MX2011009745A

MX2011009745A - Composiciones y metodos para la conversion de material lignocelulosico a azucares fermentables y productos obtenidos de los mismos.

Info

Publication number: MX2011009745A
Application number: MX2011009745A
Authority: MX
Inventors: Mark P Lyons; Brian J Hoskins
Original assignee: Alltech Inc
Priority date: 2009-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2012-06-01
Also published as: CN102449156A; TR201109113T1; US20100248320A1; JP2012520682A; CA2755449A1; US8658407B2; WO2010107944A1; AU2010226673A1; CL2011002281A1; BRPI1012700A2; CA2755449C; EP2408924A1; RU2011139512A

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la conversión de material lignocelulósico a azúcares fermentables y a productos obtenidos de los mismos (por ejemplo, etanol, alimentos, etc.). En particular, la invención proporciona composiciones degradantes de lignocelulosa (por ejemplo, generadas vía incubación de microbios con materias primas de preparación lignocelulósicas en formato de fermentación en estado sólido) y métodos de uso de las mismas (por ejemplo, en etapas de sacarificación y/o hidrólisis (por ejemplo, en materia prima etanologénica) y como alimento o aditivos alimenticios).

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA CONVE RSIÓN DE MATE RIAL LIG NOC ELU LOSICO E N AZÚCARES FERME NTAB LES Y PRODUCTOS PRODUCIDOS A PARTI R DE LOS MISMOS Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados U nidos No. de serie 61 /160.969, presentada el 17 de marzo de 2009, incorporada a la presente a modo de referencia en su totalidad.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la conversión de materiales lignocelulósicos en azúcares fermentables y productos producidos a partir de los mismos (por ejemplo, etanol, alimentos, etc.). En particular, la invención proporciona composiciones degradadoras de lignocelulosa (por ejemplo, generadas por medio de incubación de microbios con materia prima, de cebado lignocelulósica en formato de fermentación en estado sólido) y métodos para usar las mismas (por ejemplo, en etapas de sacarificación y/o hidrólisis (por ejemplo, en materia pri ma etanologénica) y como aditivos alimenticios o de piensos).

Antecedentes de la Invención Los combustibles para transporte renovables son de interés científico, económico, ambiental y geopolítico considerable debido a las reservas inherentemente limitadas de petróleo. Entre las alternativas de combustibles para transporte renovables, la generación de etanol a gran escala a partir de material de partida lignocelulósico tiene varias ventajas que incluyen un suministro de materia prima de fácil acceso, potencial para reducir emisiones de los gases de efecto invernadero (por ejemplo, dependiendo de los métodos de cultivo, cosecha y procesamiento) , potencial para la generación de puestos de trabajo, particularmente en medios rurales, disponibilidad actual y proyectada de tecnología de vehículos de etanol dedicado y de combustible flexible y sistemas de distri bución aptos para combustibles líquidos volátiles. Si n embargo, los métodos actuales de producción de etanol lignocelulósico tienen requisitos energéticos y/o químicos desfavorables y por lo tanto un costo de producción inaceptable, en gran medida debido a la recalcitrancia de la materia prima lignocelulósica a la sacarificación e hidrólisis en comparación con materia prima rica en almidón tal como granos de maíz molidos (ver por ejemplo, Sun et al. (2002) Bioresource Technol. 83: 1 - 1 1 ; Hahn-Hagerdal et al. (2006) Trends Blotechnol. 24: 549-556; Sánchez et al. (2007) Bioresource Technol. 99: 5270-5295; cada uno incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad) .

El mayor impedimento en términos bioquímicos para el uso económico de materia pri ma lignocel ulósica es la presencia de hemicelulosas y ligninas circundantes y/o cel ulosa reticulada. Para que las enzimas cel ulasas accedan eficazmente y degraden celulosa durante la etapa de fermentación, estas hemicelulosas y ligni nas deben estar al menos parcialmente degradadas previamente. Por este motivo, actualmente se considera que el pretratamiento de materia prima lignocelulósica es una necesidad económicamente adversa.

A través del pretratamiento, la materia prima se modifica químicamente, morfológicamente y/o físicamente. Los métodos de pretratamiento estándares en la técnica incluyen la exposición de la materia prima lignocelulósica a temperatura y/o presión alta (tal como pretratamiento con vapor o hidrotermólisis), ácidos o bases o una combinación de tales métodos (ver por ejemplo, Galbe et al. (2007) Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108:41-65; Chandra et al (2007) Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108:67-93; cada uno incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad). Sin embargo, cada uno de estos abordajes de pretratamiento tiene inconvenientes. El pretratamiento con ácido diluido (generalmente a temperatura alta, por ejemplo 140-200°C) hidroliza hemicelulosas proporcionando una proporción considerable de azúcares monoméricos, pero los materiales hidrolizados con ácido generalmente son difíciles de fermentar debido a la generación de compuestos que son tóxicos para los microbios usados para- la fermentación (ver por ejemplo, Galbe and Zacchi (2007) Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108:41-65; Chandra et al (2007) Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108:67-93; cada uno incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad). El pretratamiento alcalino (generalmente llevado a cabo también a temperatura alta) provoca la deslignificación y solubilización al menos parcial de hemicelulosas así como también mayor accesibilidad del componente de celulosa cristalina a la pared celular; sin embargo, el pretratamiento alcalino no es adecuado para todos los tipos de materia prima lignocelulósica (ver por ejemplo, Galbe et al. (2007) Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108:41-65; incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad). Adicionalmente, puede ser necesaria una etapa de lavado o ajuste de pH para materiales pretratados alcalinamente o ácidamente para facilitar la compatibilidad con procesos de fermentación corriente abajo intolerantes a pH bajo o alto. El pretratamiento con vapor y combinaciones de tratamientos de pH y vapor tales como explosión de fibra con amoníaco (AFEX) son las tecnologías más próximas a la producción comercial, pero tampoco son adecuadas para todos los tipos de materia prima y tienen demandas energéticas altas (ver por ejemplo, Galbe and Zacchi (2007) Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108:41-65; incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad). El tratamiento de hidrotermólisis requiere una inversión en energía inicial más baja que el pretratamiento con vapor, pero resulta en la necesidad de procesos corriente abajo que requieren más consumo de energía (ver, por ejemplo, Galbe and Zacchi (2007) Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108:41-65; incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad). El pretratamiento de oxidación en húmedo (infusión de biomasa con agua y aire u oxígeno a 120°C) solo es compatible con materia prima con bajo contenido de lignina y hace que toda la lignina presente sea irrecuperable; esto se considera perjudicial desde el punto de vista del proceso, ya que esta lignina podría de lo contrario usarse como combustible sólido dentro de la biorrefinería (ver, por ejemplo, Galbe and Zacchi (2007) Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108:41-65; incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad). Una consideración adicional es la capacidad para utilizar material residual de la producción de biocombustible para otros fines, tales como aditivos de piensos agrícolas. Dichos usos secundarios ofrecerían un beneficio económico disminuyendo el costo de alimentos y piensos agrícolas mientras evitaría de forma simultánea el costo de la eliminación del residuo de biocombustible. Sin embargo, esto es generalmente imposible para las tecnologías existentes que hacen que el material residual sea no apto para consumo debido a la presencia de disolventes, ácidos, bases o porque resultan en residuos que tienen un valor nutritivo bajo o incluso antinutritivo.

Breve Res umen de la Invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la conversión de materiales lignocelulósicos en azúcares fermentables y productos producidos a partir de los mismos (por ejemplo, etanol, alimentos, etc.). En particular, la invención proporciona composiciones degradadoras de Iignocelulosa (por ejemplo, generadas por medio de incubación de microbios con materia prima de cebado lignocelulósica en formato de fermentación en estado sólido) y métodos para usar las mismas (por ejemplo, en etapas de sacarificación y/o hidrólisis (por ejemplo, en materia prima etanologénica) y como aditivos alimenticios o de piensos).

Por consiguiente, en algunas realizaciones la presente invención proporciona composiciones que comprenden composiciones que degradan la Iignocelulosa, métodos para generar composiciones que degradan la Iignocel ulosa y métodos para utilizar las composiciones que degradan la Iignocelulosa. En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para generar composiciones que degradan la Iignocelulosa utilizando una etapa de cebado. En algunas realizaciones, la etapa de cebado comprende fermentación en estado sólido. En algunas realizaciones, se incuba un microbio con capacidad para degradar la Iignocelulosa con matéria prima de cebado. La presente invención no está limitada por el tipo o fuente de materia prima de cebado. En algunas realizaciones, la materia prima de cebado es de naturaleza lignocelulósica. En algunas realizaciones, la materia prima de cebado lignocelulósica es un material natural. Los materiales lignocelulósicos naturales utilizados como materia prima de cebado incluyen a modo no taxativo grano para elaboración cervecera ya procesado, residuo forestal, desechos de molino, desechos de madera urbanos, residuos agrícolas y cultivos de bioenergía. En algunas realizaciones, el grano de elaboración cervecera ya procesado está en forma de granos de destilación secos (DDG). En algunas realizaciones, el grano de elaboración cervecera ya procesado está en forma de granos de destilación secos con solubles (DDG). En algunas realizaciones, los materiales lignocelulósicos naturales comprenden forraje de maíz, chalas de maíz, mazorcas de maíz, fibra de maíz, paja de trigo, tallos de sorgo, pasto varilla, madera de frondosa, madera de conifera, virutas de madera de frondosa o conifera, aserrín de frondosa o conifera, desechos de cítricos, desechos o residuos vegetales urbanos, desechos o residuos de la industria de elaboración de alimentos, desechos o residuos de la fabricación de cereales, heno, paja, paja de arroz, caña de azúcar, bagazo de caña de azúcar, residuos de limpieza de granos, cáscaras de arroz, paja de cebada, sauce, abeto, álamo, eucalipto, residuo de Brassica carinata, Antigonum leptopus, liquidambar, Miscanthus, Sericea lespedeza, árbol del sebo, cáñamo, colza, Sorghum bicolor, hojas de soja, tallos de soja, vainas de soja, residuo de soja, hojas de girasol, tallos de girasol, cabezuela de girasol sin semillas, cáscaras de girasol, residuo de girasol, caña común, cáscaras de nuez, hojas de frondosa, fibra de algodón, abono, pasto Bermuda costero, trébol, sorgo de Alepo, lino, paja de trigo sarraceno, paja de avena, paja de mijo, paja de amaranto, tallos de amaranto, hojas de amaranto, residuo de amaranto, paja de espelto, paja de centeno, alfalfa y/o bambú. En algunas realizaciones, uno, dos, tres, cuatro o más tipos de material lignocelulósico se usan como materia de prima de cebado. En algunas realizaciones, la materia prima de cebado lingnocelulósica deriva de un organismo recombinante, transformado, transfectado, transgénico, muíante o alterado genéticamente de otro modo. En algunas realizaciones, la materia prima de cebado Iignocelulósica es un material sintético. En algunas realizaciones, el material sintético comprende uno o más componentes de paredes celulares vegetales tales como celulosa, xiloglucano, arabinoxiloglucano, glucuronoarabinoxilano, xilano, arabinoxilano, poligalacturonanos, homogalacturonanos, ramnogalacturonano I, ramnogalacturonano II, apiogalacturonano, mañano, calosa, glucanos con ligadura mixta (también conocidos como uuglucanos (1?3),( 1?4)uuucalosa, glucuronomananos, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas de arabinogalactano, proteínas ricas en glicina, proteínas ricas en prolina, extensina o ligninas. En algunas realizaciones, los componentes de la pared celular vegetal están fragmentados o truncados con respecto a su longitud en paredes celulares vegetales naturales. En algunas realizaciones, la materia prima de cebado Iignocelulósica es forraje de maíz. En algunas realizaciones, la materia prima de cebado Iignocelulósica es mazorca de maíz.

En algunas realizaciones, el material de cebado lignocelulosico se procesa para resultar en un tamaño de partícula más pequeño con respecto a su estado inicial. Por ejemplo, el diámetro de partícula puede ser 0,05-0,1 mm, 0,1-0,5 mm, 0,5-1,0 mm, 1,0-2,5 mm, 2,5-5,0 mm, 5,0-10,0 mm, 10,0-25,0 mm, 25,0-50 mm, menor que 0,05 mm o mayor que 50 mm. La presente invención no está limitada por ningún método específico para generar un tamaño de partícula deseado. En algunas realizaciones, el uso de molinos de martillo, molinos de cuchilla, molinos de bolas, máquinas de cincelar, máquinas de triturar, máquinas de extrusión y/o irradiación se utiliza para generar un diámetro de partícula de un tamaño deseado. Los métodos para generar un tamaño de partícula deseado se conocen en la técnica. En algunas realizaciones, la reducción del tamaño de partícula de la materia prima de cebado lignocelulósica ocurre dentro de rangos atmosféricos de temperatura y presión. En algunas realizaciones, la reducción del tamaño de partícula de la materia prima de cebado lignocelulósica ocurre a temperatura baja. En algunas realizaciones, la temperatura baja es 0°C a -20°C, -20°C a -50°C, -50°C a -100°C, -100°C a -200°C o más frío. En algunas realizaciones, el contenido de agua del material lignocelulosico se reduce antes de la reducción de tamaño de partícula.

En algunas realizaciones, la materia prima de cebado lignocelulósica se incuba con al menos un microbio degradador de lignocelulosa (por ejemplo, para generar una composición para degradación de materia prima lignocelulósica de la invención). En algunas realizaciones, el microbio es un hongo. En algunas realizaciones, el microbio es un hongo filamentoso. La presente invención no está limitada por el tipo de hongo filamentoso utilizado. De hecho, una variedad de hongos filamentosos puede usarse en la invención incluyendo, a modo no taxativo, especies de los géneros Trichoderma, Gliocladium, Aspergillus, Rhizopus, Clostridium, Phanerochaete, Bacillus, Penicillium, Aureobasidium, Humicola, Talaromyces, Chrysosporium, Monilia, Paecilomyces y Pleurotus. En algunas realizaciones, el microbio es un hongo de podredumbre marrón. En algunas realizaciones, el microbio es un hongo de podredumbre blanca. En algunas realizaciones, el microbio es un hongo de podredumbre blanda. En algunas realizaciones, el microbio es una levadura. En algunas realizaciones, el microbio es una especie de bacterias. En algunas realizaciones, el microbio es una cepa recombinante, transformada, transfectada, transgénica, muíante o alterada genéticamente de otro modo. En algunas realizaciones, más de un microbio se incuba con materia prima de cebado lignocelulósica. En algunas realizaciones, el microbio está présenle en el maíerial lignocelulósico aníes del procesamiento (por ejemplo, la materia prima de cebado lignocelulósica no es estéril). En algunas realizaciones, el microbio degradador de lignocelulosa es Aspergillus niger. En algunas realizaciones, el microbio degradador de lignocelulosa es Aspergillus niger var. altipes (ATCC 10549; IFO 4067; UCL 13608; WB 4863). En algunas realizaciones, el microbio es una cepa de Aspergillus oryzae. En algunas realizaciones, el microbio es una cepa de Rhizopus oligosporus (también conocida como Rhizopus microsporus var. oligosporus). En algunas realizaciones, la cepa de Rhizopus oligosporus es la cepa 2UV3. En algunas realizaciones, se utilizan dos o más microbios degradadores de lignocelulosa para incubación con materia prima de cebado lignocelulósica (por ejemplo, se utiliza una combinación de Aspergillus orzyae y Rhizopus oligosporus). En algunas realizaciones, se utilizan tres, cuatro, cinco o más microbios degradadores de lignocelulosa para incubación con materia prima de cebado lignocelulósica.

En algunas realizaciones, al menos un componente adicional se agrega al material lignocelulosico (por ejemplo, para auxiliar en la fermentación y/o limitar el crecimiento bacteriano). La invención no está limitada por el tipo de componente adicional agregado. Los componentes adicionales incluyen, a modo no taxativo, agua, soluciones amortiguadoras, medios nutritivos, tensioactivos, sales, minerales, agentes osmolíticamente activos, aditivos de fermentación, fuentes de nitrógeno, antibióticos y/o fuente de carbono. En algunas realizaciones, los aditivos de fermentación incluyen a modo no taxativo, almidón de maíz, BACTO Peptona (DIFCO), extracto de levadura, MgS04-7H20, KCI, KH2P04, agua desionizada y/o antibiótico LACTOSIDE (Ethanol Technology, Milwaukee, Wl). En algunas realizaciones, se agrega un inoculo (por ejemplo, inoculo líquido, inoculo seco (por ejemplo, en polvo) o una combinación de los mismos) que comprende uno o más microbios degradadores de lignocelulosa a la materia prima de cebado lignocelulósica. En algunas realizaciones, la relación entre el volumen del inoculo líquido y la masa de la materia prima de cebado está por debajo de 1 mi por 10 g; 1-2 mi por 10 g; 2-4 mi por 10 g; 4-6 mi por 10 g; 6-8 mi por 10 g; 8-10 mi por 10 g; 10-20 mi por 10 g; 20-50 mi por 10 g; 50-100 mi por 10 g. En algunas realizaciones, la relación entre la masa del inoculo seco y la masa de la materia prima de cebado es de aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:200, aproximadamente 1:500, aproximadamente 1:1000, aproximadamente 1:2500, aproximadamente 1:5000, aproximadamente 1:10000, aproximadamente 1:20000, aproximadamente 1:50000 o relaciones entre estas cantidades, por debajo o por encima de las mismas. En algunas realizaciones, se agrega extracto de levadura al 15%.

En algunas realizaciones, la materia prima de cebado lignocelulósica (por ejemplo, procesada para generar un tamaño de partícula de materia prima deseado) se inocula con una o más cepas de microbios degradadores de lignocelulosa (por ejemplo, para generar una composición para degradación de materia prima lignocelulósica) sin limitación con respecto al método de inoculación o método para preparar el inoculo. En algunas realizaciones, el o los microbios degradadores de lignocelulosa y la materia prima de cebado lignocelulósica se extienden sobre un soporte sólido (por ejemplo, en una bandeja de acero inoxidable) para crear un lecho. En algunas realizaciones, la altura del lecho está por debajo de 0,5 cm; 0,5-1 cm; 1-5 cm; 5-10 cm; 10-20 cm; 20-50 cm; 50-100 cm; 100-1000 cm; 1000 cm o más. En algunas realizaciones, se usan dispositivos de aparato de fermentación alternativos, incluidos a modo no taxativo columnas, recipientes de reactor, reactores de bandeja plana de tipo Koji, reactores de torre fija, reactores de tambor giratorio y/o reactores de agitación. En algunas realizaciones, se incuban uno o más microbios degradadores de lignocelulosa y materia prima de cebado lignocelulósica a una temperatura, presión, nivel de 02, nivel de ventilación, humedad relativa, pH y durante un tiempo suficiente para producción de al menos una composición degradadora de lignocelulosa. La invención no está limitada por la duración de la incubación. Por ejemplo, la duración de la incubación puede ser de 1 h; 2 h; 5 h; 10 h; 20 h; 1 día; 1-5 días; 5-10 días; 10-20 días; 20-30 días; 30-50 días; 50-100 días; 100-300 días o más. En algunas realizaciones, la incubación se lleva a cabo durante 5 días. La incubación puede llevarse a cabo a una humedad relativa de 1%; 1-10%; 10-25%; 25-50%; 50-75%; o 75-99%. En algunas realizaciones, la humedad relativa de la incubación es 50%. La incubación puede llevarse a cabo a 10°C; 10-20°C; 20-40°C; 40-60°C; 60-80°C; 80-120°C o a una temperatura por debajo de 10°C o por encima de 120°C. En algunas realizaciones, la incubación se lleva a cabo a 30°C.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones para la degradación de materia prima lignocelulósica. En algunas realizaciones, la composición para degradación de materia prima lignocelulósica comprende uno o más microbios degradadores de lignocelulosa y una materia prima de cebado lignocelulósica (por ejemplo, incubada a una temperatura, presión, nivel de 02, nivel de ventilación, humedad relativa, pH y/o durante un tiempo suficiente para producción de al menos una composición degradadora de lignocelulosa). La presente invención no está limitada por ningún mecanismo de acción específico de la composición degradadora de lignocelulosa. De hecho, no se requiere una comprensión del mecanismo de acción de una composición degradadora de lignocelulasa de la invención para poner en práctica la invención y la misma no está limitada por ningún mecanismo de acción específico. En algunas realizaciones, la composición degradadora de lignocelulasa posee una o más actividades enzimáticas. Dicha o dichas actividades enzi máticas pueden comprender, a modo no taxativo, celulasa, xilanasa, endoxilanasa, exoxilanasa, beta xilosidasa, endomanasa, beta-manosidasa, beta-manasa, pectina Masa, pectato Masa, endopoligalacturonasa, exopoligalacturonasa, ramnohidrolasa, xilogalacturonasa, alfa-ramnosidasa, ramnogalacturonan liasa, xilosidasa, arabinofuranosidasa, arabinofuranohidrolasa, endoarabi nasa, exoarabi nasa, endogalactanasa, glucuronidasa, feruloil esterasa, p-cumaroil esterasa, galactosidasa, endoglucanasa, exogl ucanasa, proteasa, lipasa, glucoamilasa, celobiohidrolasa, alfa amilasa, acetil esterasa, metil esterasa, lignina peroxidasa y/o lacasa. En algunas realizaciones, las composiciones degradadoras de lignocel ulosa comprenden componentes proteínicos. En algunas realizaciones, la composición degradadora de lignocel ulosa comprende polímeros de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la composición degradadora de lignocelulosa comprende ribozimas. En algunas realizaciones, la composición degradadora de lignocelulosa comprende compuestos orgánicos. En algunas realizaciones, la composición degradadora de lignocelulosa comprende compuestos inorgánicos. En algunas realizaciones, la composición degradadora de lignocelulosa comprende uno o más agentes activos (por ejemplo, agentes osmolíticamente activos, aditivos de fermentación y/o anti bióticos).

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir etanol que comprende sacarificación y/o fermentación de una materia prima etanologénica (por ejemplo, lignocelulósica) utilizando una composición degradadora de lignocelulosa que comprende uno o más microbios degradadores de lignocelulosa y una materia prima de cebado lignocelulósica. En algunas realizaciones, el componente lignocelulósico de la materia prima etanologénica es mazorca de maíz. En algunas realizaciones, la mazorca de maíz tiene 0-2% de humedad; 2-4% de humedad; 4-9% de humedad; 9-15% de humedad; 15-25% de humedad o un nivel de humedad por encima de 25%. En algunas realizaciones, la materia prima etanologénica comprende un material rico en almidón. Los materiales ricos en almidón se conocen en la técnica e incluyen a modo no taxativo, granos, raíces de almacenamiento, tubérculos, frutos secos y frutos y más específicamente puede ser granos, semillas o harinas de maíz, trigo, arroz, avenas, cebada, centeno, amaranto, trigo sarraceno (espelto), papa, boniato, colocasia, ñame, mandioca, tapioca, arrurruz, ñame, leguminosas, castaña, arracacha, banana, kudzu, oca, sagú y sorgo. En algunas realizaciones, el material rico en almidón es un subproducto o residuo de la industria de elaboración de alimentos, piensos o bebidas o de la industria papelera. En algunas realizaciones, el componente rico en almidón de la materia prima etanologénica deriva de un organismo recombinante, transformado, transfectado, transgénico, mutante o alterado genéticamente de otro modo. En algunas realizaciones, el componente rico en almidón de la materia prima etanologénica comprende un material procesado o purificado que incluye a modo no taxativo, almidón, dextrano, glucosa o celobiosa. En algunas realizaciones, el componente rico en al midón de la materia prima etanologénica comprende granos de maíz. En algunas realizaciones, los granos de maíz son EE. U U . No. 2, dentado amarillo (por ejemplo, que contiene 1 2% de humedad) . En algunas realizaciones, la materia prima etanologénica comprende una mezcla de material lignocelulosÍco y rico en almidón. La proporción de material lignocelulosÍco y rico en almidón puede variarse para proporcionar niveles óptimos de producción de etanol. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el contenido de material lignocelulosÍco puede comprender aproximadamente 1 %; 1 -5%; 5-1 0%; 1 0-20%; 50-75%; o 75-1 00% de la materia prima etanologénica. En algunas realizaciones, el contenido de material lignocelulosÍco de la materia prima etanologénica es de 30%.

En algunas realizaciones, la materia prima etanologénica se somete a una etapa de cocción antes de la sacarificación. En algunas realizaciones, la materia prima etanologénica se procesa (por ejemplo, utilizando un método para reducir el tamaño descrito en la presente (por ejemplo, molino de martillo, molino de cuchilla, molino de bolas, máquina de cincelar, máquina de triturar, etc.)) para dar como resultado un tamaño de partícula de materia prima etanologénica más pequeño antes de la cocción. En algunas realizaciones, el diámetro de partícula de la materia prima etanologénica está por debajo de 0, 05-0, 1 mm, 0, 1 -0, 5 mm, 0, 5-1 , 0 mm, 1 , 0-2, 5 mm, 2, 5-5, 0 mm, 5 , 0-1 0,0 mm, 1 0, 0-25, 0 mm, 25, 0-50 mm, por debajo de 0, 05 mm o mayor que 50 mm. En algunas realizaciones, el material etanologénico se tritura usando un molino de martillo. En algunas realizaciones, el molino de martillo está equipado con un tamiz (por ejemplo, un tamiz No. 4 (por ejemplo, con aberturas de malla de 1,588)). En algunas realizaciones, se forma una suspensión mediante la adición apropiada de materia prima etanologénica a un líquido. En algunas realizaciones, la suspensión se forma agregando primero un componente rico en almidón de la materia prima etanologénica en un líquido (por ejemplo, con posterior adición de un componente lignocelulósico). En algunas realizaciones, la suspensión se forma agregando primero un componente lignocelulósico de la materia prima etanologénica en un líquido (por ejemplo, con posterior adición de un componente rico en almidón). En algunas realizaciones, el componente rico en almidón de la materia prima etanologénica se cuece en ausencia del componente lignocelulósico. En algunas realizaciones, la materia prima etanologénica se esteriliza antes del procesamiento. En algunas realizaciones, la esterilización se logra mediante tratamiento en autoclave (por ejemplo, a 121°C). En algunas realizaciones, la esterilización se logra mediante otros medios incluidos, a modo no taxativo, irradiación de rayos gama, irradiación de haz de electrones, irradiación de microondas, calor seco e irradiación de luz visible tal como ultravioleta e irradiación infrarroja, filtración aséptica y/o aplicación de agentes bactericidas y/o fungicidas (por ejemplo, en forma gaseosa, líquida o sólida). En algunas realizaciones, se agrega alfa-amilasa al componente rico en almidón de la materia prima etanologénica, con posterior incubación a una temperatura suficiente para la actividad de la alfa-amilasa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se agrega 0,06% de alfa-amilasa (en peso del grano) a maíz molido, con posterior calentamiento a 85°C durante cinco minutos. En algunas realizaciones, la cantidad de alfa-amilasa agregada es 0,001 %-0, 02%; 0,02%-0,04%; 0,04%-0,06%; 0,06%-0,1%; 0,1%-5%; 5% o más en peso de la materia seca del sustrato. En algunas realizaciones, el calentamiento del componente rico en almidón al cual se agregó alfa-amilasa se lleva a cabo (por ejemplo, a 85°C durante 1-2 min; 2-5 min; 5-10 min; 10-20 min; 20-60 min; 60 min o más). En algunas realizaciones, la alfa-amilasa es SPEZYME XTRA (Genencor, Rochester, NY, EE.UU.). En algunas realizaciones, el componente Iignocelulosico de la materia prima etanologénica se agrega lentamente al componente rico en almidón tratado con amilasa de la materia prima etanologénica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la mazorca de maíz triturada se agrega lentamente a la pasta de maíz triturado y la mezcla se calienta (por ejemplo, a 85°C durante 20 minutos). En algunas realizaciones, la pasta de materia prima etanologénica se agita vigorosamente a lo largo de la etapa de cocción. En algunas realizaciones, la pasta se hace girar a 350 rpm usando una pala SC3 presente en un recipiente de biorreactor de fermentación. En algunas realizaciones, la pasta se esteriliza. En algunas realizaciones, la pasta se calienta hasta alcanzar 121°C durante 20 minutos y posteriormente se enfría. En algunas realizaciones, se agrega alfa-amilasa adicional a la pasta. En algunas realizaciones, se agrega 0,04% (en peso del grana) a la pasta. En algunas realizaciones, la pasta se incuba adicionalmente a una temperatura suficiente para la actividad de la alfa-amilasa. En algunas realizaciones, la pasta se cuece a 85°C durante 60 minutos. En algunas realizaciones, se lleva a cabo incubación adicional a 85°C durante 2-5 minutos; 5-10 minutos; 10-20 minutos; 20-60 minutos; 60-120 minutos; 120-360 minutos; 360 minutos o más.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir etanol a partir de materia prima lignocelulósica que comprende sacarificación de pasta cocida que contiene materia prima etanologénica usando una composición degradadora de lignocelulosa. En algunas realizaciones, el contenido de la composición degradadora de lignocelulosa de la pasta de sacarificación es 0,1-0,5%; 0,5-1%; 1-5%; 5-10%; 10-20%; 50-75%; o 75-100%. En algunas realizaciones, la composición degradadora de lignocelulosa representa aproximadamente 1-2%, 2-4%, 4-8%, 8-15% o más de los sólidos en la pasta de sacarificación. En algunas realizaciones, la composición degradadora de lignocelulosa representa aproximadamente 5% de los sólidos en la pasta de sacarificación. En algunas realizaciones, el componente rico en almidón de la materia prima etanologénica representa aproximadamente 15-25%, aproximadamente 25-50%, aproximadamente 50-70%, 70-90% o más de los sólidos dentro de la pasta de sacarificación. En algunas realizaciones, el componente rico en almidón de la materia prima etanologénica representa aproximadamente 70% de los sólidos dentro de la pasta de sacarificación. En algunas realizaciones, el componente lignocelulósico de la materia prima etanologénica representa aproximadamente 2-5%, aproximadamente 5-10%, aproximadamente 10-20%, aproximadamente 20-40%, aproximadamente 40-60%, aproximadamente 60-80% o más de los sólidos dentro de la pasta de sacarificación. En algunas realizaciones, el componente lignocelulósico de la materia prima etanologénica representa aproximadamente 25% de los sólidos dentro de la pasta de sacarificación. En algunas realizaciones, la pasta de sacarificación contiene un contenido de sólidos totales de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50% o más. En algunas realizaciones, la pasta de sacarificación contiene un contenido de sólidos totales de aproximadamente 30%. En algunas realizaciones, la pasta de sacarificación se agita vigorosamente durante la adición de cada componente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la pasta se hace girar a 350 rpm usando una pala SC3 presente en un recipiente de biorreactor de fermentación.

En algunas realizaciones, la sacarificación y fermentación ocurre en etapas separadas. En algunas realizaciones, la sacarificación y la fermentación ocurren simultáneamente (por ejemplo, en el mismo contenedor). En algunas realizaciones, el etanol se produce a partir de una materia prima etanologénica por medio de la adición de glucoamilasa a la plasta que comprende la materia prima entanologénica. En algunas realizaciones, se agrega 0,06% de glucoamilasa (en peso del componente rico en almidón de la materia prima etanologénica) a la pasta. En algunas realizaciones, se agrega una fuente de nitrógeno a la pasta que comprende la materia prima entanologénica. Las fuentes de nitrógeno se conocen en la técnica e incluyen, a modo no taxativo, urea; peptonas; digestos o hidrolizados enzimáticos de carne, caseína, pasta de soja o gelatina; triptona; fitona; nitrato y amonio. En una realización, se usa urea como una fuente de nitrógeno. En algunas realizaciones, se agrega urea a una concentración de 1 g/L de pasta. En algunas realizaciones, una pasta que comprende una materia prima entanologénica sacarificada se i nocula con un agente etanologénico sin estar limitada por el método de inoculación . En algunas realizaciones, el agente etanologénico es un microbio. Los microbios etanologénicos incluyen a modo no taxativo especies de los géneros Saccharomyces, Zymomonas, Kluyveromyces, Brettanomyces, Pichia, Candida, Escherichia, Klebsiella, Fabospora, Pachysolen, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mucor, Chalara, Monilia, Neurospora, Aspergillus, Trichoderma, Paecilomyces, Spirochaeta, Erwinia, Leuconostoc, Streptococcus, Fusarium, Thermus y Piromyces. En algunas realizaciones, el microbio etanologénico es recombinante, transformado, transfectado, transgénico, muíante o alterado genéticamente de otro modo. En algunas realizaciones, se usa más de un tipo de microbio etanologénico. En algunas realizaciones, el microbio etanologénico es una levadura. En algunas realizaciones, el microbio etanologénico es Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, el microbio etanologénico es Saccharomyces cerevisiae SU P ERSTART (Ethanol Technology, Milwaukee, Wl , E E. UU .). En algunas realizaciones, el microbio etanologénico es Saccharomyces cerevisiae TH ERMOSACC (Ethanol Technology, Milwaukee, Wl) . En algunas realizaciones, la inoculación se lleva a cabo agregando 30 millones de células por gramo de materia prima etanologénica. En algunas realizaciones, el microbio etanologénico se agrega como una preparación de levadura seca activa. En algunas realizaciones, la levadura seca activa se agrega con un recuento de células por debajo de 1 x 1(r células/g, 1 a 5 x 109 células/g, 5 a 10 x 109 células/g, 10-20 x 109 células/g, 20 a 50 x 109 células/g, 50 x 109 células/g o mayor. En algunas realizaciones, el microbio etanologénico se agrega como una preparación de torta húmeda. En algunas realizaciones, las preparaciones de torta húmeda de levadura activa se agrega con un recuento de células de 1 x 109 células/g, 1 a 5 x 109 células/g, 5 a 10 x 109 células/g, 10-20 x 109 células/g, 20 a 50 x 109 células/g, 50 x 109 células/g o mayor. En algunas realizaciones, la viabilidad del microbio etanologénico se determina o conoce antes de la adición a la fermentación. La viabilidad puede ser del 50% o menor, 50-75%, 75-85%, 85-95%, 95-99%, 99% o mayor. En algunas realizaciones, la incubación se lleva a cabo a una temperatura suficiente para provocar la producción de etanol mediante el microbio etanologénico.

En algunas realizaciones, la incubación ocurre a una temperatura, presión, nivel de 02, nivel de ventilación, humedad relativa, pH y por una duración de tiempo suficiente para producir etanol mediante el microbio etanologénico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la incubación se lleva a cabo a 10°C; 10-20°C; 20-40°C; 40-60°C; 60-80°C; 80-120°C o más. En algunas realizaciones, la incubación se lleva a cabo a 34°C. En algunas realizaciones, la incubación se lleva a cabo a 30°C. En algunas realizaciones, la duración de la incubación puede ser de 1 h; 2 h; 5 h; 10 h; 20 h; 1 día; 1-5 días; 5-10 días; 10-20 días; 20-30 días; 30-50 días; 50-100 días; 100-300 días o más. En algunas realizaciones, la incubación se lleva a cabo durante 48 h. En algunas realizaciones, la incubación se lleva a cabo durante 72 h. En algunas realizaciones, al menos un componente adicional se agrega a la pasta. En algunas realizaciones, se agrega un componente que auxilian en la sacarificación y/o fermentación. La presente invención no está limitada por el componente que auxilia en la sacarificación y/o fermentación que se agrega a la incubación. De hecho, puede usarse una variedad de componentes que auxilian a la sacarificación y/o fermentación incluidos, a modo no taxativo, soluciones amortiguadoras, medios nutritivos, tensioactivos (incluidos, a modo no taxativo, TWEEN-20, TWEEN-80, polioxietilenglicol, TWEEN 81, Emulgen 147, anhitol anfótero 20BS, Q-86W catiónico, soforolípido, ramnolípido y bacitracina), sales, minerales, agentes osmolíticamente activos, enzimas purificadas o en bruto, fuentes de nitrógeno, antibióticos (incluido, a modo no taxativo, LACTOSIDE (Ethanol Technology, Milwaukee, Wl)) y fuentes de carbono.

En algunas realizaciones, los residuos de etanol y fermentación se separan y recogen. Los materiales y métodos útiles para la separación se conocen en la técnica e incluyen, a modo no taxativo, tecnologías de destilación y tamizado molecular. En algunas realizaciones, los residuos de fermentación se utilizan para fines que incluyen, a modo no taxativo, aditivos de piensos animales, generación de calor, generación de energía y precursores para productos químicos sintéticos.

En algunas realizaciones, se utiliza una composición degradadora de lignocelulosa de la invención para mejorar la calidad nutritiva de la materia prima lignocelulósica. En algunas realizaciones, se genera una composición degradadora de lignocelulosa mediante un método que comprende inocular una materia prima lignocelulosica con al menos un hongo filamentoso y posteriormente fermentar el subproducto o residuo fibroso con lo cual disminuye un contenido de materia seca del subproducto o residuo, aumenta un contenido proteico del subproducto o residuo y disminuye un contenido graso del subproducto o residuo. La invención no está limitada por el tipo de hongo filamentoso utilizado. Se puede usar una variedad de hongos filamentosos incluidos, a modo no taxativo, Rhizopus, Aspergillus, Trichoderma y cualquier combinación de los mismos. De forma similar, la invención no está limitada por el tipo de materia prima de cebado lignocelulosico o subproducto o residuo fibroso. Una variedad de materias primas de cebado lignocelulósicas o residuos o subproductos fibrosos pueden utilizarse incluidos, a modo no taxativo, granos de elaboración cervecera ya procesados, granos de destilación secos, solubles de destilación secos, granos de destilación secos con solubles, residuos de la industria del procesamiento de cereales, salvado de trigo, cáscaras de soja, pulpa de cítricos, pulpa de remolacha, quinoa, cáscaras y cascarillas de arroz, bagazo, pulpa de manzana y/o mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el contenido de materia seca de la materia prima lignocelulosica fermentada disminuye aproximadamente 7% a aproximadamente 12% y/o el contenido proteico aumenta en aproximadamente 10% a aproximadamente 15% y/o el contenido graso disminuye aproximadamente 40% a aproximadamente 50%. En algunas realizaciones, el contenido de fibra (fibra detergente neutra; FDN) disminuye aproximadamente 10% a aproximadamente 15%. Un experto en la técnica apreciará que los diferentes animales tienen requisitos óptimos que difieren para estos nutrientes y la alteración de los tiempos y condiciones de fermentación permite adaptar el producto fermentado total de acuerdo con las necesidades nutricionales. En algunas realizaciones, una etapa de fermentación se lleva a cabo como una fermentación en estado sólido, usando el subproducto o residuo fibroso como un sustrato para el crecimiento del hongo filamentoso, tal como se describe en la presente. Los reactivos adecuados adicionales y las condiciones para dichas fermentaciones en estado sólido se conocen en la técnica.

La presente invención también proporciona composiciones que comprenden alimentos (por ejemplo, piensos animales y/o complementos de piensos) que comprenden componentes de materia prima lignocelulósica y métodos para generar los mismos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la invención proporciona un método que comprende inocular una materia prima lignocelulósica con al menos un hongo filamentoso; fermentar el subproducto o residuo fibroso con lo cual un contenido de materia seca de la materia prima lignocelulósica disminuye y/o un contenido proteico de la materia prima lignocelulósica aumenta y/o un contenido graso de la materia prima lignocelulósica diminuye; separar al menos una enzima de subproducto o residuo fibroso fermentado; y recupera la composición degradadora de lignocelulosa y/o la enzima separada (por ejemplo, para uso como alimento (por ejemplo, pienso y/o complemento animal) que se proporciona a un animal). En algunas realizaciones, la enzima separada se utiliza para aumentar la digestibilidad en una animal y/o para aumentar los valores nutricionales de un alimento. En algunas realizaciones, la enzima separada se utiliza en la industria cervecera y/o de destilación (por ejemplo, para uso en procesos de fermentación). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una enzima producida y separada tal como se describen en la presente (por ejemplo, en un subproducto o residuo de la industria cervecera o de destilación) se utiliza en fermentaciones de cerveza o destilación que comprenden el sustrato (por ejemplo, materia prima lignocelulósica), tal como fue producido específicamente por el organismo para digerir dicho sustrato (por ejemplo, materia prima lignocelulósica). En algunas realizaciones, la enzima separada es de origen fúngico. En algunas realizaciones, la enzima separada es una proteasa.

La invención también proporciona un pienso o complemento de pienso para animales que contiene una enzima que comprende una composición degradadora de lignocelulosa. En algunas realizaciones, el pienso o complemento de pienso para animales que contiene una enzima que comprende una composición degradadora de lignocelulosa se produce inoculando un subproducto o residuo fibroso de un proceso de fabricación de alimentos con al menos un hongo filamentoso y fermentar el subproducto o residuo fibroso. En algunas realizaciones, la inoculación y fermentación resultan en un contenido de materia seca del subproducto o residuo disminuido y/o un contenido proteico del subproducto o residuo aumentado y/o un contenido graso del subproducto o residuo disminuido y/o al menos una enzima de origen fúngico introducida en el subproducto o residuo fermentado. En algunas realizaciones, el pienso o complemento de pienso se utiliza para nutrición de animales.

La invención también proporciona un método para mejorar la tasa de aumento de peso corporal de un animal en desarrollo, que comprende alimentar una cantidad nutritivamente efectiva de un complemento de pienso para animales en base a una enzima formulado mediante las etapas de inocular una materia prima lignocelulósica con al menos un microbio (por ejemplo, al menos un hongo filamentoso), fermentar la materia prima lignocelulósica con lo cual un contenido de materia seca del subproducto o residuo disminuye y/o un contenido proteico del subproducto o residuo aumenta y/o un contenido graso del subproducto o residuo disminuye; separar al menos una enzima del subproducto o residuo fibroso fermentado; deshidratar la enzima separada; y proporcionar la enzima deshidratada a un animal en una formulación que comprende un portador adecuado. Los subproductos o residuos fibrosos y hongos son tales como se describen en la presente. En algunas realizaciones, el pienso o complemento de pienso se proporciona a cualquier animal incluidos, a modo no taxativo, humanos, aviares, bovinos, porcinos, equinos, ovinos, caprinos, caninos, felinos, peces, camélidos, especies de roedores así como también pescados y mariscos.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra un diagrama de flujo que representa un proceso para una biorrefinería integrada que produce etanol a partir de materias primas lignocelulósicas en una real'ización de la invención.

La Figura 2 muestra el fl ujo del proceso desde la inoculación del cultivo de semillas hasta la inoculación de la fermentación de la pasta de maíz en una realización de la presente invención.

La Figura 3 muestra la generación de etanol usando composiciones producidas en una realización de la presente invención . La producción de etanol se cuantificó durante el transcurso de una fermentación de pasta de maíz estándar (matraces Erlenmeyer de 500 mi) usando levadura SU PERSTART a 30°C complementada con el producto enzimático de fermentación en estado sólido (SSF) de A. oryzae cultivado en granos de destilación secos con solubles (DDGS) de una fuente de whisky o etanol carburante. Testigo (diamantes), producto de SSF de whisky (cuadrados), producto de SS F de etanol carburante (triángulos).

La Figura 4 muestra la generación de etanol usando composiciones producidas en una realización de la presente invención. Se muestran los datos de dos experimentos separados (paneles superior e inferior) . La producción de etanol se cuantificó durante el transcurso de una fermentación de pasta de maíz estándar (recipientes de fermentación Bélico de 4 L) usando levadura TH ERMOSACC a 30°C complementada con el producto enzimático de fermentación en estado sólido (SSF) de A. oryzae y R. oligosporus cultivados en granos de destilación secos con solubles (DDGS) (planta de etanol carburante). Testigo (diamantes) , producto de SSF de A. oryzae (cuadrados) , producto de SSF de R. oligosporus (triáng ulos).

La Figura 5 muestra cambios en la masa de la materia seca antes y después de la fermentación en estado sólido usando composición de una realización de la presente invención. A, Rhizopus cultivado en DDGS de destiladores de whisky; B, Rhizopus cultivado en DDGS de etanol carburante; C, Aspergillus cultivado en DDGS de destiladores de whisky; D, Aspergillus cultivado en DDGS de etanol carburante.

La Figura 6 muestra un diagrama de flujo de fermentación en estado sólido en una realización de la presente invención.

La Figura 7 muestra aplicaciones para productos de fermentación en estado sólido (composiciones degradadoras de lignocelulosa) en algunas realizaciones de la presente invención.

Definiciones A continuación se definen varios términos para facilitar la comprensión de la invención.

Tal como se usa en la presente, el término "pretratamiento" se refiere a cualquier proceso físico, químico o mecánico aplicado a material de materia prima antes del uso de la materia prima (por ejemplo, para generación de etanol) incluyendo, a modo no taxativo, exposición de la materia prima a ácidos, bases, presión alta, presión baja, vapor, agua calentada hasta al menos 99°C, agentes de oxidación, disolventes orgánicos, irradiación, pirólisis, explosión de fibras por amoníaco (AFEX), explosión por C02, ozonólisis, oxidación en húmedo o una combinación de los mismos. El pretratamiento no incluye procesamiento mecánico llevado a cabo solamente para reducir el tamaño de partícula del sustrato o material de materia prima. Los expertos en la técnica reconocerán que los materiales lignocelulosicos que surgen de la industria papelera (tales como papel reciclado, pulpa de papel y lodo de papel), aunque son compatibles con los métodos de la presente invención, inherentemente han experimentado tratamientos de procesamiento antes de su uso como sustratos para fermentación .

Tales como se usan en la presente, las expresiones "composición degradadora de lignocelulosa" y "composición para degradación de materia prima lignocel ulósica" se refieren a una composición que comprende una materia prima de cebado lignocelulósica inoculada con una o más cepas de microbios degradadores de lignocelulosa (y a continuación , por ejemplo, incubada a una temperatura, presión, nivel de 02, nivel de ventilación, humedad relativa, pH y/o por una duración de tiempo descritas en la presente) . U na composición degradadora de lignocelulosa, cuando se agrega a un proceso de sacarificación o de sacarificación y fermentación simultáneas, resulta en una producción aumentada de etanol a partir de la materia prima lignocelulósica que la que ocurre en ausencia de su adición. Las composiciones degradadoras de lignocelulosa de la presente invención no están limitadas a ningún mecanismo de acción específico y no es necesario una comprensión del mecanismos de acción para poner en práctica la invención. En algunas realizaciones, las composiciones degradadoras de lignocelulosa comprenden actividad enzimática. Las actividades enzimáticas de una composición degradadora de lignocelulosa pueden incluir, a modo no taxativo, cel ulasa, xilanasa, endoxilanasa, exoxilanasa, beta xilosidasa, endomanasa, beta-manosidasa, beta-manasa, pectina liasa, pectato liasa, endopoligalacturonasa, exopoligalacturonasa, ramnohidrolasa, xilogalacturonasa, alfa-ramnosidasa, ramnogalacturonan liasa, xilosidasa, arabinofuranosidasa, arabinofuranohidrolasa, endoarabinasa, exoarabinasa, endogalactanasa, glucuronidasa, feruloil esterasa, p-cumaroil esterasa, galactosidasa, endoglucanasa, exoglucanasa, proteasa, lipasa, glucoamilasa, celobiohidrolasa, alfa amilasa, acetil esterasa, metil esterasa, lignina peroxidasa y lacasa.

Tales como se usan en la presente, las expresiones "materia prima de cebado" y "materia prima de cebado lignocelulósica" se refieren a material usado como sustrato para la generación de al menos una composición degradadora de lignocelulosa.

Tal como se usa en la presente, la expresión "granos de destiladores secos" (DDG) se refiere a material de desecho generado por la industria cervecera o de destilación que se produce mediante a) fermentación de alcohol, b) destilación de la pasta fermentada para retirar el alcohol, c) procesamiento de la suspensión restante que contiene por ejemplo, 5-10% de materia seca mediante tamizado y prensado o centrifugación para retirar las partículas gruesas, d) secar las partículas restantes, que luego se denominan DDG. Tal como se usa en la presente, la expresión "granos de destilación secos con solubles" (DDGS) se define como material de desecho generado en la industria de la destilación en el cual el material soluble extraído en la etapa c) anterior se evapora para formar un jarabe que contiene por ejemplo, 30-40% de materia seca, que a continuación se vuelva a agregar a DDG y la mezcla entera se seca para producir DDGS.

Tal como se usa en la presente, la expresión "materia prima etanologénica" se refiere al material usado como sustrato para la producción de etanol en una reacción de sacarificación y/o fermentación.

Tal como se usa en la presente, la expresión "componente lignocelulósico" es material usado como sustrato para un proceso de fermentación y que no es rico en almidón (en donde el contenido de almidón está por debajo de aproximadamente 60% en base a la materia seca). Los componentes lignocelulosicos incluyen, a modo no taxativo, residuo forestal, desechos de molinos, desechos de madera urbanos, residuos agrícolas y cultivos de bioenergía, más específicamente, los materiales lignocelulosicos incluyen, a modo no taxativo, forraje de maíz, chalas de maíz, mazorcas de maíz, fibra de maíz, paja de trigo, tallos de sorgo, pasto varilla, madera de frondosa, madera de conifera, virutas de madera de frondosa o conifera, aserrín de frondosa o conifera, desechos de cítricos, desechos vegetales urbanos, heno, paja, paja de arroz, caña de azúcar, bagazo de caña de azúcar, residuos de limpieza de granos, granos de elaboración cervecera ya procesados incluyendo granos de destilación secos (DDG) y granos de destilación secos con solubles (DDGS), cáscaras de arroz, paja de cebada, sauce, abeto, álamo, eucalipto, residuo de Brassica carinata, Antigonum leptopus, liquidambar, Miscanthus, Sericea lespedeza, árbol del sebo, cáñamo, colza, Sorghum bicolor, hojas de soja, tallos de soja, vainas de soja, residuo de soja, hojas de girasol, tallos de girasol, cabezuela de girasol sin semillas, cáscaras de girasol, residuo de girasol, caña común, cáscaras de nuez, hojas de frondosa, fibra de algodón, abono, pasto Bermuda costero, trébol, sorgo de Alepo, lino, paja de trigo sarraceno, paja de avena, paja de mijo, paja de amaranto, tallos de amaranto, hojas de amaranto, residuo de amaranto, paja de espelto, paja de centeno, alfalfa y/o bambú. Más de un tipo de material lignocelulósico puede usarse como componente de materia prima. El componente lignocelulósico puede ser un material sintético que incluye uno o más componentes de paredes celulares vegetales incluyendo, a modo no taxativo, celulosa, xiloglucano, arabinoxiloglucano, glucuronoarabinoxilano, xilano, arabinoxilano, poligalacturonanos, homogalacturonanos, ramnogalacturonano I, ramnogalacturonano II, apiogalacturonano, mañano, calosa, glucanos con ligadura mixta (también conocidos como uuglucanos (1- 3),( 1?4)uuucalosa, glucuronomananos, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas de arabinogalactano, proteínas ricas en glicina, proteínas ricas en prolina, extensina o ligninas.

Tal como se usa en la presente, la expresión "componente rico en almidón" es material usado como sustrato para una fermentación que es rica en almidón (en donde el contenido de almidón es mayor o igual a aproximadamente 60% en base a la materia seca). Los materiales ricos en almidón se conocen en la técnica e incluyen a modo no taxativo, granos, raíces de almacenamiento, tubérculos, frutos secos y frutos y más específicamente se refiere a partículas, granos, semillas o harinas de maíz, trigo, arroz, avenas, cebada, centeno, amaranto, trigo sarraceno o espelto; papa, boniato, colocasia, ñame, mandioca, tapioca, arrurruz, leguminosas, castaña, arracacha, banana, kudzu, oca, sagú y sorgo.

Tal como se usa en la presente, "organismo degradador de lignocelulosa" se refiere a un agente biológico o un derivado del mismo que es capaz de generar al menos una composición degradadora de lig nocel ulosa cuando se combi na con una materia pri ma de cebado lig nocelulósica. Los organismos degradadores de lignocel ulosa i ncl uyen a modo no taxativo microbios que incluyen bacterias y hongos (por ejemplo, de los géneros Trichoderma, Gliocladium, Aspergillus, Rhizopus, Clostridium, Phanerochaete, Bacillus, Penicillium, A ureobasidium, Humicola, Talaromyces, Chrysosporium, Monilia, Paecilomyces y Pleurotus y especies que comprende hongo de podred umbre blanca, hongo de podredu mbre marrón y hongo de podredumbre blanda. Ejemplos específicos de organismos degradadores de lignocelulosa i ncl uyen cepas de Aspergillus niger (por ejemplo, la cepa ATCC 1 0549) , Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus (por ejemplo, la cepa 2UV3) . Los organismos degradadores de l ignocelulosa pueden uti l izarse solos o en combi nación .

Tal como se usa en la presente, "organismo etanologénico" se refiere a u n agente biológico o derivado del mismo que es capaz de produci r etanol tras la i ncubación con sustrato de materia prima etanologénica. Los organismos etanologénicos i ncl uyen , a modo no taxativo, microbios; más específicamente, i ncl uyen a modo no taxativo bacterias y hongos; más específicamente incluyen a modo no taxativo especies de los géneros Saccharomyces, Zymomonas, Kluyveromyces, Brettanomyces, Pichia, Candida, Escherichia, Klebsiella, Fabospora, Pachysolen, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mucor, Chalara, Monilia, Neurospora, Aspergillus, Trichoderma, Paecilomyces, Spirochaeta, Erwinia, Leuconostoc, Streptococcus, Fusarium, Thermus y Piromyces; más específicamente i ncl uyen , a modo no taxativo, cepas de Saccharomyces cerevisiae; más específicamente incluyen cepas comerciales de Saccharomyces cerevisiae SUPERSTART o THERMOSACC (Ethanol Technology, Milwaukee, Wl). En algunas realizaciones, el microbio etanologénico es recombinante, transformado, transfectado, transgénico, muíante o alterado genéticamente de otro modo. En algunas realizaciones, se usa más de un tipo de microbio etanologénico.

La expresión " medio de cultivo" se refiere generalmente a cualquier sustancia o preparación usada para cultivo de células vivas.

El término "mutado" tal como se usa en la presente, con respecto a un gen o expresión génica, significa que el gen no es un gen de tipo salvaje y que el organismo no tiene un genotipo de tipo salvaje y/o un fenotipo de tipo salvaje. El gen, genotipo o fenotipo alterado puede ser consecuencia de una mutación en dicho gen o de un gen que regula la expresión de dicho gen (por ejemplo, transcripcional o post-transcripcional) , de modo tal que su expresión normal se interrumpe o extingue. Se pretende que "expresión génica interrumpida" incluya la inhibición completa y la expresión génica disminuida (por ejemplo, como en una mutación rezumante), por debajo de la expresión génica de tipo salvaje.

Tal como se usa en la presente, el término "fragmento" cuando se usa en referencia a una secuencia (por ejemplo, una secuencia de aminoácido de una proteína, una secuencia de ácido nucleico de un gen) representa cualquier cantidad de la secuencia mencionada (por ejemplo, 0,001 % , 0, 1 %, 1 %, 1 0%, 30%, 50%, 75% , 80% , 85% , 90% , 95%, 98%, 99,999% de una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico).

La expresión "genéticamente alterado" tal como se usa en la presente se refiere a una regulación hacia arriba (es decir, activación o estimulación (por ejemplo, agonizando o potenciando)) y una regulación hacia abajo (es decir, inhibición o supresión (por ejemplo, antagonizando, disminuyendo o inhibiendo)). El término "inducible" se refiere en particular a la expresión génica que no es constitutiva sino que se produce en respuesta a un estímulo (por ejemplo, temperatura, metales pesados u otros aditivos del medio).

La expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos u oligonucleótidos tales como el ácido desoxirribonucleico (ADN) y cuando corresponde, ácido ribonucleico (ARN). También se entenderá que el término incluye, como equivalentes, análogos de ARN o ADN hechos con nucleótidos análogos y como aplicables a la realización descrita, polinucleótidos de hebra simple (con sentido o antisentído) y de hebra doble.

Tal como se usa en la presente, el término "transfección" significa la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, a través de un vector de expresión) en una célula receptora mediante transferencia génica mediada por ácido nucleico. "Transformación", tal como se usa en la presente, se refiere a un proceso en el cual se cambia el genotipo de una célula como resultado de la absorción celular de ADN o ARN exógeno.

Tal como se usa en la presente, el término "transgén" significa un ácido nucleico (por ejemplo, un gen que codifica una enzima degradadora de polisacárido de pared celular vegetal o un transcrito antisentido para el mismo) que se ha introducido en una célula.

Un transgén puede ser parcialmente o completamente heterólogo, es decir, externo con respecto al animal o célula transgénica en el que se introduce o puede ser homólogo a un gen endógeno del organismo o célula en el que se introduce, pero que se diseña para insertarse o se inserta en el genoma del animal o célula de tal modo que altera el genoma de la célula en la que se insertó. Un transgén también puede estar presente en una célula en forma de un episoma.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligado. Los vectores capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están ligados operativamente de denominan en la presente "vectores de expresión". La expresión "sistema de expresión" tal como se usa en la presente se refiere a un vector de expresión en condiciones con lo cuales un ARNm puede transcribirse y/o un ARNm puede traducirse en una enzima, ARN estructural u otro componente celular. El sistema de expresión puede ser un sistema de expresión in vitro, que está disponible en el mercado o se hace fácilmente de acuerdo con técnica conocida en la técnica o puede ser un sistema de expresión in vivo, tal como una célula eucariota o procariota que contiene el vector de expresión. En general, los vectores de expresión útiles en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de "plásmidos" que se refiere generalmente a bucles de ADN de hebra doble circulares que en su forma de vector no están unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma de vector usada más habitualmente. Sin embargo, se pretende que la invención incluya tales otras formas de vectores de expresión que cumplen funciones equivalentes y se conocen en la técnica o se volvieron conocidas en la técnica posteriormente a la presente (por ejemplo, vectores cósmidos, fagémidos y bacteriófagos) .

Descripción Detallada de la Invención La ind ustria del etanol a nivel mundial continúa desarrollándose a medida que los investigadores y la industria se esfuerzan para producir combustibles renovables con la mayor rentabilidad sobre la inversión posible. U n área donde se ha enfocado la investigación de forma importante es la aplicación y el desarrollo de composiciones para eficacia de fermentación mejorada. La mayoría de los fabricantes producen composiciones que comprenden enzimas usando técnicas de fermentación sumergida (SmF) (Ver, por ejemplo, Villas-Boas et al. (2002) Animal Feed Sci. Technol. 98, 1 -1 2) . Sin embargo, un método alternativo, que se está volviendo muy importante, es la fermentación en estado sólido (SSF) (Ver, por ejemplo, Krishna (2005) Crit. Rev. Biotechnol. 25: 1 -30; Lonsane et al (1 992) Exoenzymes, I n : Solid Substrate Cultivation , itchell et al., Eds. , Elsevier Applied Science, Londres, pp. 1 91 -209; Pandey et al. (2001 ) Solid-state fermentation in biotechnology: Fundamentáis and applications, Asiatech Publishers, Nueva Delhi, I ndia, p. 221 ).

La SS F puede caracterizarse como el crecimiento de microorganismos en sustratos insoluble, con presencia mínima o nula de agua (Ver, por ejemplo, Mitchell et al (1992) Definition, characteristics, and potential, In: Solid Substrate Cultivation, Rolz, Ed., Elsevier Applied Science, Londres, RU, pp. 1-16; Mitchell et al (2006) Solid-state fermentation bioreactors: Fundamentáis of design and operation, Springer, Berlín, Alemania; Villas-Boas et al. (2002) Animal Feed Sci. Technol. 98:1-12). Muchas bacterias y hongos son capaces de crecer en sustratos sólidos. Sin embargo, de estos organismos, los hongos filamentosos se adaptan mejor a estos procesos debido a sus características físicas (Ver, por ejemplo, Mitchell (1992) Microbial basis of process, In: Solid Substrate Cultivation, Rolz, Ed., Elsevier Applied Science, Londres, RU, pp 17-28). La SSF se ha utilizado ampliamente en Asia para la producción de alimentos y bebidas tales como salsa de soja, sake y tempeh durante siglos (Ver, por ejemplo, Mudgett (1986) Solid-state fermentations, In: Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, Demain et al., Eds., American Society for Microbiology, Washington, DC, pp. 66-83; Padmaja et al. (1999) Oriental fermented foods, In: Biotechnology: Food Fermentation, Microbiology, Biochemistry and Technology, Joshi et al., Eds., Educational Publishers and Distributers, Nueva Delhi, India, pp. 523-582).

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para la conversión de materiales lignocelulósicos en azúcares fermentables y productos producidos a partir de los mismos (por ejemplo, etanol, alimentos, etc.). En particular, la invención proporciona composiciones degradadoras de lignocelulosa (por ejemplo, generadas por medio de incubación de microbios con materia prima de cebado lignocelulósica en formato de fermentación en estado sólido) y métodos para usar las mismas (por ejemplo, en etapas de sacarificación y/o hidrólisis (por ejemplo, en materia prima etanologénica) y como aditivos alimenticios o de piensos).

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos que utilizan composiciones degradadoras de lignocelulosa para sacarificar materias primas lignocelulósicas en carbohidratos fermentables en ausencia de tratamientos químicos o físicos rigurosos y composiciones generadas usando los mismos. En algunas realizaciones, los métodos de la invención permiten un proceso de cofermentación que permite la conversión de productos de degradación lignocelulósica en presencia de azúcares fermentables obtenidos de componentes ricos en almidón de materia prima etanologénica. Las composiciones degradadoras de lignocelulosa usadas se producen usando un proceso de fermentación en estado sólido sobre humedad baja, materia prima de cebado lignocelulósica de fase sólida y cepas de microbios seleccionadas específicamente. En los experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de las realizaciones de la presente invención se usaron hongos filamentosos como microbios degradadores de lignocelulosa (Ver Ejemplo 1 y 2). En algunas realizaciones, se usaron cepas seleccionadas de Aspergillus niger. La presente invención proporciona un proceso de fermentación para la producción de etanol a partir de materia prima etanologénica que se lleva a cabo en presente de niveles bajo (1-10%) de composiciones degradadoras de lignocelulosa, un componente rico en almidón triturado de materia prima etanologénica y uno o más microbios etanol'ogénicos. En experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de realizaciones de la invención, el componente rico en almidón de la materia prima etanologénica era maíz triturado y el microbio etanologénico se selección de cepas de Saccharomyces cerevisiae. Aunque la presente invención no está limitada por ningún mecanismo de acción y aunque no es necesaria una comprensión del mecanismo de acción para poner en práctica la invención , los efectos inhibitorios de los compuestos fenólicos derivados de la lignina se minimizan controlando la relación entre el componente lignocelulósico y el componente rico en almidón de la materia prima etanologénica y controlando la adición de las composiciones degradadoras de lignocelulosa de la fermentación en estado sólido.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden usarse para convertir una variedad de materias primas fibrosas diferentes en etanol y otros productos incluidas composiciones que pueden usarse como alimento y complementos de piensos para animales. Las materias primas fibrosas incluyen, a modo no taxativo, residuos forestales, desechos de molinos, desechos de madera urbanos, residuos agrícolas y cultivos de bioenergía. Por ejemplo, las materias primas fibrosas incluyen materiales lignocelulósicos que incluyen, a modo no taxativo, forraje de maíz, chalas de maíz, mazorcas de maíz, fibra de maíz, paja de trigo, tallos de sorgo, pasto varilla, madera de frondosa, madera de conifera, virutas de madera de frondosa o conifera, aserrín de frondosa o conifera, desechos de cítricos, desechos vegetales urbanos, heno, paja, paja de arroz, caña de azúcar, bagazo de caña de azúcar, residuos de limpieza de granos, granos de elaboración cervecera ya procesados incluyendo granos de destilación secos (DDG) y granos de destilación secos con solubles (DDGS), cáscaras de arroz, paja de cebada, sauce, abeto, álamo, eucalipto, residuo de Brassica carinata, Antigonum leptopus, liquidambar, Miscanthus, Sericea lespedeza, árbol del sebo, cáñamo, colza, Sorghum bicolor, hojas de soja, tallos de soja, vainas de soja, residuo de soja, hojas de girasol, tallos de girasol, cabezuela de girasol sin semillas, cáscaras de girasol, residuo de girasol, caña común, cáscaras de nuez, hojas de frondosa, fibra de algodón, abono, pasto Bermuda costero, trébol, sorgo de Alepo, lino, paja de trigo sarraceno, paja de avena, paja de mijo, paja de amaranto, tallos de amaranto, hojas de amaranto, residuo de amaranto, paja de espelto, paja de centeno, alfalfa y/o bambú.

Las composiciones degradadoras de lignocelulosa de la invención se producen en una variedad de materias primas y preparaciones de nutrientes tal como se describe en la presente. Los sistemas de fermentación en estado sólido se adaptan para usar materias primas diferentes permitiendo la producción de composiciones degradadoras de lignocelulosa adaptadas para sustratos específicos usados en las etapas de sacarificación y fermentación.

Se ha adaptado una variedad de cepas fúngicas para la producción de composiciones degradadoras de lignocelulosa en sistemas de fermentación en estado sólido. Las diferentes cepas de hongos proporcionan composiciones degradadoras de lignocelulosa diferentes y se aplican en composiciones y métodos de la invención para mejorar el rendimiento de etanol.

En algunas realizaciones, las composiciones degradadoras de lignocelulosa (por ejemplo, generadas a través de procesos de fermentación en estado sólido descritos en la presente) se utilizan independientemente para conversión de materiales vegetales fibrosos en azúcares fermentables. En algunas realizaciones, las composiciones degradadoras de lignocelulosa (por ejemplo, generadas a través de procesos de fermentación en estado sólido descritos en la presente) se utilizan junto con otros agentes degradadores de lignocelulosa y/u otros agentes activos tales como soluciones amortiguadoras, medios nutritivos, tensioactivos (incluidos, a modo no taxativo TWEEN-20, TWEEN-80, polioxietilenglicol, TWEEN-81, Emulgen 147, anhitol anfótero 20BS, Q-86W catiónico, soforolípido, ramnolípido y bacitracina), sales, antibióticos (incluido, a modo no taxativo, el antibiótico LACTOSIDE (Ethanol Technology, Milwaukee, Wl)), minerales, agentes osmolíticamente activos, enzimas purificadas o en bruto, fuentes de nitrógeno y/o fuentes de carbono.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método de fermentación de etanol que utiliza las actividades del al menos un microbio etanologénico activo. En experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de realizaciones de la presente invención, se usó Saccharomyces cerevisiae para convertir los azúcares fermentables en la pasta de maíz/mazorca de maíz en etanol. Otras cepas o especies de levaduras descritas en la presente son útiles de igual forma en este proceso y pueden permitir eficacias de producción de etanol aumentadas.

Además de producir enzimas para metabolizar un sustrato específico, los hongos también tienen la capacidad para alterar las características nutritivas de los materialés en los que crecen. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones y métodos de la presente invención son útiles en la industria de los piensos para animales. Por ejemplo, las composiciones y métodos producidos mediante SSF de materia prima lignocelulósica descritos en la presente proporcionan alimentos (por ejemplo, aditivos y/o complementos alimenticios) para aplicaciones de alimentos y piensos agrícolas (por ejemplo, para cumplir con los requisitos nutritivos del ganado más eficazmente).

Experimentos Los siguientes ejemplos se proporcionan a efectos de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones y aspectos de la presente invención y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Productos de Fermentación en Estado Sólido Cultivados en Sustrato de Granos de Destilación Secos con Solubles (DDGS) Materiales v Métodos Organismos: Se usaron cepas de Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus para fermentación en estado sólido. Ambas cepas están designadas como organismos Generalmente Reconocidos como Seguros (GRAS). Las cepas se almacenaron en pendientes de Agar Papa Dextrosa Difco a 4o C hasta lo necesario.

Dos cepas de levaduras usadas para la fermentación de pastas de maíz eran cepas disponibles en el mercado de Saccharomyces cerevisiae. SUPERSTART (Ethanol Technology, MMwaukee, Wl, EE.UU.) era una preparación de levadura seca activa (ADY) con un recuento de células de 20 x 109 células/g a 85% de viabilidad y THERMOSACC (Ethanol Technology, Milwaukee, Wl, EE.UU.) era una preparación de torta húmeda con un recuento de células de 15 x 109 /g a 90% viabilidad.

Adición de levadura a la fermentación de pasta de maíz: Se agregó levadura a la pasta para proporcionar una concentración final de 30 x 106 células de levadura vivas/g de pasta.

Fuente de DDGS: Los DDGS se obtuvieron de dos compañías comerciales. Canadian Mist (Collingwood Ontario, Canadá) proporcionó DDGS de un proceso de producción de whisky y Commonwealth Agri-Energy (Hopkinsville, Kentucky, EE.UU.) proporcionó DDGS de un proceso dé producción de etanol carburante. Canadian Mist usa una combinación de malta de maíz y cebada para su proceso de fermentación. Commonwealth Agri-Energy usa 100% de maíz amarillo No. 2.

Preparación de cultivo fúngico seminal: El medio para propagación fúngica contenía lo siguiente: almidón de maíz (6,0% p/v) (PulpTex 12608, Cargill, Cedar Rapids, lowa); BACTO peptona (1,8% p/v) (Difco); dextrosa (0,50% p/v); extracto de levadura (0,50% p/v) (LP0021, Oxoid, Ltd., Basingstoke, Hampshire, Inglaterra); MgS04*7H20 (0,15% p/v); KCI (0,10% p/v); KH2P04 (0,10% p/v); H20 desionizado. Los componentes se calentaron en matraces Erlenmeyer de 500 mL hasta que el almidón se gelatinizó.

Los contenidos de una pendiente de PDA concentrada que contenía el cultivo fúngico se usaron para inocular el medio enfriado y los matraces se incubaron con agitación a 200 rpm durante 72 h a 30°C.

A partir de este cultivo seminal líquido, se hizo una dilución 1:4 en agua desionizada estéril y se empleó como el inóculo para los DDGS.

Preparación y Fermentación de DDGS: Los matraces Erlenmeyer (500 ml_) que contenían 10 g de DDGS se sometieron a autoclave a 105° C durante 30 min y se enfriaron hasta alcanzar temperatura ambiente. Cada matraz se inoculó con 4 mL y 6 ml_ del inóculo líquido de los cultivos seminales líquidos de Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus respectivamente, se mezclaron bien y se colocaron en una incubadora a 30°C y 90% de humedad relativa durante un máximo de 120 h.

Conservación en laboratorio del producto de DDGS: Aunque el producto fermentado de DDGS puede usarse como una adición húmeda a la fermentación de pasta de maíz, para que existiera una coherencia entre los ensayos experimentales y facilidad para almacenamiento prolongado en laboratorio, el contenido de los matraces se liofilizó (Freezemobile 25 ES, VirTis, SP Industries, Inc., Gardiner, NY, EE.UU.).

Preparación de pasta de maíz: El sustrato para las fermentación fue una pasta de maíz licuada que contenía 30% (p/v) de sólidos disueltos. Para mantener la coherencia, se compró una gran cantidad de maíz comercial, se dividió en lotes de 10 kg, se selló en una bolsa metálica hermética y se almacenó en cajas a temperatura ambiente hasta lo necesario. Antes del comienzo de la fermentación, el maíz se trituró usando un molino de martillo equipado con un tamiz No. 4 (aberturas de malla de 1,588 mm).

Para preparar la pasta, se agregó lentamente el maíz triturado al agua y se calentó hasta alcanzar 60°C. La suspensión se mezcló de forma continua durante la fase de cocción usando un homogenizador (Silverson Machines, Inc., East Longmeadow, MA, EE.UU.). Luego de la adición del maíz, se agregó u-amilasa (SPEZYME XTRA, Genencor, Rochester, NY, EE.UU.) (0,06% en peso de sólidos) para reducir la viscosidad y para evitar la retrogradación del almidón. La suspensión se calentó hasta alcanzar 85°C y se mantuvo a esta temperatura durante 20 min antes de someterse a autoclave a 121°C durante 20 min. Después de someterse a autoclave, la pasta se enfrió a 85°C y se agregó la u-amilasa restante (0,04% en peso de sólidos). La pasta se mantuvo a esta temperatura durante 1 h con agitación contante y luego se dejó enfriar hasta alcanzar 30°C. La pérdida de agua durante el sometimiento a autoclave se reemplazó con agua estéril. El producto antibiótico LACTOSIDE (Ethanol Technology, Milwaukee, Wl, EE.UU.) se agregó (5 ug/mL) para controlar el crecimiento bacteriano y para asegurar la coherencia entre experimentos. Se agregó urea (Ulrich Chemical, Galveston, Texas) a 0,016% (p/p) como una fuente adicional de nitrógeno. Se agregó glucoamilasa (Distíllase L-400 Genencor International, Rochester, Nueva York) (0,06% en peso de sólidos) para sacarificar el sustrato de pasta de maíz.

Los matraces Erlenmeyer (escala de 500 mL) que contenían 200 g de pasta se prepararon por triplicado para la fermentación levadura SUPERSTART y la adición de los productos de SSF producidos con Aspergillus oryzae en DDGS originados en una instalación de whisky o de etanol carburante.

Se prepararon recipientes Bélico (escala de 4 L) que contenían 1000 g de pasta por duplicado para dos ensayos de fermentación con levadura THERMOSACC y adiciones de productos de SSF producidos con Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus en DDGS originados en una instalación de etanol carburante. Se ha informado que la levadura THERMOSACC es una cepa más tolerante al calor (Ver, por ejemplo, Graves, Yeast and corn mash fermentaron, Tésis de Doctorado, Heriot-Watt University, Escocia, 2007; incorporada a la presente a modo de referencia,).

Estandarización de producto liofilizado para actividad de proteasa. Los productos de SSF secos se analizaron para actividad de proteasa usando el método HUT estándar (Ver, por ejemplo, Food Chemicals Codex, 4a ed., 1996, National Academy Press, Washington, D.C., pp. 812-813; incorporada a la presente a modo de referencia) a pH 4,7.

Adición de producto de SSF a fermentaciones de pasta de maíz: La adición de producto de SSF liofilizado se agregó en base a la actividad de proteasa equivalente. El producto de SSF de Aspergillus oryzae producido usando DDGS de una fuente de whisky se agregó a 0,01% (p/p) y a 0,02 % (p/p) el producto de SSF producido usando DDGS de una fuente etanol carburante. El producto de SSF de Rhizopus oligosporus producido usando DDGS de una fuente de etanol carburante se agregó a 0,07% (p/p). La Figura 2 ¡lustra el flujo de proceso ampliado a escala de laboratorio.

Muestreo de pasta de maíz y análisis por HPLC: Las muestras de fermentación (8 ml_) se analizaron para carbohidratos (dextrina, maltotriosa, maltosa y glucosa), etanol y ácido láctico y ácido acético mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Las muestras recogidas se centrifugaron (4000 rpm durante 15 min) y el sobrenadante se diluyó y filtró de forma apropiada (filtro de 0,20 pm) antes del análisis. Una muestra o solución estándar (20 pL) se inyectó en una columna de exclusión de iones Bio-Rad HPX-87H Aminex acoplada a un detector de índice de refracción (Waters Chromatographic División, Milford, A). La columna se operó a 65° C y se usó ácido sulfúrico (2 mM) como la fase móvil a una tasa de flujo de 0,6 mL/min. Los datos se procesaron mediante Millennium Software (Waters Chromatographic División).

Resultados: La adición del producto de SSF resultó en un aumento considerable en el rendimiento de etanol a las 72 h (P < 0,001) en comparación con el testigo, en el que no se agrego un producto de SSF. El etanol máximo producido después de 72 h usando los matraces de agitación con el producto enzimático de DDGS de whisky fue 14,41 % (p/p) y con el producto enzimático de DDGS de carburante fue de 14,75% (p/p). El testigo mostró un máximo de 13,20 % (p/p) a las 72 h. La Figura 3 ilustra que no existía una gran diferencia cuando se usaban DDGS de una destilería de whisky, en comparación con los DDGS de una fuente de etanol carburante. Los rendimientos de etanol mejorados, expresados como un porcentaje del testigo fueron 11,7% y 9,2% respectivamente.

Los análisis por HPLC de la fermentación para ácido acético, ácido láctico y niveles de glicerol se muestran en la Tabla 1. Los niveles de ácido láctico y ácido acético fueron bajos, confirmando que las fermentaciones no estaban contaminadas con bacterias. Las fermentaciones también se sometieron a análisis microscópico. Estas observaciones muestran que la adición del producto antibiótico LACTOSIDE (Ethanol Technology, Milwaukee, Wisconsin, EE.UU.) fue efectiva para controlar el crecimiento bacteriano para asegurar la coherencia entre experimentos. Los niveles de glicerol estaban en un rango normal para este tipo de fermentación (Ver, por ejemplo, Russell, Understanding yeast fundamentáis, In: The Alcohol Textbook, Jacques et al., eds., Nottingham University Press, Nottingham, RU, pp. 85-119; incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad).

Tabla 1. Los niveles de ácido acético, ácido láctico y glicerol en una fermentación de pasta de maíz (matraces de agitación) llevada a cabo usando levadura SUPERSTART y adiciones de complejo enzimático de SSF producido a partir de DDGS (planta de etanol carburante o destilería de whisky).

Al examinar la glucosa residual durante el período de fermentación (Ver Tabla 2), se observó que en la fermentación testigo, incluso a las 72 h, aún había glucosa disponible para fermentación, a un nivel de 2,05 % (p/v). Esto fue coherente con el etanol más bajo visto en el testigo a las 72 h en comparación con los matraces con adición de producto de DDGS.

Tabla 2. Glucosa residual % (p/v) y producción de etanol % (v/v) en una fermentación de pasta de maíz (matraces de agitación) llevada a cabo usando levadura SUPERSTART y adiciones de complejo enzimático de SSF producido a partir de DDGS (planta de etanol carburante o destilería de whisky).

Había un poco de maltosa residual presente a las 48 h (Ver Tabla 3) y el aumento en la maltosa de 6 h a 18 h indica que la hidrólisis a glucosa y maltosa de las moléculas más grandes de almidón, así como también de compuestos tales como maltotetraosa y maltotriosa, aún estaba ocurriendo.

Tabla 3. Maltosa residual % (p/v) y producción de etanol % (v/v) en una fermentación de pasta de maíz (matraces de agitación) llevada a cabo usando levadura S U PERSTART y adiciones de complejo enzimático de SSF producido a partir de D DGS (planta de etanol carburante o destilería de whisky).

A las 6 h la maltotriosa aún se estaba acumulando en la pasta, debido a la acción de las diversas enzimas en la pasta, pero a las 1 8 h la cantidad de maltotriosa presente era menor que 1 % (Tabla 4) .

Tabla 4. Maltotriosa residual % (p/v) y producción de etanol % (v/v) en una fermentación de pasta de maíz (matraces de agitación) llevada a cabo usando levadura SUPERSTART y adiciones de complejo enzimático de SSF producido a partir de DDGS (planta de etanol carburante o destilería de whisky).

Aunque la presente invención no está limitada a ningún mecanismo específica y no es necesaria una comprensión del mecanismo para poner en práctica la invención, ya que la cantidad de maltosa presente a las 18 h aún estaba en el rango de 5 a 6 %, se contempló que en lugar de ser la levadura la que recogía la maltotriosa, era la acción de las amilasas en la pasta hidrolizando la maltotriosa en unidades más pequeñas tales como glucosa y maltosa la responsable por la mayor parte de la desaparición de este azúcar de la pasta. A las 48 h la maltotriosa era menos de 0,3 % (p/v).

La viscosidad espesa de la pasta impidió la medición coherente y precisa de la cantidad de dextrinas presentes en la pasta antes de la inoculación de levadura. A las 6 h la pasta no estaba tan viscosa y se podrían obtener números de dextrina reproducibles.

La Tabla 5 muestra que las fermentación con el producto enzimático de SSF contenían menos material de dextrina a las 6 h y a las 72 h aún había más material de dextrina presente en el testigo, indicando que las enzimas en el producto de SSF había liberando carbohidratos adicionales para que la levadura los utilizase.

Tabla 5. Dextrinas residuales % (p/v) y producción de etanol % (v/v) en una fermentación de pasta de maíz (matraces de agitación) llevada a cabo usando levadura SUPERSTART y adiciones de complejo enzimático de SSF producido a partir de DDGS (planta de etanol carburante o destilería de whisky).

Se llevaron a cabo experimentos a mayor escala (fermentadores Bélico de 4 L) con levadura THERMOSACC. El efecto de la adición del producto de SSF en términos de producción de etanol fue incluso mayor y los resultados se repitieron en fermentaciones independientes (Ver Figuras 4A y 4B). La Figura 4A y 4B muestran experimentos llevados a cabo representado fermentaciones que se llevaron a cabo en momentos diferentes con pastas de maíz recién preparadas.

Los valores de etanol más altos a las 72 h se observaron con adiciones del producto de R. oligosporus con 17,68 % (v/v) y 18,06 % (v/v), del primer y segundo ensayo, respectivamente. Las adiciones de producto de A. oryzae proporcionar rendimientos de etanol de 16,84 % (v/v) y 16,90 % (v/v) para el primer y segundo ensayo, respectivamente. Las fermentaciones testigo contenían 13,98 % (v/v) y 13,69 % (v/v) de etanol para el primer y segundo ensayo, respectivamente. Los resultados fueron considerables estadísticamente entre el testigo y las fermentaciones con adiciones de producto de SSF (P = 0,001 y P = 0,007) para ambos ensayos. La Figura 4A ilustra un aumento de etanol de 26,46% y 20,45% con respecto al testigo para dos tratamientos y la Figura 4B ilustra aumentos de etanol de 31,92% y 23,44% en comparación con el testigo.

Los análisis por HPLC de fermentaciones de pasta de maíz también se llevaron a cabo en las fermentaciones en recipientes Bélico. Aunque se usó una cepa de levadura diferente para estos experimentos, los patrones fueron muy similares a lo que se observó en los matraces de agitación descritos anteriormente en términos de hidrólisis de azúcar y absorción de azúcar por parte de la levadura. Las Tablas 6-9 muestran la glucosa, maltosa, maltotriosa y dextrinas residuales para el primer ensayo. Tal como anteriormente, se agregó LACTOSIDE a las fermentaciones y nuevamente los valores muy bajo de ácido acético y ácido láctico indicaron una contaminación mínima.

Tabla 6. Glucosa residual % (p/v) y producción de etanol (v/v) en una fermentación de pasta de maíz (recipientes Bélico) llevada a cabo usando levadura TH ERMOSACC y adiciones de complejo enzimático de SSF producido por A. oryzae o R. oligosporus en DDGS (planta de etanol carburante).

Tabla 7. Maltosa residual % (p/v) y producción de etanol % (v/v) en una fermentación de pasta de maíz (recipientes Bélico) llevada a cabo usando levadura TH ERMOSACC y adiciones de complejo enzimático de SSF producido por A. oryzae o R. oligosporus en D DGS (planta de etanol carburante).

Tabla 8. Maltotriosa residual % (p/v) y producción de etanol % (v/v) en una fermentación de pasta de maíz (recipientes Bélico) llevada a cabo usando levadura THERMOSACC y adiciones de complejo enzimático de SSF producido por A. oryzae o R. oligosporus en DDGS (planta de etanol carburante).

Tabla 9. Dextrinas residuales % (p/v) y producción de etanol % (v/v) en una fermentación de pasta de maíz (recipientes Bélico) llevada a cabo usando levadura THERMOSACC y adiciones de complejo enzimático de SSF producido por A. oryzae o R. oligosporus en DDGS (planta de etanol carburante).

Debido a que el maíz contiene un nivel relativamente bajo de nitrógeno aminado libre (FAN), en algunas realizaciones, las fermentaciones para producir etanol se complementan con una fuente de nitrógeno tal como urea o sulfato de amonio para optimizar el proceso (Ver, por ejemplo, Russell, Understanding yeast fundamentáis, In: The Alcohol Textbook, Jacques et al., eds., Nottingham University Press, Nottingham, RU, pp. 85-119; incorporado a la presente a modo de referencia en su totalidad). La adición de urea generalmente está limitada a aplicaciones que no son para bebidas debido a las preocupaciones con respecto a la formación de uretano. El uretano, un carcinógeno potencial, se forma cuando la urea hace reacción con el etanol.

En algunas realizaciones, otro método para proporcionar nitrógeno adicional a la levadura en forma de nitrógeno aminado era a través de la adición de proteasas al sistema de fermentación. Las proteasas aumentan la hidrólisis de las proteínas presentes en la pasta de maíz. Se demostró que las enzimas proteolíticas mejoran el rendimiento de etanol en el proceso de trituración seca (Ver, por ejemplo, Lantero et al., 1993, Patente de los Estados Unidos No. 5.231.017), en el proceso de E-Molienda (Singh et al., 2005, Cereal Chem., 82, 187-190) y también para aumentar la cantidad de FAN en un hidrolizado de maíz (Perez-Carrillo et al, 2007, Cereal Chem., 84, 607-613).

La complejidad estructural de la fuente de nitrógeno tiene un efecto sobre el crecimiento de la levadura y el rendimiento de etanol.

Una fuente de nitrógeno más compleja, tal como peptona, ha demostrado una acumulación de biomasa y producción de etanol mayor en comparación con el sulfato de amonio (Ver, por ejemplo, de Cruz et al., 2002, J Instit. Brewing, 108, 54-61).

La tasa de inclusión óptima de fuentes de nitrógeno o enzimas proteolíticas complementarias depende de muchos factores como la cepa de levadura específica y la economía de la rentabilidad sobre la inversión de niveles particulares de complementación. Para las fermentaciones descritas en la presente, la tasa de inclusión de 0,016% (w/w) de urea, un nivel promedio usado por una cantidad plantas de etanol carburante en Estados Unidos, es considerablemente más baja que el nivel máximo descrito por Jones and Ingledew (Ver, por ejemplo, Jones et al., 1994, Process Biochem., 25, 483-488). Por consiguiente, aunque la presente invención no está limitada a ningún mecanismo de acción específico y no es necesaria una comprensión del mecanismo para poner en práctica la invención, la presente invención muestra que la respuesta observada con la adición del producto de SSF, que contiene actividad enzimática de proteasa, es atribuible en parte al aumento en la cantidad de nitrógeno aminado disponible durante la fermentación. La digestión adicional de la fracción de proteína del maíz también libera azúcares fermentables adicionales unidos a las proteínas que de lo contrario no estarían disponibles para la levadura.

Aunque la proteasa era la enzima de interés principal para este conjunto de estudios específico, una de las mayores ventajas de una adición de producto de SSF es que el producto enzimático contiene una gran cantidad de enzimas diferentes (por ejemplo, las descritas en la presente) con actividades que funcionan en combinación para descomponer un sustrato dado (por ejemplo, celulasas) para hacer que azúcares adicionales estén disponibles para la levadura. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente invención muestra que la digestión adicional de poli y oligosacáridos en glucosa y otros azúcares fermentables contribuye a concentraciones de etanol más altas. En algunas realizaciones, la presencia de enzimas amilolíticas y fibrolíticas adicionales, incluso a niveles bajos, contribuye al aumento observado en la producción de etanol. Por lo tanto, la presente invención muestra que la adición de un producto enzimático de SSF agrega un valor considerable a la fermentación mejorando el rendi miento de etanol.

Ejemplo 2 Mejora Nutritiva de Granos de Destilación Mediante Fermentación en Estado Sólido Materiales y Métodos: Se usaron cepas de Rhizopus oligosporus y Aspergillus oryzae para fermentaciones en DDGS. Todos los microorganismos que se emplearon se consideran como generalmente reconocidos como seguros (GRAS) y adecuados para aplicaciones de piensos para animales. Se obtuvieron DDGS de una destilería de whisky, Canadian Mist (Collingwood, Ontario, Canadá) y unos DDGS de una fuente de etanol carburante (Commonwealth Agri-Energy, Hopkinsville, Kentucky, EE. U U .) . Canadian Mist usa una mezcla registrada de malta de maíz y cebada para su proceso de fermentación . Commonwealth Agri-Energy usa 100% de maíz amarillo No. 2.

Cultivo seminal y preparación de inoculo: El medio para propagación fúngica contenía lo siguiente: almidón de maíz (6,0% p/v) (PulpTex 12608, Cargill, Cedar Rapids, lowa); Bacto™ peptona (1,8% p/v) (Difco); dextrosa (0,50% w/v); extracto de levadura (0,50% p/v) (LP0021, Oxoid, Ltd., Basingstoke, Hampshire, Inglaterra); MgSCv7H20 (0,15% p/v); KCI (0,10% p/v); KH2P04 (0,10% p/v); H20 desionizado. Los componentes se calentaron en matraces Erlenmeyer de 500 mi hasta que el almidón se gelatinizó.

Se agregaron DDGS de la misma fuente que se usó para la fermentación en estado sólido (2,0% w/v) y los matraces se sometieron a autoclave a 121° C durante 20 min.

Los contenidos de una pendiente de PDA concentrada que contenía el cultivo fúngico aplicable se usaron para inocular el medio enfriado y los matraces se incubaron con agitación a 200 rpm durante 72 h a 30°C.

A partir de este cultivo seminal líquido se usó una dilución 1:4 en agua desionizada estéril como inoculo.

Fermentación: Los matraces Erlenmeyer (500 mL) que contenían 20 g de DDGS se sometieron a autoclave a 105° C durante 30 min y se enfriaron hasta alcanzar temperatura ambiente. Cada matraz se inoculó con 4 mL y 6 mL del inoculo líquido de los cultivos seminales líquidos de Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus respectivamente y se mezcló bien. Los matraces que correspondían al Tiempo 0 se reservaron mientras los matraces restantes se colocaron en una incubadora a 30°C y 90% de humedad relativa durante un máximo de 120 h.

Conservación en laboratorio del producto de DDGS : Para coherencia en el almacenamiento en laboratorio, hasta que el análisis pudo completarse, los contenidos de todos los matraces se liofilizaron (Freezemobile 25 ES, VirTis, SP I ndustries, I nc. , Gardiner, NY, EE. U U .).

Análisis Masa de materia seca: Las muestras de antes y después de la fermentación se pesaron antes de la liofilizacion y se determinaron los niveles de humedad en las muestras usando un analizador de humedad (Denver I nstruments I R-200, Denver, CO, EE. U U.). La masa de materia seca para la muestras antes de la fermentación (Tiempo 0) se designó 1 00% y esto se usó para base para comparaciones. Todos se análisis se registraron en base a materia seca.

Las muestras antes y después de la fermentación se enviaron a Midwest Laboratories, I nc. (Omaha, N E) para análisis inmediato (análisis de proteína bruta, fibra detergente neutra (N DF) , fibra detergente ácida (ADF) , ceniza y grasas) .

Resultados: Las observaciones durante las fermentaciones y los resultados analíticos indican que los DDGS son un sustrato viable para la fermentación en estado sólido. Visualmente, el microorganismo cubrió los DDGS con micelios blancos que formaron una capa fúngica densa a lo largo del sustrato. Analíticamente, fue evidente que el organismo metabolizó el sustrato por la desaparición de la materia seca. La desaparición de la masa de materia seca por las fermentaciones se presenta en la Figura 5.

Aunque estaba presente una biomasa considerable después de la fermentación, la determinación directa de la biomasa en la fermentación en estado sólido es muy difícil, debido a problemas con la separación del microorganismo del sustrato (Ver, por ejemplo, Mitchell, 1992, Biomass determination in solid-state cultivation, In: Solid Substrate Cultivation, Mitchell et al., eds., Elsevier Applied Science, Londres, RU, pp. 53-63; incorporado a la presente a modo de referencia). Por consiguiente, para adquirir una mejor comprensión de lo que sucede durante la fermentación, el análisis inmediato, usado habituaimente para caracterizar los piensos para animales se llevó a cabo antes y después de la fermentación.

Los cambios en los perfiles nutricionales de DDGS son significativos, particularmente con respecto a la proteína bruta, ya que es uno de los nutrientes más caros en las dietas para animales (Ver, por ejemplo, Belyea et al., 2004, Bioresource Tech., 94, 293-298). La proteína bruta es una estimación del contenido total de proteína de un pienso usado por la industria y los reguladores de piensos. Incluye los aminoácidos verdaderos que contienen proteínas así como también nitrógeno no proteico. Por consiguiente, no proporciona información sobre la calidad o disponibilidad de proteínas en una muestra de pienso. El aumento en la proteína bruta para todas las fermentación, 16,0%, 12,6%, 17,4% y 13,2% respectivamente tal como se indica en la Tabla 10 es atribuible a la desaparición de la materia seca.

Tabla 10. Resultados de análisis inmediato y valores concentrados (A) Rhizopus cultivado en DDGS de destilerías de whisky (B) Rhizopus cultivado en DDGS de etanol carburante; (C) Aspergillus cultivado en DDGS de destiladores de whisky; (D) Aspergillus cultivado en D DGS de etanol carburante.

El análisis de ceniza en muestras antes y después de fermentación en estado sólido no indicó cambios en la cantidad de ceniza actual observada. Las únicas pérdidas durante la fermentación fueron de calor y C02 (Ver Figura 6).

Esta tendencia, sin embargo, no se observó para todos los valores nutritivos. Los cambios en el perfil nutritivo proporcionan un entendimiento sobre la capacidad del hongo para metabolizar los componentes en los DDGS . Los hongos filamentosos saprofitos necesitan carbono y nitrógeno para crecer. La desaparición de carbono en forma de dióxido de carbono es resultado de que el organismo convierte las fuentes se carbono accesibles en energía a través del ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) . Las principales fuentes de carbono disponibles para los microorganismos en D DGS , después de la conversión de los azúcares fermentables del maíz en etanol son las grasas (triglicéridos) , cel ulosa y hemicelulosa.

La fibra detergente neutra (N DF) es una estimación de los componentes de la pared celular vegetal celulosa, hemicelulosa y lignina, mientras la fibra detergente ácida (ADF) estima las porciones de pared celular solamente formadas por celulosa y lignina. La hemicelulosa comprende la diferencia en los dos valores.

En base a la desaparición de la materia seca, era posible calcular los valores concentrados para cada componente nutritivo. En otras palabras, era posible calcular cuál hubiera sido la concentración de un componente nutritivo específico en base a la desaparición observada del material si no se hubiera consumido. Estos valores se indican en la Tabla 10.

La Tabla 10 muestra que la cepa de Rhizopus metabolizó ~6 % de la grasa. Adicionalmente, los valores NDF y ADF después de la fermentación fueron menores que el aumento teórico debido a ia desaparición de materia seca, lo cual muestra que el organismo utilizó parte de la hemicelulosa y celulosa a medida que crecía. La cepa de Aspergillus también metabolizó una porción de la grasa accesible (~ 5-6 %) así como también parte de la hemicelulosa. El valor ADF, sin embargo, fue casi el mismo que el valor concentrado, lo que indica que el organismo fue incapaz de descomponer la porción de celulosa o lignina de los granos de destilerías.

Tradicionalmente, los subproductos de las destilerías se han incluido como una fuente de nutrientes en la dieta de rumiantes debido a su alto contenido en fibras (Ver, por ejemplo, Ham et al., 1994, J Animal Sci., 72, 3246-3257; Singh et al., 2005, Cereal Chem., 82, 187-190). Aunque la presente invención no está limitada a ningún mecanismo de acción específico y no es necesaria una comprensión del mecanismo para poner en práctica la invención, se contempla que los microorganismos en el rumen auxilian al animal a descomponer la celulosa y hemicelulosa para formar proteína microbiana, que a su vez es utilizada por el animal más tarde en el proceso de digestión. Al igual que los microorganismos presentes en el rumen, la capacidad de los hongos filamentosos para utilizar las fracciones de hemicelulosa y celulosa es de interés ya que no animales monogástricos (aves, porcinos, etc.) son incapaces de utilizar estas porciones del grano.

Los hongos producen un amplio espectro de enzimas extracelulares que degradan polisacáridos, péptidos y grasas en unidades monoméricas para síntesis proteica y crecimiento micelial. Cuando se cultivan en DDGS, las enzimas expresadas son específicas para el sustrato ya que los organismos producen lo que necesitan para crecer con el la nutrición disponible. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona la capacidad para recoger la capacidad de un organismo para descomponer tales compuestos y proporciona la oportunidad de una utilización mejorada de los granos y residuos agroindustriales tales como granos ya procesados para uso como piensos para animales monogástricos.

Los beneficios de la fermentación en estado sólido para el animal (Ver, por ejemplo, la Figura 7) incluyen características nutritivas mejoradas del grano, particularmente con respecto a la proteína; biomasa fúngica nutritiva; liberación de energía de la porción de fibra del grano; digestibilidad mejorada de proteína y niveles de fósforo aumentados disponibles para el animal, que reducen la cantidad de fósforo excretada como desecho.

Aunque la presente invención no está limitada a ningún mecanismo de acción específico y no es necesaria una comprensión del mecanismo para poner en práctica la invención, se contempla que de forma similar a la capacidad del hongo para mejorar la digestibilidad del grano para animales monogástricos, la fermentación en estado sólido también aumenta la eficacia de la levadura para convertir el grano en etanol. Los hongos son capaces de auxiliar en la descomposición de materias primas para la producción de etanol liberando nitrógeno adicional disponible para la levadura y descomponiendo la celulosa y hemicelulosa en azúcares fermentables.

Ejemplo 3 Producción de Etanol a partir de Materia Prima Lignocelulosica Usando una Biorrefinería Integ rada Las etapas en un método para una biorrefinería integrada que produce etanol a partir de materias primas lignocelulósicas se representan en la Figura 1 y se describen en la presente.

A. Cebado y materias primas etanologénicas: La materia prima de cebado lignocel ulosica se identificó y caracterizó por sustentar la producción de composiciones degradadoras de lignocelulosa y el proceso de fermentación de etanol. Se usaron mazorcas de maíz extensamente en los experimentos llevados a cabo durante el desarrollo de las realizaciones de la invención pero otros sustratos tales como pasto varilla, virutas de madera o forraje de maíz se contemplan como utilizables con resultados similares. El componente lignocelulósico de la pasta de materia prima etanologénicca producida para uso en el proceso de cofermentación de etanol era 30% y el restante 70% comprendía granos maíz triturados. Del 30% de material lignocelulósico (mazorca de maíz) , 25% era mazorca de maíz triturada en bruto y los otros 5% se usaron para formar una composición degradadora de lignocelulosa producida a partir de fermentación en estado sólido. La mazorca de maíz (sustancialmente libre de granos) se trituró sucesivamente tres veces en u n molino de martillo diminuyendo el tamaño del tamiz para obtener un material de trituración grueso, medio y fino. Las materias primas de mazorca de maíz y grano de maíz se trituraron por separado y luego se mezclaron antes de una etapa de cocción inicial.

B. Fermentación en estado sólido y producción de composiciones degradadoras de lignocelulosa: Las composiciones degradadoras de lignocelulosa se produjeron usando un hongo filamentoso (Aspergillus niger) cultivado en mazorca de maíz en un proceso de fermentación en estado sólido (SSF).

La fermentación se inició mezclando la mazorca de maíz triturada con 15% de extracto de levadura y agua y a continuación inoculando la mezcla con un inoculo fúngico líquido. Esta mezcla de mazorca de maíz e inoculo fúngico se dispersó sobre una bandeja de acero inoxidable y se dejó crecer durante 5 días en una cámara de humedad controlada (50%) a 30°C. Posteriormente, la composición degradadora de lignocelulosa "húmeda" que se desarrolló sobre la mazorca de maíz se cosechó para uso en etapas de sacarificación y fermentación.

C. El proceso de cocción: El proceso de cocción se llevó a cabo en un sistema de cocción de destilería convencional modificado con adaptaciones para permitir el uso de una pasta más viscosa. La adición de componentes lignocelulósicos y ricos en almidón de las materias primas etanologénicas en el sistema de cocción ocurrió en etapas para asegurar una mezcla homogénea que el procesa en el fermentador. En el primer paso del proceso de cocción, la suspensión que contenía 28,5% de mezcla de sólidos de maíz triturado (EE.UU. No. 2, dentado amarillo, 12% de humedad) y mazorca de maíz triturada (4-9% de humedad) se mezcló con agua en un termentador de 150 L MicroFerm con agitación de cabecera (New Brunswick Scientific Co, Edison, Nueva Jersey). El éxito de este proceso dependía de la adición apropiada del maíz y la mazorca de maíz triturados al agua. El maíz triturado se agregó al agua con alfa-amilasa (0,06% en peso del grano) y se calentó hasta alcanzar 85°C durante 5 minutos. Esta suspensión inicial contenía 21% de sólidos. El maíz se coció inicialmente son la mazorca para producir una pasta más espesa que permitiera que la mazorca de maíz permaneciera en suspensión. La mazorca de maíz se agregó lentamente a la pasta de maíz triturado y el proceso de cocción continuó a 85°C durante 20 minutos. La pasta se agitó vigorosamente (350 rpm) usando una paleta SC3 (Chemineer, Cincinnati, Ohio) para mantener la mazorca triturada en suspensión mientras se cocinaba. La pasta se esterilizó a 121°C durante 20 minutos y luego se enfrió. Se agregó alfa-amilasa (0,04% en p. del grano) y la pasta se cocinó a 85°C durante un período adicional de 60 minutos.

D. Sacarificación de materia prima lignocelulósica: El proceso de sacarificación resultó en la degradación de lignocelulosa en azúcares fermentables. La composición degradadora de lignocelulosa se agregó lentamente (5% del grano) a la pasta de 70% maíz/ 25% mazorca de maíz. Durante este proceso, la pasta se agitó vigorosamente (350 rpm) usando una paleta SC3 para mantener la mazorca en suspensión y evitar el asentamiento. La pasta resultante contenía 30% de sólidos. La relación ideal entre el maíz triturado y la mazorca de maíz triturada en la pasta final fue 70/30. Las composiciones degradadoras de lignocelulosa húmedas contribuyeron el 5% de la materia prima total en la pasta.

E. Cofermentación de etanol: La fermentación de etanol se caracterizó por la liberación simultánea de azúcares fermentables del almidón de maíz y la materia prima lignocelulósica (mazorca de maíz). Se agregó glucoamilasa (0,06% en p. del grano) a la pasta para sacarificar el sustrato de almidón en el maíz triturado. Se agregó urea (1g/L) como una fuente de nitrógeno. La pasta se inoculó con 30 millones de células /g de un cultivo de levadura activo (Saccharomyces cerevisiae). La fermentación de etanol se completó en aproximadamente 48 h a 34°C. Se usaron tecnologías de tamizado molecular y destilación tradicional para separar el etanol y los residuos de fermentación.

Los estudios en plantas piloto se enfocaron en producir composiciones degradadoras de lignocelulosa eficaces en mazorca de maíz y en evaluar los efectos de las composiciones degradadoras de lignocelulosa en los rendimientos de etanol de mezclas de materia prima que contienen maíz triturado (70%) y mazorca de maíz (30%) en pasta (30% sólidos secos) a las que se adiciona 0,1% de urea y mantenidas a 34° C. Las composiciones degradadoras de lignocelulosa se agregaron como una preparación de mazorca de maíz fermentada húmeda para proporcionar una adición final en peso seco de 5% de la materia prima después que la pasta se había cocinado y enfriado hasta alcanzar 34 °C. Un compendio general de los datos de la prueba de proceso en 10 fermentaciones por lote (fermentador piloto de 150 L) se proporciona en la Tabla 11.

La fermentación de materia pri ma en fermentadores de planta piloto que reci bían composiciones degradadoras de lignocel ulosa también se caracterizó por una dismi nución en el tiempo necesario para alcanzar concentraciones de etanol máxi mas (24 horas con respecto a 42 horas) , mayor contenido de proteína en los residuos (25% con respecto a 1 8%) y bajo conten ido de fibra detergente neutra (22% con respecto a 70%) y bajo contenido de fibra detergente ácida ( 1 0, 2% con respecto a 1 9, 6 %) en los residuos. Todas las observación fueron coherentes con la conversión neta de los componentes lignocelulósicos en la mazorca de maíz al etanol en una tasa de entre 45 y 48 galones por toneladas de mazorca de maíz.

Tabla 1 1 . Efecto de un complejo enzimático en estado sólido específico sobre los rendimientos de etanol en fermentaciones en planta piloto F. Cuantificación de actividades enzimática en composiciones degradadoras de lignocelulosa Las composiciones degradadoras de lignocelulosa producidas mediante fermentación en estado sólido se analizaron para contenido de humedad, contenido de material seco, contenido de etanol (i nicial y después de 48 h de fermentación) y actividad enzimática (Tabla 12).

Tabla 12. Actividades enzimática de composiciones degradadoras de lignocelulosa. %MS, porcentaje de materia seca; UCMC/g, celulasa determinada como unidades de carboximetilcelulasa por gramo de material seco; UX/g, xilanasa determinada como unidades de xilanasa por gramo de material seco; U BG/g, unidades de beta-glucanasa por gramo de material seco; H UT/g, unidades de proteasa por gramo de material seco; U CB/g, unidades de celobiasa por gramo de material seco. El contenido de etanol se muestra en la fermentación en tiempo 0 h y en tiempo 48 h.

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la memoria descriptiva precedente se incorporan a la presente a modo de referencia. Varias modificaciones y variaciones al método y sistema descritos en la invención serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones preferidas específicas, se entenderá que la invención tal como se reivindica no deberá limitarse indebidamente a dichas realizaciones específicas. De hecho, se pretende que varias modificaciones de las formas descritas para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en fermentación, producción de biocombustibles, alimentos agrícolas, piensos y nutrición o áreas relacionadas estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVIN DICACIONES

1 . U na composición para la generación de etanol a partir de materia prima lignocelulósica que comprende una composición de degradación de materia prima lignocelulósica que comprende una materia prima de cebado lignocelulósica incubada con al menos un microbio degradador de lignocelulosa.

2. La composición de la Reivindicación 1 , en donde el microbio degradador de lignocelulosa es una especie de un género seleccionado del grupo que consiste en Aspergillus, Trichoderma, Gliocladium, Aspergillus, Rhizopus, Clostridiu , Phanerochaete, Bacillus, Penicillium, Aureobasidium, Humicola, Talaromyces, Chrysosporium, Monilia, Paecilomyces y Pleurotus.

3. La composición de la Reivindicación 2, en donde el microbio degradador de lignocelulosa es una especie seleccionada del grupo que consiste en Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus.

4. La composición de la Reivindicación 3, en donde el microbio degradador de lignocelulosa es ATCC 1 0549 de Aspergillus niger.

5. La composición de la Reivindicación 3, en donde el microbio degradador de lignocelulosa es la cepa UV3 de Rhizopus oligosporus.

6. La composición de la Reivindicación 1 , en donde dicha materia prima lignocelulósica se selecciona del grupo que consiste en residuos forestales, desechos de molinos, desechos de madera urbanos, residuos agrícolas y cultivos de bioenergía, forraje, quinoa, chalas de maíz, mazorcas de maíz, fibra de maíz, paja de trigo, tallos de sorgo, pasto varilla, madera de frondosa, madera de conifera, virutas de madera de frondosa o conifera, aserrín de frondosa o conifera, desechos de cítricos, desechos o residuos vegetales urbanos, desechos o residuos de la industria de elaboración de alimentos, desechos o residuos de la fabricación de cereales, heno, paja, paja de arroz, caña de azúcar, bagazo de caña de azúcar, residuos de limpieza de granos, granos de la elaboración cervecera ya procesados, cáscaras de arroz, paja de cebada, sauce, abeto, álamo, eucalipto, residuo de Brassica carinata, Antigonum leptopus, liquidambar, Miscanthus, Sericea lespedeza, árbol del sebo, cáñamo, colza, Sorghum bicolor, hojas de soja, tallos de soja, vainas de soja, residuo de soja, hojas de gi rasol, tallos de girasol , cabezuela de girasol sin semillas, cáscaras de girasol, residuo de girasol, caña común , cáscaras de nuez, hojas de frondosa, fi bra de algodón, abono, pasto Bermuda costero, trébol, sorgo de Alepo, lino, paja de trigo sarraceno, paja de avena, paja de mijo, paja de amaranto, tallos de amaranto, hojas de amaranto, residuo de amaranto, paja de espelto, paja de centeno, alfalfa y bambú.

7. La composición de la Reivindicación 6, en donde dicho grano de elaboración cervecera ya procesado es grano de destilación seco (DDG) o grano de destilación seco con solubles (DDGS) .

8. La composición de la Reivindicación 1 , en donde la composición para la generación de etanol a partir de materia prima lignocel ülósica se hace mediante el proceso que comprende las etapas de: a. proporcionar la materia prima lignocelülósica; b. tratar la materia prima lignocelulósica para resultar en un tamaño de partícula más pequeño con respecto a su tamaño de partícula inicial; c. proporcionar un inoculo de un microbio degradador de lignocelulosa; d. mezclar el inoculo con la materia prima lignocelulósica tratada; y e. incubar la materia, prima lignocelulósica y el microbio en condiciones que comprenden al menos 30°C durante al menos 5 días.

9. Una composición para uso como complemento de pienso animal, hecha la composición mediante un proceso que comprende fermentación en estado sólido de materia prima lignocelulósica con al menos un microbio degradador de lignocelulosa en condiciones suficientes para proporcionar propiedades de materia prima lignocelulósica seleccionadas del grupo que consiste en proteína digerible aumentada, nivel aumentado de fósforo biodisponible y contenido de fibra aumentado.

10. Un método para producir etanol a partir de materia prima etanologénica que comprende: 1) proporcionar: a) una composición degradadora de lignocelulosa; b) una materia prima etanologénica que comprende un componente lignocelulósico; y 2) incubar la materia prima etanologénica con la composición degradadora de lignocelulosa.

11. El método de la Reivindicación 10, en donde dicha composición degradadora de lignocelulosa es la composición de la Reivindicación 1.

12. El método de la Reivindicación 10, en donde la materia prima etanologénica comprende materia prima rica en almidón seleccionado entre el grupo que consiste en granos, raíces de almacenamiento, tubérculos, frutas secas, frutas, maíz, trigo, arroz, avena, cebada, centeno, amaranto, trigo sarraceno o espelto; papa, boniato, colocasia, ñame, yuca, tapioca, arrurruz, yuma, leguminosas, castaña, arracacha, banana, kudzu, oca, sagú y sorgo.

13. El método de la Reivindicación 12, en donde dicho maíz está en la forma de mazorcas de maíz o granos de maíz.

14. El método de la Reivindicación 10, en donde la materia prima etanologénica comprende una mezcla de componente rico en lignocelulosa y componente rico en almidón.

15. Un método para la producción de etanol a partir de materia prima lignocelulósica, que comprende: i) proporcionar materia prima de cebado lignocelulósica capaz de ser utilizada como sustrato por al menos un microbio degradador de lignocelulosa; ¡i) incubar el microbio degradador de lignocelulosa en la materia prima de cebado lignocelulósica en condiciones suficientes para promover la formación de al menos una composición degradadora de lignocelulosa; iü) proporcionar materia prima etanologénica capaz de ser utilizada como sustrato por un microbio etanologénico en una etapa de sacarificación; iv) mezclar la composición degradadora de lignocelulosa con la materia prima etanológica en condiciones suficientes para promover la sacarificación de la materia prima etanologénica; y v) llevar a cabo la fermentación etanologénica en la materia prima etanologénica.

16. El método de la Reivindicación 15, en donde el microbio degradador de lignocelulosa comprende una o más especies seleccionadas de los géneros que consisten en Trichoderma, Gliocladium, Aspergillus, Rhizopus, Clostridium, Phanerochaete, Bacillus, Penicillium, Aureobasidium, Humicola, Talaromyces, Chrysosporium, Monilia, Paecilomyces y Pleurotus.

17. El método de la Reivindicación 16, en donde el microbio degradador de lignocelulosa se selecciona del grupo que consiste en Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus.

18. El método de la Reivindicación 17, en donde en donde la cepa de Aspergillus niger es ATCC 10549.

19. El método de la Reivindicación 17, en donde en donde la cepa de la especie Rhizopus oligosporus es 2UV3.

20. El método de la Reivindicación 15, en donde la materia prima de cebado lignocelulósica comprende una o más materias primas seleccionadas del grupo que consiste en residuos forestales, desechos de molinos, desechos de madera urbanos, residuos agrícolas y cultivos de bioenergía, forraje, chalas de maíz, mazorcas de maíz, fibra de maíz, paja de trigo, tallos de sorgo, pasto varilla, madera de frondosa, madera de conifera, virutas de madera de frondosa o conifera, aserrín de frondosa o conifera, desechos de cítricos, desechos o residuos vegetales urbanos, desechos o residuos de la industria de elaboración de alimentos, desechos o residuos de la fabricación de cereales, heno, paja, paja de arroz, caña de azúcar, bagazo de caña de azúcar, residuos de limpieza de granos, granos de la elaboración cervecera ya procesados, cáscaras de arroz, paja de cebada, sauce, abeto, álamo, eucalipto, residuo de Brassica carinata, Antigonum leptopus, liquidambar, Miscanthus, Sericea lespedeza, árbol del sebo, cáñamo, colza, Sorghum bicolor, hojas de soja, tallos de soja, vainas de soja, residuo de soja, hojas de girasol, tallos de girasol, cabezuela de girasol sin semillas, cáscaras de girasol, residuo de girasol, caña común, cáscaras de nuez, hojas de frondosa, fibra de algodón, abono, pasto Bermuda costero, trébol, sorgo de Alepo, lino, paja de trigo sarraceno, paja de avena, paja de mijo, paja de amaranto, tallos de amaranto, hojas de amaranto, residuo de amaranto, paja de espeito, paja de centeno, alfalfa y bambú.

21. El método de la Reivindicación 15, en donde la materia prima etanologénica comprende una o más materias primas ricas en almidón seleccionadas entre el grupo que consiste en granos, raíces de almacenamiento, tubérculos, frutas secas, frutas, maíz, trigo, arroz, avena, cebada, centeno, amaranto, trigo sarraceno o espeito; papa, boniato, colocasia, ñame, yuca, tapioca, arrurruz, yuma, leguminosas, castaña, arracacha, banana, kudzu, oca, sagú y sorgo.