CN105073130A - 猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明系关于具有增加稳定性之猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)突变株；含有病毒株或其所衍生之抗原之组合物；含有该等病毒株之疫苗，包括杀死的、减毒或亚单位疫苗；编码PRRSV多肽之核酸、由该等核酸编码之多肽，包括其抗原片段；与该等多肽特异性结合之抗体，及其制造与使用方法。

Description

猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法
序列表
本申请案包含序列表，其已根据37C.F.R.1.821-1.825以ASCII的格式以电子方式呈送。于2014年1月29日所产生的该ASCII复本名为10-0145-WO-1-SEQ.txt，其大小为124,804字节。伴随本申请案的序列表全部通过引用并入本文。
发明背景
A.技术领域
本发明系关于猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)组合物及相关方法。
B.相关技术描述
尽管大量努力针对病原体消除及控制策略，但养猪业仍因PRRSV而持续经历主要的经济损失。PRRSV系一种分类为套式病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)及动脉炎病毒属(Arterivirus)之包膜单链正义RNA病毒。该病毒导致猪生殖与呼吸综合征(PRRS)，且亦称为神秘猪病(MysterySwineDisease)及SIR。PRRS之症状包括育种雌性生殖失败及生长期猪之呼吸道疾病。生殖失败与中后期流产、木乃伊胎与弱出生仔猪数量增加及健康出生仔猪较少相关。PRRSV之特征亦在于通常由显微镜可见之如同间质性肺炎之厌食、发热及呼吸道疾病。因此，感染PRRSV对兽群之生产率可具有显著之负面效应。据估计，PRRSV每年使美国养猪业耗费约5亿6千万美元。复合情形系PRRSV在大多数猪生产国具地方性且在其它地方具有类似经济效应的事实。
目前用于预防病毒在兽群内及其之间传播的控制策略包括：适当管理育种动物、移除受感染个体、严格生物安全措施(包括空气过滤***)、血清接种及使用疫苗。灭活与修饰(减毒)活疫苗两者均有市售。灭活疫苗产生高水平安全性，但一般认为无效或递送极有限程度之功效。减毒活疫苗已广泛用于减少由野生型PRRS病毒引起之传播及临床疾病。尽管修饰活疫苗之功效可针对异源分离株而变化，但其仍为可用于对抗疾病之最优选疫苗接种选择。
如同已报导疑似恢复毒性之若干种情形，减毒疫苗不带有任何风险。因此，新的疫苗需要能够提供充分免疫保护以减少传播及临床疾病，同时亦展现高度安全性及对遗传改变之抗性。
为增加遗传稳定性，已研发在nsp2(非结构蛋白质2)区具有源自细胞传代之缺失的病毒。nsp2蛋白质系最大之PRRSV蛋白质、具高度抗原性且具有最高遗传多样性之PRRSV基因体。缺失突变之值源自其所赋予之稳定性增加。较短之序列导致恢复毒性之可能性较小。缺失部分将需要***以回复其初始状态，此比简单取代回到初始毒性形式更不可能发生。
发明概述
本发明提供克服本领域之缺陷之免疫原性组合物、疫苗及相关方法。该等组合物及方法尤其提供遗传稳定之PRRSV之免疫原性缺失突变体，由其可制得疫苗，包括减毒全病毒疫苗及多肽亚单位疫苗，其中该等疫苗赋予对由PRRSV感染引起之临床疾病之免疫性、对此疾病之保护抗性、减少此疾病之传播和/或减少此疾病。
本发明之例示性免疫原性组合物包含由SEQIDNO:1(PRRSV之预减毒Wetzel分离株)及SEQIDNO:2(Wetzel分离株之减毒形式)之核苷酸序列编码之多肽序列中之任一者或其片段，尤其为与其所源自之全长PRRSV蛋白质相比具有类似免疫原性特异性之在生物学或功能上(例如在免疫学上)具有活性之片段。所述多肽优选具有免疫原性且在投予多肽之动物体内诱发对PRRS病毒之免疫反应性反应，该反应对PRRSV具免疫保护性。
在另一方面中，本发明提供编码一或多种多肽、抗体构建体或抗体缀合物之核酸序列，包括DNA与RNA序列。编码多肽之基因序列包含与Wetzelp3ORF1a(SEQIDNO:3)、Wetzelp3ORF1b(SEQIDNO:4)、Wetzelp3GP2(SEQIDNO:5)、Wetzelp3GP3(SEQIDNO:6)、Wetzelp3GP4(SEQIDNO:7)、Wetzelp3GP5(SEQIDNO:8)、Wetzelp3M(SEQIDNO:9)、Wetzelp3N(SEQIDNO:10)、Wetzelp41ORF1a(SEQIDNO:11)、Wetzelp41ORF1b(SEQIDNO:12)、Wetzelp41GP2(SEQIDNO:13)、Wetzelp41GP3(SEQIDNO:14)、Wetzelp41GP4(SEQIDNO:7-与p3GP4序列相同)、Wetzelp41GP5(SEQIDNO:15)、Wetzelp3M(SEQIDNO:9-与p3M序列相同)及Wetzelp3N(SEQIDNO:10-与p3N序列相同)之核酸序列至少95％、90％、85％或甚至80％同源和/或相同之核酸序列，或其对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具免疫反应性或免疫原性之片段。与以上序列互补之核酸序列系本发明之另一方面。
此外，如本文所用之本发明之多肽包括但不限于包含以下之多肽：
i)包含SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15之氨基酸序列之多肽；
ii)与i)之多肽至少95％同源和/或相同之多肽；
iii)i)和/或ii)之多肽之片段；
iv)i)或ii)之多肽，或iii)之片段，其包含i)之多肽中任一者之氨基酸基序或免疫原性表位；
v)包含至少5个、优选8个、更优选10个、甚至更优选15个或15个以上在i)之序列中所包括之邻接氨基酸的iii)或iv)之片段；
vi)由包含SEQIDNO:1(预减毒Wetzel)或SEQIDNO:2(减毒Wetzel)之序列的多核苷酸编码之多肽；
vii)由与vi)之多核苷酸至少95％同源或相同之多核苷酸编码之多肽；或
viii)由包含至少15个、优选24个、更优选30个、甚至更优选45个或45个以上在SEQIDNO:1或SEQIDNO:2之序列中所包括之邻接核苷酸的多核苷酸编码之蛋白质片段。
包含至少一或多种如本文所定义之PRRSV多肽、杀死的或减毒病毒或基于DNA或RNA之疫苗(例如编码该等免疫原)的本发明之免疫原性组合物可另外包含生理学上可接受之媒介物，诸如医药学或兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。
本文所提供之任何PRRSV多肽或本文所提供之包含一或多种该等PRRSV多肽之任何免疫原性组合物均可用作药物，优选用作疫苗或免疫原性组合物，最优选用于预防或治疗个体抵抗PRRS感染。
本领域技术人员将了解本文所用之组合物可并有已知可注射之生理学上可接受之无菌溶液。为制备用于肠胃外注射或输注之即用型溶液，随时可用等张水溶液，例如盐水或血浆蛋白质溶液。另外，本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括兽医学上可接受之载剂、稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。
本发明之方法包括(但不限于)在个体体内引发针对PRRSV感染之免疫反应的方法，其包含向个体投予如本文所定义之包含一或多种PRRSV多肽之免疫原性组合物的步骤。优选引发针对PRRSV之一种以上血清型或病毒株之免疫反应。本发明之组合物可用于治疗或者预防PRRSV感染。该免疫反应优选减小与一或多种PRRSV血清型感染相关或由其引起之一或多种临床征象的发生率或严重性。
在本文中，适合之个体及需要投予本发明组合物之个体包括需要预防或治疗与病毒、微生物、寄生虫、原虫、细菌或真菌相关之感染、疾病或病况之动物。藉由使用本发明之组合物或方法刺激免疫反应之动物包括家畜(诸如猪、牛、家禽(例如，鸡、鸭、鹅或火鸡)、山羊及绵羊)及家养动物(诸如小鼠、兔、狗、猫及马)。优选的动物包括猪。
本发明亦提供一种减小与PRRSV感染相关或由其引起之一或多种临床征象之发生率或严重性的方法，其包含投予包含如本文所提供之一或多种PRRSV肽且优选包含载剂分子的本发明之免疫原性组合物的步骤，以使得PRRSV感染之临床征象的发生率或严重性相对于未接受如本文所提供之免疫原性组合物的个体而言减小至少10％、优选至少20％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少70％、最优选至少100％。该等临床征象包括育种雌性生殖失败及生长期猪之呼吸道疾病。生殖失败与中后期流产、木乃伊胎与弱出生仔猪数量增加及健康出生仔猪较少相关。PRRSV之特征亦在于通常由显微镜可见之如同间质性肺炎之厌食、发热及呼吸道疾病。
根据另一方面，本发明亦系关于一种预防PRRSV感染之方法，其中该PRRSV感染可由血清型PRRSV或任何其它血清型之PRRSV引起，其包含投予如本文所提供之包含一或多种PRRSV肽的本发明之免疫原性组合物之步骤。
本发明亦提供一种制备本文所提供之任何免疫原性组合物之方法，所述方法包含将如本文所提供之一或多种PRRSV肽与载剂分子混合，优选使得一或多种PRRSV肽与载剂分子彼此共价偶联或结合。所述缀合物可为多价或单价的。多价组合物或疫苗包括多种PRRSV肽与载剂分子之免疫结合。在另一方面中，本发明提供一种产生一或多种PRRSSSV肽之方法，所述方法包含以编码如本文所提供之任何PRRSV肽之核酸分子转化宿主细胞，优选为原核细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)。或者，宿主细胞可为真核细胞，诸如动物细胞、原生生物细胞、植物细胞或真菌细胞。真核细胞优选为哺乳动物细胞(诸如CHO、BHK或COS)或真菌细胞(诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))或昆虫细胞(诸如Sf9)。
本发明之另一方面提供一种产生一或多种PRRSV肽之方法，所述PRRSV肽诱发针对至少一种血清型之PRRSV且更优选两种或两种以上血清型之PRRSV的免疫反应。此方法包含培养编码且表达本文所揭示之一或多种PRRSV肽之经转化的表达载体。该等表达的蛋白质由表达生物体保留或经分泌至培养基中。在足以产生能够诱发对PRRSV之免疫反应之PRRSV肽的条件下进行表达。
本发明之又一方面系包含基于DNA和/或RNA之疫苗的组合物及制造与投予该等疫苗之方法，包括编码赋予免疫性之多肽(免疫原性多肽)之核酸(或多核苷酸)或其中该核酸本身系免疫原。制造及使用该等基于DNA和/或RNA之疫苗的方法在本领域中系熟知的。
制造本发明组合物之方法可另外包含将一或多种PRRSV抗原与载剂分子之缀合物与生理学上可接受之媒介物(诸如医药学或兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合)混合。本领域技术人员将意识到媒介物、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人喜好及动物种类来决定。
在另一方面中，本发明提供一种诊断个体之PRRSV感染的方法。所述方法包含提供一或多种PRRSV肽；使该一或多种PRRSV肽与由个体获得之样本接触；且若在样本中检测到能够结合该一或多种PRRSV肽之抗体，则确定该个体患有PRRSV感染。
在另一方面，本发明提供一种确定个体先前已暴露于PRRSV感染且能够对PRRSV表现免疫反应之方法。所述方法包含提供一或多种PRRSV肽；使该一或多种PRRSV肽与由个体获得之样本接触；且若在样本中检测到能够结合该一或多种PRRSV肽之抗体，则确定该个体患有PRRSV感染。
本发明亦提供试剂盒，其包含含有一或多种PRRSV肽优选与载剂分子一起之免疫原性组合物；一用于封装免疫原性组合物之容器；一组印刷版说明书；及一能够将免疫原性组合物投予动物之施配器(dispenser)。该一或多种PRRSV肽与载剂分子视情况可以缀合物或单独化合物之形式封装。当单独供应时，亦供应一种使一或多种PRRSV肽与载剂分子缀合之构件以及适当之印刷版说明书。
本发明亦提供用于对动物接种疫苗之试剂盒，其包含一组印刷版说明书；能够将本文所提供之包含一或多种PRRSV肽之免疫原性组合物投予动物之施配器；且其中至少一种PRRSV肽使动物有效免疫以抵抗至少一种与PRRSV感染相关之疾病。该一或多种PRRSV肽优选选自本文提供的那些。本发明之试剂盒可另外包含兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。
本发明试剂盒中之施配器能够以液滴形式施配其内容物；且免疫原性组合物包含试剂盒中所包括之如本文所提供之PRRSV肽，其在经鼻内、经口、皮内或肌肉内投予至动物时能够减小至少一种PRRSV感染临床征象之严重性。与未经治疗之感染动物相比，临床征象之严重性优选减小至少10％、优选至少20％、甚至更优选至少30％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少70％、最优选至少100％。
亦揭示治疗或预防由PRRSV引起之感染之方法。该方法包含向个体投予有效量之本发明之免疫原性组合物，其中该治疗或预防系选自减轻PRRSV感染征象、减小PRRSV感染临床征象之严重性或发生率、减小个体因PRRSV感染之死亡率及其组合。
本发明之组合物另外包含兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。该等组合物可用作疫苗且包含减毒疫苗、灭活疫苗或其组合。该等疫苗引发针对至少一种与PRRSV相关之疾病的保护性免疫反应。
本领域技术人员将了解，本文中所用之组合物可并有已知可注射之生理学上可接受之无菌溶液。为制备用于肠胃外注射或输注之即用型溶液，随时可用等张水溶液，例如盐水或血浆蛋白质溶液。另外，本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括医药学或兽医学上可接受之载剂、稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。
本发明之方法亦可包含将本发明之组合物与兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合混合。本领域技术人员将意识到媒介物、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人喜好及动物种类来决定。
本发明亦提供一种减小动物体内之PRRSV感染严重性的方法，其包含向动物投予包含来自选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14及SEQIDNO:15之非毒性、杀死的或减毒免疫有效抗原(包括其片段)和/或其组合的病毒培养物之分离物的组合物。
亦揭示治疗或预防由PRRSV引起之感染之方法。该方法包含向动物投予有效量之本发明之免疫原性组合物，其中该治疗或预防选自减轻PRRSV感染征象、减小PRRSV感染临床征象之严重性或发生率、减小动物因PRRSV感染之死亡率及其组合。
优选投药途径包括鼻内、经口、皮内及肌肉内。优选在饮用水中投药，最优选以单次给药。本领域技术人员将意识到，本发明之组合物亦可以一或两次或两次以上给药以及藉由其它投药途径来投予。举例而言，该等其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、叶内、髓内、肺内或***内。视治疗之所需持续时间及有效性而定，可一次性或分若干次，亦间歇性地，例如在每日之基础上历时若干天、数周或数月且以不同剂量来投予本发明之组合物。
本发明亦提供用于对动物接种疫苗之试剂盒，其包含一组印刷版说明书；能够将疫苗投予动物之施配器；及至少一种来自PRRSV或使动物有效免疫以抵抗至少一种与PRRSV相关之疾病之免疫组合物的病毒培养物的分离株。本发明之试剂盒可另外包含兽医学上可接受之载剂、佐剂或其组合。
本发明试剂盒中之施配器能够以液滴形式施配其内容物；且试剂盒中所包括之分离株在经鼻内、经口、皮内或肌肉内投予至动物时能够减小至少一种PRRSV感染临床征象之严重性。在某些试剂盒中，分离株亦能够减小至少一种PRRSV感染临床征象之严重性。与未经治疗之感染动物相比，临床征象之严重性优选减小至少10％。
本发明之其它目标、特征及优势将自以下详细说明变得显而易见。然而应了解详细说明及具体实施例尽管指示本发明之优选实施方案，但系仅以说明方式来给出，因为本领域技术人员根据此实施方式将清楚了解本发明之主旨及范畴内之各种改变及修改。
附图简述
以下图式形成本说明书之部分且包括该等图式以进一步说明本发明之某些方面。可藉由参考该等图式中之一或多者，结合本文提供之特定实施方案之详细描述来更好地理解本发明。
图1系来自实例1之呼吸道试验之肺病理图表。在第14天收集猪安全研究平均肺计分值。字母“a”指示平均肺计分值高于阴性对照组，而字母“b”指示计分值低于IsolateX野生型组。
图2系来自实例1之呼吸道试验之IDEXXELISA曲线图。若(S/P)比率至少为0.4，则认为样本对于PRRSV特异性抗体而言系阳性的。
图3系如经由AgPath-IDTMNA与EUPRRSVMultiplex试剂盒，由RT-PCR所测定之生殖试验之小母猪病毒血症的曲线图，具有实例1所检测之相对短期病毒血症。
图4系如经由AgPath-IDTMNA与EUPRRSVMultiplex试剂盒，由RT-PCR所测定之仔猪病毒血症的曲线图。在出生时不定程度之仔猪病毒血症，继而在来自实例1之生殖试验之幼崽内部水平传播。
图5系SEQIDNO:1(预减毒Wetzelp3)与SEQIDNO:2(减毒Wetzelp41)之核苷酸序列(RNA病毒序列之DNA等同物)对比。
图6系来自实例3之平均PRRSVELISAS/P的曲线图。
图7系由PCR展示对于实例3之PPRSV之阳性百分比的曲线图。
图8展示来自实例3之以受影响百分比表示之(A)呼吸道计分值(受影响％)、(B)行为计分值(％异常)及(C)咳嗽计分值(受影响％)的曲线图。
图9展示来自实例3之平均直肠温度。
图10展示来自实例3之平均重量增加(以磅计)。
发明详述
本发明提供具有增强稳定性之减毒PRRSV病毒株。具体揭示SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15之多肽及其片段(包括但不限于上述序列中所包括之至少5个、优选8个、更优选10个、甚至更优选15个邻接氨基酸)。另外，与上述多肽至少95％同源和/或相同的多肽。此外，亦揭示上述多肽之相关多核苷酸。
除非另外指示，否则本发明之实践将采用本领域中之分子生物学、微生物学、重组DNA技术、蛋白质化学及免疫学之习知技术。该等技术在文献中完整解释。例如参见Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第I、II及III卷，第2版(1989)；DNACloning,第I及II卷(D.N.Glover编，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编，1984)；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编，1984)；AnimalCellCulture(R.K.Freshney编，1986)；ImmobilizedCellsandEnzymes(IRL出版社，1986)；Perbal,B.,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)；theseries,MethodsInEnzymology(S.Colowick及N.Kaplan编，AcademicPress,Inc.)；Proteinpurificationmethods-apracticalapproach(E.L.V.Harris及S.Angal编，IRLPress，OxfordUniversityPress)；及HandbookofExperimentalImmunology,第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell编，1986,BlackwellScientificPublications)。
在详细描述本发明之前，应了解本发明不限于特定DNA、多肽序列或方法参数，当然同样可变化。亦应了解，本文所用之术语仅用于描述本发明之特定实施方案之目的，且不欲限制。必须注意，如本说明书及随附申请专利范围中所用，除非内容中另外明确指示，否则单数形式“一”及“该”包括复数提及物。因此，例如提及“抗原”包括两种或两种以上抗原之混合物；提及“赋形剂”包括两种或两种以上赋形剂之混合物及其类似物。
A.定义
除非另外定义，否则本文所用之所有技术及科技术语具有与熟习本发明在申请时所属之技术者通常所理解之相同含义。术语之含义及范畴应明确；然而，在存在任何隐含歧义之情况下，本文中所提供之定义优先于任何词典或非固有定义。另外，除非上下文另有需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。本文中，除非另外说明，否则使用“或”意谓“和/或”。此外，使用术语“包括”不具有限制性。本文提及之所有专利及公开案均以引用方式并入本文中。
“针对疾病的保护”、“保护性免疫”、“功能性免疫”及类似短语意谓由投予一或多种本发明之治疗性组合物或其组合产生之针对疾病或病况之反应，其导致比在暴露于疾病或感染之未经免疫个体中所预期较少之有害效应。即，在经接种疫苗之个体中，感染之有害效应的严重性降低。在经接种疫苗之个体中，可减少、减缓或可能完全预防感染。本文中，若欲完全预防感染，则特定陈述。若未陈述完全预防，则该术语包括部分预防。
本文中，“减小临床征象的发生率和/或严重性”或“减少临床症状”意谓(但不限于)与野生型感染相比减少群组中受感染个体之数目、减少或消除展现感染临床征象之个体的数目或减小在一或多个个体中存在之任何临床征象的严重性。举例而言，其应系指任何病原体负载减少、病原体脱落、病原体传播减少或疟疾之任何临床征象症状减少。与未接受组合物且受感染之个体相比，该等临床征象在接受本发明之治疗性组合物的一或多个个体中优选减少至少10％。临床征象在接受本发明组合物之个体中更优选减少至少20％、优选至少30％、更优选至少40％且甚至更优选至少50％。
术语“保护增加”在本文中意谓(但不限于)分别在接种疫苗群组之个体相对于未经接种疫苗对照组之个体中，与由感染原(优选为PRRSV)引起之感染相关之一或多种临床症状在统计学上显著减少。术语“临床症状在统计学上显著减少”意谓(但不限于)至少一种临床症状在接种疫苗群组之个体中的发生频率在攻毒感染原之后比在未经接种疫苗之对照组中低至少10％、优选至少20％、更优选至少30％、甚至更优选至少50％且甚至更优选至少70％。
“持久保护”应系指“改良之功效”持续至少3周、但更优选至少3个月、又更优选至少6个月。在家畜之情形下，持久保护最优选应持续直至动物作为食用肉出售之平均年龄。
“免疫原性或免疫组合物”或“疫苗”系指包含至少一种PRRSV或其免疫原性部分之物质组合物，其在对组合物具有细胞或抗体介导之免疫反应之宿主体内引发免疫反应。在本发明之一优选实施方案中，免疫原性组合物诱发免疫反应，且更优选赋予针对PRRSV感染之一或多种临床征象的保护性免疫。因此，该术语涵盖如下文所述之亚单位免疫原性组合物以及含有全杀死的或减毒和/或灭活PRRSV之组合物。
如本文所用之术语“亚单位免疫原性组合物”或“亚单位疫苗”系指含有至少一种免疫原性多肽或抗原之组合物，但并非所有抗原均源自来自PRRSV之抗原或与来自PRRSV之抗原同源。该组合物大体上不含完整之PRRSV。因此，“亚单位免疫原性组合物”或“亚单位疫苗”系由来自PRRSV之至少部分纯化或分馏(优选大体上纯化)免疫原性多肽或其重组类似物来制备。亚单位免疫原性组合物可包含大体上不含来自PRRSV之其它抗原或多肽或以分馏形式之所关注亚单位抗原。优选之免疫原性亚单位组合物包含PRRSV蛋白质或其片段，例如并入病毒外膜包膜中之彼等蛋白质，例如gp2、gp4、gp5和/或基质(“M”)蛋白质。亦包括作为PRRSV病毒之修饰类似物的亚单位免疫原性组合物，其中抗原之氨基酸序列经修饰以增强稳定性或免疫原性。
如本文所用之“免疫原性”PRRSV多肽或“抗原”系指如本文所述引发免疫反应之多肽或蛋白质。“免疫原性”PRRSV蛋白质或多肽包括本文识别之任何PPRSV之全长序列或其类似物或免疫原性片段。术语“免疫原性片段”或“免疫原性部分”系指包括一或多个表位且因此引发本文所述之免疫反应的PRRSV之片段或截断和/或取代形式。一般而言，该等截断和/或取代形式或片段将包含至少六个来自全长PRRSV蛋白质之邻接氨基酸。截断或取代形式或片段更优选将具有至少10个、更优选至少15个且又更优选至少19个或19个以上来自全长PRRSV蛋白质之邻接氨基酸。类似物包括对分子赋予诸如稳定性或免疫原性之增强特性的抗原修饰。
术语“表位”意谓由免疫***，特定而言由抗体、B细胞或T细胞识别之物质组合物(例如，蛋白质或多肽)的区段或片段。在本发明中，表位一般系病毒蛋白质之多肽序列的片段。
该等片段可使用本领域中熟知之任意种表位定位技术来识别。例如参见，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66卷(GlennE.Morris编，1996)HumanaPress,Totowa,NewJersey。举例而言，线性表位可由在固体支持物上同时合成大量肽(该等肽对应于蛋白质分子之部分)且使该等肽与抗体反应同时使该等肽仍与支持物连接来确定。该等技术在本领域中已知且有所描述，例如参见美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002；及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715。类似地，构形表位易于例如藉由x-射线结晶及二维核磁共振测定氨基酸之空间构形来识别。参见上文之EpitopeMappingProtocols。合成抗原亦包括在此定义中，例如多表位、侧接表位及其它重组或合成衍生之抗原。例如参见Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23:2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157:3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.andCellBiol.75:402-408；及Gardner等人,(1998)第12次世界艾滋病大会(12thWorldAIDSConference)，Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日。(其教示及内容均以引用方式并入本文中。)
“免疫反应(immuneresponse)”或“免疫学反应(immunologicalreponse)”意谓(但不限于)对所关注之组合物或疫苗产生由细胞和/或抗体介导之免疫反应。免疫或免疫学反应通常包括(但不限于)一或多种以下效应：产生或活化抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞，特定而言针对所关注之组合物或疫苗中所包括之抗原。宿主优选将展示治疗性或保护性免疫(记忆)反应，以使得可增强对新感染之抗性和/或减小疾病之临床严重性。该保护作用将由症状数目减少、症状严重性减小或缺少一或多种与病原体感染相关之症状、病毒血症发作延迟、病毒持久性减小、总体病毒负载减少和/或病毒排出减少得以证实。
本文中，“特异性免疫反应性”系指识别PRRSV感染之特征抗原，但不与严格攻毒对照物之特征抗原反应之免疫反应性蛋白质或多肽。为确定潜在PRRSV免疫反应性蛋白质或其它多肽之特异性，将使用各种免疫分析(ELISA、IFA、西方墨点法(WesternBlot))来测试针对含有遗传类似病毒之动物血清的蛋白质。亦由与表述方法相关之针对含有蛋白质之物质(杆状病毒(Baculovirus)、Sf9细胞等)的各种免疫分析来测试蛋白质。
如本文所用，“医药学或兽医学上可接受之载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂布剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂、吸附延迟剂及其类似物。在一些优选实施方案中，且尤其为包括冻干免疫原性组合物之彼等实施方案，本发明中所用之稳定剂包括用于冻干或冷冻干燥之稳定剂。
在一些实施方案中，本发明之免疫原性组合物含有佐剂。如本文所用之“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂素类，例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液特定而言可基于轻质液体石蜡油(欧洲药典(EuropeanPharmacopea)类型)；类异戊二烯油，诸如角鲨烷或角鲨烯；由烯烃(特定而言为异丁烯或癸烯)寡聚作用产生之油；含有直链烷基之酸或醇之酯，更尤其为植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支链脂肪酸或醇之酯，特定而言为异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子性界面活性剂，特定而言为脱水山梨糖醇之酯、二缩甘露醇之酯(例如，无水甘露醇油酸酯)、二醇之酯、聚甘油之酯、丙二醇之酯及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸之酯(其视情况经乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言为Pluronic产品，尤其为L121。参见Hunter等人,TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(编者Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley及Sons,NY,第51-94页(1995)及Todd等人,Vaccine15:564-570(1997)。例示性佐剂为在由M.Powell及M.Newman编辑之“VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach”,PlenumPress,1995中第147页所述之SPT乳液及在此本书第183页所述之乳液MF59。
佐剂之另一实例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及顺丁烯二酸酐与烯基衍生物之共聚物的化合物。有利之佐剂化合物系尤其与糖或多元醇之聚烯基醚交联之丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。该等化合物由术语卡波姆(carbomer)已知(Pharmeuropa第8卷,第2期,1996年6月)。本领域技术人员亦可参考美国专利第2,909,462号，其描述与具有至少3个羟基(优选不大于8个)之多羟基化化合物交联之该等丙烯酸系聚合物，至少三个羟基之氢原子系经具有至少2个碳原子之不饱和脂族基团置换。优选基团系含有2至4个碳原子之彼等基团，例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不饱和基团。不饱和基团本身可含有其它取代基，诸如甲基。以名称(BFGoodrich,Ohio,USA)出售之产品尤其适合。其与烯丙基蔗糖或烯丙基异戊四醇交联。其中可提及974P、934P及971P。最优选使用971P。顺丁烯二酸酐与烯基衍生物之共聚物尤其系共聚物EMA(Monsanto)，其系顺丁烯二酸酐与乙烯之共聚物。该等聚合物溶解于水中产生酸溶液，其优选经中和至生理学pH以产生将合并免疫原性、免疫性或疫苗组合物本身之佐剂溶液。
其它适合之佐剂尤其包括(但不限于)RIBI佐剂***(RibiInc.)、Block共聚物(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、单磷酰基脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌之热不稳定肠毒素(重组或以其它方式)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽、或天然产生或重组之细胞激素或其类似物或内源细胞激素释放之刺激剂。
预期可以每剂量约100μg至约10mg之量、优选以每剂量约100μg至约10mg之量、更优选以每剂量约500μg至约5mg之量、甚至更优选以每剂量约750μg至约2.5mg之量且最优选以每剂量约1mg之量添加佐剂。或者，以最终产物之体积计，佐剂可为约0.01至50％之浓度、优选为约2％至30％之浓度、更优选为约5％至25％之浓度、又更优选为约7％至22％之浓度且最优选为10％至20％之浓度。
“稀释剂”可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油及其类似物。等张剂尤其可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之碱金属盐。
“分离的”意谓“藉由人工”自其天然状态改变，亦即若天然存在，则由其初始环境改变或移除，或两者兼有。举例而言，如此术语在本文中所用，在活生物体中天然存在之多核苷酸或多肽不是“分离的”，但自其天然状态共存之物质分离之相同多核苷酸或多肽系经“分离的”。
“安全”系指经接种疫苗之动物在接种疫苗之后不存在不利结果，包括(但不限于)：可能恢复以细菌为基础之疫苗的毒性、临床上显著之副作用，诸如持久之全身性疾病或在疫苗投予位点处不可接受之发炎。
如本文所用之术语“接种疫苗(vaccination)”或“接种疫苗(vaccinating)”或其变化形式意谓包括投予本发明之免疫原性组合物之过程，本发明之免疫原性组合物在投予至动物时引发或能够引发(直接或间接)动物针对PRRSV之免疫反应。
在本发明之情形下，“死亡率”系指由PRRSV感染引起之死亡，且包括感染严重致使对动物施以安乐死以防受苦且为其提供人为结束生命的情形。
“减毒”意谓减小病原体之毒性。在本发明中，“减毒”与“无毒性”同义。在本发明中，减毒病毒系毒性经减少以使其不引起PRRSV感染之临床征象、但能够在标靶哺乳动物体内诱发免疫反应之病毒，但亦可意谓与感染未减毒PRRSV但未接受减毒细菌之“对照组”动物相比，动物受减毒PRRSV感染之临床征象发生率或严重性减小。在此情形下，术语“减小(reduce/reduced)”意谓与如上文定义之对照组相比，减小至少10％、优选25％、甚至更优选50％、又更优选60％、甚至更优选70％、又更优选80％、甚至更优选90％且最优选100％。因此，减毒、无毒性之PRRSV病毒株系适合并入包含经修饰活PRRSV病毒之免疫原性组合物中的病毒株。
“杀死的(killed)”或“灭活(inactivated)”意谓经致使PRRSV病毒死亡和/或以其它方式无法生殖之物理剂或化学剂处理。PRRSV可藉由常规方式杀死，诸如加热、辐射或在紫外线存在下之补骨脂素。PRRSV可藉由常规方式灭活，诸如经由使用一或多种化学灭活剂进行化学灭活，该等化学灭活剂包括(但不限于)二元伸乙基亚胺(BEI)、β-丙内酯、***、戊二醛和/或十二烷基硫酸钠中之一或多者。使该等病毒之毒性病毒株减毒之方法及制造灭活病毒制剂之方法在本领域中已知且例如描述于U.S.4,567,042及4,567,043中。来自本发明之疫苗组合物中所用之PRRSV的抗原因此可为全病毒之形式，其尤其系经修饰和/或减毒活病毒制剂或杀死的或灭活病毒制剂。
如本文所用之“抗体”包括抗-PRRSV抗体，例如单株及多株抗体、单链抗体、嵌合抗体、人类化、人类、猪及CDR-接枝抗体，包括包含特异性识别本发明之PRRSV多肽之CDR序列的化合物。术语“对……具特异性”指示本发明抗体之可变区专门识别且结合PRRSV多肽(亦即，能够区分单一PRRSV多肽与相关多肽，而与在多肽家族中发现之序列相同性、同源性或类似性无关)，且(视情况)允许其经由与抗体可变区以外且特定而言为抗体分子恒定区中之序列相互作用而与其它蛋白质(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白质或ELISA技术中之其它抗体)相互作用。本领域中熟知且常规进行筛选分析来测定本发明抗体之结合特异性。关于该等分析之广泛论述，参见Harlow等人(编),AntibodiesALaboratoryManual:ColdSpringHarborLaboratory；ColdSpringHarbor,NY(1988),第6章。亦涵盖识别且结合本发明之PRRSV多肽之片段的抗体，只要该等抗体如上文所定义首先且最先对片段所衍生之本发明之PPRSV多肽具特异性即可。为明确之目的，“抗体”系指由于对特异性抗原之免疫反应而可结合彼抗原之免疫球蛋白分子。免疫球蛋白系由具有“恒定”区与“可变”区之“轻”及“重”多肽链组成且基于恒定区之组成分类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)之血清蛋白质。抗体可以多种形式存在，例如以功能活性片段(诸如Fv、Fab'、F(ab')2)以及单链形式，且包括含有一或多个抗体单链多肽序列中之全部或部分的合成多肽。本领域中熟知用于制造本发明抗体之遗传构建体及方法，包括克隆载体、经克隆载体转化之宿主细胞及杂交瘤。
本文中，“有效剂量”意谓(但不限于)在投予抗原之动物体内引发或能够引发致使临床症状减少之免疫反应的抗原量。
如本文所用，在组合物之情形下，术语“有效量”意谓能够在动物体内诱发使感染发生率减小或减轻感染严重性或疾病事件之免疫反应的免疫原性组合物之量。有效量尤其系指每剂量之群落形成单位(CFU)。或者，在治疗之情形下，术语“有效量”系指足以减小或缓解疾病或病症或其一或多种症状之严重性或持续时间、预防疾病或病症前进、导致疾病或病症衰退、预防与疾病或病症相关之一或多种症状复发、发展、发作或进展，或增强或改良另一种治疗或治疗剂之预防或治疗的治疗量。
如本文所用之术语“对PRRSV具免疫反应性”意谓肽或片段引发针对PRRSV之免疫反应。
如本文所用，“互补”意谓核酸分子具有与参考模板序列互补之序列，其中两种序列可特异性杂交。该术语优选系指精确互补，例如在天然产生之DNA编码基因之两股核苷酸序列中所发现。
“序列相同性”如在本领域中已知系指两个或两个以上多肽序列或两个或两个以上多核苷酸序列之间之关系，即参考序列及欲与参考序列比较之指定序列。序列相同性系藉由在将指定序列与参考序列最优选对准以产生最高程度之序列类似性之后对该等序列进行比较来测定，如由该等序列串之间的匹配所测定，若必要引入间隙。经此对准后，基于位置来确定序列相同性，例如若特定位置之核苷酸或氨基酸残基相同，则彼位置处之序列系“相同的”。该等位置相同性之总数随后除以参考序列中之核苷酸或残基总数，得到序列相同性％。序列相同性可易于由已知方法来计算，包括(但不限于)ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.N.编,OxfordUniversityPress,NewYork(1988),Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.编,AcademicPress,NewYork(1993)；ComputerAnalysisofSequenceData,第I部分,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.编,HumanaPress,NewJersey(1994)；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinge,G.,AcademicPress(1987)；SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.及Devereux,J.编,M.StocktonPress,NewYork(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988)中所述之彼等方法；其教示以引用的方式并入本文中。用以测定序列相同性之优选方法系经设计以使所测试之序列之间产生最大匹配。用以测定序列相同性之方法可经编纂成用以测定指定序列之间之序列相同性的公开可用计算机程序。该等程序之实例包括(但不限于)GCG程序封装(Devereux,J.等人,NucleicAcidsResearch,12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN及BLASTX(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990))。BLASTX程序由NCBI及其它来源公开可用(BLASTManual,Altschul,S.等人,NCVINLMNIHBethesda,MD20894,Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215:403-410(1990),其教示以引用的方式并入本文中)。该等程序使用预设间隙权数最优选对准序列以在指定与参考序列之间产生最高程度之序列相同性。作为说明，具有与参考核苷酸序列具有例如至少85％、优选90％、甚至更优选95％“序列相同性”之核苷酸序列的多核苷酸意指除了指定多核苷酸序列在参考核苷酸序列之每100个核苷酸中可包括至多15个、优选至多10个、甚至更优选至多5个点突变以外，指定多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％相同性之核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列之至多15％、优选10％、甚至更优选5％之核苷酸可缺失或经另一核苷酸取代，或占参考序列中总核苷酸之至多15％、优选10％、甚至更优选5％之多个核苷酸可***参考序列中。参考序列之该等突变可发生在参考核苷酸序列之5'或3'末端位置或彼等末端位置之间之任意处，个别地散置于参考序列中或参考序列内之一或多个邻接群组中的核苷酸之间。类似地，具有与参考氨基酸序列具有例如至少85％、优选至少90％、甚至更优选至少95％序列相同性之指定氨基酸序列的多肽意指除了指定多肽序列在参考氨基酸序列之每100个氨基酸中可包括至多15个、优选至多10个、甚至更优选至多5个氨基酸变化以外，多肽之指定氨基酸序列与参考序列相同。换言之，为获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选至少95％之序列相同性的指定多肽序列，参考序列中至多15％、优选至多10％、甚至更优选至多5％之氨基酸残基可缺失或经另一氨基酸取代，或占参考序列中氨基酸残基总数至多15％、优选至多10％、甚至更优选至多5％之多个氨基酸可***参考序列中。参考序列之该等改变可发生在参考氨基酸序列之氨基或羧基末端位置或彼等末端位置之间之任意处，个别地散置于参考序列中或参考序列内之一或多个邻接群组中的残基之间。不同之残基位置优选由保守性氨基酸取代来区分。然而，在测定序列相同性时，保守性取代不作为匹配包括在内。
如本文所用之“序列同源性”系指一种测定两种序列之相关性的方法。为测定序列同源性，使两个或两个以上序列最优选对准且若必要引入间隙。然而，与“序列相同性”相反，在测定序列同源性时，保守性氨基酸取代亦作为匹配计算在内。换言之，未获得与参考序列具有95％序列同源性之多肽，参考序列中85％、优选90％、甚至更优选95％之氨基酸残基必须匹配或包含经另一氨基酸保守性取代，或占参考序列中总氨基酸残基(不包括保守性取代)至多15％、优选至多10％、甚至更优选至多5％之多个氨基酸可***参考序列中。同源序列优选包含延伸至少50个、甚至更优选100个、甚至更优选250个、甚至更优选500个编码同源氨基酸之核苷酸。
“保守性取代”系指以具有类似特征或特性(包括大小、疏水性等)之另一氨基酸残基取代氨基酸残基以使得总体功能不显著改变。其亦可意谓导致保守性氨基酸取代之核苷酸取代。
B.载剂分子
本发明之PRRSV肽可与之结合或共价连接之载剂分子优选为上文所述那些。供动物使用之优选载剂为牛血清白蛋白及钥孔血蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin)。适合人类使用(但亦可用于动物)之蛋白质载剂包括破伤风类毒素、白喉类毒素、非细胞百日咳疫苗(LPF类毒素)、与细菌毒素在抗原上类似但藉由突变而非毒性之交叉反应性物质(CRM)。举例而言，可使用根据Pappenheimer等人,Immunochemistry,9,891-906(1972)获得之CRM197及其它细菌蛋白质载剂，例如脑膜炎球菌外膜蛋白质。载剂蛋白质本身优选为免疫原。
本发明之PRRSV肽可藉由本领域中已知之任何便利方法与载剂共价偶联。尽管使用如Schneerson等人,J.ExperimentalMedicine,152,361-376(1980)所述之对称接头(诸如己二酸二酰肼)或如Fattom等人,InfectionandImmunity,56,2292-2298(1988)所述之杂双官能接头(诸如N-丁二酰亚氨基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯)(均以引用方式并入)在本发明之范畴内，但优选避免使用任何接头，而相反使本发明之猪链球菌(S.suis)肽直接与载剂分子偶联。该偶联可藉由如以引用方式明确并入本文之Landi等人J.Immunology,127,1011-1019(1981)所述之还原胺化来达成。
如由平均分子量定义之免疫原性组合物之大小系可变的且取决于所选之PRRSV肽及PRRSV肽与载剂之偶联方法。因此，其可小至1,000道尔顿(dalton，103)或大于106道尔顿。经由还原胺化偶联方法，PRRSV肽之分子量通常在5,000至500,000、例如300,000至500,000或例如5,000至50,000道尔顿之范围内。
载剂分子(亦即，肽、其衍生物及类似物)及特异性结合本发明之PRRSV肽之肽模拟物可由本领域中已知之各种方法来产生，包括(但不限于)固相合成或藉由溶解(Nakanishi等人,1993,Gene137:51-56；Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.15:2149-2154；Neurath,H.等人编,TheProteins,第II卷,第3版,第105-237页,AcademicPress,NewYork,N.Y.(1976)，其所有均以全文引用的方式并入本文中)。
本发明之PRRSV肽或本发明之抗体或其结合部分可藉由与医药学或兽医学载剂在稀释剂中之溶液或悬浮液以可注射剂型来投予。
该等分子之安全性及功效系如兽医生物制品中心(CVB)所述及调节在细胞培养物或实验动物中由标准程序来测定。该等分子之毒性及治疗功效可在细胞培养物或实验动物中藉由例如用于测定LD50(使群体之50％致死之剂量)之标准医药学程序来测定。
本发明之疫苗可为多价或单价。多价疫苗系由多个PRRSV肽与载剂分子之免疫结合而制得。
在一方面中，PRRSV肽组合物包含有效免疫量之免疫原性缀合物，优选与免疫刺激剂及生理学上可接受之媒介物组合。如本发明中所用，“免疫刺激剂”欲涵盖能够增强免疫***活性之任何化合物或组合物，而无论其与特异性抗原组合是否具有特异性增强效应或对免疫反应之一或多种要素之活性仅具有独立效应。免疫刺激剂化合物包括(但不限于)矿物质凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，诸如溶血卵磷脂、普洛尼克多元醇(pluronicpolyol)；聚阴离子；肽；油乳液；明矾及MDP。本领域中已知使用该等物质之方法且本领域技术人员即有能力测定针对指定疫苗之刺激剂的最佳量。在指定调配物中可使用一种以上免疫刺激剂。亦可将免疫原并入脂质体中，或与用于疫苗调配物中之多醣和/或其它聚合物结合。
如需要，组合物可呈现于封装或施配器装置中，其中可含有一或多个含有活性成分之单位剂型。该封装可例如：包含金属或塑料箔，例如发泡封装。封装或施配器装置可附有较适于向哺乳动物(尤其为猪)投药之投药说明书。与该(等)容器相关者系由管理医药品或生物制品之制造、使用或销售之政府机构所规定形式之说明书，该说明书说明该机构已核准其制造、使用或销售，以供投药。
C.佐剂
为进一步增加本文所提供免疫原性组合物之免疫原性，含有一或多种PRRSV肽者亦可包含一或多种佐剂。
佐剂可由先前所述或本领域中已知之任何技术来纯化。优选纯化技术系硅胶层析，特定而言为如W.ClarkStill等人,J.OrganicChemistry,43,2923-2925(1978)所述之“急骤”(快速)层析技术。然而，可使用其它层析方法(包括HPLC)来纯化佐剂。亦可使用结晶来纯化佐剂。在某些情形下，当直接由合成获得具有分析纯度之产物时，无需纯化。
本发明之疫苗组合物系藉由根据用于产生佐剂组合物之已知技术，将佐剂与PRRSV肽在适当无菌条件下进行物理混合来制备。藉由在缀合物上存在对长链烷基化合物佐剂上存在之正电荷具有静电引力之净负电荷来促进PRSV肽与佐剂之复合。
预期可以每剂量约100μg至约10mg之量、优选以每剂量约100μg至约10mg之量、更优选以每剂量约500μg至约5mg之量、甚至更优选以每剂量约750μg至约2.5mg之量且最优选以每剂量约1mg之量添加佐剂。或者，以最终产物之体积计，佐剂可为约0.01％至75％之浓度、优选为约2％至30％之浓度、更优选为约5％至25％之浓度、又更优选为约7％至22％之浓度且最优选为10％至20％之浓度。
D.生理学上可接受之媒介物
本发明之疫苗组合物可使用与用于其它医药学多肽组合物之彼等技术类似之技术来调配。因此，佐剂及RRSV肽(优选与载剂分子结合和/或与佐剂混合)可以冻干形式储存且在投药之前于生理学上可接受之媒介物中复原以形成悬浮液。或者，佐剂及缀合物可储存于媒介物中。优选媒介物为无菌溶液，特定而言为无菌缓冲溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水。将佐剂与缀合物在媒介物中合并以使得免疫原性组合物之免疫有效性改良的任何方法均系适当的。
单剂量本发明疫苗之体积可变化，但一般在习知疫苗通常所采用之范围内。在上文所述缀合物与佐剂之浓度下，单剂量之体积优选在约0.1ml与约3ml之间、优选在约0.2ml与约1.5ml之间、更优选在约0.2ml与约0.5ml之间。
本发明之疫苗组合物可由任何便利方式来投予。
E.调配物
包含与载剂分子偶联之PRRSV肽之免疫原性缀合物可用作用于针对PRRSV之一或多种血清型免疫的疫苗。在生理学上可接受之媒介物中包含免疫原性缀合物之疫苗适用于使动物(优选为猪)免疫以治疗或预防PRRSV感染之方法。
藉由免疫原性缀合物之免疫作用而针对本发明之免疫原性缀合物所产生之抗体可用于被动免疫治疗中且产生用于治疗或预防PRRSV感染之抗个体基因型抗体。
组合物所投予之个体优选为动物，包括(但不限于)奶牛、马、绵羊、猪、家禽(例如，鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠及大鼠；哺乳动物最优选为猪。
本发明之调配物包含有效免疫量之一或多种免疫原性组合物或其抗体及生理学上可接受之媒介物。疫苗包含有效免疫量之一或多种免疫原性组合物及生理学上可接受之媒介物。该调配物应适应投药模式。
若需要，免疫原性组合物亦可含有微量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。免疫原性组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、锭剂、药丸、胶囊、持续释放之调配物或散剂。口服调配物可包括标准载剂，诸如医药级别之甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
F.有效剂量
本文所述之化合物可以治疗PRRSV相关疾病之治疗有效剂量投予至个体。剂量将取决于接受疫苗之宿主以及诸如宿主大小、重量及年龄之因素。
调配物中欲采用之本发明之免疫原性缀合物或抗体之精确量将取决于投药途径及个体之性质(例如，种类、年龄、大小、疾病之阶段/程度)，且应根据医师之判断及每一个体之情形根据标准临床技术来决定。有效免疫量系足以治疗或预防个体之PRRSV感染疾病的量。有效剂量亦可由源自动物模型测试***之剂量-反应曲线来推算且可在0.001mg/kg至100mg/kg间变化。
化合物之毒性及治疗功效可在细胞培养物或实验动物中例如藉由测定LD50(使群体之50％致死之剂量)及ED50(对群体之50％治疗有效之剂量)之标准医药程序来测定。毒性与治疗效应之间的剂量比为治疗指数且其可表述为比率LD50/ED50。优选展现大治疗指数之化合物。尽管可使用展现毒性负作用之化合物，但应谨慎设计用于将该等化合物靶向受影响组织位点之递送***以使得对未受感染细胞之潜在损害最小化，且由此减少副作用。
由细胞培养物分析及动物研究获得之资料可用于调配用于动物(尤其为猪)之多种剂量。该等化合物之剂量优选在循环浓度之范围内，包括毒性极低或无毒性之ED50。视所用剂型及所用投药途径而定，剂量可在此范围内变化。对于本发明方法中所用之任何化合物而言，治疗有效剂量最初可由细胞培养物分析来估计。剂量可在动物模型中调配以达成包括如在细胞培养物中所测定之IC50(亦即，达到对症状之最大抑制一半的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可用于更准确地确定在个体中之适用剂量。血浆中之含量例如可藉由高效液相层析来量测。
可藉由在以组合物免疫之后，藉由使用本领域中已知之任何免疫分析来监控测试个体之免疫反应来确定组合物之免疫原性。产生体液(抗体)反应和/或细胞介导之免疫性可视作对免疫反应之指示。测试个体可包括动物，诸如猪、小鼠、仓鼠、狗、猫、兔、奶牛、马、绵羊及家禽(例如，鸡、鸭、鹅及火鸡)。
可藉由各种方式来分析测试个体之免疫反应，诸如：如由已知技术(例如酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)、免疫墨点、免疫沈淀等)分析之所得免疫血清对免疫原性缀合物之反应性；或如由本领域中已知之用于分析疾病感染原水平(例如细菌水平)之任何方法(例如，藉由培养来自个体之样本)或本领域中已知之其它技术所测定，藉由保护经免疫宿主免受病原体感染和/或使经免疫宿主中由于病原体感染引起之症状减轻。疾病感染原之水平亦可藉由量测免疫球蛋白所针对之抗原水平来测定。疾病感染原水平之减少或感染性疾病症状之缓解指示组合物系有效的。
在活体外用于动物之前，可经活体外测试本发明治疗剂之所需治疗或预防活性。举例而言，可用于确定是否指示投予特定治疗剂之活体外分析包括使来自细胞株之适当细胞或由患有特定疾病或病症之个体培养之细胞暴露于治疗剂或以其它方式投予治疗剂之活体外细胞培养物分析，且观测治疗剂对细胞之效应。
或者，可藉由使治疗剂与易受疾病感染原感染影响但未经疾病感染原感染之细胞(由个体或经培养之细胞株培养)接触、使细胞暴露于疾病感染原且随后确定与治疗剂接触之细胞的感染率是否低于未与治疗剂接触之细胞的感染率来对治疗剂进行分析。可藉由本领域中已知之任何方法来分析疾病感染原对细胞之感染。
另外，可藉由在治疗前、治疗期间或治疗后以适合之时间间隔量测抗体在动物模型中所针对之分子的水平来评估治疗剂。可确定分子之量的任何变化或不存在变化且与对个体之治疗效应相关。可藉由本领域中已知之任何方法来确定分子之水平。
在使用本发明之方法及组合物对动物接种针对PRRSV之疫苗之后，可使用本领域中已知之任何结合分析来评估所得抗体与特定分子间之结合。亦可进行该等分析来选择对特定抗原展现较高亲和性或特异性之抗体。
G.检测及诊断方法
由使用本发明之PRRSV肽产生之抗体或其结合部分适用于检测样本中PRRSV之存在。此检测方法包含提供针对本发明之PRRSV肽所产生之分离抗体或其结合部分、向分离抗体或其结合部分添加疑似含有一定量PRRSV之样本且检测是否存在与PRRSV结合之包含分离抗体或其结合部分之复合物的步骤。
本发明之抗体或其结合部分亦适用于检测样本中是否存在PRRSV肽。此检测方法包含提供针对PRRSV肽所产生之分离抗体或其结合部分、向分离抗体或其结合部分添加疑似含有一定量PRRSV肽之样本且检测是否存在与PRRSV肽结合之包含分离抗体或其结合部分之复合物的步骤。
如本文所述，结合作为结合对一员之特异性分子的免疫球蛋白，尤其为抗体(及其功能活性片段)可用作诊断剂及预后剂。在各种实施方案中，本发明提供对结合对一员之量测及该等量测在临床应用中之用途。本发明中之免疫球蛋白例如可用于检测生物样本中之抗原，由此可测试个体中与免疫球蛋白结合之分子的异常水平和/或是否存在该等分子之异常形式。“异常水平”意谓在来自身体一部分或未患疾病之个体的类似样本中，相对于现有水平或代表现有水平之标准水平而言增加或减少。在用于诊断或预后技术之试剂盒中亦可包括本发明之抗体作为试剂。
在一方面中，可使用与PRRSV肽免疫特异性结合之本发明之抗体来诊断、预后或筛选PRRSV感染。
在另一方面中，本发明提供一种诊断或筛选是否存在PRRSV感染或与其之免疫性的方法，其包含在个体体内量测抗体与源自个体之样本的免疫特异性结合水平，其中抗体与PRRSV肽免疫特异性结合，其中该免疫特异性结合水平相对于在来自不具有疾病感染原之个体之类似样本中的该免疫特异性结合水平而言增加指示存在PRRSV。
用于检测是否存在PRRSV肽或其拮抗剂之适合分析的实例包括(但不限于)ELISA、放射免疫分析、凝胶-扩散沉淀反应分析、免疫扩散分析、凝集分析、荧光免疫分析、蛋白A免疫分析或免疫电泳分析。
用于特定分子之免疫分析通常将包含在经可检测标记之抗体存在下培育样本(诸如生物流体、组织提取液、新鲜收集之细胞或培养细胞之裂解物)且藉由本领域中熟知之多种技术中之任一种检测结合抗体。
可根据熟知方法来测定指定抗体之结合活性。本领域技术人员将能够藉由采用常规实验来确定用于每次测定之操作性及最佳分析条件。
本发明之另一方面系关于用于检测或量测PRRSV之诊断试剂盒。提供用于诊断用途之试剂盒，其在一或多个容器中包含抗PRRSV肽抗体，且视情况包含该抗体之经标记结合搭配物。或者，抗PRRSV肽抗体可经标记(以可检测之标记，例如化学发光、酶、荧光或放射性部分)。因此，本发明提供一种包含抗PRRSV肽抗体与对照免疫球蛋白之诊断试剂盒。在一特定实施方案中，可检测性地标记容器中之以上化合物之一。试剂盒可视情况在容器中另外包含预定量之由试剂盒之抗体识别之PRRSV肽用作标准物或对照。
H.向个体投药
优选投药途径包括(但不限于)鼻内、经口、皮内及肌肉内。最优选以单次给药在饮用水中投药系有利的。本领域技术人员将意识到，本发明之组合物亦可以一或两次或两次以上给药以及藉由其它投药途径来投予。举例而言，该等其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、叶内、髓内、肺内及***内。视治疗之所需持续时间及有效性而定，可一次性或分若干次，亦间歇性地，例如在每日之基础上历时若干天、数周或数月且以不同剂量来投予本发明之组合物。
包括以下实例以说明本发明之优选实施方案。本领域技术人员应了解，在以下实例中所揭示之技术代表由本发明者所发现之技术，以在实践本发明中发挥良好作用，且因此可视其为构成用于其实践之优选模式。然而，根据本发明，本领域技术人员应了解在不悖离本发明之精神及范畴的情况下可对所揭示之特定实施方案中进行诸多改变且仍获得相同或类似之结果。
本文引用之所有申请案、专利及公开案之整个揭示内容均明确以引用的方式并入本文中。
实施例：
实施例中所用之本发明之病毒株系SEQIDNO:1(Wetzelp3(预减毒))及SEQIDNO:2(Wetzelp41(减毒))。
实施例1：细胞传代-减毒PRRS病毒之呼吸道及生殖安全性
以下揭示内容系关于对不同PRRSV分离株进行之实验；然而，使用类似方法制备本发明之Wetzel分离株，且可由本领域技术人员用以制备该等及类似减毒分离株。
细胞传代
以产生具有天然产生之缺失之分离株为目的，使用一种独特继代传代方法。在96孔细胞培养盘中种植MA-104细胞(ATCCCRL2621)且在37℃下以10％胎牛血清(Invitrogen)及5％CO2以最低必需培养基(EMEM,SAFCBiosciencesM56416)培育。细胞一经培育3天后，向培养盘上整列之每一孔中添加100μL亲本病毒MN184(MN/01/A2)或IsolateX。随后使用每一孔沿每一行进行四次1/10稀释。稀释之后，经每一孔之顶部添加100μL新鲜培养基。将盘培育3至8天，之后检查细胞病变效应。在读取盘之后，将每一行之最高阳性稀释液递送至具有3天大MA-104细胞之另一盘中。在此新盘上进行四次1/10稀释，覆盖培养基且再次培育盘。在活体外细胞第51次继代传代中连续进行此过程。有时，若一行展示无生长，则试图传递最低稀释液以产生足够之病毒来维持传递感染。随后，若在下一盘上仍无CPE征象，则使用另一行来接种下一盘。
IsolateX系一种来自2007PRRS爆发之展现ORF51-7-4RFLP模式且具有JA-142样nsp2区之分离毒性野外病毒。MN184系2002年在北美出现之一种导致高死亡率及严重生殖病症的极具病原性之分离株。此分离株与VR-2332(2型原型病毒株)相比在nsp2区中具有131个氨基酸缺失。此外，已发现MN184具有迄今为止发现之15,019kb之最短PRRS基因组[12][16]。经传代过程产生之缺失突变体称为96孔缺失突变体，而与IsolateX相关之IsolateX-9在nsp2区中不含显著缺失，但经选择用于比较目的。
核苷酸序列分析
由活体外细胞培养物及研究动物血清样本进行核苷酸序列分析。对于活体外样本而言，使用QIAamp病毒RNA小试剂盒(QiagenInc,Valencia,CA)进行核糖核酸(RNA)提取，而使用总核酸MagNA纯试剂盒(RocheAppliedScience)自所收集之猪血清进行提取。根据制造商之建议，使用III第一链合成(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)来产生互补脱氧核糖核酸(cDNA)。cDNA产物随后在具有以下配置之PCR***9700(AppliedBiosystems)96孔机器中经历聚合酶链反应(PCR)：初始化步骤在95℃下历时5分钟(min.)，变性步骤在95℃下历时30秒钟(sec.)、退火步骤在53℃下历时30sec.、继而为延长步骤在72℃下历时150sec.进行35个循环，最后为单次伸长步骤在72℃下历时5min。使样本保持在4℃直至自热循环器移除。每一PCR孔相应设定为：25μL2XAmpliTaqGoldMastermix(AppliedBiosystems)、21μLDEPC水(EMDChemicals,Gibbstown,NJ)、2μLcDNA模板及各自1μL单独引物(参见表1)。
表1.制备PRRSV分离株中所用之引物
字母注解：A-腺苷；T-胸苷；K-G或T；G-鸟苷；R-A或G；Y-C或T；C-胞苷；H-A、C或T
随后根据制造商之建议，以DNA清除***(Promega,MadisonWI)来纯化PCR产物。随后将样本以中等速度置于SavantSpeedvacDNA110(GlobalMedicalInstrumentation,Ramsey,MN)中历时10min.以移除任何残余异丙醇。随后将样本与10μL负载染料混合且负载至1.5％琼脂糖凝胶上。藉由施加120伏特(volt)进行电泳历时45min。视觉观测具有适当大小之带且经历以SV凝胶及PCR清除***(Promega)进行纯化。
随后将样本送至爱荷华州立大学(IowaStateUniversity,ISU)DNAFacility进行序列分析，其中以适当引物建立测序反应。在ISU，使用AppliedBiosystems3730xlDNA分析仪。以2.0版GeneTool(BioToolsInc.)对序列进行分析。如明尼苏达大学兽医诊断实验室(UniversityofMinnesotaVeterinaryDiagnosticLaboratory)所概述，根据其限制片段长度多态性现象对ORF5序列进行分类。
呼吸道安全性试验
对此研究而言，将25只3周大之未接受过PRRSV之市售杂种猪按重量随机分为5组，历时14天进行呼吸道安全性试验。将所有动物圈养在研究设施中且在整个研究期间使以动物进行工作之所有个人看不到动物。除阴性对照组以外，使研究组中之每只动物在颈部接受2mL含有MN184(IsolateY)(4.86logs递送)、IsolateX-2(IsolateX之另一减毒分离株)(6.13对数递送)、IsolateX-9(6.31logs递送)之减毒克隆或野生型IsolateX(3.59logs递送)的肌肉内(IM)注射。由TCID50/ml测定病毒效价(JohnsonW,RoofM,VaughnE,Christopher-HenningsJ,JohnsonCR,MurtaughMP.Pathogenicandhumoralimmuneresponsestoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)arerelatedtoviralloadinacuteinfection.以及VetImmunolImmunopathol2004年12月8日；102(3):233-47[17]及ReedLJ,MuenchH.Asimplemethodofestimatingfiftypercentend-points.AmerJHyg1938；27:493-7[18],二者均以引用的方式并入本文中)。
研究在第14天结束，所有动物均经历安乐死及由执业兽医进行验尸。收集血液样本，之后在研究日第0天以及第7天及第14天进行处理投药。
生殖安全性试验
生殖安全性试验包括16只圈养在研究设施中且所有动物看守者及研究者均看不见之怀孕90±4天之PRRSELISA阴性市售杂种小母猪。将动物随机分为四个由相同之来自呼吸道试验之三个细胞传代测试件组成之处理组及一个阴性对照组。在第0天当对雌性经鼻内以每侧鼻孔接种2.0mL以下中之一者时正式开始研究：IsolateY、IsolateX-2、IsolateX-9或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。以含有2％胎牛血清(FBS)(Sigma,St.Louis,MO.)之最低必需培养基(MEM；Sigma,St.Louis,MO.)稀释所有病毒以向每只动物递送4ml标靶之5.00对数病毒。由TCID50/剂量测定病毒效价。在各自产仔日(DOF)21天之后，对每只小母猪及其仔猪结束研究。在第0天、第7天、第14天、第21天、产仔日(DOF)、产仔7天后(DOF+7)、产仔14天后(DOF+14)及产仔21天之后(DOF+21)对所有小母猪进行抽血。另外，对活的仔猪在DOF、DOF+7、DOF+14及DOF+21进行抽血，而死的仔猪在检查时即刻收集血液或胸液，而与研究日无关。
呼吸道安全性试验临床肺部评估
在验尸时评估猪安全性研究中所有动物肺部与PRRSV感染一致之实变百分比。使用标准化计分***关于每一个别叶及总的大体肺部病理学对肺部进行计分。参见HalburPG、MillerLD、PaulPS、MengXJ、HuffmanEL、AndrewsJJ.Immunohistochemicalidentificationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)antigenintheheartandlymphoidsystemofthree-week-oldcolostrum-deprivedpigs.VetPathol1995Mar；32(2):200-4[19]。最终观测计分值与所有个别肺叶计分值之权重总和相等。
生殖安全性试验生殖效能
记录每只雌性之流产及产仔数据。产仔日定义为分娩出幼崽中之第一只活出生小猪之日。至少每天6:00AM至10:00PM定期观测小母猪。幼崽观测包括每只雌性之流产数、死产数、木乃伊胎数、活仔猪数及弱出生活仔猪数。记录发现由于母畜挤压而死亡之仔猪且由验尸进行证实。
血清学
经由静脉穿刺自每只动物收集全血(5-10mL)。将样本返回实验室以藉由离心自凝块分离。随后将血清倾析至螺旋盖之低温小瓶中且在4℃下最大储存24小时或在-70℃下冷冻直至可进行测试。使用IDEXXPRRSELISA2XR(IDEXXLaboratoriesInc,Westbrook,ME)针对PRRSV特异性抗体分析血清样本。所有测试均如制造商之说明书所述来进行。若样本阳性比(S/P)至少为0.4，则认为样本对于PRRSV抗体系阳性的。
平均每日重量增加
记录平均每日重量增加(ADWG)作为衡量研究动物健康状况之另一参数。在每次使用前均校准之级别上记录动物重量。对于呼吸道安全性研究而言，在接种免疫前3天(第-3天)及验尸时(第14天)对动物进行称重以用于平均每日重量增加分析。对于生殖安全性研究而言，在产仔8小时内对分娩之所有仔猪进行称重且在21天后对所有剩余之活仔猪再次进行称重以供分析。
生殖安全性试验病毒血症
经由逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)测试小母猪与仔猪血清中PRRSV核酸之存在性。藉由具有总核酸MagNA纯试剂盒(RocheAppliedScience)之RocheMagNA纯提取机器人提取血清。根据制造商之说明书，以AgPath-IDTMNA及EUPRRSVMultiplex(AppliedBiosystems)进行RT-PCR。在具有以下配置之RocheLightcycler48096孔机器上运行反应：退火步骤在45℃下历时10min.，变性在95℃下历时10min.及变性在97℃下历时2sec.继而退火步骤在60℃下历时40sec.进行40个循环，且最后为冷却步骤在40℃下历时40秒钟。
生殖安全性研究动物临床观测
每日观测所有研究动物之总体健康及与PRRS相关之临床征象。以对每一类指定之计分值评估每只动物之呼吸、行为及咳嗽。可能计分值在0(正常)至1(异常)之范围内。异常行为定义为异常呼吸、异常行为(诸如嗜睡)及存在咳嗽。基于3次个别计分值之总和记录每日总分。将任何死仔猪指定为3分且随后称重，且随后进行验尸以确定可能之死因。除每日观测以外，自处理前一日(第-1天)开始至研究结束(DOF+21)定期获取小母猪之直肠温度。
统计学/生物统计学
将呼吸道安全性及生殖安全性研究之所有数据输入9.1版SAS中以供管理及分析。适当时，对于所有变量由处理组产生概要统计，包括平均、中值、标准偏差、标准误差、最小值、最大值、变异系数及频率分布。对于猪及生殖研究而言，比较第1至4组(成对)相对于第5组之间之所有参数，且对于呼吸道研究而言，比较第1至3组相对于第4组之间之所有参数。根据APHIS所推荐之方法，仅报导双侧结果且所有比较均在α＝0.05下。用于分析数据之特定方法展示于表2中。
表2.分析每一评估参数之统计学方法
结果：
序列分析
经历连续细胞传代之病毒在nsp2区上每约10次传代及在ORF5区上在第50次传代时进行基因体序列分析。如所预期，若干个分离株在整个过程中发生天然缺失。在细胞第50次传代时，IsolateY在nsp2区中具有连续6个核苷酸缺失，预期导致损失2个氨基酸。IsolateX-2在细胞第50次传代时在nsp2区中展现连续63个核苷酸缺失，此导致损失连续21个氨基酸的序列。IsolateX-9仍与JA-142类似且在nsp2区中无大的缺失。对ORF5区之定序结果显示，MN184分离株仍具有1-8-4RFLP切割模式，而IsolateX分离株维持1-7-4RFLP切割模式。
来自生殖安全性试验之样本亦经历序列分析以确定病毒在活体外如何稳定。来自研究最后一天(DOF+21)之所有PCR阳性仔猪血液样本经历尝试性序列分析，且自每一接种疫苗组成功获得至少一个序列。所有病毒在活体外复制之后保持相对稳定。来自每一个别动物之nsp2区测序揭示每种病毒仅存在数个取代。导致氨基酸变化之取代概括于表3中且与MN184A及JA142AY424271相比进行描述。亦对ORF5区进行测序且所有分离株维持其初始切割模式。
表3.在分娩三周后导致阳性仔猪之相应氨基酸变化的Nsp2突变。
分离株 MN184A位置* 核苷酸变化
Isolate Y A A→G
Isolate Y B A→G
Isolate Y C T→C
Isolate Y D A→G
JA142AY424271位置* 核苷酸变化
Isolate X-2 位置 A→G
Isolate X-2 F G→A
Isolate X-9 G G→A
Isolate X-9 H C→T
Isolate X-9 I T→G
Isolate X-9 J G→A
呼吸道安全性试验肺部病理学
在第14天完成研究时，对所有动物进行验尸且评估肺部病理(图1)。使用ANOVA比较各组平均肺部计分值，仅野生型IsolateX组之临床肺部计分值与阴性对照组相比在统计学上显著增加。IsolateY组与IsolateX-9组具有比IsolateX野生型组在统计学上显著较低之肺部计分值。肺部计分值显示细胞传代过程的确显著减小IsolateY与IsolateX-9分离株之毒性，而IsolateX-2仍能够导致某种程度之呼吸道疾病。
平均每日重量增加
对于呼吸道安全性研究而言，经由ANOVA之平均每日重量增加分析证实对于所有处理组之研究持续时间而言，各组之平均初始体重或平均每日增加在统计学上无显著差异。野生型IsolateX处理比其它组具有略微较高之平均初始体重，此可归因于与其它组相比缺少ADWG之统计学差异。
对于生殖安全性研究而言，ANOVA分析证实IsolateX-2组之仔猪在产仔时具有比阴性对照组在统计学上显著较低之平均体重。有趣的系，所有处理组之仔猪与阴性对照组相比均具有在统计学上显著较低之ADWG。然而，藉由使用另一种统计学测试ANCOVA，确定初始仔猪平均体重及初始仔猪平均体重-处理组相互作用显著有助于仔猪ADWG，而每一仔猪所属之处理组并不显著有助于ADWG。
ELISA
对于呼吸道安全性研究而言，在第0天及第7天，经由IDEXXPRRSELISA2XR，所有动物均为阴性的。然而，在第14天，IsolateY组之所有动物及第4组(野生型IsolateX)之大多数动物已血清阳转，而投予IsolateX-2及X-9之处理组在约50次传代之后展现弱血清阳转(图2)。使用费希尔精确检验比较每一组中经血清阳转之动物数。结果显示仅IsolateY组及野生型IsolateX组与阴性对照组相比具有显著较高数目之由ELISA确定为阳性之动物。野生型IsolateX处理组与IsolateX-2组、而非IsolateX-9组中之动物在统计学上不同。
对于生殖安全性研究而言，所有动物在第0天及第7天仍为阴性的。然而，到第21天，接受病毒作为处理之几乎所有小母猪均为阳性的。在研究持续期间，MN184处理组之小母猪全部维持由ELISA确定之阳性。在第21天、DOF0及DOF+14，所有处理组之阳性动物与阴性对照组相比在统计学上显著增加。
发现来自生殖安全性研究之仔猪具有相当量之PRRSV特异性抗体。对于所有样本收集日而言，IsolateX-9及IsolateY组在阳性ELISA测试中展示与属于阴性对照组之仔猪相比在统计学上显著增加。发现IsolateX-2处理组仔猪仅在DOF+7与阴性对照组在统计学上不同。
来自两种研究之ELISA发现响应相同结果。尽管如由PRRSELISA2XR所检测，证明所有分离株均能够诱发PRRSV特异性抗体反应，但在MN184处理组中所检测之抗体之发作及持续时间似乎比IsolateX处理组之反应更早且持续更长。在IsolateX分离株中，IsolateX-9组始终比接受IsolateX-2之组具有更多测试阳性的动物。
小母猪生殖效能
如表4中所概述，研究中包括之所有雌性均分娩相对正常且健康之幼崽。
表4.每窝幼崽之平均小母猪生殖效能
由于设施及劳动力限制，每种分离株仅使用4只小母猪。在任何经测试之分离株中均无剧烈之毒性征象。对于统计学分析而言，使用Wilcoxon双样本测试对每一处理组与阴性对照组之间进行比较。将出生仔猪总数、死产数、健康活仔猪数、弱小活仔猪数、木乃伊胎数及产仔21天后仍存活之猪数与阴性对照组进行比较。对于任何生殖效能变量均未发现统计学差异。该等发现显示所述减毒过程已成功减少了由每种分离株引起之生殖失败的量。
仔猪、猪及小母猪之死亡率
对于呼吸道安全性研究而言，在研究期间无动物损失。然而，对于生殖安全性研究而言，在DOF0至DOF+21损失6只仔猪。该等损失仍在断乳之前所预期之仔猪死亡率范围内。IsolateX-2处理组之一只小母猪由于胎盘滞留引起之疾病而被施以安乐死。此小母猪仅分娩3只死产仔猪，因此不违背仔猪效能数据。
病毒血症
对于大多数组而言，由RT-PCR所检测之小母猪病毒血症相对较短(图3)。使用费希尔精确检验将每一处理组与阴性对照组进行比较以供统计学分析。IsolateX-9组、IsolateY组及IsolateX-2组在研究第14天对于PRRSRNA为阳性之动物在统计学上显著增加，而IsolateY组在第7天时亦在统计学上不同。阴性对照组在DOF+7时具有1只测试阳性之动物。此可能系由于在加工过程某个时刻样本受到污染，因为此系此组中唯一之阳性测试。
对于PRRS之重要安全性指示系自母畜经胎盘转移至仔猪。对于IsolateX处理组而言，大部分仔猪在产仔日系阴性的。然而，到DOF+21，属于IsolateX-9及IsolateY处理组之大多数仔猪系阳性的，据推测系由于病毒之水平传播。使用费希尔精确检验进行统计学分析。所有处理组均展现对PRRSRNA测试阳性之仔猪数在统计学上显著增加，除了IsolateX-2在DOF+7由于阴性对照组之26只仔猪中有4只在当日测试阳性而丧失显著性。阴性对照阳性样本可能系由于在样本收集、处理及加工过程某个时刻受到污染，因为在DOF+7之前或之后并无其它阴性对照组样本为PCR阳性(图4)。
生殖安全性研究临床观测
记录生殖安全性研究之临床观测作为剩余分离株毒性之支持资料。除了被施以安乐死之小母猪以外，仅记载数个异常计分值为1之分离事件。在至少一天使用费希尔精确检验比较每组中具有临床异常计分值之动物数时，并无某组与阴性对照组在统计学上不同。又，收集平均小母猪组之直肠温度且使用ANOVA与阴性对照组进行比较。在第7天(IsolateX-9与IsolateX-2)及第14天(IsolateY)注意到在统计学上显著较高之平均直肠温度。所有处理组之小母猪的体温在研究持续期间维持正常。
对于仔猪临床观测计分值而言，与阴性对照组相比，IsolateX-9及IsolateX-2处理组中之仔猪临床异常在统计学上显著增加。IsolateY处理组之仔猪P值为0.0547，此接近统计显著性，但大于用于此研究之所有统计学分析所用之0.05截断值。如前文提及，在研究期间发现8只仔猪死亡(4只来自IsolateX-9组、每个MN184组各1只且2只来自IsolateX-2组)。阴性对照组在研究期间未发现仔猪死亡。所有其它临床异常动物未受到严重影响且无异常性违背研究结果。
在此研究中，描述一种传代方法，其中藉由限制性稀释使单一分离株传代多次。使用频繁序列分析作为选择工具来活体外测试个别克隆之疫苗潜能。靶定nsp2基因中之基因组缺失，因为咸信该等分离株在动物宿主中更具基因体稳定性，同时亦能够提供针对野生型病毒之充分免疫保护。经由使用呼吸道及生殖动物模型针对基因体稳定性及安全性对所选分离株进行筛选。
此试验结果充当所有分离株均在某种程度上减毒之证据。在与阴性对照组相比时，所有细胞传代分离株之肺部病理学或平均每日重量增加均无统计学差异。此外，野生型IsolateX组之肺部病理学比IsolateY及IsolateX-9组具有统计学上显著较高之计分值。此研究中未使用野生型MN184，但先前已测试[17]。Johnson等人在细胞培养物第1次传代时以MN184对十只2-3周大之猪进行接种，且记录彼组中到研究最初14天时有2只猪死亡。对于MN184组而言未收集肺部病理学，但此组之死亡率代表亲本野生型分离株之一般毒性。此处，在猪呼吸道试验中，在研究过程中任何处理组均无动物损失。显然，所有分离株引起呼吸道疾病之能力减小，但IsolateX-2组可能更小。与野生型IsolateX处理组相比，此组之肺部计分值并无统计学差异。
生殖安全性试验之结果模拟呼吸道试验之彼等结果。在与阴性对照组相比时，任何所测试分离株之所有生殖效能参数及小母猪临床观测均无统计学差异。两种试验之ELISA结果显示，所有分离株到第21天为止均能够在小母猪体内诱发产生PRRSV特异性抗体，尽管MN184组中之血清阳转似乎比在IsolateX组中更一致且更持久。RT-PCR所检测到之病毒血症展示在小母猪体内，病毒仅在短时间内即在血液中达到可检测之水平，而经胎盘传播之病毒随后水平扩散至所有组中之同窝幼畜。尽管先天性传播之病毒的确传播至同窝幼畜，但并未负面影响所有组之效能。在与阴性对照组相比时，IsolateY组之仔猪临床观测并无统计学差异，此系先前关于目前可用减毒疫苗所述之现象。参见MengelingWL、LagerKM、VorwaldAC.Clinicaleffectsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusonpigsduringtheearlypostnatalinterval.AmJVetRes1998Jan；59(1):52-5[20]，其以引用的方式并入本文中。随着对可能恢复毒性形式之修饰活疫苗的关注日益增加，疫苗分离株之稳定性增加且得到证明将变得愈加重要。我们之基因组稳定性数据显示，该等分离株似乎足够稳定，在nsp2及ORF5区中具有相对极少变化，此系期望的且PRRS尤为如此。参见WesleyRD、MengelingWL、LagerKM、VorwaldAC、RoofMB.Evidencefordivergenceofrestrictionfragmentlengthpolymorphismpatternsfollowinginvitroreplicationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus.AmJVetRes1999Apr；60(4):463-7[21]，其以引用的方式并入本文中。
提出之结果显示，分离株能够诱发活体外血清阳转且比亲本病毒毒性小得多，但仍能够导致某些疾病或产量损失。因此，该等分离株可在细胞培养物中进一步传代以试图进一步减毒且稳定基因组。96孔缺失传代方法系一种用于产生具有增加功效及基因体稳定性之新颖修饰活疫苗的有效且高效之方法。
实施例2：细胞传代-减毒PRRS病毒在5周大仔猪中之安全性
在此研究中，评估三种PRRSV克隆之安全性：IsolateX-6、WetzelClone3p51及WetzelClone9p48。对5周大之三组6只剖腹产分娩-剥夺初乳(CD-CD)猪之一经肌肉内(IM)投予2mL剂量之每种克隆。第四组之5只猪接受安慰剂且充当对照。基于PRRSV血清转化、病毒血症及与PRRSV相关之肺部病变来评估克隆之安全性。
在研究之第0天(D0)，对易受PRRSV影响(血清学阴性；<0.4，藉由ELISA对于PRRSV抗体而言)的二十三(23)只健康5周大CD-CD仔猪以PRRSVIsolateX-6(T1组)、WetzelClone3p51(T2组)、WetzelClone9p48(T3组)或安慰剂(C组)进行接种。
在D0、第7天及第14天时，收集所有猪之血清样本。在D14，对所有猪施以安乐死，此时进行大体病理学检查及肺部病变计分。
在D-1至D14，每日临床观测总体健康状况及与PRRS疾病相关之征象，特定而言为呼吸、行为及咳嗽。在整个研究期间，任何猪均未观测到临床征象。另外，在验尸时，任何猪均未观测到肺部病变(计分值＝0)。
在所有血清样本上完成聚合酶链反应(PCR)，测试是否存在PRRSV病毒血症。所有组之猪的PCR结果在D0呈阴性，其表示在接种时没有暴露到PRRSV。对照组C在其余时间点的结果亦呈阴性，表示在研究期间之环境没有暴露到PRRSV。在D7，T1组(6/6，100％)及T2组(6/6，100％)之所有猪均为PCR阳性，而T3组(0/6，0.0％)之所有猪均为阴性。在D14，T1组(6/6，100％)及T2组(6/6，100％)维持相同水平，而T3组(2/6，33.3％)显示有两只猪出现PRRS病毒血症阳性。为证实该等最后两只猪中之PRRSV为其在接种时所接受之克隆，进行ORF5序列分析，结果与WetzelClone9p48匹配，表示无交叉污染和/或环境感染。
由ELISA测定对于PRRSV之抗体效价。所有猪在D0均为血清阴性(<0.4)。此表示在接种时没有母性抗体。所有猪在D7均维持阴性。在D14，T1组、T2组及T3组分别具有4/6(66.7％)、5/6(83.3％)及1/6(16.7％)之阳性猪。对照组在D14维持阴性，表示没有暴露到PRRSV。
尽管仔猪在第14天时发生病毒血症，但数据显示此研究中所用之PRRSV克隆并未导致肺部病变和/或PRRSV感染之临床征象。认为该等克隆对5周大之仔猪安全。
在此研究中，评估三种克隆之安全性：IsolateX-6、WetzelClone3p51及WetzelClone9p48。对5周大之三组6只剖腹产分娩-剥夺初乳(CD-CD)猪中之一组经肌肉内(IM)投予2mL剂量之每种克隆。第四组之5只猪接受安慰剂且充当对照组。基于PRRSV血清转化、病毒血症及与PRRSV相关之肺部病变来评估克隆之安全性，以有助于确定其用作MLV候选物之可行性。
此研究之目标在于评估PRRSV克隆IsolateX-6、WetzelClone3p51及WetzelClone9p48在5周大仔猪体内之安全性。自第1天至第14天每天对所有仔猪进行临床评估。评估包括死亡发生率、临床计分值(呼吸窘迫、嗜睡、行为及咳嗽)、病毒血症、肺部病变、血清状态及病毒分离(VI)。事件进程展示于表5中。
表5：事件进程
研究设计：
购买二十三(23)只易受PRRS影响(ELISA<0.4)的CD-CD研究动物、运输且随后圈养在一起1周，之后在VeterinaryResources,Inc.'s(VRI)Cambridge,IA设施中进行疫苗接种。个别地识别测试动物且由研究调查者检查总体健康状况。
如表6中所示，仔猪随机分为四组。
表6：处理组
组 动物数 处理 剂量/途径
T1 6 PRRSV Isolate X-6 2mL/IM
T2 6 PRRSV Wetzel Clone 3p51 2mL/IM
T3 6 PRRSV Wetzel Clone 9 p48 2mL/IM
C 5 对照(无菌PBS安慰剂) 2mL/IM
随机化方法
为进行随机分组，由研究调查者在研究开始之前准备该研究所包括之所有动物名册。使用计算机随机数产生器(MicrosoftExcel)为每只动物指定独特之随机数。将动物依体重分组(实验组)中。在实验组中，将具有最低随机数之动物分配至第一处理组。以递增之随机数继续分配，直至所有动物均分配至某一处理组。关于分组法可参见附件7。
盲蔽方法
该研究法是盲蔽的以评估实验室样本测试中之偏差。进行研究样本实验室测试之人并非施行处理或进行每日观测之同一人。关于包括标准参见表7。
表7：包括标准
淘汰政策
在动物期完成之前不自研究淘汰动物。
识别测试动物
由与处理组无关之双重耳标识别所有测试动物。
动物管理及圈养
将动物根据其标准操作程序圈养于VeterinaryResources,Inc.之设施中。
动物看护
在研究开始前，认为动物处于良好健康及营养状态。研究者在随机化程序之前进行健康检查。
由于CD/CD动物易受影响，因此所有仔猪在接种前六天(D-6)根据标签说明接受一剂量之Pfizer另外，在D-6至D0对仔猪喂饲MillsSenior加药饲料。自D1至研究结束，仔猪接受MillsSenior饲料。
食物及水管理
根据设施标准操作程序，饲料定量适合测试动物之年龄、状况及物种。在整个研究期间随意提供水。
研究用兽医产品(IVP)
藉由在经修饰最低必需培养基(mMEM)中以2％FBS感染AKMA-104细胞来制备PRRSV克隆。使培养物在37℃下培育直至CPE≥80％，此时将其置于-70℃下。在接种当日(D0)，自冷冻器移除烧瓶且使其在室温下解冻。随后将每种克隆之悬浮液转移至塑料之瓶塞盖疫苗瓶中且标记为T1、T2或T3(参见表1)。随后直接将其于冰上递送至研究地点。测试所有克隆制剂且在接种前及接种后由TCID50分析定量。对于对照组C而言，使用1×PBS作为安慰剂。在D0对猪投予2.0mLIM之适当IVP或安慰剂。在接种后将任何剩余之IVP返回至BIVI-Ames。关于PRRSV克隆IVP之详情，参见表8、9及10。
表8：研究用兽医产品，PRRSVIsolateY-6
表9：研究用兽医产品，PRRSVWetzelClone3p51
表10：研究用兽医产品，PRRSVWetzelClone9p48
藉由油脂精炼处置所有安乐死研究猪之尸体。在接种后或验尸前不自研究移除测试动物。在投予所有剂量之研究用兽医产品之后，将剩余IVP返回研究监控人员进行适当处置。
评估克隆安全性
基于对PRRSV血清阳转、病毒血症及与PRRSV相关之肺部病变的存在性/严重性来评估克隆之安全性。接种后在任意时间点单次发生病毒血症将猪分类为病毒血症阳性。根据12.3.1部分中所述之程序计算每只动物肺部之病理学百分比。将每个测试组之结果与对照组之结果相比较。亦对猪评估PRRSV在血清及肺部灌洗液中之分离、临床观测/计分值及死亡率。
使用无菌18-20g×1英寸(2.54cm)至1.5英寸(3.81cm)1-11/2″针、针钳及13mL血清分离管(SST)，由研究、研究者或指定人员经由前腔静脉自每只猪收集不超过10mL之静脉全血。在接种前及在第7天及第14天收集血液。对每个血液管标记以动物之ID号、研究编号、收集日期、研究日及样本类型。
藉由PCR测试血清样本之PRRSV病毒血症且使用市售测试-PRRSELISA测试血清样本之PRRSV抗体。亦藉由病毒分离(VI)测试血清样本是否存在PRRSV。每只动物在接种疫苗之前均为PRRS血清阴性(ELISAS/P比率<0.4)，指示有效研究。病毒分离结果报导为阳性或阴性。
临床观测
由研究者或指定人员在第-1天至第14天每天观测猪之总体健康状况及与PRRS疾病相关之临床征象。特定而言，每天检查猪之呼吸、行为及咳嗽，每一类定级0为正常且1为异常(参见表11)。每只猪之每日总分为其在特定日之呼吸计分值、行为计分值及咳嗽计分值之总和。在研究期间未发生死亡。
呼吸、行为、咳嗽及观测计分值计分如下：呼吸计分值：0＝正常呼吸、1＝异常呼吸；行为计分值：0＝正常行为、1＝异常行为；咳嗽计分值：0＝未注意到咳嗽、1＝存在咳嗽。
在验尸当日，在收集数据及样本之后，由研究者或指定人员对每只猪施以安乐死且进行验尸。安乐死之后，研究者或指定人员完整移除肺部及气管，沿气管置放一夹钳以防止血液交叉污染。观测肺部病理学之一般描述且记录每个肺叶中之病理学百分比。藉由每个肺叶之肺部病理学百分比总和确定每只猪之肺部病理学总％。
在评估肺部之病理学之后，由研究者或指定人员自每一组肺收集肺部灌洗样本。对每个样本标记以动物编号、研究编号、样本类型、收集日期及研究日。对此研究而言，未收集肺部组织样本。
结果：
在第0天，所有猪之ELISA结果均为阴性(S/P<0.400)，表示在接种时没有母性抗体存在。第0天，T1组、T2组、T3组及C组之平均值分别为-0.070、-0.042、-0.037及-0.032。所有猪在第7天仍为阴性，T1组、T2组、T3组及C组之平均值分别为-0.069、-0.038、-0.023及-0.053。在第14天，T1组中四只阳性猪(4/6，66.7％)、T2中五只阳性猪(5/6，83.3％)且T3组中一只阳性猪(1/6，16.7％)。然而，C组仍为全部阴性(0/5，0.0％)。T1组、T2组、T3组及C组在第14天之平均值分别为1.122、1.024、0.247及-0.045。ELISA资料可见于表11中。
表11ELISA样本与阳性比
*阳性样本＝S/P>0.400
在第0天，所有猪均为PCR阴性，表示在接种时没有暴露到PRRSV。在第7天，T1组(6/6，100％)及T2组(6/6，100％)中之所有猪均为阳性，而T3组(0/6，0.0％)及C组(0/5，0.0％)全部为阴性猪。第14天，每组中阳性猪之数目为T16/6(100％)、T26/6(100％)、T32/6(33.3％)及C0/5(0.0％)。对照组C在整个研究期间没有阳性猪，表示该环境没有暴露到PRRSV。PCR总数可见于表12中。
表12：NA-PRRSV多重PCR结果
*Neg＝阴性、Pos＝阳性
由于T3组直至第14天尚未展示任何PCR阳性猪之事实，因此进行测序以证实88及97号猪受WetzelClone9感染。比较由上文所列之猪分离之PRRSV与此研究中所用之三个PRRSV克隆之间的ORF5序列。来自88及97号猪之结果与WetzelClone9同源。序列结果可见于图5中。
血清样本上之病毒分离与PCR结果类似。在第0天，由CPE及FA显示所有猪均为阴性。在第7天，对于CPE及FA而言，T1组、T2组、T3组及C组每组中之阳性猪分别为6/6(100％)、6/6(100％)、2/6(33.3％)及0/5(0.0％)。在第14天，对于CPE及FA而言，T1组、T2组、T3组及C组每组中之阳性猪分别为5/6(83.3％)、2/6(33.3％)、5/6(83.3％)及0/5(0.0％)。对照组C在整个研究期间再次保持阴性，表示没有暴露到PRRSV。参见表13中之病毒分离-血清结果。亦在验尸时获得之支气管-肺泡灌洗样本上进行病毒分离。结果显示T1组、T2组、T3组及C组分别为2/6(33.3％)、3/6(50.0％)、1/6(16.7％)及0/5(0.0％)阳性猪。关于病毒分离-灌洗结果，参见表14。
表13：病毒分离-血清
*Neg＝阴性、Pos＝阳性；CPE＝细胞病变效应、FA＝荧光抗体
表14：病毒分离-灌洗
*Neg＝阴性、Pos＝阳性；CPE＝细胞病变效应、FA＝荧光抗体
临床观测
所有猪均具有0之临床计分值，意谓未观测到异常之临床呼吸征象、异常行为或咳嗽。关于观测计分值，参见表15。
表15：临床观测计分值
所有猪均具有0之肺叶病理学％计分值，意谓在经大体病理学检查后在任何肺叶上均无可见病变。关于肺部病变计分值参见表16，且关于IVP滴定参见表17。
表16：肺部病变计分值
*RA＝右顶叶、RC＝右心叶、RD＝右膈叶、LA＝左顶叶、LC＝左心叶、LD＝左膈叶、Int＝中叶
表17：IVP滴定结果
*效价表述为Log10TCID50/mL
结论：
此研究之目标在于评估PRRSV克隆IsolateY-6、WetzelClone3p51及WetzelClone9p48在5周大仔猪中之安全性以确定其作为疫苗候选物之活力。尽管在接种14天后无可见之肺部病变，但对于两个克隆(IsolateY-6及WetzelClone3p51)而言，到第7天时存在PRRS病毒血症。接种第三种克隆(WetzelClone9p48)之两只仔猪在第14天时测试PCR阳性。另外，在病毒血症存在一周后，直至第14天，在任何IVP仔猪中均未检测到PRRSV抗体。尽管仔猪到第14天时发生病毒血症，但数据显示此研究中所用之PRRSV克隆并未导致肺部病变和/或PRRSV感染之临床征象。认为该等克隆在5周大仔猪体内系安全的。未来研究应包括接种疫苗-攻毒模型以确定该等克隆在以PRRSV进行毒性攻毒后减少肺部病变之能力。
实施例3：减毒PRRS病毒(Wetzel减毒)在呼吸道攻毒模型中功效
此研究之目标在于评估INGELVACMLV及实验疫苗在呼吸道攻毒模型中针对最近之NA-PRRSV攻毒分离株的功效。评估包括死亡率、临床计分值(呼吸窘迫、行为、咳嗽等)、病毒血症、肺部病变、血清学、病毒分离、平均每日增加及直肠温度。
此研究之目标在于评估INGELVACMLV及实验疫苗在呼吸道攻毒模型中针对最近之NA-PRRSV攻毒分离株的功效。评估包括死亡率、临床计分值(呼吸窘迫、行为、咳嗽等)、病毒血症、肺部病变、血清学、病毒分离、平均每日增加及直肠温度。在表18中提供事件进程。
表18：事件进程
个别地识别65只易受PRRS影响之研究猪且由研究者进行检查，且认为健康以供录用。将猪随机分为四组，如表19中所示。
表19.处理组
在第0天，在研究之第0天(D0)，对第2组及第3组分别根据标签说明以INGELVACMLV或2.0mL实验疫苗经IM进行疫苗接种。第1组以相同方式接受等剂量之安慰剂。SC组充当严格对照且不接受处理。在≥3周大时对猪进行疫苗接种。在D22，以1-4-4分离株对第1组、第2组及第3组进行攻毒。在攻毒期间仅两个室可用。将第1组与第2组圈养在一起且第3组留在其初始室中。攻毒途径及剂量为1.0ml经鼻内(每鼻孔0.5mL)。在攻毒当日滴定攻毒病毒之效能，结果指示每次给药递送5.13log之剂量。攻毒后第14天(D36)，对所有猪施以安乐死并验尸。移除肺部及气管，且观测肺部病理学之一般描述。记录每一肺叶中之病理学百分比。计分之后，收集肺部灌洗。藉由PCR测试个别肺部灌洗液中是否存在PRRSV。
获取直肠温度且自攻毒前一天(D21)至验尸日(D36)对动物进行观测；观测系关于死亡率、呼吸窘迫、行为及咳嗽。在D0接种疫苗之前且在D7、14、21、D28及D35收集血清。藉由ELISA个别地测试血清样本之PRRSV抗体且藉由PCR、qPCR及VI测试血清样本之病毒血症。另外，收集固定肺部组织且若必要保留用于组织测试。在研究开始时(第0天)、攻毒时(第22天)及在验尸之前(第36天)对动物进行称重。在此研究中使用65只混合育种、混合性别、个别识别之猪，其在研究中分配之前系PRRSV抗体与病毒血症阴性的。将动物根据适当之SOP圈养于BSL2设施中。为消除各组间散毒，在研究持续期间将疫苗组与对照分房置放，参见表1。又，SC组与未经接种疫苗之第1组保持在一起直至攻毒日且在第22天进行验尸。
根据这些区域可接受之动物管理实践，动物空间适合猪之大小及数目。根据设施标准操作程序，饲料定量适合测试动物之年龄、状况及物种。在整个研究期间随意提供水。在研究期间未向猪投予方案以外之生物剂或医药剂。
疫苗、安慰剂及攻毒病毒
关于此研究中所用之疫苗、安慰剂及攻毒病毒，参见表20、21、22及23。
表20.疫苗、INGELVACMLV
表21.实验疫苗
表22.安慰剂，仅稀释剂
表23.攻毒病毒、北美PRRSV(NA-PRRSV)攻毒分离株
有效性评估
基于PRRSV病毒血症及与PRRSV相关之肺部病变总百分比的减少来评估疫苗功效。接种疫苗后在任意时间点单次发生病毒血症将猪分类为病毒血症阳性。根据实验方案中所述之程序计算每只动物肺部之病理学百分比。亦对猪评估PRRSV在血清及肺部灌洗液中之分离、临床观测/计分值、血清学、死亡率、平均每日增加(ADG)及直肠温度。
结果：
在验尸报导记录上记录肺部病理学之一般描述及每一肺叶中之病理学百分比。藉由总和每一肺叶之肺部病理学百分比来确定每只猪之肺部病理学总百分比。附录中包括个别肺部病变计分值。概括性统计学列于表24中。使用3型测试及最小均方差值，在混合程序中使用SAS来分析肺部计分值；处理及空间由于圈养限制而混乱。在与攻毒对照组相比时，两个接种疫苗之组中具有统计学上显著较低之肺部计分值。未提交组织病理学。
表24：具有个别值散布图之肺部计分值概括统计学
在评估肺部之病理学之后，由研究者或指定人员自每一组肺收集肺部灌洗样本。藉由PCR、qPCR及VI测试肺部灌洗样本之PRRSV。基于qPCR，所有BAL样本对于攻毒病毒而言均为阳性的。在BAL中检测之病毒量在统计学上无差异。
在D0、D7、14、22、D28及D36收集血液。自每一管收获血清且转移至低温小瓶中用于保留且转移至HMC中用于测试。将BIVI-Ames处之血清样本保持在2-8℃下直至测试且保持在-70±10℃下用于保留。
血清样本系用于使用市售测试(PRRSELISA)之PRRSV抗体。ELISA结果记录为样本与阳性(S/P)比。S/P比≥0.4被认为系阳性。结果展示于图6中。
由PCR及qPCR测试对于PRRSV而言之病毒血症。结果报导为阳性或阴性，其使用用于任何PRRS病毒之通用引物。接种疫苗后在任意时间点单次发生病毒血症将猪分类为病毒血症阳性。藉由使用经特定设计用以在不检测每一疫苗病毒之情形下检测攻毒144PRRS病毒之引物的qPCR测试来确定PRRS病毒之相对拷贝数。使用3型检验及最小均方差值，在混合程序中使用SAS来分析定量数据；处理及空间由于圈养限制而混乱。在第29天，W96117#9p42接种疫苗组之血清中具有比攻毒对照组显著较少之病毒(p-值＝<0.0001)。在第36天，经INGELVACMLV接种疫苗之组比攻毒对照组具有显著较少之病毒血症(p-值＝0.0089)。结果展示于图7中。
临床观测
由研究者或指定人员自攻毒前一天(D27)至验尸当日(D36)每天观测猪之总体健康状况及与PRRS疾病相关之临床征象。特定而言，每天检查猪之呼吸、行为及咳嗽，每一类正常定级为0且异常定级为1。结果展示于图8中。
自D22至D36，每天获取直肠温度。使用JMP8.0学生检验分析数据。在比较经W96117#9p42疫苗接种疫苗之组的温度反应时，平均温度与攻毒对照组相比在第22至25天显著较高，且在第26、33至35天显著较低。在比较经接种疫苗之组时，在第24天及第29天具有比攻毒对照猪显著较高之平均温度；在第22、33至35天之平均温度显著较低。在此研究中，攻毒对照组之一只猪在第35天时由于发病而被施以安乐死。结果展示于图9中。
在第0天、第22天及第36天对动物进行称重。计算接种疫苗期间及攻毒期间之总的平均重量增加。使用3型测试及最小均方差值，在混合程序中使用SAS来分析重量增加数据；处理及空间由于圈养限制而混乱。经INGELVACMLV接种疫苗之组与攻毒对照组相比在接种疫苗期间具有统计学上较低之增加(p-值＝<0.0001)且在攻毒期间具有统计学上较高之增加(p-值＝0.0039)。W96117#9p42组在攻毒期间具有比攻毒对照组显著较高之增加(p-值＝<0.0001)。结果展示于图10中。
论述：
此研究之目标在于评估INGELVACMLV及实验疫苗在呼吸道攻毒模型中针对最近之NA-PRRSV攻毒分离株的功效。攻毒分离株具有高度毒性且产生极高(高达100％之肺部病变计分值，指示肺炎)肺部病变及明显之临床疾病，包括重量损失及死亡。
在毒性攻毒存在下评估两种疫苗之功效。通常推荐在预期攻毒期之前4周对猪接种疫苗。然而，在此研究中，在接种疫苗后22天时对猪进行攻毒。两种疫苗均导致统计学上显著减少之肺部病变，重量增加在攻毒后之时期内得以改良且病毒血症在攻毒后减少。
在此研究之过程中，研发一种特定半定量性PCR来特异性检测144攻毒病毒。以此工具，血清病毒血症数据可对攻毒病毒具特异性且不检测疫苗病毒。证实未经接种疫苗之组在移至具有经接种疫苗之动物之室中之后在攻毒期间无可检测之疫苗病毒。
实施例4：Wetzel预减毒(p3Wetzel(SEQIDNO:1之核苷酸序列))与Wetzel减毒((SEQIDNO:2之核苷酸序列))之核苷酸及由其编码之蛋白质序列
核苷酸序列
此研究之目的在于为PRRSV分离株预减毒Wetzel病毒株(p3)及减毒后疫苗Wetzel病毒株(p41)提供PRRSV全基因组序列。预减毒及减毒后疫苗病毒株之基因组测序可提供有助于理解病毒适应性之生物决定子及病毒恢复所需之界限的重要信息。注意，尽管PRRSV病毒系单链RNA病毒，但本文揭示DNA等效物(其中T取代实际RNA病毒序列中之U)与NCBIGenBank用法一致。
基因组测序
采用一种病毒宏观基因组学方法，其中使每种PRRS病毒之组织培养物质经受病毒颗粒保护之核酸提取及随机引发扩增子之454-测序。总计尝试6种病毒株：1-4-4(资料未展示)、第3次传代Wetzel(p3)、p10Wetzel、p20Wetzel、p30Wetzel、p40Wetzel及疫苗病毒株p41Wetzel。在7次尝试中，对于6种病毒株之完全/近完全基因组分析实现充分测序，其中p20Wetzel失败。表25显示每种分离株之序列数及平均覆盖深度。获得高百分比之PRRSV序列且在任何样本中均未检测到其它病毒。p3Wetzel及p41Wetzel之基因组序列在下文中分别列为序列ID1及2。
表25：测序概述
减毒之组分
对在减毒期间测试之每次传代时经修饰或具多态性的那些位置进行详细分析；基于测序数据，在疫苗病毒株中确定无大规模之缺失。如表26中概述，在p3与p41之间识别33个点突变，大部分(19/33)系沉默的或具多态性。
表26：p3相对于p41之变化概述
参考位置 基因 核苷酸变化 多态性/取代 氨基酸变化
931 ORF1a C>T 取代 沉默
936 ORF1a G>GT 多态性 R252R/L
938 ORF1a G>CG 多态性 V253L/V
1147 ORF1a T>C 取代 沉默
2047 ORF1a T>C 取代 沉默
2137 ORF1a C>T 取代 沉默
2916 ORF1a A>G 取代 Y912C
3011 ORF1a C>T 取代 沉默
3151 ORF1a T>CT 多态性 沉默
3450 ORF1a C>T 取代 A1090V
3896 ORF1a T>C 取代 沉默
5626 ORF1a C>T 取代 沉默
5713 ORF1a C>T 取代 沉默
5797 ORF1a C>T 取代 沉默
6449 ORF1a A>T 取代 T2090S
6769 ORF1a T>A 取代 沉默
6947 ORF1a A>C 取代 K2256Q
7345 ORF1b A>G 取代 T16A
7602 ORF1b C>T 取代 沉默
8364 ORF1b T>A 取代 沉默
8379 ORF1b C>T 取代 沉默
9957 ORF1b G>A 取代 沉默
10361 ORF1b A>G 取代 D1021G
10894 ORF1b C>T 取代 R1199W
11976 ORF2a A>G 取代 K102R
12693 ORF3 C>T 取代 沉默
12721 ORF3 T>C 取代 F143L
12722 ORF3 T>GT 多态性 F143F/C
12968 ORF3 C>T 取代 A225V
13398 ORF5 A>T 取代 K4N
13876 ORF5 G>A 取代 G164R
13964 ORF5 C>T 取代 S193L
14098 ORF6 T>C 取代 L42S
蛋白质序列：
来自Wang等人(22)(删除内部参考；明确以引用方式并入本文中)：PRRSV系一种包括编码九个ORF之约15kb基因组的小包膜单一正链RNA病毒。PRRSV基因组包含两个聚合酶基因(ORF1a与1b)及七个结构基因(ORF2a、2b、3、4、5、6及7)。ORF1a与ORF1b占病毒基因组之约75％，且由翻译为大的聚合蛋白质之核糖体框架移位方法来表征；其自身裂解产生包括RNA依赖型RNA聚合酶之非结构蛋白质(NSP)。开放阅读框架2a、3、4及5均编码糖基化蛋白质，分别指定为GP2a、GP3、GP4及GP5。最新定义之ORF2b编码指定为GP2b之病毒颗粒的最小蛋白质。ORF7编码非糖基化核衣壳蛋白质(N)，占病毒颗粒之蛋白质含量的20-40％。ORF6编码类似非糖基化基质蛋白质(M)。
鉴别由SEQIDNO:1及2之核苷酸序列编码之多肽，且示于如下：
由SEQIDNO:1编码之p3Wetzel蛋白质序列
由SEQIDNO:2编码之不同于p3序列之p41减毒Wetzel蛋白质
序列
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以下参考文献以对本文所述之内容提供例示性程序或其它详细补充之程度而具体以引用的方式并入本文中。
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根据本发明，在无需过度实验之情况下，可制造并执行本文中所揭示且主张之所有组合物及方法。虽然已依照优选实施方案描述本发明之组合物及方法，但本领域技术人员将显而易见，在不偏离本发明之概念、精神及范畴之情况下，可对本文所述之组合物及方法及该方法之步骤或步骤次序施加变化。更特定而言，将显而易见，在可达成相同或类似之结果的情况下，可用化学上与生理学上均相关之某些试剂替代本文所述之试剂。认为本领域技术人员易于了解之所有该等类似替代及修改在如下文申请专利范围所定义之本发明之精神、范畴及概念的范围内。

Claims (20)

1.一种猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的免疫原性组合物，其包含以下至少之一
a)包含多核苷酸的组合物，所述多核苷酸为
i)SEQIDNO:1的多核苷酸(预减毒Wetzelp3)，或
ii)SEQIDNO:2的多核苷酸(减毒Wetzelp41)；
b)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的多核苷酸的免疫原性片段；
c)选自由以下组成的组的多肽
i)SEQIDNO:3(Wetzelp3的ORF1a蛋白)、
ii)SEQIDNO:4(Wetzelp3的ORF1b蛋白)、
iii)SEQIDNO:5(Wetzelp3的GP2蛋白)、
iv)SEQIDNO:6(Wetzelp3的GP3蛋白)、
v)SEQIDNO:7(Wetzelp3及Wetzelp41的GP4蛋白)、
vi)SEQIDNO:8(Wetzelp3的GP5蛋白)、
vii)SEQIDNO:9(Wetzelp3及Wetzelp41的M蛋白)、
viii)SEQIDNO:10(Wetzelp3及Wetzelp41的N蛋白)、
ix)SEQIDNO:11(Wetzelp41的ORF1a蛋白)、
x)SEQIDNO:12(Wetzelp41的ORF1b蛋白)、
xi)SEQIDNO:13(Wetzelp41的GP2蛋白)、
xii)SEQIDNO:14(Wetzelp41的GP3蛋白)及
xiii)SEQIDNO:15(Wetzelp41的GP5蛋白)；或
d)SEQIDNO:3-15的多肽的免疫原性片段。
2.一种分离的多核苷酸，其包含如下的多核苷酸，
a)具有SEQIDNO:1(预减毒Wetzelp3)或SEQIDNO:2(减毒Wetzelp41)的核酸序列；
b)具有编码SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的多肽的核酸序列；
c)具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:295％相同且编码具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的多肽的生物学或免疫有效活性的多肽的核酸序列；
d)是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列的片段，其包含SEQIDNO:1的至少30个邻接核苷酸序列，或
e)是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列的片段，其包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的至少30个邻接核苷酸序列且编码SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列的免疫有效活性。
3.一种分离的多肽，其包含如下的多肽
a)具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列；
b)具有与SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:1595％相同的氨基酸序列且具有分别由SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15编码的多肽的生物学或免疫有效活性；
c)是SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列的片段，其分别包含SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的至少15个邻接氨基酸；
d)是SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列的片段，其分别包含SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的至少15个邻接氨基酸，且具有免疫有效活性；或
e)是由包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2序列中所包括的至少15个连续核苷酸的多核苷酸编码的蛋白质片段。
4.一种分离的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，其包含
a)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列，或
b)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:295％相同的核酸序列，其编码具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的多肽的生物学或免疫有效活性的多肽。
5.权利要求4的PRRSV，其包含PRRSV的减毒、非毒性形式。
6.一种用于治疗或预防毒性PRRSV感染的疫苗，其包含权利要求4的PRRSV的杀死的或减毒形式。
7.一种用于治疗或预防毒性PRRSV感染的疫苗，其包含权利要求4的PRRSV的杀死的或减毒形式的亚单位。
8.一种免疫原性制剂，其包含免疫有效量的权利要求3的多肽及医药学或兽医学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
9.一种在哺乳动物中产生免疫反应的方法，包括施用免疫有效量的权利要求4的PRRSV。
10.一种在哺乳动物中产生免疫反应的方法，包括施用免疫有效量的权利要求3的多肽。
11.一种用于治疗或预防毒性PRRSV感染的疫苗，其包含权利要求4的PRRSV的杀死的或减毒形式。
12.一种用于治疗或预防毒性PRRSV感染的亚单位疫苗，其包含权利要求3的多肽。
13.一种免疫原性制剂，其包含免疫有效量的权利要求3的多肽及医药学或兽医学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
14.一种在哺乳动物中产生免疫反应的方法，包括施用免疫有效量的权利要求11的疫苗。
15.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物是猪。
16.权利要求14的方法，其中所述疫苗对由PRRSV感染引起的疾病提供保护性免疫。
17.一种分离的抗体，其特异性地结合由具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列的多核苷酸编码的PRRSV多肽，所述多肽具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列，且其中所述抗体不结合由不同PRRSV毒株编码的多肽。
18.一种包含权利要求2的多核苷酸的载体或质粒。
19.一种包含权利要求18的载体的宿主细胞。
20.一种表达权利要求17的抗体的杂交瘤。
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