MX2011011815A - Mutantes fgf21 y usos de los mismos. - Google Patents

Mutantes fgf21 y usos de los mismos.

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Yue-Sheng Li
Jing Xu
Jeonghoon Sun
Edward John Belouski
Murielle Marie Ellison
Agnes Eva Hamburger
Randy Ira Hecht
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Abstract

La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos mutantes FGF21, polipéptidos mutantes FGF'21, composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos mutantes FGF2I, y métodos para tratar trastornos metabólicos usando tales ácidos nucleicos, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas.

Description

MUTANTES FGF21 Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos mutantes FGF21, polipéptidos mutantes FGF21, composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos mutantes FGF21, y métodos para tratar trastornos metabólicos usando tales ácidos nucleicos, polipéptidos, o composiciones farmacéuticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN FGF21 es. un polipéptido secretado que pertenece a la subfamilia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) que incluye FGF19, FGF21, y FGF23 (Itoh et al., 2004, Trend Genet. 20: 563-69). FGF21 es un FGF atipico en que es independiente de heparina y funciona como una hormona en la regulación de glucosa, lipidos y metabolismo de energía.
Se aisló FGF21 de 'una colección de cADN del hígado como un factor secretado hepático. Se expresa altamente en el hígado y páncreas y es el único miembro de la familia FGF que se expresa primariamente en el hígado. Los ratones transgénicos que sobreexpresan FGF21 exhiben fenotipos metabólicos de lenta velocidad de crecimiento, bajos niveles de glucosa y triglicéridos en plasma, y una ausencia de diabetes tipo 2 asociada con la edad, hiperplasia de isletas, y obesidad. La administración farmacológica de proteina FGF21 recombinante en modelos de roedor y primate resulta en niveles normalizados de glucosa en plasma, niveles de triglicéridos y colesterol reducidos, y tolerancia a la glucosa y sensibilidad a la insulina mejoradas. Además, FGF21 reduce el peso corporal y la grasa corporal al incrementar el gasto de energía, actividad física, y velocidad metabólica. Las investigaciones experimentales soportadas por la administración, farmacológica de FGF21 para el tratamiento de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, y condiciones y trastoirnos metabólicos en humanos.
El FGF21 humano 'tiene una vida corta in vivo. En ratones, la vida media de FGF21 humano es de 1 a 2 horas, y en monos cyno olgus, la vida media es de 2.5 a 3 horas. En el desarrollo de una proteína FGF21 para uso como un terapéutico en el tratamiento de diabetes tipo 2, sería deseable un incremento en la vida media. Las proteínas FGF21 que tienen una vida media, aumentada permitirían una . dosificación menos frecuente de pacientes a los que se les administra la proteína. Tales proteinas.se describen en la presente.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se describe un polipéptido aislado. En una modalidad el péptido comprende SEQ ID NO : 4 o 8, .y el polipéptido aislado comprende además: (a) la sustitución de cualquier aminoácido para uno o más de: (i) el residuo de leucina en la posición 98; (ii) el residuo de prolina en la posición 171; (iii) el residuo de alanina en' la posición 180; y (b) una o más sustituciones seleccionadas de las Tablas 2-10, que se proporcionan en la presente.
En otra modalidad el péptido comprende una o más sustituciones de (b) y comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste de: (a) una mutación de cisteina de la Tabla 2; (b) un enlace disulfuro producido por ingeniería de la Tabla. 3; (c) una mutación que potencia la estabilidad de la Tabla 4; (d) una mutación resistente a la proteólisis de la Tabla 5; (e) una mutación de agregación de la Tabla 6; (f) una mutación de degradación en el C terminal de la Tabla 7; (g) una mutación de glicosilación de la Tabla 8; _ (h) una mutación resistente a la O-glicosilación seleccionada de la Tabla 9; (i) una mutación seleccionada de la Tabla 10; y (j) combinaciones de (a) - (i) .
En modalidades adicionales, la mutación de cisteina de (a) comprende una cisteina en una posición seleccionada del grupo que consiste de:' 18-31, 33, 35-50, 54, 56-62, 64-73, 75-104, 106-135, 137-140, 152-154, 163 y 167.
Todavía en modalidades adicionales, el enlace disulfuro producido por ingeniería comprende un par de residuos de cisterna en una o más posiciones¦ seleccionadas del grupo que consiste de: 19-138, 20-1.39, 21-33, 22-137, 22-139, 23-25, 23-28, 24-135, 25-122, '26-122, 27-123, 28-43, 28-124, 31-43, 33-21, 35-84, 41-82, 42-124, 42-126, 43-124, 50-69, 54-66, 58-62, 67-72, 67-135, 72-84, 73-93, 75-85, 75-92, 76-109, 77-79, 77-81, 80-129,. 82-119, 94-110, 95-107, 100-102, 102-104, 115-117, 117-129, 117-130, 118-132, 118-134, 121-127, 123-125, 127-132, y 152-163.
En otras modalidades la mutación que potencia la estabilidad comprende un D, E, R, K, H, S, T, N o Q en una o más posiciones seleccionadas del ' grupo que consiste de: 42, 54, 77, 81, 86, 88, 122, 125, 126, 130, 131, 139, 145, 146, 152, 154, 156, 161, 163, 170, y 172.
En otras modalidades la mutación resistente a la proteólisis es seleccionada del grupo que consiste de: (a) Q, 1 o K en la posición 19; (b) H, L o F en la posición 20; (c) I, F, Y o V en la posición 21; (d) I, F o V en la posición 22, (e) A o R en la posición 150; (f) A o V en la posición 151; (g) H, L, F o V en la posición 152; (h) A, D, N, C, Q, E, P, o S en la posición 170; (i) A, R, N, D, C, E, Q, G, H, K, S, T, W o Y en la posición 171;. (j) L o T en la posición 172; y (k) R o E en la posición 173.
En otras modalidades la mutación que reduce la agregación es seleccionada del grupo que consiste de: (a) E, K o R en la posición 26; (b) E K, R, Q, o T en la posición 45; (c) T en la posición 52; (d) C, E o S en la posición 58; (e) A, E, K o R en la posición 60; (f) A, C, H o R en la posición 78; (g) C o T en la posición 86; (h) A, E, K, R o S en la posición 88; (i) C, E, K, Q, o R en la posición 98; (j) C, D, E, o R en la posición 99; (k) K o T en la posición 111; (1) D, E , H, K, N, R o Q en la posición 129; y (m) E, H, K o Y en la posición 134.
En otras modalidades la mutación de degradación en el C terminal se selecciona del grupo que consiste de: (a) G, E, P o S en la posición 180; (b) G, P, K, T, A, L o P en la posición 181; y (c) A P, G, S o A en la posición 179. En otras modalidades la mutación resistente a la O-glicosilación es seleccionada del grupo que consiste de: S167A, S167E, S167D, S167N, S167Q, S167G, S167V,. S167H, S167 y S167Y.
Aún en otras modalidades el péptido comprende (a) la mutación en la posición ¦ 98 es seleccionada del grupo que consiste de L98R, L98C, L98E, L98Q, L98K and L98T; (b) la mutación en la posición 171 es seleccionada del grupo que consiste de P171A, P171R, P171N, P171D, P171C, P171E, P171Q, P171G, P171H, P171K, P171S, P171T, P171W y P171Y; (c) la mutación en la posición 180 es seleccionada del grupo que consiste de A180G, A180E, A180P y A180S.
En una modalidad particular el péptido que comprende la mutación en la posición 98 es L98R, la mutación en la posición 171 es P171G y la mutación en la posición 180 es ?180?.
En otra modalidad el polipéptido comprende además (i) una truncamiento en el N terminal de 8 o menos residuos; (ii) una truncamiento en el C terminal de 12 o menos residuos; (iii) una truncamiento en el N terminal de 8 o menos residuos y una truncamiento en el C terminal de 12 o menos residuos. En varias modalidades del polipéptido truncado, el polipéptido es capaz de reducir la glucosa sanguínea en un mamífero .
En otras modalidades, el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 4 o 8, pero en donde si el péptido comprende mutaciones L98R, P171G y A180E, las mutaciones L98R, P171G y A180E no se modifican adicionalmente .
En otras modalidades el polipéptido aislado comprende además 1 hasta 10 residuos de aminoácidos fusionados al C terminal del polipéptido, que pueden ser seleccionadas del grupo que consiste de glicina, prolina y combinaciones de las mismas .
Aún en otras modalidades el polipéptido aislado se liga covalentemente a uno o más polímeros, tal como PEG.
Todavía en modalidades adicionales, se describe un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido aislado fusionado a una secuencia de aminoácido heteróloga. La secuencia de aminoácido heteróloga puede ser un dominio o fragmento constante IgG del mismo y puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 171 o SEQ ID N0:11.
En otras modalidades el polipéptido está fusionado a la secuencia de aminoácido heteróloga por medio de un ligador, por ejemplo a polialanina, (Gly)4- (SEQ ID NO:29), (Gly)5 (SEQ ID NO:30), (Gly ) 5-Ser- (Gly) 3-Ser- (Gly) 4-Ser (SEQ ID NO:28), (Gly) -Ser- (Gly) 4-Ser- (Gly) -Ser (SEQ ID NO: 31), (Gly) 3-Lys- (Gly)4 (SEQ ID NO:32), (Gly ) 3-Asn-Gly-Ser- (Gly ) 2 (SEQ ID NO:33), (Gly) 3-Cys- (Gly) 4 (SEQ ID NO:34), Gly-Ser- (Gly4Ser ) 4 (SEQ ID NO:166), .(G4S)? ( SEQ ID NO:168), (GlySer)4 (SEQ ID NO: 167) , Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys (SEQ ID NO: 169) , Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg (SEQ ID NO: 170), y Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO: 35).
Un multímero que comprende · dos o más polipéptidos de fusión también se proporciona.
Una composición ' farmacéutica que comprende los polipéptidos aislados descritos en la presente y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable también se proporciona. Los métodos para tratar un trastorno metabólico que comprende administrar la composición farmacéutica a un paciente humano que necesita del mismo también se describen. En ejemplos particulares, el trastorno metabólico es diabetes u obesidad.
Adicionalmente , se describen los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos , asi como vectores que comprenden los ácidos nucleicos y se proporcionan células hospederas que comprenden los vectores y/o ácidos nucleicos.
Las modalidades especificas de la presente invención se volverán evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas modalidades y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1B muestran los resultados de un ensayo de actividad ELK-luciferasa realizado en los mutantes de truncamiento FGF21 7-181 y 8-181 (Figura 1A) y los mutantes de truncamiento FGF21 1-172, 1-171, 1-169, y 1-164 (Figura IB) ; cada panel muestra los resultados obtenidos para un control FGF21 humano.
La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo de actividad ELK-luciferasa realizado en un control FGF21 humano y los mutantes de truncamiento FGF21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181, y 1-149.
La Figura 3 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (barra sólida) , control FGF21 humano (barra abierta), o los mutantes de truncamiento FGF21 8-181 (barra gris) y 9-181 (barra punteada) .
La Figura 4 muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (circuios sólidos), un · control Fc-FGF21 (WT) (círculos abiertos), o proteínas de fusión Fc-FGF21 truncadas que comprende residuos de aminoácidos 5-181 (triángulos sólidos) o 7-181 (triángulos abiertos) .
La Figura 5 muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (círculos sólidos), un control FGF21-FC (WT) (círculos abiertos), una proteína de fusión FGF21-Fc truncada que comprende residuos 1-175 (triángulos sólidos), o una proteína Fc-FGF21 truncada que comprende residuos de aminoácidos 1-171 (triángulos abiertos).
Las Figuras 6A-6D muestran los resultados de análisis de espectrometría de masa-cromatografía líquida (LC-MS) de una muestra de control Fe- (G5) -FGF21 (SEQ ID NO: 107) humana (Figura 6A) y muestras de Fe- (G5) -FGF21 producidas de ratones a 6 horas (Muestra D6; Figura 6B) , 24 horas (Muestra D24; Figura 6C) , y 48 horas (Muestra D48; Figura 6D) después de la inyección .
Las Figuras 7A-7D muestran los resultados si el análisis LC-MS de una muestra de control FGF21- (G3 ) -Fe (SEQ ID NO: 105) humana derivada de mamífero (Figura 7A) y muestras de FGF21-(G3)-Fc producidas de ratones a 6 horas (Muestra E6; Figura 7B) , 24 horas (Muestra E24; Figura 7C) , y 48 horas (Muestra E48; Figura 7D) después de la inyección.
Las Figuras 8A-8D muestran los resultados de análisis LC-MS de una muestra de' control Fe- (L15) -FGF21 (SEQ ID NO: 9) (Figura 8A) y muestras de Fe- (L15) -FGF21 producidas de ratones a 6 horas (Figura 8B) , 24 horas (Figura 8C) , y 48 horas (Figura 8D) después de la inyección.
Las Figuras 9A-9D muestran los resultados de análisis LC-MS de una muestra de control FGF21- (L15) -Fe (SEQ ID NO:41) (Figura 9A) y muestras de FGF21- (L15) -Fe producidas de ratones a 6 horas (Figura 9B) , 24 horas (Figura 9C) , y 48 horas (Figura 9D) después de la inyección.
Las Figuras 10A-10B muestran los sitios de segmentación identificados por análisis LC-MS de proteínas de fusión Fc-(L15)-FGF21 (Figura 10A, SEQ ID NO:49) y FGF21- (L15) -Fe (Figura 10B, SEQ ID N0:41) inyectadas en ratones.
La Figura 11 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (barra sólida) , Fe- (L15)-FGF21 (SEQ ID NO: 9) (barra abierta), o los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fe- (L15 ) -FGF21 G170E (SEQ ID NO: 51) (barra gris), Fe- (L15) -FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (barra punteada), Fe- (L15) -FGF21 S172L (SEQ ID NO: 55) (barra cuadriculada diagonalmente abierta), Fe- (L15) -FGF21 (G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO: 59) (barra cuadriculada hori zontalmente sólida), o Fe- (L15) -FGF21 G151A (SEQ ID NO: 61) (barra cuadriculada diagonalmente abierta) .
La Figura 12 muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (circuios sólidos), Fe- (L15) -FGF21 (SEQ ID NO:49) (círculos abiertos), o los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fe- (1,15) -FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (triángulos sólidos), Fe- (L15) -FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (triángulos abiertos), Fe- (L15) -FGF21 S172L (SEQ ID NO: 55) (diamantes sólidos), Fe- (L15) -FGF21 (G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO: 59) (diamantes abiertos), o Fc-(L15)-FGF21 G151A (SEQ ID NO: 61) (cuadrados sólidos).
La Figura 13 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (barra sólida), Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO: 49) (barra abierta), o los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fe- (L15 ) -FGF21 ( P150A, G151A, I152V) (SEQ ID NO:65) (barra gris), Fe- (L15) -FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (barra cuadriculada diagonalmente abierta), Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A) (SEQ ID NO: 63) (barra cuadriculada diagonalmente gris), o Fe- (L15) -FGF21 (G170E, S172L) (SEQ ID NO:67) (barra cuadriculada diagonalmente abierta).
La Figura 14 muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (cuadrados sólidos), Fe- (L15) -FGF21 (SEQ ID NO:49) (cuadrados abiertos), o los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fc-(L15)-FGF21 ( P150A, G151A, I152V) (SEQ ID NO:65) (triángulos invertidos sólidos), Fe- (L15) -FGF21 G170E (SEQ ID NO: 51) (triángulos invertidos abiertos), Fe- (L15) -FGF21 (G170E, P171A) (SEQ ID NO:63) (circuios sólidos), o Fc-(L15)-FGF21 (G170E, S172L) (SEQ ID NO: 67) (circuios abiertos).
La Figura 15 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (barra sólida) o los mutantes Fe- (L15 ) -FGF21 Fe- (L15) -FGF21 G170E (SEQ ID NO: 51) (barra abierta), Fe- (L15) -FGF21 G170A (SEQ ID NO: 69) (barra gris), Fe- (L15) -FGF21 G170C (SEQ ID NO:71) (barra cuadriculada abierta), Fe- (L15 ) -FGF21 G170D (SEQ ID NO: 73) (barra gris y blanca), Fe- (L15 ) -FGF21 G170N (SEQ ID NO: 75) (barra cuadriculada sólida), o Fe- (L15) -FGF21 G170S (SEQ ID NO:77) (barra cuadriculada abierta).
La Figura 16 muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la 'sangre medidos en ratones inyectados con PBS (circuios sólidos) o los . mutantes Fe- (L15 ) -FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID NO:51) (circuios abiertos), Fc-(L15)-FGF21 G170A (SEQ ID NO:69) (triángulos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 G170C (SEQ ID NO:71) (triángulos abiertos), Fc-(L15)-FGF21 G170D (SEQ ID NO: 73) (diamantes sólidos), Fc-(L15)-FGF21 G170N (SEQ ID NO: 75) (diamantes abiertos), o Fc-(L15)-FGF21 G170S (SEQ ID NO: 77 ) . (triángulos sólidos invertidos).
La Figura 17 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (barra sólida) o los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fe- (L15) -FGF21 G170E (SEQ ID N0:51) (barra abierta), Fe- (L15) -FGF21 P171E (SEQ ID NO:79) (barra gris), Fe- (L15) -FGF21 P171H (SEQ ID NO:81) (barra cuadriculada sólida), Fe- (L15) -FGF21 P171Q (SEQ ID NO:83) (barra cuadriculada abierta), Fe- (L15 ) -FGF21 P171T (SEQ ID NO:85) (barra punteada), o' Fe- (L15 ) -FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87) (barra cuadriculada gris).- La Figura 18 muestra .el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre' medidos en ratones inyectados con PBS (circuios sólidos) o los mutantes Fe- (L15 ) -FGF21 Fc-(L15)-FGF21 G170E (SEQ ID N0:51) (circuios abiertos), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO: 79) (triángulos sólidos), Fc-(L15)-FGF21 P171H (SEQ ID NO: 81) (triángulos abiertos), Fc-(L15)-FGF21 P171Q (SEQ ID NO: 83) (diamantes sólidos), Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID NO: 85) (diamantes abiertos), o Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87) (cuadrados sólidos).
Las Figuras 19A-19D muestran los resultados de análisis LC-MS de una muestra de control Fe- (L15 ) -FGF21 (Figura 19A, SEQ ID NO: 49) y muestras producidos de ratones a un tiempo de 6 horas (Figura 19B) , 24 horas (Figura 19C) , y 48 horas (Figura 19D) después de la inyección.
Las Figuras 20A-20D muestran los resultados de análisis LC-MS de una muestra de control Fe- (L15) -FGF21 G170E (Figura 20A, SEQ ID NO:51) y muestras de Fe- (L15) -FGF21 G170E producidos de ratones, a 6 horas (Figura 20B) , 24 horas (Figura 20C) , y 48 horas (Figura 20D) después de la inyección.
Las Figuras 21A-21D muestran los resultados de análisis LC-MS de una muestra de control Fe- (L15 ) -FGF21 P171A (Figura 21A, SEQ ID NO: 53) y muestras de Fe- (L15) -FGF21 P171A producidos de ratones a 6 horas. (Figura 21B) , 24 (Figura 21C) , y 48 horas (Figura 21D) después de la inyección.
Las Figuras 22A-22D muestran los resultados de análisis LC-MS de una muestra de control Fe- (L15 ) -FGF21 S172L (Figura 22A, SEQ ID NO: 55) y muestras de Fe- (L15) -FGF21 S172L producidos de ratones a 6 horas (Figura 22B) , 24 horas (Figura 22C) , y 48 horas (Figura 22D) después de la inyección.
Las Figuras 23A-23D muestran los sitios de segmentación identificados por análisis LC-MS de proteínas de fusión Fc-(L15)-FGF21 (Figura 23A, SEQ ID NO:49), Fe- (L15 ) -FGF21 G170E (Figura 23B, SEQ ID NO: 51), Fe- (L15) -FGF21 P171A (Figura 23C, SEQ ID NO:53), y Fe- (L15) -FGF21 S172L (Figura 23D, SEQ ID NO: 55) inyectadas en ratones.
Las Figuras 24A-24C muestran los resultados de un ensayo de actividad ELK-luciferasa realizado en los mutantes FGF21 FGF21 L99R (SEQ ID N0:109), FGF21 L99D (SEQ ID N0:111), y FGF21 A111T (SEQ ID NO: 113) (Figura 24A) ; los mutantes FGF21 FGF21 A129D (SEQ ID NO: 115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO: 117), y FGF21 A134K (SEQ ID NO: 119) (Figura 24B) ; y los mutantes FGF21 FGF21 A134Y(SEQ ID NO:121)', FGF21 A134E (SEQ ID NO: 123), y FGF21 A129K (SEQ ID NO: 125) (Figura 24C) ; cada panel muestra los resultados obtenidos para un control FGF21 humano.
Las Figuras 25A-25D muestran los resultados de un ensayo de actividad ELK-luciferasa realizado en los mutantes Fc- (L15)-FGF21 Fe- (L15) -FGF21 P171G (SEQ ID NO:89), Fc-(L15)-FGF21 P171S (SEQ ID NO:91), .y Fe- (L15 ) -FGF21 P171T (SEQ ID NO: 85) (Figura 25A) ; los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fc-(L15)-FGF21 P171Y (SEQ ID NO:87), Fe- (L15) -FGF21 P171W (SEQ ID NO: 93), y Fe- (L15) -FGF21 P171C (SEQ ID NO: 95) (Figura 25B) ; Fe- (L15) -FGF21 (SEQ ID NO:49), Fe- (L15) -FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO: 97), y FGF21 A45K (SEQ ID NO: 99) (Figura 25C) ; y Fe- (L15) -FGF21 (SEQ ID NO:49),. Fe- (L15) -FGF21 P171E (SEQ ID NO:79), y Fe- (L15) -FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) (Figura 25D) ; cada panel muestra los resultados obtenidos para un control FGF21 humano.
Las Figuras 26A-26B muestran la agregación como una función de tiempo para FGF21 maduro de tipo natural y varios mutantes FGF21; la Figura 26A muestra el cambio en porcentaje de agregación para un control FGF21 (WT, SEQ ID NO: , diamantes sólidos) y FGF21 A45K (SEQ ID NO: 99, circuios sólidos) después de la incubación · de 65 mg/mL de proteína a 4°C por 1, 2, y 4 días, mientras la Figura 26B muestra el cambio en porcentaje de agregación para un FGF21 de control (WT) (SEQ ID NO:4) y FGF21 P78C (SEQ ID NO:127), FGF21 P78R (SEQ ID NO:129), FGF21 L86T (SEQ ID. N0:131), FGF21 L86C (SEQ ID NO: 133), FGF21 L98C (SEQ ID NO: 135), FGF21 L98R (SEQ ID NO: 137), FGF21 A111T (SEQ ID NO: 113), FGF21 A129D (SEQ ID NO: 115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO: 117), FGF21 A129K (SEQ ID NO: 125), FGF21 A134K (SEQ ID NO: 119), FGF21 A134Y (SEQ ID NO: 121), y FGF21 A134E (SEQ ID NO:123) (todos etiquetados en la gráfica) después de la incubación de 65 mg/mL de proteína a 4°C por 1, 6, y 10 días.
La Figura 27 muestra los resultados de un ensayo de actividad ELK-luciferasa realizado en un control FGF21 humano y los mutantes FGF21 FGF21 A45 (SEQ ID NO: 99), FGF21 L52T (SEQ ID NO: 139), y FGF21 L58E (SEQ ID NO: 141).
La Figura 28A es una gráfica que muestra el cambio en niveles de agregación para los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fc-(L15) -FGF21 (6-181, G170E) (SEQ ID NO:101) (diamantes sólidos), Fe- (L15) -FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO:97) (cuadrados abiertos), Fe- (L15) -FGF21 P171E (SEQ ID NO: 79) (triángulos sólidos), Fe- (L15) -FGF21 P171A (SEQ ID NO:53) (cruces), Fe- (L15 ) -FGF21 ' G170E (SEQ ID NO:51) (triángulos abiertos), y un FGF21 de. control (circuios sólidos) después de la incubación a 4°C por 1, 4, y 8 días, y la Figura 28B es una gráfica en barra que también muestra los resultados de la incubación.
La Figura 29 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS (vehículo) (círculos sólidos) o los mutantes Fe- (L15 ) -FGF21 Fe- (L15) -FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO: 97) (círculos abiertos), Fe- (L15) -FGF21 (A45K, P171G) (SEQ ID NO: 103) (triángulos sólidos), o Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (triángulos abiertos) .
La Figura 30 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de actividad ELK-luciferasa realizado en FGF21 humano (SEQ ID NO:4) (círculos sólidos, línea sólida), Fc- (L15)- FGF21 (SEQ ID NO:49) (círculos abiertos, línea sólida) y Fc-(L15) FGF21 (L98R, P171G) ( SEQ ID NO:43) (triángulos sólidos, línea punteada) .
La Figura 31 es una gráfica que muestra el porcentaje de agregados de alto peso molecular observado después de nueve días a temperatura ambiente (Figura 31A) y a 4°C (Figura 31B) para FGF21 (SEQ ID .NO: 4) (círculos sólidos, línea sólida), Fe- (L15) -FGF21 (SEQ ID NO: 49) (círculo abierto, línea sólida) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) ( SEQ ID NO:43) (triángulos sólidos, línea punteada) .
La Figura 32 es una serie de residuos de espectrometría de masas MALDI que muestran los cambios observados en Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) en varios puntos durante un periodo de tiempo de 168 horas.
La Figura 33 es una gráfica que muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre en ratones ob/ob para cada uno¦ de un control de vehículo PBS (círculos abiertos), FGF21 maduro de tipo natural (cuadrados sólidos), y los mutantes FGF21 Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) (triángulos sólidos ' invertidos ) ; Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182P) (SEQ ID NO: 143) (diamantes abiertos), y Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) (SEQ ID NO:145) (círculos sólidos) .
La Figura 34 ' es una gráfica que muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre en ratones ob/ob para cada uno de un control de vehículo PBS (círculos sólidos), y los mutantes FGF21 Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 3) (triángulos sólidos); Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182G, 183G) (SEQ ID NO:147) (triángulos abiertos), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182G) (SEQ ID NO: 145) (diamantes sólidos) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182P) (SEQ ID NO:143) (diamantes abiertos).
La Figura 35 es una gráfica que muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre en ratones ob/ob para cada uno de un control de vehículo PBS (circuios abiertos), y los mutantes FGF21 Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (cuadrados sólidos); Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, Y179S) (SEQ ID NO: 149) (triángulos abiertos), Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A) (SEQ ID NO: 153) (triángulos sólidos invertidos), Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180S) (SEQ ID NO:155). (diamantes abiertos) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180G) (SEQ ID NO: 157) (circuios sólidos).
La Figura 36 es una gráfica que muestra el cambio en porcentaje en niveles de glucosa en la sangre en ratones ob/ob para cada uno de un control de vehículo PBS (círculos sólidos), y los mutantes FGF21 Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) (cuadrados abiertos); Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, Y179F) (SEQ ID NO:151) (triángulos sólidos), y Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) (diamantes abiertos ) .
La Figura 37 es un diagrama que describe gráficamente el estudio diseñado para un estudio de escalación de dosis de seis semanas realizado- en monos Rhesus. En la figura, los símbolos sombreados indican tomas de sangre en el estado en ayuno y los símbolos punteados indican tomas de sangre en el estado con alimentación.
Las Figuras 38A-38D son una serie de gráficas que describen cómo los monos Rhesus se colocaron en forma aleatoria en perfiles OGTT, OGTT AUCs y peso corporal; La Figura 38A describe niveles en glucosa de línea base en OGTT1, el cuadro sólido corresponde al grupo A, círculo sólido, la línea sólida corresponde al grupo B y círculo abierto, la línea punteada corresponde al grupo C antes de que se asignaron los compuestos o vehículo a cada grupo; la Figura 38B describe niveles en glucosa de línea base en OGTT2, el cuadro sólido corresponde al grupo A, círculo sólido, línea sólida corresponde al grupo B y círculo abierto, línea sólida corresponde al grupo C antes de que se asignaron los compuestos o vehículo a cada grupo; la Figura 38C muestra niveles en glucosa de línea base para OGTTs 1 y 2 mostrados en términos de AUC, 1a- barra punteada corresponde al grupo A, la barra sombreada corresponde al grupo B y la barra abierta corresponde al grupo C; y la Figura 38D muestra el peso corporal de línea base, la barra punteada corresponde al grupo A, la barra sombreada corresponde al grupo B y la barra abierta corresponde al grupo C.
La Figura 39 es una gráfica que muestra el cambio en porcentaje en peso corporal con relación a la linea base de vehículo, FGF21 (SEQ ID N0:4) y Fe- ( L15 ) - FGF21 ( L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) en monos Rhesus; las barras sombreadas 1 y 2 corresponden a las semanas 1 y 2 a la dosis baja, las barras abiertas 3 y 4 corresponden a las semanas 3 y 4 a la dosis media, las barras sólidas 5 y 6 corresponden a las semanas 5 y 6 a la dosis alta y las barras punteadas 7, 8 y 9 corresponden a las semanas 7-9 durante el periodo de lavado.
La Figura 40 es una gráfica que muestra el cambio en porcentaje en insulina ayunada cón relación a la línea base de vehículo, FGF21 (SEQ ID NO: ) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) en niveles de insulina en ayuno en monos Rhesus; las barras sombreadas 1 y 2 corresponden a las semanas 1 y 2 a la dosis baja, las barras abiertas 3 y 4 corresponden a las semanas 3 y 4 a la dosis media, las barras sólidas 5 y 6 corresponden a las semanas 5 y 6 a la dosis alta y las barras punteadas 7 y 8 corresponden a las semanas 7 y 8 durante el periodo de lavado.
La Figura 41 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo, FGF21 (SEQ ID NO:4) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43), dados a la' dosis alta, en niveles de insulina con alimento de monos Rhesus adquiridos durante las semanas 5 y -6 del estudio; las barras sólidas corresponden a la semana 5 y las barras sombreadas corresponden a la semana 6.
La Figura 42 es una gráfica que muestra los perfiles de glucosa de 0GTT5 realizados al final del tratamiento de dosis alta de dos semanas con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43); circulo sólido,, linea sólida corresponde al vehículo, cuadrado abierto, línea punteada corresponde al FGF21 (SEQ ID NO: ) y triángulo sólido, línea sólida corresponde al Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) .
La Figura 43 es una gráfica que muestra los perfiles de insulina de OGTT5 realizados al final del tratamiento de dosis alta de dos semanas con Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43); círculo sólido, línea sólida corresponde al vehículo, cuadrado abierto, línea punteada corresponde al FGF21 (SEQ ID NO: 4) y triángulo sólido, línea sólida corresponde al Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43).
La Figura 44 es una gráfica que muestra el porcentaje de cambio desde la línea base de glucosa OGTT AUC3-5 determinado al final de cada periodo de dosis (dosis baja, media y alta) de los monos Rhesus; barras abiertas corresponden a AUC3 calculado a partir de mediciones de glucosa durante OGTT3, las barras sólidas corresponden a AUC4 calculado a partir de mediciones de glucosa durante OGTT4 y las barras sombreadas corresponden a AUC5 calculado a partir de mediciones de glucosa durante OGTT5.
La Figura 45 es una gráfica gue muestra los efectos de vehículo, FGF21 y Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) en el cambio en porcentaje desde la línea base de los niveles de triglicéridos en plasma en ayuno a partir de cada grupo de monos Rhesus; las barras sombreadas 1 y 2 corresponden a las semanas 1 y 2 a la dosis baja, barra abiertas 3 y 4 corresponden a las semanas 3 y 4 a la dosis media, las barras sólidas 5 y 6 corresponden a las semanas 5 y 6 a la dosis alta y barra punteadas 7, 8 y 9 corresponden a las semanas 7-9 durante el periodo de lavado.
La Figura 46 es una gráfica que muestra los niveles de triglicéridos en plasma en alimento a partir de cada grupo de los monos Rhesus; como se mide durante la quinta y sexta semanas de tratamiento con vehículo, FGF21 (SEQ ID NO: 4) o Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) a la dosis alta; las barras sombreadas corresponden a la semana 5 y las barras sólidas corresponden a la semana 6.
La Figura 47 es una gráfica que muestra niveles de FGF21 humano (SEQ ID NO: 4) en monos individuales medidos a una dosis previa, y 5, 12, 19, y 26 días, con muestras adquiridas en aproximadamente 21 horas después de cada inyección.
La Figura 48 es una gráfica que muestra niveles de Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) en mono individual medidos a una dosis previa, y 5, 12, 19, y 26 días, con muestras adquiridas aproximadamente 5 días después de cada inyección .
La Figura 49 es una gráfica que muestra las concentraciones medias de niveles de FGF21 (SEQ ID NO: 4) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) medidos a partir de las tres OGTTs realizados después de cada una de las dosis baja, media y alta; las barras, sombreadas corresponden a OGTT3 a la dosis baja, las barras sólidas corresponden a OGTT4 a la dosis media y barra abiertas corresponden a 0GTT5 a la dosis alta.
La Figura 50 es la secuencia de aminoácido de la proteina de fusión Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 47); los residuos IgGl Fe (SEQ ID NO: 11) están en negritas, el ligador (G4S)3 (SEQ ID NO: 31) está en cursivas y las mutaciones de punto en al secuencia FGF21 (SEQ ID NO: 39) están en negritas y subrayado^ La Figura 51 es una gráfica, que muestra la respuesta a la dosis de los compuestos de prueba en ensayos Erk-luciferasa; Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47), Fe- ( L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57), FGF21 tipo natural, y se probaron una fusión Fe con FGF21 tipo natural.
La Figura 52 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de enlace de equilibrio de solución Biacore de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) y Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) a humano (derecha) y cyno ß-Klotho (izquierda).' La Figura 53 es un- par . de gráficas que muestran la respuesta a la dosis de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 47) en ratones db/db después de una inyección sencilla; la Figura 53A muestra los niveles de glucosa en la sangre en ratones db/db en varios puntos de tiempo después de inyección de vehículo o Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) , mientras que la Figura 53B muestra el efecto de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en peso corporal después de una inyección sencilla en ratones db/db.
La Figura 54 es un esquemático que representa gráficamente un estudio de frecuencia de dosis de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) y Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) en ratones DIO.
La Figura 55 es una gráfica que muestra los perfiles GTT de ratones tratados con vehículo, Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) o Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) a diferentes frecuencias de dosificación.
La Figura 56 es una gráfica que muestra el cambio de peso corporal de la línea base (día 0) en ratones tratados con vehículo, Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) o Fe- (L15) -FGF21 ' (L98-R, P171G) (SEQ ID NO:43) a diferentes frecuencias.de dosificación.
La Figura 57 es una gráfica' que muestra los resultados de un estudio in vitro de hidrogeles que comprende el mutante FGF21 (L98R, P171G)) (SEQ ID NO:37) FGF21.
La Figura 58 es una gráfica que muestra el efecto en el nivel de glucosa en la sangre de ratones db/db de 8 semanas de edad dosificados con. arias formulaciones de hidrogel.
La Figura 59 es una gráfica que muestra el efecto en el nivel de glucosa en la sangre de ratones db/db de 8 semanas de edad dosificados con varias formulaciones de hidrogel.
La Figura 60 es una gráfica que muestra el efecto en the el nivel de glucosa en la sangre de ratones db/B6 de 8 semanas de edad dosificados con varias formulaciones de hidrogel; los circuios sólidos representan ratones dosificados con un control de hidrogel, los cuadrados sólidos representan ratones dosificados con FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 37) en un hidrogel en 10 mg/kg, los triángulos sólidos representan ratones dosificados con FGF21 (L98R, P171G) en un hidrogel en 30 mg/kg, y los triángulos invertidos representan ratones dosificados .con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) solo.
La Figura 61 es una gráfica que muestra el cambio en porcentaje en el nivel dé glucosa en la sangre de ratones db/B6 de 8 semanas de edad dosificados con varias formulaciones de hidrogel; los círculos sólidos representan ratones dosificados con un control de hidrogel, los cuadrados sólidos representan ratones dosificados con FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) en un hidrogel en 10 mg/kg, los triángulos sólidos representan ratones dosificados con FGF21 (L98R, P171G) en un hidrogel en 30 mg/kg, y los triángulos invertidos representan ratones dosificados con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57)' solo.
La Figura 62 es una gráfica que muestra el efecto en peso corporal de ratones db/B6 de 8 semanas de edad dosificados con varias ¦ formulaciones de hidrogel; los círculos sólidos representan ratones dosificados con un control de hidrogel, los cuadrados sólidos representan ratones dosificados con FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 37) en un hidrogel en 10 mg/kg, los triángulos sólidos representan ratones dosificados con FGF21 (L98R, P171G) en un hidrogel en 30 mg/kg, y los triángulos invertidos representan ratones dosificados con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) solo.
La Figura 63 es una gráfica que muestra el cambio en porcentaje en peso de ratones db/B6 de 8 semanas de edad dosificados con varias formulaciones de hidrogel; los círculos sólidos representan ratones dosificados con un control de hidrogel, los cuadrados sólidos representan ratones dosificados con' FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:37) en un hidrogel en 10 mg/kg, los triángulos sólidos representan ratones dosificados con FGF21 (L98R, P171G) en un hidrogel en 30 mg/kg, y los triángulos invertidos representan ratones dosificados con Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:57) solo.
La Figura 64 es un diagrama que describe gráficamente el estudio diseñado para un estudio de escalación de dosis de nueve semanas realizado en monos .cynomolgus con tolerancia debilitada a la glucosa (IGT) .
La Figura 65 es una gráfica que describe los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) y Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en ingesta alimenticia de comida AM de los monos cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 66 es una gráfica que describe los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) y Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 47) en ingesta de fruta de los monos cynomolgus IGT estudiados.
"La Figura 67 es una gráfica que describe los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO : 43 ) y Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) ingesta alimenticia de comida PM de los monos cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 68 es una gráfica que describe los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (.L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) y Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en peso corporal de los monos cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 69 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) y Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en índice de masa corporal de los monos cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 70 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo, Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) y Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en grosor del pliegue de piel de los monos cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 71 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) y Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en la circunferencia abdominal de los monos cynomolgus IGT estudiados .
La Figura 72 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) y Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en niveles de glucosa en plasma de los monos ' cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 73 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) y Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en tolerancia a la glucosa de los monos cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 74 es una gráfica- que muestra los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (.L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) y Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) ( SEQ ID NO:47) en niveles de triglicéridos en el plasma de los monos cynomolgus IGT estudiados .
La Figura 75 es una gráfica que muestra los efectos de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO : 43) y Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en niveles de colesterol total en plasma de los monos cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 76 es una gráfica- que muestra los efectos de vehículo, .Fe- (L15) -FGF21 (.L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) y Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO:47) en niveles de colesterol HDL en plasma de los monos cynomolgus IGT estudiados.
La Figura 77 es una serie de residuos de espectrometría de masas MALDI que muestran los cambios observados en Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (panel izquierdo, SEQ ID NO:43) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (panel derecho, SEQ ID NO: 57) en varios puntos durante un periodo de tiempo de 168 horas.
La Figura 78 es una gráfica que muestra la abundancia relativa (%) de péptido en el C terminal de longitud completa sobre los fragmentos de péptido en el C terminal totales derivados tanto de Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO:43) como de Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 57) como se analiza por MRM LC/MS/MS seguido por digestión Asp-N .
La Figura 79 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo ELISA para la concentración en plasma de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) ( SEQ ID NO:43) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID. NO: 57) de longitud completa intactos durante un periodo de 240 horas seguido por inyección intravenosa en ratones.
La Figura 80 es una gráfica que muestra los resultados de un ensayo de actividad ELK-luciferasa realizado en un control negativo, FGF21 humano (SEQ ID NO: 4) y los mutantes de glicosilación FGF-21 FGF21 (Y179N, S181T) (SEQ ID NO:161), FGF21 Y179N (SEQ ID NO: 163) y FGF21 P124S (SEQ ID NO: 165).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una proteina FGF21 humana que tiene propiedades mejoradas tal como una vida media incrementada y/o agregación disminuida se puece preparar usando los métodos dados a conocer en este documento y métodos de biología molecular estándares. Opcionalmente, la vida media se puede prolongar adicionalmente al fusionar un anticuerpo, o porción del mismo, al extremo en el N terminal o en el C terminal de la secuencia FGF21 de tipo natural. También es posible prolongar adicionalmente la vida media o disminuir la agregación de la proteina FGF21 de tipo natural al introducir sustituciones de aminoácidos dentro de la proteina. Estas proteínas modificadas son referidas en este documento como mutantes, o mutantes FGF21, y forman modalidades de la presente invención.
Los métodos de ácido nucleico recombinantes usados en este documento, incluyendo en los Ejemplos, son generalmente aquellos expuestos en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y colaboradores, eds . , Green Publishers Inc. y iley and Sons 1994), ambas de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. 1. Definiciones Generales El término "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de ácido nucleico de la invención que (1) se ha separado de por lo menos aproximadamente 50 por ciento de las proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se encuentra naturalmente cuando el ácido nucleico tal se aisla de las células de origen, (2) no se liga a todo o una porción de un polinucleótido al cual la "molécula de ácido nucleico aislada" se liga en la naturaleza, (3) se liga operablemente a un polinucleótido el cual no se liga en lá naturaleza, o (4) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia de polinucleotidos más grande. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención está sustancialmente libre de cualquiera de otras moléculas de ácido nucleico contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en sus ambientes naturales que interferirán con su uso en la producción de polipéptido o su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.
El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) usados para transferir la información de codificación a una célula hospedera.
El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula hospedera y contiene secuencias de ácidos nucleicos que dirigen y/o controlan la expresión' de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas insertadas. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripción, traducción, · y empalme de ARN, si están presentes los intrones .
El término "ligado operablemente" se usa en este documento para referirse a. una configuración de secuencias de flanqueo en donde las ' secuencias de flanqueo descritas de esta manera están configuradas o ensambladas para realizar su función usual. De esta manera, una secuencia de flanqueo ligada operablemente a una secuencia de codificación puede ser capaz de efectuar la replicación, transcripción y/o traducción de la secuencia de codificación. Por ejemplo, una secuencia de codificación se liga operablemente a un promotor donde el promotor es capaz de dirigir la transcripción de esa secuencia de codificación. Una- secuencia de flanqueo no necesita ser contigua con la secuencia de codificación, siempre y cuando funcione correctamente. De esta manera, por ejemplo, la intervención de secuencias ya transcritas no traducidas puede estar presente entre una secuencia promotora y la secuencia de . codificación y la secuencia promotora aún se puede considerar "ligada operablemente" a la secuencia de codificación .
El término "célula hospedera" se usa para referirse a una célula la cual se ha transformado, o es capaz de ser transformada con una secuencia de' ácidos nucleicos y luego de expresar un gen seleccionado de interés. El término incluye la progenie de la célula precursora, si la progenie es idéntica o no en morfología o en la constitución genética a la precursora original, siempre y cuando el gen seleccionado esté presente.
El término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido de la presente invención que (1) se ha separado de por lo menos alrededor de 50 por ciento de polinucleótidos , lípidos, carbohidratos, y otros materiales con los cuales se encuentran naturalmente cuando se aisla de la célula de origen, (2) no se liga (mediante la interacción covalente o no covalente) a todo o una porción del polipéptido al cual el "polipéptido aislado" se liga en naturaleza, (3) se liga operablemente (mediante la interacción covalente o no covalente) a un polipéptido con el cual no se enlaza en naturaleza, o (4) no ocurre en naturaleza. Preferiblemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de cualquiera de otros polipéptidos contaminantes y otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico o de investigación.
El término "de origen natural" cuando se usa en relación con - los materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células hospederas, y los similares, se refiere a materiales que se encuentran en naturaleza y no se manipulan por el hombre. Similarmente , "de origen no natural" como se usa .en este documento, se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado o sintetizado estructuralmente por el hombre. Cuando se usa en relación con los nucleótidos, el término "de origen natural" se refiere a las bases de adenina (A) , citosina (C) , guanina (G) , timina (T) , y uracilo (U) . Cuando se usa en relación con los · aminoácidos , el término "de origen natural" se refiere a los 20 aminoácidos alanina (A) , cisteina (C) , ácido aspártico (D) , ácido glutámico (E) , fenilalanina (F), glicina (G) , histidina (H) , isoleucina (I), lisina ( ) , leucina (L) , metionina (M) , asparagina (N) , prolina (P), glutamina (Q) , arginina (R) , serina (S), treonina (T) , valina (V), triptófano ( ) , y tirosina (Y).
El término "polipéptido FGF21" se refiere a un polipéptido de tipo natural de origen natural expresado en humanos. Para propósitos de esta descripción, el término "polipéptido FGF21" se puede usar intercambiablemente para referirse a cualquier polipéptido FGF21 de longitud completa, por ejemplo, SEQ ID NOs : 2 y 6, el cual consiste de 209 residuos de aminoácido y las cuales se codifican por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOs: 1 y 5, respectivamente; cualquier forma madura del polipéptido, por ejemplo, SEQ ID NOs : 4 y 8, las cuales consistes de 181 residuos de aminoácido y las cuales se codifican por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOs : 3 y 7, respectivamente, y en las cuales los 28 residuos de aminoácido en el extremo amino-terminal del polipéptido FGF21 de longitud completa (es decir, el cual constituye el péptido de señal) se ha removido, y variantes de los mismos. Los polipéptidos FGF21 de longitud compelta y maduros pueden no necesitar comprender una metionina amino-terminal, que puede introducirse por ingeniería o como un resultado de un proceso de expresión bacteriano.
Los términos "mutante de polipéptido FGF21" y "mutante FGF21" pueden usarse intercambiablemente y se refieren a un polipéptido FGF21 en el cual una secuencia de aminoácidos FGF21 de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, u 8) se ha modificado. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, una o más sustituciones de aminoácidos, que incluyen sustituciones con aminoácidos no de origen natural y análogos de aminoácidos no de origen natural, y truncamientos. De esta manera, los mutantes de polipéptido FGF21 incluyen, pero no- se limitan a, mutantes FGF21 dirigidos al sitio, polipéptidos FGF21 truncados, mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis, mutantes FGF21 reductores de agregación, mutantes de combinación FGF21 y proteínas de fusión FGF21, como se -describen en este documento. Para el propósito de identificar los truncamientos específicos y las sustituciones de aminoácidos de los mutantes FGF21 de la presente invención, la numeración de los residuos de aminoácido truncados o mutados corresponde a la del polipéptido FGF21 de 181 residuos maduro. Los mutantes FGF21 pueden no necesitar comprender una metionina amino-terminal , que puede introducirse por ingeniería o como resultado de procesos de expresión bacteriana.
En otras modalidades de la presente invención, un mutante de polipéptido FGF21 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos alrededor de 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de FGF21, pero en donde los residuos específicos que confieren una propiedad deseable al mutante de polipéptido FGF21, por ejemplo, resistencia a la proteólisis, vida media incrementada o propiedades reductoras -de agregación y combinaciones de las mismas, no se han modificado adicionalmente . En otras palabras, con la excepción de los residuos en la secuencia de mutante FGF21 que · se ha modificado a fin de conferir resistencia a la proteólisis, reducción de agregación u otras propiedades, alrededor de 15 por ciento de todos' los otros residuos de aminoácido en' la secuencia de mutante FGF21 se pueden modificar. Por ejemplo, en el mutante FGF21 Q173E, hasta 15 por ciento de todos los residuos de aminoácido diferentes a residuo de ácido glutámico, el cual se sustituyó por glutamina en la posición 173, se podría modificar. Todavía en otras modalidades, un mutante de polipéptido FGF21 comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos alrededor de 90 por ciento, o alrededor de 95, 96, 97, 98, o 99 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de FGF21, pero en donde los residuos específicos que confieren las propiedades de resistencia a la proteólisis o reducción a la agregación del mutante de polipéptido FGF21 no se han modificados adicionalmente . Estos mutantes de polipéptido FGF21 poseen por lo menos una actividad del polipéptido FGF21 de tipo natural.
La presente invención también abarca una molécula de ácido nucleico que codifica un mutante de polipéptido FGF21 que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos alrededor de 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de FGF21 pero en donde, los residuos específicos que confieren una propiedad deseable al mutante de polipéptido FGF21, por ejemplo, resistencia a la. proteólisis, vida media incrementada o propiedades de reducción de agregación y combinaciones de las mismas no se han modificado adicionalmente. En otras palabras, con la excepción de los residuos en la secuencia de mutante FGF21 que se han modificado a fin de conferir resistencia a la proteólisis, reducción a la agregación u otras propiedades, alrededor de 15 por ciento de todos los otros nucleótidos en la secuencia de mutante FGF21 se pueden modificar. Por ejemplo, en el mutante FGF21 Q173E, hasta ' 15 por ciento de todos los nucleótidos diferentes a los. residuos de aminoácido diferentes al residuo de ácido glutámico, el cual se sustituyó por glutamina en la posición 173, se podrían modificar. La presente invención abarca además una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos alrededor de 90 por ciento, o alrededor de 95, 96, 97, 98, o 99 por ciento idéntica a la secuencia de nucleótido que codifica un mutante FGF21, pero en donde los residuos de aminoácido que codifican nucleótidos confieren las propiedades de resistencia a la proteólisis o reducción a la agregación del mutante de polipéptido FGF21 no se han modificado adicionalmente .. Tales molécula de ácido nucleico que codifican polipéptidos mutantes FGF21 poseen por lo menos una actividad del polipéptido FGF21 de tipo natural.
El término "mutante de polipéptido FGF21 biológicamente activo" se refiere a cualquier mutante de polipéptido FGF21 descrito en este documento que posee una actividad del polipéptido FGF21 de tipo natural, tal como la capacidad para disminuir la glucosa en la sangre, insulina, triglicéridos, o el colesterol; reducir el peso corporal; y mejorar la tolerancia a la glucosa, gasto de energía, o sensibilidad a la insulina, sin considerar el tipo o número de modificaciones que se han introducido en el mutante de polipéptido FGF21. Los mutantes de polipéptido FGF21 que proveen un nivel de alguna manera disminuido de actividad FGF21 relativa con el polipéptido FGF21 de tipo natural no obstante se puede considerar que son mutantes de polipéptido FGF21 biológicamente activos.
Los términos "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" cada uno se refiere a la cantidad de un mutante de polipéptido FGF21 usado para soportar un nivel observable de una ' o más actividades biológicas del polipéptido FGF21 de tipo natural, tal como la capacidad de disminuir los niveles de glucosa en la sangre, insulina, triglicéridos , o colesterol reducir el peso corporal; o mejora la tolerancia a la glucosa, gasto de energía, o sensibilidad a la insulina.
El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable" como se usa en este documento, se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para lograr o mejorar el suministro de un mutante de polipéptido FGF21 en el cuerpo de un sujeto humano o no humano. El término incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, agentes isotónicos y que retardan la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada en fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En algunos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitoles, sorbitol, o cloruro de sodio en una comparación farmacéuticamente. Las sustancias farmacéuticamente aceptables tales como . humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores o soluciones amortiguadoras, que aumentan la vida media o efectividad del mutante de polipéptido FGF21 también pueden actuar como, o formar un componente de, un portador.
El término "antígeno" se refiere a una molécula o una porción de una molécula que es capaz de ser enlazada por un anticuerpo, y adicionalmente que es capaz de ser usada en un animal para producir anticuerpos que son capaces de enlazarse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos.
El término "Fe nativa" se refiere a la molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de enlace no de antígeno que resulta de la digestión de un anticuerpo completo o producido por otros medios, ya sea en forma monomérica o multimérica, y puede contener la región bisagra. La fuente de inmunoglobulina original de la Fe es preferiblemente, pero no necesariamente, de origen humano y puede ser cualquiera de las. inmunoglobulinas , aunque se prefieren IgGl e IgG2. También puede emplearse IgG4. Las moléculas Fe nativas están constituidas de polipéptidos monoméricos que se pueden ligar en formas diméricas o multiméricas por la asociación covalente (es decir, enlaces de disulfuro) y no covalente. El número de enlaces de disulfuro intermoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas Fe nativas varía de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, e IgE) o subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, e IgGA2). Un ejemplo de una Fe nativa es un dímero enlazado por disulfuro que resulta de la digestión de papaína de un IgG (véase Ellison y colaboradores., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). El término "Fe nativa" como se usa en este documento es genérico a las formas monoméricas, diméricas y multiméricas. Los ejemplos de una secuencia de polipéptido Fe se presenta en SEQ ID NOs: 11 y 171, que se derivan de moléculas IgGl e IgG4 humanas, respectivamente. Una Fe nativa puede, pero no necesariamente, comprender una metionina amino-terminal, que puede introducirse por ingeniería o como un resultado de un proceso de expresión bacteriana; tales moléculas fe todavía se consideran que son moléculas "Fe nativas".
El término "variante Fe" se refiere a una molécula o secuencia que se modifica de una Fe nativa pero aún comprende un sitio de enlace para el receptor de recuperación, FcRn (receptor Fe neonatal) . · Las Publicaciones Internacionales Nos. WO 97/34631 y WO . 96/32478 describen variantes Fe ejemplares, así como también la interacción con el receptor de recuperación, y se incorporan por ello en este documento a manera de referencia. De esta manera, el término "variante Fe" puede comprender una molécula o secuencia que se humaniza de una Fe nativa no humana. Adicionalmente, una Fe nativa comprende regiones que se pueden remover debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no se requieren para las molécula de fusión de los mutantes FGF21 de la presente invención. De esta manera, el término "variante Fe" . comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos Fe, o en los cuales uno o más sitios o residuos Fe se han modificado, que afecta o están implicados en: (1) formación de enlace de disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula hospedera seleccionada, (3) heterogeneidad -terminal en la expresión en una célula hospedera seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento, (6) enlace a un receptor Fe diferente a un receptor de recuperación, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . Las variantes Fe se describen con detalle adicional a partir de ahora. Una variante Fe puede, pero no necesariamente, comprender una metionina amino-terminal, que puede introducirse por ingeniería como un resultado de un proceso de expresión bacteriano; tales moléculas Fe todavía se considera que con "variantes Fe".
El término "dominio Fe" abarca Fe nativa y variantes Fe y secuencias como se definen anteriormente. Como con las variantes Fe y las moléculas Fe nativas, el término "dominio Fe" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas de un anticuerpo completo o producidas por otros medios. En algunas modalidades de la presente invención, un dominio Fe se puede fusionar a FGF21 o un mutante FGF21 (que incluye una forma truncada de FGF21 o un mutante FGF21) por medio, por ejemplo, de un enlace covalente entre el dominio Fe y la secuencia FGF21. Tales proteínas de fusión pueden formar multímeros por la medio de la asociación de los dominios Fe y ambas de estas proteínas de fusión y sus multímeros son un aspecto de la presente invención. Un dominio Fe puede, pero no necesariamente, comprender metionina amino-terminal, que puede introducirse por ingeniería o como resultado -de proceso de expresión bacteriana . 2. Mutantes FGF21 El término "mutante FGF21" se refiere a un polipéptido mutante FGF21 que tiene una secuencia de aminoácido que difiere de la secuencia de aminoácido de una secuencia de polipéptido FGF21 que se presenta naturalmente, por ejemplo, SEQ ID N0s:2, 4, 6 o 8, por uno o más aminoácidos. Los mutantes FGF21 pueden generarse al introducir una o más sustituciones de aminoácido, ya sea conservadores o no conservadores y usar aminoácidos que se presentan naturalmente o no naturalmente, en posiciones particulares del polipéptido FGF21.
Una "sustitución de aminoácido conservadora" puede involucrar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo (es decir, un residuo encontrado en una posición dada de la secuencia de polipéptido FGF21 tipo natural) con un residuo no nativo (es decir, un residuo que no se encuentra en una posición dada de la secuencia de polipéptido FGF21 tipo natural) de tal manera que hay poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de amionoácido en tal posición. Las sustituciones de aminoácido conservadoras también abarcan residuos de aminoácido que no se presentan naturalmente que se incorporan típicamente por síntesis de péptido química en vez de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos , y otras, formas invertidas o revertidas de porciones de aminoácido.
Los residuos de origen natural se pueden dividir en clases con base en las propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbica: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr; (3) ácida: Asp, Glu; (4) básica: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) residuos que afectan la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromática: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase.
Las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sea conservadoras o no conservadoras) se pueden determinar por aquellas personas expertas en el campo en el momento que se desean estas sustituciones. üna lista ejemplar (pero no limitante) de sustituciones de aminoácidos se expone en la Tabla 1.
Tabla 1 Sustituciones de Aminoácido Residuo Original Sustituciones Ejemplares Ala Val, Leu,' lie Arg Lys, Gln, Asn Asn Gln Asp Glu Cys Ser, Ala Gln Asn Glu Asp Gly Pro, Ala His Asn, Gln, Lys, Arg lie Leu, Val, Met, Ala, Phe Leu lie, Val, Met, Ala, Phe Lys Arg, Gln, Asn Met Leu, Phe, lie Phe Leu, Val, lie, Ala, Tyr Pro Ala Ser Thr, Ala, Cys Thr Ser Trp Tyr, Phe Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Val lie, Met, Leu, Phe, Ala 3. Polipéptidos FGF21 Truncados Una modalidad de la presente invención se dirige a formas truncadas del polipéptido . FGF21 maduro o mutante FGF21. Esta modalidad de la presente invención surge a partir de un esfuerzo para identificar polipéptidos FGF21 truncados que son capaces de proporcionar una actividad que es similar, y en algunos casos superior, a formas no truncadas del polipéptido FGF21 maduro.
Como se usa en este documento, el término "polipéptido FGF21 truncado" se refiere a un polipéptido FGF21 en el cual se han removido residuos de aminoácido del extremo amino-terminal (o N-terminal) del polipéptido FGF21, residuos de aminoácido que se han removido del extremo carboxilo-terminal (o C-terminal) del 'polipéptido FGF21, o residuos de aminoácido que se han removido de los extremos tanto amino-terminal como carboxilo-terminal del polipéptido FGF21. Los diversos truncamientos dados a conocer en este documento se prepararon como se describen en los Ejemplos 3 y 6 en este documento .
La actividad de los polipéptidos FGF21 truncados terminalmente en N y polipéptidos FGF21 truncados terminalmente en C se puede someter a ensayo usando un ensayo de ELK-luciferasa in vitro como se describe en el Ejemplo 4. Los detalles específicos de los ensayos in vitro que se pueden usar para examinar la actividad de los polipéptidos FGF21 truncados se pueden encontrar en el Ejemplo 4.
La actividad de los polipéptidos FGF21 truncados de la presente invención también se puede estimar en un ensayo in vivo, tal como ratones db/db, o ratones ob/ob como se muestra en los Ejemplos 5 y' 7. Generalmente, para estimar la actividad in vivo de un polipéptido FGF21 truncado, el polipéptido FGF21 truncado se puede administrar a un animal de prueba intraperitonealmente . Después de un periodo de incubación deseado (por ejemplo, una hora o más) , una muestra de sangre se puede extraer, y se pueden medir los niveles de glucosa en la sangre. Detalles específicos de los ensayos in vivo que se pueden usar para examinar la actividad de los polipéptidos FGF21 truncados se pueden encontrar en los Ejemplos 5 y 7. a. Truncamientos en el N terminal En algunas modalidades de la presente invención, los truncamientos en el N terminal comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 residuos de aminoácido del extremo en el N terminal del polipéptido FGF21 maduro o mutante FGF21. Como se demuestra, por ejemplo, en el Ejemplo 5" y la Figura 3, los polipéptidos FGF21 truncados que tiene los truncamientos en el N terminal de menos de 9 residuos de aminoácido retienen la capacidad del polipéptido FGF21 maduro de disminuir la glucosa en la sangre en un individuo. Por consiguiente, en modalidades particulares, la presente invención abarca formas truncadas del polipéptido FGF21 o mutantes de polipéptido FGF21 que tienen truncamientos en el N terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 residuos de aminoácido. b. Truncamientos en el C terminal En algunas modalidades de la presente invención, los truncamientos en el C terminal comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 residuos de aminoácido del extremo en el C terminal del polipéptido FGF21 maduro. Como se demuestra en, por ejemplo, el Ejemplo 4 y la Figura IB, los polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el C terminal de menos de 13 residuos de aminoácido exhibieron una eficacia de por lo menos 50% de la eficacia del FGF21 de tipo natural en un ensayo de · ELK-luciferasa in vitro, indicando que estos mutantes FGF21 retienen la capacidad del polipéptido FGF21 maduro de disminuir la glucosa en la sangre en un individuo. Por consiguiente, en modalidades particulares, la presente invención abarca formas truncadas de polipéptido FGF2I maduro o mutantes de polipéptido FGF21 que tienen truncamientos en el C terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 residuos de aminoácido. c. Truncamientos en el N terminal y terminal C En¦ algunas modalidades de la presente invención, los polipéptidos FGF21 truncados pueden tener una combinación de truncamientos en el N terminal y en el C terminal. Los polipéptidos FGF21 truncados que tiene una combinación de truncamientos en el N terminal y en el C terminal comparten la actividad de los polipéptidos FGF21 truncados correspondienteá que tienen los truncamientos ya sea en el N terminal o terminal C solos. En otras palabras, los polipéptidos FGF21 truncados que tiene tanto truncamientos en el N terminal de menos de 9 residuos de aminoácido como truncamientos en el C terminal de menos de 13 residuos de aminoácido poseen una actividad biológica similar o mayor, por ejemplo, actividad de .reducción de glucosa en la sangre, como los polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el N terminal de menos de 9 residuos de aminoácido o polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el C terminal de menos de 13 residuos de aminoácido. Por consiguiente, en modalidades particulares, la presente invención abarca formas truncadas del polipéptido FGF21 maduro o mutantes de polipéptido FGF21 que tienen tanto truncamientos en el N terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 residuos de aminoácido como truncamientos en el C terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 residuos de aminoácido.
Como con todos los mutantes FGF21 de la presente invención, los polipéptidos FGF21 truncados pueden comprenden opcionalmente un residuo de metionina amino-terminal, el cual se puede introducir mediante mutación dirigida o como un resultado de un proceso de expresión bacteriana.
Los polipéptidos FGF21 truncados de la presente invención se pueden preparar como se describe en los Ejemplos 3 y 6. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, familiarizados con las técnicas de biología molecular estándares, pueden emplear ese conocimiento, acoplado con la descripción actual, para hacer y usar los polipéptidos FGF21 truncados de la presente invención. Se puede usar técnicas estándares para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótidos , cultivo de tejidos, y transformación (por ejemplo, electroporación, ' lipofección) . Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como es comúnmente logrado en el campo, o como se describe en este documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en el campo. Las técnicas estándares se pueden usar para síntesis químicas; análisis químicos; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.
Los polipéptidos FGF21 truncados de la presente invención también se pueden fusionar a otra entidad, la cual puede impartir propiedades adicionales al polipéptido FGF21 truncado. En una modalidad de la presente invención, un polipéptido FGF21 truncado se puede fusionar a una secuencia Fe. Tal fusión se puede lograr usando métodos biológicos moleculares conocidos y/o la guía proporcionada en este documento. Los beneficios de tales polipéptidos de fusión, así como también métodos para hacer estos polipéptidos de fusión, se dan a conocer con más detalle en este documento. 4. Mutantes FGF21 Resistentes a Proteólisis Como se describe en el Ejemplo 8, el FGF21 maduro se descubrió que se somete a la degradación in vivo, la cual se determinó finalmente que surge del ataque proteolítico . La degradación in vivo del FGF21 maduro se descubrió que conduce a una vida media efectiva más corta, lo cual puede afectar adversamente el potencial terapéutico de una molécula. Por consiguiente, se realizó un estudio dirigido a identificar mutantes FGF21 que exhiben una resistencia a la proteólisis. Como resultado de esta investigación, los sitios en el polipéptido FGF21 maduro que se determinaron para ser particularmente susceptibles a la proteólisis incluyen el enlace de péptido entre los residuos de aminoácido en las posiciones 4-5, 20-21, 151-152, 171-172 y 178-181.
Un estudio amplio pero enfocado y dirigido se realizó para identificar sustituciones particulares que eliminan el efecto proteolitico observado mientras que no afecta la actividad de la proteina a un grado inaceptable. La Tabla 8 y 11 resaltan algunos de los mutantes que se prepararon y se sometieron a prueba. Como se describe en, por ejemplo, los Ejemplos 13 y 14, no todos los mutantes FGF21 exhibieron un perfil ideal; algunos mutantes confirieron resistencia a la proteólisis pero a costa de la actividad FGF21 comprometida. Otras mutaciones retuvieron la actividad FGF21 pero no confirieron resistencia a la proteólisis. Varios mutantes, que incluyen, por ejemplo, FGF21 P171G, retuvieron un nivel similar de actividad como el FGF21 de tipo natural mientras que también exhiben resistencia a la degradación proteolitica .
Un criterio de selección para identificar mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis deseables fue que la actividad del mutante FGF21 es esencialmente la misma como, o mayor que, la actividad del FGF21 de tipo natural. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se dirige a mutantes FGF21 que son resistentes a la proteolisis y aún retienen la actividad que es esencialmente la misma como, o mayor que, el FGF21 de tipo natural. Aunque menos deseable en algunos casos, los mutantes FGF21 que son resistentes a la proteolisis pero exhiben de alguna manera actividad disminuida forman otra modalidad de la presente invención. En algunos casos puede ser deseable mantener un grado de proteolisis, y consecuentemente, los mutantes FGF21 que permiten que ocurra algún grado de proteolisis también forman otra modalidad de la presente invención.
Como con todos los mutantes FGF21 proporcionados en la presente invención, los mutantes FGF21 resistentes a la proteolisis de la presente invención se pueden preparar como se describe en este documento. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, por ejemplo, aquellos familiarizados con las técnicas de biología molecular estándares, pueden emplear ese conocimiento, acoplado con la descripción actual, para hacer y usar los mutantes FGF21 resistentes a la proteolisis de la presente invención. Se pueden usar técnicas estándares para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótidos, cultivo de tejidos, y transformación (por ej.emplo, electroporación, lipofección) . Véase, por ejemplo, Sambrook. y colaboradores, Molecular Cloning: A Labora tory Manual, supra, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se logra comúnmente en el campo, o como se describe en este documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en el campo. Se pueden usar técnicas estándares para la síntesis química, análisis químicos; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.
Los mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis de la presente invención se pueden fusionar a otra entidad, la cual puede impartir propiedades adicionales al mutante FGF21 resistentes a proteólisis. En una modalidad de la presente invención, un mutante FGF21 resistente a la proteólisis se puede fusionar a una secuencia IgG Fe, por ejemplo, SEQ ID NO: 11 o 171. Esta fusión se puede lograr usando métodos biológicos moleculares conocidos y/o la guía proporcionada en este documento. Los beneficios de tales polipéptidos de fusión, así como también métodos para hacer estos polipéptidos de fusión, son conocidos y se plantean con más detalle en este documento. 5. Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación Como se describe en el Ejemplo 15, una propiedad del polipéptido FGF21 de tipo natural es su propensión al agregado. En las concentraciones arriba de aproximadamente 5 mg/mL, la velocidad de agregación es alta a temperatura ambiente. Como se muestra y se describe en este documento, la velocidad de agregación para el polipéptido FGF21 de tipo natural es dependiente tanto de concentración como de temperatura .
La agregación puede probar que es un reto cuando se trabaja con el FGF21 de tipo natural en estas concentraciones, tal como en el contexto de una formulación terapéutica. Por consiguiente, se realizó un estudio dirigido a identificar mutantes FGF21 . que exhiben agregación FGF21 reducida. Los mutantes FGF21 resultantes luego se sometieron a prueba para la propensión de agregarse en varias concentraciones .
Se realizó un estudio amplio pero enfocado y dirigido a identificar sustituciones particulares que eliminan o reducen el efecto de agregación observado del FGF21 de tipo natural mientras que no afecta la actividad de la proteina a un grado inaceptable. El enfoque para identificar mutantes de reducción de agregación adecuados se describe en el Ejemplo 15. La Tabla 16 resalta algunos de los mutantes que se prepararon y se sometieron a prueba. Como se describe en, por ejemplo, el Ejemplo 17, no todos los mutantes FGF21 exhibieron un perfil ideal. Algunos mutantes, tal como FGF21 L58E tuvieron la actividad FGF21 comprometida y no se estudiaron adicionalmente . Otras mutaciones, tal como FGF21 A134E, retuvieron la actividad FGF21 pero no confirieron propiedades de agregación reducidas. Varios mutantes, tal como FGF21 L98R, retuvieron la actividad FGF21 y también exhibieron agregación reducida. Un mutante, FGF21 A45K, exhibió sorprendentemente una actividad FGF21 incrementada mientras que también exhibió propiedades de agregación reducidas.
Uno de los criterios ' de selección para identificar los mutantes FGF21 de reducción de agregación deseables fue que la actividad del mutante FGF21 sea esencialmente similar a, o mayor que, la actividad del FGF21 de tipo natural. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se dirige a mutantes FGF21 que tienen propiedades de agregación reducidas mientras que aún retienen una actividad FGF21 que es similar a, o mayor que, el FGF21 de tipo natural. Aunque menos deseable en algunos casos, los mutantes FGF21 que tienen propiedades de agregación reducidas pero que exhiben de alguna manera actividad FGF21 disminuida forman otra modalidad de la presente invención. En algunos casos, puede ser deseable mantener un grado de agregación, y consecuentemente, los mutantes FGF21 que permitan que ocurra algún grado de agregación también forman otra modalidad de la presente invención.
Como con todos los mutantes FGF21 proporcionados en la presente, los mutantes FGF21 de reducción de agregación proprocionados en la presente se pueden preparar como se describe en este documento. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo/ familiarizadas con las técnicas de biología molecular estándares pueden emplear ese conocimiento, acoplado con la descripción actual, para hacer y usar los mutantes- FGF21 de reducción de agregación de la presente invención. Se pueden usar técnicas estándares para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos , cultivo de tejidos, y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Labpratory Manual, supra , la cual se incorpora en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se logra comúnmente en el campo, o como se describe en este documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, la química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en el campo. Se pueden usar técnicas estándares para síntesis químicas; análisis químicos; preparación farmacéutica, formulación, y suministro; y tratamiento de pacientes.
Los mutantes FGF21 de reducción de agregación de la presente invención se pueden fusionar a otra entidad, la cual puede impartir propiedades adicionales al mutante FGF21 de reducción de agregación. En una modalidad de la presente invención, un mutante FGF21 de reducción de agregación se puede fusionar a una secuencia IgG Fe, por ejemplo, SEQ ID NO: 11 o 171. Esta, fusión se puede lograr usando métodos biológicos moleculares conocidos y/o la guía proporcionada en este documento. Los beneficios de estos polipéptidos de fusión, así como también métodos para hacer estos polipéptidos de fusión, se plantean con más detalle en este documento . 6. Mutantes FGF21 Adicionales La descripción actual se refiere a varias formas mutantes de FGF21. Las mutaciones descritas pueden impartir una variedad de propiedades a una molécula FGF21. Por ejemplo, algunas de las mutaciones descritas pueden aumentar la vida media de FGF21 , y por ello aumentar sus propiedades terapéuticas.
En una modalidad, se ha determinado que la mutación A180E minimiza la degradación en el C terminal de la FGF21 madura. En consecuencia, la mutación A180E puede formar un elemento de una secuencia FGF21 mutante ya sea como una mutación sencilla o en combinación con otras mutaciones, como se describe en la presente.
En otra modalidad, se ha determinado que la mutación L98R minimiza la agregación y aumenta la solubilidad de la FGF21 madura. En consecuencia, la mutación L98R puede formar un elemento de una secuencia FGF21 mutante ya sea como una mutación sencilla o en combinación con otras mutaciones, como se describe en la presente.
En otra modalidad, se ha determinado que la mutación P171G minimiza la segmentación proteolitica de FGF21 madura. En consecuencia, la mutación P171G puede formar un elemento de una secuencia FGF21 mutante ya sea como una mutación sencilla o en combinación con otras mutaciones, como se describe en la presente.
Además, otras mutaciones descritas en la presente pueden aumentar la estabilidad de FGF21 al proporcionar sitios para la formación de enlaces disulfuro, proporcionando de esta manera estabilidad proteolitica aumentada, por ejemplo cuando FGF21 está dispuesto en' una formulación. Aún otras mutaciones descritas pueden proporcionar niveles incrementados o reducidos de O-glicosilación cuando FGF21 se expresa en levadura. Todavía otras mutaciones pueden romper puntos en los cuales las proteasas u otros ataques químicos pueden actuar en FGF21 para degradarlo, incluyendo la terminal C de FGF21. Otras mutaciones pueden impartir desaminación reducida. Y todavía otras mutaciones pueden reducir los niveles de la agregación de FGF21 y en consecuencia aumentar su solubilidad. Las mutaciones también pueden introducirse con objeto de servir como puntos de enlace para porciones de vida media extendida, tal como albúmina de suero humano, polietilen glicol (PEG) o una región constante IgG, como se describe en la presente. De varias maneras, estas mutaciones pueden mejorar la actividad in vivo o in vitro de FGF21 sobre FGF21 nativa. Como se describe en la presente, una o más mutaciones que imparten una o más propiedades deseadas pueden introducirse en una secuencia FGF21 para proporcionar un potenciador acumulativo de propiedades deseables.
En un ejemplo, residuos de cisteína sencillos o en pares pueden introducirse en varios puntos en la secuencia FGF21 para facilitar la formación de formación de enlace disulfuro. Los residuos de cisteina introducidos también pueden servir como sitios para PEGilación. El enlace disulfuro que se presenta naturalmente entre C75 y C93 puede mantenerse intacto, o romperse y formarse un nuevo enlace disulfuro entre C75 o C93 y un residuo de cisteina introducido. Los ejemplos de posiciones en las cuales una cisteina puede sustituirse por un residuo de tipo natural se resumen en la Tabla 2: Tabla 2 Mutaciones de cisteina Posición Tipo natural Mutación introducida 18 Q C 19 R C . 20 Y C 21 L c 22 Y c 23 T c 24 D c 25 D 'C 26 A c 27 Q c 28 Q c 29 T c 30 E · c 31 A c 33 L Posición Tipo natural Mutación introducida 35 I C 36 R C 37 E C 38 D ¦ C 39 G C 40 T C . 41 V 42 G c 43 G c 44 A c 45 A c 46 D c 47 Q c 48 S c 49 P c 50 E c 54 Q ' c 56 K c 57 A c . 58 L c 59 K c 60 P c 61 G c 62 V r- 64 Q c 65 I 66 L c 67 G c 68 V c 69 K ' c Posición Tipo natural Mutación introducida 70 T C 71 S C 72 R C 73 F C 75 C C 76 Q C 77 R C 78 P C 79 D C 80 G C 81 A C 82 L C 83 Y C 84 G C 85 S C 86 L C 87 H C 88 F C 89 D C 90 P C 91 E c 92 A 93 C c 94 S 95 F r 96 R c 98 L c 99 L r 10C L C 101 E C Posición Tipo natural Mutación introducida 102 D C 103 G C 104 Y C 106 V C 107 Y c 108 Q C 109 S C 110 E C 111 A C 112 H C 113 G c¦ 114 L C 115 P C 116 L C 117 H C 118 L C 119 P C 120 G C 121 N c 122 K c 123 S c 124 P c 125 H 126 R 127 D c 128 P c 129 A 130 P c 131 R c 132 r* c Posición Tipo natural Mutación introducida 133 P C 134 A C 135 R C 137 L C 138 P C 139 L C 140 P C 152 I C 153 L C 154 A C 163 S C 167 S C Los residuos de cisteina introducidos pueden facilitar la formación de enlaces disulfuro producidos por ingeniería. Tales enlaces disulfuro pueden aumentar la estabilidad de un polipéptido FGF21, incluyendo la estabilidad de la molécula bajo condiciones concentradas, tal como en una formulación terapéutica. Los ejemplos de pares de enlace disulfuro producidos por ingeniería incluyen aquellos mostrado en la Tabla 3: Tabla 3 Enlaces disulfuro producidos por ingeniería Posición de Residuo Enlace disulfuro Formado con una Cisteina Tipo Cisteina Introducida o que se Introducida Natural Presenta Naturalmente en la Posición 19 R 138 20 Y 139 21 L 33 22 Y 137, 139 23 T 25, 28 24 D 135 25 D 23, 122 26 A 122 27 Q 123 28 Q 28, 43, 124 31 A 43 33 L 21 35 I 84 41 V 82 42 G 124, 126 43 G 28, .31, 124 50 E 69 54 Q 66 58 L 62 62 V 58 66 L 54 67 G 72, 135 69 K 50 72 R 67, 84 73 F 93 Posición de Residuo Enlace disulfuro Formado con una Cisteina Tipo Cisteina Introducida o que se Introducida Natural Presenta Naturalmente en la Posición 75 C 85, 92 76 Q 109 77 R 79, 81 79 D 77 80 G 129 81 A 77 82 L 41, 119 84 G 35, ¦ 72 85 S 75 90 P 92 92 A 90 ¦ 93 C 73 94 S 110 95 F 107 100 L 102 102 D . 100, 104 104 Y 102 107 Y 95 109 S 76 110 E 94 115 P 117 ' 117 H 115, 129, 130 118 L 132, 134 119 P 82 · 121 N 127 122 K 25, 26 123 S 27, 125 124 P 28, 42, 43 Posición de Residuo Enlace disulfuro Formado con una Cisteina Tipo Cisteina Introducida o que se Introducida Natural Presenta Naturalmente en la Posición 125 H 123 126 R 42¦ 127 D 121, 132 129 A 80, 117 130 P 117 132 G 118, 127 134 A 118 135 R 24, 67 137 L 22 138 P 19 139 L 20, 22 152 I 163 163 s 152 La selección de uno o más pares de residuos para mutación a cisteina con la meta de producir por ingeniería un enlace disulfuro que no se encuentra en FGF21 tipo natural puede basarse en un análisis de un modelo tridimensional de FGF21. Por ejemplo, un enfoque de proteina racional producida por ingeniería puede usarse para identificar residuos apropiados en FGF21.para mutación. Esto puede alcanzarse por inspección de una estructura de cristal de rayos X (1.3 Á) de alta resolución FGF19 (1PWA) obtenida del Banco de Datos de Proteína (PDB), que puede entonces usarse para crear un modelo de homología en 3D de FGF21 usando, por ejemplo, el software de modelado MOE (Ambiente Operativo Molecular; Chemical Computing Group; Montreal, Quebéc, Canadá) . La FGF19 es una plantilla útil, ya que entre las proteínas depositadas en la PDB, FGF19 es la proteina más cercanamente relacionada a FGF21 en términos de la homología de secuencia de aminoácido .
En otro aspecto, las mutaciones adicionales pueden introducirse en la secuencia FGF21 con objeto de aumentar la estabilidad de FGF21 bajo condiciones de soluciones altamente concentradas o componentes de formulación comunes tal como fenol, m-cresol, metilparaben, resorcinol y alcohol bencílico. Los ejemplos de las mutaciones que pueden proporcionar la propiedad de estabilidad aumentada incluyen aquellos mostrados en la Tabla 4: Tabla 4 Mutaciones de Estabilidad Aumentada Posición Tipo natural Mutaciones introducidas 42 G D, E, R, K, H, S, T, N , Q 54 Q · D, E, R, K, H, S, T, N , Q 77 R D, E, R, K, H, S, T, N, Q 81 A D, E , R, K, H, S, T, , Q 86 L D, E, R, K, H, S, T, N , Q 88 F D, E, R, K, H, S, T, N, Q 122 K D, E, R, K, H, S, T, N, Q 125 H D, E, R, K, H, S, T, N, Q Posición Tipo natural Mutaciones introducidas 126 R D, E, R, K, H, S, T, N, Q 130 P D, E, R, K, H, S, T, N, Q 131 R D, E, R, K, H, S, T, N, Q 139 L D, E, R, K, H, S, T, N , Q 145 A D, E, R, K, H, S, T, N, Q 146 P D, E, R, K, H, S, T, , Q 152 I D, E, R, K, H, S, T, N, Q 154 A D, E, R, , H, S, T, , Q 156 Q D, E, R, K, H, S, T, N , Q 161 G D, E, R, K, H, S, T, N, Q 163 S D, E, R, K, H, S, T, N, Q 170 G D, E, R, , H, S, T, N, Q 172 S D, E, R, , H, S, T, N, Q La selección de. uno o más pares de residuos para mutación a una mutación que aumenta la estabilidad puede basarse en un análisis del modelo tridimensional de FGF21. Por ejemplo, un enfoque producido por ingeniería de proteína racional puede usarse para identificar residuos apropiados en FGF21 para mutación. Esto puede alcanzarse por inspección de una estructura de cristal de rayos X (1.3 Á) de alta resolución FGF19 (1P A) obtenida del Banco de Datos de Proteína (PDB), que puede entonces usarse para crear un modelo de homología . en 3D de FGF21 usando, por ejemplo, el software de modelado MOE (Ambiente Operativo Molecular; Chemical Computing Group; Montreal, Quebéc, Canadá) . La FGF19 es una plantilla útil, ya que entre las proteínas depositadas en la PDB, FGF19 es la proteína más cercanamente relacionada a FGF21 en términos de la homología de secuencia de aminoácido.
En otro aspecto, las mutaciones adicionales pueden introducirse en la secuencia FGF21 con objeto de reducir el grado de la segmentación proteolítica de un polipéptido FGF21 bajo algunas condiciones. Los ejemplos de las mutaciones que pueden proporcionar la propiedad de resistance a la segmentación proteolítica incluyen aquellas mostradas en la Tabla 5: Tabla 5 Mutaciones de Resistencia a la Proteól Posición Tipo Mutaciones Introducidas natural 19 R Q, i, K. 20 Y H, L, F 21 L I, F, Y, V 22 Y I, F, V 150 P A, R 151 G A, V 152 I H, L, F, V 170 G A, N, D, C, Q, E, P, S 171 P A, R, N, D, C, E, Q, G, H, K, S, T, W, Y 172 S L, T Posición Tipo Mutaciones Introducidas natural 173 Q R, E En un aspecto adicional, las mutaciones adicionales pueden introducirse en la secuencia FGF21 con objeto de inhibir la agregación de un . polipéptido FGF21 bajo algunas condiciones, tales como alta concentración. Los ejemplos de las mutaciones que pueden proporcionar la propiedad de inhibir la agregación de FGF21 incluyen aquellas mostradas en la Tabla 6: Tabla 6 Mutación que reduce las Agregaciones Posición Tipo Natural Mutación 26 A E, K, R 45 A E, K, R, Q, T 52 L T 58 L C, E, S 60 P A, E, K, R 78 P A, C, H, R 86 L¦ C T 88 ¦ F A, E, K, R, S 98 L C, E, K, Q, R 99 L C, D, E, R 111 A K, T 129 A D, E, H, K, N, R, Q 134 A E, H, K, Y En un aspecto adicional, las mutaciones adicionales pueden introducirse en la secuencia FGF21 con objeto de inhibir degradación en el C terminal de un polipéptido FGF21. En algunas modalidades, los mutantes FGF21 que resisten la degradación en el C .terminal comprenden una "tapa" que comprende uno o más residuos que se agregan a la serina en la posición 181, extendiendo de esta manera la longitud del mutante FGF21 más allá de su longitud de tipo natural de 181 residuos. Una tapa puede comprender cualquier número de residuos, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos. Cualquiera de los residuos puede emplearse en una tapa incluyendo leucina, glicina, serina y prolina. Una tapa no necesita comprender sólo residuos de un tipo sencillo de aminoácido, pero también puede comprender una combinación de residuos, tal como 1, 2·, 3, 4, o 5 residuos de glicina y/o 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de serina y/o 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de prolina y/o 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de leucina. Los ejemplos de las mutaciones que pueden proporcionar la propiedad de resistencia a la degradación en el C terminal de FGF21 incluyen aquellos mostrados en la Tabla 7: Tabla 1 Mutantes Resistentes a la Degradación en el C terminal i Posición I Tipo Natural | Mutación I I 180 A E, P, S 181 S G, P, K, T, A, L, P 179 Y P, G, S, A En un aspecto adicional, las mutaciones adicionales pueden introducirse en ' la secuencia FGF21 que pueden proporcionar un sitio para glicosilación mediada por transferasa GalNAc en la cual una GalNAc se agrega y sirve como un punto para glicosilación O. La siguiente lista de las mutaciones incluye tanto mutantes de punto asi como secuencias de mutaciones consecutivas y no consecutivas, y una GalNAc se agregará a un residuo S o T. Los ejemplos de las mutaciones que pueden proporcionar un sitio para glicosilación mediada por transferasa GalNAc de FGF21 incluyen aquellos mostrados en la Tabla 8; en la Tabla 8, cuando se proporcionan las secuencias de aminoácidos múltiples, los mutantes de punto se resaltan en negrita y se subrayan : Tabla 8 Mutantes de Glicosilación mediada por Transferasa GalNAc Posición Tipo Natural Mutación 1 H VT QT AT Posición Tipo Natural Mutación IAT 1, 3 H, I F, T A, T F,S A,S S,T 3 I T, S 5-7 DSS TQA TAQ TIE 5 D S, T 9-12 LLQF TTQF TINT TQGA TQGF TTVS TQAF 45-50 ADQSPE ATQSPE ATESPE ATETPE VTQSPE VTETPE ATESPA 50-53 ESLL TSLL TVS TINT Posición Tipo Natural Mutación TQAL TQGA 59-64 KPGVIQ SPTVIQ APTVIQ SPTTVS SPTINT SPTQAQ SPTQGA SPTVIA APTTVS APTINT 77-83 RPDGAL SPTGALY APTGALY SPTINTY SPTTVSY SPTQALY APTQALY SPTQGAY SPTQGAM 85-89 SLHFD SLTFT SLTET SVTET 112 H T 111-114 AHGL ATGT ATET VTET 30 Posición Tipo Natural Mutación ATGL 116-118 LHL TQA TAQ TEI TSS TAL 112-118 HGLPLHLP SGLPTQA SGLPTEI 120-125 GNKSPH TTAVPH TSGEPH GSTAPH GNSTPH GTESPH LTQTPH LTQTPA T ASPH TQGSPH VTSQPH TINTPH TSVSPH 31 Posición Tipo Natural Mutación 122-131 KSPHRDPAPR KSPTAQPAPR KSPTADPAPR ASPTAQPAPR SSPTADPAPR KSPTSDPAPR KSPTEIPAPR KSPTEDPAPR ASPTEDPAPR SSPTADPAPR SSPTAQPAPR KSPTQAPAPR SSPTQAPAPR ASPTEIPAPR KSPHRDPTPR KS PHRDPTPA KSPHRDPSPR KSPHSDPTPA KSPHADPTPS KSPHADPTPA 131-137 RGPARFL RGPTSFL RGPTSGE RGPGSTA RGPANTS RGPATES RGPATQT RGPLTQT RGPTQFL RGPTSFL RGPVTSQ Posición Tipo Natural Mutación SGPTSFL AGPTSGE SGPTSAL 135-139 RFLPL. RFLPT RFLPS SFLPT 148 E T, S 151 G T 151-156 GILAPQ TTLAPQ TQLAPQ TSGEPQ GSTAPQ TTAVPQ GNTSPQ GTESPQ GTETPQ VTSQPQ LTQ PQ VTSQPQ SSGAPQ TINTPQ TTVSPQ TQAAPQ GILAPT GILAPS 156 Q T, s Posición Tipo Natural Mutación 159 D T 159-164 DVGSSD DVGTET DAASAA DAATAA DVGTSD DVATSD TGDSSD TDASGA DVGTSG 164 D ' T 166 L T 166-170 LSMVGP TSGAM TQGAM TQGAM 172-176 SQGRS SQGAS TQGAS TQGAM 175 R A 175-181 RSPSYAS RSPTSAVAA ASPTSAVAA ASPSSGAPPPS ASPSSGAPP ASPSSGAP RSPSSGAPPPS ASPTINT ASPTSVS ASPTQAF Posición Tipo Natural Mutación ASPTINTP En contraste con la Tabla 8, las mutaciones adicionales pueden introducirse en la secuencia FGF21 que pueden proporcionar una capacidad reducida para glicosilacion 0, con relación a la secuencia FGF21 de tipo natural, cuando FGF21 se expresa en levadura. La siguiente lista de las mutaciones includes tanto mutantes de punto asi como secuencias de mutaciones consecutivas y no consecutivas. Los ejemplos de las mutaciones que se pueden proporcionar para glicosilacion 0 reducida, con relación a la secuencia FGF21 de tipo natural, cuando la secuencia FGF21 se expresa en levadura incluyen la S167A, S167E, S167D, S167N, S167Q, S167G, S167V, S167H, S167K y S167Y.
Tabla 9 Mutantes Resistentes a la Glicosilacion O Posición Tipo Natural Mutante de glicosilacion 0 167 S A,E,D,N,Q,G,V,H,K,Y 7. Mutantes de Combinación FGF21 Como se describe en este documento, la secuencia FGF21 de tipo natural posee varias propiedades que pueden plantear retos significativos cuando FGF21 se usa como una molécula terapéutica. Entre estos retos están la susceptibilidad a la degradación de la proteina y su propensión a la agregación en una alta concentración. Después de un esfuerzo exhaustivo para identificar los polipéptidos FGF21 que superan cada uno de estos retos, se realizó un estudio dirigido para determinar si las sustituciones de aminoácido que confieren resistencia a la proteólisis y aquellas que confieren propiedades de reducción de agregación se pudieran combinar en una forma de aditivo o sinérgica en una secuencia de polipéptidos individual mientras que mantienen los niveles de actividad que son iguales a o mayores que la actividad del FGF21 de tipo natural. Esto representa un reto significativo, ya que se sabe en el campo que la introducción de múltiples mutaciones en un polipéptido proporcionado algunas veces puede afectar adversamente la expresión, actividad, y manufactura subsecuente de la proteína.
Sorprendentemente, como se demuestra en, por ejemplo, los Ejemplos 19 y 20, se descubrió que las propiedades deseables de varios mut.antes FGF21 de hecho se podrían combinar en una forma de aditivo o sinérgica para genera un mutante FGF21 que tiene propiedades farmacéuticas mejoradas. Se dan a conocer en este documento mutantes FGF21 que son resistentes a la proteólisis, tienen una velocidad reducida de agregación, y los cuales aún retienen la actividad que es la misma como, o mayor que, el FGF21 de tipo natural.
Un criterio de selección para identificar mutantes de combinación FGF21 deseables fue que la actividad del mutante FGF21 es similar a, o mayor que, la actividad del FGF21 de tipo natural. Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se dirige á mutantes FGF21 que son resistentes a la proteólisis y tienen propiedades de agregación reducidas mientras que aún retienen una actividad FGF21 que es similar a, o mayor que, FGF21 de tipo natural. Aunque menos deseables en algunos casos, los mutantes FGF21 que son resistentes a la proteólisis y tienen propiedades de agregación reducidas pero exhiben de alguna manera una actividad FGF21 disminuida forman otra modalidad de la presente invención. En algunos casos, puede ser deseable mantener un grado de proteólisis y/o agregación, y consecuentemente, los mutantes .FGF21 que permiten algún grado de proteólisis y/o agregación también forman otra modalidad de la presente invención.
Como con todos los mutantes FGF21 de la presente invención, los mutantes de combinación FGF21 de la presente invención se pueden preparar como se describe en este documento. Aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo, familiarizadas con las técnicas de biología molecular estándares, pueden emplear ese conocimiento, acoplado con la descripción actual, para hacer y usar los mutantes de combinación FGF21 de la presente invención. Se pueden usar técnicas estándares para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótidos , cultivo' de tejidos, y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia para cualquier propósito. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de. purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante como se logra comúnmente en el campo, o como es describe en este documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en. el campo. Se pueden usar técnicas estándares para síntesis químicas; análisis químico; preparación farmacéutica, formulación y suministro; y tratamiento de pacientes.
Los mutantes de combinación FGF21 de la presente invención se pueden fusionar a otra entidad, la cual puede impartir propiedades adicionales al mutante de combinación. En una modalidad de la presente invención, un mutante de 38 combinación FGF2Í se puede fusionar a una secuencia IgG Fe, por Posicnió ejemplo, SEQ ID NO: 11 o 171. Esta fusión se puede lograr natural usandop Tiométodos biológicos moleculares conocidos y/o la guia proporcionacidasda en este documento. Los beneficios de estos Introdu¬ Cisteasín polipéptidos dedad fusión, asi como también métodos para hacer st Eabilestos polipéptidosed de fusión, se plantean con más detalle en uts Mante este documento. lisis roteó P- Los ejemplos de las edmutaciones que pueden introducirse Mutatsne en una secuencia FGF21 ya sea como una mutación de punto o ción como una combinación de dos ogge Aramás mutantes de punto se ed uts Mante resumen en la Tabla 10: osicioes Pn yse Cn esd Riuos Entre isulo Dfur Tabla 10 Enlaces educdsRio Mutaciones de Punto FGF21 Resumidas terminal eenlC geradacónDi Mutatesden Reducidos acióln cGliosi- 1 utadentes M H 2 P 3 I 4 P 5 D 6 S 7 s 8 P 9 L 10 L 11 Q 12 F Mutantes de Glicosi- lación Reducidos Mutantes de Degradación en el C terminal Reducidos Enlaces Disulfuro Entre Residuos s\ ro Cys en ro ro ro ro ro Posiciones ro f Mutantes de Agregación -tí ? Mutantes > ' 133971, de > Proteó- > 2285, 1 ti? ti? lisis Ó ¾ Mutantes 23221, a? co OI de í x z" EstabiliQ E-? dad Cisteínas Introdu2834,, cidas u U L) ? u ? u ? O o 124 O O CJ u ? ? O U O O O U o Tipo natural O O o> > ce OI c¿ Q Q : O OI ta ? 1 ce ? Q O > O Posición ro o m r- en o en o ro ro ro ro ro ro ro ro LT) O O CM 6 12124, 2831,, Mutantes de Glicosi- lación Reducidos Mutantes de Degradación en el C terminal Reducidos Enlaces Disulfuro Entre co Residuos Cys en r- Posiciones -0 en Mutantes Ó¡ de í¿ Agrega¬ _ ? o ción E H Mutantes de Proteó- lisis Mutantes de id se Z EstabiliQ lii H dad Cisteínas Introducidas O O o U O u O O U u j O O Tipo natural < < Q a OJ ? co O e a. > > í¿ í? 00 cC Posición co cr> o r LO co o oo o L LO O O 235 71, Mutantes de Glicosi- lación Reducidos Mutantes de Degradación en el C terminal Reducidos 8925, Enlaces Disul furo Entre 7981, Residuos s> o r- Cys en o r- m r o Posiciones l r- r— r- Mutantes C C¿ de ac ¡¿ AgregaO E ? ción < d ? Mutantes de · Proteó- l isis 9 4111, Mutantes a tí o CC w o OS o O crT co o > H de tJ _C 2 tí a: z üí 2 ? z < i 5 Q Estabil iQ i¿ Q i d i¿ & Z dad 2 357, Cisteinas Introducidas o O cj ? u o U u O O O o O Tipo natural c CC a o < >< o ? ? < O CC Posición co o m í~ n f r~~ r - r- co co \ Mutantes de Glicosi- lación Reducidos Mutantes de Degradación en el C terminal Reducidos Enlaces Disulfuro Entre Residuos Cys en \l Posiciones n Mutantes de Ó¡ i¿ ? Agrega?" o" !H c ión en o cá u 00 1014, Mutantes de Proteó- l isis Mutantes o o-" í O de co > ? í ? a: ?G Estabil i¬ 6¡ 2 O cC en O _¿ H dad Cisteínas Introducidas o o U u o ? O O U o o ? O o U O O ? U O O u Tipo natural ? ? Q o Z > o co ? < ac o a· -C J CU ¦z Pos ición r o 5 11129,, 301 323 114, 2526, Mutantes de Glicosi- lación Reducidos Mutantes de Degradación en el C terminal 22571, Reducidos 2 284,, Enlaces 3 4 Disulfuro Entre Residuos Cys en Posiciones Mutantes de ai _¿ Agregac ión Q z" fcj Mutantes 232 111, de Proteó- lisis 80711, Mutantes C¿ ¡¡ C O Di O Z tú ¾ o oo o> de ? a: z ? ac z ? se z Q Í¿ ? -c z Estabil i ü Ü H Q i¿ H Q _¿ CX Di D ¿ h dad Cisteinas Int roducidas o <J O j o O o o o o O o o O O ? O Tipo natural cu 05 Q Qj < Qj OS e> Qj < os Qj 0 O Qj Qj Posición ro m r- 2817 11, ro s o ro ro ro ro ro c ro ro ro ro LO 2674, 22 20, Mutantes de Glicosi- lación Reducidos Mutantes de Degradación en el C terminal Reducidos Enlaces Di sulfuro Entre Residuos r Cys en Posiciones Mutantes de Agregación Mutantes de > Proteó- lisis¦ > < Mutantes c¿ co O c¿ O C¿ CO H ? n tu d Q co O 10 ü de ? x 2 ? x 2 ? 2 ti co a s CU S J ?? X 2 ? x 2 Estabili¬ Q í¿ E-« Q ¿¿ EH a _¿ E-< o c 3 2 a o > 2 ? ^ H O t¿ E dad Cisteínas Introducidas o o ? Tipo natural < Ol Oí ? a, a, U J— t < Cu O Ol Cu Q > Posición m c- co o \J n o ir> m m in a") m m t 1 -l <— 1 LO O M Mutantes de Glicosi- D ? >H lación tí 6¡ Í¿ Reducidos > K Mutantes de Degradación en el C terminal Reducidos Enlaces Disulfuro Entre Residuos Cys en Posiciones Mutantes de Agrega¬ '-? ción en Mutantes O de Q z" EH Proteó- c¿ ? co H ? ¦ l isis z ? o c O ac i¿ >H ?J ¾ Mutantes a m e ra a O O ?- S n; ra o ce. ra O de ? ai z ? i z ? s i s o" cu ? ai z Cií -C z* Estabili¬ Q t¿ H a i¿ H a. z > H -u ce J Q ¡tí H O _ < dad Cisteinas Introducidas o ? Tipo natural O co Q co 2 > 0- o ce Posición n o n r- O sicióPon tuaarln 177 P po Ti A 178 S dasci 179 Y troduIn- P, G, S, A st Ceínasi 180 A G, E, P, S dad 181 S Gtabili EsG, P, K, T, de utantes M A, L, P sisli oteó Pr- 8. Proteínas de Fusión FdeGF21 tat Munes Como se usa en · este documento, el término "polipéptido ócni de fusión FGF21" o "proteína deggera Afusión FGF21" se refiere a de ates Mutn una fusión de uno o más residuos de aminoácido (tal como una oicioes Psn ye Csn proteína o péptido heterólógo) en el N tiduos Reserminal o terminal C etr En ulfuo Disr de cualquier mutante de polipéptido FGF21 aces Elndescrito en este documento . eucidosRd aterminl eelCn Los péptidos y polipéptidos heterólogos inclgueradacióDnyates Mutndeen, pero no se limitan a, un epítopo para permitir la deteccióucidosRedn y/o aciónl cosGili-aislamiento de un mutante de polipéptido FGF21; una proteíatese Mutndna del receptor de transmembrana o una porción de la misma, tal como un dominio extracelular o un dominio transmembrana e intracelular; un ligando o una porción del mismo el cual se enlaza a una proteína del receptor transmembrana; una enzima o porción de la misma que es catalíticamente activa; un polipéptido o péptido el cual promueve la oligomerización, tal como un dominio de cremallera de leucina; un polipéptido o péptido el cual incrementa la estabilidad, tal como una región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, un dominio Fe) ; una secuencia que extiende la vida media que comprende una combinación de dos o más (por ejemplo, 2, 5, 10, 15, 20, 25, etc) aminoácidos cargados y/o no cargados que se presentan naturalmente o que no se presentan naturalmente (por ejemplo, Serina, Glicina, Ácido Glutámico o Aspártico) diseñados para formar un compañero de fusión predominantemente hidrofilico o predominantemente hidrofóbico para un mutante FGF21; un anticuerpo funcional o no funcional, o una cadena pesada o ligera del mismo; y un polipéptido el cual tiene una actividad, tal como una actividad terapéutica, diferente de los mutantes del polipéptido FGF21 de la presente invención. También se abarcan por la presente invención los mutantes FGF21 fusionados a la albúmina de suero humana (HSA) .
Las proteínas de fusión FGF21 se pueden hacer al fusionar secuencias het'erólogas en ya sea la terminal N o en el C terminal de un mutante de polipéptido FGF21. Como se describe en este documento, una secuencia heteróloga puede ser una secuencia de aminoácidos o un polímero que no contiene aminoácidos. Las secuencias heterólogas se pueden fusionar ya sea directamente al mutante del polipéptido FGF21 o por la vía de una molécula ligadora o adaptadora. Una molécula ligadora o adaptadora puede ser uno o más residuos de aminoácido (o -mers) , por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 residuos (o -mers) , preferiblemente de 10 a 50 residuos de aminoácido (o -mers), por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 residuos (o -mers) , y más preferiblemente de 15 a 35 residuos de aminoácido (o -mers) . Una molécula ligadora o adaptadora también se puede diseñar con un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa para permitir la separación de las porciones fusionadas. a. Fusiones Fe En una modalidad de la presente invención, un mutante de polipéptido FGF21 se fusiona a un dominio Fe, por ejemplo, uno o más dominios de una región Fe de IgG humano. Los anticuerpos comprenden · dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", que se enlaza a un antigeno, y un dominio constante conocido como "Fe", que se implica en las funciones efectoras tal como activación de complemento y ataque por células fagociticas. Un Fe tiene una vida media en suero larga, mientras que un Fab es de corta duración (Capón y colaboradores, 1989, Nature 337: 525-31) . Cuando se unen junto con una proteina terapéutica, un dominio Fe puede proporcionar vida media más prolongada o incorporar estas funciones como el enlace del receptor Fe, enlace de proteina A, fijación de complemento, y tal vez a un transferencia placentaria (Capón y colaboradores, 1989) .
El análisis farmacocinético in vivo indica que el FGF21 humano tiene una vida media corta de alrededor de 1 hora en ratones debido a la rápida eliminación y degradación in vivo. Por lo tanto, para prolo.ngar la vida media del FGF21 se fusionó una secuencia Fe al extremo en el N terminal o C del polipéptido FGF21. La fusión de una región Fe al FGF21 de tipo natural, en particularmente el Fe fusionado a la terminal N del FG.F21 de tipo natural, no prolonga la vida media como se espera, sin embargo esta observación lleva a una investigación de la degradación proteolitica del FGF21 in vivo y a la identificación de los mutantes FGF21 que fueron resistentes a esta degradación. Estos mutantes se describen en, por ejemplo, los Ejemplos 8 y 11, y exhiben vidas medidas más prolongadas que el FGF21 de tipo natural. Estas y otras proteínas de fusión FGF21 forman modalidades de la presente invención.
A lo largo de la descripción actual, Fc-FGF21 se refiere a una proteína de fusión en la cual la secuencia Fe se fusiona a la terminal N de FGF21. Similarmente, por toda la descripción, FGF21-Fc se refiere a una proteína de fusión en la cual la secuencia Fe- se fusiona al C terminal de FGF21.
La proteina de fusión FGF21 resultante se puede purificar, por ejemplo, mediante el uso de una columna de afinidad de proteina A. Los péptidos y proteínas fusionados a una región Fe se han descubierto que exhiben una vida media sustancialmente mayor in vivo que la contraparte no fusionada. También, una fusión en la región Fe permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión. La región Fe puede ser una región Fe de origen natural, o se puede alterar para mejorar ciertas cualidades, tales como cualidades terapéuticas, tiempo de circulación o agregación reducida. En un ejemplo una región Fe es una Fe IgGl, por ejemplo, SEQ ID NO: 11, y en otro, una región Fe es una Fe IgG4, por ejemplo, . SEQ ID NO:171.
Modificaciones útiles de agentes terapéuticos proteínicos por la fusión con el dominio "Fe" de un anticuerpo se plantean con detalle en la Publicación Internacional No. WO 00/024782, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. b. Ligaduras de Proteina de Fusión Al formar las proteínas de fusión de la presente invención, una ligadura puede, pero no necesita, emplearse. Cuando está presente, la estructura química de la ligadura puede ser no critica, puesto que sirve principalmente como un espaciador. La ligadura puede estar constituida de aminoácidos ligados conjuntamente por enlaces de péptido. En algunas modalidades de la presente invención, la ligadura está constituida desde 1 a 20 aminoácidos ligados por enlaces de péptido, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos de origen natural. En varias modalidades, se selecciona de 1 a 20 aminoácidos de los aminoácidos de glicina, serina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. En algunas modalidades, una ligadura está constituida de una mayoría de aminoácidos que son estéricamente no impedidos, tal como glicina y alanina. En algunas modalidades, las ligaduras son poliglicinas (tal como (Gly)4 (SEQ ID. NO:29) y (Gly)5 (SEQ ID NO:30)), polialaninas , combinaciones de glicina y alanina (tal como poli (Gly-Ala ) ) , o combinaciones de glicina y serina (tal como poli (Gly-Ser) ) . Otros ligaduras adecuados incluyen: (Gly) 5-Ser- (Gly) 3-Ser- (Gly)4-Ser (SEQ ID NO:28), (Gly) 4-Ser- (Gly ) 4-Ser- (Gly ) 4-Ser (SEQ ID NO:31), (Gly) 3-LyS- (Gly ) 4 (SEQ ID NO:32), (Gly)3-Asn-Gly-Ser- (Gly) 2 (SEQ ID NO:33), (Gly ) 3-CyS- (Gly) 4 (SEQ ID NO:34), Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO:35), Gly-Ser (Gly4Ser) 3 ( SEQ ID NO:166), (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:167), (Gly4S)2 (SEQ ID NO: 168), DAAAKEAAAKDAAAREAAARDAAAK (SEQ ID NO: 169), NVDHKPSNTKVD R (SEQ ID NO: 170). Aunque una ligadura de 15 residuos de aminoácido se ha descubierto que funciona particularmente bien para las proteínas de fusión FGF21, la presente invención contempla ligaduras de cualquier longitud o composición. En la presente descripción, cuando se empleó una ligadura para unir una secuencia heteróloga, tal como un dominio Fe, y un polipéptido FGF21 o mutante FGF21, la ligadura se expresa entre paréntesis..
Las ligaduras descritas en este documento son ejemplares, y las ligaduras que son mucho más grandes y las cuales incluyen otros residuos se contemplan por la presente invención. Las ligaduras no de péptido también se contemplan por la presente invención. Por ejemplo, las ligaduras de alquilo tal como -NH- (CH2) s-C (O) -, en donde s = 2 a 20, se podrían usar. Estas ligaduras de alquilo se pueden sustituir adicionalmente por cualquier grupo no estéricamente impedido, que incluye, pero no se limita a, un alquilo inferior (por ejemplo, C1-C6) , acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2, o fenilo. Una ligadura no de péptido ejemplar es una ligadura de polietilenglicol , en donde la ligadura tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, por ejemplo, 100 a 500 kD. 8. Mutantes FGF21 Químicamente Modificados Las formas químicamente modificadas de los mutantes de polipéptido FGF21 descritos en este documento, que incluyen las formas truncadas de FGF21 descritas en este documento, se pueden preparar para una persona experta en el campo, dadas las descripciones descritas en este documento. Estos mutantes FGF21 químicamente modificados se alteran de tal manera que el mutante FGF21 químicamente modificado es diferente del mutante FGF21 no modificado, ya sea en el tipo o ubicación de las moléculas unidas naturalmente al mutante FGF21. Los mutantes FGF21 químicamente modificados pueden incluir moléculas formadas por la supresión de uno o más grupos químicos naturalmente unidos.
En una modalidad, los mutantes de polipéptido FGF21 de la presente invención' se pueden modificar por la unión covalente de uno o más polímeros. Por ejemplo, el polímero seleccionado es típicamente soluble en agua de modo que la proteína a la cual se une no se precipita en un medio ambiente acuoso tal como un medio ambiente fisiológico. Se incluye dentro del alcance de los polímeros adecuados una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para el uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Los polímeros solubles no en agua conjugados a los mutantes de polipéptido FGF21 de la presente invención también forman un aspecto de la invención.
Cada uno de los polímeros ejemplares puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Cada uno de los polímeros tiene típicamente un peso molecular promedio de entre alrededor de 2 kDa a aproximadamente 100 kDa (el término "alrededor de" indica que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más y algunas menos que el peso molecular establecido) . El peso molecular promedio de cada polímero está preferiblemente entre alrededor de 5 kDa y alrededor de 50 kDa, más preferiblemente entre alrededor de 12 kDa y alrededor de 40 kDa, y mucho · más preferiblemente entre alrededor de 20 kDa y alrededor de 35 kDa.
Los polímeros solubles en agua adecuados o mezclas de los mismos incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos ligados en N o ligados en O, azúcares, fosfatos, polietilenglicol (PEG) (incluyendo las formas de PEG que se han usado para modificar proteínas, que incluyen mono- (Ci~ Cio) , alcoxi-, o ariloxi-polietilenglicol), monometoxi-polietilenglicol , dextrano (tal como dextrano de peso molecular bajo de, por ejemplo, alrededor de 6 kD) , celulosa, u otros polímeros basados en carbohidratos, poli- (N-vinil-pirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), y alcohol polivinílico . También se abarcan por la presente invención moléculas reticuladoras bifuncionales que se pueden usar para preparar multimeros de mutante de polipéptido FGF21 covalentemente unidos. También se abarcan por la presente invención mutantes FGF21 covalentemente unidos a ácido polisiálico.
En algunas modalidades de la presente invención, un mutante FGF21 se modifica covalente o químicamente para incluir uno o más polímeros solubles en agua, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol , (PEG), polioxietilenglicol, o polipropilenglicol . Véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 4,640,835; 4, 496, 689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; y 4,179,337. En algunas modalidades de la presente invención, un mutante FGF21 comprende uno o - más polímeros, que incluyen pero no se limitan a, monometoxi-polietilenglicol , dextrano, celulosa, otro polímero basado en carbohidratos, poli- (N-vinilpirrolidona) -polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol , un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles pol ioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol poliviní lico, o mezclas de estos polímeros.
En algunas modalidades de la presente invención, un mutante FGF21 se modifica covalentemente con subunidades de PEG. En algunas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se enlazan en una o más posiciones específicas (por ejemplo, en el N terminal) del mutante FGF21. En algunas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se unen aleatoriamente a una o más cadenas laterales de un mutante FGF21. En algunas modalidades, el. PEG se usa para mejorar la capacidad- terapéutica de un mutante FGF21. Ciertos de estos métodos son planteados,' por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6, 133, 426, la cual se incorpora por este documento a manera de referencia para cualquier propósito.
En modalidades de la ' présente invención en donde el polímero es PEG, el grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente, y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del grupo PEG variará preferiblemente de alrededor de 2 kD a alrededor de 100 kDa, y más preferiblemente de alrededor de 5. kDa a alrededor de 50 kDa, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, o 50 kDa. Los grupos PEG se unirán generalmente al mutante FGF21 por la medio de la acilación o alquilación reductora a través de un- grupo reactivo sobre la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol, o éster) a un grupo reactivo sobre el mutante FGF21 (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, o éster) .
La PEGilación de un polipéptido, que incluye los mutantes FGF21 de la presente invención, se puede llevar a cabo específicamente usando cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en' el campo. Estas reacciones se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Francis y colaboradores, 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10; Patentes Europeas Nos. 0 154 316 y 0 401 384; y la Patente de E.U.A. No. 4,179,337. Por ejemplo, la PEGilación se puede llevar a cabo por medio de una reacción de acilación o una reacción de alquiiación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se describe en este documento. Para las reacciones de acilación, un polímero seleccionado debiera tener un grupo éster reactivo individual. Para la alquiiación reducida, un polímero seleccionado debiera tener un grupo aldehido reactivo individual. Un aldehido reactivo es, por ejemplo, propionaldehído de polietilenglicol, el cual es estable en agua, o derivados de mono o ariloxi de 1 a 10 átomos de carbono de los mismos (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5, 252,714) .
En algunas modalidades de la presente invención, una estrategia útil para la unión del grupo PEG a un polipéptido implica combinar, a través de la formación de una ligadura conjugada en solución, un péptido y una porción de PEG, cada una lleva una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva hacia la otra. Los péptidos se pueden preparar fácilmente con síntesis de fase sólida convencional. Los péptidos se "pre-act ivan" con un grupo funcional apropiado en un sitio especifico. Los precursores se purifican y se caracterizan totalmente antes de reaccionar con la porción PEG. La ligación del péptido con PEG toma lugar usualmente en fase acuosa y se puede supervisar fácilmente por la HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados se pueden purificar fácilmente por la HPLC preparativa y se caracteriza por una HPLC analítica, análisis de aminoácidos y espectrometría de masas de desorción láser.
Los polímeros de polisacárido son otro tipo de polímero soluble en agua que se puede usar para la modificación de proteínas. Por lo tanto, los mutantes FGF21 de la presente invención fusionados a Un polímero de polisacárido forman modalidades de la presente invención. Los dextranos son polímeros de polisacárido que están comprendidos de subunidades individuales de glucosa enlazadas predominantemente por los enlaces alfa 1-6. El dextrano mismo está disponible en muchos intervalos de peso molecular, y está fácilmente disponible en pesos moleculares desde alrededor de 1 kD a alrededor de 70 kD. El dextrano es un polímero soluble en agua adecuado para el uso como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fe). Véase, por' ejemplo, Publicación Internacional No. WO 96/11953. Se ha reportado el uso de dextrano conjugado 1C9 con inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico. Véase, por ejemplo, Publicación de Patente Europea No. 0 315 456, la cual se incorpora en este documento a manera de referencia. La presente invención también abarca el uso de dextrano de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD.
En general, la modificación química se puede realizar bajo cualquier condición adecuada y usada para hacer reaccionar una proteína con una molécula de polímero activada. Los métodos para preparar polipéptidos químicamente modificados comprenderán generalmente las etapas de: (a) hacer reaccionar el polipéptido con la molécula de polímero activada (tal como un éter reactivo o derivado de aldehido de la molécula de polímero) bajo condiciones mediante las cuales un mutante de polipéptido ' FGF21 llega a ser unido a una o más moléculas de polímero, y (b) obtener los productos de reacción. Las condiciones de reacción óptimas se determinarán con base en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, mientras más grande es la relación de las moléculas de polímero a la proteína, .mayor es el porcentaje de la molécula de polímero unida. En una modalidad de la presente invención, los mutantes FGF21 químicamente modificados pueden tener una sola porción de molécula de polímero en la amino-terminal (véase, por ejemplo, la Patente de E.U.S. No. 5,234,784).
En otra modalidad de la presente invención, los mutantes de polipéptido FGF21 se pueden acoplar químicamente a la biotina. Los mutantes de polipéptido biotina/FGF21 luego se permiten enlazar a la avidina, dando por resultado mutantes de polipéptido avidina/biotina/FGF21 tetravalentes. Los mutantes de polipéptido FGF21 también se pueden acoplar covalentemente al dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los conjugados resultantes precipitados con el anti-DNP o anti-TNP-IgM para formar conjugados decaméricos con una valencia de 10.
Generalmente, las condiciones que se pueden aliviar o modular por la administración de los presentes mutantes FGF21 químicamente modificados incluyen aquellas condiciones descritas en este documento para los mutantes de polipéptido FGF21. Sin embargo, los mutantes FGF21 químicamente modificados dados a conocer en este documento pueden tener actividades adicionales, actividad biológica aumentada o reducida, u otras características, tal como vida media incrementada o disminuida, como es comparado con los mutantes FGF21 no modificados. 9. Composiciones Farmacéuticas de los mutantes FGF21 y Administración de los Mismos Las composiciones, farmacéuticas que comprenden los mutantes FGF21 están dentro del alcance de la presente invención, y se contemplan específicamente a la luz de la identificación de varias secuencias FGF21 mutantes que exhiben propiedades aumentadas. Tales composiciones farmacéuticas mutantes FGF21 pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un mutante de polipéptido FGF21 en mezcla con un agente de formulación farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable seleccionado por conveniencia con el modo de adminsitración . Los agentes de formulación aceptables preferiblemente son no tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.
La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, absorción, o penetración de la composición. Los agentes de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, . aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina, o lisina) , antimicrobianos, antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio, o hidrógeno-sulfito de sodio) , soluciones amortiguadoras (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, u otros ácidos orgánicos) , agentes de volumen (tal como manitol y glicina) , agentes quelantes (tal como ácido etilendiamin tetraacético (EDTA) ) , agentes formadores de complejo (tal como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina , o hidroxipropil-beta-ciclodextrina) , rellenadores , monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos (tal como glucosa, mañosa, o dextrinas), proteínas (tal como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas) , agentes colorantes, saborizantes y de dilución, agentes emulsionantes, polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona) , polipéptidos de peso molecular bajo, contraiones formadores de sal (tal como sodio), conservadores (tal. como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timorosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico, o peróxido de hidrógeno) , solventes (tal como glicerina, propilenglicol , o polietilenglicol ) , alcoholes de azúcar (tal como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensoactivos o agentes humectantes (tal como plurónicos; PEG; ésteres de sorbitan; polisorbatos tal como polisorbato 20 o polisorbato 80; tritón; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes mejoradores de la estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol), agentes mejoradores de tonicidad (tal como haluros de metal alcalino - preferiblemente cloruro de sodio o potasio - o manitol sorbitol) , vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (véase, por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed. , ack Publishing Company 1990), y ediciones subsecuentes de los mismos, incorporados en este documento a manera de referencia para cualquier propósito) .
La composición farmacéutica óptima se determinará por un técnico experto dependiendo, por ejemplo, de la vía propuesta de administración, formato de suministro, y dosificación deseada (véase, por ejemplo, Remington ' s Pharmaceutical Sciences, supra) . Tales composiciones pueden afectar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de eliminación in' vivo del mutante de polipéptido FGF21.
El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser ya sea acuoso o no acuoso en carácter. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado para la inyección puede ser agua, solución salina fisiológica, o líquido cefalorraquídeo artificial, suplementado posiblemente con otros materiales comunes en las composiciones para la administración parenteral. La solución salina amortiguada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplares comprenden solución amortiguadora Tris de aproximadamente pH. 7.0-8.5, o solución amortiguadora de acetato de alrededor de pH 4.0-5.5, las cuales pueden incluir además sorbitol o un substituto adecuado. En una modalidad de la presente invención, las composiciones mutantes de polipéptido FGF21 se pueden preparar para almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington ' s. Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Adicionalmente , el producto mutante de polipéptido FGF21 se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropiados tal como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas de mutante de polipéptido FGF21 se pueden seleccionar para el suministro parenteral. Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para la inhalación o .para el suministro a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia del campo.
Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que sen aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, las soluciones amortiguadoras se usan para mantener la composición en pH fisiológico o en un pH ligeramente más bajo, típicamente dentro de un intervalo de pH de alrededor de 5 a alrededor de 8.
Cuando la administración parenteral se contempla, las composiciones terapéuticas para el uso en esta invención pueden estar en la forma de una solución acuosa, parenteralmente aceptable, libre de pirógenos que comprende el mutante de polipéptido FGF21 deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable.. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual un mutante de polipéptido FGF21 se formula como una ' solución isotónica, estéril, apropiadamente conservada. Todavía otra preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, · partículas bioerosionables , compuestos poliméricos (tal como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlas, o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto el cual luego se puede administrar por la medio de una inyección de depósito. El ácido hialurónico también se puede usar, y este puede tener el efecto de promover una duración sostenida en la circulación. Otro medio adecuado para la introducción de la molécula deseada incluye dispositivos de suministro de fármaco implantables .
En una modalidad, una composición farmacéutica se puede formular para inhalación. Por ejemplo., un mutante de polipéptido FGF21 se puede formular como un polvo seco para inhalación. Las soluciones de inhalación de mutante de polipéptido FGF21 también se pueden formular con un propelente para el suministro en aerosol. En todavía otra modalidad, las soluciones se pueden nebulizar. La administración pulmonar se describe adicionalmente en la Publicación Internacional No. WO 94/20069, la cual describe el suministro pulmonar de proteínas químicamente modificadas.
También se contempla que- ciertas formulaciones se puedan administrar oralmente. En una modalidad de la presente invención, los mutantes de polipéptido FGF21 que se administran en esta forma se pueden formular con o sin esos portadores usados regularmente en la composición de formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula se puede diseñar para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Agentes adicionales se pueden incluir para facilitar la absorción del mutante de polipéptido FGF21. Diluyentes, sabori zantes , ceras de punto de fusión bajo, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de comprimidos, y aglutinantes también se pueden emplear.
Otra composición farmacéutica puede implicar una cantidad efectiva de mutantes de polipéptido FGF21 en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la manufactura de comprimidos. Al disolver los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, las soluciones se pueden preparar en forma de dosificación unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes tal como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tal como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Las composiciones farmacéuticas de mutante de polipéptido FGF21 adicionales serán evidentes para aquellas personas expertas en el campo, que incluyen formulaciones que implican mutantes de polipéptido FGF21 en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de liberación sostenida o controlada, tal como portadores de liposomas, microparticulas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también son conocidos por aquellas personas expertas en el campo (véase, por ejemplo, Publicación International No. WO 93/15722, la cual describe la liberación controlada de microparticulas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas, y Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327, y Freiberg & Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18, las cuales plantean la preparación y uso de microesferas/micropartículas ) . Como se describe en la presente, un hidrogel es un eiemplo de una formulación de liberación sostenida o controlada.
Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilacturos (Patente de E.U.A. No. 3,773,919 y Patente Europea No. 0 058 481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman y colaboradores, 1983, Biopolymers 22: 547-56), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer y colaboradores, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), etilen-acetato de vinilo (Langer y colaboradores, supra) o ácido poli-D (-) -3-hidroxibutí ico (Patente Europea No. 0- 133 988) . Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, las cuales se pueden preparar mediante cualquiera de varios métodos conocidos en el campo. Véase, por ejemplo, Epstein y colaboradores, 1985, Proc . Nati. Acad. Sci. U.E.A. 82: 3688-92; y Patentes Europeas Nos. 0 036 676, 0 088 046, y 0 143 949.
La composición farmacéutica de mutante de polipéptido FGF21 que se usa para la administración in vivo debiera ser típicamente estéril. Esto se puede lograr mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Donde la composición se liofiliza, la esterilización que usa este método se puede conducir ya sea antes de, o después, de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral. se puede almacenar en forma liofilizada o en una solución. Además, las composiciones parenterales se colocan generalmente dentro de un contenedor que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasquito que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de la administración.
En una modalidad especifica, la presente invención se dirige a kits para producir una unidad de administración de dosis individual. Los kits pueden contener cada uno tanto un primer contenedor que tiene una proteina seca y un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. También se incluyen dentro del alcance de esta invención kits que contienen jeringas pre-llenadas de una y múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de liquido y liojeringas ) .
La cantidad efectiva de u a' composición farmacéutica de mutante de polipéptido FGF21 que se emplea terapéuticamente dependerá, por ejemplo, en el contexto y objetivos terapéuticos. Una persona experta en . el campo apreciará que los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento variarán de esta manera dependiendo, en parte, en la molécula suministrada, la indicación por la cual el mutante de polipéptido FGF21 está siendo usado, la vía de administración, y el tamaño (pero corporal, superficie corporal, o tamaño de órgano) y condición (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el médico puede titular la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación típica puede variar de aproximadamente 0.1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras modalidades, la dosificación puede variar de 0.1 pg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg; o de 1 pg/kg hasta alrededor de 100 mg/kg; o 5 pg/kg, 10 pg/kg, 15 pg/kg, 20 pg/kg, 25 pg/kg, 30 pg/kg, 35 pg/kg, 40 pg/kg, 45 pg/kg, 50· pg/kg, 55 pg/kg, 60 pg/kg, 65 pg/kg, 70 pg/kg, 75 pg/kg, hasta alrededor de 100 mg/kg. En todavía otras modalidades, la dosificación puede ser 50 pg/kg, 100 pg/kg, 150 pg/kg, 200 pg/kg, 250 pg/kg, 300 pg/kg, 350 pg/kg, 400 pg/kg, 450 yg/kg, 500 yg/kg, 550 yg/kg, 600 yg/kg, 550 yg/kg, 700 yg/kg, 750 yg/kg, 800 yg/kg, 850 yg/kg, 900 yg/kg, 950 yg/kg, 100 yg/kg, .200 yg/kg, 300 yg/kg, 400 yg/kg, 500 yg/kg, 600 yg/kg, 700 yg/kg, 800 yg/kg, 900 yg/kg, 1000 yg/kg, 2000 yg/kg, 3000 yg/kg, 4000 yg/kg, 5000 ug/kg, 6000 yg/kg, 7000 yg/kg, 8000 pg/kg, 9000 pg/kg o 10 mg/kg.
La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del mutante de polipéptido FGF21 en la formulación que se usa. Típicamente, un médico tendrá que administrar la composición hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. La composición por lo tanto se puede administrar como una sola dosis, como dos o más dosis (las cuales pueden o no contener la misma cantidad de la molécula deseada) a través del tiempo, o como una infusión continua por medio de un dispositivo de implantación o catéter. El refinamiento adicional de la dosis apropiada se hace rutinariamente por aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo y está dentro del ámbito de las tareas realizadas rutinariamente' por ellos. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar a través del uso de datos de respuesta a la dosis apropiados.
La vía de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, oralmente; a través de la inyección por vías intravenosas, intraperitoneales , intracerebrales ( intraparenquimal ) , intracerebroventricular , intramuscular, intraocular, intraarterial , intraportal, o intralesional ; por sistemas de liberación sostenida (los cuales también se pueden inyectar); o mediante dispositivos de implantación. Donde se desean, las composiciones se pueden administrar por inyección de bolo o continuamente por infusión o por un dispositivo de implantación .
Alternativa o adicionalmente , la composición se puede administrar localmente por medio- de la implantación de una membrana, esponja, u otro material apropiado sobre el cual la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Donde se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo se puede implantar dentro de cualquier tejido u órgano adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser por medio de infusión, bolo de liberación cronometrada o administración continua .
Con objeto de suministrar fármaco, por ejemplo, un mutante FGF21 descrito en la presente, a una relación predeterminada de tal manera que la concentración de fármaco puede mantenerse a un nivel terapéuticamente efectivo deseado durante un periodo extendido, puede emplearse una variedad de enfoques diferentes. En un ejemplo, un hidrogel que comprende un polímero tal como una gelatina (por ejemplo, gelatina de bovino, gelatina humana, o gelatina de otra fuenta) o un polímero generado sintéticamente o que se presenta naturalmente puede emplearse. Cualquier porcentaje de polímero (por ejemplo, gelatina) puede emplearse en un hidrogel, tal como 5, 10, 15 o 20%. La selección de una concentración apropiada puede depender de una variedad de factores, tales como el perfil terapéutico deseado y el perfil farmacocinético de la molécula terapéutica.
Los ejemplos de polímeros que pueden incorporarse en un hidrogel incluyen polietilen glicol ("PEG") , óxido de polietileno, óxido de polietileno-óxido de co-polipropileno, copolímeros de bloque o aleatorios de óxido de co-polietileno, alcohol polivinílico, poli (vinil pirrolidinona) , poli ( aminoácidos ) , dextrano, héparina, polisacáridos , poliéteres y similares.
Otro factor que puede considerarse cuando se genera una formulación de hidrogel es el grado de reticulación en el hidrogel y el agente reticulante. En una modalidad, la reticulación puede alcanzarse por medio de una reacción de metacrilación que involucra anhídrido metacrílico. En algunas situaciones, puede ser deseable un alto grado de reticulación mientras que en otra situaciones se prefiere un grado inferior de reticulación. En algunos casos un grado superior de reticulación proporciona una liberación sostenida más larga. Un grado superior de reticulación puede proporcionar un hidrogel más firme y un periodo más largo durante el cual se suministra el fármaco.
Cualquier relación de polímero a agente reticulante (por ejemplo, anhídrido metacrílico) puede emplearse para generar un hidrogel con propiedades deseadas. Por ejemplo, la relación de polímero a reticulante puede ser, por ejemplo, 8:1, 16:1, 24:1, o 32:1. ' Por ejemplo, cuando el polímero de hidrogel es gelatina y el reticulante es metacrilato, las relaciones de 8:1, 16:1, 24:1, o 32:1 anhídrido metacrílico : gelatina puede emplearse. 10. Usos Terapéuticos de los Mutantes de Polipéptido FGF21 Los mutantes de polipéptido FGF21 se pueden usar para tratar, diagnosticar, aminorar o prevenir una variedad de enfermedades, trastornos, o condiciones, que incluyen, pero no se limitan a trastornos metabólicos. En una modalidad, el trastorno metabólico que se trata es diabetes, por ejemplo, diabetes tipo 2. En otra modalidad, el trastorno metabólico es obesidad. Otras modalidades incluyen condiciones o trastornos metabólicos tal como dislipidemia ; hipertensión; hepatosteaotosis , tal como esteatohepatitis no alcohólica (NASH) ; enfermedad cardiovascular, tal como aterosclercsis ; y enve ecimiento.
En la aplicación, un trastorno o condición tal como diabetes u obesidad se pueden tratar al administrar un mutante de polipéptido FGF21 como se describe en este documento a un paciente en necesidad del mismo en la cantidad de una dosis terapéuticamente efectiva. La administración se puede realizar como se describe en este documento, tal como mediante inyección IV, inyección intraperitoneal , inyección intramuscular, u oralmente en la forma de un comprimido o formación liquida. En la mayoría de situaciones, una dosificación deseada se puede determinar por un médico, como se describe en este documento, y puede representar una dosis terapéuticamente efectiva del polipéptido de mutante FGF21. Será evidente para aquellas personas de experiencia en el campo que una dosis terapéuticamente efectiva del polipéptido mutante FGF21 dependerá, ínter alia, en el programa de administración, la dosis unitaria de antígeno administrado, si la molécula o polipéptido de ácido "nucleico se administra en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmunitario y la salud del receptor. El término "dosis terapéuticamente efectiva", como se usa en este documento, propone que la cantidad de polipéptido de mutante FGF21 que induce la respuesta biológica o medicinal en un sistema de tejidos, animal, o humano que es buscado por un investigador, doctor en medicina u otro médico, el cual incluye el alivio de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se trata. 11. Anticuerpos Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se enlazan específicamente a los polipéptidos mutantes FGF21 de la presente invención pero no se enlazan específicamente a los polipéptidos FGF21 de tipo natural se contemplan y están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales , incluyendo policlonal monoespecí fico; monoclonal (MAbs) ; recombinante; quiméricos; humanizados, tal como ' injertados en la región de determinación de complementariedad (CDR) ; humanos; de cadena individual; y/o biespecífieos ; así como también fragmentos; variantes; o moléculas químicamente modificadas de los mismos. Los fragmentos de anticuerpo incluyen aquellas porciones del anticuerpo que.se enlaza específicamente a un epítopo sobre un polipéptido mutante FGF21. Ejemplos de estos fragmentos incluyen fragmentos Fab y F(ab') generados por la escisión enzimática de los anticuerpos de longitud completa. Otros fragmentos de enlace incluyen aquellos generados por técnicas de ADN recombinante, tal como la expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de anticuerpos.
El término "específicamente enlazado", cuando se usa en el contexto de un anticuerpo, significa que el anticuerpo enlaza su objetivo en la presencia de una población heterogénea de proteínas y/u otro material biológico. Más particularmente, cuando un anticuerpo enlaza específicamente su objetivo, esto significa que bajo condiciones de inmunoensayo predeterminadas, el anticuerpo enlaza a su objetivo y no se enlaza en una cantidad importante a otras proteínas presentes en la muestra. Cualquier formato de inmunoensayo conveniente puede emplearse para identificar un anticuerpo que enlaza específicamente su objetivo, por ejemplo, inmunoensayos ELISA de fase sólida. Ver, por ejemplo, Harlow and Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications , New York. Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia un polipéptido mutante FGF21 generalmente se producen en animales (por ejemplo, conejos o ratones) por medio de múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del polipéptido mutante FGF21 y un adyuvante. Puede ser útil conjugar un polipéptido mutante FGF21 a una proteína portadora que es inmunogénica en la especie que se inmuniza tai como hemocianina de lapa californiana, suero, albúmina, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soya. También, agentes de agregación tal como alumbre se usan para 123 mejorar la respuesta inmunitaria. Después de la inmunización, a los animales se les extrae sangre y el suero se someten a ensayo para el titulo del anticuerpo mutante anti-FGF21.
Anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los polipéptidos mutantes FGF21 se pueden producir usando cualquier método que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por las lineas, de células continuas en el cultivo. Ejemplos de métodos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los métodos de hibridoma de Kohler y colaboradores., 1975, Nature 256: 495-97 y el método de hibridoma de células B humanas (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133: 3001; Brodeur . y colaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987). También se proporcionan por la invención lineas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con los polipéptidos mutantes FGF21.
Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden modificar para el uso como agentes terapéuticos. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo "quimérico" en el cual una porción de la cadena pesada (H) y/o ligera (L) es idéntica con u homologa a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas con u homologas a una secuencia correspondiente en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de estos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. Véase, por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 4,816,567; Morrison y colaboradores, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 81: 6851-55.
En otra modalidad, un anticuerpo monoclonal de la invención es un anticuerpo "humanizado". Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el campo. Véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A Nos. 5,585,089 y 5,693,762. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos dentro de una fuente que no . es humana. La humanización se puede realizar, por ejemplo, usando métodos descritos en el campo (véase, por ejemplo, Jones y colaboradores, 1986, Nature 321: 522-25; iechmann y colaboradores, 1998, Nature 332: 323-27; Verhoeyen y colaboradores., 1988, Science 239: 1534-36), al sustituir por lo menos una porción de una región determinante de complementariedad de roedor para las regiones correspondientes de un anticuerpo humano.
También se abarcan por la invención anticuerpos humanos que enlazan los polipéptidos- mutantes FGF21 de la presente invención. El uso de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena estos anticuerpos se producen mediante inmunización con un antigeno derivado de un mutante FGF21 (es decir, que tiene por lo menos 6 aminoácidos contiguos), conjugados- opcionalmente a un portador. Véase, por ejemplo, Jakobovits y colaboradores., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 90: 2551-55; Jakobovits y colaboradores, 1993, Nature 362: 255-58; Bruggermann y colaboradores, 1993, Year in Immuno. 7: 33. En un método, estos animales transgénicos se producen al incapacitar los sitios endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras en los mismos, y al invertir los sitios que codifican las proteínas de cadena pesada y ligera humana dentro del genoma de los mismos. Los animales parcialmente modificados, es decir, animales que tienen menos del complemento total de las modificaciones, entonces se reproducen en forma cruzada para obtener un animal que tiene todas las modificaciones del sistema inmunitario deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos con secuencias de aminoácidos humanas (en lugar de, por ejemplo, de murino) , que incluyen regiones variables que son inmunoespecíficas para estos antígenos. Véase, por ejemplo, Publicación Internacional Nos. WO 96/33735 y WO 94/02602. Se describen métodos adicionales en la Patente de E.U.A. No. 5,545,807, Publicaciones Internacionales Nos. WO 91/10741 y WO 90/04036, y en la Patente Europea No. 0 546 073. Los anticuerpos humanos también se pueden producir mediante la expresión de ADN recombinante en las células hospederas o mediante la expresión en las células de hibridoma como se describe en este documento.
En una modalidad alternativa, ' los anticuerpos humanos también se pueden producir de bibliotecas de despliegue de fagos (véase, por ejemplo', Hoogenboom y colaboradores, 1991, J. Mol Biol. 227: 381; Marks y colaboradores, 1991, J. Mol Biol. 222: 581). Estos procesos imitan la selección inmunitaria a través de la expresión de repertorios de anticuerpos sobre la superficie del bacteriófago filamentoso, y selección subsecuente del fago por su enlace a un antigeno de selección.
Los anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados se producen típicamente mediante métodos recombinantes . Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos se introducen en las células hospederas y se expresan usando materiales y procedimientos descritos en este documento. En una modalidad, los anticuerpos se producen en células hospederas de mamífero, tales como células CHO. Los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, humanos) se pueden producir por la expresión de ADN · recombinante en las células hospederas o por la expresión en las células de hibridoma como se describe en este documento.
Los anticuerpos mutantes anti-FGF21 de la invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de enlace competitivos, ensayos de intercalado directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación, (véase, por ejemplo, Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc., 1987), incorporados en este documento a manera de referencia en su totalidad) para la detección y cuantificación de los polipéptidos mutantes FGF21. Los anticuerpos se enlazaran a los polipéptidos mutantes FGF21 con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se emplea.
Para aplicaciones de diagnóstico, en ciertas modalidades, los anticuerpos mutantes anti-FGF21 se pueden etiquetar con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, un señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 1 C, 32P, 35S, 12 I, "Te, luIn, o 67Ga; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato fluoresceina, rodamina,' o luciferina; o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante (Bayer y colaboradores, 1990, Meth. Enz. 184: 138-63) .
Los ensayos de enlace competitivos dependen de la capacidad de un estándar etiquetado (por ejemplo, un polipéptido mutante FGF21, o una porción inmunológicamente reactiva del mismo) para competir con el analito de muestra de prueba (por ejemplo, un polipéptido mutante FGF21) para enlazarse con una. porción limitada del anticuerpo mutante anti-FGF21. La cantidad de un polipéptido mutante FGF21 en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad el estándar que se enlaza a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se enlaza, los anticuerpos se solubilizan típicamente antes o después de la competición, de modo que el estándar y el analito que se enlazan a los anticuerpos se pueden separar convenientemente del estándar y el analito que permanece no enlazado.
Los ensayos de intercalado implican típicamente el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de enlazarse a una porción inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína que se detecta y/o se cuantifica. En un ensayo de intercalado, el analito de muestra de prueba se enlaza típicamente por un primer anticuerpo que se inmoviliza sobre un soporte sólido, y después un segundo anticuerpo se enlaza al analito, formando de esta manera un- complejo de tres partes insoluble.
Véase, por ejemplo, Patente de E.U.A No. 4,376,110. El segundo anticuerpo por si mismo puede etiquetarse con una porción detectable .(ensayos de intercalado directos) o se puede medir usando un anticuerpo de anti-inmunoglobulina que se etiqueta con una porción detectable (ensayos de intercalado indirectos). Por ejemplo, un tipo de ensayo de intercalado es un ensayo inmunoabsorbente enlazado en enzimas (ELISA), en cuyo caso la porción detectable es una enzima.
Los anticuerpos mutantes anti-FGF21 de la presente invención también son útiles para la formación de imágenes in vivo. Un - anticuerpo etiquetado con una porción detectable se puede administrar a un animal, preferiblemente dentro de torrente sanguíneo, y la presencia y ubicación del anticuerpo etiquetado en el hospedero sometido a ensayo. El anticuerpo se puede etiquetar con cualquier porción que sea detectable en un animal, ya sea por resonancia magnética nuclear, radiología, u otro medio de detección conocido en el campo.
Los anticuerpos mutantes FGF21 de la invención se pueden usar como agentes terapéuticos. Estos agentes terapéuticos son generalmente agonistas o antagonistas, en que ya sea mejoran o reducen, respectivamente, por lo menos una de las actividades biológicas de un polipéptido mutante FGF21. En una modalidad, los anticuerpos antagonistas de la invención son anticuerpos o fragmentos de enlace de los mismos los cuales son capaces de enlazarse específicamente a un polipéptido mutante FGF21 y los cuales son capaces de inhibir o eliminar la actividad funcional de un polipéptido mutante FGF21 in vivo o in vitro. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista inhibirá la actividad funcional de un polipéptido mutante FGF21 mediante por lo menos aproximadamente 50%, y preferiblemente por lo menos aproximadamente 80%. En otra modalidad, el anticuerpo mutante anti-FGF21 es capaz de interferir con la interacción entre un polipéptido mutante FGF21 y un receptor FGF21 inhibiendo o eliminando en consecuencia la actividad del polipéptido mutante FGF21 in vitro o in vivo. Los anticuerpos mutantes anti-FGF21 agonistas o antagonistas se identifican mediante ensayos de clasificación que son bien conocidos en el campo.
La invención también se refiere a un kit que comprende anticuerpos mutantes FGF21 y otros reactivos útiles para detectar niveles de polipéptido · mutante FGF21 en muestras biológicas. Estos reactivos pueden incluir una etiqueta detectable, suero de bloqueo, muestras de control positivas y negativas, y reactivos de detección.
EJEMPLOS Los Ejemplos que siguen son ilustrativos de las modalidades específicas de la invención, y varios usos de los mismos. Se exponen para propósitos explicativos únicamente, y no se deben considerar de ninguna manera como limitantes del alcance de la invención.
EJEMPLO 1 Preparación de Constructos de Expresión FGF21 Una secuencia .de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido FGF21 maduro se obtuvo mediante la amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que tienen secuencias de nucleótidos que corresponden a los extremos 5' y 3' de la secuencia FGF21 madura. La Tabla 11 enlista los cebadores que se usaron para amplificar la secuencia FGF21 madura.
Tabla 11 Cebadores PCR para Preparar el Constructo FGF21 Cebador Secuencia SEQ ID NO: Sentido 5 ' - 12 AGGAGGAATAACATATGCATCCAATTCCAGATTCTTCTCC- 3' Antisentido 5 ' -TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3 ' 13 Los cebadores usados para preparar el constructo de expresión FGF21 maduro incorporaron sitios de endonucleasa de restricción (el sitio Ndel también comprende una metionina en el N terminal para expresión bacteriana) para la clonación direccional de la secuencia dentro de un vector de expresión adecuado (por ejemplo, pET30 (Novagen/EMD Biosciences ; San Diego, CA) o pAMG33 (Amgen; Thousand Oaks, CA) ) . El vector de expresión pAMG33 contiene un origen R-100 del número de copias bajo de replicación, un promotor lac modificado, y un gen de resistencia a la canamicina. El vector de expresión pET30 contiene un origen derivado de pBR322 de replicación, un promotor T7 inducible, y un gen de resistencia a la canamicina. Mientras que la expresión de pAMG33 se descubrió que es más alta, el pET30 se descubrió que es un vector de clonación más confiable. De esta manera, la mayoría de los constructos descritos en la presente solicitud primero se generaron en pET30 y luego se clasificaron por eficacia. Las secuencias seleccionadas luego se transfirieron al pAMG33 para amplificación adicional.
La secuencia FGF21 se amplificó en una mezcla de reacción que contiene 40.65. pL de dH20, 5pL de Solución Amortiguadora de Reacción PfuUltra II (lOx), 1.25 pL de mezcla de dNTP (40 mM - 4 x lOmM) , 0.1 pL de Plantilla (100 ng/mL), 1 pL de cebadorl (10 µ?) , 1 pL de cebador2 (10 µ?) , y 1 pL de ADN polirnerasa HS de fusión PfuUltra II (Stratagene; La Joiia, CA) . Las reacciones de amplificación se realizaron por calentamiento durante 2 minutos a 95°C; seguido por 10 diez ciclos a 95°C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos (con 1°C adicional restado por ciclos), y 72°C durante 15 segundos/kilo base de producto deseado; seguido por 20 ciclos a 94°C durante 20 segundos; 55°C durante 20 segundos, 72°C durante 15 segundos/kilo base de producto deseado; seguido por 72°C durante 3 minutos. Los productos de amplificación se digirieron con las endonucleasas de restricción Ndel, Dpnl, y EcoRI; ligadas sobre un vector adecuado, y luego transformadas en células competentes.
EJEMPLO 2 Purificación de Proteínas FGF21 de Bacterias En los Ejemplos que siguen, varias proteínas FGF21 que incluyen el polipéptido FGF21 de tipo natural, polipéptidos FGF21 truncados, mutantes FGF21 y proteínas de fusión FGF21, se expresaron en un sistema de expresión bacteriano. Después de la expresión, la cual se describe posteriormente, las proteínas FGF21 se purificaron como se describe en este Ejemplo, a menos que se indique de otra manera.
Para purificar el polipéptido FGF21 de tipo natural, polipéptidos FGF21 truncados y mutantes FGF21 de cuerpos de inclusión bacterianos, los cuerpos de inclusión doble lavados (DWIBs) se solubilizaron en una solución amortiguadora de solubilización que contiene clorhidrato de guanidina y DTT en solución reguladora Tris en pH 8.5. Luego se mezclaron durante una hora a temperatura ambiente, y la mezcla de solubilización se agregó a una solución amortiguadora replegada que contiene urea, arginina, cisterna, y clorhidrato de cistamina en pH 9.5, y luego se mezclaron durante 24 horas a 5°C (véase, por ejemplo, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall y colaboradores, 2007, Biotechnol'. Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph y colaboradores, 1997, "Folding proteins," Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., Nueva York, IRL Press) 57-99; and Ishibashi y colaboradores, 2005, Protein Expr. Purif. 42 : 1· -6) .
Después de la solubilización y replegado, la mezcla se filtró a través de un filtro de 0.45 mieras. La acumulación replegada luego se concentró aproximadamente 10 veces con un cásete Pall Omega de peso molecular de 10 KD cortado en una presión de transmembrana (TMP) de 1.41 kg/cm2 (20 psi), y se diafiltró con 3 volúmenes de columna de Tris 20 mM, pH 8.0 en TMP de 1.41 kg/cm2 (20 psi).
La muestra clarificada luego se sometió a cromatografía de intercambio anióriieo (AEX) usando una resina Q Sepharose HP. Un gradiente de sal lineal de NaCl 0 a 250 mM en Tris 20 mM se corrió en pH 8.0 a 5°C. Las fracciones pico se analizaron por el SDS- PAGE y se acumularon.
El acumulado de eluido AEX luego se sometió a cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) usando una resina Fenil Sefarosa HP. La proteína se eluyó usando un gradiente lineal de creciente de sulfato de amonio de 0.7 M a 0 M en pH 8.0 y a temperatura ambiente. Las fracciones pico se analizaron por el SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) y se cumularon.
La acumulación HIC se concentró con un cásete de 0.2 m2 Pall Omega de peso molecular de 10kD cortado a 7 mg/mL en una TMP de 1.41 kg/cm2 '(20 psi). El concentrado se diafiltró con 5 volúmenes de solución amortiguadora de formulación en una TMP de 1.41 kg/cm2 (20 psi), y el concentrado recuperado se diluyó a 5 mg/mL. Finalmente, la solución se filtró a través de una membrana de Posidina 0.2 µ? Pall mini- leenpac .
Para purificar las proteínas · de fusión FGST21 y las proteínas mutantes de fusión FGF21 de los anticuerpos de inclusión bacterianos, los anticuerpos de inclusión doble lavados (DWIBs) se solubilizaron en una solución amortiguadora de solubilizacíón que contiene clorhidrato de guanidina y DTT en solución amortiguadora Tris en pH 8.5 y luego se mezclaron durante una hora a temperatura ambiente.
Luego la mezcla de solubilización se agregó a una solución amortiguadora replegada ' que contiene urea, arginina, cisteína, y clorhidrato de cistamina en pH 9.5 y luego se mezclaron durante 24 horas a 5°C (véase, por ejemplo, Clarke, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9: 157-63; Mannall y colaboradores, 2007, Biotechnol . Bioeng. 97: 1523-34; Rudolph y colaboradores, 1997, "Folding proteins," Protein Function: A Practical Approach (Creighton, ed., Nueva York, IRL Press) 57-99; e Ishibashi y colaboradores, 2005, Protein Expr . Purif. 42: 1-6) .
Después de la solubilización y replegado, la mezcla se dializó nuevamente 5 volúmenes de Tris de 20 mM, pH 8.0 usando una tubería de diálisis de 10 kD. El pH del replegado dializado se ajustó a 5.0 con ácido acético al 50%, y luego se clarificó mediante centrifugación durante 30 minutos a 4K.
La muestra clarificada luego se sometió a cromatografía de intercambio aniónico (AEX) . usando una resina Sefarosa HPQ. Un gradiente de sal lineal de NaCl de 0 a 250 mM en Tris 20 mM se corrió en pH 8.0 a 5°C. Las fracciones pico se analizaron por el SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-85) y se acumularon.
La acumulación de material eluído AEX luego se sometió a cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) usando una resina Fenil Sepharose HP. La proteína se eluyó usando un gradiente lineal de creciente de sulfato amonio 0.6 M a 0 M en pH 8.0 a temperatura ambiente. Las fracciones pico se analizaron por el SDS-PAGE y se cumularon.
Después de la etapa de HIC, la acumulación luego se dializó 60 volúmenes de solución amortiguadora de formulación. La acumulación dializada se concentró a 5 mg/mL usando un Pall jumbosep. Finalmente, la solución se filtró a través de una membrana de Posidina 0.2 µ? Pall mini-Kleenpac .
EJEMPLO.3 Preparación y Expresión de Proteínas FGF21 Truncadas Los constructos que codifican las proteínas FGF21 truncadas · listadas en la Tabla 12 se prepararon mediante amplificación PCR del vector de expresión FGF21 de tipo natural como se describe posteriormente (la construcción del vector de expresión FGF21 de tipo natural se describe en el Ej emplo 1 ) .
Tabla 12 Truncamientos FGF21 Número de residuos Residuos de truncados* Aminoácido Truncamientos en el C terminal 1 - 180 1 Número de residuos Residuos de truncados* Aminoácido 1 - 179 2 1 - 178 3 1 - 177 4 1 - 176 5 1 - 175 6 1 - 17 ^ 7 1 - 173 8 1 - 172 9 1 - 171 10 1 - 169 12 1 - 168 13 1 - 167 14 1 - 166 15 1 - 165 16 1 - 164· 17 1 - 160 21 1 - 156 25 1 - 152 29 1 - 149. 32 1 - 113 68 Truncamientos en el N terminal 2 - 181 1 3 - 181 2 - 181 3 5 - 181 4 6 - 181 5 7 - 181 6 8 - 181 7 Número de residuos Residuos de truncados* Aminoácido 9 - 181 8 Truncamientos en el C terminal y N 5 - 174 11 7 - 172 17 9 - 169 20 9 - 149 40 15 - 169 26 15 - 149 46 15 - 113 82 * con relación a po Lipéptido FGF21 maduro Los constructos.de proteina FGF21 truncada se prepararon usando cebadores que tienen secuencias que son homologas a las regiones cadena arriba y corriente debajo de un codón (o codones) que se suprimen (dando por resultado el truncamiento) . Los cebadores usados en estas reacciones de amplificación también proporcionaron aproximadamente 15 nucleótidos de secuencia de solapamiento para permitir la recirculación del producto amplificado, principalmente el vector completo que ahora tiene el mutante deseado.
Un constructo FGF21 truncado ejemplar, que codifica una proteina FGF21 que carece del residuo de histidina en la posición 1 de la secuencia FGF21 madura (es decir, el mutante de truncamiento 2-181) , se preparó usando los cebadores mostrados en la Tabla 13.
Tabla 13 Cebadores PCR para Preparar el Mutante FGF21 de Truncamiento Ejemplar Cebador Secuencia SEQ ID NO: Sentido 5'- 14 GGAGATATACATATGCCAATTCCAGATTCTTCTCCA TTATT-3 ' Antisentido 5'- 15 CATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAA- 3' Los cebadores mostrados en la Tabla 4 permiten la supresión del residuo de histidina como se muestra a continuación, en donde la secuencia superior (SEQ ID NO: 9) es una porción de un polipéptido FGF21 maduro que comprende una metionina N-terminal, la segunda secuencia es el cebador de sentido (SEQ ID NO: 14), la tercera y cuarta secuencias (SEQ ID NOs : 17 y 18) son posiciones de un constructo de expresión FGF21, y la .quinta secuencia es el cebador antisentido (SEQ ID NO: 16) : MetHisProIleProAspSerSerProLeu 5 ' -GGAGATATACATATG CCAATTCCAGATTCTTCTCCATTATT TTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCATCCAATTCCAGATTCTTCTCCATTA TT AAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTATACGTAGGTTAAGGTCTAAGAAGAGGTAAT AA AAAACAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTATAC-5 ' Se prepararon constructos de proteína FGF21 truncada usando esencialmente las condiciones PCR descritas en el Ejemplo 1. Los productos de amplificación se digirieron con la endonucleasa de restricción Dpnl, y luego se transformaron en células competentes. Los clones resultantes se secuenciaron para confirmar la ausencia de errores generados por la polimerasa.
Las proteínas FGF21 truncadas se expresaron al transformar las células BL21. (DE3) o BL21 Star (Invitrogen; Carlsbad, CA) con el constructo que codifica una proteína FGF21 truncada particular. Los transformantes se desarrollaron durante toda la noche con aireación limita en un medio TB suplementado con 40 pg/mL de canamicina, se airearon la siguiente mañana, y después de un corto periodo de recuperación, se indujeron . en IPTG 0.4 mM. Los mutantes FGF21 se cosecharon mediante centrifugación 18-20 horas después de la inducción.
EJEMPLO 4 Actividad in vitro de las Proteínas FGF21 Truncadas Se realizaron experimentos para identificar proteínas FGF21 truncadas que retienen una actividad FGF21 de tipo natural en un ensayo in vitro de ELK-luciferasa . La Tabla 5 resume los resultados obtenidos para las proteínas FGF21 que tienen truncamientos en la N-terminal, la C-terminal , o en tanto la N-terminal como la C-terminal. Los ensayos de ELK-luciferasa se realizaron usando un sistema de células de riñon 293T humanas recombinantes , en las cuales las células 293T sobre expresan los constructos reporteros ß-Klotho y luciferasa. Estos constructos también contienen secuencias que codifican GAL-ELK1 ' y 5xUAS-Luc, un reportero de luciferasa conducido por un promotor que contiene cinco copias en tándem del sitio de enlace Gal4. El ß-Klotho es un co-receptor que es requerido por FGF21 para la activación de sus receptores FGF y la inducción de la transducción de señal intracelular , la cual a su vez conduce a la fosforilación Erk y ELK. La actividad de la luciferasa se regula por el nivel de Erk/ELKl fosforilado, y se induce para supervisar y cuantificar indirectamente la actividad FGF21.
Los ensayos de ELK-luci ferasa se realizaron al cultivar las células 293T en presencia de diferentes concentraciones del polipéptido mutante FGF21 o FGF21 de tipo natural durante 6 horas, y luego al someter a ensayo los Usados celulares para la actividad de la luciferasa. Las Figuras 1A-1B muestran los resultados de un ensayo de actividad de la ELK-luciferasa revisado sobre los mutantes de truncamiento FGF21 7-181 y 8-181 (Figura' 1A) y los mutantes de truncamiento FGF21 1-172, 1-171, 1-169, y 1-164 (Figura IB). La luminiscencia obtenida en los ensayos de ELK-luciferasa para cada uno de los mutantes de truncamiento FGF21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1- 174, 1-173, 1-172, 9-181, y 1-149 se muestra en la Figura 2.
Los polipéptidos de mutantes FGF21 se compararon con un estándar FGF21 de tipo natural y los mutantes muestran una eficacia de por lo menos 50% de la eficacia del FGF21 de tipo natural se consideraron por no tener una pérdida de actividad FGF21 y se asignaron un' "+" en la Tabla 14.
Tabla 14 Proteínas PGF21 Truncadas: Ensayo in vitro Truncamientos en el C terminal Residuos de aminoácidos Eficacia Actividad (+/-) 1 - 180 93.2% + 1 - 178 95.0% + 1 - 177 112.0% + 1 - 176 104.8% + Truncamientos en el C terminal Residuos de aminoácidos Eficacia Actividad (+/-) 1 - 174 104'.6% + 1 - 173 96.1% + 1 - 172 ' 97.5% + 1 - 171 113.0% + 1 - 169 84.9% + 1 - 167 20% - 1 - 166 20% 1 - 165 10% Truncamientos en el N terminal Residuos de aminoácidos Eficacia Actividad (+/-) 2 - 181 112.5% + 3 - 181 130.3% + 4 - 181 117.0% + 5 - 181 119.6% + 7 - 181 74.2% + 8 - 181 24.9% - 9 - 181 12.5% — Colectivamente, los resultados presentados en la Tabla 14 indican que las supresiones en C-terminal de 14 o más residuos de aminoácido (es decir, una proteína FGF21 C-terminalmente truncada que consiste de 1-167 residuos de aminoácido y proteínas más cortas) eliminan la actividad de FGF21. Además, la Tabla 14 indica las supresiones en N terminal de 7 o más residuos de aminoácido (es decir, una proteína FGF21 N-terminalmente truncada que consiste de 8-181 residuos de aminoácido y proteínas más cortas) eliminan la actividad de FGF21. No sorprendentemente, las proteínas FGF21 truncadas que poseen tanto un truncamiento en N terminal de 8 a 14 residuos y un truncamiento en C terminal de 12 o 32 residuos se descubrieron que carecen de actividad en los ensayos de ELK-luciferasa .
Consistentes con los datos presentados en la Tabla 14, los polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el N terminal de menos de 7 residuos de aminoácido constituyen modalidades de la presente invención. Similarmente , los polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el- C-terminal de menos de 13 residuos de aminoácido constituyen modalidades de la presente invención.
EJEMPLO 5 Actividad in vivo de las Proteínas FGF21 Truncadas El FGF21 posee un número de actividades biológicas, que incluyen la capacidad de disminuir los niveles de glucosa en la sangre, insulina, triglicéridos o colesterol; reducir el peso corporal; o mejorar la tolerancia a la glucosa, gasto de energía o sensibilidad a la insulina. Los polipéptidos FGF21 truncados se analizaron adicionalmente para la · actividad FGF21 in vivo, al introducir los polipéptidos FGF21 truncados dentro de ratones ob/ob resistentes a la insulina, y al medir la capacidad de un polipéptido FGF21 truncado particular para disminuir la glucosa en la sangre. El polipéptido FGF21 truncado que se somete a prueba se inyectó intra-peritonealmente en un ratón ob/ob de 8 semanas de edad ( Jackson Laboratory) , y las muestras de sangre se obtuvieron en varios puntos de tiempo después de una sola inyección, por ejemplo, 0, 6, 24, 72, 120, y 168 horas después de la inyección. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron con un Glucómetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA) , y los resultados se expresaron como un porcentaje del cambio de la glucosa en la sangre relativo con el nivel de línea base en la glucosa en la sangre (es decir, en el tiempo 0) Los resultados de un experimento se proporcionan en la Figura 3, la cual muestra la cantidad de glucosa en la sangre detectada en ratones inyectados con los mutantes de truncamiento FGF21 8-181 y 9-181. Este experimento demostró que las proteínas de fusión FGF21 truncadas que comprenden 8-181 residuos de aminoácido exhiben actividad de disminución de glucosa en la sangre in vivo sin embargo la actividad es ligeramente menor que la actividad de FGF21 de tipo natural a 3 y 6 horas después de la inyección, pero estas proteínas de fusión FGF21 truncadas que comprenden 9-181 residuos de aminoácido no exhiben esta actividad. De esta manera, el análisis in vivo de los . polipéptidos FGF21 truncados indicaron que la supresión de hasta 7 aminoácidos de la N-terminal del FGF21 maduro no eliminan la actividad biológica de la molécula (en contraste con el análisis in vitro, lo cual sugirió que la supresión de los 7 aminoácidos de la N-terminal del FGF21 maduro eliminará la actividad) .
Los diferentes resultados obtenidos con los polipéptidos FGF21 N-terminalmente truncados particulares (por ejemplo, FGF21 8-181) en los ensayos in vitro e in vivo se puede explicar por la interacción del FGF21 con el ß-Klotho y el receptor FGF al efectuar la transducción de señal. En particular, el FGF21 activa un complejo de receptor doble que comprende el co-receptor ß-Klotho y el receptor FGF (FGFR), el cual inicia una cascada de señalización que implica la tirosina cinasa. La N-terminai del FGF21 se ha mostrado que se implicó en el enlace y activación del FGF21 mientras que la C-terminal del FGF21 es requerida para la interacción del ß-Klotho (Yie y colaboradores., 2009 FEBS Lett. 583:19-24). El ensayo in vitro de ELK-luciferasa se realiza en 293 células de riñon en la cuales el co-receptor ß-Klotho se sobre expresa y el FGFR se expresa en niveles normales. La cantidad de FGFR es baja en relación con la aquella de ß-Klotho y la relación de ß-Klotho a FGFR en 293 células por lo tanto no es fisiológica, lo cual puede afectar la formación del complejo receptor y ligar finalmente el enlace y activación del FGFR. El sistema in vitro 293 parece que es más vulnerable a los polipéptidcs FGF21 N-terminalmente truncados y por lo tanto puede haber producido menos de los resultados de actividad para pocos de los mutantes N-terminalmente truncados sometidos a prueba, tal como FGF21 8-181. De esta manera, al determinar si un mutante FGF21 N-terminalmente truncado particular retuvo la actividad FGF21 de tipo natural-, la actividad del mutante FGF21 en el ensayo in vivo se consideró que es dispositivo. Por consiguiente, los polipéptidos FGF21 truncados que tienen truncamientos en el N-terminal de menos de 8 residuos de aminoácido se abarcan por la invención.
EJEMPLO 6 Preparación y Expresión de las Proteínas de Fusión FGF21 Truncadas Debido a que. la vida media de una proteina se puede incrementar al fusionar la proteina a una secuencia Fe, las proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos FGF21 truncados se prepararon y se analizaron. Las proteínas de fusión FGF21 truncadas listadas en la Tabla 15 se prepararon a partir de secuencias FGF21 amplificadas por la PCR SOEing (empalme de genes por la extensión de solapamiento) . Se prepararon las proteínas de fusión FGF21 tal que la porción Fe del gen IgGl de inmunoglobulina humana (SEQ ID NO: 11) se fusionó a ya sea la N-terminal o la C terminal de la proteina FGF21.
Tabla 15 Proteínas de Fusión FGF21 Truncadas Residuos de aminoácidos Posición Fe Ligadura Truncamientos en el C terminal 1 - 178 -NH2 15 1 - 175 -NH2 15 1 - 175 -C00H 15 1 - 171 -NH2 15 1 - 171 -COOH 15 1 - 170 -COOH 15 Truncamientos en el N terminal 5 - 181 -NH2 15 5 - 181 -COOH 15 7 - 181· -NH2 15 7 - 181 -COOH 15 Truncamientos en el C terminal y N 5 - 175 -NH2 15 5 - 175 -COOH 15 5 - 171 -NH2 15 5 - 171 -COOH 15 6 - 170 -COOH 15 7 - 178 -COOH 35 7 - 175 -NH2 15 7 - 175 -COOH 15 7 - 174 -COOH 35 Residuos de aminoácidos Posición Fe Ligadura 7 - 172 -COOH 35 7 - 171 -NH2 15 7 - 171 -COOH 35 7 - 171 -COOH 15 En particular, los constructos de la proteína de fusión FGF21 (que incluyen aquellos que codifican las proteínas de fusión FGF21 truncadas) se prepararon en una serie de tres reacciones de amplificación usando esencialmente las condiciones de reacción descritas en el Ejemplo 1. En la primera reacción, un par de cebadores se diseñó para producir una secuencia que contiene un sitio de clonación Ndel (incluyendo una metionina en el N terminal para expresión bacteriana), región Fe y secuencia de ligadura. En la segunda reacción, un par de cebadores se diseñó para producir una secuencia que contiene una porción de traslape de la ligadura, una porción de la secuencia de codificación FGF21, y el sitio de clonación EcoRI . Finalmente, en la tercera reacción, un par de cebadores se diseñó para el propósito de enlazar los productos de las primeras dos reacciones. Un conjunto ejemplar de cebadores para la construcción de Fc-FGF21 1- 181 se lista en la Tabla 16.
Tabla 16 Cebadores PCR para Preparar un Constructo de Proteina Fusión FGF21 Ejemplar Cebador Secuencia SEQ ID NO: Reacción 1 Sentido 5 ' -AGGAGGAATAACATATGGACAAAACTCACACATG-3 ' 19 Antisentido 5 ' -GGATCCACCACCACCGCTACCAC-3 ' 20 Reacción 2 Sentido 5'- 21 GGTGGTGGTGGATCCCATCCAATTCCAGATTCTTCTCCA- 3' Antisentido 51 -TAGTGAGCT.CGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3 ' 22 Reacción 3 Sentido 5 ' -AGGAGGAATAACATATGGACAAAACTCACACATG-3 ' 19 Antisentido 5 ' -TAGTGAGCTCGAATTCTTAGGAAGCGTAGCTGG-3 ' 22 El producto de la reacción final se digirió con las endonucleasas de restricción Ndel y EcoRI, se ligó en el vector pET30, y luego se transformó en células competentes. Los clones resultantes se secuenciaron para confirmar la ausencia de errores generados por la polimerasa.
EJEMPLO 7 Actividad in vivo de las Proteínas de Fusión FGF21 Truncadas Las proteínas de · fusión que comprenden una secuencia FGF21 truncada fusionada a una secuencia Fe se generaron y se sometieron a ensayo para la actividad in vivo. Las proteínas de fusión FGF21 truncadas se prepararon al fusionar una molécula IgGl Fe ya sea al extremo N-terminal o C-terminal de una proteina FGF21 truncada para formar una secuencia contigua individual. Para distinguir entra las fusiones N-terminal y C-terminal, las proteínas de fusión FGF21 en las cuales la molécula Fe se fusionó al extremo N-terminal de la proteína FGF21 se designan como FGF21-Fc, y las proteínas de fusión en la cual la molécula Fe se fusionó al extremo C-terminal de la proteína FGF21 se designan como FGF21-Fc.
El FGF21 posee un número de actividades biológicas, que incluyen la capacidad de disminuir los niveles de glucosa en la sangre, insulina, triglicéridos , colesterol, reducir el peso corporal; o mejorar la tolerancia en la glucosa, gasto de energía o sensibilidad a la insulina. Para estimar la actividad FGF21 in vivo, los polipéptidos FGF21, polipéptidos mutantes FGF21, y polipéptidos de fusión FGF21 se introdujeron en ratones ob/ob resistentes a la insulina, y se midió la capacidad de una proteína FGF21 particular para disminuir los niveles de glucosa en la sangre. El polipéptido FGF21, polipéptido mutante FGF21, o polipéptido de fusión FGF21 que se somete a prueba se inyectó intraperitonealmente en ratones ob/ob de 8 semanas de edad ( Jackson Laboratory) , y se obtuvieron muestras de sangre en varios puntos de tiempo después de una sola inyección, por ejemplo, 0, 6, 24, 72, 120, y 168 horas después de la inyección. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron con un Glucómetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA) , y los resultados se expresaron como un porcentaje de cambio de la glucosa en la sangre relativa con el nivel de linea base de la glucosa en la sangre (es decir, en el tiempo 0) .
Los resultados de un experimento se proporcionan en la Figura 4, la cual muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones inyectados con un control PBS, un control FC-FGF21 de tipo natural que comprende 1-181 residuos de aminoácido o proteínas de fusión FC-FGF21 truncadas que comprenden los residuos de aminoácido 5-181 o 7-181. Este experimento demostró que las proteínas de fusión Fc-FGF21 truncadas que comprenden los residuos de aminoácido 5-181 o 7-181 exhiben actividad de disminución en la sangre que es similar a la actividad de Fc-FGF21 de tipo natural a 6 horas después de la inyección. De esta manera, el análisis in vivo de los polipéptidos Fc-FGF21 truncados indicó que la supresión de hasta 6 aminoácidos de la N-terminal del FGF21 maduro no afecta la actividad biológica de la molécula. Los análisis in vivo indicaron, sin embargo, qué la capacidad de los polipéptidos FGF21 truncados de disminuir la glucosa en la sangre se redujo y que los niveles de glucosa en la sangre regresaron a la linea base a 24 horas después de la inyección (los resultados similares se obtuvieron con el FGF21 del tipo natural) . La actividad in vivo corta se descubrió que es un resultado de la degradación proteolítica del FGF21, como se describe en el Ejemplo 8.
Los resultados de otro experimento se proporcionan en la Figura 5, la cual muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones inyectados con un control PBS, un control FGF21-Fc de tipo natural que comprende los residuos de aminoácido 1-181, una proteina de fusión FGF21-Fc truncada que comprende los residuos 1-175, o una proteína Fc-FGF21 truncada que comprende los residuos de aminoácido 1-171. Este experimento demuestra que el FGF21-Fc de tipo natural que comprende los residuos de aminoácido 1-181 tiene una actividad de disminución de glucosa sostenida que da por resultado una reducción de los niveles de glucosa en la sangre de aproximadamente 30% durante el período de tiempo de 24 horas a 120 horas después de la inyección. La proteína Fc-FGF21 truncada que comprende los residuos de aminoácido 1-171 exhibe una actividad de disminución de glucosa en la sangre retardada evidente únicamente a 72 horas después de la inyección. Sin embargo, la actividad observada es la misma como la actividad de FGF21-Fc de tipo natural. La proteína de 16? fusión FGF21-Fc truncada que comprende los residuos 1-175 no es activa in vivo en la disminución de la glucosa en la sangre.
Colectivamente, los experimentos de truncamiento descritos en este documento demuestran que las proteínas de fusión FGF21 truncadas que tienen un truncamiento N-terminal exhiben una actividad de disminución de glucosa en la sangre que es similar a aquella de la proteína de fusión FGF21 de tipo natural, y además, estás proteínas de fusión FGF21 truncadas en las cuales la molécula Fe se ha fusionado al extremo N-terminal de la proteína FGF21 truncada exhiben más actividad que las proteínas de fusión en las cuales la molécula Fe se ha fusionado al extremo C-terminal de la proteína FGF21 truncada.
EJEMPLO 8 Degradación Observada in vivo del FGF21 La degradación FGF21 primero se observó con los constructos de proteína de fusión FGF21 Fe como se describe en el Ejemplo 7. El análisis farmacocinético in vivo indicó que el FGF21 humano tiene una vida media corta de aproximadamente 1 hora en ratones debido a la rápida eliminación y a la degradación in .vivo. Por lo tanto, para prolongar la vida media del FGF21- se fusionó una secuencia Fe al extremo - o C-terminal del polipéptido FGF21. Sin embargo, la fusión de una región Fe no resolvió completamente el problema de vida media puesto que las proteínas de fusión en las cuales una secuencia Fe se fusionó al extremo N- o C-terminal del polipéptido FGF21 y (y en particular las fusiones FGF21 es decir, en las cuales la secuencia Fe se fusiona a la N-terminal del FGF21 maduro) , no exhibieron la eficacia in vivo esperada, y en lugar se descubrió que mantienen la actividad de · disminución de glucosa en la sangre por no más de 24 horas en . los ratones ob/ob. Como se describe en la Figura 4, las proteínas de fusión Fc-FGF21 redujeron los niveles de glucosa en la sangre por aproximadamente 30-40% a 6 horas después de la inyección, mientras que los niveles de glucosa en la sangre regresaron a los niveles de línea base a 24 horas.
La degradación proteolítica del FGF21 de tipo natural se investigó subsecuentemente, y la pérdida rápida de la actividad in vivo con las proteínas de fusión Fc-FGF21 se descubrió que es el resultado de la degradación in vivo de FGF21. La degradación proteolítica conduce a una actividad biológica disminuida de la molécula in vivo y de esta manera una vida media efectiva más corta, y tal degradación impacta adversamente el uso terapéutico de la molécula. Por consiguiente, la degradación observada de la proteínas de fusión FGF21 Fe condujo a la investigación de la degradación proteolitica de FGF21 in vivo y para identificar los mutantes FGF21 qué fueron resistentes a esta degradación.
Para determinar los sitios de degradación, el análisis LC-MS y la secuenciación Edman se realizaron en las proteínas de fusión FGF21 Fe y FGF21 humana, obtenidas en varios puntos de tiempo después de la inyección en ratones C57B6 machos. La secuenciación de Edman ayudó a confirmar si el extremo N-terminal o C-terminal. de la proteína se sometió a la degradación. Cuando una secuencia Fe se fusionó a la N-terminal del humano FGF21, la degradación se descubrió que ocurre en el péptido enlazado entre los residuos de aminoácido 151 y 152 y entre los residuos de aminoácido 171 y 172 de la porción FGF21 humana de la molécula de fusión (la numeración de residuos anterior se basa en la secuencia FGF21 madura y no incluye la porción Fe de la proteína de fusión) . La degradación en 171 y 172 se descubrió que ocurre primero, y se sigue por la degradación en 151-152. La degradación en 171 y 172 parece que es la misma etapa del límite de velocidad y desempeña una función en la vida media de la molécula. Cuando una secuencia Fe se fusionó a la C-terminal del FGF21, se descubrió que ' la degradación ocurre en el enlace de péptido entre los residuos de aminoácido 4 y 5 y entre los residuos de aminoácido 20 y 21. Como resultado de estos experimentos, se determinó que la secuencia Fe parece que protege la porción de la secuencia FGF21 que esta adyacente a la secuencia Fe de la degradación. Un análisis de la degradación in vivo, de la FGF21 de tipo natural y las proteínas de fusión Fc-FGF21 se condujeron adicionalmente en monos cynomolgus. Estos estudios confirmaron que el sito de decisión de FGF21 en los residuos de aminoácido 171-172 en el sitio principal de degradación de los' monos y que este sitio de degradación se conserva entre él.murino y los primates.
EJEMPLO 9 Identificación de los Mutantes Resistentes a la Proteólisis FGF21 Los mutantes FGF21 adecuados se identificaron para determinar experimentalmente las posiciones de la secuencia FGF21 de tipo natural que son los sitios de actividad proteolítica principal, y las sustituciones de aminoácidos específicos se introdujeron en estos sitios. Las sustituciones de aminoácidos se basaron en la conservación de secuencia FGF21 con otra · especie (como se describe en el Ejemplo 8) y la conservación bioquímica con otros residuos de aminoácido. Una lista de sustituciones de aminoácidos que fueron o se pueden introducir en las proteínas FGF21 de tipo natural se proporciona -en la Tabla 17, aunque la Tabla 17 es únicamente ejemplar y se pueden hacer otras sustituciones. Los números de las posiciones proporcionadas en la Tabla 17 responden a la posición de residuos en la proteina FGF21 madura, la cual consiste de 181 residuos de aminoácido Tabla 17 Residuos Mutados FGF21 Posición del Residuo nativo Mutaciones aminoácido 19 Arg Gln, lie, Lys 20 Tyr His, Leu, Phe 21 Leu lie, Phe, Tyr, Val 22 Tyr lie, Phe, Val 150 Pro Ala, Arg 151 Gly Ala, Val 152 lie His, Leu, Phe, Val 170 Gly Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Pro, Ser 171 Pro Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr 172 Ser Leu, Thr 173 Gln Arg, Glu EJEMPLO 10 Análisis in vivo de la Degradación del Fc-FGF21 y FGF21-FC determinó la estabilidad de las proteínas de fusión FGF21 Fe in vivo al inyectar ratones con una proteina de fusión, extrayendo la sangre de los ratones en varios puntos de tiempo y al analizar el suero por cromatograf a liquida-espectrometría de masas (LC- S) . En particular, los ratones se inyectaron intraperitonealmente con 10 mg/kg de Fe- (G5) -FGF21 ( SEQ ID NO: 107) (expresado en ¦ E. coli y purificado como se describe en el Ejemplo 2) o FGF21-(G3)-Fc (expresada en células de mamífero y purificada de acuerdo con los procedimientos estándares) . La sangre se extrajo de los ratones a 6, 24, y 48 horas después de la inyección (Tabla 18) y se recolectó en tubos EDTA pre- tratados con cócteles inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics) . El plasma se separó al centrifugar las muestras a 12,000 g durante 10 minutos. Las proteínas FGF21 se purificaron por afinidad de la sangre usando una resina de agarosa Fe anti-humana.
Tabla 18 Muestra FGF21 Muestra Proteina administrada Retiro de sangre D6 Fe- (G5) -FGF21 6 horas D2 Fe- (G5) -FGF21 24 horas D48 Fe- (G5) -FGF21 48 horas E6 FGF21- (G3) -Fe 6 horas E24 FGF21- (G3) -Fe 24 horas Mues ra Proteína administrada Retiro de sangre E48 FGF21- (G3) -Fe 48 horas Antes de analizar las muestras purificadas por afinidad por el LC-MS, los estándares de proteina Fe- (G5) -FGF21 y FGF21- (G3) -Fe se analizaron como una referencia. Los estándares de proteínas se redujeron ya sea con tris [2-carboxi-etil ] fosfina ( CEP) o no se redujeron. Los estándares reducidos y no reducidos se analizaron por el LC-MS usando una columna de 0.3 mm x 30 cm ACE ciano con la pulverización de efluente de columna en un espectrómetro de masas de trampa de iones LCQ Classic. Puesto que los espectros desconvulucionados de las muestras reducidas fueron más limpios, las muestras purificadas por afinidad se redujeron antes del análisis LC-MS.
Las masas observadas para el estándar Fe- (G5) -FGF21 reducido y las muestras D6, D24, y D48 se muestran en la Figura 6A-Figura 6D. Las' masas observadas para el estándar FGF21- (G3) -Fe reducido y las muestras E6, E24, y E48 se muestran en la Figura 7A-Figura 7D. Algunos de los materiales eluídos estándares y de muestra se sometieron a la secuenciación Edman a fin de confirmar la N-terminal de las proteína y los fragmentos como se determina por el LC-MS. Los resultados del análisis LC-MS de los estándares y las muestras se proporcionan en la Tabla 19.
Tabla 19 Resultados del Análisis LC-MS y Fragmentos Predichos Muestra FGF21 Masas observadas Fragmento ¿N- principales Terminal intacto? Estándar Fc- 45, 339. Da 1-414 Si (G5) -FGF21 D6 45,338 Da 1-414 Si 44,317 Da 1-404 D24 44,321 Da 1-404 Si D48 44,327 Da 1-404 Si 42,356 Da ¦p Estándar 46,408 Da 1-410 Si FGF21- (G3) -Fe (glicosilado, GOF) 1-410 44,964 Da (no glicosilado) E6 45,963 Da 5-410 No (glicosilado, GOF) 5-410 44, 516 Da (no glicosilado ) E24 45,963 Da 5-410 No (glicosilado, GOF) 5-410 44, 526 Da (no 21-410 glicosilado) 44, 130 Da (glicosilado, GOF) E48 45, 984 Da 5-410? No 44,130 Da 21-410 Muestra FGF21 Masas observadas Fragmento ¿N- principales Terminal intacto? 44,022 Da 7 Como se indica en la Tabla 19, todas las muestras purificadas por afinidad mostraron algún grado de degradación después de únicamente 6 horas de circulación. Después de 24 horas de circulación, el producto principal de Fe- (G5 ) -FGF21 fue un fragmento que consiste de residuos de aminoácido 1-404, el cual se observó en tanto las muestras D como E muestras. En las muestras E, sin embargo, el producto principal del FGF21- (G3) -Fe fue un fragmento que consiste de los residuos de aminoácido 5-410. Para ambas proteínas de fusión sometidas a prueba, la porción FGF21 de la proteína de fusión fue más susceptible a la degradación que la porción Fe de la proteína.
EJEMPLO 11 Preparación y Expresión de los Mutantes FGF21 Resistentes a la Proteólisis y las Proteínas de Fusión Los constructos que codifican los mutantes FGF21 listados en la Tabla 20 se prepararon por la amplificación PCR del vector de expresión FGF21 de tipo natural como se describe posteriormente (la construcción del vector de expresión FGF21 de tipo natural se describe en el Ejemplo 1).
Cuando una ligadura se incluyó en el constructo, la ligadura usada es GGGGGSGGGSC-GGGS ("L15," SEQ ID NO: 28). La meta de estos experimentos fue generar mutantes FGF21 que sean resistentes a la proteólisis y exhiben vidas medias más prolongadas.
Tabla 20 Mutantes FGF21 Resistentes a la Proteólisis Mutaciones Fe Ligadura R19I R19I -C00H L15 R19K R19K -COOH L15 R19Q R19Q -COOH L15 R19K, Y20H' R19 , Y20H -COOH L15 R19K, L21I R19K, L21I -COOH L15 R19K, Y20H, L21I R19K, Y20H, L21I -COOH L15 Y20F Y20F -COOH L15 Y20H Y20H -COOH L15 Y20L Y20L -COOH L15 Y20H, L21I Mutaciones Fe Ligadura Y20H, L21I -COOH L15 L21I L21I -C00H L15 L21F L21F -COOH L15 L21V L21V -COOH L15 L21Y L21Y -COOH L15 Y22F Y22F -COOH L15 10 Y22I Y22I -COOH L15 Y22V Y22V -COOH L15 P150A P150A -NH2 L15 15 P150R -NH2 L15 P150A, G151A P150A, G151A -NH2 L15 P150A, I152V P150A, I152V -NH2 L15 P150A, G151A, I152V P150A, G151A, I152V -NH2 L15 20 G151A G151A -N¾ L15 G151V G151V -NH2 L15 G151A, I152V G151A, I152V- -NH2 L15 Mutaciones Fe Ligadura I152F I152F -NH2 L15 I152H I152H -NH2 L15 5 I152L I152L -NH2 L15 I152V G170A G170A -NH2 L15 G170C G170C -NH2 L15 10 G170D G170D -NH2 L15 G170E G170E -NH2 L15 G170N G170N -NH2 L15 15 G170P G170P -NH2 L15 G170Q G170Q -NH2 L15 G170S G170S -NH2 L15 G170E, P171A 20 G170E, P171A -NH2 L15 G170E, S172L G170E, S172L -NH2 L15 G170E, P171A, S172L G170E, P171A, . S172L -NH2 L15 Mutaciones Fe Ligadura P171A -NH2 L15 P171C -NH2 L15 P171D -NH2 L15 P171E -NH2 L15 P171G -NH2 L15 P171H -NH2 L15 P171K -NH2 L15 P171N -NH2 L15 P171Q -NH2 L15 P171S -NH2 L15 P171T -NH2 L15 P171W -NH2 L15 P171Y -NH2 L15 P171A, S172L P171A, S172L -NH2 L15 S172L -NH2 L15 S172T S172T -NH2 L15 Q173E Q173E -NH2 L15 Q173R Q173R -NH2 L15 Los constructos mutantes FGF21 se prepararon usando cebadores que tienen secuencias que son homologas a las regiones cadena arriba y cadena abajo de un codón (o codones) que son mutados. Los cebadores usados en estas reacciones de amplificación también proporcionaron aproximadamente 15 nucleótidos de secuencia de solapamiento para permitir la recirculación del producto amplificado, principalmente el vector completo que ahora tiene el mutante deseado.
Un constructo mutante FGF21 ejemplar, · que codifica un mutante FGF21 que tiene un residuo de ácido glutámico en la posición 170 en lugar del residuo de glicina nativo (es decir, el mutante G170E) ' se preparó usando los cebadores mostrados en la Tabla 21.
Tabla 21 Cebadores de PCR para Preparar el Mutante FGF21 Ejemplar Cebador Secuencia SEQ ID NO: Sentido 5 ' -ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC-3 ' 23 Antisentido 5 ' -GGAAGGTTCCACCATGCTCAGAGGGTCCGA-3 ' 24 Los cebadores mostrados en la Tabla 21 permiten la sustitución del residuo de glicina . con un residuo de ácido glutámico como se muestra posteriormente, en donde la secuencia superior es el cebador de sentido (SEQ ID NO: 23), la segunda y tercera secuencias (SEQ ID NOs : 25 y 27) son porciones de un constructo de expresión FGF21 y la cuarta secuencia es el cebador antisentido (SEQ ID NO: 26) : 5 ' -ATGGTGGAACCTTCCCAGGGCCGAAGC CTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCA GAGGAGCCTGGGAGACTCGTACCACCCTGGAAGGGTCCCGGCTTCGGGGT AGCCTGGGAGACTCGTACCACCTTGGAAGG-5'' Los constructos mutantes FGF21 se prepararon usando esencialmente las condiciones de PCR descritas en el Ejemplo 1. Los productos de amplificación se digirieron con la endonucleasa de restricción Dpnl, y luego se transformaron en células competentes. Los clones resultantes se secuenciaron para confirmar la ausencia de errores generados por la polimerasa. Las proteínas de. fusión Fe- (L15) -FGF21 y FGF21-(L15)-Fc se generaron como se describe en este documento, por ejemplo, en el Ejemplo 6.
Los mutantes FGF21 se expresaron al transformar las células BL21 (DE3) o BL21 Star ( Invitrogen ; Carlsbad, CA) con el constructo que codifica un muíante particular. Los transformantes se desarrollaron durante toda la noche con aireación limitada en el medio TB suplementado con 40 pg/mL de canamicina, se airearon la siguiente mañana y después de un corto período de recuperación, se indujeron en IPTG 0.4 mM. Los polipéptidos mutantes FGF21 se cosecharon mediante centrifugación 18-20 horas después de la inducción.
Los mutantes FGF21 también se analizaron para la inmunogenicidad predicha. Las respuestas inmunitarias contra las proteínas se mejoraron mediante el procesamiento de antígenos y la presentación en el sitio de enlace clase II de complejo de histocompatibilidad principal ( HC) . Esta interacción es requerida para ayudar a las células T en la maduración de los anticuerpos que reconocen la proteina. Puesto que los sitios de enlace de las moléculas clase II MHC se han caracterizado, es posible predecir si las proteínas tienen secuencias específicas que se pueden enlazar a una serie de alelos humanos comunes. Se han creado algoritmos informáticos con base en las referencias de literatura y las estructuras de cristal clase II MHC para determinar si las secuencias de péptidos de aminoácido lineales tienen el potencial de romper la tolerancia inmunitaria. El programa de computadora TEPITOPE se usó para determinar si las mutaciones puntuales en los mutantes FGF21 particulares incrementarían las células T específicas de antígeno en una mayoría de humanos. Con base en un análisis de la secuencia de proteínas lineal de cada mutante FGF21, ninguno de los mutantes se predijo para mejorar la inmunogenicidad .
EJEMPLO 12 Impacto de la Secuencia de Ligadura sobre la Degradación FGF21 Para determinar si la presencia de una ligadura de aminoácidos más grande entre la secuencia Fe y la secuencia FGF21 afecta la degradación FGF21, se inyectaron ratones con proteínas de fusión FGF21 en las cuales la región Fe se separó de la secuencia FGF21 por una ligadura de 15 aminoácidos que tiene la secuencia GGGGGSGGGSGGGGS (designada "L15", SEQ ID NO: 28), se extrajo sangre de los ratones en varios puntos de tiempo, y el suero se analizó por LC-MS. En particular, los ratones se inyectaron con Fe- (L15) -FGF21 o FGF21- (L15) -Fe (obtenidos de E. coli) a 23 mg/kg, se extrajo sangre a 6, 24, y 48 horas, y la sangre extraída se purificó por afinidad usando una- resina de agarosa Fe anti-humana.
Antes de analizar las muestras purificadas por el LC-MS, los estándares de proteínas Fe- (L15) -FGF21 y FGF21- (L15) -Fe se analizaron como una referencia. Los estándares de proteínas se redujeron ya sea con TCEP o no se redujeron. Ambos estándares reducidos y no reducidos se analizaron por LC-MS usando una columna de 0.3 mm x 30 cm de ACE ciano con la pulverización de efluente de columna en un espectrómetro de masas de trampa de iones LCQ Classic. Puesto que los espectros desconvolucionados de las muestras reducidas fueron más limpios, las muéstras purificadas por afinidad se redujeron antes del análisis LC-MS.
Las masas observadas para el estándar Fe- (L15 ) -FGF21 reducido y las ' muestras purificadas por afinidad correspondientes retiradas en varios puntos de tiempo se muestran en la Figura 8A-Figura 8D. Las masas observadas para el estándar FGF21- (L15) -Fe reducido y las muestras purificadas por afinidad correspondientes retiradas en varios puntos de tiempo se muestran en la Figura 9A-Figura 9D.
Algunos de los materiales eluidos estándares y de muestra se sometieron a la secuenciación de Edman a fin de confirmar la N-terminal de las proteínas y asistir en predecir la identidad de los fragmentos observados por LC-MS. Los resultados del análisis LC-MS de los estándares y las muestras y una indicación de los fragmentos predichos se proporcionan en la Tabla 22.
Tabla 22 Resultados del Análisis LC-MS y los Fragmentos Predichos Masas Porcentaje Fragmento ¿terminal Muestra observadas del Total N intacta? FGF21 principales Estándar Fc- 46, 002 Da 100% 1-424 Si (L15) -FGF21 Fe (L15) FGF21 46,000 Da 65% 1-424 Si 6 horas 44,978 Da 35% 1-414 Fe- (L15) - 44,978 Da 85% 1-414 Si FGF21 43,022 Da ' 15% 1-394 24 horas Fe- (L15) - 44, 976 Da 60% 1-414 Si FGF21 43,019 Da 40% 1-394 48 horas Estándar 45, 999 Da 100% 1-424 Si Masas Porcentaje Fragmento ¿terminal Muestra observadas del Total N intacta? FGF21 principales FGF21- (L15) - Fe FGF21- (L15) - 45, 870 Da 100% 1-423 Si Fe 6 horas FGF21- (L15) - 45,869 Da 40% 1-423 Alguno Fe 45,301 Da 35% 6-423 24 horas 43,460 Da 25% 22-423 FGF21- (L15) - 45,870 Da 15% 1-423 Alguno Fe 45,297 Da 20% 6-423 48 horas 43,461 Da 65% 22-423 Como se indica en la Tabla 22, todas las muestras purificadas por afinidad mostraron algún grado de degradación después de únicamente 6 horas de circulación. Después de 24 horas de circulación, los productos principales de Fe- (L15) -FGF21 fueron fragmentos que consisten de residuos de aminoácido 1-414 (85% de la muestra) y 1-394 (15% de la muestra), y los productos principales de FGF21(15)Fc fueron fragmentos que consisten de los residuos de aminoácido 1-423 (40% de la muestra), 6- 423 (35% de la muestra),, y 22-423 (25% de la muestra) . Los puntos de escisión identificados para las proteínas Fc- (L15)-FGF21 y FGF2I- (L15 ) -Fe se muestran en la Figura 10A y Figura 10B, respectivamente.
EJEMPLO 13 Actividad in vivo de los Mutantes Fe- (L15) -FGF21 Resistentes a la Proteólisis a 1-7 Dias Después de la Inyección Como se describe en este documento, la escisión proteolitica de las proteínas de fusión FGF21 Fe depende de la orientación de la secuencia Fe, con el extremo Fe de la proteína de fusión que es más estable que el extremo FGF21 de la proteína de fusión (es decir, la porción N-terminal de las proteínas de fusión Fc-(L15) -FGF21 y la porción C-terminal de las proteínas de fusión FGF21- (L15) -Fe se descubrieron que son más estables). Por ejemplo, la escisión se identificó en las posiciones 5 y 21 de FGF21- (L15 ) -Fe y las posiciones 151 y 171 de Fe- ( Ll 5 ) -FGF21.
Como resultado de estas observaciones, se realizó una investigación para identificar mutantes FGF21 resistentes a la proteólisis. El análisis LC-MS de Fe- (L15) -FGF21 demuestra que la degradación proteolitica in vivo ocurre primero entre los residuos de aminoácido 171-172, seguido por la degradación entre los residuos de aminoácido 151-152. Al bloquear la degradación proteolitica en la posición 171, la escisión en la posición 151 se puede evitar, prolongando efectivamente la vida media de la molécula. Sin 130 embargo, los mutantes resistentes a la proteólisis en la cual la escisión se evita en la posición 151 aún puede poseer residuos en la posición 171 que son susceptibles al ataque de la proteasa, dando por resultado en consecuencia una molécula que pierde los últimos 10 aminoácidos, los cuales se sabe que se implican en el enlace del co-receptor ß-Klotho, el cual es un determinante de la afinidad del receptor de ligando y la potencia in vitro e in vivo. Por lo tanto, la mutagénesis de los residuos de aminoácido que circundan la posición 171 en el FGF21 maduro parece que es más critica para mejorar la estabilidad in vivo, potencia y eficacia de la molécula.
La actividad in vivo de los mutantes Fe- (L15) -FGF21 resistentes a la proteólisis particulares se sometió a ensayo al inyectar ihtraperitonéalmente ratones ob/ob con un mutante FGF21, al extraer las' muestras de sangre de los ratones inyectados a 0, 0.25, 1, 3, 5, y 7 días después de la inyección, y luego al medir los niveles de glucosa en la sangre en las muestras. Los resultados de un experimento se proporcionan en la Figura 11, la cual muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con un control PBS, un control Fe- (L15) -B^GF21 (SEQ ID NO: 49), o los mutantes Fe- (L15 ) -FGF21 , Fe- (L15 ) -FGF21 G170E (SEQ ID NO: 51), Fe- (L15) -FGF21 P171A (SEQ ID NO: 53), Fe- (L15) -FGF21 S172L (SEQ ID NO: 55), Fe- (L15 ) -FGF21 (G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO: 59), o Fe- (L15) -FGF21 G151A (SEQ ID NO: 61). La Figura 12 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de sangre en la glucosa como se determina en este experimento. Este experimento demuestra que los mutantes Fe- (L15 ) -FGF21 G170E, Fe- (L15) -FGF21 ?G71?, Fe- (L15) -FGF21 S172L, y Fc-(L15)-FGF21 (G170E, P171A, S172L) exhiben una actividad de disminución de glucosa en la sangre sostenida por hasta 5 días, los cual es superior a la actividad del Fe- (L15) -FGF21 de tipo natural. El mutante Fe- (L15 ) -FGF21 G151A solo mejoró parcialmente la duración de .la actividad de disminución de glucosa en la sangre como es comparada con la proteína de fusión Fe- (L15 ) -FGF21 de tipo natural. Sorprendentemente, aunque el mutante Fe- (L15) -FGF21 S172L no es un mutante resistente a la proteólisis, y por lo tanto tiene un perfil de degradación similar como el polipéptido Fe- (L15) -FGF21 de tipo natural, este mutante se descubrió que exhibe una eficacia in vivo mejorada como es comparado con el polipéptido Fe- (L15) -FGF21 de tipo natural.
Los resultados de otro experimento se proporcionan en la Figura 13, la cual muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con un control PBS, un control Fe- (Ll 5 ) -FGF21 , o los mutantes Fe- (L15) -FGF21, Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A, I152V) (SEQ ID NO: 65), Fe- (L15)-FGF21 G170E, Fe- (L15) -FGF21 (G170E, P171A) (SEQ ID. NO: 63), o Fe- (L15) -FGF21 (G170E, S172L) (SEQ ID NO: 67). La Figura 14 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre como se determina en este experimento. Como en el experimento descrito anteriormente, la proteina de fusión Fc-FGF21 de tipo natural y el mutante Fe- (L15) -FGF21 (P150A, G151A, I152V) no exhiben una actividad de disminución de glucosa en la sangre sostenida, posiblemente debido a que la degradación en el sitio 171 aún podría ocurrir, y los niveles de glucosa en la sangre en animales inyectados con estas proteínas regresaron en la línea base 24 horas después de la inyección. Sin embargo, el Fe- (L15) -FGF21 G170E, Fe- (L15) -FGF21 (G170E, P171A) , o Fe- (L15) -FGF21 (G170E, S172L) exhibieron una actividad de disminución de glucosa en . la sangre máxima hasta 5 días después de la inyección, lo cual es superior a la proteína de fusión Fe- (L15 ) -FGF21 de tipo natural y el mutante Fc-(L15)-FGF21 (P150A, G151A, I152V).
Los resultados de otro experimento se proporcionan en la Figura 15, la cual muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con un control PBS o los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fe- (L15) -FGF21 G170E (SEQ ID NO: 51), Fe- (L15) -FGF21 G170A (SEQ ID NO: 69), Fe- ( Ll 5 ) -FGF21 G170C (SEQ ID NO: 71), Fe- (L15) -FGF21 G170D (SEQ ID NO: 73), Fe- (L15J-FGF21 G170N (SEQ. ID NO: 75), o Fe- (L15) -FGF21 G170S (SEQ ID NO: 77) . La Figura 16 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre como se determina en este experimento. Todos los mutantes FGF21 sometidos a prueba en este experimento exhibieron una actividad de disminución de glucosa en la sangre sostenida por hasta 5 días después de la inyección.
Los resultados de otro experimento se proporcionan en la Figura 17, la cual muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con PBS o los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fe- (L15) -FGF21 G170E (SEQ ID NO: 51), Fc-(L15)-FGF21 P171E (SEQ ID NO: 79), Fe- (L15) -FGF21 P171H (SEQ ID NO: 81), Fe- (L15 ) -FGF21 P171Q (SEQ ID NO: 83), Fc-(L15)-FGF21 P171T (SEQ ID- NO: 85), o Fe- (L15) -FGF21 P171Y (SEQ ID NO: 87) . La Figura 18 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre como se determina en este experimento. Todos los mutantes FGF21 sometidos a prueba en este experimento exhibieron una actividad de disminución de glucosa en la sangre mejorada cuando se compara con el Fc-FGF21 de tipo natural.
EJEMPLO 1 Degradación In vivo de los Mutantes Fe- (L15) -FGF21 Resistentes a la Proteólisis de 6 a 120 Horas Después de la Inyección La estabilidad in vivo de los mutantes FGF21 seleccionados se analizó al inyectar ratones con un mutante FGF21, al extraer la sangre de los ratones en varios puntos de tiempo y al analizar el suero por LC-MS. En particular, los ratones se inyectaron con ya sea los mutantes Fc-(L15)-FGF21 G170E, Fe- (L15) -FGF21 P171A, o Fe- ( Ll 5 ) - FGF21 S172L (obtenidos de E. coli como se describen en el Ejemplo 2), cada uno de los cuales se diluyó en aproximadamente 180 pL de HC1 10 mM para inyección, y la sangre se extrajo a 6, 24, 48, 72, y 120 horas. .Las proteínas FGF21 se purificaron por afinidad de la sangre extraída usando una columna de resina de agarosa Fe ánti-humana. Las muestras se eluyeron de la columna usando HC1 10 mM. Todos los constructos FGF21 comprenden una región Fe y una ligadura de 15 aminoácidos en el extremo amino-terminal de la proteína FGF21. Los ratones también se inyectaron con un control FGF21 de tipo natural .
Antes de analizar las muestras, purificadas por afinidad por el LC-MS, los mutantes FGF21 de tipo natural no procesados y FGF21 no procesados se analizaron como una referencia. Todos los estándares y las muestras de punto de tiempo se redujeron con' el TCEP, y luego se analizaron por el LC-MS usando una columna de 0.3 mm x 30 cm de ACE ciano con la pulverización de efluente de columna dentro de un espectro de masas de trampa de iones LCQ Classic. Las muestras purificadas por afinidad se disminuyeron con acetato de amonio, se redujeron con TCEP, y luego se analizaron ' por el LC-MS como se describe anteriormente.
Las masas observadas para el Fe- (L15) -FGF21 de tipo natural a 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección se muestran en la Figura 19A-Figura 19D, respectivamente. Las masas observadas para Fe- (L15) -FGF21 G170E a 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección se muestran en la Figura 20A-Figura 20D, respectivamente. Las masas observadas para Fc-(L15J-FGF21 P171A a 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección se muestran en las Figura 21A-Figura 21D, respectivamente. Las masas observadas para Fe- (L15 ) -FGF21 S172L a 0, 6, 24 y 48 horas después de la inyección se muestran en la Figura 22A-Figura 22D, respectivamente.
Todas las muestras extraídas a 72 y 120 horas se descubrieron gue contienen un componente de peso molecular alto (>200 kDa pdr el SDS-PAGE no de reducción) de fibrinógeno que es mucho más abundante que la proteína de fusión Fe- (L15) -FGF21 restante. Los resultados del análisis LC-MS de los otros estándares y las muestras se proporcionan en la Tabla 23.
Tabla 23 Resultados del Análisis LC-MS y los Fragmentos Predichos Muestra FGF21 Masas Porcentaje Fragmento Edman observadas del total principales Estándar Fc- 45,994 Da 100% 1-424 - (L15) -FGF21 TN Fe- (L15) - 46,001 Da 80% 1-424 No FGF21 TN 44 , 987 Da 20% 1-414 6 horas Fe- (L15) - 44, 979 Da -100% 1-414 No FGF21 TN 24 horas Fe- (L15) - 44, 980 D -100% 1-414 - FGF21 TN 48 horas Estándar Fc- 46, 068 Da 100% 1-424 - (L15) -FGF21 G170E Fe- (L15) - 46,078 Da 100% 1-424 NO FGF21 G170E 6 horas Fe- (L15) - 46,074 Da 80% 1-424 No FGF21 G170E 45,761 Da 20% 1-421 24 horas Fe- (L15) - 46,072 Da -60% 1-424 No FGF21 G170E 45,760 Da -40% 1-421 48 horas Muestra FGF21 Masas Porcentaje Fragmento Edman observadas del total principales Estándar Fc- 45,970 Da 100% 1-424 - (L15) -FGF21 P171A Fe- (L15) - 45, 980 Da 100% 1-424 No FGF21 P171A 6 horas Fe- (L15) - 45,973 Da -70% 1-424 No FGF21 P171A 45,657 Da -30% 1-421 24 horas Fe- (L15) - 45,992 Da -50% 1-424 NO FGF21 P171A 45, 673 Da -50% 1-421 48 horas Estándar Fc- 46,022 Da 100% 1-424 - (L15) -FGF21 S172L Fe- (L15) - 46, 027 Da 100% 1-424 No FGF21 S172L 6 horas Fe- (L15) - 44,984 Da 100% 1-414 No FGF21 S172L 24 horas Fe- (L15) - 44, 985 Da 100% 1-414 No FGF21 S172L 48 horas Como se indica en la Tabla 23, la degradación del Fc- (L15)-FGF21 de tipo natural y el mutante S172L se ven similares, en que después de 24 horas de circulación, el producto principal de la proteína de fusión fue un fragmento que consiste de los residuos de aminoácido 1-414. Los productos de degradación . de los mutantes Fe- (L15) -FGF21 G170E y Fe- (L15) -FGF21 P171A también se ven similares en que las muestras extraídas después e 24 horas de circulación contienen 70-80% ' de proteína intacta (aminoácidos 1-424) y 20-30% de un fragmento que consiste de los residuos de aminoácido 1-421. Aún después de 48 horas, los mutantes Fe- ( Ll 5 ) - FGF21 G170E y Fe- (L15) -FGF21 P171A aún retienen la proteína intacta mientras que muestran un incremento en la cantidad del fragmento que consiste de los residuos de aminoácido 1-421. Como se observa en el análisis anterior de los constructos Fc-FGF21, se detectó la degradación de la porción FGF21 de proteína de fusión y la porción Fe se descubrió que permanece estable. Los sitios de escisión identificados por el Fe- (L15) -FGF21 G170E, Fe- ( Ll 5 ) - FGF21 P171A, y Fc-(L15)-FGF21 S172L de tipo natural se muestran en la Figura 23A-Figura 23D, respectivamente.
EJEMPLO 15 Identificación de los Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación Una propiedad del FGF21 de tipo natural es su propensión a agregarse. En vista de esta propiedad, se deseó generar mutantes FGF21 de reducción de agregación. Los mutantes FGF21 de reducción de agregación se identificaron sobre la base de dos hipótesis. La primera hipótesis es que, con respecto a FGF21, la agregación (o dimerización) se desencadena por interacciones hidrofóbicas e interacciones van der Waals entre las moléculas FGF21 causadas por los residuos hidrofóbicos que se exponen al medio ambiente de solvente basado en agua hidrofilico. La segunda hipótesis es que estos residuos hidrofóbicos expuestos se pueden sustituir para crear mutaciones puntuales de reducción de agregación en la secuencia de aminoácido FGF21 si comprometer la actividad FGF21.
Se usó un procedimiento de ingeniería de proteínas racional sistemático para identificar residuos hidrofóbicos expuestos en FGF21. Ya que no se conocían las estructuras de rayos X o RNM de FGF21 que se podrían usar para identificar los residuos hidrofóbicos expuestos, una estructura de cristal de rayos X (1.3 A) de alta resolución de FGF19 (IPWA) obtenida de Banco de Datos de Proteína (PDB) se usó para crear un modelo de homología 3D del FGF21 usando un software de modelación MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group; Montreal, Quebec, Canadá) . El FGF19 se seleccionó como una plantilla, puesto que entre las proteínas depositadas en el PDB, el FGF19 es la proteina más estrechamente relacionada con el FGF21 en términos de la homología de secuencia de aminoácidos.
La accesibilidad del solvente se calculó por el siguiente método usando MOE . Una primera medición del área superficial (SAI) se define como el área de la superficie accesible del residuo en A2. Mientras" que un residuo de aminoácido particular se presenta en una secuencia primaria de la proteína muchas veces, cada ocurrencia en el residuo puede tener un área superficial diferente debido a las diferencias en, inter alia, la proximidad del residuo a la superficie de la proteína. La orientación de la cadena lateral del residuo, y. la posición espacial de los residuos de aminoácido adyacentes. Por lo tanto, una segunda medición del área superficial (SA2) se hace en donde el residuo de interés se extrae de la estructura de la proteína junto con ese vecino del residuo, o residuos adyacentes. Estos residuos espacialmente adyacentes son mutados in silico a glicinas para remover sus cadenas laterales, y luego se calcula la SA2 para el residuo de interés, proporcionando una medida del área superficial posible total para ese residuo en su conformación particular. Una relación de SAI a SA2 (SA1/SA2) entonces puede proporcionar una medición del porcentaje del área superficial posible para ese residuo que se expone actualmente.
Varios residuos hidrofóbicos que se exponen altamente al solvente se seleccionaron para el análisis adicional, y las mutaciones puntuales in silico se hicieron para estos residuos para reemplazar el residuo seleccionado con los otros residuos de aminoácido de origen natural. Los cambios en la estabilidad térmica en la proteína que resultan de diferentes sustituciones se calcularon usando el modelo FGF21 y el programa basado en la red interactivo CUPSAT (Cologne üniversity Protein Stability Analysis Tools) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el sitio de la red CUPSAT. Véase Parthiban y colaboradores, 2006, Nucleic Acids Res. 34: W239-42; Parthiban y colaboradores, 2007, BMC Struct. Biol. 7:54. Significativamente las mutaciones de desestabilización o hidrofóbicas se excluyeron en el diseño de las variantes de mutación puntual de reducción de agregación. Las sustituciones de estabilización (o, en casos raros, ligeramente de desestabilización) que introducen características hidrofílicas y/o iónicas mejoradas se consideraron como candidatos para los mutantes FGF21 de reducción de agregación.
Un resumen de los datos generados a través de este procedimiento de ingeniería de proteínas racional se proporciona en la Tabla 24, la cual también lista mutantes FGF21 ejemplares esperados que tengan una agregación de proteínas reducida y estabilidad mejorada.
Tabla 24 Efecto Calculado de los utantes FGF21 Sobre la Estabilidad # de residuo Residuo TN Mutación Estabilización (Kcal/mol) 2.6 A K 1.25 E 1.54 R 2.016 45 A T 0.66 Q 0.71 ' K 1.8 E 2.34 R 1.59 52 L T -0.33 58 L G 0.16 S -0.15 C 1.0 E 0.08 60 P A 1.3 K 1.51 E 0.66 R 1.31 78 P A 0.14 • C 2.48 R 0.08 H 0.13 86 L T 0.18 C 4.1 # de residuo Residuo TN Mutación Estabilización (Kcal/mol) 88 F A 2.52 S 3.08 K 2.88 E 1.48 98 L T 0.49 Q 0.17 K -0.19 c . 3.08 E 0.84 R 3.4 99 L C 7.34 E 2.0 D 1.01 R 1.61 111 A T 0.47 K -0.12 129 A Q 3.93 K 1.02 N 3.76 E 3.01 D 3.76 R 1.68 H 2.9 13 A K 5.37 Y 4.32 E 5.13 R 6.18 ' H 2.86 EJEMPLO 16 Preparación y Expresión de Mu an es FGF21 de Reducción de Agregación y Proteínas de Fusión Los constructos que codifican los mutantes FGF21 listados en la Tabla 25 se prepararon por la amplificación de PCR del vector de expresión FGF21 de tipo natural como se describe en el Ejemplo 11 (la construcción del vector de expresión FGF21 de tipo natural se describe en el Ejemplo 1) . Las proteínas de fusión se generaron como se describe en este documento, por ejemplo, en el Ejemplo 6. Cuando una ligadura se empleó fue GGGGGSGGGSGGGGS ("L15," SEQ ID NO: 28) Tabla 25 Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación Mutaciones Fe Ligadura A26E A26K A26R A45E A45K · A45K -NH2 L15 A45R -NH2 L15 A45Q -NH2 L15 A T -NH2 L15 A45K, L98R -NH2 L15 Mutaciones Fe Ligadura L52T L58C L58E L58G 5 L58S P60A P60E P60K P60R P78A P78C 10 P78H P78R .
L86C L86T F88A F88E 15 F88K F88R F88S L98C L98E -NH2 L15 L98K -NH2 L15 L98Q -NH2 L15 20 L98R L98R . -NH2 L15 L99C L99D L99E L99R Mutaciones Fe Ligadura AlilK -NH2 L15 A111T.
A129D A129E -NH2 L15 A129H -NH2 L15 A129K A129N -NH2 L15 A129R -NH2 L15 A129Q A134E A134H -NH2 L15 A134K A134Y La agregación de varias proteínas FGF21, que incluyen FGF21 de tipo natural, polipéptido FGF21 truncados, mutantes FGF21, y proteínas de fusión FGF21 se sometieron a ensayo por la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) . Las muestras que se analizan se incubaron a 4°C, a temperatura ambiente, o 37°C por varios puntos de tiempo, y luego se sometieron al análisis SEC. Los experimentos se realizaron sobre un sistema HPLC Beckman equipado con una columna SEC. Para el FGF21 de ' tipo natural, se usó una columna TOSOHAAS TSK-GeL G2000 SEC con 2x de PBS que contiene alcohol isopropílico al 2% como la fase móvil. Para las proteínas de fusión FGF21 Fe y los polipéptidos mutantes FGF21, se usó una columna TOSOHAAS TSK-Gel G3000 SEC con 2x de PBS como la fase móvil.
EJEMPLO 17 Actividad Jn vitro de los Mutantes FGF21 de Reducción de Agregación Se realizaron experimentos para identificar mutantes de reducción de agregación que retienen la actividad FGF21 de tipo natural en una ensayo in vitro de ELK-luciferasa . Los ensayos de ELK-luci ferasa se realizaron como se describe en el Ejemplo 4. La. Figura 24A-Figura 24C muestran los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferasa realizado sobre los mutantes FGF21 FGF21 L99R (SEQ ID NO: 109), FGF21 L99D (SEQ ID NO: 111), y FGF21 A111T (SEQ ID NO: 113) (Figura 24A) ; los mutantes FGF21 FGF21 A129D (SEQ ID NO: 115), FGF21 A129Q (SEQ ID NO: 117), y FGF21 A134K (SEQ ID NO: 119) (Figura 24B) ; y los mutantes FGF21 FGF21 A134Y (SEQ ID NO: 121), FGF21 A134E (SEQ ID NO: 123), y FGF21 A129K (SEQ ID NO: 125) (Figura 24C) . Los resultados de estos experimentos demostraron que algunas de las mutaciones de reducción de agregación no impactaron adversamente la actividad FGF21 como se sometió a ensayo en los ensayos de ELK-luci ferasa .
EJEMPLO 18 Preparación y Expresión de los Mutantes de Combinación Fc- (L15) -FGF21 que Muestran Vida Media Más Prolongada y Niveles Más Bajos de Agregación Una variedad de mutantes de combinación FGF21, que contiene mutaciones mostradas para reducir la agregación asi como también para incrementar la vida media al interrumpir la degradación proteolitica , se prepararon y se conjugaron a las moléculas IgGl Fe ( SEQ ID NO:. 11). Estos mutantes FGF21 se prepararon esencialmente como se describe en el Ejemplo 11.
EJEMPLO 19 Estudios In vitro de Mutantes Fe- (L15) -FGF21 que Muestran Vida Media Más Prolongada y Niveles Más Bajos de Agregación Se realizaron experimentos para identificar los mutantes de combinación FGF21 que retienen la actividad FGF21 de tipo natural en un ensayo in vitro de ELK-luciferasa . Se realizaron ensayos de ELK-luciferasa como se describe en el Ejemplo 4.
Las Figuras 25A-25D muestran los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luci ferasa realizados sobre los mutantes Fe- (L15) -FGF21 Fe- (L15 ) -FGF21 P171G, Fe- (L15) -FGF21 P171S, y Fe- (L15) -FGF21 P171T (Figura 25A) ; los mutantes Fc-(L15)-FGF21 Fc-(L15) -FGF21 ??1?, Fe- (L15) -FGF21 P171W, y Fc-(L15)-FGF21 P171C (Figura 25B) ; Fe- (L15) -FGF21 , Fe- (L15 ) -FGF21 (A45K, G170E), y FGF2l' A45K (Figura 25C) ; y Fe- (L15) -FGF21, Fe- (L15) -FGF21 P171E, y Fe- ( Ll 5 ) -FGF21 (A45K, G170E) (Figura 25D) . Los resultados de estos experimentos demuestran que las mutaciones dirigidas a mejorar la estabilidad, o tanto la estabilidad como la solubilidad, no comprometieron la actividad in vitro como es comparado con el Fe- (L15 ) -FGF21 de tipo natural. Interesantemente, el mutante FGF21 A45K mostró una potencia mejorada relativa con el Fe- ( L15 ) -FGF21 de tipo natural.
La Figura 26A muestra el cambio en el porcentaje de agregación para un control FGF21 (TN) y FGF21 A45K después de la incubación de 65 mg/mL de proteina a 4°C durante 1, 2, y 4 días. Los datos indicaron que la mutación A45K conduce a una disminución en la agregación de la proteina, comparada con la proteina de tipo natural.
La Figura 26B muestra el cambio en el porcentaje de agregación para un control FGF21 (TN) y FGF21 P78C, FGF21 P78R, FGF21 L86T, FGF21 L86C, FGF21 L98C, FGF21 L98R, FGF21 A111T, FGF21 A129D, FGF21 A129Q, FGF21 A129K, FGF21 A134K, FGF21 A134Y, y FGF21 Al 3.4E después de la incubación de 65 mg/mL de proteínas a 4°C durante 1, 6, y 10 días. Los datos indicaron que el FGF21 L86C, FGF21 L98C, FGF21 L98R, FGF21 FGF21 A111T, FGF21 A129Q, y FGF21 A129K condujo a una disminución a la agregación de la proteina, comparada con la proteina de tipo natural.
La Figura 27 muestra los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferasa realizados sobre un control FGF21 humano y los mutantes FGF21 FGF21 A45K, FGF21 L52T, y FGF21 L58E. Este experimento demuestra que el mutante FGF21 A45K retiene la eficacia total del FGF21 de tipo natural y exhibe una potencia que es aún mayor que el FGF21 de tipo natural. Sin embargo, los mutantes FGF21 L52T, y FGF21 L58E muestran una potencia y eficacia reducidas como es comparado con el FGF21 de tipo natural.
Las Figuras 28A-28B muestran el cambio en los niveles de agregación para los mutantes Fe- (L15 ) -FGF21 Fe- (L15 ) -FGF21 (6-181, G170E), Fe- (L15 ) -FGF21 (A45K, G170E) , Fe- (L15) -FGF21 P171E, Fe- (L15) -FGF21 P171A, Fe- ( Ll 5 ) - FGF21 G170E, y un control FGF21 después de la incubación a 4°C durante 1, 4, y 8 días. Este experimento demuestra que durante el periodo de d días, el mutante Fe- (L15) -FGF21 (A45K, G170E) mostró menos agregación que los mutantes Fe- (L15 ) -FGF21 G170E o Fc-(L15)-FGF21 P171E, pero los tres mutantes mostraron menos agregación que el control Fe- (L15 ) -FGF21. La Tabla 17 muestra el porcentaje de agregación obtenido para un control Fc-(L15) -FGF21 y el mutante Fe- (Ll5) -FGF21 (A45K, G170E) después de la incubación a 4°C o a temperatura ambiente durante 0, 2, 3, 4, o 7 días.
Tabla 26 Porcentaje de Agregación para el Fc-FGF21 y Mutante Fc-FGF21 Muestra Día 0 Día 2 Día 3 Día 4 Día 7 Fe- (L15) -FGF21 TN 4°C 1.12 1.71 1.89 2.14 2.32 32 mg/mL RT 1.12 6.09 7.94 9.57 12.59 Fe- (L15) -FGF21 4°C 0.45 0.77 0.88 1.03 1.24 (A45K, G170E) 33 mg/mL RT 0.45 3.86 5.22 6.62 8.60 EJEMPLO 20 Preparación y Expresión de los Mutantes de Combinación de Fusión FGF21 Como se describe anteriormente, la estabilidad y solubilidad del FGF21 se puede modular a través de la introducción de truncamientos específicos y sustituciones de aminoácidos. Además,, la estabilidad FGF21 se puede mejorar adicionalmente al fusionar estas proteínas FGF21 modificadas con la porción Fe del gen IgGl dé de inmunoglobulina humano. Por otra parte, al introducir combinaciones de las modificaciones anteriores, se pueden generar moléculas FGF21 que tienen tanto estabilidad como solubilidad mejoradas. Las secuencias de' ácidos nucleicos que codifican los mutantes de combinación FGF21 listados en la Tabla 27 se prepararon usando las técnicas descritas anteriormente. GGGGGSGGGSGGGGS ( SEQ ID NO: 28) .
Tabla 27 Mutan es de Combinación FGF21 Residuos de Mutación de Mutación de Fe Ligadura aminoácido proteolisis agregación 1-181 G170E A45K -NH2 L15 1-181 G170E L98R -NH2 L15 1-181 G170E A45K, L98R -NH2 L15 1-181 P171G A45K -NH2 L15 1-181 ' P171S A45 -NH2 L15 1-181 P171G L98R -NH2 L15 1-181 P171S L98R -NH2 L15 1-181 P171G A45K, L98R -NH2 L15 1-178 G170E -NH2 L15 6-181 G17CE -NH2 L15 6-181 G170E A45K -NH2 L15 6-181 G170E L98R -NH2 L15 6-181 P171G -NH2 L15 6-181 P171G L98R -NH2 L15 7-181 G170E -NH2 L15 La Figura 29 muestra los niveles de glucosa en la sangre medidos en ratones inyectados con los mutantes de combinación Fe- (L15) -FGF21 Fe- (L15) -FGF21 (A45K, G170E) , Fe- (L15) -FGF21 (A45K, P171G), o Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) .
En otro experimento el mutante FGF21 Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) se estudió en¦ paralelo con el FGF21 de tipo natural y el Fc-FGF21. En un experimento, una linea de células 293T recombinantes se cultivó en presencia de diferentes concentraciones de FGF21, Fe- (L15) -FGF21 , o Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) durante 6 horas. Los Usados celulares luego se sometieron a ensayo para la actividad de luciferasa. Como se muestra en la Figura 30, el Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) tuvo actividad similar al Fe- (L15 ) -FGF21 , indicando que la introducción de las dos mutaciones puntuales no alteraron la actividad in vitro de la molécula.
En todavía otro experimento, la estabilidad del Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) a 65 mg/mL se evaluó durante nueve días a dos temperaturas diferentes, principalmente a temperatura ambiente y .a 4°C, en paralelo con el FGF21 y Fc-(L15)-FGF21. Después del período de incubación los lisados celulares se analizaron con SEC-HPLC para determinar un perfil de agregación contra tiempo en varias temperaturas. Los datos mostrados en la Figura 31A y Figura 31B indican que la velocidad de la formación de agregación se redujo significativamente en el Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) a temperatura ambiente (triángulos sólidos, línea punteada en la Figura 31A) y a 4°C (triángulos sólidos, línea punteada en la Figura 31B) .
EJEMPLO 21 Mutantes FGF21 Resistentes a la Proteólisis que Comprenden Mutaciones en el C-terminal También se estudió la estabilidad ín vivo de los mutantes de combinación. Específicamente, la estabilidad in vivo del Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) se comparó con la estabilidad de Fe- (L15) -FGF21 en modelos de murino y cynomolgus. Los resultados se encontraron que son similares en ambas especies. En el estudio de cynomolgus, el Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) y Fe- ( L15 ) -FGF21 se inyectaron IV en 23.5 mg/kg y las alícuotas del suero y plasma se recolectaron en los puntos de tiempo a 840 horas después de la dosis. Se analizaron los puntos de tiempo de las 168 horas. Las muestras de punto de tiempo se purificaron por afinidad usando reactivos anti-Fc, luego se analizaron usando la espectrometría de masas MALDI . Los resultados se correlacionaron bien entre los dos análisis.
Al analizar los datos generados usando la inmunoafinidad- ALDI , que recorta el sitio P171 se observó que se elimina en la molécula Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) como resultado de la mutación de P171 a P171 G. Sin embargo, una degradación menor y lenta que da por resultado una pérdida de hasta 3 residuos C-terminales se observó para Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) (Figura 32). Las escisiones menores en los tres residuos C-terminales también se observaron con otros mutantes FGF21 después de que el sitio de escisión más susceptible entre los residuos de aminoácido 171 y 172 se bloqueó como se muestra en la 20 y Figura 21. La escisión de 3 residuos C-terminales puede representar el cese de la escisión del extremo C-terminal de la molécula por una carboxipeptidasa en una forma secuencia, residuo a residuo o un ataque de proteasa . especifica en los residuos de aminoácido 178 y 179 con el recorte no especifico en los residuos de aminoácido 179-180 y 180-181. La pérdida de los 2-3 aminoácidos en. la C-terminal o podría causar el enlace reducido del ß-Klotho y la potencia finalmente disminuida y la actividad in vivo de la molécula Véase, por ejemplo, Yie y colaboradores, 2009, FEBS Lett. 583:19-24. Para tratar la degradación del carboxipeptidasa evidente de la C-terminal, se estudió el impacto de agregar un residuo de aminoácido "tapa" a varios polipéptidos mutantes FGF21. Una variedad de constructos, que incluyen aquellos representados en la Tabla 28, se hicieron y se sometieron a ensayo usando las técnicas descritas en este documento. La Tabla 28 resume los resultados del ensayo de ELK-luciferasa in vitro.
Las terminaciones de aminoácidos adecuadas pueden ser de entre 1 y 15 aminoácidos en longitud, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10 o 15 aminoácidos en longitud. Cualquier número y tipo de aminoácido ( s ) se puede emplear como una tapa, por ejemplo, un residuo de prolina individual, y un residuo de glicina individual, dos residuos de glicina, cinco residuos de glicina, asi como también otras combinaciones. Ejemplos adicionales de terminaciones se proporcionan en el presente Ejemplo y en la Tabla 19.
Adicionalmente , para tratar el ataque de proteasa evidente en los residuos de aminoácido 178 y 179, se estudió la mutación de los residuos de aminoácido en la posiciones 179, 180 y 181. Nuevamente, una variedad de constructos, que incluyen aquellos presentados en la Tabla 28, se hicieron y se sometieron a ensayo usando las técnicas descritas en este documento. El impacto de las combinaciones de la terminación y las mutaciones en estos sitios también se exploró. La Tabla 28 resume los constructos ejemplares que se hicieron y se estudiaron en el ensayo de ELK-luciferasa in vitro, el cual se realizó como se describe en este documento. Consistente con la terminología usada en este documento, hFc significa una secuencia Fe humana (es decir, SEQ ID NO: 11), L15 se refiere a una ligadura que tiene que tiene 15 residuos (es decir, GGGGGSGGGSGGGGS SEQ ID NO: 28).
Tabla 28 Eficacia y Valores RC50 para los Polipeptidos FGF21 que Comprenden Modificaciones C-terminales Constructos EC50 (nM) Eficacia huFGF21 0.4 100.0% hFc- (L15) -hFGF21 (L9-8R, P171G) 2.5 76.1% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, Y179F) 2.6 78.3% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, 1- 180) hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, 1- 179) 7.8 77.4% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, A180E) 1.9 79.6% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, S181K) 130 87.9% GSGSGSGSGS-hFGF21 -(LÍ5)-hFc MKEDD-hFGF21- (L15) -hFc 834 83.1% hFc- (L15) -hFGF21 (L9-8R, P171G, S181P, P182) 272 69.9% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, A180G) 3.25 76.9% hFc- (L15) -hFGF21(L98R, P171G, S181G) 3.43 77.3% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G,.
L182) hFGF21 (L98R, P171G, G182) hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, Y179P) 428 44.4% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, 61 82.6% Constructos EC50 (nM) Eficacia Y179G) hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, Y179S) 25.3 74.8% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, Y179A) 43.2 79.6% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, S181T) 3.07 77.6% hFc- (L15) -hFGF21 (L9.8R, P171G, S181A) 2.66 73.5% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, S181L) 3.46 72.6% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, S181P) 33.8 79.5% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, A180P) 617 77.1% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R,¦ P171G, A180S) 2.18 84.7% hFGF21 (L98R, P171G, GGGGG182-6) hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, P182) 6.1 85.9% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, G182) 6.5 71.1% hFc- (L15) -hFGF21 (1-178, L98R, P171G) 167 63.9% hFc- (L15) -hFGF21.(L98R, P171G, GG182-3) 1941 84.2% hFc- (L15) -hFGF21 (L98R, P171G, GGGGG182-6) 4307 99.7% Figura 33 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones db/db diabéticos (fondo C57B6) inyectados con un control PBS nativo de tipo natural FGF21, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y dos moléculas terminadas a las cuales se agregaron ya sea un residuos de prolina o glicina en el extremo C-terminal, es decir Fe- (L15) -FGF21 (.L98R, P171G, 182P) y Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, 182G) . En el presente Ejemplo, cuando un residuo se agregó a la C-terminal de un polipéptido FGF21 de tipo natural o mutante, el residuo es referido por su posición en la proteina resultante. De esta manera, "182G" indica que un residuo de glicina se agregó a la C-terminal de la proteina de tipo natural o mutante de 181 residuos maduros. La Figura 33 muestra que el FGF21 nativo disminuyó los niveles de glucosa en la sangre durante 6 horas mientras que tres mutante Fc-FGF21 estudiados mostraron una actividad de disminución de glucosa en la sangre durante por lo menos 120 horas. La molécula Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182P) , que comprende la adición de un residuo de prolina en la C-terminal del componente FGF21 de la molécula de fusión, pareció más potente y dio por resultado niveles de glucosa en la sangre más bajos comparados con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182G) .
En un experimento subsecuente, la actividad in vivo de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182G) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182P) se estudió, y se comparo con la actividad in vivo de una molécula terminada que comprende una adición de dos glicinas en la C-terminal, principalmente Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G) . La Figura 34 muestra los resultados de ese experimento. La Figura 34 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en los ratones ob/ob inyectados con el control PBS, Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G) , Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182G) y Fe- ( Ll 5 ) - GF21 (L98R, P171G, 182P) .
Como se muestra en la Figura 34, todas las moléculas estudiadas mostraron una actividad de disminución de glucosa sostenida comparada con el control PBS. El experimento confirmó los resultados previos (Figura 33) de que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, 182P) con una adición de prolina en la C-terminal mostraron una eficacia ' de disminución de glucosa ligeramente mejorada comparada con la molécula sin una terminación de prolina, por ejemplo Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) . Sin embargo, la adición de dos residuos de glicina en la C-terminal, por ejemplo Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, 182G 183G) , pareció que reducen la potencia in vivo de la molécula y acortan la duración del efecto de disminución de glucosa in vivo .
La Figura 35 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones db/db diabéticos (fondo C57B6) inyectados con el control PBS o los polipéptidos mutantes FGF21 Fe- (Ll 5 ) -FGF21 (L98R, P171G), Fc-(L15) -FGF21 (L98R, P171G, Y179S), Fe- ( L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, Y179A) , Fe- ( Ll 5 ) - FGF21 (L98R, P171G, A180S), y Fc-(L15)-FGF21 (L98R, ¦ P171G, A180G) . Todos los mutantes mostraron una disminución de glucosa similar con duración de acción similar.
La Figura 36 muestra el porcentaje de cambio en los niveles de glucosa en la sangre observados en ratones db/db diabéticos (fondo C57B6.) inyectados con el control de vehículo, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) , Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, Y179F)', y Fe- ( Ll 5 ) - FGF21 (L98R, P171G, A180E) . Comparados con los Fe- ( Ll 5 ) -FGF21 (L98R, P171G), Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, Y 179F) fue menos eficaz en disminuir la glucosa en la sangre. Sin embargo, el Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E), en el cual la alanina en la posición de aminoácidos de 180 se mutó al ácido glutámico, fue más eficaz que el Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) y causó una reducción del 20% adicional de los niveles de glucosa en la. sangre comparado con el Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) . Estos datos sugieren que la mutación A180E puede haber reducido la degradación C-terminal in vivo y mejore en consecuencia la potencia in vivo y la eficacia de la molécula.
EJEMPLO 22 Estudio de Monos Rhesus Un constructo Fc-Ligadura-FGF21 se generó usando la metodología descrita en este documento. El constructo comprendió una secuencia IgGl Fe (SEQ ID NO: 11) fusionada a la C-terminal a una secuencia de ligadura (Gly)s-Ser-(Gly) 3-Ser- (Gly) 4-Ser (SEQ ID NO: 28) la cual luego se fusionó en la C-terminal a la N-terminal de una secuencia FGF21 madura (SEQ ID NO: 4), dentro de la cual dos mutaciones, L98R y P171G, se había introducido. Esto constructo luego se expresó y se purificó como se describe en este documento. Se aisló una forma dimérica de la proteína, la cual se enlazó por la vía de enlaces de disulfuro intermoleculares entre la región Fe de cada monómero. Esta molécula es referida en el presente Ejemplo 22 como "Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G)" y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y se codifica por SEQ ID NO: 42. En este Ejemplo, FGF21 se refiere a la forma madura de FGF21, principalmente SEQ ID NO: 4. 22.1 Diseño del Estudio El constructo Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P1"UG) se administró crónicamente y subcutáneamente ("SC") en monos Rhesus macho no diabéticos con un BMI > 35. Los otros dos grupos de monos (n=10 por grupo) se trataron con ya sea FGF21 maduro (es decir, SEQ ID N0:4) o un control de vehículo.
Los animales se aclimataron durante 42 días antes de la administración de cualquier compuesto de prueba y luego se dividieron en grupos de 10 y se les administró múltiples inyecciones SC de los compuestos de prueba el artículo de control en una forma ciega, como se representa gráficamente en la Figura 37. En breve, cada animal se inyectó una vez al día con el compuesto vehículo. El FGF21 se administró diariamente, mientras que el Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) se administró semanalmente . Las dosis de Fe- ( L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) y FGF21 se escalaron cada dos días, como se muestra en la Figura 37. El peso corporal y la captación de alimentos se supervisó por todo el ' estudio. La CRO fue ciega al tratamiento .
Se realizaron dos pruebas de tolerancia a la glucosa orales (OGTTs) antes del inicio del tratamiento. La OGTT1 se usó para clasificar los animales en tres grupos equivalentes que tiene una distribución similar de animales con base en el área bajo la curva (AUC) y el peso corporal. Los resultados del segundo OGTT (OGTT2 ) se usó para confirmar la clasificación del primer OGTT (OGTT1) . Los monos con perfiles OGTT que fueron inconsistentes de una prueba (0GTT1) a la siguiente (0GTT2) se excluyeron. Los resultados de los OGTTs 1 y 2 se muestran en la Figura 38A y Figura 38B, con las mediciones AUC que mostradas en la Figura 38C. El peso corporal de línea base se muestra en la Figura 38D y la Tabla 20.
Las OGTTs 3, 4, y 5 se realizaron cada 2 semanas al final de cada tratamiento de dosis de dosis baja, media y alta. Las muestras de sangre se recolectaron de animales en ayunas semanalmente y se usaron para medir los niveles de glucosa, insulina, triglicéridos, así como también los niveles del compuesto de prueba. Las muestras de sangre también se recolectaron semanalmente durante el período de lavado de 3 semanas.
Los OGTT1 y OGTT2 de línea base mostraron un perfil de glucosa esperado como se observa en los animales normales, con una glucosa plasmática máxima obtenida a 30 minutos, y demostró AUCs estables para los 3 grupos diferentes.
Los valores de la línea base en ayunas para la química del plasma se muestran en la Tabla 29. Las mediciones de la química del plasma se realizaron en muestras de sangre recolectadas antes del inicio del . tratamiento .
Tabla 29 Valores de la Línea Base para el Peso Corporal, Niveles de Glucosa en el Plasma en Ayunas , Insulina y Triglicéridos de los Tres Grupos de Monos Rhesus Vehículo FGF21 Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) N 10 10 10 Peso corporal 8.5 ± 0.5 8.7 ± 0.4 8.5 ± 0.4 (kg) Glucosa en el 91.9 ± 4.8 94.8 ± 5.3 82.2 ± 3.7 plasma (mg/dL) Insulina (pg/mL) 942.6' ±· 976.1 1023.4 ± 205.1 121.4 ±107.7 Triglicéridos 44.4 ± 4.8 58.6 ± 5.2 71.7 ± 9.8 (mg/dL) Se seleccionaron tres niveles de dosis diferentes, y la dosis baja fue 0.1 y 0.3 mg/kg, la dosis media fue 0.3 y 1 mg/kg y la dosis alta fue 1 y 5 mg/kg para FGF21 y Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G), respectivamente. Los niveles de dosis se seleccionaron con base en la dosis-respuesta observa en los ratones con un régimen de dosificación con base en la frecuencia anticipada de la inyección en humanos. Las dosis equimolares de FGF21 se usaron para las dosis bajas y medias, y la dosis alta de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) se elevó a 5 mg/kg (es decir, en lugar de 3 mg/kg, lo cual habría sido equimolar a la dosis de 1 mg/kg FGF21) . 22.2 Efecto de los Compuestos de Prueba en el Peso Corporal En este experimento, a fin de medir el efecto de los compuestos de prueba en el peso corporal medido semanalmente, el porcentaje de cambio del peso corporal de la linea base se calculó semanalmente en los tres grupos diferentes de mono Rhesus. El peso corporal también se midió durante las tres semanas del periodo de lavado. Los valores del peso corporal de la linea base para cada grupo que incluyen en la Tabla 29.
El peso corporal se siguió .por todo el estudio, tanto antes como después de la administración de los compuestos de prueba. El porcentaje de cambio del peso corporal de la línea base de los animales de vehículo se incrementaron con el tiempo, mientras que el peso corporal de los animales tratados con Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) y FGF21 disminuyeron en una forma dependiente de dosis durante el curso del período de tratamiento de 6 semanas, como se muestra en la Figura 39. Como se observó previamente en los roedores (Xu y colaboradores, Diabetes 58 (lj: 250-9 (2009)), el tratamiento con FGF21 disminuyó de manera estadística significativamente el peso corporal. El Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) tuvo una exposición mayor que el FGF21 (Figura 48 y Figura 47, respectivamente) , que ofrece una explicación posible para la observación de que el Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) mostró una disminución del peso corporal más pronunciada que el FGF21. 22.3. Efecto de los Compuestos de Prueba en los Niveles de Insulina Los niveles de insulina se midieron en las muestras de sangre que habían sido recolectadas después de un ayuno durante toda la noche o después de una comida de la tarde.
Se midieron los niveles de insulina en el plasma en ayunas en monos Rhesus cada semana en animales tratados con ya sea vehículo, FGF21 o Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y durante el período de lavado' de 3 semanas. Las muestras de sangre en ayunas se extrajeron a. aproximadamente cinco días después de la última inyección de Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) y aproximadamente 21 horas después de la última inyección de FGF21.
Los niveles de insulina en el plasma alimentados se midieron en los monos Rhesus durante cinco y seis semanas de tratamiento con ya sea el vehículo o FGF21 durante el tratamiento de dosis alta. Las muestras de sangre alimentadas se extrajeron aproximadamente tres días después de la inyección de Fe- (L15) -FGF21 (RG) y aproximadamente 2 horas después de la última inyección de. FGF21. La Figura 40 muestra el efecto del vehículo, FGF21 y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) en los nieles de insulina en ayunas durante el estudio de nueve semanas total, mientras que la Figura 41 representa los niveles de insulina alimentados determinados de las muestras tomadas durante la semana 5 y.6.
En resumen, en las dos dosis más altas, tanto FGF21 como Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) disminuyeron de manera estadística significativamente los niveles de insulina en el plasma en ayunas y alimentados. La observación de que los niveles de insulina de los animales tratados con FGF21 y Fc-(L15) -FGF21 (L98R, P171G) se disminuyó sin observar que los niveles de glucosa incrementados es indicativo de sensibilidad a la insulina incrementada. 22.4 Efecto de los Compuestos de Prueba en el OGTT (Glucosa e Insulina) Tres OGTTs (OGTTs 3, 4 y 5) se realizaron después de que se inició el tratamiento. Los perfiles del nivel de glucosa e insulina OGTT5 se midieron en animales tratados durante 6 semanas con el vehículo, FGF21 o Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) , que corresponden a las últimas dos semanas del régimen de escalamiento de dosis alta. El 0GTT5 se condujo a aproximadamente 7 días después de la última inyección de Fc- (L15) -FGF21 (L98R, P171G), y aproximadamente 21 horas después de la última inyección de FGF21. Los perfiles de glucosa e insulina de OGTT5 se muestran en la Figura 42 y la Figura 43, respectivamente. Los animales tratados con Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) mostraron una eliminación de glucosa mejorada comparado con los animales tratados con vehículo solamente en la dosis más alta y en el mismo tiempo punto de tiempo medido, como se muestra en la Figura 42. Al final de la última dosis, el Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) mostró la mejora más fuerte en la eliminación de la glucosa. El FGF21 no mostró mejora en la eliminación . de glucosa. El Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) tuvo una exposición mayor que el FGF21 (Figura 48 y Figura 47,. respectivamente), ofreciendo una explicación posible para la observación de que el Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) mostró un efecto más pronunciado en la eliminación de glucosa que FGF21. Los niveles de insulina durante el OGTT5 se disminuyeron de manera estadística significativamente en el último punto de tiempo medido en los animales tratados con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) comparado con los animales tratados con el vehículo.
El porcentaje de cambio de AUC de la glucosa de la línea base se calculó para los tres OGTT (OGTTs 3, 4 y 5) realizados al final de cada una de las dosis baja, media y alta en los tres grupos de los diferentes grupos de monos Rhesus como se muestra ' en la Figura 44. El OGTT5 se condujo aproximadamente siete días después de la última inyección Fc- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y 21 horas después de la última inyección de FGF21 y mostró que el Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) redujo de manera, estadística significativamente la AUC5. Los valores OGTT de línea base para cada grupo se muestran en la Figura 38C.
Los niveles de glucosa en el plasma en ayunas se midieron en los días donde no se realizaron OGTTs. No hubo diferencias estadísticas significativas observadas en los niveles de glucosa en el plasma en ayunas medidos entre los tres grupos de animales. 22.5 Efecto de los Compuestos de Prueba en los Niveles de Triglicéridos El porcentaje de los niveles de triglicéridos en el plasma en ayunas se calculó en los monos Rhesus cada semana en animales tratados con ya sea el vehículo, FGF21 o Fc- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y durante el período de lavado de 3 semanas. Las muestras de sangre en ayunas se retiraron aproximadamente cinco días después de la última inyección de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y aproximadamente 21 horas después de la última inyección de FGF21. Los niveles de triglicéridos se midieron cada semana después de que el tratamiento se inició y el porcentaje de cambios en la línea base se muestra en la Figura 45, los valores de línea base en ayunas se muestran en la Tabla 29.
Como se representa en la- Figura 45, los animales tratados con ya sea Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) o FGF21 mostraron una disminución dependiente de dosis en los niveles de triglicéridos, con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) que tiene el efecto de disminución más grande comparado con FGF21.
La Figura 46 muestra los niveles de triglicéridos en el plasma en las muestras adquiridas de los monos Rhesus en un estado de ayuno, durante la quinta y sexta semana del tratamiento con el vehículo o Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) o FGF21. Las muestras de sangre alimentadas se extrajeron aproximadamente 3 días después de la inyección de Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) y aproximadamente 2 horas después de la última inyección de FGF21. Los niveles de triglicéridos en el plasma alimentadnos de los animales tratados con FGF21 y Fc- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) se redujeron de manera estadística significativamente, qomparados con los niveles de triglicéridos de los animales tratados con el vehículo (Figura 46) . 22.6 Concentración de los Compuestos de Prueba La exposición de los compuestos de prueba administrados en niveles de dosis molares aproximadamente equivalentes se estimó por todo el periodo de estudio. La concentración del Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) se midió antes de la dosis, y aproximadamente 5 días después de la inyección. Los niveles de FGF21 se midió antes de la dosis, y a 5, 12, 19, y 26 días. Las muestras de sangre se extrajeron at aproximadamente 21 horas después de la última inyección.
La concentración individual de los compuestos de prueba en cada uno de los monos se muestra en la Figura 47 y la Figura 48. Como se muestra en la Figura 47, la mayoría de los animales en el grupo tratado con FGF21 tuvo concentraciones abajo del límite de cuantificación . La Figura 48 muestra que los animales en el grupo tratado con Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) tuvo niveles detectables de Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) durante cada fase de' dosificación (dos dosis a la semana en la misma potencia de dosis) . La concentración promedio para cada fase de dosificación se incrementó a aproximadamente de manera proporcional de dosis de 0.3 a 5 mg/kg para Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) . Existe una acumulación mínima como es demostrado por las concentraciones permanentes después de la primera y segunda dosis a la semana dentro de cada fase de escalamiento de dosis para ambos compuestos. Durante la fase sin tratamiento (período de lavado) los niveles de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) fueron detectables hasta aproximadamente el día 47 (12 días después de la última dosis) y estuvieron abajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ) más tarde.
La exposición de 'los compuestos de prueba también se supervisó durante cada OGTT . El FGF21 no fue detectable durante los OGTTs 3 y 4, después del tratamiento con FGF21 de dosis baja y media. Sin embargo, los niveles medibles se observaron durante el OGTTS, después del tratamiento con dosis alta. Un incremento proporcional de dosis en los niveles Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G). se observó a través del tercero al quinto OGTT con niveles de dosis de escalamiento, como se muestra en la Figura 49.
Los datos de los niveles del compuesto confirman que los animales se expusieron a la cantidad esperada de cada compuesto, principalmente FGF21 y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G), de una manera de escalamiento de dosis. Se observó una gran variabilidad en la cantidad de FGF21 medido, lo cual fue un resultado esperado considerando que el muestreo se realizó aproximadamente 21 horas después de la última dosis y la vida media del FGF21 es de aproximadamente 1 hora. 22.7 Conclusiones El FGF21 disminuyó los niveles de triglicéridos e insulina en el plasma en ayunas y alimentados y disminuyó el peso corporal en las dosis más altas. El Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) mejoró el OGTT y disminuyó los niveles de insulina en la dosis más alta, y la dosis disminuyó dependientemente los niveles de triglicéridos en el plasma en ayunas y alimentados así como también en el peso corporal. Tanto el FGF21 como el Fe- (L15) -FGF2.1 (L98R, P171G) disminuyeron una variedad de parámetros metabólicos en los monos Rhesus no diabéticos. Las disminuciones del nivel de insulina y triglicéridos fueron idénticos entre FGF21 y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) cuando los niveles de compuesto circulante estuvieron en un intervalo similar, en la condición alimentada. Debido a sus propiedades mejoradas, el Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) fue superior al FGF21 en la mayoría de los parámetros medidos y se podría administrar una vez a la semana para observar la eficacia en los parámetros metabólicos.
EJEMPLO 23 Molécula de fusión Fe Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98 , P171G, A180E) Una fusión Fe que comprende un mutante FGF21, que se unió a un componente Fe IgGl por una ligadura, se generó. El componente FGF21 de la fusión Fe comprende tres mutaciones de punto preparadas por ingeniería- en la secuencia de polipéptido de FGF21, particularmente L98R, P171G, A180E (enumerados basados en la forma madura de FGF21, proporcionados como SEQ ID NO: 4). Esta molécula se construyó al conjugar un Fe humano (SEQ ID NO: 11) a la terminal N del FGF21 de mutante L98R, P171G, A180E (SEQ ID NO: 39) por medio de una ligadura de 15 aminoácidos que comprende la secuencia de GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31) . Esta molécula se disgnó como "Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) " y su secuencia de aminoácidos de longitud completa se muestra en la Figura 50 y en SEQ ID NO: 47; se codifica por el ácido nucleico de SEQ ID NO: 46. La prueba in vitro de Fc-(G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mostrada es un estimulador potente de fosforilación Erk en una linea celular recombinante que sobreexpresa ß-Klotho. El Fe- (G S ) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) también muestra afinidad de enlace ß-Klotho potenciada comparada con fusión Fe de fusión Fe o FGF21 de tipo natural de FGF21- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 5). Cuando se inyecta en modelos de animal diabéticos, Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) reduce los niveles de glucosa en la sangre, disminuyendo el peso corporal, y fue adecuado para inyección bisemanal. 23.1 Actividad in vitro de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) Los experimentos se realizaron para examinar si Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mantiene la actividad similar a la fusión Fe de FGF21 nativo de tipo natural o FGF21 de tipo natural .en un ensayo in vitro de ELK-luciferasa .
Los ensayos EL -1 uciferasa se realizaron usando un sistema de célula de riñon 293T ' humana recombinante, en el cual las células 293T sobreexpresan ß-Klotho y constructos reporteros de luciferasa. El ß-klotho es un co-receptor requerido para FGF21 para activar receptores FGF e inducir transducción de señal intracelular, incluyendo fosforilación Erk. Los constructos reporteros de Erk-luciferasa contienen secuencias que codifican GAL4-ELK1 y el reportero de 5xUAS-Luciferasa. El reportero de 5xUAS-Luciferasa se conduce por un promotor que contiene cinco copias tándem del sitio de enlace Gal . La actividad reportera se regula por el nivel de Erk fosforilado, y se usa para vigilar y cuantificar indirectamente la actividad FGF21.
Los ensayos de ELK-luciferasa se realizaron al cultivar las células 293T en la presencia de concentraciones diferentes de FGF21 de tipo natural, fusión Fe de FGF21 de tipo natural, FC-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, ?180?) durante 6 horas, y luego procesar por ensayo los Usados celulares para actividad de luciferasa. Las luminiscencias obtenidas en ensayos de ELK-luciferasa para cada uno de los constructos FGF21 se expresaron en el eje y y las concentraciones de compuesto se expresaron en el eje x.
La Figura 51 muestra la respuesta de dosis de los compuestos probados en ensayos de Erk-luciferasa . El Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, . P171G, A180E) mantiene la actividad similar comparada con fusión Fe de FGF21 de tipo natural, sugiriendo que una combinación de mutaciones con L98R, P171G y A180E no cambian la bioactividad de FGF21. Comparado con el FGF21 de tipo natural nativo, los constructos de fusión Fe muestran potencia ligeramente reducida y la actividad máxima en este ensayo basado en célula con el co-receptor ß-Klotho sobreexpresado . 23.2 Actividad in vitro de Fusiones Fc-FGF21 (L98R, P171G, A180E) que Comprenden Diferentes Secuencias Ligadoras Se generó un análogo de fusión Fe similar al fusionar el IgGl Fe humano a FGF21 (L98R, P171G, A180E) por medio de una secuencia ligadora diferente, GGGGGSGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28) . Esta ligadura se designó L15 y la molécula de fusión resultante se designó Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 57). En este -experimento, se estudió el efecto de secuencias ligadoras diferentes en la actividad de fusiones FC-FGF21 (L98R, P171G, A180E) .
Se realizaron ensayos de ELK-iuciferasa al cultivar las células 293T en la presencia de diferentes concentraciones de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fe-L15-FGF21 (L98R, P171G,. A180E) durante 6 horas, y luego se procesaron por ensayo los lisados celulares para actividad de luciferasa. El Fe- ( G4 S ) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) muestra actividad a FC-L15-FGF21 (L98R, P171G, A180E) , indicando que las secuencias ligadoras diferentes, por ejemplo, ligaduras (G4S)3 o L15, no tienen impacto importante en la bioactividad de fusiones Fc-FGF21. 23.3 Afinidad de enlace in vitro de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) para ß.-Klotho en Ensayos de Enlace El enlace de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) a humano y cyno ß-Klotho se probó en un ensayo de enlace de equilibrio de solución Biacore. La afinidad de Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) también se comparó con un análogo FGF21 de fusión Fe con sólo ' mutaciones L98R y P171G, particularmente Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43).
La Neutravidina se inmovilizó en un chip CM5 usando acoplamiento de amina. La biotina-FGF21 se capturó en la segunda célula de flujo a -1500RU. La primera célula de flujo se usó como un control de respaldo. Los mutantes FGF21 en 5x diluciones (0.03-2000 nM) se incubaron con humano ???? o cyno ß-Klotho 25nM en PBS más O.lmg/ml de BSA, P20 al 0.005% a temperatura, ambiente durante 1 hora. El enlace del ß-Klotho libre en las soluciones mezcladas se midió al inyectar sobre la superficie de biotina-FGF21. Se determinó la señal de enlace ß-Klotho al 100% en la ausencia de mutantes FGF21 en la solución. Una respuesta de enlace ß-Klotho disminuida con concentraciones incrementadas de mutantes FGF21 indica que ß-Klotho se enlazó a mutantes FGF21 en solución, que bloquea a ß-Klotho del enlace a la superficie de biotina-FGF21 inmovilizada. El enlace relativo de la mezcla contra concentración molar de FGF21 se gráfico usando GraphPad Prizm 5. El EC50 se calculó usando un ajuste no lineal de competencia del sitio en el mismo software.
La Figura 52 muestra los resultados de un ensayo de enlace de equilibrio de solución Biacore de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G) a humano (derecha) y cyno ß-Klotho (izquierda). El Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) muestra al menos 2x actividad de enlace mejorada a tanto humano como cyno ß- lotho comparado con Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G) . 23.4 Eficacia in vivo de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en Ratones db/db Diabéticos Se estudió la cuestión de si Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) puede ejercer efectos benéficos metabólicos, tales como glucosa en la sangre disminuida y peso corporal reducido, en ratones db/db diabéticos. El estudio también se pretendió . para examinar la duración y respuesta de dosis de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) después de una inyección sencilla. El Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en dosis de 0.1, 0.3, 1 y 3 mg/kg. se inyectó intraperitonealmente en ratones db/db diabéticos. También se incluyó en el estudio el grupo tratado con un vehículo (Tris lOmM, sacarosa al 2.2%, Sorbitol al 3.3%, pH 8.5). Las muestras de sangre se obtuvieron de cada animal (n=10 por grupo) en línea basal (antes de la inyección), y 6, 24, 72, 120, y 168 horas después de la inyección. Se midieron los niveles de glucosa en la sangre con un Glucómetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA) . Se midió el peso corporal en línea basal (tiempo 0), 24, 72, 120, y 168 horas después de la inyección.
La Figura 53A muestra los niveles de glucosa en la sangre en ratones db/db en varios puntos de tiempo después de la inyección de vehículo o Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) . El Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) resulta en una disminución dependiente de la dosis en los niveles de glucosa en la sangre en ratones db/db. La reducción de glucosa máxima fue alrededor de 50% de la línea basal o comparada con el grupo tratado con vehículo. El efecto máximo se alcanzó dentro de 6 horas después de la inyección y se sostuvo durante 120 horas después de la inyección. Los niveles de glucosa en la sangre comienzan a regresar a la linea basal en alrededor de 168 horas. El ED50 estimado, la dosis requerida para alcanzar el efecto máximo medio, para Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) fue aproximadamente 1 mg/kg en ratones db/db.
La Figura 53B muestra el efecto de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en peso corporal después de una inyección sencilla en ratones db/db. Los resultados se expresan como cambio de peso corporal desde el tiempo 0 (antes de la inyección) . Los ratones tratados con vehículo muestran ganancia en peso corporal estable y progresivo durante el periodo de 7 días de estudio. Sin embargo, la tasa de crecimiento de peso corporal se inhibió en ratones tratados con Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en una manera dependiente de la dosis. A mayor dosis, fue más larga la inhibición de crecimiento. En un ejemplo, Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) despunta la ganancia de peso corporal durante 5 días a 3 mg/kg, 3 días a 1 mg/kg, o 1 día a 0.3 mg/kg. Las tasas de crecimiento se recuperaron posteriormente. El ED50 estimado de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en reducción de peso corporal fue aproximadamente de 1 mg/kg en este experimento. 23.5 Comparación de eficacia de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) en Ratones DIO con Frecuencias de Inyección Diferentes El estudio fue para determinar si Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) puede inyectarse menos frecuentemente que Fc-(L15) -FGF21 (L98R, P171G) pero alcanzar eficacia similar. El estudio se condujo en ratones DIO con Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) dado una vez a la semana (Q7D) o una vez cada dos semanas (Q14D), o Fc-L15-FGF21 (L98R, P171G) administrado dos veces a la semana (BIW) , Q7D o Q14D.
Los ratones DIO se "prepararon al alimentar ratones C57BL/6 macho de 4 semanas de edad una dieta alta en grasa que contiene 60% de . energía de grasa enriquecida con ácidos grasos saturados (D12492, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) . Después de 12 semanas de alimentación de dieta alta en grasa, se midieron los niveles de glucosa en la sangre y peso corporal. Los ratones DIO luego se asignaron aleatoriamente en grupos de vehículo o tratamiento para alcanzar peso corporal y niveles de glucosa en la sangre promedios de línea' bas l similares. Un total de 7 grupos se incluyeron en el estudio: vehículo administrado en Q7D; Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) administrado en Q7D o Q14D; o Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) administrado en BIW, Q7D o Q14D. La inyección fue intraperitoneal y el estudio se llevo a cabo durante 31 días. El peso corporal se midió semalmente. Se realizó un GTT en el estudio el día 28 y el estudio se finalizó en el día 31. El diseño del estudio se muestra gráficamente en la Figura 54.
La Figura 55 muestra los perfiles GTT en ratones tratados con vehículo, Fe- (G S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) o Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) en diferentes frecuencias de dosificación. La tolerancia a la glucosa estadísticamente se mejoró de manera importante en ratones tratados con Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en cualquier dosificación Q7D o Q14D cuando se compara con vehículo, sugiriendo que Fc- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) es eficaz y adecuado para administración Q14D en ratones DIO. El Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) mejora la tolerancia a la glucosa cuando se administra en BI o Q7D, pero sin Q14D, sugiriendo .que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) puede ser menos adecuado para inyección Q14D en ratones. La eficacia de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en Q7D o Q14D se · comparó con aquella de Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) en BIW o Q7D respectivamente, sugiriendo que Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) puede darse 2 veces menos frecuentemente que Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G).
La Figura 56 muestra cambios de peso corporal de la línea basal (día 0) en ratones tratados con vehículo, Fe- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) o Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) en diferentes · frecuencias de dosificación. Los ratones tratados Q7D con Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) pierden peso corporal importante que los ratones tratados BIW con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) . El peso corporal se redujo moderadamente en ratones tratados Q14D con Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) o Q7D con Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G). No se observó el efecto de peso corporal importante en ratones tratados Q14D con Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) . El efecto en peso corporal fue consistente con aquel en GTT como se describe arriba, sugiriendo que Fe- (G4S) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) fue eficaz en dosificación Q14D y requiere alrededor de 2 veces menos inyecciones frecuentes que Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) para alcanzar el mismo efecto.
EJEMPLO 24 Formulaciones de Hidrogel que Comprenden Mutantes FGF21 Como un agente de formulación para terapéuticos basados en proteina, los hidrogeles ofrecen un número de propiedades deseadas. Por ejemplo, los hidrogeles conservan la estructura y función nativa de la proteina incorporada en el hidrogel. Por lo tanto, son bien tolerados y dependientes del polímero y tipo de reticulado, que pueden ser biodegradables . Adicionalmente, ios hidrogeles se han usado previamente de manera exitosa para liberación sostenida de proteínas. En consecuencia, los- hidrogeles se investigaron como un método de suministro posible para los mutantes FGF21 descritos en la presente.
Para todos los experimentos descritos en este ejemplo, los hidrogeles se prepararon como sigue. Se preparó una solución de gelatina de bovino (Sigma) al 1.25% en PBS . Se agregó el anhídrido metacrílico de agente reticulado a una relación molar (MA a gelatina) de 16:1, 24:1 o 32:1. La solución resultante se dializó contra agua para remover cualquier metacrilamida no polimerizada para crear un vehículo de hidrogel. Finalmente> el vehículo de hidrogel se liofilizó y almacenó a 4°C hasta que ya se hizo hidrogeles que comprenden un mutánte FGF21. Esta preparación puede usarse para preparar vehículos de hidrogel basados en gelatina que pueden posteriormente adaptarse para comprender cualquiera de los mutantes FGF21 descritos en la presente.
Luego se prepararon hidrogeles con mutantes FGF21 específicos. Iniciando con un vehículo de hidrogel de gelatina metacrílico, liofilizado al 10%, se prepararon las soluciones. Los vehículos de hidrogel se calentaron y luego centrifugaron para disolver y ¦ derretir el vehículo de hidrogel de gelatina MA . liof i lizada . La proteína FGF21 seleccionada, (FGF21 (L98R, P171G), (SEQ ID NO:37)) en el Ejemplo actual) , luego se agregó a la solución de gelatina derretida a una concentración predeterminada. Luego se agregó una solución de reserva TEMED. Luego se agregó una solución de reserva KPS y la solución se mezcló suavemente. Se rellenaron ' j eringas de 1 mi hasta 200 µ? y se permitieron ajustarse durante 1.5 hasta 2 horas a temperatura ambiente. Las jeringas se almacenaron a -20°C y se descongelaron a 4°C durante la noche antes del uso. El vehículo de hidrogel comprende Tris lOmM, sacarosa al 9%, pH8.5 sin agregar el mutante FGF21 se usó como un control.
Para los experimentos in vivo, las jeringas se colocaron en una almohadilla de calentamiento a 37°C durante aproximadamente 10 minutos antes de la inyección en los animales. 24.1 Actividad In vitro de FGF21 (L98R, P171G) Liberado de Hidrogeles al 10% con Varias Relaciones de Reticulado Un objetivo de este experimento fue probar si FGF21 (L98R, P171G) liberado del hidrogel es biológicamente activo comparado con la forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) en un ensayo in vitro de ELK-luciferasa .
Se preparó FGF21 (L98R, P171G) e incorporó en soluciones de gelatina metacríliea al 10% con relaciones de reticulado de gelatina metacrílica en 16:1, 24:1 y 32:1 como se describe. Los hidrogeles luego se dispersaron en una solución amortiguadora in vitro para permitir la liberación de FGF21 (L98R, P171G) : Los medios se recolectaron después de 100 o 150 horas y se sometieron a ensayos in vitro para actividad FGF21 (L98R, P171G) . Los ensayos analíticos (por ejemplo, SDS-PAGE, HPLC de exclusión de tamaño, y HPLC de fase inversa) muestran gue el FGF21 (L98R, P171G) liberado estuvo intacto en todos los puntos de tiempo.
Se realizaron ensayos de ELK-luciferasa usando un sistema de célula de riñon 293T humana recombinante, en el cual las células 293T sobreexpresan ß-Klotho y constructos reporteros de luciferasa. El ß- lotho es un co-receptor que se requiere por FGF21 para activación de sus receptores FGF. Los receptores FGF usados en este ensayo son receptores FGF endógenos expresados en célula de riñon 293T. Los constructos reporteros de luciferasa contienen secuencias que codifican GAL4-ELK1 y un reportero de luciferasa conducido por un promotor que contiene cinco copias tándem del sitio de enlace Gal4 (5xUAS-Luc) . La actividad de luciferasa se regula por el nivel Erk/ELKl fosforilado, y se usa para vigilar y cuantificar indirectamente la actividad FGF21.
Los ensayos de ELK-luciferasa se realizaron al cultivar las células 293T 'en la presencia de diferentes concentraciones de la forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) o FGF21 liberado de hidrogel (L98R, P171G) durante 6 horas, y luego procesando por ensayo los lisados celulares para actividad de luciferasa. La Figura 57 muestra los resultados in vitro del ensayo de ELK-luciferasa . El FGF21 (L98R, P171G) liberado de hidrogeles con relaciones reticuladas de gelatina metacrilica en 16:1, 24:1 y 32:1 fue biológicamente activo con actividad equivalente para la forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) . Los datos demuestran que el hidrogel conserva la estructura y función de la proteína incorporada y el FGF21 liberado (L98R, P171G) está activo y estable aún después de 10-15 horas en el medio. 24.2 Eficacia in vivo de Hidrogel FGF21 (L98R, P171G) en Diferentes Relaciones Reticuladas en Ratones ob/ob El objetivo de este experimento fue determinar si un hidrogel de FGF21 (L98R, P171G) preparado con relaciones reticuladas de gelatina metacrilica en 24:1 y 32:1 proporciona una liberación sostenida de FGF21 biológicamente activo (L98R, P171G) in vivo y últimamente resulta en eficacia in vivo más larga como se compara con la forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) . Además, basado en la evaluación de tasas de liberación in vitro, se determinó que las relaciones reticuladas superiores de gelatina metacrílica da mejor liberación sostenida del FGF21 incorporado (L98R, P171G) . Por lo tanto, otro objetivo de este experimento fue comparar dos hidrogeles FGF21 (L98R, P171G) preparados con relaciones reticuladas de gelatina metacrílica en 24:1 y 32:1.
El FGF21 posee diversas actividades biológicas, incluyendo la capacidad' para disminuir los niveles de glucosa en la sangre, insulina, triglicéridos , o colesterol; reducir el peso corporal; o mejorar la tolerancia a la glucosa, gasto de energía, o sensibilidad a la insulina. Los hidrogeles FGF21 (L98R, P171G) se introdujeron en ratones ob/ob resistentes a la insulina, y se midieron las capacidades del hidrogel FGF21 (L98R, P171G) para disminuir la glucosa en la sangre y reducir el peso corporal. El procedimiento para el trabajo in vivo fue como sigue.
Los hidrogeles se prepararon usando el procedimiento descrito arriba. A los ratones ob/ob de 8 semanas de edad (Jackson Laboratory) se les afeitó el pelo en el sitio de inyección y se anestesiaron con isoflurano y 02 justo antes de la inyección. Los hidrogeles (0.2 mi) se inyectaron lentamente bajo la piel y Vetbond se aplicó en el sitio de inyección después de la inyección. El FGF21 de vehículo (Tris lOm , sacarosa al 9% pH8.5) o nativo (L98R, P171G) también se incluyeron en el experimento y se inyectaron similarmente como hidrogeles. Los animales se regresaron a su jaula después de que despértaron de la anestesia. Las muestras de sangre se obtuvieron antes de la inyección y en varios puntos de tiempo después de la inyección, por ejemplo, 0, 3, 6, 24, 72, 120, 192 y 264 horas después de la inyección. Se midieron los niveles' de glucosa en la sangre con un Glucómetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas, CA) . También se vigiló el peso corporal.
Las Figuras 58 y 59 resumen los resultados del experimento. Comparados con el hidrogel de vehículo o control, la forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) rápidamente reduce los niveles de glucosa en la sangre en 3 y 6 hr después de la inyección. Sin embargo, la actividad in vivo de la forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) disminuida y los niveles de glucosa de sangre regresan a la linea basal 24 horas después de la inyección. Los hidrogeles FGF21 (L98R, P171G) resultan en reducción de glucosa en la sangre tan temprano como 3 hr después de la inyección y la actividad se sostuvo hasta 8 días. No hubo diferencia importante entre las relaciones reticuladas en 24:1 o 32:1. Los grupos de hidrogel FGF21 (L98R, P171G) también muestran ganancia de peso corporal disminuida que los ratones tratados con solo vehículo o hidrogel. Estos resultados demuestran que los hidrogeles FGF21 (L98R, P171G) preparados con relaciones de reticulado de gelatina metacrilica en 24:1 y 32:1 son capaces de proporcionar una liberación sostenida de FGF21 biológicamente activo (L98R, P171G) in vivo y últimamente resultando en eficacia in vivo más larga como se compara con la forma nativa de FGF21 (L98R, P171G) . 24.3 Eficacia in vivo de Hidrogel FGF21 (L98 , P171G) y FGF21 (L98R, P171G, A180E) en Diferentes Relaciones de Reticulado en Ratones db/B6 Las formulaciones' de hidrogel se prepararon usando gelatina de bovino (Sigma) y varios mutantes y constructos FGF21, particularmente FGF21 (L98R, P171G) y Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) . También se preparó un control de hidrogel. Los 0.2 mL de hidrogel se colocaron enj una jeringa de 1 mi que tiene una aguja 21G.
Los controles de hidrogel e hidrogeles que comprenden un mutante FGF21 se prepararon como se describe arriba. Ratones db/B6 de 8 semanas de edad (Jackson Laboratory) se afeitaron del pelo en el sitio de inyección y se anestesiaron con isoflurano y 02 justo a'ntes de la inyección. Los hidrogeles (0.2 mi) se inyectaron lentamente bajo la piel y Vetbond se aplicó en el sitio de inyección después de la inyección. El FGF21 de vehículo (Tris lOmM, sacarosa al 9% pH8.5) o nativo (L98R, P171G) también se incluyeron en el experimento e inyectaron similarmente como. Los animales se regresaron a su jaula después de que despertaron de la anestesia. Las muestras de sangre se obtuvieron antes de la inyección y en varios puntos de tiempo después de la inyección, por ejemplo, 0, 24, 96, 168, 240, 312 horas después de la inyección. Los niveles de glucosa en la sangre se midieron con un Glucómetro OneTouch (LifeScan, Inc. Milpitas-, CA) . También se vigiló el peso corporal.
El diseño experimental fue como sigue: Grupo de animales (n=9 por grupo) A. Hidrogel de control 32:1 (10%) MA:HU4 200µ1 B. Hidrogel FGF21 (L98R, P171G) 32:1 (10%) MA:HU4 0.5 mg/ratón (200µ1, ~ 10 mg/kg) C. Hidrogel FGF21 (L98R, P171G) 32:1 (10%) MA:HU4 1.5 mg/ratón (200µ1 ~ 30 mg/kg) D . Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (sin hidrogel) 3 mg/kg Varios parámetros se midieron y los resultados de los experimentos se muestran en las Figuras 60-63. La Figura 60 muestra el cambio . de glucosa en la sangre durante el curso del experimento en el día 14, mientras que la Figura 61 muestra el cambio en porcentaje de glucosa en la sangre durante el mismo periodo. La Figura 62 muestra el cambio en peso corporal durante el curso del experimento en el día 14, mientras que la Figura 63 muestra el cambio de porcentaje en el peso corporal durante el mismo periodo.
Los resultados del experimento se muestran gráficamente en las Figuras 60-63 pueden resumirse como sigue: FGF21 (L98R, P171G) 32:1(10%) MA: HU4 en 10 mg/kg fue eficaz al reducir la glucosa en la sangre en 24 horas después de la inyección y el nivel de glucosa en la sangre regresa a la linea basal entre 4-7 días.
FGF21 (L98R, P171G) 32:1(10%) MA: HU4 en 30 mg/kg fue más eficaz al reducir la glucosa en la sangre que la dosificación 10 mg/kg, y el nivel de glucosa en la sangre se apreció para regresar a la linea basal entre 7-10 días.
Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en 3 mg/kg por si mismo reduce la glucosa en la sangre en 24 horas después de la inyección a un grado que fue similar a FGF21 (L98R, P171G) en 30mg/kg de hidrogeles.
El control de hidregel (que no comprende un mutante FGF21) no tiene ningún efecto al reducir la glucosa en la sangre.
Los grupos de hidrogel de FGF21 (L98R, P171G) y Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (que no se presentó en un hidrogel) muestra ganancia de peso corporal reducida comparada con ratones tratados con un control de hidrogel.
EJEMPLO 25 Estudio de Monos Cynomolgus Se generaron dos constructos Fc-Ligadura-FGF21 usando la metodología descrita en la presente. Un constructo comprende de una secuencia IgGl Fe (SEQ ID NO: 11) fusionada al C terminal a una secuencia ligadora (Gly ) 5-Ser- (Gly) 3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 28) que luego se fusionó a la terminal N de una secuencia FGF21 madura (SEQ ID NO: 4), en la cual dos mutaciones, L98R y P171G, se int odujeron. Esta molécula se refiere en el Ejemplo actual como "Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G)" (SEQ ID NO: 43). Un segundo constructo comprende una secuencia IgGl Fe (SEQ ID NO: 11) fusionada al C terminal a una secuencia ligadora (Gly ) 4-Ser- (Gly ) 4-Ser- (Gly ) 4-Ser (SEQ ID NO: 31) que luego se fusionó a la terminal N de la secuencia FGF21 madura (SEQ ID NO: 4), en la cual tres mutaciones, L98R, P171G, y A180E, se introdujeron. Esta molécula se refiere en el Ejemplo actual como "Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) " (SEQ ID NO:47). Estos constructos luego se expresaron y purificaron como se describe en la presente, y se aislaren como una forma dimérica de la proteína, cada monómero del cual se ligó por medio de enlaces de disulfuro intermoleculares entre la región Fe de cada monómero . 25.1 Diseño de Estudio El estudio se condujo en monos cynomolgus con características de tolerancia debilitada a la glucosa (IGT). Los monos tenían 8-18 años de edad. Sus pesos corporales están en el intervalo desde 5-15 kg y BMI en el intervalo desde 32-70 kg/m2. 44 monos se aclimataron durante 6 semanas antes del inicio de la administración del compuesto. Durante el periodo de aclimatación, los monos se entrenaron 4 veces a la semana durante 4 semanas para familiarizarse con los procedimientos incluyendo dominar la silla, inyección subcutánea (PBS, 0.1 ml/kg) , alimentación por sonda (Water, 10 ml/kg) , extracción de sangre por muestras de OGTT y no de OGTT. Después de 4 semanas de entrenamiento, se midieron los parámetros metabólicos de plasma y OGTT de línea basal. 40 de los 44 monos se seleccionaron y asignaron aleatoriamente en tres grupos de tratamiento para alcanzar los niveles de línea basal similares de peso corporal, respuesta OGTT AUC, y niveles de triglicérido y glucosa en el plasma.
El estudio se condujo en una forma ciega. Se etiquetaron el vehículo (n=14), Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) (n=13) y Fe- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (n=13) como compuesto A, B y C y se administraron .una vez a la semana por medio de inyección subcutánea. Los compuestos se dieron en una forma de escala de dosis de niveles bajos (0.3 mg/kg) , medios (1 mg/kg) hasta altos (3 mg/kg) y la dosis se aumentó cada tres semanas. Después de 9 semanas de tratamiento con el compuesto, los animales se vigilaron durante 3 semanas adicionales para lavar el compuesto y recuperarlo de los tratamientos. La ingesta alimenticia, peso corporal, química clínica y OGTT se vigilaron a lo largo del estudio. La ingesta alimenticia se midió cada comida. El peso corporal se midió semanalmente . Las muestras de sangre se recolectaron semanalmente 5 días después de cada inyección para medir los niveles de glucosa, triglicéridos , colesterol total, colesterol HDL y LDL. Las OGTTs se condujeron cada tres semanas después del inicio de los tratamientos (al final de cada nivel de dosis) . El día de inicio del tratamiento se designa como 0 y el plan del estudio detallado se muestra en la Figura 64.
Los resultados mostrados en este ejemplo ejemplo son datos recolectados al final de 9 semanas de tratamiento. 25.2 Efecto de los Compuestos de Prueba en Ingesta Alimenticia Los animales se alimentaron dos veces al día, con cada animal que recibió 120 g de ..alimento formulado establecido durante el periodo de aclimatación. El alimento restante se removió y pesó después de cada comida para calcular la ingesta alimenticia. Los tiempos de alimentación fueron de 8:00 AM a 8:'30 AM (±30 minutos) y luego de 4:30PM a 5:00PM (±30 minutos) . Para producir golosinas, se suministró manzana (150 g) a cada animal de 11:30 a 12:30 PM (±30 minutos) cada día .
Comparado con el vehículo, tanto Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) como Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) reducen la ingesta alimenticia en monos (Figuras 65, 66 y 67). El Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) inhibe la ingesta alimenticia en cada comida incluyendo las comidas de la mañana, fruta y de la noche en dosis 0.3 mg/kg. Sin embargo, el efecto disminuye y la ingesta alimenticia regresa cerca de los niveles de control o línea basal después de alrededor de 30 días de tratamiento cuando la dosis se aumentó hasta 1 mg/kg. El Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) no tiene un efecto importante en la ingesta alimenticia de la mañana y sólo reduce modestamente la ingesta alimenticia en la comida de la noche cuando la dosis se aumentó hasta 1 y 3 mg/kg. Sin embargo, el Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) reduce la ingesta de fruta similarmente como Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) .
En general, Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) muestra un efecto más fuerte al inhibir la ingesta alimenticia que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). El efecto en la ingesta alimenticia aparece para ser de corta duración y la ingesta alimenticia se recuperó después de aproximadamente 30 dias de tratamiento. 25.3. Efecto de los Compuestos de Prueba en el Peso Corporal Se vigiló el peso corporal semanalmente a lo largo del estudio. Durante el curso de los tratamientos de 9 semanas, el peso corporal de animales tratados con vehículo permanece constante mientras que el peso corporal de los animales tratados con Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) y Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) progresivamente disminuye. El Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) resulta en una disminución de peso corporal más pronunciada que Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) como se muestra en la Figura 68. 25.4. Efecto de los Compuestos de Prueba en el índice de Masa Corporal (BMI) , Grosor del pliegue de la Piel (SFT) y Circunferencia Abdominal (AC) Se vigilaron el BMI , SFT y AC semanalmente a lo largo del estudio, tanto antes como después de la administración de los compuestos de prueba cuando se tomó peso corporal. El B I se define como el peso corporal del individuo dividido por el cuadrado de su altura. El SFT es el grosor de una capa doble de piel y la grasa debajo con un calibre especial que ejerce una tensión constante en el sitio. El BMI, SFT y AC son mediciones relativamente exactas, sencillas, y baratas de la composición corporal particularmente indicativas de grasa subcutánea. Los. animales tratados con vehículo muestran BMI, SFT y AC relativamente estables a lo largo del estudio. Los animales tratados con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) muestran niveles disminuidos de BMI, .SFT y AC durante el curso del estudio de 9 semanas, sugiriendo que ambos compuestos resultan en reducción de masa de grasa. El Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) fue más efectivo y resultó en reducciones más pronunciadas en BMI, SFT y AC que Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) . Los resultados se muestran en las Figuras 69, 70 y 71, respectivamente. 25.5 Efecto de los Compuestos de Prueba en Niveles de Glucosa en la Sangre en Ayunas La sangre se recolectó de animales que ayunaron durante toda la noche. El retiro de sangre se condujo semanalmente en 5 días después de cada inyección. Tanto Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) . como Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) reducen los niveles de glucosa en la sangre en ayunas. El Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) reduce los niveles de glucosa en la sangre, en ayunas en la dosis de 0.3 mg/kg y la reducción de glucosa máxima se alcanzó cuando la dosis se aumentó a 1 mg/kg. Sin embargo, el Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) sólo resulta en una reducción modesta de los niveles de glucosa en la sangre en la dosis más alta probada (3 mg/kg). Por lo tanto, Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) fue más eficaz y produjo reducción de glucosa en la sangre más pronunciada que Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) . No se observó hipoglicemia en ninguno de los monos tratados con Fc- (G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) o Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) . La Figura 72 muestra los niveles de glucosa en la sangre en ayunas durante el curso del estudio. 25.6 Efecto de los Compuestos de Prueba en Prueba de Tolerancia a la Glucosa Oral (OGTT) Se condujeron las OGTTs antes y después del inicio de los tratamientos. Los OGTTs después de la dosis se realizaron cada tres semanas para probar el efecto del compuesto en cada nivel de dosis. El Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) mejora la tolerancia a la glucosa en todas las dosis probadas de 0.3 hasta 3 mg/kg. Los niveles de glucosa se redujeron y la excursión de glucosa seguida por un bolo de enfrentamiento a la glucosa incrementan en respuesta al tratamiento Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) . No hubo respuesta de dosis observada sugiriendo que Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) alcanza su efecto máximo en la dosis de 0.3 mg/kg. El Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) sólo resulta en una mejora de tolerancia a la glucosa en dosis de 1 mg/kg y no fue claro como el efecto disminuye cuando la dosis se aumentó a 3 mg/kg. La Figura 73 muestra los perfiles de curva antes y después de OGTT y el área bajo la curva OGTT. 25.7 Efecto de los Compuestos de Prueba en los Niveles de Triglicéridos Se recolectó sangre de animales que ayunaron durante toda la noche. El retiro de sangre se condujo semanalmente en 5 días después de cada inyección. Los niveles de triglicérido se redujeron significativamente en animales tratados con Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) o Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Sin embargo, Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) fue más efectivo que Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) . El Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) resulta en una reducción máxima de los niveles de triglicéridos en el plasma en 0.3 mg/kg mientras que Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) sólo resulta en una reducción intermedia de los niveles de triglicérido con la dosis probada más alta (3 mg/kg) . La Figura 74 muestra los niveles de triglicéridos en el plasma en el ayuno durante el curso del estudio. 25.8 Efecto de los Compuestos de Prueba en Niveles de Colesterol Total y Colesterol HDL Se recolectó sangre de animales ayunados durante la noche. El retiro de sangre se condujo semanalmente en 5 días después de cada inyección. Los niveles de colesterol HDL y colesterol total en el plasma tienden a incrementar después del tratamiento de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) o Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G). Las Figuras 75 y 76 muestran los niveles de colesterol total y colesterol HDL sobre el curso del estudio. 25.9 Conclusiones En un estudio a escalamiento de la dosis conducido en monos cynomolgus IGT macho, los animales tratados con mutantes FGF21 conjugados con Fe, particularmente Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) , muestran parámetros metabólicos mejorados. El peso corporal se redujo y la composición corporal se mejoró. La reducción de corta duración de ingesta alimenticia se observó y la ingesta alimenticia se recuperó a niveles de control o linea basal del estudio medio. Los niveles de triglicérido y glucosa en la sangre en ayuno también se redujeron por ambos componentes, Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) o Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) . La ¦ OGTT se mejoró y los niveles de colesterol HDL se elevaron ligeramente. Comparado con Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) , Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) aparece para ser superior a Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) e todos los parámetros medidos en cualquier dosis probada. El Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) alcanza sus efectos máximos para la mayoría de los parámetros medidos cuando se administran en 0.3 mg/kg. Por lo tanto la dosis efectiva terapéutica de Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) en especies superiores puede ser menor que 0.3 mg/kg.
EJEMPLO 26 Estudio de Estabilidad en Monos Cynomolgus Este estudio se diseñó para determinar si Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 57) fue más resistente a la proteasa que Fe- (LI5) -FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43) . El procesamiento en el C terminalarboxi se observó seguido por inyección Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) en ratones o monos como se muestra en el Ejemplo 21. La degradación resulta en una pérdida sucesiva de 1 hasta 3 residuos de aminoácidos de la terminal C. Los esfuerzos por limitar la terminal C o introducir las mutaciones adicionales en el C terminal de Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) proporcionan una molécula superior Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) . Este estudio se diseñó para evaluar si Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) ha mejorado la estabilidad in vivo comparado con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) .
Se generaron los constructos Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) . Estos constructos comprenden una secuencia IgGl Fe (SEQ ID NO: 11) fusionada al C terminal a una secuencia ligadora (Gly)5-Ser- (Gly) 3-Ser- (Gly) 4-Ser (SEQ ID. NO: 28) que luego se fusionó a la terminal N de una secuencia FGF21 madura (SEQ ID NO: 4), en la cual ya sea dos mutaciones, L98R, P171G, o tres mutaciones, L98R, P171G, y A180E, se introdu eron. Estos constructos luego se expresaron y purificaron como se describe en la presente', y se aislaron como una forma dimérica de la proteina, cada monómero del cual se ligó por medio de enlaces de disulfuro intermoleculares entre la región Fe de cada monómero.
La estabilidad in vivo de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) se comparó en monos cynomolgus macho. El Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) y Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) se inyectaron intravenosamente en monos cynomolgus en 23.5 mg/kg. Las muestras de sangre se recolectaron en varios puntos de tiempo seguido por una inyección iv sencilla. Se usó espectrometría de masas de inmunoafinidad-MALDI-TOF para vigilar los metabolitos en cada punto de tiempo después de la inyección. Los resultados se muestran en la Figura 77.
Comparado con Fe- (L15) -FGF21 (.L98R, P171G) , Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) muestra degradación en el C terminal significativamente reducida con pocos picos de masa detectables adyacentes al pico precursor de la molécula intacta, sugiriendo que la mutación A180E disminuye la degradación de peptidasa en el C terminal. Las truncaciones más grandes con pérdidas de masa estimadas en [1-376] , [1-394] y [1-401] también se observaron y los sitios corresponden a 133-134, 153-154 y 158-159 en la secuencia de polipéptido FGF21. El recorte de endopeptidasa interno contribuye al metabolismo general de tanto Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G) como Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) , y la mutación A180E no aparace para impactar significativamente la tasa de degradación de endopeptidasa interna.
Con objeto de incrementar la resolución y proporcionar detalles de la mezcla de degradación, la espectrometría de masas LC-EM MRM (monitoreo de reacción múltiple) también se realizó para vigilar varias formas de los fragmentos de degradación en el C terminal. Las muestras de mono se purificaron por afinidad y luego se sometieron a digestión Asp-N. Los péptidos digeridos en el C terminal luego se vigilaron por MRM. Los resultados para varias formas de los fragmentos de degradación en el C terminal se expresan como cantidad relativa para especies de péptido de longitud completa (%) mostradas en la Figura 78. Consistente con los espectros MALDI, el análisis semi-cuantitativo MRM de los fragmentos en el C terminal también muestran abundancia relativa reducida de los fragmentos de péptido que pierden 1-3 aminoácidos de la terminal C y la abundancia relativa incrementada de la molécula intacta en monos administrados con Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) comparados con Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) .
En resumen, Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) muestra la degradación en el C terminal reducida y estabilidad in vivo potenciada comparada con Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) en monos cynomolgus .
EJEMPLO 27 Farmacocinética de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) en Ratones Este estudio se diseñó para evaluar la farmacocinética de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO: 57) y Fc- (L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ ID NO: 43; siguiendo una dosis intravenosa sencilla para ratones C57BL/6 macho.
El Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) se dieron en 20 mg/kg a través de la inyección intravenosa. Las muestras de sangre se recolectaron en 0.083 (5 minutos), 1, 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 168, y 240 horas después de la dosificación. Con objeto de determinar las concentraciones de plasma de la molécula de longitud completa intacta, un ensayo ELISA con la inmunoreactividad dirigida al FGF21 en el C terminal y terminal N se desarrolló. El ensayo encuentra la molécula intacta de longitud completa con combinaciones insignificantes de otros productos de degradación. Las concentraciones de plasma de Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) y Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G) intacto durante un periodo de 240 horas después de la inyección intravenosa en ratones se muestran en la Figura 79.
Las concentraciones de plasma de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) fueron significativamente superiores que aquellas de Fe- (Ll 5 ) -FGF21 (L98R, P171G) administradas en el mismo nivel de dosis de 24 hasta 168 horas después de la inyección. Una cantidad importante' de Fe- (L15) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) se midió en 168 horas después de la inyección en ratones. Como un resultado, Fe- (L15 ) -FGF21 (L98R, P171G, A180E) muestra cobertura AUC incrementada y vida media circulante en el plasma por 2 veces comparada con Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) en ratones. La vida media de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) fue 16.6 horas y aquella de Fc-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) fue 9.4 horas. Ambos compuestos fueron debajo del nivel detectable en 240 horas después de la dosis.
EJEMPLO 28 Generación de Mutantes de Glicosilación Ligados a N para Mejorar la Solubilidad o Disminuir el Recorte de la Terminal C para Incrementar la Vida Media Los mutantes FGF21 se diseñaron y generaron para crear sitios de glicosilación ligados a N potenciales para expresión mamifera con disrupción- mínima para la secuencia de aminoácidos nativa. Los mutantes construidos incluyen FGF21 (Y179N, S181T) (SEQ ID NO: 161), FGF21 Y179N (SEQ ID NO: 163) y FGF21 P124S (SEQ ID NO: 165) .
La expresión de los mutantes se realizó transitoriamente en células 293-6E. y el medio acondicionado se probó para actividad en un ensayo in vitro de ELK-luciferasa . Los ensayos de ELK-luciferasa se realizaron como se describe en el Ejemplo 4, con la excepción de que varias diluciones de medio acondicionados se usaron en vez de concentraciones diferentes de proteínas purificadas.
El análisis del medio acondicionado revela que la glicosilación incrementada comparada con el tipo natural no se alcanzó en el sistema de expresión transitoria. La Figura 80 muestra los resultados de un ensayo de actividad de ELK-luciferasa. Los resultados mostrados en la Figura 80 demuestran que el mutante P124S FGF21 no impacta adversamente la actividad FGF21 pero los mutantes FGF21 Y179N y FGF21 (Y179N, S181T), en la ausencia de glicosilación, resultando en actividad reducida como se procesa por ensayo en el ensayo de ELK-luciferasa .
Mientras que la presente invención se ha descrito en términos de varias modalidades, se entiende que ocurrirán variaciones y modificaciones a aquellas personas expertas en el campo. Por lo tanto, se propone que las reivindicaciones adjuntas cubran todas estas variaciones equivalentes que entran en el alcance de la invención como es reclamada. Además, los títulos de las secciones usados en este documento son para propósitos de organización únicamente y no se deben considerar como limitantes del contenido descrito.
Todas las referencias citadas en esta solicitud se incorporan expresamente a manera de referencia en este documento.

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido aislado que comprende SEQ ID NO: u 8, caracterizado porque el polipéptido aislado comprende además: (a) la sustitución de cualquier aminoácido para uno o más de: (i) el residuo de leucina en la posición 98;' (ii) el residuo de prolina en la posición 171; (iii) el residuo de alanina en la posición 180; y (b) una o más sustituciones seleccionadas de las mutaciones de las Tablas 2-10.
2. El polipéptido · aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una o más sustituciones de (b) comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste de: (a) una mutación de cisteina de la Tabla 2; (b) un enlace disulfuro producido por ingeniería de la Tabla 3; (c) una mutación ' que potencia la estabilidad de la Tabla 4; (d) una mutación resistente a la proteólisis de la Tabla 5; (e) una mutación de agregación de la Tabla 6; (f) una mutación de degradación en el C terminal de la Tabla 7; (g) una mutación de glicosilación de la Tabla 8; (h) una mutación resistente a la O-glicosilación seleccionada de la Tabla 9; (i) una mutación seleccionada de la Tabla 10; y (j) combinaciones de (a) - (i).
3. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la mutación de cisteina de (a) comprende una cisteina en una posición seleccionada del grupo que consiste de: 18-31, 33, 35-50, 54, 56-62, 64-73, 75-104, 106-135, 137-140, 152-154, 163 y 167. '
4. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el enlace disulfuro producido por ingeniería comprende un par de residuos de cisteina en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de: 19-138, 20-139, 21-33, 22-137, 22-139, 23-25, 23-28, 24-135, 25-122, 26-122, 27-123, 28-43, 28-124, 31-43, 33-21, 35-84, 41-82, 4.2-124, 42-126, 43-124, 50-69, 54-66, 58-62, 67-72, 67-135, 72-84, 73-93, 75-85, 75-92, 76-109, 77-79, 77-81, 80-129, 82-119,- 94-110, 95-107, 100-102, 102-104, 115-117, 117-129, 117-130, 118-132, 118-134, 121-127, 123-125, 127-132, y 152-163.
5. La proteina aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la mutación que potencia la estabilidad comprende un D, E, R, K, H, S, T, N o Q en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de: 42, 54,.77, 81, 86, 88, 122, 125, 126, 130, 131, 139, 145, 146, 152, 154, 156, 161, 163, 170, y 172.
6. La proteina aislada ' de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la mutación resistente a la proteólisis es selecciona del grupo que consiste de: (a) Q, I o K en la posición 19; (b) H, L o F en la posición 20; (c) I, F, Y o V en la posición 21; (d) I, F c' V en la posición 22, (e) A o R en la posición 150; (f) A o V en la posición 151; (g) H, L, F o V en la posición 152; (h) A, D, N, C, Q, E, P, o S en la posición 170; (i) A, R, N, D, C, E, Q, G, H, K, S, T, W o posición 171; (j) L o T en la posición 172; y (k) R o E en la posición 173.
7. La proteina aislada de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la mutación que reduce la agregación es seleccionada del grupo que consiste de: (a) E, K o R en la posición 26; (b) E K, R, Q, o T en la posición 45; (c) T en la posición 52; (d) c, E o S en la posición 58; (e) A, E, K o R en la posición 60; (f) A, c, H o R en la posición 78; (g) C 0 T en la posición 86; (h) A, E, K, R o S en la posición 88; (i) c, E, K, Q, o R en la posición 98; (j) c, D, E, o R en la posición 99; (k) K o T en la posición 111; (1) D, E, H, K, N, R o Q en la posición 129; y (m) E, H, K o Y en la posición 134.
8. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la mutación degradación en el C terminal se selecciona del grupo que consiste de: (a) G, E, P o S en la posición 180; (b) G, P, K, T, A, L o P en' la posición 181; y (c) A P, G, S o A en 'la posición 179.
9. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la mutación resistente a la glicosilación G se seleccionada del grupo que consiste de: S167A, S167E, S167D, S167N, S167Q, S167G, S167V, S167H, S167K y S167Y.
10. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque (a) la mutación en la posición 98 es seleccionada del grupo que consiste de L98R, L98C, L98E, L98Q, L98K y L98T; (b) la mutación en la posición 171 es seleccionada del grupo que consiste de P171A, P171R, P171N, P171D; P171C, P171E, P171Q, P171G, P171H, P171 , P171S, P171T, P171W y P171Y; (c) la mutación en la posición 180 es seleccionada del grupo que consiste de A180G, A180E, A180P y A180S.
11. El polipéptido. aislado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la mutación en la posición 98 es L98R, la mutación en la posición 171 es P171G y la mutación en la posición 180 es A180E.
12. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque además comprende (i) un truncamiento en el N terminal de 8 o menos residuos; (ii) un truncamiento en el C terminal de 12 o menos residuos ; (iii) un truncamiento en el N terminal de 8 o menos residuos y un truncamiento en el C terminal de 12 o menos residuos.
13. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido es capaz de reducir la glucosa sanguínea en un mamífero.
14. El polipéptido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1 o 11, caracterizado porque el péptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 u 8, pero en donde si el péptido comprende mutaciones L98R, P171G y A180E, las mutaciones L98R, P171G y A180E no se modifican adicionalmente .
15. El polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 11, caracterizado porque además comprende 1 hasta 10 residuos de aminoácidos fusionados al C terminal del polipéptido.
16. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el 1 hasta 10 residuos de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste de glicina, prolina y combinaciones de los mismos.
17. El polipéptido aislado de conformidad con las reivindicaciones 1 o 11, caracterizado porque el polipéptido se liga covalentemente a une o más polímeros.
18. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polímero es PEG.
19. El polipéptido de. fusión, caracterizado porque comprende el polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 u 11 fusionados a una secuencia de aminoácidos heterologa.'
20. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos heterologa es un dominio constante IgG o fragmento del mismo.
21. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el dominio constante IgG comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 171 o SEQ ID NO:ll.
22. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido es fusionado a la secuencia de aminoácidos heterologa por medio de una ligadura.
23. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la ligadura es seleccionada del grupo que consiste de polialaninas , (Gly)4 (SEQ ID NO:29), (Gly)5 (SEQ ID NO:30), (Gly) 5-Ser- (Gly) 3-Ser-(Gly)4-Ser (SEQ ID NO:28), (Gly ) 4-Ser- (Gly) 4-Ser- (Gly) ,-Ser (SEQ ID NO: 31), (Gly) 3-Lys- (Gly ) 4 (SEQ ID NO: 32), (Gly) 3-Asn-Gly-Ser- (Gly) 2 (SEQ ID NO: 33'), (Gly) 3-Cys- (Gly) 4. (SEQ ID NO:34), Gly-Pro-Asn-Gly-Gly (SEQ ID NO:35), Gly-Ser (Gly4Ser) 3 (SEQ ID NO:166), (Gly4Ser) 4 (SEQ ID NO:167), (Gly4S)2 (SEQ ID NO:168), DAAAKEAAAKDAAAREAAARD AAK (SEQ ID NO:169), y NVDHKPSNTKVDKR (SEQ ID NO: 170).
24. El multimero, caracterizado porque comprende dos o más polipéptidos de fusión de conformidad con la reivindicación 23.
25. La composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el polipéptido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24 y un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.
26. Un método para tratar un trastorno metabólico, caracterizado porque comprende administrar a un paciente humano que necesita del mismo la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el trastorno metabólico es diabetes.
28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el trastorno metabólico es obesidad.
29. El ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24.
30. El vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29.
31. La célula hospedera, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29.
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