MX2012006016A - Variantes de beta-glucosidasa recombinante para produccion de azucares solubles de biomasa celulosica. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la expresión recombinante de una forma de variante de una ß-glucosidasa cepa C1 fúngica; la invención también se refiere a la generación de azúcares fermentables a partir de biomasa y la producción de biocombustibles por fermentación de los azúcares usando organismos modificados genéticamente que expresan la variante de ß-glucosidasa; la invención proporciona métodos para producir un azúcar fermentable, tal como glucosa, a partir de celobiosa al poner en contacto celobiosa con una proteína variante de ß-glucosidasa recombínante, tal como una proteína variante secretada por una célula huésped recombinante en medio de cultivo; métodos de la invención se pueden usar para conversión de un sustrato de biomasa a un azúcar fermentable, y últimamente a etanol u otro biocombustible.

Description

VARIANTES DE BETA-GLUCOSIDASA RECOMBINANTE PARA PRODUCCIÓN DE AZÚCARES SOLUBLES DE BIOMASA CELULÓSICA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Estas solicitudes reclaman el beneficio de solicitud provisional de E.U.A. 61/264,608, presentada el 25 de noviembre de 2009 y solicitud provisional de E.U.A. No. 61/355,511 , presentada el 16 de junio de 2010, cada una de las cuales se incorpora aquí para referencia en su totalidad para todos los propósitos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención describe la expresión de variantes de ß-glucosidasa recombinante y su uso en la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Biomasa celulósica es un recurso renovable significante para la generación de azúcares solubles. Estos azúcares pueden utilizarse como reactivos en diversos procedimientos metabólicos, incluyendo fermentación, para producir biocombustibles, compuestos químicos y otros productos de valor comercial. Mientras la fermentación de azúcares simples tal como glucosa a etanol es relativamente sencilla, la eficiente conversión de biomasa celulósica en azúcares solubles es difícil (véase, por ejemplo, Ladisch et al., 1983, Enzime Microb. Technol. 5:82). Celulosa puede ser pre-tratada químicamente, mecánicamente, enzimáticamente o en otras formas para aumentar la susceptibilidad de celulosa a hidrólisis. Dicho pre-tratamiento puede estar seguido de la conversión enzimática de celulosa a celobiosa, celo-oligosacáridos, glucosa y otros azúcares y polímeros de azúcar, utilizando enzimas que rompen los enlaces glucosídicos ß-1-4 de la celulosa. Estas enzimas se conocen colectivamente como "celulasas".

Celulasas se dividen en tres sub-categorías de enzimas: 1 ,4-ß-?-glucano glucanohidrolasa ("endoglucanasa" o "EG"); 1 ,4- -D-glucano celobiohidrolasa ("exoglucanasa", "celobiohidrolasa" o "CBH"); y ß-D-glucósido-glucohidrolasa ("ß-glucosidasa", "celobiasa" o "BGL"). Endoglucanasas rompen enlaces internos e interrumpen la estructura cristalina de celulosa, exponiendo las cadenas de polisacárido celulosa individuales ("glucanos"). Celobiohidrolasas reducen incrementadamente las moléculas de glucano, liberando principalmente unidades de celobiosa (un dímero ß-1 ,4-enlazado de glucosa), así como glucosa, celotriosa y celotetraosa. ß-glucosidasa dividida en celobiosa en monómeros de glucosa.

Celulasas con propiedades mejoradas para su uso en procesamiento de biomasa celulósica pueden reducir costos y aumentar la eficiencia de producción de biocombustibles y otros compuestos comercialmente valiosos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención proporciona una variante de ß-glucosidasa aislada o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 60% idéntica, algunas veces por lo menos aproximadamente 65% idéntica y frecuentemente al menos aproximadamente 70% idéntica a residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2 (ß-glucosidasa C1 tipo silvestre), o que está codificado por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones severas a SEQ ID NO: 1 o el complemento exacto de SEQ ID NO: 1y que tiene al menos una sustitución, en relación a SEQ ID NO: 2, de un residuo de aminoácido descrito aquí, donde la variante tiene mayor actividad ß-glucosidasa que la proteína de tipo silvestre y/o es más termoestable que la proteína de tipo silvestre. También se proporcionan polinucleótidos que codifican las variantes de ß-glucosidasa, vectores de expresión que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped transformadas con los vectores de expresión.

La invención también proporciona un método para producir una variante de ß-glucosidasa por un cultivo de célula huésped transformada con un polinucleótido que codifica una variante de ß-glucosidasa bajo condiciones adecuadas para la expresión de la ß-glucosidasa. En algunas modalidades, el polipéptido ß-glucosidasa es recuperado del medio de cultivo o de las células transformadas y cultivadas.

La invención también proporciona una composición de enzima que comprende una variante ß-glucosidasa aislada o recombinante. Opcionalmente, la composición de enzima también incluye al menos una enzima de celulasa adicional.

En un relacionado y/u otro aspecto, la invención proporciona un método para convertir un sustrato de biomasa, tales como celobiosa, a un azúcar fermentable poniendo en contacto una variante ß-glucosidasa con el sustrato de biomasa bajo condiciones adecuadas para la producción de azúcar fermentable. En una modalidad el sustrato de biomasa se mantiene en un medio que contiene células que expresan una variante de ß-glucosidasa. En una modalidad la célula huésped recombinante que expresa una variante de ß-glucosidasa también expresa al menos otra celulasa recombinante y/u otra enzima. Opcionalmente el sustrato de biomasa es pre-tratada antes de poner en contacto el sustrato con una variante de polipéptido ß-glucosidasa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1A Termoestabilidades de variantes de BgM C1 mejoradas producidas en la cepa C1 ; actividad enzimática residual después de 6 horas de incubación a pH 5, 65°C se determina por ensayo de pNPG a pH 5, 50°C durante 20 minutos. N = 6-8; Barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 1 B Termoestabilidades de variantes de BgM C1 mejoradas producidas en la cepa C1 ; actividad enzimática residual después de 24 horas de incubación a pH 5, 65°C se determinada por ensayo de pNPG a pH 5, 50°C durante 20 minutos. N = 6-30; barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 1 C correlación de termoestabilidad de BgM C1 entre levadura y huéspedes C1.

Figura 2A Las termoestabilidades de variantes de Bgl1 C1 mejoradas 481 , 269 y 3 se comparan con la de la enzima de Bgl1 C1 nativa. La actividad enzimática residual después de 24 horas de incubación a pH 4.5, 65°C se media utilizando pNPG como sustrato a pH 5, 50°C durante 20 minutos. N = 6-16; barras de error representan ± 1 desviación estándar. Figura 2B la termoestabilidad de variante de BgM C1 664 se compara con la de la variante 481. La actividad enzimática residual después de 4 horas de incubación a pH 4, 65°C se mide utilizando pNPG como sustrato a pH 5, 50°C durante 20 minutos. N = 6-24; barras de error representan ± 1 desviación estándar.

Figura 3 Termoestabilidades de variantes de BgM C1 mejoradas 3, 481 , 664, 916, 885 y 871 se comparan con la de la enzima de 1 BgM nativa. La actividad enzimática residual después de 72 horas de incubación a pH 4.5, 65°C se mide utilizando pNPG como sustrato a pH 5, 50°C durante 20 minutos. N = 6-10; barras de error representan ± 1 desviación estándar.

Figura 4 Actividad específica de BgM C1 nativa se compara con la de la variante 871 en un ensayo de celbiosa. Condiciones de ensayo: pH 4.5-5, temperaturas de 55°C-75°C; 8 g/L de celobiosa, 18 horas de reacción.

Concentración de proteína se normaliza en reacciones. N+2; barras de error representan ± 1 desviación estándar.

Figura 5 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de C BgM , nativa (tipo silvestre) (SEQ ID NO: 2) con las secuencias de aminoácidos de variantes 3 (SEQ ID NO: 5), 269 (SEQ ID NO: 7), 481 (SEQ ID NO: 9), 647 (SEQ ID NO: 15), 664 (SEQ ID NO: 13), 871 (SEQ ID NO: 17), 885 (SEQ ID NO: 19) y 916 (SEQ ID NO: 21).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones Las siguientes definiciones se proporcionan para ayudar al lector. A menos que se definan de otra manera, todos los términos de técnica pretenden tienen los significados comúnmente entendidos por aquellos de experiencia en la técnica de biología y microbiología molecular. En algunos casos, términos con significados comúnmente entendidos se definen aquí para claridad y/o para referencia lista, y la inclusión de tales definiciones aquí no deben interpretarse necesariamente como que representan una diferencia sustancial respecto a la definición del término como generalmente se entiende en la técnica.

El término "celulasa" se refiere a una categoría de enzimas capaces de hidrolización de celulosa (enlaces p-1 ,4-glucano o ß-D-glucosídico) a oligosacáridos cortos, celobiosa y/o glucosa.

Los términos "ß-glucosidasa" y "celobiasa" se utilizan indistintamente y se refieren a una ß-D-glucósido glucohidrolasa que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, incluyendo pero no limitado a celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente. En una modalidad, una ß-glucosidasa es una ß-glucosidasa glucohidrolasa de la clasificación E.C. 3.2.1.21 que cataliza la hidrólisis de celobiosa a glucosa. Algunas de las ß-superficies tienen la capacidad de hidrolizar también ß-D-galactosidas, ß-L-arabinosidas y/o ß-D-fucosidas y además algunas ß-glucosidasas pueden actuar en a-1 ,4-sustratos tales como almidón, actividad ß-glucosidasa puede medirse por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo los ensayos descritos aquí más adelante.

El término "polipéptido ß-glucosidasa " se refiere a un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa.

El término "polinucleótido ß-glucosidasa " se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad ß-glucosidasa.

"Actividad celulótica" abarca la actividad exoglucanasa (CBH), actividad endoglucanasa (EG) y/o actividad ß-glucosidasa.

Los términos "exoglucanasa", "exo-celobiohidrolasa" o "CBH" se refieren a un grupo de enzimas de celulasa clasificadas como E.C. 3.2.1.91. Estas enzimas hidrolizan celobiosa desde el fin de reducción o no reducción de celulosa.

Los términos "endoglucanasa" o "EG" se refieren a un grupo de enzimas de celulasa clasificadas como E.C. 3.2.1.4. Estas enzimas hidrolizan enlaces ß-1 ,4 glucosídicos de celulosa.

Como se usa aquí, el término "aislado" se refiere a un ácido nucleico, polinucleótido, polipéptidos, proteínas u otro componente que está parcial o totalmente separado de componentes con los que es normalmente asociado (otras proteínas, ácidos nucleicos, células, etc.).

El término "tipo silvestre" como se aplica a un polipéptido (proteína) significa un polipéptido (proteína) expresada por un microorganismo de origen natural tal como bacterias u hongos filamentosos. Como se aplica a un microorganismo, el término "tipo silvestre" se refiere a microorganismos no recombinantes, nativas. Con referencia a ß-glucosidasa C1 , Bgl1 tipo silvestre se refiere a la forma madura (secretada) de la proteína que tiene la secuencia de residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2.

Una "variante" como se usa aquí significa un polipéptido ß-glucosidasa o polinucleótido que codifica una ß-glucosidasa que comprende una o más modificaciones relativas a ß-glucosidasa C1 (Bgl1) tipo silvestre o el polinucleótido tipo silvestre tal como sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos de uno o más residuos de aminoácido específico o de uno o más nucleótidos específicos o codones en el polipéptido o polinucleótido.

Una "secuencia de ß-glucosidasa de referencia" se refiere a una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencia, tal como SEQ ID NO. 2. Una secuencia de ß-glucosidasa de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande. Generalmente una secuencia de referencia es al menos 25 aminoácidos en longitud, por lo menos 50 residuos en longitud, por lo menos 100 residuos en longitud, por lo menos 150 residuos en longitud por lo menos 200 en longitud, por lo menos 300 residuos en longitud, por lo menos 350 residuos en longitud, por lo menos 500 residuos en longitud, por lo menos 600 residuos en longitud, por lo menos 700 residuos en longitud, o la longitud completa del polipéptido.

Un ácido nucleico (tal como un polinucleótido), un polipéptido o una célula es "recombinante" cuando es artificial o diseñada, o derivado o contiene una proteína artificial o diseñada o ácido nucleico. Por ejemplo, un polinucleótido que se inserta en un vector o cualquier otra ubicación heteróloga, por ejemplo, en un genoma de un organismo recombinante, tal que no está asociado con secuencias de nucleótidos que normalmente flanquean el polinucleótido como se encuentra en la naturaleza es un polinucleótido recombinante. Una proteína expresada in vitro o in vivo de un polinucleótido recombinante es un ejemplo de un polipéptido recombinante. Asimismo, una secuencia de polinucleótido que no aparecen en la naturaleza, por ejemplo, una variante de un gen de origen natural, es recombinante.

Una "propiedad mejorada" se refiere a un polipéptido ß-glucosidasa que exhibe una mejora en cualquier propiedad en comparación con la ß-glucosidasa C1 (BgM) tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2). Propiedades mejoradas pueden incluir expresión de proteína incrementada, termoactividad, termoestabilidad, actividad de pH, estabilidad de pH, especificidad de producto, actividad específica incrementada, especificidad de sustrato, resistencia incrementada a la inhibición de sustrato o producto final, perfil de pH/temperatura alterado y estabilidad química.

Una variante con "actividad ß-glucosidasa mejorada", como el término se utiliza aquí, significa una variante que despliega un incremento relativo a una secuencia de referencia, en la cantidad de hidrólisis de sustrato que se produce en un momento determinado bajo condiciones de reacción especificadas. Actividad ß-glucosidasa puede medirse utilizando una variedad de métodos conocidos en la técnica, tal como ensayos de celobiosa descritos más adelante. Para comparar la actividad ß-glucosidasa de dos proteínas expresadas de manera recombinante, puede compararse la actividad específica (actividad por mol de enzima o actividad por gramo de enzima). Alternativamente, células que expresan y que secretan las proteínas recombinantes pueden ser cultivadas bajo las mismas condiciones y la actividad ß-glucosidasa por medio de cultivo de volumen se puede comparar.

El término "termoestabilidad mejorada" como se utiliza aquí significa que una enzima variante despliega un aumento en "actividad residual" con respecto a la enzima tipo silvestre. Actividad residual se determina mediante la exposición de la enzima (variante o referencia, por ejemplo, tipo salvaje) a condiciones de esfuerzo de temperatura elevada durante un período de tiempo y después determinar la actividad ß-glucosidasa bajo condiciones en las que la referencia (por ejemplo, tipo silvestre) normalmente enzima tiene actividad. La actividad ß-glucosidasa de la enzima expuesta a condiciones de esfuerzo ("a") es comparada con la de un control en el que la enzima no está expuesta a las condiciones de esfuerzo ("b"), y actividad residual es igual a la relación a/b. Una variante con termoestabilidad incrementada tendrá mayor actividad residual que la de enzima de referencia (por ejemplo, tipo silvestre). Condiciones ejemplares para determinar termoestabilidad se proporcionan en los ejemplos, infra. En una modalidad las enzimas están expuestas a condiciones de esfuerzo de 65°C a pH 5 durante 6 horas y se ensaya a 50°C, pH 5, durante 1.5 horas.

Los términos "por ciento de identidad", "% de identidad", "por ciento idéntico" y "% idéntico" se usa indistintamente aquí para referirse al por ciento de identidad de secuencia de aminoácido que se obtiene por análisis de ClustalW (versión W 1.8 disponible del Instituto Europeo de bioinformática, Cambridge, Reino Unido), contando el número de coincidencias idénticas en la alineación y dividiendo dicho número de coincidencias idénticas por la longitud de la secuencia de referencia, y utilizando los siguientes parámetros de ClustalW predeterminados para lograr alineamientos óptimos a manera de par lento/agudo - penalidad abierta de espacio: 10; penalidad de extensión de espacio: 0.10; matriz de peso de proteína: serie de Gonnet; matriz de peso de ADN: IUB; alineamientos a manera de pares lento/rápido = alineamiento LENTO o COMPLETO.

Dos secuencias son "alineadas óptimamente" cuando están alineadas por similitud de puntuación usando una matriz de sustitución de aminoácido definida (por ejemplo, BLOSUM62), penalidad de existencia de espacio y penalidad de extensión de espacio para llegar a la mayor puntuación posible para ese par de secuencias. Matrices de sustitución de un aminoácido y su uso en cuantificar la similitud entre dos secuencias son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, véase Dayhoff et al (1978), Dayhoff et al. (1978), "A model of evolutionary change in proteins"; "Atlas of Protein Sequence and Structure," Vol. 5, Suppl. 3 (Ed. M.O. Dayhoff), pp. 345-352, Nati. Biomed. Res. Round., Washington, D.C.; and Henikoff et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, ambos de los cuales se incorporan aquí por referencia. La matriz de BLOSUM62 a menudo se utiliza como una matriz de sustitución de puntaje predeterminado en protocolos de alineación de secuencia tal como Gapped BLAST 2.0. Se impone la penalidad de existencia de espacio para la introducción de espacio de aminoácido sencillo en una de las secuencias alineadas, y se impone la penalidad de extensión de espacio para cada posición de aminoácido vacía adicional insertada en un espacio ya abierto. El alineamiento está definido por la posición de un aminoácido de cada secuencia en la que comienza y termina el alineamiento, y opcionalmente mediante la inserción de un espacio o varios espacios en una o ambas secuencias a fin de llegar a la mayor puntuación posible. Mientras alineamiento y puntuación óptimos pueden realizarse manualmente, el procedimiento es facilitado por el uso de un algoritmo de alineamiento implementado en la computadora, por ejemplo, BLAST 2.0 abierto, descrito en Altschul, et al (1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (incorporado aquí para referencia) y hecho disponible en el Centro Nacional para sitio web de información de biotecnología. Alineamientos óptimos y múltiples alineamientos pueden ser preparados mediante programas disponibles ya tal como PSI-BLAST, que es descrita por Altschul, et al (1997), supra. Una herramienta de alineamiento útil es "T-Coffee" (Notredame et al., 2000, J. Mol. Bio. 302:205-17). Alineamientos T-Coffee pueden llevarse a cabo usando parámetros predeterminados (Documentación técnica de T-Coffee, versión 8.01 , Julio 2009, WorldWideWeb. tcoffee.org).

"Correspondiente a," "referencia a, o "relativo a", cuando se utiliza en el contexto de la numeración de un aminoácido dado o una secuencia de polinucleótido, se refiere a la numeración de los residuos de una secuencia de referencia especificada cuando el aminoácido determinado o una secuencia de polinucleótido es comparada con la secuencia de referencia.

Una "posición" de aminoácido o de base nucleótido está indicada por un número que identifica secuencialmente cada aminoácido (o base de nucleótidos) en la secuencia de referencia en función de su posición relativa a N-término (o 5'-extremo). Debido a que supresiones, inserciones, truncamientos, fusiones y lo similar deben tenerse en cuenta al determinar un alineamiento óptimo, en general el número de residuos de aminoácidos en una secuencia de prueba se determina por simplemente el conteo desde el N-término no necesariamente será el mismo que el número de su posición correspondiente en la secuencia de referencia. Por ejemplo, en un caso donde una variante tiene una supresión relativa a una secuencia de referencia alineada, no será aminoácido en la variante que corresponde a una posición en la secuencia de referencia en el sitio de supresión. Donde existe una inserción en una secuencia de referencia alineada, que la inserción no corresponderá a una posición de aminoácido numerada en la secuencia de referencia. En el caso de truncamientos o fusiones pueden ser tramos de aminoácidos en cualquier referencia o secuencia alineada que no corresponden a cualquier aminoácido en la secuencia correspondiente. Ácidos nucleicos "hibridan" cuando se asocian para formar estructuras de doble cadena, normalmente en solución. Ácidos nucleicos hibridan debido a una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizadas, tal como unión de hidrogeno, exclusión de solvente, apilamiento de base y lo similar. Como se utiliza aquí, el término "condiciones de lavado de hibridación severa" en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tal como hibridaciones tipo Southern y Northern, son dependiente de secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una extensa guía a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, 1993, "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes," Parte I, Capítulo 2 (Elsevier, New York), que se incorpora aquí por referencia. Para los polinucleótidos de al menos 100 nucleótidos de longitud, condiciones de severidad bajas a muy altas se definen como sigue: pre-hibridación e hibridación a 42°C en 5xSSPE, 0.3% de SDS, 200 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, y 25% de formamida para severidades bajas, 35% de formamida para severidades media y media alta, o 50% de formamida para severidades alta y muy alta, siguiendo procedimientos Southern Blotting estándar. Para los polinucleótidos de al menos 100 nucleótidos en longitud, el material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos usando 2xSSC, 0.2% de SDS al menos a 50°C (severidad baja), al menos a 55°C (severidad media), al menos a 60°C (severidad media-alta), al menos a 65°C (severidad alta) y al menos a 70°C (severidad muy alta).

Los términos "que cultiva" o "cultivo" se refieren a un crecimiento de población de células microbianas bajo condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido.

El término "poner en contacto" se refiere a la colocación de una enzima respectiva en proximidad suficientemente cerca a un sustrato respectivo para permitir a la enzima convertir el sustrato en un producto. Por ejemplo, al combinar una solución que contiene la enzima con el sustrato respectivo afectarán el contacto. Tal contacto también incluye incubando una célula que secretan una enzima en un medio que contiene un sustrato de enzima.

Como se usa aquí, referencia a una célula "que metaboliza" un azúcar soluble u otro sustrato para producir un producto final significa que el azúcar sirve como una fuente de carbono y/o la fuente de energía para una reacción metabólica en la célula. Normalmente la célula es una célula microbiana tal como una célula fúngica o células bacterianas.

Como se utiliza aquí el término "transformado" o "transformación" usado en referencia a una célula significa que una célula tiene una secuencia de ácido nucleico no nativa integrada en su genoma o como un plásmido episomal que se mantiene a través de múltiples generaciones.

El término "introducido" en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula significa, transfectar, transducir, o transformar (colectivamente, "transformado") o de lo contrario incorporado en el genoma de o mantenido como un episoma en la célula.

El término "enlazado operablemente" se refiere aquí a una configuración en donde una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición relativa a la secuencia de codificación de la secuencia de ADN tal que la secuencia de control influye en la expresión de un polipéptido.

Cuando se usa aquí, el término "secuencia de codificación" está destinada a cubrir una secuencia de nucleótidos, que directamente especifica la secuencia de aminoácidos de su producto de proteína. Los límites de la secuencia de codificación generalmente están determinados por un marco abierto de lectura, que por lo general comienza con el codón de inicio ATG. La secuencia de codificación normalmente incluye un ADN, ADNc y/o secuencia de nucleótido recombinante.

Una secuencia promotora, péptido de señal u otra secuencia es "heteróloga", cuando está enlazada operablemente a un ácido nucleico o secuencia de proteínas con la cual el promotor, péptido de señal u otra secuencia no se asocia en la naturaleza.

Como se usa aquí, el término "expresión" incluye cualquier paso involucrado en la producción del polipéptido, incluyendo pero sin limitarse a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-traduccional y secreción.

El término "vector de expresión" se refiere aquí a una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de la invención, y que es operablemente enlazado a segmentos adicionales que proporcionan para su transcripción.

Un polipéptido variante de ß-glucosidasa es "enzimáticamente activo" cuando tiene actividad de ß-glucosidasa.

El término "pre-proteína" se refiere a una proteína que incluye una región de péptido de señal amino-terminal (o secuencia líder) adjuntada. El péptido de señal es escindido desde el pre-proteína por una peptidasa de señal antes de la secreción para resultar en proteína "madura" o "secretada".

Como se usa aquí, un "codón de inicio" es el codón ATG que codifica el primer residuo de aminoácido (metionina) de una proteína.

En el contexto de identidad de secuencia, una referencia para "al menos x % de identidad de secuencia" en esta especificación pretende, a menos que se especifique lo contrario, referirse a "x % de identidad de secuencia", así como modalidades alternativas en que % de identidad de secuencia se define por cada número entero de (x + 1) % a 99% de identidad, justo como si cada modalidad alternativa es explícitamente enumerada. Por ejemplo, la referencia a "al menos 70% de identidad de secuencia para SEQ ID NO: 2", o "residuos de aminoácido 20-870 de SEQ ID NO: 2", se refiere a modalidades alternativas con por lo menos 71% de identidad de secuencia, por lo menos 72% de identidad, por lo menos 73% de identidad, por lo menos 74% de identidad, al menos 75% de identidad, por lo menos 76% de identidad, al menos 77% de identidad, al menos 78% de identidad, al menos 79% de identidad, al menos 80% de identidad, por lo menos 81% de identidad, al menos 82% de identidad, por lo menos 83% de identidad, por lo menos 84% de identidad, al menos 85% de identidad, al menos 86% de identidad, por lo menos 87% de identidad, por lo menos 88% de identidad, por lo menos 89% de identidad, por lo menos 90% de identidad, por lo menos 91% de identidad, por lo menos 92% de identidad, por lo menos 93% de identidad, por lo menos 94% de identidad, por lo menos 95% de identidad, por lo menos 96% de identidad, por lo menos 97% de identidad, por lo menos 98% de identidad, o por lo menos 99% de identidad para SEQ ID NO: 2 de aminoácido o residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2. Para un alineamiento que se extiende por la longitud de aminoácido 851 completo de residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2, puede ser al menos 596 identidades entre una secuencia variante y SEQ ID NO: 2, algunas veces por lo menos 604, por lo menos 613, por lo menos 622, por lo menos 630, por lo menos 638, por lo menos 647, por lo menos 655, por lo menos 664, por lo menos 672, por lo menos 681 , por lo menos 723, por lo menos 766 o por lo menos 808 identidades.

Como se usa aquí, "C1" se refiere a una cepa fúngica descrita por Garg, A., 1966, "An addition to the genus Chrysosporium Corda" Mycopathologia 30: 3-4. "Chrysosporium lucknowense" incluye las cepas descritas en Patente de E.U.A. Nos. 6,015,707, 5,81 1 ,381 y 6,573,086; Pat. de E.U.A. Pub. Nos. 2007/0238155, US 2008/0194005, US 2009/0099079; Pub. De Pat. Internacional. Nos. WO 2008/073914 y WO 98/15633, e incluyen, sin limitación, Chrysosporium lucknowense Garg 27 K, VKM-F 3500 D (No. de acceso VKM F-3500-D), UV13-6 cepa C1 (No. de acceso VKM F-3632 D), NG7C-19 cepa C1 (No. de acceso VKM F-3633 D) y UV18-25 cepa C1 (VKM F-3631 D), todos los cuales han sido depositados en la colección toda Rusa de microorganismos de la Academia Rusa de Ciencias (VKM), Bakhurhina St. 8, Moscú, Rusia, 113184 y sus derivados. Aunque inicialmente se describe como Chrysosporium lucknowense, C1 puede actualmente considerarse una cepa de Myce iophthora thermophilia. Derivados de C1 ejemplares incluyen organismos modificados en el que uno o más genes endógenos o secuencias han sido eliminados o modificados y/o uno o más genes heterólogos o secuencias han sido introducidos. Derivados incluyen UV18#100fAalpl, UV18#100f Apyr5 Aalpl, UV18#100.f Aalpl ??ß?4 Aalp2, UV18#100.f Apyr5 Aalpl Apep4 Aalp2 y UV18#100.f Apyr4 Apyr5 Aalp 1 Apep4 Aalp2 como se describe en WO2008073914, incorporado aquí para referencia.

La nomenclatura siguiente puede por utilizada para describir sustituciones en una secuencia de polipéptido o polinucleótido relativa a una secuencia de referencia: "R-#-V," donde # se refiere a la posición en la secuencia de referencia, R se refiere al aminoácido (o base) en esta posición en la secuencia de referencia, y V se refiere al aminoácido (o base) en la posición correspondiente en la secuencia variante. Por ejemplo, para un polipéptido variante descrito con referencia a SEQ ID NO: 2, "D369L" indica que en el polipéptido variante, el ácido aspártico en posición 369 de la secuencia de referencia se sustituye por leucina, con posición de aminoácido está determinada por un alineamiento óptimo de la secuencia variante con SEQ ID NO: 2. Asimismo, "S182UW" describe dos variantes: una variante en la que la serina en posición 182 es remplazada por leucina y una variante en la que la serina en posición 182 es remplazada por triptófano.

Se utilizan las siguientes convenciones para describir posiciones de aminoácido en variantes Bgl1. Posiciones de aminoácidos están numeradas en relación con la secuencia de referencia SEQ ID NO: 2, que es la secuencia de la pre-proteína Bgl1 C1 tipo silvestre (incluyendo el péptido de señal). Alineamientos para determinar un grado de identidad de secuencia (por ejemplo, "al menos el 70% de identidad") o para describir eliminaciones (por ejemplo, eliminaciones de residuos en el c-término de la proteína) están en relación con la forma secretada de la proteina BgM tipo silvestre, residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2. Sustituciones de base de nucleótidos se numeran respecto a SEQ ID NO: 1. Sustituciones en el péptido de señal (residuos 1-19 de SEQ ID NO: 2) se refieren a la secuencia de la pre-proteína Bgll II. Introducción El hongo C1 produce una variedad de celulasas y otras enzimas que actúan conjuntamente para catalizar la descristalización y la hidrólisis de celulosa para producir azúcares solubles. C1 se describe por Garg, 1966, "An addition to the genus Chrysosporium corda" Mycopathologia 30: 3-4. Véase también Patente de E.U.A. Nos. 6,015,707 y 6,573,086, que se incorporan aquí para referencia en su totalidad.

El genoma C1 ha sido secuenciado al menos parcialmente, como se indica en las publicaciones de Patente de E.U.A. Nos. 2007/0238155, US 2008/0194005 y US 2009/0099079, incorporado aquí para referencia para todos los propósitos. La secuencia de gen ß-glucosidasa 1 C1 (bgl1) y la proteína codificada (Bgl1) se establece aquí como SEQ ID NOS: 1 y 2 (también véase aplicación co-pendiente No. 61/247,379 y PCT/US10/50982, incorporado aquí para referencia). Tenga en cuenta que estas secuencias difieren de las secuencias de BgM de publicación patente U.S. 2007/0238155.

Las variantes de ß-glucosidasa C1 descritas aquí son particularmente útiles para la producción de azúcares solubles de biomasa celulósica. En un aspecto la invención describe un método para producir glucosa al poner en contacto una composición que comprende celobiosa con una variante de ß-glucosidasa C1 expresada recombinantemente bajo condiciones en las que la celobiosa enzimáticamente se convierte en glucosa. En un aspecto, las células huésped recombinantes que expresan una variante ß-glucosidasa pueden combinarse con celobiosa bajo condiciones en las que se expresa la ß-glucosidasa (y en algunas modalidades, secretadas) por las células. Alternativamente, proteínas ß-glucosidasas recombinantes parcialmente purificadas pueden ser contactadas con celobiosa. En un aspecto de la presente invención, poner en contacto comprende cultivar una célula huésped recombinante en un medio que contiene celobiosa producida a partir de una materia prima celulósica. Por ejemplo, las variantes de ß-glucosidasa C1 descritas aquí demuestran el beneficio en reacciones de sacarificación en conjunción con otras celulasas, tales como celulasas T. reesei (por ejemplo, T. reesei CBH1 , CBH2, y/o EG1 o sus variantes, y/o caldo de T. reesei) y celulasas C1 (véase Patente de E.U.A. Nos. 6,015,707, 5,811 ,381 y 6,573,086; Publicación de Patente de E.U.A. Nos. 2007/0238155, US 2008/0194005, US 2009/0099079; Publicación de Patente Internacional Nos. WO 2008/073914 y WO 98/15633, todos incorporados aquí para referencia).

Varios aspectos de la invención se describen en las secciones siguientes.

III. Propiedades de proteínas ß-qlucosidasas para uso en métodos de la invención En un aspecto, la invención proporciona un método que expresa una proteína p-glucosidasa al cultivar una célula huésped que comprende un vector o plásmido episomal que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante BgM C1 , o que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante Bgl1 C1 integrado en su genoma, bajo condiciones en que se expresa la proteína ß-glucosidasa o su fragmento enzimáticamente activo. Generalmente la proteína expresada comprende un péptido de señal que se remueve por la célula como la enzima es secretada.

En una modalidad, transcripción de la secuencia que codifica la variante BgM C1 está controlada por un promotor heterólogo operablemente enlazado.

Variantes de polipéptido ß-qlucosidasa La presente invención proporciona enzimas novedosas que son variantes de ß-glucosidasa C1 (BgM). Variantes de polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención son variantes de BgM que exhiben actividad de ß-glucosidasa, normalmente actividad ß-glucosidasa mayor que la ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) especialmente bajo condiciones relevantes a procedimientos de sacarificación comerciales. También se incluyen variantes de polipéptido ß-glucosidasa que exhiben mayor estabilidad bajo condiciones relevantes a los procedimientos de sacarificación comercial (por ejemplo, termoestabilidad incrementada relativa a ß-glucosidasa tipo silvestre).

La presente invención proporciona variantes BgM que tiene una mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína BgM C1 (WT) tipo silvestre y que tiene al menos una de las sustituciones encontradas en una variante de actividad incrementada y/o termoestabilidad incrementada descrita aquí. Como se discute con más detalle posteriormente, un polinucleótido que codifica la proteína BgM C1 (WT) tipo silvestre (SEQ ID NO: 2) se prepara. El polinucleótido se inserta en un vector de expresión como se describe en el ejemplo 1 , infra, genotecas de polinucleótidos que codifican proteínas BgM variantes se preparan por mutagénesis y evolución dirigida, y las propiedades (por ejemplo, actividad de ß-glucosidasa y termoestabilidad) de variantes Bgl1 individuales se evalúan (véase cuadros 2-7 y ejemplos 2-9, infra). Un número de sustituciones de aminoácido y combinaciones de sustituciones se identifican en variantes con mayor que la actividad de tipo silvestre y/o mayor que la termoestabilidad de tipo silvestre. Véase cuadro 2. Una variante con elevada actividad y termoestabilidad se selecciona y somete a mutagénesis adicional y clasificación. Véase el cuadro 3. Una variante de esta ronda de mutagénesis y clasificación se selecciona y somete a mutagénesis adicional y clasificación. Véase el cuadro 4. Una variante de esta ronda adicional de clasificación se selecciona y somete a mutagénesis adicional y selección. Véase cuadro 5. Dos variantes de esta ronda de clasificación se seleccionan y someten a mutagénesis adicional y clasificación. Véase cuadros 6 y 7.

Más específicamente, la presente invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislado y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína C1 tipo silvestre, y que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (BgM) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en la posición seleccionada del grupo que consiste de K57; A88; 1106; N112; Q119; T120; A123; R132; Y135; A136; A141; K142; L149; G158; P161 ; P172; T177; 1179; G180; M181 ; S182; E183; K186; A197; G202; Y219; N220; S222; T224; I229; M234; F242; A243; V246; Q258; D274; V286; Q291 ; Q313; V318; A343; T354; T357; D358; E360; D369; P374; I375; A378; Q381 ; E385; S388; V390; A394; N398; E402; K406; 1428; S434; N437; E449; Q474; A475; T482; S489; Y491 ; K530; N536; T540; T565; V674; R682; I867; E868; P870 (en donde posición de aminoácidos se determina por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). "Sustitución" en este contexto, significa que el residuo en la proteína variante es diferente entonces del residuo que se muestra. Por ejemplo, "A88" denota una variante que comprende un aminoácido distinto de alanina en posición 88 (es decir, uno de los otros 19 aminoácidos de origen natural). En algunas modalidades, el aminoácido en la proteína variante no es el residuo tipo silvestre ni un residuo que es un sustituto conservador para el residuo tipo silvestre. Como se discute más adelante, en este contexto, un sustituto conservador para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en el cuadro 1.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido ß-glucosidasa recombinante y/o aislada que tiene mayor actividad y/o termoestabilídad que la proteína Bgl1 01 (WT), en donde la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a 01 tipo silvestre (Bgh) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q291 , D369 y E402; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en la posición seleccionada del grupo que consiste de 1106, A109, Q119, T120, R132, Y135, M181 , Q215, A243, V246, Q258, A265, D274, N278, Q313, F314, G332, T357, D358, P374, E385, S434, N437, A475, S489, Y491 , E493, K495, K497, S501. A503E N504, A505, N521 , K530, N536. T540, D566, T591 , A601 , K610, T611 , R612, S614, L620, G628, T635, V638, V648, D650, S652, N670, R672, V674, S676, T685, T687, A689, Q690, T699, D703, K708, Y715, A732, E742, L757, V775, T777, y D781 ; (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, el aminoácido en la proteína variante no es el residuo tipo silvestre ni un residuo que es un sustituto conservador para el residuo tipo silvestre. Como se discute posteriormente, en este contexto, un sustituto conservador para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en el cuadro 1.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteina Bgl1 C1 tipo silvestre, en donde la variante comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 (BgM) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q258, Q291 , Q313, D369, E402, S434, A475, K495 y G628; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en la posición seleccionada del grupo que consiste de A4, A15, E21 , S22, K24, V25, H26, Q27, P29, L30, N45, D47, Q55, S58, A79, Q85, 1106, A109, Q1 19, Y135, A136, P161 , V175, G180, G202, G216, 1221 , L237, D244, V253, V260, L275, D311 , F314, A343, D358, E360, Q381 , E385, A394, A404, A405, K421 , I428, P436, N437, M454, D470, R476, A477, Q479, T482, Y491 , E493, E494, T496, S501 , A505, N536, V559, V562, N588, S604, R612, G616, A617, G626, N627, F634, D646, D650, S652, R672, V673, T685, T687, A689, Q690, K708, Y715, Q716, A732, A748, D751 , L757K, S764, R769, V775, T777, T783, T785, S787, S799, P806, K807, R817, E819, E822, T823, V840, V846, I847, S848, Y850, K866, y P870, (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, el aminoácido en la proteína variante no es el residuo tipo silvestre ni un residuo que es un sustituto conservador para el residuo tipo silvestre. Como se discute posteriormente, en este contexto, un sustituto conservador para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en el cuadro 1.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína BgM C1 tipo silvestre, en donde la variante comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (BgM) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q258, Q291 , Q313, D369, E402, S434, A475, K495, G628, A689 y Y715; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en la posición seleccionada del grupo que consiste de C8, L9, K24, V25, D47, S58, A79, Q85, 1106, A109, A136, V175, L237, A243, V253, V260, D274, L275, F314, A343, Q381 , E385, P436, N437, Q474, R476, A505, S550, N588, S604, G616, G626, D650, D651 , S652, V674, T687, Q690, D709, E710, A732, D733, Y736N, L757, S764, T777, T783, T785, K807, M816, D844, V846, L869, y P870 (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, el aminoácido en la proteína variante no es el residuo tipo silvestre ni un residuo que es un sustituto conservador para el residuo tipo silvestre. Como se discute posteriormente, en este contexto, un sustituto conservador para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en el cuadro 1.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre, en donde la variante comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (Bgl1) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones D47, Q258, Q291 , Q313, A343, D369, E402, S434, A475, K495, G628, T687, A689 y Y715; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de A79, Q85, V260, L275, F314, D395, P439, A505, D646, T693, N723, A730, A732, S764, R769, T827 y Y855, (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, el aminoácido en la proteína variante no es el residuo tipo silvestre ni un residuo que es un sustituto conservador para el residuo tipo silvestre. Como se discute posteriormente, en este contexto, un sustituto conservador para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en el cuadro 1.

La presente invención proporciona además una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre, en donde la variante comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 (BgM) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2); tiene una sustitución en cada una de las posiciones 1106, Q258, V260, Q291W, Q313, F314, D369, E402, S434, K495, G628, A689, Y715 y A732; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de A109, A343, A475, A505, A689, A79, C8, D47, L275, N315, Q85, T591 y T687, (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, el aminoácido en la proteína variante no es el residuo de tipo silvestre ni un residuo que es un sustituto conservador del residuo tipo silvestre. Como se discute posteriormente, en este contexto, un sustituto conservador para un residuo es otro residuo en el mismo grupo identificado en el cuadro 1.

CUADRO 1 En algunas modalidades, el aminoácido en la proteína variante no es el residuo de tipo silvestre ni un residuo que es un residuo comúnmente intercambiado con el residuo de tipo silvestre como se define por los siguientes pares: Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, LeuA/al, Ala/Glu, y Asp/Gly.

Como se resumen en el cuadro 2, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que tiene una mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre, es por lo menos 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 (BgM) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2), y que tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de K57R; A88S; I106V; N1 12V; Q119E/L; T120M/Y V/H; A123N; R132K/G/W; Y135I/Q/M; A136E; A141 F; K142R; L149Q/M; G158D; P161S; P172A; T177I; I179M; G180E; M181Y; S182L W; E183G/M/Q/K; K186R; A197V; G202MA ; Y219V; N220Y/S/L; S222Q/E; T224N; I229M; M234E/I; F242L; A243V; V246L; Q258N; D274Y/N; V286I; Q291W/A/F; Q313M; V318E; A343VH"; T354Q; T357IJP; D358K/N; E360R/A D; P374Y; I375V; A378K T; Q381V/D/I/L; D369Q/L/Y/C/A I/P/E/K R/F/M/HA/; E385L; S388W/C; V390I; A394G/V/L/P/Q; N398G; E402N; K406D; I428V; S434P; N437F/Y/D/UW; E449Q; Q474I; A475F/Y/H/W/C; T482A; S489L; Y491 H/F; K530M/G; N536K; T540K; T565A G/P; V674I; R682W; I867M; E868R; P870S (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). Combinaciones benéficas de las sustituciones en listadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquier 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en el cuadro 3, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que tiene una mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre, en donde la variante es por lo menos 70% idéntica a C1 tipo silvestre (Bgh) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2 20-870); tiene las sustituciones Q291W, D369H/L/R Y y E402N; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de A109S, A243V, A265S, A475C/F/L/W, A503E, A505C, A601T, A689I, A732G/M, D274Y, D358E/K/N, D566G, D650FA , D703K, D781 N, E385L, ?493??//?, E742G, F314L/V, G332D, G628UV/W, I106V, K495F/H/I/N/Q/V, K497R, K530C/D/E/I/M/N/V, K610S, K708F, L620M, L757K, M181Y, N278Y, N437D/F/I/K/L/V/W/Y, N504Y, N521 C, N536K, N670D, P374Y, Q1 19E, Q215E/M, Q258H/N, Q313M, Q690A/K/R, R132H, R612H/P, R672A/D/F/G/I/S 17V, S434P, S489I/LJN/T, S501 H/N/R, S614A/C/D/H/URA /Y, S652D, S676C, S764F, T120H/Y, T357A, T540K, T591A/C/R, T611A/H/Q, T635A/I/V, T685V. T687C/F/K/L/M W/Y, T699L, T777N, T779S, V246I, V638E/R/S, V648W, V674M, V775C, Y135Q, Y491 F/H/L, y Y715P; (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en el cuadro 4, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre, es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipos silvestre (BgM) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2), tiene las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de A4V, A15V, A109S/T, A136L, A343C, A394G, A404S, A405T, A477G, A505C, A617V, A689I, A732G/M/S, A748T, A79E/G/M, D244H, D31 N, D358K, D470N, D47I, D646N, D650F/N Y, D751 N, E21Q/R, E360D, E385L, E493A/V/Y, E494K, E819A/LA/, E822A/G/K M, F314LA , F634A, G180E, G202M, G216L, G616D, G626D, H26R, I106V, I221V, I428V, I847T, K24G/L T, K421 R, K708F, K807R, K866I/Q, L237Y, L275Y, L30K, L757K, M454E, N437W, N45H, N536K, N588F, N627H, P161S, P29M/Q/R, P436E/Q, P806L, P870S, Q119E, Q27H/R, Q381V, Q479R, Q55R, Q690A/H/K, Q716R, Q85N, R476Q, R612H, R672G, R769H, R817P, S22L/R, S501C/R, S58G, S604I, S652D, S764F, S787G, S799N, S848N, T482A, T496A, T685V, T687C/K/M, T777N, T783H/Q, T785L, T823K, V175A, V253F, V25A/G/R, V260G/L, V559T, V562C/L, V673A, V775C, V840I, V846F, Y135M/Q, Y491 F, Y715P, y Y850H/Q, (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, el polipéptido Bgl1 no tiene una sustitución en la posición A475. Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en el cuadro 5, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre, es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (Bgl1) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2), tiene las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I y Y715P; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de C8A, L9F, K24G/T, V25A, D47I/N, S58G, A79E/G/M, Q85H/N, I106V, A109S T, A136L, V175A, L237Y, A243G, V253F, V260G, D274Y, L275F/Y, F314LA , A343C/G, Q381V, E385L, P436Q, N437D/K, Q474I/L, R476G, A505C, S550C, N588F, S604A/C/I/V, G616D, G626D, D650N/Y, D651 E, S652D, V674I, T687C/K/W, Q690H/K, D709E, E710G, A732G/M/V, D733G, Y736N, L757I/K, S764F, T777N, T783A, T785L, K807R, M816L, D844G, V846F/UQ, L869R, y P870S (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, la variante de polipéptido BgM no tiene una sustitución en la posición A475. Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en el cuadro 6, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína BgM C1 tipo silvestre, es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (BgM) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2), tiene las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, T687K, A689I, Y715P; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de: A79E/G/M, Q85N, V260G, L275Y, F314LA , D395N, P439S, A505C, D646N, T693A/E, N723G, A730S, A732G/M/V, S764Y, R769H, T827I, y Y855, (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, la variante de polipéptido BgM no tiene la sustitución T687K o T687W en lugar de T687K. En algunas modalidades, el polipéptido variante Bgl no tiene una sustitución en la posición A475. Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14 o 15, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

Como se resume en el cuadro 7, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre, es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (Bgl1) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2), tiene las sustituciones I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314LA , D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P, y A732G; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de: A109S/T, A343C/G, A475L, A505C, A79E/G/M, C8G, D47I, L275F/Y, N315D, Q85H/N, and T591 I, T687C/KM/, (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, la proteína Bgl1 adicionalmente tiene la sustitución F314V. Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención además proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre y que tiene una secuencia de aminoácido codificada por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones severas para el complemento de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente la longitud completa de un ácido nucleico exactamente complementario a SEQ ID NO: 1) en donde el polipéptido codificado tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de K57; A88; 1106; N112; Q119; T120; A123; R132; Y135; A136; A141 ; K142; L149; G158; P161; P172; T177; 1179; G180; M181 ; S182; E183; K186; A197; G202; Y219; N220; S222; T224; I229; M234; F242; A243; V246; Q258; D274; V286I; Q291 ; Q313; V318; A343; T354; T357; D358; E360; P374; I375; A378; Q381; D369; E385L; S388; V390I; A394; N398; E402; K406; I428; S434; N437; E449Q; Q474I; A475; T482; S489; Y491 ; K530; N536; T540; T565; V674; R682; I867; E868; P870 (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención además proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre y que tiene una secuencia de aminoácido codificada por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones severas para el complemento de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente toda la longitud de un ácido nucleico exactamente complementaria a SEQ ID NO: 1); en donde el polipéptido codificado tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q291 , D369 y E402; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de 1106, A109, Q119, T120, R132, Y135, M181 , Q215, A243, V246, Q258, A265, D274, N278, Q313, F314, G332, T357, D358, P374, E385, S434, N437, A475, S489, Y491 , E493, K495, K497, S501. A503E N504, A505, N521 , K530, N536. T540, D566, T591 , A601 , K610, T611 , R612, S614, L620, G628, T635, V638, V648, D650, S652, N670, R672, V674, S676, T685, T687, A689, Q690, T699, D703, K708, Y715, A732, E742, L757, V775, T777, y D781; (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención además proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína Bgl1 C1 tipo silvestre y que tiene una secuencia de aminoácido codificada por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones severas para el complemento de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente toda la longitud de un ácido nucleico exactamente complementaria a SEQ ID NO: 1); en donde el polipéptido codificado tiene una sustitución en cada una de las posiciones Q258, Q291 , Q313, D369, E402, S434, A475, K495, y G628; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste de A4, A15, E21 , S22, K24, V25, H26, Q27, P29, L30, N45, D47, Q55, S58, A79, Q85, 1106, A109, Q119, Y135, A136, P161 , V175, G180, G202, G216, 1221 , L237, D244, V253, V260, L275, D311 , F314, A343, D358, E360, Q381 , E385, A394, A404, A405, K421 , I428, P436, N437, M454, D470, R476, A477, Q479, T482, Y491 , E493, E494, T496, S501 , A505, N536, V559, V562, N588, S604, R612, G616, A617, G626, N627, F634, D646, D650, S652, R672, V673, T685, T687, A689, Q690, K708, Y715, Q716, A732, A748, D751 , L757K, S764, R769, V775, T777, T783, T785, S787, S799, P806, K807, R817, E819, E822, T823, V840, V846, I847, S848, Y850, K866, y P870; (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención además proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteína BgM C1 tipo silvestre y que tiene una secuencia de aminoácido codificada por un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones severas para el complemento de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente toda la longitud de un ácido nucleico exactamente complementaria a SEQ ID NO: 1); en donde el polipéptido codificado tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de K57R; A88S; I106V; N1 12V; Q1 19E/L; T120M/Y/V/H; A123N; R132K/G/W; Y135I/Q/M; A136E; A141 F; K142R; L149Q/M; G158D; P161S; P172A; T177I; I179M; G180E; M181Y; S182UW; E183G/M/Q/K; K186R; A197V; G202M/V; Y219V; N220Y/S/L; S222Q/E; T224N; I229M; M234E/I; F242L; A243V; V246L; Q258N; D274Y/N; V286I; Q291W7A/F; Q313M; V318E; A343V/T; T354Q; T357L/P; D358K/N; E360R/A/D; P374Y; I375V; ?378?/G; Q381V/D/I/L; D369Q/L/Y/C/A/I/P/E/K/R/F/M/H/V; E385L; S388W/C; V390I; A394G/V/L/P/Q; N398G; E402N; K406D; I428V; S434P; N437F/Y/D/L/W; E449Q; Q474I; A475F/Y/H/W/C; T482A; S489L; Y491 H/F; K530M/G; N536K; T540K; T565A G/P; V674I; R682W; I867M; E868R; P870S (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención además proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteina BgM C1 tipo silvestre y que tiene una secuencia de aminoácido codificada por un ácido nucleico que híbrida bajo condiciones estrictas para el complemento de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente toda la longitud de un ácido nucleico exactamente complementaria a SEQ ID NO: 1); en donde el polipéptido codificado tiene una sustitución Q291W, D369H/L/R Y, y E402N; y tiene al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A109S, A243V, A265S, A475C/F/UW, A503E, A505C, A601T, A689I, A732G/M, D274Y, D358E/K/N, D369H/L/R/Y, D566G D650F/V, D703K, D781N, E385L, E402N, E493A/V/Y, E742G, F314V, G332D, G628LA//W, 1106V, K495F/H/I/N/Q/V, K497R, K530C/D/E/I/M/N/V, K610S, K708F, L620 , L757K, M181Y, N278Y, N437D/F/I/K/L/V/W/Y, N504Y, N521 C, N536K, N670D, P374Y, Q119E, Q215E/M, Q258H/N, Q291W, Q313M, Q690A/K/R, R132H, R612H/P, R672A/D/F/G/I/S 17V, S434P, S489I/L/N T, S501 H/N/R, S614A/C/D/H/UR/V/Y, S652D, S676C S764F, T120H/Y, T357A, T540K, T591A/C/R, T611A7H/Q, T635A/I/V, T685V. T687C/F/K/L/M W/Y, T699L, T777N, T779S, V246I, V638E/R/S, V648W, V674M, V775C, Y135Q, Y491 F/H/L, y Y715P (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas.

La presente invención además proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que tiene mayor actividad y/o termoestabilidad que la proteina Bgl1 C1 tipo silvestre y que tiene una secuencia de aminoácido codificada por un ácido nucleico que hibrida bajo condiciones severas para el complemento de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, sobre sustancialmente toda la longitud de un ácido nucleico exactamente complementaria a SEQ ID NO: 1); en donde el polipéptido codificado tiene una sustitución en posición Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, y G628W; y tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste de A4V, A15V, A109S/T, A136L, A343C, A394G, A404S, A405T, A477G, A505C, A617V, A689I, A732G/M/S, A748T, A79E/G/M, D244H, D311 N, D358K, D470N, D47I, D646N, D650F/N/Y, D751 N, E21 Q/R, E360D, E385L, E493A/V/Y, E494K, E819A/L V, E822A/G/K/M, F314UV, F634A, G180E, G202M, G216L, G616D, G626D, H26R, I106V, I221V, I428V, I847T, K24G/L/T, K421 R, K708F, K807R, K866I/Q, L237Y, L275Y, L30K, L757K, M454E, N437W, N45H, N536K, N588F, N627H, P161 S, P29M/Q/R, P436E/Q, P806L, P870S, Q119E, Q27H/R, Q381V, Q479R, Q55R, Q690A/H/K, Q716R, Q85N, R476Q, R612H, R672G, R769H, R817P, S22UR, S501C/R, S58G, S604I, S652D, S764F, S787G, S799N, S848N, T482A, T496A, T685V, T687C/K/M, T777N, T783H/Q, T785L, T823K, V175A, V253F, V25A/G/R, V260G/L, V559T, V562C/L, V673A, V775C, V840I, V846F, Y135M/Q, Y491 F, Y715P, Y850H/Q, (en donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2). Combinaciones beneficiosas de las sustituciones enlistadas anteriormente incluyen cualquier combinación de sustituciones en cualquiera 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o más de las posiciones anteriormente identificadas. En ciertas modalidades, la proteína Bgl1 C1 tiene las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369L, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W.

Será apreciado que variantes BgM de la invención pueden incluir sustituciones de aminoácido adicionales más allá de los enumerados anteriormente (tal como sustituciones conservadoras adicionales) y pueden ser menos que longitud completa en comparación con proteína Bgl1 C1 tipo silvestre. Así, variantes Bgl1 de la invención pueden comprender inserciones o eliminaciones (por ejemplo, el truncamiento de término amino- y/o carboxi-) relativa a los residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2. La forma secretada tipo silvestre de proteína Bgl1 C1 es aproximadamente 851 aminoácidos en longitud; variantes de la presente invención pueden ser más largos o más cortos que el tipo silvestre. Para la ilustración y no limitación, en algunas modalidades la variante puede ser más larga o más corta por hasta 10% de la longitud tipo silvestre, algunas veces hasta 5%, algunas veces hasta 4%, algunas veces hasta 3%, algunas veces hasta 2%, algunas veces hasta 1 %.

Se realiza un análisis de actividad de secuencia de variantes de acuerdo con los métodos descritos en WO 03/075129, USSN 10/379,378 presentado el 3 de marzo de 2003; R. Fox et al., 2003, "Optimizing the search algorithm for protein engineering by directed evolution," Protein Eng. 16(8):589-597, y R. Fox et al., 2005, "Directed molecular evolution by machine learning and the influence of nonlinear interactions," J. Theor. Biol. 234(2): 187-199, todos los cuales se incorporan aquí para referencia, para identificar sustituciones con probablemente los efectos más significantes en la actividad.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q119E; R132H; Y135Q; G180E; G202M/V; Q258N; D274Y; Q291W/A/F; D358K/N; D369L_A7V/A/H/R/F/E/M/I/K/C/P/Q; P374Y; E385L; A394L; E402N; S434P; N437F/D/UW/Y; Q474I; A475F/Y/H/C/W; T482A; S489L; K530M; N536K; T540K, que se prevé que sean sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones Q291W + D369L + E402N (como se encuentra en la variante 3) o las sustituciones Q291W + D369H/UR/Y + E402N. En algunas modalidades, la secuencia incluye al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q258N/H, D358K/N, I106V, E385L, D274Y, K495H/I/N/Q, Q119E, Y135Q, G628W, R132H, N437I, S501R, P374Y, N437V, S614A, Q313M, L369H, S434P, N437W/D, y Y491 F. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q258N. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es D358K o Q258H. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es I106V, E385L, D274Y o K495H. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es K495I/N, Q119E, Y135Q o D358N. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es G628W, R132H, K495Q, N437I, S501 R o P374Y. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es N437V, S614A, Q313M, L369H, S434P, N437W/D o Y491 F. Estas sustituciones se predicen que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W (como se encuentra en la variante 269) y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Y715P, S764F, E385D/L, A732G/M, A689I, A109T, T687M/C/K, L757K, Q381V/D, A109S, T777N, I106V, T823K, Q716R, V846F, T685V, T687K, D650Y, F314V/L, S652D y I428V. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es Y715P. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es S764F, E385L, A732G, A689I o A109T o E285D. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es T687M, A732M o L757K. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q381V, A109S, T777N, I106V, T823K, T687C o Q716R. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es V846F, T685V, T687K, D650Y, F314V/L, S652D, Q381 D o I428V. Estas sustituciones, se predice que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I y Y715P (como se encuentra en la variante 481); o las sustituciones 258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I y Y715P; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A79E/M/G, Q85N, I106V, A109S/T, V260G, F314LA/, A343C/G, A505C, T687K/W/C y A732G/M/V. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es T687W. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es T687C o T687W, V260G, A343C, A732G o A109T. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es F314V/L, A732MA , A109S o A343G. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79E, A505C, I106V o A79M/G. En algunas modalidades, la variante de estas sustituciones, se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, A475L, S434P, K495N, G628W, T687K, A689I y Y715P (como se encuentra en la variante 647) o las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, T687W, A689I y Y715P; o las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313 , A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, T687K/W/C, A689I y Y715P; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A79G/E/M, Q85N, V260G, L275Y y F314UV y A732G/M. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79E, A79M, A79G, A732G, V260G o F314L. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q85N, F314V o A732M. Estas sustituciones, se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de ß- glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314L/V, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G (como se encuentra en la variante 664) y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo formado por D47I, A79G/E/ , A109T, A505C, A343C/G, T687W/C/K, N315D y L275F. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79E o A79G. En algunas modalidades, al menos un aminoácido sustituido es A109T, A79M, A505C o A343C. En algunas modalidades, al menos un aminoácido sustituido es T687W, T687C, D47I, T687K, N315D o A343G. Estas sustituciones, se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la actividad de ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo formado por I106V; A123N; G180E; M181Y; M234E; Q258N; Q291W/F/A; T357L/P; D358K; E360D; D369L7V/C/Y/R/K/M/A/H/E/F/Q/P/I; P374Y; E385L; A394G; N437D/L; T482A; S489L; K530M; N536K; T540K, que se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones Q291W, D369H/LJR/Y y E402N; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q313M, Q258N/H, N536K, Q119E, S489I/N/L T, T120Y, K495N/V/I/H/Q, I106V, T120H, N437I/DM//F/K/LA//Y, E385L, M181Y, D274Y, S434P, S501 R, T591 C, Y135Q, Y491 H/F, T540K, N521 C, T591 R, G628W y A475L. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q313M o Q258N. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es N437I, K495N, Q258H o N536K. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es Q119E, S489I, T120Y, K495V, S489L, I106V, T120H o N437D. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es N437W, K495I, N437F, E385L, K495H, N437K, N437L, S489T, M181Y, D274YS434P o N437V. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es S501 R, T591C, Y135q, Y491 H, R491 F, T540K, N521C, T591 R, K495K, G628W, N437Y, S489N o A475L. Estas sustituciones se predice que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, Q381V, E385L, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de S764F, Y715P, E385L/D, A732G/M, A109T/S, T687M/C/K, T777N, I106V, L475A, F314V, D650Y, L757K, Q716R, T685V o F314L. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es S764F o Y715P. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es E385L o A732G. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es A109T o T687M. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es T777N, I106V, I732M, T687C, T687K, E385D, L475A o A109S. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es P720P, F314V, D650Y, L757K, Q716R, T685V o F314L. Estas sustituciones se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar termoestabilidad.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I y 715 P (como se encuentra en la variante 481); y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo formado por D47I, A79E, Q85N, I106V, A109S/T, V260G, L275Y, F314LA/, A505C, T687W/C/K y M/A732G/V. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es T687K/W/C. En algunas modalidades, al menos un aminoácido sustituido es I106V, V260G, F314V, A732G, A109T, F314L, A732M, Q85N o A109S. En algunas modalidades, al menos un aminoácido sustituido es F314, A732V, A505C, D47I, L275Y o A79E. Estas sustituciones se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar termoestabilidad.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, T687K/W, A689I y Y715P (como se encuentra en variante 647); o las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, T687K/W, A689I y Y715P; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo formado por A79E/G/M, Q85N, V260G, L275Y, F314V/L, D395N y A732G, que se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar termoestabilidad. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79M, F314V o A79G. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es A79E, F314L, V260G, A85N, D395N o A732G.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314UV, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G (como se encuentra en la variante 664) y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de A109Sn", A79G/E/ , D47I, Q85N/H, L314V y T591 I. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es A109S, A79G, A109T o A79E. En algunas modalidades, al menos un residuo de aminoácido sustituido es D47I, A79M, A85N o A85H. Estas sustituciones, se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye al menos una sustitución de un residuo de aminoácido en la posición seleccionada del grupo conformado por G180E; Q258N; Q291W/A/F; D358K; D369IJYA//A/H/R/F/E/M/I/K/C/P/Q; P374Y; E385L; N437D/L; T482A; S489L; K530M; N536K; y T540K, que se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad y actividad de ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye Q291W, D369H/L/R/Y y E402N; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Q258N/H, I106V, E385L, D274Y, K495H/I/N/Q, Q119E, Y135Q, G628W, N437I/V/W/D, S501 R, Q313M, S434P y Y491 F, que se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad y actividad ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N y G628W; o Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, K495N y G628W; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo formado por S764F, Y715P, E385L/D, A732G/M, A109T/S, T687M/C/K, T777N, I106V, F314V, D650Y, L757K, Q716R, T685V y F314L las sustituciones se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad y actividad ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I y 715P (como se encuentra en la variante 481); y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo formado por A79E, Q85N, T687K /C, I106V, A109T/S, V260G, F314V/L, A505C y A732G/M/V. Las sustituciones se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad y actividad ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos que incluye D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, A475L, K495N, G628W, T687K/W, A689I y Y715P (como se encuentra en la Variante 647); o el D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, T687K/W, A689I y Y715P; y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo formado por A79E/G/M, Q85N, V260G, F314V/L, A732G y L275Y. En algunas modalidades, el residuo de aminoácido sustituido es A79E, A79M, A79G, Q85N, V260G, F314V, F314L o A732G. Las sustituciones se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad y actividad ß-glucosidasa.

Ciertas variantes de ß-glucosidasa de la presente invención tienen una secuencia de aminoácido que incluye las sustituciones I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314L/V, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G (como se encuentra en la variante 664) y al menos una sustitución de un residuo de aminoácido seleccionado del grupo formado por D47I, A79E/M/G y A109T, que se prevé que son sustituciones altamente beneficiosas para aumentar la termoestabilidad y actividad de ß-glucosidasa.

Notablemente, un número de vanantes con actividad superior y/o termoestabilidad comprende sustituciones en la posición 369, con 14 residuos alternativos diferentes (es decir, ácido no aspártico) que aparecen en variantes beneficiosas. Sustituciones en la posición 369 se prevé que aumenta la actividad y/o termoestabilidad. Así, en un aspecto la invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (Bgl1) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) en donde el aminoácido en posición 369 no es ácido aspártico. En algunas modalidades el aminoácido en posición 369 se selecciona del grupo formado por Q, L, Y, C, A, I, P, E, K, R, F, M, H y V. En algunas modalidades el aminoácido en posición 369 es L (leucina), que aparece especialmente beneficioso para ß-glucosidasa y termoestabilidad.

Un número de variantes con actividad superior y/o termoestabilidad comprende sustituciones en posición 291. Sustituciones en posición 291 se prevé que aumentan la actividad y/ termoestabilidad. Así, en un aspecto la invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (BgM) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) en donde el aminoácido en posición 291 no es glutamina. En algunas modalidades el aminoácido en posición 291 es W, A, o F. En algunas modalidades el aminoácido en posición 369 es W (triptófano), que aparece especialmente beneficioso para ß- glucosidasa y termoestabilidad.

Un número de variantes con actividad superior y/o termoestabilidad comprende sustituciones en posición 402. Sustituciones en posición 402 se prevé que aumentan la actividad y/o termoestabilidad. Así, en un aspecto la invención proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante que comprende una secuencia de aminoácido que es por lo menos 70% idéntica a ß-glucosidasa C1 tipo silvestre (Bgl1) (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) en donde el aminoácido en posición 402 no es ácido glutámico. En algunas modalidades, el aminoácido no es ácido glutámico ni ácido aspártico. En algunas modalidades, el aminoácido no es ácido glutámico, ácido aspártico o prolina. En algunas modalidades, el aminoácido en posición 402 es asparagina, glutamina, histidina, lisina o arginina. En algunas modalidades el aminoácido en posición 402 es asparagina o glutamina. En algunas modalidades el aminoácido en posición 402 es N (asparagina), que parece especialmente beneficiosa para ß-glucosidasa y termoestabilidad.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de: M181Y + Q291W + E402N + S434P; R132K + L149M + Q313M + D369L + E385L + N437D; Q291W + D369L + E402N; Y135I + Q258N + Q474I; M181Y + Q291W + E360D + D369V + P374Y + T482A; Q258N + N437F + S489L + Y491H; Q119E + Q258N + T357L + Q474I + S489L; Q258N + D369R + S489L + Y491 H; N220Y + Q258N + T357L + D369R + Q474I + Y491 F; M234E + V246L + D358K + D369L + N398G + K530M; Y135Q + I229M + F242L + D369L + K530M; D369Q + P374Y + E402N + T540K; Y135Q + P172A + I179M + I229M + Q291A + D358K + D369L + N398G; R132K + D369L + E385L; Y135M + I179M + Q291A + D358K + D369L; Q291W + P374Y + E402N + S434P; Q119E + N220Y + Q258N + T357L + S489L; I179M + Q291A + D358K + D369L + I375V + S388W; Q291W + D369C; R132K + T354Q + D369L + N437L; Q291A + D369L + N398G + K530M; Q1 19E + Q258N + D274Y + S489L; Q1 19E + N220Y + Q258N + Q474I + S489L; M181Y + D369L; T120M + S222E + Q313M + T354Q + D369L + E385L; A4G + Q258N + D274Y + T357L + N437W + Q474I + Y491 H; R132G + D369L + N437D; S182L + Q313M + D369L + E385L; R132G + D369L + E385L; N112V + D358K + D369L + S388W + K530M; 1106V + G180E + D369L + Q381V; I179M + Q291A + D369L; I179M + D358K + D369L + S388W; M234E + Q291A + D369L + N398G; I179M + Q291A + D358K + D369L + Q381 I; Y135Q + N220L + Q291A + D369L + N398G; Y135I + D369L; S182L + D369L + E385L + N437L; T120Y + R132K + D369L + N437D; M234E + D369L + S388W + N398G + K530M; Y135M + I179M + D369L + V390I + K530M; L149Q + A197V + Q313M + D369L; T120M + R132K + D369L + N437L; T120M + R132W + L149M + Q313M + T354Q + D369L + E385L + N437D; A4G + Y135I + N220Y + Q258N + T357P + N437Y; D358K + D369L + S388W; Q258N + D274Y + N437F; D369L + S434P + T540K; G158D + I179M + Q291A + D358K + D369L + I375V + N398G + K530M; Y135I + D274Y + D369R; Q258N + D369L + Q474I + S489L + Y491 F; R132W + S182W + D369L + E385L; S182L + T354Q + D369L + E385L; S222Q + T354Q + D369L + E385L + N437D + T565G; Y135M + P161 S + Q291A + A343T + D369L + I375V + K406D; Q291W + D369C + T540K; D369L + P374Y + E402N; Y135I + A343V + D369F + S489L; M234E + D358K + D369L + S388W; T120M + L149Q + D369L + E385L; Q313M + D369L + E385L; T120Y + D369L + E385L; D369L + N437D + T565A; N112V + Q291A + D369L + I375V; R132W + L149Q + Q313M + T354Q + D369L; Y135M + D369L + I375V + N398G; D369L + E385L; T120M + S182L + Q313M + T354Q + D369L + E385L; T177I + Q291W + P374Y + T482A; Q258N + N437F; T120V + R132W + D369L + T565G; N112V + Q291A + D358N + D369E + S388C + K406D; Q291A + D358K + D369L + S388W + K406D; 1106V + E360R + D369L + Q381V; M234E + Q291A + D369L + S388W + N398G; L149M + Q313M + D369L; M234I + Q291W + E360D + D369V + T482A; T120V + T354Q + D369L + E385L + T565P; M234I + Q291W + E360D + S434P; D369Y + I867M + E868R; R132W + S182L + Q313M + D369L; M234I + Q291W + P374Y + T482A; Y219V + M234I + D369C + P374Y + S434P; S182L + Q313M + D369L + E385L + N437L; M234E + D358K + D369L + S388W + K530M; R132G + S222E + D369L + E385L; R132K + L149M + S182L + D369L + N437L; T120H + Q313M + D369L; R132W + D369L; D369L + P374Y; N1 12V + N220L + Q291A + D369L + S388W + N398G; Q291A + D369L + I375V + K530G; R132K + L149M + S182L + T354Q + D369L + N437D + T565G; T120H + S222E + Q313M + D369L + N437D + T565G; A123N + Q291W + T482A + T540K; S222E + Q313M + T354Q + D369L + E385L; R132W + D369L + T565G; G202M + E360A + D369I + A394L; R132G + S222Q + Q313M + D369L; R132W + L149M + D369L; L149M + Q313M + T354Q + D369L; Q1 19L + G202 + D369L; M181Y + 234I + D369C; I179M + N220L + Q291A + D369L + I375V; S222E + Q313M + D369L + E385L + N437L; I179M + M234E + D358K + D369L + S388W + N398G; A123N + Y219V + Q291W + -E360D + P374Y + S434P; D369L + E402N; D369L; Y219V + M234I + Q291W + T482A; Q291W + E360D + S434P; D369L + S434P; G180E + E360R + D369L; A123N + M181Y + Q291W + D369K + S434P + T540K; Q1 19E + T357L + D369M + S489L; Q1 19E + D369F + Y491 H; Q119L + D369L; Q119E + N220Y + V286I + S489L; Q291A + D369L + Q381 I; A475F; D369L + N536K; Q1 19E + Y135I + D369H; Q258N + S489L; Q1 19E + Y135I + N437Y; Q119E + Y135I + N437F + Y491 F; Q1 19L + D369L + A394V; E183G + E360A + D369L + I428V; D369L + E449Q + N536K; Q1 19L + G202M + E360A + A475F; 1106V + D369L; Y135I + D369M; M234I + D369C + S434P; D369L + A475Y; Q119E + Y135I + S489L; D369Y + N536K; E360R + D369L; G202V + A475H; D369L + Q381V + N536K; N220Y + Q258N + S489L + Y491 F; Q258N + T357L + D369M; I179M + Q291A + D369L + Q381 L + S388W + N398G; D369Y + A394G + N536K; Q291W + E360D + D369V + P374Y; T120M + L149Q + T354Q + D369L + E385L; S489L + Y491 H; N220S + Q291 F + D369L; D369C + S434P + T540K; V318E + D369L + I428V; E183M + G202M + E360A + D369L + A378K + A394V; A394G + N536K; Q291W + T540K; N220L + Q291A + D369L + Q381 L + S388W + K530M; T120V + R132W + E385L + N437D; Q119L + E360A + D369L + A378K; D369A + N536K; G202V + D369L + A475H; Q381V + A475Y + N536K; S434P; 1106V + G180E + D369Y + A394G; G180E + Q381V + A475H; Q1 19E + N220Y + Q474I; 1106V + D369Q; A475Y + N536K; K142R + Y219V + Q291W + S434P + V674I; L149Q + S182L + Q313M + D369L + N437L; N1 12V + I179M + M234E + D369L + N398G; E360A + D369L + A378K; E360R + D369Y + N536K; E360R + D369A + Q381V + N536K; D369L + Q381 D; N437F + S489L; E183M + G202M + V318E + D369I + A394L + I428V; E360D + D369L + E402N + S434P; Q119L + A141 F + G202M + A394L + I428V + A475F; T357L + D369R + S489L + Y491 H; Y135I + Q258N + T357L; K142R + Q291W + E360D + D369C + E402N; E183M + A243V + D369L + A378K + A475F; R132K + L149M + E385L; D369Y; M234I + E402N + S434P; N437Y; Q119E + N437F; N536K; Q119L + E183Q + G202M + D369P; N112V + I179M + Q291A + D358K + K406D; A123N + Q291W + T540K; D369I + A394L + I428V; A88S + N536K; Q119E + Y135I + N437F; A141 F + G202M + E360A + D369P + A378K; A123N + T482A; Q313M + N437D; E360R + D369Y; E183M + G202M + A475F; Q119L + E360A + A394V + A475F; D369L + A378K; E360R + D369L + A394G; M181Y + D369E + S434P; D369I; N112V + Y135Q + I375V + K406D + K530M + P870S; Q119E + Y135I + N220Y + Q258N; D369P + A394V + I428V; V318E + D369L; K186R + N536K; Q1 9L + D369L + A378K; M234I + D369K + S434P; N112V + I179M + N220L + Q291A + Q381 I + S388W + N398G; E402N + S434P; Q119L + A141 F + G202M + A394Q; Q313M + T354Q + N437D; N1 12V + M234E + D369L + I375V + K406D; Q119E + A136E + N220Y; Q381 D + A394G + N536K; Q1 19L + E183G + D369Q + A378T + V390I; Y135I + T357L + Q474I + S489L + Y491 F; D369E + A394P + I428V; N112V + Q291A + Q381 I + N398G; E360R + N536K; E360D + D369C; R132W + S182L + E385L; I179M + Q291A + D358K + N398G + K530G; N220Y + Q258N + T357L; T224N + D274Y + T357L + N437F; N437D; M234I + E360D + T482A; A141 F + G202M + D274N + V318E + E360A + I428V; D369Q; N112V + N220L + D358K + D369L + I375V + Q381 I + N398G; Y135I + D369F; A243V + V318E + E360A + A475W; N220L + D369L + Q381 L + S388W + N398G + K530G; S489L; K142R + Y219V; Y135I + N220Y + Y491 F; S182W + T354Q + E385L; I179M + D358K + S388W; L149M + Q313M + T565P; R132G + E385L; V318E; Q1 19L + E183K; R132W + E385L; E183G + V318E + E360A + A394Q + A475C; E183M + G202M + E360A; A394G; D369P; Y135M + Q291A + S388W + N398G; Y219V + D369C; A394V + I428V; Q119L; Y135I; E360R + D369Q + Q381 D + N536K; N220L + 234E + Q291A + I375V + K530M; Q1 19L + G202M + E360A; N220Y + Q258N + D369R; M181Y + M234I + Q291W + E402N; A394V; T120M + L149Q + Q313M; Q119L + V318E + I428V; E360R + Q381V; K57R + G202M + E360A + A394V; I179M + D358K + I375V + Q381 L; E360A; I179M + R682W; E360A + I428V; and D369K + P374Y (donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2).

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de: I106V + Q258N + Q291W + D369L + E402N + S434P; I106V + Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; I106V + Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + S434P + A475C + K495I + T540K + G628W; I106V + Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + K495H + G628L; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437I + S489N; Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + S434P + T540K; I106V + Q258N + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475F + K495H + G628V; Q258N + Q291W + Q313 + D369L + E402N + S434P + A475C + K495I + G628W; I106V + Y135Q + M181Y + Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + K495N; Y135Q + Q258N + Q291W + D369L + E402N + K495N; Q119E + D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437V + S489N + S614A; Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + A475F + K495N + G628V; R132H + Q258N + Q291W + D369Y + E402N + K495Q; Y135Q + Q258N + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475F + K495H; Y135Q + Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + K495I + G628V; I106V + M181Y + Q258N + Q291W + D369L + E402N; I106V + Q258N + Q291W + D369H + E402N + S434P + A475F + K495F + G628V; Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + G628V; Q258N + Q291W + D369L + E402N + A475F + K495I; Q119E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437I; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L; Q258N + Q291W + D369Y + E402N + S434P + K495H + G628W; D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437I + S489N + K530C; 1106V + Y135Q + Q258N + Q291W + Q313M + D369Y + E402N + S434P + A475F + K495H + T540K; Q119E + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N; 1106V + M181Y + Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + S434P + A475L + K495Q + G628V; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437D; Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + G628V; Q258N + Q291W + Q313M + D369H + E402N + S434P + G628L; Q258N + Q291W + D369L + E402N; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437F + S614D; Q1 19E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437L + K530V; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437V + S489L + K530N; Q258N + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475F + K495F + T540K; M181Y + Q291W + Q313M + D369Y + E402N; A243V + D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437I + K530C; Q119E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437V + K530V + S614A; Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437W + K530C + S614A; Q1 19E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437W; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437I + K530N + S614V; M181Y + Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P; A109T + Q291W + D369L + E402N; Q1 19E + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437Y + S489I + K530N; Q1 19E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437D; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437W + K530V + S614D; Q258N + Q291W + D369R + E402N + A475W + K495H + G628V; A109S + Q291W + D369L + E402N; Q1 19E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L + S614A; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + T611A; Q119E + D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + S614V; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L + K530N + S614A; Q258H + Q291W + Q313M + D369R + E402N + A475F + K495N + G628L; Q258N + Q291W + Q313M + D369Y + E402N + A475W + K495V + T540K + G628W; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437W + S614V; 1106V + Y135Q + Q291W + Q313M + D369L + E402N + A475L + K495Q; Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + A475F + G628V; Q119E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437V; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437Y + S489L + K530V; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + K495V + S501 R + A503E + K530N + T61 1H; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437V + S489I + K530C; Q119E + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437L + S489N; D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437W + K530C + S614D; Q258N + Q291W + D369R + E402N + A475F + K495N + T540K + G628V; Q291W + D369L + E402N + E493V + N504Y; Q291W + D358E + D369L + E385* + E402N + S489T; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + A475L + K495V + A601T + G628W; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + S489N + S614C; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437V + S489L + K530C + S614A; Q1 19E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + N437D; Q1 19E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437L + S614R; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437Y + K530V; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + N437Y + S489N + K530N + S614V + D781 N; Q258H + Q291W + D369* + E402N + S434P + T540K + G628L; Q119E + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L + S489N + K530V; Q258N + Q291W + D369L + E402N + G628V; Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + S489I + K530N; Q119E + Q291W + D369L + E385L + E402N + S489N + K530V + S614A; 1106V + Y135Q + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475F + K495H + G628L; Q1 19E + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437V + K497R + S614A; Q1 19E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437L + S489I + K530V + S614A; 1106V + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + A475W + K495N + G628W; Q291W + D369L + E402N + A505C + L620M + T635I; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + A505C + L620M + T635A; D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + S489N + K530C + S614A; D274Y + Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437W + K530D; Q291W + D369L + E402N + S489N + K495H + S501 R + K530N; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437D + K530C + S614H; Q1 19E + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437W + S489N + K530E + S614A; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + N521C + T591A + R612P + L620M + T635I; Q291W + D358K + D369L + E385L + E402N + N437I + K530M + S614L; Q291W + D369L + E402N + R672I; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437L + S489L; A265S + Q291W + D369L + E402N; Q215M + Q291W + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + E493V + N504Y + N521C + T591A + L620M + T635I; Q1 19E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437L + S489N + K530M + S614D; Q119E + Q291W + D369L + E385L + E402N; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + D566G + R612P + L620M + T635A; Q1 19E + D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + S614Y; 1106V + Y135Q + M181Y + Q258N + Q291W + D369L + E402N; Q119E + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437W + K530V; Q215E + Q291W + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + N504Y + N521C + T591A + R612H + L620M + T635I; Q1 19E + D274Y + Q291W + D358K + D369L + E402N + N437Y + K530I; Q258H + Q291W + D369L + E402N + K495N; Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437D + S489N + K530I; Q291W + D369L + P374Y + E402N + Y491L + S501 R; Q258N + Q291W + Q313M + G332D + D369H + E402N + S434P; Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437F + S489L + K530V; Q291W + D369L + E402N + R672S; Q291W + D369L + E402N + T687M; Q291W + F314V + D369L + E402N; Q258N + Q291W + T357A + D369H + E402N + S434P + K495F; Q291W + D369L + P374Y + E402N + Y491 F + S501 R + N521 C; Q291W + D369L + E402N + Q690K; Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437F + K530V + S614A; Q291W + D369L + E402N + R672A; Q291W + D369L + E402N + R672T; Q291W + D369L + E402N + D703K; D274Y + Q291W + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + R672F; Q291W + D369L + E402N + R672D; Q291W + D369L + E402N + Y491 F + S501 + N536K + D566G; Q291W + D369L + E402N + A732G; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + N521C + T591 C + R612P + L620M; 1106V + Y135Q + Q291W + D369L + E402N + A475F + G628W; Q291W + D369L + E402N + R672G; Q291W + D369L + E402N + T777N; Q291W + Q313M + D369L + E402N + T540K; Q291W + D369L + E402N + K708F; Q291W + D369L + P374Y + E402N + S501 H; Q291W + D369L + E402N + Y715P; Q291W + D369L + E402N + A732M; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + N521 C + D566G + R612P + L620M; Q291W + D369L + E402N + Q690R; D274Y + Q291W + D369L + E385L + E402N + N437V + K530I + S614D; Q291W + D369L + E402N + L757K; Q291W + D369L + E402N + T687Y; Q291W + D369L + E402N + Y491 H + S501 R + N521C + T591A; Q291W + D369L + E402N + V775C; Q291W + D369L + E402N + R672V; Q291W + D369L + E402N + N670D; Q291W + D369L + E402N + T779S; Q291W + D369L + E402N + V638R; Q291W + D369L + E402N + T687F; Q291W + D369L + E402N + T687L; Q291W + D369L + E402N + K610S; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + S501 R + N521C; D274Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + K530V + S614V; 1106V + M181Y + Q258N + Q291W + D369R + E402N + S434P + A475W + K495V + T540K + G628V; Q291W + D369L + E402N + N536K; Q291W + D369L + E402N + E493V + N504Y + R612P + L620M; Q291W + D369L + E402N + S676C; Q291W + D369L + E402N + T540K + G628W; Q291W + D369L + E385L + E402N + N437D + S489L + K530C + S614D; Q119E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437F + S489N + S614L; Q291W + D369L + E402N + S434P + A475W + K495V; Q291W + D369L + E402N + A689I; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + N521C + D566G + R612H + L620M; Q291W + D369L + E402N + V638S; Q291W + D369L + E402N + V648W; Q291W + D369L + E402N + D650V; Q291W + D369L + E402N + V674M; Q291W + D369L + E402N + V638E; 1106V + Q291W + D369L + E402N; Y135Q + Q291W + D369L + E402N; Q291W + D369L + E402N + S764F; Q291W + D369L + E402N + E493A + N504Y + A505C + N521C + T591A + R612P; Q291W + D369L + E402N + S489N + K495Q + S501 R + K530N + T61 1 Q; Q291W + D369L + E402N + T685V; 1106V + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475C + K495N + T540K; Q119E + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437D + K530N + S614V; Q291W + D369L + E402N + T687K; Q291W + D369L + E402N + S652D; Q291W + D369R + E402N + A475F + K495Q + T540K + G628L; Y135Q + Q291W + D369L + E402N + G628V; Q291W + D369L + E402N + E493Y + A505C + N521C + T591A + L620M; Q291W + D369L + E402N + T687W; Q291W + D369L + E402N + D650F; Q291W + D369L + E402N + T687C; Q291W + D369L + E402N + S434P + K495N + G628V; Q291W + D369L + E402N + S501 N; D274Y + Q291W + D369L + E402N + N437K + S489I + K530V + S614L; Q291W + D369L + E402N + T699L; Q1 19E + V246I + Q291W + D358E + D369L + E402N + S614L; Q291W + D369L + E402N + N504Y + N521C + D566G + L620M + T635A; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + D566G + T591A + R612P + L620M; Q291W + D369L + E402N + N536K + T591A; Q291W + D369L + E402N + Q690A; Q291W + D358K + D369L + E402N + N437L + S489I + K530D; Q119E + D274Y + Q291W + D358E + D369L + E385L + E402N + N437V + S489N + K530M + S614H; Q291W + D369L + P374Y + E402N + Y491 L; Q291W + D369L + E402N + S501 R; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + N521 C + N536K; Q291W + D369L + E402N + E493Y + N504Y + N521C + T591 C + R612P + L620M + T635V; Q1 19E + Q291W + D358N + D369L + E385L + E402N + N437I + S489I + S614L; T120Y + Q291W + D369L + E402N + S501 R + N521C + D566G; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + N521C; Q291W + D369L + E402N + Y491 L + S501N + D566G + T591A; D274Y + N278Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + N437Y + S489L + K530E; 1106V + Q291W + D369L + E402N + S434P + A475W + K495F + T540K + G628V; Q119E + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437Y + E742G; Y135Q + Q291W + D369Y + E402N + A475F + K495F; T120H + Q291W + D369L + E402N + Y491 H + S501 H + T591 C; Q119E + Q291W + D358N + D369L + E402N + N437F + S489N + K530E + S614L; Q1 19E + D274Y + Q291W + D358N + D369L + ?402? + N437I + S489N + K530V + S614Y; T120Y + Q291W + D369L + E402N + N521C + N536K; Q291W + D369L + E402N + Y491 F + S501 N + N521C + N536K + T591 R; Q291W + D369L + E402N + S501 N + N521C + D566G + T591 R; Q291W + D369L + E402N + Y491L + S501 R + N536K + D566G + T591 R; and D274Y + Q291W + D358E + D369L + E402N + N437Y + S489N + K530I + S614L; (donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2).

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a Bgl1 C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de: Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Y715P + T823K; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T685V + Y715P; I106V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S764F; A109T + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + I428V + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + Y491 F + K495N + G628W + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + A475L + K495N + S501 R + G628W + Y715P; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S764F; 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Y135M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + V775C; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N627H + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + A405T + S434P + A475L + K495N + G628W; 1221V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S501 R + G628W + T685V; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + A394G + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + L757K; P161S + Q258N + Q291W + Q313M + D358K + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G616D + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + K807R; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A732M; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + E822G; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493V + K495N + G628W + S652D; A15V + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + K866Q; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493A + K495N + G628W + S652D + Q690A; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + E819L; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + E819V; G180E + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E385L + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + D751 N; G202M + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N627H + G628W + T687K + E822A; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + K866I; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T783Q; Q258N + Q291W + Q313M + D369L + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + E493Y + K495N + A505C + G628W; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + T482A + K495N + G628W + D646N; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + A477G + K495N + G628W + S764F + S848N; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + I847T; Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T685V + Y850Q; Y135M + Q258N + Q291W + Q313 + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S501 R + G628W + T685V + T777N; and Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + Y850Q; (donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2).

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a Bgl1 C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de: Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;D47I + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P;A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + S764F;D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + S764F;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P;D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313 + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P;D47I + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P;I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;D47I + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S652D + A689I + Y715P + A732G;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S652D + A689I + Y715P + A732G;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + S652D + A689I + Y715P + A732M;A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343G + D369R + E402N + S434P + Q474L + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I 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S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + Q474I + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;D47I + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N588F + G628W + A689I + Y715P;S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P;V253F + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L + M816L;A243G + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + S764F;I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + N588F + G628W + S652D + A689I + Y715P + D733G;Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + V846L;Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604A + G628W + A689I + Y715P;A79G + 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T785L;A109S + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604I + G628W + A689I + Y715P;Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604V + G628W + A689I + Y715P + K807R;Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604V + G628W + A689I + Y715P;Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + L757K;D47I + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + K495N + N588F + G628W + S652D + A689I + Y715P;A79M + A136L + Q258N + D274Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + T783A;D47I + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + S604V + G628W + A689I + Y715P + S764F;S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L;K24G + A136L + Q258N + D274Y + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + T777N;S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + Q381V + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L; and S58G + Q258N + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689I + Y715P + T785L + M816L; (donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2).

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de: D47I + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732M; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687W + A689I + Y715P; D47I + A79E + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P + S764Y + R769H; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79M + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79M + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79M + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732V; D47I + A79M + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732M; D47I + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732M; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732 ; D47I + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79M + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79G + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79M + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q85N + Q258N + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q85N + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + A79G + Q258N + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + D646N + T687K + A689I + Y715P + A732G; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732V; D47I + A79G + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + P439S + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P; D47I + Q85N + Q258N + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + D395N + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732V; D47I + A79G + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + T693A + Y715P + T827I; D47I + Q85N + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732V; and D47I + A79G + Q258N + L275Y + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + T693E + N723G + A730S + Y855; (donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2).

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de: I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79E + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79E + Q85N + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79M + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79E + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79G + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79E + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79G + Q85N + I106V + A109T + Q258N + V260G + L275F + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G;D47I + I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79E + Q85N + I106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79E + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + N315D + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G;D47I + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79E + Q85N + 1106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79G + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79G + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + Q85N + 1106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79E + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79M + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + 1106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79G + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79M + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79M + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79M + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79G + Q85N + 1106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G.A79E + Q85H + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79G + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79G + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79E + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + 1106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;C8G + D47I + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79E + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79G + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313 + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79G + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + T591 I + G628W + A689I + Y715P + A732G;Q85N + 1106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79M + 1106V + Q258N + V260G + Q291 W + Q3 3M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;Q85N + 1106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q3 3M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G;I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + T687K + A689I + Y715P + A732G;Q85N + 1106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + Q85N + 1106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343G + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + Q85N + 1106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + Q85N + 1106V + A109S + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + Q85N + 1106V + A109S + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687C + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79M + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79G + Q85N + 1106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + A79E + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;Q85N + 1106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + T687W + A689I + Y715P + A732G;I106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;D47I + Q85N + 1106V + A109T + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314V + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;Q85N + 1106V + A109S + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314V + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; D47I + A79M + 1106V + A109S + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G;A79M + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G; y A79M + Q85N + 1106V + Q258N + V260G + L275Y + Q291W + Q313M + F314L + A343C + D369R + E402N + S434P + K495N + A505C + G628W + A689I + Y715P + A732G (donde posición de aminoácido es determinada por alineamiento óptimo con SEQ ID NO: 2).

En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado de aquellos ejemplificados anteriormente (Cuadro 2, 3, 4, 5, 6, 7) y comprende sustituciones adicionales que (a) no disminuyen la actividad o termoestabilidad de la variante y (b) no incluyen sustituciones en cualquiera de los residuos adicionales en el grupo que consiste de: K57; A88; 1106; N112; Q119; T120; A123; R132; Y135; A136; A141 ; K142; L149; G158; P161 ; P172; T177; 1179; G180; M181 ; S182; E183; K186; A197; G202; Y219; N220; S222; T224; I229; M234; F242; A243; V246; Q258; D274; V286; Q291 ; Q313; V318; A343; T354; T357; D358; E360; D369; P374; I375; A378; Q381 ; E385; S388; V390; A394; N398; E402; K406; I428; S434; N437; E449; Q474; A475; T482; S489; Y491 ; K530; N536; T540; T565; V674; R682; I867; E868; y P870.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a Bgl1 C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 6.0 a 6.9 veces en actividad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 5.0 a 5.9 veces en la actividad sobre Bgl1 C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces en la actividad sobre Bgl1 C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces en la actividad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en termoestabilidad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en termoestabilidad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 6.0 a 6.9 veces en actividad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran de un mejoramiento de 5.0 a 5.9 veces en la actividad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran un mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces en la actividad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces en la actividad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante de un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en la actividad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en la actividad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a Bgl1 C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces en actividad sobre la variante 269, como se identifica en el cuadro 4. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran un mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces en la actividad sobre la variante 269, como se identifica en el cuadro 4. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en la actividad sobre la variante 269, como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en la actividad sobre la variante 269, como se identifica en el cuadro 4.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces en actividad sobre la variante 481 , como se identifica en el cuadro 5. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces en la actividad sobre la variante 481 , como se identifica en el cuadro 5. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en la actividad sobre la variante 481 , como se identifica en el cuadro 5. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en la actividad sobre la variante 481 , como se identifica en el cuadro 5.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces en actividad sobre la vanante 647, como se identifica en el cuadro 6. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces en la actividad sobre la variante 647, como se identifica en el cuadro 6. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en la actividad sobre la variante 647, como se identifica en el cuadro 6. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en la actividad sobre la variante 647, como se identifica en el cuadro 6. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 0.6 a 1.0 veces en la actividad sobre la variante 647, como se identifica en el cuadro 6.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a Bgl1 C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces en actividad sobre la variante 664, como se identifica en el cuadro 7. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en la actividad sobre la variante 664, como se identifica en el cuadro 7.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces en termoestabilidad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces en termoestabilidad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en termoestabilidad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en termoestabilidad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 2.0 a 2.9 en termoestabilidad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 3, como se identifica en el cuadro 3.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 2.0 a 2.0 veces en termoestabilidad sobre la variante 269, como se identifica en el cuadro 4. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 269, como se identifica en el cuadro 4.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 481 , como se identifica en el cuadro 5. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 481 , como se identifica en el cuadro 5. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 481 , como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 0.6 a 1.0 veces en termoestabilidad sobre la variante 481 , como se identifica en el cuadro 5.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a Bgl1 C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 647, como se identifica en el cuadro 6. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 647, como se identifica en el cuadro 6. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 0.6 a 1.0 veces en termoestabilidad sobre la variante 647, como se identifica en el cuadro 6. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 0.2 a 0.5 veces en termoestabilidad sobre la variante 647, como se identifica en el cuadro 6.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces en termoestabilidad sobre la variante 664, como se identifica en el cuadro 7. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran al menos un mejoramiento de 0.6 a 1.0 veces en termoestabilidad sobre la variante 664, como se identifica en el cuadro 7.

En algunas modalidades, la variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada y/o recombinante de la presente invención es por lo menos aproximadamente 70% idéntica a BgM C1 tipo silvestre (residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2) y comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en actividad y/o termoestabilidad sobre BgM C1 nativa, como se identifica en el cuadro 2. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en actividad y/o termoestabilidad sobre la variante 3 como se identifica en el cuadro 3. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en actividad y/o termoestabilidad sobre la variante 269 como se identifica en el cuadro 4. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo que consiste de conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en actividad y/o termoestabilidad sobre la variante 481 como se identifica en el cuadro 5. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en actividad y/o termoestabilidad sobre la variante 647 como se identifica en el cuadro 6. En algunas modalidades, la variante comprende un conjunto de sustitución seleccionado del grupo formado por conjuntos de sustitución que muestran cualquier mejora en actividad y/o termoestabilidad sobre la vanante 664 identificada en el cuadro 7.

Como se señala anteriormente, polipéptidos ß-glucosidasa llevados a cabo por la invención tienen por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia para residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, polipéptidos ß-glucosidasa llevados a cabo por la invención incluyen aquellos que tienen una secuencia de aminoácido al menos aproximadamente 71% idéntica, por lo menos aproximadamente 72% idéntica, por lo menos aproximadamente 73% idéntica, por lo menos aproximadamente 73% idéntica, por lo menos aproximadamente 74% idéntica, por lo menos aproximadamente 75% idéntica, por lo menos aproximadamente 76% idéntica, por lo menos aproximadamente 77% idéntica, por lo menos aproximadamente 78% idéntica, por lo menos aproximadamente 79% idéntica, por lo menos aproximadamente 80% idéntica, por lo menos aproximadamente 81% idéntica, por lo menos aproximadamente 82% idéntica, por lo menos aproximadamente 83% idéntica, por lo menos aproximadamente 84% idéntica, por lo menos aproximadamente 85% idéntica, por lo menos aproximadamente 86% idéntica, por lo menos aproximadamente 87% idéntica, por lo menos aproximadamente 88% idéntica, por lo menos aproximadamente 89% idéntica, por lo menos aproximadamente 90% idéntica, por lo menos aproximadamente 91 % idéntica, por lo menos aproximadamente 92% idéntica, por lo menos aproximadamente 93% idéntica, por lo menos aproximadamente 94% idéntica, por lo menos aproximadamente 95% idéntica, por lo menos aproximadamente 96% idéntica, por lo menos aproximadamente 97% idéntica, por lo menos aproximadamente 98% idéntica o por lo menos aproximadamente 99% idéntica a los residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2. Cada recitación aquí de "70 %" debe entenderse para incluir también, en forma alternativa, cualquiera de los valores más altos anteriores.

Como se señala anteriormente, variantes BgM de la invención pueden abarcar sustituciones de aminoácidos adicionales más allá de los enumerados anteriormente que incluyen, por ejemplo, variantes con una o más sustituciones conservadoras adicionales hechas en sus secuencias de aminoácidos. Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparaginas), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina, prolina, cisteína y metionina). Sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por H. Neurath and R.L. Hill, 1979, in "The Proteins," Academic Press, New York, que se incorpora aquí para referencia. Los intercambios que ocurren más comúnmente son Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, AlafThr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, LeuA al, Ala/Glu, y Asp/Gly, así como estos en sentido inverso.

Variaciones sustituidas conservadoramente de las variantes de polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención incluyen las sustituciones de un pequeño porcentaje, típicamente menos de 5%, más típicamente menos de 2% y a menudo menos del 1% de los aminoácidos de la secuencia de polipéptidos, con un aminoácido seleccionado conservadoramente del mismo grupo de sustitución conservador. La adición de secuencias que no alteran la actividad codificada de una ß-glucosidasa, tal como la adición de una secuencia no funcional o no codificación, es considerada una variación conservadora de la polinucleótido ß-glucosidasa.

La presente invención también proporciona fragmentos enzimáticamente activas de variantes de polipéptido ß-glucosidasa descritos aquí que tienen actividad ß-glucosidasa y al menos una sustitución descrita aquí. Se cree basado en estudios previos que Bgl1 C1 tolera truncamiento (es decir, conserva la actividad). Se ha observado que una variante de BgM C1 que tiene una secuencia que difiere de tipo salvaje en cada una de las posiciones de aminoácido 25 N-terminal retiene la actividad ß-glucosidasa (no mostrada). Asimismo, el truncamiento en el término carboxilo de 16 residuos de aminoácido es tolerado en ß-glucosidasa Azospiríllum irakense (CelA). Véase USSN 61/218,020, que se incorpora aquí para referencia. En consecuencia, la presente invención además proporciona una variante de polipéptido ß-glucosidasa aislada o recombinante que tiene una secuencia de aminoácido que tiene una eliminación de 1 a 50 residuos de aminoácidos desde el término (C-) carboxi, el término (N-) amino o ambos (es decir, una eliminación de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50 residuos de aminoácidos de cualquiera o ambos N- o C-término) con respecto a SEQ ID NO: 2. En ciertas modalidades, la eliminación será de 1 a 15 residuos de aminoácidos del N-término y/o de 1 a 40 residuos de aminoácidos del C-término. Estos fragmentos de ß-glucosidasa también se conocen aquí como variantes de polipéptido ß-glucosidasa truncada N-terminalmente y C-terminalmente, respectivamente. En algunas modalidades, la eliminación puede ser de 1 a 30 o 1 a 20, o 1 a 10 residuos, o 1 a 5 residuos del C-término, el N-término, o ambos.

CUADRO 2 El cuadro 2 muestra condiciones de termoactividad: pH 5, 65°C durante 21 horas. Condiciones de termoestabilidad: actividad residual enzimática se determina después de incubar a pH 5, 65°C durante 6 horas.

Cambios de aminoácido se indican con respecto a SEQ ID NO: 2. 2Cambios de nucleótido se indican con respecto a SEQ ID NO: 1. 3Mejora múltiplo se representa como sigue: * = mejoramiento de 0.3 a 0.5 veces sobre BgM C1 nativa (SEQ ID NO: 2) ** = mejoramiento de 0.6 a 1 veces sobre BgM C1 nativa (SEQ ID NO: 2) + = mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces sobre BgM C1 nativa (SEQ ID NO: 2) ++ = mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces sobre Bgl1 C1 nativa (SEQ ID NO: 2) +++ = mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces sobre Bgl1 C1 nativa (SEQ ID NO: 2) ++++ = mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces sobre BgM C1 nativa (SEQ ID NO: 2) +++++ = mejoramiento de 5.0 a 5.9 veces sobre BgM C1 nativa (SEQ ID NO: 2) ++++++ = mejoramiento de 6.0 a 6.9 veces sobre BgM C1 nativa (SEQ ID NO: 2) CUADRO 3 El cuadro 3 muestra las condiciones de termoactividad: pH 5, 70°C durante 21 horas. Condiciones de termoestabilidad: actividad residual enzimática se determina después de incubar a pH 5, 65°C durante 16-48 horas. 1Cambios de aminoácido se indican con respecto a SEQ ID NO: 2; la secuencia de cadena principal contiene sustituciones Q291W + D369L + E402N. 2Cambios de nucleótido se indican con respecto a SEQ ID NO: 1. 3Mejora múltiplo se representa como sigue: * = mejoramiento de 0.3 a 0.5 veces sobre variante 3 (SEQ ID NO: 5) ** = mejoramiento de 0.6 a 1 veces sobre variante 3 (SEQ ID NO: 5) + = mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces sobre variante 3 (SEQ ID NO: 5) ++ = mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces sobre variante 3 (SEQ ID NO: 5) +++ = mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces sobre variante 3 (SEQ ID NO: 5) ++++ = mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces sobre variante 3 (SEQ ID NO: 5) +++++ = mejoramiento de 5.0 a 5.9 veces sobre variante 3 (SEQ ID NO: 5) ++++++ = mejoramiento de 6.0 a 6.9 veces sobre variante 3 (SEQ ID NO: 5) CUADRO 4 El cuadro 4 muestra las condiciones de termoactividad: pH 4.5, 70°C durante 21 horas. Condiciones de termoestabilidad: actividad residual enzimática se determina después de incubar a pH 4.5, 70°C durante 2 horas. 1Cambios de aminoácido se indican con respecto a SEQ ID NO: 2; la secuencia de cadena principal contiene sustituciones Q258W + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W 2Cambios de nucleótido se indican con respecto a SEQ ID NO: 1. 3Mejora múltiplo se representa con respecto a la variante 266 (SEQ ID NO: 7) * = mejoramiento de 0.2 a 0.5 veces ** = mejoramiento de 0.6 a 1 veces + = mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces ++ = mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces +++ = mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces ++++ = mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces CUADRO 5 El cuadro 5 muestra las condiciones de termoactividad: pH 4.2, 70°C durante 21 horas. Condiciones de termoestabilidad: actividad residual enzimática se determina después de incubar a pH 4.5, 70°C durante 3 horas. 1Camb¡os de aminoácido se indican con respecto a SEQ ID NO: 2; la secuencia de cadena principal contiene sustituciones Q258W + Q291W + Q313M + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + A689L + Y715P 2Cambios de nucleótido se indican con respecto a SEQ ID NO: 1. 3Mejora múltiplo se representa con respecto a la variante 481 (SEQ ID NO: 9) * = mejoramiento de 0.2 a 0.5 veces ** = mejoramiento de 0.6 a 1 veces + = mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces ++ = mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces +++ = mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces ++++ = mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces CUADRO 6 El cuadro 6 muestra las condiciones de termoactividad: pH 4, 70°C durante 21 horas. Condiciones de termoestabilidad: actividad residual enzimática se determina después de incubar a pH 4.5, 70°C durante 24 horas. Cambios de aminoácido y nucleótido silencioso se indican con respecto secuencia tipo silvestre. 1Cambios de aminoácido se indican con respecto a SEQ ID NO: 2; la secuencia de cadena principal contiene sustituciones D47I + Q258N + Q291W + Q313M + A343C + D369R + E402N + S434P + A475L + K495N + G628W + T687K + A689I + Y715P. 2Cambios de nucleótido se indican con respecto a SEQ ID NO: 1. 3Mejora múltiplo es con respecto a la variante 647 (SEQ ID NO: 15) * = mejoramiento de 0.2 a 0.5 veces ** = mejoramiento de 0.6 a 1 veces + = mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces ++ = mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces +++ = mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces ++++ = mejoramiento de 4.0 a 4.9 veces CUADRO 7 El cuadro 7 muestras las condiciones de termoactividad: pH 4, 70°C durante 21 horas. Condiciones de termoestabilidad: actividad residual enzimática se determina después de incubar a pH 4.5, 70°C durante 24 horas. 1Cambios de aminoácido se indican con respecto a SEQ ID NO: 2; la secuencia de cadena principal contiene sustituciones I106V + Q258N + V260G + Q291W + Q313M + F314L + D369R + E402N + S434P + K495N + G628W + A689I + Y715P + A732G. 2Cambios de nucleótido se indican con respecto a SEQ ID NO: 1. 3Mejora múltiplo es con respecto a la variante 664 (SEQ ID NO: 13) * = mejoramiento de 0.2 a 0.5 veces ** = mejoramiento de 0.6 a 1 veces + = mejoramiento de 1.1 a 1.9 veces ++ = mejoramiento de 2.0 a 2.9 veces +++ = mejoramiento de 3.0 a 3.9 veces.

El cuadro 8 ¡lustra propiedades ejemplares de variantes Bgl C1 con mayor termoactividad y/o termoestabilidad en comparación con la enzima tipo silvestre.

CUADRO 8 Por ejemplo, en algunas modalidades, una variante tiene al menos 5 veces menos de termoactividad y/o al menos 2 veces mayor termoestabilidad que BgM tipo silvestre. Por ejemplo y sin limitación, la variante 3 tiene estas propiedades. Por ejemplo, en otra modalidad, una variante tiene al menos 4 veces más termoactividad y/o al menos 4 veces más termoestabilidad que la variante 481 Bgl1. Por ejemplo y sin limitación, la variante 647 tiene estas propiedades.

Las secuencias de aminoácidos de variantes ß-glucosidasa no específicamente descritas aquí pueden generarse fácilmente e identificarse usando métodos que son bien conocidos por aquellos que tienen experiencia ordinaria en la técnica. Algunas variantes de ß-glucosidasa de la invención de tener al menos el 70% de identidad de secuencia a residuos 20-870 de SEQ ID: 2 y una o más sustituciones descritas aquí, también tienen una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones, además de las específicamente descritas aquí. El efecto, si los hubiere, de dichas sustituciones, eliminaciones o inserciones sobre la actividad de ß-glucosidasa y termoestabilidad puede determinarse mediante ensayos conocidos en la técnica y descritos en este documento (véase por ejemplo, los ejemplos 3 y 5, infra). Para ilustración, la variante número 1 en el cuadro 2 tiene las siguientes sustituciones relativas a los residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2: M181Y + Q291W + E402N + S434P. Para determinar el efecto de una sustitución adicional (por ejemplo, reemplazo de isoleucina en la posición 20 con leucina) se expresa la variante (en este caso, I20L + M181Y + Q291W + E402N + S434P) y sus propiedades en comparación con el origen (en este caso, M181Y + Q291W + E402N + S434P).

Además, las genotecas de variantes polipéptido ß-glucosidasa (y polinucleótidos de codificación de las variantes) pueden generarse desde una secuencia parental (por ejemplo, como una o más variantes ejemplificadas aquí) y tamizadas utilizando el tamiz de alto rendimiento para la presencia de actividad de ß-glucosidasa descrita en, por ejemplo, ejemplo 5. Mutagénesis y métodos de evolución dirigida conocidos en la técnica pueden aplicarse fácilmente a los polinucleótidos de codificación de variantes de ß-glucosidasa ejemplificadas aquí para generar genotecas variantes que pueden ser expresadas, seleccionadas y ensayadas según los métodos descritos en este documento. Mutagénesis y métodos de evolución dirigida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ling, et al., 1999, "Approaches to DNA mutagénesis: an overview," Anal. Biochem., 254(2):157-78; Dale, et al., 1996, "Oligonucleotide-directed random mutagénesis using the phosphorothioate method," Methods Mol. Biol., 57:369-74; Smith, 1985, "ln vitro mutagénesis," Ann. Rev. Genet., 19:423-462; Botstein, et al., 1985, "Strategies and applications of in vitro mutagénesis," Science, 229:1193-1201 ; Cárter, 1986, "Site-directed mutagénesis," Biochem. J., 237:1-7; Kramer, et al., 1984, "Point Mismatch Repair," Cell, 38:879-887; Wells, et al., 1985, "Cassette mutagénesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites," Gene, 34:3 5-323; Minshull, et al., 1999, "Protein evolution by molecular breeding," Current Opinión in Chemical Biology, 3:284-290; Christians, et al., 1999, "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling, "Nature Biotechnology, 17:259- 264; Crameri, et al., 1998, "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution, "Nature, 391 :288-291 ; Crameri, et al., 1997, "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling, "Nature Biotechnology, 15:436-438; Zhang, et al., 1997 "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening, "Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 94:45-4-4509; Crameri, et al., 1996, "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling, "Nature Biotechnology, 14:315-319; Stemmer, 1994, "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, "Nature, 370:389-391 ; Stemmer, 1994, "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, "Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 91 :10747-10751 ; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651 ; y WO 01/75767, todos los cuales se incorporan aquí por referencia.

En la generación de variantes que comprenden las sustituciones, inserciones o eliminaciones en posiciones además de las descritas supra, el practicante ordinariamente calificados estarán consciente que ciertas regiones de la proteína ß-glucosidasa son menos tolerantes que otras sustituciones (especialmente sustituciones no conservadoras). Así, en algunas modalidades, proteínas de va ante BgM conservan residuos conservados y dominios funcionales del origen.

Actividad de ß-glucosidasa y ensayos de termoestabilidad La actividad B-glucosidasa puede determinarse por métodos descritos en los ejemplos 3 y 5, asi como cualquier otro método conocido en la técnica. Actividad de ß-glucosidasa podrá determinarse, por ejemplo, utilizando un ensayo de para-nitrofenil- -D-glucopiranosida (pNPG) o un ensayo de celobiosa.

Por ejemplo, un pNPG colorimétrico ensayo basado en (p-nitrofenil- -D-glucopiranosida) puede utilizarse para medir la actividad de ß-glucosidasa. Un tal ensayo se describe en el ejemplo 3, infra. En otro ensayo de pNPG ejemplar, en un volumen total de 100 µ?, 20 µ? de sobrenadante de medio claro que contiene la enzima ß-glucosidasa se añaden a solución pNPG 4 mM (Sigma-Aldrich, Inc. St. Louis, MO) en regulador de pH de fosfato de sodio 50 mM a pH 5. Las reacciones son incubadas a pH 5, 50°C durante 1.5 horas. La mezcla de reacción se templa; con 100 µ? de solución pH 11 de carbonato de sodio 1 M. La absorbancia de la solución se mide a 405 nm para determinar la conversión de pNPG a nitrofenol. La liberación de p-nitrofenol (e = 17,700 M-1 cm-1) se mide a 405 nm para calcular la actividad de ß-glucosidasa. La actividad de ß-glucosidasa detectable es observado bajo condiciones de selección de alto rendimiento (pH 7, 50°C). Ver Breves et al., 1997, Appl. Environmental Microbiol. 63:3902, incorporado en el presente documento por referencia.

Alternativamente, la actividad de ß-glucosidasa puede determinarse mediante un ensayo en que celobiosa es el sustrato. Un ensayo adecuado es descrito en el ejemplo 3, infra. Otro ensayo adecuado se lleva a cabo como sigue: en un volumen total de 100 µ?, 25 µ? de sobrenadante de medio claro que contiene la enzima ß-glucosidasa se añade a celobiosa 10 g/l (Fluka Cat. No. 22150, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) en regulador de pH de fosfato de sodio 100 mM (pH 6-7) o regulador de pH de acetato de sodio (pH 5-5.5). La reacción es incubada a 45-70°C durante un tiempo apropiado (25 minutos en la noche dependiendo de la concentración de la enzima) mientras se agita. La producción de glucosa puede determinarse utilizando cualquier número métodos conocidos en la técnica para medir la glucosa. En un enfoque, la producción de glucosa se determina mediante un ensayo enzimático de glucosa (K-GLUC, Megazyme, Irlanda). 10 µ? de cada reacción se agrega a reactivo GOPOD 190 µ? (suministrado como parte del kit de ensayo K-GLUC). La reacción es incubada a 45°C durante 20 minutos y se midió la absorbancia de la solución a 510 nm. El reactivo GOPOD contiene regulador de pH de fosfato de potasio de 50 mM pH7.4, ácido p-hidroxibenzoico 0.011M, azida sódica 0.008% p/v, oxidasa de glucosa (>12,000U/L), peroxidasa (>650 U/L) y 4-aminoantipirina 80 mg/l. La enzima oxidasa de glucosa en el reactivo reacciona con cualquier glucosa presente en la muestra y produce peróxido de hidrógeno que reacciona después con la 4-aminoantipirina para producir un tinte de quinonaimina en cantidades proporcionales con la cantidad de glucosa presente y puede medirse espectrofotométricamente en 510nm.

Péptido de señal En general, los polipéptidos ß-glucosidasa son secretados por la célula hospedera en que se expresan (por ejemplo, una levadura o célula de hongo) y se expresan como una pre-proteína incluyendo un péptido de señal, es decir, una secuencia de aminoácidos ligados a la terminal amino de un polipéptido y que dirige el polipéptido codificado en la vía secretoria celular. En una modalidad, el péptido de señal es el péptido endógeno de señal de ß-glucosidasa endógena C1 con la secuencia expuesta como residuos 1-19 de SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, se utilizan los péptidos de señal de otras proteínas secretadas C1.

Todavía otros péptidos de señal podrán utilizarse, dependiendo de la célula hospedera y otros factores. Regiones de codificación de péptido de señal efectiva de células hospederas de hongos filamentosos incluyen, pero no están limitadas a las regiones de codificación de péptido de señal obtenidas de Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger neutral amilasa, Aspergillus niger glucoamilasa, Rhizomucor miehei asparatica proteinasa, Humicola insolens celulasa, Humicola lanuginosa lipasa y T. reesei celobiohidrolasa II (TrCBH2).

Regiones de codificación de péptido de señal efectiva para células hospederas bacterianas son las regiones de codificación de péptido de señal obtenidas de los genes para Bacillus NCIB 11837 maltogénica amilasa, Bacillus stearothermophilus alfa-amilasa, Bacillus licheniformis subtilisina, Bacillus licheniformis ß-lactamasa, Bacillus stearothermophilus neutral proteasas (nprT, nprS, nprM) y Bacillus subtilis prsA. Péptidos de señal son descritas por Simonen y Palva, 1993, Microbiol Rev 57:109-137 (incorporado en el presente documento por referencia).

Péptidos de señal útiles para las células hospederas de levadura también incluyen aquellos de los genes de Saccharomyces cerevisiae factor alfa, Saccharomyces cerevisiae SUC2 invertasa (véase Taussig y Carlson, 1983, Nucleic Acids res 11 : 1943-54; SwissProt adhesión No. P00724) y otros. Véase, por ejemplo, Romanos et al., 1992, 8:423-488. Variantes de estos péptidos de señal y otros péptidos de señal son adecuados.

Polipéptidos de fusión y elementos adicionales de secuencia En algunas modalidades, una variante de polipéptido ß-glucosidasa de la invención incluye secuencias adicionales que no alteran la actividad codificada de una ß-glucosidasa. Por ejemplo, la ß-glucosidasa puede vincularse a una etiqueta de epítope o a otra secuencia útil en la purificación de ß-glucosidasa.

La presente invención también proporciona polipéptidos de fusión variante ß-glucosidasa, en donde el polipéptido de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de codificación de una variante polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención o su fragmento, enlazado directa o indirectamente a través de N- o C-terminal de la variante polipéptido ß-glucosidasa a una secuencia de aminoácidos de codificación de por lo menos un segundo polipéptido (adicional). El polipéptido de fusión variante ß- glucosidasa además puede incluir una secuencia de aminoácidos de codificación de un tercero, cuarto, quinto, o polipéptidos adicionales. Normalmente, cada polipéptido adicional tiene una actividad biológica, o alternativamente, es una porción de un polipéptido que tiene actividad biológica, donde la porción tiene el efecto de mejorar la expresión y/o secreción del polipéptido de fusión desde el hospedero de expresión deseada. Estas secuencias pueden ser fusionadas, directa o indirectamente, a la N- o C-terminal de la variante de polipéptido ß-glucosidasa o su fragmento, o alternativamente, a la N- o C-terminal de los polipéptidos adicionales que tienen actividad biológica.

Normalmente, el o los polipéptidos adicionales codifican una enzima o su fragmento activo, y/o un polipéptido que mejora la expresión y/o secreción del polipéptido de fusión de la célula hospedera de expresión deseada. Más generalmente, el o los polipéptidos adicionales codifican una celulasa (por ejemplo, una ß-glucosidasa que tiene una secuencia de aminoácidos diferentes del polipéptido ß-glucosidasa variante en el polipéptido de fusión (por ejemplo, una ß-glucosidasa tipo silvestre o una variante de la misma, incluyendo una T. aurentiacus ß-glucosidasa diferente variante polipéptido) o un polipéptido exhibiendo actividad de BCH o EG) y/o un polipéptido que mejora la expresión y la secreción de la célula hospedera deseada, tales como, por ejemplo, un polipéptido que normalmente es expresado y secretado desde el hospedero deseado de expresión, como un polipéptido secretado normalmente expresado de hongos filamentosos. Estos incluyen glucoamilasa, a-amilasa y aspartil proteasas de Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori y Aspergillus oryzae, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, endoglucanasa I y endoglucasa III de Trichoderma y glucoamilasa de especies de Neurospora y Humicola. Consulte WO 98/31821 , que se incorpora aquí por referencia.

Los componentes de polipéptido del polipéptido de fusión pueden unirse entre sí indirectamente a través de un enlazador. Enlazadores aptos para su uso en la práctica de la presente invención se describen en WO 2007/075899, que se incorpora aquí por referencia. Enlazadores ejemplares incluyen enlazadores de péptido de entre 1 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos de longitud, incluyendo aquellos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos de aminoácidos de longitud y aquellos de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, los enlazadores pueden estar formados por un residuo de aminoácido sencillo, como, por ejemplo, un Gly, Ser, Ala, residuo Thr o combinaciones de los mismos, especialmente de Gly y Ser. Enlazadores empleados en la práctica de la presente invención puede ser divisibles. Enlazadores divisibles adecuados pueden contener un sitio de división, como un sitio de reconocimiento de proteasa. Sitios de reconocimiento de proteasa ejemplares son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, Lys-Arg (el sitio reconocimiento de KEX2 proteasa, que puede ser dividido por una proteasa tipo KEX2 Aspergillus nativa), Lys y Arg (los sitios de reconocimiento de proteasa tripsina). Véase, por ejemplo, WO 2007/075899, que se incorpora aquí por referencia.

IV. ß-glucosidasa polinucleótidos y sistemas de expresión La presente invención proporciona secuencias de polinucleótido que codifican variantes de ß-glucosidasa C1 de la invención. El C1 genómico y secuencias de ADNc se describen en la sección II, supra.

En una modalidad, para la expresión de una variante de ß-glucosidasa descrita aquí, la secuencia de ADNc de ß-glucosidasa C1 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), o su porción que comprende el marco abierto de lectura, puede utilizarse (con los cambios necesarios en los codones correspondientes a sustituciones (residuos mutados respecto a la secuencia de tipo salvaje). Además, pueden incorporarse uno o más de los cambios de nucleótidos "silenciosos" mostrados en el cuadro 2, cuadro 3, cuadro 4, cuadro 5, cuadro 6 o cuadro 7.

Aquellos con experiencia en la técnica comprenderán que debido a la degeneración del código genético, existe una multitud de secuencias de nucleótidos de codificación de polipéptidos ß-glucosidasa de la presente invención. El cuadro 9 proporciona el código genético triplete estándar para cada aminoácido. Por ejemplo, los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican el aminoácido arginina. Así, en cada posición en los ácidos nucleicos de la invención donde una arginina es especificada por un codón, el codón puede modificarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos antes sin alterar el polipéptido codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN corresponde a T en una secuencia de ADN. La invención contempla y proporciona cada variación posible de secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención que podría realizarse seleccionando combinaciones según codón posibles opciones de codón.

Una secuencia de ADN también puede estar diseñada para codones de sesgo de codón alto (codones que se utilizan con mayor frecuencia en las regiones de codificación de la proteína que otros codones que codifican el mismo aminoácido). Los codones preferidos pueden determinarse en relación con el uso de codón en un solo gen, un conjunto de genes de función común u origen, genes altamente expresados, la frecuencia de codón en las regiones de codificación de proteína agregada de todo el organismo, frecuencia de codón en las regiones de codificación de proteína agregada de organismos relacionados, o combinaciones de los mismos. Codones cuya frecuencia aumenta con el nivel de expresión génica son codones típicamente óptimos para la expresión. En particular, una secuencia de ADN puede optimizarse para la expresión de un organismo determinado hospedero. Referencias proporcionan información de preferencia para una amplia gama de organismos están fácilmente disponibles véase por ejemplo, Henaut y Danchin en "Escherichia Salmonella," Neidhardt, et al eds., ASM Pres, Washington D.C. (1996), pp. 2047-2066, que se incorpora aquí por referencia. Para ilustración y no para limitación, SEQ ID NO: 3 muestra una secuencia de polinucleótido de codificación de Bgl1 C1 diseñada con desplazamiento de codón para expresión en Saccharomyces cerevisiae.

CUADRO 9 Código genético Aminoácido Codon Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteina Cys C UGC UGU ácido aspartico Asp D GAC GAU ácido glutamico Glu E GAA GAG fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina lie I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp w UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Se conocen una variedad de métodos para determinar la frecuencia de codón (por ejemplo, el uso de codón, el uso de codón sinónimo relativo) y la preferencia de codón en organismos específicos, incluyendo análisis multivariante, por ejemplo, mediante análisis de clúster o análisis de correspondencia y el número efectivo de codones en un gen (véase GCG CodonPreference, Paquete Genetics Computer Group Wisconsin; Codón W, John Peden, Universidad de Nottingham; Mclnerney, J. O., 1998, Bioinformatics 14:372-73; Stenico et al., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46; Wright, F., 1990, Gene 87:23-29; Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:21 1 1-2118; Nakamura et al., 2000, Nucí. Acids Res. 28:292; Henaut y Danchin, "Escherichia coli and Salmonella," 1996, Neidhardt, et al. Eds., ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066, todos los cuales están incorporados en el presente para ser referencia). El origen de datos para la obtención de uso de codón puede depender de cualquier secuencia de nucleótido disponible capaz de codificar para una proteína. Estos conjuntos de datos incluyen secuencias de ácido nucleico actualmente conocidas por codificar las proteínas expresadas (por ejemplo, secuencias de codificación de proteína completa-CDS), etiquetas de secuencia expresada (EST), o regiones de de codificación predichas de secuencias genómicas (véase, por ejemplo, Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Capítulo 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001 ; Uberbacher, E. C, 1996, Methods Enzymol. 266:259-281 ; Tiwari et al., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270, todos los cuales se incorporan aquí por referencia).

Para la expresión de una variante ß-glucosidasa en un C1 u hospedero M. thermophilia, la secuencia de ADNc de ß-glucosidasa tipo silvestre C1 (SEQ ID NO: 1) o la parte de la misma que comprende el marco abierto de lectura, puede utilizarse (con los cambios necesarios en los codones correspondientes a sustituciones (residuos mutados respecto a la secuencia de tipo salvaje). Además, pueden ser incorporados uno o más de los cambios de nucleótidos "silenciosos" mostrados en el cuadro 2. Estos cambios pueden afectar la actividad de ß-glucosidasa en una variedad de formas. Por ejemplo, sin intención de ligarse por un mecanismo particular, mutaciones silenciosas pueden aumentar la estabilidad del ARNm de codificación de proteina variante.

Vectores de expresión La presente invención hace de uso de recombinante construye compuesto por una secuencia de codificación de una ß-glucosidasa como se describe anteriormente. En un aspecto particular la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido ß-glucosidasa operablemente enlazado a un promotor heterologo. Vectores de expresión de la presente invención pueden utilizarse para transformar una célula hospedera apropiada para permitir que el hospedero exprese la proteína ß-glucosidasa. Métodos de expresión recombinante de proteínas en hongos y otros organismos son bien conocidos en la técnica, y un número de vectores de expresión están disponibles o pueden construirse utilizando métodos de rutina. Véase, por ejemplo, Tkacz y Lange, 2004, ADVANCES IN FUNGAL BIOTECHNOLOGY FOR INDUSTRY, AGRICULTURE, AND MEDICINE, KLUWER ACADEMIC/PLENUM PUBLISHERS. New York; Zhu et al., 2009, Construction of two Gateway vectors for gene expression in fungí Plasmid 6:128-33; Kavanagh, K. 2005, FUNGI: BIOLOGY AND APPLICATIONS Wiley, todos los cuales se incorporan aquí por referencia.

Constructos de ácido nucleico de la presente invención comprenden un vector, como un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC) y similares, en que se ha insertado una secuencia de ácido nucleico de la invención. Polinucleótidos de la presente invención pueden incorporarse en cualquiera de una variedad de vectores de expresión adecuados para expresar un polipéptido. Vectores adecuados incluyen secuencias de ADN cromosomales, no cromosomales y sintéticas, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; fago ADN; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y fago ADN, ADN viral como vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar, pseudorrabia, adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus y muchos otros. Cualquier vector que transduce material genético en una célula, y, si se desea la replicación, que es replicable y viable en el hospedero pertinente pueden utilizarse.

En un aspecto de esta modalidad, el constructo además comprende las secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operablemente enlazado a la secuencia de codificación de proteínas. Gran número de vectores adecuados y promotores se conoce por aquellos de experiencia en la técnica.

Promotor/constructos qénicos Como hemos comentado anteriormente, para obtener altos niveles de expresión en un determinado hospedero suele ser útil expresar ß-glucosidasa C1 bajo control de un promotor heterólogo. Normalmente, una secuencia de promotor puede unirse operablemente a la región 5' de la secuencia de codificación de ß-glucosidasa C1 mediante métodos de rutina.

Ejemplos de promotores útiles para la expresión de polinucleótidos ß-glucosidasa incluyen promotores de hongos. Por ejemplo, se pueden utilizar secuencias de promotor que impulsan la expresión de genes diferentes de gen ß-glucosidasa 1 en C1. Por ejemplo, puede usarse un promotor de hongo de un gen que codifica la celobiohidrolasa.

Ejemplos de otros promotores adecuados útiles para dirigir la transcripción de los constructos de nucleótido de la presente invención en una célula hospedera de hongos filamentosos son promotores obtenidos de los genes para Aspergillus oryzae amilasa TAKA, Rhizomucor miehei aspártico proteinasa, Aspergillus niger neutral alfa-amilasa, Aspergillus niger ácido alfa-amilasa estable, Aspergillus niger o Aspergillus awamori glucoamilasa (glaA), Rhizomucor miehei lipasa, Aspergillus oryzae proteasa alcalina, aspergillus oryzae triosa fosfato isomerasa, Aspergillus nidulans acetamidase y proteasa tipo Fusarium oxysporum tripsina (WO 96/00787, que se incorpora aquí por referencia), así como el promotor de NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para Aspergillus niger neutral alfa-amilasa y Aspergillus oryzae triosa fosfato isomerasa), promotores, como cbhl , cbh2, egh , egl2, pepA, hfbl , hfb2, xynl , amy y glaA (Nunberg et al.1984, Mol Cell Biol., 4:2306-2315, Boel et al., 1984, EMBO j 3:1581-85 y EPA 137280, todos los cuales se incorporan aquí por referencia) y promotores mutantes, truncados y sus híbridos. En un hospedero de levadura, pueden ser útiles promotores de los genes para Saccharomyces cerevisiae enolasa (eno-1), Saccharomyces cerevisiae galactoquinasa (gall), Saccharomyces cerevisiae alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) y S. cerevisiae 3-fosfoglicerato quinasa. Otros promotores útiles para las células hospederas de levadura se describen por Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488, incorporado en el presente documento por referencia. Podrán utilizarse los promotores asociados con la producción de quitinasa en hongos. Véase, por ejemplo, Blaiseau y Lafay, 1992, Gene 120243-248 (hongos filamentosos Aphanocladium álbum); Limón et al., 1995, Curr. Genet, 28:478-83 (Trichoderma harzianum), ambos de los cuales se incorporan aquí por referencia.

Promotores conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus y que pueden utilizarse en algunas modalidades de la invención incluyen promotor de SV40, promotor de lac o prt de E. coli, promotor de fago lambda PL, promotor de tac, promotor T7 y lo similar. En células hospederas bacterianas, promotores adecuados incluyen los promotores obtenidos del operón lac E.coli, gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), gen de levansucransa de Bacillus subtilis (sacB), gen de alfa-amilasa Bacillus licheniformis (amyl), gen de amilasa de bacillus stearothermophilus maltogénico (amyM), gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y gen procariota ß-lactamasa.

Se puede utilizar cualquier otra secuencia de promotor que impulse la expresión en una célula hospedera adecuada. Secuencias de promotor adecuadas pueden identificarse mediante métodos bien conocidos. En un enfoque, una secuencia de promotor putativo es unida 5' a una secuencia de codificación de una proteína reportero, el constructo es transfectado en la célula hospedera (por ejemplo, una célula C1) y se mide el nivel de expresión del reportero. Expresión del reportero puede determinarse midiendo, por ejemplo, los niveles de ARNm de la secuencia de reportero, una actividad enzimática de la proteína reportero, o la cantidad producida de proteína reportero. Por ejemplo, la actividad del promotor puede determinarse mediante la proteina verde fluorescente como secuencia de codificación (Henriksen et al., 1999, Microbiology 145:729-34, incorporado en el presente documento por referencia) o un gen reportero lacZ (Punt et al., 1997, Gene, 197:189-93, incorporado en el presente documento por referencia). Promotores funcionales se pueden derivar de secuencias de promotor de origen natural por métodos de evolución dirigida. Véase, por ejemplo, Wright et al., 2005, Human Gene Therapy, 16:881-892, incorporado en el presente documento por referencia.

Un vector de expresión contiene opcionalmente un sitio de enlace de ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de transcripción, tales como Pinll. El vector también incluye secuencias adecuadas para amplificar la expresión, por ejemplo, un potenciador.

Además, vectores de expresión de la presente invención opcionalmente contienen uno o más genes marcadores seleccionable para proporcionar un rasgo fenotípico para selección de células hospederas transformadas. Genes marcadores adecuados incluyen aquellos que codifican para resistencia antimicrobiana como ampicilina (ampR), kanamicina, cloranfenicol o resistencia de tetraciclina. Otros ejemplos incluyen la estreptomicina o espectinomicina antimicrobiana (por ejemplo, el gen aada), el gen estreptomicina fosfotransferasa (spt) de codificación para resistencia de estreptomicina, el gen neomicina fosfotransferasa (nptil) de codificación de Kanamicina o resistencia de geneticina, el gen de higromicina fosfotransferasa (hpt) de codificación para la resistencia de higromicina. Genes marcadores seleccionares adicionales incluyen dihidrofolato reductasa o resistencia de neomicina para cultivo de células eucariotas y resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

Síntesis y manipulación de polinucleótidos ß-Glucosidasa Los polinucleótidos de codificación de ß-glucosidasa pueden ser preparados mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Normalmente, oligonucleótidos de hasta unas 40 bases individualmente son sintetizados, luego unidos (por ejemplo, mediante métodos de ligadura enzimática o química, o métodos mediados por la polimerasa) para formar esencialmente cualquier secuencia continua deseada. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser preparados por síntesis química, por ejemplo, mediante el método fosforamidita clásico descrito por Beaucage, et al., 1981 , Tetrahedron Letters, 22:1859-69, o el método descrito por Matthes, et al., 1984, EMBO J. 3:801-05, ambos de los cuales se incorporan aquí por referencia. Estos métodos se practican normalmente en métodos sintéticos automatizados. De acuerdo con el método fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, purificado, recocido, ligado y clonado en vectores adecuados.

Además, esencialmente cualquier ácido nucleico puede ser personalizado ordenado desde cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), The Great American Gene Company (Ramona, CA), ExpressGen Inc. (Chicago, IL), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchos otros.

Los polinucleótidos pueden sintetizarse también por técnicas bien conocidas como se describe en la literatura técnica. Véase, por ejemplo, Carruthers, et al., 1982, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47:41 1-18 y Adams et al., 1983, J. Am. Chem Soc. 105:661 , ambos de los cuales se incorporan aquí por referencia. Fragmentos de ADN de doble cadena se pueden entonces obtener al sintetizar la cadena complementaria y recocido de las cadenas juntas en condiciones adecuadas o añadiendo la cadena complementaria mediante ADN polimerasa con una secuencia iniciadora adecuada.

Textos generales que describen técnicas biológicas moleculares que son útiles en el presente documento, incluida la utilización de vectores, promotores, protocolos suficientes para dirigir a las personas con experiencia a través de métodos de amplificación in vitro, incluida la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de ligasa (LCR) y muchos otros métodos pertinentes, incluyendo Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") and Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2009) ("Ausubel"), todos los cuales se incorporan aquí por referencia. Se hace referencia a Berger, Sambrook y Ausubel, asi como Mullís et al., (1987) Patentde E.U.A. No. 4,683,202; PCR Protocols A Guíde to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (October 1 , 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991 ) 3, 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 173; Guatelli et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al., (1988) Science 241 , 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu and Wallace, (1989) Gene 4, 560; Barringer et al. (1990) Gene 89, 1 17, and Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564, todos los cuales se incorporan aquí por referencia. Métodos de clonación in vitro de ácidos nucleicos amplificados se describen en Wallace et al., Patente de E.UA. No. 5,426,039, que se incorpora aquí por referencia.

Hospederos de expresión La presente invención proporciona también células hospederas diseñadas (recombinante) que se transforman con un vector de expresión o constructo de ADN de codificación de ß-glucosidasa. Opcionalmente, expresión de ß-glucosidasa en la célula está bajo el control de un promotor heterólogo. Las células hospederas de la invención pueden utilizarse para producir polipéptidos ß-glucosidasa. Así, la presente invención está dirigida a una célula hospedera que comprende cualquier polinucleótido ß-glucosidasa de la presente invención que es descrito antes aquí. Como se utiliza en el presente, una célula hospedera genéticamente modificada o recombinante incluye la progenie de dicha célula hospedera que comprende un polinucleótido ß-glucosidasa que codifica un polipéptido recombinante de la invención. A menudo, la célula hospedera genéticamente modificada o recombinante es un microorganismo. En algunas modalidades, la célula hospedera genéticamente modificada o recombinante es una célula procariota. En algunas modalidades, la célula hospedera genéticamente modificada o recombinante es una célula eucariota. Generalmente la célula hospedera eucariota es una célula no humana. Células hospederas eucariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a las células fúngicas, células de algas, células de insectos y células vegetales. En algunos casos células hospederas pueden modificarse para aumentar la expresión de proteínas, secreción o estabilidad, o para conferir otras características deseadas. Las células (por ejemplo, hongos) que se han mutado o seleccionado para tener actividad de proteasa baja son particularmente útiles para la expresión. Por ejemplo, cepas deficientes de proteasa C. lucknowense (por ejemplo, en que el locus de proteasa alcalina ha sido eliminado o perturbado) podrá utilizarse. En algunas modalidades, las células hospederas, por ejemplo, hongos, pueden modificarse para expresar una celulasa recombinante.

Las células hospederas de hongos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota, Zygomycota y hongos imperfecti. En algunas modalidades las células hospederas fúngicas son células de levadura y hongos filamentosos. Las células hospederas de hongos filamentosos de la presente invención incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina y Oomycota. (Véase, por ejemplo, Hawksworth et al, en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungí, 8th edition, 1995, CAB International, Universíty Press, Cambridge, Reino Unido, que se incorpora aquí por referencia). Hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Las células hospederas de hongos filamentosos de la presente invención son morfológicamente distintas de levadura.

En algunas modalidades la célula hospedera fúngica filamentosa puede ser una célula de una especie de, pero no limitada a Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothia, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella, o teleomorfos, o anamorfos y sinónimos o sus equivalentes taxonómicos.

En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Aspergillus, especie Ceriporiopsis, especie Chrysosporium, especie Corynascus, especie Fusarium, especie Humicola, especie Neurospora, especie Penicillium, especie Tolypocladium, especie Tramates o especie Trichoderma.

En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de las especies de Chrysosporium, por ejemplo, C. lucknowense, C.keratinophilum, C. tropicum, C. merdarium, C. inops, C. pannicola y C. zonatum.

En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Trichoderma, por ejemplo, T. longibrachiatum, T. viride (por ejemplo, ATCC 32098 y 32086) o T. reesei, un anamorfo de Hypocrea jecorina, (NRRL 15709, CIAT 13631 , 56764, 56765, 56466, 56767 y RL-P37 y derivados de éstos - ver Neiss Sheir et al., 1984, Appl. Microbiol. Biotecnology, 20:46-53, que se incorpora aquí por referencia), T. koningii y T. harzianum. Además, el término "Trichoderma" se refiere a cualquier cepa de hongo que fue previamente clasificada como Trichoderma o actualmente clasificada como Trichoderma.

En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera filamentosa es de la especie Aspergillus, por ejemplo, A. awamori, A. fumigatus, A. japonicus, A. nidulans, A. niger, A. aculeatus, A. foetidus, A. oryzae, A. sojae, and A. kawachi. (Se hace referencia a Kelly y Hynes, 1985, EMBO J. 4,475479; NRRL 3112, ATCC 11490, 22342, 44733, and 14331 ; Yelton et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 , 1470-1474; Tilbum et al., 1982, Gene 26,205-221 ; and Johnston et al., 1985, EMBO J. 4, 1307-1311 , todos los cuales se incorporan aquí por referencia).

En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Fusarium, por ejemplo, f F. bactridioides, F. cerealis, F. crookwellense, F. culmorum, F. graminearum, F. graminum. F. oxysporum, F. roseum, y F. venenatum.

En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Myceliophthora, por ejemplo, M. thermophilia.

En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie como, por ejemplo, N. crassa. Se hace referencia a Case, M E. et al., 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76, 5259-5263; USP 4,486,553; and Kinsey, J.A. and J.A. Rambosek, 1984, Molecular and Cellular Biology 4, 117-122, todos los cuales se incorporan aquí por referencia. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Humicola, por ejemplo, H. insolens, H. grísea y H. lanuginosa. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Mucor, por ejemplo, M. miehei y M. circinelloides. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Rhizopus, por ejemplo, R. oryzae y R. niveus. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Penicillium, por ejemplo, P. purpurogenum, P. crustosum, y P. verruculosum. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Thielavia, por ejemplo, T. terrestris. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Tolypocladium, por ejemplo, T. inflatum y T. geodas. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera fúngica filamentosa es de la especie Trametes, por ejemplo, T. villosa y T. versicolor.

En la presente invención una célula hospedera de levadura puede ser una célula de una especie de, pero no limitado a Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, and Yarrowia. In some embodiments of the invention, the yeast cell is Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans, y Yarrowia lipolytica.

En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera es un alga como Chlamydomonas (por ejemplo, C. reinhardtii) y Phormidium (P sp. ATCC29409).

En otras modalidades, la célula hospedera es una célula procariota. Las células procariotas adecuadas incluyen células bacterianas gram positivo, gram negativo y gram-variable. La célula hospedera puede ser una especie de, pero no se limita a Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Acinetobacter, Acidothermus, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Buchnera, Campestris, Camplyobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chromatium, Coprococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacter, Erwinia, Fusobacterium, Faecalibacterium, Francisella, Flavobacterium, Geobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, llyobacter, Micrococcus, Microbacterium, Mesorhizobium, Methylobacterium, Mycobacterium, Neisseria, Pantoea, Pseudomonas, Prochlorococcus, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Roseburia, Rhodospirillum, Rhodococcus, Scenedesmus, Streptomyces, Streptococcus, Synecoccus, Saccharomonospora, Staphylococcus, Serratia, Salmonella, Shigella, Thermoanaerobacterium, Tropheryma, Francisella, Temecula, Thermosynechococcus, Thermococcus, Ureaplasma, Xanthomonas, Xylella, Yersinia y Zymomonas.

En algunas modalidades, la célula hospedera es una especie de Agrobacterium, Acinetobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Buchnera, Geobacillus, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Enterococcus, Erwinia, Flavobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus, Streptomyces, y Zymomonas.

En otras modalidades, la cepa bacteriana hospedera es no patógena para el ser humano. En algunas modalidades la cepa bacteriana hospedera es una cepa industrial. Numerosas cepas bacterianas industriales son conocidas y adecuadas de la presente invención.

En algunas modalidades de la invención la célula hospedera bacteriana es de la especie Agrobacterium, por ejemplo, A. radiobacter, A. rhizogenes, and A. rubi. En algunas modalidades de la invención, la célula hospedera bacteriana es de la especie Arthrobacter, por ejemplo, A. aurescens, A. citreus, A. globformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparqffinus, A. sulfureus, y A. ureafaciens. En algunas modalidades de la invención la célula hospedera bacteriana es de la especie Bacillus, por ejemplo, B. thuringiensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulans, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. firmus, B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans y B. amyloliquefaciens. En modalidades particulares, la célula hospedera será una cepa Bacillus industrial incluyendo pero no limitada a B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis, B. megaterium, B. clausii, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens. Algunas modalidades de una célula hospedera Bacillus incluyen B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. stearothermophilus y B. amyloliquefaciens. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de la especie Clostridium, por ejemplo, C. acetobutylicum, C. tetani E88, C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens, C. thermocellum y C. beijerinckii. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de la especie Corynebacterium por ejemplo, C. glutamicum y C. acetoacidophilum. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de la especie Escherichia, por ejemplo, E. coli. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de las especies Erwinia, por ejemplo, E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata, y E. terreus. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de la especie Pantoea, por ejemplo, P. citrea y P. agglomerans. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de la especie Pseudomonas, por ejemplo, P. putida, P. fluorescens, P. aeruginosa, P. mevalonii y P. sp. D-OI 10. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de la especie Streptococcus, por ejemplo, S. equisimiles, S. pyogenes y S. uberis. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de la especie Streptomyces, por ejemplo, S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus y S. lividans. En algunas modalidades la célula hospedera bacteriana es de la especie Zymomonas, por ejemplo, Z. mobilis y Z. lipolytica.

Cepas que pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyendo cepas procariotas y eucariotas, son fácilmente accesibles al público de una serie de colecciones de cultivo como la colección de cultivo tipo americana (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y agrícola investigación servicio patente Culture Collection, centro de investigación Regional Norte (NRRL).

Las células hospederas pueden ser modificadas genéticamente para tener características que mejoran la secreción de proteínas, estabilidad de proteínas u otras propiedades deseables para la expresión y/o secreción de una proteína. Por ejemplo, función knock out de Alp1 resulta en una célula que es proteasa deficiente. Knock out de función pyr5 resulta en una célula con un fenotipo deficiente de pirimidina. En modalidades particulares las células hospedera son modificadas para eliminar secuencias de codificación de la proteína endógena celulasa o de lo contrario eliminar la expresión de una o más celulasas endógenas. En una modalidad la expresión de una o más celulasas endógenas es inhibida para aumentar la producción de celulasas de interés. Modificación genética puede lograrse mediante técnicas de ingeniería genética o mediante técnicas microbiológicas clásicas, como química o mutagénesis UV y posterior selección. Puede utilizarse una combinación de técnicas de selección clásica y modificación recombinante para producir el organismo de interés. Usando tecnología recombinante, moléculas de ácido nucleico pueden ser introducidas, eliminadas, inhibidas o modificadas, de manera que resulte en mayores rendimientos de ß-glucosidasa dentro del organismo o en el cultivo. Por ejemplo, knock out de función de Alp1 resulta en una célula que es proteasa deficiente. Knock out de función de pyr5 resulta en una célula con un fenotipo deficiente de pirimidina. En un enfoque de ingeniería genética, recombinación homologa puede utilizarse para inducir modificaciones génicas dirigidas por direccionamiento específicamente a un gen in vivo para suprimir la expresión de la proteína codificada. En un enfoque alternativo, ARNsi, antisentido o tecnología de ribozima puede utilizarse para inhibir la expresión génica.

Transformación y cultivo Introducción de un vector o constructo de ADN en una célula hospedera puede ser efectuada por transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por dextrano-DEAE, electroporacion u otras técnicas comunes (véase Davis et al., 1986, Basic Methods ¡n Molecular Biology, que se incorpora aquí por referencia).

Las células hospederas diseñadas pueden cultivarse en medio convencionales de nutrientes modificado según corresponda para activar promotores, transformantes seleccionandos o amplificar la ß-glucosidasa polinucleótido. Condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas anteriormente con la célula hospedera seleccionada para la expresión y serán aparentes a aquellos especializados en la técnica. Como se ha señalado, muchas referencias están disponibles para el cultivo y la producción de muchas células, incluyendo células de bacterias, plantas, animales (especialmente mamífero) y de origen arquebacterial. Véase por ejemplo, Sambrook, Ausubel y Berger (todos supra), así como Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York and the references cited therein; Doyle and Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, cuarta edición W.H. Freeman and Company; and Ricciardelli, et al., (1989) In Vitro Cell Dev. Biol. 25:1016-1024, todos los cuales se incorporan aquí por referencia. Para cultivos celulares vegetales y regeneración, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York); Jones, ed. (1984) Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey and Plant Molecular Biology (1993) R.R.D.Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6, todos los cuales se incorporan aquí por referencia. Medio de cultivo celular en general figuran en Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL, que se incorpora aquí por referencia. Información adicional para cultivo celular se encuentra en publicaciones comerciales disponibles tales como Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) from Sigma- Aldrich, Inc (St Louis, MO) ("Sigma-LSRCCC") y, por ejemplo, The Plant Culture Catalogue and supplement (1997) también de Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO) ("Sigma-PCCS"), todos los cuales se incorporan aquí por referencia.

En algunas modalidades, se cultivan células que expresan los polipéptidos ß-glucosidasa de la invención bajo condiciones de fermentaciones por lote o continúa. Fermentación clásica por lotes es un sistema cerrado, en el que las composiciones del medio se establecen al principio de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Una variación del sistema por lotes es una fermentación alimentada por lotes que también encuentra uso en la presente invención. En esta variación, el sustrato se agrega en incrementos conforme avanza la fermentación. Sistemas alimentados por lotes son útiles cuando la represión de catabolito es probable que inhiban el metabolismo de las células y donde es deseable tener una limitada cantidad de sustrato en el medio. Fermentaciones por lotes y alimentadas por lotes son comunes y bien conocidas en la técnica. Fermentación continua es un sistema abierto donde un medio de fermentación definida se agrega continuamente a un bio-reactor y una cantidad igual de medio condicionado se elimina simultáneamente para su procesamiento. Fermentación continua generalmente mantiene los cultivos en una densidad alta constante donde las células están principalmente en el crecimiento de la fase log. Sistemas de fermentación continúa se esfuerzan por mantener las condiciones de crecimiento de estado estacionario. Métodos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procedimientos de fermentación continua, asi como técnicas para maximizar la tasa de formación de producto son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial.

Sistemas de transcripción/traducción libre de células también pueden emplearse para producir polipéptido ß-glucosidasa mediante los polinucleótidos de la presente invención. Varios de esos sistemas son comercialmente disponibles. Una guía general de protocolos de transcripción y traducción in vitro se encuentra en Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology, Volumen 37, Garland Publishing, NY, que se incorpora aquí por referencia.

V. Producción y recuperación de polipéptidos ß-qlucosidasa La presente invención está dirigida también a un método para elaborar un polipéptido con actividad de ß-glucosidasa, el método que comprende proveer una célula hospedera transformada con alguno de los ß-glucosidasa polinucleótidos descrito de la presente invención; el cultivo de la célula hospedera transformada en un medio de cultivo en condiciones en donde la célula hospedera expresa el polipéptido ß-glucosidasa codificado; y opcionalmente, recuperando o aislando el ß-glucosidasa polipéptido expresado, o recuperación o aislamiento del medio de cultivo que contiene el polipéptido ß-glucosidasa expresado. El método además proporciona opcionalmente lisis de las células hospederas transformadas después de expresar el polipéptido ß-glucosidasa codificado y opcionalmente la recuperación o aislamiento del polipéptido ß-glucosidasa expresada del lisado celular. La presente invención además proporciona un método para hacer un polipéptido ß-glucosidasa, dicho método integrado por cultivar una célula hospedera transformada con un polinucleótido ß-glucosidasa en condiciones aptas para la producción de polipéptido ß-glucosidasa y recuperando el polipéptido ß-glucosidasa.

Normalmente, recuperación o aislamiento del polipéptido ß-glucosidasa es del medio de cultivo de células hospederas, la célula hospedera o ambas, mediante técnicas de recuperación de proteínas que son bien conocidas en la técnica, incluyendo las descritas aquí. Normalmente se cosechan las células por centrifugación, disgregadas por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante puede conservarse para mayor purificación. Células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser interrumpidas por cualquier método conveniente, incluyendo el ciclo congelación-deshielo, sonicación, interrupción mecánica o uso de agentes de lisado celular, u otros métodos, que son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El polipéptido resultante puede ser recuperado/aislado y purificado opcionalmente por cualquiera de un número de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser aislado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, interacción hidrofóbica, cromatoenfocado y exclusión de tamaño) o precipitación. Pueden utilizarse pasos de repliegue de proteínas, como se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede emplearse en los pasos de purificación final. Purificación de BGL1 se describe en Parry et al., 2001 , Biochem. J. 353: 1 17, and Hong et al., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol. 73:1331 , ambos incorporados en el presente documento por referencia. Además de las referencias señaladas supra, una variedad de métodos de purificación son bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los establecidos en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2a Edición, Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris and Angal (1990) Protein Purif ¡catión Applications: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach, IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principies and Practice 3a Edición, Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods and Applications, Second Edition, Wiley-VCH, NY; and Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, NJ, todos los cuales se incorporan aquí por referencia.

Podrán utilizarse métodos inmunológicos para purificar polipéptidos ß-glucosidasa. En un enfoque, anticuerpos contra los polipéptidos ß-glucosidasa (por ejemplo, contra un polipéptido compuesto por SEQ ID NO: 2 o un fragmento ¡nmunogénico del mismo) utilizando métodos convencionales se inmovilizó en perlas, mezclados con medios de cultivo celular en condiciones en donde ß-glucosidasa está unida y precipita. En un enfoque relacionado se utiliza inmunocromatografía.

Como se ha señalado, en algunas modalidades ß-glucosidasa se expresa como una proteína de fusión incluyendo una porción no enzima. En algunas modalidades la secuencia de ß-glucosidasa está fusionada a un dominio de facilitación de purificación. Como se utiliza en el presente documento, el término "dominio de facilitación de purificación" se refiere a un dominio que media la purificación del polipéptido al que está fusionado. Dominios de purificación adecuados incluyen péptidos quelantes de metales, módulos de histidina-triptófano que permite la purificación de metales inmovilizados, una secuencia que une glutatión (por ejemplo, GST), una etiqueta de hemaglutinina (HA) (correspondiente a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de gripe; Wilson et al., 1984, cell 37:767), secuencias de proteína de unión de maltosa, el epitope FLAG utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA) y similares. La inclusión de una secuencia enlazadora de polipéptido proteasa divisible entre el dominio de purificación y el polipéptido HHDH es útil para facilitar la purificación. Un vector de expresión contemplado para su uso en las composiciones y los métodos descritos aquí se proporciona para la expresión de una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la invención fusionado a una región de polihistidina separada por un sitio de división de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación de IMIAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, como se describe en Porath et al., 1992, Protein Expression and Purification 3:263-281) mientras que el sitio de división de enteroquinasa proporciona un medio para separar el polipéptido HHDH de la proteína de fusión. Vectores pGEX (Promega; Madison, Wisconsin) también pueden usarse para expresar polipéptidos extranjeros como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y fácilmente pueden ser purificadas de células lisadas por adsorción a perlas de agarosa ligando (por ejemplo, glutationa-agarosa en el caso de fusiones de GST) seguidas por elución en presencia del ligando libre.

VI. métodos de uso de polipéptidos ß-glucosidasa y células que expresan polipéptidos ß-qlucosidasa Como se describe supra, polipéptidos ß-glucosidasa de la presente invención pueden utilizarse para catalizar la hidrólisis de un dímero de azúcar con la liberación del correspondiente monómero de azúcar, por ejemplo, la conversión de celobiosa con la liberación de glucosa. Así, la presente invención proporciona un método para producir glucosa, al (a) proporcionar una celobiosa; y (b) poner en contacto la celobiosa con un polipéptido ß-glucosidasa de la invención en condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción para convertir la celobiosa a la glucosa. El polipéptido ß-glucosidasa puede utilizarse en tales métodos en cualquier forma aislada o como parte de una composición, como cualquiera de los descritos aquí. El polipéptido ß-glucosidasa también podrá proveerse en medio de cultivo celular o en un lisado celular. Por ejemplo, después de producir el polipéptido ß-glucosidasa por cultivo de una célula hospedera transformada con un polinucleótido ß-glucosidasa o vector de la presente invención, la ß-glucosidasa no necesita aislarse del medio de cultivo (es decir, si la ß-glucosidasa es secretada en el medio de cultivo) o lisado celular (es decir, si la ß-glucosidasa no es secretada en el medio de cultivo) o utilizado en forma purificada para ser útil en más métodos para utilizar el polipéptido ß-glucosidasa. Cualquier composición, medio de cultivo de células o lisado celular conteniendo un polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención puede ser adecuado para el uso en métodos que utilizan una ß-glucosidasa. Por lo tanto, la presente invención además proporciona un método para producir glucosa, por: (a) proporcionar una celobiosa; y (b) poner en contacto la celobiosa con un medio de cultivo o lisado celular o una composición que comprende un polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención en condiciones suficientes para formar una mezcla de reacción para convertir la celobiosa a la glucosa.

La presente invención además proporciona composiciones que son útiles para la conversión enzimática de celobiosa a la glucosa. Por ejemplo, uno o más polipéptidos ß-glucosidasa de la presente invención pueden combinarse con otra enzima y/o un agente que altera las propiedades de manipulación de material a granel o capacidad de procesamiento adicional del -glucosidasa(s) (por ejemplo, un agente auxiliar de flujo, agua, regulador de pH, un agente tensoactivo y lo similar) o que mejora la eficiencia de la conversión de celobiosa a la glucosa, como se describe en más detalle aquí abajoi. La otra enzima puede ser una ß-glucosidasa diferente u otra enzima celulasa.

Mezclas de enzima En otro aspecto, la invención proporciona una mezcla de enzimas que comprende un polipéptido variante BgM C1 como se describe en este documento. La mezcla de enzimas puede ser libre de células, o en modalidades alternativas, no puede separada de las células hospederas que secretan un componente de mezcla de enzima. Una mezcla de enzimas libre de células normalmente comprende las enzimas que han sido separadas de cualquiera de las células. Mezclas de enzima libre de células pueden ser preparadas por cualquiera de una variedad de metodologías que son conocidas en la técnica, como metodologías de filtración o centrifugación. En ciertas modalidades, la mezcla de enzimas puede ser, por ejemplo, parcialmente libre de células, sustancialmente libre de células o totalmente libre de células.

Vanante de Bgl1 C1 y cualquier otra enzima presente en la mezcla de enzimas se pueden secretar desde una sola célula de hongo modificada genéticamente o por distintos microbios en fermentaciones combinadas o separadas. Igualmente, la variante de BgM C1 y cualquier otra enzima presente en la mezcla de enzimas pueden expresarse individualmente o en sub-grupos de diferentes cepas de diferentes organismos y las enzimas combinadas in vitro para hacer la mezcla de enzimas. También se contempla que la variante de Bgl1 C1 y cualquier enzima adicional en la mezcla de enzimas pueden expresarse individualmente o en sub-grupos de diferentes cepas de un solo organismo, y las enzimas se combinan para hacer la mezcla de enzimas. En algunas modalidades, todas las enzimas se expresan desde un organismo hospedero único, tal que la célula fúngica sea modificada genéticamente.

En algunas modalidades, la mezcla de enzimas comprende otros tipos de celulasas, seleccionados de BCH, EG y BG celulasa. En algunas modalidades, la celobiohidrolasa es T. reesei celobiohidrolasa II. En algunas modalidades, la endoglucanasa abarca un dominio catalítico derivado del dominio catalítico de una Streptomyces avermitilis endoglucanasa. Ver, solicitud co-pendiente No. 12/751 ,985, incorporada en el presente documento por referencia. En algunas modalidades, la al menos una celulasa es Acidothermus cellulolyticus, Thermobifida fusca, Humicola grísea o una Chrysosporium sp. Enzimas de celulasa de la mezcla de celulasa trabajan juntas resultando en la decristalización e hidrólisis de la celulosa desde un sustrato de biomasa para producir azúcares solubles, tales como pero no limitadas a la glucosa (véase Brigham et al., 1995, en Handbook on Bioethanol (C. Wyman ed.) pp 1 19-141 , Taylor y Francis, Washington DC, que se incorpora aquí por referencia).

Son conocidas las mezclas celulasa para hidrólisis enzimática eficiente de celulosa (véase, por ejemplo, Viikari et al., 2007, "Thermostable enzymes in lignocellulose hydrolysis" Adv Biochem Eng Biotechnol 108:121-45, y Publicaciones de Patente de E.U.A. US 2009/0061484; US 2008/0057541; y US 2009/0209009 para logen Energy Corp.), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia para todos los efectos. En algunas modalidades, las mezclas de enzimas naturalmente presentes o recombinantes purificadas se combinan con materia prima celulósica o un producto de la hidrólisis de celulosa. Alternativamente o además, una o más poblaciones de células, cada una produciendo uno o más celulasas naturalmente presentes o recombinantes, pueden combinarse con materia prima celulósica o un producto de la hidrólisis de celulosa.

Un polipéptido ß-glucosidasa variante de la invención también puede estar presente en las mezclas con enzimas diferentes de celulasas que degradan la celulosa, hemicelulosa, pectina y/o lignocelulosa.

Una "hemicelulasa" en este documento, se refiere a un polipéptido que puede catalizar la hidrólisis de hemicelulosa en polisacáridos pequeños como oligosacáridos o sacáridos monoméricos. Hemicelulosas incluyen xilano, glucuonoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Hemicelulasas incluyen, por ejemplo, los siguientes: endoxilanasas, ß-xilosidasas, a-L-arabinofuranosidasas, a-D-glucuronidasas, feruloil esterasas, coumarolil esterasas, a-galactosidasas, ß-galactosidasas, ß-mannanasas y ß-mannosidasas. Por lo tanto una mezcla de enzimas puede comprender una vanante ß-glucosidasa de la invención y una o más hemicelulasas.

Una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) cataliza la endohidrolisis de enlaces 1 ,4- -D-xilosidico en xtlanos. Esta enzima también puede ser referida como endo-1 ,4-p-xilanasa o 1 ,4-p-D-xilano xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1 ,4 xilosidicos en glucuronoarabinoxilanos.

Una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) cataliza la hidrólisis de 1 ,4-ß-?-xilanos, para eliminar residuos de D-xilosa sucesivos desde los términos no reductores. Esta enzima también puede ser contemplada como xilano 1 ,4-ß-xilosidasa, 1 ,4-P-D-xilano xilohidrolasa, exo-1 ,4- -xilosidasa o xilobiasa.

Una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) cataliza la hidrólisis de residuos alfa-L-arabinofuranosida no reductores terminales en alfa-L-arabinosidas. La enzima actúa sobre alfa-L-arabinofuranosidas, alfa-L-arabinanas que contienen (1 ,3)- y/o (1 ,5)-enlaces, arabinoxilanos y arabinogalactanas. Alfa-L-arabinofuranosidasa es también conocida como arabinosidasa, alfa-arabinosidasa, alfa-L-arabinosidasa, alfa-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa, polisacárido alfa-L-arabinofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranosida hidrolasa, L-arabinosidasa y alfa-L-arabinanasa.

Un alfa-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) cataliza la hidrólisis de una alfa-D-glucuronosida a D-glucuronato y un alcohol.

Una acetilxilanesterasa (EC 3.1.1.72) cataliza la hidrólisis de grupos acetilo de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo y p-nitrofenil acetato.

Una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) tiene actividad 4-hidrox¡-3-metoxicinnamoil-azúcar hidrolasa (EC 3.1.1.73) que cataliza la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinnamoil (feruloil) de un azúcar esterificado, que suele ser arabinosa en sustratos "naturales", para producir ferulato (4-hidroxi-3-metoxicinamato). Feruloil esterasa es también conocido como ácido ferúlico esterasa, hidroxicinnamoil esterasa, FAE-lll, cinnamoil éster hidrolasa, FAEA, cinnAE, FAE-I o FAE-II.

Una coumaroil esterasa (EC 3.1.1.73) cataliza una reacción de la forma: coumaroil-sacárido + H(2)0 = coumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. También se puede hacer referencia a esta enzima como trans-4-coumaroil esterasa, trans-p-coumaroil esterasa, p-coumaroil esterasa o esterasa de ácido p-coumárico. La enzima también cae dentro de EC 3.1.1.73 por lo que también puede ser conocido como feruloil esterasa.

Una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) cataliza la hidrólisis de residuos a-D-galactosa terminales, no reductores en a-D-galactosidas, incluyendo oligosacáridos de galactosa, galactomannanas, galactanas y arabinogalactanas. También se puede hacer referencia a esta enzima como melibiasa.

Una ß-galactosidasa (EC 3.2.1.23) cataliza la hidrólisis de residuos ß-D-galactosa no reductores terminales en ß-D-galactosidas. Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinosidas. También se puede hacer referencia a esta enzima como exo-(1->4)^-D-galactanasa o lactasa.

Una ß-mannanasa (EC 3.2.1.78) cataliza la hidrólisis aleatoria de enlaces 1 ,4- -D-mannosidicos en mannanas, galactomannanas y glucomannanas. También se puede hacer referencia a esta enzima como mannan endo-1 ,4-P-mannosidasa o endo-1 ,4-mannanasa.

Una ß-mannosidasa (EC 3.2.1.25) cataliza la hidrólisis de residuos ß-D-mannosa terminales, no reductores en ß-D-mannosidas. También se puede hacer referencia a esta enzima como mannanasa o mannasa.

Una o más enzimas que degradan pectina también pueden incluirse en una mezcla de enzimas que comprende una variante ß-glucosidasa de la invención. Una pectinasa cataliza la hidrólisis de la pectina en unidades más pequeñas como oligosacáridos o sacáridos monoméricos. Una mezcla de enzimas puede constar de cualquier pectinasa, por ejemplo una endo-poligalacturonasa, una pectina metil esterasa, una endo-galactanasa, una pectina acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una exo-poligalacturonato liasa, una ramnogalacturonana hidrolasa, una ramnogalacturonana liasa, una ramnogalacturonana acetil esterasa, una ramnogalacturonana galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa.

Una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) cataliza la hidrólisis aleatoria de enlaces 1 ,4-a-D-galactosiduron¡cos en pectato y otros galacturonanos. Esta enzima también puede ser denominada como poligalacturonasa pectina despolimerasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, pol¡-a-1 ,4-galacturonida glicanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli(1 ,4-a-D-galacturonida) glicanohidrolasa.

Una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11) cataliza la reacción: pectina + n H20 = n metanol + pectato. La enzima también es conocida como pectinesterasa, demetoxilasa de pectina, metoxilasa de pectina, metilesterasa de pectina, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.

Una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) cataliza la endohidrolisis de enlaces 1 ,4-P-D-galactosidicos en arabinogalactanos. La enzima también se conoce como arabinogalactano endo-1,4- -galactosidasa, endo-1 ,4- -galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4-ß-?-galactanohidrolasa.

Una pectina acetil esterasa cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de residuos GalUA de pectina.

Una endo-pectina liasa (EC 4.2.2.10) cataliza la división eliminativa de éster metílico de (1?4)-a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-0-metil-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también se conoce como pectina liasa, pectina trans-eliminasa; endo-pectina liasa, transeliminasa polimetilgalacturonica, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PLN o PMGL o (1?4)-6-0-metil-a-D-galacturonana liasa.

Una pectato liasa (EC 4.2.2.2) cataliza la división eliminativa de (1?4)-a- D-galacturonana para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser conocida poligalacturónico transeliminasa, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péctico liasa, péctico liasa, ácido a-1 ,4-D-endopoligalacturonico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-a-1 ,4-poligalacturónico, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa o (1?4)-a-D-galacturonano liasa.

Una ramnosidasa alfa (EC 3.2.1.40) cataliza la hidrólisis de residuos a-L-ramnosa no reductores terminales en a-L-ramnosidas o alternativamente en ramnogalacturonana. Esta enzima también se conoce como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnósida ramnohidrolasa.

Una exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) hidroliza el ácido péctico desde el extremo no reductor, digalacturonato de liberación. La enzima también se conoce como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.

Una exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) cataliza una reacción del siguiente tipo: (1 ,4-a-D-galacturonida)n + H20 = (1 ,4-a-D-galacturonida)n-i + D- galacturonato. La enzima también se conoce como galacturana 1 ,4-a- galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli(galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o o poli(1 ,4-a-D-galacturonida) galacturonohidrolasa.

Una exopoligalacturonato Nasa (EC 4.2.2.9) cataliza la división eliminativa de 4-(4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato del extremo de reducción de pectato, es decir, pectina de-esterificada. Esta enzima puede ser conocida como pectato disacárido-liasa, pectate exo-liasa, ácido exopéctico transeliminasa, exopectato Nasa, ácido exopoligalacturónico -trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o (1?4)-ot-D-galacturonana extremo reductor-disacárido-liasa.

Una ramnogalacturonana hidroliza el enlace entre ácido galactosiluronico y ramnopiranosilo de forma endo en estructuras ramnogalacturonana estrictamente alternantes, consistente en el disacárido [ácido (1 ,2-alfa-L-ramnoil-(1 ,4)-alfa-galactosilurónico].

Una ramnogalacturonana Nasa escinde los enlaces a-L-Rhap- (1?4)-a-D-GalpA de manera endo en ramnogalacturonana por la eliminación beta.

Una ramnogalacturonana acetil esterasa cataliza la desacetilación de la columna vertebral de ramnosa alternante y residuos de ácido galacturónico en ramnogalacturonana.

Una ramnogalacturonana galacturonohidrolasa hidroliza el ácido galacturónico desde el extremo no reductor de estructuras ramnogalacturonana estrictamente alternantes de un modo exo. Esta enzima también se conoce como xilogalacturonana hidrolasa.

Una endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) cataliza endohidrolisis de enlaces 1 ,5-a-arabinofuranosídicos en 1 ,5-arabinanas. La enzima también puede ser conocida como endo-arabinasa, arabinana endo-1 ,5-a-L-arabinosidasa, endo-1 ,5-a-L-arabinanasa, endo-a-1 ,5-arabanasa; endo-arabanasa o 1 ,5-a-L-arabinana 1 ,5-a-L-arabinanohidrolasa.

Una o más de las enzimas que participan en la degradación de la lignina pueden también incluirse en una mezcla de enzimas que comprenden una variante ß-glucosidasa de la invención. Despolimerización de lignina enzimática puede lograrse por peroxidasa de lignina, peroxidasas de manganeso, laccasas y celobiosa deshidrogenasas (CDH), a menudo trabajan en sinergia. Estas enzimas extracelulares son a menudo referidas como enzimas de modificación de lignina o LME. Tres de estas enzimas comprenden dos peroxidasas que contienen hemo glucosilada: peroxidasa de lignina (LIP); peroxidasa dependiente de MN (MNP); y una lacasa fenoloxidasa que contiene cobre (LCC).

Lacasa. Lacasas son enzimas oxidasa que contienen cobre que se encuentran en muchas plantas, hongos y microorganismos. Lacasas son enzimáticamente activas en fenoles y moléculas similares y realizan una oxidación de electrones. Lacasas pueden ser poliméricas y la forma enzimáticamente activa puede ser un dímero o trímero.

Peroxidasa dependiente de Mn. La actividad enzimática de la peroxidasa dependiente de Mn (MnP) es dependiente de n2+. Sin estar ligado a la teoría, se ha sugerido que la función principal de esta enzima es oxidar n2+ a Mn3+ (Glenn et al. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 251 :688-696). Posteriormente, se oxidan sustratos fenólicos por el Mn3+ generado.

Peroxidasa de lignina. Peroxidasa de lignina es un hemo extracelular que cataliza la despolimerización oxidativa de soluciones diluidas de lignina polimérica in vitro. Algunos de los sustratos de LiP, más notablemente alcohol 3,4-dimetoxibencílico (alcohol veratrilo, VA), son compuestos redox activos que han demostrado que actúan como mediadores redox. VA es un metabolito secundario producido al mismo tiempo como LiP por cultivos ligninolíticos de P. chrysosporium y sin estar sujeto a la teoría, se ha propuesto para funcionar como un mediador fisiológico redox en la oxidación catalizada con LiP de lignina in vivo (Harvey, et al (1986) FEBS Lett. 195, 242-246).

Una mezcla enzimática que comprende una variante de ß-glucosidasa de la invención puede además comprender por lo menos uno de los siguientes; una proteasa o una lipasa que participa en la degradación de la celulosa.

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (peptidasas), así como las enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otros radicales, tales como azúcares (glicopeptidasas). Muchas proteasas se caracterizan bajo EC 3.4 y son aptos para su uso en la invención. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteina proteasas incluyendo pepsina, papaina y serina proteasas incluyendo quimotripsinas, carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas.

"Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan los lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos, incluyendo fosfoglicéridos, lipoproteínas, diacilgliceroles y similares. En las plantas, los lípidos se utilizan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua e infección de patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

Una mezcla de enzimas que comprende una variante ß-glucosidasa de la invención también podrá incluir al menos una expansina o proteína tipo expansina, tal como una swollenina (ver Salheímo et al., EUR. J. Biohem. 269, 4202-421 1 , 2002) o una proteína similar a swollenina.

Expansinas están implicadas en el debilitamiento de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de las células vegetales. Se han propuesto expansinas para interrumpir el enlace de hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolítica. De esta manera, se pensaron para permitir el deslizamiento de fibras de celulosa y la ampliación de la pared celular. Swollenina, una proteína similar a la expansina contiene un dominio de la familia de modulo de unión de carbohidrato N-terminal 1 (CBD) y un dominio tipo expansina C-terminal. Para los efectos de esta invención, una proteína tipo expansina o proteína tipo swollenina puede constar de uno o ambos de estos dominios y/o puede alterar la estructura de paredes celulares (tales como interrupción de la estructura de celulosa), opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

Una mezcla de enzimas que comprende una variante ß-glucosidasa de la invención también puede estar formado por al menos uno de los siguientes: un producto de polipéptido de una celulosa integrando la proteina, andamio o una proteína tipo andamio, por ejemplo CipA o CipC de de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum respectivamente. Andamios y proteínas de integración de celulosa son subunidades de integración multifuncionales que pueden organizar subunidades celulóticas en un complejo multi-enzimático. Esto se logra mediante la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir, un dominio de cohesión en andamio y un dominio de dockerin en cada unidad enzimática. La subunidad de andamio también tiene un módulo de enlace de celulosa que media la unión de la celulosoma a su sustrato. Un andamio o proteína de integración de celulosa para los propósitos de esta invención puede constar de uno o ambos de estos dominios.

Una mezcla de enzimas que comprende una variante ß-glucosidasa de la invención también podrá incluir al menos una proteína inducida de celulosa o modulación de proteína, por ejemplo como codificado por el gen 6p21.2 o cip2 o genes similares de Trichoderma reesei (ver Foreman et al., J. Biol. Chem 278(34), 31988-31997, 2003).

Una mezcla de enzimas que comprende una variante ß-glucosidasa de la invención puede constar de un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos descritos anteriormente, varios miembros de una clase de polipéptido, o cualquier combinación de estas clases de polipéptido.

Otros componentes de composiciones ß-glucosidasa Polipéptidos ß-glucosidasa de la presente invención pueden utilizarse en combinación con otros ingredientes opcionales como un regulador de pH, un agente tensoactivo y/o un agente para pulido. Un regulador de pH puede utilizarse con un polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención (opcionalmente combinado con otras celulasas, incluyendo otras ß-glucosidasa) para mantener un pH deseado dentro de la solución en donde se emplea la ß-glucosidasa. La concentración exacta de regulador de pH empleada dependerá de varios factores que puede determinar el experto en la técnica. Reguladores de pH adecuados son bien conocidos en la técnica. Un agente tensoactivo además puede utilizarse en combinación con las celulasas de la presente invención. Agentes tensoactivos adecuados incluyen cualquier agente tensoactivo compatible con ß-glucosidasa y, opcionalmente, con cualquier otra celulasa utilizada. Agentes tensoactivos ejemplares incluyen un agente tensoactivo aniónico, no iónico y anfolítico.

Agentes tensoactivos aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a alquilbencenosulfonatos lineales o ramificados; alquilo o alquenilo éter sulfatos que tienen grupos alquilo lineales o ramificados o alquenilo; sulfatos de alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos; alcanosulfonatos y similares. Contra-iones adecuados para agentes tensoactivos aniónicos incluyen, por ejemplo, iones de metales alcalinos, tales como sodio y potasio; iones de metales alcalinotérreos, como calcio y magnesio; ion de amonio; y alcanolaminas que tienen de 1 a 3 grupos alcanol de número de carbono 2 o 3. Agentes tensoactivos anfolíticos aptos para su uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, sulfonato de sal de amonio cuaternario, agentes tensoactivos anfolíticos tipo betaina y lo similar. Los agentes tensoactivos no iónicos adecuados generalmente incluyen polioxalquileno éteres, así como alcanolamidas de ácido graso superiores o aducto de óxido de alquileno de los mismos, monoésteres de glicerina de ácidos grasos y similares. También se pueden emplear mezclas de agentes tensoactivos como se conoce en la técnica.

Producción de azúcares solubles de biomasa celulósica Polipéptidos ß-glucosidasa de la presente invención, así como cualquier composición, medio de cultivo o lisado celular compuesto por dichos polipéptidos ß-glucosidasa, podrán utilizarse en la producción de monosacáridos, disacáridos u oligómeros de un mono- o di-sacárido como materia prima química o de fermentación de la biomasa. Como se utiliza en el presente documento, el término "biomasa" se refiere a material biológico vivo o muerto que contiene un sustrato de polisacárido, tal como, por ejemplo, celulosa, almidón y similares. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para convertir un sustrato de biomasa en azúcar fermentable, el método que comprende poner en contacto un medio de cultivo o lisado celular que contiene un polipéptido ß-glucosidasa según la invención, con el sustrato de biomasa en condiciones aptas para la producción de azúcares fermentables. La presente invención además proporciona un método para convertir un sustrato de biomasa a un azúcar soluble (o "fermentable") al (a) pre-tratar un sustrato de celulosa para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis; (b) contactar el sustrato de celulosa pre-tratada del paso (a) con una composición, medio de cultivo o lisado celular que contiene un polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención (y, opcionalmente, otras celulasas) en condiciones aptas para la producción de azúcares fermentables.

En algunas modalidades, la biomasa incluye sustratos celulósicos que contienen celulosa, hemicelulosa, lignocelulosa. Sustratos celulósicos incluyen, pero no se limitan a, madera, pasta de madera, pasta de papel, forraje de maíz, fibra de maíz, arroz, papel y pulpa de procesamiento de plantas de residuos, plantas leñosas o herbáceas, pulpa de fruta o verdura, grano de destiladores, pastos, cáscaras de arroz, paja de trigo, algodón, cáñamo, lino, sisal, mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, hierba y sus mezclas. La biomasa opcionalmente puede ser pretratada para aumentar la susceptibilidad de celulosa a hidrólisis mediante métodos conocidos en la técnica como pre-tratamientos químicos, físicos y biológicos (por ejemplo, explosión de vapor, pulpa, molienda, hidrólisis ácida, exposición de solvente y lo similar, así como combinaciones de los mismos). En algunas modalidades, la biomasa comprende plantas transgénicas que expresan ligninasa y/o enzimas de celulasa que degradan la lignina y celulosa. Véase, por ejemplo, US 20080104724, que se incorporaron aquí por referencia.

En algunas modalidades, el polipéptido ß-glucosidasa y composiciones que contienen polipéptido ß-glucosidasa, medios de cultivo celular y lisados celulares pueden reaccionar con la biomasa o biomasa pre-tratada a una temperatura en el intervalo de alrededor de 25°C a aproximadamente 100°C, aproximadamente 30°C a aproximadamente 90°C, aproximadamente 30°C a aproximadamente 80°C, aproximadamente 40°C a aproximadamente 80°C y aproximadamente 35°C a aproximadamente 75°C. Además, la biomasa puede reaccionar con el polipéptido ß-glucosidasa y composiciones que contienen polipéptido ß-glucosidasa, medios de cultivo celular y lisados celulares a una temperatura de aproximadamente 25°C, a aproximadamente 30°C, a aproximadamente 35°C, a aproximadamente 40°C, a aproximadamente 45°C, a aproximadamente 50°C, a aproximadamente 55°C, a aproximadamente 60°C, a aproximadamente 65°C, a aproximadamente 70°C, a aproximadamente 75°C, a aproximadamente 80°C, a aproximadamente 85°C, a aproximadamente 90°C, a aproximadamente 95°C y a aproximadamente 100°C. Además de las temperaturas que se han descrito anteriormente, condiciones adecuadas para convertir un sustrato de biomasa en azúcares fermentables que emplean un polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención (opcionalmente en una composición, medio de cultivo celular o lisado celular) incluyen llevar a cabo el procedimiento a un pH en un intervalo de aproximadamente pH 3.0 a aproximadamente 8.5, aproximadamente pH 3.5 a aproximadamente 8.5, aproximadamente pH 4.0 a aproximadamente 7.5, aproximadamente pH 4.0 a aproximadamente 7.0 y aproximadamente pH 4.0 a aproximadamente 6.5. Aquellos con experiencia en la técnica podrán apreciar que los tiempos de reacción para convertir un sustrato particular de biomasa en azúcares fermentables pueden variar, pero el tiempo de reacción óptimo puede determinarse fácilmente. Tiempos de reacción ejemplares pueden estar en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 240 horas, de aproximadamente 5 a aproximadamente 180 horas y de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 horas. Por ejemplo, el tiempo de incubación puede ser al menos de 1 hora, por lo menos 5 horas, por lo menos 10 horas, por lo menos 15 horas, por lo menos 25 horas, por lo menos 50 horas, por lo menos 100 horas, por lo menos 180 y lo similar.

La reacción de la ß-glucosidasa con sustrato de biomasa o sustrato de biomasa pre-tratada bajo estas condiciones pueden resultar en la liberación de cantidades sustanciales de los azúcares solubles del sustrato. Por ejemplo al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, por lo menos el 60%, al menos el 70%, por lo menos el 80%, por lo menos el 90% o azúcar más soluble ser disponible en comparación con la liberación de azúcar por C1 tipo silvestre. En algunas modalidades, la cantidad de azúcar soluble disponible puede ser al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, o al menos 5 veces mayores que los disponibles por C1 tipo silvestre en las mismas condiciones. En algunas modalidades, los azúcares solubles comprenderán glucosa.

Los azúcares solubles producidos por los métodos de la presente invención pueden utilizarse para producir un alcohol (tal como, por ejemplo, etanol, butanol y lo similar). La presente invención por lo tanto proporciona un método de producir un alcohol, donde el método comprende (a) proporcionar un azúcar fermentable producido utilizando un polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención en los métodos descritos supra; (b) poner en contacto el azúcar fermentable con un microorganismo de fermentación para producir el alcohol u otros productos metabólicos; y (c) recuperando el alcohol u otros productos metabólicos.

En algunas modalidades, el polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención, o composición, medio de cultivo de células, o lisado celular que contiene el polipéptido ß-glucosidasa puede utilizarse para catalizar la hidrólisis de un sustrato de biomasa en azúcares fermentables en presencia de un microorganismo de fermentación como una levadura (por ejemplo, Saccharomyces sp., tales como, por ejemplo, S. cerevisiae, Pichia sp. y lo similar) u otros microorganismos de fermentación C5 o C6 que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Zymomonas sp., E. coli), para producir un producto final como el etanol. En un ejemplo, una sacarificación simultánea y procedimiento de fermentación (SSF) es usado en donde los azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa y/o xilosa) se eliminan del sistema por el procedimiento de fermentación.

Los azúcares solubles producidos por el uso de un polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención también pueden utilizarse en la producción de otros productos finales. Tal como, por ejemplo, acetona, un aminoácido (por ejemplo, glicina, lisina y lo similar), un ácido orgánico (por ejemplo, ácido láctico, y lo similar), glicerol, un diol (por ejemplo, 1 ,3 propanodiol, butanodiol y similares) y alimentos para animales.

Uno con experiencia en la técnica comprenderá fácilmente que las composiciones de polipéptido ß-glucosidasa de la presente invención pueden utilizarse en forma de una solución acuosa o un concentrado sólido. Cuando se emplean soluciones acuosas, la solución ß-glucosidasa fácilmente se puede diluir para permitir concentraciones precisas. Un concentrado puede estar en cualquier forma que se reconoce en la técnica, por ejemplo, líquidos, emulsiones, suspensiones, gel, pastas, gránulos, polvos, un aglomerado, un disco sólido, así como otras formas que son bien conocidos en la técnica. Otros materiales también pueden utilizarse con o incluidos en la composición de ß-glucosidasa de la presente invención como se desee, incluyendo piedras, piedra pómez, rellenos, solventes, activadores de enzima y agentes anti-deposición dependiendo del uso previsto de la composición.

Además del uso para la conversión de biomasa celulósica, polipéptidos ß-glucosidasa y sus composiciones pueden usarse en la industria de alimentos y bebidas por ejemplo en el procedimiento de hacer vino la liberación eficaz de monoterpenoles (véase, por ejemplo, Yanai y Sato (1999) Am. J. Enol. Eitic., 50:231-235, que se incorpora aquí por referencia) y para la preparación de tofu enriquecido con isoflavona de glicon (véase, por ejemplo, Mase et al., (2004) J. Appl. Glycosci, 51 :211-216, que se incorpora aquí por referencia). Polipéptidos ß-glucosidasa de la presente invención también pueden ser empleados en composiciones detergentes para mejorar el rendimiento de limpieza (véase, por ejemplo, USP 7,244,605; US 5,648,263 y WO 2004/048592, que se incorporan aquí por referencia).

Los aspectos anteriores y otros de la invención pueden ser mejor entendidos en relación con los siguientes ejemplos no limitantes.

VII EJEMPLOS EJEMPLO 1 Adquisición de gen ß-qlucosidasa C1 tipo silvestre (BqM C1 ) y construcción de vectores de expresión El ADNc bgh C1 tipo silvestre se sintetiza y se verifica la secuencia de ADN. El gen es clonado en un vector lanzadera Saccharomyces cerevisiae/C1 pYTDX20 usando sitios de clonación Pml1. El péptido de señal y gen están bajo el control de un promotor quitinasa (Pchi). El vector contiene el REP2, repl y origen de proteína D (parcial) de replicación para S. cerevisiae y un marcador de resistencia URA3. El plásmido resultante (pYTDX20-C1 bgh ) se transforma en cepa S. cerevisiae INVSC1 , y las células hospederas transformadas fueron cultivadas en HTP para la producción de proteínas Bgh C1. La secuencia de bgh C1 de los transformantes fue verificada. La parte de codificación de la proteína de la secuencia de ADNc tipo salvaje bgh C1 se proporciona como SEQ ID NO: 1 y el polipéptido codificado se proporciona como SEQ ID NO: 2. los primeros 19 residuos de SEQ ID NO: 2 se muestran en negritas y comprenden el péptido de señal.

EJEMPLO 2 Procedimiento de matraz agitado Una única colonia de S. cerevisiae con un plásmido con el gen de ADNc bgl1 C1 fue inoculado en caldo sintético definido-uracilo (SD-ura) 1 mi (2 g/l goteo sintético menos uracilo w/o base de nitrógeno de levadura (de United States Biological, Swampscott, MA), sulfato de amonio 5 g/l, 0.1 g/L cloruro de calcio, 2 mg/L Inositol, 0.5 g/L de sulfato de magnesio, 1 g/L de fosfato de potasio monobásico (KH2PO4), cloruro de sodio 0.1 g/L) que contiene 6% de glucosa. Las células se cultivan por 24 horas en una incubadora a 30°C con agitación a 250 rpm. 500 µ? del cultivo durante la noche fue diluido en medio SD-ura de 50 mL que contiene 2% de glucosa en un matraz agitado estéril desconectado de 250 mL e incubado a 37°C durante 48 horas. Las células se granulan por centrifugación (4000 rpm, 15 minutos, 4°C). El sobrenadante medio claros que contiene la enzima BgM C1 secretada fue recolectado y almacenado a -20°C hasta su uso.

EJEMPLO 3 Ensayos para determinar la actividad de ß-Glucosidasa La actividad de ß-glucosidasa puede determinarse mediante un ensayo de para-nitrofenil-3-D-glucósido (pNPG) o un ensayo de celobiosa.

Un ensayo pNPG colorimétrico basado en (p-nitrofenil- -D-glucosida) fue usado para medir la actividad de ß-glucosidasa. En un volumen total de 150 µ?, agregaron 75 pL de sobrenadante medio claro que contiene enzima Bgl1 C1 a 75 pL de solución de pNPG 3 mM (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) en regulador de pH de acetato de sodio 300 mM, pH 5. Las reacciones fueron incubadas a pH 5, 50°C 1.5 horas. Después de la reacción, 75 pL de la mezcla de reacción se templa con 75 pL de solución pH 1 1 de carbonato de sodio 1 M. La absorbancia de la solución fue medida a 405 nm para determinar la conversión de pNPG a p-nitrofenilo. La cantidad de producto de p-nitrofenol se midió espectrofotométricamente a 405 nm para calcular la actividad de ß-glucosidasa descrita por Breves, et al (1997), Appl. Environmental Microbiol. 63:3902-3910. Actividad Detectable de ß-glucosidasa se observó bajo condiciones de selección de alto rendimiento (pH 5, 65°C).

La actividad de ß-glucosidasa también se determinó mediante un ensayo de celobiosa, que utiliza celobiosa (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) como sustrato. En un volumen total de 150 pl, 75 pl del sobrenadante de medio claro que contiene enzima BgM C1 se añaden a 75 pl de celobiosa 6.6 g/L en regulador de pH de acetato de sodio 300 mM (pH 5). La reacción fue incubada a 65°C durante 21 horas con agitación. Producción de glucosa se determinó mediante un kit de ensayo enzimático de glucosa (K-GLUC, Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlanda). En un volumen total de 200 µ?, 15 µ? de la mezcla de reacción de Bgl1 C1 se añade a 185 µ? de reactivo de determinación de glucosa (GOPOD reagent, suministrado como parte del kit de ensayo K-GLUC). La reacción fue incubada a 50°C durante 30 minutos y la absorbancia de la solución se midió en 510 nm. La enzima oxidasa de glucosa en el reactivo GOPOD reacciona con glucosa y produce peróxido de hidrógeno que luego reacciona con 4-aminoantipirina en el reactivo para producir un tinte de quinoneimina. La cantidad de tinte quinoneimina se midió espectrofotométricamente en 510 nm para calcular la actividad de ß-glucosidasa. La conversión de celobiosa a glucosa también fue medida utilizando un HPLC 1200 Agilent equipado con una columna de exclusión de ion HPX-87H (300 x 7.8 mm) con agua como eluyente con un caudal de 1.0 ml/min a 80°C. Los tiempos de retención de la celobiosa y glucosa fueron 4.7 y 5.8 minutos respectivamente. Actividad detectable de ß-glucosidasa se observó bajo condiciones de selección de alto rendimiento (pH 5, 65°C).

EJEMPLO 4 Evaluación de actividad óptima BgM C1 El perfil de actividad de BgM C1 nativa fue investigado en diferentes temperaturas (50°C, 60°C y 65°C) y pH (3.5-7.5) utilizando celobiosa (3.3 g/l) como un sustrato. Se describen los procedimientos analíticos y experimentales en el ejemplo 3. Bgl1 C1 exhibe actividad óptima a pH 5 y 50°C y actividad detectable ß-glucosidasa (20% de actividad óptima) se observó bajo condiciones de selección de alto rendimiento (pH 5 y 65°C).

EJEMPLO 5 Ensayos de alto rendimiento para identificar variantes mejoradas BqM C1 Genotecas de plásmido que contienen genes de bgM C1 variantes fueron transformados en la cepa S. cerevisiae INVSC1 y revestidas en placa de agar SD-ura que contiene 2% de glucosa. Tras la incubación durante al menos 48 horas a 30°C, colonias fueron escogidas mediante un selector de colonia robótico Q-bot® (Genetix USA, Inc., Beaverton, OR) en placas microvaloradoras tendidas de 96 pozos que contienen medio SD-ura 200 µ? y 6% de glucosa. Las células fueron cultivadas durante 24 horas a 30°C con agitación a 250 rpm y 85% de humedad. 20 µ? de este cultivo durante la noche fue transferida en placas de 96 pozos microvaloradoras (pozo profundo) que contiene 380 µ? de medio SD-ura y 2% glucosa como se describe en el ejemplo 2. Las placas se incuban a 37°C con agitación en 250 rpm y 85% de humedad durante 48 horas. Las placas profundas se centrifugan a 4000 rpm durante 15 minutos y el sobrenadante de medio claro que contiene la enzima BgM C1 secretada fue utilizado para el ensayo de pNPG o celobiosa de alto rendimiento.

Las genotecas Bgl1 C1 fueron seleccionadas con alto rendimiento mediante ensayos de termoactividad y termoestabilidad. En el ensayo de termoactividad, variantes Bgl1 C1 fueron seleccionadas con un ensayo basado en celobiosa de alto rendimiento (sustrato: celobiosa; pH: 5.0; temperatura: 65°C; tiempo: 21 horas). Variantes activas de Bgl1 C1 identificadas desde el ensayo de termoactividad posteriormente fueron sometidas a ensayo de termoestabilidad. En el ensayo de termoestabilidad, las muestras de sobrenadante de medio HTP que contiene enzimas variantes BgM C1 fueron pre-incubadas a pH 5, 65°C durante 0 o 6 horas. La actividad enzimática residual después que el desafio térmico fue medido utilizando pNPG como sustrato a pH 5, 50°C durante 1.5 horas como se describe en el ejemplo 3.

Ensayo de termoactividad La clasificación de termoactividad fue un ensayo basado en celobiosa de alto rendimiento (HTA). En placas microvaloradoras tendidas de 96 pozos de 75 µ? de sobrenadante medio que contiene enzima variante Bgl1 C1 se agregó a 75 pl de celobiosa de 6.6 g/l en regulador de pH de acetato de sodio 300 mM pH 5.0. Después del sellado con cinta de sello térmico laminado de aluminio/polipropileno (velocidad 11 (Menlo Park, CA), Cat # 06643-001), las placas fueron sacudidas a 65°C hasta 21 horas. Las placas fueron centrifugadas durante 5 minutos a 4000 rpm. En placas microvaloradoras claras de pozo tendido, 15 µ? de la mezcla de reacción se templan con 185 µ? de solución GOPOD Reagent por pozo. Las soluciones se mezclan suavemente 3 veces y se mide la absorbencia a 510 nm para la identificación de termoactividad de variantes BgM C1 mejorada.

Ensayo de termoestabilidad La clasificación de termoactividad fue un ensayo basado en pNPG de alto rendimiento. En placas microvaloradoras de 96 pozos tendidas, 180 µ? de sobrenadante de medio que contiene variante BgM C1 activa enzima fue mezclada con 30 µ? de regulador de pH de acetato de sodio 1 M pH 5.0. De un total de 210 µ? de la solución de enzima, 120 µ? de la solución de enzima fue transferido en placas de PCR de 96 pozos para tratamiento de desafío térmico y 90 µ? de solución de enzima se deja en placas de 96 pozos tendidas fue utilizada como muestra de enzima BgM C1 no desafiada. Después del sellado con cinta de sello térmico laminado de aluminio/polipropileno (velocidad 11 (Menlo Park, CA), Cat # 06643-001), las placas PCR se calientan en el termociclador (MJ Research, Waltham, MA) a 65°C durante 6 horas. Después del desafío térmico, 90 ? de solución de enzima desafiada fueron transferidos en placas tendidas de 96 pozos. Para iniciar la reacción de pNPG, en placas tendidas de 96 pozos, 90 µ? de soluciones de enzima no desafiadas o desafiadas fueron mezcladas con 10 µ? de solución de pNPG (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) 15 mM en regulador de pH de acetato de sodio 150 mM, pH 5. Las reacciones fueron incubadas a pH 5, 50°C durante 1.5 horas. Después de la reacción, 100 µ? de solución de pH 1 1 de carbonato de sodio 1 M fueron añadidos a la mezcla de reacción para templar la reacción. La absorbancia de la solución fue medida a 405 nm para determinar la conversión de pNPG a p-nitrofenilo. La actividad residual se calcula mediante la fórmula: Actividad residual % = 100 x (absorbancia de las muestras desafiadas/absorbancia de muestras no desafiadas).

Actividades residuales de variantes BgM C1 fueron comparadas con aquellas de la enzima nativa para identificar las variantes de termoestabilidad mejorada.

EJEMPLO 6 Actividades Mejoradas de ß-glucosidasa y estabilidades de variantes de BgM C1 diseñadas Variantes de BgM C1 mejoradas fueron identificadas desde la clasificación de alto rendimiento de varias genotecas de variantes de BgM C1 como se describe en el ejemplo 5. Una secuencia de referencia variante exhibiendo mayor actividad y estabilidad en comparación con BgM C1 tipo silvestre fue seleccionada como una proteína de referencia (variante 3, como se muestra en los cuadros 2 y 3) y variantes de BgM C1 adicionales fueron generadas y evaluadas como se indica en la leyenda del cuadro 3 para identificar variantes que tienen mayor estabilidad y actividad con respecto a la secuencia de referencia variante 3. Una de las mejores variantes de esta ronda fue seleccionada como una proteína de referencia (variante 269, tal como se muestra en los cuadros 3 y 4) y variantes adicionales de Bgl1 C1 fueron generadas y evaluadas como se describe en la leyenda del cuadro 4 para identificar variantes que tienen estabilidad y actividad mejorada con respecto a la variante de 269. Una variante (variante 481 , como se muestra en los cuadros 4 y 5) fue seleccionada de esta ronda como una proteína de referencia adicional y variantes Bgl1 C1 adicionales fueron generadas y evaluadas como se describe en la leyenda del cuadro 5 para identificar variantes que tienen estabilidad y actividad mejorada con respecto a la variante 481. A continuación, se seleccionaron dos variantes (variante de 647, como se muestra en los cuadros 5 y 6; y variante 664 como se muestra en los cuadros 5 y 7). Cada variante sirvió como una proteína de referencia para distintas rondas de clasificación. Variantes de Bgl1 C1 adicionales fueron generadas y evaluadas como se describe en la leyenda del cuadro 6 para identificar variantes que tienen mayor estabilidad y actividad con respecto a la variante 647. Variantes Bgl1 C1 también fueron generadas y evaluadas como se describe en la leyenda del cuadro 7 para identificar variantes que tienen mayor estabilidad y actividad con respecto a la variante 664.

Los cuadros 2, 3, 4, 5, 6 y 7 resumen la mejora de termoactividades y termoestabilidades de ciertas variantes de Bgl1 C1 llevadas a cabo por la invención.

EJEMPLO 7 Producción de variantes de ß-qlucosidase mejoradas en el hospedero de C1 Un procedimiento de fermentación de dos etapas (inoculación y fermentaciones principales a partir de esporas) se utilizó para expresar genes de variantes bgll C1 en C1. Seis plásmidos conteniendo genes vanantes bgM C1 se transformaron en cepa C1 y revestidos en placas de agar que contienen medio de M3-01 con sacarosa 22.93% (ingredientes de medio M3-01 : 6.0 g/l nitrato de sodio, 0.52 g/l de cloruro de potasio, 1.52 g/l de potasio fosfato monobásico (KH2PO4), 0.24 g/l de sulfato de magnesio, 1.6 mg/L sulfato de cobre(ll) pentahidratado (CuS045H20), 5 mg/l de sulfato ferroso heptahidrato (FeS0 7H20), 22 mg/l de sulfato de zinc heptahidratado (ZnS047H20), 5 mg/l de cloruro de Manganeso(ll) tetrahidratado (MnCI24H20), 1 ,8 mg/l de sulfato cobalto (II) heptahidratado (CoS047H20), 1.5 mg/l de molibdato de sodio dihidratado (Na2MoO42H2O), 11 mg/L de ácido bórico, 50 mg/L EDTA, 10.0 g/L de glucosa, 1.0 g/l CAS aminoácidos (tritium Microbiologie B. V., Holanda), 16 g/L de agar, 1 ml/L 1000x Pen/Strep tras la esterilización (1000x Pen/Strep: 2 g penicilina G y 5 g de estreptomicina disuelta en 100 mi de H20, esterilizado por filtración). El pH del medio fue ajustado a 6.5 con 10 M KOH y autoclave durante 25 minutos a 121°C. Las placas se incuban a 35°C durante 5 días. Esporas recolectadas de las placas de agar se utilizaron para inocular un medio de inoculo 100 mL F1-01 esterilizado en un matraz erlenmeyer de 500 mi para llegar a 5*104-105 esporas/ml número inicial de espora. (Ingredientes de F1-01 inoculo medio: 0.50 g/l potasio fosfato dibásico (K2HPO4), 0.05 g/l de cloruro de potasio 0.007 g/l sulfato ferroso heptahidrato (FeS047H20), 1.00 g/l de extracto de levadura (sólo KAT), 10 g/l Pharmamedia (Traders Protein, Lubbock, TX, USA), 10 g/l D(+)monohidrato de lactosa, 10 g/l de glucosa después de esterilización, 1 ml/l 1000x Pen/Strep tras la esterilización (1000x Pen/Strep: 2 g de penicilina G y 5 g de estreptomicina disuelta en 100 mi de H2O, esterilizada por filtración). El pH del medio fue ajustado a 7.0 con 10 M NaOH y autoclave durante 25 minutos a 121 °C (el pH del medio después de la esterilización fue de 6.5). Para preparar el cultivo de inoculo, el matraz fue incubado a 35°C, 85% de humedad durante 3 días con agitación a 250 rpm y 25 mm de desplazamiento. 15 mi de F1-01 medio principal fermentación esterilizado en un matraz erlenmeyer de 100 ml_ fue inoculado con 750 µ? del cultivo inoculo obtenido (ingredientes del medio de fermentación principal F1-01 : 0.66 g/l potasio fosfato dibásico (K2HP04), 0.24 g/l de potasio fosfato monobásico (KH2PO4), 8.00 g/L de sulfato de amonio, 12.00 g/L sodio citrato tribásico deshidratado, 0.15 g/L de extracto de levadura (sólo KAT), 0.09 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado, 0.80 g/l de cloruro de calcio dihidratado, 24.80 g/l Pharmamedia (Traders Protein, Lubbock, TX, Estados Unidos), 26.40 g/L D(+) monohidrato de lactosa, 64.80 g/L celulosa (AlphaCel BH200A)). El medio fue colocado en autoclave durante 25 minutos a 121°C. La fermentación principal se llevó a cabo por incubación a 35°C, 85% de humedad durante 6 días con agitación a 300 rpm y 25 mm de desplazamiento. Después de terminar la fermentación principal las células se granulan por centrifugación (4500 rpm, 15 min, 4°C). El medio claro sobrenadante que contiene la enzima Bgl1 C1 secretada fue recopilada y almacenada a -20°C hasta que se use.

EJEMPLO 8 Termoestabilidades mejoradas de variantes ß-qlucosidasa producidas en el hospedero de C1 Ocho variantes BgM C1 (3, 8, 70, 109, 143, 194, 269 y 270) y la enzima nativa, producida en el hospedero C1 , se caracterizaron para determinar sus estabilidades a alta temperatura (65°C). Las muestras que contienen diversas enzimas de variantes BgM C1 fueron pre-incubadas en pH 5, 65°C durante 0, 6 o 24 horas. La actividad enzimática residual tras el desafío térmico fue medida utilizando pNPG como sustrato a pH 5, 50°C durante 20 minutos. La mejor variante de los ocho exhibe una mejora de hasta 34 veces en estabilidad sobre la enzima nativa (figura 1A y figura 1 B). Comparación de perfiles de estabilidad de la enzima nativa y ocho variantes de BgM C1 , producidas de levadura y de C1 , mostró buena correlación entre los dos hospederos (figura 1 C).

EJEMPLO 9 Termoestabilidades de variantes Bgl1 C1 Las termoestabilidades de variantes mejoradas de Bgl1 C1 3, 269 y 481 fueron comparadas con la de la enzima nativa de BgM C1. La actividad enzimática residual después de 24 horas de incubación a pH 4.5, 65°C fue medida utilizando pNPG como sustrato a pH 5, 50°C durante 20 minutos. Figura 2A muestra que la variante 481 tuvo el mayor aumento en la actividad siguiendo el desafío térmica.

La termoestabilidad de la variante mejorada BgM C1 664 fue comparada con la de la variante 481. La actividad enzimática residual después de 4 horas de incubación a pH 4, 65°C fue medida utilizando pNPG como sustrato a pH 5, 50°C durante 20 minutos. La figura 2B muestra que la variante 664 ha mejorado la actividad enzimática después del desafío térmico relativo a la variante 481.

La termoestabilidad de variantes mejoradas de BgM C1 3, 481 , 664, 916, 885 y 871 fue comparada con la de la enzima nativa (figura 3). Se midió la actividad enzimática residual después de 72 horas de incubación a pH 4.5, 65°C mediante un ensayo pNPG a pH 5, 50°C durante 20 minutos. Los resultados mostraron que las variantes 664, 916, 885 y 871 mantienen la actividad sustancial.

La actividad específica de la variante 871 se comparó con la enzima nativa, es decir, tipo silvestre mediante un ensayo de celobiosa (pH 4.5 o pH 5, 55°C-75°C; celobiosa 8 g/l, reacción 8 horas). La figura 4 muestra que la variante 871 produce más glucosa en el ensayo que la enzima nativa.

La figura 5 muestra una alineación de variantes 871 , 916, 885, 664, 647, 481 , 269 y 3 con la secuencia de aminoácidos BgM C1 nativa.

Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a las modalidades específicas de la misma, debe entenderse por aquellos especializados en la técnica que se pueden realizar varios cambios y equivalentes pueden ser sustituidos sin apartarse del alcance de la invención. Además, pueden hacerse muchas modificaciones para adaptarse a una situación concreta, material, composición de materia, paso de procedimiento o pasos para lograr los beneficios proporcionados por la presente invención sin apartarse del alcance de la presente invención. Todas estas modificaciones se pretenden dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas a éste documento.

Todas las publicaciones y documentos de patente citados en el presente documento se incorporan aquí por referencia como si cada publicación o documento individualmente y específicamente fuera indicado para ser incorporado en el presente documento por referencia. Citas de publicaciones y documentos de patente no se pretenden como una indicación de que cualquier documento de ese tipo es técnica previa pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o la fecha de la misma.

Claims (63)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una variante de ß-glucosidasa (Bgl1) que tiene al menos el 70% de identidad de aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2 y consta de una sustitución de aminoácido en la posición Q291 , una sustitución de aminoácido en la posición D369 y una sustitución de aminoácido en la posición E402, determinada con referencia a SEQ ID NO: 2, donde la sustitución en Q291 es W, A, o F; la sustitución en D369 es L, Y, V, A H, R, F, E, M, I, K, C, P o Q; y la sustitución en E402 es N.

2.- La variante Bgl1 de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la sustitución de aminoácido en la posición Q291 es W y la sustitución de aminoácido en la posición D369 es L, H, R o Y.

3.- La variante Bgl1 de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la sustitución de aminoácido en la posición D369 es L.

4.- La variante BgM de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque tiene, en relación con una BgM C1 nativa compuesta por aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2, a) al menos una termoactividad 5 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o b) al menos una termoestabilidad 3 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o c) (a) y (b).

5.- La vanante BgM de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo formado por Q258, Q313, S434, A475, K495 y G628.

6.- La variante BgM de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la sustitución en Q258 es N o H, la sustitución en Q313 es M, la sustitución en S434 es P, la sustitución en A475 es L, la sustitución en K495 es N y la sustitución en G628 es W.

7. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la variante comprende las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, K495N y G628W.

8. - La variante BgM de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 5 a 7, caracterizada además porque tiene, en relación con variante 3 BgM C1 (SEQ ID NO: 5), a) al menos una termoactividad 6 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 70°C, o b) al menos una termoestabilidad 3 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o c) (a) y (b).

9. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la variante comprende al menos una sustitución en la posición seleccionada del grupo conformado por A689 y Y715.

10. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la sustitución es A689I o Y7 5P.

11. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la variante comprende las sustituciones Q258N, Q291W, Q313M, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I y Y715P.

12. - La variante BgM de conformidad con las reivindicaciones 1-3, 5-7 o 9-11 , caracterizada además porque tiene, en relación con la variante 269 BgM C1 (SEQ ID NO: 7), a) al menos una termoactividad 4 veces mayor a aproximadamente pH 4.5 y aproximadamente 70°C, o b) al menos una termoestabilidad 2 veces mayor a aproximadamente pH 4.5 y aproximadamente 70°C, o c) (a) y (b).

13. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo formado por D47, A343 y T687.

14. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque la sustitución es D47I, A343C o T687W/K/C.

15.- La variante BgM de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la sustitución es T687K.

16. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la variante comprende las sustituciones D47I, Q258N, Q291W, Q313M, A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, T687K, A689l y Y715P.

17. - La variante Bgl1 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-1 1 o 13-16, caracterizada además porque tiene, en relación con la variante 481 BgM C1 (SEQ ID NO: 9), a) al menos una termoactividad 4 veces mayor a aproximadamente pH 4.2 y aproximadamente 70°C, o b) al menos una termoestabilidad 4 veces mayor a aproximadamente pH 4.5 y aproximadamente 70°C, o c) (a) y (b).

18. - La variante Bgl1 de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido en la posición seleccionada del grupo conformado por 1106, V260, F314 y A732.

19. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque la sustitución es I106V, V260G, F314L/V o A732G/M/V.

20. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la sustitución es F314L o A732G.

21. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la variante comprende las sustituciones I 06V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314L/V, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G.

22. - La variante BgM de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-11 , 13-16, o 18-21 , caracterizada además porque tiene, en relación con la variante 481 BgM C1 (SEQ ID NO: 9), a) al menos una termoactividad 2 veces mayor a aproximadamente pH 4 y aproximadamente 70°C, o b) al menos una termoestabilidad 1.1 veces mayor a aproximadamente pH 4.5 y aproximadamente 70°C, o c) (a) y (b).

23. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos una sustitución de aminoácido en la posición D47, A79, Q85, 109 o A343.

24. - La variante Bgl1 de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque la al menos una sustitución de aminoácido es D47I, A79E/G/M, Q85N/H, A109SA" o A343C.

25. - La variante Bgl1 de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque la variante comprende las sustituciones de aminoácido D47I, A79E, Q85N, I106V, A109T, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314V, A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G.

26. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque la variante comprende las sustituciones de aminoácido D47I, Q85N, I106V, A109S, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314V, A343C, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G.

27. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque la variante comprende las sustituciones de aminoácidos D47I, A79M, I106V, Q258N, V260G, Q291W, Q313M, F314L, D369R, E402N, S434P, K495N, G628W, A689I, Y715P y A732G.

28.- La variante BgM de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-1 1 , 13-16, 18-21 , o 23-27, caracterizada además porque tiene, en relación con la variante 664 BgM C1 (SEQ ID NO: 13), a) al menos una termoactividad 2 veces mayor a aproximadamente pH 4 y aproximadamente 70°C, o b) al menos una termoestabilidad 1.1 veces mayor a aproximadamente pH 4.5 y aproximadamente 70°C, o c) (a) y (b).

29. - La variante Bgl1 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-11 , 13-16, 18-21 , o 23-27, caracterizada además porque la variante tiene al menos el 75% de identidad, o al menos el 80% de identidad, o al menos el 85% de identidad o al menos el 90% de identidad, o al menos el 95% de identidad, a residuos 20-870 de SEQ ID NO: 2.

30. - La variante Bgl1 de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque es 851 residuos de aminoácidos de longitud.

31.- Una variante de ß-glucosidasa (BgM) que comprende residuos de aminoácido 20-870 de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21.

32.- Una variante de ß-glucosidasa (BgM ) que tiene al menos el 70% de identidad, o al menos el 75% de identidad, al menos el 80% de identidad, al menos el 85% de identidad, o al menos el 90% de identidad, o al menos el 95% de identidad a residuos de aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácido en posición Q291 , como se determina con referencia a SEQ ID NO: 2, en donde la sustitución es W, A, o F; y en donde además respecto a una BgM C1 nativa que comprende aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2, la variante tiene a) al menos una termoactividad 5 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o b) al menos una termoestabilidad 3 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o c) (a) y (b).

33. - Una variante de ß-glucosidasa (BgM) que tiene al menos el 70% de identidad, o al menos el 75% de identidad, al menos el 80% de identidad, al menos el 85% de identidad, o al menos el 90% de identidad, o al menos el 95% de identidad a residuos de aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácido en la posición D369, como se determina con referencia a SEQ ID NO: 2, en donde la sustitución es L, Y, V, A H, R, F, E, M, I, K, C, P, o Q; y en donde además, respecto a una BgM C1 nativa que comprende aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2, la variante tiene: a) al menos una termoactividad 5 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o b) al menos una termoestabilidad 3 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o c) (a) y (b).

34. - Una variante de ß-glucosidasa (BgM) que tiene al menos el 70% de identidad, o al menos el 75% de identidad, al menos el 80% de identidad, al menos el 85% de identidad, o al menos el 90% de identidad, o al menos el 95% de identidad a residuos de aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácido en la posición E402N, como se determina con referencia a SEQ ID NO: 2, y en donde además, respecto a una BgM C1 nativa que comprende aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2, la variante tiene: a) al menos una termoactividad 5 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o b) al menos una termoestabilidad 3 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o c) (a) y (b).

35. - Un ácido nucleico recombinante de codificación de una variante BgM de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-11 , 13-16, 18-21 , 23-27, 30, 31 , 32, 33 o 34.

36. - El ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque codifica un preproteína que comprende la variante Bgl1 fusionada a un péptido señal, opcionalmente el péptido de señal BgM C1 de origen natural.

37. - Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 35.

38.- Una célula hospedera que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 35, en donde dicho ácido nucleico opcionalmente operablemente enlazado a un promotor distinto del promotor BgM C1.

39. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque es una especie de hongos filamentosos.

40. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque es una especie Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Chrysosporium, Myceliophthora o Thielavia.

41. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque también expresa al menos un polipéptido celulasa recombinante adicional de origen no natural, seleccionado de a) un polipéptido recombinante endoglucanasa (EG), y/o b) un polipéptido recombinante celobiohidrolasa (CBH).

42. - Un método para producir un polipéptido BgM compuesto por cultivo de una célula hospedera de la reivindicación 38 bajo condiciones en que se expresa la variante BgM .

43. - El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque la variante es secretada por la célula hospedera.

44. - El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque comprende un paso de recuperar la variante BgM del medio en el que la célula es cultivada.

45.- Una composición que comprende una variante BgM de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-11 , 13-16, 18-21, 23-27, 30, 31 , 32, 33, o 34 y al menos un polipéptido celulasa recombinante adicional de origen no natural, seleccionado de a) un polipéptido recombinante endoglucanasa (EG) b) un polipéptido recombinante celobiohidrolasa (CBH) c) al menos un polipéptido recombinante de EG y al menos un polipéptido recombinante CBH.

46. - La composición de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos un polipéptido seleccionado de un grupo de polipépitdos que consta de una hemicelulasa, una pectinase, una peroxidasa de lignina, una peroxidasa de manganeso, una lacasa y una deshidrogenasa de celobiosa.

47. - La composición de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque la celobiohidrolasa (CBH) y/o endoglucanasa (EG) es de Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophilia o Streptomyces avermitilis, o que es una vahante de una T. reesei CBH o EG, M. thermophilia CBH o EG o una S. avermitilis CBH o EG.

48. - La composición de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque comprende una célula hospedera que expresa la variante Bgl1.

49. - Un método de sacarificación de un sustrato celulósico que comprende (a) proporcionar un sustrato celulósico; y (b) poner en contacto el sustrato con una mezcla de celulasa que comprende: i) al menos una proteína con actividad celobiohidrolasa; ii) al menos una proteína con actividad de endoglucanasa; y iii) una variante de ß-glucosidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-11 , 13-16, 18-21 , 23-27, 30, 31 , 32, 33 o 34, bajo condiciones en las que la mezcla de celulasa cataliza la hidrólisis del sustrato celulósico.

50.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque la celobiohidrolasa (CBH) y/o endoglucanasa (EG) es de Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophilia o Streptomyces avermitilis, o que es una variante de una T. reesei CBH o EG, M. thermophilia CBH o EG o una S. avermitilis CBH o EG.

51.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el sustrato celulósico es una biomasa pretratada celulósica.

52.- Un método para producir glucosa que comprende combinar celobiosa con una variante de ß-glucosidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-11 , 13-16, 18-21, 23-27, 30, 31 , 32, 33 o 34 en condiciones en que se produce la glucosa.

53. - Un método para producir glucosa que comprende la combinación de un sustrato celulósico y (a) una variante de ß-glucosidasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, 5-7, 9-11 , 13-16, 18-21 , 23-27, 30, 31 , 32, 33 o 34 en condiciones en que se produce la glucosa; (b) al menos una celulasa adicional bajo condiciones en que se produce la glucosa.

54. - El método de conformidad con la reivindicación 52 o 53, caracterizado además porque comprende adicionalmente i) cultivar un microorganismo en condiciones en las que la glucosa producida en la reivindicación 46 se utiliza como una fuente de energía y carbono para producir un producto metabólico, ii) recuperar el producto metabólico.

55. - El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque que el microorganismo es una levadura o bacteria.

56. - El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque el producto metabólico es un alcohol, ácido orgánico o hidrocarburo con 1-20 átomos de carbono.

57.- El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el producto metabólico es etanol.

58.- Una variante de ß-glucosidasa (BgM) que tiene al menos el 80% de identidad, o al menos el 85% de identidad, o al menos el 90% de identidad, o al menos el 95% de identidad de residuos de aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2 y comprende una sustitución de aminoácido en la posición Q291 , una sustitución de aminoácido en la posición D369 y una sustitución de aminoácido en la posición E402, como se determina con referencia a SEQ ID NO: 2.

59. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada además porque la variante tiene al menos el 90% de identidad o al menos el 95% de identidad de aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2.

60. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada además porque comprende al menos una sustitución de aminoácido adicional en D47, A79, Q85, 1106, 109, Q258, V260, Q313, F314, A343, S434, A475, K495, G628, A689, Y715 o A732.

61. - La variante BgM de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada además porque la sustitución es D47I, A79E/G/M, Q85N/H, I106V, A109/SH", V260G, Q313M, F314L/V, A343C, S434P, A475L, K495N, G628W, A689I, Y715P o A732G.

62. - La variante Bgl1 de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizada además porque la variante comprende al menos una sustitución Q291W, D369UH/R/Y o E402N.

63.- La variante BgM de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 62, caracterizada además porque la variante tiene, en relación con BgM C1 nativa que comprende aminoácidos 20-870 de SEQ ID NO: 2, la variante tiene a) al menos una termoactividad 5 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o b) al menos una termoestabilidad 3 veces mayor a aproximadamente pH 5 y aproximadamente 65°C, o c) (a) y (b).