MX2011004233A - Composiciones y metodos para tratar las condiciones producidas por la matriz-metaloproteinasa 9 (mmp9). - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento de una afección o enfermedad mediada por la MMP9, que comprende la administración de un fluido acuoso alterado elctrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga que tiene sustancialmente un diámetro promedio menor de aproximadamente 100 nanómetros y que se configuran establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para tratar una afección o enfermedad mediada por la MMP9. Las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga se configuran preferentemente de forma estable en el fluido en una cantidad suficiente para proporcionar la modulación del potencial y/o conductividad de la membrana celular.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA TRATAR LAS CONDICIONES PRODUCIDAS POR LA MATRIZ -METALOPROTEINASA 9 (MMP9) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a las metaloproteinasas y a las afecciones mediadas por metaloproteinasas , y más particularmente a las metaloproteinasas de la matriz (MMP) , a las afecciones mediadas por las MMP, y a los inhibidores de las MMP y el tratamiento de las afecciones mediadas por las MMP. Los aspectos particularmente preferidos se refieren a la modulación (por ejemplo, la inhibición) de las MMP (por ejemplo, de la MMP9) , mediante la administración de una composición terapéutica que comprende al menos un fluido generado electrocinéticamente (incluyendo fluidos generados electrocinéticamente enriquecidos con gas (por ejemplo, enriquecidos con oxígeno)) como se describe en la presente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las metaloproteinasas son una superfamilia de proteasas (enzimas) clasificadas en familias y subfamilias como se describe, por ejemplo, en N. M. Hooper FEBS Letters 354:1-6, 1994. Los ejemplos de metaloproteinasas incluyen las metaloproteinasas de la matriz (MMP) , tales como las colagenasas (MMP1, MMP8 , MMP13), las gelatinasas ( MP2, MMP9) , las estromelisinas (MMP3 , MMP10, MMP II), la matrilisina (MMP7) , la metaloelastasa (MMP12) , la enamelisina (MMP19) , las T-M P (MMP14 , MMP15, MMP16 , MMP17) , la reprolisina o la damalisina o la familia MDC, que incluye las secretasas y shedasas tales como las enzimas convertidoras del TNF (ADAM10 y TACE) ; la familia de las astacinas que incluye enzimas tales como la proteinasa transformadora del procolágeno (PCP) ; y otras metaloproteinasas tales como agrecanasa, la familia de las enzimas convertidoras de endotelinas y la familia de las enzimas convertidoras de angiotensinas .

Colectivamente, las metaloproteinasas son conocidas por su capacidad de escindir una amplia gama de sustratos de la matriz, tales como el colágeno, el proteoglicano y la fibronectina . Las metaloproteinasas están implicadas en el procesamiento o secreción de mediadores celulares biológicamente importantes, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF) ; y el procesamiento proteolítico post-traduccional , o la difusión de proteínas de la membrana biológicamente importantes, tales como el receptor de CD23 de baja afinidad para la IgE (ver, por ejemplo, N. . Hooper y otros, (1997) Biochem J. 321:265-279) .

No es sorprendente, por lo tanto, que se crea que las metaloproteinasas son importantes en muchos procesos de enfermedades fisiológicas que involucran la remodelación tisular (por ejemplo, el desarrollo embrionario, la formación ósea, la remodelación del útero durante la menstruación, la alteración de la barrera hemato-encefálica, etc.) Más aún, la inhibición de la actividad de una o más metaloproteinasas bien pudiera ser beneficiosa en estas enfermedades o afecciones, por ejemplo, varias enfermedades inflamatorias y alérgicas, tales como inflamación de las articulaciones (especialmente artritis reumatoide, artrosis y gota); inflamación del tracto gastro- intestinal (especialmente enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerativa y gastritis) ; inflamación de la piel (especialmente psoriasis, eczema, dermatitis); en la metástasis o invasión tumoral ; en la enfermedad asociada con la degradación incontrolada de la matriz extracelular, tal como artrosis; en la enfermedad de reabsorción de los huesos (tales como osteoporosis y enfermedad de Paget) ; en enfermedades asociadas con angiogénesis aberrante; la remodelación incrementada del colágeno asociada con diabetes; la enfermedad periodontal (tal como gingivitis) , la ulceración de la córnea; la ulceración de la piel; las afecciones post-operatorias (tal como la anastomosis del colon) y la cicatrización de lesiones dérmicas; las enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso central y periférico (tal como la esclerosis múltiple) ; la enfermedad de Alzieimer la remodelación de la matriz extracelular observada en enfermedades cardiovasculares tales como la reestenosis y la aterosclerosis ; el asma, la rinitis, y las enfermedades pulmonares obstructivas crónicas ( COPD) .

La MMP12, también conocida como elastasa de los macrófagos o metaloelastasa, se clonó inicialmente en ratón (Shapiro y otros, Journal of Biological Chemistry 267: 4664, 1992) y también se clonó en el hombre por el mismo grupo en 1995. La MMP12 se expresa preferentemente en los macrófagos activados, y se ha demostrado que es secretada por los macrófagos alveolares de los fumadores (Shapiro y otros, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824), así como en células espumosas en lesiones ateroscleróticas (Matsumoto y otros, Am. J. Pathol 153:109, 1998). Un modelo de ratón de la COPD se basa en el reto de los ratones con el humo de cigarrillo durante seis meses, dos cigarrillos al día durante seis días a la semana. Los ratones de tipo salvaje desarrollaron enfisema pulmonar después de este tratamiento. Cuando los ratones knock-out con MMP12 se ensayaron en este modelo, no desarrollaron enfisema significativo, lo que indica fuertemente que la MMP12 es una enzima clave en la patogénesis de la COPD. El papel de las MMP, como la MMP12 en la COPD (enfisema y bronquitis) se discute en Anderson y Shinagawa, de 1999, Current Opinión in Anti- inflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38.

Recientemente se ha descubierto que fumar aumenta la infiltración de macrófagos y la expresión de MMP-12 derivada de macrófagos en las placas de la arteria carótida humana (Matetzky S, Fishbein MC y otros, Circulación 102: (18), 36- 39 Suppl. S, Oct. 31, 2000) .

La MMP9 (Gelatinasa B, Colagensa Tipo IV de 92 kDa, Gelatinasa de 92 kDa) es una proteína secretada que primero se purificó, y luego se clonó y secuenció en 1989 (S. M.

Wilhelm y otros, J. Biol . Chem 264 (29) : 17213-17221, 1989; fe de errata publicada en J. Biol. Chem 265 (36): 22570, 1990) (para una revisión detallada de la información y referencias sobre esta proteasa ver T. H. Vu& Z. Werb (1998) (En: Matrix Metalloproteinases , 1998, editado por W. C.

Parks& R. P. Mecham, pg 115-148, Academic Press. ISBN 0-12- 545090-7) .

La expresión de MMP9 se limita normalmente a unos pocos tipos celulares, incluyendo trofoblastos , osteoclastos , neutrófilos y macrófagos (Vu & Werb, supra) . Sin embargo, la expresión puede inducirse en estas mismas células y en otros tipos de células mediante varios mediadores, incluyendo la exposición de las células a factores de crecimiento o citocinas. Estos son los mismos mediadores frecuentemente implicados en la iniciación de una respuesta inflamatoria. Al igual que con otras MMP secretadas, la MMP9 se libera como una pro-enzima inactiva, que posteriormente es escindida para formar la enzima enzimáticamente activa. Las proteasas requeridas para esta activación in vivo no se conocen. El balance de la MMP9 activa con respecto a la enzima inactiva es además regulado in vivo por la interacción con el TIMP-1 (Inhibidor Tisular de etaloproteinasas-1) , una proteína de origen natural. El TI P-1 se une a la región C- terminal de la MMP9, lo que conduce a la inhibición del dominio catalítico de la M P9. El balance de la expresión inducida de la ProMMP9, la escisión de la Pro- a la MMP9 activa y la presencia de TIMP-1, se combinan para determinar la cantidad de MMP9 activa catalíticamente que está presente en un sitio local. La MMP9 activa proteolíticamente ataca sustratos que incluyen gelatina, elastina y colágenos nativos de Tipo IV y de Tipo V; ésta no tiene actividad contra el colágeno nativo de Tipo I, los proteoglicanos o las lamininas .

Se ha producido un creciente conjunto de datos que implican funciones de la MMP9 en varios procesos fisiológicos y patológicos. Las funciones fisiológicas incluye la invasión de los trofoblastos embrionarios a través del epitelio uterino en las primeras etapas de la implantación embrionaria; alguna acción en el crecimiento y desarrollo de los huesos, y la migración de células inflamatorias del sistema vascular a los tejidos.

La liberación de la M P9, medida usando inmunoensayo enzimático, se incrementó significativamente en los fluidos y en los sobrenadantes de AM provenientes de los asmáticos no tratados en comparación con los de otras poblaciones (Am. J. Resp. Celular & Mol. Biol . , 5:583-591, 1997). Además, el aumento de la expresión de MMP9 se ha observado en ciertos estados patológicos, lo que involucra a la MMP9 en procesos de enfermedades tales como COPD, artritis, metástasis tumoral, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y ruptura de la placa en la aterosclerosis , lo que conduce a graves afecciones coronarias tales como infarto del miocardio (véase también WO 07/087637A3, incorporado aquí como referencia).

Recientemente, se ha demostrado que los niveles de MMP-9 se incrementaron significativamente en pacientes con asma estable, y aún más en pacientes con asma aguda, en comparación con sujetos sanos de control. La MMP-9 juega una función crucial en la infiltración de las células de las vías inflamatorias y en la inducción de la hiperreactividad de las vías respiratorias, lo que indica que la MMP-9 puede tener una función importante en la inducción y el mantenimiento del asma (Vignola y otros, Sputum metalloproteinase- 9/tissue inhibitor of the metalloproteinase-1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998; Hoshino y otros, Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase- 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999; Simpson y otros, Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565,2005; Lee y otros, A murine model of toluene diisocianate-induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J" Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001; y Lee y otros, Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocianate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los aspectos particulares proporcionan un método para el tratamiento de una afección o enfermedad mediada por la MMP9, que comprende la administración a un mamífero que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, que tienen sustancialmente un diámetro promedio menor que aproximadamente 100 nanómetros y que se configuran establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para tratar una afección o enfermedad mediada por la MMP9. En ciertos aspectos, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga se configuran establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, al contacto de una célula viva con el fluido, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y de la conductividad de la membrana celular.

En ciertos aspectos del método, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga son las especies principales de nanoestructuras que contienen gas estabilizado por carga en el fluido. En modalidades particulares, el porcentaje de moléculas de oxígeno disueltas presentes en el fluido como nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, es un porcentaje seleccionado del grupo que consiste de mayor que: 0.01%; 0.1%; 1%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90% y 95 %. En aspectos particulares, el total del oxígeno disuelto está sustancialmente presente en las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga. En ciertas modalidades, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga sustancialmente tienen un diámetro promedio menor que un tamaño seleccionado del grupo que consiste de: 90 nra; 80 nm; 70 nm; 60 nm; 50 nm; 40 nm; 30 nm; 20 nm; 10 nm; y menor que 5 nm.

En aspectos particulares del método, la solución acuosa iónica comprende una solución salina. En ciertos aspectos, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente se superoxigena .

En aspectos particulares del método, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende una forma de electrones solvatados .

En ciertos aspectos, la alteración del fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados, inducidos hidrodinámicamente. En ciertas modalidades, la exposición a los efectos electrocinéticos localizados comprende la exposición a al menos uno de pulsos de voltaje y pulsos de corriente. En aspectos particulares, la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados, inducidos hidrodinámicamente, comprende la exposición del fluido a las características estructurales que inducen el efecto electrocinético de un dispositivo que se utiliza para generar el fluido.

En aspectos particulares, la afección o enfermedad mediada por la MP9 comprende una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, que incluye pero no se limita a, asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En aspectos particulares, la afección o enfermedad mediada por la MMP9 comprende al menos una de artritis reumatoide, artrosis, arteriesclerosis, cáncer y esclerosis múltiple. En ciertas modalidades, la afección o enfermedad mediada por la MMP9 comprende al menos una enfermedad o trastorno del sistema nervioso periférico o central caracterizado por la expresión persistente o sostenida y/o la actividad de la MMP9, seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular/ isquemia cerebral, traumatismo craneoencef lico, lesión de la médula espinal, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero.

En ciertos aspectos, el método comprende, además, terapia de combinación, en donde al menos un agente terapéutico adicional se administra al paciente. En modalidades particulares, el al menos un agente terapéutico adicional comprende la administración de un inhibidor adicional de al menos una MMP. En ciertos aspectos, la al menos una MMP se selecciona del grupo consistente de MMP-1, t MMP-2, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP- 12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19 and MMP-20 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP- 12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19 y MMP-20. En aspectos particulares, el al menos un agente terapéutico adicional es un antagonista de TSLP y/o TSLPR, y en modalidades particulares, el antagonista de TSLP y/o TSLPR se selecciona del grupo consistente de anticuerpos neutralizantes específicos para TSLP y el receptor de TSLP, moléculas del receptor de TSLP soluble, y proteínas de fusión del receptor de TSLP, incluyendo polipéptidos o moléculas Fe de TSLPR-inmunoglobulina o que codifican para los componentes de más de una cadena del receptor.

En ciertos aspectos, el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: fármacos anti- inflamatorios no esteroideos estándares (NSAID) , piroxicam, diclofenaco, un ácido propiónico, naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno, un fenamato, ácido mefenámico, indometacina, sulindac, apazona, una pirazolona, fenilbutazona, un salicilato, aspirina, una terapia analgésica o intra-articular, un corticosteroide , un ácido hialurónico, hyalgan, synvisc, un inmunosupresor, ciclosporina, interferón, un inhibidor del TNF-alfa, Enbrel™, metotrexato en dosis bajas, lefunimida, hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina, oro parenteral y oro oral.

En modalidades particulares, el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo de agentes del CNS que consiste de: un antidepresivo, sertralina, fluoxetina, paroxetina, un fármaco contra el Parkinson, deprenil, L-dopa, requip, miratex, un inhibidor de MAOB, selegina, rasagilina, un inhibidor de COMP, tolcapona, Tasmar, un inhibidor de A-2, un inhibidor de la recaptación de la dopamina, un antagonista de NMDA, un agonista de la nicotina, un agonista de la dopamina, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa neuronal, un fármaco contra el Alzheimer, un inhibidor de la acetilcolinesterasa, metrifonato, donepezil, Aricept, Exelon, ENA 713 o rivastigmina; tetrahidroaminoacridina, Tacrina, Cognex, o THA, un inhibidor de COX-1 o COX-2, celecoxib, Celebrex, rofecoxib, Vioxx, propentofilina, una medicación anti-accidente cerebrovascular, un antagonista selectivo de NR2B, un antagonista del sitio de la glicina, y un factor inhibidor de neutrófilos (NIF) .

En ciertos aspectos, el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: un estrógeno; un modulador selectivo de los estrógenos, estrógenos, raloxifeno, tamoxifeno, droloxifeno, lasofoxifeno; un agente que resulta en la reducción de A. beta.1-40/1-42, un inhibidor de la agregación amiloide, un inhibidor de la secretasa, un agente de osteoporosis , droloxifeno, fosomax, agentes inmunosupresores , FK-506, rapamicina; un agente contra el cáncer, endostatina, angiostatina; un fármaco citotóxico, adriamicina, daunomicina, cis-platino, etopósido, taxol, taxotere,- un alcaloide, vincristina; un antimetabolito , metotrexato; un agente cardiovascular, bloqueadores de los canales de calcio; un agente hipolipetrtiante, una estatina; un fibrato, un beta-bloqueador, un inhibidor de la ACE, un antagonista del receptor de la angiotensina-2 , y un inhibidor de la agregación plaquetaria.

En aspectos particulares del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y de la conductividad de la membrana celular comprende alterar al menos una de las estructuras o funciones de la membrana celular, que comprende alterar al menos uno de una conformación, la actividad de unión al ligando, y una actividad catalítica de una proteína o componente asociados a la membrana. En ciertos aspectos, la proteína asociada a la membrana comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste de receptores, receptores de transmembrana, proteínas de los canales de iones, proteínas de unión intracelular , proteínas de adhesión celular, integrinas, etc. En ciertas modalidades, el receptor de transmembrana comprende un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) . En aspectos particulares, el receptor acoplado a la proteína G (GPCR) interactúa con la subunidad a de la proteína G, por ejemplo, en la cual la subunidad de la proteína G comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste de GOÍS, GOÍÍ, Goíq y G0Í12, y en ciertas modalidades la al menos una subunidad a de la proteína G es Go¡q.

En aspectos particulares del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la conductancia de las células completas, por ejemplo, en la cual la modulación de la conductancia de la célula completa se compone de la modulación al menos uno de las contribuciones lineales y no lineales dependientes del voltaje de la conductancia de las células completas.

En ciertos aspectos del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de una vía o sistema de mensajería celular dependiente del calcio. En ciertos aspectos del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la actividad de la fosfolipasa C. En ciertos aspectos del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la actividad de la adenilato ciclasa (AC) . En ciertos aspectos del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la transducción de las señales intracelulares asociadas con al menos una afección o síntoma seleccionado del grupo que consiste de enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, artritis reumatoide, artrosis, arteriosclerosis , cáncer, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular/isquemia cerebral, traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero.

Aspectos particulares del método comprenden la administración del fluido electrocinético a una red o capa celular, y comprenden posteriormente la modulación de una unión intercelular en ella. En ciertas modalidades, la unión intracelular comprende al menos una seleccionada del- grupo que consiste de uniones estrechas, uniones de hendiduras, adherinas de zona y desmosomas . En aspectos particulares, las redes o capas celulares comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste del epitelio pulmonar, el epitelio bronquial, y el epitelio intestinal.

En ciertos aspectos del método, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente se oxigena, en el cual el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos de 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno a presión atmosférica.

En ciertos aspectos del método, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende al menos uno de electrones solvatados y especies de oxígeno electrocinéticamente modificadas o cargadas, por ejemplo, en el cual la forma de electrones solvatados o de especies de oxígeno electrocinéticamente modificadas o cargadas están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm; al menos 0.1 ppm; al menos 0.5 ppm; al menos 1 ppm; al menos 3 ppm; al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm. En ciertos aspectos, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende una forma de electrones solvatados estabilizados mediante oxígeno molecular .

En ciertos aspectos, la capacidad del fluido alterado electrocinéticamente para modular al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular persiste durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6, al menos 12 meses, o durante más tiempo, en un contenedor cerrado a prueba de escape de gas .

En ciertos aspectos, la cantidad de oxígeno presente en las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga del fluido alterado electrocinéticamente es de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos de 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno a la presión atmosférica.

En aspectos particulares, el tratamiento comprende la administración mediante al menos una de las vías tópica, por inhalación, intranasal e intravenosa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra que el fluido generado electrocinéticamente de la invención (por ejemplo, Revera 60 y Solas) redujo la expresión del receptor de TSLP inducida por DEP en células epiteliales bronquiales (BEC) en aproximadamente un 90% y 50%, respectivamente, mientras que una solución salina normal (NS) sólo tuvo un efecto marginal.

La Figura 2 muestra que el fluido generado electrocinéticamente de la invención (por ejemplo, Revera 60 y Solas) inhibió los niveles de la MMP9 unida a la superficie celular inducida por DEP en células epiteliales bronquiales en aproximadamente un 80% y 70%, respectivamente, mientras que la solución salina normal (NS) solo tuvo un efecto marginal .

Las Figuras 3A, 3B, y 3C demuestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de membrana que evaluaron los efectos del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, RNS-60 y Solas) sobre la polaridad de la membrana de las células epiteliales y la actividad de los canales de iones en dos puntos de tiempo (15 min (paneles de la izquierda) y 2 horas (paneles de la derecha)) y en protocolos de voltajes diferentes.

Las Figuras 4A, 4B, y 4C muestran, con respecto a los experimentos relacionados con las figuras 3A, 3B, y 3C, los gráficos resultantes de la sustracción de los datos de la corriente de Solas de los datos de la corriente de RNS-60 en tres protocolos de voltaje (A. escalonado desde cero mV; B. escalonado desde -60 mV, escalonado desde -120 mV) y los dos puntos de tiempo (15 minutos (círculos abiertos) y 2 horas (círculos cerrados) ) .

Las Figuras 5A, 5B, 5C, y 5D muestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de membrana que evaluaron los efectos del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, Solas (paneles A y B) y RNS-60 (paneles C y D) ) sobre la polaridad de la membrana de las células epiteliales y la actividad de los canales de iones usando diferentes soluciones salinas externas y en los protocolos de voltajes diferentes (los paneles A y C muestran la escalonado desde cero mV; los paneles B y D muestran el escalonado desde -120 mV) .

Las Figuras 6A, 6B, 6C, y 6D presentan, con respecto a los experimentos relacionados con las figuras 5A, 5B, 5C, y 5D, los gráficos resultantes de la sustracción de los datos de la corriente de CsCl (que se muestra en la Figura 5) de los datos de la corriente de 20 mM de CaCl2 (diamantes) y 40 mM de CaCl2 (cuadrados rellenos) , en dos protocolos de voltaje (paneles A y C, escalonado desde cero mV, B y D escalonado desde -120 mV) para Solas (paneles A y B) y Revera 60 (paneles C y D) .

Las Figuras 7A y 7B muestran los resultados de un experimento de fijación de membrana que evaluó los efectos de la dilución del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, RNS-60) sobre la polaridad de la membrana de las células epiteliales y la actividad de los canales de iones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporcionan métodos para el tratamiento de una afección o enfermedad mediada por la MMP9, que comprenden la administración de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente , que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, que tienen sustancialmente un diámetro promedio menor que aproximadamente 100 nanómetros y que se configuran establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para tratar una afección o enfermedad mediada por la MMP9. Las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga se configuran preferentemente de forma estable en el fluido, en una cantidad suficiente para proporcionar la modulación del potencial y/o la conductividad de la membrana celular. Ciertos aspectos que comprenden la modulación o la regulación negativa de la expresión y/o de la actividad de la MMP-9, tienen utilidad para el tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por la MMP9 como se describe en la presente (por ejemplo, enfermedad obstructiva de las vías respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, artritis reumatoide, artrosis, aterosclerosis , cáncer, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular/isquemia cerebral, traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas) .

Los métodos para hacer el fluido generado electrocinéticamente que se utilizan en la presente, se han descrito previamente (véase, por ejemplo, US-2008-0219088 , PCT/US2007/082578 ) , que se incorporan mediante referencia en su totalidad.

Los aspectos particulares proporcionan métodos para el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por una MMP (por ejemplo, la MMP9) , que comprenden la administración, a un sujeto que lo necesita, de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende al menos un fluido generado electrocinéticamente (que incluye fluidos generados electrocinéticamente enriquecidos con gas (por ejemplo, enriquecidos con oxígeno)) como se describe en la presente.

Aspectos adicionales proporcionan métodos para el tratamiento de una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, que comprenden administrar una composición terapéutica que comprende al menos un fluido generado electrocinéticamente (incluyendo los fluidos generados electrocinéticamente enriquecidos con gas (por ejemplo, enriquecidos con oxígeno)) como se describe en la presente.

En modalidades particulares, la enfermedad obstructiva de las vías respiratorias comprende al menos una de asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Aspectos particulares comprenden el tratamiento de al menos una de artritis reumatoide, artrosis, arteriosclerosis , cáncer y esclerosis múltiple.

Aspectos adicionales proporcionan nuevos métodos y composiciones que tienen utilidad sustancial para el tratamiento de COPD, artritis, metástasis tumoral, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, y ruptura de la placa de aterosclerosis que conduce a afecciones coronarias agudas, tal como el infarto de miocardio. Los nuevos métodos tienen utilidad para el tratamiento de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso periférico o central caracterizado por la expresión y/o actividad persistente o sostenida de la MMP9, que incluye pero no se limita a la enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular/isquemia cerebral, traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero, los cuales comprenden administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la MMP9 como se describe en la presente.

Aspectos particulares de la presente invención proporcionan nuevos métodos y composiciones que tienen utilidad sustancial para el tratamiento del deterioro cognitivo (por ejemplo, la demencia, el deterioro cognitivo en personas mayores, la enfermedad de Alzheimer, etc.) Preferentemente se utilizan inhibidores de la MP-9, como se describe en la presente.

Aspectos adicionales proporcionan métodos de tratar una enfermedad medida por la MMP9 o afección, que comprende administrar, a un sujeto necesitado de éste una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende al menos un fluido electroconéticamente generado (que incluyen los fluidos electroconéticamente generados enriquecido con gas (por ejemplo, enriquecido con oxígeno) ) como se describe en la presente, en conjunto con la administración de un inhibidor adicional de al menos otra MMP (por ejemplo, un inhibidor de MMP-1, MMP-2, MMP- 7, MMP-8, MMP-9, MMP- 10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19 y MMP-20 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19 y MMP-20, etc.). En modalidades particulares, el al menos un inhibidor de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) adicional es adeucado para inhibir al menos una MMP con las características de expresión o actividad elevada. En modalidades adicional, la al menos un inhibidor de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) es adecuado para inhibir al menos dos MMP con las características de expresión o actividad elevada. En ciertas modalidades, el al menos un inhibidor de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) es MMP-específico o sustancialmente específico a una MMP particular o inhibe un número limitado de MMP (por ejemplo, de una a dos MMP, de una a tres MMP, o de aproximadamente una a aproximadamente cuatro MMP) . En ciertas modalidades el al menos un inhibidor de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) es un inhibidor de MMP de amplio espectro que inhibe al menos tres, o al menos 4 MMP {por ejemplo, con las características de expresión o actividad elevadas) .

Modalidades ejemplares preferidas: Los aspectos particulares proporcionan un método para el tratamiento de una afección o enfermedad mediada por la MMP9 , que comprende la administración a un mamífero que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, que tienen sustancialmente un diámetro promedio menor que aproximadamente 100 nanómetros y que se configuran establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para tratar una afección o enfermedad mediada por la MMP9. En ciertos aspectos, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga se configuran establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, al contacto de una célula viva con el fluido, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y de la conductividad de la membrana celular .

En ciertos aspectos del método, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga son las especies principales de nanoestructuras que contienen gas estabilizado por carga en el fluido. En modalidades particulares, el porcentaje de moléculas de oxígeno disueltas presentes en el fluido como nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, es un porcentaje seleccionado del grupo que consiste de mayor que: 0.01%; 0.1%; 1%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90% y 95 %. En aspectos particulares, el total del oxígeno disuelto está sustancialmente presente en las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga. En ciertas modalidades, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga sustancialmente tienen un diámetro promedio menor que un tamaño seleccionado del grupo que consiste de: 90 nm; 80 nm; 70 nm,- 60 niti; 50 nm; 40 nm; 30 nm; 20 nm; 10 nm; y menor que 5 nm.

En aspectos particulares del método, la solución acuosa iónica comprende una solución salina. En ciertos aspectos, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente se superoxigena .

En aspectos particulares del método, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende una forma de electrones solvatados.

En ciertos aspectos, la alteración del fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados, inducidos hidrodinámicamente. En ciertas modalidades, la exposición a los efectos electrocinéticos localizados comprende la exposición a al menos uno de pulsos de voltaje y pulsos de corriente. En aspectos particulares, la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados, inducidos hidrodinámicamente, comprende la exposición del fluido a las características estructurales que inducen el efecto electrocinético de un dispositivo que se utiliza para generar el fluido.

En aspectos particulares, la afección o enfermedad mediada por la MMP9 comprende una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, que incluye pero no se limita a asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En aspectos particulares, la afección o enfermedad mediada por la MMP9 comprende al menos una de artritis reumatoide, artrosis, arteriosclerosis , cáncer y esclerosis múltiple. En ciertas modalidades, la afección o enfermedad mediada por la MMP9 comprende al menos una enfermedad o trastorno del sistema nervioso periférico o central caracterizado por la expresión persistente o sostenida y/o la actividad de la MMP9, seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular/ isquemia cerebral, traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero.

En ciertos aspectos, el método comprende, además, terapia de combinación, en donde al menos un agente terapéutico adicional se administra al paciente. En modalidades particulares, el al menos un agente terapéutico adicional comprende la administración de un inhibidor adicional de al menos una MMP. En ciertos aspectos, la al menos una MMP se selecciona del grupo consistente de MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP- 8, MMP- 9, MMP- 10, MMP-11, MMP- 12, MMP- 13, MMP- 14, MMP- 15, MMP-16, MMP-17, MMP- 18, MMP-19 and MMP-20 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP- 13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP- 18, MMP-19 y MMP-20. En aspectos particulares, el al menos un agente terapéutico adicional es un antagonista de TSLP y/o TSLPR, y en modalidades particulares, el antagonista de TSLP y/o TSLPR se selecciona del grupo consistente de anticuerpos neutralizantes específicos para TSLP y el receptor de TSLP, moléculas del receptor de TSLP soluble, y proteínas de fusión del receptor de TSLP, incluyendo polipéptidos o moléculas Fe de TSLPR- inmunoglobulina o que codifican para los componentes de más de una cadena del receptor.

En ciertos aspectos, el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: fármacos anti- inflamatorios no esteroideos estándares (NSAID) , piroxicam, diclofenaco, un ácido propiónico, naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno, un fenamato, ácido mefenámico, indometacina, sulindac, apazone, una pirazolona, fenilbutazona, un salicilato, aspirina, una terapia analgésica o intra-articular, un corticosteroide , un ácido hialurónico, hyalgan, synvisc, un inmunosupresor, ciclosporina, interferón, un inhibidor del TNF-alfa, Enbrel™, metotrexato en dosis bajas, lefunimida, hidroxicloroquina, d-penicilaraina, auranofina, oro parenteral y oro oral.

En modalidades particulares, el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo de agentes del CNS que consiste de: un antidepresivo, sertralina, fluoxetina, paroxetina, un fármaco contra el Parkinson, deprenil, L-dopa, requip, miratex, un inhibidor de MAOB, selegine, rasagilina, un inhibidor de CO P, tolcapona, Tasmar, un inhibidor de A-2, un inhibidor de la recaptación de la dopamina, un antagonista de NMDA, un agonista de la nicotina, un agonista de la dopamina, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa neuronal, un fármaco contra el Alzheimer, un inhibidor de la acetilcolinesterasa, metrifonato, donepezil, Aricept, Exelon, ENA 713 o rivastigmina; tetrahidroaminoacridina, Tacrina, Cognex, o THA, un inhibidor de COX-1 o COX-2, celecoxib, Celebrex, rofecoxib, Vioxx, propentofilina, una medicación anti-accidente cerebrovascular, un antagonista selectivo de NR2B, un antagonista del sitio de la glicina, y un factor inhibidor de neutrófilos (NIF) .

En ciertos aspectos, el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: un estrógeno, un modulador selectivo de los estrógenos, estrógenos, raloxifeno, tamoxifeno, droloxifeno, lasofoxifeno, un agente que resulta en la reducción de A. beta .1-40/1-42 , un inhibidor de la agregación amiloide, un inhibidor de la secretasa, un agente de osteoporosis , droloxifeno, fosomax, agentes inmunosupresores , FK-506, rapamicina, un agente contra el cáncer, endostatina, angiostatina, un fármaco citotóxico, adriamicina, daunomicina, cis-platino, etopósido, taxol, taxotere, un alcaloide, vincristina, un antimetabolito, metotrexato, un agente cardiovascular, bloqueadores de los canales de calcio, un agente hipolipemiante , una estatina, un fibrato, un beta-bloqueador, un inhibidor de la ACE, un antagonista del receptor de la angiotensina-2 , y un inhibidor de la agregación plaquetaria.

En aspectos particulares del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y de la conductividad de la membrana celular comprende alterar al menos una de las estructuras o funciones de la membrana celular, que comprende alterar al menos uno de una conformación, la actividad de unión al ligando, y una actividad catalítica de una proteína o componente asociados a la membrana. En ciertos aspectos, la proteína asociada a la membrana comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste de receptores, receptores de transmembrana, proteínas de los canales de iones, proteínas de unión intracelular, proteínas de adhesión celular, integrinas , etc.

En ciertas modalidades, el receptor de transmembrana comprende un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) . En aspectos particulares, el receptor acoplado a la proteína G (GPCR) interactúa con la subunidad a de la proteína G, por ejemplo, en la cual la subunidad o¡ de la proteína G comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste de Gas, GOÍÍ, G q y Go¡i2, y en ciertas modalidades la al menos una subunidad a de la proteína G es Gaq.

En aspectos particulares del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la conductancia de las células completas, por ejemplo, en la cual la modulación de la conductancia de la célula completa se compone de la modulación al menos uno de las contribuciones lineales y no lineales dependientes del voltaje de la conductancia de las células completas.

En ciertos aspectos del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de una vía o sistema de mensajería celular dependiente del calcio. En ciertos aspectos del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la actividad de la fosfolipasa C. En ciertos aspectos del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la actividad de la adenilato ciclasa (AC) . En ciertos aspectos del método, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la transducción de las señales intracelulares asociadas con al menos una afección o síntoma seleccionado del grupo que consiste de enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, artritis reumatoide, artrosis, arteriesclerosis, cáncer, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular/isquemia cerebral, traumatismo craneoencef lico, lesión de la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero.

Aspectos particulares del método comprenden la administración del fluido electrocinético a una red o capa celular, y comprenden posteriormente la modulación de una unión intercelular en ella. En ciertas modalidades, la unión intracelular comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste de uniones estrechas, uniones de hendiduras, adherinas de zona y desmosomas. En aspectos particulares, las redes o capas celulares comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste del epitelio pulmonar, el epitelio bronquial, y el epitelio intestinal.

En ciertos aspectos del método, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente se oxigena, en el cual el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos de 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno a presión atmosférica.

En ciertos aspectos del método, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende al menos uno de electrones solvatados y especies de oxígeno electrocinéticamente modificadas o cargadas, por ejemplo, en el cual la forma de electrones solvatados o de especies de oxígeno electrocinéticamente modificadas o cargadas están presentes en una cantidad de al menos 0,01 ppm; al menos 0,1 ppm; al menos 0,5 ppm; al menos 1 ppm,- al menos 3 ppm; al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm. En ciertos aspectos, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende una forma de electrones solvatados estabilizados mediante oxígeno molecular .

En ciertos aspectos, la capacidad del fluido alterado electrocinéticamente para modular al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular persiste durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6, al menos 12 meses, o durante más tiempo, en un contenedor cerrado a prueba de escape de gas .

En ciertos aspectos, la cantidad de oxígeno presente en las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga del fluido alterado electrocinéticamente es de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos de 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno a la presión atmosférica.

En aspectos particulares, el tratamiento comprende la administración mediante al menos una de las vías tópica, por inhalación, intranasal e intravenosa.

Fluidos generados electrocinéticamente: "Fluido generado electrocinéticamente", como se usa en la presente, se refiere a los fluidos generados electrocinéticamente de la invención de los solicitantes, para los propósitos de los ejemplos prácticos en la presente, mediante el dispositivo mezclador ejemplar descrito en detalle en la presente (véase también US 200802190088 y O 2008/052143, ambos incorporadas en la presente mediante referencia en su totalidad). Los fluidos electrocinéticos , como lo demuestran los datos divulgados y presentados en la presente, representan fluidos nuevos y fundamentalmente distintos en relación con los fluidos no electrocinéticos de la técnica anterior, incluso en relación con los fluidos no electrocinéticos oxigenados de la técnica anterior (por ejemplo, los fluidos oxigenados en autoclave y similares) . Según lo divulgado en varios aspectos en la presente, los fluidos electrocinéticamente generados tienen propiedades físicas y biológicas nuevas y únicas, que incluyen pero no se limitan a lo siguiente: En aspectos particulares, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga sustancialmente con un diámetro promedio menor que aproximadamente 100 nanómetros y que se configuran de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, al entrar en contacto una célula viva con el fluido, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular.

En aspectos particulares, los fluidos generados electrocinéticamente se refieren a los fluidos generados en presencia de efectos electrocinéticos (por ejemplo, pulsos de voltaje/ corriente) , localizados (por ejemplo, no uniformes con respecto al volumen del fluido en general) hidrodinámicamente inducidos, tal como los efectos localizados de las características del dispositivo como se describe en la presente. En aspectos particulares, dichos efectos electrocinéticos localizados, inducidos hidrodinámicamente, están en combinación con los efectos de la doble capa relacionados con la superficie y/o el flujo de la corriente como se describe y discute en la presente.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son adecuados para modular el ancho de línea de la RMN-C13 de los solutos reporteros (por ejemplo, la trehalosa) disueltos en ellos. Los efectos del ancho de línea de la RMN están en el método indirecto de medición, por ejemplo, de la 'caída' del soluto en un fluido de prueba como se describe en la presente, en particular, en los ejemplos prácticos .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente se caracterizan por al menos uno de: diferencias del pico voltamétrico de la onda cuadrada distintiva en cualquiera de -0.14V, -0.47V, -1.02V y -1.36V; los picos polarográficos a -0.9 voltios; y la ausencia de picos polarográficos a -0.19 y -0.3 voltios, los cuales son únicos para los fluidos generados electrocinéticamente como se describe en la presente, en particular, en los ejemplos prácticos .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son adecuados para modificar la conductividad de la membrana celular (por ejemplo, una contribución dependiente del voltaje de la conductancia de las células completas como medida en los estudios de fijación de membrana divulgados en la presente) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente se oxigenan, en los cuales el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno disuelto a la presión atmosférica. En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente tienen menos de 15 ppm, menos de 10 ppm de oxígeno disuelto a la presión atmosférica, o aproximadamente los niveles del oxígeno ambiental.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente se oxigenan, en los cuales el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad entre aproximadamente 8 ppm y aproximadamente de 15 ppm, y en este caso se refieren algunas veces en la presente como "Solas".

En aspectos particulares, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende al menos uno de electrones solvatados (por ejemplo, estabilizados mediante oxígeno molecular) , y especies de oxígeno modificadas y/o cargadas electrocinéticamente , y los cuales, en ciertas modalidades de los electrones solvatados y/o las especies de oxígeno modificadas y/o cargadas electrocinéticamente, están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son adecuados para modificar la estructura o función de la membrana celular (por ejemplo, la alteración de una conformación, la actividad de unión al ligando, o una actividad catalítica de una proteína asociada a la membrana) suficientes para proporcionar la modulación de la transducción de señales intracelulares , en la cual, en aspectos particulares, la proteína asociada a la membrana comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste de receptores, receptores de transmembrana (por ejemplo, el receptor acoplado a la Proteína G (GPCR) , el receptor de TSLP, el receptor beta 2 adrenérgico, el receptor de la bradiquinina, etc.), las proteínas de los canales de iones, las proteínas de uniones intracelulares, las proteínas de adhesión celular, y las integrinas. En ciertos aspectos, el Receptor Acoplado a la Proteína G (GPCR) interactúa con la subunidad a de la proteína G (por ejemplo, G s, GOÍÍ, G q y Ga12) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son adecuados para modular la transducción de las señales intracelulares , que comprende la modulación de una vía o sistema de mensajería celular dependiente del calcio (por ejemplo, la modulación de la actividad de la fosfolipasa C, o la modulación de la actividad de la adenilato ciclasa (AC) ) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente se caracterizan por varias actividades biológicas (por ejemplo, la regulación de citocinas, receptores, enzimas y otras proteínas y vías de señalización intracelular) descritas en la presente.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente despliegan sinergia con albuterol, y con budesonida, como se muestra en la presente.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente reducen la expresión del receptor de TSLP inducida por DEP en las células epiteliales bronquiales (BEC) como se muestra en los ejemplos prácticos en la presente .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente inhiben los niveles de MMP9 unida a la superficie celular inducidos por DEP en células epiteliales bronquiales (BEC) , como se muestra en los ejemplos prácticos en la presente .

En aspectos particulares, los efectos biológicos de los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente se inhiben por la toxina de la difteria, lo que indica que el bloqueo beta, el bloqueo de GPCR y el bloqueo de los canales de Ca afectan la actividad de los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente (por ejemplo, en función de las células T reguladoras) como se muestra en la presente.

En aspectos particulares, los efectos físicos y biológicos (por ejemplo, la capacidad de alterar la estructura de la membrana celular o la función, suficiente para proporcionar la modulación de la transducción de señales intracelulares) de los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente persiste durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6 meses, o durante más tiempo, en un contenedor cerrado (por ejemplo, en un contenedor cerrado a prueba de gas) .

Por lo tanto, aspectos adicionales proporcionan dichas soluciones electrocinéticamente generadas y los métodos de producir un fluido o solución acuosos oxigenados alterados electrocinéticamente que comprenden: proporcionar un flujo de un material fluido entre dos superficies espaciadas en movimiento relativo y que definen un volumen de mezcla entre ellas, en el cual el tiempo de permanencia de un solo pase del material fluido que fluye dentro y a través del volumen de mezcla es mayor que 0.06 segundos o mayor que 0.1 segundos, y la introducción de oxígeno (02) en el material del fluido que fluye dentro del volumen de mezcla bajo condiciones apropiadas para disolver al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 ppm de oxígeno en el material, y para alterar electrocinéticamente el fluido o la solución. En ciertos aspectos, el oxígeno se infunde dentro del material en menos de 100 milisegundos , menos de 200 milisegundos, menos de 300 milisegundos, o menos de 400 milisegundos. En modalidades particulares, la relación entre el área de superficie y el volumen es de al menos 12, al menos 20, al menos 30, al menos 40, o al menos 50.

En incluso aspectos adicionales, se proporciona un método de producir un fluido o solución acuosa oxigenada alterada electrocinéticamente, que comprende: proporcionar un flujo de un material fluido entre dos superficies espaciadas en movimiento relativo y que definen un volumen de mezcla entre ellas, e introducir oxígeno en el material que fluye dentro del volumen de mezcla en condiciones apropiadas para infundir al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 ppm de oxígeno en el material en menos de 100 milisegundos , menos de 200 milisegundos , menos de 300 milisegundos, o menos de 400 milisegundos. En ciertos aspectos, el tiempo de permanencia del material que fluye dentro del volumen de mezcla es mayor que 0.06 segundos o mayor que 0.1. En modalidades particulares, la relación entre el área de superficie y el volumen es de al menos 12, al menos 20, al menos 30, al menos 40, o al menos 50.

En aspectos particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención administrados comprenden nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga en una cantidad suficiente para proporcionar la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular. En ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente se superoxigenan (por ejemplo, R S-20, R S-40 y RNS-60, que comprenden 20 ppm, 40 ppm y 60 ppm de oxígeno disuelto, respectivamente, en solución salina estándar). En modalidades particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente no se superoxigenan (por ejemplo, RNS-10 o Solas, que comprenden 10 ppm (por ejemplo, aprox. los niveles ambientales de oxígeno disuelto en solución salina estándar) . En ciertos aspectos, la salinidad, la esterilidad, el pH, etc., de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención se establece en el momento de la producción electrocinética del fluido, y los fluidos estériles se administran por una vía apropiada. Alternativamente, al menos uno de la salinidad, esterilidad, pH, etc., de los fluidos se ajusta debidamente (por ejemplo, usando solución salina estéril o diluyentes apropiados) para ser fisiológicamente compatibles con la ruta de administración antes de la administración del fluido. Preferentemente, las soluciones salinas y/o los diluyentes y/o las composiciones tamponadas usadas para ajustar al menos uno de la salinidad, esterilidad, pH, etc., de los fluidos, también son fluidos electrocinéticos , o compatibles de otra forma .

En aspectos particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención comprenden solución salina (por ejemplo, una o más sal (es) disuelta (s) ; por ejemplo, sales basadas en metales alcalinos (Li, Na, K, Rb, Cs, etc.), sales basadas en metales alcalinotérreos (por ejemplo, Mg, Ca) , etc., sales basadas en metales de transición (por ejemplo, Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, etc.,), junto con cualquier componente anión/contraión adecuado). Los aspectos particulares comprenden fluidos electrocinéticos basados en sal mezclada (por ejemplo, Na, K, Ca, Mg, etc., en varias combinaciones y concentraciones) . En aspectos particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención comprenden solución salina estándar (por ejemplo, aprox. 0.9% NaCl, o aproximadamente 0.15 NaCl) . En aspectos particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención comprenden solución salina a una concentración de al menos 0.0002 M, al menos 0.0003 , al menos 0.001 M , al menos 0.005 M, al menos 0.01 M, al menos 0.015 M, al menos 0.1 M, al menos 0.15 M, o al menos 0.2 M. En aspectos particulares, la conductividad de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención es al menos 10 yS/cm, al menos 40 S/cm, al menos 80 S/cm, al menos 100 S/cm, al menos 150 pS/cm, al menos 200 yS/cm, al menos 300 pS/cm, o al menos 500 pS/cm, al menos 1 mS/cm, al menos 5, mS/cm, 10 mS/cm, al menos 40 mS/cm, al menos 80 mS/cm, al menos 100 mS/cm, al menos 150 mS/cm, al menos 200 mS/cm, al menos 300 mS/cm, o al menos 500 mS/cm. En aspectos particulares, cualquier sal se puede usar para preparar los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención, con la condición de que permitan la formación de nanoestructuras estabilizadas con sal biológicamente activas (por ejemplo, nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas con sal) como se describe en la presente.

De acuerdo con aspectos particulares, los efectos biológicos de las composiciones de los fluidos de la invención comprenden nanoestructuras que contienen gas estabilizado por carga, se pueden modular (por ejemplo, aumentar, disminuir, adaptar, etc.) mediante la alteración de los componentes iónicos de los fluidos, como por ejemplo se describe anteriormente, y/o mediante la alteración del componente de gas del fluido. En aspectos preferidos, el oxígeno se usa en la preparación de los fluidos electrocinéticos de la invención. En aspectos adicionales, se usan mezclas de oxígeno junto con al menos uno de otros gases que se seleccionan a partir de nitrógeno, oxígeno, argón, dióxido de carbono, neón, helio, criptón, hidrógeno y xenón.

Interacciones moleculares relevantes e Escuchar : Convencionalmente , se cree que las propiedades cuánticas pertenecen a las partículas elementales de menos de 10~10 metros, mientras que el mundo macroscópico de nuestra vida cotidiana se refiere como clásico, debido a que éste se comporta de acuerdo a las leyes del movimiento de Newton.

Recientemente se ha descrito que las moléculas forman agrupamientos que aumentan de tamaño con la dilución. Estos agrupamientos miden varios micrómetros de diámetro, y se ha reportado que aumentan de tamaño de forma no lineal con la dilución. Se ha postulado que los dominios coherentes cuánticos que miden 100 nanómetros de diámetro se originan en el agua pura, y las vibraciones colectivas de las moléculas de agua en el dominio coherente pueden eventualmente convertirse bloqueadas de fase para las fluctuaciones del campo electromagnético, proporcionando oscilaciones estables en el agua, y proveyendo una forma de "memoria" en forma de excitación de las oscilaciones coherentes de larga duración, específica para las sustancias disueltas en el agua que cambian la estructura colectiva del agua, las cuales pueden a su vez determinar las oscilaciones coherentes específicas que se desarrollan. Cuando estas oscilaciones se estabilizan mediante el acoplamiento de las fases del campo magnético, el agua al diluirse puede aún llevar oscilaciones coherentes 'semillas' . Debido a que un agrupamiento de moléculas aumenta de tamaño, su firma electromagnética se amplifica correspondientemente, reforzando las oscilaciones coherentes llevadas por el agua.

A pesar de las variaciones en el tamaño del agrupamiento de las moléculas disueltas y la detallada estructura microscópica del agua, puede existir sin embargo una especificidad de las oscilaciones coherentes. Un modelo para considerar los cambios en las propiedades del agua se basa en consideraciones que se involucran en la cristalización.

Un agrupamiento de agua protonada simplificado, formando una jaula a nanoescala, se muestra en la solicitud de patente previa de los solicitantes: WO 2009/055729. Un agrupamiento de agua protonada típicamente toma la forma de H+(H20)n. Algunos agrupamientos de agua protonada se producen de forma natural, tal como en la ionosfera. Sin apegarse a alguna teoría en particular, y de acuerdo con aspectos particulares, otros tipos de agrupamientos o estructuras del agua (agrupamientos, nanojaulas, etc.) son posibles, incluyendo las estructuras que comprenden oxígeno y electrones estabilizados impartidos a los materiales resultantes de la invención. Los átomos de oxígeno pueden quedar atrapados en las estructuras resultantes. La química de la nano aula semi-ligada permite que el oxígeno y/o los electrones estabilizados permanezcan disueltos durante períodos de tiempo prolongados. Otros átomos o moléculas, tales como los compuestos medicinales, pueden enjaularse con fines de liberación sostenida. La química específica del material de solución y los compuestos disueltos depende de las interacciones de esos materiales.

Los fluidos procesados por el dispositivo mezclador se han mostrado previamente, a través de los experimentos para exhibir diferentes características estructurales que son consistentes con un análisis del fluido en el contexto de una estructura de agrupamiento . Véase, por ejemplo, WO 2009/055729.

Nanoestructuras estabilizadas por carga (por ejemplo, nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga) : Como se ha descrito previamente en el documento de los solicitantes WO 2009/055729, el "Efecto de la Doble Capa", el "Tiempo de Residencia", la "Velocidad de Infusión", y las "Medidas del Tamaño de la Burbuja", el dispositivo de mezcla electrocinética crea, en cuestión de milisegundos , una única interacción dinámica del fluido no lineal del primer material y el segundo material con turbulencia dinámica, compleja, lo que proporciona la mezcla compleja en contacto con un área de superficie efectivamente enorme (incluyendo la del dispositivo y la de las burbujas de gas excepcionalmente pequeñas de menos de 100 nm) , lo que proporciona los efectos electrocinéticos novedosos descritos en la presente. Adicionalmente , los efectos electrocinéticos localizados por las características (voltaje/corriente) se demostraron usando un dispositivo mezclador especialmente diseñado, que comprende las características del rotor y el estator aislados .

Como bien se reconoce en estado de la técnica, se sabe que las redistribuciones de cargas y/o electrones solvatados son muy inestables en solución acuosa. De acuerdo con aspectos particulares, los efectos electrocinéticos de los solicitantes (por ejemplo, las redistribuciones de cargas, incluyendo, en aspectos particulares, los electrones solvatados) son sorprendentemente estabilizados en el material de salida (por ejemplo, soluciones salinas, soluciones iónicas) . De hecho, tal como se describe en la presente, la estabilidad de las propiedades y la actividad biológica de los fluidos electrocinéticos de la invención (por ejemplo, RNS-60 o Solas) se pueden mantener durante meses en un contenedor a prueba de gas, lo que indica la participación del gas disuelto (por ejemplo, el oxígeno) para ayudar a generar y/o mantener, y/o mediar las propiedades y actividades de las soluciones de la invención. Significativamente, las redistribuciones de cargas y/o electrones solvatados se configuran de forma estable en los fluidos acuosos iónicos electrocinéticos de la invención, en una cantidad suficiente para proporcionar, en contacto con uno célula viva (por ejemplo, una célula de mamífero) por el fluido, la modulación de al menos una del potencial de la membrana celular y de la conductividad membrana celular (véase, por ejemplo, el Ejemplo práctico 23 de fijación de membrana celulares de WO 2009/055729 y según se divulga en la presente) .

Como se describe en la presente, bajo el término "Interacciones Moleculares, " para referirse a la estabilidad y la compatibilidad biológica de los fluidos electrocineticos de la invención (por ejemplo, las soluciones salinas electrocinéticas) , los solicitantes han propuesto que las interacciones entre las moléculas de agua y las moléculas de las sustancias (por ejemplo, el oxígeno) disueltas en el agua, cambian la estructura colectiva del agua y proporcionan agrupamientos de jaulas de nanoescala, incluyendo nanoestructuras que comprenden oxígeno y/o electrones estabilizados transmitidos a los materiales resultantes de la invención. Sin apegarse al mecanismo, la configuración de las nanoestructuras, en aspectos particulares, es tal que: comprenden (al menos para la formación y/o la estabilidad y/o la actividad biológica) gas disuelto (por ejemplo, oxígeno); permiten que los fluidos electrocinéticos (por ejemplo, JMS-60 o los fluidos salinos Solas) modulen (por ejemplo, impartan o reciban) las cargas y/o los efectos de las cargas al entrar en contacto con una membrana celular o un constituyente relacionado de la misma; y en aspectos particulares, proporcionan la estabilización (por ejemplo, llevando, acogiendo, capturando) de electrones solvatados en una forma biológicamente relevante.

De acuerdo con aspectos particulares, y como se apoya mediante la presente divulgación, en las soluciones salinas (por ejemplo, solución salina estándar, NaCl) o iónicas, las nanoestructuras de la invención comprenden nanoestructuras estabilizadas por carga (por ejemplo, de diámetro promedio menor que 100 nm) , que pueden comprender al menos una molécula de gas disuelta (por ejemplo, oxígeno) dentro de una cubierta de hidratacion estabilizado por carga. De acuerdo con otros aspectos, la cubierta de hidratacion estabilizado por carga puede comprender una jaula o vacío de acogida de al menos una molécula de gas disuelta (por ejemplo, oxígeno) . De acuerdo con aspectos adicionales, en virtud de la provisión de cubiertas de hidratacion estabilizado por carga adecuadas, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, pueden comprender adicionalmente un electrón solvatado (por ejemplo, un electrón estabilizado solvatado).

Sin apegarse a un mecanismo o teoría en particular, después de la presente fecha de prioridad, microburbuj as estabilizas por carga, estabilizadas por los iones en el fluido acuoso en equilibrio con el gas ambiental (atmosférico) se han propuesto (Bunkin y otros, Journal of Experimental and Theoretical Physics, 104:486-498 de 2007, incorporadas a la presente como referencia en su totalidad) . De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, los fluidos electrocinéticos novedosos de los solicitantes comprenden una nueva forma, biológicamente activa, de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, y pueden comprender adicionalmente matrices novedosas, agrupamientos o asociaciones de tales estructuras.

De acuerdo con el modelo de microburbujas estabilizado por carga, el orden molecular de corto alcance de la estructura del agua se destruye por la presencia de una molécula de gas (por ejemplo, una molécula de gas disuelto, inicialmente formando complejo con un ion no adsorptivo proporciona un defecto de orden de corto alcance) , proporcionando la condensación de las gotas iónicas, en las cuales el defecto se rodea por una primera y segunda esferas de coordinación de moléculas de agua, las cuales alternativamente se llenan mediante iones adsortivos (por ejemplo, adquisición de una cubierta de detección de iones de Na+ para formar una doble capa eléctrica) y no iones adsortivos (por ejemplo, iones Cl" que ocupan la segunda esfera de coordinación) que ocupan seis y 12 plazas, respectivamente, en las esferas de coordinación. En soluciones iónicas no completamente saturadas (por ejemplo, soluciones salinas no completamente saturadas) , este "núcleo" hidratado se mantiene estable hasta que las primera y segunda esferas estén ocupadas por seis iones adsortivos y cinco no adsortivos, respectivamente, y entonces sufre la explosión de Coulomb, creando un vacío interno que contiene la molécula de gas, en el cual los iones adsortivos (por ejemplo, los de iones Na+) se adsorben a la superficie del vacío resultante, mientras que los iones no adsortivos (o alguna porción de los mismos) se difunden en la solución (Bunkin y otros, supra) . En este modelo, el vacío en la nanoestructura se previene del colapso mediante la repulsión Coulómbica entre los iones (por ejemplo, los iones Na+) adsorbidos en su superficie. La estabilidad de la nanoestructuras que contienen vacío se postula que se debe a la adsorción selectiva de iones disueltos con cargas iguales encima de la superficie del vacío/burbuja y el equilibrio difusivo entre el gas disuelto y el gas dentro de la burbuja, donde la presión electrostática hacia el exterior negativa ejercida por la doble capa eléctrica resultante, proporciona la compensación estable para la tensión superficial, y la presión del gas dentro de la burbuja se equilibra con la presión ambiental. Según el modelo, la formación de tales microburbujas , requiere un componente iónico, y en ciertos aspectos, las asociaciones mediadas por colisión entre las partículas, pueden propiciar la formación de agrupamientos de orden mayor (matrices) {Id) .

El modelo de microburbuj as estabilizado por carga sugiere que las partículas pueden ser microburbuj as de gas, pero sólo contempla la formación espontánea de tales estructuras en solución iónica en equilibrio con el aire ambiental, no está caracterizado y es silente en cuanto a si el oxígeno es capaz de formar estas estructuras, y es igualmente silente en cuanto a si los electrones solvatados podrían asociarse y/o estabilizarse por estas estructuras.

De acuerdo con aspectos particulares, los fluidos electrocinéticos de la invención que comprenden nanoestructuras estabilizadas por carga y/o nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga son novedosos y fundamentalmente distintos de las estructuras de microburbuj as estabilizado por carga atmosféricas no electrocinéticas , postuladas de acuerdo con el modelo de las microburbuj as . Significativamente, esta conclusión es inevitable, derivando al menos en parte, del hecho de que las soluciones salinas de control no tienen las propiedades biológicas divulgadas en la presente, mientras que las nanoestructuras estabilizado por carga de los solicitantes proporcionan una forma biológicamente activa novedosa de nanoestructuras que contienen oxígeno de carga de estabilizada .

De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, el dispositivo electrocinético novedoso y los métodos de los solicitantes proporcionan fluidos alterados electrocinéticamente novedosos que comprenden cantidades significativas de nanoestructuras estabilizadas por carga en exceso de cualquier cantidad que pueda o no pueda ocurrir de forma espontánea en los fluidos iónicos en equilibrio con el aire, o en cualquier fluido generado no electrocinéticamente. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga comprenden nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga. En aspectos adicionales, las nanoestructuras estabilizadas por carga son todas, o sustancialmente todas nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, o de las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, las principales especies de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga en el fluido electrocinético.

De acuerdo con otros aspectos adicionales, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga pueden comprender o acoger un electrón solvatado, y con ello proporcionan un novedoso portador de electrones solvatados estabilizado. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga proporcionan un nuevo tipo de electruro (o electruro invertido) , el cual, a diferencia de los electruros de solutos convencionales tienen un único catión coordinado orgánicamente más que una pluralidad de cationes establemente ordenados con respecto a un vacío o a un vacío que contiene un átomo de oxígeno, en los cuales los iones de sodio ordenados se coordinan por las cubiertas de hidratación de agua, más que por las moléculas orgánicas. De acuerdo con aspectos particulares, un electrón solvatado se puede acomodar mediante la cubierta de hidratación de las moléculas de agua, o preferentemente se puede acomodar dentro del vacío de la nanoestructura, distribuido a través de todos los cationes. En ciertos aspectos, las nanoestructuras de la invención proporcionan una estructura novedosa de "super electruro" en la solución, ya que no sólo proporciona la distribución y la estabilización del electrón solvatado a través de múltiples cationes de sodio ordenados, sino que también proporciona la asociación o la asociación parcial de los electrones solvatados con la(s) molécula (s) de oxígeno enjauladas en el vacío de los electrones solvatados se distribuyen a través de una matriz de átomos de sodio y al menos un átomo de oxígeno. De acuerdo con aspectos particulares, por lo tanto, los "electrones solvatados" tal como se han divulgado en la presente en asociación con los fluidos electrocinéticos de la invención, no pueden solvatarse en el modelo tradicional que comprende la hidratación directa mediante moléculas de agua. Por otra parte, en analogía limitada con las sales de electruro secas, los electrones solvatados en los fluidos electrocinéticos de la invención se pueden distribuir a través de múltiples nanoestructuras estabilizadas por carga, para proporcionar un "pegamento de rejilla" para estabilizar las matrices de orden mayor en solución acuosa.

En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras que contiene oxígeno estabilizado por carga son capaces de interactuar con las membranas celulares o con los constituyentes de las mismas, o proteínas, etc., para mediar las actividades biológicas. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga que acogen un electrón solvatado, son capaces de interactuar con las membranas celulares o con constituyentes de las mismas, o proteínas, etc., para mediar las actividades biológicas .

En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga interactúan con las membranas celulares o con constituyentes de las mismas, o proteínas, etc., como una carga y/o un efecto donante (entrega) de carga y/o como una carga y/o un efecto receptor de carga para mediar las actividades biológicas. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga que acogen un electrón solvatado, interactúan con las membranas celulares como una carga y/o como un efecto donante de carga y/o como una carga y/o como un efecto receptor de carga para mediar las actividades biológicas.

En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o nanoestructuras la carga estabilizada que contienen oxígeno son consistentes con, y dan cuenta de la estabilidad observada y las propiedades biológicas de los fluidos electrocinéticos de la invención y, además, proporcionan un electruro novedoso (o electruro invertido) que proporciona electrones solvatados estabilizados en soluciones iónicas acuosas (por ejemplo, soluciones salinas, NaCl, etc.).

En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga sustancialmente comprenden, tomando la forma de, o pueden dar lugar a, nanoburbujas que contienen oxígeno estabilizado por carga. En aspectos particulares, los agrupamientos que contienen oxígeno estabilizado por carga proporcionan la formación de matrices relativamente mayores de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, y/o nanoburbujas que contienen oxígeno estabilizado por carga o matrices de las mismas. En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga pueden proporcionar la formación de nanoburbujas hidrofóbicas luego del contacto con una superficie hidrofóbica.

En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas con carga sustancialmente comprenden al menos una molécula de oxígeno. En ciertos aspectos, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas con carga sustancialmente comprenden al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10 al menos 15, al menos 20, al menos 50, al menos 100, o más moléculas de oxígeno. En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas con carga comprenden u originan nanoburbujas (por ejemplo, nanoburbujas hidrofóbicas) de aproximadamente 20 nm x 1.5 nm, comprenden aproximadamente 12 moléculas de oxígeno (por ejemplo, basado en el tamaño de una molécula de oxígeno (approx 0.3 nm por 0.4 nm) , suposición de un gas ideal y aplicación de n=PV/RT, donde P=l atm, R=0.082D057D1. atm/mol . K; T=295K; V=pr2h=4.7xl0"22 L, donde r=10xl0~9 m, h=1.5xl0~9 m, y n=1.95xl0~22 moles).

En ciertos aspectos, el porcentaje de moléculas de oxígeno presentes en el fluido que están en esas nanostructuras , o matrices de éstas, que tienen una configuración estabilizada con carga en el fluido acuoso iónico es una cantidad en por ciento seleccionada del grupo consistente de mayor que: 0.1%, 1%; 2%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; y mayor que 95%. De preferencia, este porcentaje es mayor que aproximadamente 5%, mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 15%, o mayor que aproximadamente 20%. En aspectos adicionales, el tamaño sustancial de las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, o matrices de éstas, que tienen una configuración estabilizada con carga en el fluido acuoso iónico es un tamaño seleccionado del grupo consistente de menor que: 100 nm; 90 nm; 80 nm; 70 nm; 60 nm; 50 nm; 40 nm; 30 nm; 20 nm; 10 nm; 5 nm; 4 nm; 3 nm; 2 nm; y 1 nm. Preferentemente, este tamaño es menor que aproximadamente 50 nm, menor que aproximadamente 40 nm, menor que aproximadamente 30 nm, menor que aproximadamente 20 nm, o menor que aproximadamente 10 nm.

En ciertos aspectos, los fluidos electrocinéticos de la invención comprenden electrones solvatados . En aspectos adicionales, los fluidos electrocinéticos comprenden nanoestructuras estabilizadas por carga y/o nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, y/o matrices de las mismas, las cuales comprenden al menos uno de: electron(es) solvatado (s) , y distribuciones de carga única (distribución de carga polar, simétrica, asimétrica) . En ciertos aspectos, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga, y/o matrices de las mismas, tienen propiedades paramagnéticas .

En contraste, en relación a los fluidos electrocinéticos de la invención, el control de los fluidos oxigenados por autoclave (fluidos no electrocinéticos) y similares, no comprenden tales nanoestructuras biológicamente activas estabilizado por carga generadas electrocinéticamente , y/o nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga biológicamente activas y/o matrices de las mismas, capaces de modular al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular.

Sistemas para hacer los fluidos enriquecidos con gas El sistema y métodos descritos en la presente permiten que el gas (por ejemplo oxígeno) se enriquezca establemente a una alta concentración con pérdidas mínimas pasivas. Este sistema y métodos se pueden usar efectivamente para enriquecer una amplia variedad de gases a porcentajes aumentados en una amplia variedad de fluidos. A modo de ejemplo solamente, el agua desionizada a temperatura ambiente que típicamente tiene niveles de aproximadamente 2-3 ppm (partes por millón) de oxígeno disuelto puede lograr niveles de oxígeno disuelto que se encuentran en el intervalo desde al menos aproximadamente 5 ppm, al menos aproximadamente 10 ppm, al menos aproximadamente 15 ppm, al menos aproximadamente 20 ppm, al menos aproximadamente 25 ppm, al menos aproximadamente 30 ppm, al menos aproximadamente 35 ppm, al menos aproximadamente 40 ppm, al menos aproximadamente 45 ppm, al menos aproximadamente 50 ppm, al menos aproximadamente 55 ppm, al menos aproximadamente 60 ppm, al menos aproximadamente 65 ppm, al menos aproximadamente 70 ppm, al menos aproximadamente 75 ppm, al menos aproximadamente 80 ppm, al menos aproximadamente 85 ppm, al menos aproximadamente 90 ppm, al menos aproximadamente 95 ppm, al menos aproximadamente 100 ppm, o cualquier valor mayor o que se encuentre entre éstos usando los sistemas y/o métodos descritos. De acuerdo con una modalidad ilustrativa particular, agua enriquecida con oxígeno puede generarse con niveles de aproximadamente 30-60 ppm de oxígeno disuelto.

La Tabla 1 ilustra varias mediciones de la presión parcial tomadas en una curación de lesiones tratadas con una solución salina enriquecida con oxígeno (Tabla 1) y en muestras de la solución salina enriquecida con gas, enriquecida con oxígeno, de la presente invención.

TABLA 1 Afecciones mediadas por MMP-9 Se cree que la MMP-9 está involucrada en muchos tipos de enfermedades, trastornos y/o afecciones, que incluyen pero no se limitan a, varios tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer gástrico, carcinoma del endometrio, glioblastomas , y linfoma primario del sistema nervioso central (PCNSL) , enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, aterosclerosis y restenosis) , trastornos neuropsiquiátricos (por ejemplo, esquizofrenia y enfermedad bipolar) , enfermedades pulmonares (por ejemplo, asma y bronquitis crónica) , enfermedades degenerativas neuroinflamatorias (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amilotrófica (ALS, también conocida como enfermedad de Lou Gehrig) y retinopatía diabética) , enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso y artritis reumatoide) , y trastornos y afecciones relacionados con el sistema nervioso (por ejemplo, accidente cerebrovascular/isquemia cerebral, traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal, migraña, angiopatía amiloide cerebral, demencia asociada al VIH (SIDA) , deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve, y las enfermedades priónicas en un mamífero) .

Indicaciones Cicatrización de lesiones. Se ha demostrado que la MMP-9 tiene un papel en la curación de lesiones libre de cicatrices en ratones desnudos (Manuel y Gawronska-Kozak, Matrix Biology, 25:505-514, 2006). En particular, Manuel y Gawronska-Kozak mostraron que el tejido de la piel post-lesionado tenía altos niveles de AR m y proteínas de MMP-9 en comparación con los ratones de tipo salvaje durante la fase de remodelación de la curación de lesiones. Otro estudio encontró que la MMP-9 se expresó altamente en la mucosa oral humana lesionada. Puesto que la curación de lesiones requiere de la migración de queratinocitos y la remodelación del tejido de granulación, el estudio por lo tanto indicó que, en la curación de lesiones, la MMP-9 está involucrada en la migración de los queratinocitos y la remodelación de tejido de granulación (Salo y otros, Lab Invest. 70:176-82, 1994). Estos resultados indican que la MMP-9 juega un papel importante en la cicatrización de las lesiones. Sin embargo, un estudio más reciente demostró que la producción prolongada de MMP-9, resultó en la poca cicatrización de lesiones en las úlceras de pacientes diabéticos, debido al menos en parte a la inflamación prolongada (Liu y otros, Diabetes Care, 32:117-119, 2009). Este resultado indica que la MMP-9, si bien es necesaria durante la fase de remodelación de la curación de lesiones, inhibe la cicatrización completa de las úlceras. Los solicitantes muestran en la presente, usando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención, regulan significativamente de forma negativa la producción de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen una utilidad importante para el tratamiento de lesiones y afecciones similares.

Tipos de cáncer. Una reciente revisión describe el papel de la MMP-9 en diferentes tipos de cáncer (Rybakowski . , Cardiovascular Psychiatry and Neurology, vol . 2009, Artículo ID 904836, 7 páginas) . Más específicamente, la revisión se centra en cómo una mutación genética que aumenta la expresión del ARNm de la MMP-9, se asocia frecuentemente con un mayor riesgo de algunos tipos de cáncer y con una progresión más severa del tumor y/o una mayor dinámica de la metástasis. Además, varios estudios mostraron que esta mutación genética particular, se asocia con la malignidad, el crecimiento de tumores y la gravedad de la metástasis en los ganglios linfáticos en el cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer gástrico y cáncer de vejiga urinaria. Además, un estudio reciente sobre el nivel de la MMP-9 en los tumores del carcinoma gástrico en comparación con la mucosa gástrica normal demostró que los carcinomas tienen un nivel significativamente mayor de la proteína MMP-9, y que ese incremento estuvo significativamente asociado a una peor supervivencia de los pacientes (Sier y otros, J. Thrombosis y Haemostasis, 4:127-127, 2006). Otro estudio demostró que el ARNm de la MMP-9 y la actividad de la MMP-9 fueron superiores en los gliomas que en el cerebro normal y más fuertemente correlacionada con la gravedad del tumor (Forsyth, y otros. British J. Cáncer, 79:1828-1835, 1999). Estos estudios indican que la MMP-9 juega un papel importante en la patogénesis de muchos tipos de cáncer. Los solicitantes muestran en la presente, usando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regularon negativamente de forma significativa la producción de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento de ciertos tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer gástrico, gliomas y cáncer de vejiga urinaria) y afecciones similares, y limitan la metástasis en los ganglios linfáticos y alivian las complicaciones relacionadas con las afecciones cancerosas.

Enfermedades pulmonares (asma y bronquitis crónica, por ejemplo) . Recientemente, se ha demostrado que los niveles de MMP-9 se incrementaron significativamente en pacientes con asma estable, y aún más en pacientes con asma aguda en comparación con sujetos sanos de control. La MMP-9 juega un papel crucial en la infiltración de las células inflamatorias en las vías respiratorias, y la inducción de la hiper-respuesta de las vías respiratorias, lo que indica que la MMP-9 puede tener un papel importante en la inducción y el mantenimiento del asma (Vignola y. otros, Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor of the metalloproteinase- 1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998; Hoshino y otros, Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase- 9 and tissue inhibitor of metalloproteinase- 1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999; Simpson y otros, Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565,2005; Lee y otros, A murine model of toluene diisocianate- induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J" Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001; y Lee y otros, Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocianate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284) . Además, un estudio reciente demostró que el tratamiento apical usando MMP-9 resultó en: 1) disminución de la inmunotinción de las proteínas que se encuentran en las uniones estrechas y 2) aumento de la eficacia de la infección por virus (por ejemplo, accesos virales en la superficie basolateral del epitelio) , los cuales indican la alteración de la función de la barrera (Vermeer y otros, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 296: L751-L762, 2009) . Estos estudios indican que la MMP-9 juega un papel importante en la patogénesis de las enfermedades pulmonares (asma y bronquitis crónica) . Los solicitantes muestran en la presente, usando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regularon negativamente de forma significativa la producción de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento de enfermedades pulmonares (asma y bronquitis crónica) y afecciones similares.

Enfermedades cardiovasculares. Una revisión reciente describe el papel de la MMP-9 en las enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, enfermedad coronaria, aterosclerosis e hipertensión.) (Rybakowski, 2009). Más específicamente, la revisión se centra en cómo la mutación genética que aumenta la expresión del ARNm de la MMP-9 está relacionada con una progresión y mortalidad de la enfermedad cardíaca coronaria (CHD) , el aumento de la aterosclerosis y el aumento de la progresión de la hipertensión. En estudios posteriores, se encontraron correlaciones entre niveles más altos de MMP-9 y ectasia arterial coronaria, niveles más altos de MMP-9 y miocardiopatía hipertrófica, y niveles más altos de MMP-9 y pacientes hipertensos . Estos estudios indican que la MMP-9 juega un papel importante en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, CHD, aterosclerosis e hipertensión) . Los solicitantes muestran en la presente, usando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regularon negativamente de forma significativa la producción de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, CHD, aterosclerosis e hipertensión) y afecciones similares.

Trastornos neuropsiquiátricos . Una revisión reciente describe el papel de la MMP-9 en los trastornos neuropsiquiátricos (por ejemplo, esquizofrenia y trastorno bipolar) (Rybakowski , 2009). Más específicamente, la revisión se centra en cómo los pacientes con trastorno bipolar tuvieron una prevalencia significativa de la mutación genética que aumenta la expresión del ARNm de la MMP-9 en comparación con los sujetos sanos del control. Sin embargo, los pacientes con esquizofrenia en comparación con los pacientes normales tuvieron una asociación significativamente más baja de la mutación genética que aumenta la expresión del ARNm de la MMP-9. Estos estudios indican que la MMP-9 tiene un papel correlativo en los trastornos neuropsiquiátricos (por ejemplo, esquizofrenia y trastorno bipolar) . Los solicitantes muestran en la presente, usando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regularon negativamente de forma significativa la producción' de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento de los trastornos neuropsiquiátricos (por ejemplo, esquizofrenia y trastorno bipolar) y afecciones similares.

Enfermedades degenerativas neuroinflamatorias. Durante varios años, la MMP- 9 se ha implicado en la patogénesis de enfermedades como la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica. El incremento en la expresión de la MMP-9 también se ha reportado en la enfermedad de Alzheimer y en el tejido cerebral post-mortem de ALS (Lorenzl y otros. Neurochem. Int. 43:191-6, 2003). Lorenzl y otros también reportaron el aumento en los niveles de MMP- 9 en el plasma circulante de pacientes con Alzheimer. Curiosamente, un estudio reciente demostró que la MMP- 9 puede degradar las fibrillas beta-amiloides fuertemente agregadas y puede contribuir al aclaramiento progresivo de las placas provenientes de los cerebros cargados de amiloide (Yan y otros, J Biol Chem. 281:24566-74, 2006). Otro estudio reciente mostró una mayor expresión de MMP- 9 en la corteza y el cerebelo de muestras post mortem de pacientes con enfermedad de Huntington en comparación con los controles (Silverstroni , y otros. Clinical Neuroscience and Neuropathology, 20:1098-1103, 2009). Estos estudios indican que la MMP-9 tiene un papel importante en las enfermedades degenerativas neuroinflamatorias (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y ALS) . Los solicitantes muestran en la presente, usando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regularon negativamente de forma significativa la producción de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento de enfermedades degenerativas neuroinflamatorias (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y ELA) y similares afecciones.

Demencia asociada al VIH (SIDA) . La MMP-9 está involucrada en la degradación de la matriz extracelular y conduce a la reducción de la fortaleza de la barrera hemato-encefálica, lo que puede conllevar a la disfunción de la barrera hemato-encef lica si la MMP-9 es demasiado activa. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regulan negativamente de forma significativa la producción de MMP-9 (ver debajo) y en consecuencia, aumentan la resistencia de la barrera hemato-encefálica, reduciendo de esta forma la infección por VIH en el cerebro y la demencia posterior.

Trastornos autoinmunes . Desde hace varios años, los estudios han demostrado la presencia o aumento de la presencia de la MMP-9 en los fluidos corporales de muchas enfermedades autoinmunes, que incluyen pero no se limitan a la esclerosis múltiple, SLE y artritis reumatoide . Un estudio reciente resumió y discutió los estudios que examinaron la presencia y la cantidad de MMP-9 en el suero, el fluido cefalorraquídeo (CSF) , y el fluido sinovial de pacientes afectados por esclerosis múltiple, SLE y la artritis reumatoide (Ram y otros, J. Clinical Inmunology, 26:299-307, 2006) . En general, cada estudio encontró un aumento de la MMP-9 en el fluido corporal respectivo, en comparación con los controles. En otro estudio, Ainiala, y otros, descubrieron una correlación entre el aumento de la MMP-9 en el suero y las manifestaciones neuropsiquiátricas (por ejemplo, pacientes que tienen al menos uno de los síntomas neuropsiquiátricos , como la disfunción cognitiva) , la vasculopatía de pequeños vasos cerebrales, y eventos de isquemia cerebral de mayor riesgo en pacientes con SLE (Ainiala, y otros. Arthritis Rheum 50:858-65, 2004) .

Para la artritis reumatoide, un estudio ha demostrado la elevación sustancial de los niveles de MMP-9 en el suero y fluido sinovial de pacientes (Gruber y otros, Clin Immunol Iwmunopathol , 78:161-71, 1996). El estudio también descubrió que la fuente de la MMP- 9 en la artritis reumatoide es el sinovio de la artritis reumatoide. La PCR de la transcriptasa inversa in situ encontró que el transcripto de la MMP- 9 se produjo en varios tipos diferentes de células sinoviales reumatoides . En otro estudio, se encontró que los niveles de MMP- 9 eran sustancialmente más altos en los fluidos de las articulaciones provenientes de artritis reumatoide en comparación con los fluidos de las articulaciones de artrosis (Seki, y otros, Modern Reumatology, 7:197-209, 2009). Además, el estudio demostró que las concentraciones de MMP- 9 activa en los fluidos de las articulaciones de los pacientes con artritis reumatoide se correlacionaron positivamente con células positivas para MMP-9 en el sinovio de la artritis reumatoide y con el conteo de linfocitos de infiltrados difusos. Estos resultados indican que la MMP- 9 participa activamente en la destrucción de las articulaciones de la artritis reumatoide.

Para la esclerosis múltiple, los estudios han demostrado que la MMP- predomina en las lesiones de la esclerosis múltiple aguda. Varios estudios también han demostrado que los niveles de MMP- 9 en el suero y en el CSF son diferentes dependiendo del tipo de la enfermedad que tiene el paciente.

En particular, un estudio mostró que la duración corta de la enfermedad y la recaída-remisión de la esclerosis múltiple tuvieron niveles mucho más altos de MMP-9 que la esclerosis múltiple progresiva primaria (Avolio, y otros, J" Neuroimmunol , 136:46-53, 2003). Sin embargo, la esclerosis múltiple primaria progresiva tuvo niveles mucho más altos de MMP-9 que un paciente con esclerosis múltiple inactiva. Un estudio reciente examinó los efectos de del estriol, una hormona del embarazo que tiene propiedades anti-inflamatorias , en la producción de MMP-9 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) colectadas a partir de pacientes femeninas con esclerosis múltiple (Gold, y otros, Lab Investigation 89.: 1076-1083, 2009). Gold, y otros, demostraron que la producción de MMP-9 disminuyó significativamente en las PBMCde aquellos pacientes que tienen el tipo de recaída-remisión de esclerosis múltiple. Curiosamente, esta disminución de la MMP-9 se correlacionó con una disminución en el incremento de las lesiones en la MRI y una disminución en la infiltración de células T y macrófagos en el sistema nervioso central como se muestra en el modelo de ratón de EAE.

Estos estudios indican que la MMP-9 tiene un papel importante en las enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple, SLE y artritis reumatoide) . Los solicitantes muestran en la presente, utilizando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regularon negativamente de forma significativa la producción de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento de enfermedades autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple, SLE y artritis reumatoide) y afecciones similares.

Migraña. Recientemente, un estudio mostraó un aumento de la producción de MMP-9 en pacientes migrañosos durante los ataques de migraña, lo que indica que un ataque de migraña tiene un componente de inflamación y/o de alteración de la barrera hemato-encef lica . Estos estudios indican que la MMP-9 tiene un papel en los ataques de migraña. Los solicitantes muestran en la presente, utilizando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regularon negativamente de forma significativa la producción de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento de ataques de migraña y afecciones similares.

Accidente cerebrovascula . La participación de la MMP-9 en la remodelación de la matriz extracelular y, más específicamente en la degradación de la barrera hemato-encefálica se ha apreciado durante mucho tiempo en el estado de la técnica. El papel de la MMP-9 en la recuperación posterior al accidente cerebrovascular se ha examinado (Clark, y otros. Neuroscience Letters, 238:53-56, 1997). Clark, y otros, demostraron que la actividad de la MMP-9 es marcadamente elevada en el tejido infartado dos días después del infarto. Curiosamente, aquellos pacientes que murieron a causa del accidente cerebrovascular tuvieron niveles elevados de MMP-9 a partir de los 2 días y hasta su muerte, lo que indica que la prolongada actividad de la MMP-9 tiene un papel en la mortalidad resultante de un accidente cerebrovascular. Estos estudios indican que la MMP-9 tiene un papel en la recuperación del accidente cerebrovascular. Los solicitantes muestran en la presente, utilizando un modelo de BEC, que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención regularon negativamente de forma significativa la producción de MMP-9. De acuerdo a ciertas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad sustancial para el tratamiento de los pacientes que se recuperan de un accidente cerebrovascular y afecciones similares.

Inhibidores de las MM : Se conocen un número de inhibidores de las metaloproteinasas (véase, por ejemplo, las revisiones de los inhibidores de MMP por Beckett R. P y Whittaker M. , 1998, Exp . Opin. Ther. Patents, 8 (3) :259-282; Whittaker M. y otros, 1999, Chemical Reviews 99 (9) : 2735-2776) . El documento WO 02/074767 describe derivados de la hidantoína de fórmula que son útiles como inhibidores de las MMP, particularmente como inhibidores potentes de la MMP12. La solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 11/721,590 (publicada como US 20080032997) divulga un grupo adicional de derivados de la hidantoína que son inhibidores de las metaloproteinasas y son de particular interés en la inhibición de las MMP, tales como la MMP12 y la MMP9. Nuevos derivados de triazolona para la inhibición de MMP, tales como la MMP12 y la MMP9 se describen en solicitud de patente de los Estados Unidos número de serie 10/593,543 (publicada como US 20070219217). Inhibidores adicionales de MMP12 y MMP9 se divulgaron en 11/509,490 (publicada como US 20060287338) (véase también 10/831265 (publicada como US 20040259896)).

Los inhibidores MMP ilustrativos adicionales se resumen en la Tabla 2 a continuación: Tabla 2. Inhibidores ilustrativos de la metaloproteinasa de la matriz (MMP) (por ejemplo, obtenible de EMD Biosciences) .

Pl P2 P3 Alcohol (nM) i-butil t-butil metil >20000 2- i-butil t-butil piridil 4600 i-butil CHM fenetil 1300 n-heptil t-butil Metilo 120 n-heptil t-butil PhS02NH2 120 n-heptil i-butil fenetil 1500 Morfoli n-heptil i-butil no 5100 Leu (eti n-heptil i-butil 1) 210 n-heptil CHM PhS02NH2 290 fenpropil CHM fenetil >2000 MPI no- Ver David T. hidroxama Puerta y otros 0 0' £2 to supr . ilustrati o Pl 0 Batima Ver David T. Puerta y stat Los Titulada DERIVADOS compuestos DE ÁCIDO HIDROXAMICO de la Y ÁCIDO CARBOXÍLICO, patente U.S. PROCESO PARA SU No. PREPARACIÓN Y USO DE 5,618,844, LOS MISMOS, incorporados concedida a en la Gowravaram y otros, presente el 8 de abril de como 1997 referencia Los Titulada ÁCIDOS a-compuestos AMINO SULFONIL de la HIDROXÁMICOS COMO patente U.S. INHIBIDORES DE No. METALOPROTEINASA DE 5,804,593, LA MATRIZ, concedida incorporados a arpehoski y en la otros, el 8 de presente septiembre de 1998 como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente U.S. LA MATRIZ, concedida No. a Huxley y otros, el 5, 917, 090, 29 de junio de 1999 incorporados en la presente como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente U.S. LA MATRIZ DE ÁCIDO No. BUTÍRICO, concedida 6,020,366, a Picard y otros, el incorporados 1 de febrero de 2000 en la presente como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente U.S. LA MATRIZ, concedida No. a Alpegiani y otros, 6, 194,451, el 27 de febrero de incorporados 2001 en la presente como referencia Los Titulada compuestos INHIBIDORES DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente U.S. LA MATRIZ, concedida No. a Christensen, el 21 6, 277, 876, de agosto de 2001 incorporados en la presente como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente U.S. LA MATRIZ DE No. DIBENZOFURAN 6,294,674, SULFONAMIDA, incorporados concedida a Picard y en la otros, el 25 de presente septiembre de 2001 como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente U.S. LA MATRIZ Y MÉTODOS No. DE USAR LOS MISMOS, 6, 294, 694, concedida a itiak y incorporados otros, el 25 de en la septiembre de 2001 presente como referencia Los Titulada PREPARACIÓN compuestos Y USO DE ÁCIDOS ORTO-de la SULFONAMIDO ARIL patente HIDROXÁMICOS COMO U.S. No. INHIBIDORES DE LA 6, 65, 508, METALOPROTEINASA DE incorporad LA MATRIZ, concedida os en la a Nelson y otros, el presente 15 de octubre de 2002 como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ, concedida U.S. No. a Alpegiani y otros, 6,482, 827, el 19 de noviembre de incorporad 2002 os en la presente como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ, concedida U.S. No. a Sorensen y otros, 6, 521, 606, el 18 de febrero de incorporad 2003 os en la presente como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ Y MÉTODOS U.S. No. DE USAR LOS MISMOS, 6,531,499, concedida a Witiak y incorporad otros, el 11 de os en la marzo de 2003 presente como referencia Los Titulada INHIBIDOR compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DEL patente ÁCIDO SULFONA U.S. No . HIDROXÁMICO 6, 541,489, AROMÁTICO, concedida incorporad a Barta y otros, el os en la 1 de abril de 2003 presente como referencia Los Titulada COMPUESTOS compuestos DEL ÁCIDO Oí-AMINO- ß -de la SULFONIL patente HIDROXÁMICO, U.S. No. concedida a 6 , 583 , 299, Hockerman y otros, incorporad el 24 de junio de os en la 2003 presente como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ, concedida U.S. No. a Quirk, el 29 de 6, 600, 057, julio de 2003 incorporad os en la presente como referencia Los Titulada REMEDIOS compuestos PARA LAS de la ENFERMEDADES DE LAS patente ARTICULACIONES , U.S. No. concedida a Serizawa 6,608,043, y otros, el 19 de incorporad agosto de 2003 os en la presente como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuesto DE LA s de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ Y U.S. No. REGULADORES 6,624, 144 DESCENDENTES , concedida a Koivunen incorpora y otros, el 23 de dos en la septiembre de 2003 presente como referenci a Los Titulada INHIBIDORES compuesto DE LA s de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ Y SUS USOS U.S. No. TERAPEUTICOS, 6, 624, 177 concedida a O'Brien y otros, el 23 de incorpora septiembre de 2003 dos en la presente como referenci a Los Titulada INHIBIDORES compuesto DE LA s de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ, concedida U.S. No. a Carpenter Jr. y 6, 656, 448 otros, el 2 de diciembre de 2003 incorpora dos en la presente como referenci a Los Titulada INHIBIDOR compuesto PÉPTIDO DE LA s de la ACTIVIDAD DE LA MMP patente Y ANGIOGÉNESIS, U.S. No. concedida a Bein y 6,667,388 otros, el 23 de diciembre de 2003 incorpora dos en la presente como referenci a Los Titulada COMPUESTOS compuesto DE ÁCIDO HIDROXÁMICO s de la ÚTILES COMO patente INHIBIDORES DE LA U.S. No. METALOPROTEINASA DE 6,677,355 LA MATRIZ, concedida a Conrad y otros, el incorpora 13 de enero de 2004 dos en la presente como referenci a Los Titulada INHIBIDOR compuesto DE LA s de la METALOPROTEINASA patente DEL ÁCIDO SULFONA U.S. No. HIDROXÁMICO 6, 750, 233 AROMÁTICO, concedida a Barta incorpora y otros, el 15 de dos en la junio de 2004 presente como referenci a Los Titulada DERIVADOS compuestos DEL ÁCIDO 3-de la ARILSULFONIL-2 patente (METIL SUSTITUIDO) U.S. No. PROPANOICO COMO 6, 765, 003 , INHIBIDORES DE LA incorporad METALOPROTEINASA DE os en la LA MATRIZ, concedida presente a Mantegani y otros, como el 20 de julio de referencia 2004 Los Titulada PREPARACIÓN compuestos Y USO DE ÁCIDOS de la ORTO-SULFONAMIDO patente ARIL HIDROXÁMICOS U.S. No. COMO INHIBIDORES DE 6, 825, 352, LA METALOPROTEINASA incorporad DE LA MATRIZ, os en la concedida a Nelson y presente otros, el 30 de como noviembre de 2004 referencia Los Titulada INHIBIDOR compuestos DE LA de la METALOPROTEINASA DEL patente ÁCIDO SULFONA U.S. No. HIDROXÁMICO 6, 890, 937, AROMÁTICO, concedida incorporad a Barta y otros, el os en la 10 de mayo de 2005 presente como referencia Los Titulada DERIVADOS compuestos DEL ÁCIDO TIAZEPINIL de la HIDROXÁMICO COMO patente INHIBIDORES DE LA U.S. No. METALOPROTEINASA DE 6, 967, 197, LA MATRIZ, concedida incorporad a Neya y otros, el os en la 22 de noviembre de presente 2005 como referencia Los Titulada INHIBIDORES compuesto DE LA s de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ, concedida U.S. No . a Decicco y otros, 6, 989, 139 el 24 de enero de 2006 incorpora dos en la presente como referenci a Los Titulada INHIBIDORES compuesto DE LA s de la METALOPROTEINASA DE patente LA MATRIZ, concedida U.S. No. a Carpenter, Jr. y 7, 060, 248 otros, el 13 de junio de 2006 incorpora dos en la presente como referenci a Los Titulada compuesto INHIBIDORES DE LA s de la METALOPROTEINASAS DE patente LA MATRIZ DEL ÁCIDO U.S. No. o¡-SULFONILAMINO 6, 417, 229 HIDROXÁMICO PARA EL TRATAMIENTO DE incorpora TRASTORNOS dos en la PERIFÉRICOS 0 DEL presente SISTEMA NERVIOSO como CENTRAL, concedida a referenci Sahagan y otros, el a 9 de julio de 2002 Métodos de tratamiento El término "tratar" se refiere a, e incluye, revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir una enfermedad, trastorno o estado, o uno o más síntomas de los mismos, y "tratamiento" y "terapéutico" se refieren al acto de tratar, como se define en la presente.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es cualquier cantidad de cualquiera de los compuestos utilizados en el curso de la práctica de la invención proporcionados en la presente, que es suficiente para revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir una enfermedad, trastorno o estado, o uno o más síntomas de los mismos.

Ciertas modalidades de la presente se refieren a composiciones terapéuticas y métodos de tratamiento para un sujeto mediante la prevención o mitigación de al menos un síntoma de la inflamación asociada con ciertas afecciones o enfermedades. Muchas afecciones o enfermedades asociadas con trastornos de la inflamación se han tratado con esteroides, metotrexato, fármacos inmunosupresores incluyendo la ciclofosfamida, la ciclosporina, la azatioprina y la leflunomida, agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como la aspirina, el paracetamol y los inhibidores de la COX-2, los agentes de oro y los tratamientos contra la malaria. Rutas y Formas de administración Como se usa en la presente, "sujeto", puede referirse a cualquier criatura viva, preferentemente un animal, más preferentemente un mamífero, y aún más preferentemente un ser humano .

En modalidades ejemplares particulares, el fluido enriquecido con gas de la presente invención puede funcionar como una composición terapéutica, solo o en combinación con otro agente terapéutico, de manera tal que la composición terapéutica previene o alivia al menos un síntoma de la inflamación. Las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen composiciones que son capaces de administrarse a un sujeto que las necesita. En ciertas modalidades, la formulación de la composición terapéutica también puede comprender al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consiste de: vehículos, adyuvantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, edulcorantes, aromas, perfumes, y aglutinantes.

Como se usa en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" y "vehículo" se refieren generalmente a un material de encapsulación, diluyente, o de relleno, líquido, semi-sólido o sólido no tóxico, inerte o formulación auxiliar de cualquier tipo. Algunos ejemplos no limitativos de los materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables son los azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como el almidón de maíz y el almidón de papa; celulosa y sus derivados tales como la carboximetilcelulosa de sodio, etil celulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como la manteca de cacao y las ceras de supositorios; los aceites como el aceite de maní, aceite de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles; tales como el glicol de propileno; ésteres tales como etil oleato y laurato de etilo; agar; agentes tampones; tales como el hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico, y las soluciones de tampón fosfato, así como otros lubricantes no tóxicos compatibles tales como el lauril sulfato de sodio y el estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes liberadores, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saborizantes y aromatizantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, de acuerdo al juicio del formulador. En aspectos particulares, tales vehículos y excipientes pueden ser los fluidos o las soluciones enriquecidos con gas de la presente invención.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables descritos en la presente, por ejemplo, los vehículos, adyuvantes, excipientes o diluyentes, son bien conocidos para aquellos que son expertos en la materia. Típicamente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es químicamente inerte para los agentes terapéuticos y no tiene efectos secundarios perjudiciales o toxicidad bajo las condiciones de uso. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir polímeros y matrices de polímeros, nanopartículas , microburbujas , y similares.

Además de los fluidos enriquecidos con gas terapéuticos de la presente invención, la composición terapéutica puede comprender adicionalmente diluyentes inertes tales como agua u otros disolventes no enriquecidos con gas adicional, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, glicol de propileno, 1, 3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, de semilla de algodón, maní, maíz, germen, oliva, ricino, y aceites de sésamo) , glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y esteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Como se aprecia por los expertos, una formulación novedosa y mejorada de una composición terapéutica particular, un fluido terapéutico enriquecido con gas novedoso, y un nuevo método de administrar el fluido terapéutico enriquecido con gas novedoso se pueden obtener mediante el reemplazo de uno o más diluyentes inertes con un fluido enriquecido con gas de la composición idéntica, similar o diferente. Por ejemplo, el agua convencional se puede sustituir o suplementar con un fluido enriquecido con gas producido mediante la mezcla de oxígeno en agua o agua desionizada para proporcionar el fluido enriquecido con gas.

En ciertas modalidades, el fluido enriquecido con gas inventivo se puede combinar con uno o más agentes terapéuticos y/o se usa solo. En modalidades particulares, la incorporación del fluido enriquecido con gas puede incluir el reemplazo de una o más soluciones conocidas en la técnica, tales como agua desionizada, solución salina, y similares, con uno o más fluidos enriquecidos con gas, proporcionando así una composición terapéutica mejorada para la administración al sujeto.

Ciertas modalidades, proporcionan las composiciones terapéuticas que comprenden un fluido enriquecido con gas de la presente invención, una composición farmacéutica u otro agente terapéutico o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar en la profilaxis y el tratamiento de las enfermedades o afecciones anteriores y en las terapias como se mencionó anteriormente. Preferentemente, el vehículo deberá ser farmacéuticamente aceptable y debe ser compatible con, es decir, no tener un efecto deletéreo sobre, los demás componentes de la composición. El vehículo puede ser un sólido o un líquido y se formula preferentemente como una formulación de dosis unitaria, por ejemplo, un comprimido que puede contener de 0.05 a 95% en peso del ingrediente activo.

Posibles rutas de administración incluyen la oral, sublingual, bucal, parenteral (por ejemplo subcutánea, intramuscular, intra-arterial, intraperitoneal , intracisternal , intravesical , intratecal o intravenosa), rectal, tópica incluyendo transdérmica, intravaginal , intraocular, intraótica, intranasal , inhalación e inyección o inserción de materiales o dispositivos implantables .

Rutas de Administración La mayoría de los medios adecuados de administración para un sujeto en particular dependerá de la naturaleza y la gravedad de la enfermedad o afección a ser tratada, o de la naturaleza de la terapia que se utiliza, así como de la naturaleza de la composición terapéutica o del agente terapéutico adicional. En ciertas modalidades, se prefieren la administración oral o tópica.

Las formulaciones apropiadas para la administración oral se pueden proporcionar como unidades discretas, tales como comprimidos, cápsulas, papelillos, jarabes, elíxires, goma de mascar, formulaciones "lollipop", microemulsiones , soluciones, suspensiones, pildoras, ampollas revestidas de gel, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del compuesto activo; como polvos o gránulos, como soluciones o suspensiones en líquidos acuosos y no acuosos, o como aceite en agua o emulsiones de aceite en agua.

Las formulaciones apropiadas para los métodos de aplicación por vía transmucosa, por ejemplo, administración sublingual o bucal, incluyen parches, pildoras, comprimidos, y similares que comprenden el compuesto activo y, típicamente una base saborizada, tal como azúcar y goma arábiga o tragacanto y pastillas que comprenden el compuesto activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o la acacia y sacarosa .

Las formulaciones apropiadas para la administración parenteral típicamente comprenden soluciones acuosas estériles que contienen una concentración predeterminada del fluido enriquecido con gas activo y, posiblemente, otro agente terapéutico, la solución es preferentemente isotónica con la sangre del receptor objeto. Las formulaciones adicionales apropiadas para administración parenteral incluyen formulaciones que contienen co- solventes y/o agentes que forman complejos fisiológicamente apropiados, tales como surfactantes y ciclodextrinas . Las emulsiones de aceite en agua también pueden ser apropiadas para las formulaciones para la administración parenteral del fluido enriquecido con gas . Aunque este tipo de soluciones se administran preferentemente por vía intravenosa, también se pueden administrar por inyección subcutánea o intramuscular.

Las formulaciones apropiadas para la administración uretral, rectal o vaginal incluyen geles, cremas, lociones, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables , emulsiones, materiales sólidos solubles, duchas, y similares. Las formulaciones se proporcionan preferentemente en forma de supositorios de dosis unitaria que comprenden el ingrediente activo en uno o más vehículos sólidos que forman la base del supositorio, por ejemplo, la manteca de cacao. Alternativamente, los lavados colónicos con los fluidos enriquecidos con gas de la presente invención se pueden formular para la administración colónica o rectal .

Las formulaciones apropiadas para la aplicación tópica, intraocular, intraótica, o intranasal son pomadas, cremas, pastas, lociones, pastas, geles (como hidrogeles) , aerosoles, polvos y gránulos dispersables, emulsiones, nebulizadores o aerosoles que utilizan propulsores que fluyen (tales como los aerosoles liposomales, gotas nasales, aerosoles nasales, y similares) y aceites. Los vehículos adecuados para tales formulaciones incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles , alcoholes, y combinaciones de los mismos. La administración nasal o intranasal pueden incluir dosis controladas de cualquiera de estas formulaciones u otras. Del mismo modo, la intraótica o intraocular pueden incluir gotas, pomadas, fluidos para la irritación y similares.

Las formulaciones de la invención se pueden preparar por cualquier método apropiado, típicamente mezclando íntimamente de manera uniforme el fluido enriquecido con gas opcionalmente con un compuesto activo con vehículos líquidos o sólidos finamente divididos o ambos, en las proporciones requeridas y, a continuación, si fuera necesario, la configuración de la mezcla resultante en la forma deseada.

Por ejemplo, un comprimido se puede preparar por la compresión de una mezcla íntima que comprende un polvo o gránulos del ingrediente activo y uno o más ingredientes opcionales, tales como un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, o agente de dispersión activo de superficie, o mediante el moldeado de una mezcla íntima del ingrediente activo en forma de polvo y un fluido enriquecido con gas de la presente invención.

Las formulaciones apropiadas para la administración por inhalación incluyen polvo de partículas finas o vaporizaciones que se pueden generar por medio de varios tipos de aerosoles, nebulizadores , o insufladores presurizados de dosis controladas. En particular, los polvos u otros compuestos de los agentes terapéuticos se pueden disolver o suspender en un fluido enriquecido con gas de la presente invención.

Para la administración pulmonar a través de la boca, el tamaño de la partícula del polvo o de las gotitas está típicamente en el rango de 0.5 a 10 µ?, preferentemente de 1-5 µ?, para garantizar la administración al árbol bronquial. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de partícula en el rango de 10 a 500 µ? para asegurar la retención en la cavidad nasal .

Los inhaladores de dosis controlada son dispensadores de aerosol presurizado, que típicamente contienen una formulación de solución o suspensión de un agente terapéutico en un propulsor licuado. En ciertas modalidades, como se describe en la presente, los fluidos enriquecidos con gas de la presente invención se pueden utilizar adicionalmente o en lugar del propulsor licuado estándar. Durante el uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para proporcionar un volumen controlado, por lo general de 10 a 150 µ?, para producir un aerosol de partículas finas que contiene el agente terapéutico y el fluido enriquecido con gas. Los propulsores apropiados incluyen ciertos compuestos de clorofluorocarbono, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los mismos.

La formulación puede contener adicionalmente uno o más co-solventes , por ejemplo, surfactantes del etanol, tales como ácido oleico o trioleato de sorbitán, antioxidantes y agentes saborizantes apropiados. Los nebulizadores son dispositivos comercialmente disponibles que transforman las soluciones o suspensiones del ingrediente activo en una vaporización de aerosol terapéutico, ya sea por medio de la aceleración de un gas comprimido (típicamente aire u oxígeno) a través de un orificio difusor estrecho, o por medio de agitación ultrasónica. Las formulaciones apropiadas para su uso en nebulizadores consisten de otro agente terapéutico en un fluido enriquecido con gas y comprenden hasta el 40% p/p de la formulación, preferentemente menor que el 20% p/p. Además, pueden utilizarse otros vehículos, tales como agua destilada, agua estéril, o una solución acuosa diluida de alcohol, preferentemente isotónica con los fluidos corporales mediante la adición de sales, tales como el cloruro de sodio. Los aditivos opcionales incluyen conservantes, especialmente si la fórmula no es preparada estéril, y pueden incluir hidroxi -benzoato de metilo, antioxidantes, agentes saborizantes , aceites volátiles, agentes tampones y surfactantes .

Las formulaciones apropiadas para administración por insuflación incluyen polvos finamente pulverizados que pueden administrase por medio de un insuflador o tomados en la cavidad nasal en la manera de un rapé. En el insuflador, el polvo está contenido en cápsulas o cartuchos, típicamente hechos de gelatina o plástico, los cuales son o bien perforados o abiertos in situ y el polvo se emite por el aire que pasa por el dispositivo luego de la inhalación, o por medio de una bomba de accionamiento manual. El polvo empleado en el insuflador consiste, ya bien únicamente del ingrediente activo o de una mezcla en polvo que contiene el ingrediente activo, un diluyente en polvo adecuado, tal como la lactosa, y un surfactante opcional. El ingrediente activo típicamente comprende de 0.1 a 100 p/p de la formulación.

Además de los ingredientes específicamente mencionados anteriormente, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes conocidos por los expertos en la materia, teniendo en cuenta el tipo de formulación de que se trata. Por ejemplo, las formulaciones apropiadas para la administración oral pueden incluir agentes saborizantes y las formulaciones apropiadas para la administración intranasal puede incluir perfumes .

Las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar por cualquier método convencional disponible para su uso en combinación con fármacos, ya sea como agentes terapéuticos individuales o en una combinación de agentes terapéuticos .

La dosificación administrada, por supuesto, variará dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente en particular y su modo y ruta de administración, la edad, salud y peso del receptor, la naturaleza y la ampliación de los síntomas, el tipo de tratamiento concomitante, la frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Una dosis diaria del ingrediente activo se puede esperar que sea de aproximadamente 0.001 a 1.000 miligramos (mg) por kilogramo (kg) de peso corporal, siendo la dosis preferida de 0.1 a 30 mg/kg.

Las formas de dosificación (composiciones apropiadas para la administración) contienen aproximadamente de 1 mg a 500 mg del ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo normalmente estará presente en una cantidad aproximadamente de 0.5 a 95% en peso con respecto al peso total de la composición.

Los ungüentos, pastas, espumas, oclusiones, cremas y geles también pueden contener excipientes tales como almidón, tragacanto, celulosa, siliconas, bentonitas y talco, o mezclas de éstos. Los polvos y los aerosoles también pueden contener excipientes tales como lactosa, talco, ácido de sílice, hidróxido de aluminio, y silicatos de calcio, o mezclas de estas sustancias. Las soluciones de metales antimicrobianos nanocristalinos se pueden convertir en aerosoles o atomizadores por cualquiera de los medios conocidos habitualmente usados para la fabricación de fármacos en aerosol. En general, dichos métodos comprenden presurizar o proporcionar un medio para presurizar un contenedor de la solución, usualmente con un gas vehículo inerte, y pasar el gas presurizado a través de un pequeño orificio. Los aerosoles pueden contener adicionalmente propulsores habituales, tales como nitrógeno, dióxido de carbono y otros gases inertes. Además, las microesferas o nanopartículas se pueden emplear con las composiciones terapéuticas enriquecidas con gas o los fluidos de la presente invención, en cualquiera de las rutas requeridas para administrar los compuestos terapéuticos a un sujeto.

Las formulaciones de uso como inyección, se pueden presentar en contenedores sellados de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en una condición de secado por congelación (liofilizados) , lo que requiere solamente la adición del excipiente líquido estéril, o del fluido enriquecido con gas, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles. Los requerimientos para los vehículos farmacéuticos efectivos para las composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la materia. Ver, por ejemplo, Pharmaceutics y Pharmacy Practice, J. b. Lippincott Co . , Philadelfia, Pa, Banker and Chalmers, Eds . , 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ta ed. , 622- 630 (1986).

Las formulaciones apropiadas para la administración tópica incluyen grageas que comprenden un fluido enriquecido con gas de la invención y, opcionalmente , un agente terapéutico y un sabor adicional, usualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden un fluido enriquecido con gas y opcionalmente agente terapéutico adicional en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia, y lavados bucales o enjuagues orales que comprenden un fluido enriquecido con gas y opcionalmente un agente terapéutico adicional en un vehículo líquido adecuado, así como cremas, emulsiones, geles, y similares.

Adicionalmente , las formulaciones apropiadas para la administración rectal pueden presentarse como supositorios, mezclando con una variedad de bases tales como las bases emulsionantes o las bases solubles en agua. Las formulaciones apropiadas para la administración vaginal se pueden presentar como óvulos, tampones, cremas, geles, pastas, espumas, aerosoles o fórmulas que contienen, además del ingrediente activo, tales vehículos como es conocido en la técnica apropiada .

Los vehículos farmacéuticos apropiados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, un texto de referencia estándar en este campo.

La dosis administrada a un sujeto, especialmente a un animal, especialmente a un ser humano, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica en el animal durante un período de tiempo razonable. Un experto en la materia reconocerá que la dosis dependerá de una variedad de factores que incluyen la condición del animal, el peso corporal del animal, así como la afección que se está tratando. Una dosis apropiada es aquella que resultará en una concentración de la composición terapéutica en un sujeto que se sabe que afecta la respuesta deseada .

El tamaño de la dosis también se determinará por la ruta, el tiempo y la frecuencia de administración, así como la existencia, naturaleza y la ampliación de los efectos secundarios adversos que podrían acompañar a la administración de la composición terapéutica y el efecto fisiológico deseado.

Se apreciará que los compuestos de la combinación se pueden administrar: (1) simultáneamente mediante la combinación de los compuestos en una co- formulación o (2) mediante la alternancia, es decir, la administración de los compuestos en serie, de forma secuencial, en paralelo o simultáneamente en formulaciones farmacéuticas separadas. En la terapia de alternancia, el retraso en la administración del segundo, y, opcionalmente, un tercer ingrediente activo, no debe ser tal que se pierda el beneficio de un efecto sinérgico terapéutico de la combinación de los ingredientes activos . De acuerdo a ciertas modalidades de cualquiera de los métodos de administración (1) o (2) , lo ideal sería que la combinación se administrara para lograr los resultados más eficaces. En ciertas modalidades mediante cualquiera de los métodos de administración (1) o (2) , lo ideal sería la que la combinación se administrara para alcanzar concentraciones plasmáticas máximas de cada uno de los ingredientes activos. Un régimen de una pildora una vez por día, mediante la administración de una combinación de co- formulación puede ser factible para algunos pacientes que sufren de enfermedades neurodegenerativas inflamatorias. De acuerdo a ciertas modalidades, las concentraciones plasmáticas máximas efectivas de los ingredientes activos de la combinación estarán en el rango de aproximadamente 0.001 a 100 mM. Las concentraciones plasmáticas máximas óptimas se pueden alcanzar mediante una formulación y un régimen de dosificación prescrito para un paciente en particular. También se entenderá que los fluidos de la invención y un esteroide glucocorticoide (por ejemplo, la budesonida) o los derivados fisiológicamente funcionales de cualquiera de ellos, ya sean presentados simultáneamente o secuencialmente , se pueden administrar de forma individual, agrupados, o en cualquier combinación de estas formas de administración. En general, durante la terapia con alternancia (2) , una dosificación efectiva de cada compuesto se administra en serie, en la cual, en la terapia de co- formulación (1) , las dosificaciones efectivas de dos o más compuestos se administran de forma conjunta.

Las combinaciones de la invención se pueden presentar convenientemente como una formulación farmacéutica en forma de dosificación unitaria. Una formulación de dosificación unitaria conveniente contiene los ingredientes activos en cualquier cantidad desde 1 mg hasta 1 g de cada uno, por ejemplo, pero no limitado a, 10 mg a 300 mg . Los efectos sinérgicos de los fluidos de la invención en combinación con, por ejemplo, un esteroide glucocorticoide (por ejemplo, budesonida) se pueden observar en una amplia relación, por ejemplo, desde 1:50 hasta 50:1 (fluido inventivo: un esteroide glucocorticoide (por ejemplo, la budesonida) ) . En una modalidad, la relación puede variar desde 1:10 hasta 10:1. En otra modalidad, la relación en peso/peso del fluido de la invención con respecto a un esteroide glucocorticoide (por ejemplo, budesonida) en una forma de dosificación de combinación co- formulada, tal como una pildora, comprimido, tableta o cápsula, será de aproximadamente 1, es decir, una cantidad aproximadamente igual del fluido inventivo y un esteroide glucocorticoide (por ejemplo, budesonida). En otras co- formulaciones ejemplares, puede haber más o menos fluido inventivo y un esteroide glucocorticoide (por ejemplo, budesonida) . En una modalidad, cada compuesto se empleará en la combinación en una cantidad a la cual éste exhibe actividad antiinflamatoria cuando se usa solo. Otras relaciones y cantidades de los compuestos de dichas combinaciones se contemplan dentro del alcance de la invención .

Una forma de dosificación unitaria puede comprender además el fluido inventivo y, por ejemplo, un esteroide glucocorticoide (por ejemplo, budesonida) , o derivados funcionales fisiológicamente de cualquiera de ellos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Será apreciado por los expertos en la materia que la cantidad de ingredientes activos en las combinaciones de la invención requerida para el uso en el tratamiento, variará de acuerdo a una variedad de factores, incluyendo la naturaleza de la afección a tratarse y la edad y estado del paciente, y en última instancia será a discreción del médico o profesional de la salud que esté tratando. Los factores a considerar incluyen la ruta de administración y la naturaleza de la formulación, el peso corporal del animal, la edad y estado general y la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratarse .

También es posible combinar cualquiera de dos de los ingredientes activos en una forma de dosificación unitaria para la administración simultánea o secuencial con un tercer ingrediente activo. La combinación de tres partes se puede administrar simultáneamente o secuencialmente . Cuando se administra secuencialmente, la combinación se puede administrar en dos o tres administraciones . De acuerdo a ciertas modalidades, la combinación de tres partes del fluido inventivo y un esteroide glucocorticoide (por ejemplo, budesonida) se puede administrar en cualquier orden.

De acuerdo con aspectos particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención, tienen una utilidad sustancial para el tratamiento de afecciones mediada por MMP-9, que incluyen pero no se limitan al género ejemplar de las indicaciones aquí divulgadas . De acuerdo con otros aspectos, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad para el tratamiento de varios subgéneros del género ejemplar, donde al menos una indicación del género se excluye de cada uno de los subgéneros.

Ejemplo 1 (Se demostraron los efectos sinérgicos de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención y el albuterol) Información general. Los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención proporcionaron efectos sinérgicos prolongados (por ejemplo, la supresión de la broncoconstricción) con albuterol in vivo en un modelo animal reconocido en el estado de la técnica de la broncoconstricción en humanos (modelo de asma en humanos) ) y por lo tanto permite una disminución en el uso del albuterol en un paciente. Los resultados descritos en este Ejemplo también se divulgan en el documento de los solicitantes WO 2009/055729.

Primer experimento. En un primer experimento, dieciséis cobayos se evaluaron para los efectos de los broncodilatadores sobre la función de las vía respiratorias en relación con la broncoconstricción inducida por metacolina. Tras la determinación de la dosis óptima, cada animal se dosificó con 50 µ?/p?? para administrar la dosis objetivo de 12,5 µ? de sulfato de albuterol en 250 µ? por animal. El estudio fue un diseño completamente al azar bloqueado para los valores de peso y línea base de la Penh. Dos grupos (A y B) recibieron una instilación intratraqueal de 250 µ? de 50 µ?/p?? de sulfato de albuterol en uno o dos diluyentes: en el grupo A fue agua desionizada que había pasado por el dispositivo inventivo, sin la adición de oxígeno, mientras que el Grupo B fue el agua enriquecida con gas inventiva. Cada grupo se administró por vía intratraqueal con soluciones usando un Penn Century Microsprayer . Además, los animales se estratificaron en todas las unidades del pletismógrafo Buxco de manera que cada grupo de tratamiento esté igualmente representado dentro de la alimentación de los nebulizadores de los pletismógrafos y las unidades de grabación. Los animales que mostraron al menos el 75% de su valor de la Penh de referencia a las 2 horas posteriores a la administración del albuterol no se incluyeron en el análisis de los datos. Este criterio de exclusión se basa en estudios pasados en los cuales el fallo en observar broncoproteccion con los broncodilatadores puede estar asociado con errores de dosificación. Como resultado, uno de los animales del grupo control se descartó de los análisis de los datos. Una vez que el animal tuvo más del 50% de broncoconstriccion, el animal se consideró que no estaba protegido. Los resultados indican que el 50% de los animales del grupo B estuvieron protegidos de la broncoconstriccion a las 10 horas (momento en que la prueba se dio por concluida) .

Segundo experimento. Se realizó un conjunto adicional de experimentos usando un mayor número de animales para evaluar los efectos protectores de los fluidos generados electrocinéticamente de la invención (por ejemplo, RDC1676-00, RDC1676-01, RDC1676-02 y RDC1676-03) en contra de la broncoconstriccion inducida por metacolina, cuando se administran solos o como diluyentes para el sulfato de albuterol en cobayos machos .

Materiales y métodos. Cobayos (Cavia porcellus) fueron Hartley albinos, Crl:(HA)BR provenientes de Charles River Canadá Inc. (St. Constant, Quebec, Canadá). Peso: Aproximadamente 325 ± 50 g al inicio del tratamiento, el número de grupos fue de 32, con 7 machos por grupo (más 24 adicionales provenientes del mismo lote de animales). Dieta: todos los animales tuvieron libre acceso a una dieta de laboratorio comercial granulada certificada estándar (PMI Certified Guinea Pig 5026, PMI Nutrition International Inc.), excepto durante los procedimientos designados. La ruta de administración fue la instilación intratraqueal a través de un Penn Century Microsprayer y el reto con metacolina a través de la inhalación de todo el cuerpo. La ruta intratraqueal se seleccionó para maximizar la exposición del pulmón al artículo de prueba/solución control. El reto de la inhalación de todo el cuerpo se ha seleccionado para el reto con metacolina con el objetivo de provocar una respuesta de hipersensibilidad de las vías respiratorias superiores (es decir, broncoconstricción) . La duración del tratamiento fue de un día.

Diseño experimental. Todos los animales se sometieron a la exposición por inhalación de metacolina (500 µ? /mi) , 2 horas después de la administración de TA/control. Todos los animales recibieron un volumen de dosis de 250 µ?. Por lo tanto, el sulfato de albuterol se diluyó (en el artículo de control y los 4 artículos de prueba) a concentraciones de 0, 25, 50 y 100 µq/ml. Treinta minutos antes de la administración, las soluciones de sulfato de albuterol de las 4 concentraciones diferentes (0, 25, 50 y 100 se conformaron en una solución madre lOx (500 pg/ml) en cada una de estas cuatro soluciones de los artículos de prueba (RDC1676-00, RDC1676-01, RDC1676-02, y RDC1676-03) . Estas concentraciones de sulfato de albuterol también se conformaron en los fluidos controles generados no electrocinéticamente (control 1) . Las soluciones de dosificación se prepararon mediante la dilución adecuada de cada solución madre. Todas las soluciones madres y de dosificación se mantuvieron en hielo una vez preparadas. La dosificación se completó dentro de una hora después que se prepararon los artículos de prueba/control . Una solución de metacolina (500 se preparó el mismo día de la dosificación.

Cada animal recibió una instilación intratraqueal del artículo de prueba o del control con un Penn Century Microsprayer . Los animales se privaron de alimentos durante la noche y se anestesiaron usando isoflurano, la laringe se visualizó con la ayuda de un laringoscopio (o la alternativa adecuada) y la punta del microsprayer se insertó en la tráquea. Se administró un volumen de dosis de 250 µ?/animal del artículo de prueba o del control. El aerosol de metacolina se generó en la entrada de aire de una cámara de mezcla usando nebulizadores ultrasónicos Aeroneb, suministrados con el aire proveniente de una bomba de flujo polarizado Buxco . Esta cámara de mezcla, a su vez alimenta cuatro pletismógrafos individuales sin límites de todo el cuerpo, cada uno operado bajo una ligera presión negativa mantenida por medio de una válvula de compuerta situada en el conducto de escape. Una bomba de vacío se utilizó para agotar la cámara de inhalación a la velocidad de flujo requerida.

Antes del comienzo de la fase principal del estudio, 12 animales adicionales se asignaron a los tres grupos (n=4/grupo) para determinar el período de exposición máximo al cual los animales pueden estar expuestos a la metacolina para provocar una broncoconstriccion aguda, grave pero no mortal. Cuatro animales se expusieron a la metacolina (500 pg/ml) durante 30 segundos y se realizaron mediciones de los parámetros respiratorios hasta 10 minutos después del comienzo del aerosol. La concentración del nebulizador de metacolina y/o el tiempo de exposición de la aerosolización se ajustó adecuadamente para inducir a una broncoconstriccion aguda/reversible, grave pero no mortal, que se caracteriza por un aumento transitorio en aflicciones.

Una vez antes de la administración del artículo de prueba (día -1) y de nuevo a las 2, 6, 10, 14, 18, 22 y 26 horas después de la dosis, los animales se colocaron en la cámara y los parámetros ventilatorios (volumen corriente, frecuencia respiratoria, ventilación pulmonar total) y la pausa incrementada Penh se midieron durante un período de 10 minutos usando el sistema Buxco Electronics BioSystem XA, siguiendo el comienzo del reto de aerosoles para la metacolina. Una vez que los animales se encontraron dentro de la línea base de las cámaras, los valores se registraron durante 1 minuto, tras lo cual los animales se expusieron a la metacolina durante 30 segundos, a la concentración del nebulizador de 500 µ?/ml, y se expusieron al aerosol durante 10 minutos adicionales durante los cuales los parámetros de ventilación en el tiempo se evaluaron de forma continua. La Penh se utilizó como indicador de la broncoconstricción; la Penh es un valor derivado obtenido a partir del flujo inspiratorio máximo, el flujo espiratorio máximo y el tiempo de espiración. Penh = (Flujo espiratorio máximo/Flujo inspiratorio máximo) * (tiempo espiratorio / tiempo para espirar el 65% del volumen espiratorio -1) .

Los animales que no mostraron una broncoconstricción aguda grave durante el reto con la predosis de metacolina se reemplazaron. Cualquier animal que mostró al menos el 75% de su valor PenhPenes de la línea base a las 2 horas posteriores a la dosis, no se incluyeron en el análisis de los datos. Los parámetros respiratorios se registraron como los promedios de 20 segundos. Los datos considerados como no fisiológicos se excluyeron del análisis posterior. Los cambios en la Penh se trazaron durante un período de 15 minutos y el valor de la Penh se expresó como el área bajo la curva. Los datos numéricos se sometieron al cálculo de los valores promedios del grupo y de las desviaciones estándares (según corresponda) .

Resultados . Los resultados de este experimento mostraron que, en ausencia del albuterol, la administración de los fluidos generados electrocinéticamente de la invención no tuvo ningún efecto aparente sobre por ciento promedio de los valores de la Penh de la línea base, cuando se midieron durante un período de 26 horas. Sorprendentemente, sin embargo, la administración de albuterol (se muestran datos representativos para los grupos de 25 yg de albuterol/animal) formulado en los fluidos electrocinéticamente generados de la invención (en todos los niveles de valores de oxígeno ensayados; ambiente, 20 ppm, 40 ppm y 60 ppm) resultó en un prolongación notable de los efectos anti-broncoconstrictivos del albuterol, en comparación con el fluido del control. Es decir, los resultados de la metacolina mostraron una prolongación de la broncodilatación del albuterol de al menos 26 horas. Los solicitantes también demostraron que existían diferencias consistentes en todos los niveles de oxígeno entre RDC1676 y el control de solución salina normal. Combinando todos los 4 fluidos RDC1676, el valor de p para la diferencia de tratamiento en general a partir de la solución salina normal fue de 0.03.

De acuerdo con aspectos particulares, por lo tanto, las soluciones generadas electrocinéticamente de la invención proporcionan efectos de prolongación sinérgica con albuterol, conllevado así a una disminución en el uso del albuterol de un paciente, lo que permite un uso del fármaco costo-efectivo más eficiente, menos efectos secundarios, e incrementa el período durante el cual un paciente puede tratarse y responder al tratamiento con albuterol .

Ejemplo 2 (Se determinaron los efectos de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención en la expresión de ci tocinas) Información general. Los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención disminuyeron la producción de las citocinas pro- inflamatorias (IL-?ß, TNF- , IL-6, y GM-CSF) , las quimiocinas (IL-8, MIP-la, RANTES y eotaxina) , las enzimas inflamatorias (iNOS, COX-2 y MMP-9) , las respuestas a los alérgenos (MHC de clase II, CD23, B7-1 y B7-2) y las citocinas Th2 (IL-4, IL-13 e IL-5) , en comparación con el fluido del control, e incrementaron las citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, ILlR- , TIMP) en comparación con el fluido del control. Los resultados descritos en este Ejemplo también se divulgan en el documento de los solicitantes WO 2009/055729.

En aspectos particulares, linfocitos mezclados humanos se estimularon con el antígeno T3 o PHA en el fluido enriquecido con oxígeno Revalesio, o en el fluido del control, y se evaluaron los cambios en la IL-?ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-17, eotaxina, IFN-?, GM-CSF, ???-?ß, MCP-1, G-CSF, FGFb, VEGF, TNF-a, RANTES, leptina, TNF-ß, TFG-ß, y NGF. Como se demostró, las citocinas pro- inflamatorias (IL-?ß, TNF-a, IL-6, y GM-CSF), las quimiocinas (IL-8, MIP-la, RANTES y eotaxina), las enzimas inflamatorias (iNOS, COX- 2 y MMP-9) , las respuestas a los alérgenos (MHC de clase II, CD23, B7-1 y B7-2) , y las citocinas Th2 (IL-4, IL-13 e IL-5) ensayadas se redujeron en el fluido de prueba en comparación el fluido del control. Por el contrario, las citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, ILlR-a, TIMP) ensayadas se incrementaron en el fluido de prueba en comparación el fluido del control.

Adicionalmente, los solicitantes usaron un sistema de modelo reconocido en el estado de a técnica que involucra la sensibilización a la ovoalbúmina, para evaluar las reacciones de hipersensibilidad alérgica. Los puntos finales estudiados fueron los componentes celulares y citológicos particulares de la reacción, así como las medidas serológicas de las proteínas y de LDH. Se realizó el análisis de las citocinas, incluyendo el análisis de eotaxina, IL-1A, IL-1B, KC, MCP-1, MCP-3, MIP-1A, RANTES, TNF-A, y VCAM.

Brevemente, ratas machos Brown Norway se inyectaron por vía intraperitoneal con 0,5 mi de ovoalbúmina (OVA) Grado V (A5503-1G, Sigma) en solución (2,0 mg/ml) que contiene hidróxido de aluminio (Al(OH)3) (200 mg/ml) una vez cada uno de los días 1, 2 y 3. El estudio fue un ensayo aleatorizado con arreglo factorial 2 x 2 de tratamientos (4 grupos) . Después de un período de espera de dos semanas, para permitir que se produzca una reacción inmune, las ratas se expusieron o se trataron durante una semana, ya sea con RDC1676-00 (solución salina estéril procesada a través del dispositivo propietario Revalesio) , y RDC1676-01 (solución salina estéril procesada a través del dispositivo propietario Revalesio con oxígeno adicional añadido) . Al final de la semana 1 del tratamiento, una vez al día, los dos grupos se rompieron a la mitad y el 50% de las ratas de cada grupo recibió solución salina o el reto con OVA por inhalación.

Específicamente, catorce días después de la serialización inicial, 12 ratas se expusieron a RDC 1676-1600 por inhalación durante 30 minutos cada día durante 7 días consecutivos. La velocidad del flujo del aire a través del sistema se fijó en 10 litros/minuto. Un total de 12 ratas se alinearon en la cámara circular, con un único puerto para el material nebulizado para introducir y distribuir equitativamente a las 12 sub-cámaras del Aeroneb.

Quince días después de la sensibilización inicial, 12 ratas se expusieron a RDC 1676-1601 por nebulización ultrasónica durante 30 minutos cada día durante 7 días consecutivos. El flujo de aire también se fijó en 10 litros/minuto, con los mismos nebulizador y cámara. El RDC 1676-1600 se nebulizó primero y la cámara Aeroneb se secó completamente antes que el RDC 1676-1601 se nebulizara.

Aproximadamente dos horas después del último tratamiento de nebulización, 6 ratas del grupo de RDC 1676-1600 se retaron nuevamente con OVA (1% en solución salina) administrada mediante instilación intratraqueal usando un Penn Century Microsprayer (Modelo 1A-1B) . Las otras seis ratas del grupo de RDC 1676-00 se retaron con solución salina en el grupo de control, administrada mediante la instilación intratraqueal. Al día siguiente, se repitió el procedimiento con el grupo de RDC 1676-01.

Veinticuatro horas después del segundo reto, todas las ratas en cada grupo se sacrificaron por sobredosis con pentobarbital sódico. Las muestras de sangre completa se recolectaron de la vena cava inferior, y se colocaron en dos tubos de recolección de sangre diferentes: Qiagen PAXgene™ Blood R A Tube y Qiagen PAXgene™ Blood DNA Tube . Los órganos de los pulmones se procesaron para obtener un lavado broncoalveolar (BAL) del fluido y el tejido pulmonar para RT-PCR, para evaluar los cambios en los marcadores de la expresión de citocinas que se conoce que están asociadas con la inflamación pulmonar en este modelo. Una técnica de lavado unilateral se empleó con el objetivo de preservar la integridad de los cuatro lóbulos en el lado derecho del pulmón. El lóbulo "grande" izquierdo se lavó, mientras que los cuatro lóbulos derechos se amarraron e inmediatamente se colocaron en TRI-zol™, se homogeneizaron y se enviaron al laboratorio para su posterior procesamiento.

Análisis del BAL. El lavado del pulmón se colectó y se centrifugó durante 10 minutos a 4°C a 600-800 g para sedimentar las células. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos frescos y se congelaron a -80°C. El fluido del lavado bronquial ( "BAL" ) se separó en dos alícuotas . La primera alícuota se centrifugó y el sobrenadante se congeló rápidamente sobre hielo seco picado, se colocó a -80°C, y se envió al laboratorio para su posterior procesamiento. La cantidad de proteína y LDH presentes indican el nivel de proteína del suero de la sangre (la proteína es un componente del suero que se filtra a través de las membranas cuando se reta como en este experimento) y la muerte celular, respectivamente. El lado de la prueba registrada mostró ligeramente menos proteína que el del control .

La segunda alícuota del fluido del lavado bronquial se evaluó para el contenido total de proteínas y LDH, así como se sometió a un examen citológico. El grupo tratado mostró que las células totales eran mayores que las del grupo de control con solución salina. Además, hubo un aumento de los eosinófilos en el grupo tratado en comparación con el grupo de control . También hubo células polimorfonucleares ligeramente diferentes para las tratadas en comparación con el lado del control.

Análisis de la sangre. La sangre total se analizó mediante la transferencia de 1.2 a 2.0 mi de sangre en un tubo, y permitiéndole a esta coagularse durante al menos 30 minutos. La muestra de sangre restante (aproximadamente 3,5-5,0 mi) se guardó para la extracción del ARN usando TRI-zol™ o PAXgene™. A continuación, la muestra de sangre coagulada se centrifugó durante 10 minutos a 1200 g a temperatura ambiente El suero (sobrenadante) se retiró y se colocó en dos tubos frescos, y el suero se almacenó a -80°C.

Para la extracción del ARN utilizando Tri-Reagent (TB-126, Molecular Research Center, Inc.), 0.2 mi de sangre total o plasma se añadieron a 0.75 mi de Tri-Reagent BD suplementado con 20 µ? de 5N de ácido acético por 0.2 mi de sangre total o plasma. Los tubos se agitaron y se almacenaron a -80°C. Utilizando PAXgene™, los tubos se incubaron durante aproximadamente dos horas a temperatura ambiente . Los tubos entonces se colocaron en su lado y se almacenaron en el congelador a -20°C durante 24 horas, y luego se transfirieron a -80°C para el almacenamiento a largo plazo.

Análisis de Luminex. Mediante la plataforma Luminex, un análisis de microesferas se utilizó como sustrato para una reacción de unión de anticuerpos relacionados, el cual se lee en unidades de luminosidad y se puede comparar con los estándares cuantificados . Cada muestra de sangre se corrió como dos muestras concurrentemente. Las unidades de medida son unidades de luminosidad y los grupos se dividieron en los controles de los retados con OVA, los de tratamiento retados con OVA y los de tratamiento con el fluido propietario retados con solución salina.

Para la generación de los datos de la matriz génica de Agilent, el tejido pulmonar se aisló y se sumergió en Reactivo TRI (TR118, Molecular Research Center, Inc.) . En resumen, aproximadamente 1 mi de Reactivo TRI se añadió a 50-100 mg de tejido en cada tubo. Las muestras se homogeneizaron en Reactivo TRI, usando el homogeneizador glass-TefIon™ o Polytron™. Las muestras se almacenaron a -80°C.

Resultados provenientes de las muestras de sangre. Cada muestra de sangre se dividió en dos muestras y las muestras corrieron concurrentemente. Las unidades de medida son unidades de luminosidad y los grupos, yendo de izquierda a derecha son: controles retados con OVA, tratamiento con Revalesio retados con OVA; seguido por tratamiento con reto de solución salina, y tratamiento con Revalesio retados con solución salina. Para facilitar la revisión, ambos grupos RDC1676-01 se destacaron con fondos sombreados en gris, mientras que los grupos de tratamiento con solución salina de control tienen fondos no sombreados.

Generalmente, al comparar los dos grupos de la izquierda, en tanto que la dispersión de los datos del grupo RDC1676-01 es algo mayor, los niveles de citocinas particulares en el grupo RDC1676-01 como un todo son menores que en las muestras del grupo tratado de control, típicamente aproximadamente un 30% de diferencia numérica entre los 2 grupos. Generalmente, al comparar los dos grupos de más a la derecha, el grupo RDC1676-01 tiene un valor numérico ligeramente superior en comparación con el grupo RDC1676-00.

Los solicitantes determinaron que el nivel de RA TES (super familia de la IL-8) producida después del tratamiento con los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención fue menor que el producido por los grupos expuestos solamente a la solución salina. Los solicitantes demostraron que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención causaron que la MCP-1 se produjera a niveles inferiores en comparación a lo producido por los grupos expuestos solamente a la solución salina. Los solicitantes determinaron que el nivel de TNF alfa producido después del tratamiento con los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención fue menor que el producido por los grupos expuestos solamente a la solución salina.

Además, los solicitantes demostraron que el nivel de MIP-l alfa producida después del tratamiento con los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención fue menor que la producida por los grupos expuestos solamente a la solución salina. Los solicitantes demostraron que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención causaron que la IL-1 alfa se produjera a niveles inferiores en comparación a lo producido por los grupos expuestos solamente a la solución salina. Los solicitantes observaron que el nivel de Vcam producida después del tratamiento con los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención fue menor que el producido por los grupos expuestos solamente a la solución salina. Los solicitantes observaron que el nivel de IL-1 beta producida después del tratamiento con los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención fue menor que el producido por los grupos expuestos solamente a la solución salina. Los solicitantes demostraron que los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención causaron que la eotaxina y la MCP-3 se produjeran a niveles inferiores en comparación a los producidos por los grupos expuestos solamente a la solución salina.

En resumen, este ensayo estándar de reacción inflamatoria a una sensibilización conocida produjo, al menos en las muestras de sangre, una marcada afectación clínica y serológica. Adicionalmente , mientras que un número significativo de animales del control se estresaron fisiológicamente y casi murieron en el proceso, ninguno de los del grupo tratado con RDC1676-01 mostraron tales efectos de estrés clínico. Esto se reflejó luego en los niveles circulantes de citocinas, con aproximadamente un 30% de diferencias entre los grupos RDC1676-01 tratado y RDC1676-01 tratado en los grupos retados con OVA. En contraste, hubo pequeños y relativamente insignificantes cambios en los perfiles de citocinas, celulares y serológicos entre grupos RDC1676-01 tratado y RDC1676-01 tratado en los grupos no retados con OVA, lo que probablemente sólo representan cambios mínimos de la línea base del fluido por sí mismo.

Ejemplo 3 (Se determinaron efectos de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención en la modulación de la proliferación de las células T) Información general. Los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención mejoraron la función de las células T reguladoras, como se muestra por la proliferación relativamente reducida.¦ Los resultados descritos en este Ejemplo también se divulgan en el documento de los solicitantes WO 2009/055729.

La capacidad de las modalidades particulares divulgadas en la presente para regular las células T se estudió mediante la irradiación de las células presentadoras de antígenos, e introductoras de antígenos, y las células T. Típicamente, estas células T estimuladas proliferan. Sin embargo, tras la introducción de las células T reguladoras, la proliferación usual de las células T se suprime.

Métodos. En resumen, el anticuerpo anti-CD25 conjugado con FITC (ACT-1) usado en la clasificación, se compró a DakoCytomation (Chicago, IL) . Los otros anticuerpos usados fueron los siguientes: CD3 (HIT3a para condiciones solubles), GIT (conjugado con PE) , CD4 (Cy-5 y conjugado con FITC) , CD25 (conjugado con APC) , CD28 (clon CD28.2), CD127- APC, Granzima A (conjugada con PE) , FoxP3 (BioLegend) , IgGl de ratón (control de isotipo) , y los anticuerpos XCL1. Todos los anticuerpos se usaron según las instrucciones del fabricante .

Las células T CD4+ se aislaron a partir de la sangre total periférica con el Rosette Kit CD4+ (Stemcell Technologies) . Las células T CD4+ se incubaron con anticuerpos anti-CD127-APC, anti-CD25-PE y anti-CD4-FITC. Las células se clasificaron por citometría de flujo usando un FACS Aria en células T CD4+CD25hiCD1271o/nTreg y CD4+CD25-céluas T respondedoras.

Los ensayos de supresión se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pocilios de fondo redondeado. 3.75 x 103 células T respondedoras CD4+CD25neg, 3.75 x 103 reguladoras T autólogas, 3.75 x 104 CD3 -depletadas PBMC-alogénicas irradiadas se agregaron como se indica. Todos los pocilios se suplementaron con anti-CD3 (clon HIT3a a 5.0 ug/ml) . Las células T se cultivaron durante 7 días a 37°C en medio RP I 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%. Dieciséis horas antes del final de la incubación, se añadió 1.0 mCi de 3H-timidina a cada pocilio. Las placas se recolectaron usando el recolector de células Tomtec y se determinó la incorporación de 3H-timidina usando un contador de centelleo Perkin Elmer. La células presentadoras de antígenos (APC) , consistieron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) depletadas de células T usando StemSep human CD3+ T cell depletion (Stemcell Technologies) , seguido de 40 Gy de radiación.

Las células T reguladoras se estimularon con condiciones anti-CD3 y anti-CD28, y entonces se tiñeron con colorante de viabilidad Live/Red Dead (Invitrogen) y los marcadores de superficie CD4 , CD25 y CD127. Las células se fijaron en el buffer Lyze/Fix fosFlow™ y se permeabilizaron en Permbuffer IIi" desnaturalizante. Las células entonces se tiñeron con anticuerpos contra cada molécula particular seleccionada.

El análisis estadístico se realizó mediante el software GraphPad Prism. Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron usando la prueba t de Student de dos colas, no pareada. Las comparaciones entre los tres grupos se realizaron usando un A OVA de una vía. Los valores de p <0.05 se consideraron significativos (de dos colas). La correlación entre dos grupos se determinó que era estadísticamente significativa a través del coeficiente de Spearman si el valor de r era mayor que 0.7 o menor que -0.7 (de dos colas) .

Resultados . La proliferación de las células T reguladoras se estudió mediante la estimulación de las células con material particulado de gases de combustión (PM, de EPA) . Los solicitantes determinaron que las células estimuladas con PM (sin Rev, sin Solas) resultaron en una disminución de la IL-10 secretada, mientras que las células expuestas a PM en presencia de los fluidos de la presente divulgación ("PM + Rev") resultaron en una producción mantenida o ligeramente disminuida de IL-10 en relación a los controles de solución salina y medios (sin PM) . Además, la toxina de la difteria (DT390, una molécula de la toxina diftérica truncada; dilución 1:50 de la concentración comercial estándar) se tituló en las muestras de los fluidos de la invención, y bloqueó el efecto mediado por Rev del incremento en la IL-10. Debe notarse que el tratamiento con Rev sólo resultó en mayores niveles de IL-10 en relación con los controles de solución salina y medios. Resultados similares se obtuvieron con GITR, granzima A, XCL1, pStat5 y Foxp3 , respectivamente.

Los solicitantes también obtuvieron datos de AA PBMC, obtenidos a partir de un perfil de asma alérgica (AA) de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , evaluando la triptasa. Los datos de AA PBMC fueron consistentes con los datos anteriores de las células T reguladoras, puesto que las células que se estimularon con el material particulado (PM) mostraron altos niveles de triptasa, mientras que las células tratadas con el PM en presencia de los fluidos de la presente divulgación ("PM + Rev") dieron como resultado niveles de triptasa significativamente más bajos, similares a los de los controles de solución salina y medios. Consistente con los datos de las células T reguladoras, la exposición a DT390 bloqueó el efecto mediado por Rev sobre los niveles de triptasa, resultando en un nivel elevado de triptasa en las células, como se observó para el PM solamente (menos Rev, sin Rev, sin Solas) . El tratamiento con Rev solo resultó en niveles de triptasa inferiores en relación con los controles de solución salina y medios.

En resumen, los solicitantes observaron una disminución de la proliferación en presencia de PM y Rev en relación con el PM en el fluido del control (sin Rev, sin Solas) , lo que indica que el fluido generado electrocinéticamente inventivo Rev mejoró la función de las células T reguladoras, como se muestra por la proliferación relativamente reducida en el ensayo. Más aún, la evidencia indica que el bloqueo beta, el bloqueo GPCR y el bloqueo de los canales de Ca afecta la actividad de Rev en función de Treg.

Ejemplo 4 (Se determinaron los efectos sinérgicos entre los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención y la budesonida) Información general. Los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención proporcionaron efectos sinérgicos anti-inflamatorios con budesonida in vivo en un modelo animal reconocido en el estado de la técnica para el asma alérgica. Los resultados descritos en este Ejemplo también se divulgan en el documento de los solicitantes WO 2009/055729.

Los solicitantes inicialmente realizaron experimentos para evaluar las propiedades antiinflamatorias de las vías respiratorias de los fluidos electrocinéticamente generados de la invención (por ejemplo, RDC-1676-03) en un modelo de sensibilización de la ovoalbúmina en la rata Brown Norway. La rata Brown Norway es un modelo reconocido en el estado de la técnica para la determinación de los efectos de un material de prueba sobre la función de las vías respiratorias y esta cepa ha sido ampliamente usada, por ejemplo, como un modelo de asma alérgica. Los cambios bioquímicos y en la patología de las vía respiratoria inducidos por la sensibilización de la ovoalbúmina en este modelo se asemejan a las observados en el hombre (Elwood y otros, J Allergy Clin Inmuno 88:951-60, 1991; Sirois& y Bissonnette, Clin Exp Iw unol 126:9-15, 2001) . La vía por inhalación se seleccionó para maximizar la exposición del pulmón al material de prueba o a la solución del control. Los animales sensibilizados con ovoalbúmina se trataron con budesonida sola o en combinación con el material de prueba RDC 1676-1603 durante 7 días antes del reto con ovoalbúmina. 6 y 24 horas después del reto, el conteo de sangre total y los niveles de varias citocinas pro y anti- inflamatorias, así como varios parámetros respiratorios se midieron para estimar cualquier efecto beneficioso de la administración del material de prueba sobre varios parámetros inflamatorios.

Materiales y Métodos : Ratas Brown Norway de la cepa Bn/Crl se obtuvieron de Charles River Kingston, con un peso aproximado de 275+ 50 g al inicio del experimento. Todos los estudios de los animales se llevaron a cabo con la aprobación del PCS-MTL Institucional Animal Care and Use Committee. Durante el estudio, el uso y cuidado de los animales se realizaron de acuerdo con las directrices del USA National Research Council, así como del Canadian Council of Animal Care.

Sensibilización . El día 1 del experimento, los animales (14 animales en cada grupo de tratamiento) se sensibilizaron mediante la administración de una inyección intraperitoneal de 1 mi de una solución recién preparada de 2 mg ovoalbúmina/100 mg de hidróxido de aluminio por 1 mi de cloruro de sodio al 0.9%, seguido por la repetición de la inyección en el día 3.

Tratamiento. Quince días después de la sensibilización inicial, los animales se sometieron a la exposición nebulizada del control (solución salina normal) o las soluciones de prueba (fluidos generados electrocinéticamente RDC1676-00, RDC1676-02 y RDC-1676-03) , ya sean administrados solos o en combinación con budesonida, una vez al día durante 15 minutos por 7 días consecutivos . Los animales se dosificaron en una cámara de cuerpo entero de aproximadamente 201, y la atmósfera de prueba se generó en la entrada de aire de la cámara usando nebulizadores ultrasónicos Aeroneb, suministrados con el aire proveniente de una bomba de flujo polarizado Buxco. La velocidad del flujo del aire se fijó en 10 litros/min.

.Reto con ovoalbúmina . El día 21, dos horas después del tratamiento con las soluciones de prueba, todos los animales se inocularon con una solución nebulizada de ovoalbúmina al 1% durante 15 minutos (en una cámara de cuerpo entero al flujo de aire de 21/min) .

Toma de muestras. En los puntos de tiempo de 6 y 24 horas después del reto con ovoalbúmina, se tomaron muestras de sangre para el conteo total y diferencial de células sanguíneas, así como para medir los niveles de varias citocinas pro y anti- inflamatorias . Además, inmediatamente después, y a las 6 y 24 horas después del reto con ovoalbúmina, la pausa incrementada Penh y el volumen corriente se midieron durante un período de 10 minutos usando el sistema Buxco Electronics BioSystem XA.

Resultados : Conteo de eosinofilos : Según lo esperado, el tratamiento con budesonida ("NS + budesonida 750 g/Kg"; gráfico de barras densamente sombreado) redujo el conteo de eosinofilos totales en los animales retados en relación con el control de tratamiento con solución salina normal "NS" solamente. Adicionalmente , mientras que el tratamiento con el fluido inventivo "RDC1676 - 03 " por sí solo no redujo significativamente el conteo de eosinofilos, éste no obstante mostró una sinergia sustancial con budesonida en la reducción del conteo de eosinofilos ("RDC1676-03 + budesonida 750 g/kg) . Similarmente , el % de eosinofilos también reflejó una tendencia similar. Mientras que el RDC1676-03 o la budesonida 750 g/kg por sí solos no tuvieron un efecto significativo en el conteo del % de eosinofilos en los animales retados, los dos en combinación redujeron significativamente el % de eosinofilos.

Por lo tanto, los solicitantes determinaron, de acuerdo a aspectos particulares, que los fluidos electrocinéticamente generados de la invención (por ejemplo, RDC1676-03) tienen una utilidad sustancial, desde el punto de vista sinérgico, en combinación con la budesonida para reducir significativamente el conteo de eosinófilos ("% de eosinófilos" y conteo total) en un modelo de rata reconocido ¦ en el estado de la técnica para el asma alérgica humana.

Parámetros respiratorios : Los solicitantes también demostraron el efecto observado de los fluidos de prueba sobre la Penh y el volumen corriente inmediatamente medidos, a las 6 y 24 horas después del reto con ovoalbúmina. La Penh es un valor derivado obtenido a partir del flujo inspiratorio máximo, el flujo espiratorio máximo y el tiempo de espiración, y el descenso del valor de la Penh refleja un resultado favorable para la función pulmonar .

Penh = (flujo espiratorio máximo/ flujo inspiratorio máximo) * (tiempo espiratorio/tiempo para espirar el 65% el volumen espiratorio - 1) .

El tratamiento con budesonida (tanto a 500 como a 750 ug/kg) solo o en combinación con cualquiera de los fluidos de prueba, no afectó significativamente los valores de la Penh inmediatamente después del reto. Sin embargo, seis horas después del reto, los animales tratados con RDC1676-03 solo o en combinación con budesonida a 500 ó 750 ug/kg, demostraron una caída significativa en los valores de la Penh. Aunque la magnitud de esta caída fue menor a las 24 horas después del reto, la tendencia de un efecto sinérgico del fluido RDC y la budesonida se observó aún en este punto de tiempo.

El volumen corriente es el volumen de aire en los pulmones durante la inspiración con respecto a la posición espiratoria final, el cual deja a los pulmones pasivamente durante la espiración en el curso de la respiración tranquila. Los animales tratados con budesonida sola no mostraron cambios en el volumen corriente inmediatamente después del reto. Sin embargo, el RDC1676-03 solo tuvo un efecto significativo estimulante sobre el volumen corriente, incluso en este punto de tiempo temprano. Y de nuevo, RDC1676-03 en combinación con budesonida (ambos a 500 y 750 ug/kg) tuvo un efecto aún más pronunciado en las mediciones del volumen corriente en este punto de tiempo. Seis horas después del reto, el RDC1676-03 fue suficiente para causar un aumento significativo en el volumen corriente y la adición de budesonida al régimen de tratamiento, ya sea sola o en combinación, no tuvo ningún efecto añadido sobre el volumen corriente. Cualquier efecto observado en estos dos puntos de tiempo anteriores, sin embargo, perdió por el punto de tiempo de las 24 horas .

En conjunto, estos datos demuestran que RDC1676-03, solo o en combinación con budesonida, proporciona un alivio significativo a la inflamación de las vías respiratorias como se evidencia por el aumento del volumen corriente y la disminución en los valores de la Penh a las 6 horas después del reto.

Análisis de las citocinas: Para analizar el mecanismo de los efectos observados en los parámetros fisiológicos previamente discutidos, se midieron un número de citocinas pro así como antiinflamatorias en muestras de sangre tomadas a las 6 y 24 después del reto, realizando las mediciones fisiológicas inmediatamente después .

Los solicitantes observaron que Rev 60 (o RDC1676-03) sola disminuyó significativamente el nivel de eotaxina en sangre, tanto a las 6 como a las 24 horas después del reto. La budesonida a 750 ug/kg también redujo los niveles de eotaxina en sangre en estos dos puntos de tiempo, mientras que la budesonida a 250 ug/kg solamente tuvo un efecto notable en el punto de tiempo posterior. Sin embargo, la solución de prueba Rev 60 sola mostró efectos que son significativamente más potentes (en la reducción de los niveles sanguíneos de eotaxina) que ambas concentraciones de budesonida, en ambos puntos de tiempo. La eotaxina es una pequeña quimiocina C-C conocida por acumularse en y atraer los eosinófilos a los pulmones de los asmáticos y otros tejidos en las reacciones alérgicas (por ejemplo, en el intestino en la enfermedad de Crohn) . La eotaxina se une a una proteína G acoplada al receptor CCR3. El CCR3 se expresa por un número de tipos de células como los linfocitos Th2, basófilos y mastocitos, pero la expresión de este receptor por los linfocitos Th2 es de particular interés ya que estas células regulan el reclutamiento de los eosinófilos. Varios estudios han demostrado una mayor producción de eotaxina y CCR3 en el pulmón del asmático, así como han establecido un vínculo entre estas moléculas y la hiperreactividad de las vías respiratorias (revisado en Eotaxin and the attraction of eosinophils to the asmatic lungs, Dolores M Conroy y Timothy J. Williams en Respiratory Research 2001, 2: 150-156) En conjunto, estos resultados indican fuertemente que el tratamiento con RDC1676-03 solo o en combinación con budesonida puede reducir significativamente el conteo de eosinófilos totales y el % en sangre 24 horas después del reto con ovoalbúmina. Esto se correlaciona con un descenso significativo en los niveles de eotaxina en la sangre observado a las 6 horas después del reto.

Los niveles en sangre de las dos citocinas anti-inflamatorias clave principales, la IL-10 y el interferón gamma, son también significativamente mayores a las 6 horas después de la exposición como resultado del tratamiento con Rev 60 sola o en combinación con budesonida. Los solicitantes observaron tales efectos sobre el interferón gamma y la IL-10, respectivamente. Rev 60 sola o Rev 60 en combinación con budesonida a 250 ug/kg aumentó significativamente el nivel en sangre de IL-10 en los animales retados hasta 6 horas después del reto. Similarmente , Rev 60 sola o en combinación con budesonida a 250 ug/kg o 750 ug/kg aumentó significativamente los niveles sanguíneos de IFN gamma a las 6 horas después del reto. El aumento de estas citocinas antiinflamatorias puede explicar bien, al menos en parte, los efectos beneficiosos observados en los parámetros fisiológicos respiratorios observados a las 6 horas posteriores al reto. El efecto sobre estas citocinas ya no se observó a las 24 horas después del reto (datos no mostrados) .

La Rantes o CCL5 es una citocina que se expresa por las células T circulantes y es quimiotáctica para las células T, los eosinófilos y los basófilos y tiene un papel activo en el reclutamiento de los leucocitos en los sitios de inflamación. Rantes también activa la liberación de los eosinófilos, por ejemplo, la proteína catiónica eosinofílica . Esta cambia la densidad de los eosinófilos y los hace hipodensos, lo cual se piensa que representa un estado de activación celular generalizado. También es un potente activador del metabolismo oxidativo específico para los eosinófilos.

Los solicitantes observaron que los niveles sistémicos de Rantes se redujeron de manera significativa a las 6 horas, pero no a las 24 horas después del reto en los animales tratados con Rev 60 sola o en combinación con budesonida a 250 ug/kg o 750 ug/kg. Una vez más, hubo un claro efecto sinérgico de la budesonida a 750 ug/kg y Rev 60. Una tendencia descendente similar se observó para una serie de otras citocinas pro-inflamatorias , tales como KC o IL8 , MCP3 , IL1B, GCSF, TGFb, así como NGF, observado tanto a las 6 o como a las 24 horas posteriores al reto, en los animales tratados con Rev 60 sola o en combinación con budesonida.

Ejemplo 5 (Se determinaron los efectos de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención sobre las uniones estrechas intercelulares) ) Información general. Los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención, mostraron que modulan las uniones estrechas intercelulares. Los resultados descritos en este Ejemplo también se divulgan en el documento de los solicitantes WO 2009/055729.

De acuerdo con aspectos particulares, los fluidos terapéuticos procesados por el difusor inventivo tienen una utilidad sustancial para modular las uniones estrechas intercelulares, incluyendo las relacionadas con la administración pulmonar y sistémica y la biodisponibilidad de los polipéptidos , incluyendo el polipéptido ejemplar calcitonina de salmón (sCT) .

Ejemplo general. La calcitonina de salmón (sCT) es un péptido de 32 aminoácidos con un peso molecular de 3.432 dalton. La administración pulmonar de la calcitonina se ha estudiado ampliamente en los sistemas modelos (por ejemplo, sistemas modelos en roedores, sistemas modelos en rata, etc.) para investigar los métodos para mejorar la administración de los fármacos a nivel pulmonar (por ejemplo, la administración de fármacos intratraqueal) . De acuerdo con aspectos ejemplares particulares, el fluido terapéutico procesado por el difusor inventivo tiene utilidad sustancial para modular (por ejemplo, incrementar) las uniones estrechas intercelulares, por ejemplo las asociadas con la administración pulmonar y sistémica y la biodisponibilidad de la sCT en un sistema modelo en rata.

Métodos : Administración de fármacos intratraqueal . Según modalidades particulares, la sCT se formuló en el fluido terapéutico inventivo y se administró a ratas usando un dispositivo de administración de fármacos intratraqueal. En ciertos aspectos, se usa un dispositivo Penn Century Micro-Sprayer diseñado para la administración de fármacos intratraqueal a roedores, lo que permite la buena administración al pulmón, pero como se aprecia en el estado de la técnica, con relativamente baja deposición alveolar, lo que resulta en una escasa biodisponibilidad sistémica de los péptidos. De acuerdo con aspectos particulares, este sistema de modelo reconocido en el estado de la técnica se usó para confirmar que el fluido terapéutico procesado por el difusor de la invención, tiene utilidad sustancial para modular (por ejemplo, incrementar) las uniones estrechas intercelulares, incluyendo las asociadas con la administración y la biodisponibilidad pulmonar y sistémica de los polipéptidos .

Grupos de animales y dosificación. En ciertos aspectos, las ratas son asignadas a uno de los 3 grupos (n = 6 por grupo) : a) solución salina estéril; b) solución básica sin enriquecimiento de 02 ("solución básica") , o c) fluido terapéutico procesado por el difusor inventivo ("solución enriquecida de la invención" ) . La solución basada enriquecida inventiva se forma, por ejemplo, mediante la infusión de oxígeno en la solución salina al 0.9%. Preferentemente, la solución básica comprende aproximadamente solución salina al 0.9%, para reducir al mínimo las posibilidades de ruptura hipo-osmótica de las células epiteliales. En ciertas modalidades, la sCT se reconstituye por separado en la solución básica y la solución basada enriquecida inventiva y las soluciones respectivas se administran a los respectivos grupos de animales mediante instilación intratraqueal dentro de 60 minutos (10 yg sCT en 200 µ? por animal) .

Ensayos. En aspectos particulares, se colectaron muestras de sangre (por ejemplo, 200 µ?) y se colocaron en tubos recubiertos con EDTA antes de la administración, y a los 5, 10, 20, 30, 60, 120 y 240 minutos después de la dosificación. El plasma se colecta y se almacena a = -70°C hasta que se analizó para la sCT mediante la técnica ELISA.

Para la generación de los datos de la matriz génica de Agilent, el tejido pulmonar se aisló y se sumergió en Reactivo TRI (TR118, Molecular Research Center, Inc.). En resumen, aproximadamente 1 mi de Reactivo TRI se añadió a 50-100 mg de tejido en cada tubo. Las muestras se homogeneizaron en Reactivo TRI, usando el homogenizador de vidrio-TefIon™ o Polytron™. Las muestras se almacenaron a -80°C.

Resultados : Incremento de las uniones estrechas . Los solicitantes observaron que RDC1676-01 (solución salina estéril procesada a través del dispositivo propietario de la presente con oxígeno adicional añadido; fluido generado electrocinéticamente enriquecido con gas (Rev) de la presente divulgación) , disminuyó la administración sistémica y la biodisponibilidad de la sCT. De acuerdo con aspectos particulares, la disminución sistémica de la administración resulta en la adsorción disminuida de sCT, muy probablemente como resultado del incremento de las uniones estrechas pulmonares. RDC1676-00 representa una solución salina estéril procesada de acuerdo con los métodos presentemente divulgados, pero sin oxigenación.

Adicionalmente , de acuerdo con aspectos particulares, las proteínas relacionadas con las uniones estrechas se regularon positivamente en el tejido pulmonar. Los solicitantes mostraron la regulación positiva de las moléculas de adhesión de las uniones JA 2 y 3, GJA1, 3, 4 y 5 (adherinas de las uniones) , OCLN (ocludina) , claudinas (por ejemplo, CLDN 3, 5, 7, 8, 9, 10), TJP1 (proteína de unión estrecha 1), respectivamente.

Ejemplo 6 ' (Se determinaron los efectos de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención sobre la conductancia de las células completas) Información general. Los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención disminuyeron la conductancia de las células completas, como se demostró mediante el análisis de fijación de membrana conducido en las células epiteliales bronquiales (BEC) . El análisis de fijación de membrana conducido sobre las células epiteliales bronquiales (BEC) perfundidas con el fluido alterado electrocinéticamente inventivo (RNS-60) reveló que la exposición a RNS-60 resultó en una disminución en la conductancia de las células completas. Además, la estimulación con un "cóctel" estimulante de cAMP, el cual aumentó dramáticamente la conductancia de las células completas, también aumentó la porción sensible a los fármacos de la conductancia de las células completas, la cual fue diez veces mayor que la observada en condiciones básales. Los resultados descritos en este Ejemplo también se divulgan en el documento de los solicitantes WO 2009/055729.

Los estudios de fijación de membrana se llevaron a cabo para confirmar adicionalmente la utilidad de los fluidos generados electrocinéticamente de la invención para modular la transducción de señales intracelulares mediante la modulación de al menos una de las estructuras de la membrana, el potencial de la membrana o la conductividad de la membrana, los receptores o las proteínas de la membrana, y los sistemas de mensajería celular dependientes de los canales de calcio y de los canales de iones .

Información general. Los solicitantes mostraron que la unión de la bradiquinina al receptor B2 fue dependiente de la concentración, y la afinidad de la unión se incrementó en el fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, Rev; el fluido generado electrocinéticamente enriquecido con gas) de la presente divulgación en comparación con la solución salina normal. Adicionalmente , los solicitantes mostraron en el contexto de las células T reguladoras estimuladas con material particulado (PM) , que hubo una disminución de la proliferación de las células T reguladoras en presencia de PM y Rev en relación a PM en el fluido del control (sin Rev, sin Solas) , lo que indica que el fluido generado electrocinéticamente inventivo Rev mejoró la función de las células T reguladoras, por ejemplo, como lo demuestra la proliferación relativamente disminuida en el ensayo. Más aún, la exposición a los fluidos de la invención resultó en una producción mantenida o ligeramente disminuida de la IL-10 en relación con los controles de solución salina y medios (sin PM) . Similarmente , en el contexto del asma alérgica (AA) los perfiles de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) estimuladas con material particulado (PM) , los datos mostraron que la exposición a los fluidos de la presente divulgación ("PM + Rev") resultaron en niveles significativamente menores de triptasa, similares a los de los controles de solución salina y medios. Adicionalmente , los efectos de la toxina diftérica (DT390) indican que el bloqueo beta, el bloqueo GPCR y el bloqueo de los canales de Ca afecta la actividad de los fluidos generados electrocinéticamente sobre la función de las Treg y las PBMC. Además, los solicitantes demostraron, de acuerdo con aspectos adicionales, luego de la exposición a los fluidos de la invención, que las proteínas relacionadas con las uniones estrechas se regularon positivamente en el tejido pulmonar. Los solicitantes mostraron la regulación positiva de las moléculas de adhesión de las uniones JAM 2 y 3, GJA1, 3,4 y 5 (adherinas de unión) , OCLN (ocludina) , claudinas (por ejemplo, CLDN 3, 5, 7, 8, 9, 10), TJP1 (proteína de unión estrecha 1), respectivamente. Los estudios de fijación de membrana se realizaron para investigar adicionalmente y confirmar dichas utilidades .

Materiales y Métodos: La línea epitelial bronquial Calu-3 se utilizó en los estudios de fijación de membrana. Las células epiteliales bronquiales Calu-3 (ATCC # HTB-55) se cultivaron en una mezcla 1:1 de medio DMEM y F12 de Ham que se suplemento con FBS al 10% sobre cubreobjetos de vidrio hasta el momento de los experimentos. En resumen, un dispositivo de fijación de voltaje en las células completas se utiliza para medir los efectos sobre las células Calu-3 expuestas a los fluidos electrocinéticamente generados de la invención (por ejemplo, RNS-60; solución salina normal electrocinéticamente tratada con 60 ppm de oxígeno disuelto, a veces referida como "fármaco" ) .

Las técnicas de fijación de membrana se utilizaron para evaluar los efectos del material de prueba (RNS-60) sobre la polaridad de la membrana de las células epiteliales y la actividad del canal de iones. Específicamente, la fijación de voltaje en las células completas se realizó en la línea epitelial bronquial Calu-3 en una solución de baño que consiste en: 135 mM de NaCl, 5 mM de KC1, 1.2 mM de CaC12, 0.8 mM de MgC12, y 10 mM de HEPES (pH ajustado a 7.4 con N-metil-D-glucamina) . Se midieron las corrientes b sales, después de lo cual el RNS-60 se perfusionó en las células.

Más específicamente, las pipetas de la membrana se extrajeron del vidrio de borosilicato (Garner Glass Co, Claremont, California) con un extractor vertical Narishige PB-7 de dos etapas y luego se pulieron al fuego a una resistencia entre 6-12 Mohms con un microforge Narishige MF-9 (Narishige Internacional USA, East Meadow, NY) . Las pipetas se llenaron con una solución intracelular que contenía (en mM) : 135 de KC1, 10 de NaCl, 5 de EGTA, 10 de Hepes, el pH se ajustado a 7.4 con NMDG (N-metil-D-glucamina) .

Las células Calu-3 cultivadas se colocaron en una cámara que contiene la siguiente solución extracelular (en mM) : 135 de NaCl, 5 de C1 , 1.2 de CaC12, 0.5 de MgC12 y 10 de HEPES (ácido libre), el pH se ajustó a 7.4 con NMDG.

Las células se observaron usando el objetivo 40X CID de un microscopio Olympus 1X71 (Olympus Inc., Tokio, Japón). Después que se estableció un sello de alta resistencia (gigaseal) unido a la célula, se aplicó una succión suave para irrumpir, y para lograr la configuración de célula completa. Inmediatamente después de la irrupción, a la célula se le aplicó una fijación de voltaje a -120, -60, -40 y 0 mV, y se estimuló con pasos de voltaje de ± 100 mV (500 ms/paso) . Después de colectar las corrientes de las células completas en la condición del control, la misma célula se perfundió a través de un baño con el fluido de prueba que comprende los mismos solutos extracelulares y el pH como para el fluido del control anterior, y las corrientes de las células completas a diferentes potenciales de explotación se registraron con los mismos protocolos.

Los datos electrofisiológicos se adquirieron con un amplificador Axon Patch 200B, de paso bajo filtrado a 10 kHz y digitalizados con 1400A Digidata (Axon Instruments, Union City, CA) . El software pCLAMP 10.0 (Axon Instruments) se utilizó para adquirir y analizar los datos. Las relaciones de la corriente ( I) -a-volta e (V) (conductancia de las células completas) se obtuvo mediante la representación gráfica del valor de la corriente real a aproximadamente 400 mseg en el paso, en comparación con el potencial de explotación (V) . La pendiente de la relación I/V es la conductancia de las células completas .

Fármacos y productos químicos. Siempre que se indica, las células se estimularon con un cóctel estimulador de cAMP con 8-Br-cAMP (500 mM) , IBMX (isobutil-l-metilxantina, 200 mM) y forskolina (10 mM) . El análogo del cAMP, 8-Br-cAMP (Sigma Chem. Co.) se usó a partir de una solución madre de 25 mM en H20. La forskolina (Sigma) y el IBMX (Sigma) se usaron a partir de una solución de DMSO que contiene tanto forskolina 10 mM y 200 mM de la solución madre de IBMX.

Resultados de la fijación de membrana: Los solicitantes determinaron las corrientes de las células completas bajo condiciones básales (sin cAMP) , con un protocolo escalonado desde cero mV con un potencial de explotación a +/-100 mV. Los trazados representativos (control, seguido por los trazados de las células completas, mientras que se perfunden con la solución de prueba) se realizaron sobre un promedio de n=12 células. Los trazados "delta" del compuesto, se obtuvieron mediante la sustracción de los valores promedios de la prueba, de aquellos bajo las condiciones del control. La conductancia de las células completas, obtenida a partir de las relaciones de corriente-a-voltaje, fue altamente lineal bajo ambas condiciones, y reflejó un modesto aunque significativo cambio en la conductancia, debido a las condiciones de la prueba. La contribución a la conductancia de las células completas, es decir, el componente inhibido por el fármaco (fluido generado electrocinéticamente inventivo) fue también lineal, y el potencial de regresión fue cercano a cero mV. Hubo una disminución en la conductancia de las células completas en condiciones de hiperpolarización.

Además, el solicitante determinó las corrientes de las células completas bajo condiciones básales, con un protocolo escalonado desde -40 mV de potencial de explotación hasta ± 100 mV. Los trazados representativos (control, seguido por los trazados de las células completas, mientras que se perfunden con la solución de prueba) se realizaron sobre un promedio de n=12 células. Los trazados "delta" de los compuestos se obtuvieron mediante la sustracción de los valores promedios de la prueba, de aquellos bajo las condiciones del control. La conductancia de las células completas, obtenida a partir de las relaciones de corriente-a-voltaje, fue altamente lineal bajo ambas condiciones, y reflejó un modesto aunque significativo cambio en la conductancia, debido a las condiciones de la prueba. La contribución a la conductancia de las células completas, es decir, el componente inhibido por el fármaco (fluido generado electrocinéticamente inventivo) fue también lineal, y el potencial de regresión fue cercano a cero mV. Los valores fueron compara ivamente similares a los obtenidos con el protocolo de mV cero.

Los solicitantes determinaron las corrientes de las células completas bajo condiciones básales, con un protocolo escalonado desde -60 mV con un potencial de + 100 mV. Los trazados representativos (control, seguido por los trazados de las células completas, mientras que se perfunden con la solución de prueba) se realizaron sobre un promedio de n=12 células. Los trazados "delta" del compuesto se obtuvieron mediante la sustracción de los valores promedios de la prueba, de aquellos bajo las condiciones del control. La conductancia de las células completas, obtenida a partir de las relaciones de corriente-a-voltaje, fue altamente lineal bajo ambas condiciones, y reflejó un menor aunque significativo cambio en la conductancia, debido a las condiciones de la prueba. La contribución a la conductancia de las células completas, es decir, el componente inhibido por el fármaco (fluido generado electrocinéticamente inventivo) es también lineal, y el potencial de regresión fue cercano a cero mV. Los valores fueron comparativamente similares a los obtenidos con el protocolo de mV cero.

Los solicitantes también determinaron las corrientes de las células completas bajo condiciones básales, con un protocolo escalonado desde -120 mV con un potencial de + 100 mV. Los trazados representativos (control, seguido por los trazados de las células completas, mientras que se perfunden con la solución de prueba) se realizaron sobre un promedio de n=12 células. Los trazados "delta" del compuesto se obtuvieron mediante la sustracción de los valores promedios de la prueba, de aquellos bajo las condiciones del control. La conductancia de las células completas, obtenida a partir de las relaciones de corriente-a-voltaje, fue altamente lineal bajo ambas condiciones, y reflejó un menor aunque significativo cambio en la conductancia, debido a las condiciones de la prueba. La contribución a la conductancia de las células completas, es decir, el componente inhibido por el fármaco (fluido generado electrocinéticamente de la invención) es también lineal, y el potencial de regresión fue cercano a cero mV. Los valores fueron comparativamente similares a los obtenidos con el protocolo de mV cero.

Además, los solicitantes determinaron las corrientes de las células completas bajo condiciones de estimulación con cAMP, obtenidas con los protocolos escalonados a partir de varios potenciales de explotación a ± 100 mV. Los trazos representativos son el promedio de n=5 células . Los trazados representativos (control, seguido por los trazados de las células completas después de la estimulación con cAMP, seguido de la perfusión con la solución que contiene el fármaco) se hicieron sobre un promedio de n=l2 células. Los trazados "delta" del compuesto (correspondientes a los protocolos de voltaje a cero mV, y a -40 mV) se obtuvieron mediante la sustracción de los valores promedio de la prueba en el fármaco + cAMP, de aquellos bajo las condiciones del control (cAMP solo) . La conductancia de las células completas obtenidas a partir de las relaciones corriente-a-voltaje, fue altamente lineal bajo todas las condiciones, y reflejó un cambio en la conductancia debido a las condiciones de la prueba.

Los solicitantes demostraron las corrientes de las células completas bajo condiciones de estimulación con cAMP, obtenidas con los protocolos escalonados a partir de varios potenciales explotación a + 100 mV. Los trazados representativos (control, seguido por los trazados de las células completas después de la estimulación con cAMP, seguido de la perfusión con la solución que contiene el fármaco) se hicieron en un promedio de n=5 células. Los trazados "delta" del compuesto (protocolos de voltaje a -60 mV y -120 mV) se obtuvieron mediante la sustracción de los valores promedio de la prueba en el fármaco + cAMP, de aquellos bajo las condiciones del control (cAMP solo) . La conductancia de las células completas, obtenida a partir de las relaciones corriente-a-voltaje, fue altamente lineal bajo todas las condiciones, y reflejó un cambio en la conductancia debido a las condiciones de la prueba.

Los solicitantes también demostraron el efecto del potencial de explotación sobre las corrientes activadas con cAMP . El efecto del fármaco (los fluidos electrocinéticamente generados de la invención; R S-60; solución salina normal electrocinéticamente tratada que comprende 60 ppm de oxígeno disuelto) sobre la conductancia de las células completas se observó bajo protocolos de voltajes diferentes (0, -40, -60, -120 mV de potenciales de explotación) . Bajo las condiciones básales, la corriente de las células sensibles al fármaco fue idéntica a todos los potenciales de explotación (contribución del voltaje insensible) . En las condiciones de activación por cAMP, sin embargo, las corrientes sensibles a los fármacos fueron muy superiores, y sensibles al protocolo del voltaje aplicado. Las relaciones corriente-a-voltaje son altamente no lineales. Esto se observó en las corrientes sustraídas, donde la contribución de de la conductancia de las células completas a cero mV se sustrajo adicionalmente para cada protocolo (n=5) .

.Resumen del ejemplo. De acuerdo con aspectos particulares, por lo tanto, los datos indican que hay un efecto moderado pero constante del fármaco (los fluidos generados electrocinéticamente de la invención; R S-60; solución salina normal electrocinéticamente tratada con 60 ppm de oxígeno disuelto) bajo las condiciones básales. Para incrementar el efecto del fármaco en la conductancia de las células completas, se llevaron a cabo también experimentos mediante la perfusión del fármaco después de la estimulación con un "cóctel" de cAMP estimulante, el cual aumentó dramáticamente la conductancia de las células completas. Curiosamente, este protocolo también incrementó la porción sensible a los fármacos de la conductancia de las células completas, la cual fue diez veces mayor que la observada en las condiciones básales. Además, en presencia de la estimulación con cAMP, el fármaco mostró diferentes efectos con respecto a los protocolos de voltajes varios, lo que indica que los fluidos generados electrocinéticamente afectan una contribución dependiente del voltaje de la conductancia de las células completas . También hubo una disminución en un componente lineal de la conductancia, lo que sugiere adicionalmente al menos una contribución del fármaco a la inhibición de otra vía (por ejemplo, el canal de iones, los canales de cationes dependientes del voltaje, etc.) En aspectos particulares, y sin apegarse al mecanismo, los datos de los solicitantes son consistentes con los fluidos electrocinéticamente generados de la invención (por ejemplo, RNS-60; solución salina normal electrocinéticamente tratada con 60 ppm de oxígeno disuelto) , produciendo un cambio ya sea sobre un(unos) canal(es), que está(n) bloqueado (s) o que se recupera (n) a partir de la membrana plasmática .

En conjunto con otros datos de los solicitantes, los aspectos particulares de la presente invención proporcionan composiciones y métodos para modular la transducción de señales intracelulares , incluida la modulación de al menos uno de la estructura de la membrana, el potencial de la membrana o la conductividad de la membrana, las proteínas de la membrana o los receptores, los canales de iones, y los sistemas de señalización celular dependientes de calcio, que comprenden el uso de las soluciones electrocinéticamente generadas de la invención para impartir cambios conformacionales y/o electroquímicos en las estructuras membranosas (por ejemplo, la membrana, y/o las proteínas de la membrana, los receptores y otros componentes) , que incluyen pero no se limitan a GPCR y/o proteínas g, y TSLP. De acuerdo a aspectos adicionales, estos efectos modulan la o. expresión génica, y pueden persistir, depender, por ejemplo, de la vida media de los componentes de la mensajería individual, etc.

Ejemplo 7 (Se determinaron los efectos de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención en la conductancia de las células completas) Información general. El análisis de fijación de membrana llevado a cabo en células Calu-3 perfundidas con los fluidos generados electrocinéticamente de la invención (RNS-60 y Solas) reveló que (i) la exposición a RNS-60 y Solas resultó en un aumento en la conductancia de las células completas, (ii) que la exposición de las células a RNS-60 produjo un aumento en la conductancia no lineal, evidente a los 15 minutos de los tiempos de incubación, y (iii) que la exposición de las células a RNS-60 produce un efecto de RNS-60 salina sobre los canales permeables al calcio. Los solicitantes realizaron estudios de fijación de membrana para confirmar adicionalmente las utilidades, como se describe en la presente, de los fluidos salinos generados electrocinéticamente de la invención (RNS-60 y Solas) , incluyendo la utilidad para modular las corrientes de las células completas. Dos series de experimentos se llevaron a cabo .

El resumen de los datos de la primera serie de experimentos indica que la conductancia de las células completas (relación corriente-a-voltaje) obtenida con la solución salina Solas es altamente lineal, tanto para ambos tiempos de incubación (15 min, 2 horas) , y para todos los protocolos de voltaje. Sin embargo, es evidente que la incubación mayor (2 horas) con Solas incrementó la conductancia de las células completas. La exposición de las células a RNS-60 produjo un aumento en la conductancia no lineal, como se muestra en las corrientes delta (sustracción Rev-Sol) , que sólo es evidente a los 15 minutos de tiempo de incubación. El efecto de RNS-60 en esta corriente no lineal desaparece, y es en cambio altamente lineal en el tiempo de incubación de dos horas. La contribución de la conductancia de las células completas no-lineal, como ya observó previamente, fue sensible al voltaje, aunque estuvo presente en todos los protocolos de voltaje.

El resumen de los datos de la segunda serie de experimentos indica que hay un efecto de RNS-60 salina sobre una corriente no lineal, que se hizo evidente en el alto nivel de calcio en la solución externa. La contribución de la conductancia de las células completas no lineal, aunque sensible al voltaje, estuvo presente en ambos protocolos de voltaje, e indica un efecto de RNS-60 salina sobre los canales permeables al calcio.

Primera serie de experimentos (aumento de la conductancia y activación de una conductancia regulada por el voltaje no-lineal) Métodos para la primera serie de experimentos. Ver arriba para los métodos generales de fijación de membrana. En la siguiente primera serie de experimentos, los estudios de fijación de membrana se llevaron a cabo para confirmar adicionalmente la utilidad de los fluidos salinos generados electrocinéticamente de la invención (RNS-60 y Solas) para modular las corrientes de las células completas, utilizando células Calu-3 bajo condiciones básales, con protocolos escalonados, ya sea con un potencial cero mV, -120 mV, ó -60mV.

La conductancia de las células completas en cada caso se obtuvo a partir de las relaciones corriente-a-voltaje obtenidas de las células incubadas ya sea durante 15 minutos o durante dos horas. En este estudio, los grupos se obtuvieron en un momento dado, ya sea para las soluciones salinas Solas o RNS-60. Los datos obtenidos se expresan como la media + SEM de la corriente de las células completas para 5-9 células.

Resultados. Las Figuras 3 A-C muestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de membrana que evaluaron los efectos del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, RNS-60 y Solas) sobre la polaridad de la membrana de las células epiteliales y la actividad de los canales de iones en dos puntos de tiempo (15 min (paneles de la izquierda) y 2 horas (paneles de la derecha) ) y en los protocolos de voltajes diferentes (A, escalonado desde cero mV; B, escalonado desde -60 mV, y C, escalonado desde -120 mV) . Los resultados indican que RNS-60 (círculos rellenos) tiene un mayor efecto sobre la conductancia de las células completas que Solas (círculos abiertos) . En el experimento se observaron resultados similares en los tres protocolos de voltaje y tanto en los puntos de tiempo de incubación de 15 minutos y dos horas .

Los gráficos de las Figuras 4 A-C muestran como resultado de la sustracción de los datos de la corriente de Solas de los datos de la corriente de R S-60 en los tres protocolos de voltaje ("corrientes Delta") (A, escalonado desde cero mV; B, escalonado desde -60 mV, y C, escalonado desde -120 mV) y de los dos puntos de tiempo (15 minutos (círculos abiertos) y 2 horas (círculos rellenos) ) . Estos datos indicaron que en el punto de tiempo de 15 minutos con RNS-60, hubo un componente dependiente del voltaje no lineal que está ausente en el punto de tiempo de 2 horas.

Como en experimentos previos, los datos con solución salina "normal" dieron una muy consistente e independiente del tiempo conductancia usada como una referencia. Los presentes resultados se obtuvieron comparando los grupos, ya sea con Solas o con RNS-60 salina, e indican que la exposición de las células Calu-3 a RNS-60 salina en condiciones básales (sin cAMP, o cualquier otro estímulo) , produce efectos dependientes del tiempo, consistente con la activación de una conductancia regulada con el voltaje a tiempos de incubación más cortos (15 min) . Este fenómeno no fue tan evidente en el punto de incubación de dos horas. Como se describe en cualquier otra parte de la presente, el componente lineal es más evidente cuando la conductancia se incrementa por la estimulación con el "cóctel" de cAMP. Sin embargo, el tiempo de incubación de dos horas mostró una mayor conductancia lineal, tanto para R S-60 como para la solución salina Solas, y en este caso, la RNS-60 salina duplicó la conductancia de las células completas, en comparación con Solas sola. Esta evidencia indica que al menos dos contribuciones a la conductancia de las células completas se ven afectadas por RNS-60 salina, a saber, la activación de una conductancia regulada por el voltaje no-lineal, y una conductancia lineal, que es más evidente a tiempos de incubación más largos.

Segunda serie de experimentos (efecto sobre los canales permeables al calcio) Métodos para la segunda serie de experimentos. Ver arriba para los métodos generales de fijación de membrana. En la siguiente segunda serie de experimentos, los estudios de fijación de membrana se llevaron a cabo para confirmar adicionalmente la utilidad de los fluidos salinos generados electrocinéticamente de la invención (RNS-60 y Solas) para modular las corrientes de las células completas, usando células Calu-3 bajo condiciones básales, con protocolos escalonados, ya sea desde potenciales de explotación de cero mV o desde -120 mV.

La conductancia de las células completas en cada caso se obtuvo de las relaciones corriente-a-voltaje obtenidas a partir de las células incubadas durante 15 min con solución salina. Para determinar si existe una contribución de los canales permeables al calcio a la conductancia de las células completas, y si esta parte de la conductancia de la célula completa se ve afectada por la incubación con RNS-60 salina, las células se parchearon en solución salina normal después del período de incubación (conlleva una solución externa alta de NaCl, mientras que la solución interna contiene alto KCl) . La solución salina externa entonces se reemplazó con una solución donde el NaCl, se sustituye por CsCl para determinar si hay un cambio en la conductancia mediante la sustitución del catión externo principal. Bajo estas condiciones, la misma célula se expuso entonces a las concentraciones crecientes de calcio, de modo que un paso de entrada del calcio se hace más evidente.

Resultados: Las figuras 5 A-D muestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de membrana que evaluaron los efectos del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, Solas (paneles A y B) y RNS-60 (paneles C y D) ) sobre la polaridad de la membrana celular del epitelio y la actividad de los canales de iones usando diferentes soluciones de sales externas y en los protocolos de voltaje diferentes (los paneles A y C muestran escalonado desde cero mV, mientras que los paneles B y D muestran escalonado desde -120 mV) . En estos experimentos se usó un punto de tiempo de 15 minutos. Para Solas (paneles A y B) los resultados indican que: 1) el uso de CsCl (símbolos cuadrados) en lugar de NaCl en la solución externa, incrementó la conductancia de las células completas con un comportamiento lineal en comparación con el control (símbolos diamantes) , y 2) el CaCl2 tanto a 20 mM de CaCl2 (símbolos circulares) como a 40 mM de CaCl2 (símbolos triangulares) aumentaron la conductancia de las células completas de una manera no-lineal. Para RNS-60 (paneles C y D) , los resultados indican que: 1) el uso de CsCl (símbolos cuadrados) en lugar de NaCl en la solución externa tuvo poco efecto en la conductancia de las células completas, en comparación con el control (símbolos diamantes) , y 2) el CaCl2 a 40 mM (símbolos triangulares) aumentó la conductancia de las células completas de una manera no-lineal.

Las Figuras 6 A-D muestran los gráficos resultantes de la sustracción de los datos de la corriente en CsCl (que se muestra en la Figura 5) de los datos de la corriente en 20 mM de CaCl2 (símbolos diamantes) y 40 mM de CaCl2 (símbolos cuadrados) de dos protocolos de voltaje (paneles A y C, escalonado desde cero mV; y B y D, escalonado desde -120 mV) de Solas (paneles A y B) y RNS-60 (paneles C y D) . Los resultados indican que tanto las soluciones Solas como RNS-60 activaron la conductancia de las células completas inducida por calcio de forma no lineal. El efecto fue mayor con RNS-60 (indicando una capacidad de respuesta a la dosificación) , y con RNS-60 sólo se incrementó a las concentraciones más altas de calcio. Más aún, la conductancia no lineal dependiente de calcio a la concentración más alta de calcio también se incrementó por el protocolo de voltaje.

Los datos de esta segunda serie de experimentos además indican un efecto de RNS-60 salina y Solas salina para los datos de la conductancia de las células completas obtenidos en células Calu-3. Los datos indican que la incubación durante 15 minutos con cualquier solución salina produce un efecto distinto en la conductancia de las células completas, lo que es más evidente con RNS-60 y cuando el calcio externo se incrementa, y además indica que RNS-60 salina incrementa un componente no lineal dependiente del calcio de la conductancia de las células completas .

La evidencia acumulada sugiere la activación por Revalesio salina de los canales de iones, lo cual contribuye de manera diferente a la conductancia celular basal .

En conjunto con otros datos de los solicitantes (por ejemplo, datos de los solicitantes distintos de los ejemplos prácticos) , aspectos particulares de la presente invención proporcionan composiciones y métodos para modular la transducción de señales intracelulares , incluyendo la modulación de al menos una de las estructuras de la membrana, el potencial de membrana o la conductividad de la membrana, las proteínas de la membrana o los receptores, los canales de iones, los componentes lipidíeos, o los componentes intracelulares que son intercambiables por la célula (por ejemplo, las vías de señalización, tales como los sistemas de señalización celular dependientes del calcio) , que comprenden el uso de las soluciones generadas electrocinéticamente de la invención para impartir cambios electroquímicos y/o conformacionales en las estructuras membranosas (por ejemplo, la membrana, y/o las proteínas de la membrana, los receptores u otros componentes de la membrana) , que incluye pero no se limita a GPCR y/o las proteínas g. De acuerdo a aspectos adicionales, estos efectos modulan la expresión génica, y pueden persistir, depender, por ejemplo, de la vida media de los componentes de la mensajería individual, etc.

Ejemplo 8 (Se investigaron los efectos de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención sobre la conductancia de las células completas, y se generó una curva dosis-respuesta) Información general. En este experimento, los solicitantes evaluaron el efecto de las diluciones del fluido electrocinéticamente alterado (por ejemplo, RNS-60) sobre la polaridad de la membrana de las células epiteliales y la actividad de los canales de iones.

Métodos. Ver arriba para los métodos generales de fijación de membrana. En el siguiente experimento, se llevaron a cabo estudios de fijación de membrana para confirmar adicionalmente la utilidad de los fluidos salinos electrocinéticamente generados de la invención (RNS-60) para modular las corrientes de las células completas . En particular, el experimento evaluó el efecto de las diluciones del fluido salino electrocinéticamente generado inventivo. Las soluciones se hicieron mediante la dilución del fluido salino generado electrocinéticamente inventivo en solución salina normal a concentraciones de: 100% (Rev) , 75% (3:4), 50% (1:1), 25% (4:3), y 0% (Sal).

Resultados . Las Figuras 7 A y B muestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de membrana que evaluaron los efectos del fluido generado electrocinéticamente diluido (por ejemplo, RNS-60) sobre la polaridad de la membrana de las células epiteliales y la actividad de los canales de iones. El panel A muestra los voltios con respecto a la corriente de la conductancia de las células completas para cada muestra diluida como se indica en el gráfico (Rev, 3:4, 1:1, 4:3, y Sal) . El panel B muestra la cantidad de dilución con respecto al cambio en la corriente comparando la dilución con solución salina normal. Los resultados indican que el mecanismo de acción de la solución RNS-60 se produce en una de forma de dosis respuesta lineal.

Ejemplo 9 (El tratamiento de las células epiteliales bronquiales primarias (BEC) con los fluidos generados electrocinéticamente de la invención, así como con el fluido de autoclave de control no electrocinético, resultó en la reducción de la expresión y/o actividad de dos proteínas clave en las reacciones inflamatorias de las vías respiratoria, MMP9 y TSLP) Información general. Los solicitantes han ahora demostrado (usando un biosensor Bio-Layer Interferometry, Octet Rapid Extended Detection (RED) ( forteBio™) ) , que en presencia de los fluidos generados electrocinéticamente (por ejemplo, Rev, fluido generado electrocinéticamente enriquecido con gas) de la presente divulgación en comparación con solución salina normal, la unión de la bradiquinina al receptor B2 fue dependiente de la concentración, y la afinidad de unión se incrementó. Además, en el contexto de las células T reguladoras estimuladas con material particulado de gases de combustión (PM, fuente comercial estándar) , los datos de los solicitantes mostraron una disminución de la proliferación de las células T reguladoras en presencia del PM y Rev relativa a PM en el fluido del control (sin Rev, sin Solas) , lo que indica que el fluido generado electrocinéticamente inventivo Rev mejoró la función de células T reguladoras, por ejemplo, como lo demuestra la proliferación relativamente reducida en el ensayo. Más aún, la exposición a los fluidos de la invención resultó en una producción mantenida o ligeramente disminuida de la IL-10 en relación con los controles de solución salina y medios (sin PM) . Similarmente , en el contexto del asma alérgica (AA) los perfiles de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) estimuladas con material particulado (PM) , los datos mostraron que la exposición a los fluidos de la presente divulgación ("PM + Rev") resultaron en niveles significativamente menores de triptasa, similares a los de los controles de solución salina y medios. Adicionalmente, la toxina de la difteria (DT390, una molécula de la toxina ' diftérica truncada; dilución 1:50 de la concentración comercial estándar) resultó en el bloqueo beta, el bloqueo GPCR y el bloqueo de los canales de Ca de los efectos de la actividad de los fluidos generados en electrocinéticamente sobre la función de Treg y PBMC. Además, los solicitantes han demostrado que luego de la exposición a los fluidos de la invención, las proteínas relacionadas con las uniones estrechas (por ejemplo, JAM, 2 y 3, GJA1, 3, 4 y 5 (adherinas de unión), OCLN (ocludina) , claudinas (por ejemplo, CLDN 3, 5, 7, 8, 9, 10), TJP1 (proteína 1 de unión estrecha)) se regularon positivamente en el tejido pulmonar. Además, como se muestra en los estudios de fijación de membrana, los fluidos generados electrocinéticamente de la invención (por ejemplo, R S-60) afectan la modulación de la conductancia de las células completas (por ejemplo, bajo condiciones hiperpolarizantes) en las Células Epiteliales Bronquiales (BEC, por ejemplo, Calu-3) , y de acuerdo a aspectos adicionales, la modulación de la conductancia de las células completas refleja la modulación de los canales de iones.

En este ejemplo, los solicitantes han ampliado estos descubrimientos conduciendo experimentos adicionales para medir los efectos de la producción de dos proteínas clave de la respuesta inflamatoria de las vías respiratorias. Específicamente, se ensayaron MMP9 y TSLP en células epiteliales bronquiales primarias (BEC) .

Materiales y Métodos : Las células epiteliales bronquiales primarias disponibles comercialmente (BEC) (HBEpC-c de Promocell, Alemania) se usaron en estos estudios. Aproximadamente 50.000 células se sembraron en cada pocilio de una placa de 12 pocilios hasta que llegaron a ~80% de confluencia. Las células se trataron durante 6 horas con solución salina normal, fluido de control Solas, fluido de autoclave de control no electrocinético, o fluido de prueba Revera 60 a una dilución de 1:10 (100 ul en 1 mi de medio de crecimiento epitelial de las vías respiratorias) , junto con material particulado de gases de combustión (DEP o PM) , antes de levantarlas para el análisis de FACS . Ambos anticuerpos para los receptores de MMP9 y TSLP se obtuvieron a partir de BD Biosciences y se usaron según las especificaciones del fabricante .

Resultados : En las Figuras 1 y 2, DEP representa las células expuestas al material particulado de gases de combustión (PM, de origen comercial estándar) solo, "NS" representa las células expuestas a una solución salina normal sola, "DEP + NS" representan las células tratadas con el material particulado en presencia de solución salina normal, "Revera 60" se refiere a las células expuestas solamente al material de ensayo, "DEP + Revera 60" se refiere a las células tratadas con material particulado en presencia del material de prueba Revera 60. Además, "Solas" y "DEP + Solas" representan las células expuestas al fluido de control Solas, solo o en combinación con el material particulado, respectivamente. "PP60" representa las células expuestas al fluido de autoclave de control no electrocinético, y " DEP + PP60" se refiere a las células tratadas con material particulado en presencia del fluido de autoclave de control no electrocinético (es decir, que tiene 60 ppm de oxígeno disuelto) .

La Figura 1 muestra que el material de ensayo Revera 60 reduce la expresión del receptor de TSLP inducida por DEP en las células epiteliales bronquiales (BEC) en aproximadamente un 90%. Solas resultó en una reducción del 55% en la expresión del receptor de TSLP inducida por DEP, mientras que solución salina normal no produjo el mismo nivel de reducción de la expresión del receptor de TSLP inducida por DEP (aproximadamente 20% de reducción) . Adicionalmente, el fluido de autoclave de control no electrocinético PP60 resultó en aproximadamente 50% de reducción en la expresión del receptor de TSLP inducida por DEP.

El efecto de las soluciones de la invención Revera 60, Solas, y también de PP60, en la reducción de la expresión del receptor de TSLP es un descubrimiento significativo en vista de los hallazgos recientes que muestran que TSLP juega un papel fundamental en la patobiología del asma alérgica y el bloqueo mediado por anticuerpos locales de la función del receptor de TSLP de la enfermedad alérgica aliviada (Liu, YJ, Thymic stromal linfopoietin : aster switch for allergic inflammation, J Exp Med 203:269-273, 2006, Al-Shami y otros, A role for TSLP in the development of inflammation in an asthma model, J Exp Med 202:829-839, 2005; y Shi y otros, Local blockade of TSLP alleviated allergic disease by regulating airway dendritic cells, Clin Immunol, 29 de agosto de 2008 (publicación electrónica antes de la impresión) ) .

Similarmente , la Figura 2 muestra el efecto de Revera 60, Solas, el fluido de autoclave de control no electrocinético (PP60) y la solución salina normal, en el incremento de la MMP-9 mediado por DEP. Específicamente, Revera 60 inhibió los niveles de MMP9 unida a la superficie celular inducidos por DEP en las células epiteliales bronquiales en aproximadamente un 80%, y Solas tuvo un efecto inhibidor de aproximadamente el 70%, mientras que la solución salina normal (NS) tuvo un efecto marginal de aproximadamente 20% de reducción. Adicionalmente, el fluido de autoclave de control no electrocinético PP60 resultó en la reducción de aproximadamente el 30% de los niveles de MMP9 unida a la superficie celular inducidos por DEP. La MMP-9 es una de las proteasas principales implicadas en la inflamación de las vías respiratorias y la remodelación bronquial en el asma. Recientemente, se ha demostrado que los niveles de MMP-9 se incrementaron significativamente en pacientes con asma estable, y aún más en pacientes con asma aguda, en comparación con sujetos sanos de control. La MMP-9 juega un papel crucial en la infiltración de las células inflamatorias de las vías aéreas y la inducción de la hiperreactividad de las vías respiratorias lo que indica que la MMP-9 pueden tener un papel importante en la inducción y el mantenimiento del asma (Vignola y otros, Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and cronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998; Hoshino y otros, Hoshino y otros, Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999; Simpson y otros, Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565,2005; Lee y otros, A murine model of toluene diisocianate- induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001; and Lee y otros, Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocianate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003 ; 111 : 1278-1284) .

De acuerdo a aspectos adicionales, por lo tanto, los fluidos generados electrocinéticamente de la invención tienen utilidad terapéutica sustancial para modular (por ejemplo, reducir) la expresión del receptor de TSLP y/o para inhibir la expresión y/o la actividad de la MMP-9, incluyendo, por ejemplo, para el tratamiento de la inflamación y el asma.

De acuerdo aún con los aspectos adicionales, el fluido de autoclave de control no electrocinético (es decir, que tiene 60 ppm de oxígeno disuelto) tiene utilidad terapéutica para la modulación (por ejemplo, la reducción) de la expresión del receptor TSLP y/o para la inhibición de la expresión y/o la actividad de MMP-9, incluyendo, por ejemplo, para el tratamiento de la inflamación y el asma. Sin apegarse al mecanismo, los datos colectivos de los solicitantes indican que la acción del fluido de autoclave de control no electrocinético en este sistema es mediada por un mecanismo que es distinto del de los fluidos generados electrocinéticamente de los solicitantes. Esto no es solamente porque los efectos son relativamente más pequeños, sino también porque el fluido de autoclave de control no electrocinético no ha mostrado actividad en otros ensayos donde se ha mostrado actividad con los fluidos generados electrocinéticamente de los solicitantes. Sin embargo, el descubrimiento de los solicitantes de la actividad divulgada en la presente del fluido de autoclave de control no electrocinético en este sistema, representa un nuevo uso para el fluido de autoclave en el contexto del asma y las afecciones relacionadas como se describe en la presente.

De acuerdo con aspectos particulares, por lo tanto, los métodos de la invención que comprenden la administración de los fluidos generados electrocinéticamente de los solicitantes que proporcionan la modulación (regulación negativa de la expresión y/o actividad de TSLP) son aplicables al tratamiento de al menos una enfermedad o afección seleccionada de las del grupo que son mediadas por TSLP las que consisten de trastornos del sistema inmune, inflamación alérgica, inflamación alérgica de las vías respiratorias, respuestas Th2 inflamatorias mediadas por DC, dermatitis atópica, eczema atópico, asma, enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y alergias a los alimentos, artritis inflamatoria, artritis reumatoide y psoriasis.

Los resultados divulgados en la presente son enteramente consistentes con el papel reconocido en el estado de la técnica de TSLP como un interruptor principal de la inflamación alérgica en la interfase de células DC epiteliales (Yong-Jun y otros, J. Exp. Med. , 203:269-273, 2006) , y son además consistentes con los fenotipos de los ratones que carecen de TSLPR (por ejemplo, no llegan a desarrollar asma en respuesta a antígenos inhalados; Zhou y otros, supra y Al-Shami y otros, J. Exp. Med., 202:829-839, 2005) , y con los resultados obtenidos a partir del pretratamiento con OVA-DC con anti-TSLPR (por ejemplo, resultando en una reducción significativa de los eosinófilos y la infiltración de linfocitos, así como en los niveles de IL-4 e IL-5) .

La materia divulgada presentemente además ilumina el papel que desempeña TSLPR en la enfermedad alérgica predispuesta por DC, y proporciona nuevas composiciones y métodos que comprenden la administración de los fluidos generados electrocinéticamente de los solicitantes.

Ejemplo 10 (Se determinaron los efectos de los fluidos electrocinéticos en la cicatrización de las lesiones) Los efectos de un fluido enriquecido con gas (enriquecido con oxígeno) se probaron en cuanto a la capacidad de los queratinocitos epidérmicos humanos cultivados para sellar una lesión. Los resultados descritos en este ejemplo también se divulgan en las solicitudes publicadas de los solicitantes US 2008/0139674 y O 2008/115290.

Los queratinocitos epidérmicos humanos se aislaron a partir de los prepucios de recién nacidos que se obtuvieron de circuncisiones de rutina y sin identificación. Los prepucios se lavaron dos veces en PBS y se incubaron con 2.4 U/ml de dispasa II con el objetivo de separar la dermis de la epidermis. La epidermis se incubó con 0.25% de tripsina/EDTA 1 mM, se neutralizó con inhibidor de tripsina de soja, se agitó, y se pasó a través de un tamiz de 70 um para separar las células. A continuación, la suspensión celular se centrifugó y se resuspendió en medio de cultivo celular (M154) suplementado con 0.07 mM de CaCl2, y suplementos de crecimiento de queratinocitos humanos (0.2% de hidrocortisona, 0.2 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico humano) y el cóctel de antibióticos de penicilina/estreptomicina, anfotericina . Las suspensiones celulares de queratinocitos se sembraron en placas de cultivo de 12 pocilios sin recubrimiento y el medio se reemplazó después de 24 horas, y cada 48 horas después de la siembra inicial.

Al llegar a la confluencia celular, se realizaron raspados lineales con la punta de una pipeta P1000 estéril, lo cual resultó en una lesión uniforme libre de células. Las monocapas se lavaron varias veces con PBS de Dulbecco con el objetivo de eliminar cualquier residuo celular. Las monocapas lesionadas se incubaron en los siguientes medios: i) medios de crecimiento completos (como se describe anteriormente en este ejemplo) , ii) medios de crecimiento completos diluidos 1:1 con una versión despojada de solución salina sin oxígeno (fluido de control que se procesó utilizando el dispositivo difusor divulgado, pero sin la adición de un gas) , y iii) medios de crecimiento completos diluidos 1:1 con solución salina enriquecida con oxígeno. Cada estudio se realizó por triplicado.

Antes de la incubación, los pozos se llenaron con los respectivos medios y se sellaron mediante la colocación de cubreobjetos de cristal de 25 x 25 mm en la parte superior de cada pocilio. A las 6, 12, 24 y 48 horas después de la lesión, se realizaron mediciones de oxígeno, y se le hicieron estudios de imágenes a los cultivos.

Resultados. Seis horas después de la lesión, los bordes de las lesiones en la solución salina y en los medios enriquecidos con gas fueron más confusos en los medios del control que en el medio procesado con el dispositivo difusor divulgado en la presente, pero sin la adición de un gas. Doce horas después de la lesión, los bordes de las lesiones en los tres medios aparecieron irregulares, con queratinocitos a lo largo de los bordes migrando hacia el centro de las lesiones. La cuantificación de la migración de los queratinocitos reveló aproximadamente el mismo nivel de migración de queratinocitos en la solución salina y en los medios enriquecidos con gas.

Ejemplo 11 (Se demostró el efecto de los fluidos electrocinéticos sobre la mejora de la cicatrización de las lesiones) Se realizó un estudio para determinar las características de la cicatrización mejorada de las lesiones que se expusieron a una solución salina enriquecida con oxígeno que se procesó de acuerdo con las modalidades descritas en la presente. En este experimento, se colocaron vendajes en las lesiones de las biopsias por escisión dérmica porcina. Los vendajes se empaparon en la solución salina enriquecida con oxígeno o un grupo control de vendajes se empapó en una solución salina que no fue enriquecida con oxígeno. Microscópicamente, se evaluaron varios factores mediante el estudio, los cuales incluyen: 1) epidermalización; 2) neovascularización; 3) diferenciación epidérmica; 4) migración de los mastocitos, y 5) mitosis. Los resultados descritos en este ejemplo también se divulgan en las solicitudes publicadas de los solicitantes US 2008/0139674 y O 2008/115290.

Resultados . Externamente, las lesiones parecieron cicatrizar a diferentes velocidades. Las lesiones tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno mostraron un incremento en la cicatrización de las lesiones en los días 4 al 11. Sin embargo, ambas lesiones parecieron cicatrizar completamente en aproximadamente el mismo tiempo. El estudio mostró que entre los días 3 y 11, la nueva epidermis de las lesiones tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno migró de dos a cuatro veces más rápido que la epidermis de las lesiones tratadas con la solución salina normal. El estudio también mostró que entre los días 15 y 22, la lesión tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno se diferenció a una velocidad más rápida que la evidenciada por la formación anterior de las capas epidérmicas más maduras. En todas las etapas, el engrosamiento que ocurre en la epidermis asociado con la cicatrización normal no ocurrió dentro de las lesiones tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno.

Sin apegarse a ninguna teoría en particular, se cree que la solución salina enriquecida con oxígeno puede aumentar el nivel de óxido nítrico (NO) dentro de las lesiones. El NO modula los factores de crecimiento, la deposición del colágeno, la inflamación, la migración de los mastocitos, el engrosamiento de la epidermis, y la neovascularización en la cicatrización de las lesiones. Además, el óxido nítrico se produce por una enzima inducible que es regulada por el oxígeno .

Así, mientras que no se desea apegarse a ninguna teoría en particular, el fluido enriquecido con gas inventivo puede estimular la producción de NO, lo cual está de acuerdo con el espectro de los efectos de cicatrización de las lesiones observado en estos experimentos .

La cicatrización de la epidermis de los cerdos experimentó la diferenciación temprana en el grupo de solución salina enriquecida con oxígeno en los días 15 a 22. En el caso de la migración de los mastocitos, también ocurrieron diferencias en la migración temprana y tardía para la solución enriquecida con oxígeno. Un resultado concluyente al nivel de la mitosis no se pudo determinar debido a la dificultad en la tinción.

Los resultados indicaron que la lesión tratada con la solución salina enriquecida con oxígeno mostró muchas más características de cicatrización que la lesión no tratada. Además, los resultados muestran una epidermis más diferenciada con más contorno epidérmico/dérmico normal.

Incorporación como referencia Todas las patentes anteriores de los Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de patentes de los Estados Unidos, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones no relacionadas con patentes mencionadas y referidas a esta especificación y/o recogidas en la Hoja de Datos de la Solicitud, se incorporan a la presente como referencia, en su totalidad.

Debe entenderse que las figuras y la descripción detallada en la presente deben considerarse en una manera más bien ilustrativa y no restrictiva, y no pretenderse que limitan la invención a las formas particulares y ejemplos divulgados. Por el contrario, la invención incluye cualquier de las modificaciones, cambios, reordenamientos, sustituciones, alternativas, elecciones de diseño, y modalidades evidentes para los expertos en la materia, sin apartarse del espíritu y el alcance de esta invención, como se define por las siguientes reivindicaciones. De esta manera, se pretende que las siguientes reivindicaciones se interpreten de manera que abarquen todas las modificaciones, cambios, reordenamientos, sustituciones, alternativas, elecciones de diseño, y modalidades adicionales.

Las modalidades descritas anteriormente representan los diferentes componentes contenidos dentro de, o conectados con, otros componentes diferentes. Debe entenderse que tales arquitecturas representadas son simplemente ejemplares, y que de hecho muchas otras arquitecturas se pueden implementar las cuales logren la misma funcionalidad. En un sentido conceptual, cualquier ordenamiento de los componentes para lograr la misma funcionalidad se "asocia" efectivamente de tal manera que se alcanza la funcionalidad deseada. Por lo tanto, cualquiera de dos de los componentes de la presente combinados para lograr una funcionalidad particular se puede ver como que se "asocia con" cada uno de esos otros que manera tal que se logra la funcionalidad deseada, con independencia de las arquitecturas o componentes intermedios . Asimismo, cualquiera de los dos componentes así asociados también se puede ver como "operativamente conectado", u "operativamente acoplado", el uno al otro para lograr la funcionalidad deseada.

Mientras que se ha demostrado y descrito modalidades particulares de la presente invención, será obvio para los expertos en la materia que, sobre la base de las enseñanzas de la presente, se pueden hacer cambios y modificaciones sin salirse de esta invención y sus aspectos más amplios y, por tanto, las reivindicaciones adjuntas son para incluir dentro de su alcance todos los cambios y modificaciones que se encuentran dentro del verdadero espíritu y alcance de esta invención. Además, ha de entenderse que la invención es definida solamente por las reivindicaciones adjuntas. Se entenderá por aquellos dentro del estado de la técnica que, en general, los términos utilizados en' la presente, y especialmente en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, los cuerpos de las reivindicaciones adjuntas) se deben entender generalmente como términos "abiertos" (por ejemplo, el término "incluyendo o que incluye" debe interpretarse como "que incluye pero no se limita a", el término "teniendo o que tiene" se debe interpretar como "que tiene al menos", el término "incluye" debe interpretarse como " que incluye pero no se limita a", etc.). Se entenderá además por aquellos dentro del estado de la técnica que si se pretende un número específico de una recitación de la reivindicación introducida, tal intención se recitará explícitamente en la reivindicación, y en ausencia de tal recitación no está presente tal pretensión. Por ejemplo, como ayuda para la comprensión, las siguientes reivindicaciones adjuntas pueden contener el uso de las frases introductorias "al menos una" y "una o más" para introducir las recitaciones de las reivindicaciones. Sin embargo, el uso de tales frases no deben construirse de manera que impliquen que la introducción de una recitación de reivindicación mediante los artículos indeterminados "un" o "una" limite cualquier reivindicación particular que contenga tal recitación de reivindicación introducida a las invenciones que contienen solamente una de tal recitación, incluso cuando la misma reivindicación incluye las frases introductorias "uno o más" o "al menos uno" y los artículos indeterminados tales como "un" o "una" (por ejemplo, "un" y/o "una" típicamente deben interpretarse como que significan "al menos un" o "uno o más"), y lo mismo ocurre con el uso de artículos definidos utilizados para introducir las recitaciones de las reivindicaciones. Además, incluso si un número específico de una recitación de la reivindicación introducida se recita explícitamente, los expertos en la materia reconocerán que tal recitación debe típicamente interpretarse como que significa al menos el número recitado (por ejemplo, la recitación básica de "dos recitaciones," sin otros modificadores, típicamente significa al menos dos recitaciones, o dos o más recitaciones) . En consecuencia, la invención no se limita, excepto por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (46)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para el tratamiento de una afección o enfermedad mediada por la MMP9 , que comprende la administración a un mamífero que lo necesita de una cantidad terapéuticamente efectiva de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga, que tienen sustancialmente un diámetro promedio menor que aproximadamente 100 nanómetros y que se configuran establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para tratar una afección o enfermedad mediada por la MMP9.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga se configuran establemente en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, al contacto de una célula viva con el fluido, la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y de la conductividad de la membrana celular.

3. El método de la reivindicación 1, en donde las nanoestructuras que contienen oxigeno estabilizadas por carga son las especies principales de nanoestructuras que contienen gas estabilizado por carga en el fluido.

. El método de la reivindicación 1, en donde el porcentaje de moléculas de oxígeno disueltas presentes en el fluido como nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga es un porcentaje seleccionado del grupo consistente de mayor que: 0.01%, 0.1%, 1%, 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; y 95%.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el oxígeno dosuelto total está sustancialmente presente en las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizadas por carga

6. El método de la reivindicación 1, en donde las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga sustancialmente tienen un diámetro promedio menor que un tamaño seleccionado del grupo que consiste de: 90 nm; 80 nm; 70 nm; 60 nm; 50 nm; 40 nm; 30 nm; 20 nm; 10 nm; y menor que 5 nm.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la solución acuosa iónica comprende una solución salina.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido es superoxigenado .

9. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido comprende una forma de electrones solvatados .

10. El método de la reivindicación 1, en donde la alteración del fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados, inducidos hidrodinámicamente.

11. El método de la reivindicación 10, en donde, la exposición a los efectos electrocinéticos localizados comprende la exposición a al menos uno de pulsos de voltaje y pulsos de corriente.

12. El método de la reivindicación 10, en donde la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados, inducidos hidrodinámicamente, comprende la exposición del fluido a las características estructurales que inducen el efecto electrocinético de un dispositivo que se utiliza para generar el fluido.

13. El método de la reivindicación 1, en donde la afección o enfermedad mediada por la MMP9 comprende una enfermedad obstructiva de las vías respiratorias .

14. El método de la reivindicación 13, en donde la enfermedad obstructiva de las vías respiratorias comprende al menos una de asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

15. El método de la reivindicación 1, en donde la afección o enfermedad mediada por la MMP9 comprende al menos una de artritis reumatoide , artrosis, arteriesclerosis, cáncer y esclerosis múltiple.

16. El método de la reivindicación 1, en donde la afección o enfermedad mediada por la MMP9 comprende al menos una enfermedad o trastorno del sistema nervioso periférico o central caracterizado por la expresión persistente o sostenida y/o la actividad de la MMP9 , seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular/isquemia cerebral, traumatismo craneoencef lico, lesión de la médula espinal, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero.

17. El método de la reivindicación 1, que comprende terapia de combinación, en donde al menos un agente terapéutico adicional se administra al paciente.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el al menos un agente terapéutico adicional comprende la administración de un inhibidor adicional de al menos una MMP .

19. El método de la reivindicación 18, en donde la al menos una MMP se selecciona del grupo consistente de MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-8, MMP- 9, MMP- 10, MMP- 11, MMP- 12, MMP- 13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19 and MMP-20 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-18, MMP-19 y MMP-20.

20. El método de la reivindicación 17, en donde el al menos un agente terapéutico adicional es un antagonista de TSLP y/o TSLPR.

21. El método de la reivindicación 20, en donde el antagonista de TSLP y/o TSLPR se selecciona del grupo consistente de anticuerpos neutralizantes específicos para TSLP y el receptor de TSLP, moléculas del receptor de TSLP solubles, y proteínas de fusión del receptor de TSLP, que incluyen moléculas Fe de TSLPR-inmunoglobulina o polipéptidos que codifican para los componentes de más de una cadena del receptor.

22. El método de la reivindicación 17, en donde el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: fármacos anti-inflamatorios no esteroideos estándares (NSAID) , piroxicam, diclofenaco; un ácido propiónico, naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno; un fenamato, ácido mefenámico, indometacina, sulindac, apazona; una pirazolona, fenilbutazona, un salicilato, aspirina; una terapia analgésica o intraarticular, un corticosteroide ; un ácido hialurónico, hyalgan, synvisc; un inmunosupresor, ciclosporina, interferón; un inhibidor del TNF- alfa, Enbrel™,- metotrexato en dosis bajas, lefunimida, hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina, oro parenteral y oro oral .

23. El método de la reivindicación 17, en donde el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo de agentes del CNS que consiste de: un antidepresivo, sertralina, fluoxetina, paroxetina; un fármaco contra el Parkinson; deprenil, L-dopa, requip, miratex; un inhibidor de MAOB, selegine, rasagilina; un inhibidor de COMP, tolcapona, Tasmar; un inhibidor de A-2, un inhibidor de la recaptación de la dopamina, un antagonista de NMDA, un agonista de la nicotina, un agonista de la dopamina, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa neuronal, un fármaco contra el Alzheimer; un inhibidor de la acetilcolinesterasa, metrifonato, donepezil, Aricept, Exelon, ENA 713 o rivastigmina; tetrahidroaminoacridina, Tacrina, Cognex, o TH; un inhibidor de COX-1 o COX-2, celecoxib, Celebrex, rofecoxib, Vioxx; propentofilina, una medicación anti-accidente cerebrovascular, un antagonista selectivo de NR2B, un antagonista del sitio de la glicina, y un factor inhibidor de neutrófilos (NIF) .

24. El método de la reivindicación 17, en donde el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: un estrógeno; un modulador selectivo de los estrógenos, estrógenos, raloxifeno, tamoxifeno, droloxifeno, lasofoxifeno; un agente que resulta en la reducción de A. eta.1-40/1-42, un inhibidor de la agregación amiloide, un inhibidor de la secretasa; un agente de osteoporosis , droloxifeno, fosomax; agentes inmunosupresores , FK-506, rapamicina; un agente contra el cáncer, endostatina, angiostatina; un fármaco citotóxico, adriamicina, daunomicina, cis-platino, etopósido, taxol, taxotere; un alcaloide, vincristina; un antimetabolito, metotrexato; un agente cardiovascular, bloqueadores de los canales de calcio; un agente hipolipemiante , una estatina; un fibrato, un beta-bloqueador, un inhibidor de la ACE, un antagonista del receptor de la angiotensina-2 , y un inhibidor de la agregación plaquetaria.

25. El método de la reivindicación 2, en donde la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y de la conductividad de la membrana celular comprende alterar al menos una de las estructuras o funciones de la membrana celular, que comprende alterar al menos uno de una conformación, la actividad de unión al ligando, y una actividad catalítica de una proteína o componente asociados a la membrana.

26. El método de la reivindicación 25, en donde la proteína asociada a la membrana comprende al menos una seleccionada del grupo consistente de receptores, receptores transmembrana, proteínas del canal iónico, proteínas de unión intracelular, proteínas de adhesión celular, integrinas, etc.

27. El método de la reivindicación 26, en donde el receptor transmembrana comprende un Receptor Acoplado a la Proteína-G (GPCR) .

28. El método de la reivindicación 27, en donde el Receptor Acoplado a la Proteína-G (GPCR) interactúa con una subunidad a de la proteína G.

29. El método de la reivindicación 28, en donde la subunidad a de la proteína G comprende al menos una seleccionada del grupo consistente de Go¡s , GOÍÍ , Gaq , y Ga12.

30. El método de la reivindicación 29, en donde la al menos una subunidad de la proteína G es Gaq.

31. El método de la reivindicación 2, en donde la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la conductancia de las células completas.

32. El método de la reivindicación 31 en donde la modulación de la conductancia de las células completas, comprende modular al menos una de una contribución dependiente de voltaje lineal y una no lineal de la conductancia de las células completas.

33. El método de la reivindicación 2, en donde la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de una vía o sistema de mensajería celular dependiente del calcio.

34. El método de la reivindicación 2, en donde la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la actividad de la fosfolipasa C.

35. El método de la reivindicación 2, en donde la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la actividad de la adenilato ciclasa (AC) .

36. El método de la reivindicación 2, en donde la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular comprende la modulación de la transducción de las señales intracelulares asociadas con al menos una afección o síntoma seleccionado del grupo que consiste de enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, artritis reumatoide, artrosis, arteriesclerosis , cáncer, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular/isquemia cerebral, traumatismo craneoencef lico, lesión de la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero .

37. El método de la reivindicación 1, que comprende la administración del fluido electrocinético a una red o capa celular, y comprende posteriormente la modulación de una unión intercelular en ella.

38. El método de la reivindicación 37, en donde la unión intracelular comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste de uniones estrechas, uniones de hendiduras, adherinas de zona y desmosomas .

39. El método de la reivindicación 37, en donde la red o capa celulare, comprende al menos uno seleccionado del grupo consistente de epitelio pulmonar, epitelio bronquial, y epitelio intestinal .

40. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido acuoso alterado electrocinéticamente se oxigena, y en donde el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos de 30 pm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno a presión atmosférica.

41. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende al menos uno de electrones solvatados, y especies de oxígeno cargadas o modificadas electrocinéticamente.

42. El método de la reivindicación 41, en donde la forma de electrones solvatados o de especies de oxígeno electrocinéticamente modificadas o cargadas están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm,- al menos 0.1 ppm; al menos 0.5 ppm; al menos 1 ppm; al menos 3 ppm; al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm, o al menos 20 ppm.

43. El método de la reivindicación 42, en donde el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende una forma de electrones solvatados estabilizados por oxígeno molecular .

44. El método de la reivindicación 2 , en donde la capacidad para modular al menos uno del potencial de la membrana celular y la conductividad de la membrana celular persiste durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6, al menos 12 meses, o durante más tiempo, en un contenedor cerrado a prueba de escape de gas.

45. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad de oxígeno presente en las nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga del fluido alterado electrocinéticamente es de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos de 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm, o al menos 60 ppm de oxígeno a la presión atmosférica.

46. El método de la reivindicación 1, en donde el tratamiento comprende la administración por al menos una de la vía tópica, inhalación, intranasal, e intravensa.