MX2011000269A - Metodo, kit y sistema para conteo de celulas cultivables. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método, kit y sistema para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables, tales como E. Coli, PS. Aeroginosa o una mezcla de células microbianas (por ejemplo, para conteo microbiano total) en una muestra probada, el método comprende (i) poner en contacto la muestra probada, susceptible de portar células microbianas cultivables con al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con la membrana de la célula microbiana, el contacto es para un primer periodo de tiempo predeterminado (T1) que será suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida desde la muestra esencialmente alcanza un plató; (ii) retirar de la muestra probada el agente emisor de señales no internalizado; (iii) durante un segundo periodo de tiempo (T2), seguir el primer periodo de tiempo (T1), y en el cual la señal se mantiene esencialmente en el plató, detectar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra, las células cultivables emisoras de señales, la detección se basará en la selección de los parámetros predeterminados para las células cultivables; y (iv) determinar, con base en los objetos emisores de señales seleccionados, un valor cuantitativo indicativo del número de células cultivables en la muestra probada. El kit comprende uno o más de los agentes emisores de señales y las instrucciones para utilizar el mismo. También se proporciona un dispositivo para almacenamiento de programas legible por máquina, que incorpora tangiblemente un programa de las instrucciones ejecutables por la máquina para realizar el método y un programa de computadora que comprende medios del código de programa de computadora para realizar el método.

Description

MÉTODO, KIT Y SISTEMA, PARA CONTEO DE CÉLULAS CULTIVABLES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos, kits y sistemas para la medición cuantitativa de una cantidad de células en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La siguiente es una lista de la técnica que se considera será pertinente para describir el estado de la técnica en el campo de la invención. (1) Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO06/065350 (Kimberly Clark Worldwide Inc.) (2) Solicitud de Patente Europea No. 0612850 (Nihon Millipore Kogyo KK) ; (3) Patente de los Estados Unidos No. 5,258,285 (Foss Electric Holding AS) ; (4) Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2008014607; (5) Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO92/02632 (Sierra Cytometric) ; (6) Jones, D. L., M . A. Brailsford, and J.-L. Drocourt. 1999. Solid-phase, láser- scanning cytometry: a new two-hour method for the enumeration of microorganisms in pharmaceutical water. Pharmacop. Forum 25:7626-7645.

La medición cuantitativa de entidades biológicas en muestras, en particular muestras líquidas, es importante para determinar el grado de contaminaciones, infecciones, estado de una enfermedad, etc. Por ejemplo, en microbiología, la medición del número de bacterias u hongos se proporciona por la unidad formadora de colonias (UFC/ml) .

Mientras que los microorganismos incluyen formas de esporas, microorganismos inactivos (no cultivables) y reproducibles, es importante tener medios para la cuantificación de sólo los microorganismos reproducibles. Por ejemplo, la cuantificación de microorganismos reproducibles es uno de los problemas principales en los procesos para control de calidad de las industrias de alimentos y bebidas, la elaboración de artículos que entran en contacto con el consumidor tales como, productos farmacéuticos y cuidado personal, protección ambiental de sistemas acuáticos tales como, ríos, lagos y océanos, seguridad pública (por ejemplo, monitoreo bacteriológico de sistemas de agua municipales, pozos, aguas para recreación tales como, piscina, albercas y playas etc.) diversos procesos industriales, infecciones asociadas con el cuidado de la salud y la provisión de cuidado médico.

La cuantificación de microorganismos para división (cultivables) típicamente es un procedimiento de laboratorio con base en un desarrollo para cultivo de bacterias. Es necesario que se mantengan las condiciones especificas para el desarrollo microbiano en medios sólidos y líquidos durante largos periodos de incubación al término de los cuales se determina una UFC (UFC/ml) . En el laboratorio, la UFC típicamente se calcula al normalizar el número total de colonias contadas de acuerdo con el número de diluciones y el volumen de la muestra. Esta metodología requiere equipo de laboratorio, personal cualificado y largos períodos de tiempo largo que pueden variar de un día a un mes. No obstante, el trabajo laborioso y que lleva tiempo implicado con esto, la UFC es el estándar actual aceptado por los cuerpos reguladores para el conteo de microorganismos.

La técnica proporciona diversos métodos para la detección de microorganismos en muestras probadas, los cuales, como una alternativa al conteo de células, utilizan marcado con color o fluorescente.

Se proporciona, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente internacional No. O06/065350 (Kimberly Clark Worldwide Inc.) describe un método para detectar semi-cuantitativa o cuantitativamente la presencia de un microbio en una muestra. El método utiliza un tinte de prueba que experimenta un cambio de color detectable en presencia de uno o más microbios. Por ejemplo, el tinte de prueba es un tinte solvatocrómico (por ejemplo, tinte de Reichardt) que responde a las diferencias de polaridad entre los componentes microbianos (por ejemplo, la membrana celular, citoplasma, etc.) y el entorno fuera de la célula.

La patente europea No. EP0612850 describe un método para determinar un conteo de célula microbianas viable en una solución de muestra, que comprende filtrar la solución de muestra a través de una membrana de filtración que tiene propiedades hidrofóbicas para atrapar microbios dentro de las barreras hidrofóbicas; aplicar a la misma un rocío fino de reactivo de extracción de ATP para extraer un ingrediente luminiscente de los microbios; aplicar a la misma otro rocío fino de un reactivo inductor de luminiscencia líquido para que el ingrediente luminiscente extraído permita que el ingrediente emita luminiscencia; y medir el nivel de la luminiscencia, utilizando un medio competente para medir el nivel de luminiscencia.

La patente de los Estados Unidos No. 5,258,285 describe un método para determinar el número de bacterias en una población celular que comprende bacterias y células somáticas.

La publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. US2008/014607, describe un método a base de bioluminiscencia para detectar y contar células vivas de una especie determinada potencialmente presentes en una muestra liquida, que comprende medir el total del contenido de nucleótidos de adenilo (AN, por sus siglas en inglés) intracelular libre total, expresado en forma ATP, de células vivas de una especie no viral determinada.

La publicación de la solicitud de patente internacional No. WO92/202632 describe un proceso para la detección, identificación, y/o enumeración de células viables en leche bovina donde las células viables se marcan selectivamente con un tinte fluorescente (por ejemplo, tintes esterasa-dependientes , tintes de unión con ácido nucleico, y tintes que detecten la actividad oxidativa intracelular) y luego se identifican y/o cuentan.

La patente de los Estados Unidos. No. 7,312,073 describe un método para la cuantificación de células viables, donde un precursor liquido sol-gel que incorpora un marcador se hace traspasar como un recubrimiento de capa fina sobre un porta-objetos. El porta-objetos entra en contacto durante un periodo de incubación con un filtro que contiene microorganismos que se separan de una muestra de prueba. Durante el periodo de incubación se presenta la absorción del marcador/marcadores por los microorganismos. El portaobjetos luego se irradia y se detecta la señal emitida del marcador contenido en los microorganismos para generar una imagen para la enumeración de detección del microorganismo.

Además se describe por Jones, et al {Pharmacop . Forum 1999, 25, 7626-7645) , un método de dos horas para el conteo de microorganismos en agua farmacéutica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en la explotación de dinámicas de membrana celular de acuerdo con las cuales las células cultivables (que se dividen) continuamente experimentan tráfico de membranas. Actualmente los inventores han previsto que en células microbianas cultivables, la membrana celular se internaliza, se fusiona con el compartimiento membranoso interno y luego se vuelve a incorporar en la membrana a una velocidad que es mucho mayor que en células que no se dividen.

La presente invención particularmente se basa en el hallazgo de que la tinción de células microbianas con un tinte fluorescente que se puede asociar con -la membrana e internalizar en el compartimiento intracelular de la célula microbiana, da por resultado la acumulación del tinte dentro de la célula. Este proceso de internalización tiene un perfil característico donde después de un primer período de tiempo, TI, la acumulación alcanza una meseta fija y la cantidad acumulada permanece fija en esta meseta durante un segundo período de tiempo, T2 característico.

Además, la presente invención se basa en el hallazgo de que para un tipo de célula microbiana determinada o un grupo de células microbianas, el primer periodo de tiempo TI y el segundo periodo de tiempo T2 son característicos para el tipo de células. En otras palabras, TI y T2 permanecerán esencialmente constantes para un tipo de célula determinado (o grupo de células) cuando se mide bajo las mismas condiciones, predefinidas.

De esta forma, la presente invención proporciona, de acuerdo con un primer aspecto, un método para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el método comprende : (i) poner en contacto la muestra probada, susceptible de portar células microbianas cultivables con al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con la membrana de la célula microbiana, el contacto es durante un primer periodo de tiempo predeterminado (TI) que sea suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida de la muestra esencialmente alcance una meseta; (ii) retirar de la muestra probada el agente emisor de señales no internalizado; (iii) durante un segundo período de tiempo ( T2) , después del primer periodo de tiempo (TI) , y en el cual la señal se mantiene esencialmente en la meseta, detectar a partir de los objetos emisores de señal dentro de la muestra las células cultivables emisoras de señales, la detección está basada en los parámetros de selección predeterminados para las células cultivables; y (iv) determinar, con base en los objetos emisores de señales seleccionados, un valor cuantitativo indicativo del número de células cultivables en la muestra probada.

La invención también proporciona un kit para determinar un valor cuantitativo equivalente al número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el kit comprende: (i) al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con una membrana de la célula microbiana, (ii) las instrucciones para poner en contacto al menos un agente emisor de señales con la muestra durante un primer periodo de tiempo (TI) que sea suficiente para la internalizacion del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida de la muestra alcance esencialmente una meseta; (iii) las instrucciones para retirar de la muestra el agente emisor de señales no asociado; (iv) las instrucciones para detectar y seleccionar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra las células cultivables emisoras de señales, la detección se basará en los parámetros de selección predeterminados para las células cultivables, la detección y selección que serán durante un segundo periodo de tiempo (G2), después del TI, y en el cual la señal se mantiene esencialmente en la meseta; (v) las instrucciones para uso de los objetos emisores de señales seleccionados para determinar a partir de los mismos un valor cuantitativo indicativo del número de células cultivables en la muestra probada.

Además, la invención proporciona un sistema para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el sistema comprende: (i) un portador para contener la muestra y permitir el contacto de una muestra con uno o más agentes emisores de señales ; (ii) un detector para detectar los objetos emisores de señal dentro de la muestra, y dar salida- a los datos correspondientes a los mismos; (iii) una unidad de memoria que comprende una base de datos con los parámetros de selección predeterminados y una pluralidad de factores de normalización predeterminados, cada parámetro de selección y cada factor de normalización serán específicos para una célula microbiana o para un grupo de células microbianas; (iv) una unidad de procesamiento para recibir los datos de salida provenientes del detector, uno o más de los parámetros y el factor de normalización proveniente de la unidad de memoria y procesar los datos de salida con los parámetros y el factor de normalización para determinar el valor cuantitativo indicativo del número de las células microbianas cultivables en la muestra.

Además, se proporciona por la invención un dispositivo para almacenamiento de programas legible por máquina, que incorpora tangiblemente un programa de instrucciones ejecutables por la máquina para realizar un método para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el método comprende: (i) poner en contacto la muestra probada, susceptible de portar células microbianas cultivables con al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con la membrana de la célula microbiana, el contacto es durante un primer periodo de tiempo predeterminado {TI) que sea suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida de la muestra alcance esencialmente una meseta; (ii) retirar de la muestra probada el agente emisor de señales no internalizado; (iii) durante un segundo periodo de tiempo (T2) , después del primer periodo de tiempo (TI) , y en el cual la señal se mantiene esencialmente en la meseta, detectar y seleccionar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra las células cultivables emisoras de señales, la detección se basará en los parámetros de selección predeterminados para las células cultivables; y (iv) determinar, con base en los objet'os emisores de señales seleccionados, un valor cuantitativo indicativo del número de células cultivables en la muestra probada.

Además, se proporciona un programa de computadora que comprende medios de código de programa de computadora para realizar todos los pasos de la invención, cuando el programa se corre en una computadora, el-., programa de computadora se incorporará en un dispositivo para almacenamiento de programa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Para comprender la invención y ver la forma en que se puede llevar a cabo en la práctica, ahora se describirán las modalidades, a manera de ejemplo no limitante únicamente, con referencia a los dibujos anexos, en los cuales: la figura 1, es un gráfica que muestra la intensidad de fluorescencia como una función de tiempo de las muestras que comprenden una mezcla de células bacterianas derivadas de aguas municipales (- ¦ -) , E. coli aislada (- ? -), y Ps. aerugínosa (- ? -) , teñidos con tinte fluorescente FM1-43; la figura 2, es una gráfica que marca el conteo de UFC/ml de células microbianas en una muestra contra una medición cuantitativa de la cantidad de células microbianas en una misma muestra, la medición cuantitativa se obtendrá mediante el método de la invención.

Las figuras 3A, 3B, son gráficas que muestran la correlación entre el conteo de UFC/ml obtenido mediante el método convencional (UFC/ml estándar) y un equivalente de UFC obtenido de acuerdo con una modalidad de la invención (figura 3A) asi como la correlación entre cada valor (equivalente de UFC y UFC/ml convencional) por muestra probada (figura 3B) .

Los resultados en la tabla 2, también se marcan en una gráfica, proporcionada como la figura 3A (? que representa el equivalente de ÜFC , ¦ que representa la UFC estándar) , con la correlación entre el equivalente de UFC y la UFC estándar representadas en la figura 3B.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En general, la presente invención proporciona los métodos, kits y sistemas para medir cuantitativamente la cantidad de células microbianas cultivables en una muestra, típicamente una muestra líquida, en un término de varios minutos después de que la muestra se tiñe con un agente emisor de señales convencional.

Las técnicas para conteo de células microbianas convencionales, tales como el conteo en placa heterotrópica (HPC) analizado más adelante, que típicamente requiere el cultivo de células microbianas durante muchas horas para distinguir entre las células muertas y las células microbianas cultivables y contar sólo las células cultivadas. Algunas de las células microbianas cultivables se identifican como unidades formadoras de colonias (UFC/ml) . Contra esto, la presente invención permite, dentro de unos cuantos minutos, el conteo de únicamente células microbianas cultivables, para proporcionar un valor cuantitativo que sea equivalente con la UFC. La invención, de esta forma, permite un equivalente de UFC, mientras que acorta el tiempo y reduce los costos requeridos en comparación con los métodos convencionales. Mientras que el equivalente de UFC de la invención se correlaciona con las- mediciones de las unidades formadoras de colonias convencionales (tales como, HPC) , puede existir alguna desviación y cualquier desviación no excederá una diferencia de más del 30%, de preferencia no más del 10% y de mayor preferencia, no más del 5%.

En el contexto de la invención el término "célula microbiana cultivable" o "célula cultivable", se utiliza para denotar cualquier célula (por ejemplo, célula madre) de tamaño microscópico o ultramicroscópico que cuando se coloca en un medio adecuado y controlado se pueda dividir en dos células (hijas) . Por consiguiente, el termino "célula microbiana no cultivable" denota células, incluso si son viables, que cuando se colocan en condiciones de cultivo, no se dividen y no se pueden dividir en células hijas.

Las células microbianas pueden incluir, sin limitarse a las mismas, bacterias, tales como, bacterias Coliformadoras (E. coli) , Enterobacterias {salmonella , listeria, shigella) , grupo de Pseudomonas {pseudomonas auriginosa , pseudomonas fluorescensa) , grupo de Staphylococcus (staphilococus aureus , streptococcus fecalis) , grupo de Streptococcus y Metanobacteria, etc. ; mohos tales como Aspergillus niger, el grupo penicillium, etc.; levaduras, tales como el grupo Candida, el grupo Sachramises, etc.; protozoarios, tales como el grupo Cryptosporidium, el grupo Giardia, Amoeba etc.; algas tales como algas verdes, etc.; bacterias acidofilicas (TAB) ; el grupo legionella; la especie Vibrio; y otros.

La invención puede tener diversas aplicaciones, de preferencia aunque no exclusivamente, cuando haya una necesidad de una identificación y cuantificación esencialmente inmediata de contaminaciones microbianas en muestras, por ejemplo, agentes (patogénicos) que provocan enfermedades. Como un ejemplo, el método de la invención se puede aplicar para la medición cuantitativa de la cantidad de células microbianas en el agua para beber. "'Algunas otras aplicaciones pueden estar relacionadas con la microbiología industrial (por ejemplo, las células presentes en alimentos o bebida, el cuidado personal, los procesos industriales y las infecciones asociadas con el cuidado de la salud) , sistemas acuáticos (agua potable, agua para proceso, agua residual, fuentes de agua natural, aguas para recreación tales como, piscinas, albercas y playas etc.), microbiología médica (muestra de plasma, saliva, orina, garganta, fluidos gastrointestinales) , microbiología ambiental (suelo, superficies aéreas) etc.

Como se indicó anteriormente, la solución proporcionada por la presente invención para la determinación casi en tiempo real de la cantidad de células microbianas cultivables en una muestra se basa en la explotación del tráfico de membranas, o el movimiento de la membrana celular hacia el compartimiento intercelular, que se lleva a cabo en células cultivables a un grado que sea, en un factor 1.5, 3, 6, 12 e incluso hasta 20, mayor que el que se presenta en células viables, aunque, no cultivables. Las células no cultivables pueden incluir, por ejemplo, esporas, células anabióticas, etc. Como tal, de esta forma se planteo como hipótesis por los inventores que si es posible teñir una membrana de la célula con un agente emisor de señales que se asocia con la membrana y presenta tráfico de membrana, entonces, el agente emisor de señales se acumulará a un grado mayor en las células cultivables en comparación con las células no cultivables y con esto dará lugar a una señal más fuerte proveniente de estas células cultivables.

Los términos "esencialmente inmediatos" o "inmediatamente" o "casi en tiempo real" denotan una ventana de tiempo de menos de 20 minutos, de preferencia, menos de 15 minutos, de mayor preferencia, menos de 10 minutos a partir del inicio del método de la invención hasta que se capture al menos una imagen de la muestra probada a partir de la cual el equivalente de UFC de acuerdo con la invención se pueda deducir (típicamente y de preferencia mediante procesamiento de imágenes), como se analizará adicionalmente más adelante. En otras palabras, el método de la invención es tan inmediato que no requiere largo plazo (horas) para cultivar células para determinar el número de células cultivables en una muestra probada.

De esta forma, de acuerdo con un primer aspecto, la invención, proporciona un método para determinar un valor cuantitativo indicativo del conteo celular de células microbianas cultivables en una muestra probada, el método comprende : (i) poner en contacto la muestra probada, susceptible de portar las células microbianas cultivables, con al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con la membrana de la célula microbiana, el contacto es durante un primer periodo de tiempo predeterminado (TI) que sea suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida de la muestra alcance esencialmente una meseta; (ii) retirar de la muestra probada el agente emisor de señales no internalizado; (iii) durante un segundo periodo de tiempo (T2) , después del primer periodo de tiempo (Ti) , y en cual la señal se mantiene esencialmente en la meseta, detectar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra las células cultivables que emiten la señal, la detección se basará en los parámetros de selección predeterminados para las células cultivables; y (iv) determinar, con base en los objetos emisores de señales seleccionados un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en la muestra probada .

El método de acuerdo con la invención comprende proporcionar la muestra susceptible de portar células microbianas cultivables con condiciones que permitan el cultivo de las células. Las condiciones se pueden determinar fácilmente por aquellos versados en la técnica con base en la técnica disponible y típicamente dependerán del tipo de células microbianas o grupo de células microbianas que se sospeche estén presentes en la muestra. Por ejemplo, las condiciones pueden ser similares o idénticas a aquellas requeridas para HPC.

La muestra probada puede ser un líquido, semilíquido así como también algo seco. Cuando la muestra es una muestra líquida se puede secar antes de iniciar el análisis para determinación. No es necesario que la muestra alcance una sequedad total, aunque para retirar al menos una porción del líquido de la misma, para concentrar las células en la muestra, recibir un concentrado celular.

La concentración de células microbianas en muestras líquidas puede utilizar cualquier medio disponible en los laboratorios biológicos. Estos incluyen, sin limitación al mismo, filtrar la muestra vía filtros adecuados, centrifugación, y otras técnicas de secado.

La muestra (ya sea como se recibe o después de retirar de la misma al menos una porción del liquido) se tiñe con uno o más agentes emisores de señales. El término "agente emisor de señales", en el sentido en el que se utiliza en la presente, denota cualquier entidad química que bajo condiciones adecuadas emita una señal detectable. El agente emisor de señales puede ser un agente emisor de luz, por ejemplo, agentes colorimétricos , o un agente emisor de luminiscencia, el último será, por ejemplo fotoluminiscencia (incluyendo fluorescencia o fosforescencia), quimioluminiscencia , radioluminiscencia , termoluminiscencia; o cualquier otro agente emisor de señales conocido en la técnica para marcado celular.

Los ejemplos de entidades emisores de luminiscencia que se pueden utilizar de acuerdo con la invención comprenden, sin limitarse a los mismos, bioluminiscentes entre los que se incluyen agentes a base de luciferina (por ejemplo, 6-0-beta-galactopiranosil luciferina) , fluorescentes entre los que se incluyen miembros de la familia Alexa Fluor (Invitrogen) , tintes PromoFluor (PromoKine), HiLyte Fluors (AnaSpec) , DyLight Fluors (Pierce, Thermo Fisher Scientific) , y la serie ATTO Dye (ATTO-TEC y Sigma-Aldrich) . Aquellos versados en la técnica deben apreciar que se pueden utilizar de acuerdo con la invención una amplia variedad de agentes fluorescentes u otros luminiscentes.

En una modalidad, el agente comprende una porción luminiscente, de preferencia, una fluorescente conjugada con un enlazante lipofilico que permita la asociación, por ejemplo, la incrustación de al menos una porción del agente con la membrana de las células cultivables y mediante esto la internalización del agente en la célula como resultado del tráfico de membranas.

La asociación del agente emisor de señales con la membrana celular de las células cultivables típicamente no es específica y es un resultado de la lipofilicidad del agente (por ejemplo, debido al enlace de una porción luminiscentes con el enlazante lipofilico) . De esta forma, típicamente se utilizada un agente emisor de señales no específico para obtener un conteo total de bacterias cultivables (TCBC) .

La invención también permite la obtención de un conteo celular de un tipo específico de célula microbiana cultivable en una muestra que tenga incluso una mezcla de microorganismos. Esto se puede alcanzar utilizando diversos agentes emisores de señales específicos, ya sea solos o en combinación con un agente emisor de señales no específico.

El término "especifico" o especificidad", en el contexto del término "agente emisor de señales especifico" se utiliza para denotar que el agente tiene afinidad y/o unión selectiva con la membrana o con un componente intracelular de un tipo de célula especifica (una célula, se desea la detección de la misma en la muestra) .

Un agente emisor de señales específico puede comprender una porción blanco, es decir, un ligando que tenga especificidad de unión con un componente extracelular de la célula. En una modalidad, agente emisor de señales blanco es tal que se pueda internalizar en la célula cultivable, permitiendo con esto la detección de sólo aquellas que tengan internalizado el agente emisor de señales.

En otra modalidad, el agente emisor de señales blanco (específico) no se internaliza en la célula a la cual se dirige, y la detección de estas células se obtiene mediante la combinación de este agente emisor de señales específico con un agente emisor de señales no específico. Para este fin, el agente emisor de señales no específico proporciona un conteo total de bacterias cultivables y el agente emisor de señales específico proporciona un conteo total de un tipo celular (al cual se une específicamente la señal) . Las señales emitidas desde las imágenes obtenidas con los dos agentes emisores de señales luego se superponen para deducir de sólo aquellas células las que emitan ambas señales, es decir, las que satisfagan ambos criterios de ser cultivables y que sean capaces de unirse al agente especifico .

La especificidad de un agente emisor de señales también se puede alcanzar utilizando entidades enzimáticas (por ejemplo, donde la enzima activa las reacciones intracelulares especificas para un tipo celular) . Estas enzimas pueden incluir, sin limitarse a las mismas, aquellas que actúan en orto-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido para crear un producto para degradación emisor de señales. Esto puede facilitar la identificación de una población celular especifica en una muestra, que tenga la enzima especifica que crea el producto para degradación emisor de señales.

Todavía en un ejemplo adicional, la especificidad (blanco) se puede alcanzar al utilizar un anticuerpo célula específico (monoclonal así como también policlonal) . Los ejemplos de anticuerpos pueden incluir anticuerpos anti-Salmonella los LPS, anticuerpos anti CD18, anticuerpos E. coli LPS (por ejemplo, E. coli J5 LPS) , anticuerpos anti-Salmonella flagellum antígeno, anticuerpos del factor de unión con Anti-£. coli K99. Como un ejemplo todavía adicional, el anticuerpo puede ser un inmunoliposoma (anticuerpo unido a liposomas) .

Todavía en otro ejemplo, la especificidad se puede alcanzar utilizando bacteriófagos (por ejemplo, bacteriófago fluorescente) . Debido a que el método de la invención proporciona un valor cuantitativo en un término de varios minutos, es posible completar el análisis antes de que el bacteriófago fluorescente dañe las células. Como un ejemplo, E. coli se puede detectar y cuantificar utilizando el bacteriófago Lamba Coliphage 1 (LG1).

Un ejemplo de una combinación de agentes emisores de señales no específicos y específicos puede ser, sin limitarse a la misma, una porción luminiscente conj ugada con la proteína de unión con la toxina de cólera B para detectar la especie de cólera, mientras que E. coli se puede cuantificar utilizando una porción luminiscente enlazado a un lipopolisacárido de membrana específica de E. coli, cada uno se utiliza en combinación con un agente emisor de señales no específico tal como, FMl-43 utilizada en los ejemplos.

Se observa que el agente puede emitir constantemente una señal o la señal se puede generar como resultado de un estímulo, tal como, un proceso enzimático que se lleva a cabo dentro del compartimiento intracelular , la reacción enzimática que manipula al agente para emitir la señal o el producto para degradación enzimática emite una señal (como se analizó anteriormente) , un estímulo de radiación, etc.

Durante la etapa de contacto, el agente emisor de señales se asocia con la membrana de las células. En el contexto de la presente invención el término "asociación" denota cualquier tipo de interacción del agente con la membrana de las células; incluyendo, sin limitarse a los mismos, unión electrostática, unión iónica, unión covalente, incrustación de al menos una porción del marcador en la membrana de la célula, unión antigeno-anticuerpo, unión receptor-ligando y lo semejante. En el contexto de la presente invención, el término "asociación" también abarca cualquier agente emisor de señales que ya se haya internalizado en la célula.

El contacto de la muestra susceptible de portar células microbianas cultivables del transporte es durante un periodo de tiempo suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula y suficiente para la acumulación intracelular del agente emisor de señales. Se ha encontrado por los inventores que, debido al tráfico de membranas que se presenta en las células cultivables a un mayor grado que en las células no cultivables, las células microbianas cultivables tienen un mayor grado del agente acumulado dentro de la célula. La diferencia entre la célula no cultivable y la cultivable puede ser en un factor de 1.5, 3, 6, 12 e incluso hasta 20 con respecto a la' cantidad del agente acumulado, bajo condiciones determinadas. Además se ha determinado por los inventores que la acumulación del agente dentro de la célula alcanza una meseta.

El tiempo requerido para que el agente alcance una meseta se define en la presente como "TI". El tiempo TI es característico para un tipo celular y está predeterminado. La predeterminación de TI se puede alcanzar mediante la tinción de un tipo de célula seleccionada con un agente emisor de señales y detectar el cambio en intensidad de señal en el tiempo hasta que prácticamente no haya, cambio en la intensidad de señal. El punto de tiempo a partir del no sea evidente un cambio en intensidad de señal se define como el tiempo en el cual se alcanza la meseta. El término "meseta" en el sentido en el que se utiliza en la presente, denota un nivel de un agente emisor de señales acumulado intracelular que permanezca igual durante al menos 50, 250 e incluso hasta 900 segundos.

Para ilustración, se hace referencia a los ejemplos proporcionados en la presente que muestran que la tinción de la muestra que contiene E. coli aislado con el agente emisor de señales no específico, FM1-43 (Molecular probes production) requiere un TI entre aproximadamente 90 hasta 110 segundos hasta que el nivel de señal capturado alcance un nivel en estado estable; mientras que para una muestra que contiene Ps. aeruginosa aislada teñida también con FM1-43 un TI entre aproximadamente 70 hasta 100 segundos se requirió para alcanzar un nivel en estado estable. Debido a que TI se determina a priori para las células (o grupo de células) susceptibles de estar en una muestra probada, es posible determinar un punto de tiempo para el lavado de los agentes emisores de señales no asociados y de preferencia no internalizados. El lavado del agente se puede alcanzar mediante cualquier técnica conocida en este campo. Esto puede incluir, sin limitarse a los mismos, filtración (por ejemplo, con un filtro microbiano convencional), centrifugación (por ejemplo, superior a 4500 rpm) y cualquier otra técnica que permita la separación de las células de los agentes no asociados disueltos o suspendidos en el liquido de la muestra.

Las células que tengan asociadas a las mismas un agente emisor de señales se detectan como objetos emisores de señales. Sin embargo, como se apreciara, los agentes emisores de señales también se pueden asociar con componentes celulares o con otros artefactos en la muestra que no son células cultivables e intactas y pueden proporcionar una señal falsa. De manera similar, la señal puede provenir del agente emisor de señales agregado (es decir, que no se haya disuelto suficientemente en la muestra) . De esta forma, el método proporciona una herramienta para detectar y seleccionar sólo aquellos objetos emisores de señales que se originan de las células que tengan asociado e internalizado a las mismas el agente. En el contexto de la presente invención, el término "objeto emisor de señales" denota cualquier punto óptico a partir de la muestra probada que emita una señal. El objeto emisor de señales no es necesario que tenga el tamaño de una célula, y de hecho, puede ser mayor, debido a un halo alrededor de la célula formado a partir de la señal emitida de la célula, en especial cuando la imagen de la célula esté fuera de foco ("circulo de confusión") . Esto se provoca por un cono de rayos de luz provenientes de las lentes que no dan un foco perfecto cuando están formando la imagen de una célula emisora de señales. La detección y selección se lleva a cabo después de que la señal alcanza una meseta, en un segundo periodo de tiempo, T2. Este período de tiempo, T2, representa la ventana de tiempo durante la cual la señal emitida del objeto emisor de señales se conserva en la meseta, esencialmente en un estado estable .

Durante T2 se detectan diversos parámetros de señal. Estos parámetros incluyen la intensidad de la señal emitida del objeto emisor de señales, el tamaño del objeto emisor de señales dentro de la muestra probada, la morfología del objeto emisor de señales.

Los criterios de selección requieren una célula microbiana o un grupo de células microbianas en las cuales la intensidad de la señal emitida a partir de los objetos detectados esté al menos por debajo de un umbral superior predeterminado, y en algunas modalidades dentro de una variación de intensidad predeterminada. De esta forma, una intensidad de señal por debajo de un nivel mínimo predeterminado, por ejemplo, emitido a partir de los fragmentos celulares (células muertas y dañadas) o una intensidad de señal por encima de un nivel máximo predeterminado (el umbral superior) , por ejemplo, emitido de los agregados del agente o de los cuerpos no celulares en la muestra, se desecha.

Los criterios de selección también requieren que los objetos emisores de señal tengan una variación de tamaño predeterminado. Esto incluye desechar los objetos por debajo de un umbral mínimo (por ejemplo, si se relacionan con fragmentos celulares) o por encima de un umbral máximo (por ejemplo, a partir de grandes cuerpos en la muestra) .

Además, los criterios de selección pueden requerir que los objetos emisores de señal tengan una morfología predeterminada. Según se aprecia, la morfología celular en general es característica del una especie bacteriana determinada y estas células vienen en una amplia variedad de morfologías. Éstas pueden incluir morfologías esencialmente redondeadas (por ejemplo, Cocí), esencialmente alargadas (por ejemplo, Bacilos) , o similares a bastón, etc. El objeto emisor de señales típicamente podría tener una forma que corresponda (que se asemeje) a la de la célula a partir de la cual se emite. Por ejemplo, un objeto emisor de señal alargado típicamente se podría originar a partir de una célula microbiana alargada. La detección de la forma del objeto permite no sólo desechar los objetos emisores de señales no microbianos (es decir, los artefactos) sino que también facilita la identificación del tipo de célula a partir del cual se emite la señal.

En una modalidad, al menos el parámetro de intensidad y el parámetro de tamaño necesarios se satisfarán para la detección y selección de los objetos emisores de señales .

Se observa que los parámetros de selección pueden variar entre aplicaciones. Por ejemplo, para probar el agua para beber, las variaciones, umbrales y formas seleccionadas pueden ser diferentes de aquellas predeterminadas para probar la calidad del agua, por ejemplo de los lagos.

Los siguientes ejemplos no limitantes muestran que para una mezcla de microorganismos que comprendan al menos E. coli y Ps. aeruginosa se determinó la variación, de tamaño que será un diámetro de 0.8-2 µ??, y el parámetro de intensidad se determinó para que esté por debajo de 254 GL (y dentro de la variación 60-254 GL, no mostrado en los ejemplos) .

En una modalidad, al menos dos parámetros, de preferencia el parámetro de intensidad y el parámetro de tamaño es necesario que se satisfagan para identificar los objetos emisores de señales. Una vez que se identifican los objetos emisores de señales que satisfacen los criterios de selección predeterminados, estos objetos se seleccionan y se deduce a partir del mismo un valor de cuantitativo. En una modalidad, se resume su valor de intensidad de raíz cuadrada media; esta intensidad resumida de preferencia se normaliza con un factor de normalización predeterminado (por ejemplo, al utilizar una ecuación predeterminada (véase más adelante materiales y métodos)), para obtener un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en la muestra (es decir, un equivalente de UFC) . El factor de normalización es especifico para un tipo celular o para un grupo de células, por el tipo de muestra probada (es decir, por aplicación) y se determina con base en las cantidades de las células en las muestras probadas a priori medidas bajo condiciones controladas por aplicación. Por ejemplo, se determina el factor de normalización una vez para el agua para beber de una ubicación geográfica bajo las condiciones de control y al correlacionar los valores obtenidos de las imágenes capturadas como se describe con los conteos de las células obtenidas mediante métodos convencionales, tales como el HPC (UFC/ml) . Este factor de normalización entonces se puede utilizar para una determinación futura de la calidad del agua para beber en esa ubicación (véase materiales y métodos) .

De acuerdo con una modalidad de la invención, un factor de normalización (ecuación) de 0.025x + 0.3375 (x será la escala logarítmica de fluorescencia total) se determinó para una muestra de prueba que comprende una mezcla de E. coli y Ps . aeruginosa.

La invención también proporciona un kit para determinar un valor cuantitativo equivalente con el número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el kit comprende: al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con una membrana de la célula, las instrucciones para poner en contacto al menos un agente emisor de señales con la muestra durante un primer periodo de tempo {TI) que sea suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula a un nivel en el cual la señal emitida desde la muestra alcance esencialmente una meseta; las instrucciones para retirar de la muestra el agente emisor de señales no asociado; las instrucciones para detectar y seleccionar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra las células cultivables emisoras de señales, la detección se basará en los parámetros de selección predeterminados para las células microbianas cultivables, la detección y selección serán, durante un segundo período de tiempo (G2), después de TI, y en el cual la señal emitida desde la muestra se mantenga esencialmente en la meseta; las instrucciones para el uso de los objetos emisores de señales seleccionados para determinar a partir de los mismos el valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en la muestra probada.

El kit también comprende las instrucciones para retirar de la muestra al menos una porción del líquido antes de teñir la muestra con el agente emisor de señales.

De acuerdo con una modalidad de la invención, el kit comprende una pluralidad de agentes emisores de señales. La pluralidad de agentes será característica para una aplicación, es decir, un kit dedicado a probar la calidad del agua municipal para uso en el hogar la cual de esta forma incluirá los agentes específicos para células microbianas que típicamente se encuentran en el agua municipal.

En una modalidad, las instrucciones, incluyen los lineamientos para la selección de células o grupo de células que serán detectados, y también incluye un umbral superior de intensidad de señal y/o una variación de intensidad de señal predeterminada para las células o grupo de células, una variación de tamaño para los objetos que serán detectados, y las morfologías de los objetos emisores de señales predeterminados y las instrucciones para seleccionar aquellos objetos que satisfagan los lineamientos.

Además, de acuerdo con este aspecto particular, el kit puede comprender una o más ecuaciones de normalización, célula específicas predeterminadas, cada una específica para un tipo de célula bacteriana, hongos u otro tipo de células microbianas, y las instrucciones para el uso de la ecuación predeterminada para deducir a partir de la misma el valor cuantitativo del equivalente de UFC.

La invención también proporciona un sistema para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el sistema comprende: un portador para contener una muestra y permitir el contacto de la muestra con uno o más agentes emisores de señales; un detector para detectar la objetos emisores de señales dentro de la muestra, y actualizar los datos correspondientes a la misma; una unidad de memoria que comprende una base de datos con parámetros de selección predeterminados y uno o más factores de normalización célula específicos predeterminados, cada parámetro de selección, cada factor de normalización serán específicos para una célula microbiana o un grupo de células microbianas; una unidad de procesamiento para recibir los datos de salida provenientes del detector, y para recibir proveniente de la unidad de memoria los parámetros de selección y los factores de normalización específicos para una célula microbiana o un grupo de células microbianas y procesar los datos de salida con los parámetros y el factor de normalización, para determinar a partir de los mismos, el valor cuantitativo equivalente al número de células microbianas cultivables en una muestra.

El portador puede ser cualquier receptáculo que pueda contener células biológicas. En una modalidad, el portador comprende un filtro para filtrar al menos una porción del líquido proveniente de la muestra y que contenga la muestra semi-seca o seca.

El detector de acuerdo con la invención típicamente comprende un sistema para formación de imágenes luminiscentes, tal como una cámara que sea capaz de capturar una o más imágenes de las señales luminiscentes emitidas de la muestra probada. Los ejemplos no limitantes de cámaras que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen un dispositivo acoplado por carga (CCD) , un detector CMOS, detector fotodiodo (PD) , un tubo fotomultipliegues (PMT), contadores gamma, contadores de centelleo o cualquier otro dispositivo para captura de señales conocido en la técnica para la formación de imágenes de objetos luminiscentes.

La unidad para procesamiento de imágenes se configura para que reciba una o más imágenes emitidas de la muestra probada e identifique de las mismas, con base en los parámetros de selección de los objetos emisores de señales, el número de células cultivables en la muestra.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "unidad de procesamiento" denota cualquier procesamiento de datos y la utilidad de análisis preprogramada para recolectar los parámetros de señales medidos provenientes de los objetos emisores de señales en la muestra y llevar a cabo el análisis de datos que consiste de la selección de los parámetros de señales de acuerdo con las condiciones predefinidas y la salida de un valor cuantitativo con base en los parámetros de selección seleccionados. Para este fin, la unidad de procesamiento porta un programa basado en computadora configurado para llevar a cabo el análisis.

En una modalidad, la unidad de procesamiento de imágenes se configura para seleccionar, entre objetos emisores de señales, aquellos que tengan una intensidad de señal dentro de una variación predeterminada, un tamaño dentro de una variación predeterminada y una morfología predeterminada; y determinados para los objetos emisores de señales seleccionados, la intensidad de valor de raíz cuadrada media. La unidad de procesamiento además se configura para dar salida a un valor cuantitativo con base en el valor de intensidad de raíz cuadrada media emitido a partir de los objetos seleccionados.

Todavía en una modalidad adicional, la unidad para procesamiento de imágenes se configura para normalizar el valor cuantitativo con un factor de normalización recuperado de la base de datos para obtener un valor normalizado que sea equivalente al conteo UFC/ml.

La invención se ha descrito de una forma ilustrativa, y se debe entender que la terminología que se haya utilizado, pretende estar en la naturaleza de las palabras de la descripción en lugar de la limitación. Obviamente, a la luz de la enseñanza anterior son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención. Por lo tanto, se debe entender que dentro de las reivindicaciones anexas, la invención se puede practicar de otra manera distinta a la descrita específicamente en lo sucesivo .

En el sentido en el que se utilizan en la especificación y reivindicaciones., las formas "uno", "una" y "el" incluyen referencias al singular, así como también al plural a menos que el contexto claramente dicte de otra manera. Por ejemplo, el término "un parámetro de señal" incluye uno o más parámetros.

Además, en el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "que comprende" pretende dar a entender que los métodos, kits y sistemas incluyen los elementos mencionados, aunque no excluyen otros. De manera similar, "que consiste esencialmente de", se utiliza para definir los métodos, kits y sistemas que incluyen los elementos mencionados pero excluyen otros elementos que tengan una significancia esencial en el desempeño de la invención. "Que consiste de", debe significar que excluye más de los elementos traza de otros elementos. Las modalidades definidas por cada uno de estos términos de transición quedan dentro del alcance de esta invención.

Además, todos los valores numéricos, por ejemplo, la concentración o dosis o variaciones de las mismas, son aproximaciones que se varían ( + ) o (-) hasta en un 20%, en tiempos de hasta el 10% o de los valores de estado. Se debe entender, incluso si no se establece específicamente siempre que todas las designaciones numéricas se deben leer como si estuvieran precedidas por el término "aproximadamente" . También se debe entender, aunque no siempre se establezca explícitamente, que los reactivos descritos en la presente son simplemente ilustrativos y que los equivalentes de los mismos se conocen en la técnica.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS NO LIMITANTES General En el siguiente ejemplo no limitante, las muestras que comprenden agua municipal (agua de grifo) mezcladas con concentraciones predeterminadas de bacterias se utilizaron para determinar la eficiencia del método de la presente invención .

En cada muestra, la cantidad de microorganismos de reproducción viables se cuantificó haciendo uso del método de la invención así como también el conteo de UFC estándar (Standard Methods for Examination of Water & Wastewater (Lenore S. Clescerl (Editor), Arnold E. Greenberg (Editor), Andrew D. Eaton (Editor). 18-th Edition, 2002.). Los resultados se compararon y la eficacia del método de la invención tuvo una correlación de R2 = 0.997 para el método UFC.

Materiales y métodos Células microbianas : Se proporcionaron tres preparaciones de concentrado de células microbianas: formas sin tratamiento previo de E. coli (Ia preparación) y Ps. aeruginosa (2a preparación) se aislaron de agua de grifo, utilizando para E. coli, medio de triptona Bile X-Glucuronide (TBX) (Promega production) y para Ps. aeruginosa agar Cetrimide (Promega production). Una 3a preparación contuvo agua de grifo regular y se denomina como la preparación de la mezcla microbiana (como típicamente podría contener la mezcla microbinana) .

Las preparaciones de E. coli y Ps . aeruginosa cultivadas y aisladas y el agua de grifo cada una se transfirieron en medio de crecimiento en caldo y se incubaron mediante agitación vigorosa utilizando medio de caldo Lysogeny (LB) (Promega Cat . # 7290A) .

Condiciones de incubación para las tres preparaciones : E. coli - 35°C durante 18 horas; Ps. aeruginosa - 30°C durante 40 horas; Mezcla de células microbianas en agua - 30°C durante 72 horas.

Las preparaciones cultivadas se enjuagaron tres veces mediante centrifugación (6,000 RPM durante 5 minutos) utilizando PBS. En esta etapa, las concentraciones microbianas, según se determinó mediante conteo de UFC por filtración microbiana, se determinó que sean de aproximadamente : 1010 UFC/ml para E. coli; 109 UFC/ml para Ps . aeruginosa ; y 108 UFC/ml para mezcla microbiana derivada de agua.

Luego, las preparaciones microbianas (E. coli y Ps . aeruginosa) se diluyeron con PBS estéril, mientras que la preparación de la mezcla bactriana en agua de grifo se utilizó como está o se diluyó con agua de grifo esterilizada (preparada mediante la filtración de agua de grifo via filtros microbianos de 0.22 µp? (Milipore production) ) . Se preparó el conteo en placa heterotrópica (HPC) utilizando el procedimiento de filtración microbiana (filtro de 0.45 µ??) (Standard Methods for Examination of Water & astewater/ By Lenore S. Clescerl (Editor), Arnold E. Greenberg (Editor), Andrew D. Eaton (Editor). 18-th Edition, 2002.) con volúmenes de prueba de las suspensiones en una variación de 0.01 mi hasta 1 litro. Los filtros se incubaron en medio PCA (Promega Cat. # 7157A) con condiciones de incubación como sigue : E. coli - 35°C durante 24 horas; Ps . aeruginosa 30°C durante 48 horas; Mezcla bacteriana 30°C durante 72 horas.

Los resultados del conteo de UFC se normalizaron a un volumen de prueba de 1 litro.

Tinte fluorescente: En los siguientes experimentos, el tinte de estirilo FM1-43 (Nishikawa S. Sasaki F. Internalization of styryl dye FM1-43 in the hair cells of lateral line organs in Xenopus larvae, Histochem Cytochem, 1996 44 ( 7 ) : 733-41 ) se utilizó a una concentración de 1 µ?/p?? en PBS.

Método de tinción : La tinción fluorescente de las preparaciones con células microbianas se condujo a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) utilizando el tinte de estirilo F 1-43. Los tiempo de tinción y la ventana tiempo de trabajo se determinaron utilizando una preparación en monocapa de las células y se determinó que se requirieron 2 minutos para que la señal alcanzara la meseta de señal (TI, véase la determinación de TI y T2 más adelante) y la meseta permaneció en estado estable durante un periodo de tiempo de aproximadamente 600 segundos (TI, véase la determinación de TI y T2 más adelante) . Al término de la tinción, los cultivos se enjuagaron tres veces con PBS iso-normal. Se observa que se utilizó el mismo método de tinción para los cultivos adheridos a la superficie de los filtros o para los cultivos suspendidos (es decir, esto no es especifico para las preparaciones monocapa) .

Formación de imágenes por fluorescencia: Las imágenes fluorescentes de las muestras emisoras de señales se obtuvieron utilizando un microscopio Axiovert 200 (Karl Zeiss) , objetivo 1.3NA Plan Neofluor X10 ( (BP 450-490) filtro de excitación (Excitación: 450-490 nm; Divisor de haz: FT 510 nm; Emisión: 515-565 nm; Karl Zeiss).

Capturar de imágenes: Las imágenes se capturaron haciendo uso de una Sensicam qe (Cooke Corp.) 512 X CCD 512.

Procesamiento de imágenes : El procesamiento de las imágenes y la recolección de datos se realizaron utilizando el software ImagePro+ (2002) .

Determinación de TI y T2: Para la determinación de TI, se prepararon tres muestras a partir de las preparaciones concentradas, es decir, una muestra de agua de grifo que comprende una mezcla bacteriana existente naturalmente en el agua de grifo (después de ser cultivada en un medio de cultivo y se lavó con PBS como se describió anteriormente) ; una segunda muestra de E. coli aislada (después de ser cultivada, y se lavó con PBS, como se describió anteriormente) y una tercera muestra de Ps. aeruginosa aislada (después de ser cultivada, y se lavó con PBS, como se describió anteriormente) .

Una muestra proveniente de cada preparación concentrada se analizó de acuerdo con la metodología HPC, para obtener el conteo UFC/ml convencional correspondiente.

Cada muestra luego se diluyó con PBS para obtener muestras de aproximadamente 1000 UFC/ml de concentración. Cada muestra luego se tiñó con FM1-43 y se formó la imagen cuando en la monocapa (como se describió anteriormente) cada 10 segundos hasta que la señal emitida de la monocapa alcanzó una meseta. El tiempo en el cual la señal alcanzó una meseta se determinó como TI.

Determinación de T2 En un conjunto adicional de tres muestras diluidas a partir de las tres preparaciones, aproximadamente 110 segundos después de la tinción de las muestras, las muestras se lavaron con PBS, y se formó la imagen en una monocapa en una secuencia de tiempo de 10 segundos, hasta que la señal comenzó a ' perder intensidad. El punto de tiempo en el cual la señal comenzó a perder intensidad se determinó como T2.

El procedimiento anterior se repitió tres veces. La intensidad de la señal capturada durante la sesión de medición se gráfico y los resultados se muestran en la figura 1.

Determinación de la equivalencia de UFC: Para identificar un equivalente de UFC (es decir, para calibrar la medición de la invención con el conteo UFC/ml estándar) se recolectaron y utilizaron un total de tres muestras de agua de grifo proveniente de tres ubicaciones geográficas diferentes (A, B y C) . Las preparaciones de cada ubicación se prepararon como se describió anteriormente con respecto a la determinación de TI, para obtener muestras de E. coli y Ps . aeruginosa aisladas y una muestra de la mezcla bacteriana. Para cada ubicación, la concentración de cada célula bacteriana o el conteo total de bacterias para cada preparación se determinó a priori con base en la metodología HPC (es decir, para obtener un TBC antes de la dilución) y luego" las muestras provenientes de las preparaciones de la mezcla bacteriana (es decir, de cada ubicación, en total 3) se diluyeron con agua esterilizada hasta obtener cuatro concentraciones aproximadas, 1000 UFC/ml, 100 UFC/ml, 10 UFC/ml y 1 UFC/ml, es decir, en un total de 12 muestras.

Cada una de las 12 muestras se analizó de acuerdo con la metodología HPC y también de acuerdo con el método de la invención, en el último caso, cada muestra se tiñó con FM1-43 como se describió anteriormente, se lavó después de 120 segundos con agua esterilizada (es decir, al inicio de la meseta) e inmediatamente se formaron las imágenes (aproximadamente 150-180 segundos). La imagen se procesó de acuerdo con los parámetros para selección de señal. Específicamente, una vez que se capturaron las imágenes, se enumeraron los objetos que satisfacen los parámetros de selección, y su intensidad de raíz cuadrada media, determinada. Los resultados de la selección se proporcionan en las Tabla IA-IB más adelante.

La E. coli y Ps . aeruginosa aisladas de las muestras preparadas anteriormente se trataron exactamente como la muestra de la mezcla bacteriana. Se observó que las dinámicas de los cambios fueron similares a aquellas de la mezcla bactriana, y que no hubo cambios significativos en las señales obtenidas a partir de la muestra de la mezcla bacteriana de concentraciones similares (datos no mostrados) .

Validación del método de la invención Un total de 48 muestras de prueba microbiana se prepararon a partir de las tres diferentes ubicaciones como se describió anteriormente (4 muestras de cada ubicación, cada muestra por triplicado) . Específicamente, las preparaciones a partir de cada ubicación (con una concentración celular desconocida) ya sea se diluyeron con agua esterilizada xlO, xlOO o quedaron sin diluir. También, a partir de cada ubicación, una muestra de la preparación concentrada se esterilizó mediante filtración con un filtro de malla 0.22 pm (Nitrocellulose, Milipore production) .

Cada muestra de prueba luego se tiñó con FM1-43, se lavó con agua esterilizada y se analizó utilizando el método HPC convencional o el método de la invención como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 2 más adelante.

Medición de fluorescencia Todas las mediciones de fluorescencia y los conteos de UFC correspondientes se condujeron a temperatura ambiente (~25°C) .

Formación de imágenes y procesamiento de las señales Con el fin del análisis de imágenes, un objeto emisor de señales microbianas (es decir, un objeto que será contado) se determinó para tener tamaños de 0.8-1.5 µ?? cuando se visualizaron mediante un microscopio de luz correspondiente a 12-28 pixeles (en el ajuste particular utilizado en estos ejemplos no limitantes) . Éstos fueron los criterios de selección.

En los ejemplos no limitantes proporcionados en la presente, a menos que se establezca de otra manera, se formaron imágenes de las muestras de 150 a 180 segundos después de la tinción (es decir, poco después de los 2 minutos después de la tinción) . Además, el tiempo de exposición se calibró para una intensidad máxima fluorescente en "objetos microbianos" para tener 254 niveles de gris (o entre 60-254 GL) . El tiempo de exposición se ajustó a 0.8 segundos .

Los cálculos promedio y la desviación estándar (en porcentajes) se utilizaron para determinar los valores cuantitativos.

Resultados La invención se basa en la comprensión de que las células microbianas en reproducción (cultivables) pueden internalizar fracciones de lipidos de la pared celular extracelular y concentrar las mismas dentro de la célula durante un periodo de tiempo (más rápido en comparación con las células microbianas no cultivables) . La velocidad de tráfico de las membrana y su nivel de concentración intracelular es una función de la actividad de la célula, muy alta en microorganismos reproducibles . De esta forma, se ha previsto por los inventores que este fenómeno se puede utilizar para distinguir y cuantificar la cantidad de células reproducibles, viables, en una muestra.

Determinación de TI y T2: La figura 1, muestra que la acumulación de FM1-43 hasta que la señal alcanzó una meseta fue de aproximadamente 120 segundos después de la tinción. Este punto de tiempo se marcó de esta forma como TI. La acumulación de tinte intracelular estable se mantuvo estable en una ventana de tiempo entre 115 a 550 segundos a partir del inicio de la meseta. En otras palabras, la acumulación de tinte fluorescente en el compartimiento intracelular de la mezcla de células se tornó estable después de 115 segundos y se mantuvo asi durante al menos 550 segundos. De esta forma se ha determinado que para la determinación cuantitativa de E. coli y/o Sp. aeruginosa en una muestra liquida, una ventana de tiempo entre aproximadamente 115 hasta aproximadamente 550 segundos es una ventana de medición efectiva T2.

Determinación de la equivalencia UFC : Las imágenes para las 12 muestras microbianas utilizadas para la determinación de la equivalencia de UFC, como se describió anteriormente, se procesaron para seleccionar tres de los objetos que satisfagan los criterios de selección predeterminados (es decir, tamaños 0.8-1.5 pm cuando se visualizan mediante un microscopio de luz correspondiente a 12-28 pixeles, intensidad máxima de 254 niveles de gris) .

Los valores de intensidad de raíz cuadrada media determinados para los objetos seleccionados se incluyen en las Tabla 1A-1B junto con los conteos UFC/ml obtenidos mediante la metodología HPC convencional. La concentración aproximada se determinó con base en el conteo UFC/ml obtenido a partir de las preparaciones concentradas. Las diferentes muestras se identificaron por ubicación (A, B, o C) y un número de muestra por ubicación (XI, X2 o X3) .

Tabla 1A: Análisis de la muestra de mezcla bacteriana Concentración Idenificador Intensidad No. de Conteo aproximada de la muestra (GL) objetos UFC/ml seleccionados convencional 1000 Al 64, 195 599 157 1000 Bl 67, 375 624 170 1000 Cl 65, 772 628 169 100 A2 6, 797 62 15 100 B2 7, 818 71 24 100 C2 6, 608 60 14 10 A3 878 8 3 10 B3 946 9 5 10 C3 639 6 2 1 A4 73 0 0 1 B4 78 0 0 1 C4 24 0 0 Tabla IB: Análisis de E. coli o Ps. aeruginosa Tipo de célula Concentración Intensidad No. de Conteo microbiana aproximada (GL) objetos UFC/ml seleccionados convencional E. coli 1000 48, 572 641 336 E. coli 100 5, 827 77 45 E. coli 10 543 8 3 E. coli 1 42 1 0 Ps. aeruginosa 1000 18, 366 167 88 Ps. aeruginosa 100 1, 660 15 9 Ps. aeruginosa 10 118 2 10 Ps. aeruginosa 1 7 0 5 Los resultados proporcionaron en la tabla 1A también se presentan en la figura 2 que muestras una correlación entre los valores UFC/ml obtenidos mediante el método HPC estándar y los valores cuantitativos obtenidos mediante el método de la invención. La figura 2, muestra específicamente que la correlación entre los dos métodos de medición se puede presentar mediante la siguiente ecuación: y=0.025x + 0.3375, Esta ecuación se determinó así para ser el factor de normalización para la determinación cuantitativa de la mezcla microbiana en muestras de agua de grifo proveniente de sistemas de aguas municipales.

Validación del método equivalente de UFC Para validar la exactitud de la ecuación anterior con respecto a las muestras de agua de grifo desconocidas, se condujo un análisis adicional con muestras provenientes de agua municipal proveniente de diferentes ubicaciones como se describió anteriormente, sin embargo, sin una determinación de la concentración bacteriana a príori. De cada ubicación se tomaron tres muestras. Todas las muestras se diluyeron, como se describió en materiales y métodos (preparación para el paso de validación) y se probaron en paralelo para determinar el conteo equivalente de UFC de acuerdo con el método de la invención haciendo uso de la ecuación den normalización identificada anteriormente, y el conteo UFC estándar. Se observa que las muestras se identificaron mediante su ubicación, dilución y número de muestra del conjunto por triplicado, es decir para cada ubicación A, B o C, y para cada dilución por ejemplo, Al, A2, A3, A_4, se utilizaron triplicados, Ala, Alb, Ale. De esta forma, por ejemplo, la muestra Ala, denota una de las tres muestras provenientes de la ubicación 1, sin dilución.

Los resultados se presentan en la Tabla 2, que proporcionan una comparación entre el conteo de equivalente de UFC (el método de la invención) y el conteo UFC estándar de diversas muestras liquidas.

Tabla 2 : conteos del equivalente de UFC y UFC estándar Determinada utilizando la ecuación identi anteriormente: y=0.025x + 0.3375 Como se muestra, la diferencia entre el valor cuantitativo obtenido mediante el método de la invención, es decir, el equivalente de UFC, y el valor obtenido mediante el método HPC convencional fue menor del 10% para todas las muestras probadas. Se encontró que la correlación será R2 = 0.9978, lo cual confirma que el conteo del equivalente de UFC de acuerdo con el método de la invención se puede utilizar de manera segura para el conteo UFC casi en tiempo real.

Los resultados de la Tabla 2 también se marcaron en una gráfica, proporcionada como la figura 3A (? que representa el equivalente de UFC, ¦ que representa la UFC estándar) , con la correlación entre el equivalente de UFC y el UFC estándar presentadas en la figura 3B.

Comparaciones para la determinación del conteo UFC estándar y el equivalente de UFC para la cuantificación de microorganismos reproducibles El equivalente de UFC de acuerdo con la invención proporciona los medios para una cuantificación de microorganismos rápida, y casi en tiempo real en una muestra liquida. No sólo el equivalente de UFC es menos consumidora de tiempo en comparación con los métodos de conteo UFC estándar, el tiempo para recibir los resultados en casi tiempo real (entre 5 a 10 minutos, en comparación con dias cuando se utiliza el conteo UFC estándar.

Además, la obtención del conteo equivalente de UFC podría ser menos costoso, puede ser un proceso automatizado, no requiere grandes espacios de trabajo y se puede determinar cerca del área probada. Los resultados de la comparación se muestran en la figura 3A y en la figura 3B. Específicamente, la figura 3A muestra que existe casi una correlación lineal entre las dos técnicas de medición, es decir, R2 = 0.99778, y la figura 3B muestra que para cada muestra, los valores obtenidos mediante cada método (HPC o el método de la invención) casi se superponen. De esta forma, se concluye que el método de la invención puede proporcionar de manera segura un valor equivalente de UFC.

Claims (40)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un método para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el método caracterizado porque comprende: (i) poner en contacto la muestra probada, susceptible de portar células microbianas cultivables con al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con la membrana de la célula microbiana, el contacto es durante un primer periodo de tiempo predeterminado (TI) que sea suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida de la muestra esencialmente alcance una meseta; (ii) retirar de la muestra probada el agente emisor de señales no internalizado; (iii) durante un segundo periodo de tiempo (T2) , después del primer periodo de tiempo (TI) , y en el cual la señal se mantiene esencialmente en la meseta, detectar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra, las células cultivables emisoras de señales, la detección se basa en los parámetros de selección predeterminados para las células cultivables; y (iv) determinar, con base en los objetos emisores de señales seleccionados, un valor cuantitativo indicativo del número de células cultivables en la muestra probada.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende retirar al menos una porción de liquido de la muestra probada antes de teñir la muestra con el agente emisor de señales.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el retiro de líquidos es mediante uno o más de filtración o centrifugación.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la muestra comprende unos o más tipos de células microbianas.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el agente emisor de señales es un agente luminiscente o un agente emisor de luz .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con al menos un agente emisor de señales adicional que tenga especificidad para una célula microbiana seleccionada con sospecha de estar en la muestra.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende detectar la señal emitida de cada agente emisor de señales de la muestra y determinar a partir de la misma un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas especificas cultivables en la muestra.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado por la determinación de una pluralidad de valores cuantitativos, cada valor será i'ndicativo del número de una célula microbiana especifica o de las células microbianas de un grupo especifico en la muestra.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque los parámetros de selección comprenden dos o más parámetros seleccionados de la intensidad de señal emitida desde una objeto emisor de señales, el tamaño del objeto emisor de señales, la morfología del objeto emisor de señales.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque se detectan únicamente los objetos emisores de señales que tienen al menos una intensidad de señal por debajo de un umbral superior predeterminado y un tamaño dentro de una variación de tamaños del objeto.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque se detectan sólo los objetos emisores de señales que tienen al menos una intensidad de señal dentro de una variación de intensidad predeterminada, y un tamaño dentro de una variación de tamaños del objeto.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque comprende calcular para los objetos seleccionados el valor cuantitativo .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el valor cuantitativo comprende una intensidad de raíz cuadrada media de los objetos seleccionados .

14. El método de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el valor cuantitativo se normaliza para que corresponda con el conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) , el valor cuantitativo normalizado que será un equivalente de UFC.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la normalización comprende factorizar el valor cuantitativo con un factor de normalización célula-especifico predeterminado- para obtener el equivalente de UFC.

16. Un kit para determinar un valor cuantitativo equivalente al número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el kit caracterizado porque comprende: (i) al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse una membrana de la célula microbiana, (ii) las instrucciones para poner en contacto al menos un agente emisor de señales con la muestra durante un primer periodo de tiempo [TI) que sea suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida de la muestra alcance esencialmente una meseta; (iii) las instrucciones para retirar de la muestra el agente emisor de señales no asociado; (iv) las instrucciones para detectar y seleccionar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra, las células cultivables que emiten la señal, la detección se basará en los parámetros de selección predeterminados para las células cultivables, la detección y selección serán durante un segundo periodo de tiempo (T2) , después de TI, y en el cual la señal se mantenga esencialmente en la meseta; (v) las instrucciones para el uso de los objetos emisores de señal seleccionados para determinar a partir de los mismos un valor cuantitativo indicativo del número de células cultivables en la muestra probada.

17. El kit de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende las instrucciones para retirar de la muestra al menos una porción del liquido antes de teñir la muestra con el agente emisor de señales.

18. El kit de conformidad con la reivindicación 16 ó 17, caracterizado porque comprende más de un agente emisor de señales.

19. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque el agente emisor de señales es un agente luminiscente o un agente emisor de luz.

20. El kit de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el agente emisor de señales es un tinte fluorescente.

21. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizado porque comprende los parámetros de selección y las instrucciones para el uso de al menos dos parámetros de selección para seleccionar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra las células microbianas cultivables emisoras de señales.

22. El kit de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque los parámetros de selección comprenden un umbral superior de intensidad de señal predeterminada, una variación de intensidad de señal, un tamaño dentro de una variación de tamaños del objeto emisor de señales predeterminado y una morfología emisora de señales .

23. El kit de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende las instrucciones para el uso de al menos dos de los parámetros de selección para seleccionar sólo los objetos emisores de señales con una intensidad de señal por debajo de un umbral superior predeterminado o dentro de una variación de tamaños del objeto, y que tenga un tamaño dentro de una variación de tamaño predeterminado.

24. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, caracterizado porque comprende las instrucciones para calcular a partir de los objetos seleccionados el valor cuantitativo.

25. El kit de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque las instrucciones comprenden calcular una intensidad de raíz cuadrada media de los objetos seleccionados para obtener de la misma el valor cuantitativo.

26. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, caracterizado porque comprende las instrucciones para normalizar el valor cuantitativo con un factor de normalización para obtener un equivalente de conteo de la unidad formadora de colonias (UFC) .

27. El kit de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende uno o más factores de normalización predeterminados y las instrucciones para el uso de los factores de normalización predeterminados, para deducir a partir del valor cuantitativo medido el equivalente de UFC.

28. Un sistema para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en una muestra probada, el sistema caracterizado porque comprende: (i) un portador para contener la muestra y permitir el contacto de una muestra con uno o más agentes emisores de señales; (ii) un detector para detectar los objetos emisores de señal dentro de la muestra, y dar salida a los datos correspondientes a los mismos; (iii) una unidad de memoria que comprende una base de datos con los parámetros de selección predeterminados y una pluralidad de factores de normalización predeterminados, cada parámetro de selección y cada factor de normalización serán específicos para una célula microbiana o para un grupo de células microbianas; (iv) una unidad de procesamiento para recibir los datos de salida provenientes del detector, uno o más de los parámetros y el factor de normalización a partir de la unidad de memoria y procesar los datos de salida con los parámetros y el factor de normalización para determinar el valor cuantitativo indicativo del número de las células microbianas cultivables en la muestra.

29. El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el portador comprende un filtro para filtrar al menos una porción de liquido proveniente de la muestra.

30. El sistema de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizado porque el detector comprende una cámara para capturar una imagen de la objetos emisores de señales dentro de la muestra probada.

31. El sistema de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la unidad de procesamiento se configura para determinar, a partir de los datos recibidos del detector, por cada objeto emisor de señales detectado la intensidad de señal, el tamaño del objeto emisor de señales, la morfología del objeto emisor de señales .

32. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque la unidad de procesamiento se configura para seleccionar los objetos emisores de señales que tengan una intensidad de señal por debajo de un umbral de intensidad predeterminado y un tamaño dentro de una variación de tamaños predeterminados.

33. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque la unidad de procesamiento se configura para seleccionar los objetos emisores de señales que tengan una intensidad de señal dentro de una variación de intensidad predeterminada y un tamaño dentro de una variación predeterminada.

34. El sistema de conformidad con la reivindicación 32 ó 33, caracterizado porque la unidad de procesamiento se configura para dar salida a un valor cuantitativo, con base en la raiz cuadrada media de la intensidad emitida desde los objetos emisores de señales seleccionados .

35. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, caracterizado porque la unidad de procesamiento se configura para normalizar el valor cuantitativo con un factor de normalización recuperado de la base de datos.

36. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizado porque comprende un estuche de uno o más agentes emisores de señales, el sistema se pre-programará para que permita que el estuche libere uno o más de los agente emisores de señales en el portador y permitir el contacto de uno o más de los agentes emisores de señales con una muestra probada en el portador.

37. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizado porque comprende una disposición de estuches, cada uno que porta un agente emisor de señales, el sistema se pre-programará para permitir la liberación en el portador de uno o más agente emisores de señales a partir de la disposición de los estuches.

38. Un dispositivo para almacenamiento de programas legible por máquina, que incorpora tangiblemente un programa de instrucciones ejecutables por la¦' máquina para realizar un método para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables en una muestra de prueba, el método caracterizado porque comprende : (i) poner en contacto la muestra probada, susceptible de portar células microbianas cultivables con al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con la membrana de la célula microbiana, el contacto es durante un primer periodo de tiempo predeterminado (TI) que sea suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida desde la muestra alcance esencialmente una meseta ; (ii) retirar de la muestra probada el agente emisor de señales no internalizado; (iii) durante un segundo período de tiempo (T2) , después del primer período de tiempo (TI), y en el cual la señal se mantiene esencialmente en la meseta, detectar y seleccionar a partir de la objetos emisores de señales dentro de la muestra, las células cultivables emisoras de señales, la detección se basará en los parámetros de selección predeterminados para las células cultivables; y (iv) determinar, con base en los objetos emisores de señales seleccionados, un valor cuantitativo indicativo del número de células cultivables en la muestra probada.

39. El dispositivo para almacenamiento de programa de conformidad con la reivindicación 38, ejecutable mediante la máquina para realizar el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

40. Un programa de computadora caracterizado porque comprende medios con código de programa de computadora para realizar todos los pasos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, cuando el programa se corre en una computadora, el programa de computadora se incorporará en un dispositivo para almacenamiento de programas. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método, kit y sistema para determinar un valor cuantitativo indicativo del número de células microbianas cultivables, tales como E. Coli, Ps . Aeroginosa o una mezcla de células microbianas (por ejemplo, para conteo microbiano total) en una muestra probada, el método comprende (i) poner en contacto la muestra probada, susceptible de portar células microbianas cultivables con al menos un agente emisor de señales capaz de asociarse con la membrana de la célula microbiana, el contacto es para un primer periodo de tiempo predeterminado (TI) que será suficiente para la internalización del agente emisor de señales en la célula microbiana a un nivel en el cual la señal emitida desde la muestra esencialmente alcanza una meseta; (ii) retirar de la muestra probada el agente emisor de señales no internalizado; (iii) durante un segundo periodo de tiempo (T2), seguir el primer periodo de tiempo (Ti) , y en el cual la señal se mantiene esencialmente en la meseta, detectar a partir de los objetos emisores de señales dentro de la muestra, las células cultivables emisoras de señales, la detección se basará en la selección de los parámetros predeterminados para las células cultivables; y (iv) determinar, con base en los objetos emisores de señales seleccionados, un valor cuantitativo indicativo del número de células cultivables en la muestra probada. El kit comprende uno o más de los agentes emisores de señales y las instrucciones para utilizar el mismo. También se proporciona un dispositivo para almacenamiento de programas legible por máquina, que incorpora tangiblemente un programa de las instrucciones ejecutables por la máquina para realizar el método y un programa de computadora que comprende medios del código de programa de computadora para realizar el método.