MX2011003813A - Tratamiento de la infeccion del virus de la hepatitis c con la sobreexpresion de arnmicro-196. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos de tratamiento de células infectadas con VHC y mamíferos que padecen una infección con VHC transfectando las células infectadas con mímico de ARNm-196. El mímico de ARNm-196 regula hacia abajo en forma significativa la proteína Bach1 y la expresión del gen del VHC, mientras además regula hacia arriba la expresión del gen HMOX1. El ARNm-196 se une a la 3'-UTR del ARNm de Bach1 para reducir la expresión de Bach1. Como tal, el ARNm-196 puede jugar un papel de importancia en la regulación de la replicación del VHC y la expresión de HMOX1/Bach1 en los hepatocitos. La presente invención además provee una formulación para el tratamiento de células que expresan VHC que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de ARNm-196 de manera que la expresión de Bach1 y del gen del VHC sean reguladas hacia abajo incrementando a la par la expresión de HMQX1. Las formulaciones están adaptadas para permitir la transfección de mímico de ARNm-196 en hepatocitos que expresan proteínas de VHC.

Description

TRATAMIENTO PE LA INFECCIÓN DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C CON LA SOBREEXPRESIÓN DE ARNmicro-196 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a un método y formulación para el tratamiento de la infección Hepatitis C. Más específicamente, la presente invención se refiere a la regulación de Bachl y/o VHC. Bachl y la proteina NS5A del VHC pueden regularse hacia abajo mediante R-196mi, regulando hacia arriba HMOX1 a la vez.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de la Hepatitis C (VHC) es un virus pequeño (50 nm de tamaño), envuelto, de ARN de sentido único positivo de la familia Flaviviridae. A pesar que el virus de la Hepatitis A, el virus de la Hepatitis B , y el virus de la Hepatitis C tienen denominaciones similares dado que todos ellos provocan una inflamación del hígado, cada uno de ellos es un virus distinto ,y diferente tanto genética como clínicamente. El VHC provoca la enfermedad infecciosa de transmisión sanguínea (es decir, se contagia por contacto sangre con sangre) conocida como Hepatitis C. La infección a menudo es asintomática, pero una vez establecida, la infección crónica puede provocar la inflamación del hígado (hepatitis crónica). Esta condición puede avanzar hasta provocar la cicatrización del hígado (fibrosis), y la cicatrización avanzada (cirrosis). En algunos casos, aquellos con cirrosis pueden experimentar una falla hepática u otras complicaciones de la cirrosis, incluyendo cáncer de hígado.

La expresión hepatitis C aguda hace referencia a los primeros 6 meses luego de la infección con el VHC. Entre el 60% y 70% de la gente infectada no desarrolla síntomas durante la fase aguda. En una minoría de pacientes que experimentan síntomas en la fase aguda, en general son leves y no específicos, y raramente conducen a un diagnóstico especifico de hepatitis C. Los síntomas de la infección aguda por hepatitis C incluyen falta de apetito, fatiga, dolor abdominal, ictericia, comezón, y síntomas tipo gripe. El VHC usualmente es detectable en la sangre de una a tres semanas luego de la infección, y los anticuerpos para el virus son detectables dentro de las 3 a 12 semanas. Aproximadamente, 15-40%' de las personas infectadas con VHC despiden el virus de sus cuerpos durante la fase aguda tal como lo indica la normalización en pruebas de la función hepática (LFTs) como normalización de alanina transaminasa (ALT)'& aspartato transaminasa (AST), así como también clearance de ARN de VHC en plasma {clearance viral espontáneo). El resto, 60-85%, de los pacientes infectados con VHC desarrollan hepatitis C crónica (HCC).

La hepatitis crónica C es una infección con VHC que persiste durante más de seis meses. El curso natural de la hepatitis C crónica varía considerablemente de una persona a otra. Virtualmente todas las personas infectadas con el VHC tienen evidencia de inflamación en una biopsia de hígado. Sin embargo, la velocidad de avance de la cicatrización del hígado (fibrosis) varia mucho entre los individuos. Datos recientes sugieren que entre los pacientes no tratados, aproximadamente un tercio desarrolla cirrosis de hígado en menos de 20 años. Otro tercio desarrollar cirrosis dentro de los 30 años. Los síntomas específicamente sugestivos de la enfermedad hepática típicamente están ausentes hasta producirse la cicatrización sustancial del hígado. Sin embargo, la hepatitis C es una enfermedad sistémica y los pacientes pueden experimentar un amplio espectro de manifestaciones clínicas que van desde la ausencia de síntomas a una enfermedad más sintomática antes del desarrollo de la enfermedad hepática avanzada. Los signos y síntomas generalizados asociados con la hepatitis C crónica incluyen fatiga, marcada pérdida de peso, síntomas tipo gripe, dolor muscular, dolor de articulaciones, febrículas intermitentes, comezón, trastornos del sueño, dolor abdominal (en especial en el cuadrante superior derecho), cambios de apetito, náuseas, diarrea, dispepsia, cambios cognitivos, depresión, dolores de cabeza, y cambios de carácter.

Una vez que la hepatitis C crónica se ha convertido en cirrosis, pueden aparecer signos y síntomas en general provocados por la menor función hepática o la mayor presión en la circulación del hígado, una condición conocida como hipertensión portal. Los signos y síntomas posibles de la cirrosis hepática incluyen ascitis (acumulación de líquido en el abdomen), tendencia a los hematomas y sangrados, dolor óseo, várices (venas agrandadas, en especial en el estómago y el esófago), deposiciones grasosas (esteatorrea), ictericia, y un síndrome de afectación cognítiva conocido como encefalopatía hepática.

La hepatitis C crónica, más que otras formas de hepatitis, se diagnostica a causa de las manifestaciones extra hepáticas asociadas con la presencia del VHC como tiroiditis (inflamación de la tiroides) con hipertireosis o hipotireosis, porfiria cutánea tarda, crioglobulinemia (una forma de vasculitis de los vasos pequeños) y glomerulonefritis (inflamación del riñón), específicamente glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN). La hepatitis C además está asociada con el síndrome de Sicca, trombocitopenia, liquen plano, diabetes mellitus y con los desórdenes linfoproliferativos de las células B.

La infección por el virus de la Hepatitis C es un problema de salud mundial, para el cual no se dispone en la actualidad de una vacuna. La terapia convencional actual para la hepatitis C crónica (CHC) es una combinación de interferón pegilado (IFN) y ribavirina, pero sólo aproximadamente el 50% de los paciente responden a este tratamiento. Además, este tratamiento es costoso, prolongado, y está acompañado por numerosos efectos colaterales desagradables. Se estima que 150-200 millones de personas en el mundo están infectadas con la hepatitis C.

Por ello es necesario descubrir y desarrollar terapias antivirales y procedimientos orientados al VHC y para el tratamiento de todas las formas de la Hepatitis C.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención satisface por lo menos algunas de las necesidades antes mencionadas mediante un método de tratamiento de células o un mamífero que padece una infección con VHC mediante la reducción de la expresión de los niveles de protema Bachl en células de hepatoma humano que expresan proteínas virales de la hepatitis C. Una reducción en la expresión de los niveles de proteína Bachl puede alcanzarse transfectando las células con mímico de ARNm-196 de manera que el ARNm-196 se una a la 3'-UTR del ARNm de Bachl para reducir la expresión de Bachl . El ARNmi meramente necesita incluir la "región semilla" coincidente para efectivamente unirse a la 3'-UTR del ARNm de Bachl . Preferentemente, el ARNmi es regulado hacia arriba o sobreexpresado para incrementar la reducción en los niveles de expresión de Bachl . El nivel de ARNm-196 es regulado hacia arriba mediante un mímico de ARNmi sintetizado, que ingresa al camino del ARNmi y actúa como un ARNm-196 maduro.

Un mamífero que padece una infección por VHC también puede ser tratado regulando hacia arriba la expresión del gen HMOX1 en células que expresan proteínas no estructurales de VHC. En varias realizaciones, la regulación hacia arriba de la expresión del gen HMOX1 es acompañada por la regulación hacia abajo de la expresión del gen Bachl en las células. Como tal, el ARNm-196 regula hacia arriba indirectamente HMOX1 uniéndose con Bachl , que regula negativamente HMOX1. La regulación de cada uno puede lograrse transfectando las células con mímico de ARNm-196. Además, las células, como los hepatocitos, infectadas con VHC pueden ser tratadas por reducción de la expresión de VHC en las mismas transfectando las células con mímico de ARNm-196.

En otro aspecto, la invención provee una formulación farmacéutica adaptada para administrar mímico de ARNm-196 a un mamífero de manera que las células infectadas con VHC puedan ser transfectadas con mímico de ARNm. La administración de estas formulaciones reprime traslacionalmente la expresión de Bachl , regula hacia arriba HMOX1 , y regula la replicación del VHC en los hepatocitos.

Es de destacar que la presente invención revela los sitios de unión de ARNm-196 funcionales en la 3'-UTR de Bachl , que conducen a la regulación hacia debajo de la expresión del gen Bachl , la regulación hacia arriba de la expresión del gen H OX1 , y la regulación hacia abajo de la expresión del gen del VHC. El uso del ARNm-196 provee nuevas terapias adicionales para el tratamiento de células infectadas con VHC y mamíferos que padecen Hepatitis C (por ejemplo infección por VHC crónica) y, probablemente, para otras enfermedades caracterizadas por un mayor esfuerzo oxidativo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Habiendo así descripto la invención en términos generales, a continuación se hará referencia a los dibujos que se acompañan, los cuales no necesariamente están realizados a escala.

La Figura 1A ilustra un esquema de una primer coincidencia de la región semilla entre R-196mi y el primer sitio Bachl 3'-UTR putativo apuntado; La Figura 1 B ilustra un esquema de segunda coincidencia de la región semilla entre R-196mi y el sitio Bachl 3 -UTR putativo apuntado; La Figura 2A ilustra los niveles regulados hacia abajo de proteína Bachl asociados con la transfección con mímico de ARNm-196; La Figura 2B ilustra los niveles regulados hacia arriba de proteína Bachl asociados con la transfección con inhibidor de ARNm-196; La Figura 2C ilustra que los niveles de ARNm de Bachl no fueron alterados por la transfección del mímico de ARNm-196; La Figura 3A ilustra la regulación hacia arriba de los niveles de ARNm de HMOX1 asociada con el mímico de ARNm-196; La Figura 3B ilustra que la transfección con mímico de ARNm-196 no alteró los niveles de ARNm de Cullin 3; La Figura 4A ilustra la regulación hacia abajo de los niveles de proteína NS5A de VHC asociada con la transfección con mímico de ARNm-196; La Figura 4B ilustra la regulación hacia arriba de los niveles de proteína NS5A de VHC asociada con la transfección con inhibidor de ARNm-196; La Figura 4C ilustra la regulación hacia abajo de los niveles de ARNm de NS5A y core de VHC mediante la transfección con mímico de ARNm-196 en las células de replicón de longitud total Con 1 (subtipo 1 b); La Figura 5A ilustra los dos sitios de coincidencia semilla Bachl 3'-UTR para el ARNm- 196; La Figura 5B ilustra un esquema representativo de pGL3-Bach1 , la construcción reportera de luciferasa de luciérnaga (f-luc) utilizada en células de co-transfección con pGL3-Bac , pRL-TK (renilla) y con mímico de R-196mi o inhibidor por Lipofectamina 2000.

La Figura 5C ilustra que el mímico de ARNm-196 inhibió las actividades de f-luc del reportero pGL3-Bach1 ; La Figura 5D ilustra que el inhibidor de ARNm-196 incrementó levemente la actividad de f-luc del reportero pGL3-Bach1 ; La Figura 6A ilustra el reemplazo de cuatro nucleótidos en los dos sitios de coincidencia semilla de Bac 3'-UTR; La Figura 6B ilustra que el mímico de ARNm-196 disminuyó la actividad de f-luc de pGL3-Bach1-WT pero no del reportador pGL-Bach1-Mut en células co-transfectadas con mutante pGL3-Bach1 o pGL3-Bach1 , con pRL-TK (renilla), y con mímico de R-196mi; La Figura 6C ilustra que el mímico de R-155mi redujo las actividades de f-luc del reportador pGL3-Bach1-WT y pGL-Bach1-Mut en células co-transfectadas con mutante pGL3-Bachl o pGL3-Bach1 , con pRL-TK (renilla), y con mímico de R-155mi; La Figura 7A ilustra las cuatro mutaciones de nucleótidos introducidas a los sitios de coincidencia semilla de ARNm-196; La Figura 7B ilustra la actividad de Luciferasa de células co-transfectadas con pGL3-Bachl , pRL-TK y con mayores concentraciones de control negativo de mímico, mímico de R-196m¡ o mutante R-196mi; La Figura 8A ilustra la recuperación del coincidencia de la región semilla entre el mutante ARNm-196 y el mutante Bachl 3'-UTR; La Figura 8B ilustra las actividades de luciferasa medidas de células co-transfectadas con reportero mutante (pGL3-Bach1-Mut), pRL-TK, y con mutante ARNm-196 o mímico natural de ARNm-196 durante 48 horas; La Figura 9A ilustra la regulación hacia abajo de los niveles de ARN J6/JFH1 de VHC mediante el mímico de ARNm-196 en células Huh-7.5 transfectadas con ARN J6/JFH1 ; La Figura 9B ilustra células Huh-7.5 infectadas con virus de la hepatitis C J6/JFH1 secretado en el supernatante del cultivo; y La Figura 9C ilustra la regulación hacia abajo de los niveles de proteína de VHC J6/JFH1 mediante el mímico de ARNm-196 en células Huh-7.5 infectadas con virus de la hepatitis C J6/JFH1 secretado en el supernatante del cultivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención será descripta con mayor detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales se ilustran algunas mas no todas sus realizaciones. De hecho la invención puede ser llevada a la práctica de diversas formas y no debe considerarse limitada a las realizaciones descriptas; por el contrario, estas realizaciones se exponen de modo que la presente satisfaga las exigencias legales aplicables.

Se acepta que el virus de la Hepatitis C (VHC) induce en forma directa el estrés oxidativo en los hepatocitos. Asimismo se acepta que heme oxigenase 1 (HMOX1 ) es una enzima citoprotectora clave que ejerce actividades antioxidantes y antiinflamatorias. Como tal, la existencia o uso de HMOX1 puede verse como un medio para negar o mitigar el esfuerzo oxidativo inducido por el VHC. Sin embargo, Bachl , un represor transcripcional de mamífero cierre de leucina básico (bZip), regula negativamente HMOX1. Como tal, la reducción de los niveles de Bachl, sola o en conjunto con mayores niveles de HMOX1 , es potencialmente capaz de conducir a la prevención o mejora de la Hepatitis C.

Bachl es un gen que codifica un factor de transcripción que pertenece al tipo cap'n'collar de la familia del factor cierre de leucina de la región básica (CNC-bZip). La proteina codificada contiene un complejo amplio de dominios tramtrack, bric-a-brac/poxvirus y dedo de zinc (BTB/POZ), lo cual es atípico en los miembros de la familia CNC-bZip. Estos dominios BTB/POZ facilitan las interacciones proteína-proteína y la formación de homo- y/o hetero-oligómeros. Cuando esta proteína codificada forma un heterodímero con MafK, funciona como un represor del elemento de reconocimiento Maf (MARE) y se reprime la transcripción. Más específicamente, Bachl es un represor transcripcional en mamíferos de HMOX1 que regula negativamente la expresión del gen HMOX1. Bachl forma heterodímeros antagonistas con la familia de oncogenes relacionados con Maf. Estos heterodímeros se unen a los elementos de reconocimiento de Maf (MAREs) y suprimen la expresión de genes (por ejemplo, HMOX1 y NQ01 ) que responden a los heterodímeros que contienen Maf y otros factores transcripcionales positivos.

Los ARNmi son ARNs no codificantes pequeños (-22 nt) que en general se consideran importantes reguladores de la expresión genética. Antes de la presente invención, el hecho mismo así como el mecanismo de regulación de Bachl o VHC de los ARNmicro era en gran medida desconocido. La presente invención reconoce, por primera vez, que el ARNm-196 actúa directamente sobre la 3'-UTR del ARNm de Bachl y reprime por vía traslacional la expresión de esta proteína, y regula hacia arriba HMOX1. Además, R-196m¡ también inhibe la proteina NS5A de la expresión del VHC. Asi, el ARNm-196 juega un rol importante, tal vez crítico, en la regulación de la replicación del VHC y la expresión de HMOX1/Bach1 en hepatocitos. En consecuencia, las células infectadas con VHC o los mamíferos que padecen Hepatitis pueden ser tratados mediante la administración de mímico de ARNm-196 de manera que las células infectadas sean transfectadas con mímico de ARNm-196. Preferentemente, la sobreexpresión de ARNm-196 y su transfección en células infectadas puede convenientemente proveer un enfoque tendiente a prevenir o atenuar la infección hepatitis C. En una realización, el nivel de ARNm-196 es regulado hacia arriba mediante un mímico de ARNmi sintetizado, que ingresa al camino ARNmi y actúa como un ARNm-196 maduro.

Según se ha indicado, los ARNmi son pequeños ARNs no codificantes (-22 nt) que en general se consideran importantes reguladores de la expresión genética. Más específicamente, los ARNmi son moléculas de ARN de cadena simple de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud, que regulan la expresión genética fundamentalmente a través de represión por vía traslacional. Los ARNmi son codificados por genes que son transcriptos a partir del ADN pero que no se traducen en una proteína (ARN no codificante); por el contrario son procesados a partir de transcriptos primarios conocidos como pri-ARNmi para acortar las estructuras de tallo-bucle denominadas pre-ARNmi y finalmente en RNAmi funcional. Las moléculas maduras de ARNmi son parcialmente complementarias a una o más moléculas de ARN mensajero (ARNm), y su función principal es regular hacia abajo la expresión genética. La función del ARNmi parece estar en la regulación de genes. Por tal motivo, un ARNmi es complementario a una parte de uno o más ARNs mensajeros (ARNm). Los ARNmi de origen animal son usualmente complementarios a un sitio en la 3' UTR. El anillado del ARNmi con el ARNm luego inhibe la traducción de la proteína, pero en algunos casos facilita el clivaje del ARNm. En tales casos, la formación del ARN de cadena doble a través de la unión del ARNmi dispara la degradación del transcripto de ARNm a través de un proceso similar a la interferencia de ARN (RNAi). Sin embargo, en otros casos se cree que el complejo ARNmi bloquea la maquinaria de traducción de proteínas o de otro modo impide la traducción de la proteína sin hacer que el ARNm se degrade. Actualmente, no está claro el mecanismo exacto por el cual los genes apuntados son regulados hacia abajo.

A los fines de la presente solicitud, los mímicos de ARNMicro (por ejemplo mímico de ARNm-196) son oligonucleótidos de ARN de cadena doble químicamente modificados con ON-TARGET® para incrementar su estabilidad y mejorar sus actividades. Los mímicos de ARNmicro imitan al precursor endógeno ARNmi para ingresar al camino del ARNmi y actuar como especies maduras de ARNmi.

La complementariedad de secuencias en las "regiones semilla" de 6-8 pares de bases en el extremo del heterodúplex ARNmi-ARNm parece determinar la especificidad de las interacciones ARNmi-ARN blanco. Primeramente se reconoció que el R-196mi tenía una complementariedad extensiva y evolutivamente conservada con los clústeres homeobox (HOX), grupos de genes de factores de transcripción relacionados cruciales para numerosos programas de desarrollo en animales, y para regular la expresión del gen HOX.

Los inventores de la presente proponen que el ARNm-196 apunta al genoma del VHC así como a la regulación hacia arriba del gen HMOX1 apuntando la 3'-UTR del ARNm de Bachl . En consecuencia, las células infectadas con VHC pueden ser tratadas transfectando las células infectadas con mímico de ARNm-196. Transfectando las células infectadas con VHC, los niveles de expresión de Bachl pueden ser reducidos incrementando a la par los niveles de HMOX1. Convenientemente, la regulación hacia abajo de Bachl , que regula negativamente HMOX1 , ayuda a incrementar la expresión de HMOX1. Según lo expuesto, H OX1 provee efectos antioxidativos para mitigar el esfuerzo oxídativo inducido por el VHC. Además, la regulación hacia arriba de ARNm-196 puede inducirse con un tratamiento con IFN ß. Esta inducción de ARNm-196 puede observarse en la línea de células de hepatoma humano Huh-7 y en hepatocitos murinos primarios.

El número de ARNsmi continúa creciendo, y otros ARNms y genes candidatos regulados por ellos siguen siendo identificados. Con respecto al hígado, el ARNmi-122 fue identificado como el ARNmi más abundante en los hepatocitos y el que muestra los mayores efectos sobre varias enzimas del metabolismo del colesterol. También se ha demostrado que el ARNmi-122 es necesario para la expresión del VHC. En general, los efectos del ARNmi-122 dependen del contexto y localización de sus sitios de unión de la secuencia semilla cognata con los sitios en la región 5' que en su mayoría están asociados con la regulación hacia arriba de la expresión, en tanto aquellos en la región no traducida 3' están en su mayor parte asociados con la represión de la expresión. Las realizaciones de la presente invención comprenden la utilización del mímico de ARNm-196 como un regulador hacia abajo de la expresión de la proteína NS5A del VHC. Esta proteína es esencial para la total y normal expresión del VHC. Como tal, las realizaciones de la presente invención comprenden métodos de tratamiento de células infectadas o mamíferos que padecen Hepatitis C con una cantidad terapéuticamente efectiva de mímico de ARNm-196. La cantidad terapéuticamente efectiva puede ser provista por vías de administración conocidas. Por ejemplo, los agentes terapéuticos que comprenden mímico de ARNm-196 pueden ser aplicados por vía tópica, enteral o parenteral de acuerdo a las varias realizaciones de la presente invención.

En la actualidad en general se acepta que la infección con VHC produce un aumento en el esfuerzo oxidativo en los hepatocitos infectados y probablemente también en otras células infectadas. Un mediador importante de tal esfuerzo oxidativo es la proteína core del VHC. Asimismo se acepta que HMOX1 ayuda a proteger numerosas células y tejidos contra los efectos potencialmente dañosos del exceso de esfuerzo oxidativo. Según se ha indicado, HMOX1 es una enzima citoprotectora clave que posee efectos antioxidantes y antiinflamatorios capaz de negar o mitigar el esfuerzo oxidativo' inducido por el VHC. Más específicamente, HMOX1 es una enzima citoprotectora clave, que cataliza la degradación de heme y genera hierro ferroso, monóxido de carbono y biliverdina, que poseen efectos antioxidantes y antiinflamatorios en vivo. Estas propiedades beneficiosas de HMOX1 se basan en la capacidad de HMOX1 para reducir heme "libre" o escasamente unida, que puede actuar como un potente pro oxidante, e incrementar la producción de monóxido de carbono, biliverdina, y bilirrubina, que ejercen potentes efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antifibrinogénicos.

La regulación de la expresión del gen HMOX1 es compleja. Sin embargo, los inventores de la presente han demostrado que entre los sitios importantes de regulación de HMOX1 se encuentra una serie de sitios AP-1 expandidos (también denominados elementos de respuesta antioxidantes), los elementos de respuesta a la proteína Maf [MARE], y los elementos de respuesta a las metaloporfirinas [MPRE] en la región sin traducir 5' de los genes HMOX a través de muchas especies. Bachl es un miembro de proteínas de cierre de leucina de zinc cap'n'collar. Juega un papel en la represión tónica de la expresión del gen HMOX1. Lo hace formando heterodímeros con las proteínas Maf pequeñas y bloqueando la activación transcripcional del gen. Bachl contiene varios sitios de unión de consenso (todos contienen motivos CP) los cuales, cuando se unen a heme, conducen a un cambio en la conformación de la proteína con una marcada reducción de la afinidad por las proteínas Maf y la subsecuente depresión y aumento en la actividad de expresión del gen HMOX1. Una de las más estimulatorias proteínas Maf es Nrf2. La regulación hacia arriba de Nrf2 está asociada con la mayor expresión del gen HMOX1.

En vista de lo precedente, la actividad de HMOX1 podría incrementarse en la infección con VHC. Sin embargo, estudios clínicos han identificado una disminución en la expresión de HMOX1 al inicio de la hepatitis C crónica. Por ello, los pacientes con factores genéticos o de otra naturaleza que conduzcan a menores niveles de expresión del gen HMOX1 pueden tener un mayor riesgo de desarrollar una hepatitis C crónica luego de una exposición aguda al VHC y/o una enfermedad hepática progresiva más rápidamente debido a la infección por VHC.

Los menores niveles de la expresión del gen HMOX1 pueden correlacionarse con la infección hepatitis C crónica y Bachl regula negativamente HMOX1. En consecuencia, el tratamiento de células infectadas con VHC o mamíferos que padecen Hepatitis C para reducir el nivel de Bac en las células infectadas puede mitigar beneficiosamente el impacto del VHC. Como tal, una realización de la presente invención comprende un método de tratamiento de un mamífero que padece hepatitis C crónica transfectando las células con mímico de ARNm-196 de manera que el ARNm-196 se una a la 3'-UTR del ARNm de Bachl para reducir la expresión de Bachl y regular hacia arriba HMOX1. Preferentemente, el ARNm-196 es sobreexpresado para proveer más ARNm-196 a unirse con Bachl y regular hacia arriba HMOX1.

En una realización de acuerdo a la presente invención, un mamífero que padece una infección con VHC (por ejemplo hepatitis C crónica) es tratado con ARNm-196. En particular, las células infectadas son transfectadas con mímico de ARNm-196, que regula hacia abajo la expresión de Bachl . En una realización específica, los niveles de expresión de Bachl en las células infectadas que expresan la proteína no estructural del VHC pueden ser reducidos transfectando las células con mímico de ARNm-196 de manera que el ARNm-196 se una a la 3'-UTR del ARNm de Bachl para reducir la expresión de Bachl . En un método preferido, el ARNm-196 que se une a la 3'-UTR del ARNm de Bachl es sobreexpresado. En una realización específica, el ARNm-196 es regulado hacia arriba administrando además interferón beta. En otra realización, el ARNm-196 también es regulado hacia arriba mediante la administración de mímico de ARNm-196 solo o en combinación con interferón beta.

El tratamiento de células infectadas individualmente, o mamíferos que tienen esas células infectadas, puede proveer una reducción significativa en la expresión de los niveles de proteína Bachl ante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de mímico de ARNm-196. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" hace referencia a una cantidad de mímico de ARNm-196 efectiva para el tratamiento de una célula infectada o mamífero con Hepatitis y/o prevención de uno o más desórdenes. A modo de pauta general, una cantidad terapéutica diaria del mímico de ARNm-196 para el tratamiento de la infección con VHC puede en general oscilar entre 0.5 y 5 µG???/kg de peso corporal, o entre 1.0 y 4 µ?p??/kg de peso corporal, o entre 2 y 3 µ????/kg de peso corporal. En una realización alternativa, la cantidad terapéutica de mímico de ARNm-196 puede oscilar entre 0.1 y 1 pmol/kg de peso corporal, o entre 0.25 y 1 µ?t???/kg de peso corporal, o . entre 0.25 y 0.75 µ????/kg de peso corporal.

En varias realizaciones, la expresión de los niveles de proteína Bachl puede reducirse aproximadamente entre 10% y aproximadamente 75%, o aproximadamente entre 25% y aproximadamente 65%. En otras realizaciones, la expresión de los niveles de proteína Bachl 24 horas después de la transfección comprende una reducción de aproximadamente entre 25% y aproximadamente 75%, o aproximadamente entre 50% y aproximadamente 60%. De acuerdo a otra realización, la expresión de los niveles de proteína Bachl 48 horas después de la transfección provee una reducción de aproximadamente entre 40% y aproximadamente 80%, o aproximadamente entre 60% y aproximadamente 70%.

Según se ha expuesto, el aumento del nivel de la expresión del gen HMOX1 puede ser beneficioso para negar o mitigar el esfuerzo oxidativo inducido por el VHC. Al transfectarse con ARNm-196, la expresión del gen HMOX1 en células que expresan proteínas no estructurales de VHC puede incrementarse convenientemente. En consecuencia, una realización de la presente invención comprende un método de tratamiento de células infectadas con VHC o un mamífero que padece una infección con VHC regulando hacia arriba la expresión del gen HMOX1 en células que expresan proteínas no estructurales de VHC. La expresión del gen HMOX1 es regulada hacia arriba transfectando las células infectadas con una cantidad terapéuticamente efectiva de mímico de ARNm-196. En una realización la regulación hacia arriba de H OX1 es acompañada por la regulación hacia debajo de la expresión del gen Bachl en las células. En una realización preferida, el método incluye regular hacia arriba o sobreexpresar ARNm-196 para tratar hepatocitos. En varias realizaciones, la expresión de HMOX1 se incrementa aproximadamente entre 2 y aproximadamente 3 veces por sobre el nivel de expresión de HMOX1 en células que no han sido transfectadas con mímico de ARNm-196.

Además de reprimir la expresión de Bachl , además se reprime la expresión de la proteína no estructural del VHC 5a (NS5A del VHC) en hepatocitos humanos que expresan proteínas no estructurales de VHC. Así, las realizaciones de la presente invención comprenden tratar células infectadas con VHC con mímico de ARNmi. Las células infectadas pueden ser transfectadas con mímico de ARNm-196 para regular hacia abajo la expresión de NS5A del VHC. Preferentemente, el ARNm-196 es sobreexpresado.

Ciertas realizaciones de la presente invención comprenden tratar las células infectadas con VHC o un mamífero que padece una infección con VHC reduciendo la expresión de NS5A del VHC en células que expresan proteínas no estructurales de VHC transfectando las células con mímico de ARNm-196. Es decir, en ciertas realizaciones un mamífero que padece una infección con VHC es tratado reduciendo la expresión de ARN de VHC y/o la expresión de proteínas en células de replicón de VHC y células infectadas con VHC transfectando las células con mímico de ARNm. En'una de estas realizaciones, la expresión de los niveles de proteína NS5A de VHC se reduce entre 10 y 60 por ciento, o entre 20 y 50 por ciento. En otra realización, la expresión de los niveles de proteína NS5A de VHC 24 horas después de la transfección comprende una reducción de aproximadamente entre 45 y aproximadamente 55 por ciento, mientras la expresión de los niveles de proteína NS5A de VHC 48 horas después de la transfección comprende una reducción de aproximadamente entre 35 y aproximadamente 45 por ciento.

El término "transfección" según se emplea en la presente solicitud describe la introducción de material extraño en células eucarióticas usando un vector de virus u otro medio de transferencia. La transfección de células animales típicamente comprende abrir poros transitorios u "orificios" en la membrana plasmática celular, para permitir la absorción de material. El material genético (como ADN de plásmido superenrrollado o construcciones de ARNsi), o aún proteínas como los anticuerpos, puede ser transfectado. Además de la electroforación, la transfección puede ser llevada a cabo mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas, que se fusiona con la membrana plasmática celular y deposita su carga dentro.

Un método posible de transfección puede utilizar fosfato de calcio. Una solución salina estabilizada con HEPES (HeBS) que contiene iones fosfato se combina con una solución de cloruro de calcio que contiene el material a transfectar. Cuando los dos se combinan, se forma un precipitado fino del calcio positivamente cargado y el fosfato negativamente cargado, uniendo el material a transfectar en su superficie. La suspensión del precipitado luego se agrega a las células a transfectar. A pesar que el proceso no se entiende por completo, las células absorben parte del precipitado, y con éste, el material a transfectar.

Otros métodos usan compuestos orgánicos altamente ramificados (por ejemplo dendrímeros) para unir el material genético (por ejemplo ADN, ARN, o ARNmi) y llevarlo a la célula. Otro método consiste en la inclusión del material genético a transfectar en los liposomas, es decir, cuerpos pequeños unidos a la membrana que son de alguna manera similares a la estructura de la célula y que pueden en realidad fusionarse con la membrana celular, liberando el material genético en la célula. Para las células eucarióticas, por lo general se emplea la transfección basada en la interacción lípido-catión, dado que las células son más sensibles.

Otro método consiste en el uso de polímeros catiónicos como DEAE-dextran o polietilenimina. El material genético negativamente cargado se une al policatión y el complejo es absorbido por la célula vía endocitosis.

Un enfoque directo para la transfección es la pistola genética, donde el material genético se acopla a una nanopartícula de un sólido inerte (comúnmente oro) que luego es "disparado" directamente el núcleo de la célula blanco. El material genético también puede ser introducido en las células usando virus como portadores. En tales casos, la técnica se denomina transfección viral, y, se dice que las células son transducidas. Otros métodos de transfección incluyen nucleofección, electrof oración, shock térmico, magnetofección y reactivos de transfección registrados como Lipofectamina, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene o DreamFect.

La Patente Estadounidense Número 5,942,634, que se incorpora a la presente como referencia, describe el uso de anfifilos catiónicos para facilitar el transporte de moléculas biológicamente activas (terapéuticas) a las células. La Patente Estadounidense Número 5,942,634 además revela cómo preparar composiciones terapéuticas que incorporan una molécula terapéutica poniendo en contacto una dispersión de uno o más anfifilos catiónicos con las moléculas terapéuticas. Las moléculas terapéuticas que pueden ser liberadas en las células incluyen ADN, ARN, y polipéptidos. Tales composiciones pueden ser utilizadas para proveer una terapia génica, y liberar los pollnucleótidos antisentido o polipéptidos biológicamente activos en las células.

En otro aspecto, la presente invención provee una formulación farmacéutica para el tratamiento de células o mamíferos que padecen hepatitis C, preferentemente hepatitis C crónica. Las formulaciones de acuerdo a la presente invención deben comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de mímico de ARNm-196 de modo que Bachl y/o NS5A del VHC sean reguladas hacia abajo incrementando a la vez la expresión de HMOX1. Las realizaciones de acuerdo a la presente Invención están adaptadas para permitir la transfección de mímico de ARNm-196 en los hepatocitos que expresan VHC. Las formulaciones de la presente invención pueden incluir o utilizar, entre otros, cualquiera de los medios mencionados para transfectar material genético a una célula blanco.

De acuerdo a varias realizaciones, las formulaciones de la presente invención pueden ser provistas en una forma para administración enteral. Por ejemplo, una formulación de acuerdo a las realizaciones de la presente invención puede ser provista en forma de una tableta, cápsula, o preparación líquida para administración oral. Más aún, sin embargo, la formulación se provee como una preparación líquida para inyección intravenosa.

En otras realizaciones, la formulación puede ser provista como una inyección o infusión.

Por ejemplo, varias formulaciones de acuerdo a la presente invención pueden ser administradas por vía intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), subcutánea (debajo de la piel), intradérmica (en la piel propiamente dicha), intratecal (en el canal espinal), o intraperitoneal (infusión o inyección en el peritoneo).

El tratamiento de células infectadas individualmente, o mamíferos que portan tales células infectadas, con las formulaciones de acuerdo a las realizaciones de la presente invención puede generar una reducción significativa en la expresión de Bachl y los niveles de proteína NS5A de VHC y un aumento en los niveles de HMOX1 ante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de mímico de ARNm-196. La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" hace referencia a una cantidad de mímico de ARNm-196 administrada a una célula infectada o mamífero con Hepatitis efectiva para tratar y/o prevenir una o más desórdenes. A modo de pauta general, una cantidad terapéutica diaria del mímico de ARNm-196 para el tratamiento de la infección con VHC puede en general oscilar entre 0.5 y 5 µ?t???/kg de peso corporal, o entre 1.0 y 4 mol/kg de peso corporal, o entre 2 y 3 mol/kg de peso corporal. En una realización alternativa, la cantidad terapéutica de mímico de ARNm-196 puede oscilar entre 0.1 y 1 pmol/kg de peso corporal, o entre 0.25 y 1 pmol/kg de peso corporal, o entre 0.25 y 0.75 µ????/kg de peso corporal.

Ejemplos I. Materiales y Experimentos A. Reactivos y Anticuerpos Los reactivos para el ensayo de proteínas BCA fueron adquiridos a Pierce Biotechnology (Rockford, IL). El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y el suero bovino fetal provienen de HyClone (Logan, UT). El Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo® es de Promega (Madison, Wl). TRIzol fue adquirido a Invitrogen (Carlsbad, CA) y la geneticina (G-418) es de Gibco (Grand Island, NY). Los iniciadores fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Los geles SDS-PAGE 4-15% en gradiente y las membranas ImmunBlot PVDF fueron adquiridos a Bio-Rad (Hercules, CA). Los anticuerpos monoclonales de ratón ant¡-NS5A del VHC y anti-NS3 del VHC fueron adquiridos a Virogen (Watertown, MA). Los anticuerpos policlonales de cabra anti-humanos Bachl y GAPDH fueron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). ECL-Plus fue de Amersham (Piscataway, NJ).

B. Cultivo de células Las células 9-13 fueron provistas por la Universidad de Heidelberg, Heidelberg, Alemania. La línea de células 9-13, una población de células Huh-7 de hepatoma humano, contiene una región no estructural de VHC replicante y expresa establemente NS3 del VHC para NS5B. Las células fueron mantenidas en DMEM suplementado con 10% (v/v) FBS, 100 u/mL penicilina, 100 pg/mL estreptomicina, y 500 pg/mL G-418. Las células Huh-7.5 del replicón de longitud total Con 1 (subtipo 1 b) (células Con1 ) fueron provistas por el Dr. Charles M. Rice (The Rockefeller University, New York, NY). La línea de células Con1 es una población de células Huh-7.5 que contiene el replicón 1 b del genotipo del VHC de longitud completa con la sustitución de serina por isoleucina altamente adaptativa en el aminoácido 2204 del polipéptido.

Las células Con1 fueron mantenidas en DMFM suplementado con 10% (v/v) FBS y 0.1 mM aminoácidos no esenciales, 100 unidades/mL penicilina, 100 pg/mL estreptomicina, y antibiótico de selección 750 pg/mL G418. Las células fueron mantenidas en una atmósfera humidificada de 95% aire ambiente y 5% de C02 a 37 °C.

C. ARNs micro y Construcciones Los mímicos miRIDIAN de ARNmicro para has-ARNm-196, has-ARNmi-16, mutante customizado has-ARNm-196, y control negativo de mímico ARNmi (MMNC) fueron adquiridos a Dharmacon (Lafayette, CO). Los mímicos de ARN micro son oligonucleótldos de ARN de cadena doble químicamente modificados con ON-TARGET® para incrementar su estabilidad y mejorar su acción. Los mímicos de ARNmicro imitan al precursor endógeno ARNmi para ingresar al camino del ARNmi y actuar como especies maduras de ARNmi. Además, los siguientes inhibidores de ARNmi, has-R-196m¡ y el control negativo de inhibidor de ARNmi (MINC), también fueron adquiridós a Dharmacon. Los inhibidores miRIDIAN mlcroRNA horquilla son la más nueva generación de inhibidores de oligonucleótldos sintéticos diseñados para suprimir la actividad del ARNmi nativo. El vector pRL-TK fue adquirido a Promega. El vector reportero pRL-TK contiene un ADNc (R/uc) que codifica Renilla luciferasa como un reportero de control interno. La construcción reportera pGL3-Bach1 luciferasa, que contiene un fragmento de 1837 pb de 3'-UTR de Bachl , fue provisto por la Universidad de Florida, Gainesville, FL. El mutante pGL3-Bach1 fue generado por GENEWIZ, Inc. (South Plainfield, NJ). Las construcciones fueron confirmadas por digestión de enzima de restricción y secuenciado.

D. Transfección y Ensayos de Actividad de Luciferasa Las transfecciones fueron realizadas usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo a los protocolos del fabricante. Brevemente, las células 9-13 fueron co-transfectadas con pGL3-Bach1 o mutante pGL3-Bach, con pRL-TK, y con ARNmi testeado. Pasadas 48 horas de la transfección, las células fueron cosechadas y lisadas. La actividad de luciferasa fue medida usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual-Glo®. La actividad de la luciferasa de luciérnaga fue normalizada a actividad de luciferasa de renilla y el total de proteína determinado usando el kit de ensayos de proteínas BCA. Para facilitar la comparación, los valores para las células con transfección de pGL3-Bac 1 y pRL-TK se fijaron en 1.

E. Transcripción, Transfección e Infección En Vitro El clon infeccioso del VHC pJ6/JFH1 , el genoma quimérico completo con las regiones core-NS2 del J6 infeccioso (genotipo 2a) y las regiones NS3-NS5B del JFH1 infeccioso (genotipo 2a), fueron generosamente provistos por C. M. Rice (Rockefeller University, New York, NY). La producción de VHC generado en cultivo de células J6/JFH1 (VHCcc) ya ha sido descripta. Brevemente, el plásmido pJ6/JFH1 fue linealizado con Xbal, y purificado por precipitación en etanol, digestión con proteinasa K, y extracción con fenol-cloroformo. El plásmido linealizado fue utilizado como una plantilla para transcripción en vitro usando el kit MEGAscript T7 (Ambion, Austin, TX). Para la transfección del ARN de VHC, las células Húh-7.5 fueron colocadas en placas de 24 cavidades un día antes de la transfección y transfectadas al 70-80% de confluencia. Las células fueron transfectadas a una relación de ARN/lipofectamina de 1 :2 usando 2 pg/cavidad de ARN de VHC y 4 uL/cavidad de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por espacio de 48 horas. Para infectar las células Huh-7.5 na'íve, los supernatantes de cultivos celulares de las células transfectadas con ARN de VHC durante 48 h fueron colectados y filtrados por un filtro de 0.20 pm, y agregados a los cultivos de células na'fve infectadas Huh-7.5. ' F. Western Blots Se ejecutaron western blots según lo descripto. Brevemente, las proteínas totales (30-50 pg) fueron separadas en geles SDS-PAGE. Luego de una transferencia electroforética sobre membrana ImmunBlot PVDF, las membranas fueron bloqueadas por espacio de 1 hora en PBS conteniendo 5% de leche en polvo descremada y 0.1% Tween-20, y a continuación incubadas durante la noche con anticuerpo primario a 4o C. Las diluciones de los anticuerpos primarios fueron las siguientes: 1 :1000 para el anticuerpo anti-Bach1 de VHC y 1 :2000 para los anticuerpos de NS5A anti VHC y GAPDH. Las membranas luego fueron incubadas por espacio de una hora con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (dilución 1 :10,000). Finalmente, los anticuerpos unidos fueron visualizados con el sistema de quimioluminiscencia ECL-Plus de acuerdo al protocolo del fabricante. Un sistema de generación de imágenes computarizado Kodak 1 DV3.6 (Rochester, NY) fue empleado para medir la densidad óptica relativa de cada banda específica obtenida luego del Western blot.

G. RT-PCR Cuantitativo El total de ARN de las células testeadas fue extraído y se sintetizó el ADNc según lo descripto. Los iniciadores utilizados fueron los siguientes: iniciador con sentido específico Bach-1 5'-GGACACTCCTTG CCAAATGCAG-3' (22 bp), iniciador antisentido 5'-TG ACCTGGTTCTG G G CTCTC AC-3' (22 bp); iniciador con sentido específico HMOX1 5'-CGGGCCAGCAACAAAGTG-3' (18 bp), iniciador antisentido 5'-AGTGTAAGGACCCATCGGAGAA-3' (22 bp); iniciador con sentido específico Cul3 5'-GTGCTCACGACAGGATA-3' (17 bp), iniciador antisentido 5'-GTTTGGCTAAGTAGAACCTTC-3' 21 bp); iniciador con sentido específico GAPDH 5'-TTGTTGCCATCAATGACCC-3' (19 bp), iniciador antisentido 5'-CTTCCCGTTCTCAGCCTTG-3' (19 bp). El análisis RT-PCR cuantitativo en tiempo real fue ejecutado usando un Sistema de Detección de PCR en Tiempo Real CFX96TM (Bio-Rad) y el equipo ¡Q™ SYBR Green Supermix Real-Time PCR kit (Bio-Rad). Las muestras sin plantilla y sin transcriptasa inversa fueron incluidas como controles negativos, que, según lo esperado, produjeron señales insignificantes (valores Ct >35). Los valores de cambio fueron calculados por análisis Ct comparativo luego de la normalización de la cantidad de GAPDH en las mismas muestras. Los experimentos iniciales demostraron que los varios tratamientos y la manipulación de células un afectó la expresión del gen GAPDH.

H. Análisis estadístico El análisis inicial demostró que los resultados estuvieron normalmente distribuidos. En consecuencia, se usaron procedimientos estadísticos paramétricos. Se usó la prueba t de Student (para comparar dos condiciones) o análisis de variancia (para comparar más de dos) para analizar las diferencias entre las muestras. Los valores de P <0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Los experimentos fueron repetidos por lo menos tres veces con resultados similares. Todos los experimentos incluyeron por lo menos muestras triplicadas para cada grupo de tratamiento. Se presentan los resultados significativos para ciertos experimentos. Los análisis estadísticos fueron ejecutados con el software JMP 4.0.4 del SAS Institute (Cary, NC).

II. Resultados A. El Análisis por vía computacional predice dos coincidencias de la región semilla de R-196mi y la 3'-UTR del ARNm de Bachl Se utilizaron enfoques bioinformáticos para identificar los blancos de ARNmi potenciales. Una búsqueda en línea en la base de datos TargétScan 4.0 demostró la presencia de al menos dos sitios de coincidencia semilla de ARNm-196 putativos en la 3'-UTR de ARNm de Bachl . Según lo ilustrado en las Figuras 1A & B, uno de los sitios de unión pronosticados (2280-2286 nt) estuvo altamente conservado en el hombre, ratón, rata, pollo y perro, mientras que los otros sitios putativos (2161 -2166 nt) estuvieron pobremente conservados a través de las especies. No se encontraron sitios de unión m¡RNa-196 pronosticados en el gen Nrf2 y HMOX1 gene, y no se encontraron sitios de unión de ARNm-196 putativos en la región de codificación del gen Bachl (los datos no se ilustran).

B. ARNm-196 regula hacia abajo el represor transcripcional Bachl y regula hacia arriba HMOX1 en células 9-13 que expresan proteínas no estructurales de VHC Para verificar por vía experimental que los sitios de unión de R-196mi son funcionales, las células 9-13 fueron transfectadas con mímico o inhibidor de ARNm-196. Los niveles de proteína Bachl y ARNm fueron determinados por Western blots y qRT-PCR, respectivamente. Las células 9-13 transfectadas con mímico de ARNm-196 mostraron una reducción significativa en la expresión de los niveles de proteína Bachl de aproximadamente 55% luego de 24 h de la transfección y de aproximadamente 64% . luego de 48 h de la transfección con relación al control negativo de mímico de ARNmi (MMNC). No se detectaron efectos sobre los niveles de proteína Bachl en las células transfectadas con control negativo de mímico de ARNmi con relación a la transfección de prueba (Figura 2A). La regulación hacia abajo del ARNm-196 por el inhibidor específico de ARNm-196 incrementó en forma marcada los niveles de proteína Bachl contrariamente al control negativo de inhibidor de ARNmi (Figura 2B). Sin embargo, no se observaron efectos significativos del ARNm-196 sobre los niveles de ARNm de Bachl en las células 9-13. Los niveles de ARNm de Bachl no fueron alterados con la transfección del mímico de ARNm-196 (Figura 2C). Estos resultados demostraron que la regulación de ARNm-196 sobre Bachl puede producirse a un nivel traslacional en las células de hepatoma humano 9-13.

Dado que Bachl es un represor transcripcional bien establecido del gen HMOX1 , los inventores de la presente luego determinaron si la regulación hacia abajo de la proteína Bachl por ARNm-196 podría incrementar la expresión del gen HMOX1. Así, las células 9-13 fueron transfectadas con mímico de ARNm-196 o control negativo de mímico de ARNmi durante 48 h. Luego de 48 horas, los niveles de ARNm de HMOX1 y Cullin 3 (Cul 3, control de gen no específico) fueron cuantificados por qRT-PCR. El mímico de ARNm-196 reguló hacia arriba en forma marcada los niveles de ARNm de HMOX1 2.4 veces con respecto a la misma cantidad de control negativo de mímico de ARNmi según se indica en la Figura 3A. Los niveles de ARNm de Cul 3 no fueron regulados hacia arriba tal como se indica en la Figura 3B.

C. El ARNm-196 reprime la expresión de proteínas NS5A no estructurales del VHC en células 9-13 que expresan proteínas no estructurales de VHC Hasta la presente invención, no se sabía si el ARNm-196 alteraba los niveles de proteínas NS5A no estructurales del VHC en células de hepatoma humano que expresan proteínas no estructurales de VHC. Para determinar si el ARNm-196 altera los niveles de proteínas NS5A no estructurales del VHC en células de hepatoma humano que expresan proteínas no estructurales de VHC, las células 9-13 fueron transfectadas con mímico de ARNm-196 o inhibidor. Luego de 24 h y 48 h de la transfección, se ejecutaron Western blots para analizar los niveles de proteínas NS5A y GAPDH. 50 nM mímico de ARNm-196 generaron una marcada reducción en la expresión de los niveles de proteínas NS5A de aproximadamente 52% luego de 24 h desde la transfección, y de aproximadamente 37% luego de 48 h, con relación a la misma cantidad de control negativo de mímico de ARNmi según se ilustra en la Figura 4A. Contrariamente, la regulación hacia abajo de ARNm-196 mediante el inhibidor específico de ARNm-196 incrementó significativamente los niveles de proteínas NS5A en 2.2 veces según se ¡lustra en la Figura 4B. Para evaluar si el ARNm-196 puede inhibir la replicación del VHC, se transfectaron células Huh-7.5 con el replicón de VHC de longitud total Con1 con controles negativos o mímico de ARNm-196 por espacio de 48 horas. Según se ilustra en la Figura 4C, el ARNm-196 dio como resultado una reducción marcada de los niveles de ARN viral, con relación al control negativo de mímico de ARNmi (MMNC).

D. R-196m¡ inhibe la expresión de VHC en el sistema de cultivo de células a base de JFH1 de VHC Las Huh-7.5 células fueron transfectadas con 2 g/cavidad de ARN J6/JFH1 de VHC mediante Lipofectamina 2000. Luego de 48 h, las células fueron transfectadas con mímico de ARNm-196, o control negativo de mímico de ARNmi (MMNC). Para la infección con VHC, Huh-7.5 na'íve fueron cultivadas con 1 mL de supernatante del cultivos celulares cosechados de células transfectadas con J6/JFH1 , según se ha descripto. Luego de 48 horas de exposición a los supernatantes, las células fueron transfectadas con mímico de ARNm-196, o control negativo de mímico de ARNmi (MMNC) durante 48 h. Las células fueron cosechadas y se extrajo el total de ARN y proteínas. El ARN de VHC fue cuantificado por qRT-PCR, y los niveles de proteínas NS3 del VHC y GAPDH fueron medidos por Western blots.

- ' Se encontró una coincidencia perfecta para el ARNm-196 en la región de codificación del gen NS5A del VHC en el genoma VHC JFH1. Se observó un efecto regulatorio hacia abajo del ARNm-196 sobre la expresión del VHC en el sistema de cultivo celular VHC J6/JFH1. 50 nM de ARNm-196 condujeron a una disminución significativa del ARN J6/JFH1 de VHC de prácticamente 70% en las células Huh-7.5 transfectadas con J6/JFH1 (según se ilustra en la Figura 9A), de -50% en las células Huh-7.5 infectadas con J6/JFH1 (según se ilustra en la Figura 9B), y -60% de reducción de la proteína NS3 del VHC en las células Huh-7.5 infectadas con J6/JFH1 (según se ilustra en la Figura 9C). Estos resultados fueron consistentes con las observaciones previas en el sistema de cultivo celular JFH1.

E. El ARNm-196 interactúa directamente con la 3'-UTR del ARNm de Bachl en células 9-13 que expresan proteínas no estructurales de VHC Para establecer aún mejor que el ARNm-196 apunta la 3'-UTR de ARNm de Bachl , que contiene dos sitios de coincidencia semilla pronosticados para R-196mi según se ilustra en Figura 5A, en lugar de ejercer una regulación menos directa y específica, se utilizó una construcción reportera denominada pGL3-Bach1 con la 3'-UTR de Bachl caudal abajo del marco de lectura abierto de la luciferasa de luciérnaga (f-luc) (Figura 5B). Las células 9-13 fueron co-transfectadas con pGL3-Bach1 (f-luc), pRL-TK (renilla, para normalizar la eficacia de transfección), y con controles negativos de ARNmi, mímico de ARNm-196 o inhibidor o ARNm-196 (un miR "negativo" sin sitios de unión pronosticados en la 3'-UTR de ARNm de Bachl ). 48 horas luego de la transfección, se determinó la actividad reportera de luciferasa. La transfección con mímico de ARNm-196 disminuyó marcadamente la actividad reportadora en aproximadamente 53%, mientras que el control negativo de mímico de ARNmi y el mímico de ARNm-196 no tuvieron efecto sobre la actividad de luciferasa. Además, no se observó un cambio marcado en la actividad reportera en las células transfectadas con inhibidor de ARNm-196. Según lo ¡lustrado en la Figura 5C, el mímico de ARNm-196 inhibió la acción de f-luc del reportero pGL3-Bach1 , mientras el inhibidor de ARNm-196 incrementó levemente la actividad de f-luc del reportero pGL3-Bach1 (Figura 5D).

A continuación, las células 9-13 fueron co-transfectadas con la construcción reportera Luc que contiene un mutante de cuatro nucleótidos Bachl 3'-UTR, denominado pGL3-Bach1-Mut (Figura 6A), y con pRL-TK, y con mímico de ARNm-196 o mímico de ARNmi-155 (un m¡R "negativo", sin cambios de los sitios de unión pronosticados de R-155m¡ en pGL3-Bach1-WT y pGL3-Bach1- ut). 48 horas luego de la transfección, se midió la actividad del reportero de luciferasa usando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Dual de Promega, la actividad de la luciferasa de luciérnaga fue normalizada con la actividad de la luciferasa de renllla y el total de proteínas. Según se ilustra en la Figura 6B, el mímico de ARNm-196 redujo la actividad de f-luc de pGL3-Bach1 -WT pero no del reportero pGL-Bach1 -Mut. La transfección con mímico miRNa-196 disminuyó marcadamente la actividad de luciferasa de acuerdo a la dosis, mientras que ARNm-196 no modificó la actividad en las células transfectadas con la construcción reportera que contiene los sitios de unión de mutante para ARNm-196. ARNmi-155 redujo marcadamente la actividad reportera en pGL3-Bach1-WT y pGL3-Bach1-Mut según se ilustra en Figura 6C. Estos resultados demuestran que el ARNm-196 regula en forma directa la expresión del gen Bachl y que el ARNm-196 media regulación hacia abajo de Bachl a través de la 3'-UTR del ARNm de Bachl .

Para determinar de una mejor manera la interacción directa entre el ARNm-196 y Bachl -3'-UTR, se introdujeron mutantes de cuatro nucleótidos para producir el mutante ARNmi 196 según se ilustra en Figura 7A, donde se eliminaron los sitios de coincidencia semilla para la 3'-UTR del ARNm de Bachl . Las células fueron co-transfectadas con pGL3-Bach1-WT, y con pRL-TK, y con mayores concentraciones de control negativo de mímico de ARNmi, mímico de ARNm-196 o mutante mímico de ARNm-196, se determinó la actividad del reportero de luciferasa. Según se ilustra en la Figura 7B, el ARNm-196 generó una marcada reducción en la actividad de luciferasa de acuerdo a la dosis, que fue constante con nuestras observaciones previas, en tanto los controles negativos de ARNmi y mutante R-196mi no afectaron la actividad de luciferasa, lo cual indica además la interacción directa entre R-196mi y la 3'-UTR de ARNm de Bachl .

El mutante ARNm-196 (R-196mi-Mut), que contiene la base complementaria con el mutante pGL3-Bach1 (pGL3-Bach1-Mut), debería recuperar su efecto sobre la actividad del reportero mutante (Bachl -3'-UTR-Mut) dado que nuevamente concuerdan perfectamente en sus regiones semilla según se ilustra en Figura 8A. El mímico de ARNm-196 mutante inhibió marcadamente la actividad de luciferasa en las células transfectadas con mutante pGL3-Bach1 , que mutó para calzar con el mutante ARNm-196. Por otra parte, no se observaron efectos significativos del ARNm-196 natural sobre la actividad de luciferasa del reportero mutante (pGL3-Bach1-Mut). Asi, se comprobó adicionalmente la interacción directa entre ARNm-196 y la 3'-UTR del ARNm de Bachl según lo ilustrado por la Figura 8B.

El trabajo experimental antes descripto ilustra que la transfección de mímico de ARNm- 196 reguló marcadamente hacia abajo Bachl y los niveles de proteínas NS5A no estructurales del VHC, y reguló hacia arriba la expresión del gen HMOX1. Como tal, el ARNm-196 puede jugar un rol importante, tal vez crítico, en la regulación de la replicación del VHC y la expresión de HMOX1 /Bachl en hepatocitos. En consecuencia, la regulación hacia arriba de R-196mi puede proveer un nuevo enfoque terapéutico adicional para la terapia de la hepatitis C crónica, y probablemente, otros trastornos hepáticos.

Los expertos en el arte advertirán muchas modificaciones y otras realizaciones de la invención en base a lo precedentemente descripto y los dibujos asociados. En consecuencia, se entiende que la invención no se limita a las realizaciones reveladas y que las modificaciones y demás realizaciones caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. A pesar de haberse empleado términos específicos, se usan en un sentido genérico y descriptivo solamente y no con fines de limitación.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación para el tratamiento de células que expresan proteínas de VHC y mamíferos que padecen hepatitis C, caracterizada porque comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva de mímico de ARNmi-196 de modo que el ARNmi-196 sea sobreexpresado o regulado hacia arriba reduciendo la expresión de Bach 1 ; en tanto la formulación está adaptada para permitir la transfección de mímico de ARNmi-196 en hepatocitos que expresan proteínas de VHC.

2. La formulación de la Reivindicación 1 , caracterizada porque comprende interferón para asistir a la regulación hacia arriba del ARNmi-196.

3. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el mímico de ARNmi-196 es incluido en los liposomas de modo que el mímico de ARNmi-196 pueda ser liberado en células que expresan proteínas de VHC.

4. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la formulación comprende lípidos catiónicos.

5. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque comprende además anfifilos catiónicos, polímeros catiónicos, dendrímeros, fosfato de calcio, o combinaciones de los mismos, de manera que el mímico de ARNm- 96 pueda ser liberado en células que expresan proteínas de VHC

6. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la formulación se encuentra bajo una forma adecuada para administración oral.

7. La formulación de la Reivindicación 6, caracterizada porque la formulación se encuentra bajo la forma de una tableta, cápsula, o preparación líquida oral.

8. La formulación de la Reivindicación 1 , caracterizada porque la formulación se encuentra bajo una forma adecuada para inyección o infusión destinada a un mamífero.

9. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la formulación provee una reducción en la expresión de niveles de proteína Bachl de aproximadamente entre 10% y aproximadamente 75%.

10. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la formulación provee una reducción en la expresión de niveles de proteína Bachl 24 horas luego de la transfección de aproximadamente entre 50% y aproximadamente 60%.

11. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la formulación provee una reducción en la expresión de niveles de proteína Bachl 48 horas luego de la transfección de aproximadamente entre 60% y aproximadamente 70%.

12. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la formulación indirectamente regula hacia arriba la expresión del gen HMOX1 en células infectadas con VHC.

13. La formulación de la Reivindicación 12, caracterizada porque la expresión del gen HMOX1 aumenta aproximadamente entre 2 y aproximadamente 3 veces por sobre el nivel de expresión de HMOX1 en células que no han sido transfectadas con mímico de ARNmi-196.

14. La formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la cantidad terapéuticamente efectiva de mímico de ARNmi-196 comprende entre 0.5 y 5 pmol/kg de peso corporal.

15. Una formulación para el tratamiento de células que expresan proteínas de VHC y mamíferos que padecen hepatitis C, caracterizada porque comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva de mímico de ARNmi-196 de manera que los niveles de expresión de Bachl y NS5A de VHC sean regulados hacia abajo mientras aumenta la expresión de H OX1 ; en tanto la formulación está adaptada para permitir la transfección de mímico de ARNmi-196 en hepatocitos que expresan proteínas de VHC.

16. La formulación de la Reivindicación 15, caracterizada porque la expresión de los niveles de proteína NS5A de VHC se reducen entre 10 y 60 por ciento.

17. La formulación de la Reivindicación 15, caracterizada porque la expresión de los niveles de proteína NS5A de VHC 24 horas luego de la transfección comprende una reducción de aproximadamente entre 45 y aproximadamente 55 por ciento.

18. La formulación de la Reivindicación 15, caracterizada porque la expresión de los niveles de proteína NS5A de VHC 48 horas luego de la transfección comprende una reducción de aproximadamente entre 35 y aproximadamente 45 por ciento.

19. Un método de tratamiento de células infectadas con la cepa pJ6/JFH1 de VHC genotipo 2a, caracterizado porque comprende un paso de transfección de las células con mímico de ARNmi-196 de modo que el ARNmi-196 se una al ARNm de la 3'-UTR de Bachl para reducir la expresión de Bachl en las células infectadas.

20. El método de la Reivindicación 19, caracterizado porque comprende además regular hacia arriba la expresión del gen HMOX1 en las células.

21. El uso de una formulación de acuerdo a cualquiera de las Reivindicaciones 1-18, caracterizado por aplicarse a la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección con VHC.