MX2011002046A - Vacuna contra sindrome disgenesico y respiratorio porcino altamente patogeno (hp prrs). - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones víricas atenuadas para uso en la prevención y tratamiento de formas con fiebre alta asociadas con el síndrome disgenésico y respiratorio porcino (PRRS), tales como el síndrome disgenésico y respiratorio porcino altamente patógeno (HP PRRS), una enfermedad vírica que afecta al ganado porcino.

Description

VACUNA CONTRA SINDROME DISGENESICO Y RESPIRATORIO PORCINO ALTAMENTE PATOGENO (HP PRRS) CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a vacunas contra enfermedades infecciosas. Más particularmente, se refiere a vacunas contra Síndrome Disgenésico y Respiratorio Porcino Altamente Patógeno (HP PRRS, por sus siglas en inglés), una enfermedad vírica que afecta al ganado porcino.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El síndrome disgenésico y respiratorio porcino (PRRS, por sus siglas en inglés) está reconocido como una grave enfermedad porcina, y se caracteriza, o bien por fracaso reproductor en cerdas preñadas, o bien por dificultad en las vías respiratorias, en particular en lechones . Esta enfermedad vírica fue descubierta por primera vez en Estados Unidos en 1987, después apareció en Europa, y fue identificada en Asia a principios de la década de 1990. Hasta la fecha, el PRRS se ha extendido por todo el mundo y ha adquirido la categoría de endémico en los países criadores de cerdos, provocando enormes pérdidas económicas cada año. El agente etiológico del PRRS es el virus del síndrome disgenésico y respiratorio porcino (PRRSV) , que, junto con el virus elevador de lactato-deshidrogenasa del ratón (LDEV) , el virus de la arteritis equina (EAV) , y el virus de la fiebre REF.216815 hemorrágica de simios (SHFV) , pertenece a la familia Arteriviridae dentro del orden Nidovirales .

El PRRSV, un miembro de los virus encapsulados de pequeño tamaño, tiene un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo (+ssRNA) con aproximada-mente 15,1-15,5 kb, que comprende al menos 8 marcos de lectura abiertos (siglas inglesas ORF) que codifican en torno a 20 proteínas putativas . El genoma contiene también dos regiones no traducidas (siglas inglesas UTR) tanto en el extremo 5' como en el extremo 3'. Concretamente, el 0RF1 (ORFla y ORFlb) está situado aguas abajo de la 5 ' -UTR, y ocupa más de dos tercios de todo el genoma. El ORFla es traducido directamente, mientras que el ORFlb es traducido mediante un desplazamiento del marco ribosómico, proporcionando una poliproteína ORFlab de gran tamaño que es escindida proteolíticamente para dar productos relacionados con la maquinaria de transcripción y replicación del virus. Los ORFs 2-7, situados aguas arriba del 3 ' -UTR, codifican una serie de proteínas estructurales víricas asociadas con el virión, tales como la proteína de la envoltura (E) y la proteína del nucleocápside (N) . Todas estas proteínas son traducidas desde un conjunto anidado 3r-coterminal de mARNs sub-genómicos (sgmR As) .

El análisis filogenético de aislados de PRRSV procedentes de diferentes regiones geográficas del mundo indica claramente la existencia de dos genotipos principales: el Tipo I, representado por el prototipo europeo (virus Lelystad, LV) , y el Tipo II, representado por la cepa de América del Norte ATCC VR2332 (en lo referente a la secuencia genómica de VR2332, véase el número de accesión AY150564 a GenBank) como prototipo (Murtaugh et al., Arch Virol . 1995;140:1451-1460). Además, algunos estudios han demostrado que el ORF5 y el gen (nsp2) codificador de la proteína no estructural 2 (NSP2) pueden constituir las regiones genéticamente más variables de los genomas de PRRSV. En lo referente a la secuencia de NSP2 de VR2332, véase el número de accesión Q9 JB2 a SwissProt o bien la SEQ ID NO: 2. Está así mismo bien documentado que las cepas PRRSV difieren mucho en sus patogenicidades .

En 2006 se produjo un brote a gran escala, sin precedentes, de una enfermedad al principio desconocida, que se llamó "enfermedad de fiebre alta" con síntomas de PRRS, y que se extendió a más de 10 provincias y afectó a cerca de 2,000,000 de cerdos con aproximadamente 400,000 casos fatales. A diferencia de la PRRS típica, también numerosas cerdas adultas fueron infectadas por la "enfermedad de fiebre alta" . Esta pandemia de PRRS atípica fue identificada inicialmente como una enfermedad parecida al cólera porcino, que manifestaba síntomas neurologicos (por ejemplo, temblor) , fiebre alta (40-42°C) , erupción eritematosa que palidecía con la presión, etc. Las autopsias, combinadas con análisis inmunológicos , demostraron claramente que múltiples órganos estaban infectados con PRRSVs altamente patógenos, observándose graves cambios patológicos (Tian et al., PLoS ONE. 2007; 2(6): e526) . El análisis del genoma completo de los virus aislados reveló que estos aislados de PRRSV pertenecen al grupo del Tipo II, y son sumamente homólogos con HB-1, una cepa china de PRRSV (identidad nucleotídica de 96,5%), y con JX143 (Yuan et al, 2007 International PRRS Symposium, Chicago) . En lo referente a la secuencia genómica de JX143, véase la SEQ ID N0:1, o bien el número de accesión EU708726 a EMBL/GenBank . Se observó, además, que estos aislados víricos comprenden una característica distintiva molecular única, concretamente una deleción discontinua de 30 aminoácidos en la proteína no estructural 2 (NSP2) (Tian et al., PLoS ONE. 2007; 2(6): e526). En la actualidad, a la forma "de fiebre alta" del PRRS se la denomina también "PRRS altamente patógena" , o bien HP PRRS .

En diversas publicaciones (WO 92/21375, WO 93/06211, O93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356) se han descrito el aislamiento de virus de PRRS (PRRSV) y la preparación de vacunas contra PRRS , ya sea las que contienen PRRSV vivo modificado (atenuado), o las que contienen PRRSV inactivado. En particular, el documento WO 93/03760 describe métodos de aislamiento, cultivo y atenuación de virus PRRS, así como de fabricación de las vacunas respectivas, y en particular del aislado de prototipo de PRRS de Tipo ATCC VR-2332. El documento WO 96/36356 describe un descendiente atenuado particularmente útil del aislado antes mencionado, obtenido por traspaso seriado en células de simio, que ha sido depositado con el número de accesión ATCC VR-2495. Un producto de vacuna viva modificada (siglas inglesas MLV) respectivo está comercialmente disponible de Boehringer Ingelheim bajo la marca Ingelvac® PRRS MLV. Otra vacuna MLV basada en un aislado de Tipo II está comercialmente disponible bajo la marca Ingelvac® PRRS ATP.

La vacunación es una estrategia adecuada en la prevención del PRRS. Sin embargo, hasta ahora no se sabía si la vacunación podría ser eficaz contra HP PRRS, y qué tipo de vacuna podría utilizarse.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores han realizado el sorprendente descubrimiento de que se pueden emplear cepas atenuadas de virus de PRRS Tipo II para vacunar y proteger ganado porcino de los efectos de las formas de enfermedad con fiebre alta asociadas con el síndrome disgenésico y respiratorio porcino. La identificación de características profilácticas de cepas atenuadas de virus de PRRS Tipo II puede permitir el tratamiento de cerdos con alto riesgo, por ejemplo, de contraer HP PRRS . ??· programa de vacunación o tratamiento semejante puede ayudar a reducir la probabilidad o el impacto de otros brotes de HP PRRS similares a los que devastaron la industria porcina de China en 2006 y provocaron el sacrificio selectivo de aproximadamente 20 millones de cerdos.

Una modalidad de la presente invención proporcionada en la presente memoria incluye un método para proteger profilácticamente ganado porcino de los efectos de una enfermedad con fiebre alta que comprende administrar a un cerdo que lo necesite una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II, preferiblemente un virus de PRRS Tipo II atenuado. La composición puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender aún más un adyuvante. El método puede utilizarse como medida de prevención o de tratamiento. Además, la administración de una cantidad eficaz de una de tales composiciones inmunogénicas da como resultado la disminución de la incidencia, o de la gravedad de los síntomas clínicos, de formas de enfermedad con fiebre alta de PRRS.

También se proporciona en la -presente memoria un método i para vacunar ganado porcino contra una enfermedad con fiebre alta que comprende administrar a un cerdo una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II, preferiblemente un virus de PRRS Tipo II atenuado. La composición puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender aún más un adyuvante. Tal vacunación con una cantidad eficaz de la composición inmunogénica dará preferiblemente como resultado la disminución de la incidencia, o de la gravedad de los síntomas clínicos, de formas de enfermedad con fiebre alta de PRRS.

La enfermedad con fiebre alta puede ser una forma que esté asociada con el síndrome disgenésico y respiratorio porcino. El síndrome disgenésico y respiratorio porcino puede ser altamente patógeno ( "HP PRRS"). El HP PRRS o una forma de enfermedad con fiebre alta pueden ser detectados en ganado porcino que muestre uno o más de los siguientes signos clínicos: rubefacción, púrpura, petequias, erupciones eritematosas que palidecen con la presión, y erupciones cutáneas, observados frecuentemente en orejas, boca, hocico, lomo, e interior de los muslos. Otros síntomas comunes pueden incluir fiebre alta (más de 40°C) , depresión, anorexia, tos, asma, cojera, temblor, trastornos de las vías respiratorias, y diarrea. El HP PRRS está causado por un virus de HP PRRS.

Otra modalidad de la presente invención proporcionada en la presente memoria incluye un método para proteger profilácticamente ganado porcino de la infección por HP PRRS que comprende administrar a un cerdo que lo necesite una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II, preferiblemente un virus de PRRS Tipo II atenuado.

El virus de HP PRRS que apareció ' en 2002 en China, como miembro del genotipo Tipo 2 de PRRS, está correlacionado con la denominada enfermedad de fiebre alta. Después de ello, el virus de HP PRRS llegó a ser dominante en varias provincias de China, lo que indica una ventaja selectiva en su difusión dentro de poblaciones porcinas afectadas, en comparación con otros virus de PRRS.

La expresión "virus de HP PRRS" significa, pero sin que deba quedar limitada a ello, una cepa de virus de PRRS que tiene una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:l. Preferiblemente, un virus de HP PRRS es una cepa de virus de PRRS que tiene una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:l. Sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:i debe significar que la secuencia nucleotídica de la cepa de virus de PRRS comprende preferiblemente una secuencia que es entre 85% y 100% idéntica a la SEQ ID NO:l, preferiblemente con la condición de que el virus de HP PRRS no sea un virus de PRRS Tipo II tal como se define en la presente memoria, por ejemplo que la homología de nucleótidos sea menor que 91%, preferiblemente una homología inferior a 92%, 93%, 94%, '95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, en ORF 5, con respecto a VR2332, en calidad de aislado vírico de referencia. La secuencia nucleotídica de la cepa de virus de HP PRRS es preferiblemente idéntica en más de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, u 89% a la SEQ ID NO:l, de manera análoga preferiblemente con la condición de que el virus de HP PRRS no sea un virus de PRRS Tipo II tal como se define en la presente memoria, por ejemplo que la homología de nucleótidos sea menor que 91%, preferiblemente una homología inferior a 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99%, en ORF 5, con respecto VR2332, en calidad de aislado vírico de referencia. Aún más preferiblemente, la secuencia nucleotídica de la cepa de virus de PRRS es idéntica en más de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o en más de 99% a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente con la condición de que el virus de HP PRRS no sea un virus de PRRS Tipo II tal como se define en la presente memoria, por ejemplo que la homología de nucleótidos sea menor que 91%, preferiblemente una homología inferior a 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% en el ORF 5 con VR2332, en calidad de aislado vírico de referencia.

La expresión "virus de HP PRRS" significa también cualquier cepa de virus de PRRS que tenga una modificación definida dentro de la proteína NSP2. Según esta definición, una cepa de virus de HP PRRS es una cepa de virus de PRRS que codifica una proteína NSP2, en donde ha sido eliminado el aminoácido que corresponde a leucina en la posición de aminoácido 482 de SEQ ID NO: 2 y que provoca el síntoma clínico de fiebre alta. Como alternativa, o además de la leucina eliminada en la posición de aminoácido de la SEQ ID NO: 2, pueden haber sido eliminados de la proteína NSP2 codificada por el virus PRRS los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 534 a 562 de la SEQ ID NO: 2. En este contexto, la SEQ ID NO: 2 debe ser entendida también de una manera ilustrativa, y la expresión "proteína NSP2 " no debe quedar limitada a la proteína NSP2 de la SEQ ID NO: 2. Basándose en las enseñanzas precedentes, una persona especialista en la técnica puede identificar fácilmente cualquier modificación correspondiente en una cepa de virus PRRS, que tenga una secuencia de proteína NSP2 que sea diferente de la secuencia de SEQ ID NO: 2, pero que muestre la misma modificación, lo que significa una deleción de la leucina que corresponde a la leucina en la posición 482 de SEQ ID NO: 2 y/o una deleción de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 534 a 562 de SEQ ID NO: 2.

Además, la expresión "virus de HP PRRS" puede significar también una cepa de virus de PRRS que tenga una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO:l (tal como se ha definido antes) y que codifique una proteína NSP2, en donde de la proteína NSP2 codificada por el virus PRRS han sido eliminados el aminoácido correspondiente a leucina en la posición de aminoácido 482 de SEQ ID NO: 2 y/o los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 534 a 562 de SEQ ID N0:2.

Además, la expresión "virus de HP PRRS" se refiere a un virus de HP PRRS que es una cepa de virus PRRS que tiene una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a SEQ ID N0:1, con la condición de que el virus de HP PRRS no sea un virus de PRRS Tipo II tal como se define en la presente memoria, por ejemplo que la homología de nucleótidos sea inferior a 91%, preferiblemente una homología inferior a 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en el ORF 5 con respecto a VR2332 en calidad de aislado vírico de referencia (tal como se ha definido más arriba) y que codifica una proteína NSP2, en donde de la proteína NSP2 codificada por el virus PRRS han sido eliminados el aminoácido correspondiente a leucina en la posición de aminoácido 482 de SEQ ID NO: 2 y/o los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 534 a 562 de SEQ ID NO: 2 .

Además, la expresión "virus de HP PRRS" se refiere a un virus de HP PRRS que es una cepa de virus PRRS que tiene una secuencia nucleotídica sustancialmente idéntica a SEQ ID NO:l, preferiblemente con la condición de que el virus de HP PRRS no sea un virus de PRRS Tipo 2 tal como se define en la presente memoria, por ejemplo que la homología de nucleótidos sea inferior a 91%, preferiblemente una homología inferior a 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% en el ORF 5 con respecto a VR2332 en calidad de aislado vírico de referencia (tal como se ha definido más arriba) y que codifica una proteína NSP2, en donde anticuerpos con reactividad hacia péptidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos 536-550 ó 546-560 ó 476-490 no muestran reactividad.

Además, se sabe que los siguientes aislados de virus de PRRS son cepas de virus de HP PRRS. En consecuencia, la expresión "cepa de virus de HP PRRS", tal como se emplea en la presente memoria incluirá cualquiera de estas cepas de virus, así como cualquier descendiente de las mismas: cepa AH-1 de virus HP PRRS ; AHCFSH; AHCFZC; BB07; BD-8; BQ07; CL07; CX07; CZ07; FY060915; FY080108; GC-2; GCH-3; GDI; GD2 ; GD2007; GD3 ; GD4 ; GDSD1; GDY1-2007; GDY2-2007; GDYF1; GS2008; GXHZ12; GXHZ13 ; GXHZ14; GXHZ16; GXHZ19 ; GXHZ2; GXHZ21 ; GXHZ ; GXLZ5; GXLZ7; GY; GZCJ; GZDJ; GZHW1 ; GZHW2 ; GZHX; GZJS ; GZKB; GZKY; GZLJ1; GZWB; GZ ; GZZB; Hainan-l; Hainan-2; HB1; HB2 ; HB3; HB-Tshl; HB-Xtl; HEN46; HeN-KF; HeN-LH; HeN-LY; HLJDF; HLJMZ1; HLJMZ2; HLJMZ3 ; HLJZY; HM-1; H 2 ; HN2007; H 3 ; HNld; iHNly; HNLY01; HNNX01; HNPJ01; HNsp; HNXT1; HNyy; HNyz ; HQ-5; HQ-6; HUB; HuN; HUN1 ; HUN11; HUN15 ; HUN16 ; HU 17 ; HU 2 ; HU 3 ; HUN4; HUN5 ; HU 6 ; HU 7 ; Hunan-1; Hunan-2; Hunan-3; HUNH2 ; HUNH4; HuNhl ; HUNL1 ; HUNX4 ; HZ061226; HZ070105; Jiangsu-1; Jiangsu-2; Jiangsu-3; Jiangxi-2; Jiangxi-4; JLYS ; JN; JXl; JX143; JX2; JX-2; JX2006; JX3 ; JX4 ; JX5 ; JXA1 ; KS06; LC07; LJ; LS06; LS-4; LY07; NB070319; SC07; SD; SD14 ; SDWF2 ; SH02 ; ST-7; SX2007; SY0608; TJDMJ; TJZHJ2 ; TJZHJ3 ; TQ; TQ07; TW07 ; WF07; XJ07; XL2008; YN2008; YNBS; YNDL; YNMG; YNWS ; YNYS ; YNYX1; YNYX3; ZJ06; ZJCJ; ZJWL; ZX07; ZS070921. El término "descendiente" significa, pero sin que deba quedar limitado a ello, un aislado vírico que procede de cualquiera de los virus progenitores arriba enumerados, y que tiene una identidad de secuencia nucleotídica superior a 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% con la cepa de virus progenitora correspondiente .

La expresión "virus de PRRS Tipo II" significa, pero sin que deba quedar limitada a ello, una cepa de virus de PRRS que es sustancialmente idéntica al aislado vírico depositado como ATCC-VR2332 o a cualquier descendiente del aislado vírico depositado como ATCC-VR2332. La expresión "sustancialmente idéntico", tal como se usa en la presente memoria, significa que la secuencia nucleotídica que codifica la proteína de ORF5 es entre 85% y 100% idéntica a la secuencia nucleotídica del aislado vírico depositado como ATCC-VR2332 y tal como se define en SEQ ID N0:3. La secuencia nucleotídica de ORF5 es preferiblemente idéntica en más de 86%, 87%, 88%, u 89% a SEQ ID NO: 3. Aún más preferiblemente, la secuencia nucleotídica de ORF5 es idéntica en más de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o en más de 99% a SEQ ID NO: 3. Preferiblemente, un virus de PRRS Tipo II, tal como se emplea en la presente memoria, es una cepa de virus de PRRS que es sustancialmente idéntica al aislado vírico depositado como ATCC-VR2332 o a cualquier descendiente del aislado vírico depositado como ATCC-VR2332 (tal como se ha definido más arriba) , pero no presenta una deleción dentro del gen NSP2 de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 534 a 562 de SEQ ID NO: 2. La secuencia completa del virus de PRRS ATCC-VR2332 se puede encontrar bajo el número de accesión a GenBank U87392.

La expresión "virus de PRRS Tipo II" incluirá también cualquier virus atenuado que se origine de cualquiera de las cepas de virus de PRRS Tipo II mencionadas más arriba. Por ejemplo, la expresión "virus de PRRS Tipo II" incluirá también virus de PRRS Tipo II atenuado depositado como ATCC-VR2495. Además, un virus de PRRS Tipo II atenuado puede ser cualquier descendiente atenuado del aislado vírico depositado como ATCC-VR2332. En algunas formas preferidas, el virus de PRRS Tipo II y un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden ser la vacuna Ingelvac® PRRS MLV (número de serie JA-A64A-149) de Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. (St. Joseph, MO) . La expresión "virus de PRRS Tipo II" puede incluir también los aislados conocidos como HB-l; BJ-4; CH-la; CH-1R; CH-1R01; HB-2; H 1 ; HT06; HZ07; LS05; LY03; NH04; PL97-1; SI; SH061130; SX071226; TW07-1; WF03 ; XX03 ; ZJJ04 ; ZJJ05 ; ZJJ07 , que son cepas de PRRS no-HP de origen chino.

Otro aspecto de la presente invención proporcionada en la presente memoria incluye un método para la profilaxis del ganado porcino frente a la infección con HP PRRS, que comprende administrar a un cerdo que lo necesite una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II, preferiblemente un virus de PRRS Tipo II atenuado, en donde el virus de PRRS Tipo II es una cepa de virus de PRRS que es sustancialmente idéntica al aislado vírico depositado como ATCC-VR2332 o a cualquier descendiente del aislado vírico depositado como ATCC-VR2332. Preferiblemente, este virus de PRRS Tipo II no tiene una deleción dentro del gen NSP2 de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 534 a 562 de SEQ ID NO: 2. Es incluso más preferido que el virus de PRRS Tipo II sea el virus de PRRS Tipo II atenuado depositado como ATCC-VR2495. Además, el virus de PRRS Tipo II es el de la vacuna de Ingelvac® PRRS MLV (número de serie JA-A64A-149) .

Una cantidad eficaz del virus de PRRS Tipo II puede ser una cantidad del virus que desencadene o que sea capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un animal, al cual se le haya administrado la dosis eficaz del virus . La cantidad que es eficaz puede depender de los ingredientes de la vacuna y del programa de administración. Si se emplea un virus inactivado o una preparación de virus vivo modificado, se puede recomendar una cantidad de vacuna que contenga de aproximadamente 102,0 a aproximadamente 109,0 TCID50 (dosis infectiva al 50% en cultivo de tejido, como criterio de valoración) , más preferiblemente de 103,0 a aproximadamente ÍO4,0 TCID50, y aún más preferiblemente de aproximadamente 104,0 a aproximadamente 108 0 TCID50 por dosis.

El virus de PRRS Tipo II descrito en la presente memoria puede ser utilizado en forma de un virus muerto, totalmente inactivado, o bien como una forma atenuada de un virus de PRRS Tipo II para la profilaxis del ganado porcino frente a los efectos de una enfermedad con fiebre alta, tal como se describe en la presente memoria. Además, para la profilaxis del ganado porcino frente a los efectos de una enfermedad con fiebre alta, también se pueden utilizar subunidades, entre ellas fragmentos inmunogénicos o fracciones del virus de PRRS Tipo II.

El virus de PRRS Tipo II atenuado descrito en. la presente memoria puede ser una vacuna viva modificada (siglas inglesas MLV) que comprende una o varias de las cepas antes mencionadas, vivas, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, o de manera alternativa, se pueden utilizar virus inactivados para preparar vacunas de organismos muertos (siglas inglesas KV) , tal como se ha descrito más arriba. Se pueden formular las MLV para permitir la administración de entre 101 y 107 partículas víricas, más preferiblemente de 103 a 105 partículas víricas, y aún más preferiblemente de 104 a 105 partículas víricas por dosis. Se pueden formular KV basadas en un título anterior a la inactivación de entre 103 y 1010, de 104 a 109, de 105 a 108, o bien de 106 a 107 partículas víricas por dosis.

Se puede administrar a un cerdo el virus de PRRS Tipo II, pre eriblemente el virus de PRRS Tipo II atenuado, antes de la exposición del cerdo a una cepa de virus de PRRS que produce HP PRRS, como agente profiláctico, de manera concomitante con la exposición del cerdo a una cepa de virus de PRRS que produce HP PRRS, o bien como tratamiento después de que un cerdo objetivo ha estado expuesto a una cepa de virus de PRRS que produce HP PRRS. El cerdo objetivo puede presentar uno o varios signos clínicos o síntomas comunes del HP PRRS o de una forma de enfermedad con fiebre alta tal como se ha descrito más arriba. Un cerdo objetivo puede ser particularmente susceptible a una enfermedad con fiebre alta asociada con HP PRRS. Un cerdo objetivo puede ser particularmente susceptible a HP PRRS. El cerdo objetivo puede ser susceptible a HP PRRS a causa de una inmunodef iciencia. El cerdo objetivo puede ser susceptible a HP PRRS a causa de que está criado en una instalación ganadera. Un cerdo susceptible puede estar siendo criado en China. El cerdo susceptible puede estar siendo criado en una provincia china tal como la provincia de Jiangxi, la provincia de Hebei, o la ciudad de Shanghai. Véase Tian et al., PloS ONE. 2007; 2 (6), cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia. El virus de PRRS Tipo II atenuado puede ser administrado por inyección, por inhalación, o a través de un implante, siendo particularmente preferida la inyección. Dependiendo de la duración y eficacia deseados de la vacunación o el tratamiento, el virus de PRRS Tipo II, preferiblemente el virus de PRRS Tipo II atenuado, puede ser administrado una o varias veces, también de forma intermitente, por ejemplo sobre una base diaria durante varios días, semanas o meses y en diferentes dosificaciones. De éstas, se prefiere la administración en dosis única. La inyección se puede realizar en una zona periférica o en una vena central, en cualquier cantidad que se desee, o bien, como alternativa, puede ser infundido de manera continua. El virus de PRRS Tipo II, preferiblemente el virus de PRRS Tipo II atenuado, puede ser administrado por vía oral, parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosal , tópica por inhalación, mediante administración oral, o combinaciones de éstas. El virus de PRRS Tipo II, preferiblemente el virus de PRRS Tipo II atenuado, puede ser administrado también en forma de un implante, el cual puede permitir una liberación lenta del virus atenuado. Para la inyección intramuscular, se puede aplicar un volumen de entre 0,5 mL y 3 mL, más preferiblemente entre 1 mL y 2,5 mL, aún más preferiblemente entre 1,5 mi y 2 mL. Es muy preferida una inyección intramuscular de 2 mL. Para la inyección intradérmica, se administra un volumen entre 0,05 mL y 1 mL, más preferiblemente entre 0,1 raL y 0,8 mL, aún más preferiblemente entre 0,1 y 0,5 mL, incluso más preferiblemente entre 0,2 y 0,4 mL. Muy preferiblemente, se puede administrar una inyección intradérmica de 0,2 mL. Se pueden administrar por vía intranasal volúmenes de virus de PRRS Tipo II entre 0,5 mL y 5 mL, más preferiblemente entre 1 mL y 4 mL, aún más preferiblemente entre 2 mL y 3 mL. Muy preferiblemente, se puede administrar por vía intranasal un volumen de 3 mL.

El vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir cualesquiera disolventes, medios dispersantes, revestimientos, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos, agentes que retardan la adsorción y similares.

Los "adyuvantes", de la manera como se utiliza este término en la presente memoria, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas, por ejemplo Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) , GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals , Inc., Birmingham, AL), emulsión de agua en aceite, emulsión de aceite en agua, o emulsión de agua en aceite en agua. La emulsión puede tener una base, en particular, de aceite de parafina líquido ligero (tipo de la Farmacopea Europea) ; de aceite isoprenoide tal como aceite de escualano o de escualeno que resulta de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; esteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol , tri- (caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ásteres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, en particular ésteres de ácido isoesteárico . El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferiblemente tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol) , de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y copolímeros de bloques de polioxipropileno- -polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (compilado por Stewart-Tull, D.E.S.), John Wiley and Sons, NY, págs . 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine 15: 564-570 (1997).

Por ejemplo, es posible utilizar la emulsión SPT descrita en la página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" compilado por M. Powell y M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 del mismo libro.

Un ejemplo adicional de un adyuvante es un compuesto elegido entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alguenílico. Son adyuvantes ventajosos los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con polialquenil-éteres de azúcares o polialcoholes . Estos compuestos se conocen con el nombre de carbómeros (Pharmeuropa, vol. 8, n° 2, junio de 1996). Los especialistas en la técnica pueden consultar también la patente de Estados Unidos n° 2.909,462 que describe polímeros acrílicos de este tipo, reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos reemplazados por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los propios radicales insaturados pueden contener también otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos con el nombre Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, Estados Unidos) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alilsacarosa o con alilpentaeritritol . Entre ellos, se pueden mencionar Carbopol 974P, 934P y 971P. Es muy preferido es el uso de Carbopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, los copolímeros EMA (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de estos polímeros en agua produce una solución ácida que será neutralizada, preferiblemente hasta un pH fisiológico, con el fin de obtener la solución de adyuvante en la que se incorporará la propia composición inmunógena, inmunológica o de vacuna.

Otros adyuvantes adecuados incluyen, pero sin quedar limitados a éstos, acetato de a-tocoferol, el sistema de adyuvante RIBI (Ribi Inc.), copolímeros en bloques (CytRx, Atlanta GA) , SAF-M (Chiron, Emeryville CA) , monofosforil-lípido A, adyuvante de lípido-amina Avridine, enterotoxina termolábil procedente de E. coli (recombinante o de otra forma) , toxina del cólera, IMS 1314, o dipéptido muramilo, entre muchos otros .

Preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 g hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 500 pg hasta aproximadamente 5 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 750 g hasta aproximadamente 2,5 mg por dosis. Muy preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis .

También se proporciona en la presente memoria un método para producir un virus de PRRS Tipo II atenuado que es capaz de tratar o inmunizar frente a HP PRRS un cerdo objetivo. El método puede comprender uno o más de los siguientes pasos : (a) traspasar ATCC-VR2332 o cualquier PRRS Tipo II sustancialmente idéntico a ATCC-VR2332, tal como se describe más adelante, para modificar el virus y hacerlo avirulento y capaz de inmunizar el cerdo objetivo frente a HP PRRS, (b) cosechar las células o el cultivo celular de producción del virus, (c) añadir un agente estabilizante al cultivo de producción del virus; y/o (d) liofilizar el cultivo de producción del virus. El traspaso del virus puede comprender técnicas de propagación y selección clásicas; por ejemplo, la propagación continuada en células hospederas adecuadas con el fin de extender el fenotipo atenuado. Los traspasos pueden dar como resultado una cepa vírica que haya adquirido mutaciones, muchas de las cuales no alterarán significativamente las propiedades de la cepa progenitora. El virus de PRRS Tipo II atenuado ?µß?e ser el resultado de haber traspasado ATCC-VR2332 o cualquier virus de PRRS Tipo II sustancialmente idéntico a ATCC-VR2332 al menos 60, 65, 70, 75, 80, o más veces en una célula hospedera. El virus de PRRS Tipo II atenuado puede ser el resultado de haber traspasado ATCC-VR2332 o cualquier PRRS Tipo II sustancialmente idéntico a ATCC-VR2332 entre 50 y 100 veces, entre 60 y 90 veces, entre 70 y 80 veces, o entre 65 y 75 veces en una célula hospedera. El virus de PRRS Tipo II atenuado puede ser el resultado de haber traspasado ATCC-VR2332 o cualquier PRRS Tipo II sustancialmente idéntico a ATCC-VR2332 , 70 o 75 veces en una célula hospedera. Una célula hospedera adecuada puede incluir una línea celular de simio, células de Vero, o macrofagos alveolares porcinos. Una línea celular de simio preferida es MA-104. La célula hospedera puede ser un cultivo celular. La línea celular puede estar infectada con el virus que ha de ser traspasado. Cada traspaso puede requerir la incubación de la línea celular o cultivo celular infectada con virus, resultante, a una temperatura entre 34 °C y 40°C, más preferiblemente entre 35°C y 39°C, aún más preferiblemente entre 36°C y 38°C, e incluso más preferiblemente entre 35°C y 37 °C. Muy preferiblemente, cada traspaso puede requerir la incubación de la línea celular o cultivo celular infectada con virus, resultante, a una temperatura de 37 °C. El paso de la cosecha puede incluir la congelación del cultivo celular infectado por el virus. La liofilización puede incluir la sublimación de humedad desde una muestra congelada del cultivo celular infectado con virus.

También se puede emplear la modificación vírica para producir un virus de PRRS Tipo II atenuado, y se puede conseguir- mediante mutación dirigida de la secuencia de ácido nucleico de la cepa vírica, por medio de técnicas de ingeniería genética apropiadas . Tales técnicas pueden utilizar la construcción de una copia de ácido nucleico complementario de longitud completa, del genoma vírico, que puede ser modificada mediante métodos de recombinación y manipulación de ácidos nucleicos. Tales métodos pueden utilizar la mutagénesis dirigida. Así se pueden modificar sitos antigénicos o propiedades enzimáticas de proteínas víricas .

También se proporciona en la presente memoria un kit o conjunto para llevar a cabo cualquiera de lo métodos descritos en lo que antecede. El kit puede comprender un recipiente, una composición inmunogénica que comprende preferiblemente virus PRRS Tipo II atenuado, un vehículo farmacéuticamente aceptable, un adyuvante, e instrucciones para administrar la composición inmunogénica a un animal que la necesite, a fin de disminuir la incidencia, o la gravedad de los signos clínicos o los efectos, de la infección PRRS, y preferiblemente formas de enfermedad con fiebre alta de PRRS o HP-PRRS. El kit puede comprender además un medio de inyección y/o un medio para cualquier otra forma de administración. El kit puede aún comprender adicionalmente un disolvente. La vacuna atenuada puede estar liofilizada y puede ser reconstituida con el disolvente, dando como resultado una solución para inyección y/o inhalación. El disolvente puede ser agua, solución salina fisiológica, tampón, o un disolvente coadyuvante. El kit puede comprender recipientes separados para contener el virus atenuado, el disolvente, y/o el vehículo farmacéuticamente aceptable. Las instrucciones pueden consistir en un prospecto y/o una etiqueta unida a uno o más de los recipientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIGURA 1 es una representación gráfica de cómo se puntúa y se evalúa en los pulmones el porcentaje de superficie afectado por neumonía visible; la FIG. 2 es una gráfica que compara la temperatura rectal de cerdos en grupos vacunados y no vacunados; la FIG. 3 es una gráfica que ilustra una comparación de la relación S/P media de cerdos en grupos vacunados y no vacunados, en donde la relación S/P media de ELISA del grupo se ha utilizado para medir la respuesta serológica respectiva del grupo a PRRSV; la FIG. 4 es una gráfica que ilustra una comparación de puntuaciones clínicas promedio de cerdos en grupos vacunados y no vacunados, en donde se han registrado puntuaciones de enfermedad respiratoria de grupos de cerdos vacunados y no vacunados ; la FIG. 5 es una gráfica que compara la ganancia de peso diaria media de cerdos en grupos vacunados y no vacunados ; y la FIG. 6 es una gráfica que ilustra un resumen del porcentaje de sueros positivos para PRRSV por RT-PCR en cerdos vacunados con MLV y en cerdos no vacunados/sometidos a prueba de provocación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES La terminología utilizada en la presente memoria sólo tiene la finalidad de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante. Tal como se emplean en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "uno/a", "y" , y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

En la enumeración de intervalos numéricos en la presente memoria, está explícitamente contemplado cada uno de los números contenidos entre los mismos, con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, en el caso del intervalo de 6-9, están contemplados los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, están explícitamente contemplados los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, y 7,0.

Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "virus atenuado" significa un virus avirulento que no provoca signos clínicos de enfermedad PRRS pero es capaz de inducir una respuesta inmunológica en el mamífero objetivo, aunque también puede significar que los signos clínicos quedan reducidos en incidencia y en gravedad en animales infectados con el virus atenuado, en comparación con un "grupo testigo" de animales infectados con el virus de PRRS no atenuado, y que no han recibido el virus atenuado . En este contexto, el término "reducir/reducido" significa una reducción de al menos 10%, preferiblemente 25%, incluso más preferiblemente 50%, muy preferiblemente de más de 100% en comparación con el grupo testigo tal como se ha definido más arriba.

La expresión "fragmento inmunogénico" tal como se emplea en la presente memoria puede significar una porción de péptido o polipéptido o secuencia de ácido nucleico de virus de PRRS Tipo II que puede desencadenar una respuesta inmunológica en el hospedero, entre ellas una respuesta inmunológica celular y/o mediada por anticuerpo a PRRSV.

Los términos "idéntico" o "identidad", tal como se emplean en la presente memoria en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido o nucleotídicas , pueden significar que las secuencias tienen un porcentaje especificado de restos o de nucleótidos que son iguales dentro de una región especificada. El porcentaje se puede calcular alineando óptimamente las dos secuencias, comparando las dos secuencias a lo largo de la región especificada, determinando el número de posiciones en las cuales se presenta idéntico residuo en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones de la región especificada, y multiplicando por 100 el resultado, a fin de proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. En los casos en donde las dos secuencias tienen longitudes diferentes o la alineación produce uno o más extremos en escalón y la región de comparación especificada sólo incluye una única secuencia, los restos de la secuencia única se incluyen en el denominador de la fórmula, pero no en el numerador.

El aislado de PRRS ATCC VR-2332 fue depositado en la American Type Culture Collection de Rockville, Maryland, de acuerdo con el tratado de Budapest, el 7 de julio de 1992, y recibió el número de accesión ATCC VR-2332.

El aislado de PRRS VR-2495 fue depositado en la American Type Culture Collection de Rockville, Maryland, de acuerdo con el tratado de Budapest, el 28 de enero de 1995, y recibió el número de accesión ATCC VR-2495.

La expresión "composición inmunogénica" o "vacuna" tal como se emplea en la presente memoria, significa una composición que comprende virus de PRRS Tipo II (MLV o virus muertos) o cualquiera de sus fragmentos o fracciones inmunogénicas , preferiblemente virus PRRS Tipo II atenuado, tal como Ingelvac PRRS MLV o Ingelvac PRRS ATP, que desencadena una "respuesta inmunológica" en el hospedero de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a PRRSV. Preferiblemente, esta composición inmunogénica es capaz de conferir inmunidad protectora contra una infección por PRRSV y los síntomas clínicos asociados con la misma.

La expresión "desencadenar una respuesta inmunológica o respuesta inmunitaria" tal como se emplea en la presente memoria significa cualquier respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a una composición inmunogénica o vacuna administrada a un animal que recibe la composición inmunogénica o vacuna. Habitualmente , una "respuesta inmune" incluye, pero sin quedar limitada a éstos, uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células T yd, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el hospedero manifestará una respuesta inmunológica, sea terapéutica o protectora, tal que se incrementa la resistencia a una nueva infección y/o se reduce la gravedad clínica de la enfermedad en comparación con testigos que no reciben la administración de la composición inmunogénica o vacuna. Una protección de este tipo quedará demostrada por una reducción, sea de la incidencia o de la gravedad, que puede llegar hasta e incluir la carencia de los síntomas asociados con infecciones de hospedero según se ha descrito anteriormente .

La expresión "inmunidad protectora" tal como se usa en la presente memoria, significa que la resistencia en un grupo de animales a una infección con PRRS, preferiblemente HP PRRS, resultará intensificada en comparación con un grupo testigo de animales infectados con HP PRRS pero que no reciben una composición inmunogénica o vacuna que contenga PRRS, preferiblemente PRRS Tipo II. La expresión "resistencia intensificada" tal como se emplea en la presente memoria significa que menos de 10 %, preferiblemente menos de 20%, incluso más preferiblemente menos de 30%, incluso más preferiblemente menos de 40%, incluso m s preferiblemente menos de 50%, incluso más preferiblemente menos de 75%, incluso más preferiblemente menos de 100% de los animales que reciben la composición inmunogénica o vacuna de la invención desarrollan uno o varios síntomas clínicos asociados con fiebre alta, preferiblemente causados por HP PRRS tal como se describe en la presente memoria, en comparación con un grupo de animales infectados con PRRS pero que no reciben la composición inmunogénica o vacuna.

La expresión " sustancialmente complementaria" tal como se emplea en la presente memoria puede significar que una primera secuencia es idéntica en al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% al complemento de una segunda secuencia a lo largo de una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos, o bien que las dos secuencias se hibridan en condiciones de hibridación restrictivas.

La expresión "sustancialmente idéntica" tal como se emplea en la presente memoria puede significar que una primera y una segunda secuencias son idénticas en al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% a lo largo de una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos o aminoácidos, o con respecto a ácidos nucleicos, si la primera secuencia es sustancialmente complementaria al complemento de la segunda secuencia.

Los términos "ganado porcino", "cerdo" y "lechón", tales como se emplean en la presente memoria, pueden ser utilizados indistintamente .

El término "vacunar" se refiere a la administración de la composición inmunogénica o vacuna descrita en la presente memoria antes de la exposición a formas de enfermedad con fiebre alta de PRRS o HP-PRRS.

El término "proteger" o "protección" se refiere a la reducción de la gravedad o incidencia de signos clínicos de infección HP-PRRS o formas de enfermedad con fiebre alta de PRRS como consecuencia de haber recibido una administración de la composición inmunogénica de la presente invención. La reducción en la gravedad o incidencia se considera en comparación con un animal o grupo de animales que no reciben la composición inmunogénica de la presente invención.

MODALIDADES PREFERIDAS Los siguientes ejemplos recogen los materiales y procedimientos preferidos de acuerdo con la presente invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención se pueden utilizar cualesquiera materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, a continuación se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Ha de entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan solamente a modo de ilustración, y nada en ellos debe considerarse una limitación del alcance global de la invención.

EJEMPLOS Los Ejemplos identificados a continuación ilustran la naturaleza sumamente virulenta del aislado de PRRSV JX143. Los cerdos vacunados con Ingelvac® PRRS MLV presentan una supervivencia de 100% y respuesta de anticuerpos significativamente superior, menor proporción de PRRS clínica y viremia, lesiones pulmonares y fiebre menos graves, signos clínicos más benignos y breves, y un período más breve de temperatura rectal alta, en comparación con cerdos no vacunados, tras una prueba de provocación con una cepa de PRRSV sumamente virulenta. 1. Materiales y métodos 1.1 Vacunas y virus La vacuna Ingelvac® PRRS MLV (número de serie JA-A64A-149) procedía de Boehringer Ingelheim Vetmedica. El aislado de PRRSV sumamente virulento JX143 fue aislado por el Shanghai Veterinary Research Institute. El cultivo en tejido de PRRSV JX143 (105,2 TCID50/ml) fue diluido a un quinto con DMEM para la inoculación a los cerdos . 1.2 Cebadores y reactivos La polimerasa de transcripción inversa y el ADN en escalera fueron adquiridos a Tiangen Biotechnology Company. La mezcla 2xPCR Mix procedía de Dongsheng Company. Trizol® y los cebadores procedían de la compañía Invitrogen.

Tabla 1. Cebadores utilizados para la amplificación RT-PCR 1.3 Origen y agrupamiento de los animales Para los ensayos se adquirieron cincuenta (50) cerdos de 29 días de edad de la granja de cría Henan Muyuan. Fueron confirraados negativos para PRRSV y PCV2 mediante RT-PCR (para PRRSV y PCV 2) y ELISA (un kit anti- PRRSV, IDEXX Laboratory, Inc.) realizando cada uno de estos tres ensayos en muestras de suero obtenidas a la llegada. Se pesó a los cerdos, y se les asignó al azar a los grupos 1, 2 ó 3, que contenían respectivamente 22, 14 y 14 cerdos. Después se alojó a los cerdos en salas separadas conforme al grupo a que pertenecían . 1.4 Vacunación y prueba de provocación con virus Los 22 cerdos del grupo 1 (V/C) fueron vacunados el día 0 con una dosis única de 2 mL de vacuna Ingelvac® PRRS MLV, administrada por vía intramuscular. A los 14 cerdos del grupo 2 (no-V/C) se les inyectó 2mL de PBS el día 0. La prueba de provocación para los cerdos del grupo 1 y del grupo 2 se produjo el día 28 con la administración intranasal de 3 mL de PRRSV JX143 diluido. Los cerdos del grupo 3 (no-V/no-C) no fueron vacunados ni sometidos a la prueba de provocación, para ser testigos estrictamente negativos, y se les inyectó 3 mL de DME el día 28. Para observación, se sometió a necroscopia a dos cerdos de cada grupo los días 14 y 42, respectivamente. El resto de los cerdos fue sometido a necroscopia el día 49. 1.5 Temperatura rectal Se registró la temperatura rectal cada día a la misma hora desde el día 0 hasta el día 49 (21 días después de la prueba de provocación) . 1.6 Serología Se obtuvo suero de cada uno de los cerdos en los días 0 , 7, 14, 21, 28, 32, 42, y 49, y se analizó en el mismo la presencia de anticuerpo anti-PRRSV utilizando un kit ELISA para PRRSV de IDEXX. 1.7 Evaluación clínica Se examinó diariamente a los cerdos desde el día 0 hasta el día 49, y se puntuó la gravedad de los cambios en el comportamiento y signos clínicos respiratorios, entre ellos la respiración y la tos. En la Tabla 2 se muestra el sistema de puntuación de los signos clínicos.

Tabla 2. Sistema de puntuación de signos clínicos.

*Respiración: la puntuación 2 (ligera) corresponde a respiración superficial, secreción nasal, respiración abdominal "retumbante" cuando se estimula. La puntuación 3 (grave) corresponde a respiración rápida y superficial, secreción nasal, respiración con la boca abierta, respiración abdominal "retumbante" .

?Conducta: 1. la piel de la boca, hocico, orejas e interior de las patas se enrojece, congestión, manchas rojas, pápulas 2. depresión, pelaje áspero. 3. anorexia 4. cojera, temblor, convulsiones 5. escuálido. La puntuación 2 corresponde a uno o dos de los síntomas arriba descritos. La puntuación 3 corresponde a tres o más de los síntomas arriba descritos. *Tos: La puntuación 2 corresponde a tos improductiva. La puntuación 3 corresponde a tos productiva. 1.8 Evaluación de la productividad Se registró el peso de todos los cerdos en el día 0 (antes de la vacunación) , en el día 28 (antes de la prueba de provocación) , y en el día 49 (21 días después de la prueba de provocación) . 1.9 Se analizó la eficacia de Ingelvac® PRRS MLV evaluando los signos clínicos, las puntuaciones de lesión pulmonar y las temperaturas rectales después de la prueba de provocación en cerdos vacunados, en comparación con el grupo testigo con prueba de provocación y el grupo testigo negativo. Se consideró que los cerdos estaban clínicamente afectados por PRRS cuando eran evidentes: 1) temperatura rectal alta (41°C) durante más de 3 días, 2) depresión, anorexia, conjuntivitis, tos, dificultad respiratoria, y 3) neumonía. 1.10 Lesiones pulmonares Se realizó la necropsia en el día 49 (21 días después de la provocación con PRRSV) . En cada uno de los cerdos se evaluaron los pulmones en cuanto a porcentaje de la superficie (de 0 a 100%) afectado por neumonía visible a simple vista (edema, congestión, hemorragia, estructura carnosa y fibrosa firme), de manera "a ciegas " . 1.11 Detección y cuantificación de ARN de PRRSV Se obtuvo suero de los cerdos del grupo 1 (V/C) los días 0, 7, 14, 21, 28, 32, 35, 42, y de los cerdos del grupo 2 (no-V/C) los días 28, 32, 35 y 42. La extracción de ARN de 140 L de muestras individuales de suero se realizó utilizando un mini-kit para ARN vírico QIAamp (QIAGEN) . Después se llevó a cabo RT-PCR utilizando combinaciones se cebador- sonda (Invitrogen) específicas (Tabla 1) para la región conservada del ARN de PRRSV (Genbank) .

Cada reacción RT consistió en 12,5 L de ARN plantilla, 4 L de dNTP, 2 L de tampón lOxBuffer, 0,5 L de cebador Qst y 1 pL de transcriptasa inversa Quant. Se incubó la mezcla en un baño de agua a 37 °C durante 1 hora y se conservó a -20 °C. Después se llevó a cabo la PCR utilizando 1 yL de la reacción RT, 1 L de cada uno de los cebadores SF14413 y SR1549, 2 yL de tampón lOxBuffer, 2i de dNTP, 5 unidades de polimerasa rTaq y agua hasta un volumen total de 20 \x . Se desarrolló la placa de reacción en un sistema de detección de secuencias en condiciones específicas (94 °C durante 5 minutos; después 40 ciclos de 94 °C 30 segundos, 65°C 30 segundos, 72°C 75 segundos, 40 ciclos; finalmente 72°C durante 10 minutos) . El fragmento amplificado por PCR fue separado en gel de agarosa y detectado bajo luz ultravioleta. 1.12 Inmunohistoquímica para la detección de antígeno de PRRSV .

La inmunohistoquímica para la detección de antígeno específico contra PRRSV se llevó a cabo en cortes de tejido pulmonar fijadas con formol e incrustadas en parafina realizadas en el transcurso de 48 horas después de la necropsia, utilizando anticuerpo monoclonal anti -proteína N de PRRSV (SR30 ó SDOW17) y anticuerpo conjugado secundario. 2. Resultados 2.1 Cambios en la temperatura rectal después de la prueba de provocación .

Después de la inoculación con el PRRSV JX143 altamente virulento, la temperatura rectal tanto en los cerdos del grupo vacunado como en los del grupo no vacunado aumentó rápidamente. La temperatura máxima fue 41°C, y 75% de los cerdos presentaron fiebre inmediatamente después de la inoculación con el virus de provocación. Las temperaturas rectales declinaron hasta los niveles anteriores a la prueba de provocación en el transcurso de 10 días en el caso de los cerdos vacunados, mientras que los cerdos del grupo no-V/C tuvieron un período febril más largo y presentaban temperaturas rectales elevadas durante un tiempo significativamente más largo (Fig. 2) . 2.2 Respuesta serológica.

Para medir la respuesta serológica respectiva del grupo a PRRSV se utilizó la relación S/P de ELISA media del grupo (Fig. 3) . Los cerdos del testigo negativo continuaron siendo negativos para anticuerpos contra PRRSV a lo largo de todo el estudio. En el grupo V/C, el anticuerpo se detectó por primera vez a los 10-14 días después de la vacunación, y la relación S/P =0,4 se produjo a los 14 días después de la inoculación (abreviado p.i.) con 8 cerdos positivos de 20, y a los 21 días p.i., 13 cerdos de 20 resultaron positivos en el grupo V/C. La relación S/P más alta en el grupo V/C se ^observó después de la prueba de provocación, y continuó siendo alta hasta el final del estudio (ELISA S/P*2) . En los cerdos no-V/C el suero se convirtió rápidamente después de la prueba de provocación a los 7 días p.i., 9 cerdos de los 12 eran positivos, con relación S/P =0,4. 2.3 Signos clínicos Se registraron las puntuaciones de enfermedad respiratoria del grupo V/C y del grupo no-V/C (Fig. 4) . Después de la prueba de provocación, 5 cerdos de los 20 cerdos del grupo V/C presentaban signos respiratorios y tos, y 2 cerdos presentaban respiración abdominal "retumbante" . Ocho de los 12 cerdos del grupo no-V/C murieron antes de los 21 días p.i., y el resto de los cerdos del grupo no-V/C mostraron signos respiratorios graves y tos, con respiración abdominal "retumbante". Los cerdos no-V/C recibieron una puntuación por encima de 6 durante 10 días consecutivos, siendo 7 la máxima puntuación alcanzada. Los cerdos V/C no presentaron signos clínicos significativos y su máxima puntuación media se situó en el intervalo de 4-5 durante 7 días consecutivos. Como testigos negativos estrictos, los cerdos no-V/no-C no mostraron signos clínicos, y su puntuación media fue de 3 (normal) . 2.4 Ganancia diaria media de peso antes y después de la prueba de provocación En la Fig. 5 se resume la ganancia diaria media de peso (siglas inglesas ADG) . Desde el día 0 hasta el día 28, la ADG no fue significativamente distinta entre los cerdos vacunados (0, 3301±0 , 0414 kg) y los cerdos no vacunados ( 0 , 3008±0 , 0653 kg) . Desde el día 28 (el día anterior a la prueba de provocación) hasta el día 49, los cerdos vacunados tuvieron una ADG similar a la de los cerdos testigo no-V/no-C (0,3373 +0,0800 kg frente a 0,3484+0,0890 kg) , mientras que los cerdos no-V/C tuvieron una ADG bruscamente mucho menor (0, 0392±0 ,2398) . 2.5 Eficacia de la vacunación.

Después de la prueba de provocación, los cerdos vacunados con MLV manifestaron signos clínicos poco tiempo después de la prueba de provocación, con una puntuación media de signos clínicos de 5, y más de 3 cerdos tenían temperatura rectal alta (41°C) y lesiones pulmonares. Tal como se ha definido por los criterios indicados en la sección de métodos, 25% (5/20) de los cerdos vacunados con MLV padecieron PRRS y 75% (15/20) de los cerdos fueron protegidos. En contraste, todos los cerdos no vacunados padecieron PRRS después de la prueba de provocación, y 8 cerdos murieron antes de la necropsia.

Tabla 3. Eficacia de la vacunación con MLV 2.6 Lesiones macroscópicas.

En la necropsia, los cuatro cerdos supervivientes del grupo no-V/C presentaban lesiones macroscópicas, entre ellas fracaso/colapso pulmonar, manchas de color bronce, congestión, ganglios linfáticos en la ingle, papada, edema mesentérico y congestión, y necrosis hepática en algunos de ellos. Un pequeño número de cerdos en el grupo V/C tenían lesiones similares, pero menos graves. Los cerdos testigo no-V/no-C no presentaban lesiones macroscópicas. 2.7 Puntuaciones de lesiones pulmonares macroscópicas La puntuación de lesiones pulmonares macroscópicas de los cerdos vacunados con MLV fue significativamente menor que la de los cerdos no-V/C, lo que sugiere que la MLV proporcionó una buena protección contra la inoculación con PRRSV altamente patógeno (Tabla 4, en donde el intervalo para la incidencia de lesiones pulmonares macroscópicas va de 0 a 100%) .

Tabla 4. Comparación de la gravedad de lesiones pulmonares macroscópicas en cerdos de diferentes grupos Día después Grupo de la MLV-V/C no-V/C no-V/no-C vacunación 14 0, 500±2, 00 0, 30±2, 30 42 28,58±16,15 75, 25±7, 27 0, 25±1, 00 49 19, 12+8, 37 69, 6±12. 7 0,30+0, 50 2.8 Detección de Viremia En la Fig 6 se resume el porcentaje de sueros positivos para PRRSV por RT-PCR. Se detectó viremia en 60% de los cerdos vacunados con MLV 7 días después de la vacunación, y este número disminuyó hasta 20% antes de la prueba de provocación. Después de la prueba de provocación, 70% de los cerdos vacunados presentaban viremia, y este número disminuyó hasta 60% a los 7 días p.i., siendo virémico el 20% a los 21 días p.i. En contraste, 100% de los cerdos no-V/C presentaba viremia después de la prueba de provocación, la viremia continuó siendo elevada después de la prueba de provocación, y 70% de los cerdos no-V/C eran virémicos 21 días después de la prueba de provocación. 2.9 Detección de antígeno por inmunohistoquímic .

Las lesiones pulmonares microscópicas fueron observadas bajo el microscopio. Se apreciaron células infectadas con PRRSV en todos los cerdos sometidos a la prueba de provocación. Los cerdos MLV-V/C presentaron menos células infectadas con PRRSV. Se registró el número total de células y el número de células infectadas con PRRSV en diferentes zonas . La proporción de infección celular era significativamente diferente entre los grupos: 23,34+4,691 para los cerdos no-V/C, 9,36±8,069 para los cerdos V/C y 0,24±0,1L4 para los cerdos no-V/no-C (Tabla 5).

Tabla 5. Células infectadas con PRRSV mediante análisis inmunohistoquímico de bloques de pulmón de cerdo incrustados en parafina.

LISTADO DE SECUENCIAS Esta solicitud contiene un listado de secuencias en formato papel y en formato legible por ordenador, cuyas enseñanzas y contenido se incorporan por la presente como referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de- la invención.

Claims (15)

REIVI DICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Método para vacunar ganado porcino contra los efectos de una forma de enfermedad con fiebre alta de PRRS, caracterizado porque comprende administrar a un cerdo una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la forma de enfermedad con fiebre alta de PRRS está originada por un PRRSV chino que tiene una secuencia de ácido nucleico que es homologa en al menos 95% a la secuencia de ácido nucleico de HB-1, o JX143.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la forma de enfermedad con fiebre alta está causada por un virus HP PRRS.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus de PRRS Tipo II está atenuado.

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el virus de PRRS Tipo II es una forma atenuada de la cepa que tiene el número de accesión ATCC VR-2332, o un descendiente de éste.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el virus de PRRS Tipo II es una cepa que tiene el número de acessión ATCC VR-2495, o un descendiente de éste.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, 5 caracterizado porque la cepa de PRRSV chino está seleccionada del grupo consistente en AH-1; AHCFSH ; AHCFZC; BB07; BD-8; BQ07; CL07; CX07; CZ07; FY060915; FY080108; GC-2; GCH-3; GDI; GD2 ; GD2007; GD3 ; GD4 ; GDSD1 ; GDY1-2007; GDY2-2007; GDYF1 ; GS2008; GXHZ12; GXHZ13; GXHZ1 ; GXHZ16; GXHZ19; GXH 2 ; 10 GXHZ21; GXHZ4 ; GXLZ5 ; GXLZ7; GY; GZCJ; GZDJ; GZHW1 ; GZHW2 ; GZHX; GZJS; GZKB; GZKY; GZLJ1 ; GZWB; GZWM; GZZB; Hainan-1; Hainan-2; HB1; HB2; HB3 ; HB-Tshl; HB-Xtl; HEN46; HeN-KF; HeN- LH; HeN-LY; HLJDF; HLJMZ1 ; HLJMZ2 ; HLJMZ3 ; HLJZY; HM-1; HN2 ; HN2007; HN3 ; HNld; HNly; HNLY01; HNNX01; HNPJ01; HNsp; HNXT1; 15 HNyy; HNyz; HQ-5; HQ-6; HUB; HuN; HU 1 ; HUN11; HU 15 ; HUN16; HUN17; HUN2 ; HUN3 ; HUN4 ; HU 5 ; HU 6 ; HU 7 ; Hunan-1; Hunan-2; Hunan-3; HUNH2 ; HUNH4 ; HuNhl; HUNL1 ; HUNX4 ; HZ061226; HZ070105; Jiangsu-1; Jiangsu-2; Jiangsu-3; Jiangxi-2; Jiangxi-4; JLYS; JN; JX1 ; JX143 ; JX2 ; JX-2; JX2006; JX3 ; JX4 ; 20 J 5; JXA1; KS06; LC07; LJ; LS06; LS-4; LY07; NB070319; SC07; SD; SD14; SDWF2 ; SH02; ST-7; SX2007 ; SY0608; TJDMJ; TJZHJ2 ; TJZHJ3 ; TQ; TQ07; TW07 ; WF07; XJ07; XL2008; YN2008; YNBS; YNDL; YNMG; YNWS ; YNYS ; YNYX1 ; YNYX3 ; ZJ06; ZJCJ; ZJWL; ZX07; y ZS070921.

?? 8. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la composición comprende además un adyuvante .

9. Método para vacunar ganado porcino contra los efectos de una forma de enfermedad con fiebre alta de virus de PRRS JX143, caracterizado porque comprende administrar a un cerdo una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II.

10. Método para disminuir la incidencia, o la gravedad de signos clínicos, de formas de enfermedad con fiebre alta de PRRS, caracterizado porque comprende administrar a un cerdo que 1A necesite una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II.

11. Método para disminuir la incidencia, o la gravedad de signos clínicos, de formas de enfermedad con fiebre alta de PRRS, que comprende administrar a un cerdo que la necesite una composición inmunogénica caracterizado porque comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II, en donde la forma de enfermedad con fiebre alta de PRRS procede de un PRRSV chino que tiene una secuencia de ácido nucleico que es homologa en al menos 95% a la secuencia de ácido nucleico de HB-1, o JX143.

12. Uso de un virus de PPRS Tipo II para vacunar ganado porcino contra los efectos de una forma de enfermedad con fiebre aLta de virus de PRRS, que comprende administrar a un cerdo una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II.

13. Uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde la forma de enfermedad con fiebre alta de PRRS procede de un PRRSV chino que tiene una secuencia de ácido nucleico que es homologa en al menos 95% a la secuencia de ácido nucleico de HB-1, o JX143.

14. Uso de un virus de PPRS Tipo II para preparar una composición farmacéutica para vacunar ganado porcino contra los efectos de una forma de enfermedad con fiebre alta de virus de PRRS, que comprende administrar a un cerdo una composición inmunogénica que comprende una cantidad eficaz de un virus de PRRS Tipo II.

15. Uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde 'la forma de enfermedad con fiebre alta de PRRS procede de un PRRSV chino que tiene una secuencia de ácido nucleico que es omóloga en al menos 95% a la secuencia de ácido nucleico de HB-1, o JX143.