con respecto a los datos clasificados ajustado para el volumen cerebral normalizado de línea base.

MRI. El DAC HYP redujo la actividad de la nueva lesión de MS, según lo definido por MRI, en toda la población del estudio y un subconjunto con MRI mensualmente realizadas entre las semanas 8 a 24 (tabla 36). En contraste con las puntos finales clínicos, los cálculos puntuales de la eficacia fueron marginalmente más fuertes en los grupos de dosis de 300 mg en comparación con los grupos de dosis de 150 mg incluso después el ajuste para los desequilibrios potenciales de línea base. El análisis longitudinal demostró que la actividad de la lesión de Gd+ fue más alta en los grupos de dosis de 150 mg en comparación los grupos de dosis de 300 mg en los primeros meses del tratamiento pero fue similar en la semana 52. (Tabla 36). Los análisis de sensibilidad que incluyeron 21 pacientes de un sitio de estudio excluido produjeron resultados similares para todos los análisis de eficacia.

Seguridad. Los acontecimientos adversos (AE, por sus siglas en inglés) ocurrieron en una proporción similar de pacientes en los grupos de DAC HYP a 150 mg (73%), DAC HYP a 300 mg (76%) y placebo (79%) (tabla 37). Los AE serios (AES, por sus siglas en inglés), ocurrieron en 26% del grupo de placebo, 15% en el grupo de DAC HYP a 150 mg y 17% en el grupo de DAC HYP a 300 mg. Excluyendo las recaídas de S, los AES ocurrieron en 6%, 7% y 9% de los pacientes en cada grupo (tabla 37). Los AE que ocurrieron en >5% de pacientes de DAC HYP se muestran en la tabla 37. La incidencia de infecciones serias fue del 2% en los pacientes tratados con DAC HYP contra el 0% en los pacientes tratados con placebo. Entre los 7 pacientes que tuvieron una infección seria mientras la dosificación estuvo en curso, 1 discontinuó el tratamiento debido a la infección seria y 6 recomenzaron el tratamiento después de aliviar la infección. La incidencia de acontecimientos cutáneos fue de 18% en el grupo de DAC HYP a 150 mg, 22% en el grupo de DAC HYP a 300 mg, y 13% en el grupo de placebo (tabla 37). Los acontecimientos cutáneos serios ocurrieron en el 1% de pacientes tratados con DAC HYP. Un paciente tratado con DAC HYP que se recuperaba de una erupción seria murió debido a una complicación de un absceso del psoas. En la autopsia, un absceso del psoas, que previamente no se había diagnosticado, se encontró la implicación de una arteria mesentérica y que habla dado lugar a la trombosis local y a la colitis isquémica aguda. Cinco afecciones ocurrieron durante el ensayo: dos casos de carcinoma cervical (1 en el grupo de placebo y 1 en el grupo de DAC HYP a 150 mg); un caso de neoplasma de tiroides en el grupo de DAC HYP a 150 mg fue un nódulo de tiroides no serio; y dos casos de melanoma en el grupo de DAC HYP a 300 mg. Los caso de melanoma se trataron con excisión local sin recurrencia reportada.

Tabla 37. Sinopsis de acontecimientos adversos Placebo 150 mg 300 mg (n=204) (n=208) (n=209) Sinopsis de acontecimientos adversos Cualquier acontecimiento adverso, n (%) 161 (79) 151 (73) 159(76) Cualquier acontecimiento adverso serio, n (%) 53(26) 32 (15) 36 (17) Cualquier acontecimiento adverso serio 12(6) 15(7) 19(9) excluyendo la recaída de MS, n (%) Muerte, n 0 1* 0 Acontecimientos adversos comunes que ocurrieron en el >5% de pacientes de DAC HYP durante el tratamiento Recaída de EM, n (%) 76 (37) 43 (21) 41 (20) Nasofaringitis, n (%) 31 (15) 30(14) 29 (14) DAC HYP DAC HYP Placebo 150 mg 300 mg (n=204) (n=208) (n=209) Infección del tracto respiratorio superior, n (%) 14(7) 18(9) 21 (10) Dolor de cabeza, n (%) 20 (10) 18(9) 20(10) Faringitis, n (%) 8(4) 13(6) 13(6) Acontecimientos adversos de interés Infecciones, n (%) 89 (44) 104 (50) 112 (53) Infecciones serias, n (%) 0 6(3) 3(1) Acontecimientos cutáneos, n (%) 27 (13) 38 (18) 45 (22) Reacción de sitio de inyección, ectima, 3(1) 4(2) 4(2) Acontecimientos cutáneos severos, n (%) 0 2(<1) 2(1) Afección, n (%) 1 (<D 2(<1) 2(<1) Incidencia de anormalidades de ALT 1-3x ULN, n (%) 64 (31) 54 (26) 62 (30) 3-5x ULN, n (%) 6(3) 7(3) 6(3) >5x ULN, n (%) 1 (<1) 9(4) 8(4) ULN, límite superior al normal; ALT, aminotransferasa de alanina Hallazgos de laboratorio. Los pacientes tratados con DAC HYP tuvieron un aumento en el conteo total de células NK (células/mm3) en comparación con los pacientes tratados con placebo en la semana 52 (promedio: 42.0 (150 mg de DAC HYP); 46.5 (300 mg de DAC HYP); contra -4.5 de placebo; p = <0.001).

El aumento en número total de células NK se relacionó con un aumento selectivo en las células NK CD56bright desde un punto medio de 7.77 en la línea base a 44.84 al final del tratamiento. En cambio, hubo solamente cambios marginales en las células NK CD56dim (cambios medios de 122.68 a 123.70). Las células NK CD56bnght expandidas fueron evidentes en el primer punto de tiempo después de la línea base (semana 4) en ambas ramificaciones de DAC HYP contra el placebo (p<0.0001). Las células NK CD56br'9ht se expandieron desde un punto medio de 0.6% de los linfocitos en la línea base a 2.8% en la semana 52. En cambio, los pacientes tratados con DAC HYP tuvieron una disminución modesta de células B y conteos totales de linfocitos (tabla 38). Las conteos de células T CD4* y CD8+ disminuyeron aproximadamente 7-10% en la semana 52 en los pacientes tratados con DAC HYP y la relación de CD4VCD8* permaneció constante durante el tratamiento.

Tabla 38: Cambios en los conteos de las células linfocitos durante las 52 semanas Placebo 150 mg 300 mg (n=179) (n=184) (n=186) Linfocitos totales, células/mm3 promedio (SD) Línea base 1420.9(450.3) 1444.1 (441.9) 1395.7(471.4) DAC HYP Placebo 150 mg 300 mg (n=179) (n=184) (n=186) Semana 24 1455.7 (468.7) 1380.9(426.4) 1314.7(366.3) % de cambio en la semana 24 4.81 (29.48) -1.30 (27.60) -1.2 (29.01) Semana 52 1397.2(414.4) 1332.5(398.4) 1286.2(446.8) % cambio en la semana 52 1.89 (26.60) -3.63 (27.95) -3.69 (27.74) Células B, células/mm3 promedio (SD) Línea base 174.4 (91.9) 175.5(89.8) 167.2(89.6) Semana 24 187.4 (110.3) 169.4(107.2) 150.9(94.9) % de cambio en la semana 24 17.77 (69.77) -1.19(42.49) -3.35 (53.29) Semana 52 177.2 (81.2) 157.2 (92.9) 141.0(76.9) % de cambio en la semana 52 12.57 (47.25) -4.25 (43.67) -11.26 (38.15) Células NK, células/mm3 promedio (SD) Línea base 163.4 (76.7) 166.2 (110.9) 175.0(95.7) Semana 24 169.0 (80.3) 199.3(106.6) 205.1 (87.9) % de cambio en la semana 24 9.50 (44.88) 32.71 (56.55) 33.03 (65.13) Semana 52 158.3(82.7) 213.0(113.9) 223.5(117.9) % de cambio en la semana 52 2.77 (43.07) 48.14(82.09) 50.5(84.1) Células CD4+, células/mm3 promedio (SD) DAC HYP Placebo 150 mg 300 mg (n=179) (n=184) (n=186) Linea base 686.9 (248.3) 698.8(241.3) 664.4 (261.0) Semana 24 692.8 (235.3) 646.2 (216.2) 606.5 (222.8) % de cambio en la semana 24 3.87 (26.72) -4.42 (27.20) -4.66 (28.24) Semana 52 682.9(219.6) 612.8(202.6) 581.7(259.8) % de cambio en la semana 52 2.77 (26.45) -6.95 (30.33) -8.94 (29.97) Células CD8+, células/mm3 promedio (SD) Línea base 355.3 (156.2) 361.4(146.4) 353.4(165.8) Semana 24 363.9(176.8) 328.0(139.6) 309.5(133.4) % de cambio en la semana 24 4.11 (40.70) -4.73 (30.67) -6.49 (30.23) Semana 52 344.9 (160.9) 315.7(139.6) 295.7(151.0) % de cambio en la semana 52 3.05 (44.60) -9.12(30.96) -9.83 (33.94) Relación CD4/CD8 Línea base 2.2 (0.9) 2.1 (0.9) 2.1 (09) Semana 24 2.2 (0.9) 2.2 (0.9) 2.2(1.0) % de cambio en la semana 24 4.23 (25.38) 2.87(18.55) 4.07 (19.85) Semana 52 2.3 (1.0) 2.2 (0.9) 2.2 (0.9) % de cambio en la semana 52 6.36 (30.00) 4.57(18.77) 4.47 (20.63) SD, desviación estándar; NK, eliminación natural, Las anormalidades de la prueba de función hepática (LFT, por sus siglas en inglés) estuvieron por encima de 5X ULN, ocurrieron en el 4% de los pacientes tratados con DAC y <1% de los pacientes tratados con placebo. Estas anormalidades ocurrieron comúnmente tarde en el período de tratamiento (inicio medio + día 308) y se determinaron con un periodo medio de 62 días. De los 17 pacientes tratados con DAC HYP con elevaciones de >5X ULN, 6 continuaron o reasumieron el tratamiento con DAC HYP por lo menos 6 meses después de la determinación, todos sin recurrencia durante este período. En 2 pacientes, las elevaciones de LFT se asociaron a las infecciones (un caso de hepatitis B y un caso de infección por citomegalovirus).

Inmunogenicidad. En la semana 24, los anticuerpos de neutralización para DAC HYP se detectaron en 6 (2%) pacientes tratados con DAC HYP (5 pacientes en los grupos de dosis de 150 mg y 1 paciente en los grupos de dosis de 300 mg). En algunos pacientes estos anticuerpos fueron transitorios, y en la semana 52, los anticuerpos de neutralización para DAC HYP estuvieron presentes en solamente 1 paciente de cada grupo de dosis de DAC HYP.

Conclusión. El antagonismo de CD25 con la monoterapia mensual subcutánea de DAC HYP demostró efectos robustos y clínicamente significativos durante 1 año sobre la actividad de la enfermedad de MS, por ejemplo, según lo medido por la reducción en la tasa de recaída, una nueva MRI definió las lesiones y progresión de discapacidad en predominantemente una población sin tratamiento previo de pacientes con MS. 6. Modalidades específicas, incorporación mediante referencia Varios aspectos del presente descripción se describen en las modalidades dispuestas en los párrafos numerados siguientes. 1. Una célula modificada NSO que se ha adaptado para crecer en medio sin suero y colesterol y que se dirige a expresar una proteína recombinante, la célula es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 100 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días cuando creció en medio sin suero y colesterol. 2. La célula modificada NSO de la modalidad 1, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 1,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días cuando creció en medio sin colesterol y componentes de origen animal. 3. La célula modificada NSO de la modalidad 1, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días cuando creció en medio sin colesterol y componentes de origen animal. 4. La célula modificada NSO de cualquiera de las modalidades 1-3, a cuyo medio de alimentación se agrega de acuerdo con el siguiente itinerario, donde el volumen agregado representa el porcentaje del volumen inicial del cultivo celular: 5. La célula modificada NSO de la modalidad 1, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 200 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de por lo menos 100 I en un proceso de alimentación por lotes de 13 días. 6. La célula modificada NSO de la modalidad 5, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 200 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 1,000 I en un proceso de alimentación por lotes de 13 días cuando creció en medio sin colesterol. 7. La célula modificada NSO de la modalidad 5, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días cuando creció en medio sin suero y colesterol. 8. La célula modificada NSO de la modalidad 1, que se transfecta establemente con un ácido nucleico útil para expresar un anticuerpo monoclonal anti-CD25. 9. La célula modificada NSO de la modalidad 8, en la cual el anticuerpo monoclonal anti-CD25 comprende una cadena VL que corresponde en secuencia a las posiciones 21-233 de la SEC ID NO: 2 y una cadena VH que corresponde en secuencia a las posiciones 20 a 465 de la SEC ID NO: 4. 10. La célula modificada NSO de la modalidad 1, que fue transformada con el vector pAbX.gpt. 11. La célula modificada NSO de la modalidad 1, que fue transformada con el vector pHAT.lgG1.rg.dE. 12. La célula modificada NSO de la modalidad 1, que se designa como el clon 7A11 -5H7-14-43. 13. Un método para producir una proteína recombinante, que comprende cultivar la célula modificada NSO de cualquiera de las modalidades 1-12. 14. El método de la modalidad 13, en donde la célula modificada NSO se cultiva bajo condiciones que dan lugar a la producción de por lo menos 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 100 I, 1,000 I o 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días, o por lo menos 200 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 100 I, 1,000 I o 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de 13 días. 15. El método de la modalidad 13 ó 14, en donde la célula modificada NSO se cultiva en ausencia de suero y colesterol. 16. El método de la modalidad 15, en donde la célula modificada NSO se cultiva en ausencia de tropolona e hidrocortisona. 17. El método de la modalidad 13 ó 14, en donde la célula modificada NSO se cultiva en un medio básico y/o de alimentación que contiene 10-35 g/l de glucosa. 18. El método de la modalidad 17, en donde la célula modificada NSO se cultiva en un medio básico que contiene 15 g/l de glucosa y/o un medio de alimentación que contiene 28 g/l de glucosa. 19. El método de la modalidad 18, en donde el medio básico se compone de los componentes de PFBIVI2 ± 10%. 20. El método de la modalidad 18, en donde el medio de alimentación se compone de los componentes de PFFM3 ± 10%. 21. El método de la modalidad 19 ó 20, en donde la célula se cultiva en el medio básico durante 1-3 días, y entonces en medio de alimentación durante 10-13 días. 22. El método de la modalidad 18, en donde el medio de alimentación se agrega de acuerdo con el itinerario delineado en la tabla 7 ± 10%. 23. Un vector útil para expresar de manera recombinante una proteína de interés, que comprende un promotor débil que conduce la expresión de un marcador seleccionable operable en las células mamíferas y un promotor potente que conduce la expresión de una proteína de interés. 24. El vector de la modalidad 23, en donde la proteína de interés es un anticuerpo terapéutico. 25. El vector de la modalidad 24, en donde el anticuerpo terapéutico es un anticuerpo anti-CD25. 26. El vector de la modalidad 25, en donde el anticuerpo anti-CD25 comprende las CDR de daclizumab. 27. El vector de la modalidad 26, en donde el anticuerpo anti-CD25 es daclizumab. 28. Un método para obtener una célula hospedadora mamífera que tiene una alta productividad volumétrica de una proteína de interés, que comprende transfecta la célula con el vector de cualquiera de las modalidades 23-27, y seleccionar una célula que es capaz de producir por lo menos la 100 mg/l/día de proteína de interés en un cultivo de 100 I, 1,000 I o 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días o por lo menos 200 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 100 I, 1,000 I o 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de 13 días. 29. Una composición que comprende el daclizumab, donde el daclizumab es caracterizado por la presencia de una isoforma ligada a N de cadena pesada pE/Q y/o una isoforma de terminal N de cadena pesada Q/VHS. 30. La composición de la modalidad 29, en la cual la isoforma de terminal N de cadena pesada pE/Q constituye aproximadamente 6-15% de daclizumab. 31. La composición de la modalidad 29, en la cual la isoforma de terminal N de cadena pesada pE/Q constituye aproximadamente 7-12% de daclizumab. 32. La composición de cualquiera de las modalidades 29-31, en el cual la isoforma de terminal N de cadena pesada Q/VHS constituye aproximadamente 1-15% de daclizumab. 33. La composición de la modalidad 32, en la cual la isoforma de terminal N de cadena pesada Q/VHS constituye aproximadamente 3-12% de daclizumab. 34. La composición de la modalidad 29, en la cual la cadena pesada de daclizumab existe en las siguientes isoformas de terminal N: 35. La composición de la modalidad 29, en la cual la cadena pesada de daclizumab existe en las siguientes isoformas de terminal N: 36. La composición de la modalidad 29, donde el daclizumab es caracterizado por un perfil de isoforma de la cromatografía de intercambio catiónico sustancialmente similar al de la figura 18. 37. La composición de la modalidad 29, donde el daclizumab es DAC HYP. 38. Una composición que comprende el daclizumab, donde el daclizumab es caracterizado por un perfil de HPLC de la glicosilación ligada a N que contiene dos máximos principales, uno que corresponde al oligosacárido G0-G1cNAc y uno que corresponde al oligosacárido G0, donde la AUC combinada de estos dos máximos constituye aproximadamente 88-99.5% de la AUC total de todos los máximos. 39. La composición de la modalidad 38, en la cual la AUC del máximo de G0-G1cNAc constituye aproximadamente 5-18% de la AUC total de todos los máximos y la AUC del máximo de G0 constituye aproximadamente 75-92% de la AUC total de todos los máximos. 40. La composición de la modalidad 39, en la cual la AUC del máximo de G0-G1cNAc constituye aproximadamente 6-16% de la AUC total de todos los máximos y la AUC del máximo de G0 constituye aproximadamente 78-90% de la AUC total de todos los máximos. 41. La composición de cualquiera de las modalidades 38-40, en la cual el perfil de glicosilación ligada a N tiene menos de aproximadamente 3% de Man5. 42. La composición de la modalidad 41, en la cual el perfil de glicosilación ligada a N tiene menos de aproximadamente 0.5% de G2, Man6 y/o Man7. 43. La composición de la modalidad 38, en la cual el perfil de glicosilación ligada a N contiene un tercer máximo que corresponde a los oligosacáridos sialilados, y la AUC del máximo del oligosacárido sialilado constituye el 1% o menos de la AUC total de todos los máximos. 44. La composición de la modalidad 38, en la cual el perfil de glicosilación ligada a N contiene un tercer máximo que corresponde al oligosacárido G1, y la AUC del máximo de G1 constituye de aproximadamente 1-5% de la AUC total de todos los máximos. 45. La composición de la modalidad 44, en la cual la AUC del máximo de G1 constituye aproximadamente 1-2% de la AUC total de todos los máximos. 46. La composición de la modalidad 38, en la cual el daclizumab tiene un perfil de HPLC de la glicosilación ligada a N sustancialmente similar al de la figura 19 o al del panel inferior de la figura 21. 47. La composición de la modalidad 38, en la cual el daclizumab es DAC HYP. 48. Una composición que comprende el daclizumab que exhibe menos de 35% de citotoxicidad ADCC promedio según lo medido en un análisis celular in vitro al usar las células efectoras de por lo menos 3 donadores sanos y las células kit 225 K6 como células objetivo, a una concentración de daclizumab de 1 pg/ml y una relación de célula efectora a célula objetivo de aproximadamente 25:1. 49. La composición de la modalidad 48, en donde el daclizumab exhibe 10% a 30% de citotoxicidad ADCC promedio en el análisis. 50. La composición de la modalidad 48 ó 49, en donde el análisis utiliza las células efectoras de por lo menos 6 donadores sanos. 51. La composición de la modalidad 48 ó 49, en donde el análisis utiliza las células efectoras de por lo menos 10 donadores sanos. 52. La composición de cualquiera de las modalidades 48-51, en el cual el daclizumab es DAC HYP. 53. Una composición útil para hacer una formulación de fármaco de daclizumab, que comprende aproximadamente 150-190 mg/ml de daclizumab y cantidades de excipientes tal que la dilución de la composición con un amortiguador de dilución produzca una composición diluida que contenga aproximadamente 85-165 mg/ml de daclizumab y tenga una osmolalidad de aproximadamente 267-327 mOsm/kg y un pH de aproximadamente pH 5.8-6.2 a 25°C, y en la cual por lo menos aproximadamente 95% de daclizumab está en forma de monómero, según lo medido por la cromatografía mediante exclusión de tamaño. 54. La composición de la modalidad 53, que contiene cantidades de excipientes tal que cuando se diluye con un amortiguador de dilución, la composición diluida contiene aproximadamente 85-115 mg/ml de daclizumab. 55. La composición de la modalidad 53, que contiene cantidades de excipientes tal que cuando se diluye con un amortiguador de dilución, la composición diluida contiene aproximadamente 150 ± 15 mg/ml de daclizumab. 56. Una composición que comprende aproximadamente 4 a 15 mg/ml de daclizumab, donde 0.1% o menos de daclizumab en están en forma de agregado. 57. La composición de la modalidad 56, que se obtiene al purificar una composición de daclizumab que comprende aproximadamente 4 a 15 mg/ml de daclizimab, donde hasta 2.5% de daclizumab está en forma de agregado, a través de la cromatografía en columna sobre una resina de intercambio catiónico débil. 58. La composición de la modalidad 57, donde la resina intercambio catiónico débil es CM-650M. 59. La composición de la modalidad 58, donde la resina CM-650M se equilibra con un amortiguador de equilibrio que contiene aproximadamente 20 mM de citrato de sodio, pH 4.4-4.6, y el daclizumab se eluye con un amortiguador de elución que contiene aproximadamente 20 mM de citrato de sodio y aproximadamente 75 mM de sulfato de sodio, pH 4.4-4.6. 60. La composición de la modalidad 59, donde la cromatografía se realiza en una columna cilindrica al usar un lecho de resina que tiene una altura de aproximadamente 10-30 cm o aproximadamente 17-19 cm, y el daclizumab se eluye a una temperatura de aproximadamente 4-22°C o aproximadamente 18-22°C, y un caudal de aproximadamente 50-200 cm/hr o aproximadamente 90-110 cm/hr. 61. Una composición conveniente para la administración a los humanos, que comprende aproximadamente 85-165 mg/ml de daclizumab; y aproximadamente 0.02-0.04% (p/v) de polisorbato 80, donde la composición tiene una osmolalidad de aproximadamente 267-327 mOsm/kg y un pH de aproximadamente pH 5.8-6.2 a 25°C, y por lo menos aproximadamente 95% de daclizumab está en forma de monómero, según lo medido por cromatografía mediante exclusión de tamaño. 62. La composición de la modalidad 61, en la cual por lo menos aproximadamente 99% de daclizumab está en forma de monómero, según lo medido por cromatografía mediante exclusión de tamaño. 63. La composición de la modalidad 61, que comprende aproximadamente 85-115 mg/ml de daclizumab. 64. La composición de la modalidad 63, que consiste esencialmente de aproximadamente 100 mg/ml de daclizumab, aproximadamente 40 m de succinato de sodio, aproximadamente 100 mM de cloruro de sodio, y aproximadamente 0.03% (p/v) de polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a 25 °C. 65. La composición de la modalidad 61, que comprende aproximadamente 135-165 mg/ml de daclizumab. 66. La composición de la modalidad 65, que consiste esencialmente de aproximadamente 150 mg/ml de daclizumab, aproximadamente 40 mM de succinato de sodio, aproximadamente 100 mM de cloruro de sodio, y aproximadamente 0.03% (p/v) de polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a 25°C. 67. La composición de la modalidad 65, que es obtenida por un proceso que comprende las etapas de concentrar una composición de daclizumab que comprende aproximadamente 4 a 15 mg/ml de daclizumab a través de ultrafiltración en un amortiguador conveniente para alcanzar una concentración de daclizumab de aproximadamente 85-180 mg/ml y opcionalmente diluir la composición concentrada con un amortiguador de dilución. 68. Una composición farmacéutica conveniente para la administración subcutánea, que comprende aproximadamente 85-165 mg/ml de daclizumab, donde el porcentaje de daclizumab en forma de agregado no excede aproximadamente 3% después de almacenamiento durante un período de aproximadamente 12 meses a una temperatura de aproximadamente 2-8°C. 69. La composición farmacéutica de la modalidad 68, que comprende aproximadamente 85-115 mg/ml de daclizumab. 70. La composición farmacéutica de la modalidad 68, que comprende aproximadamente 135-165 mg/ml de daclizumab. 71. La composición farmacéutica de la modalidad 69 ó 70, en la cual el porcentaje de daclizumab en forma de agregado no excede aproximadamente 2% después de almacenamiento durante un período de aproximadamente 12 meses a una temperatura de aproximadamente 2-8°C. 72. La composición farmacéutica de la modalidad 69 ó 70, en la cual el porcentaje de daclizumab en forma de agregado no excede aproximadamente 3% después de almacenamiento durante un período de aproximadamente 18 meses a una temperatura de aproximadamente 2-8°C. 73. Un proceso para cosechar una proteína recombinante de un cultivo celular, que comprende las etapas de: (i) ajustar el pH de un cultivo celular que expresa y secreta una proteína recombinante a un pH de aproximadamente pH 4.5-5.5; (ii) incubar el cultivo celular de pH ajustado durante aproximadamente 30-90 minutos a una temperatura de aproximadamente 4 a 15°C; y (iii) centrifugar el cultivo celular de pH ajustado incubado para eliminar los desechos celulares. 74. Un proceso para producir una composición purificada de daclizumab, que comprende las etapas de: (i) absorber el daclizumab de una preparación de daclizumab crudo sobre la resina de cromatografía de afinidad; (ii) lavar la resina de cromatografía de afinidad con un amortiguador de lavado para eliminar los contaminantes; (iii) eluir el daclizumab absorbido con un amortiguador de elución; (iv) desactivar los virus en el eluído mediante el ajuste del pH a un pH de aproximadamente pH 3-4 e incubar el eluído de pH ajustado a una temperatura especificada durante un periodo de tiempo suficiente para desactivar los virus; (v) neutralizar el eluído de virus desactivado a un pH de aproximadamente pH 7.7-7.9 (medido a 25°C); (vi) hacer fluir el eluído neutralizado a través de una resina de cromatografía de intercambio aniónico potente; (vii) absorber el daclizumab del eluído de la etapa (vi) sobre una resina de cromatografía de intercambio catiónico débil; y (viii) eluir el daclizumab absorbido de la resina de cromatografía de intercambio catiónico débil. 75. El proceso de la modalidad 74, en el cual la preparación de daclizumab crudo se cosecha de un cultivo celular. 76. El proceso de la modalidad 74, en el cual la preparación de daclizumab crudo se obtiene al cultivar la célula hospedadora 7A11 -5H7-14-43 bajo condiciones en las cuales el daclizumab se secreta en el medio de cultivo y cosecha del daclizumab secretado. 77. El proceso de la modalidad 76, en el cual el daclizumab se cosecha la usar el método de la modalidad 73. 78. El proceso de la modalidad 74, el cual adicionalmente comprende las etapas de: (ix) filtrar la composición de daclizumab eluída de la etapa (viii) para eliminar el virus; y (x) concentrar la solución filtrada a través de ultrafiltración para producir una composición de daclizumab purificada que comprende aproximadamente 85-180 mg/ml de daclizumab. 79. El proceso de la modalidad 78, que adicionalmente comprende la etapa de diluir la composición purificada de daclizumab con un amortiguador de dilución para obtener una composición que comprende aproximadamente 85-165 mg/ml de daclizumab; y aproximadamente 0.02-0.04% (p/v) de polisorbato 80, donde la composición tiene una osmolalidad de aproximadamente 267-327 mOsm/kg y un pH de aproximadamente pH 5.8-6.2 a 25°C, y por lo menos aproximadamente 95% de daclizumab está en forma de monómero, según lo medido por cromatografía mediante exclusión de tamaño. 80. El proceso de la modalidad 79, en donde la composición obtenida tiene menos de 50 ppm de proteínas de célula hospedadora de una fuente recombinante de daclizumab, menos de 10 ppm de proteína A, y no más de 3% de daclizumab en la composición está en forma de agregado. 81. Medio básico PFBM2. 82. Medio de alimentación PFFM3. 83. Una composición de daclizumab, que es obtenida por un proceso que comprende la etapa de cultivar una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-12 bajo las condiciones en las cuales el daclizumab se secrete en el medio de cultivo. 84. La composición de daclizumab de la modalidad 83, en la cual el proceso adicionalmente comprende la etapa de aislar el daclizumab secretado del medio de cultivo celular. 85. Un amortiguador útil para esterilizar una resina de cromatografía de afinidad de proteína A, que comprende aproximadamente 100-500 mM de citrato de sodio, aproximadamente 10-30 mM de NaOH y aproximadamente 0.5-3% (v/v) de alcohol bencílico. 86. Un método para esterilizar una columna de cromatografía de afinidad de proteína A, que comprende lavar la columna con el amortiguador de esterilización de la modalidad 85 a un caudal y durante un periodo de tiempo suficiente para esterilizar la columna. 87. El método de la modalidad 86, en el cual la columna se lava con aproximadamente 1.8 volúmenes de columna de amortiguador de esterilización a un caudal de aproximadamente 150 cm/hr, la columna lavada se incuba sin caudal durante un período de aproximadamente 30-45 minutos, y después equilibra con un amortiguador de equilibrio. 88. El método de la modalidad 87, en el cual el amortiguador de equilibrio comprende aproximadamente 20 mM de citrato de sodio y 150 mM de NaCI, y tiene un pH de aproximadamente pH 7 (a 25°C). 89. Un método para tratar a un paciente que sufre de esclerosis múltiple, que comprende administrar al paciente una cantidad suficiente de una composición de DAC HYP para proporcionar el beneficio terapéutico. 90. El método de la modalidad 89, en el cual la composición de DAC HYP se administra de manera intravenosa. 91. El método de la modalidad 90, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a aproximadamente 0.8-0.9 mg/kg de DAC HYP. 92. El método de la modalidad 91, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a aproximadamente 1 mg/kg de DAC HYP. 93. El método de cualquiera de las modalidades 89-92, en el cual el DAC HYP se administra una vez por semana durante un período de por lo menos 6 semanas, por lo menos 12 semanas, por lo menos 24 semanas. 94. El método de cualquiera de las modalidades 89-93, en el cual el DAC HYP se administra como una monoterapia. 95. El método de la modalidad 94, en el cual el paciente no ha podido responder al tratamiento anterior con interferon beta o ha discontinuado el tratamiento anterior con interferon beta. 96. El método de cualquiera de las modalidades 89-93, en el cual el DAC HYP se administra en combinación con el interferón beta. 97. El método de la modalidad 89, en el cual la composición de DAC HYP se administra de manera subcutánea. 98. El método de la modalidad 97, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a aproximadamente 1 mg/kg de DAC HYP. 99. El método de la modalidad 98, en el cual la composición de DAC HYP se administra una vez cada dos semanas. 100. El método de la modalidad 99, en el cual la composición de DAC HYP se administra durante un total de aproximadamente 24 semanas. 101. El método de la modalidad 97, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a aproximadamente 2 mg/kg de DAC HYP. 102. El método de la modalidad 101, en el cual la composición de DAC HYP se administra una vez cada 4 semanas. 103. El método de la modalidad 102, en el cual la composición de DAC HYP se administra durante un total de aproximadamente 24 semanas. 104. El método de la modalidad 103, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a 75 mg a 300 mg de DAC HYP. 105. El método de la modalidad 104, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a 150 mg. 106. El método de la modalidad 104, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a 300 mg. 107. El método de cualquiera de las modalidades 103-106, en donde la composición de DAC HYP se administra una vez cada 4 semanas. 108. El método de la modalidad 107, en donde la composición de DAC HYP se administra durante un total de por lo menos 48 semanas. 109. El método de cualquiera de las modalidades 103-108, en el cual el DAC HYP se administra como una monoterapia. 110. El método de la modalidad 109, en el cual el paciente no ha podido responder al tratamiento anterior con interferón beta o ha discontinuado el tratamiento anterior con interferón beta. 111. El método de cualquiera de las modalidades 103-108, en el cual el DAC HYP se administra en combinación con el interferón beta. 112. Una proteína recombinante de un cultivo celular, obtenido u obtenible mediante un proceso que comprende las etapas de: (i) ajustar el pH de un cultivo celular que expresa y secreta una proteína recombinante a un pH en el intervalo de aproximadamente pH 4.5-5.5; (ii) incubar el cultivo celular de pH ajustado durante aproximadamente 30-90 minutos a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 4 a 15°C; y (iii) centrifugar el cultivo celular de pH ajustado incubado para eliminar los desechos celulares. 113. Una composición purificada de daclizumab, obtenida u obtenible mediante un proceso que comprende las etapas de: (i) absorber el daclizumab a partir de una preparación de daclizumab crudo sobre la resina de cromatografía de afinidad; (ii) lavar la resina de cromatografía de afinidad con un amortiguador de lavado para eliminar los contaminantes; (iii) eluir el daclizumab absorbido con un amortiguador de elución; (iv) desactivar los virus en el eluído al ajustar el pH a un pH en el intervalo de aproximadamente pH 3-4 e incubar el eluído de pH ajustado a la temperatura especificada durante un periodo de tiempo suficiente para desactivar el virus; (v) neutralizar el eluído de virus desactivado a un pH en el intervalo de aproximadamente pH 7.7-7.9 (medido a 25°C); (vi) hacer fluir el eluído neutralizado a través de una resina de cromatografía de intercambio aniónico potente; (vii) absorber el daclizumab a partir del eluído de la etapa (vi) sobre una resina de cromatografía de intercambio catiónico débil; y (viii) eluir el daclizumab absorbido a partir de la resina de cromatografía de intercambio catiónico débil. 114. Una composición purificada de daclizumab, obtenida u obtenible mediante el proceso de cualquiera de las modalidades 74-80.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otros documentos citados en esta solicitud son incorporados en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación, patente, solicitud de patente u otro documento individual fueran indicados individualmente como incorporados por referencia para todos los propósitos.

Aunque se han ilustrado y descrito varias modalidades específicas, será apreciado que varios cambios se puedan realizar sin apartarse del espíritu y alcance de las invenciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula modificada NSO que se ha adaptado para crecer en un medio sin suero y colesterol y que se diseña para expresar una proteína recombinante, la célula es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 100 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días cuando creció en medio sin suero y colesterol.

2. La célula modificada NSO de la reivindicación 1, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 1,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días cuando creció en medio sin colesterol y componentes de origen animal.

3. La célula modificada NSO de la reivindicación 1, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días cuando creció en medio sin colesterol y componentes de origen animal.

4. La célula modificada NSO de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el proceso de alimentación por lotes comprende la adición de un medio de alimentación que se agrega de acuerdo con el siguiente itinerario, donde el volumen agregado representa el porcentaje del volumen inicial de cultivo celular:

5. La célula modificada NSO de la reivindicación 1, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 200 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de por lo menos 100 I en un proceso de alimentación por lotes de 13 días.

6. La célula modificada NSO de la reivindicación 5, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 200 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 1,000 I en un proceso de alimentación por lotes de 13 días cuando creció en medio sin colesterol.

7. La célula modificada NSO de la reivindicación 5, que es capaz de alcanzar una productividad volumétrica que excede 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días cuando creció en medio sin suero y colesterol.

8. La célula modificada NSO de la reivindicación 1, que se transfecta establemente con un ácido nucleico útil para expresar un anticuerpo monoclonal anti-CD25.

9. La célula modificada NSO de la reivindicación 8, en la cual el anticuerpo monoclonal anti-CD25 comprende una cadena VL que corresponde en secuencia a las posiciones 21-233 de la SEC ID NO: 2 y una cadena VH que corresponde en secuencia a las posiciones 20 a 465 de la SEC ID NO: 4.

10. La célula modificada NSO de la reivindicación 1, que se transforma con el vector pAbX.gpt.

11. La célula modificada NSO de la reivindicación 1, que se transforma con el vector pHAT.lgG1.rg.dE.

12. Un método para producir una proteína recombinante, que comprende cultivar la célula modificada NSO de cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la célula modificada NSO se cultiva bajo condiciones que dan lugar a la producción de por lo menos de 100 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 100 I, 1,000 I o 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días, o por lo menos 200 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 100 I, 1,000 I o 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de 13 días.

14. El método de la reivindicación 12 ó 13, en donde la célula modificada NSO se cultiva en ausencia de suero y colesterol.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la célula modificada NSO se cultiva en ausencia de tropolona y hidrocortisona.

16. El método de la reivindicación 12 ó 13, en donde la célula modificada NSO se cultiva en un medio básico y/o de alimentación que contiene 10-35 g/l de glucosa.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la célula modificada NSO se cultiva en un medio básico que contiene 15 g/l de glucosa y/o un medio de alimentación que contiene 28 g/l de glucosa.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el medio básico se constituye de los componentes de PFBM2 ± 10%.

19. El método de la reivindicación 17, en donde el medio de alimentación se constituye de los componentes de PFFM3 ± 10%.

20. El método de la reivindicación 18 ó 19, en donde la célula se cultiva en el medio básico durante 1-3 días, y entonces en medio de alimentación durante 10-13 días.

21. El método de la reivindicación 18, en donde el medio de alimentación se agrega de acuerdo con el itinerario delineado en la tabla 7 ± 10%.

22. Un vector útil para expresar de manera recombinante una proteína de interés, que comprende un promotor débil que conduce la expresión de un marcador seleccionable operable en las células mamíferas y un promotor potente que conduce la expresión de una proteína de interés.

23. El vector de la reivindicación22, en donde la proteína de interés es un anticuerpo terapéutico.

24. El vector de la reivindicación23, en donde el anticuerpo terapéutico es un anticuerpo anti-CD25.

25. El vector de la reivindicación 24, en donde el anticuerpo anti-CD25 comprende las CDR de daclizumab.

26. El vector de la reivindicación 25, en donde el anticuerpo anti-CD25 es daclizumab.

27. Un método para obtener una célula hospedadora mamífera que tiene una alta productividad volumétrica de una proteína de interés, que comprende transfectar la célula con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 22-26, y seleccionar una célula que es capaz de producir por lo menos 100 mg/l/día de proteína de interés en un cultivo de 100 I, 1,000 I o 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de diez días o por lo menos 200 mg/l/día de proteína recombinante en un cultivo de 100 I, 1,000 I o 16,000 I en un proceso de alimentación por lotes de 13 días.

28. Una composición que comprende el daclizumab, donde el daclizumab se caracteriza por la presencia de una isoforma ligada a N de cadena pesada pE/Q y/o una isoforma de terminal N de cadena pesada Q/VHS.

29. La composición de la reivindicación 28, en la cual la isoforma de terminal N de cadena pesada pE/Q constituye aproximadamente 3-17% o 6-15% de daclizumab.

30. La composición de la reivindicación 28, en la cual la isoforma de terminal N de cadena pesada pE/Q constituye aproximadamente 5-12% o 7-12% de daclizumab.

31. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 28-30, en la cual la isoforma de terminal N de cadena pesada Q/VHS constituye aproximadamente 1-15% de daclizumab.

32. La composición de la reivindicación 31, en la cual la isoforma de terminal N de cadena pesada Q/VHS constituye aproximadamente 3-12% de daclizumab.

33. La composición de la reivindicación 28, en la cual la cadena pesada de daclizumab existe en las siguientes isoformas de terminal N:

34. La composición de la reivindicación 28, en la cual la cadena pesada de daclizumab existe en las siguientes isoformas de terminal N:

35. La composición de la reivindicación 28, en donde el daclizumab se caracteriza por un perfil de isoforma de cromatografía de intercambio catiónico sustancialmente similar al de la figura 18.

36. La composición de la reivindicación 28, en donde el daclizumab es DAC HYP.

37. Una composición que comprende el daclizumab, donde el daclizumab se caracteriza por un perfil de HPLC de la glicosilación ligada a N que contiene dos máximos principales, uno que corresponde al oligosacárido G0-G1cNAc y uno que corresponde al oligosacárido GO, donde la AUC combinada de estos dos máximos constituye aproximadamente 75-100%, aproximadamente 80-100%, aproximadamente 85-100%, o aproximadamente 88-99.5% de la AUC total de todos los máximos.

38. La composición de la reivindicación 37, en la cual la AUC del máximo de G0-G1cNAc constituye aproximadamente 5-20%, aproximadamente 5-18% de la AUC total de todos los máximos y la AUC del máximo de GO constituye aproximadamente 70-99%, aproximadamente 75-92% o aproximadamente 75-90% de la AUC total de todos los máximos.

39. La composición de la reivindicación 38, en la cual la AUC del máximo de G0-G1cNAc constituye aproximadamente 6-16% o aproximadamente 7-15% de la AUC total de todos los máximos y la AUC del máximo de GO constituye aproximadamente 78-90% o aproximadamente 81-88% de la AUC total de todos los máximos.

40. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 37-39, en la cual el perfil de glicosilación ligada a N tiene menos de aproximadamente 3% de Man5.

41. La composición de la reivindicación 40, en la cual el perfil de glicosilación ligada a N tiene menos de aproximadamente 0.5% de G2, Man6 y/o Man7.

42. La composición de la reivindicación 37, en la cual el perfil de glicosilación ligada a N contiene un tercer máximo que corresponde a los oligosacáridos sialilados, y la AUC del máximo de oligosacárido sialilado constituye el 1% o menos de la AUC total de todos los máximos.

43. La composición de la reivindicación 37, en la cual el perfil de glicosilación ligada a N contiene un tercer máximo que corresponde al oligosacárido G1, y la AUC del máximo de G1 constituye menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 3%, o aproximadamente 1-5%, aproximadamente 1-4%, o aproximadamente 1-3% de la AUC total de todos los máximos.

44. . La composición de la reivindicación43, en la cual la AUC del máximo de G1 constituye aproximadamente 1-2% de la AUC total de todos los máximos.

45. La composición de la reivindicación37, en la cual el daclizumab tiene un perfil de HPLC de la glicosilación ligada a N sustancialmente similar a la figura 19 o al del panel inferior de la figura 21.

46. La composición de la reivindicación 37, en la cual el daclizumab es DAC HYP.

47. Una composición que comprende el daclizumab que exhibe menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, o menos de 5% de citotoxicidad ADCC promedio según lo medido en un análisis celular in vitro al usar las células efectoras de por lo menos 3 donadores sanos y las células Kit 225 K6 como células objetivo, a una concentración de daclizumab de 1 µg/ml y una relación de célula efectora a célula objetivo de aproximadamente 25:1.

48. La composición de la reivindicación 47, en donde el daclizumab exhibe 5% a 30%, 5% a 25%, 10% a 30%, 10% a 25% o 15% a 25% de citotoxicidad ADCC promedio en el análisis.

49. La composición de la reivindicación 47 ó 48, en donde el análisis utiliza las células efectoras de por lo menos 6 donadores sanos.

50. La composición de la reivindicación 47 ó 48, en donde el análisis utiliza las células efectoras de por lo menos 10 donadores sanos.

51. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 47-50, en I a cual el daclizumab es DAC HYP.

52. Una composición útil para hacer una formulación de fármaco de daclizumab, que comprende aproximadamente 150-190 mg/ml de daclizumab y cantidades de excipientes tal que la dilución de la composición con un amortiguador de dilución produzca una composición diluida que contenga aproximadamente 85-165 mg/ml de daclizumab y tenga una osmolalidad de aproximadamente 267-327 mOsm/kg y un pH de aproximadamente pH 5.8-6.2 a 25°C, y en la cuul por lo menos es aproximadamente 95% de daclizumab están en forma de monómero, según lo medido por cromatografía mediante exclusión de tamaño.

53. La composición de la reivindicación 52, que contiene cantidades de excipientes tal que cuando se diluye con un amortiguador de dilución la composición diluida contiene aproximadamente 85-115 mg/ml de daclizumab.

54. La composición de la reivindicación 52, que contiene cantidades de excipientes tal que cuando se diluye con un amortiguador de dilución la composición diluida contiene aproximadamente 150 ± 15 mg/ml de daclizumab.

55. Una composición que comprende aproximadamente 4 a 15 mg/ml de daclizumab, donde 0.1% o menos de daclizumab está en forma agregada.

56. La composición de la reivindicación 55, que se obtiene la purificar una composición de daclizumab que comprende aproximadamente 4 a 15 mg/ml de daclizimab, en donde hasta 2.5% de daclizumab está en forma de agregado, a través de la cromatografía en columna sobre una resina de intercambio catiónico débil.

57. La composición de la reivindicación 56, en donde la resina de intercambio catiónico débil es CM-650M.

58. La composición de la reivindicación 57, en donde la resina CM-650M se equilibra con un amortiguador de equilibrio que contiene aproximadamente 20 mM de citrato de sodio, pH 4.4-4.6, y el daclizumab se eluye con un amortiguador de elución que contiene aproximadamente 20 mM de citrato de sodio y aproximadamente 75 mM de sulfato de sodio, pH 4.4-4.6.

59. La composición de la reivindicación 58, en donde la cromatografía se realiza en una columna cilindrica al usar un lecho de resina que tiene una altura de aproximadamente 10-30 cm o aproximadamente 17-19 cm, y el daclizumab se eluye a una temperatura de aproximadamente 4-22°C o aproximadamente 18-22, y a un caudal de aproximadamente 50-200 cm/hr o aproximadamente 90-110 cm/hr.

60. Una composición conveniente para la administración a los humanos, que comprende aproximadamente 85-165 mg/ml de daclizumab; y aproximadamente 0.02-0.04% (p/v) de polisorbato 80, en donde la composición tiene una osmolalidad de aproximadamente 267-327 mOsm/kg y un pH de aproximadamente pH 5.8-6.2 a 25°C, y por lo menos aproximadamente 95% de daclizumab está en forma de monómero, según lo medido por cromatografía mediante exclusión de tamaño.

61. La composición de la reivindicación 60, en la cual por lo menos aproximadamente 99% de daclizumab está en forma de monómero, según lo medido por cromatografía mediante exclusión de tamaño.

62. La composición de la reivindicación 60, que comprende aproximadamente 85-115 mg/ml de daclizumab.

63. La composición de la reivindicación 62, que consiste esencialmente de aproximadamente 100 mg/ml de daclizumab, aproximadamente 40 mM de succinato de sodio, aproximadamente 100 mM de cloruro de sodio, y aproximadamente 0.03% (p/v) de polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.0 en 25 °C.

64. La composición de la reivindicación 60, que comprende aproximadamente 135-165 mg/ml de daclizumab.

65. La composición de la reivindicación 64, que consiste esencialmente de aproximadamente 150 mg/ml de daclizumab, aproximadamente 40 mM de succinato de sodio, aproximadamente 100 mM de cloruro de sodio, y aproximadamente 0.03% (p/v) de polisorbato 80, y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a 25°C.

66. La composición de la reivindicación 64, que se obtiene por un proceso que comprende las etapas de concentrar una composición de daclizumab que comprende aproximadamente 4 a 15 mg/ml de daclizumab a través de la ultrafiltración en un amortiguador conveniente para alcanzar una concentración de daclizumab de aproximadamente 85-180 mg/ml y diluir opcionalmente la composición concentrada con un amortiguador de dilución.

67. Una composición farmacéutica conveniente para la administración subcutánea que comprende aproximadamente 85-165 mg/ml de daclizumab, donde el porcentaje de daclizumab en forma de agregado no excede aproximadamente 3% después de almacenamiento durante un período de aproximadamente 12 meses a una temperatura de aproximadamente 2-8°C.

68. La composición farmacéutica de la reivindicación 67, que comprende aproximadamente 85-115 mg/ml de daclizumab.

69. La composición farmacéutica de la reivindicación 68, que comprende aproximadamente 135-165 mg/ml de daclizumab.

70. La composición farmacéutica de la reivindicación 68 ó 69, en la cual el porcentaje de daclizumab en forma de agregado no excede aproximadamente 2% después de almacenamiento durante un período de aproximadamente 12 meses a una temperatura de aproximadamente 2-8°C.

71. La composición farmacéutica de la reivindicación 68 ó 69, en la cual el porcentaje de daclizumab en forma de agregado no excede aproximadamente 3% después de almacenamiento durante un período de de aproximadamente 18 meses a una temperatura de aproximadamente 2-8°C.

72. Un proceso para cosechar una proteína recombinante a partir de un cultivo celular, que comprende las etapas de: (i) ajustar el pH de un cultivo celular que expresa y secreta una proteína recombinante a un pH de aproximadamente pH 4.5-5.5; (ii) incubar el cultivo celular de pH ajustado durante aproximadamente 30-90 minutos a una temperatura de aproximadamente 4 a 15°C; y (iii) centrifugar el cultivo celular de pH ajustado incubado para eliminar los desechos celulares.

73. Un proceso para producir una composición purificada de daclizumab, que comprende las etapas de: (i) absorber el daclizumab de una preparación de daclizumab crudo sobre la resina de cromatografía de afinidad; (ii) lavar la resina de cromatografía de afinidad con un amortiguador de lavado para eliminar los contaminantes; (iii) eluir el daclizumab absorbido con un amortiguador de elución; (iv) desactivar los virus en el eluído al ajustar el pH a un pH de aproximadamente pH 3-4 e incubar el eluído de pH ajustado a una temperatura especificada durante un periodo de tiempo suficiente para desactivar los virus; (v) neutralizar el eluído de virus desactivado a un pH de aproximadamente pH 7.7-7.9 (medido a 25°C); (vi) hacer fluir el eluído neutralizado a través de una resina de cromatografía de intercambio aniónico potente; (vii) absorber el daclizumab del eluído de la etapa (vi) sobre una resina de cromatografía de intercambio catiónico débil; y (viii) eluir el daclizumab absorbido de la resina de cromatografía de intercambio catiónico débil.

74. El proceso de la reivindicación 73, en el cual la preparación de daclizumab crudo se cosecha a partir de un cultivo celular.

75. El proceso de la reivindicación 73, en el cual el daclizumab se cosecha al usar el método de la reivindicación 72.

76. El proceso de la reivindicación73, el cual adicionalmente comprende las etapas de: (ix) filtrar la composición eluída de daclizumab de la etapa (viii) para eliminar los virus; y (x) concentrar la solución filtrada a través de ultrafiltración para producir la composición purificada de daclizumab que comprende aproximadamente 85-180 mg/ml de daclizumab.

77. El proceso de la reivindicación 76, que adicionalmente comprende la etapa de diluir la composición purificada de daclizumab con un amortiguador de dilución para obtener una composición que comprende aproximadamente 85-165 mg/ml de daclizumab; y aproximadamente 0.02-0.04% (p/v) de polisorbato 80, donde la composición tiene una osmolalidad de aproximadamente 267-327 mOsm/kg y un pH de aproximadamente pH 5.8-6.2 a 25°C, y por lo menos aproximadamente 95% de daclizumab está en forma de monómero, según lo medido por cromatografía mediante exclusión de tamaño.

78. El proceso de la reivindicación 77, en donde la composición obtenida tiene menos de 50 ppm de proteínas de célula hospedadora de una fuente recombinante de daclizumab, menos de 10 ppm de proteína A, y no más de 3% de daclizumab en la composición está en forma de agregado.

79. Medio básico de PFBM2.

80. Medio de alimentación PFFM3.

81. Una composición de daclizumab, que se obtiene por un proceso que comprende la etapa de cultivar una célula hospedadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 bajo las condiciones en las cuales el daclizumab se secreta en medio de cultivo.

82. La composición de daclizumab de la reivindicación 81, en la cual el proceso adicionalmente comprende la etapa de aislar el daclizumab secretado del medio de cultivo celular.

83. Un amortiguador útil para esterilizar una resina de cromatografía de afinidad de proteína A, que comprende aproximadamente 100-500 mM de citrato de sodio, aproximadamente 10-30 mM de NaOH y aproximadamente 0.5-3% (v/v) de alcohol bencílico.

84. Un método para esterilizar una columna de cromatografía de afinidad de proteína A, que comprende lavar la columna con el amortiguador de esterilización de la reivindicación 83 a un caudal y durante un periodo de tiempo suficientes para esterilizar la columna.

85. El método de la reivindicación 84, en el cual la columna se lava con aproximadamente 1.8 volúmenes de columna de amortiguador de esterilización a un caudal de aproximadamente 150 cm/hr, la columna lavada se incuba sin caudal durante un período de aproximadamente 30-45 minutos, y después se equilibra con un amortiguador de equilibrio.

86. El método de la reivindicación 85, en el cual el amortiguador de equilibrio comprende aproximadamente 20 mM de citrato de sodio y 150 mM de NaCI, y tiene un pH de aproximadamente pH 7 (a 25°C).

87. Un método para a un paciente que sufre de esclerosis múltiple, que comprende administrar al paciente una cantidad suficiente de una composición de DAC HYP para proporcionar el beneficio terapéutico.

88. El método de la reivindicación 87, en el cual la composición de DAC HYP se administra de manera intravenosa.

89. El método de la reivindicación 88, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a aproximadamente 0.8-0.9 mg/kg de DAC HYP.

90. El método de la reivindicación 89, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a aproximadamente 1 mg/kg de DAC HYP.

91. El método de cualquiera de las reivindicaciones 87-90, en el cual el DAC HYP se administra una vez por semana durante un período de por lo menos 6 semanas, por lo menos 12 semanas, o por lo menos 24 semanas.

92. El método de cualquiera de las reivindicaciones 87-91, en el cual el DAC HYP se administra como una monoterapia.

93. El método de la reivindicación 92, en el cual el paciente no ha podido responder al tratamiento anterior con interferón beta o ha discontinuado el tratamiento anterior con interferón beta.

94. El método de cualquiera de cualquiera de las reivindicaciones 87-91, en el cual el DAC HYP se administra en combinación con el interferón beta.

95. El método de la reivindicación 87, en el cual la composición de DAC HYP se administra de manera subcutánea.

96. El método de la reivindicación 95, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a aproximadamente 1 mg/kg de DAC HYP.

97. El método de la reivindicación 96, en el cual la composición de DAC HYP se administra una vez cada dos semanas.

98. El método de la reivindicación 97, en el cual la composición de DAC HYP se administra durante un total de de aproximadamente 24 semanas.

99. El método de la reivindicación 95, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a aproximadamente 2 mg/kg de DAC HYP.

100. El método de la reivindicación 99, en el cual la composición de DAC HYP se administra una vez cada 4 semanas.

101. El método de la reivindicación 100, en el cual la composición de DAC HYP se administra durante un total de aproximadamente 24 semanas.

102. El método de la reivindicación 101, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a 75 mg a 300 mg de DAC HYP.

103. El método de la reivindicación 102, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a 150 mg.

104. El método de la reivindicación 102, en el cual la composición de DAC HYP se administra en una cantidad que corresponde a 300 mg.

105. El método de cualquiera de las reivindicaciones 101-104, en donde la composición de DAC HYP se administra una vez cada 4 semanas.

106. El método de la reivindicación 105, en donde la composición de DAC HYP se administra durante un total de por lo menos 48 semanas.

107. El método de cualquiera de las reivindicaciones 101-106 en el cual el DAC HYP se administra como una monoterapia.

108. El método de la reivindicación 107, en el cual el paciente no ha podido responder al tratamiento anterior con interferón beta o ha discontinuado el tratamiento anterior con interferón beta.

109. El método de cualquiera de las reivindicaciones 101-106, en el cual el DAC HYP se administra en combinación con el interferón beta.