KR101654526B1 - 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101654526B1
KR101654526B1 KR1020150145274A KR20150145274A KR101654526B1 KR 101654526 B1 KR101654526 B1 KR 101654526B1 KR 1020150145274 A KR1020150145274 A KR 1020150145274A KR 20150145274 A KR20150145274 A KR 20150145274A KR 101654526 B1 KR101654526 B1 KR 101654526B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
asp
val
ile
ala
gly
Prior art date
Application number
KR1020150145274A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150123213A (ko
Inventor
김세미
남은희
이윤희
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020150145274A priority Critical patent/KR101654526B1/ko
Publication of KR20150123213A publication Critical patent/KR20150123213A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101654526B1 publication Critical patent/KR101654526B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명에서는, 대장암 세포주에서 카드헤린-11(cadherin-11)이 과발현되고, 카드헤린-11의 발현을 siRNA로 저해한 결과, 암세포 침윤 및 세포 이동성이 감소하며, 상피세포-중간엽세포(epithelial-mesenchymal transition, EMT)이 억제되고, 세포신호전달이 저해됨을 확인하였다. 또한, 대장암, 간암 및 위암의 세포주에서 카드헤린-11은 EMT유도 전사인자 ZEB2에 의해 직접적으로 발현이 유도됨을 확인함으로써 카드헤린-11이 대장암, 간암 및 위암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the treatment of colorectal cancers or inhibition of metastasis containing the expression or activity inhibitors of cadherin―１１}
본 발명은 신규한 암 치료 표적인 카드헤린-11(cadherin-11) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암, 간암 또는 위암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
대장암은 전 세계적으로 연간 100만 명의 환자가 발생하고 53만 명이 사망하는 난치성 질환으로, 노령화와 식이패턴의 변화에 따라 우리나라에서도 전체 암 발생의 12.7 %로 3위를 차지할 정도로 빠른 속도로 증가하고 있다. 현재 대장암에 효과적인 항암제로는 5-에프유, 유에프티, 카페시타빈(상품명: 젤로다)과 같은 플루오로피리미딘계 약물, 이리노테칸(상품명: 갬푸토) 및 옥살리플라틴과 같은 약물이 널리 이용되고 있으며, 미국, 유럽 등 세계 7대 제약시장에서 대장암 치료제 시장은 현재 9억 달러 규모에서 2017년 78억 달러로 급성장할 전망이다. 이러한 약물의 지속적인 사용은 내성의 증가 및 부작용을 나타낼 수 있다는 문제점을 항상 지니고 있어, 새로운 치료제의 개발 및 진단에 대한 연구가 필요한 시점이다.
현재 대장암의 진단 마커로 이용되고 있는 암태아성항원(CEA)은 태아 시기에 정상적으로 만들어지는 일종의 당단백질로, 정상적으로는 태어나기 전에 이 물질의 생산이 중단되기 때문에, 성인에게서 신생아보다도 더 높은 암태아성항원(CEA)의 수치가 나타난다면 이것은 대장암이나 다른 암이 있을 가능성이 있음을 제시하나, 이 수치는 간경변증, 간질환, 알코올성 췌장염 환자나 그리고 흡연자에게서도 증가할 수 있어, 보조적으로 사용되고 있는 실정이다.
위암은 전세계적으로 암이환율 및 암사망율이 가장 높은 암이며, 한국을 비롯하여 일본, 중국, 러시아, 중유럽, 남중미, 홍콩, 스칸디나비아 등에서 암으로 인한 사망 중 가장 많은 원인을 차지하고 있다. 한국이나 일본 남성의 16 % 이상이 위암으로 사망하고 있는 것으로 나타나고 있다. 특히, 한국이나 일본 등 아시아의 경우, 다른 대륙의 인종들에 비해 위암 발병율이 높은 것으로 보고되고 있는데, 이는 민족이나 인종의 차이로 보기는 어렵고, 암 발생에 제일 중요한 생활환경의 차이, 특히 식생활의 차이에서 오는 것으로 보고되고 있다. 한국인의 경우, 하루 소금 섭취량은 약 20g으로 서양인보다 두 배 가까이 많이 섭취하고 있으며, 특히 소금에 절인 생선을 먹는 습관이 있는 한국, 일본, 핀란드, 아이슬란드 등에서 위암의 발생률이 높은 것으로 보고되고 있다. 또한 위암의 발병원인으로 식습관 이 외에도 유전적인 원인이 관여하고 있는데, 위암환자의 1세대 자손들에게 위암의 발생률이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있으며, 위암의 증상이 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 보이며, 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 증상이 있다고 하더라도 비교적 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬어 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다. 현재 위암을 포함하여 각종 암을 치료하는 주요한 치료법으로는 외과적인 수술, 방사선조사 및 화학요법 중 1가지 또는 이들의 조합을 통한 치료법이 사용되고 있는데, 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 것을 포함하며, 이러한 외과적 수술은 종양조직 또는 이들 주변의 조직을 제거하는 데에는 효과적이지만 척추와 같이 수술하기 어려운 구역에 있는 종양을 치료하거나 백혈병과 같은 전신에 흩어져 있는 분산성 종양을 치료하는 데는 사용할 수 없다. 화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사를 붕괴시켜 암을 치료하는 것으로서 각종 종양의 치료에 사용될 수 있으나, 정상세포에도 작용하므로 심각한 부작용을 일으킨다. 특히, 세포분열과 세포대사가 활발하게 일어나는 조혈기관에 작용하여 환자의 면역 체계를 약화시키는 심각한 부작용을 일으키기도 한다. 이러한 부작용은 환자의 생명에 큰 영향을 미치며, 또한, 약물의 투여시 주의해야 하는 주용량 제한 독성(DLT)이 있다. 이와 같이 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 임상적 처치시 주요 문제가 되고 있으므로, 화학요법 치료제의 부작용을 감소시킬 수 있는 체내 안정성이 우수한 새로운 항암제의 개발이 시급한 실정이다.
위암은 전세계적으로 암이환율 및 암사망율이 가장 높은 암이며, 한국을 비 롯하여 일본, 중국, 러시아, 중유럽, 남중미, 홍콩, 스칸디나비아 등에서 암으로 인한 사망 중 가장 많은 원인을 차지하고 있다. 그러나 위암에 대한 탁월한 치료효과를 가진 항암제는 개발되어 있지 않은 실정이다.
카드헤린-11은 주로 유방암세포 및 전립선암세포에서 발현되며, 전립선암세포의 침윤을 유도하는 것으로 보고되었다(Huang et al., (2010) Cancer Res. 70(11)4580-4589). 반면, 카드헤린-11은 정상의 상피 세포에 대비 다양한 암 세포주에서 발현이 억제되어 있으며, 카드헤린-11 발현이 암 발현를 억제하고 암 세포 아포토시스(apoptosis)를 유도할 뿐만 아니라, EMT를 억제함이 보고되고 있다(Li et al., Oncogene 2011 Dec 5. doi: 10.1038/onc.2011.541. Epub ahead of print). 따라서, 카드헤린-11의 암세포 전이에서의 기능은 다양한 것으로 보인다. 한편, 카드헤린-11의 대장암, 위암 및 간암에서의 기능은 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 카드헤린-11이 대장암 세포주에서 과발현하고, 대장암, 위암 및 간암 세포주에서 카드헤린-11의 발현을 저해한 결과 암세포 침윤 및 세포 이동성이 감소하며, 상피세포-중간엽세포(epithelial-mesenchymal transition, EMT)이 억제되고, 세포신호전달이 저해됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 암 치료 표적인 카드헤린-11(cadherin-11) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카드헤린-11(cadherin-11) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 대장암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 카드헤린-11 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 카드헤린-11 단백질의 발현 세포주에 대해 카드헤린-11 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 카드헤린-11 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;
를 포함하는, 대장암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 카드헤린-11 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 카드헤린-11 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 카드헤린-11 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;
를 포함하는, 대장암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 치료 또는 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법.
아울러, 본 발명은
1) 피검 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 카드헤린-11 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
2) 상기 카드헤린-11 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군에 비해 감소한 피검 개체를 대장암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암에 걸릴 위험 또는 암 전이 위험성이 높은 것으로 판단하는 단계;
를 포함하는, 대장암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암 발달 또는 전이의 모니터링 또는 진단의 정보를 제공하기 위한, 단백질의 발현 또는 활성 수준 측정 방법을 제공한다.
본 발명에서는 대장암 세포주에서 카드헤린-11(cadherin-11)이 과발현되고, 카드헤린-11의 발현을 siRNA로 저해한 결과, 암세포 침윤 및 세포 이동성이 감소하며, 상피세포-중간엽세포(epithelial-mesenchymal transition, EMT)이 억제되고, 세포신호전달이 저해됨을 확인하였다. 또한, 대장암, 간암 및 위암의 세포주에서 카드헤린-11은 EMT유도 전사인자 ZEB2에 의해 직접적으로 발현이 유도됨을 확인함으로서 카드헤린-11이 암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 대장암 세포주인 SW480에서 카드헤린-11의 발현 억제에 의한 암세포의 침윤능 및 세포이동성의 변화를 확인한 결과, 카드헤린-11 발현 억제에 의해 대장암 세포의 침윤 및 세포이동성이 감소함을 나타낸 그림이다.
도 2는 대장암 세포주에서 카드헤린-11의 발현 억제에 의한 세포신호전달 및 EMT 변화를 분석하기 위하여, 카드헤린-11 특이적 siRNA를 도입하고 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과, 카드헤린-11는 대장암세포의 EMT를 유도하고 암세포침윤 및 세포이동성을 유도함을 나타낸 그림이다.
도 3은 ZEB2가 대표적인 E-카드헤린 전사 억제자 및 EMT 유도 전사로써 암세포의 침윤 및 전이와 관련이 있으므로 ZEB2에 의해 카드헤린-11의 발현이 유도됨을 리포터 분석(reporter assay)한 결과, SW480, AGS 및 HEK293E 세포에서 ZEB2에 의해 카드헤린-11 프로모터가 활성 됨을 확인한 그림이다.
도 4는 ZEB2에 의해 카드헤린-11의 발현이 유도됨을 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 검사(Real time qPCR analysis)로 확인한 결과, SW480 세포에 ZEB2를 형질전환시킨 후 카드헤린-11 mRNA 수준이 증가하였고, 내재성 ZEB2를 발현하는 위암세포인 SNU-638 및 간암세포 SNU-398에 ZEB2-특이적 siRNA를 형질전환시킨 후 카드헤린-11 mRNA 발현이 감소함을 확인한 그림이다.
도 5는 ZEB2에 의한 카드헤린-11 유도에 Sp1이 요구될 것으로 예상하고 이를 검증하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 검사 및 웨스턴 블롯 분석을 한 결과, ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현이 Sp1 활성 억제에 의해 감소됨을 확인한 그림이다.
도 6은 ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현에 Sp1-특이적 siRNA의 영향을 확인하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 확인한 결과, ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현이 Sp1-특이적 siRNA에 의해서도 감소함을 확인한 그림이다.
도 7은 간암세포주인 SNU-638 세포에서 ZEB2 및 Sp1 구체적으로 카드헤린-11 프로모터의 어느 부위에 결합하는지 알아보기 위해 ChIP을 수행한 결과, 카드헤린-11 프로모터 (-191/-62) 영역에 ZEB2 및 Sp1이 특이적으로 결합함을 확인한 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 카드헤린-11(cadherin-11) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 대장암, 간암 및 위암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 카드헤린-11 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열, 이의 단편 또는 상기 이내 몇 개의 아미노산 이 첨가, 결심 또는 치환된 돌연변이 서열이 모두 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 구체적으로 상기 카드헤린-11은 서열번호 1의 아미노산 서열, 상기 아미노산 서열 1 ~ 22 번째가 일부 제거된 단편(서열 번호 24), 상기 아미노산 서열 23 ~ 53 번째가 일부 제거된 단편(서열 번호 25), 상기 아미노산 서열 1 ~ 53번째가 일부 제거된 단편(서열 번호 26)인 것이 보다 바람직하다.
상기 카드헤린-11 단백질은 ZEB2(zinc finger E-box-binding homeobox 2)에 의해 발현이 유도되는 것이 바람직 하나 이에 한정되지 않는다.
상기 카드헤린-11 단백질의 발현 억제제는 카드헤린-11 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), ZEB2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, shRNA, siRNA 또는 ZEB2 단백질의 항체, 또는 Sp1(specificity protein 1) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, shRNA, siRNA 또는 Sp1 단백질의 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 카드헤린-11 단백질의 활성 억제제는 카드헤린-11 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질 유사체, 앱타머 또는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 대장암 세포주인 SW480에서 카드헤린-11의 발현 억제에 의한 암세포의 침윤능 및 세포이동성의 변화를 확인하였다. 그 결과 카드헤린-11 발현 억제에 의해 대장암 세포의 침윤 및 세포이동성이 감소하였다(도 1).
대장암 세포주에서 카드헤린-11의 발현 억제에 의한 세포신호전달 및 EMT 변화를 분석하기 위하여, 대장암 세포주인 SW480에 카드헤린-11 특이적 siRNA를 도입하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과, SW480 세포에서 siRNA로 카드헤린-11의 발현을 억제한 결과, 중간엽세포 마커인 인테그린 알파5 및 비멘틴의 발현이 감소하며 및 상피세포 마커인 E-카드헤린의 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한, 전사인자 Sp1의 발현이 감소하였고, FAK, ERK 및 c-src의 인산화가 감소함을 확인하였으며 이러한 결과를 통하여 카드헤린-11 발현억제에 의해 EMT가 억제되고 세포신호전달이 불활성화되었다. 따라서, 카드헤린-11는 대장암세포의 EMT를 유도하고 암세포침윤 및 세포이동성을 유도하는 기능을 하는 것을 확인하였다(도 2).
본 발명자들은 ZEB2가 대표적인 E-카드헤린 전사 억제자 및 EMT 유도 전사로써 암세포의 침윤 및 전이와 관련이 있으므로 ZEB2에 의해 카드헤린-11의 발현이 유도됨을 리포터 분석(reporter assay)으로 확인하였다. 그 결과 SW480, AGS 및 HEK293E 세포에서 ZEB2에 의해 카드헤린-11 프로모터가 활성 됨을 확인하였다 (도 3).
ZEB2는 대표적인 E-카드헤린 전사 억제자 및 EMT 유도 전사로써 암세포의 침윤 및 전이와 관련이 있으므로 ZEB2에 의해 카드헤린-11의 발현이 유도됨을 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 검사(Real time qPCR analysis)로 확인하였다. 그 결과, SW480 세포에 ZEB2를 형질전환에서 카드헤린-11 mRNA 수준이 증가하였고, 내재성 ZEB2를 발현하는 위암세포인 SNU-638 및 간암세포 SNU-398에 ZEB2-특이적 siRNA를 형질전환 시킨 후 카드헤린-11 mRNA 발현이 감소함을 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 검사로 확인하였다(도 4).
ZEB2에 의해 중간엽 세포 마커인 인테그린 알파5 및 비멘틴의 발현유도에는 전사인자 Sp1이 관여함을 확인하였다(Nam et al., (2012) Carcinogenesis 33(3):563-571). 따라서, ZEB2에 의한 카드헤린-11 유도에 Sp1이 요구될 것으로 예상하고 이를 검증하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 검사 및 웨스턴 블롯 분석하였다. 그 결과, ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현이 Sp1 활성 억제에 의해 감소됨을 확인하였다(도 5).
ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현이 Sp1 활성 억제에 의해 감소됨을 확인한 결과를 통해 ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현에 Sp1-특이적 siRNA의 영향을 확인하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 하였다. 그 결과, ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현이 Sp1-특이적 siRNA에 의해서도 감소함을 확인하였다(도 6).
간암세포주인 SNU-638 세포에서 ZEB2 및 Sp1 구체적으로 카드헤린-11 프로모터의 어느 부위에 결합하는지 알아보기 위해 ChIP을 수행하였다. 그 결과, 카드헤린-11 프로모터 (-191/-62) 영역에 ZEB2 및 Sp1이 특이적으로 결합함을 확인하였다(도 7).
따라서, 대장암 세포주에서 카드헤린-11의 발현을 siRNA로 저해한 결과, 암세포 침윤 및 세포 이동성이 감소하고, 상피세포-중간엽세포(epithelial-mesenchymal transition, EMT)이 억제되며, 세포신호전달이 저해됨을 확인하였다. 또한, 카드헤린-11은 EMT유도 전사인자 ZEB2에 의해 직접적으로 발현이 유도되는 것을 통해 카드헤린-11이 대장암, 간암 또는 위암의 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 카드헤린-11 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량 %로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법 또는 암전이 억제 방법을 제공한다.
상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
대장암 세포주에서 과발현되고, 카드헤린-11의 억제에 의해 대장암, 간암 및 위암 세포의 성장, 이동, 침윤 및 전이가 저해되고 세포사멸이 유도됨으로써, 신규한 항암제의 표적으로서 카드헤린-11의 가능성을 확인하였으므로, 카드헤린-11 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 대장암, 간암 또는 위암의 치료 또는 전이 억제에 유용하게 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 카드헤린-11 단백질을 이용한 대장암, 간암 또는 위암의 치료 또는 전이 억제용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은
1) 카드헤린-11 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 세포주의 카드헤린-11 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 카드헤린-11 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 세포주는 대장, 간 및 위 세포 또는 대장암, 간암 또는 위암 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 대장암, 간암 및 위암 세포주인 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 2) 및 3)에서
a) ZEB2 또는 Sp1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
b) ZEB2 또는 Sp1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암, 간암 또는 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 치료 또는 전이 억제용 후보물질을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또 다른 방법은,
1) 카드헤린-11 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 카드헤린-11 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 카드헤린-11 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 세포주는 대장, 간 및 위 세포 또는 대장암, 간암 또는 위암 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 대장암, 간암 및 위암 세포주인 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2) 및 3)에서
a) ZEB2 또는 Sp1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
b) ZEB2 또는 Sp1 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암, 간암 또는 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 치료 또는 전이 억제용 후보물질을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또 다른 방법은,
1) 피검 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 카드헤린-11 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
2) 상기 카드헤린-11 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군에 비해 감소한 피검 개체를 대장암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암에 걸릴 위험 또는 암 전이 위험이 높은 것으로 판단하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암, 간암 또는 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 치료 또는 전이 억제용 후보물질을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 피검 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 래빗, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 세포주는 대장, 간 및 위 세포 또는 대장암, 간암 또는 위암 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 대장암, 간암 및 위암 세포주인 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1) 및 2)에서
a) ZEB2(zinc finger E-box-binding homeobox 2) 또는 Sp1(specificity protein 1) 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
b) ZEB2 또는 Sp1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 정상 대조군에 비해 감소한 피검 개체을 선별하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는,대장암, 간암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암에 걸릴 위험 또는 암 전이 위험성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 암세포주 배양
SW480(대장암세포주), AGS(위암세포주) 및 HEK293E(Human Embryonic Kidney 293E) 세포주는 미국종균은행(USA)에서 제공받았다. SNU-638(위암세포주), SNU-398(간암세포주) 세포주는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 제공받았다. SW480, AGS, SNU-638 및 SNU-398 세포주는 10 % FBS, 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민 및 소디움 피루베이트가 포함된 RPMI1640(GIBCO, USA)배지에서 배양하였다. HEK293E는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Medium: GIBCO, USA)배지에서 배양하였다. 모든 세포주는 37℃ 및 5 % CO2 조건에서 배양하였다.
< 실시예 2> 암세포주에 카드헤린 -11 특이적 siRNA 형질전환
암세포주에서 카드헤린-11의 발현을 억제하고 세포의 형태학적 변화를 확인하기 위하여, 카드헤린-11 특이적 siRNA를 대장암 세포주인 SW480에 전기천공기법
(Neon Transfection system, Invitrogen)을 이용하여 형질전환하였다.
구체적으로, 세포를 수확한 뒤, PBS로 세척하고, R 버퍼(buffer)에 3 × 105세포/12 ul의 농도로 재현탁한 뒤, 40 uM siRNA 2 ul를 첨가하고 전기천공 기기를 이용하여 형질전환하였다.
48시간 후, 세포를 수확하여 침윤 및 세포이동성 실험을 하거나, 세포를 용해하여 웨스턴 블롯 실험을 하거나, RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다. 사용한 카드헤린-11-특이적 siRNA(Dharmacon 社) 4종의 믹스츄어(mixture) 그 표적 서열 4종은 하기와 같다:
5'-GUG AGA ACA UCA UUA CUU A-3'(서열 번호 2)
5'-GGA CAU GGG UGG ACA UAU G-3'(서열 번호 3)
5'-GGA AAU AGC GCC AAG UUA G-3'(서열 번호 4), 및
5'-CCU UAU GAC UCC AUU CAA A-3'(서열 번호 5).
또한, 인테그린 알파5-특이적 siRNA 서열은 5'-GGACCAAGGCAGAAGGCAGTT-3'(서열 번호 6)이고, Sp1-특이적 siRNA 서열은 5'-GGUAGCUCUAAGUUUUGAUTT-3'(서열 번호 7)이며 ZEB2-특이적 siRNA(Dharmacon 4종의 mixture)이고 하기에 기재되어있다.
5'-GAA CAG ACA GGC UUA CUU AUU-3'(서열번호 8)
5'-GAA GCU ACG UAC UUU AAU AUU-3'(서열번호 9)
5'-CAA CAU AUC CAC UCC AUU UUU-3'(서열번호 10), 및
5'-GGA GAC AGA UCA GUA AUA UUU-3'(서열번호 11).
< 실시예 3> 암세포주에서 카드헤린 -11 유전자 발현 확인
암세포주에서 카드헤린-11 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 1>의 조건으로 배양한 다양한 세포주로부터 트리졸(Trizol, Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, cDNA는 역전사효소(바이오니어, 한국)를 이용하여 합성하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응 정량은 SYBR 그린(PKT, 한국)을 사용하여 수행하였다. 카드헤린-11의 구체적인 프라이머 서열은 정방향 프라이머: 5'-CCAACAGCCCGATAAGGTAT-3'(서열 번호 12) 및 역방향 프라이머: 5'-TGGATTTCTGCTGCAAAGAC-3'(서열 번호 13)을 사용하였다.
한편, PCR 반응의 내부 대조군으로, GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)을 사용하였고, 이때 이용한 프라이머는 정방향 프라이머: 5'-CATGACCACAGTCCATGCCAT-3'(서열 번호 14) 및 역방향 프라이머: 5'-AAGGCCATGCCAGTGAGCTTC-3'(서열 번호 15) 이었으며, 어닐링 온도는 58 ℃에서 수행하였다. 결과로 얻어진 PCR 산물은 2 % 아가로즈 겔 또는 5 %, 8 % 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 발현 유무를 확인하였다.
< 실시예 4> 카드헤린 -11의 프로모터 컨스트럭트 제작
프로모터 리포터 분석(Promoter reporter assay)을 위해, 카드헤린-11의 프로모터 컨스트럭트를 제작하였다.
구체적으로, 대장암 세포주 SW480의 게놈 DNA(genomic DNA)에서 프라이머 5'-CCGCTCGAGTTTTTCGCGGGTCCAT-3'(서열 번호 16) 및 5'-CCGCTCGAGCTGGGGCCCTTGAGG-3'(서열 번호 17)를 이용하여 인간 카드헤린-11 프로모터 부위(region)를 증폭하기 위한 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 수행 후 얻어진 증폭 산물인 카드헤린-11 프로모터 부위를 제한효소 XhoI으로 절단하고 pGL3 basic 벡터(Promega, Southampton, UK)에 삽입하여 pCad11-1350luc 컨스트럭트를 제작하였다.
< 실험예 1> 카드헤린 -11의 발현 억제에 의한 대장암 세포의 침윤 및 이동성 억제 효과 확인
대장암 세포주인 SW480에서 카드헤린-11의 발현 억제에 의한 암세포의 침윤능 및 세포이동성의 변화를 분석하기 위해서, 카드헤린-11-특이적 siRNA (Dharmacon) 및 대조군 siRNA (센스 서열 5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG ATT-3'(서열 번호 18), 안티 센스 서열 5'-UCG AAG UAC UCA GCG UAA GTT-3'(서열 번호 19)), 에스티팜으로 SW480 세포주를 형질전환(transfection)하고 48시간 뒤 침윤 분석(invasion assay) 및 세포이동성 분석(migration assay)을 수행하였다.
구체적으로, 침윤분석실험은 24-웰 트렌스웰 플레이트(8 ㎛ pore size; Costar, 미국)의 다공성 막을 무혈청(serum free) 배지로 희석된 250 ug/㎖ 농도의 100 ㎕ 마트리젤(BD Biosciences, 미국)로 코팅하였고, 실온에서 1시간 동안 방치하여 고형화시켰다. 트렌스웰 플레이트의 하층은 화학유인물(chemoattractant)로서 5 ug/㎖ 농도의 콜라겐 타입 I(Sigma) 100 ㎕를 이용하여 코팅하였다. 무혈청 배지에서 재현탁한 3 × 104 개의 세포를 상층 챔버(chamber)에 분주하였고, 37 ℃ 및 5 % CO2 조건에서 48시간 동안 배양하면서 상층 챔버에서 하층 챔버로 이동하도록 하였다. 이동하지 않은 세포는 상층 챔버의 표면에서 제거하였다. 하층 챔버로 전이한 세포는 PBS에 녹인 3.7 % 파라포름알데하이드로 고정하였고, 2 % 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 여분의 크리스탈 바이올렛 용액을 증류수로 세척한 뒤, 선택 면적(×100 배율)의 사진을 찍었고, 이동한 세포수는 5개의 선택 면적에서 계수하였다. 실험은 동일한 조건의 2개로 최소 2회 이상 반복한 수 대표결과를 나타내었다. 데이터 값은 200 배율당 (HPF) 전이세포표준편차의 수를 반영하였다. 세포이동성실험은, 마트리젤 코팅없이 1 × 104 개의 세포를 상층 챔버에 분주하였고, ×100 배율당 전이세포표준편차의 수를 반영하였다.
그 결과, 대장암 세포주 SW480에 카드헤린-11-특이적 siRNA를 형질전환한 후, 마트리겔-코팅한 트렌스웰을 사용한 침윤능 및 세포이동성를 수행하여 카드헤린-11 발현 억제에 의해 침윤능 및 세포이동성이 각각 34 % 및 56 % 감소함을 확인하였다(도 1).
< 실험예 2> 카드헤린 -11의 발현 억제에 의한 대장암 세포의 신호전달 및 EMT 억제 효과 확인
대장암 세포주에서 카드헤린-11의 발현 억제에 의한 세포신호전달 및 EMT 변화를 분석하기 위하여, 대장암 세포주인 SW480에 카드헤린-11 특이적 siRNA를 도입하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
세포는 RIPA 완충용액 (10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1 % deoxycholate, 1 % Triton X-100, 0.1 % SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, complete protease inhibitor)에서 파쇄하고, 세포 용해물은 상업적으로 이용가능한 변형된 Bradford 분석(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하여 정량하였다. 이후, 얻어진 세포 용해물 30 ug을 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 가열한 다음, 8 % SDS-PAGE 겔에 전기영동하였다. 전기영동을 통해 SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시키고, 5 % 스킴 밀크 (skim milk)로 블락킹(blocking)하였다. 이 후 항-인산화-ERK1/2 및 항-ERK1/2 (세포 signaling technology), 항-GAPDH(Santa Cruz), 항-인테그린 알파5(BD Biosciences), 항-카드헤린-11(Invitrogen), 항-E-카드헤린(R&D systems), 항-비멘틴(Sigma) 및 항-Sp1(Santa Cruz) 와 함께 반응시켰고, 홀스레디쉬 퍼올시데이즈(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이 후 ECL 키트(ECL Plus, Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하여 발생반응을 유도하였다.
그 결과, SW480 세포에서 siRNA로 카드헤린-11의 발현을 억제한 결과, 중간엽세포 마커인 인테그린 알파5 및 비멘틴의 발현이 감소하며 및 상피세포 마커인 E-카드헤린의 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한, 전사인자 Sp1의 발현이 감소하였다. 이 외에 FAK, ERK, c-src의 인산화가 감소함을 확인하였고 이러한 결과는 카드헤린-11 발현억제에 의해 EMT가 억제되고 세포신호전달이 불활성화되었다. 따라서, 카드헤린-11는 대장암세포의 EMT를 유도하고 암세포침윤 및 세포이동성을 유도하는 기능을 하였다(도 2).
< 실험예 3> 암세포에서 EMT 유도 전사인자 ZEB2에 의해 카드헤린 -11 발현 유도
<3-1> ZEB2에 의해 카드헤린 -11의 발현 유도를 리포터 분석
ZEB2(Smad-interacting protein-1/Zinc finger E-box binding homeobox 2)는 대표적인 E-카드헤린 전사 억제자 및 EMT 유도 전사로써 암세포의 침윤 및 전이와 관련이 있으므로 ZEB2에 의해 카드헤린-11의 발현이 유도됨을 리포터 분석(reporter assay)으로 확인하였다.
구체적으로, 2.5×105 개의 SW480, AGS 및 HEK293E 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 후에 상기 <실시예 4>에서 제조된 2 ug의 리포터 플라스미드 DNA와 1.8 ug의 ZEB 발현 벡터인 pCS3 SIP1(Dr. D, Huylebroeck, University of Leuven, Belgium; Nam et al., (2012) Carcinogenesis 33(3):563-571) 및 리포펙타민 2000 시약(Lipofectamine 2000 reagent, invitrogen)로 함께 형질전환시켰다. 형질전환 48시간 후, 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)를 두얼-루시퍼라아제 리포터 분석 시스템(Dual-luciferase reporter assay system, Promega)로 측정하였으며, 형질전환 효율은 0.2 ug의 레닐라 루시퍼라아제(Renila luciferase)벡터 pRL-TK(Promega)를 함께 형질전환하여 측정한 레닐라 루시퍼라아제 활성 측정값을 이용하여 확인하였다.
그 결과 카드헤린-11 프로모터 영역(-1350/+137)을 pGL3basic에 클로닝한 후, 리포터 분석을 수행한 결과, SW480, AGS 및 HEK293E 세포에서 ZEB2에 의해 카드헤린-11 프로모터가 각각 3.3배, 3.6배 및 1.5배 활성됨을 확인하였다 (그림 3).
<3-2> ZEB2에 의해 카드헤린 -11의 발현 유도를 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 분석
ZEB2는 대표적인 E-카드헤린 전사 억제자 및 EMT 유도 전사로서 암세포의 침윤 및 전이와 관련이 있으므로 ZEB2에 의해 카드헤린-11의 발현이 유도됨을 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 검사(Real time qPCR analysis, RT-qPCR)로 확인하였다.
구체적으로, 2.5 × 105 개의 SW480세포, 2 × 105 개의 SNU-638세포 및 5 × 105 개의 SNU-398세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 후에 4 ug의 ZEB 발현 벡터인 pCS3 SIP1(Dr. D, Huylebroeck, University of Leuven, Belgium; Nam et al., (2012) Carcinogenesis 33(3):563-571) 혹은, 40 uM 농도의 siRNA 4.5 ul를 리포펙타민 2000 시약(invitrogen)를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환 48시간 후, 세포로부터 트리졸(Trizol, Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 이용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 상기 RT-qPCR은 <실시예 3>의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, SW480 세포에 ZEB2를 형질전환시킨 후 카드헤린-11 mRNA 수준이 2.3배 증가하였고, 내재성 ZEB2를 발현하는 위암세포인 SNU-638 및 간암세포 SNU-398에 ZEB2-특이적 siRNA를 형질전환시킨 후 카드헤린-11 mRNA 발현이 각각 39 % 및 71 % 감소함을 RT-qPCR로 확인하였다(도 4).
<3-3> ZEB2에 의해 카드헤린 -11의 발현유도에 Sp1의 영향 분석
본 연구팀의 이전 연구에서, ZEB2에 의해 중간엽 세포 마커인 인테그린 알파5 및 비멘틴의 발현유도에는 전사인자 Sp1이 관여함을 확인하였다(Nam et al., (2012) Carcinogenesis 33(3):563-571). 따라서, ZEB2에 의한 카드헤린-11 유도에 Sp1이 요구될 것으로 예상하고 이를 검증하기 위하여 RT-qPCR 및 웨스턴 블롯 분석하였다.
구체적으로 SW480 및 AGS 세포에 ZEB2를 형질전환한 후, 24 시간 후 Sp1-DNA 결합저해제(mithramycin A, 50 nM)를 24 시간 처리한 후, 상기 <실시예 3>의 실시간 중합효소 연쇄반응 정량 검사 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 세포는 RIPA 버퍼 (10 mM Tris, pH7.2, 150 mM NaCl, 1 % deoxycholate, 1 % Triton X-100, 0.1 % SDS, 1 mM sodium orthovanadate, 50 mM NaF, 1 mM PMSF, complete protease inhibitor)에서 용해하였다. 세포용해는 브레드포드 분석 방법(bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 정량하였다. 세포용해 30 ug을 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 가열하였고, 8 % SDS-PAGE 젤에 영동하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 이동시키고, 5 % 스킴 밀크 (skim milk)로 차단하였다. 이후 안티-GAPDH (Santa Cruz) 및 안티-카드헤린-11(Invitrogen)과 함께 반응시켰고, 홀스레디쉬 퍼올시데이즈(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이 후 ECL 키트(ECL Plus, Amersham, USA)를 제조사의 방법대로 처리하여 카드헤린-11 발현을 확인하였다.
그 결과, ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현이 Sp1 활성 억제에 의해 감소됨을 확인하였다(도 5). 구체적으로, SW480 세포에서 ZEB2에 의해 카드헤린-11 mRNA 수준이 1.6배 증가하였는데(도 5A), 이러한 증가는 Sp1 활성 억제[미스라마이신(mithramycin) A]에 의해 완전히 억제되었다. 또한, AGS 세포에서 ZEB2에 의해 카드헤린-11 mRNA 수준이 6.3배 증가하였는데(도 5C), 이러한 증가는 Sp1 활성 억제(미스라마이신 A)에 의해 완전히 억제되었다.
<3-4> ZEB2에 의한 카드헤린 -11의 발현유도에 Sp1 -특이적 siRNA의 영향을 분석
ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현이 Sp1 활성 억제에 의해 감소됨을 확인한 결과를 통해 ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현에 Sp1-특이적 siRNA의 영향을 확인하기 위하여 RT-qPCR을 하였다.
구체적으로, 2.5 ×105 개의 SW480 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 후에 40 uM 농도의 siRNA 6 ul를 리포펙타민 2000 시약(invitrogen)를 이용하여 도입(형질전환)하였다. 형질전환 24시간 후, 4 ug의 ZEB 발현 벡터인 pCS3 SIP1(Dr. D, Huylebroeck, University of Leuven, Belgium; Nam et al., (2012) Carcinogenesis 33(3):563-571) 를 리포펙타민 2000 시약(invitrogen)를 이용하여 형질전환시켰다. 24시간 후 세포로부터 트리졸(Trizol, Invitrogen)을 이용하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 이용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 상기 RT-qPCR은 <실시예 3>의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, ZEB2에 의해 유도되는 카드헤린-11 발현이 Sp1-특이적 siRNA에 의해서도 감소함을 확인하였다(도 6). 구체적으로, SW480세포에서 ZEB2에 의해 카드헤린-11 mRNA 수준이 3.0배 증가하였는데, 이러한 증가는 Sp1-특이적 siRNA에 의해 1.6배로 감소되어 ZEB2에 의한 카드헤린-11 mRNA 증가가 Sp1-특이적 siRNA에 의해 약 46 % 감소하였다.
<3-5> 간암세포주에서 ChIP (Chromatin immunoprecipitation ) 확인
간암세포주인 SNU-638 세포에서 ZEB2 및 Sp1 구체적으로 카드헤린-11 프로모터의 어느 부위에 결합하는지 알아보기 위해 ChIP을 수행하였다.
구체적으로 ChIP 분석 키트(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)의 지시에 따라 수행하였다. 2 × 106 SNU-638 세포 당량당 래빗 안티-ZEB2 (H260, Santa Cruz Biotechnology) 또는 래빗 안티-SP1(PEP2, Santa Cruz Biotechnology)를 ChIP 반응에 사용하였다. 대조 항체는 정상 래빗 IgG를 반응에 사용하였다. 세포를 파괴하고 DNA를 잘게 부순 다음, 안티-ZEB2 또는 안티-Sp1 항체를 넣고 4 ℃에서 어느 정도 반응시켰다. 그런 다음 단백질 G-아가로스 비드(agarose bead)를 넣어 4 ℃에서 반응시킨 후 비드에 결합된 항체-DNA 복합체(complex)를 획득하였다. 이러한 복합체로부터 DNA만을 분리정제하였다. 그리고 확인하고자 하는 카드헤린-11 프로모터 주변에서 프라이머를 디자인하여 PCR을 수행하였다. 상기 카드헤린-11 프로모터-구체적 프라이머는 -191/-62 영역을 인식하는 5'-AGCCTCGGCTTCTCTCAG-3'(서열 번호 20) 및 5'-GCTAGTGGCAGGAATGAGAA-3'(서열 번호 21) 및 -1122/-1007 영역을 인식하는 5'-AGTCCTTGGCGTGATTCCTA-3'(서열 번호 22) and 5'-CCTCACTGACGACTCGCTAC-3'(서열 번호 23)을 사용하였다.
그 결과, 카드헤린-11 프로모터 (-191/-62) 영역에 ZEB2 및 Sp1이 특이적으로 결합함을 확인하였다(도 7).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pharmaceutical composition for the treatment of colorectal cancers or inhibition of metastasis containing the expression or activity inhibitors of cadherin-11 <130> 15p-10-31 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 796 <212> PRT <213> cadherin-11 preproprotein(1..796) <400> 1 Met Lys Glu Asn Tyr Cys Leu Gln Ala Ala Leu Val Cys Leu Gly Met 1 5 10 15 Leu Cys His Ser His Ala Phe Ala Pro Glu Arg Arg Gly His Leu Arg 20 25 30 Pro Ser Phe His Gly His His Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu 35 40 45 Gln Arg Ser Lys Arg Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile Glu 50 55 60 Glu Tyr Thr Gly Pro Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser Asp 65 70 75 80 Ile Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Gly 85 90 95 Ala Gly Thr Ile Phe Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala 100 105 110 Thr Lys Thr Leu Asp Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met Ala 115 120 125 Gln Ala Val Asp Arg Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu 130 135 140 Phe Ile Val Lys Val Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Leu 145 150 155 160 His Glu Thr Tyr His Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly Thr 165 170 175 Ser Val Ile Gln Val Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly 180 185 190 Asn Ser Ala Lys Leu Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr Phe 195 200 205 Ser Val Glu Ala Gln Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn Met 210 215 220 Asp Arg Glu Ala Lys Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys Asp 225 230 235 240 Met Gly Gly His Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr Ile 245 250 255 Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe Pro Gln Ser Val 260 265 270 Tyr Gln Met Ser Val Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly Glu Glu Val Gly 275 280 285 Arg Val Lys Ala Lys Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn Gly Leu Val Thr 290 295 300 Tyr Asn Ile Val Asp Gly Asp Gly Met Glu Ser Phe Glu Ile Thr Thr 305 310 315 320 Asp Tyr Glu Thr Gln Glu Gly Val Ile Lys Leu Lys Lys Pro Val Asp 325 330 335 Phe Glu Thr Lys Arg Ala Tyr Ser Leu Lys Val Glu Ala Ala Asn Val 340 345 350 His Ile Asp Pro Lys Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe Lys Asp Thr Val 355 360 365 Thr Val Lys Ile Ser Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro Pro Met Phe Leu 370 375 380 Ala Pro Ser Tyr Ile His Glu Val Gln Glu Asn Ala Ala Ala Gly Thr 385 390 395 400 Val Val Gly Arg Val His Ala Lys Asp Pro Asp Ala Ala Asn Ser Pro 405 410 415 Ile Arg Tyr Ser Ile Asp Arg His Thr Asp Leu Asp Arg Phe Phe Thr 420 425 430 Ile Asn Pro Glu Asp Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys Pro Leu Asp Arg 435 440 445 Glu Glu Thr Ala Trp Leu Asn Ile Thr Val Phe Ala Ala Glu Ile His 450 455 460 Asn Arg His Gln Glu Ala Lys Val Pro Val Ala Ile Arg Val Leu Asp 465 470 475 480 Val Asn Asp Asn Ala Pro Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile 485 490 495 Cys Glu Ser Asp Gln Thr Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr 500 505 510 Ile Ser Ala Asp Asp Lys Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile 515 520 525 Phe Ser Leu Pro Pro Glu Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg 530 535 540 Asp Asn Arg Asp Asn Thr Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe 545 550 555 560 Ser Arg Gln Lys Gln Asp Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp 565 570 575 Gly Gly Ile Pro Pro Met Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys Val 580 585 590 Cys Gly Cys Asp Val Asn Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu Ala 595 600 605 Tyr Ile Leu Asn Ala Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ile Ala Ile Leu 610 615 620 Ala Cys Ile Val Ile Leu Leu Val Ile Val Val Leu Phe Val Thr Leu 625 630 635 640 Arg Arg Gln Lys Lys Glu Pro Leu Ile Val Phe Glu Glu Glu Asp Val 645 650 655 Arg Glu Asn Ile Ile Thr Tyr Asp Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp 660 665 670 Thr Glu Ala Phe Asp Ile Ala Thr Leu Gln Asn Pro Asp Gly Ile Asn 675 680 685 Gly Phe Ile Pro Arg Lys Asp Ile Lys Pro Glu Tyr Gln Tyr Met Pro 690 695 700 Arg Pro Gly Leu Arg Pro Ala Pro Asn Ser Val Asp Val Asp Asp Phe 705 710 715 720 Ile Asn Thr Arg Ile Gln Glu Ala Asp Asn Asp Pro Thr Ala Pro Pro 725 730 735 Tyr Asp Ser Ile Gln Ile Tyr Gly Tyr Glu Gly Arg Gly Ser Val Ala 740 745 750 Gly Ser Leu Ser Ser Leu Glu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Asp Leu Asp 755 760 765 Tyr Asp Tyr Leu Gln Asn Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp 770 775 780 Leu Tyr Gly Ser Lys Asp Thr Phe Asp Asp Asp Ser 785 790 795 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 siRNA <400> 2 gugagaacau cauuacuua 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 siRNA <400> 3 ggacaugggu ggacauaug 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 siRNA <400> 4 ggaaauagcg ccaaguuag 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 siRNA <400> 5 ccuuaugacu ccauucaaa 19 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin alpha5 siRNA <400> 6 ggaccaaggc agaaggcagt t 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sp-1 siRNA <400> 7 gguagcucua aguuuugaut t 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEB2 siRNA <400> 8 gaacagacag gcuuacuuau u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEB2 siRNA <400> 9 gaagcuacgu acuuuaauau u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEB2 siRNA <400> 10 caacauaucc acuccauuuu u 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEB2 siRNA <400> 11 ggagacagau caguaauauu u 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 forward primer <400> 12 ccaacagccc gataaggtat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 reverse primer <400> 13 tggatttctg ctgcaaagac 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 14 catgaccaca gtccatgcca t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 15 aaggccatgc cagtgagctt c 21 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SW480 forward primer <400> 16 ccgctcgagt ttttcgcggg tccat 25 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SW480 reverse primer <400> 17 ccgctcgagc tggggccctt gagg 24 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 control group siRNA <400> 18 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 control group siRNA <400> 19 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 -191/-62 forward primer <400> 20 agcctcggct tctctcag 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 -191/-62 reverse primer <400> 21 gctagtggca ggaatgagaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 -1122/-1007 forward primer <400> 22 agtccttggc gtgattccta 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cadherin-11 -1122/-1007 reverse primer <400> 23 cctcactgac gactcgctac 20 <210> 24 <211> 774 <212> PRT <213> cadherin-11 proprotein (23..796) <400> 24 Phe Ala Pro Glu Arg Arg Gly His Leu Arg Pro Ser Phe His Gly His 1 5 10 15 His Glu Lys Gly Lys Glu Gly Gln Val Leu Gln Arg Ser Lys Arg Gly 20 25 30 Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile Glu Glu Tyr Thr Gly Pro Asp 35 40 45 Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser Asp Ile Asp Ser Gly Asp Gly 50 55 60 Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Gly Ala Gly Thr Ile Phe Val 65 70 75 80 Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala Thr Lys Thr Leu Asp Arg 85 90 95 Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met Ala Gln Ala Val Asp Arg Asp 100 105 110 Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Val Lys Val Gln 115 120 125 Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Leu His Glu Thr Tyr His Ala 130 135 140 Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly Thr Ser Val Ile Gln Val Thr 145 150 155 160 Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly Asn Ser Ala Lys Leu Val 165 170 175 Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr Phe Ser Val Glu Ala Gln Thr 180 185 190 Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn Met Asp Arg Glu Ala Lys Glu 195 200 205 Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys Asp Met Gly Gly His Met Gly 210 215 220 Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr Ile Thr Leu Thr Asp Val Asn 225 230 235 240 Asp Asn Pro Pro Lys Phe Pro Gln Ser Val Tyr Gln Met Ser Val Ser 245 250 255 Glu Ala Ala Val Pro Gly Glu Glu Val Gly Arg Val Lys Ala Lys Asp 260 265 270 Pro Asp Ile Gly Glu Asn Gly Leu Val Thr Tyr Asn Ile Val Asp Gly 275 280 285 Asp Gly Met Glu Ser Phe Glu Ile Thr Thr Asp Tyr Glu Thr Gln Glu 290 295 300 Gly Val Ile Lys Leu Lys Lys Pro Val Asp Phe Glu Thr Lys Arg Ala 305 310 315 320 Tyr Ser Leu Lys Val Glu Ala Ala Asn Val His Ile Asp Pro Lys Phe 325 330 335 Ile Ser Asn Gly Pro Phe Lys Asp Thr Val Thr Val Lys Ile Ser Val 340 345 350 Glu Asp Ala Asp Glu Pro Pro Met Phe Leu Ala Pro Ser Tyr Ile His 355 360 365 Glu Val Gln Glu Asn Ala Ala Ala Gly Thr Val Val Gly Arg Val His 370 375 380 Ala Lys Asp Pro Asp Ala Ala Asn Ser Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Asp 385 390 395 400 Arg His Thr Asp Leu Asp Arg Phe Phe Thr Ile Asn Pro Glu Asp Gly 405 410 415 Phe Ile Lys Thr Thr Lys Pro Leu Asp Arg Glu Glu Thr Ala Trp Leu 420 425 430 Asn Ile Thr Val Phe Ala Ala Glu Ile His Asn Arg His Gln Glu Ala 435 440 445 Lys Val Pro Val Ala Ile Arg Val Leu Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro 450 455 460 Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile Cys Glu Ser Asp Gln Thr 465 470 475 480 Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr Ile Ser Ala Asp Asp Lys 485 490 495 Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile Phe Ser Leu Pro Pro Glu 500 505 510 Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg Asp Asn Arg Asp Asn Thr 515 520 525 Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe Ser Arg Gln Lys Gln Asp 530 535 540 Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp Gly Gly Ile Pro Pro Met 545 550 555 560 Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys Val Cys Gly Cys Asp Val Asn 565 570 575 Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu Ala Tyr Ile Leu Asn Ala Gly 580 585 590 Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ile Ala Ile Leu Ala Cys Ile Val Ile Leu 595 600 605 Leu Val Ile Val Val Leu Phe Val Thr Leu Arg Arg Gln Lys Lys Glu 610 615 620 Pro Leu Ile Val Phe Glu Glu Glu Asp Val Arg Glu Asn Ile Ile Thr 625 630 635 640 Tyr Asp Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Glu Ala Phe Asp Ile 645 650 655 Ala Thr Leu Gln Asn Pro Asp Gly Ile Asn Gly Phe Ile Pro Arg Lys 660 665 670 Asp Ile Lys Pro Glu Tyr Gln Tyr Met Pro Arg Pro Gly Leu Arg Pro 675 680 685 Ala Pro Asn Ser Val Asp Val Asp Asp Phe Ile Asn Thr Arg Ile Gln 690 695 700 Glu Ala Asp Asn Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Ile Gln Ile 705 710 715 720 Tyr Gly Tyr Glu Gly Arg Gly Ser Val Ala Gly Ser Leu Ser Ser Leu 725 730 735 Glu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Asp Leu Asp Tyr Asp Tyr Leu Gln Asn 740 745 750 Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Leu Tyr Gly Ser Lys Asp 755 760 765 Thr Phe Asp Asp Asp Ser 770 <210> 25 <211> 765 <212> PRT <213> cadherin-11 proprotein(23..54,54..796) <400> 25 Met Lys Glu Asn Tyr Cys Leu Gln Ala Ala Leu Val Cys Leu Gly Met 1 5 10 15 Leu Cys His Ser His Ala Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile 20 25 30 Glu Glu Tyr Thr Gly Pro Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser 35 40 45 Asp Ile Asp Ser Gly Asp Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu 50 55 60 Gly Ala Gly Thr Ile Phe Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His 65 70 75 80 Ala Thr Lys Thr Leu Asp Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met 85 90 95 Ala Gln Ala Val Asp Arg Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser 100 105 110 Glu Phe Ile Val Lys Val Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe 115 120 125 Leu His Glu Thr Tyr His Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly 130 135 140 Thr Ser Val Ile Gln Val Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Gly Asn Ser Ala Lys Leu Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr 165 170 175 Phe Ser Val Glu Ala Gln Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn 180 185 190 Met Asp Arg Glu Ala Lys Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys 195 200 205 Asp Met Gly Gly His Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr 210 215 220 Ile Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe Pro Gln Ser 225 230 235 240 Val Tyr Gln Met Ser Val Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly Glu Glu Val 245 250 255 Gly Arg Val Lys Ala Lys Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn Gly Leu Val 260 265 270 Thr Tyr Asn Ile Val Asp Gly Asp Gly Met Glu Ser Phe Glu Ile Thr 275 280 285 Thr Asp Tyr Glu Thr Gln Glu Gly Val Ile Lys Leu Lys Lys Pro Val 290 295 300 Asp Phe Glu Thr Lys Arg Ala Tyr Ser Leu Lys Val Glu Ala Ala Asn 305 310 315 320 Val His Ile Asp Pro Lys Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe Lys Asp Thr 325 330 335 Val Thr Val Lys Ile Ser Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro Pro Met Phe 340 345 350 Leu Ala Pro Ser Tyr Ile His Glu Val Gln Glu Asn Ala Ala Ala Gly 355 360 365 Thr Val Val Gly Arg Val His Ala Lys Asp Pro Asp Ala Ala Asn Ser 370 375 380 Pro Ile Arg Tyr Ser Ile Asp Arg His Thr Asp Leu Asp Arg Phe Phe 385 390 395 400 Thr Ile Asn Pro Glu Asp Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys Pro Leu Asp 405 410 415 Arg Glu Glu Thr Ala Trp Leu Asn Ile Thr Val Phe Ala Ala Glu Ile 420 425 430 His Asn Arg His Gln Glu Ala Lys Val Pro Val Ala Ile Arg Val Leu 435 440 445 Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe 450 455 460 Ile Cys Glu Ser Asp Gln Thr Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val 465 470 475 480 Thr Ile Ser Ala Asp Asp Lys Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe 485 490 495 Ile Phe Ser Leu Pro Pro Glu Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val 500 505 510 Arg Asp Asn Arg Asp Asn Thr Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly 515 520 525 Phe Ser Arg Gln Lys Gln Asp Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser 530 535 540 Asp Gly Gly Ile Pro Pro Met Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys 545 550 555 560 Val Cys Gly Cys Asp Val Asn Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu 565 570 575 Ala Tyr Ile Leu Asn Ala Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ile Ala Ile 580 585 590 Leu Ala Cys Ile Val Ile Leu Leu Val Ile Val Val Leu Phe Val Thr 595 600 605 Leu Arg Arg Gln Lys Lys Glu Pro Leu Ile Val Phe Glu Glu Glu Asp 610 615 620 Val Arg Glu Asn Ile Ile Thr Tyr Asp Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu 625 630 635 640 Asp Thr Glu Ala Phe Asp Ile Ala Thr Leu Gln Asn Pro Asp Gly Ile 645 650 655 Asn Gly Phe Ile Pro Arg Lys Asp Ile Lys Pro Glu Tyr Gln Tyr Met 660 665 670 Pro Arg Pro Gly Leu Arg Pro Ala Pro Asn Ser Val Asp Val Asp Asp 675 680 685 Phe Ile Asn Thr Arg Ile Gln Glu Ala Asp Asn Asp Pro Thr Ala Pro 690 695 700 Pro Tyr Asp Ser Ile Gln Ile Tyr Gly Tyr Glu Gly Arg Gly Ser Val 705 710 715 720 Ala Gly Ser Leu Ser Ser Leu Glu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Asp Leu 725 730 735 Asp Tyr Asp Tyr Leu Gln Asn Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala 740 745 750 Asp Leu Tyr Gly Ser Lys Asp Thr Phe Asp Asp Asp Ser 755 760 765 <210> 26 <211> 743 <212> PRT <213> cadherin-11 muture protein(54..796) <400> 26 Gly Trp Val Trp Asn Gln Phe Phe Val Ile Glu Glu Tyr Thr Gly Pro 1 5 10 15 Asp Pro Val Leu Val Gly Arg Leu His Ser Asp Ile Asp Ser Gly Asp 20 25 30 Gly Asn Ile Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Glu Gly Ala Gly Thr Ile Phe 35 40 45 Val Ile Asp Asp Lys Ser Gly Asn Ile His Ala Thr Lys Thr Leu Asp 50 55 60 Arg Glu Glu Arg Ala Gln Tyr Thr Leu Met Ala Gln Ala Val Asp Arg 65 70 75 80 Asp Thr Asn Arg Pro Leu Glu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Val Lys Val 85 90 95 Gln Asp Ile Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Leu His Glu Thr Tyr His 100 105 110 Ala Asn Val Pro Glu Arg Ser Asn Val Gly Thr Ser Val Ile Gln Val 115 120 125 Thr Ala Ser Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly Asn Ser Ala Lys Leu 130 135 140 Val Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Gln Pro Tyr Phe Ser Val Glu Ala Gln 145 150 155 160 Thr Gly Ile Ile Arg Thr Ala Leu Pro Asn Met Asp Arg Glu Ala Lys 165 170 175 Glu Glu Tyr His Val Val Ile Gln Ala Lys Asp Met Gly Gly His Met 180 185 190 Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Lys Val Thr Ile Thr Leu Thr Asp Val 195 200 205 Asn Asp Asn Pro Pro Lys Phe Pro Gln Ser Val Tyr Gln Met Ser Val 210 215 220 Ser Glu Ala Ala Val Pro Gly Glu Glu Val Gly Arg Val Lys Ala Lys 225 230 235 240 Asp Pro Asp Ile Gly Glu Asn Gly Leu Val Thr Tyr Asn Ile Val Asp 245 250 255 Gly Asp Gly Met Glu Ser Phe Glu Ile Thr Thr Asp Tyr Glu Thr Gln 260 265 270 Glu Gly Val Ile Lys Leu Lys Lys Pro Val Asp Phe Glu Thr Lys Arg 275 280 285 Ala Tyr Ser Leu Lys Val Glu Ala Ala Asn Val His Ile Asp Pro Lys 290 295 300 Phe Ile Ser Asn Gly Pro Phe Lys Asp Thr Val Thr Val Lys Ile Ser 305 310 315 320 Val Glu Asp Ala Asp Glu Pro Pro Met Phe Leu Ala Pro Ser Tyr Ile 325 330 335 His Glu Val Gln Glu Asn Ala Ala Ala Gly Thr Val Val Gly Arg Val 340 345 350 His Ala Lys Asp Pro Asp Ala Ala Asn Ser Pro Ile Arg Tyr Ser Ile 355 360 365 Asp Arg His Thr Asp Leu Asp Arg Phe Phe Thr Ile Asn Pro Glu Asp 370 375 380 Gly Phe Ile Lys Thr Thr Lys Pro Leu Asp Arg Glu Glu Thr Ala Trp 385 390 395 400 Leu Asn Ile Thr Val Phe Ala Ala Glu Ile His Asn Arg His Gln Glu 405 410 415 Ala Lys Val Pro Val Ala Ile Arg Val Leu Asp Val Asn Asp Asn Ala 420 425 430 Pro Lys Phe Ala Ala Pro Tyr Glu Gly Phe Ile Cys Glu Ser Asp Gln 435 440 445 Thr Lys Pro Leu Ser Asn Gln Pro Ile Val Thr Ile Ser Ala Asp Asp 450 455 460 Lys Asp Asp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Phe Ile Phe Ser Leu Pro Pro 465 470 475 480 Glu Ile Ile His Asn Pro Asn Phe Thr Val Arg Asp Asn Arg Asp Asn 485 490 495 Thr Ala Gly Val Tyr Ala Arg Arg Gly Gly Phe Ser Arg Gln Lys Gln 500 505 510 Asp Leu Tyr Leu Leu Pro Ile Val Ile Ser Asp Gly Gly Ile Pro Pro 515 520 525 Met Ser Ser Thr Asn Thr Leu Thr Ile Lys Val Cys Gly Cys Asp Val 530 535 540 Asn Gly Ala Leu Leu Ser Cys Asn Ala Glu Ala Tyr Ile Leu Asn Ala 545 550 555 560 Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ile Ala Ile Leu Ala Cys Ile Val Ile 565 570 575 Leu Leu Val Ile Val Val Leu Phe Val Thr Leu Arg Arg Gln Lys Lys 580 585 590 Glu Pro Leu Ile Val Phe Glu Glu Glu Asp Val Arg Glu Asn Ile Ile 595 600 605 Thr Tyr Asp Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Glu Ala Phe Asp 610 615 620 Ile Ala Thr Leu Gln Asn Pro Asp Gly Ile Asn Gly Phe Ile Pro Arg 625 630 635 640 Lys Asp Ile Lys Pro Glu Tyr Gln Tyr Met Pro Arg Pro Gly Leu Arg 645 650 655 Pro Ala Pro Asn Ser Val Asp Val Asp Asp Phe Ile Asn Thr Arg Ile 660 665 670 Gln Glu Ala Asp Asn Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Ile Gln 675 680 685 Ile Tyr Gly Tyr Glu Gly Arg Gly Ser Val Ala Gly Ser Leu Ser Ser 690 695 700 Leu Glu Ser Ala Thr Thr Asp Ser Asp Leu Asp Tyr Asp Tyr Leu Gln 705 710 715 720 Asn Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Leu Tyr Gly Ser Lys 725 730 735 Asp Thr Phe Asp Asp Asp Ser 740

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고 ZEB2(zinc finger E-box-binding homeobox 2)에 의해 발현이 유도되는 카드헤린-11 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 카드헤린-11 단백질의 발현 세포주에 대해 카드헤린-11 단백질의 발현 정도를 측정하고 Sp1(specificity protein 1) 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 카드헤린-11 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별한 후, Sp1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 2차적으로 선별하는 단계;
    를 포함하는, 대장암의 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법.
  4. 삭제
  5. 1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고 ZEB2에 의해 발현이 유도되는 카드헤린-11 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 카드헤린-11 단백질의 활성 정도를 측정하고 Sp1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 카드헤린-11 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별한 후, Sp1 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 2차적으로 선별하는 단계;
    를 포함하는, 대장암의 전이 억제용 후보물질의 스크리닝 방법.
  6. 삭제
  7. 1) 피검 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 카드헤린-11 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하고 Sp1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    2) 상기 카드헤린-11 및 Sp1 단백질의 발현 또는 활성 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 피검 개체를 대장암 전이 위험이 높은 것으로 판단하는 단계;
    를 포함하는, 대장암 전이의 모니터링 정보를 제공하기 위한, 단백질의 발현 또는 활성 수준 측정 방법.
  8. 삭제
KR1020150145274A 2015-10-19 2015-10-19 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 KR101654526B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150145274A KR101654526B1 (ko) 2015-10-19 2015-10-19 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150145274A KR101654526B1 (ko) 2015-10-19 2015-10-19 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120065247A Division KR20130142025A (ko) 2012-06-18 2012-06-18 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150123213A KR20150123213A (ko) 2015-11-03
KR101654526B1 true KR101654526B1 (ko) 2016-09-06

Family

ID=54599282

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150145274A KR101654526B1 (ko) 2015-10-19 2015-10-19 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101654526B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180075139A (ko) 2016-12-26 2018-07-04 한국원자력의학원 Ccnd3 또는 pak2 유전자의 발현을 저해하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120128693A1 (en) * 2009-02-09 2012-05-24 Georgetown University Cadherin-11 inhibitors and methods of use thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2242769T1 (sl) * 2008-01-11 2017-02-28 Adheron Therapeutics, Inc. Protitelesa anti-kadherin-11 EC domene za zdravljenje vnetnih obolenj sklepov

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120128693A1 (en) * 2009-02-09 2012-05-24 Georgetown University Cadherin-11 inhibitors and methods of use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAHLERT, C. et al., Clinical Cancer Research, Vol. 17(24), pages 7654-7663 (2011.12.15. 공개)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150123213A (ko) 2015-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10633659B2 (en) C/EBPα short activating RNA compositions and methods of use
Nzeako et al. COX‐2 inhibits Fas‐mediated apoptosis in cholangiocarcinoma cells
CN109609644B (zh) Pax3-fkhr和acta1基因在预防、治疗横纹肌肉瘤中的用途
CN112543809A (zh) 包含C/EBPα saRNA的组合疗法
KR102377702B1 (ko) Syt11 억제제를 유효성분으로 포함하는 위암 치료용 조성물
CN114585384A (zh) 使用C/EBPα saRNA的组合物和方法
CN110592222A (zh) Triml1作为肝癌的分子标记物的应用
KR101654526B1 (ko) 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물
KR101198714B1 (ko) Ｃ１２ｏｒｆ５９ 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
WO2019051025A2 (en) TREATMENT OF AGGRESSIVE CANCERS BY TARGETING C9ORF72
CN105722525B (zh) 鉴定对肿瘤具有直接抑制作用的干扰素的方法及其用途
KR20130142025A (ko) 카드헤린―１１ 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 대장암 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물
KR101781257B1 (ko) Rip3 발현촉진제를 유효성분으로 포함하는 항암보조용 조성물
CN107847564B (zh) 鉴定对肿瘤具有直接抑制作用的干扰素的方法及其用途
CN110665007A (zh) 一种治疗癌症用组合药物及其用途
JP2021028297A (ja) マイクロｒｎａ及びその誘導体を有効成分とするがん治療剤
KR102104478B1 (ko) miR-133a-3p를 유효성분으로 함유하는 항암제 민감성 증진용 조성물
KR102026142B1 (ko) Crif1 억제제를 함유하는 항암 및 암전이 억제용 조성물
Minn Identification of negative regulators of p53 pathway by a forward genetic screen in ovarian cancer
KR20220125424A (ko) Fgf19-fgfr4 신호 경로가 활성화된 간암 치료제 및 그의 스크리닝 방법
CN115944740A (zh) 靶向hif-1/cbs在三阴性乳腺癌中的应用
JPWO2020040185A1 (ja) Ｈｓｐ４７の阻害物質を用いた、化学療法剤感受性の増強
Yee Targeting the transcription factor c-Jun in cervical cancer cells
WO2015076481A1 (ko) ＴＸＮＩＰ유전자의 프로모터 부위에 상보적인 ｄｓＲＮＡ를 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
WO2012050303A2 (ko) Ｃ１２ｏｒｆ５９ 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)