KR101415660B1 - 샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 표적 단백질을 정제하는 방법 - Google Patents

샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 표적 단백질을 정제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 적어도 부분적으로, 개선된 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 적어도 부분적으로, Fc 영역 함유 단백질 및 1 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 Fc 영역 함유 단백질을 정제하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 지지 탱크 및/또는 완충액 교환 단계의 필요성을 제거한다.

Description

샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 표적 단백질을 정제하는 방법{Method for purifying a target protein from one or more impurities in a sample}
관련출원
본 출원은, 그 전체 내용이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된, 2009년 8월 7일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/273,709호를 우선권 주장하는 것이다.
발명의 분야
본 발명은, 적어도 부분적으로, 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 적어도 부분적으로, 표적 단백질 및 1 이상의 불순물을 포함하는 조성물로부터 표적 단백질(예를 들어 항체 및 그의 단편과 같은 Fc 영역 함유 단백질 및 예를 들어 면역접합체(immunoadhesins)와 같은 항체-유사 분자)를 정제하는 방법에 관한 것이다.
단백질, 예를 들어 항체를 비롯한 치료 단백질(therapeutic protein)의 효과적이고 경제적인 대규모 정제는 생명공학 및 약학 산업에 있어서 점점 중요한 고려 대상이다. 일반적으로, 단백질 정제 방법은 아주 정교하고 비용이 비싸고 또 상이한 다수 단계를 포함한다. 예를 들어, 전형적으로, 단백질은 세포 배양 방법을 이용하여, 예컨대 목적하는 단백질에 대한 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 삽입하는 것에 의하여 목적하는 단백질을 생성하도록 조작(engineered)된 포유동물 또는 박테리아 세포주를 사용하여 제조된다. 일반적으로, 세포에 공급된 배지 성분으로부터 및 세포 그 자체의 부생성물뿐만 아니라 존재할 수 있는 기타 불순물로부터 소망하는 단백질을 분리하는 것은 상당한 도전을 제공할 수 있다. 이러한 분리는 치료 단백질을 인간에 사용하려 할 때 특히 중요하며 또 FDA(Food and Drug Administration)로부터 승인을 받아야 한다.
일반적으로, 현재 이용되고 있는 정제 방법은 적어도 다음 단계들을 포함한다: 세포내 단백질을 회수하기 위하여 또는 분비 단백질의 경우 배지로부터 단백질을 회수하기 위하여 세포를 용해하는 단계; 차등 원심분리 또는 여과를 이용하여 세포 부서러기를 제거하여 목적하는 단백질을 함유하는 청정화된(clarified) 샘플을 얻는 단계; 다단계 방법에서 다양한 크로마토그래피 매질을 사용하여 샘플 중의 다양한 불순물로부터 목적하는 단백질을 분리하는 단계.
일반적으로 사용되는 크로마토그래피 방법은 1 이상의 친화성 크로마토그래피 매질, 이온 교환 크로마토그래피 매질, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 크기 배제 및 혼합 모드(즉, 다양한 크로마토그래피 방법의 조합)를 포함한다. 예를 들어, 단일클론(monoclonal) 항체를 정제하기 위하여, 몇 개 방법이 기재되어 있으며, 그 대부분은 초기 단백질 A 친화성 포획 단계에 이어, 1 이상의 이온 교환 연마(polishing) 단계를 포함한다. 또한, 결합 및 용출 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC); 플로우-쓰루(flow-through) 소수성 상호작용 크로마토그래피(FTHIC); 혼합 모드 크로마토그래피 수법, 예를 들어 결합 및 용출 약한 양이온 및 음이온 교환(Abx), 결합 및 용출 소수성 및 이온 교환 상호작용 및 플로우-쓰루 소수성 및 이온 교환 혼합 모드 상호작용(FTMM) 등과 같이, Capto Adhere, Capto MMC, HEA Hypercel, PPA Hypercel과 같은 수지를 이용할 수 있는 기타 크로마토그래피 기술이 사용될 수 있다. 또한, 기타 및 다양한 수법의 조합과 함께 소수성 전하 유도(HCI) 크로마토그래피가 연마를 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 연마 단계는 음이온 교환 단계를 함유하여 부가적인, 직교(orthogonal) 바이러스 제거 단계를 제공하는 것이 중요하다.
상기 논의한 바와 같이 다양한 크로마토그래피 단계의 조합을 비롯한 단백질 정제 방법이 기재되었지만, 이들 방법은 각 크로마토그래피 단계 사이에 지지 탱크 및/또는 완충액 교환 단계의 이용을 필요로 한다. 전형적으로, 표적 단백질은 용출되어 지지 탱크로 들어가며, 그곳에서 이들이 다음 크로마토그래피 단계에 적합하도록 완충액/용액 조건이 조정된다(완충액 교환이라 칭함). 지지 탱크 중의 완충액의 조건, 예를 들어 pH, 염 등은 전형적으로 다음 크로마토그래피 매질 또는 여과 막에 로딩(loading) 되기 전에 필요에 따라 조정된다.
발명의 요약
본 발명은 적어도 부분적으로, 1 이상의 불순물로부터 목적하는 단백질을 정제 또는 분리하는 개선된 방법을 제공하며, 상기 방법은 다양한 크로마토그래피 단계 사이에 지지 탱크 및/또는 완충액 교환 단계의 필요성을 제거한다.
다양한 구체예로서, 본 발명은 강인한 주형을 갖지만, 중간의 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계는 피하는 Fc 영역 함유 단백질(예를 들어 단일클론 항체 및 유사 단백질)의 정제를 제공한다. 따라서, 상기 정제 방법은 "연속 방법(connected process)"이라 칭할 수 있다. 이 방법은 연속적으로 지지 탱크를 갖지 않는 방법을 달성하기 위하여 적절한 조건 및 크로마토그래피 매질의 사용을 포함한다.
본 발명에 따른 일부 구체예로서, 샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 정제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 샘플을 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; (b) 상기 친화성 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계; (c) 상기 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; (d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계; (e) 상기 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및 (f) Fc 영역 함유 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 단계 (b)와 (c) 사이 및 단계 (d)와 (e) 사이에 지지 탱크의 필요성을 제거한다.
본 발명에 따른 다른 구체예로서, 샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 정제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 샘플을 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; (b) 상기 친화성 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계; (c) 상기 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; (d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계; (e) 상기 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및 (f) Fc 영역 함유 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 단계 (b)와 (c) 사이 및 단계 (d)와 (e) 사이에 완충액 교환 단계의 필요성을 제거한다.
본 발명에 따른 다른 구체예로서, 샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 정제하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 샘플을 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; (b) 상기 친화성 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계; (c) 상기 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; (d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계; (e) 상기 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및 (f) Fc 영역 함유 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 단계 (b)와 (c) 사이 및 단계 (d)와 (e) 사이에 지지 탱크 및 완충액 교환 단계의 필요성을 제거한다.
본 발명의 방법에 따른 다른 구체예로서, 상기 방법은 단계 (a)와 (b) 사이에 예비용출(pre-elution) 단계를 더 포함한다. 다양한 구체예로서, 상기 예비용출 단계는 단계 (a)의 친화성 크로마토그래피 매질을 양이온 교환 크로마토그래피 완충액과 접촉시키는 것을 포함한다.
다양한 구체예로서, 상기 청구된 방법은 1 이상의 불순물로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 정제하는데 유용하다. 이러한 Fc 영역 함유 표적 단백질은, 비제한적으로, 항체, 면역접합체(immunoadhesion) 분자 및 Fc 융합 단백질, 및 그의 Fc 함유 단편을 포함한다. 특별한 구체예로서, Fc 영역 함유 표적 단백질은 단일클론 항체이다.
다양한 구체예로서, 상기 Fc 영역 함유 표적 단백질은 2.0 내지 4.0 범위의 pH를 갖는 완충액을 사용하여 친화성 매질로부터 용출된다.
일부 구체예로서, 단계 (d)는 5.0 내지 9.0 범위의 pH를 갖는 완충액의 사용을 포함한다. 또 다른 구체예로서, 단계 (d)는 6.0 내지 8.0 범위의 pH를 갖는 완충액의 사용을 포함한다.
일부 구체예로서, 본 발명의 방법에서 친화성 크로마토그래피 매질 단계는 단백질 A 또는 그의 기능성 변이체(functional variants)의 사용을 포함한다.
일부 구체예로서, 본 발명에 따른 방법은 또한 단계 (c)와 (d) 사이에 바이러스 불활성화 단계를 포함한다. 일부 구체예로서, 상기 바이러스 불활성화 단계는 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 바이러스 불활성화에 적합한 기간 동안 4.0 보다 낮은 pH를 갖는 완충액과 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 시간은 통상 15분 내지 60분 범위이다.
샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 정제하기 위한 키트도 또한 제공된다. 일부 구체예로서, 이러한 키트는 1 이상의 친화성 크로마토그래피 컬럼, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 및 1 이상의 용출 완충액과 함께 키트를 사용하는 지시서를 포함한다.
일부 구체예로서, 키트에 포함된 1 이상의 크로마토그래피 컬럼은 일회용이다.
도 1 다양한 pH 조건하에서 샘플을 양이온 교환 컬럼에 로딩하는 크로마토그램을 도시한다.
도 2는, 실시예 3에 자세하게 기재된 바와 같이, 샘플을 비환원 조건하에서 분석하는 SDS-PAGE 실험의 결과를 도시한다. 모든 레인에서 우세한 밴드는 IgG를 나타낸다. 온전한(intact) IgG는 ~175 kDa에서 볼 수 있다. 150 kDa, 100 kDa, 75 kDa, 40 kDa, 및 20 kDa에서 나타나는 부가적 밴드는 부분적으로 환원된 IgG, 비집합(unassembled) IgG 또는 IgG 단편(fragment)으로부터 유래한다.
도 3은 인-라인 3단계 방법에 대한 컬럼 배관을 나타내는 변형된 Akta(즉, 크로마토그래피 작업소 또는 시스템)에 대한 개략도를 도시한다.
도 4는 단백질 A 친화성 매질을 양이온 교환 컬럼에 직접 로딩하는 크로마토그램을 도시한다.
도 5는 단백질 A 친화성 포획 단계 2 주기를 단일 인-라인 양이온 교환 컬럼 상에 로딩하는 크로마토그램을 도시한다.
도 6은 단백질 A 친화성 포획 단계 4 주기를 단일 인-라인 양이온 교환 컬럼에 로딩하는 크로마토그램을 도시한다.
도 7은, 실시예 4-7에 자세하게 기재한 바와 같이, SDS-PAGE 실험으로부터 얻은 결과를 도시한다. 모든 레인에서 우세한 밴드는 IgG를 나타낸다. 샘플은 환원 및 비환원 조건하에서 분석하였다. 온전한 IgG는 ~175 kDa에서 찾을 수 있다. 150 kDa, 100 kDa, 75 kDa, 40 kDa, 및 20 kDa에서의 부가적 밴드는 부분적으로 환원된 IgG, 비집합 IgG로부터 또는 IgG 단편으로부터 생긴다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은, 적어도 부분적으로, 샘플 함유 표적 단백질 및 1 이상의 불순물로부터 표적 단백질을 정제하기 위한 신규하고 개선된 방법을 제공하며, 상기 방법은 통상의 단백질 정제 방법의 일부를 형성하는 다양한 크로마토그래피 단계 사이에 전형적으로 실시되는, 지지 탱크 및/또는 완충액 교환 단계에 대한 필요성을 특이적으로 제거한다.
본 명세서에 기재된 방법은, 방법 제한을 감소시키고 또 액체 취급이 도전일 수 있는 일회용 또는 부분적으로 일회용 방법에 대한 주형을 제공하는 점에서 종래 기술에 기재된 방법에 비하여 발명적이고 또 더욱 효율적이다. 이 방법은 단일클론 항체와 같은 임의 단백질 A 결합 폴리펩티드(예를 들어 Fc 영역 함유) 및 Fc 영역을 함유하는 단편, 면역접합체 분자 및 Fc 융합 단백질에 적용될 수 있다. 일부 구체예로서, 상기 방법 조건은, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는, 정제될 표적 분자에 대한 pI 값에 따라 달라진다. 본 명세서에 기재된 완충액은 8.0 보다 큰 pI 값을 갖는 단일클론 항체와 같은 Fc 영역 함유 단백질에 대해 가장 잘 작용한다. 그러나, 상기 방법은, 당해 분야의 가르침 및 본 명세서에 기재된 내용을 기초로 하여, 8.0보다 낮은 pI 값을 갖는 단백질에 대해 용이하게 최적화될 수 있다.
I. 정의
본 발명을 더욱 용이하게 이해할 수 있도록, 특정 용어에 대해 먼저 정의한다. 부가적 정의는 상세한 설명을 통하여 기재한다.
용어 "면역글로불린," "Ig" 또는 "항체"(본 명세서에서는 상호교환적으로 사용됨)는 예를 들어 항원을 특이적으로 결합시키는 능력을 갖는 사슬간(interchain) 다이설피드(disulfide) 결합에 의해 안정화되는 2개의 중쇄(heavy chain) 및 2개의 경쇄(light chain)로 이루어지는 기본적으로 4개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 용어 "단일사슬 면역글로불린" 또는 "단일사슬 항체"(본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨)는 예를 들어 항원을 특이적으로 결합시키는 능력을 갖는 사슬간 펩티드 링커에 의해 안정화되는 1개 중쇄 및 1개 경쇄로 이루어진 2개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 용어 "도메인"은 예를 들어 β-주름형 시트 및/또는 사슬간 다이설피드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예컨대 3 내지 4개 펩티드 루프 포함)를 포함하는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구형 영역을 지칭한다. 도메인은 또한 "불변(constant)" 또는 "가변(variable)"으로도 지칭되는데, "불변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 서열 변이의 상대적 결여를 기본으로 하거나, 또는 "가변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 현저한 변이를 기본으로 한다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 흔히 이 기술분야에서 항체 또는 폴리펩티드 "영역"으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인으로 상호교환적으로 지칭된다.
면역글로불린 또는 항체는 단일클론 또는 폴리클론(polyclonal)일 수 있고 또 단량체 형태 또는 중합체 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어 IgM 항체는 오량체 형태로 존재할 수 있고 및/또는 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재할 수 있다. 면역글로불린 또는 항체는 또한 다중특이성(multispecific) 항체(예를 들어 이특이성(bispecific) 항체), 및 리간드-특이적 결합 도메인을 유지하거나 또는 포함하도록 변형되는 한 항체 단편을 포함할 수 있다. 용어 "단편"은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬에 비하여 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 지칭한다. 상기 단편은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통하여 얻을 수 있다. 상기 단편은 또한 재조합 수단에 의해서도 얻을 수 있다. 재조합적으로 생성되면, 단편은 단독으로 발현되거나 또는 융합 단백질이라 불리는 대형 단백질의 일부로서 발현된다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다.
일반적으로, 면역글로불린 또는 항체는 관심을 갖고 있는 "항원"에 대한 것이다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이며 또 질환 또는 장애에 걸린 포유동물에 상기 항체를 투여하는 것은 상기 포유동물에서 치료적 이점을 초래할 수 있다. 그러나, 비폴리펩티드 항원(종양-관련 당지질 항원과 같은; 미국특허 번호 5,091,178호 참조)에 대한 항체도 또한 고려할 수 있다. 항원이 폴리펩티드이면, 막횡단(transmembrane) 분자(예컨대 리셉터)이거나 또는 성장인자와 같은 리간드일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻은 항체, 즉 상기 집단이 소량으로 존재할 수 있는 천연산출 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 포함하는 개별 항체를 지칭한다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대하여 아주 특이적이다. 또한, 상이한 결정기(에피토프(epitopes))에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상의 (폴리클론) 항체 제조와 대조적으로, 각 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. "단일클론"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻은 항체의 특징을 나타내는 것으로, 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature 256:495 (1975)에 의해 최초로 기재된 하이브리도마(hybridoma) 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어 미국특허 번호 4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. MoI. Biol. 222:581-597 (1991)에 기재된 수법을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
단일클론 항체는 또한 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유도된 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 일치하거나 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하고, 사슬의 나머지는 다른 종으로부터 유도된 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 일치하거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 "키메라" 항체(면역글로불린)뿐만 아니라 소망하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편도 포함할 수 있다(미국특허 번호 4,816,567호; 및 Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984) 참조).
본 명세서에 사용된 용어 "초가변(hypervariable) 영역"은 항원-결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상기 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 얻은 아미노산 잔기(즉 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 31-35(Hl), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터 얻은 아미노산 잔기(즉 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia 및 Lesk J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크(framework)" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기보다는 가변 도메인 잔기이다.
비인간(예를 들어 쥐) 항체의 "인간화(humanized)" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수혜자의 초가변 영역 잔기가 소망하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체(donor antibody))으로부터 얻은 초가변 영역 잔기에 의해 치환되어 있는 인간 면역글로불린(수혜자 항체)(recipient antiboy)이다. 일부 예로서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 볼 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위하여 행해진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 전부 또는 실질적으로 전부에 상응하며 또 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 전부 또는 실질적으로 전부이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 더욱 자세한 내용은 Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)를 참조한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"는 리보뉴클레오티드이거나 또는 데옥시리보뉴클레오티드이건 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 이들 용어는 단일가닥, 이중가닥 또는 삼중가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 기타 천연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 주쇄(backbone)는 당 및 포스페이트기(RNA 또는 DNA에서 볼 수 있는 바와 같이), 또는 변형된 또는 치환된 당 또는 포스페이트기를 포함할 수 있다. 또한, 상보 가닥을 합성하고 그 가닥들을 적절한 조건하에서 어닐링(annealing)하는 것에 의해, 또는 적절한 프라이머와 함께 DNA 폴리머라제(polymerase)를 사용하여 새로이 상보 가닥을 합성하는 것에 의해 화학합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다. 핵산 분자는 예를 들어 유전자 또는 유전자 단편, 1 이상의 엑손, 1 이상의 인트론, mRNA, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분기된(branched) 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머와 같이 다수의 상이한 형태를 취할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체(analogs), 우라실, 기타 당 및 플루오로리보오스와 티오에이트와 같은 결합기, 및 뉴클레오티드 브랜치와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "DNA" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 염기 A, T, C, 및 G뿐만 아니라 메틸화 뉴클레오티드; 비하전(uncharged) 결합 및 티오에이트(thioate)와 같은 인터뉴클레오티드(internucleotide) 변형, 당 유사체의 사용, 및 변형된 및/또는 폴리아미드와 같은 선택적 주쇄 구조와 같은 이들 염기의 유사체 또는 변형된 형태도 포함한다. 특별한 구체예로서, 핵산 분자는 SpA의 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체(immunoadeheson)"는 면역글로불린 불변 도메인의 이팩터(effector) 기능을 갖는 이질 "접합체" 단백질(예를 들어 리셉터, 리간드 또는 효소)의 "결합 도메인"을 조합하는 항체-유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 상기 면역접합체는 항체의 항원 인식 및 결합 부위(항원 조합 부위)가 아닌 소망하는 결합 특이성을 갖는 접합체 아미노산 서열(즉, "이질적"임) 및 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역접합체 중의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 바람직하게는 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄로부터 유도되며, 이는 이들 영역을 포함하는 면역접합체는 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있기 때문이다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)).
"항체-면역접합체 키메라"는 항체의 적어도 1개 도메인(예를 들어 Fc 영역)과 적어도 1개의 면역접합체 분자를 조합하는 분자를 포함한다. 예시적 항체-면역접합체 키메라는 Berg et al, PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) 및 Chamow et al., J. Immunol. 153:4268 (1994)에 기재된 이특이적 CD4-IgG 키메라이다.
용어 "Fc 영역" 및 "Fc 영역 함유 단백질"은 단백질이 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 또는 면역 글로불린의 도메인(앞서 정의한 바와 같은 CH 및 CL 영역)을 함유하는 것을 의미한다. "Fc 영역"을 함유하는 단백질은 면역글로불린 불변 도메인의 이팩터 기능을 보유할 수 있다. CH2/CH3 영역과 같은 "Fc 영역"은 단백질 A 또는 그의 기능성 변이체와 같은 친화성 리간드에 선택적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예로서, Fc 영역 함유 단백질은 단백질 A 또는 그의 기능성 유도체, 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예로서, Fc 영역 함유 단백질은 단백질 G 또는 단백질 L, 또는 그의 기능성 유도체, 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "리간드 결합 도메인"은 임의의 천연 세포-표면 리셉터(receptor)이거나 또는 상응하는 천연 리셉터의 적어도 정량적 리간드 결합을 보유하는 임의 영역 또는 그의 유도체를 지칭한다. 청구된 발명에 따른 일부 구체예로서, 리간드 결합 도메인은 Fc 영역에 융합된다. 특정 구체예로서, 리간드에 대한 리셉터는 면역글로불린 슈퍼 유전자 패밀리의 멤버와 동종인 세포외(extracellular) 도메인을 갖는 세포-표면 폴리펩티드로부터 유도된다. 일반적으로, 본 발명의 방법에는, 리셉터가 본 명세서에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 포함하거나 그에 융합된 것인 한, 임의 리셉터가 사용될 수 있다. 면역글로불린 슈퍼 유전자 패밀리의 멤버가 아니지만 상기 정의에 특이적으로 포함되는 다른 리셉터는 사이토카인에 대한 리셉터, 및 특히 티로신 키나제 활성을 갖는 리셉터(리셉터 티로신 키나제), 헤마토포리에틴의 멤버 및 신경 성장인자 리셉터 슈퍼 패밀리, 및 세포 접합체 분자, 예컨대 (E-, L- 및 P-셀렉틴)이다.
용어 "리셉터 결합 도메인"은 세포 접합체 분자를 비롯한 리셉터에 대한 천연 리간드, 또는 상응하는 천연 리간드의 적어도 정량적 리셉터 결합능을 보유하는 그러한 천연 리간드의 임의 영역 또는 유도체를 지칭하기 위해 이용된다. 이 정의는, 다른 것 중에서도, 상술한 리셉터에 대한 리간드로부터 얻어진 결합 서열을 특이적으로 포함한다. 일부 구체예로서, 리셉터 결합 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같이, Fc 영역을 함유하거나 또는 Fc 영역에 융합된다.
본 명세서에서 용어 정제될 "조성물", "용액" 또는 "샘플"은 표적 단백질(예를 들어 Fc 영역 함유 단백질) 및 1 이상의 불순물을 포함한다. 상기 조성물 또는 샘플은 "부분적으로 정제"될 수 있거나(즉, 본 명세서에 기재된 바와 같이 비친화성 크로마토그래피와 같은 것에 의해 1 이상의 정제 단계에 처리된 것) 또는 폴리펩티드를 생성하는 숙주 세포 또는 생물로부터 직접 얻을 수 있다(예를 들어 상기 조성물은 수집된 세포 배양액 유체를 포함할 수 있다).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 지칭한다. 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "목적하는 단백질" 및 "표적 단백질"은, 비제한적으로, 본 발명의 방법에 의해 단백질 및 필요에 따라 세포 부서러기 등과 같은 기타 물질의 혼합물로부터 정제될 항체와 같이 Fc 영역 함유 단백질을 비롯한 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
상기 논의한 바와 같이, 일부 구체예로서, 표적 단백질은 Fc 영역 함유 단백질, 예를 들어 면역글로불린이다. 일부 구체예로서, Fc 영역 함유 단백질은 다른 폴리펩티드 또는 그의 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 예시적 폴리펩티드는 예를 들어 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; α-1 -항트립신; 인슐린 α-사슬; 인슐린 β-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트 인자와 같은 응고 인자; 단백질 C와 같은 항-응고인자; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 유로키나아제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제(t-PA)와 같은 플라스미노겐 활성화제; 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나제; RANTES(활성화시 조절화되어 정상적으로 T-세포 발현 및 분비된); 인간 마크로파아지 염증 단백질(MIP-1-α); 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민; 뮐레리안(Muellerian) 억제 물질; 릴랙신 α-사슬; 릴랙신 β-사슬; 프로릴랙신; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; β-락타마제와 같은 미생물 단백질; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA)(예를 들어 CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장인자(VEGF); 호르몬 또는 성장인자용 리셉터; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 뼈-유래 신경영양 인자(BDNF), 유로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6)과 같은 신경영양 인자, 또는 NGF-β; 혈소판-유래 성장인자(PDGF)와 같은 신경 성장인자; αFGF 및 βFGF와 같은 섬유아세포 성장인자; 표피 성장인자(EGF); TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-알파 및 TGF-β와 같은 형질전환 성장인자(TGF); 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(l-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질(IGFBP); CD3, CD4, CD8, CD 19 CD20, CD34, 및 CD40과 같은 CD 단백질; 에리쓰로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골형태발생 단백질(BMP); 인터페론-α -β 및 -γ와 같은 인터페론; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨(IL), 예를 들어 IL-I 내지 IL-IO; 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase); T-세포 리셉터; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 예를 들어, AIDS 엔빌로프의 일부와 같은 바이러스 항원; 수송 단백질; 호밍 리셉터(homing receptor); 어드레신; 조절 단백질; CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM과 같은 인테그린; HER2, HER3 또는 HER4 리셉터와 같은 종양 관련 항원; 및 상기 수록한 폴리펩티드의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 또한, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 수록한 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 단편 또는 변이체이다.
용어 "산성 변이체"는 표적 단백질에 비하여 더욱 산성(예컨대 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정되는 바와 같이)인 표적 단백질의 변이체이다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "오염물," "불순물" 및 "부서러기"는 본 발명의 방법을 이용하여 1 이상의 외래 또는 부적절한 분자로부터 분리되는 Fc 함유 표적 단백질을 함유하는 샘플에 존재할 수 있는 DNA, RNA, 1 이상의 숙주 세포 단백질, 내독소, 지질 및 1 이상의 첨가제와 같은 생물학적 거대분자를 비롯한 임의의 외래 또는 부적절한 분자이다. 또한, 이러한 오염물은 정제 방법 이전에 생길 수 있는 단계에서 사용되는 임의 시약을 포함할 수 있다.
용어 "중국 햄스터 난소 세포 단백질" 및 "CHOP"은 중국 햄스터 난소("CHO") 세포 배양물로부터 유도된 숙주 세포 단백질("HCP")의 혼합물을 지칭하기 위하여 상호교환적으로 사용된다. HCP 또는 CHOP는 CHO 세포에서 발현된 항체 또는 면역접합체과 같은 목적하는 단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 용해물(예를 들어 수집된 세포 배양액 유체("HCCF")) 중의 불순물로서 일반적으로 존재한다. 목적하는 단백질을 포함하는 혼합물 중에 존재하는 CHOP의 양은 목적하는 단백질의 순도의 정도를 제공한다. HCP 또는 CHOP는, 비제한적으로, CHO 숙주 세포와 같은 숙주 세포에 의해 발현된 목적하는 단백질을 포함한다. 전형적으로, 단백질 혼합물 중의 CHOP의 양은 혼합물 중의 목적하는 단백질의 양에 대하여 ppm(parts per million)으로 표시된다. 숙주 세포가 다른 세포 유형, 예를 들어 CHO 이외의 포유동물 세포, 대장균, 효모, 곤충 세포, 또는 식물 세포인 경우, HCP는 숙주 세포의 용해물에서 볼 수 있는 표적 단백질 이외의 단백질을 지칭한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "ppm"은 본 발명의 방법에 의해 정제된 표적 단백질의 순도의 정도를 지칭한다. 단위 ppm은 목적하는 단백질(밀리그램/밀리리터) 당 HCP 또는 CHOP(나노그램/밀리리터)의 양(즉, CHOP ppm = (CHOP ng/ml)/(목적하는 단백질 mg/ml), 이때 단백질은 용액 중에 있음)을 지칭한다. 단백질이 건조되면(동결건조에 의해서와 같이), ppm은 (CHOP ng)/(목적하는 단백질 mg)을 지칭한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "정제하는" "분리하는" 또는 "단리하는"은 폴리펩티드 및 1 이상의 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 폴리펩티드 또는 목적하는 단백질 또는 표적 단백질의 순도의 정도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 단백질의 순도의 정도는 상기 조성물로부터 적어도 1개 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거하는 것에 의해 증가된다. "정제 단계"는 목적하는 단백질을 포함하는 조성물 중에 100 ppm 미만의 HCP, 다르게는 90 ppm 미만, 80 ppm 미만, 70 ppm 미만, 60 ppm 미만, 50 ppm 미만, 40 ppm 미만, 30 ppm 미만, 20 ppm 미만, 10 ppm 미만, 5 ppm 미만, 또는 3 ppm의 HCP를 포함하는 조성물 또는 샘플을 지칭하기 위해 이용되는 "동종" 조성물 또는 샘플을 초래하는 전체적 정제 방법의 일부일 수 있다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "플로우-쓰루 방법", "플로우-쓰루 모드" 및 "플로우-쓰루 크로마토그래피"는 1 이상의 오염물과 함께 샘플에 함유된 적어도 1개 생성물(예를 들어 Fc 영역 함유 단백질)이 크로마토그래피 수지 또는 배지를 통하여 유동하는 한편, 적어도 1개의 가능성 있는 오염물 또는 불순물이 크로마토그래피 수지 또는 배지에 결합하게 되어 있는 생성물 분리 수법을 지칭한다. 상기 "플로우-쓰루 모드"는 일반적으로 등용매 조성(isocratic) 작업(즉, 이동상의 조성이 변경되지 않는 크로마토그래피 방법)이다.
청구된 방법에 따른 일부 구체예로서 및 본 명세서에 개시된 실시예에 기재된 바와 같이, 상기 방법은 플로우-쓰루 모드로 실시되는 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 적용한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "결합 및 용출 모드" 및 "결합 및 용출 방법"은 샘플 중에 함유된 적어도 1개 생성물(예를 들어 Fc 영역 함유 단백질)이 크로마토그래피 수지 또는 배지에 결합한 다음 용출되는 생성물 분리 수법을 지칭한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "지지 탱크," "풀 탱크" 및 "중간 탱크"는 방법 단계의 배출물(예를 들어 컬럼으로부터 용출액)을 수집하기 위해 사용될 수 있는, 용기, 탱크 또는 백을 지칭한다. 대부분의 통상의 방법에서, 1 이상의 중간 용기는 다음 방법 단계에 적합하게 하기 위하여 1개 방법 단계로부터의 배출물의 상태/특성을 조절하기 위해 사용된다. 예를 들어, 다음 크로마토그래피 컬럼 또는 단계에 풀(pool)을 로딩하기 전에, 크로마토그래피 컬럼 또는 단계로부터 얻은 용출액(예를 들어 단백질 표적 및 불순물 함유)의 pH 및/또는 도전성을 조절하는데 필요할 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 다양한 구체예로서, 지지 탱크에 대한 필요성이 제거된다. 따라서, 청구된 방법의 다양한 구체예로서, 상기 방법은 통상의 정제 방법에서 전형적으로 사용되는 지지 탱크를 필요로 하지 않고 1 이상의 불순물로부터 표적 단백질을 정제하는 개선된 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "연속 방법"은 지지 탱크 및/또는 완충액 교환 단계의 필요성을 제거한 Fc 영역 함유 단백질의 정제 방법을 지칭한다. 따라서, 청구된 발명에 따른 연속 방법은, 시간뿐만 아니라 자원 면에서 절약을 제공하므로 현재 사용되고 있는 통상의 정제 방법보다 훨씬 우수하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "완충액 교환 단계"는, 상기 기재한 바와 같이 많은 통상의 방법에서 전형적으로 지지 탱크를 대체하는 인-라인 용액 조건 조절을 지칭한다. 전형적인 완충액 교환 단계에서, 2개 용액은 전달하는 동안 파이프 또는 혼합 용기, 여과 장치 중에서 용액 혼합을 이용하여 혼합되거나 또는 적정될 수 있다. 예를 들어, 상기 용액을 다른 낮은 도전성 용액과 혼합하는 것에 의해 도전성을 낮추도록 용액을 사용하여 희석시킬 필요가 있다. 완충액 교환은 투석여과(diafiltration), 한외여과 등과 같은 여과 장치를 이용하여 달성될 수 있다. 청구된 발명에 따른 일부 구체예로서, 상기 방법은 완충액 교환 단계의 필요성을 제거하는, 개선된 단백질 정제 방법을 제공한다.
다른 구체예로서, 청구된 발명에 따른 방법은 지지 탱크뿐만 아니라 완충액 교환 단계의 필요성을 제거한다.
용어 "크로마토그래피"는 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 관심 분석물(예를 들어 면역글로불린과 같은 Fc 영역 함유 단백질)을 분리하는 수법 종류를 지칭한다. 통상, 관심 분석물은 혼합물의 개별 분자가 이동상 영향 하에서 정지상 매질을 통하여 이동하는 속도에서, 또는 결합 및 용출 방법에서 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "크로마토그래피 수지" 또는 "크로마토그래피 매질"은 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 관심 분석물(예를 들어 면역글로불린과 같은 Fc 영역 함유 단백질)을 분리하는 임의 고상 종류를 지칭한다. 통상, 관심 분석물은 혼합물의 개별 분자가 이동상 영향 하에서 정지상 매질을 통하여 이동하는 속도에서, 또는 결합 및 용출 방법에서 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다. 비제한적 예는 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 음이온 교환 수지, 음이온 교환 막, 소수성 상호작용 수지 및 이온 교환 모노리쓰(monoliths)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "친화성 분리" 또는 "친화성 정제"는 표적 분석물(예를 들어 면역글로불린과 같은 Fc 영역 함유 단백질)을 함유하는 샘플을 상기 표적 분석물을 결합시키는 것으로 공지된 친화성 매질(예를 들어 단백질 A 또는 그의 변이체와 같이 분석물을 결합시키는 것으로 공지된 친화성 리간드를 보유하는 고체 지지체)와 접촉시키는 것을 포함하는 정제 또는 에세이 수법을 지칭한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "친화성 크로마토그래피" 및 "단백질 친화성 크로마토그래피"는 표적 단백질(예를 들어 Fc 영역을 함유하는 목적 단백질 또는 항체)이 표적 단백질에 대하여 특이적인 리간드에 특이적으로 결합되는 단백질 분리 수법을 지칭한다. 이러한 리간드는 일반적으로 생체특이적(biospecific) 리간드라 칭한다. 일부 구체예로서, 생체특이적 리간드(예를 들어 단백질 A 또는 그의 기능성 변이체)는 크로마토그래피 고상 물질에 공유 결합되고 또 용액이 크로마토그래피 고상 물질과 접촉함에 따라서 용액 중의 표적 단백질에 접근할 수 있다. 표적 단백질은 일반적으로 크로마토그래피 단계 동안 생체특이적 리간드에 대한 그의 특이적 결합 친화성을 유지하는 반면에, 혼합물 중의 다른 용액 및/또는 단백질은 리간드에 눈에 띄게 또는 특이적으로 반응하지 않는다. 표적 단백질이 고정화 리간드에 결합하는 것은 크로마토그래피 매질을 통하여 통과할 단백질 또는 단백질 불순물 오염을 허용하는 반면에, 표적 단백질은 고상 물질 상의 고정화 리간드에 특이적으로 결합되어 존재한다. 특이적으로 결합된 표적 단백질은 적절한 조건(예를 들어 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁 리간드 등)하에서 고정화 리간드로부터 활성화 형태로 제거되며, 또 컬럼을 통과하도록 이전에 허용된 오염성 단백질 또는 단백질 불순물을 갖지 않는 용출 완충액에 의해 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 각 특이적 결합 단백질, 예컨대 항체를 정제하기 위한 리간드로서 임의 성분이 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 다양한 방법에서, 단백질 A는 Fc 영역 함유 표적 단백질에 대한 리간드로서 사용된다. 표적 단백질(예를 들어 Fc 영역 함유 단백질)의 생체특이적 리간드(예를 들어 단백질 A)로부터 용출하기 위한 조건은 당해 분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 구체예로서, 단백질 G 또는 단백질 L 또는 그의 기능성 변이체가 생체특이적 리간드로서 사용될 수 있다. 일부 구체예로서, 단백질 A과 같은 생체특이적 리간드는 Fc 영역 함유 단백질에 결합시키고, 생체특이적 리간드/표적 단백질 콘쥬게이트를 세척하거나 재평형화한 다음 적어도 1개 염을 함유하는 pH 약 4 이하의 완충액을 사용하여 용출시키기 위하여 5-9 범위의 pH에서 사용된다.
용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는 관심 용질 또는 분석물이 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물에 비하여 하전 화합물과 비특이적으로 상호작용하도록 혼합물 중의 관심 용질 또는 분석물(예를 들어 Fc 영역 함유 표적 단백질)이 고상 이온 교환 물질에 결합된(공유결합 부착에 의해) 하전 화합물과 상호작용하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 혼합물 중의 오염성 용질은 관심 용질에 비하여 더 신속하게 또는 더 느리게 이온 교환 물질의 컬럼으로부터 용출되거나 또는 관심 용질에 대하여 수지에 결합되거나 배출된다. "이온-교환 크로마토그래피"는 특이적으로 양이온 교환, 음이온 교환, 및 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자(예를 들어 Fc 영역 함유 표적 단백질)를 결합시킨 다음 용출(양이온 교환 결합 및 용출 크로마토그래피 또는 "CIEX")시키거나 또는 주로 불순물을 결합시키는 한편 표적 분자는 컬럼을 통과(플로우 쓰루)시킬 수 있다(양이온 교환 통과(플로우 쓰루) 크로마토그래피 FT-CIEX). 음이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자(예를 들어 Fc 영역 함유 표적 단백질)를 결합시킨 다음 용출시키거나 또는 불순물을 주로 결합시키고 표적 분자는 컬럼을 통과시킨다. 일부 구체예로서 및 이하의 실시예에 나타낸 바와 같이, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 플로우 쓰루 모드로 실시된다.
용어 "이온 교환 물질"은 음으로 하전(즉 양이온 교환 수지)되거나 또는 양으로 하전(즉 음이온 교환 수지)된 고상을 지칭한다. 전하는 1 이상의 하전된 리간드를 예컨대 공유 결합에 의해 상기 고상에 부착시키는 것에 의해 제공될 수 있다. 다르게는, 또는 전하는 고상의 고유한 특성일 수 있다(예컨대 전체적 음전하를 갖는 실리카의 경우에서와 같이).
"양이온 교환 수지"는 음으로 하전되므로 고상 위를 또는 고상 속을 통과하는 수성 용액 중의 양이온을 교환하기 위하여 양이온을 갖지 않는 고상을 지칭한다. 고상에 부착하여 양이온 교환 수지를 형성하는 음으로 하전된 리간드는 예를 들어 카복실레이트 또는 설포네이트일 수 있다. 상업적으로 입수가능한 양이온 교환 수지는 카복시-메틸-셀룰로오스, 아가로오스 상에 고정된 설포프로필(SP)(예를 들어 SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCETM, 파마시아 제조) 및 아가로오스 상에 고정된 설포닐(예컨대 S-SEPHAROSE FAST FLOWTM, 파마시아 제조)를 포함한다.
"혼합 모드 이온 교환 수지"는 양이온성, 음이온성, 및 소수성 잔기에 의해 공유결합적으로 변형된 고상을 지칭한다. 상업적으로 입수가능한 혼합 모드 이온 교환 수지는 약한 양이온 교환기, 저농도의 음이온 교환기, 및 실리카겔 고상 지지 매트릭스에 부착된 소수성 리간드를 함유하는 BAKERBOND ABXTM(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)이다.
용어 "음이온 교환 수지"는 양으로 하전된, 예컨대 1 이상의 양으로 하전된 리간드, 예컨대 부착된 4급 아미노기를 갖는 양으로 하전된 고상을 지칭하기 위하여 사용된다. 상업적으로 입수가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로오스, QAE SEPHADEXTM 및 FAST Q SEPHAROSETM (파마시아 제조)를 포함한다.
용어 "단백질 A" 및 "ProA"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 또 천연 공급원으로부터 회수된 단백질 A, 합성적으로 제조된 단백질 A(예를 들어 펩티드 합성에 의해 또는 재조합 수법에 의해), 및 Fc 영역과 같은 CH2/CH3 영역을 갖는 단백질에 결합하는 능력을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 단백질 A는 레플리겐(Repligen), 파마시아 및 퍼마테크(Fermatech)로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 단백질 A는 일반적으로 고상 지지체 물질 상에 고정된다. 용어 "ProA"는 또한 단백질 A가 공유결합되어 있는 크로마토그래피 고체 지지 매트릭스를 함유하는 친화성 크로마토그래피 수지 또는 컬럼을 지칭한다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 단백질 A의 기능성 유도체, 단편 또는 변이체는 마우스 IgG2a 또는 인간 IgG1의 Fc 영역에 대하여 적어도 K=1O-8 M, 및 바람직하게는 K=1O-9M의 결합 상수를 특징으로 할 수 있다. 결합 상수에 대한 이러한 값에 순응하는 상호작용을 본 발명에서는 "높은 친화성 결합"이라 칭한다. 바람직하게는, 단백질 A의 이러한 기능성 유도체 또는 변이체는 IgG 결합 작용성을 유지한 천연 도메인 E, D, A, B, C 또는 조작된 그의 돌연변이체로부터 선택된 야생성 단백질 A의 기능성 IgG 결합 도메인의 적어도 일부를 포함한다.
또한 단일 지점 부착을 허용하도록 조작된 단백질 A 유도체 또는 변이체는 청구된 방법의 친화성 크로마토그래피 단계에서 사용될 수 있다. 단일 지점 부착은 상기 단백질 잔기가 일반적으로 단일 공유 결합을 통하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 크로마토그래피 지지체 물질에 부착되는 것을 의미한다. 이러한 단일 지점 부착은 또한 단백질 폴드(fold)의 N- 또는 C-말단 또는 외주면 상의 다른 곳에 가까운 루프 중의 노출된 아미노산 위치에 위치하는 적합한 반응성 잔기의 사용에 의해 생길 수 있다. 적합한 반응기는 예컨대 설프히드릴 또는 아미노 작용기이다.
본 발명에 따른 "오염성 단백질 A"는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로부터 결합 항체를 용출시킬 때 얻어진 상기 정의한 바와 같은 단백질 A 또는 그의 기능성 유도체의 임의 유형의 기능성 IgG 결합 후손(offspring)이다. 이러한 오염성 단백질 A 종은 특히 공업적 제조에서 효소 작용에 의해 생길 수 있는 펩티드 결합의 가수분해로부터 초래될 수 있다. 단백질 A 크로마토그래피는 대충 정제된, 새로운 생성물 용액이 여전히 상당한 프로테아제(protease) 활성을 보유하고 있을 때 하류 처리(downstream processing)의 초기 단계로서 적용된다. 초기 원심분리 또는 여과 단계에서 파쇄된 세포 배양액 육즙 또는 세포 중의 죽어가는 세포는 자유 프로테아제를 가질 것으로 보이며; 조절 목적의 경우, 생화학적 연구 실험과 대조적으로, 하류 처리 이전 또는 도중에 프로테아제 억제제를 갖는 세포 배양 육즙의 보충은 보통 실시되지 않는다. 그 예는 페닐-메틸-설포닐-클로라이드(PMSF) 또는 e-카프로산이다. 이러한 화학제는 생물학적약제(biopharmaceuticals)의 생산에서 첨가제로서 바람직하지 않다. 단백질 A의 재조합 기능성 유도체 또는 단편은 단백질 폴드의 삼차 구조에 따라서 야생형(wild-type) 단백질 A에 비하여 프로테아제 내성이 덜할 수 있다. 개별 IgG 결합 도메인을 연결하는 아미노산 절편은 결합 도메인의 전체 개수가 감소되면 노출될 수 있다. 도메인간 접촉은 도메인 폴딩의 안정성에 기여할 수 있다. 단백질 A 또는 그의 기능성 유도체에 의한 항체의 결합은 항체의 결합시 유도된 형태 변화로 인하여, 프로테아제 작용에 대한 감수성에 영향을 주거나 또는 프로테아제 작용에 대한 감수성을 용이하게 할 수 있다. 또한, 야생형 또는 전장(full length) 단백질 A 또는 그의 기능성, 조작된 단편은 상이하게 거동할 수 있다.
분자를 크로마토그래피 수지에 "결합"시키는 것은 적절한 조건(pH/도전성)하에서 분자를 크로마토그래피 수지에 노출시켜 상기 분자가 리간드-단백질 상호작용으로 인하여 크로마토그래피 수지 속에 또는 위에 가역적으로 고정되는 것을 의미한다. 비제한적 예는 분자와 하전된 기 또는 이온 교환물질의 하전된 기 사이의 이온성 상호작용 또는 및 단백질 A와 면역글로불린 사이의 생체특이적 상호작용을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 표적 단백질(예를 들어 Fc 영역 함유 단백질) 및 고체 지지체(예를 들어 고상 매트릭스 또는 수지에 결합된 단백질 A)에 결합된 리간드 사이의 상호작용을 기재하는 것과 같은 용어 "특이적 결합"은 결합 부위에서 정전력, 수소결합, 소수성 힘, 및/또는 반데어발스력에 의해 결합된 단백질 및 리간드 구조의 공간적 상보성의 조합 효과를 통하여 리간드에 대한 목적 단백질의 가역적 결합을 지칭한다. 일반적으로, 상기 공간적 상보성이 클수록 결합 부위에서 다른 힘이 더 커지며, 각 리간드에 대한 단백질의 결합 특이성도 더 커질 것이다. 특이적 결합의 비제한적 예는 항체-항원 결합, 효소-기질 결합, 효소-보조인자 결합, 금속 이온 킬레이트화, DNA 결합 단백질-DNA 결합, 조절 단백질-단백질 상호작용 등을 포함한다. 이상적으로, 친화성 크로마토그래피에서 특이적 결합은 유리 용액에서 약 10-4 내지 10-8 M의 친화성으로 생긴다.
관심 분자(예를 들어 표적 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같음)와 고체 지지체에 결합된 리간드 또는 다른 화합물(예를 들어 고상 매트릭스 또는 수지에 결합된 단백질 A) 사이의 상호작용을 개시하기 위하여 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "비특이적 결합"은 상호작용 부위에서 정전력, 수소결합, 소수성 힘, 및/또는 반데어발스력을 통하여 고체 지지체 상의 리간드 또는 화합물에 목적하는 단백질을 결합시키지만, 비구조적 힘의 영향을 개선시키는 구조적 상보성은 결여하는 것을 지칭한다. 비특이적 상호작용의 예는, 비제한적으로, 정전, 소수성, 및 반데어발스력뿐만 아니라 수소결합을 포함한다.
"염"은 산 및 염기의 상호작용에 의해 형성된 화합물이다. 본 명세서에 기재된 완충액에 사용될 수 있는 다양한 염은, 비제한적으로, 아세테이트(예컨대 나트륨 아세테이트), 시트레이트(예컨대 나트륨 시트레이트), 클로라이드(예컨대 염화 나트륨), 설페이트(예컨대 나트륨 설페이트), 또는 칼슘 염을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "용매"는 용액을 제공하기 위하여 1 이상의 다른 물질을 용해 또는 분산시킬 수 있는 액체 물질을 지칭한다. 용매는 수성 및 유기 용매를 포함하며, 유용한 유기 용매는 비극성 용매, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세토니트릴, 헥실렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 2,2-티오디글리콜을 포함한다.
용어 "세제"는 폴리소르베이트(예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴옥사머(예컨대 폴옥사머 188); 트리톤; 나트륨 도데실 설페이트(SDS); 나트륨 라우렐 설페이트; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소테아르아미도프로필-베타인(예컨대 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 디나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQU ATTM 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.)와 같은 이온성 및 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 유용한 세제는 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20(TWEEN 20®) 또는 폴리소르베이트 80(TWEEN 80®)이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "중합체"는 2 이상의 단량체의 공유 결합에 의해 형성된 분자를 지칭하며, 상기 단량체들은 아미노산 잔기가 아니다. 중합체의 예는 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 공중합체(예컨대 Pluronics, PF68 등)을 포함한다. 유용한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예컨대 PEG 400 및 PEG 8000이다.
"고상" 또는 "다공성 기질" 또는 "기본 매트릭스"는 1 이상의 하전된 리간드가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상은 정제 컬럼, 개별 입자의 비연속 상, 막, 모노리스(monolith) 또는 필터 등을 포함한다. 고상을 형성하는 물질의 예는 다당류(아가로오스 및 셀룰로오스와 같은); 및 기타 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 실리카(예컨대 제어된 기공 글래스), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 상술한 것의 유도체를 포함한다.
"완충액"은 산-염기 콘쥬게이트 성분의 작용에 의해 pH 변화를 견디는 용액이다. 예를 들어 완충액의 소망하는 pH에 따라 이용될 수 있는 다양한 완충액은 완충액 부분에 기재되어 있다. 완충액의 제조 및 사용에 대한 가이드는 Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation(1975)에 기재되어 있다. 청구된 발명의 방법의 일부 단계에서, 완충액은 2.0 내지 4.0 범위, 또는 2.8 내지 3.8범위의 pH를 갖는다. 청구된 발명의 다른 단계에서, 완충액은 5.0 내지 9.0 범위의 pH를 갖는다. 청구된 발명의 다른 단계에서, 완충액은 4.0 내지 6.5 범위의 pH를 갖는다. 청구된 발명의 방법의 다른 단계에서, 완충액은 4.0보다 낮은 pH를 갖는다. 상기 범위에서 pH를 제어하는 완충액의 비제한적 예는 MES, MOPS, MOPSO, 트리스, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 및 암모늄 완충액, 뿐만 아니라 이들의 조합물을 포함한다.
용어 "양이온 교환 완충액"은 표적 분자(예컨대 면역글로불린)가 양이온 교환 물질에 결합되도록 pH 및 도전성을 갖는 평형 완충액을 지칭한다.
"로딩 완충액"은 목적하는 표적 분자(예를 들어 Fc 영역 함유 표적 단백질) 및 1 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 친화성 컬럼 또는 이온 교환 컬럼)에 로딩하기 위해 사용되는 완충액이다. 로딩 완충액은 목적하는 단백질은 컬럼을 따라 흘러나가는 반면에 불순물은 수지에 결합되게 하도록 목적 분자(및 일반적으로 1 이상의 불순물)가 크로마토그래피 수지에 결합되게 하는 도전성 및/또는 pH를 갖는다.
"중간 완충액"은 목적하는 폴리펩티드 분자를 용출시키기 전에 크로마토그래피 수지로부터 1 이상의 불순물을 용출시키기 위하여 사용된다. 중간 완충액의 도전성 및/또는 pH는 1 이상의 불순물이 이온 교환 수지로부터 용출되지만, 목적하는 폴리펩티드의 상당량은 용출되지 않게 한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "세척 완충액" 또는 "평형 완충액"은 목적하는 폴리펩티드 분자를 용출시키기 전에 크로마토그래피 수지를 세척하거나 재평형화하기 위하여 사용되는 완충액이다. 일부 경우에서, 세척 완충액 및 로딩 완충액은 동일할 수 있다.
"용출 완충액"은 고상으로부터 표적 단백질을 용출시키기 위하여 사용된다. 용출 완충액의 도전성 및/또는 pH는 표적 단백질이 크로마토그래피 수지로부터 용출되도록 한다.
"재생 완충액"은 재사용될 수 있는 크로마토그래피 수지를 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 재생 완충액은 크로마토그래피 수지로부터 실질적으로 모든 불순물 및 표적 단백질을 제거하는데 필요한 도전성 및/또는 pH를 갖는다.
용어 "도전성"은 2개 전극 사이에 전류를 흐르게 하는 수성 용액의 능력을 지칭한다. 용액에서, 전류는 이온 수송에 의해 흐른다. 따라서, 수성 용액에 존재하는 이온양의 증가에 따라서, 용액은 더 높은 도전성을 가질 것이다. 도전성의 측정 단위는 밀리지멘스/센티미터(mS/cm 또는 mS)이고, 또 예를 들어 오리온에 의해시판되는 도전성 측정계를 이용하여 측정될 수 있다. 용액의 도전성은 그 속의 이온 농도를 바꾸는 것에 의해 변경될 수 있다. 예를 들어, 용액 중의 완충제의 농도 및/또는 염(예컨대 NaCl 또는 KCl)의 농도는 소망하는 도전성을 달성하도록 변경될 수 있다. 바람직하게는, 다양한 완충액의 염 농도는 이하의 실시예에서와 같이 소망하는 도전성을 달성하도록 변형될 수 있다.
폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드의 양전하가 그의 음전하 균형을 유지시키는 pH를 지칭한다. pI는 폴리펩티드의 아미노산 잔기 또는 부착 탄수화물의 시알산 잔기의 네트 전하로부터 산출될 수 있거나 또는 등전점전기영동에 의해 결정될 수 있다.
크로마토그래피 매질을 "세척"하는 것은 배지 위로 적절한 완충액을 통과시키는 것을 의미한다.
크로마토그래피 수지로부터 분자(예를 들어 목적 폴리펩티드 또는 불순물)를 용출시키는 것은 완충액이 크로마토그래피 수지 상의 리간드 부위에 대해 목적하는 분자와 경쟁하도록 용액 조건을 변경하는 것에 의해 분자를 제거하는 것을 지칭한다. 비제한적인 예는 이온 교환 물질을 둘러싸는 완충액의 이온 세기를 변경하는 것에 의해 완충액이 이온 교환 물질 상의 하전 부위에 대해 분자와 경쟁하도록 하는 것에 의해 이온 교환 수지로부터 분자를 용출시키는 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "여액"은 여과 막을 통하여 통과하는 샘플 부분을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "잔여분(retentate)"은 여과 막에 의해 실질적으로 유지된 샘플 부분을 지칭한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "바이러스 불활성화", "바이러스 제거" 또는 "바이러스 감소"는 바이러스가 세포를 감염시킬 수 없게 만들거나 또는 생리화학적 수단을 통하여 바이러스 기능을 억제하는 임의 방법을 지칭한다. 전형적인 바이러스 불활성화 방법은, 비제한적으로, 낮은 pH 처리(예를 들어 pH 4.5 미만, 4.0 미만 또는 3.8 미만), 열처리, 계면활성제 및 방사선 처리(예를 들어 자외선 노출)를 포함한다. 일부 구체예로서, 바이러스 불활성화 방법은 레트로바이러스(retrovirus)에 대한 것이다. 특별한 구체예로서, 낮은 pH 조건은 전형적으로 바이러스 지질 엔빌로프(envelope)를 파쇄하여 바이러스를 불활성화하는 조건과 같이 바이러스 불활성화를 위해 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "낮은 pH 조건"은 수성 용액 또는 완충액의 특성을 지칭하며, 용액 또는 완충액의 pH는 Fc 영역 함유 단백질(예컨대 단일클론 항체 또는 MAbs)을 함유하는 샘플을 로딩하는 양이온 교환(CIEX) 배지에 전형적으로 사용되는 정상 작업 조건보다 아래이다. 예를 들어, 전형적인 CIEX 로딩 조건은 pH 4.5 이상, 및 일반적으로 pH 5 내지 6이다. 본 발명에 따른 방법에서, 낮은 pH 조건은 예를 들어 4.5 아래의 pH가 이용될 수 있다.
용어 "예비용출 단계"는 용출하기 전의 끝에서 두번째 크로마토그래피 단계를 지칭하며, 이때 표적 분자는 컬럼에 결합되어 존재하지만, 다음 컬럼으로 로딩하는 동안 완충액 혼합은 표적 수율 또는 표적 순도에 나쁜 영향을 주지 않는다. 비제한적 예는 pH 5.4 나트륨 아세테이트 또는 pH 5.0 나트륨 시트레이트와 같은 양이온 교환 컬럼 로딩에 적합한 완충액 중에 Fc 함유 단백질이 로딩된 단백질 A 컬럼을 평형화한 다음, pH 3 나트륨 아세테이트를 사용하여 컬럼을 양이온 교환 컬럼으로 용출하는 것을 포함한다.
"탄젠트 유동 여과" 또는 "TFF" 또는 "크로스유동 여과"는 샘플 혼합물이 막의 상부를 횡단하여 회전하는 반면에, 인가된 압력은 특정 용질 및 소형 분자로 하여금 막을 통과하도록 하는 여과 방법을 지칭한다. 전형적으로, 상기 용액은 필터 막과 평행하게 흐른다. 막 전체 압력차는 유체 및 여과성 용질이 필터를 통과하게 한다. 이것은 연속-유동 방식으로 실시될 수 있는데, 왜냐하면 상기 용액이 막 전반에 걸쳐 반복적으로 통과하는 한편, 필터를 통과하는 유체는 연속적으로 별개 회로로 배출되기 때문이다.
"고성능 탄젠트 유동 여과" 또는 "HPTFF"는 막횡단 압력 곡선에 대하여 플럭스 상의 막횡단 압력의 5% 내지 100% 사이의 플럭스로 실시된 TFF를 지칭한다(예를 들어, 미국특허 번호 5,256,694호; 미국특허 번호 4,490,937호; 및 미국특허 번호 6,054,051호 참조).
"기공 크기 분포"는 확률 밀도 함수로서 표현된, 일부 이론적 반경(r) 근처의 실제 반경(R)을 갖는 기공의 수를 기본적으로 지칭한다(참조: Zeman, L. J. and Zydney, A. L., supra, p. 299-301). 실제 기공 반경의 표준편차가 증가함에 따라서, 기공 크기 분포는 증가한다. 협소화된 기공 크기 분포는 이론적 값으로부터 기공의 표준편차에서 감소에 기인한 것이다. 이것은 예를 들어, 대형 기공의 일부 크기가 하전 화합물이 하전된 막의 대형 기공에 부가되는 것에 의해 감소될 수 있다. 액체-액체 기공 침투의 원리는 기공 크기 분포 측정에 유용하다(참조: R. van Reis and A. L. Zydney, supra, p. 2201). 상기 원리에 따르면, 2개의 고 비혼화성 액체, 예컨대 설페이트 염 및 폴리(에틸렌 글리콜)의 용액을 혼합을 통하여 접촉시켜 평형 분배에 도달시켰다. 시험할 막은 액체 중의 하나로 처리하여 모든 기공이 충전되게 한다. 공급 채널을 배출한 후, 제2 유체를 계에 도입한다. 제1 유체는 제2 유체에 의해 기공 밖으로 배출되며, 또 유동속도는 막횡단 압력 함수로서 측정한다. 얻어진 데이터는 기공 크기 분포에 대한 정보를 제공하며 또 명목상 분자량 컷오프와 상관관계가 있을 수 있다(참조: R. van Reis and A. L. Zydney, supra, p. 2201).
"작용기"의 예는 비제한적으로 이온 교환기, 생물친화성 또는 생물특이적 기, 소수성 기, 티오필릭(thiophilic) 상호작용성 기, 킬레이트 또는 킬레이트화 기, 표적 화합물과 소위 파이-파이(pi-pi) 상호작용을 갖는 기, 수소결합 기, 및 친수성 기를 포함한다.
"리간드"의 예는, 비제한적으로, 이온 교환기, 소수성 상호작용 기, 친수성 상호작용 기, 티오필릭 상호작용성 기, 금속 친화성 기, 친화성 기, 생물친화성 기 및 혼합 모드 기(상술한 것의 조합)를 포함한다. 본 명세서에 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드는, 비제한적으로, 강한 양이온 교환기, 예컨대 설포프로필, 설폰산; 강한 음이온 교환기, 예컨대 트리메틸암모늄 클로라이드; 약한 양이온 교환기, 예컨대 카복시산; 약한 음이온 교환기, 예컨대 N,N-디에틸아미노 또는 DEAE; 소수성 상호작용 기, 예컨대 페닐, 부틸, 프로필, 헥실; 및 친화성 기, 예컨대 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 L을 포함한다.
II . 친화성 크로마토그래피 단계
청구된 발명에 따른 다양한 구체예로서, 본 발명의 방법은 친화성 크로마토그래피 단계에서 사용하기 위한 단백질 A 기제 친화성 수지의 사용을 포함한다. 단백질 A는 천연 단백질 A(스타필로코커스 아우레우스(Staph. Aureus)로부터), 재조합 단백질 A 또는 그의 기능성 변이체일 수 있다. 청구된 발명에 사용될 수 있는 단백질 A 수지의 예는 다음을 포함한다: ProSep-vA HC, ProSep Ultra Plus, MabSelect, MabSelect SuRe 및 기타 상업적으로 입수가능한 친화성 수지. 예를 들어, 단백질 G 및 기타 Fc 결합 단백질(예를 들어 단일 사슬 카멜리드(camelid) 항체)와 같은 기타 친화성 리간드/수지가 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
청구된 방법에서, 친화성 포획 단계 이후에, 표적 단백질은 바람직하게는 pH 2.0 내지 4.0, 및 바람직하게는 pH 2.8 내지 3.8을 이용하여 용출된다. 용출 풀(pool) 부피는 친화성 컬럼으로부터 표적 단백질을 제거하여 방법 중의 후속 인-라인 양이온 교환 컬럼에 성공적으로 로딩하기에 충분히 많은 부피일 필요가 있다. 이들 부피는 친화성 및 양이온 교환 컬럼의 상대적 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 친화성 및 양이온 교환 컬럼이 동일 크기이면, 용출 풀은 바람직하게는 1-5 컬럼 부피(CV), 가장 바람직하게는 1.5-4 CV로 용출될 것이다. 친화성 용출 완충액의 비제한적 예는 아세트산, 시트르산, 포스페이트 및 글리신이다. 이들 친화성 용출 완충액은 도전성을 제어하거나 또는 생성물 회수를 개선하기 위하여 부가적 염 또는 첨가제에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 부가적 성분은 응집물 형성을 감소시키기 위한 첨가제를 함유할 수 있다. 첨가제의 비제한적 예는, 비제한적으로, 아르기닌, 헥실렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
일부 구체예로서, 친화성 포획 단계는 후속 이온 교환 단계에 대해 양호한 로딩 성능, 생성물 회수 및 불순물 제거를 제공한다.
III . 이온 교환 크로마토그래피 단계
본 명세서에 기재된 방법의 경우, 상기 친화성 단계 용출 풀은 양이온 교환 컬럼에 직접적으로 로딩되므로, 지지 탱크/완충액 교환 단계의 이용을 제거한다. 이러한 양이온 교환 컬럼은 2-20 mS 범위의 도전성을 갖는 pH 3.0 내지 7.0 범위의 완충액; 및 가장 바람직하게는 2-16 mS 도전성을 갖는 pH 4.5 내지 6의 완충액을 사용하여 평형화될 수 있다. 상기 컬럼에는 친화성 컬럼으로부터 단일 용출 주기에서 수지 리터당 5-120 그램의 표적 단백질(g/L)이 로딩되거나 또는 친화성 컬럼의 다수 용출 주기를 통하여 5-120 g/L 로딩될 수 있다. 일부 구체예로서, 양이온 교환 컬럼 상의 전체 로딩량은 20-80 g/L 또는 40-60 g/L이다.
상기 양이온 교환 컬럼에는 양이온 교환 컬럼을 로딩한 후 친화성 용출 pH보다 더 높은 pH로 재평형화하는 것에 의해 친화성 포획 단계로부터 1 이상의 주기로 로딩될 수 있다.
전체 방법에서 바이러스 제거를 타당화하기 위하여, CIEX 컬럼은 생성물 로딩 후 10-60분간 또는 15-45분간 바이러스 불활성화하기 위하여 4.0 미만(예컨대 <3.8)의 pH를 갖는 완충액으로 교환될 수 있다. 다르게는, 상기 컬럼 플로우-쓰루는 로딩 pH에서 바이러스 제거가 입증되어, 바이러스 플로우-쓰루 및 감소된 pH 바이러스 불활성화 모두에서 축적되는 바이러스 제거를 초래한다.
컬럼에 단백질 로딩 또는 결합하는 동안 또는 이후에 특정 표적 단백질을 낮은 pH 조건에 노출하는 것은 전체 표적 단백질 회수에 영향을 줄 수 있음이 관찰되었다. 청구된 발명은 특정 방법 단계의 도전성을 증가시키는 것에 의해 회수율 손실을 피하는 개선된 정제 방법을 제공한다. 예를 들어, 양이온 교환 단계(CIEX)로부터 표적 단백질 회수는 흔히 낮은 pH에서 실시되는 예를 들어, 단백질 A 용출 단계 및 바이러스 불활성화 단계와 같은 정제 방법 동안 낮은 pH 완충액 단계에 의해 영향을 받을 수 있다. 청구된 방법에 따른 특정 구체예에서, 낮은 pH 완충액의 도전성에서의 증가를 이용하는 개선된 정제 방법이 제공되며, 그에 의해 표적 단백질의 전체 회수율을 개선시킨다. 다르게는, 낮은 pH 완충액의 pH는 약간 상승할 수 있다(예를 들어 pH 4.5 대 pH 3.5 사용하여).
낮은 pH 완충액의 도전성은 예를 들어 염을 단백질 A 용출 완충액 또는 바이러스 불활성화 완충액에 부가하는 것에 의해 증가될 수 있다. 사용될 수 있는 염은 완충액의 pH에 따라 달라질 것이며 또 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 일부 구체예로서, 부가되는 염의 양은 25mM 내지 50OmM 및 10OmM 내지 25OmM이다.
양이온 교환 컬럼의 용출은 본 명세서에 기재된 임의 단계뿐만 아니라 당업자에게 공지된 단계 또는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 단계를 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예로서, 양이온 교환 컬럼의 용출은 1 이상의 pH 단계를 이용하여 달성될 수 있으며, 이때 용출액은 플로우-쓰루 모드로 음이온 교환 배지로 직접 로딩된다. 상기 용출 pH 변화는 완충액 유형, 완충액 농도 및 염 농도에 대한 변화를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 양이온 교환 단계에 대해 바람직한 용출 pH 범위는 약 6.0 내지 9.0, 또는 약 7.0 내지 8.0이다.
양이온 교환 컬럼의 용출은 완충액 도전성에서 증가를 이용하여 또한 달성될 수 있다. 용출 도전성의 바람직한 범위는 pH 및 표적 분자 등전점(pI)에 따라서 달라진다. 일반적으로, 용출은 4mS 내지 5OmS, 또는 8mS 내지 3OmS 범위의 도전성 변화에 대해 효과적이다. 양이온 교환 컬럼의 용출은 후속 음이온 교환 플로우 쓰루 단계의 성능에 대한 설명이 되도록 최적화되어야 한다. 예를 들어, 일부 경우에서, 양이온 교환 단계로부터의 효과적인 용출은 예를 들어, pH 7.0의 6mS 완충액과 같은 낮은 도전성을 갖는 고 pH를 이용하여, 또는 예를 들어 pH 5.5에서 15 mS 완충액과 같은 더 높은 도전성을 갖는 더 낮은 pH를 이용하여 달성될 수 있다. 이들 경우에서, 음이온 교환 플로우 쓰루 단계의 성능은 양쪽 조건들을 이용하여 탐험되어야 하고 또 양이온 교환 단계의 하류 성능은 양이온 교환에 대한 바람직한 용출 방법을 결정한다.
일부 구체예로서, 본 발명에 따른 방법은 상기 방법 단계 사이에 또는 상기 방법 단계 이후에 바이러스 여과 단계를 적절히 포함한다. 일부 구체예로서, 상기 바이러스 여과 단계는, 비제한적으로, 막, 심층 필터, 크로마토그래피 컬럼 또는 그의 조합을 포함하는 임의 포맷일 수 있는 프리필터(prefilter)를 적용한다. 이 방법은 친화성 포획 이전에 막, 심층 필터, 크로마토그래피 컬럼 또는 그의 조합을 이용한 부가적 청정화 또는 심층 여과(depth filtration)를 포함할 수 있다. 비제한적으로 HPTFF, FT-HIC, HIC 및 기타를 비롯한 부가적 연마 단계가 음이온 교환 이후에 부가될 수 있다.
본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 잘 설명되며, 이들 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다. 본 출원을 통하여 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허출원뿐만 아니라 도면의 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
실시예
실시예 1: 낮은 pH 로딩용 수지의 결합능 대조
하기 표 1에 수록된 조건하에서 이하의 방법을 이용하여 3개의 양이온 교환 매질을 동적 성능(dynamic capacity)에 대해 비교하였다(단백질 A 친화성 크로마토그래피에 대한 전형적인 용출 조건).
이하의 특징을 갖는 예시적 양이온 교환 매질이 사용되었다: 평균 입자 크기 60㎛, 기공 크기 60-80nm, "S" 리간드 밀도 170-270 μmol/수지 mL 및 2 바(bar)에서 20 cm 베드(bed) 높이가 >400 cm/hr에 도달하게 하는 압력-유동 특성 및 3분 체류 시간에서 >50 g/L의 IgG 능력을 갖는 다공성, 단분산 폴리메타크릴레이트 수지. 밀리포어 코포레이션으로부터 시판되는 ProRes-STM, EMD 머크가 시판하는 Fractogel-S® 및 GE 헬쓰케어로부터 시판되는 SP-Sepharose Fast Flow®를 옴니피트(옴니피트) 컬럼(0.66 cm 직경, 7 cm 베드 높이) (미국 뉴저지 분타운에 소재하는 Bio Chem Valve, Inc. 제조)에 충전시키고 또 폴리클론 인간 감마 글로불린(IgG)의 동적 결합능에 대해 시험하였다. 상기 컬럼은 표 1에 수록된 pH 및 도전성을 이용하여 평형화시키고, 필요에 따라서 염화 나트륨을 사용하여 도전성을 조절하였다. 단백질(5 g/L)을 상기 컬럼에 로딩하며, 이때 단백질은 평형 완충액과 동일 완충액 중에 존재한다. 3분 체류 시간과 일치하는 로딩 유동 속도에서 생긴 5% 돌파능(capacity at 5% breakthrough)을 이용하여 동적 결합능을 특징화하였다.
표 1. 낮은 pH 에서 CIEX 에 대한 결합능의 요약
Figure 112012003754679-pct00001

실시예 2: 직접 로딩 조건하에서 모델 공급물(Model Feed)을 사용한 이온 교환 단계의 표시
대표적인 실험으로서, 양이온 교환 컬럼에 직접 로딩에 이어 음이온 교환 단계를 통한 단백질 회수 및 정제를 나타내는 모델 단백질 공급물을 사용하였다.
모델 단백질 A 용출 풀은 다음 혼합물을 사용하여 고안하였다: 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 3.5, 2.5 g/L 폴리클론 IgG, n-단백질 A 50-100 ppm 및 비발현성 CHO 세포주로부터 얻은 10중량% HCCF. ProRes-STM으로 채워진 7 cm x 0.66 cm 옴니피트(ommnifit) 컬럼은 pH 3.5의 50 mM 아세테이트 완충액으로 평형화하였다(5 컬럼 부피, CV). 이 모델 단백질 A 용출 풀 혼합물(~20 mL)을 ProRes-STM 컬럼 상에 0.33 CV/분으로 로딩하였다. 단백질 혼합물을 로딩한 후, 수지는 pH 5의 100mM 시트레이트 완충액 3CV로 평형화시켰다. pH 5에서 평형화 이후, 컬럼은 0.3M NaCl과 함께 50 mM 트리스, pH 8.0를 사용하여 2CV 동안, 이어 0.4M NaCl과 함께 50 mM 트리스, pH 8.0을 사용하여 2CV 동안 및 0.5M NaCl과 함께 50 mM 트리스, pH 8.0을 사용하여 2CV 동안 용출시켰다. 용출 부피는 예시적 음이온 교환 수지 컬럼(예컨대, 음이온 교환 화학에 의해 변형된 ProRes-STM 기제 매질, 미국 특허공개 20090050566호에 기재된 바와 같음)에 직접 로딩된 다음, 0.3M NaCl과 함께 50 mM 트리스, pH 8.0을 사용하여 예비평형화시키고 또 상기 기재한 바와 같이 양이온 교환 컬럼의 인라인 및 하류(downstream)로 설정한다. 양이온 교환 용출 단계에 상응하는 2CV 분획에서 플로우 쓰루를 수집하였다. 이 플로우 쓰루 분획을 모아 "크로마토그래피 후(post) 풀"을 형성하며 또 주요 불순물에 대해 에세이하여 하기 표 2에 그 결과를 요약하였다.
표 2.
Figure 112012003754679-pct00002

실시예 3: Fc 영역 함유 단백질을 정제하기 위한 뱃치 모드 방법
대표적 실험으로서, 예시적 Fc 영역 함유 단백질인 단일클론 항체를 정제하는 뱃치 모드 방법을 설계하며, 이 방법은 단백질 A 수지, 상이한 pH 조건에서 로딩되는 양이온 교환 수지 및 음이온 교환을 이용한다. 이 방법은 다음과 같이 기재된다. 이 실험은 친화성 포획 이후에 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계에 대한 필요성을 갖지 않는 이온 교환 단계의 직접 로딩을 허용할 수 있는 조건을 나타내었다.
중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 IgG 발현주를 교반되는 생물반응기(bioreactor)에서 약 10일간 배양하였다. 이 세포들을 일차 심층 필터(밀리포어 DOHC)를 이용하여 제거한 다음 이차 심층 필터(밀리포어 XOHC)를 이용하여 청정화시켰다. 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 이하의 과정을 이용하여 IgG1을 정제하였다:
친화성 단계는 ProSep® Ultra Plus Protein A 배지(밀리포어 코포레이션)를 사용하였고 컬럼 치수는 다음과 같았다: 높이 = 7 cm; I.D. = 1 cm 및 컬럼 부피 = 5.5 mL.
표 3.1
Figure 112012003754679-pct00003
양이온 교환 크로마토그래피 단계는 ProRes-STM 매질(밀리포어 코포레이션)를 적용하였고 또 컬럼 치수는 다음과 같았다: 높이 = 22 cm; I.D. = 0.66 cm 및 컬럼 부피 = 7.53 mL.
표 3.2 CIEX 단계에 대한 일반적 과정
Figure 112012003754679-pct00004
음이온 교환 크로마토그래피 단계는 ChromaSorb 0.08 mL 장치 중의 ChromaSorb® 막(밀리포어 코포레이션)을 적용하였다.
표 3.3 FT - AIEX 단계에 대한 일반적 과정
Figure 112012003754679-pct00005

컬럼은 독립적으로 처리되며 각 단계로 부터 얻은 풀은 컬럼 사이의 가능한 직접적 전달 조건을 모방하도록 조절되었다. ProSep Ultra Plus를 상기 기재한 바와 같이 컬럼에 채우고 표 3.1의 단계에 따라 로딩하였다.
용출 풀은 pH 값 범위(pH 3.42, pH 3.44, pH 3.46 및 pH 3.5)에서 생성되어 수집되었고 또 CIEX 로딩에 맞는 pH 조건 범위에 의해 풀을 창제하도록 pH 조절되었다. pH 3.41(여기서 샘플 1로 칭함), pH 3.75 (여기서 샘플 2라 칭함), pH 4 (여기서 샘플 3이라 칭함), pH 4.3 (여기서 샘플 4라 칭함) 및 pH 5.0 (여기서 샘플 5라 칭함)로 pH 조절된 풀은, 표 3.2에 기재된 순서를 이용하여 양이온 교환 컬럼(예를 들어 ProRes-STM) 상에 개별적으로 로딩하였다(참조: 대표적 크로마토그램으로 도 1). 양이온 교환 단계로부터 얻은 용출 풀을 수집하고 또 음이온 교환 단계(플로우-쓰루 막 흡수제 ChromaSorb)에 로딩하기 전에 pH 8.0으로 조절하였다. 최종 풀은 FT-AIEX 단계 후에 수집하며 또 순도 및 수율에 대해 평가하였다. 결과를 하기 표 3.4 및 3.5에 나타낸다. ChromaSorb 수율은 약 100%이었고 또 예상된 바와 같이 ProRes-STM의 pH 로딩에 의해 영향을 받지 않았다. 중간 및 최종 풀의 순도는 하기 표 3.6에 나타낸다. 상응하는 풀에 대한 SDS PAGE 겔의 분석은 도 2에 도시한다. 공급물은 2배로 희석하며 나머지 샘플은 램리(Laemmli) 완충액에 의해 20배 희석되었다.
표 3.4 친화성 포획 단계의 수율
Figure 112012003754679-pct00006

표 3.5 CIEX 단계에 대한 수율
Figure 112012003754679-pct00007

표 3.6 실시예 3에 기재된 방법에 대한 중간 및 최종 풀 순도
Figure 112012003754679-pct00008
실시예 4: 지지 탱크 및 완충액 교환 단계를 필요로 하지 않는, 단백질 A 수지, 양이온 교환 수지 및 음이온 교환 수지를 사용한 정제 방법
다른 대표적 실험으로서, Fc 영역 함유 단백질, 예를 들어 단일클론 항체를 정제하기 위한 개선된 방법을 설계하며, 이 방법은 단백질 A 수지, 양이온 교환 수지 및 음이온 교환 수지를 적용하며 지지 탱크 및 완충액 교환 단계를 필요로 하지 않는다.
특이적으로, 청정화된 IgG 함유 공급물은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 표 4에 기재된 과정을 이용하여 이하에 수록된 컬럼을 이용하여 IgG1을 정제하였다.
친화성 단계는 단백질 A 수지, ProSep Ultra Plus(밀리포어 코포레이션)을 적용하였고 또 상기 컬럼은 이하의 치수를 가졌다: 높이 = 21 cm; I.D. = 0.66 cm; 및 컬럼 부피 = 7.5 mL.
양이온 교환 크로마토그래피 단계는 ProRes-S 배지(밀리포어 코포레이션)를 적용하였고 또 컬럼 치수는 다음과 같았다: 높이 = 21 cm; I.D. = 0.66 cm; 및 컬럼 부피 = 7.5 mL.
사용된 음이온 교환 수지는 Q Sepharose Fast Flow(GE 헬쓰케어 제조)였고 또 컬럼 치수는 다음과 같았다: 높이 = 7 cm; I.D. = 0.66 cm 및 컬럼 부피 = 2.4 mL.
표 4. 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 필요로 하지 않는 3-단계 정제 방법의 과정
Figure 112012003754679-pct00009
표 4에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타(Akta) 익스플로러 시스템(GE 헬쓰케어 제조) 상에서 실시하였다. 컬럼들은 표 4에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링되어(인라인) 처리되었다. 이렇게 하여, 놀랍게도, 지지 탱크 또는 완충액 교환 없이 IgG 생성물이 정제될 수 있었다. 어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니나, 크로마토그래피 컬럼은 생성물을 저장하는 "지지 탱크"로 되고, 상기 완충액은 로딩된 컬러에 대한 용출 완충액으로 작용하는 완충액 또는 다음 컬럼 하류에 대한 로딩 완충액으로 변경되는 것으로 추정된다. 크로마토그램은 도 4에 도시된다. 순도 및 수율은 표 6에 특징화되어 있다.
실시예 5: 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 필요로 함없이 단일클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지, 양이온 교환 수지 및 음이온 교환 막을 사용한 정제 방법
실시예 3의 기재에 따라서 청정화된 IgG 함유 공급물을 제조하였다. 표 4에 기재된 과정을 이용하고 이하에 수록된 컬럼을 이용하여, 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
사용된 단백질 A 수지는 다음과 같은 컬럼 치수를 갖는 ProSep Ultra Plus(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 21 cm; I.D. = 0.66 cm; 및 컬럼 부피 = 7.5 mL.
사용된 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 다음과 같은 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S 이었다: 높이 = 21 cm; I.D. = 0.66 cm; 및 컬럼 부피 = 7.5 mL.
사용된 음이온 교환 막은 ChromaSorb 0.08 mL 장치 중의 ChromaSorb(밀리포어 코포레이션)이었다.
상기 컬럼들은 수지 컬럼 대신 막 흡수제를 사용한 AEIX 단계를 제외하고는 실시예 4에 기재된 바와 같이 처리하였다. 표 4에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 처리하였다. 컬럼들은 표 4에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링되어(인라인) 처리하였다. 따라서, 놀랍게도, 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 사용함 없이 IgG 생성물이 정제될 수 있었다. 순도 및 수율은 표 6에 특징화되어 있다.
실시예 6: 단일클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지의 다수 주기, 양이온 교환 수지의 단일 주기 및 음이온 교환 막을 사용하는 정제 방법
실시예 3 기재에 따라서 청정화된 IgG 함유 공급물을 제조하였다. 표 5에 기재된 과정을 이용하고, 이하에 수록된 컬럼을 이용하여, 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
사용된 단백질 A 수지는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProSep Ultra Plus(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 12cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 4.1mL
양이온 교환 크로마토그래피는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S를 이용하여 실시하였다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
ChromaSorb(밀리포어 코포레이션)을 사용한 음이온 교환 막은 ChromaSorb 0.08mL 장치와 함께 사용하였다.
표 5. 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 갖지 않는 3-단계 정제 방법의 과정
Figure 112012003754679-pct00010
*인라인의 2 컬럼을 갖는 단계의 경우, CIEX 컬럼 부피를 이용하여 완충액 부피(CV)를 측정하였다.
상기 컬럼들은, 단백질 A 포획 단계를 양이온 교환 컬럼(반복 단계 4-11)에 2x 반복 주기를 한 이외에는 실시예 5에 기재된 바와 같이 처리하였다. CIEX 컬럼은 수지 컬럼 대신 막 흡수제 상에 용출되었다. 표 6에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 실시하였다.
컬럼들은 표 5에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링되어 처리되었다. 이렇게 하여, 지지 탱크 또는 완충액 교환을 이용하지 않고 IgG 생성물을 정제할 수 있었으므로, 더욱 효과적이고 개선된 방법을 제공하였다. 양이온 교환 단계 상에서 단백질 A 친화성 용출의 로딩 2 주기에 대한 크로마토그램은 도 5에 도시되어 있다. 순도 및 수율은 표 6에 특징화하였다.
실시예 7: 단일클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지의 다수 주기, 양이온 교환 수지의 단일 주기 및 음이온 교환 막을 사용한 정제 방법
실시예 3 기재에 따라서 청정화된 IgG 함유 공급물을 제조하였다. 표 5에 기재된 과정을 이용하고, 이하에 수록된 컬럼을 이용하여, 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
사용된 단백질 A 수지는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProSep Ultra Plus(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 5cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 2mL.
양이온 교환 크로마토그래피는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S를 이용하였다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
사용된 음이온 교환 막은 ChromaSorb 0.08mL 장치 중의 ChromaSorb(밀리포어 코포레이션) 이었다.
상기 컬럼들은, 단백질 A 포획 단계가 양이온 교환 컬럼에 4x 주기 반복한 이외에는 실시예 6에 기재된 바와 같이 처리하였다(단계 4-11은 양이온 용출 이전에 4 연속 실시되었다). 표 6에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 실시하였다. 컬럼들은 표 6에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링되어 처리되었다.
따라서, 놀랍게도, 지지 탱크 또는 완충액 교환을 이용하지 않고 IgG 생성물을 정제할 수 있었다. 양이온 교환 단계 상에서 단백질 A 친화성 용출의 로딩 4 주기에 대한 크로마토그램은 도 6에 도시되어 있다. 순도 및 수율은 표 6에 특징화하였다.
표 6: 실시예 4-7에 기재된 방법에 따른 최종 풀 순도
Figure 112012003754679-pct00011
*검출 한계 미만, # 도 7 참조, NA = 적용 불가, NM = 측정 불가.
** 정제 인자 = 공급물 중의 [DNA]/최종 풀 중의 [DNA]. 정제 인자(로딩 ppm /최종 풀 ppm)는 DNA 에세이의 한계로 인하여 보고됨.
실시예 8: 단일클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지의 단일 주기, 양이온 교환 수지의 단일 주기 및 음이온 교환 수지를 사용한 정제 방법
실시예 3 기재에 따라서 청정화된 IgG 함유 공급물을 제조하였다. 표 7에 기재된 과정을 이용하고, 이하에 수록된 컬럼을 이용하여, 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
사용된 단백질 A 수지는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProSep Ultra Plus(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
양이온 교환 크로마토그래피는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S를 이용하여 실시하였다: 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
사용된 음이온 교환 수지는 이하의 컬럼 치수를 갖는 Q Sepharose Fast Flow (GE 헬쓰케어 제조)이었다: 높이 = 5cm; I.D. = 1.1cm; 및 컬럼 부피 = 4.8mL.
표 7. 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 갖지 않는 3-단계 정제 방법에 대한 과정
Figure 112012003754679-pct00012
컬럼들은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 표 7에 기재된 순서를 이용하여 처리하였다. 컬럼들은 표 7에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링(인라인)되어 처리되었다. 따라서, 지지 탱크 또는 완충액 교환을 이용하지 않고 IgG 생성물을 정제할 수 있었다.
순도 및 수율은 표 9에 특징화되었다.
실시예 9: 단일클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지의 단일 주기수 지, 양이온 교환 수지의 단일 주기 및 음이온 교환 막을 사용하는 방법
청정화된 IgG 함유 공급물은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 표 7에 기재된 순서를 이용하고 또 이하에 수록된 컬럼을 이용하여 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
사용된 단백질 A 수지는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProSep Ultra Plus(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
양이온 교환 크로마토그래피는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S 매질(밀리포어 코포레이션)을 이용하여 실시하였다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
다음 음이온 교환 막이 사용되었다: ChromaSorb 0.08mL 장치 중의 ChromaSorb(밀리포어 코포레이션).
상기 컬럼들은 실시예 8에 기재된 바와 같이 처리하였다. 표 7에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 실시하였다. 컬럼들은 표 7에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링(인라인)되어 처리되었다.
따라서, 지지 탱크 또는 완충액 교환을 이용하지 않고 IgG 생성물을 정제할 수 있었다. 순도 및 수율은 표 9에 특징화하였다.
실시예 10: 단일 클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지의 다수 주기, 양이온 교환 수지의 단일 주기 및 혼합 모드 수지를 사용하는 정제 방법
청정화된 IgG 함유 공급물은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 표 8에 기재된 순서를 이용하고 또 이하에 수록된 컬럼을 이용하여 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
사용된 단백질 A 매질은 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProSep Ultra Plus(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 5cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 2mL.
양이온 교환 크로마토그래피는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S(밀리포어 코포레이션)를 이용하여 실시하였다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
음이온 교환 크로마토그래피 매질은 이하의 컬럼 치수를 갖는 Capto Adhere(GE 헬쓰케어 제조)를 사용한 혼합 모드 수지였다: 높이 = 5cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 2mL.
상기 컬럼들은 단백질 A 포획단계가 양이온 교환 칼럼 상에 총 4x 주기 반복된 것을 제외하고는 실시예 6에 기재된 바와 같이 처리하였다(단계 4-11은 양이온 용출 이전에 4회 연속 실시되었다). 표 8에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 실시하였다. 컬럼들은 표 8에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링(인라인)되어 처리되었다. 이렇게 하여, 놀랍게도, 지 지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 사용함 없이 IgG 생성물을 정제할 수 있었다. 순도 및 수율은 표 9에 특징화하였다.
표 8: 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계 없이 3-단계 정제 방법의 과정
Figure 112012003754679-pct00013
실시예 11. 단일클론 항체를 정제하기 위하여 음이온 교환 배지를 포함한 단백질 A 수지의 단일 주기, 양이온 교환 수지의 단일 주기를 이용한 정제 방법
청정화된 IgG 함유 공급물은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 표 7에 기재된 순서를 이용하고 또 이하에 수록된 컬럼을 이용하여 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
사용된 단백질 A 매질은 이하의 컬럼 치수를 갖는 MabSelect® SuRe (GE 헬쓰케어 제조)이었다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
사용된 양이온 교환 크로마토그래피는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
사용된 음이온 교환 막은 ChromaSorb 0.08 mL 장치를 구비한 ChromaSorb(밀리포어 코포레이션 제조)이었다.
상기 컬럼들은 실시예 8에서와 같이 처리하였다. 표 7에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 실시하였다. 컬럼들은 표 7에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링(인라인)되어 처리하였다. 이렇게 하여 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 사용함 없이 IgG 생성물을 정제할 수 있었다. 순도 및 수율은 표 9에 특징화하였다.
표 9: 실시예 8-11에 기재된 방법에 대한 최종 풀 순도
Figure 112012003754679-pct00014
*검출 한계 미만, NA = 적용 불가, NM = 측정 불가,
** 정제 인자 = 공급물 중의 [DNA]/최종 풀 중의 [DNA]. 정제 인자(로딩 ppm /최종 풀 ppm)는 DNA 에세이의 한계로 인하여 보고됨. # 조건은 제조자의 추전에 따라 상기 수지에 최적이 아니다, 수율은 제조자 추천된 조건에 가깝게 분리를 실시하는 것에 의해 개선될 수 있었다.
실시예 12: 단일클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지의 단일 주기, 낮은 pH 유지를 갖지 않는 양이온 교환 수지의 단일 주기 및 음이온 교환 막을 사용한 정제 방법
청정화된 IgG 함유 공급물은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 표 7에 기재된 순서를 이용하고 또 이하에 수록된 컬럼을 이용하여 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
사용된 단백질 A 수지는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProSep Ultra Plus(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
사용된 양이온 교환 크로마토그래피는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S(밀리포어 코포레이션)이었다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
음이온 교환 크로마토그래피 단계는 ChromaSorb 0.08 mL 장치를 구비한 ChromaSorb(밀리포어 코포레이션 제조)를 이용하였다.
상기 컬럼들은 실시예 8에서와 같이 처리하였다. 표 7에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 실시하였다. 컬럼들은 표 7에 기재된 순서대로 개별적으로 또는 커플링(인라인)되어 처리하였다. 이렇게 하여, 놀랍게도, 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 사용함 없이 IgG 생성물을 정제할 수 있었다. 순도 및 수율은 표 11에 특징화하였다.
실시예 13. 단일클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지의 단일 주기, 30분 낮은 pH 유지를 포함한 양이온 교환 수지의 단일 주기 및 음이온 교환 막을 이용하는 정제 방법
청정화된 IgG 함유 공급물은 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 표 10에 기재된 순서를 이용하고 또 이하에 수록된 컬럼을 이용하여 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 IgG1을 정제하였다.
친화성 단계는 다음 컬럼 치수를 갖는 단백질 A 수지, ProSep Ultra Plus (밀리포어 코포레이션)를 사용하였다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
사용된 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 이하의 컬럼 치수를 갖는 ProRes-S(밀리포어 코포레이션)를 이용하여 실시하였다: 높이 = 21cm; I.D. = 0.66cm; 및 컬럼 부피 = 7.5mL.
음이온 교환 크로마토그래피 단계는 ChromaSorb 0.08 mL 장치를 구비한 ChromaSorb 막(밀리포어 코포레이션 제조)을 사용하였다.
표 10. 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 갖지 않는 3-단계 정제 방법에 대한 과정
Figure 112012003754679-pct00015
상기 컬럼들은 실시예 10에서와 같이 처리하였다. 표 10에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 실시하였다. 따라서, 놀랍게도, 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 사용함 없이 IgG 생성물을 정제할 수 있었다. 순도 및 수율은 표 11에 특징화하였다.
실시예 14. 단일클론 항체를 정제하기 위하여 단백질 A 수지의 단일 주기, 1 시간 낮은 pH 유지를 포함한 양이온 교환 수지의 단일 주기 및 음이온 교환 막을 이용하는 본 발명의 방법의 예시
실시예 13에 기재된 컬럼은, 낮은 pH 유지 단계 노출 시간을 실시예 13에서 30분과 비교하여 1시간으로 증가시킨 것을 제외하고는, 표 10에 기재된 과정을 이용하여 처리하였다. 표 10에 기재된 과정은 도 3에 도시된 배관 구조를 갖는 아크타 익스플로러 시스템 상에서 처리하였다. 이렇게 하여, 지지 탱크 또는 완충액 교환 단계를 사용함 없이 IgG 생성물을 정제할 수 있었다. 순도 및 수율은 표 11에 특징화하였다.
표 11. 낮은 pH 유지를 갖는 본 발명의 방법에 대한 생성물 회수 및 순도
Figure 112012003754679-pct00016
실시예 15. 양이온 교환 컬럼 상에서 바이러스를 불활성화하기 위하여, 풀( pool )로서 수집된 단백질 A 수지의 단일 주기에 이어 바이러스에 의한 접촉에 이은, 낮은 pH 유지를 포함하는 양이온 교환 수지의 단일 주기를 이용한 정제 방법
실시예 3 기재에 따라 청정화된 IgG 함유 공급물을 제조하였다. 평형 완충액이 25mM 트리스, 25mM NaCl, 0.05M EDTA, pH 7.0이고 또 용출 완충액이 10OmM 아세트산, 15OmM NaCl, pH 3.5인 것을 제외하고는 표 3.1에 기재된 과정과 유사하게, 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터, ProSep Ultra Plus 컬럼을 이용하여 IgG1을 정제하였다. 단백질 A로부터의 용출 풀을 양이온 교환 컬럼에 직접 로딩하기 위하여 단백질 A 컬럼 용출물은 pH 4.0로 적정하였다. 6.5 Log X-MuLV (5% 스파이크, M뇨 백혈병 바이러스)의 바이러스 스파이크(spike)를 상기 풀에 부가하였다. 상기 풀을 표 12에 기재된 조건하에서 ProRes-S 양이온 교환 컬럼을 통하여 처리하였다. 관련 분획은 X-MuLV의 경우 감염성 에세이를 통하여 또 표준 방법 및 당해 분야에 공지된 수법을 이용한 qPCR을 통하여 에세이하였다. 낮은 pH 유지 세척 및 컬럼 재생은 바이러스 감염성에서 ≥ 3.5 로그 감소를 나타내었고 또 어떠한 활성 바이러스도 검출되지 않았다. 생성물 용출 풀은 바이러스 감염성에서 ≥ 4.3 로그 감소를 나타내었고 또 어떠한 활성 바이러스도 검출되지 않았다. 따라서, CIEX 컬럼 상에서 낮은 pH 유지에 의한 바이러스 불활성화는 검출가능한 수준 미만의 바이러스 활성으로 감소시키는데 효과적인 방식이다. 더 높은 수준의 제거를 달성하기 위하여, 바이러스 스파이킹 전략 및 에세이는 용해를 개선하도록 정제될 필요가 있다.
표 12. 바이러스 스파이킹 실험에 대한 크로마토그래피 단계 및 완충액 조건
Figure 112012003754679-pct00017
실시예 16. 양이온 교환 낮은 pH 유지 및/또는 단백질 A 용출 조건의 최적화를 통한 야이온 교환 생성물 회수의 최적화
실시예 3 기재에 따라 청정화된 IgG 함유 공급물을 제조하였다. 수집된 청정화된 세포 배양액 유체(HCCF)로부터 평형 완충액이 25mM 트리스, 25mM NaCl, 0.05M EDTA, pH 7.0인 것을 제외하고는 표 3.1에 기재된 과정에 따라 ProSep Ultra Plus 컬럼을 이용하여 IgG1을 정제하였다. 단백질 A 용출 풀은 pH 5 및 최종 농도 1.2 g/L로 조정하였다. ProRes-S 양이온 교환 수지의 9개의 개별 0.5 mL 샘플들은 5 CV의 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5(CIEX EQ 완충액)에 의해 평형화된 일회용 컬럼(Evergreen Scientific, Los Angeles CA)을 이용하여 측정하였고, 또 개별 50 mL 플라스틱 원심분리관에 부가하였다. ProRes-S 수지 샘플들을 앞에서 기재한 단백질 A 풀 25 mL를 부가하는 것에 의해 40 g/L로 로딩하였다. 상기 단백질/수지 혼합물을 4시간 동안 회전시켰다. ProRes-S 수지 샘플들을 일회용 크로마토그래피 컬럼으로 여과하고 또 5CV의 CIEX EQ 완충액으로 세척하였다. 이들 수지 샘플을 다시 5OmL 원심분리관으로 되돌리고 또 낮은 pH 세척 완충액(표 13에 나타낸 바와 같은) 15 mL 부피 시리즈를 부가하여 단백질 A 컬럼으로부터 CIEX를 직접 로딩하기 위한 낮은 pH 유지 단계 또는 단백질 A 용출 로딩 조건을 모방하도록 하였다. 15 mL 부피의 낮은 pH 완충액은 pH 3.5이었고 또 표 13에 기재한 염화 나트륨 부가로 인하여 다양한 도전성을 가졌다. 샘플들을 1.5 시간 동안 회전시킨 다음 일회용 크로마토그래피 컬럼에 전달하였다. 이 샘플들을 CIEX EQ 완충액으로 세척하고 또 5mL의 전형적 CIEX 용출 완충액; 5OmM 나트륨 아세테이트 pH 5.4 중의 20OmM 염화나트륨을 사용하여 용출시켰다. 생성물 회수는 1.38의 소광 계수(extinction coefficient)를 이용하여 280 nm에서 흡수에 의해 결정하였다. 단백질 A 풀 로딩을 기본으로 한 생성물 회수는 표 13에 수록되어 있다. 놀랍게도, 낮은 pH 완충액에 대한 노출 이후의 생성물 회수는 낮은 pH 완충액의 도전성에 대하여 민감하다. 생성물 회수는, 낮은 pH 유지 및 단백질 A 용출 단계에 존재하였던, 낮은 pH 완충액 중의 염의 부가에 의해 현저하게 개선되었다.
표 13. 다양한 낮은 pH 유지 또는 단백질 A 용출 완충액 도전성에 대한 생성물 회수
Figure 112012003754679-pct00018
실시예 17. 단백질 A 용출 완충액 도전성( CIEX 로딩 완충액 ) 및 CIEX 의 최적화를 통한 양이온 교환 폴리클론 IgG 회수의 최적화
3개의 상이한 pH 값: pH 3.5, pH 4 및 pH 4.5에서 5OmM 나트륨 아세테이트 및 2.5 g/L 폴리클론 IgG(PAb, SeraCare Life Sciences, Inc., Oceanside, CA)를 사용한 하기 혼합물을 사용하여 모델 단백질 A 용출 풀을 작성하였다. ProRes-S 수지의 3개의 개별 4.5 mL 샘플은 각각 pH 3.5, pH 4 및 pH 4.5에서 50mM 나트륨 아세테이트를 사용하여 일회용 크로마토그래피 컬럼으로 평형화하였다. pH 등가 PAb 함유 모델 공급물에 상기 수지 샘플들을 40 g/L 로딩량으로 부가하였다. 단백질 결합을 철야로 허용하는 한편, 샘플들은 20 rpm으로 회전시켰다. 수지 샘플들을 10 CV의 pH 등가 평형 완충액(5OmM 아세테이트, pH 3.5, pH 4 및 pH 4.5, 각각)을 사용하여 세척하였다.
상기 샘플을 사용하여 pH 등가 평형 완충액 중에 10% v/v 비이드(bead) 현탁액을 형성하였다. 상기 수지를 슬러리화하고 10 uL의 수지(10OuL의 슬러리)를 96웰 필터 플레이트(1um 친수성 PVDF 막, 밀리포어 코포레이션 제조)에 분배시켰다. 다수벽(multiwall) 플레이트 여과 시스템(밀리포어 코포레이션 제조)을 이용하여 슬러리로부터 과량의 낮은 pH 완충액을 제거하여, PAb가 로딩된 lOuL의 ProRes-S 수지를 단리하였다. 각 PAb 로딩 pH에 대하여 다양한 용출 완충액 조건(30 개별 조건, 각 웰당 20OuL)을 웰에 3회 반복 부가하였다. 상기 플레이트를 1시간 동안 진탕시키고 또 280 nm에서 흡수를 측정하였다. 상기 흡수는 IgG 회수율과 상관관계가 있으며 표 14에 보고되어 있다. 놀랍게도, 대 범위의 용출 조건에 걸친 생성물 회수율은 로딩이 실시된 pH에 대하여 민감하다.
상기 실험은 수지의 정적 로딩에 대한 것이지만, 그 경향은 연속 방법의 최적화에 대한 중요한 고려사항이다. 단백질 A 용출 완충액의 pH는 pH 조건 범위를 결정하며, IgG와 같은 표적 분자는 연속 방법 동안 양이온 교환 수지를 로딩하는 동안 경험할 것이다. 표 14는 단백질 A와 같은 친화성 컬럼으로부터 단백질 용출이 생기는 가능한 가장 높은 값에서 CIEX 로딩 pH 값을 유지하는 것은 최고 생성물 회수율을 제공해야 함을 제시한다.
표 14. 다양한 단백질 A 용출 완충액 도전성에 대한 생성물 회수율
Figure 112012003754679-pct00019
실시예 18. 생성물 풀 순도의 특징화
본 명세서에 개시된 실시예에서, IgG 응집물의 수준은 크기 배제 크로마토그래피/HPLC를 이용하여 측정하였다. Zorbax GF450(Agilent cat 884973-902, S/N USMX006417) 컬럼은 0.2M 나트륨 포스페이트, pH 7 완충액을 사용하여 1 mLL/분 유량으로 동작시켰다. 공지된 표준과 대조적으로 샘플을 주입하고 체류 시간 처리하였다.
용액 중의 IgG 수준은 분석용 단백질 A 컬럼을 이용하여 다르게 측정하였다. Poros A/20 단백질 A 컬럼(어플라이드 바이오시스템스 제조)은 PBS로 평형화시키고, 0.1M 글리신(pH 2.0)으로 용출시킨 다음 6M 구아니딘 HCl을 사용하여 세정하였다. IgG 표준 곡선은 폴리클론 IgG(Seracare 제조)의 다양한 주사 부피를 이용하여 창제하였다. 샘플을 주사하고 또 표준 곡선으로부터 IgG 농도를 결정하였다.
용출 풀을 280 nm에서 UV 흡수를 측정하여 IgG 농도 및 수율을 결정하였다. 용출 풀은 또한 시판되는 효소-결합된 면역흡착 에세이(ELISA) 키트[모든 HCP 데이터는 표 11, HCP 3G ELISA, F550; 시그너스 테크놀로지스 인코포레이티드 제조(노쓰캐롤라이나 사우쓰포트 소재)를 제외하고는 CHO HCP ELISA Kit F015를 사용하여 얻음]를 이용하여 CHOP 농도를 분석하였다. DNA 농도는 표준 피코 그린 에세이(pico green assay) 및 청어 정자 DNA를 표준으로 사용하여 결정하였다. 단백질 A 농도는 n-단백질 A를 표준으로 사용하는 ELISA 키트(OEM 컨셉 제조)를 이용하여 결정하였다. SDS-PAGE는 샘플 2x을 2x Laemmli 완충액을 사용하여 희석시킨 다음 비환원 조건 및 환원 조건하에서 적절히 분석함으로써 실시하였다. 겔에는 레인당 lOuL의 샘플을 로딩하고 겔 코드 블루(Thermofisher 24592)에 의해 염색하였다.
본 명세서는 본 명세서에 참고로 포함된 명세서 내에서 인용된 참고문헌의 가르침을 참고하면 가장 완전히 이해될 것이다. 본 명세서 내의 구체예는 본 발명을 자세히 설명하기 위해 제공되며 그 범위에 제한을 가하지 않아야 한다. 당업자들은 다수의 다른 구체예가 본 발명에 포함됨을 잘 인식할 것이다. 모든 문헌 및 발명은 본 명세서에 포함된다. 참고문헌에 포함된 것이 본 발명의 내용과 상반되지 않는 정도에서, 본 명세서는 이러한 물질을 초과할 것이다. 본 명세서에서 어떠한 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행기술이라는 것은 아니다.
특별히 다르게 나타내지 않는 한, 특허청구범위를 포함한 명세서에서 사용된 성분, 세포 배양물, 처리조건 등의 양을 나타내는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해된다. 따라서, 특별히 다르게 나타내지 않는 한, 숫자 변수는 대략적인 것이고 또 본 발명이 추구하는 목적 특성에 따라서 다양하게 달라질 수 있다. 특별히 다르게 나타내지 않는 한, 어떠한 일련의 원소 앞의 용어 "적어도"는 일련의 매 원소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자들은 통상의 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 발명의 특정 구체예에 등가 실험을 다수 실시할 수 있음을 잘 인식하고 있을 것이다. 이러한 등가물은 특허청구범위에 포함되는 것이다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 숫자 범위 및 변수가 대략적인 것임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 숫치는 가능한한 정확해하게 기록한다. 또한, 본 명세서에 제시된 모든 범위는 본 명세서에 제시된 모든 하부 범위를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "1 내지 10" 범위는 최소 1 및 최대 10 사이의 모든 숫자 및 모든 하부범위를 포함하며, 즉 1과 동일하거나 그보다 큰 최소값을 갖고 또 10과 동일하거나 10보다 작은 최대 값을 갖는 모든 하부범위, 예를 들어 5.5 내지 10도 포함하는 것이다.
본 발명의 다수의 변형과 변이는 당업자에 의해 분명한 바와 같이 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 범위에서 가능하다. 본 명세서에 기재된 특정 구체예는 예시적으로 제공된 것이고 어떠한 의미로든 본 발명을 제한하지 않는다. 본 명세서 및 실시예는 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 본 발명의 진정한 범위와 정신은 이하의 특허청구범위에 나타낸 바와 같음을 알아야 한다.

Claims (22)

  1. (a) 샘플을 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 친화성 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계;
    (c) 상기 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 4.0 미만의 pH를 갖는 완충액과 바이러스 불활성화에 적합한 시간 동안 접촉시키는 단계로서, 상기 완충액 도전성이 5 내지 50 mS인 단계,
    (e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계;
    (f) 상기 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및
    (g) Fc 영역 함유 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하며,
    단계 (b) 와 (c) 사이 및 단계 (e)와 (f) 사이에 지지 탱크의 필요성을 제거하거나,
    단계 (b) 와 (c) 사이 및 단계 (e)와 (f) 사이에 완충액 교환 단계의 필요성을 제거하거나, 또는
    단계 (b) 와 (c) 사이 및 단계 (e)와 (f) 사이에 지지 탱크 및 완충액 교환 단계의 필요성을 제거하는,
    샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a) 및 (b) 사이에 예비용출 단계를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, Fc 영역 함유 표적 단백질은 항체, 면역접합체 분자 및 Fc 융합 단백질 및 그의 Fc 함유 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 항체가 단일클론 항체인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (b)가 2.0 내지 4.0 범위의 pH를 갖는 완충액의 사용을 포함하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 예비용출 단계가 친화성 매질을 양이온 교환 크로마토그래피 완충액과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화에 적합한 시간이 15분 내지 60분인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (e)가 5.0 내지 9.0 범위의 pH를 갖는 완충액의 사용을 포함하거나 또는 6.0 내지 8.0 범위의 pH를 갖는 완충액의 사용을 포함하는 방법.
  8. 제3항에 있어서, 단계 (b)가 5 내지 50 mS의 도전성을 갖는 완충액의 사용을 포함하거나 또는 12 내지 25 mS 범위의 도전성을 갖는 완충액의 사용을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 매질이 단백질 A 또는 그의 기능성 변이체를 포함하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. (a) 샘플을 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 친화성 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계;
    (c) 상기 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질을 4.0 미만의 pH를 갖는 완충액과 바이러스 불활성화에 적합한 시간 동안 접촉시키는 단계로서, 상기 완충액 도전성이 5 내지 50 mS인 단계,
    (e) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 매질로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 용출시키는 단계;
    (f) 상기 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및
    (g) Fc 영역 함유 표적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는,
    샘플 중의 1 이상의 불순물로부터 Fc 영역 함유 표적 단백질을 정제하기 위한 연속 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단계 (b) 및 (c) 사이 및 단계 (e) 및 (f) 사이에 지지 탱크 및/또는 완충액 교환 단계의 필요성을 제거하는 방법.
  15. 삭제
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  21. 삭제
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