MX2011000041A - Proteinas antagonistas del factor-alfa de necrosis tumoral (tnf-alfa), de union a multiples objetivos. - Google Patents

Proteinas antagonistas del factor-alfa de necrosis tumoral (tnf-alfa), de union a multiples objetivos.

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Abstract

Esta descripción proporciona una proteína de fusión de múltiples objetivos compuesta de un dominio antagonista de TNF-a y otro dominio de unión antagonista para un objetivo heterólogo, tal como IL6, RNKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2, IGF1, IGF2 o BLyS/APRIL o agonista para un objetivo heterólogo tal como IL10. La proteína de fusión multiespecífica también puede incluir un dominio interpuesto que separa los dominios de unión y permite la dimerización. Esta descripción también proporciona polinucleótidos que codifican para las proteínas de fusión multiespecíficas, composiciones de las proteínas de fusión, y métodos para usar las proteínas de fusión multiespecificas, y las composiciones.

Description

PROTEINAS ANTAGONISTAS DEL FACTOR-ALFA DE NECROSIS TUMORAL (TNF-ALFA) , DE UNION A MULTIPLES OBJETIVOS Campo de la Invención 5 Esta descripción se refiere en general al campo de moléculas de unión a múltiples objetivos o dianas y a aplicaciones terapéuticas de las mismas, y de manera más específica, a proteínas de fusión compuestas de ya sea un dominio antagonista de TNF-a y otro dominio, de unión, ¦^g antagonista para un agente heterólogo, tal como IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2 , IGF1 , IGF2 o BLyS/APRIL, o un dominio antagonista de TNF-a y otro dominio, de unión, agonista para un agente heterólogo, tal como IL10, así como composiciones y usos terapéuticos de las mismas. 5 Antecedentes de la Invención El Receptor del Factor de Necrosis Tumoral (TNFR) es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral y es el receptor para el Factor-a de Necrosis Tumoral (TNF-OÍ) , también conocido como CD120 o caquectina. 20 Existen dos variantes de este receptor de citosina, TNFRl y TNFR2 (los receptores CD120a y CD120b, respectivamente) . El TNFRl tiene un peso molecular de aproximadamente 55 KD, y por lo tanto, se refiere algunas veces como p55. El TNFR2 tiene un peso molecular de aproximadamente de 75 KD y por lo tanto se 25 refiere algunas veces como p75.
Ref. 216688 La mayoría de tipos celulares y tejidos parecen expresar ambos receptores de TNF . Ambos existen en la superficie celular, así como en formas solubles y ambos son activos en la transducción de señales, aunque pueden mediar distintas respuestas celulares. Parece que TNFR1 es responsable de la señalización de la mayoría de las respuestas de TNF . Entre otras actividades, el TNFR2 estimula la proliferación de timocitos, activa NF - Kp , y es un aditamento a TNFR1 en la señalización de las respuestas mediadas principalmente por TNFR1, tal como citotoxicidad .
Los antagonistas de TNF , tal como los anticuerpos anti-TNF, pueden afectar de manera positiva varias condiciones inflamatorias. Por ejemplo, en los Estados Unidos se indica infliximab para el tratamiento de artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, espondilitis anquilosante, artritis psoriática, psoriasis de placa y colitis ulcerativa. De acuerdo a la información de prescripción de REMICADEÍ® (infliximab) , las actividades biológicas atribuidas a TNF incluyen inducción de citosinas pro-inflamatorias tal como interleucinas (IL) 1 y 6, mejora de la migración de leucocitos al incrementar la permeabilidad de la capa endotelial y la expresión de moléculas de adhesión por células endoteliales y leucocitos, la activación de la actividad funcional de neutrófilos y eosinófilos, la inducción de reactivos de fase aguda y otras proteínas hepáticas, así como enzimas degradadoras de tejido producidas por sinoviocitos y/o condrocitos. Recientemente, se ha mostrado que la administración periespinal del inhibidor TNFa, etanercept reduce los síntomas en pacientes con enfermedad de Alzheimer (Tobinick y Gross (2008) BMC Neurol 5 8:27-36; Griffin (2008) J. Neuroinflammation, 5:3-6).
Anteriormente se han descrito moléculas bispecíficas que incluyen un sitio de unión específico, ya sea para un receptor de TNF o T FoC' conjuntamente con un sitio de unión específico para una molécula heteróloga (ver, por ejemplo, US 2008/0260757, US 10 2006/0073141, US 2007/0071675, O 2006/074399 y O 2007/146968) .
La patente de los Estados Unidos 7,300,656 describe moléculas biespecíficas que incluyen un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo anti-IFN-? y un receptor para TNF-a o un dominio extracelular del mismo. !5 Breve Descripción de la Figuras Las Figuras 1A-1C muestran que las proteínas de fusión multi-específicas (Xceptor) que contienen uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6, fusionadas a un ectodominio de T FR, se unen a Hiper-IL6 de forma específica como 20 se mide por ELISA, y que estas proteínas de fusión, multi- específicas, se unen de manera preferencial a Hiper-IL6 con respecto a IL6 o IL6R solos. Únicamente dos proteínas de fusión probadas se unieron a IL6 y ninguna se unió a sIL6R.
La Figura 2 muestra que las proteínas de fusión " multi-especificas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a uno de varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6 se unen a TNF-a , como se mide por ELISA.
La Figura 3 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen uno de varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6, fusionadas a un ectodominio de TNFR, pueden unirse de manera simultánea a Hiper-IL6 y TNF-a como se mide por ELISA.
La Figura 4 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6, fusionadas a un ectodominio de TNFR bloquean gpl30 de la unión a Hiper-IL6, como se mide por ELISA.
Las Figuras 5A y 5B muestran que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6, fusionadas a un ectodominio de TNFR, bloquean (Figura 5A) la proliferación de células TF-1 inducida IL6 o (Figura 5B) por Hiper-IL6.
La Figura 6 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6, fusionadas a un ectodominio de TNFR bloquean TNF- de la unión a TNFR como se mide por ELISA.
La Figura 7 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a uno de los varios dominios diferentes de unión a Hiper-IL6 bloquean la aniquilación de células L929 inducida por TNF-a .
La Figura 8 muestra que las proteínas de fusión multi -específicas que contienen un ectodominio de TNFR, fusionadas al ectodominio del receptor humano de TWEA bloquean la aniquilación de células HT29, inducida por TWEAK.
La Figura 9 muestra que las proteínas, de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a un ectodominio de OPG bloquean la osteoclastogénesis mediada por RANKL en células RAW 246.7.
La Figura 10 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a un dominio de unión a IL6 no se unen a células HepG2 (hígado) .
La Figura 11 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a un dominio de unión a IL6 bloquearon la respuesta de SAA inducidas por HIL6, en ratones.
La Figura 12 muestra que las proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a un dominio de unión a IL6 bloquearon la respuesta de sgpl30 inducida por HIL6, en ratones.
Las Figuras 13A y 13B muestran los resultados de estudios de la capacidad de proteínas de fusión multi-específicas que contienen un ectodominio de TNFR fusionadas a un dominio de unión a IL6 para bloquear la respuesta de SAA inducida por TNF-¾, en ratones, a las 2 horas y 24 horas después de la administración, respectivamente.
Descripción Detallada de la Invención La presente descripción proporciona proteínas de fusión, multi-específicas, referidas en la presente como moléculas Xceptor. Las estructuras de ejemplo de estas proteínas de fusión, multi-específicas , incluyen N-BD- ID-ED-C, N-ED-ID-BD-C y N-ED1-ID-ED2 -C, en donde N- y C-representan respectivamente el amino-terminal y carboxi-terminal , BD es un dominio de unión de región variable de inmunoglobulina o tipo inmunoglobulina, ID es un dominio de intervención, y ED es un ectodominio (por ejemplo, un dominio extracelular) , tal como un dominio de unión a ligando de receptor, dominio con alto contenido de cisteína (por ejemplo, dominio de clase A de receptores de LDL, ver WO 02/088171 y WO 04/044011) , dominio de semaforina o tipo semaforina, o similares. En algunas construcciones, el ID puede comprender una región o sub-región constante de inmunoglobulina colocada entre el primero y segundo dominios de unión. En aún construcciones adicionales, el BD y el ED se enlazan cada uno al ID mediante el mismo o diferente ligador (por ejemplo, un ligador que comprende de uno a 50 aminoácidos) , tal como una región de articulación de inmunoglobulina (constituida de, por ejemplo, las regiones superior y núcleo) o variante funcional de la misma, o una región de interdominio de lectina o variante funcional de la misma, o una agrupación de la región de tallo de molécula de diferenciación (CD) o variante funcional de la misma.
Antes de exponer esta descripción en detalle, puede ser útil para el entendimiento de la misma proporcionar definiciones de ciertos términos que se van a usar en la presente. A todo lo largo de este descripción se exponen definiciones adicionales.
En la presente descripción, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación, o intervalo de números enteros se va entender que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado, y cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tal como, un décimo y un centésimo de un entero) , a menos que se indique de otro modo. También, cualquier intervalo de número citado en la presente que se relacione a cualquier característica física, tal como subunidades poliméricas, tamaño o espesor, se va entender que incluye cualquier número entero dentro del intervalo citado, a menos que se indique de otro modo. Como se usa en la presente, "aproximadamente" o "que consiste esencialmente de" significa + 20 % del intervalo, valor o estructura indicada, a menos que se indique de otro modo. Se debe entender que los términos "un" y "uno" como se usa en la presente se refieren a "uno o más" de los componentes enumerados. El uso de la alternativa (por ejemplo, "o") se debe entender que significa ya sea uno, ambos, o cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Como se usa en la presente, los términos "incluye" y "comprende" se usan de manera indistinta. Además, se debe entender que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las varias combinaciones de las estructuras y sustituyentes descritos en la presente, se describen por la presente solicitud al mismo grado como si cada compuesto o grupo de compuestos se expusiera de manera individual. De esta manera, la selección de estructuras particulares o de sustituyentes particulares, está dentro del alcance de la presente descripción.
Un "dominio de unión" o "región de unión" , de acuerdo a la presente descripción puede ser, por ejemplo, cualquier proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido que posee la capacidad para de reconocer y unirse de manera específica a una molécula biológica (por ejemplo, TGF O IL6) o complejo de más de una de la misma o diferente molécula o montaje o agregado, ya sea de manera estable o transciente (por ejemplo, complejo IL6/IL6R) . Estas moléculas biológicas incluyen proteínas, polipéptidos , oligopéptidos , péptidos, aminoácidos o derivados de los mismos, lípidos, ácidos grasos o derivados de los mismos; carbohidratos, sacáridos o derivados de los mismos; nucleótidos, nucleósidos, ácidos nucleicos peptídicos, moléculas de ácido nucleico o derivados de los mismos; glicoproteínas , glicopéptidos , glicolípidos , lipoproteínas , proteolípidos o derivados de los mismos; otras moléculas biológicas que pueden estar presentes en, por ejemplo, una muestra biológica; o cualquier combinación de los mismos. Una región de unión incluye cualquier compañero de unión, que se presente de manera natural, sintético, semi-sintético o producido de manera recombinante , para una molécula biológica u otro objetivo o diana de interés. Se conocen una variedad de ensayos para identificar dominios de unión de la presente descripción que se unen de manera especifica con un objetivo particular, incluyendo Western Blot, ELISA, o análisis BiacoreMR.
Los dominios de unión y las proteínas de fusión de los mismos, de esta descripción pueden ser capaces de unirse a un grado deseado, incluyendo "que se une de manera específica o de forma selectiva" a un objetivo o diana, en tanto que no se une de forma significativa a otros componentes presentes en una muestra de prueba, si se unen a molécula objetivo con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, mayor que o igual a aproximadamente 105 M"1, 106 M"1, 107 M"1, 108 M"1, 109 M"1, 1010 M"1, 1011 M"1, 1012 M"1 o 1013 M"1. Los dominios de unión de "alta afinidad" se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M"1, al menos 108 M"1, al menos 109 M"1, al menos 1010 al menos 1011 M"1, al menos 1012 M"1-, al menos 1013 M"1, o mayor. De manera alternativa, la afinidad se puede definir como una constante de disociación en equilibrio (¾) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, 10"5 M a 10"13 M) . Las afinidades de los polipéptidos de dominio de unión y de las proteínas de fusión y de acuerdo con la presente descripción, se pueden determinar fácilmente usando técnicas convencionales (ver, por ejemplo, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, y patentes de los Estados Unidos Nos. 5,283,173; 5,468,614; análisis BiacoreMR; o el equivalente) .
Los dominios de unión de esta descripción se pueden generar como se describe en la presente o por una variedad de métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos Nos. 6,291,161; 6,291,158). Las fuentes incluyen secuencias génicas de anticuerpo de varias especies (que se pueden formatear como anticuerpos, sFv, scFv o Fab, tal como en una biblioteca de fagos) , incluyendo humano, camélido (de camellos, dromedarios o llamas; Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363:446 y Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol, 275:413), tiburón (Roux et al. (1998) Proc . Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804), pez (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics , 54:39), roedor, aviar, ovino secuencias que codifican para bibliotecas peptídicas aleatorias o secuencias que codifican para una diversidad manejada de aminoácidos en regiones asa de núcleos alternativos no de anticuerpo, tal como dominios de fibrinógeno {ver, por ejemplo, eisel et al. (1985) Science 230:1388), dominios Kunitz (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos Nos. 6,423,498), dominios de lipocalina (ver, por ejemplo, O 2006/095164) , dominios tipo V (ver, por ejemplo, publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2007/0065431) , dominios de lectina tipo C (Zelensky y Gready (2005) FEBS J. 272:6179), mAb2 o FcabMR (publicaciones de solicitudes de patente PCT Nos. WO 2007/098934, WO 2006/072620), o similares. Adicionalmente , se pueden usar estrategias tradicionales para el desarrollo de hibridomas usando un complejo de IL6/IL6R de cadena individual, sintético, tal como un complejo humano de IL6/IL6R o Hiper-IL6 (IL6 unido por un ligador peptídico a IL6R) , como un inmunógeno en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, ratón HuMAbMR, ratón TCMR, ratón KMMR, llamas, pollos, ratas, hámsteres, conejos, etcétera) para desarrollar los dominios de unión de esta descripción.
Los términos entendidos por los expertos en la técnica como que se refieren a tecnología de anticuerpos se dan cada uno por el significado adquirido en la técnica, a menos de que se defina expresamente en la presente. Por ejemplo, los términos "VL" y "VH" se refieren a la región variable de unión derivada de una cadena ligera y pesada de anticuerpo, respectivamente. Las regiones variables de unión están constituidas de sub-regiones discretas bien definidas conocidas como "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) y "regiones menos variables" (FR) . Los términos "CL" y "CH" se refieren a una "región constante de inmunoglobulina" , es decir, una región constante derivada de una cadena ligera o pesada de anticuerpo, respectivamente, con la última región entendida como que es adicionalmente divisible en dominios de región constante CHi, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo de anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) del cual se derivó la región. Una porción de los dominios de región constante constituye la región Fe (la región "cristalizable de fragmento"), que contiene dominios responsables de las funciones efectoras de una inmunoglobulina, tal como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo) , ADCP (fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo) , CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) y fijación de complemento, unión a receptores de Fe, mayor vida media in vivo con relación a un polipéptido que carece de una región de Fe, unión a proteína A, y quizá aún transferencia placentaria (ver Capón et al. (1989) Nature, 337:525). Adicionalmente, un polipéptido que contiene una región Fe permite la dimerización o multimerización del polipéptido. Una "región de charnela" , también referida en la presente como un "ligador" , es una secuencia de aminoácidos interpuesta entre y que conectan las regiones constantes y variables de unión de una cadena individual de un anticuerpo, que se conoce en la técnica como que proporciona flexibilidad en la forma de una charnela a anticuerpos o moléculas de tipo anticuerpo.
La estructura de dominio de las inmunoglobulinas es tratable al manejo, ya que los dominios de unión al antígeno y los dominios que confieren funciones efectoras se pueden intercambiar entre clases y subclases de inmunoglobulina . La estructura y función de las inmunoglobulinas se revisa, por ejemplo, en Harlow et al., Eds, Antibodies : A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988) . Se puede encontrar una introducción extensa, así como información detallada a cerca de todos los aspectos de la tecnología de anticuerpos recombinantes en el libro de texto Recombinant Antibodies (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999) . Se puede encontrar una colección comprensiva de los protocolos detallados de laboratorio de manejo de anticuerpos en R. Kontermann y S. Dübel, Eds., The Antibody Engineering Lab Manual (Springer Verlag, Heidelberg / Nueva York, 2000) .
"Derivado" como se usa en la presente, se refiere a una versión químicamente o biológicamente modificada de un compuesto que es estructuralmente similar a un compuesto progenitor y (real o teóricamente) derivable de ese compuesto progenitor. En general, un "derivado" difiere de un "análogo" ya que un compuesto progenitor puede ser el material de inicio para generar un "derivado" , en tanto que el compuesto progenitor no necesariamente se puede usar como el material de inicio para generar un "análogo" . Un análogo puede tener diferentes propiedades químicas o físicas del compuesto progenitor. Por ejemplo, un derivado puede ser más hidrófilo o puede tener reactividad alterada (por ejemplo, una CDR que tiene un cambio de aminoácido que altera su afinidad para un objetivo o diana) en comparación al compuesto progenitor.
El término "muestra biológica" incluye muestra de sangre, espécimen de biopsia, explante de tejido, cultivo de órgano, fluido biológico o cualquier otro tejido o célula u otra preparación de un sujeto o de una fuente biológica. Un sujeto o fuente biológica puede ser, por ejemplo, un humano o animal no humano, un cultivo de células primarias o una línea celular adaptada a cultivo, que incluye líneas celulares genéticamente manejadas que contienen secuencias recombinantes de ácido nucleico, episomales o cromosómicamente integradas, líneas de células híbridas de células somáticas, líneas de células inmortalizadas o inmortalizables , líneas de células diferenciadas o diferenciables , líneas de células transformadas, o similares. En modalidades adicionales de esta descripción, se puede sospechar que una fuente biológica o sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno o condición, que incluye una enfermedad, trastorno o condición maligna o trastorno de células B. En ciertas modalidades, se puede sospechar que un sujeto o fuente biológica tiene está en riesgo de tener una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria o autoinmunitaria, y en ciertas modalidades diferentes de esta descripción, el sujeto o fuente biológica se puede conocer como que está libre de un riesgo o presencia de esta enfermedad, trastorno o condición.
En ciertas modalidades, la presente descripción hace posible el agotamiento o modulación de células asociadas con actividad anormal de TNF-Q; al proporcionar proteínas de fusión multi -específicas que se unen tanto a TNF-a como a un segundo objetivo o diana diferente de TNF-(¾, tal como IL6, IL6R, un complejo de IL6/IL6R, activador de receptor del ligando de factor kappa B nuclear (RA KL, también conocido como TNFSF11, ODF, CD254) , IL7, IL17A, IL17F, IL17A/F, inductor débil de apoptosis, tipo factor de necrosis tumoral (TWEAK, también conocido como la superfamilia de factores (ligando) de necrosis tumoral, miembros 12, TNFSF12) , factor 2 estimulador de colonias (CSF2, también conocido como factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos o GM-CSF) , factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF1) , factor-2 de crecimiento tipo insulina (IGF2) ; IL10, o una proteína de la familia de TNFSF13 (por ejemplo, TNFSF13, también conocido como un ligando inductor de proliferación, APRIL, CD256, o TNFSF13B, también conocido como estimulador de linfocitos B, BLyS, CD257, BAFF) . En ciertas modalidades, una proteína de fusión multi- específica comprende un primero y segundo dominio de unión, un primero y un segundo ligador, y un dominio interpuesto, en donde un extremo del dominio interpuesto se fusiona mediante un ligador a un primer un dominio de unión que es un ectodominio de TNF-a (por ejemplo, un dominio extracelular, uno o más dominios de alto contenido de cisteína (CRD) , tal como CRD1, CRD2 , CRD3) y en el otro extremo se fusiona mediante un ligador a un segundo dominio de unión. En algunas modalidades, se emplea menos de un ectodominio completo de TNF-?. De manera específica, se emplean dominios dentro del ectodominio que funcionan como un antagonista de TNF-D o confieren unión al ligando. En algunas modalidades, el segundo dominio de unión no es un dominio de unión a IFNy, tal como un dominio de inmunoglobulina anti-IFNy o un ectodominio de receptor de IF y.
En ciertas modalidades, el segundo dominio de unión es un antagonista de IL-6 (tal como una región variable de inmunoglobulina que es específica para una IL6 o complejo de IL6/IL6ROÍ) , un antagonista de RA KL (tal como una región variable de región de inmunoglobulina que es específica para RANKL, o un ectodominio de osteoprotegrina (por ejemplo, SEQ ID NO: 737) o fragmento de unión a RANKL del mismo) , un antagonista de IL7 (tal como, un dominio de unión de inmunoglobulina específico para IL7 o IL7Ro¡, o un ectodiminio de IL7Ro¡ (por ejemplo, SEQ ID NO: 738 o 739) o un fragmento de unión a IL7 del mismo) , un antagonista de IL17A/F (tal como, como un dominio de unión de inmunoglob lina específico para IL17A, IL17F, IL17A/F, IL17RA, IL17RC, IL17RA/C, una ectodominio de IL17RA (por ejemplo, SEQ ID NOS: 739, 816), un ectodominio de IL17RA/C, un ectodominio de IL17R/C (por ejemplo, SEQ ID NOS: 740, 817) o un fragmento de unión a IL17A, IL17F o IL17A/F del mismo) , un antagonista de TWEAK (tal como, un dominio de unión de inmunoglobulina específico para TWEAK o TWEAKR, o un ectodominio de TWEAKR (por ejemplo, SEQ ID NO: 741) o fragmento de unión a TWEAK del mismo), un antagonista de CSF2 (tal como, un dominio de unión de inmunoglobulina específico para CSF2 o CSF2Ra, o un ectodominio de CSF2Ra (por ejemplo, SEQ ID NO: 742) o fragmento de unión a CSF2 del mismo) , un antagonista de IGFl o IGF2 (tal como un dominio de unión de inmunoglobulina específico para IGFl o IGF2 , o un ectodominio de IGF1R (por ejemplo, SEQ ID NOS: 746, 818) o IGFBP (por ejemplo, SEQ ID NOS: 747-753) o un fragmento de unión a IGF del mismo), o un antagonista de BLyS/APRIL (tal como, un dominio de unión de inmunoglobulina específico para BLyS/APRIL o TACI , o un ectodominio de TACI (por ejemplo, SEQ ID NO: 743) o un ectodominio de BAFFR (también conocido como" TNFRSF13C) (por ejemplo, los ácidos, aminoácidos 1-76 del Acceso al GenBank No. NP 443177.1) o un fragmento de unión a BLyS/APRIL del mismo) . En aún otras modalidades, el segundo dominio de unión es un agonista IL10, tal como un IL10 (por ejemplo, SEQ ID NO: 754) o un ILlOFc, o un sub-dominio funcional del mismo, o una proteína de unión de cadena individual, tal como scFv, que se une de manera específica a IL10R1 o IL10R2. 5 El complejo de IL6 con el receptor de IL6 soluble o de membrana (IL6ROÍ) se refiere en la presente como IL6xR cuando se refiere a IL6, con ya sea IL6Ra de membrana o IL6R soluble (SIL6ROÍ) , y como sIL6xR cuando se refiere solo al complejo de IL6 con sIL6Ra. En algunas modalidades, las "LQ proteínas de fusión multi -específicas que contienen un dominio de unión específico para IL6xR tienen una o más de las siguientes propiedades: (1) tienen mayor o igual afinidad para un complejo IL6xR que para IL6 sola o IL6ROÍ solo, o tiene una mayor afinidad para IL6Ra solo o un complejo IL6xR que para 15 IL6 sola; (2) compiten con gpl30 de membrana para la unión con un complejo sIL6xR o mejoran la unión de gpl30 soluble con un complejo sIL6xR; (3) inhiben de manera preferencial la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6; y (4) no inhibe la señalización de las citosinas de la familia 20 de gpl30 diferentes de IL-6.
Antagonistas de TNF-g Los TNFR son proteínas transmembrana de tipo I que tienen un dominio extracelular que contiene tres dominios de alto contenido de cisteína, bien tolerados (CRD1, CRD2 , CRD3) 25 característicos de la superfamilia de TNFR, y un cuarto menos bien conservado, próxima membrana CRD (Banner et al. (1993) Cell 73:431) . Un antagonista de TNF-a de esta descripción inhibe la actividad inflamatoria o hiperproliferativa de TNF-OÍ. Los dominios antagonistas pueden bloquear la multimerización de TNFR o la unión de TNF-a, o los dominios pueden unirse a componentes del sistema de receptores y bloquear la actividad ya sea al impedir la actividad de los ligandos o al impedir el montaje del complejo de receptor. En la técnica se conocen varios antagonistas de TNF-a, incluyendo anticuerpos anti-TNF, tal como infliximab, y receptor de TNF soluble (sTNFR) . Estos antagonistas de anticuerpos se unen e inhiben TNF-a, pero no inhiben de forma significativa TNF-ß .
Se pueden preparar anticuerpos anti-TNF, incluyendo anticuerpos monoclonales , usando técnicas conocidas y se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 6,509,015). Un antagonista de TNF-a de esta descripción también puede comprender uno o más dominios de unión a TNF-a presenten en un ectodominio de TNFR.
Los antagonistas de TNF-a contemplados incluyen un dominio o subdominio extracelular de TNFR, uno o más dominios de CRD de TNFR (tal como CRD2 y CRD3 ) , o dominios de unión, derivados de anticuerpo, específicos de TNF-a (análogos al dominio de unión, derivado de anticuerpo, específico de IL-6 o complejo IL6xR descrito en la presente) . En algunas modalidades, un antagonista de TNF-a puede ser un dominio extracelular ( "ectodominio" ) de un TNFR, tal como un ectodominio de TNFR1 o TNFR2. Como se usa en la presente, un ectodominio de TNFR se refiere a un sTNFR, uno o más CDR, o cualquier combinación de los mismos, de los dominios de TNFR. En ciertas modalidades, un antagonista de TNF-a comprende una porción amino-terminal de TNFR2 (también conocido como p75, TNFRSF1B) , tal como los primeros 257 aminoácidos de TNFR2 como se expone en el Acceso al GenBank No. NP_001057.1 (SEQ ID NO: 671) . En otras modalidades, un antagonista de TNF-OÍ comprende los aminoácidos 23-257 de SEQ ID NO: 671 (es decir, sin la secuencia guía nativa). En modalidades preferidas, un antagonista de TNF-OÍ comprende un fragmento de TNFR2 (por ejemplo, un ectodominio), tal como los aminoácidos 23-163 de SEQ ID NO: 671 o los aminoácidos 23-185 de SEQ ID NO: 671 o los aminoácidos 23-235 de SEQ ID NO: 671. En otras modalidades preferidas, un antagonista de TNF-OÍ comprende un derivado de un fragmento de TNFR2 , tal como los aminoácidos 23-163 de SEQ ID NO: 671, con una supresión del aminoácido glutamina en la posición 109 o los aminoácidos 23-185 de SEQ ID NO: 671 con una supresión del aminoácido glutamina en la posición 109 y una supresión del aminoácido prolina en la posición 109 o los aminoácidos 23-235 de SEQ ID NO: 671, con una supresión del aminoácido glutamina en la posición 109, una supresión del aminoácido prolina en la posición 109, y una sustitución del aminoácido aspartato en la posición 235 (por ejemplo, a una treonina, alanina, serina o glutamato) . En modalidades adicionales, un antagonista de TNF-a comprende una porción amino.- terminal de TNFR1 (también conocido como p55, TNFRSFIA), tal como los primeros 211 aminoácidos de TNFR1 como se expone en Acceso al GenBank No. NP_001056.1 (SEQ ID NO:672) . En otras modalidades, un antagonista de TNF-a comprende los aminoácidos 31-211 de SEQ ID NO: 672 (es decir, sin la secuencia guía nativa) .
En un aspecto, un antagonista de TNF-a o proteína de fusión del mismo de esta descripción es específico para TNF-a en donde tiene una afinidad con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 10"5 M a 10"13 M, o menos. En ciertas modalidades, el antagonista de TNF-a o proteína de fusión del mismo se une a TNF-a con una afinidad que es menor de aproximadamente 300 pM. Otra medida, la disociación cinética (kd) , también referida en la presente como kdisociaci6n, es una medida de la velocidad de disociación del complejo y de esta manera, el "tiempo de residencia" de la molécula objetivo o diana, unida por un dominio de unión de polipéptido de esta descripción. La kd (kdisociación) tiene unidades de 1/segundo. Los antagonistas de TNF-a de ejemplo de esta descripción pueden tener un kdisociación de aproximadamente de 10" /segundo (por ejemplo, aproximadamente un día) a aproximadamente 10" Vsegundo o menos. En ciertas modalidades, la kdisociación puede varias desde aproximadamente 10'Vsegundo, es decir de aproximadamente 10"2/segundo, aproximadamente 10"3/segundo, aproximadamente 10"4/segundo, aproximadamente 10"5/segundo, aproximadamente 10"6/segundo, aproximadamente 10"7/segundo, aproximadamente 10"8/segundo, aproximadamente 10"9/segundo, 5 aproximadamente 10"10/segundo o menos (ver Graff et al. (2004) Protein Eng. Des. Sel. 17:293) . En algunas modalidades, un antagonista de TNF-a o proteína de fusión del mismo de esta descripción se unirá a TNF-a con mayor afinidad y tendrá una menor proporción de kdisoCiación en comparación a la unión de o TNFR cognado a TNF-a. En algunas modalidades, un antagonista de TNF-a o proteína de fusión del mismo de esta descripción que bloquea o altera la dimerización de TNF-OÍ U otra actividad de superficie celular puede tener una afinidad más moderada (es decir, una K¿ de aproximadamente 10"8 M a aproximadamente 5 10"s M) y una constante de disociación más moderada (es decir, una kdisociación más cerca de aproximadamente 10"4/segundo) en comparación a la afinidad y velocidad de dimerización de TNFR cognado .
Los dominios de unión de ejemplo que funcionan como Q antagonistas de TNF-a de esta descripción se pueden generar como se describe en la presente o por una variedad de métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 6,291,161, 6,291,158). Las fuentes incluyen secuencias de genes de anticuerpo varias especies (que se 5 pueden formatear como scFv o Fab, tal como en una biblioteca de fagos) , incluyendo de humano, camélido (de camellos, dromedarios o llamas; Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363:446 y Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol, 275:413), tiburón (Roux et al. (1998) Proc . Nati. Acad. Sci. (EUA) 95:11804), pez (Nguyen et al. (2002) Immunogenetics , 54:39), roedor, aviar, ovino, secuencias que codifican para bibliotecas peptídicas aleatorias o secuencias que codifican para diversidad manejada de aminoácidos en regiones asa de núcleos alternativos no de anticuerpo, tal como dominios de fibrinógeno (ver, por ejemplo, Weisel et al. (1985) Science 230:1388), dominios Kunitz {ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos No. 6,423,498), dominios de lipocalina {ver, por ejemplo, WO 2006/095164) , dominios tipo V {ver, por ejemplo, publicación de patente de los Estados Unidos No. 2007/0065431) , dominios de lectina tipo C (Zelensky y Gready (2005) FEBS J. 272:6179), o similares. Adicionalmente, se pueden usar estrategias tradicionales para el desarrollo de hibridomas usando un TNF-o¡ sintético o ectodominio de TNFR de cadena individual como un inmunógeno en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, ratón HuMAbMR, ratón TCMR, ratón KMMR, llamas, pollos, ratas, hámsteres, conejos, etcétera) para desarrollar los dominios de unión de esta descripción.
En un ejemplo ilustrativo, los antagonistas de TNF-OÍ de esta descripción específicos para un TNF-a o ectodominio de TNFR de cadena individual se pueden identificar usando una biblioteca de fagos de Fab de fragmentos (ver, por ejemplo, Hoet et al. (2005) Biotechnol Naturaleza. 23:344) al examinar para la unión a un TNF-a sintético o recombinante (usando una secuencia de aminoácidos o fragmento de la misma como se exponen en el Acceso al GenBank No. NP 000585.2) o un ectodominio de TNFR de cadena individual . Un TNF- OÍ O un ectodominio de TNFR de cadena individual, como se describe en la presente o se conoce la técnica, se puede usar para este examen. En ciertas modalidades, una TNF- o ectodominio de TNFR de cadena individual usado para generar un antagonista de TNF - OÍ puede comprender además un dominio interpuesto o un dominio de dimerización, como se describe en la presente, tal como un dominio de Fe de inmunoglobulina, o fragmento del mismo .
En algunas modalidades, los dominios antagonistas de TNF - OÍ de esta descripción comprenden dominios VH y VL como se describe en la presente. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son de roedor (por ejemplo, ratón, rata) , humanizados o de humano. En modalidades adicionales, se proporcionan dominios antagonistas de TNF-a de esta descripción que tiene una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una o más regiones variables de cadena ligera, (VL) o a una o más regiones variables de cadena pesada, (VH) , o ambas, en donde cada CDR tiene hasta tres cambios de aminoácido (es decir, muchos de los cambios estarán en las regiones menos variables) .
Los términos "idénticos" o "por ciento de identidad" , en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido o de molécula de ácido nucleico, significa dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos sobre una región especificada (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de identidad) , en comparación y alineadas para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada, como se mide usando los métodos conocidos en la técnica, tal como un algoritmo de comparación de secuencias, por alineación manual, o por inspección visual. Por ejemplo, los algoritmos preferidos adecuados para determinar el por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen, en Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol . 215:403, respectivamente.
En cualquiera de estas u otras modalidades descritas en la presente, los dominios VL y VH se pueden arreglar en cualquier orientación y pueden estar separados por aproximadamente un ligador de cinco a aproximadamente 30 aminoácidos como se describe en a presente o cualquier otra secuencia de aminoácidos capaz de proporcionar una función separadora compatible con la interacción de los dos dominios de sub-unión. En ciertas modalidades, un ligador que une los dominios VL y VH comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 497-604 y 791-796, tal como el Ligador 47 (SEQ ID NO: 543) o Ligador 80 (SEQ ID NO: 576) . Los dominios de unión, multiespecífieos , tendrán al menos dos dominios específicos de sub-unión, por analogía a la organización de anticuerpos de camélidos, o al menos cuatro dominios específicos de sub-unión, por analogía a la organización más convencional de anticuerpos mamíferos de cadenas apareadas VH y VL.
En modalidades adicionales, los dominios de antagonistas de TNF-a y proteínas de fusión de los mismos, de esta descripción, pueden comprender un dominio de unión que incluye una o más regiones determinantes de complementariedad ("CDR") , o múltiples copias de una o más CDR, que se han obtenido, derivado o diseñado de regiones variables de un fragmento scFv o Fab anti-TNF-OC o anti-TNFR o de regiones variables de cadena pesada o ligera de los mismos.
Las CDR se definen de varias maneras en la técnica, incluyendo las definiciones de Kabat, Chothia, AbM y de contacto. La definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia y es la definición más comúnmente usada para predecir regiones CDR (Johnson et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:214) . La definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones asa estructurales (Chothia et al. (1986) J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al. (1989) Nature 342:877). La definición AbM, un compromiso entre las definiciones de Kabat y Chothia, es una suite integral de programas para modelado de estructuras de anticuerpo, producida por el Oxford Molecular Group (Martin et al. (1989) Proc . Nat'l. Acad. Sci. (EUA) 86:9268; Rees et al., ABMTM, un programa de computadora para modelar regiones variables de anticuerpos, Oxford, RU; Oxford Molecular, Ltd.). Recientemente, se ha introducido (ver MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 5:732), una definición adicional, conocida como la definición de contacto que se basa en un análisis de las estructuras cristalinas, complejas, disponibles .
Por convención, los dominios de CDR en la cadena pesada se refieren como Hl , H2 y H3 , que se numeran de manera secuencial en el orden que se mueve desde el amino-terminal al carboxi -terminal . La CDR-H1 es de aproximadamente diez a 12 residuos de longitud e inicia cuatro residuos después de Cys de acuerdo a las definiciones de Chothia y de AbM, o cinco residuos después de acuerdo a la definición de Kabat. El Hl se puede seguir por un Trp, Trp-Val, Trp-Ile, o Trp-Ala. La longitud de Hl es aproximadamente de diez a 12 residuos de acuerdo a la definición de AbM, en tanto que la definición de Chothia excluye los últimos cuatro residuos. La CDR-H2 inicia 15 residuos después del extremo de Hl de acuerdo a las definiciones de Kabat y de AbM, que en general se precede por la secuencia Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (pero se conocen varias variaciones) y en general se sigue por la secuencia Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. De acuerdo a la definición de Kabat, la longitud de H2 es de aproximadamente 16 a 19 residuos, en tanto que la definición de AbM predice que la longitud es de 9 a 12 residuos. La CDR-H3 inicia usualmente 33 residuos después del extremo de H2 , en general se precede por la secuencia de aminoácidos Cys-Ala-Arg y se sigue por el aminoácido Gly, y tiene una longitud que varía desde tres a aproximadamente 25 residuos.
Por convención, las regiones CDR en la cadena ligera se refieren como Ll, L2, y L3 , que se numeran de manera secuencial en el orden que se mueve desde el amino-terminal al carboxi -terminal . La CDR-L1 inicia en general en aproximadamente el residuo 24 y sigue en general una Cys . El residuo después de la CDR-L1 es siempre Trp, que empieza una de las siguientes secuencias: Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, o Trp-Tyr-Leu. La longitud de CDR-L1 es aproximadamente de diez a 17 residuos. La CDR-L2 inicia aproximadamente 16 residuos después del extreme de Ll y seguirá en general los residuos Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys, o Ile-Phe. La CDR-L2 es de aproximadamente siete residuos de longitud. La CDR-L3 usualmente inicia 33 residuos después del extremo L2 y en general sigue una Cys, que en general se sigue por la secuencia Phe-Gly-XXX-Gly y tiene una longitud de aproximadamente siete a 11 residuos.
De esta manera, un dominio de unión de esta descripción puede comprender una CDR individual de una región variable de un anti-TNF-oc o anti-TNFR, o puede comprender múltiples CDR que pueden ser las mismas o diferentes. En ciertas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para TNF-a o TNFR que comprenden regiones menos variables y regiones CDR1, CDR2 y CDR3 , en donde (a) el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos de una CDR3 de cadena pesada; o (b) el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera; o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) ; o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) y en donde la VH y VL se encuentran en la misma secuencia de referencia. En modalidades adicionales, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para TNF-a o TNFR que comprende regiones menos variables y regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 , en donde (a) el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos de una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada; o (b) el dominio VL comprende una secuencia de aminoácidos de una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) ; o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) , en donde las secuencias de aminoácidos de VH y VL son de la misma secuencia de referencia .
En cualquiera de las modalidades descritas en la presente que comprenden CDR específicas, un dominio de unión puede comprender (i) un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH, en donde cada CDR tiene a lo mucho tres cambios de aminoácido (es decir, muchos de los cambios estarán en las regiones menos variables) ; o (ii) un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio VL, en donde cada CDR tiene a lo mucho tres cambios de aminoácido (es decir, muchos de los cambios estarán en las regiones menos variables) ; o (iii) tanto un dominio VH de (i) como un dominio de VL de (ii) ; o tanto un dominio VH de (i) como un dominio VL de (ii) , en donde la VH y VL son de la misma secuencia de referencia.
Un dominio de antagonista de TNF-oc de las proteínas de fusión de esta descripción puede ser un dominio tipo inmunoglobulina tal como un núcleo de inmunoglobulina . Los núcleos de inmunoglobulina contemplados por esta descripción incluyen, pero no se limitan a, un scFv, un anticuerpo de dominio o un anticuerpo solo de cadena pesada. En un scFV, esta descripción contempla que las regiones variables de cadena pesada y ligera se unen por un péptido ligador conocido en la técnica por ser compatible con la acumulación de dominios o regiones en una molécula de unión. Los ligadores de ejemplo son ligadores basados en el motivo de ligador Gly4Ser (tal como Gly4Ser)n, en donde n=l-5. Si un dominio de unión de una proteína de fusión de esta descripción se basa en una inmunoglobulina no humana o incluye CDR no humanas, el dominio de unión se puede "humanizar" de acuerdo a los métodos conocidos en la técnica.
De manera alternativa, un dominio de antagonista de TNF-OC de las proteínas de fusión de esta descripción puede ser un núcleo diferente de un núcleo de inmunoglobulina. Otros núcleos contemplados por esta descripción presentan las CDR específicas de TNF-a en una conformación funcional. Otros núcleos contemplados incluyen, pero no se limitan a, una molécula de dominio A, un dominio de fibronectina III, una anticalina, una molécula de unión, manejada, de repetición de anquirina, una adnectina, un dominio de Kunitz o un aficuerpo de dominio de proteína AZ .
Antagonistas de IL6 Como se señal anteriormente, en ciertas modalidades la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un antagonista de IL6 (por ejemplo inhibe de manera preferencial la transseñalización de IL6 o inhibe tanto la cis- como la transseñalización de IL6) . En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona proteínas de fusión, multiespecíficas, que contiene una región o dominio de unión, específico para un complejo de IL6/IL6R que tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) mayor o igual afinidad para un complejo IL6xR que para IL6 o IL6Ra solos, o tiene mayor afinidad para IL6Ra solo o un complejo de IL6/IL6R que para IL6 sola, (2) compite con gpl30 de membrana para la unión con un complejo de SIL6/IL6R o incrementa la unión de gpl30 soluble al complejo de SIL6/IL6R, (3) inhibe de manera preferencial la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, o (4) no inhibe la señalización de citosinas de la familia gpl30 diferentes de IL6. En ciertas modalidades preferidas, un dominio de unión, específico para un complejo de IL6/IL6R de acuerdo a esta descripción, tiene las siguientes propiedades: (1) mayor a afinidad para IL6 solo o un complejo de IL6/IL6R que para IL6 sola, (2) incrementa la unión de gp!30 soluble al complejo sIL6xR, (3) inhibe de manera preferencial la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, y (4) no inhibe la señalización de las citosinas de la familia gpl30 diferente de IL6. Por ejemplo, una región de unión o 5 dominio específico para un complejo de IL6/IL6R puede ser un dominio de unión, variable, de inmunoglobulina, o derivado del mismo, tal como un anticuerpo, Fab, scFv, o similares. En el contexto de esta descripción, se debe entender que una región o dominio de unión, específico para un complejo de IL6/IL6R, -LO no es gpl30 como se describe en la presente.
Como se usa en la presente, "complejo IL6xR" o "IL6xR" se refiere a un complejo de IL6 con un receptor de IL6, en donde el receptor de IL6 (también conocido como, por ejemplo, IL6Ra, IL6RA, IL6R1, y CD126) es ya sea una proteína 15 de membrana (referida en la presente como mIL6R o mIL6Ro¡) o una forma soluble (referida en la presente como sIL6R o sIL6Ra) . El término "IL6R" abarca tanto mIL6Ra y sIL6Ra. En una modalidad, IL6xR comprende un complejo de IL6 y mIL6Ra. En ciertas modalidades, el complejo IL6xR se mantiene 20 conjuntamente mediante uno o más enlaces covalentes . Por ejemplo, el carboxi-terminal de un IL6R se puede fusionar al amino-terminal de una IL6 mediante un ligador peptídico, que se conoce en la técnica como Hiper-IL6 (Ver, por ejemplo, Fischer et al. (1997) Nat . Biotechnol . 15:142). Un ligador de 25 Hiper-IL6 puede estar comprendido de un compuesto reticulador, una secuencia de uno a 50 aminoácidos, o una combinación de los mismos. Un Hiper-IL6 puede incluir además una marca o marcas peptídicas adicionales (por ejemplo, AviFlagHis) , o incluir además un dominio de dimerización, tal como un dominio de inmunoglobulina Fe o una sub-región de dominio constante de inmunoglobulina . En ciertas modalidades, el complejo IL6xR se mantiene conjuntamente mediante interacciones no covalentes, tal como por unión de hidrógeno, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der aal, puentes de sal, interacciones hidrófobas, o similares, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, una IL6 y el IL6R pueden asociarse de manera natural de forma no covalente (por ejemplo, como se encuentra en la naturaleza, o como proteínas sintéticas o recombinantes) o cada uno se puede fusionar a un dominio que promueve la multimerización, tal como un dominio Fe de inmunoglobulina, para mejorar adicionalmente la estabilidad del complejo.
Como se usa en la presente, "gpl30" se refiere a una proteína de transducción de señal que se une a un complejo IL6xR. La proteína gpl30 puede estar en una membrana (mgpl30) , ser soluble (sgpl30) o cualquier otra forma funcional de la misma. Las proteínas gpl30 de ejemplo tienen una secuencia como se expone en el Acceso al GenBank No. NP_002175.2 o cualquier forma soluble o derivada de la misma (ver, por ejemplo Narazaki et al. (1993) Blood 82:1120 o Diamant et al. (1997) FEBS Lett . 412:379). A manera de ilustración y no deseando que se una por teoría, una proteína mgpl30 puede unirse ya sea a un IL6/mILR o un complejo de IL6/sILR, en tanto que sgpl30 se une principalmente con el complejo de IL6/sILR (ver Scheller et al. (2006) Scand. J. Immunol . 63:321). De esta manera, ciertas modalidades de los dominios de unión, o proteínas de fusión de los mismos, de la presente descripción, pueden inhibir la trans-señalización del complejo IL6xR por la unión con mayor afinidad a IL6xR que ya sea IL6 o IL6ROÍ solos y de manera preferente al competir con el complejo sIL6xR que se une a mgpl30. Un dominio de unión de la presente descripción "compite" con gpl30 que se une a sIL6xR cuando (1) un dominio de unión o proteína de fusión del mismo impide que gpl30 se una a sIL6xR y el dominio de unión se une a sIL6xR con igual o mayor afinidad en comparación a la unión de gpl30 con sIL6xR, o (2) un dominio de unión o proteína de fusión del mismo mejora o promueve la unión de sgpl30 a sIL6xR y de este modo reduce la cantidad de tiempo en que está disponible el complejo sIL6xR para la unión a mgpl30.
En un aspecto, un dominio de enlace de antagonista de IL6 de esta descripción tiene una afinidad para IL6 o complejo IL6xR que es al menos 2 veces a 1000 veces mayor que para IL6Ra solo o tiene una afinidad para IL6Ra o complejo IL6xR que es al menos 2 veces a 1000 veces mayor que para IL6 sola. Por la unión a IL6, IL6R, o complejo IL6xR, un antagonista de IL6 de esta descripción inhibe de manera preferente la cys- y trans-señalización de IL6. En ciertas modalidades, la afinidad de un dominio de unión para IL6 o complejo sIL6xR es aproximadamente la misma como la afinidad de gpl30 para el complejo IL6xR, con "aproximadamente el mismo" significado igual o hasta aproximadamente 2 veces mayor afinidad. En ciertas modalidades, la afinidad del dominio de unión para IL6, IL6R, o complejo IL6xR es mayor que la afinidad de gpl30 para el complejo IL6xR por al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, 1000 veces, o mayor. Por ejemplo, si la afinidad de gpl30 para un complejo IL6xR es aproximadamente 2 nM (Ver, por ejemplo, Gaillard et al. (1999) Eur. Cytokine Netw. 10:337), entonces, un dominio de unión que tiene al menos una afinidad 10 veces mayor para el complejo IL6xR tendrá una constante de disociación (¾) de aproximadamente 0.2 nM o menos.
En modalidades adicionales, un dominio de unión del antagonista de IL6 de esta descripción comprende una secuencia de polipéptido que (a) se une a un complejo sIL6xR con una afinidad al menos 2 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces a 100 veces, 100 veces a 1000 veces mayor que ya sea IL6 o IL6ROÍ solos, y (b) compite con gpl30 de membrana para la unión al complejo sIL6xR o incrementa la unión de gpl30 soluble al complejo sIL6xR. En modalidades adicionales, un dominio de un unión de polipéptido de esta descripción que se une a un complejo sIL6xR con una afinidad al menos 2 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces a 100 veces, 100 veces a 1000 veces mayor que ya sea para IL6 o IL6Ra sola puede también (i) inhibir de manera más significativa o preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, (ii) no inhibir la señalización de los miembros de la familia de citosinas de gpl30 diferentes de IL6, (iii) inhibe preferencialmente la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6 y no inhibe de manera detectable la señalización de las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6, y (iv) puede tener dos o más de estas propiedades, o (v) puede tener todas estas propiedades .
En ciertas modalidades, un dominio de unión de antagonista de IL6 de polipéptido, de esta descripción, se une a un complejo sIL6xR con una afinidad al menos 2 veces a 1000 veces mayor que ya sea para IL6 o IL6Ra, solos, e inhibe de manera más significativa y preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6. Para "inhibir de manera preferencial la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6" · se refiere a alterar la trans-señalización a un grado que se disminuya de manera medible la actividad de sIL6xR en tanto que no se altere de manera sustancial la disminución en la cis-señalización de IL6 (es decir, que significa inhibición es mínima, no existente o no medible) . Por ejemplo, un biomarcador para la actividad de sIL6xR (por ejemplo, expresión de fase aguda de actiquimiotripsina (ACT) en células HepG2) se puede medir para detectar la inhibición de transseñalización. Un ensayo representativo se describe por Jostock et al. (Eur. J. Biochem., 2001); brevemente, se pueden estimular células HepG2 para sobre-expresar ACT en la presencia de sIL6xL (trans-señalización) o IL6 (cis-señalización) , pero adicionando spgl30 inhibirá la sobre-expresión de ACT inducida por sIL6xR en tanto que no afecta de manera sustancial la expresión inducida por IL6. De manera similar, un dominio de unión de polipéptido de esta descripción que inhibe de manera preferencial la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6 inhibirá la sobre-expresión de ACT inducida por sIL6xR (es decir, inhibe la trans-señalización) en tanto que no afecta de forma sustancial la expresión inducida por IL6 (es decir, no disminuye de forma medible la cis-señalización) . Estos y otros ensayos conocidos en la técnica se pueden usar para medir la inhibición preferencial de la trans-señalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6 (ver, por ejemplo, otros biomarcadores descritos en Sporri et al. (1999) Int . Immunol . 11:1053; Mihara et al. (1995) Br. J. Rheum. 34:321; Chen et al. (2004) Immun. 20:59).
En modalidades adicionales, no se inhibe de forma sustancial la señalización por las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6 por los polipéptidos del dominio de unión o proteínas de fusión, multiespecíficas de los mismos, de esta descripción. Por ejemplo, la cis- y trans-señalización por un complejo IL6xR mediante gpl30 se inhibirá, pero la señalización por una o más de otras citosinas de la familia de gpl30 se afectará al mínimo o no se afectará, tal como la señalización mediante el factor inhibidor de leucemia (LIF) , factor neurotrópico ciliar (CNTF) , neuropoyetina (NPN) , citosina tipo cardiotropina (CLC) , oncostatina M (OSM) , IL-11, IL-27, IL-31, cardiotrofina-1 (CT-1) , o cualquier combinación de los mismos.
Se apreciará, por los expertos en la técnica que, la vida media in vivo preferida de un dominio de unión de esta descripción está en el orden de días o semanas, pero en tanto que puede ser baja la concentración del dominio de unión, el objetivo o diana puede ser abundante puesto que la producción de IL6 o sIL6 puede ser bastante elevada en los estado de enfermedad (ver, por ejemplo, Lu et al. (1993) Cytokine 5:578). De esta manera, en ciertas modalidades, un dominio de unión de esta descripción tiene una kDISociAcióN de aproximadamente 10"5/segundo (por ejemplo, aproximadamente un día) o menos. En ciertas modalidades, la k.DISociAcióN puede variar desde aproximadamente 10_1/segundo, aproximadamente 10" 2/segundo, aproximadamente 10"3/segundo, aproximadamente 10" Vsegundo, aproximadamente 10"5/segundo, aproximadamente 10" 5 Vsegundo, aproximadamente 10"7/segundo, aproximadamente 10" Vsegundo, aproximadamente 10"9/segundo, aproximadamente 10" 10/segundo, o menos.
En un ejemplo ilustrativo, los dominios de unión de esta descripción específicos para una IL6 o complejo IL6xR se -LO identificaron en una biblioteca de fagos Fab, de fragmentos (ver. Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol . 23:344) al examinar para la unión a un complejo IL6xR sintético. El complejo IL6xR sintético usado para este examen comprende una estructura de N-IL6ROÍ (frag) -L1-IL6 (frag) -L2-ID-C, en donde N es el amino- 15 terminal y C es el caboxi-término, IL6Ra(frag) es un fragmento de IL6ROÍ de longitud completa, IL6(frag) es un fragmento de IL6, Ll y L2 son ligadores e ID es un dominio de intervención o de dimerización, tal como un dominio Fe de inmunoglobulina .
De manera más específica un IL6xR (que es una forma 20 de Hiper-IL6) usado para identificar los dominios de unión, específicos para el complejo IL6xR, tiene una estructura, desde el amino-terminal al carboxi -terminal como sigue; (a) un fragmento central de 212 aminoácidos de IL6Ra que le faltan los primeros 110 aminoácidos de la proteína de longitud 25 completa y una porción carboxi-terminal que dependerá de la isoforma usada (ver Acceso al GenBank No. NP_000556.1, isoforma 1 o NP_852004.1, isoforma 2) fusionado a (2) un ligador de G3S que a su vez está fusionado a (3) un fragmento carboxi -terminal de 175 aminoácidos de IL6 (es decir, que carece de los primeros 27 aminoácidos de la proteína de longitud completa; Acceso al GenBank No. NP_000591.1) que a su vez está fusionado a (4) un ligador que es una charnela de IgG2A como se expone en SEQ ID NO: 589, que finalmente está fusionado a un dominio de dimerización comprendido de un dominio Fe de inmunoglobulina Gl (IgGl) . En ciertas modalidades, el dominio de dimerización comprendido de un dominio Fe de IgGl tiene uno o más de los siguientes aminoácidos mutados (es decir, tiene un diferente aminoácido en esa posición) : leucina en la posición 234 (L234) , leucina en la posición 235 (L235) , glicina en la posición 237 (G2347) , glutamato en la posición 318 (E318) , lisina en la posición 320 (K320) , lisina en la posición 322 (K322) , o cualquier combinación de los mismos (numeración EU) . Por ejemplo, cualquiera de estos aminoácidos se puede cambiar a alanina. En una modalidad adicional, un dominio Fe de IgGl tiene cada uno de L234, L235, G237, E318, K320, y K322 (de acuerdo a la numeración de EU) mutado a alanina (es decir, L234A, L235A, G237A, E318A, K320A, y K322A, respectivamente) .
En una modalidad, un complejo IL6xR usado para identificar los dominios de unión del antagonista de IL6, de esta descripción, tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 606. En ciertas modalidades, se proporcionan polipéptidos que contienen un dominio de unión específico para un complejo IL6xR, en donde el IL6xR es un sIL6xR y tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SE IQ NO: 606. En modalidades adicionales, los polipéptidos que contienen un dominio de unión específico para un complejo IL6xR (1). tienen una mayor o igual afinidad para un complejo IL6xR que para IL6 o IL6Ra solos, o tiene mayor afinidad para IL6Ra solos o un complejo IL6xR que para IL6 sola, (2) compiten con gpl30 de membrana para la unión con un complejo sIL6xR o incrementan la unión de gpl30 soluble al complejo sIL6xR, (3) inhiben de manera preferencial la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, o (4) no inhiben la señalización de las citosinas de la familia gpl30 diferentes de IL6, (5) tienen cualquier combinación de los mismos de las propiedades (l)-(4), o (6) tienen todas las propiedades de (l)-(4). Otros complejos IL6xR de ejemplo que se pueden usar para identificar dominios de unión de la presente descripción o usar como complejos de referencia para medir cualquiera de las propiedades de unión, mencionadas anteriormente, se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Números 2007/0172458; 2007/0031376; y patentes de los Estados Unidos Números 7,198,781; 5,919,763.
En algunas modalidades, los dominios de unión del antagonista de IL6 de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para IL6, IL6R o complejo IL6xR como se describe en la presente, de manera preferente IL6 humana, IL6R humano, o complejo IL6xR humano. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son de roedor (por ejemplo, ratón, rata) , humanizados o de humano. Los ejemplos de dominios de unión que contienen estos dominios VH y VL específicos para IL6, IL6R, o IL6xR se exponen en SEQ ID NOS:435-496 y 373-434, respectivamente. En modalidades adicionales, se proporcionan dominios de unión de polipéptido específicos para un complejo IL6xR que se une al IL6xR con una mayor o igual afinidad que ya sea IL6 o IL6RCC solos, y ya sea compite con gpl30 de membrana para la unión al complejo sIL6xR o aumenta la unión de gpl30 soluble al complejo sIL6xR, en donde el dominio de unión comprende una secuencia que es al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una o más regiones variables de cadena ligera (VL) o una o más regiones variables de cadena pesada (VH) , o ambas, como se expone en SEQ ID NOS: 373-434 y 435-496, respectivamente, en donde cada CDR tiene hasta tres cambios de aminoácido (es decir, muchos de los cambios se encuentran en una o más de las regiones menos variables) .
En modalidades adicionales, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para IL6xR como se expone en SEQ ID NOS:435-496 y 373 1-434, respectivamente , que son al menos 80 , al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 al menos 93 %, al menos 94 al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o al menos 99. 5 % idénticos a la secuencia de aminoácidos de este dominio VH, dominio VL, o ambos, en donde cada CDR tiene cero, uno, dos, o tres cambios de aminoácido. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un dominio VH, dominio VL, o ambos de esta descripción puede ser al menos 80 al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 % , al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 % , al menos 91 al menos 92 al menos 93 al menos 94 % , al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % al menos 99 %, O al menos 99 .5 idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH (por ejemplo, aminoácidos 512 a 631) , dominio VL (por ejemplo, aminoácidos 649 a 758) , o ambos, respectivamente, de una molécula xceptor de ejemplo que contienen el dominio TRU6 (XT6 ) -1002 de unión (ver SEQ ID NO:608), en donde cada CDR tiene cero, uno, dos o tres cambios de aminoácido.
En cualquiera de estas u otras modalidades descritas en la presente, los dominios VL y VH se pueden arreglar en cualquier orientación y se pueden separar por hasta aproximadamente un ligador de diez aminoácidos como se describe en la presente o cualquier otra secuencia de aminoácidos capaz de proporcionar una función separadora compatible con la interacción de los dos dominios de sub-unión. En ciertas modalidades, un ligador que une los dominios VH y VL comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:497-604 y 791-796, tal como el Ligador 47 (SEQ ID NO:543) o Ligador 80 (SEQ ID NO:576).
En modalidades adicionales, los dominios de unión del antagonista de IL6 de esta descripción pueden comprender una o más regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), o múltiples copias de una o más CDR, que se han obtenido, derivado o diseñado de regiones variables de un fragmento scFv o Fab anti-IL6, anti-IL6R o anti-complejo IL6xR o de regiones variables de cadena pesada o ligera de los mismos. De esta manera, un dominio de unión de esta descripción puede comprender una CDR3 individual de una región variable de un anti-IL6, anti-IL6xR o anti-IL6xr o puede comprender múltiples CDR que pueden ser las mismas o diferentes. En ciertas modalidades, los dominios, de unión, antagonistas de IL6 de esta descripción comprenden dominios VH y VL que comprenden regiones variables y regiones CDR1, CDR2 y CDR3 , en donde (a) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR3 de cadena pesada encontrada en cualquiera de SEQ ID NOS: 435-496; o (b) el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR3 de cadena ligera encontrada en cualquiera de SEQ ID NOS : 373 -434 ; o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) ; o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) y en donde la VH y VL se encuentran en la misma secuencia de referencia. En modalidades adicionales, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para un complejo IL6xR que comprende regiones menos variables y regiones CDRl, CDR2 y CDR3 , en donde (a) el dominio VH comprende una secuencia de aminoácidos de CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, encontradas en cualquiera de SEQ ID NOS : 435 -496 ; ; o (b) el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de una CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera encontradas en cualquiera de SEQ ID NOS:373-434; o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) ; o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) , en donde las secuencias de aminoácidos de VH y VL son de la misma secuencia de referencia. Las CDR de dominio variable de cadena ligera y pesada de ejemplo dirigidas contra IL6, IL6R o complejo IL6xR se proporcionan en SEQ ID NO: 1-187 y 787-792, y SEQ ID NO:187-371 y 793-798, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera del antagonista de IL6 se proporcionan en SEQ ID NO: 373-434 y 799-804 e IL6, con las correspondientes regiones variables de cadena pesada que se proporcionan en SEQ ID NO:435-496 y 805-810, respectivamente.
En cualquiera de las modalidades descritas en la presente que comprenden CDR específicas contra IL6, IL6R, o IL6xR, un dominio de unión puede comprender (i) un dominio de VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH encontrado en cualquiera de SEQ ID NOS:435-496 y 805-810; o (ii) un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio VL encontrado en cualquiera de SEQ ID NOS: 373-434 y 799-804; o (iii) tanto un dominio VH de (i) como un dominio de VL de (ii) ; o tanto un dominio VH de (i) como un dominio VL de (ii) , en donde la VH y VL son de la misma secuencia de referencia.
En ciertas modalidades, un dominio de unión de esta descripción puede ser un dominio tipo inmunoglobulina, tal como un núcleo de inmunoglobulina. Los núcleos de inmunoglobulina contemplados en esta descripción incluyen scFv, Fab, un anticuerpo de dominio, o un anticuerpo solo de cadena pesada. En modalidades adicionales, se proporcionan anticuerpos anti-IL6 o anti-IL6xR (por ejemplo, no humanos tal como de ratón o rata, quiméricos, humanizados, humanos) o fragmentos Fab o fragmentos scFv que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH y VL expuesto en cualquiera de SEQ ID NOS:435-496 y 805-801, y 373-434 y 799-804, respectivamente, que también tienen una o más de las siguientes propiedades: (1) tienen mayor o igual afinidad para un complejo IL6xR que para IL6 o IL6Ra solos, o tiene mayor afinidad para IL6Ra solo o un complejo IL6xR que para IL6 sola, (2) compiten con gpl30 de membrana para la unión con un complejo sIL6xR o incrementa la unión de gpl30 soluble al complejo sIL6xR, (3) inhiben de manera preferencial la transseñalización de IL6 con respecto a la cis-señalización de IL6, o (4) no inhiben la señalización de las citosinas de la familia gpl30 diferentes de IL6. Estos anticuerpos, Fab y scFv se pueden usar en cualquiera de los métodos descritos en la presente. En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona polipéptidos que contiene un dominio de unión que es un antagonista de IL6 (es decir, puede inhibir la cis-trans-señalización de IL6) . En modalidades adicionales, un antagonista de IL6 de acuerdo a esta descripción no inhibe la señalización de las citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6. Los antagonistas de IL6 de ejemplo incluyen dominios de unión específicos para IL6 o IL6xR, tal como un dominio de unión variable de inmunoglobulina, o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, Fab, scFv, o similares) .
De manera alternativa, los dominios de unión de esta descripción pueden ser parte de un núcleo diferente de una inmunoglobulina. Otros núcleos contemplados incluyen una molécula de dominio A, un dominio de fibronectina III, una anticalina, una molécula de unión, manejada, de repetición de anquirina, una adnectina, o un dominio de Kunitz, o un aficuerpo de dominio de proteína AZ .
Antagonistas de RA KL Como se señala anteriormente, en ciertas modalidades, la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un antagonista de RANKL (es decir, puede inhibir la señalización de RANK) . Los antagonistas RANKL de ejemplo incluyen dominios de unión específicos para un RANKL o RANK tal como un dominio de unión variable de inmunoglobulina o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, Fab, scFv, o similares) , o un ectodominio de OPG o fragmento del mismo.
La osteoprotegrina (OPG, también conocida como OCIF) es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) . La OPG es una proteína soluble, segregada que se expresa inicialmente como una proteína precursora que tiene un péptido de señal de 21 residuos de aminoácido. La mitad amino-terminal de la proteína contiene cuatro repeticiones de alto contenido de cisteína, que son características de los miembros de la superfamilia de receptores de TNF. La porción carboxi-terminal de la proteína contiene dos regiones homologas de dominio muerto. La OPG se expresa en osteoblastos y tejidos incluyendo corazón, riñon, hígado, bazo y médula ósea (ver, por ejemplo, Boyce y Xing, Arthritis Res. Ther. (2007) 9 (Suppl 1) :S1) . Los ligandos para OPG son RA KL y TRAIL (ligando inductor de apoptosis relacionado a TNF) .
El sistema OPG/RANK/RANKL está comprendido en la formación de osteoclastos . Los osteoclastos son células de resorción ósea, que son crítica para el remodelado óseo y salud del esqueleto. RANKL se une a RANK lo que provoca señalización de tapa posterior. RANK activado se une a TRAF (factores asociados al receptor de factor de necrosis tumoral) <3ue a su vez conduce a la activación de NF-KB. Se activan siete rutas por la señalización mediada por NF-KB incluyendo inhibición de NF-KB-cinasas/NF-KB , cinasa amino terminal de c-Jun/proteína-1 activadora, c-myc calcineurina/factor nuclear de células T activadas, src, KK6/p38/MITF y cinasa relacionada a señal extracelular . La proteína 2 de aglutinante asociado a Grb-2 también se une a RANK y medía la señalización. La OPG funciona por la unión a RANKL y le impide asociarse con RANK. Por lo tanto, la OPG es un regulador negativo de la resorción ósea.
En algunas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para un RANKL o RANK. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son humanos. En los ejemplos de dominios de unión que contienen estos dominios VH y VL específicos para RANKL, incluyen aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 6, 740, 522.
En ciertas modalidades, un antagonista de RANKL comprende una proteína OPG (también conocida como TR1 u OCIF) que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en el Acceso al GenBank No. NP_002537.3 (SEQ ID NO: 737), o cualquier fragmento de la misma que continua funcionando como un antagonista de RANKL. En otras modalidades, un antagonista de RANKL comprende los aminoácidos 22-401 de SEQ ID NO : 737 (es decir, carece de la secuencia guía nativa de 21 aminoácidos) . En modalidades adicionales, se proporcionan dominios de unión de polipéptidos específicos para RANKL, en donde el dominio de unión comprende una secuencia que al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 737 o a los aminoácidos 22-401 de SEQ ID NO: 737, en donde el dominio de unión de polipéptido se une a RANKL e inhibe la actividad del mismo.
Antagonistas de IL7 Como se señala anteriormente, en ciertas modalidades la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un antagonista de IL7 (es decir, puede inhibir la señalización de IL7ROÍ) . Los antagonistas de IL7 de ejemplo incluyen dominios de unión específicos para una IL7 tal como un dominio de unión, variable, de inmunoglobulina, o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, Fab, scFv, o similares) , o un ectodominio de IL7R0C o fragmento del mismo.
La interleucina-7 (IL7) es una citosina producida por células reticulares fibroblásticas en la zona de células T en órganos linfoides que se unen al receptor de interleucina-7 (IL7R) (Palmer et al. (2008) Cell. Mol. Immun. 5:79) . IL7 estimula la proliferación de células B precursoras, timocitos, progenitores de células T, y células T CD4+ y CD8+ maduras. En general, IL7 funciona en capacidades de pro- supervivencia y proliferativas y desempeña un papel inmunomodulador en células dendríticas. Las cascadas de señalización principales activadas por el sistema de IL7 incluyen rutas Jak-Stat y PI3K-Akt. La unión de IL7R a IL7 estimula la trans- fosforilación de las cinasas Jak unidas a receptor. Las cinasas Jak activadas fosforilan los residuos de tirosina en el receptor, y las fosfotirosinas resultantes sirven como sitios de acoplamiento para proteínas de unión SH2 , incluyendo la familia Stat de factores de transcripción. Las cinasas Jak entonces activas las proteínas Stat reclutadas mediante fosforilación.
IL7R está compuesto de dos polipéptidos separados: la cadena alfa de IL7R (IL7Ra) y la cadena gamma común (IL7Ryc) . Ambas proteínas son miembros de la superfamilia hematopoyetina (Ouellette et al. (2003) Prot . Exp . Pur . 30:156) . El IL7Ro¡ se expresa en células B, timocitos, progenitores de células T, células T CD4+ y CD8+ maduras, células dendríticas y monocitos. Se expresa como una proteína precursora de 459 aminoácidos que contiene una secuencia de señal de 20 aminoácidos, un dominio de unión a ligando, extracelular de 219 aminoácidos, un dominio transmembrana de 25 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 195 aminoácidos.
En algunas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden los dominios VH y VL específicas para una IL7. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son humanos. Los ejemplos de dominios de unión que contienen estos dominios VH y VL específicas para IL7, incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,714,585. En ciertas modalidades, un antagonista de IL7 puede ser un dominio extracelular ("ectodominio") de un IL7R . Como se usa en la presente, un ectodominio de IL7Rcc se refiere a una porción extracelular de IL7Ra, un IL7Ra soluble, un dominio tipo II de fribonectina de IL7Roc, cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, un antagonista de IL7 comprende una porción amino-terminal de IL7R0C, tal como los primeros 240 aminoácidos de IL7R0C expuestos en el Acceso al GenBank No. NP_002176.2 (SEQ ID NO: 738), o cualquier fragmento de los mismos que continúen funcionando como un antagonista de IL7. En otras modalidades, un antagonista de IL7 comprende los aminoácidos 21-240 o 120-230 de SEQ ID NO: 738 (es decir, sin la secuencia guía nativa y el dominio tipo II de fibronectina , respectivamente) . En modalidades adicionales, se proporcionan dominios de unión de polipéptido específicos para IL7, en donde el dominio de unión comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 738 o a los aminoácidos 21 a 240 o 120 a 130 de SEQ ID NO: 738, en donde el dominio de unión de polipéptido se une a IL7 e inhibe la actividad del mismo.
Antagonistas de IL7A/F Como se señala anteriormente, en ciertas modalidades la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un antagonista de IL17A/F (es decir, pueden inhibir la señalización de IL17RA, IL17RC o IL17RA/C) . Los antagonistas de IL17A/F de ejemplo incluyen los dominios de unión específicos para un IL17A, IL17F o IL17A/F, como un dominio, variable, de inmunoglobulina o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, FAb, scFv, o similares) , o un ectodominio de IL17RA, IL17RC o IL17RA/C o fragmento del mismo .
La superfamilia de citosinas de interleucina 17 se produce por una subpoblación distinta de células auxiliare T referidas como Thl7. Existen seis citosinas IL17 ( IL17A-IL17F) y cinco receptores ( IL17RA- IL17RE) que se han identificado (Kolls y Linden, 2004, Immunity, 21:467) . IL17A e IL17F comparten aproximadamente 55 % de homología y tienen funciones biológicas similares, aunque se cree que las actividades de IL17A son . al menos 10 veces más potentes que aquellas de IL17F. Tanto IL17A como IL17F forman homodímeros y estudios recientes han indicado que IL17A e IL17F también forman heterodímeros con potencia intermedia de señalización ( right et al. (2007) J. Biol . Chem. 282:13447; Chang et al (2007) Cell Res 17:435). El heterodímero de IL17A/IL17F puede ser la forma dominante de esta citosina in vivo (Shen y Gaffen (2008) Cytokine 41:91) .
La interleucina 17A (IL17A; originalmente conocida como IL17, también conocida como CTLA8) es una citosina potente. La unión de IL17A a su receptor, IL17RA, estimula la secreción de varias moléculas proinflamatorias , incluyendo el factor-a de necrosis tumoral (TNFOL) , interleucina 6 (IL6) , interleucina lP(ILip) y prostaglandina E2 (PGE2) de macrófagos (Jovanovic et al. (1998) J. Immunol . 160:3513). La IL6 fue uno de los objetivos génicos de IL17A más anteriormente definidos y se usa como el bioensayo normal para la actividad de IL17A. Se ha mostrado que IL17A activa de manera sinérgica a IL6 con otras citosinas, incluyendo ILip, TNFy, TNFa e IL22, aunque no está bien entendido el mecanismo subyacente de sinergia (ver, por ejemplo, Teunissen et al. (1998) J. Invest . Dermatol . 111:645) .
La interleucina 17F (IL17F, también conocida como ML-1) es una proteína segregada de 17kD, igual que IL17A, forma un homodímero enlazado a disulfuro. IL17A e IL17F tienen funciones biológicas similares, aunque se cree que las actividades de IL17A son más potentes que aquellas de IL17F. Los estudios recientes han indicado que IL17A e IL17F también forman heterodímeros con potencia intermedia de señalización (Wright et.al. (2007) J. Biol Chem 282:13447-55; Chang et al. (2007) Cell Res. 17:435). Se ha sugerido que el heterodímero de IL17A/IL17F puede ser la forma dominante de esta citosina in vivo (Shen y Gaffen (2008) Cytokine 41:91). En tanto que, igual que IL17A, la IL17F se expresa principalmente por células T activadas, también se ha mostrado que IL17F se expresa por monocitos activados, basófilos activados y células cebadas (Kawaguchi et al. (2002) J. Immunol . 167:4430).
El receptor IL17RA es una glicoproteína de membrana tipo I, ubicua, que se ha mostrado que se une a IL17A con una afinidad de aproximadamente 0.5 nM (Yao et al. (1995) Immunity 3:811), pero IL17RC también se une a IL17A con alta afinidad aunque IL17RC es el receptor cognado para IL17F humana (Keustner et al. (2007) J. Immunol. 179:5462). Sin embargo, se ha observado que la deficiencia de IL17RA y la neutralización del anticuerpo de IL17RA corta tanto la función de IL17A como de IL17F, sugiriendo que IL17RC solo no puede distribuir una señal de IL17A o IL17F en la ausencia de IL17RA (Toy et al. (2006) J. Immunol. 177:36; McAllister et al. (2005) J. Immunol 175:404) . Adicionalmente , la expresión forzada de IL17RC en ratones deficientes de IL17RA no restaura la función IL17A o IL17F (Toy et al . , 2006) .
Estructuralmente , el dominio extracelular de IL17RA contiene dos dominios tipo fibronectina III (FN) (FN1 (residuos 69-183) y FN2 (residuos 205-282)) conectados por un ligador flexible. Los dominios FN se encuentran comúnmente en receptores de citosinas Tipo I donde medían las interacciones proteína-proteína y la unión a ligando. Kramer et al. identificó un Dominio de Montaje de pre-Ligando (PLAD) localizado completamente dentro de FN2 y determinó que el ligador de FN2 codifica para el sitio de unión de IL17A (Kramer et al. (2007) J. Immunol . 179:6379). Además, un dominio de SEFIR está localizado en los aminoácidos 378-536 de la secuencia de IL17RA (Acceso al GenBank No. NP-_055154.3; SEQ ID NO: 739) y en los aminoácidos 473-623 de la secuencia de IL17RC (Acceso al GenBank No. NP_598920.2; SEQ ID NO: 740) .
En algunas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicas para un IL17A, IL17F o IL17A/F. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son humanos. Los ejemplos de dominios de unión que contienen estos dominios VH y VL específicos para IL17A, IL17F o IL17A/F incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente PCT Nos. WO 2006/088833, O 2007/117749, WO 2008/047134, O 2008/054603; y publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2007/0212362. Una proteína de fusión de IL17R-FC y su uso para disminuir la severidad de enfermedad en un modelo murino de artritis reumatoide se describen en la patente de los Estados Unidos No. 6,973,919.
En ciertas modalidades, un antagonista de IL17A/F puede ser un dominio extracelular ( "ectodominio" ) de un IL17RA, IL17RC o IL17RA/C. Como se usa en la presente, un ectodominio de IL17RA, IL17RC o IL17RA/C se refiere a una porción extracelular de IL17RA, IL17RC o IL17RA/C, un IL17RA, IL17RC o IL17RA/C soluble, uno o más dominios tipo fibronectina, uno o más dominios de montaje de pre-ligando (PLAD) , uno o más dominios de SEFIR, o cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, un antagonista de IL17A/F comprende una porción amino-terminal de IL17RA, tal como los primeros 307 aminoácidos de IL17RA como se expone en el Acceso al GenBank No. NP_055154.3 (SEQ ID NO: 739), o un cualquier fragmento de los mismos que contienen funcionando como un antagonista de IL17A/F. En otras modalidades, una antagonista de IL17A/F comprende los aminoácidos 32-307 de SEQ ID NO: 739 (es decir, sin la secuencia guía) o SEQ ID NO: 816. En modalidades adicionales, un antagonista de IL17A/F comprende una porción amino-terminal de IL17RC, tal como los primeros 539 aminoácidos de IL17RC como se expone en al Acceso al GenBank No. NP_703191.1 (SEQ ID NO: 740), SEQ ID NO: 817, o cualquier fragmento de los mismos que continua funcionando como un antagonista de IL17A/F. En otras modalidades, un antagonista de IL17A/F comprende los aminoácidos 21-539 de SEQ ID NO: 740 (es decir, sin la secuencia guía). En modalidades aún adicionales, se proporcionan dominio de unión de polipéptido específicos para IL17A/F, en donde el dominio de unión comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 739, aminoácidos 32-307 de SEQ ID NO: 739, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 816, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 740, aminoácidos 21-539 de SEQ ID NO: 740 o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 817, en donde el dominio de unión de polipéptido se une IL17A/F e inhibe la actividad del mismo.
Antagonistas de TWEAK Como se señala anteriormente, en ciertas modalidades, la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un antagonista de TWEAK (es decir, puede inhibir la señalización de TWEAKR) . Los antagonistas de TWEAK de ejemplo incluyen dominios de unión específicos para un TWEAK, tal como un dominio de unión, variable, de inmunoglobulina o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, Fab, scFv, o similares) , o un ectodominio de TWEAKR o fragmento del mismo.
TWEAK es una citosina que corresponde a la familia de ligandos del receptor de necrosis tumoral (TNF) y regula múltiples respuestas celulares que incluyen actividad pro-inflamatoria, angiogénesis y proliferación celular. TWEAK es una proteína transmembrana tipo II que se escinde para generar una citosina soluble con actividad biológica. La posición de varios dominios dentro de la proteína T EAK se muestra, por ejemplo, en la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos no. 2007/0280940. TWEAK tiene funciones de señalización de traslape con TNF, pero presenta una distribución mucho más amplia en tejido. TWEAK puede inducir apoptosis mediante múltiples rutas de muerte celular de una manera específica del tipo celular y también se ha encontrado que promueve la proliferación y migración de células endoteliales , y de esta manera actúa como un regulador de la angiogénesis .
En algunas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para un TWEAK. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son de roedor. Los ejemplos de dominios de unión que contienen estos dominios VH y VL específicos para TWEAK, incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 7,169,387 y aquellos descritos en la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2008/0279853 como SEQ ID NOS: 3 -7, secuencias que se incorporan de este modo por referencia. Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales que bloquean TWEAK son efectivos en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) en ratón (Kamata et al. (2006) J. Immunol 177:6433; Perper et al. (2006) J. Immunol 177:2610).
En ciertas modalidades, un antagonista de TWEAK puede ser un dominio extracelular ("ectodominio") de un TWEAKR (también conocido como FN14) . Como se usa en la presente, un ectodominio de TWEAKR se refiere a una porción extracelular de TWEAKR, un TWEAKR soluble, o cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, un antagonista de TWEAK comprende una porción amino-terminal de TWEAKR, tal como los primeros 70 aminoácidos de TWEAKR como se expone en el Acceso al GenBank No. NP_057723.1 (SEQ ID NO: 741), o cualquier fragmento del mismo que continúe funcionando como un antagonista de TWEAK. En otras modalidades, un antagonista de TWEAK comprende los aminoácidos 28-70 de SEQ ID NO: 741 (es decir, sin la secuencia guía nativa) . En modalidades aún adicionales, un antagonista de TWEAK comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 % o al menos 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 741, o aminoácidos 28-70 de SEQ ID NO: 741, en donde el antagonista se une a TWEAK e inhibe la actividad del mismo.
La capacidad de las proteínas de unión o las proteínas de fusión, descritas en la presente, para reducir la unión de TWEAK a TWEAKR se puede determinar usando ensayos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen los descritos en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos Nos. 2007/0280940 y 2008/0279853.
Antagonistas de CSF2 Como se señala anteriormente, en ciertas modalidades, la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un antagonista de CSF2 (es decir, puede inhibir la señalización de CSF2Ra) . Los antagonistas de CSF2 de ejemplo incluyen dominios de unión específicos para un CSF2, tal como un dominio de unión, variable, de inmunoglobulina, o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, Fab, scFv, o similares) , o un ectodominio de CSF2ROÍ O fragmento del mismo.
El CSF2 es una citosina que funciona como un factor de crecimiento de células sanguíneas blancas. Se produce por varios tipos celulares que incluyen linfocitos, monocitos, células endoteliales , fibroblastos y algunas células malignas. Además de estimular el crecimiento y la diferenciación de células precursoras hematopoyéticas , el CSF2 tiene una variedad de efectos en las células del sistema inmunitario que expresan el receptor de CSF2. La más importante de estas funciones es la activación de monocitos, macrófagos y granulocitos en varios procesos inflamatorios e inmunitarios . El CSF2 maduro es una proteína monomérica de 127 aminoácidos con dos sitios de glicosilación y la forma activa se encuentra como un homodímero extracelular .
Las acciones de CSF2 se medían por su receptor CSF2R (también conocido como GMR, GMCSFR o Agrupación de Diferenciación 116 (CD 116) ) . El receptor se expresa normalmente en la superficie celular de células mieloides y células endoteliales , pero no en linfocitos. El receptor nativo es un heterodímero compuesto de al menos dos subunidades, cadena alfa (CSF2ROÍ) y cadena beta (ßs) . La subunidad alfa imparte especificidad de ligando y une CSF2 con afinidad nanomolar (Gearing et al. (1989), EMBO J. 12:3667; Gasson et al. (1986) Proc . Nat'l, Acad. Sci . EUA 83:669). La subunidad beta también está presente en los receptores para complejos de receptores de interleucina-3 e interleucina-5 , y está comprendido en la transducción de señales. La asociación de las subunidades beta y alfa con CSF2 conduce a la formación de un complejo con afinidad de unión picomolar (Hayashida et al. (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 87:9655) y da por resultado la activación del receptor.
Los dominios de unión de CSF2 para el receptor se han correlacionado (Brown et al. (1994) Eur. J. Biochem 225:873; Shanafelt et al. (1991) J. Biol . Chem. 266:13804; Shanafelt et al. (1991), EMBO J. 10:4105; López et al.. (1986) J. Clin. Invest. 78:1220). Además, McClure et al. ha demostrado que una molécula de CSF2 se asocia con una subunidad alfa y dos subunidades beta para formar el complejo ternario (McClure et al. (2003): Blood 101:1308-1315). La formación del complejo de receptor de CSF2 conduce a la activación de las cascadas de señalización de complejo que comprenden moléculas de las familias JAWSTAT, Shc, Ras, Raf, las cinasas MAP, NFKB y fosfatidilinositol-3 -cinasa, finalmente que conduce a la transcripción de c-myc, c-fos y c-jun.
En algunas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para un CSF2. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son humanos. Los ejemplos de dominios de unión que contienen estos dominios VH y VL específicos para CSF2 incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 7,381,801. Los dominios VH y VL adicionales específicos para CSF2 incluyen aquellos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos No. 2009/0053213 como SEQ ID NO:11-20, 49-52, y 31-40, 58-61, respectivamente, secuencias que se incorporan de este modo específica como referencia. Se ha mostrado que los anticuerpos neutralizantes anti-CSF2 son efectivos en el modelo de artritis murina inducida por colágeno (Cook et al. (2001) Arthritis Res. 3:293-298) y en el modelo de asma murina (Yamashita et al. (2002) Cel Immunol . 219 : 92) .
En ciertas modalidades, un antagonista de CSF2 puede ser un dominio extracelular ("ectodominio") de un CSF2Ra. Como se usa en la presente, un ectodominio de CSF2Ra se refiere a una porción extracelular de CSF2Ra, un CSF2Ra soluble, o cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, un antagonista de CSF2 comprende una porción amino-terminal de CSF2Ra, tal como los primeros 323 aminoácidos de CSF2ROÍ como se expone en el Acceso al GenBank No. NP_006131.2 (SEQ ID NO: 742) , o cualquier fragmento de los mismos que continúan funcionando como un antagonista de CSF2. En otras modalidades, un antagonista de CSF2 comprende los aminoácidos 23-323 de SEQ ID NO: 742 (es decir, sin la secuencia guía nativa) . En modalidades aún adicionales, un antagonista de CSF2 comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 742, o los aminoácidos 23-323 de SEQ ID NO: 742, en donde el antagonista se une a CSF2 e inhibe la actividad del mismo.
La capacidad de las proteínas de unión y/o proteínas de fusión descritas en la presente para reducir la unión de CSF2 a su receptor, se puede determinar usando ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en la publicación de solicitud de patente PCT No. WO 2006/122797 y publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2009/0053213.
Antagonistas de IGFl/2 Como se señala anteriormente, en ciertas modalidades, la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un antagonista de IGFl o IGF2 (es decir, puede inhibir la señalización de IGFl o IGF2) . Los antagonista de IGFl o IGF2 de ejemplo incluyen dominios de unión específicos para IGFl o IGF2, tal como un dominio de unión variable de inmunoglobulina o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, Fab, scFv, o similares) , o un ectodominio IGF1R o IGFBP o subdominio del mismo .
Los factores de crecimiento tipo insulina (IGF) , comprenden una familia de péptidos que juegan papeles importantes en el crecimiento y desarrollo de los mamíferos. El factor 1 de crecimiento tipo insulina (IGFl) es una proteína segregada que tiene las siguientes características: enlaces de disulfuro (aminoácidos 54-96, 66-109, 95-100); dominio de péptido D (aminoácidos 111-118); dominio de propéptido carboxi-terminal (péptido E) (aminoácidos 119-153); dominio tipo cadena A de insulina (aminoácidos 90 a 110) ; dominio tipo cadena B de insulina (aminoácidos 49-77) , dominio tipo péptido C de conexión de insulina (aminoácidos 78-89) ; dominio de propéptido (aminoácidos 22-48) y dominio de secuencia de señal (aminoácidos 1-21) .
Se sintetiza IGFl en múltiples tejidos incluyendo hígado, músculo esquelético, hueso y cartílago. Los cambios en las concentraciones sanguíneas de IGFl reflejan cambios en su síntesis y secreción del hígado, que da cuenta del 80 % del IGF1 sérico total en animales experimentales. El resto del IGF1 se sintetiza en la periferia, usualmente por células del tipo de tejido conectivo, tal como células estromales que están presentes en la mayoría de los tejidos. El IGF1 que se sintetiza en la periferia puede funcionar para regular el crecimiento celular por mecanismos autocrinos y paracrinos. Dentro de estos tejidos, el IGF1 recién sintetizado y segregado puede unirse a receptores que están presentes ya sea en las células del tejido conectivo en sí mismas y simular el crecimiento (autocrino) , o puede unirse a receptores en tipos celulares adyacentes (frecuentemente tipos de células epiteliales) que no pueden sintetizar realmente IGF1 pero se estimulan para crecer por IGF1 localmente segregado (paracrino) (Clemmons, 2007, Nat Rev Drug Discov. 6(10) :821-33) . La síntesis de IGF1 se controla por varios factores, que incluyen la hormona de crecimiento de pituitaria humana (GH, también conocida como somatotropina) . Las concentraciones de IGF2 son altas durante el crecimiento fetal, pero son menos dependientes de GH en la vida de adulto en comparación con IGF1.
IGF1 mejora el crecimiento y/o supervivencia de células en una variedad de tejidos incluyendo sistemas musculoesqueléticos , hígado, riñon, intestinos, tejidos del sistema nervioso, corazón y pulmón. También, IGF1 tiene un papel importante en la promoción del crecimiento celular y en consecuencia en la inhibición IGF1 que se persigue como una medida adjunta potencial para tratar la aterosclerosis. Se ha propuesto la inhibición de la acción IGF1 como un tratamiento específico, ya sea para potenciar los efectos de otras formas de terapias anti-cáncer o para inhibir el directamente el crecimiento de células tumorales .
Al igual que IGF1, IGF2 actúa a través de IGF1R. IGF2 es un importante factor de crecimiento autocrino en tumores debido a sus funciones mitogénicas y antiapoptóticas (Kaneda et al., 2005, Cáncer Res. 65 (24) : 11236-11240) . La expresión incrementada de IGF2 se encuentra frecuentemente en una amplia variedad de malignidades, incluyendo cáncer colorrectal, hepático, esofágico y adrenocortical , así como sarcomas. La señalización paracrina por IGF2 también juega un papel en tumores incluyendo cánceres de mama, puesto que se encuentra expresión abundante de IGF2 en fibroblastos estromales que circundan células epiteliales malignas de mama.
El receptor del factor 1 de crecimiento tipo insulina (IGF1R) es un tetrámero de dos cadenas alfa y dos cadenas beta enlazadas por enlaces de disulfuro. La escisión de un precursor genera las subunidades alfa y beta. Se relaciona IGF1R a la superfamilia de proteína-cinasas , la familia de tirosina-proteína-cinasas , y la subfamilia de receptores de insulina. Contiene tres dominios tipo II de fibronectina, y un dominio de proteína-cinasa (Lawrence et al., 2007, Current Opinión in Structural Biology 17:699-705). Las cadenas alfa contribuyen a la formación del dominio de unión a ligando, en tanto que la cadena beta tiene un de dominio cinasa. Es una proteína de membrana tipo I de un solo paso y se expresa en una variedad de tej idos .
El dominio cinasa tiene una actividad de tirosina-proteína-cinasa, que es necesaria para la activación de la cascada de señalización de etapa posterior estimulada por IGFl o IGF2. La auto- fosforilación activa la actividad de cinasa. IGF1R interactúa con PIK3R1 y con los dominios PTB/PID del IRS1 y SHC1 in vitro cuando se autofosforila en residuos de tirosina en el dominio citoplasmático de la subunidad beta. IGF1R juega un papel crítico en eventos de transformación. Se sobre-expresa altamente en la mayoría de los tejidos malignos donde funciona como un agente anti-apoptótico al mejorar la supervivencia celular. Las células que carecen de este receptor no se pueden transformar por la mayoría de los oncogenes, con la excepción de v-Src.
La familia de proteínas de unión al factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP) comprenden seis proteínas solubles (IGFBP1-6) de aproximadamente 250 residuos que se unen a los IGF con afinidades nanomolares . Debido a su homología de secuencia, las IGFBP se asume que comparten un pliegue completo común y se espera que tengan determinantes cercanamente relacionados de unión a IGF. Cada IGFBP se puede dividir en tres dominios distintos de longitudes de aproximadamente iguales : los dominios N ' y C altamente conservados de alto contenido cisteína y un dominio ligador central único a cada especie de IGFBP. Los dominios tanto N como C participan en la unión a los IGF, aunque no se han determinado de forma decisiva los papeles específicos de cada uno de estos dominios en la unión de IGF. El dominio C-terminal puede ser responsable de las preferencias de IGFBP para una especie de IGF con respecto a la otra, el dominio C-terminal también está comprendido en la regulación de la afinidad de unión a IGF a través de la interacción con los componentes de matriz extracelular y más probablemente se acopla al mediar acciones independientes de IGF1. El dominio ligador central es la región menos conservada y nunca se ha citado como parte del sitio de unión a IGF para ninguna IGFBP. Este dominio es el sitio de modificaciones post-transduccionales , proteólisis específica, y la subunidad lábil a ácido y las asociaciones de matriz extracelular conocidas para las IGFBP. La escisión proteolítica en este dominio se cree que produce fragmentos N y C-terminales de menor afinidad que no pueden competir con los receptores de IGF para los IGF, y, de esta manera, se asume que la proteólisis es el mecanismo predominante para la liberación de IGF de las IGFBP. Sin embargo, estudios recientes indican que los fragmentos N y C- terminales resultantes aún pueden inhibir la actividad de IGF y tienen propiedades funcionales que difieren de aquellas de las proteínas intactas (Sitar et al. (2006) Proc . Nati. Acad. Sci. EUA. 103 (35) : 13028) .
Las proteínas de unión a IGF son proteínas segregadas que prolongan la vida media de los IGF y se ha mostrado que ya sea inhiben o estimulan los efectos promotores de crecimiento de las IGF en el cultivo celular. Alteran la interacción de los IGF con sus receptores de superficie celular y también promueven la migración celular. Se unen igualmente bien a IGF1 como IGF2. Los dominios C-terminales de todas las IGFBP muestran homología de secuencia con dominios tipo 1 de tiroglobulina y comparten elementos comunes de estructura secundaria: una a-hélice y una ß-hoja de 3 a 4-ß-CD3- a 4-trenzadas. El núcleo de la molécula se conecta por los tres apareamientos de disulfuro de consenso, tiene aminoácidos Tyr/Phe conservados y tiene los motivos QC, CWCV. Estas características esenciales están conservadas en CBP1, CBP4 y CBP-6, las estructuras de dominios C solucionadas hasta ahora, aunque hay variaciones significativas en el detalle. Por ejemplo, CBP4 tiene hélice (¾2 , en tanto que los residuos correspondientes en CBP1 forman una beta-hebra corta vista en otras estructuras de la superfamilia de dominios tipo 1 de tiroglobulina. Esta región particular de CBP tiene alta diversidad de secuencia y está comprendida en la formación de complejos de IGF y de esta manera puede desempeñar el papel de un regulador de afinidad.
La inhibición de la unión de IGF/ IGF- receptor interfiere con el crecimiento celular y representa una estrategia para el desarrollo de las IGFBP y variantes como antagonistas naturales de IGF y en muchas enfermedades comunes que surgen de la desregulación del sistema de IGF, incluyendo diabetes, aterosclerosis y cáncer.
En algunas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para IGF1 o IGF2. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son de roedor. Los dominios de unión de esta descripción también o de manera alternativa pueden comprender un ectodominio de IGF1R del Acceso al Genbank no. NP_000866.1 (SEQ ID NO: 746) o sub-dominio del mismo, o un aminoácido de SEQ ID NO: 818, o un ectodominio de IGFBP del Acceso al Genbank no. NP_000587.1 (IGFBP1, SEQ ID NO: 747) , aminoácidos 490-723 de SEQ ID NO:804, NP_000588.2 (IGFBP2, SEQ ID NO: 748), NP_001013416.1 (isoforma a IGFBP3 , SEQ ID NO: 749) , NP_000589.2 (isoforma b de IGFBP3; SEC ID NO: 750) , NP_001543.2 (IGFBP4, SEQ ID NO: 751) , NP_000590.1 (IGFBP5 , SEQ ID NO: 752) o NP_002169.1 (IGFBP6, SEQ ID NO: 763) o un sub-dominio del mismo. En aún modalidades adicionales, un antagonista de IGF1 o IGF2 comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, en al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 % o al menos 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 746 -753 o 818, en donde el antagonista inhibe la actividad de al menos un IGF1 e IGF2.
Antagonistas de BLyS/APRIL Como se señala anteriormente, en ciertas modalidades, la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un antagonista de BLyS/APRIL (es decir, puede inhibir la señalización de TACI) . Los antagonistas de BLyS/APRIL de ejemplo incluyen dominios de unión específicos para un BLyS/APRIL, tal como un dominio de unión variable de inmunoglob lina o derivado del mismo (por ejemplo, un anticuerpo, Fab, scFv, o similares) , o un ectodominio de TACI o fragmento del mismo.
El BLyS (también conocido como BAFF, TALL-1, THANK, TNFSF13B o zTNF4 ) y un ligando inductor de proliferación (APRIL o TNFSF13) son citosinas que corresponden a la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral (TNF) . BLyS y APRIL estimulan la maduración, proliferación y supervivencia de células B (Gross et al. (2000) Nature 404:995; Gross et al. (2001) Immunity 15:289), y pueden estar comprendidos en la persistencia de enfermedades autoinmunitarias que comprende células B.
BLyS actúa en células B por la unión a tres miembros de la superfamilia de receptores de TNF, TACI (también conocido como TNFRSF13B, o CD267) , BCMA y BR3 (también conocido como BAFF-R) . BCMA se une BLyS con una afinidad más débil, en tanto que APRIL se une solo a TACI y BCMA (ver, por ejemplo, Bossen y Schneider (2006) Seminars in Immunol . 18:263). Parece que TACI funciona tanto para favorecer la expresión de respuestas inmunitarias independientes de células T como para reducir la expresión de la expansión y activación de células B (Yan (2001) Nat . Immunol 2:638; MacKay y Schneider (2008) Cytokine Growth Factor Rev. 9:263).
En algunas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VH y VL específicos para un BLyS/APRIL. En ciertas modalidades, los dominios VH y VL son humanos. Los ejemplos de dominios de unión que contienen estos dominios VH y VL específicos para BLyS/ABRIL incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2003/0223996 o patente de los Estados Unidos No. 7,189,820. Se ha usado una proteína de fusión de TACI - inmunoglobulina (atacicept) en la clínica para tratar pacientes con artritis reumatoide (Tak et al. (2001) Arthritis Rheum. 58:61) o lupus eritematoso sistémico (Dalí' Era et al. (2007) Arthritis Rheum. 56:4142).
En ciertas modalidades, un antagonista de BLyS/APRIL puede ser un dominio extracelular ( "ectodominio" ) de un TACI.
Como se usa en la presente, un ectodominio de TACI se refiere a una porción extracelular de TACI, un TACI soluble, un fragmento que contiene uno o más dominios de alto contenido de cisteína (CRD) , o cualquier combinación de los mismos. En ciertas modalidades, un antagonista de BLyS/APRIL comprende una porción amino-terminal de TACI, tal como los primeros 166 aminoácidos de TACI como se expone en el Acceso al GenBank No. NP_036584.1 (SEQ ID NO: 743), o cualquier fragmento del mismo que continua funcionando como un antagonista de BLyS/APRIL . En otras modalidades, un antagonista de BLyS/APRIL comprende los aminoácidos 21-166 de SEQ ID NO: 743 (es decir, sin la secuencia guía nativa). En aún modalidades adicionales, un antagonista de BLyS/APRIL comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 743, o los aminoácidos 21-166 de SEQ ID NO: 743, en donde el antagonista se une a CSF2 e inhibe la actividad del mismo.
Se puede determinar la capacidad de las proteínas de unión y/o de las proteínas de fusión descritas en la presente, para reducir la unión de BLyS/APRIL a su receptor, usando ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos Nos. 2003/0223996; 2005/0043516 y en la patente de los Estados Unidos No. 7, 189, 820.
Agonistas de IL10 5 Como se señala anteriormente, en ciertas modalidades, la presente descripción proporciona polipéptidos que contienen una región o dominio de unión que es un agonista de IL10 (es decir, puede incrementar la señalización de IL10) . En algunas modalidades, el dominio de unión, agonista de IL10 -Lo es una IL10 o una ILlOFc, o un sub-dominio funcional del mismo. En otras modalidades, el dominio de unión, agonista de IL10 v es una proteína de única de cadena individual, tal como un scFv, que se une de manera específica a IL10R1 o IL10R2.
IL10 (Acceso al Genbank no. NP_000563.1 ,- SEQ ID 15 NO: 754) es un miembro de una superfamilia de citosinas que comparte una estructura alfa-helicoidal. Aunque no existe evidencia empírica, se ha sugerido que todas poseen seis alfa- hélices (Fickenscher, H. et al., 2002, Trends Immunol . 23: 89) . IL10 tiene cuatro cisteínas, solo una de las cuales está 20 conservada entre los miembros de la familia. Puesto que IL10 demuestra un pliegue en forma de V que contribuye a su dimerización, parece que los enlaces de disulfuro no son críticos a esta estructura. La identidad de aminoácidos de los miembros de la familia a IL10 varía desde 20 % (IL-19) a 28 % 25 (IL-20) (Dumouter et al., 2002, Eur. Cytokine Netw. 13: 5).
IL10 se describió primero como una citosina Th2 en ratones que inhibió la producción de las citosinas de IFN-a y GM-CSF por células Thl (Moore et al., 2001, Annu. Rev. Immunol . 19: 683; Florentino et al., 1989, J. Exp . Med. 170:2081). La ILlO-humana es de 178 aminoácidos de longitud con una secuencia de señal de 18 aminoácidos y un segmento maduro de 160 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 18 kDa (monómeros) . La IL10 humana no contienen sitio potencial de glicosilación N-enlazado y no está glicosilada (Dumouter et al., 2002, Eur. Cytokine Netw. 13: 5; Vieira et al., 1991, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 88:1172) . Contiene cuatro residuos de cisteína que forman dos enlaces intracadena de disulfuro. Las hélices A a D de un monómero interactúan de manera no covalentes con las hélices E y F de un segundo monómero, que forma un homodímero no covalente en forma de V. Se han correlacionado áreas funcionales en la molécula de IL10. En el N-término, los residuos no. 1-9 de la pre-hélice A N-terminal están comprendidos en la proliferación de células cebadas, en tanto c_ue l°s residuos no. 152-160 de la hélice F C-terminal medían la secreción de leucocitos y la quimiotaxis.
Las células que se sabe que expresan IL10 incluyen células T CD8+, microglia, monocitos CD14+ (pero no CD16+) , células Th2 CD4+ (ratones) , queratinocitos , células estrelladas hepáticas, células T Thl y Th2 CD4+ (humanas) , células de melanoma, macrófagos activados, células NK, células dendríticas, células B (CD5+ y CD19+) y eosinófilos. En células T, ahora se cree que las observaciones iniciales de la inhibición de ILIO de la producción de IFN-gamma son un efecto indirecto mediado por células no esenciales. Los efectos adicionales en las células T, incluyen, sin embargo: quimiotaxis de células T CD8+ inducida por ILIO, inhibición de quimiotaxis de células T CD4+ hacia IL-8, supresión de producción de IL-2 después de activación, una inhibición de apoptosis de células T por favorecimiento de expresión de Bcl-2, y una interrupción de la proliferación de células T después de la exposición a poco antígeno lograda por co-estimulación con CD28 (Akdis et al., 2001, Immunology 103:131).
En células B, ILIO tiene varias funciones relacionadas, pero distintas. En unión con TNF-ß y CD40L, ILIO induce producción de IgA en células B (IgD+) sin tratamiento previo. Se cree que TGF-/CD40L promueve la conmutación de clase en tanto que ILIO inicia la diferenciación y crecimiento. Cuando no está presente TGF-ß, ILIO coopera con CD40L al inducir IgGl e IgG3 (humanas) , y de esta manera puede ser un factor de cambio directo para los subtipos de IgG. ILIO tiene efectos divergentes en la secreción de IgE inducida por IL-4. Si ILIO está presente en el momento de la conmutación o cambio de clase inducida por IL-4, invierte el efecto, si está presente después del cometido de IgE, incrementa la secreción de IgE . La interacción CD27/CD70 en la presencia de IL10 promueve la formación de células de plasma a partir de células B de memoria (Agematsu et al., 1998, Blood 91:173).
Las células cebadas y células NK también se impactan por IL10. En células cebadas, IL10 induce la liberación de histamina, en tanto que bloquea la liberación de GM-CSF y TNF-a. Este efecto puede ser autocrino puesto que se sabe que IL10 se libera por células cebadas en rata. Como evidencia de su naturaleza pleyotrófica, IL10 tiene los efectos opuestos en células NK. En lugar de bloquear la producción de TNF- y GM-CSF, IL10 promueve realmente esta función en células NK. Además, potencia la proliferación de células NK inducida por IL-2 y facilita la secreción de IFN-? en células NK cebadas por IL-18. En unión tanto en IL-12 y/o IL-18, IL10 potencia la citotoxicidad de células NK (Cai et al., 1999, Eur. J. Immunol 29 :2658) .
La IL10 tiene un impacto anti-inflamatorio pronunciado en neutrófilos. Inhibe la secreción de las quimiocinas ???-1(?, ???-1ß e IL-8, y bloquea la producción de los mediadores proinflamatorios IL-?ß y TNF-a. Además, disminuye la capacidad de los neutrófilos para producir superóxido, y como resultado interfiere con la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediada por PMN. También, IL10 bloquea la quimiotaxis inducida por IL-8 y fMLP, posiblemente mediante CXCR1 (Vicioso et al., 1998 Eur.
Cytokine Netw 9:247) .
En células dendríticas (DC) , la ILIO exhibe en general efectos inmunosupresores . Parece promover diferenciación de macrófagos CD14+ a costa de las DC. Los macrófagos, en tanto que son fagocíticos, son células pobres que presentan al antígeno. Parece que ILIO disminuye la capacidad de las DC para estimular células T, particularmente para células tipo Thl . Con relación a la expresión de MHC-II, se puede reducir la expresión, estar sin cambio, o favorecer la expresión (Sharma et al., 1999, j. Immunol . 163:5020). Con respecto a B7-1/CD80, ILIO ya sea favorecerá o reducirá su expresión. B7-2/CD86 juega un papel clave en la activación de células T. Por esta molécula, ILIO está comprendida tanto en el favorecimiento de la expresión como en la reducción de la expresión. Quizá la modulación más significativa, se presenta sin embargo, con CD40 (parece que ILIO reduce su expresión) . A nivel regional, ILIO puede bloquear la inmunoestimulación al inhibir la migración de células de Langerhans en respuesta a citosinas proinflamatorias . De manera alternativa, ILIO bloquea un paso de maduración de DC inducida por inflamación que comprende normalmente reducción de la expresión de CCR1, CCR2 y CCR5 y el favorecimiento de la expresión de CCR7. Este bloqueo, con retención de CCR1, CCR2 y CCR5 , da por resultado una falla de las DC para migrar a nodulos regionales. El resultado es una DC inmóvil que estimulará células T, pero se unirá (pero depurará) quimiocinas proinflamatorias sin que responda a estas (D-Amico et al., 2000 de Nat . Immunol 1:387).
En los monocitos, la IL10 tiene varios efectos documentados. Por ejemplo, parece que IL10 reduce claramente la expresión de MHC-II de superficie celular. También inhibe la producción de IL-12 después de la estimulación. En tanto que promueve una transición de monocito a macrófago en unión con M-CSF, no es claro el fenotipo del macrófago (es decir, CD16+/citotóxico vs CD16-). También, IL10 reduce la secreción de monocitos GM-CSF y la producción de IL-8, en tanto que promueve la liberación de IL-lra (Gesser et al., 1997, Proc . Nat'l. Acad. Sci. EUA 94:14620).
Las proteínas de fusión de IL10, con ya sea regiones Fe de murinas o de macaco (referidas como ILlOFc) se han mostrado que inhiben la función de macrófagos y prolongan la supervivencia del xenoinjerto de lotes pancreáticos (Feng et al. (1999) Trasplantation 68:1775; Asiedu et al. (2007) Cytokine 40:183), así como reducen choque séptico en el modelo murino (Zheng et al. (1995) J. Immunol. 154:5590).
El IL10R1 humano es una glicoproteína transmembrana tipo I de un solo paso de 90-110 kDa que se expresa en un número limitado de tipos celulares (Liu et al., 1994, J. Immunol. 152:1821), con expresión débil que se ve en páncreas, músculo esquelético, cerebro, corazón y riñon. La placenta, pulmón e hígado mostraron niveles intermedios de expresión, en tanto que los monocitos, células B, linfocitos granulares grandes y células T expresan altos niveles (Liu et al., 1994, J. Immunol . 152:1821). La proteína expresada es una proteína de 578 aminoácidos que contiene un péptido de señal de 21 aminoácidos, una región extracelular de 215 aminoácidos, un segmento de transmembrana de 25 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 317 aminoácidos. Hay dos motivos FNIII dentro de la región extracelular y un sitio de acoplamiento STAT3 más una región de asociación JAK1 dentro del dominio citoplasmático (Kotenko et al., 2000 Oncogene 19:2557; Kotenko et al., 1997, EMBO J. 16:5894). IL10R1 se une IL10 humana con una Kd de aproximadamente 200 pM.
En algunas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VL y VH específicos para un IL10R1 o IL10R2 como se describe en la presente. En ciertas modalidades, los dominios VL y VH son humanos. Los dominios VL y VH se pueden arreglar en cualquier orientación y pueden estar separados por hasta aproximadamente un ligador de 30 aminoácidos como se describe en la presente o cualquier otra secuencia de aminoácidos capaz de proporcionar una función separadora compatible con la interacción de los dos dominios de sub-unión. En ciertas modalidades, un ligador que une los dominios VL y VH comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO:497-604 y 791-796. Los dominios de unión multi -específicos , pueden tener al menos dos dominios específicos de sub-unión, por analogía a la organización de anticuerpos de camélidos, o al menos cuatro dominios específicos de sub-unión, por analogía a la organización más convencional de anticuerpos mamíferos de cadenas VL y VH apareadas. En modalidades adicionales, los dominios de unión específicos para IL10R1 o IL10R2 de esta descripción pueden comprender una o más regiones determinantes de complementariedad ("CDR"), o múltiples copias de una o más CDR, que se han obtenido, derivado, o diseñado de regiones variables de un fragmento scFv o Fab anti-ILlORl o IL10R2 o de regiones variables de cadena pesada o ligera de los mismos. De esta manera, un dominio de unión de esta descripción puede comprender una CDR individual y una región variable de un anti-ILlORl O-IL10R2, o puede comprender múltiples CDR que, pueden ser las mismas o diferentes. En ciertas modalidades, los dominios de unión de esta descripción comprenden dominios VL y VH específicas para un IL10R1 o IL10R2 que comprende regiones menos variables y regiones CDRl, CDR2 y CDR3.
En ciertas modalidades, un agonista de IL10 puede ser un dominio extracelular ("ectodominio") de IL10. Como se usa en la presente, un ectodominio IL10 se refiere a una porción extracelular IL10, una IL10 soluble, o cualquier combinación de los mismos. En aún en modalidades adicionales, un agonista de IL10 comprende una secuencia que es al menos 80 %# al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, al menos 99.5 %, o al menos 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 754, aminoácidos 19-178 de SEQ ID NO: 754, o una porción extracelular de las mismas, en donde el agonista se une a IL10R1 o IL10R2 e incrementa la actividad de IL10.
Proteínas de Fusión Multi-Específicas La presente descripción proporciona proteínas de fusión multi-específicas que comprenden un dominio que es un antagonista de TNF-a ("dominio antagonista de TNF- ") y un dominio que se une un ligando diferente de TNF-a ("dominio de unión heterólogo" ) , tal como IL6, IL6R, complejo IL6xR, RANKL, IL7, IL17A/F, T EAK, CSF2 , IGF1, IGF2 , BLyS/APRIL o IL10R. Se contempla que un dominio antagonista de TNF-a puede estar en el amino-terminal y un dominio de unión heterólogo en el carboxi -terminal de una proteína de fusión, o el dominio de unión heterólogo puede estar en el amino-terminal y el antagonista de TNF-a puede estar en el carboxi-terminal . Como se expone en la presente, los dominios de unión de esta descripción se pueden fusionar a cada extremo de un dominio interpuesto (por ejemplo, una región o sub-región constante de inmunoglobulina del mismo, de manera preferente los dominios CH2 y CH3 de IgG, tal como IgGl) . Adicionalmente , los dos o más dominios de unión se pueden unir cada uno a un dominio interpuesto mediante un ligador conocido en la técnica o como se describe en la presente.
Como se usa en la presente, un "dominio interpuesto" se refiere a una secuencia de aminoácidos que funciona simplemente como un núcleo para uno o más dominios de unión de modo que la proteína de fusión existirá principalmente (por ejemplo, 50 % o más de una población de proteínas de fusión) o sustancialmente (por ejemplo, 90 % o más de una población de proteínas de fusión) como un polipéptido de cadena individual en una composición. Por ejemplo, ciertos dominios interpuestos pueden tener una función estructural (por ejemplo, separación, flexibilidad, rigidez) o función biológica (por ejemplo, una vida media incrementada en plasma, tal como en sangre humana) . Los dominios interpuestos de ejemplo que pueden incrementar la vida media de las proteínas de fusión de esta descripción en plasma incluyen albúmina, transferrina, un dominio de núcleo que se une a una proteína de suero, o similar, o fragmentos de la misma.
En ciertas modalidades preferidas, el dominio interpuesto contenido en la proteína de fusión, multi-específica, de esta descripción es un "dominio de dimerización" , que se refiere a una secuencia de aminoácidos que es capaz de promover la asociación de al menos dos polipéptidos o proteínas de cadena individual mediante interacciones no covalentes o covalentes, tal como por unión con hidrógeno, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waal, puentes de sal, enlaces de disulfuro, interacciones hidrófobas, o similares, o cualquier combinación de los mismos. Los dominios de dimerizacion de ejemplo incluyen regiones o sub-regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina , tal como una región Fe que comprende dominios CH2 y CH3 de IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4), de manera preferente dominios CH2 y CH3 de IgGl . Se debe entender que un dominio de dimerizacion puede promover la formación de dímeros o complejos de multímeros de mayor orden (tal como trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, septámeros, octámeros, etcétera).
Una "sub-región constante" es un término definido en la presente para referirse a un péptido, polipéptido, o secuencia de proteína que corresponde a, o se deriva de, parte o todo de uno o más dominios de región constante de inmunoglobulina, pero no contiene todos los dominios de región constante encontrados en un anticuerpo fuente. En algunas modalidades, los dominios de región constante de una proteína de fusión de esta descripción carecen o tienen funciones efectoras mínimas de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) , fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP) , y activación de complemento y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , en tanto que retiene la capacidad para unirse a algunos receptores Fc (tal como unión a FcRn) y de retener una vida media relativamente prolongada in - vivo. En ciertas modalidades, un dominio de unión de esta descripción se fusiona a una región o sub-región constante de IgGl humana, en donde la región o sub-región constante de IgGl tiene uno o más de los siguientes aminoácidos mutados : leucina en la posición 234 (L234) , leucina en la posición 235 (L235) , glicina en la posición 237 (G237) , glutamato en la posición 318 (E318) , lisina en la posición 320 (K320) , lisina en la posición 322 (K322) , o cualquier combinación de los mismos (numeración EU) .
Se conocen métodos, en la técnica, para producir mutaciones dentro o fuera de un dominio Fe que puedan alterar las interacciones de Fe con los receptores de Fe (CD16, CD32, CD64, CD89, Fe £R1 , FcRn) o con ' eI~componéñT*e""'de complemento Clq (Ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,624,821; Presta (2002) Curr. Pharma. Biotechnol . 3:237). Las modalidades particulares de esta descripción incluyen composiciones que comprenden inmunoglobulina o proteínas de fusión que tienen una región o sub-región constante de IgG humana en donde se conserva la unión a FcRn y proteína A y en donde el dominio de Fe no interactúa por más tiempo o interactúa de manera mínima con otros receptores de Fe o con Clq. Por ejemplo, se puede fusionar un dominio de unión de esta descripción a una región o sub-región constante de IgGl humana en donde la asparagina en la posición 297 (N297 según numeración EU) se ha mutado a otro aminoácido para reducir o eliminar la glicosilación en el sitio, y por lo tanto, anular la unión eficiente de Fe a Fc/R y Clq. Otra mutación de ejemplo es un P331S, que suprime la unión de Clq pero no afecta la unión de Fe.
En modalidades adicionales, una región Fe de inmunoglob lina puede tener un patrón alterado de glicosilación con relación a una secuencia de referencia de inmunoglobulina. Por ejemplo, se puede emplear cualquiera de una variedad de técnicas genéticas para alterar uno o más residuos particulares de aminoácido que forman un sitio de glicosilación (ver Co et al. (1993) Mol. Immunol . 30:1361; Jacquemon et al. (2006) J. Thromb. Haemost . 4:1047; Schuster et al. (2005) Cáncer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005) Biotechnol . Bioeng. 92:831). De manera alternativa, las células hospedadoras en las cuales se producen las proteínas de fusión de esta descripción, se pueden manejar para producir un patrón alterado de glicosilación. Un método conocido en la técnica, proporciona, por ejemplo, glicosilación alterada en la forma de variantes divididas, no fucosiladas que incrementan la ADCC. Las variantes resultan de la expresión en una célula hospedadora que contiene una enzima modificadora de oligosacárido . De manera alternativa, la tecnología PotelligentR de BioWa/Kyowa Hakko se contempla para reducir el contenido de fucosa de moléculas glicosiladas de acuerdo a esta descripción. En un método conocido, se proporciona una célula hospedadora CHO para producción recombinante de inmunoglobulina que modifica el patrón de glicosilación de la región Fe de inmunoglobulina, a través de la producción de GDP-fucosa.
De manera alternativa, se usan técnicas químicas para alterar el patrón de glicosilación de proteínas de fusión de esta descripción. Por ejemplo, una variedad de inhibidores de glucosidasa y/o manosidasa proporcionan uno o más de los efectos deseados para incrementar la actividad de ADCC, incrementar la unión del receptor de Fe, y alterar el patrón de glicosilación. En ciertas modalidades, las células que expresan una proteína de fusión, multi -específica, de la presente descripción (que contiene un dominio antagonista de TNF-a enlazado a un antagonista de IL6, RA KL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2, IGF1, IGF2 o BLys/APRIL o a un agonista de IL10) se cultivan en un medio de cultivo que comprende un modificador de carbohidrato a una concentración que incrementa la ADCC de las moléculas de inmunoglicoproteína producidas por esta célula hospedadora, en donde el modificador de carbohidrato está a una concentración de menos de 800 µ?. En una modalidad preferida, las células que expresan estas proteínas de fusión, multi-específicas , se cultivan en un medio de cultivo que comprende castanospermina o cifunensina, de manera más preferente castanospermina a una concentración de 100-800 µ?, tal como 100 µ?, 200 µ?, 300 µ?, 400 µ?, 500 µ?, 600 µ?, 700 µ?, o 800 µ?. Se proporcionan métodos para alterar la glicosilación con un modificador de carbohidrato tal como castanorpermina en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2009/0041756 o Publicación PCT No. WO 2008/052030.
En otra modalidad, la región Fe de inmunoglobulina puede tener modificaciones de aminoácido que afectan la unión a los receptores Fe de células efectoras. Estas modificaciones se pueden hacer usando cualquier técnica conocida, tal como el planteamiento descrito en Presta et al. (2001) Biochem. Soc. Trans . 30:487. En otro planteamiento, está disponible la tecnología Xencor XmAb para manejar sub-regiones constantes que corresponden a dominios Fe para mejorar la función efectora de aniquilación celular (ver Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 103:4005). Usando este planteamiento, por ejemplo, se pueden generar sub-regiones constantes con especificidad y unión mejoradas para FcR, mejorando de este modo la función efectora de aniquilación celular .
En aún modalidades adicionales, una región o sub-región constante puede incrementar de manera opcional la vida media en plasma o la transferencia placentaria en comparación a una proteína de fusión correspondiente que carece de este dominio interpuesto. En ciertas modalidades, la vida media en plasma, prolongada, de una proteína de fusión de esta descripción, es al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos diez, al menos 12, al menos 18, al menos 20, al menos 24, al menos 30, al menos 36, al menos 40, al menos 48 horas, al menos varios días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos varas semanas, al menos un mes, al menos dos meses, al menos varios meses, o más en un humano.
Una sub-región constante puede incluir parte o todo , de cualquiera de los siguientes dominios: un dominio CH2 y un dominio CH3 (IgA, IgD, IgG) , o un dominio CH3 y un dominio CH (IgE o IgM) . Un sub-región constante como se define en la presente, por lo tanto, puede referirse a un polipéptido que corresponde a una porción de una región constante de inmunoglobulina . La sub-región constante puede comprender un dominio CH2 y un dominio CH3 derivado de la misma o diferente inmunoglobulina, isotipos de anticuerpo, o variantes alélicas. En algunas modalidades, el dominio <¾ está truncado y comprende una secuencia carboxi-terminal listada en la Publicación PCT No. WO 2007/146968) como SEQ ID NO: 366-371, secuencias que se incorporan de este modo como referencia. En ciertas modalidades, una sub-región constante de un polipéptido de esta descripción tiene un dominio CH2 y domino CH3< que pueden tener opcionalmente un ligador amino-terminal , un ligador carboxi-terminal , o un ligador en ambos extremos.
Un "ligador" es un péptido que une o enlaza a otros péptidos o polipéptidos , tal como un ligador de aproximadamente 2 a aproximadamente 150 aminoácidos. En las proteínas de fusión de esta descripción, un ligador puede unirse a un dominio interpuesto (por ejemplo, una sub-región constante derivada de inmunoglobulina) a un dominio de unión o un ligador puede unirse a dos regiones variables de un dominio de unión. Por ejemplo, in ligador puede ser una secuencia de aminoácidos obtenida, derivada o diseñada de una secuencia de región de charnela de anticuerpo, una secuencia que enlaza un dominio de unión a un receptor, o una secuencia que enlaza un dominio de unión a una región transmembrana de superficies celular o ancla de membrana. En algunas modalidades, un ligador puede tener al menos una cisteína capaz de participar en al menos un enlace de disulfuro bajo condiciones fisiológicas u otras condiciones peptídicas normales (por ejemplo, condiciones de purificación de péptidos, condiciones para almacenamiento de péptidos) . En ciertas modalidades, un ligador que corresponde o es similar á un péptido de charnela de inmunoglobulina retiene una cisteína que corresponde a la cisteína de charnela colocada hacia el amino-terminal de esa charnela. En modalidades adicionales, un ligador es de una charnela de IgGl o IgG2A y tiene una cisteína o dos cisteínas que corresponden a cisteínas de charnela. En ciertas modalidades, uno o más enlaces de disulfuro se forman como enlaces de disulfuro inter-cadena entre dominios interpuestos. En otras modalidades, las proteínas de fusión de esta descripción pueden tener un dominio interpuesto fusionado directamente a un dominio de unión (es decir, ausente de un ligador o charnela) . En algunas modalidades, el dominio interpuesto es u dominio de dimerización .
El dominio interpuesto o de dimerización de las proteínas de fusión, multi-específicas, de esta descripción, se puede conectar a uno o más dominios terminales de unión por un ligador peptídico. Además de proporcionar una función de separación, un ligador puede proporcionar flexibilidad o rigidez adecuada para orientar apropiadamente el uno o más dominios de unión de una proteína de fusión, ambos dentro de la proteína de fusión y entre o en medio de las proteínas de fusión y sus objetivos o dianas. Adicionalmente , un ligador puede soportar la expresión de una proteína de fusión de longitud completa y la estabilidad de la proteína purificada tanto in vitro como in vivo después de la administración a un sujeto en necesidad del mismo, tal como un humano, y de manera preferente es no. inmunogénico o pobremente inmunogénico en estos mismos sujetos. En ciertas modalidades, un ligador de un dominio interpuesto o de dimerización de la proteína de fusión, multi-específicas , de esta descripción, pueden comprender parte o toda la charnela de inmunoglobulina humana.
Adicionalmente, un dominio de unión puede comprender un dominio VH y VL y estos dominios de región variable se pueden combinar por un ligador. Los ligadores de dominio de unión de región variable de ejemplo incluyen aquellos que corresponden a la familia (GlynSer) , tal como (Gly3Ser)n(Gly4Ser) !, (Gly3Ser) 1 (Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n- (Gly4Ser)n, o (Gly4Ser)n, en donde n es un número entero de 1 a 5 (ver, por ejemplo, Ligadores 22, 29, 46, 89, 90, y 116 que corresponden a SEQ ID NOS: 518, 525, 542, 585, 586 y 603, respectivamente). En modalidades preferidas, estos ligadores basados en (GlynSer) se usan para enlazar dominios variables y no se usan para enlazar un dominio de unión a un dominio interpuesto .
Los ligadores de ejemplo que se pueden usar para unir un dominio interpuesto (por ejemplo, una sub-región constante derivada de inmunoglobulina) a un dominio de unión o para unir dos regiones variables de un dominio de unión se listan en SEQ ID N0:497-604 y 791-796.
Los ligadores contemplados en esta descripción incluyen, por ejemplo, péptidos derivados de cualquier región inter-dominio de un miembro de la familia de inmunoglobuli as (por ejemplo, una región de charnela de anticuerpo) o una región de tallo de lectinas tipo C, una familia de proteínas de membranas tipo II. Estos ligadores varían de longitud desde aproximadamente dos a aproximadamente 150 aminoácidos, o de aproximadamente dos a aproximadamente 40 aminoácidos, o de aproximadamente ocho a aproximadamente 20 aminoácidos, de manera preferente de aproximadamente diez a aproximadamente 60 aminoácidos, de manera más preferente de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 aminoácidos, y de manera más preferente de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. Por ejemplo, el Ligador 1 (SEQ ID NO: 497) es de dos aminoácidos de longitud y el Ligador 116 (SEQ ID NO: 560) es de 36 aminoácidos de longitud.
Más allá de las consideraciones generales de longitud, un ligador adecuado para el uso en las proteínas de fusión de esta descripción incluye una región de charnela de anticuerpo seleccionada de una charnela de IgG, una charnela de IgA, una charnela de IgD, una charnela de IgE, o variantes de las mismas. En ciertas modalidades, un ligador puede ser una región de charnela de anticuerpos (región superior y de núcleo) seleccionada de IgGl humana, IgG2 humana, IgG3 humana, IgG4 humana, o fragmentos o variantes de las mismas. Como se usa en la presente, un ligador que es una "región de charnela de inmunoglobulina" se refiere a los aminoácidos encontrados entre el extremo carboxilo de CHl y el extremo amino-terminal de CH2 (para IgG, IgA, y IgD) o el extremo amino-terminal de CH3 (para IgE e IgM) . Una "región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre", como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de aminoácidos que se presenta de forma natural interpuesta entre y que conecta las regiones CHl u CH2 (para IgG, IgA, y IgD) o interpuesta entre y que conecta las regiones CH2 y CH3 (para IgE e IgM) encontradas en la cadena pesada de un anticuerpo. En modalidades preferidas, las secuencias de región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre son humanas.
De acuerdo a estudios cristalográficos, un dominio de charnela de IgG se puede subdividir de manera funcional y estructural en tres regiones: la región superior de charnela, la región núcleo o intermedia de charnela y la región inferior de charnela (Shin et al. (1992) Immunological Reviews 130:87). Las regiones superiores de charnela de ejemplo incluyen EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 819) como se encuentra en IgGl , ERKCCVE (SEQ ID NO: 820) como se encuentra en IgG2 , ELKTPLGDTT HT (SEQ ID NO: 821) o EPKSCDTPPP (SEQ ID NO: 822) como se encuentra en IgG3, y ESKYGPP (SEQ ID NO : 823) como se encuentra en IgG4. Las regiones intermedias de charnela de ejemplo incluyen CPPCP (SEQ ID NO: 834) como se encuentra en IgGl y IgG2 , CPRCP (SEQ ID NO: 824) como se encuentra en IgG3, y CPSCP (SEQ ID NO: 825) como se encuentra en IgG4. En tanto que los anticuerpos IgGl, IgG2 , e IgG4 parecen cada uno tener una región superior e intermedia individual, IgG3 tiene cuatro en tándem - una de ELKTPLGDTT HTCPRCP (SEQ ID NO: 826) y tres de EPKSCDTPPP CPRCP (SEQ ID NO: 827) .
Los anticuerpos IgA e IgD parecen carecer de una región tipo IgG y la IgD parece tener do regiones superiores de charnela en tándem (Ver SEQ ID NOS:828 y 829). Las regiones superiores de charnela tipo silvestre de ejemplo encontradas en los anticuerpos IgAl e IgA2 se exponen en SEQ ID NOS: 830 y 831.
Los anticuerpos IgE e IgM, en contraste, en lugar de una región típica de charnela tiene una región CH2 con propiedades tipo charnela. Las secuencias tipo charnela, superior, de CH2 , tipo silvestre de ejemplo de IgE e IgM se exponen en SEQ ID NO: 8324 (VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQL LCLVSGYTPG TINITWLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQK H LSDRTYTC QVTYQGHTFE DSTKKCA) y SEQ ID NO: 833 (VIAELPPKVS VFVPPRDGFF GNPRKSKLIC QATGFSPRQI QVSWLREGKQ VGSGVTTDQV QAEAKESGPT TYKVTSTLTI KESDWLGQSM FTCRVDHRGL TFQQNASSMC VP) , respectivamente .
Una "región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre, alterada" o "región alterada de charnela de inmunoglobulina" se refiere a (a) una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre con hasta 30 % de cambios de aminoácido (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o supresiones de aminoácido) , (b) una porción de una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre que es a^ menos de 10 aminoácidos (por ejemplo, al menos 12, 13, 14 o 15 aminoácidos) de longitud con hasta 30 % de cambios de aminoácido (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o supresiones de aminoácido) , o (c) una porción de una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre que comprende la región de charnela de núcleo (porción que puede ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 aminoácidos de longitud) . En ciertas modalidades, uno o más residuos de cisteína en una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre pueden estar sustituidos por uno o más residuos diferentes de aminoácido (por ejemplo, uno o más residuos de serina) . Una región alterada de charnela de inmunoglobulina puede tener de manera alternativa o adicionalmente un residuo de prolina de una región de charnela de inmunoglobulina tipo silvestre, sustituido por otro residuo de aminoácido (por ejemplo, un residuo de serina) .
Las secuencias alternativas de charnela y de ligador que se pueden usar como regiones conectadoras se pueden elaborar de porciones de receptores de superficie celular que conectan dominios tipos IgV o tipo IgC. Las regiones entre los dominios tipo IgV donde el receptor de superficie celular contiene múltiples dominios tipo IgV en tándem y entre dominios tipo IgC donde el receptor de superficie celular contiene múltiples regiones tipo IgC en tándem también se pueden usar como regiones conectadoras o péptidos ligadores. En ciertas modalidades, las secuencias de charnela y ligadoras son de cinco a 60 aminoácidos de largo, y pueden ser principalmente flexibles, pero también pueden proporcionar características más rígidas, y pueden contener principalmente una estructura alfa-helicoidal con mínima estructura de ß- hoja. De manera preferente, las secuencias son estables en plasma y suero y son resistentes a escisión proteolítica . En algunas modalidades, las secuencias pueden contener un motivo adicionado o que se presenta de forma natural tal como CPPC que confiere la capacidad de formar un enlace de disulfuro o múltiples enlaces de disulfuro para estabilizar el C-término de la molécula. En otras modalidades, las secuencias pueden contener uno o más sitos de glicosilación . Los ejemplos de secuencias ligadoras y de charnela incluyen regiones interdominio donde los dominios tipo IgV y tipo IgC o entre los dominios tipo IgC o IgV de CD2 , CD4 , CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86 , CD96, CD150, CD166, y CD244. Las charnelas alternativas también se pueden elaborar de regiones que contienen disulfuro de los receptores tipo II de los miembros de la superfamilia no de inmunoglobulinas tal como CD69, CD72, y CD161.
En algunas modalidades, un ligador de charnela tiene un residuo individual de cisteína para la formación de un enlace intercadena de disulfuro. En otras modalidades, un ligador tiene dos residuos de cisteína para la formación de enlaces intercadena de disulfuro. En modalidades adicionales, un ligador de charnela se deriva de una región interdominio de inmunoglobulina (por ejemplo, una región de charnela de anticuerpo) o una región de tallo de lectina tipo C tipo II (derivada de una proteína de membrana tipo II; ver, por emplo, secuencias de regiones de tallo de lectina de ejemplo expuestas en la Publicación se Solicitud PCT No. WO 2007/146968, tal como SEQ ID NOS: 111 ., 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287, 289, 297, 305, 307, 309- 311, 313-331, 346, 373-377, 380, o 381 de esa publicación, secuencias que se incorporan en la presente como referencia) .
En un aspecto, las proteínas de fusión, multi-específicas, de ejemplo que contienen un antagonista de TNF-a como se describe en la presente también contendrán al menos un dominio o región de unión adicional que es específica para un objetivo o diana diferente de TNF-a, tal como un antagonista de IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2 , IGF1 , IGF2 o BLyS/APRIL, o un agonista de IL10. Por ejemplo, una proteína de fusión multi-específica de esta descripción tiene un dominio antagonista de TNF-a enlazado a un dominio de antagonista de IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2, IGF1, IGF2 o BLyS/APRIL o un dominio agonista de IL10 por un dominio interpuesto. En ciertas modalidades, una proteína de fusión multi -específica comprende un primero y segundo dominio de unión, un primero y un segundo ligador, y un dominio interpuesto, en donde un extremo del dominio interpuesto se fusiona mediante el primer ligador a un primer dominio de unión que es un antagonista de TNF-a (por ejemplo, un ectodominio de TNFR, un anti-TNFR, un anti-TNF-a) y en el otro extremo se fusiona mediante el segundo ligador a un diferente dominio de unión, tal como un antagonista de IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2 , IGF1 , IGF2 o BLyS/APRIL o un agonista de IL10.
En ciertas modalidades, el primer ligador y el segundo ligador de una proteína de fusión multi -específica de esta descripción se seleccionan cada uno independientemente de, por ejemplo, SEQ ID NO:497-604 y 791-796. Por ejemplo, el primero o segundo ligador puede ser el Ligador 102 (SEQ ID NO:589), 47 (SEQ ID NO:543), 80 (SEQ ID N0:576), o cualquier combinación de los mismos. En modalidades adicionales, un ligador es el Ligador 102 (SEQ ID NO: 589) y el otro ligador es el Ligador 47 (SEQ ID NO:543), o un ligador es el Ligador 102 (SEQ ID NO: 589) y el otro ligador es el Ligador 80 (SEQ ID NO: 576) . En ejemplos adicionales, los dominios de unión de esta descripción que comprenden los dominios VH y VL, tal como aquellos específicos para el ectodominio de IL6, IL6R, IL6xR, RANKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2 , IGF1, IGF2 , BLyS/APRIL o IL10, o TNF-a pueden tener un ligador adicional (tercero) entre os dominios VH y VL, tal como el Ligador 46 (SEQ ID NO:542). En cualquiera de estas modalidades, los ligadores pueden estar flanqueados por uno a cinco aminoácidos adicionales de unión, que simplemente pueden ser el resultado de crear esta molécula recombinante (por ejemplo, el uso de un sitio particular de enzima de restricción para unir moléculas de ácido nucleico puede dar por resultado la inserción de uno a varios aminoácidos) , o para los propósitos de esta descripción se puede considerar una parte de cualquier secuencia núcleo, ligadora, particular.
En modalidades adicionales, el dominio interpuesto de una proteína de fusión multi-específica de esta descripción está comprendida de una región o sub-región constante de inmunoglobulina (de manera preferente CH2CH3 de IgG, IgA, o IgD; o CH3CH4 de igE o IgM) , en donde el dominio interpuesto está colocado entre un dominio antagonista de TNF-a y un dominio de unión de un antagonista de IL6, RANKL, IL7, IL17A/F,, TWEAK, CSF2 , IGF1 , IGF2 o BLyS/APRIL o un dominio de unión del agonista de IL10. En ciertas modalidades, el dominio interpuesto de una proteína de fusión multi-específica de esta descripción tiene un antagonista de TNF-oc en el amino-terminal y un dominio de unión del antagonista de IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2 , IGF1, IGF2 o BLyS/APRIL o un dominio de unión de IL10, en el amino-terminal y un antagonista en el carboxi -terminal . En otras modalidades, el dominio interpuesto de una proteína de fusión multi-específica de esta descripción tiene un dominio de unión del antagonista IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2 , IGF1, IGF2 o BLyS/APRIL o un dominio de unión de IL10, en el amino-terminal y un antagonista de TNF-a en el amino-terminal . En modalidades adicionales, la región o sub-región constante de inmunoglobulina incluye los dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulina Gl (IgGl) . En modalidades relacionadas, los dominios CH2 y CH3 de IgGl tienen uno o más de los siguientes aminoácidos mutados (es decir, tienen un diferente aminoácido en esa posición) : leucina en la posición 234 (L234) , leucina en la posición 235 (L235) , glicina en la posición 237 (G237) , glutamato en la posición 318 (E318) , lisina en la posición 320 (K320) , lisina en la posición 322 (K322), o cualquier combinación de los mismos (numeración EU) . Por ejemplo, cualquiera de estos aminoácidos se puede cambiar a alanina. En una modalidad adicional, de acuerdo a la numeración de Kabat, el dominio CH2 tiene cada uno de L234, L235, G237, E318, K320 y K322 mutado a una alanina (es decir, L234A, L235A, G237A, E318A, K320A y K322A, respectivamente) .
En algunas modalidades, una proteína de fusión multi-específica de esta descripción tiene un antagonista de TNF- , que comprende un dominio o un sub-dominio extracelular de TNFR, uno o más dominios de CRD de TNFR (tal como CRD2 y CRD3), o dominios de unión derivados de anticuerpo específicos de TNF-a (análogos al dominio de unión derivado de anticuerpo específico de IL6, IL6R o complejo IL6xR descrito en la presente) . En algunas modalidades, un antagonista de TNF- es un ectodominio de TNFR1 o TNFR2. En ciertas modalidades, un antagonista de TNF- comprende una porción amino-terminal de TNFR2 (también conocida como p75, TNFRSF1B) , tal como los primeros 257 aminoácidos como se exponen en el Acceso al GenBank No. NP_001057.1 (SEQ ID NO: 671). En otras modalidades, un antagonista de TNF-a comprende los aminoácidos 23-257 de a SEQ ID NO: 671 (es decir, sin la secuencia guía nativa) . En modalidades preferidas, un antagonista de TNF-a comprende un fragmento de TNFR2 (por ejemplo, un ectodominio) , tal como los aminoácidos 23-163 de SEQ ID NO: 671 o los aminoácidos 23-185 aminoácidos de SEQ ID NO: 671 o los aminoácidos 23-235 de SEQ ID NO: 671. En otras modalidades preferidas, un antagonista de TNF-a comprende un derivado de un fragmento de TNFR2 , tal como los aminoácidos 23-163 de SEQ ID NO: 671, con una supresión del aminoácido glutamina en la posición 109 o los aminoácidos 23-185 de la SEQ ID NO: 671, con una supresión del aminoácido glutamina en la posición 109 y una supresión del aminoácido prolina en la posición 109 o los aminoácidos 23-235 de SEQ ID NO: 671, con una supresión del aminoácido glutamina en la posición 109, una supresión del aminoácido prolina en la posición 109, y una sustitución del aminoácido aspartato en la posición 235 (por ejemplo, a, treonina, alanina, serina, o glutamato) . En modalidades adicionales, un antagonista de TNF-a comprende una porción amino-terminal de TNFR1 (también conocida como p55, TNFRSFIA), tal como los primeros 211 aminoácidos como se exponen el Acceso al GenBank No. NP_001056.1 (SEQ ID NO: 672). En otras modalidades, un antagonista de TNF-a comprende los aminoácidos 31-211 de SEQ ID NO: 672 (es decir, sin la secuencia guía nativa) .
En modalidades adicionales, una proteína de fusión multi -específica de esta descripción tiene un dominio de unión del antagonista de TNF-a y un dominio de unión de un antagonista de IL6 que se une con mayor afinidad a IL6xR que ya sea a IL6 o IL6Ro¡ solo y compite con el complejo sIL6xR que se une a mgpl30 o mejora la unión de sgpl03 al complejo sIL6xR. En ciertas modalidades, un dominio de unión específico para un IL6xR comprende (i) un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio VL encontrado en cualquiera de SEQ ID N0S:435-496 y 805-810; o (ii) un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de un dominio VL encontrado en cualquiera de SEQ ID NOS: 373-434 y 799-804; o (iii) tanto un dominio VH de (i) como un dominio de VL de (ii) ; o tanto un dominio VH de · (i) como un dominio VL de (ii) , en donde la VH y VL son de la misma secuencia de referencia. En una modalidad, estos dominios VH y VL pueden formar el dominio de unión de ejemplo TRU6-1002 (ver SEQ ID NOS: 374 y 436, respectivamente) . En ciertas modalidades, una proteína de fusión multi-específica que comprende el dominio de unión, antagonista de IL6, inhibe de manera medible la cis- y trans-señalización de IL, y opcionalmente no inhibe la señalización de citosinas de la familia de gpl30 diferentes de IL6.
En modalidades aún adicionales, un dominio de unión de un antagonista de IL6, que se une a IL6xR con un mayor afinidad que a IL6 o IL6ROÍ O ya sea IL6 o IL6Ra solos, y compite con gpl30 para la unión al complejo sIL6xR o mejora la unión de sgpl30 al complejo sIL6xR, comprende los dominios VH y VL que comprende regiones menos variables y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 , en donde (a) el dominio VH comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada encontrada en cualquiera de SEQ ID NOS: 435-496 y 805-810; o (b) el dominio VL comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera encontrada en cualquiera de SEQ ID NOS: 373-434 y 799-804; o (c) el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) ; o el dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos de VH de (a) y una secuencia de aminoácidos de VL de (b) en donde las secuencias de aminoácidos de VH y VL son de la misma secuencia de referencia. Los dominios VH y VL de estas proteínas de fusión multi-específicas se pueden arreglar en cualquier orientación y pueden estar separadas por hasta aproximadamente un ligador de 5-30 aminoácidos como se describe en la presente. En ciertas modalidades, un ligador que une los dominios VH y VL comprende una secuencia de aminoácidos del Ligador 47 (SEQ ID N0:543) o el Ligador 80 (SEQ ID NO:576). En ciertas modalidades, una proteína de fusión multi-específica que comprende el dominio de unión del antagonista de IL6 inhibe de manera medible la cis- y trans-señalización de IL6, de manera preferente la trans-señalización, y opcionalmente , no inhibe la señalización de las citosinas de la familia de gpl30 diferente de IL6.
Las estructuras de ejemplo de estas proteínas de fusión multi-específicas , referidas en la presente como moléculas xceptor incluyen N-BD-X-ED-C, N-ED-X-BD-C, N-EDI-X-ED2-C, en donde BD es un dominio de unión de la región variable tipo inmunoglobulina o de inmunoglobulina, X es un dominio interpuesto, y ED es un ectodominio de receptor, dominio de semaforina o similares. En algunas construcciones, X puede comprender una región o sub-región constante de inmunoglobulina colocada entre el primero y segundo dominios de unión. En algunas modalidades, una proteína de fusión multi-específica de esta descripción tiene un dominio interpuesto (X) que comprende, desde el amino-terminal al carboxi-terminal , una estructura como sigue: -L1-X-L2-, en donde Ll y L2 son cada uno independientemente un ligador que comprende de dos a aproximadamente 150 aminoácidos; y X es una región o sub-región constante (de preferencia CH2CH3 de IgGl) . En modalidades adicionales, la proteína de fusión multi-específica tendrá un dominio interpuesto que es albúmina, transferrina, u otra proteína de unión de proteína de suero, en donde la proteína de fusión permanece principal o sustancialmente como un polipéptido de cadena individual en una composición. En aún modalidades adicionales, una proteína de fusión, multi-específica, de esta descripción tiene la siguiente estructura: N-BD1-X-L2-BD2-C, en donde N y C presentan el amino-termino y carboxi-terminal , respectivamente; BD1 es un antagonista de TNF- oc que es al menos aproximadamente 90 % idéntico a un ectodominio de TNFR; -X- es -L1-CH2CH3-, en donde Ll es la primera charnela de IgGl, opcionalmente mutada al sustituir la primera cisteína y en donde -CH2CH3- es la región CH2CH3 de un dominio de Fe de IgGl, opcionalmente mutado para eliminar la interacción FcyRI-III en tanto que permanece la interacción de FcRn; L2 es un ligador no basado en (G4S) seleccionado de SEQ ID NOS: 497-604 y 791-796; y BD2 es un dominio de unión de antagonista de IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, T EAK, CSF2 , IGF1, IGF2 o BLyS/APRIL o un dominio de unión de agonista de IL10 como es descrito en la presente.
En modalidades particulares, una proteína de fusión xceptor multi -específica (a) un antagonista del TNF-a que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672 o un fragmento contiguo de aproximadamente 140 a aproximadamente 215 aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672, y (b) un antagonista de IL6, que se une al IL6xR con una mayor afinidad que IL6, o IL6Ra, o ya sea IL6 o IL6ROÍ solos si compite con mgpl30 para la unión al complejo sIL6xR o mejora la unión de sgpl30 con sIL6xR, que comprende una región variable de cadena pesada con secuencias de aminoácido de CDR1, CD2 y CDR3 al menos 80 % a 100 % idénticas a las secuencias expuestas en SEQ ID NOS: 435-496 y 805-810, respectivamente, y una región variable de cadena ligera con secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 , y CDR3 al menos 80 % a 100 % idénticas a las secuencias expuestas en SEC ID NOS: 373 -434 y 799-804, respectivamente, en donde, desde el amino-terminal al carboxi-terminal o desde el carboxi-terminal al amino-terminal, (i) un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de IL-6 de (b) se fusiona a un primer ligador, (ü) si primer ligador se fusiona a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de CH2 y CH3 que comprende los aminoácidos 275 a 489 de SEQ ID NO: 608, (iii) el polipéptido de región constante CH2CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (iv) el segundo ligador se fusiona a un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de IL-6 de (b) . En ciertas modalidades, el primer ligador 47 (SEQ ID NO: 543) o ligador 80 (SEQ ID NO: 576), el segundo ligador es 102 (SEQ ID NO: 589) , y un ligador adicional (tercero) entre los dominios VH y VL del antagonista de IL6 es el ligador 46 (SEQ ID NO: 542) .
En modalidades aún adicionales, una proteína de fusión multi-específica de esta descripción tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica a úna secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID: 607-668, con o sin un secuencia guía (es decir, los primeros 23 aminoácidos encontrados en esta secuencia) . En modalidades adicionales, una proteína de fusión multi-específica de esta descripción tiene un antagonista de TNF-OÍ que comprende los aminoácidos 23-257, 23-163, 23-185, o 23-235 de SEQ ID NO: 671 y un antagonista de IL6, que se une al complejo IL6xR con una mayor afinidad que IL6, IL6Ra o ya sea IL6 o IL6ROÍ, solos y compite con mgpl30 para la unión al complejo sIL6xR o mejora la unión de sgpl30 con sIL6xR, que comprende una VL de SEQ ID NO: 374 unida a una VH de SEQ ID NO: 436 mediante el ligador 46 (SEQ ID NO: 542) , en donde el antagonista de TNF-a se une al amino-terminal de un dominio interpuesto que comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglob lina de CH2 y CH3 que comprende los aminoácidos 275 a 489 de SEQ ID NO: 608 mediante el ligador 47 (SEQ ID NO: 543) y el antagonista de IL6 se une al carboxi-terminal del dominio interpuesto mediante el ligador 102 (SEQ ID NO: 589) . En una modalidad, la proteína de fusión multi -específica tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 608.
En otras modalidades, una proteína de fusión xceptor multi-específica tiene (a) un antagonista de TNF-OÍ que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672 o un fragmento contiguo de aproximadamente 140 a aproximadamente 215 aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 671 ° 672, y (b) un dominio de unión de antagonista de TWEAK que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a SEQ ID NO: 741, en donde, desde el amino-terminal al carboxi-terminal o desde el carboxi-términio al amino-terminal, (i) un antagonista de TNF-a (a) o un antagonista de TWEAK (b) se fusiona a un primer ligador, (ii) el primer ligador se fusiona a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de CH2 y CH3 que comprende los aminoácidos 275 a 489 de SEQ ID NO: 798, (iii) el polipéptido de región constante CH2CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (iv) el segundo ligador se fusiona a un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de TWEAK de (b) . En ciertas modalidades, el primer ligador es el ligador 47 (SEQ ID NO: 543), y el segundo ligador es el ligador 175 (SEQ ID NO: 791) . En una modalidad, la proteína de fusión multi-específica tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 798 (que corresponde a la secuencia de ácido nucleico proporcionada en SEQ ID NO: 805) .
En otras modalidades, una proteína de fusión xceptor multi-específica tiene (a) un antagonista de TNF-a que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672 o un fragmento contiguo de aproximadamente 140 a aproximadamente 215 aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672, y (b) un dominio de unión de antagonista de RANKL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a SEQ ID NO: 737, en donde, desde el amino-terminal al carboxi-terminal o desde el carboxi-terminal al amino-terminal, (i) un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de RANKL de (b) se fusiona a un primer ligador, (ii) el primer ligador se fusiona a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de CH2 y CH3 que comprende los aminoácidos 253-468 de SEQ ID NO: 799, (iii) el polipéptido de región constante de CH2CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (iv) el segundo ligador se fusiona a un antagonista de TNF-OÍ de (a) o un antagonista de RANKL de (b) . En ciertas modalidades, el primer ligador es el ligador 47 (SEQ ID NO: 543) , y el segundo-ligador es el ligador 175 (SEQ ID NO: 791) . En una modalidad, la proteína de fusión multi-específica tiene una secuencia de aminoácidos como se expone SEQ ID NO: 799 (que corresponde a la secuencia de ácido nucleico proporcionada en SEQ ID NO: 806) .
En otras modalidades, una proteína de fusión xceptor multi -específica tiene (a) un antagonista de TNF-a que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672 o un fragmento contiguo de aproximadamente 140 a aproximadamente 215 aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672, y (b) un dominio de unión de antagonista de IGF que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a SEQ ID NO: 818 o 746, en donde, desde el amino-terminal al carboxi -terminal o desde el carboxi-terminal al amino-terminal , (i) un antagonista de TNF-OÍ de (a) o un antagonista de IGF de (b) se fusiona a un primer ligador, (ii) el primer ligador se fusiona a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de CH2 y CH3 que comprende los aminoácidos 253-468 de SEQ ID NO: 800, (iii) el polipéptido de región constante de CH2CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (iv) el segundo ligador se fusiona a un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de IGF de (b) . En ciertas modalidades, el primer ligador es el ligador 47 (SEQ ID NO: 543) , y el segundo ligador es el ligador 175 (SEQ ID NO: 791). En una modalidad, la proteína de fusión multi-específica tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 800 (que corresponde a la secuencia de ácido nucleico proporcionada en SEQ ID NO: 807) .
En otras modalidades, una proteína de fusión xceptor multi -específica tiene (a) un antagonista de TNF- que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672 o un fragmento contiguo de aproximadamente 140 a aproximadamente 215 aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672, y (b) un dominio de unión antagonista de IL7 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a SEQ ID NO: 738, en donde, desde el amino-terminal al carboxi-terminal o desde el carboxi -terminal al amino-terminal, (i) un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de IL7 de (b) se fusiona a un primer ligador, (ii) el primer ligador se fusiona a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de CH2 y CH3 que comprende los aminoácidos 253-468 de SEQ ID NO: 801, (iii) el polipéptido de región constante de CH2CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (iv) el segundo ligador se fusiona a un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de IL7 de (b) . En ciertas modalidades, el primer ligador es el ligador 47 (SEQ ID NO: 543), y el segundo ligador es el ligador 175 (SEQ ID NO: 791) . En una modalidad, la proteína de fusión multi-específica tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 801 (que corresponde a la secuencia de ácido nucleico proporcionada en SEQ ID NO: 808) .
En otras modalidades, una proteína de fusión xceptor multi-específica tiene (a) un antagonista de TNF-a que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672 o un fragmento contiguo de aproximadamente 140 a aproximadamente 215 aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672, y (b) un dominio de unión de antagonista de IL17, que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a SEQ ID NO:739, 740, 816 o 817, en donde, desde el amino-terminal al carboxi-terminal o desde el carboxi -terminal al amino-terminal , (i) un antagonista de TNF- de (a) o un antagonista de IL-17 de (b) se fusiona a un primer ligador, (ii) el primer ligador se fusiona a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de CH2 y CH3 que comprende los aminoácidos 253-468 de SEQ ID NO: 802 o 803, (iii) el polipéptido de región constante de CH2CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (iv) el segundo ligador se fusiona a un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de IL-17 de (b) . En ciertas modalidades, el primer ligador es el ligador 47 (SEQ ID NO: 543) , y el segundo ligador es el ligador 175 (SEQ ID NO: 791) . En una modalidad, la proteína de fusión multi-específica tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 802 o 803 (que corresponde a la secuencia de ácido nucleico proporcionada en SEQ ID NO: 809 y 810, respectivamente) .
En otras modalidades, una proteína de fusión xceptor multi -específica tiene (a) un antagonista de TNF- que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672 o un fragmento contiguo de aproximadamente 140 a aproximadamente 215 aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 671 o 672, y (b) un dominio de unión, antagonista de IGF que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 % a 100 % idéntica a SEQ ID NO: 747 o 818, al menos 80 % a 100 % idéntica a los aminoácidos 490-723 de SEQ ID NO: 804, al menos 80 % a 100 % idéntica a los aminoácidos 21-922 de a SEQ ID NO: 812, o al menos 80 % y 100 % idéntica a los aminoácidos 21-726 de SEQ ID NO: 813 en donde, desde el amino-terminal al carboxi -terminal o desde el carboxi -terminal al amino-terminal, (i) un antagonista de TNF-OÍ de (a) o un antagonista de IGF de (b) se fusiona a un primer ligador, (ii) el primer ligador se fusiona a una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de CH2 y CH3 que comprende los aminoácidos 253-468 de SEQ ID NO: 804, (iii) el polipéptido de región constante de CH2CH3 se fusiona a un segundo ligador, y (iv) el segundo ligador se fusiona a un antagonista de TNF-a de (a) o un antagonista de IGF de (b) . En ciertas modalidades, el primer ligador es el ligador 47 (SEQ ID NO: 543) , y el segundo ligador es el ligador 175 (SEQ ID NO: 791) . En una modalidad, la proteína de fusión multi-específica tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 804 (que corresponde a la secuencia de de ácido nucleico proporcionada en SEQ ID NO: 811) .
Producción de Proteínas de Fusión Multi-Específicas Para producir de manera eficiente cualquiera de los 5 polipéptidos de dominio de unión o proteínas de fusión descritas en la presente, se usa un péptido guía para facilitar la secreción de los polipéptidos expresados y de las proteínas de fusión. Usando cualquiera de los péptidos guías convencionales (secuencias de señal) se espera dirigir los "LQ polipéptidos o proteínas de fusión, recién expresados, en una ruta secretoria y dar por resultado la escisión del péptido guía del polipéptido maduro o proteína de fusión en o cerca de la unió entre el péptido guía y el polipéptido o proteína de fusión. Se elegirá un péptido guía particular en base a 15 consideraciones conocidas en la técnica, tal como usando secuencias codificadas por polinucleótidos que permite la fácil inclusión de sitios de escisión de endonucleasa de restricción al comienzo o final de la secuencia codificadora para el péptido guía para facilitar el manejo molecular, con 20 1¾ condición que estas secuencias introducidas especifiquen aminoácidos que ya sea no interfieren de manera aceptable con algún procesamiento deseado del péptido guía de la proteína recién expresada o no interfieran de manera inaceptable con alguna función deseada de una molécula de polipéptido o de 25 proteína de fusión si el péptido guía no se escinde durante la maduración de los polipéptidos o proteínas de fusión. Los péptidos guía de ejemplo de esta descripción incluyen secuencias guía naturales (es decir, aquellas expresadas con la proteína nativa) o el uso de secuencias guía heterólogas, tal como H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG (X) n-C02H, en donde X es cualquier aminoácido y n es cero a tres (SEQ ID NO: 744) o H3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG-CO2H (SEQ ID NO: 745) .
Como se señala en la presente, se contemplan variantes y derivados de dominios de unión tal como ectodominios , regiones variables ligeras y pesadas y las CDR descritas en la presente. En un ejemplo, se proporcionan variantes de inserción en donde uno o más residuos de aminoácidos complementan una secuencia específica de aminoácidos del agente de unión. Las sensaciones pueden estar localizadas en cualquiera o ambos términos de la proteína, o pueden estar colocadas dentro de regiones internas de la secuencia específica de aminoácidos del agente de unión. Los productos variantes de esta descripción también incluyen productos específicos maduros del agente de unión, es decir, productos específicos del agente de unión en donde se remueve una secuencia guía o secuencia de señal, y la proteína resultante tiene residuos amino-terminales adicionales. Los residuos amino-terminales adicionales se pueden derivar de otra proteína, o pueden incluir uno o más residuos que no se pueden identificar como que se derivan de una proteína específica. Se contemplan polipéptidos con resido adicional de metionina en la posición menos -1, como que son los polipéptidos de esta descripción con residuos adicionales de metionina y lisina en las posiciones -2 y -1. Son particularmente útiles las variantes que tienen residuos adicionales de Met, Met-Lys, o Lys (o uno o más residuos básicos en general) para la producción mejorada de proteínas recombinantes en células hospedadoras bacterianas.
Como se usa en la presente, "aminoácidos" se refiere a un aminoácido natural (aquellos que se presentan en la naturaleza) , un aminoácido natural sustituido, un aminoácido no natural, un aminoácido no natural sustituido, o cualquiera combinación de los mismos. Las designaciones para aminoácidos naturales se exponen en la presente ya sea como el código normal de una o de tres letras. Los aminoácidos polares naturales incluyen asparagina (Asp o N) y glutamina (Gln o Q) ,· así como aminoácidios básicos tal como arginina (Arg o R) , lisina (Lys o K) , histidina (His o H) , y ) derivados de los mismos; y aminoácido ácidos tal como ácido aspártico (Asp o D) ácido glutámico (Glu o E) , y derivados de los mismos. Los aminoácidos hidrófobos naturales incluyen triptófano (Trp o W) , fenilalanina (Phe o F) , isoleucina (lie o I) , leucina (Leu o L) , metionina (Met o M) , valina (Val o V) , y derivados de los mismos; así como otros aminoácidos no polares tal como glicina (Gly o G) , alanina (Ala o A) , prolina (Pro o P) , y derivados de los mismos. Los aminoácidos naturales de polaridad intermedia incluyen serina (Ser o S) , treonina (Thr o T) , tirosina (Tyr o Y) , cisteína (Cys o C) , y derivados de los mismos. Al menos que se especifique de otro modo, cualquier aminoácido descrito en la presente puede estar ya sea en la configuración D o L.
Las variantes de sustitución incluyen aquellas proteínas de fusión en donde se remueven uno o más residuos de aminoácido en una secuencia de aminoácidos y se reemplazan con residuos alternativos. En algunas modalidades, las sustituciones son de naturaleza conservadora; sin embargo, esta descripción abarca sustituciones que también no son conservadoras. Los aminoácido se pueden clasificar de acuerdo a propiedades físicas y a la contribución a la estructura secundaria y terciaria de la proteína. En la técnica se reconoce una sustitución conservadora como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Las sustituciones conservadoras de ejemplo se exponen en la Tabla 1 (ver O 97/09433, página 10, publicada el 13 de Marzo de 1997) , inmediatamente a continuación.
Tabla 1. Sustituciones conservadoras I Cadena lateral Característica aminoácidos Polar - cargada D, E, K, R Aromática H, F, W,Y Otra N, Q, E, D De manera alternativa, los aminoácidos conservadores se pueden agrupar como se describe en Lehninger (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975) , páginas 71-77) como se expone en la tabla 2, inmediatamente a continuación.
Tabla 2. Sustituciones Conservadoras II Cadena lateral Característica aminoácidos No polar (hidrófoba) alifática A, L, I, V, P Aromática F, w Que contiene azufre M Línea límite G No cargada-polar Hidroxilo S, T, Y Amidas N, Q Sulfhidrilo C Línea límite G Positivamente K, R, H cargada (básica) Negativamente D, E cargada (ácida) Las variantes o derivados también pueden tener residuos adicionales de aminoácido que surgen del uso de sistemas específicos de expresión. Por ejemplo, el uso de 5 vectores comercialmente disponibles que expresan un polipéptido deseado como parte de un producto de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) proporciona el polipéptido deseado que tiene un residuo adicional de lisina en la posición -1 después de la escisión del componente de GST del -LO polipéptido deseado. Las variantes que resultan de la expresión en otros sistemas de vector también se contempla, incluyendo aquellas en donde se incorporan marcas de histidina en la secuencia de aminoácidos en general en el carboxi- terminal y/o amino- terminal de la secuencia. 15 También se contemplan variantes de supresión, en donde se remueven uno o más residuos de aminoácidos en un dominio de unión de esta descripción. Se pueden efectuar supresiones en uno o ambos términos de la proteína de fusión, o de la remoción de uno o más residuos dentro de la secuencia 20 de aminoácidos.
En ciertas modalidades ilustrativas, las proteínas de fusión de esta descripción están glicosiladas , el patrón de glicosilación que es dependiente de una variedad de factores que incluye la célula hospedadora en la cual se expresa la 25 proteína (se "prepara en células hospedadoras recombinantes) y las condiciones de cultivo.
Esta descripción también proporciona derivados de proteínas de fusión. Los derivados incluyen polipéptidos específicos del dominio de unión que tienen modificaciones diferentes de inserción, supresión, o sustitución de residuos de aminoácidos. En ciertas modalidades, las modificaciones son de naturaleza covalente, incluyen, por ejemplo, unión química con polímeros, lípidos, otras porciones orgánicas e inorgánicas. Los derivados de esta descripción se pueden preparar para incrementar la vida media en circulación de un polipéptido específico del dominio de unión, o se pueden diseñar para mejorar la capacidad de selección de objetivo para el polipéptido hacia células deseadas, tejidos deseados u órganos deseados.
Esta descripción abarca además proteínas de fusión que- se modifican de manera covalente o se derivatizan para incluir una o más uniones poliméricas solubles en agua tal como polietilenglicol , polioxietilenglicol , o polipropilenglicol , como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos: 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 y 4,179,337. Aún otros polímeros útiles conocidos en la técnica incluyen monometoxi -polietilenglicol , dextrano, celulosa, y otros polímeros basados en carbohidratos, poli- (N-vinilpirrolidona) -polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol , un co-polímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de estos polímeros. Particularmente preferidas son las proteínas derivatizadas con polietilenglicol (PEG) . Los polímeros solubles en agua se pueden unir en posiciones específicas, por ejemplo en el amino-terminal de las proteínas y polipéptidos de acuerdo a esta descripción, o unir de manera aleatoria a una o más cadenas laterales del polipéptido. El uso de PEG para mejorar las capacidades terapéuticas se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,133,426.
Una modalidad particular de esta descripción es una mmunoglobuli a o protema de fusión de Fe. Esta protema de fusión puede tener una vida media prolongada, por ejemplo, varias horas, un día o más, o aún una semana o más, específicamente si el dominio Fe es capaz de interactuar con FcRn el receptor de Fe neonatal. El sitio de unión para FcRn en un dominio Fe también es el sitio en el cual se une las proteínas A y G bacterianas. La unión estrecha entre estas proteínas se puede usar como un medio para purificar anticuerpos o proteínas de fusión de esta descripción, por ejemplo, al emplear cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G durante la purificación de la proteína.
Son bien conocidas por los expertos las técnicas de purificación de proteínas. Estas técnicas comprenden, a un nivel, el fraccionamiento crudo de las fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas . Frecuentemente se desea la purificación adicional usando técnicas cromatográficas o electroforéticas para lograr purificación parcial o completa (o purificación a homogeneidad) . Los métodos analíticos particularmente adecuados a la preparación de una proteína de fusión pura son cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de exclusión; electroforesis en gel de poliacrilamida; y enfoque isoeléctrico. Los métodos particularmente eficientes para purificar péptidos son cromatografía líquida rápida de proteínas y HPLC.
Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren a la purificación, y en modalidades particulares, a la purificación sustancial, de una proteína de fusión. El término "proteína de fusión purificada" como se usa en la presente se propone para referirse a una composición, aislable de otros componentes, en donde la proteína de fusión se purifica a cualquier grado con relación a su estado obtenible en la naturaleza. Por lo tanto, una proteína de fusión purificada también se refiere a una proteína de fusión, libre del ambiente en el cual se presenta en la forma natural .
En general, "purificada" se referirá a una composición de proteína de fusión que se ha sometido a fraccionamiento para remover varios componentes diferentes, y la composición que retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. Donde se usa el término "sustancialmente purificada" esta designación se refiere a una composición de proteína de unión de fusión en la cual la proteína de fusión forma el componente principal" de la composición, tal como que constituye aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 99 % o más de la proteína, en peso, en la composición.
En vista de la presente descripción los expertos en la técnica conocen varios métodos para cuantificar el grado de purificación. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de unión de una fracción activa o valorar la cantidad de proteína de fusión en un fracción por análisis de SDS/PAGE. Un método preferido para valorar la pureza de una fracción de proteína es calcular la actividad de unión de la fracción, para compararla a la actividad de unión del extracto inicial, y de este modo calcular el grado de purificación, valorado en la presente por un "-veces el número de purificación" . Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad de unión serán dependientes, por supuesto, en la técnica particular de ensayo elegida para seguir la purificación y de sí o no la proteína de fusión expresada exhibe una actividad detectable de unión.
Los expertos en la técnica conocen bien varias técnicas adecuadas para el uso en la purificación de proteínas. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio PEG, anticuerpos y similares, o por desnaturalización térmica seguido por centrifugación; pasos de cromatografía tal como cromatografía de intercambio iónico, de filtración en gel, de fase inversa, de hidroxilapatita y de afinidad; enfoque isoeléctrico; electrofóresis en gel; y combinaciones de estas y otras técnicas. Como se conoce en general en la técnica, se cree que el orden de llevar a cabo los varios pasos de purificación se puede cambiar, o que se pueden omitir ciertos pasos, o aún dan por resultado un método adecuado para la preparación de una proteína sustancialmente purificada .
No hay requisito general que la proteína de fusión se proporcione siempre en su estado más purificado. En realidad, se contempla que las proteínas sustancialmente menos purificadas tendrán utilidad en ciertas modalidades. Se puede lograr purificación parcial al usar menos pasos de purificación en combinación, o al utilizar diferentes formas del mismo esquema general de purificación. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC dará en general por resultado mayor purificación que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. Los métodos que exhiben un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto de proteína, o al mantener la actividad de unión de una proteína expresada.
Se conoce que puede variar la migración en un polipéptido, algunas veces de forma significativa, con diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi et al. (1977) Biochem. Biophys . Res. Comm. 76:425). Por lo tanto, se apreciará que bajo diferentes condiciones de electroforesis, pueden variar los pesos moleculares aparentes de los productos purificados o parcialmente purificados de expresión de proteína de fusión.
Polinucleótidos , Vectores de Expresión y Células Hospedadoras Esta descripción proporciona polinucleótidos (polinucleótidos aislados o purificados o puros) que codifican para la proteína de fusión, multi-específica, de esta descripción, vectores (incluyendo vectores de clonación y vectores de expresión) que comprenden estos polinucleótidos y células (por ejemplo, células hospedadoras) transformadas o transfectadas con un polinucleótido o vector de acuerdo a esta descripción .
En ciertas modalidades, se contempla un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica para un domino de unión de esta descripción, o una proteína de fusión multi-específica que contiene uno o más de estos dominios de unión. En los ejemplos anexos a la presente se proporcionan casetes de expresión que codifican para construcciones de proteínas de fusión multi -específicas .
La presente descripción también se refiere a vectores que incluyen un polinucleótido de esta descripción, y en particular, a construcciones recombinantes de expresión. En una modalidad, esta descripción contempla un vector que comprende un polinucleótido que codifica para una proteína de fusión multi-específica que contiene un dominio antagonista de TNF-a y un dominio de unión antagonista de IL6, RA KL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2 , IGF1 , IGF2 o BLys/APRIL o un dominio de unión agonista de IL10 de esta descripción, junto con otras secuencias de polinucleótido que provocan o facilitan la transcripción, traducción y procesamiento de estas secuencias que codifican para la proteína de fusión multi-específica .
Se describen vectores apropiados de clonación y expresión para el uso con hospedadores procarióticos y eucarióticos , en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989) . Los vectores de clonación/expresión de ejemplo incluyen vectores de clonación, vectores de transposición, y construcciones de expresión, que se pueden basar en plásmidos, fagómidos, fasmidos, cosmidos, virus, cromosomas artificiales o cualquier vehículo de ácido nucleico conocido en la técnica adecuado para purificación, transferencia y/o expresión de un polinucleótido contenido en el mismo.
Como se usa en al presente, "vector" significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Los vectores de ejemplo incluyen plásmidos, cromosomas artificiales de levadura y genomas virales. Ciertos vectores pueden replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora, en tanto que otros vectores se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora y de este modo se replican con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores se refieren en la presente como "vectores recombinantes de expresión" (o simplemente "vectores de expresión"), que contienen secuencias de ácido nucleico que están operativamente enlazadas a una secuencia de control de expresión y por lo tanto son capaces de dirigir la expresión de estas secuencias.
En ciertas modalidades, las construcciones de expresión se derivan de vectores de plásmidos. Las construcciones ilustrativas incluyen vector pNASS modificado (Clontech, Palo Alto, CA) , que tienen secuencias de ácido nucleico que codifican para un gen de resistencia a ampicilina, una señal de poliadenilación y un sitio del promotor T7 ; pDEF38 y pNEF38 (CMC ICOS Biologies, Inc.), que tiene un promotor CHEF1 ; y pD18 (Lonza) , que tiene un promotor CMV. Otros vectores adecuados de expresión de mamífero son bien conocidos (ver, por ejemplo, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., supra; ver también por ejemplo, catálogos de Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI ; Pharmacia, Piscataway, NJ) . Se pueden preparar construcciones útiles que incluyen una secuencia que codifica para dihidrofoliato-reductasa (DHFR) bajo control regulador adecuado para promover niveles mejorados de producción de las proteínas de fusión, niveles que resultan de la amplificación génica después de la aplicación de un agente apropiado de selección (por ejemplo, metotrexato) .
En general, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural de etapa posterior, como se describe anteriormente. Un vector en enlace operable con un polipéptido de acuerdo a esta descripción produce una construcción de clonación o expresión. Las construcciones de clonación/expresión de ejemplo contienen un elemento de control de expresión, por ejemplo un promotor, operablemente enlazado a un polinucleótido de esta descripción. Los elementos de control de expresión, adicionales, tal como intensificadores , sitios de unión específicos del factor, terminadores , y sitios de unión a ribosoma también se contemplan en los vectores y construcciones de clonación/expresión de acuerdo a esta descripción. La secuencia estructural heteróloga del polinucleótido de acuerdo a esta descripción se monta en fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de traducción. De esta manera, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican para la proteína de fusión, como se proporciona en la presente, se pueden incluir en cualquiera de una variedad de construcciones de vector de expresión como una construcción recombinante de expresión para expresar esta proteína en una célula hospedadora.
Las secuencias apropiadas de ADN se pueden insertar en un vector, por ejemplo, por una variedad de procedimientos. En general, se inserta una secuencia de ADN en sitios apropiados de escisión de endonucleasa de restricción por procedimientos conocidos en la técnica. Se contemplan técnicas normales para clonación, aislamiento de ADN amplificación purificación para reacciones enzimáticas que comprendan ADN-ligasa, ADN-polimerasa, endonucleasas de restricción y similares, y varias técnicas de separación. Se describen varias técnicas normales, por ejemplo, en Ausubel et al. (Current Protocole in Molecular Biology, Greene Pu l . Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA, 1993); Sambrook et al. {Molecular Cloning, Second Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1989); Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1982) ; Glover (Ed. ) (ADN Cloning Vol . I y II, IRL Press, Oxford, UK, 1985); Hames y Higgins (Eds.) {Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK, 1985) ; y en otro sitio.
La secuencia de ADN en el vector de expresión se enlaza de manera operativa a al menos una secuencia apropiada de control de expresión (por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor regulado) para dirigir la síntesis de mARN. Los ejemplos representativos de estas secuencias de control de expresión incluyen promotores de células eucarióticas o sus virus, como se describe anteriormente. Se pueden seleccionar regiones promotoras de cualquier gen deseado usando vectores de CAT (cloramfenicol-transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables . Los promotores eucarióticos incluyen CMV inmediatamente temprano, timidina-cinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus, metalotioneína- I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados está bien dentro del nivel de experiencia del experto en la técnica, y la preparación de ciertas construcciones particularmente preferidas recombinantes de expresión que comprenden un promotor o promotor regulado operablemente enlazado a un ácido nucleico que codifica para una proteína o polipéptido de acuerdo a esta descripción, se describe en la presente.
También se contemplan variantes de los polinucleótidos de esta descripción. Los polinucleótidos variantes son al menos 90 %, y de manera preferente 95 %, 99 %, o 99.9 % idénticos a uno de los polinucleótidos de la secuencia definida como se describe en la presente, o que hibridiza a uno de estos polinucleótidos de secuencia definida bajo condiciones de hibridación severa de cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M a aproximadamente 65-68°C o cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M, y formamida al 50 % a aproximadamente 42 °C. Las variantes de polinucleótidos retiene la capacidad para codificar para un dominio de unión o proteína de fusión del mismo que tiene la funcionalidad descrita en la presente.
El término "severo" se usa para referirse a condiciones que están comúnmente entendidas en la técnica como severas. La severidad de hibridación se determina principalmente por la temperatura, concentración iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tal como formamida. Los ejemplos y condiciones severas para hibridación y lavados son cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M a aproximadamente 65-68°C o cloruro de sodio 0.015M, citrato de sodio 0.0015M, y formamida 50 % a aproximadamente 42°C (ver Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) .
Las condiciones más severas (tal como mayor temperatura, menor concentración iónica, más formamida u otro agente desnaturalizante) también se pueden usar; sin embargo, se afectará la velocidad de hibridación. En casos donde sea de interés la hibridación de desoxioligonucleótidos , las condiciones adicionales de ejemplo de hibridación severa incluyen lavado en 6x SSC, pirofosfato de sodio al 0.05 % a 37°C (para oligonucleótidos* de 14 bases) , 48°C (para oligonucleótidos de 17 bases) , 55°C (para oligonucleótidos de 20 bases) , y 60°C (para oligonucleótidos de 23 bases) . .
Un aspecto adicional de esta descripción proporciona una célula hospedadora transformada o transfectada con, o que contiene de otro modo, cualquiera de los polinucleótidos o vector/construcciones de expresión de esta descripción. Los polinucleótidos o construcciones de clonación/expresión de esta descripción se introducen en células adecuadas usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo transformación, transfección y traducción. Las células hospedadoras incluyen las células de un sujeto que se somete a terapia celular ex vivo que incluyen por ejemplo, terapia génica ex vivo. Las células hospedadoras eucarióticas contempladas como un aspecto de esta descripción cando tienen un polinucleótido, vector o proteína de acuerdo a esta descripción, incluye, además de las células propias del sujeto (por ejemplo, las células apropiadas de un paciente humano) , células VERO, células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO) (incluyendo células CHO modificadas capaces de modificar el patrón de glicosilación de moléculas de unión, multivalentes , expresadas, ver, Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0115614) , células COS (tal como COS-7) , células W138, BHK, HepG2 , 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12 , K562, HEK293, células HepG2 , células N, células 3T3, células Spodoptera frugiperda (por ejemplo, células Sf9) , células Saccharomyces cerevisia , y cualquier otra célula eucariótica que se conoce en la técnica por ser útil en la expresión, y opcionalmente en el aislamiento, de un péptido o proteína de acuerdo a esta descripción. También se contemplan células procarióticas, incluyendo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, un Streptomyceto, o cualquier célula procariótica conocida en la técnica por ser adecuada para expresar y opcionalmente para aislar, una proteína o péptido de acuerdo a esta descripción. Al aislar la proteína o péptido de células procarióticas, en particular, se contempla que se pueden usar técnicas conocidas para extraer la proteína de los cuerpos de inclusión. La selección de un hospedador apropiado está dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica de las enseñanzas de la presente. Se contemplan células hospedadoras que glicolizan las proteínas de fusión de esta descripción.
El término "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora") se refiere a una célula que contiene un vector recombinante de expresión. Se debe entender que estos términos se proponen solo para referirse a una célula particular del sujeto pero a la progenie de esta célula. Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido ya sea mutación o influencias ambientales, esta progenie puede no ser en realidad, idéntica la célula progenitora, pero aún se incluyen dentro del alcance del término "célula hospedadora" como se usa en la presente.
Se pueden cultivar las células hospedadoras recombinantes en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para activar promotores, para seleccionar transformantes o para amplificar genes particulares. Las condiciones de cultivo para células hospedadoras particulares seleccionadas para la expresión tal como temperatura, pH y similares, serán fácilmente evidentes a un experto en la técnica. También se contemplan varios sistemas de cultivo celular de mamífero para expresar proteína recombinante . Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritas por Gluzman (1981) Cell 23:175, y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas de células C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión, mamíferos, comprenderán un origen de replicación, un promotor adecuado, y opcionalmente , un intensificador, y también cualquier sitio necesario de unión de ribosoma, sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de empalme, secuencias de terminación transcripcional , y secuencias no transcriptas de 5' -flanqueo, por ejemplo, como se describe en la presente con respecto a la preparación de construcciones de expresión de proteína de unión, multivalente . Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV40, y sitios de poliadenilación, se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos, no transcriptos, requeridos. La introducción de la construcción en la célula hospedadora se puede efectuar por una variedad de métodos con los cuales estarán familiarizados los expertos en la técnica, que incluyen transfección con sulfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación (Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology) .
En una modalidad, una célula hospedadora se transduce por una construcción viral recombinante que dirige la expresión de una proteína o polipéptido de acuerdo con esta descripción. La célula hospedadora transducida produce partículas virales que contienen la proteína o polipéptido expresado, derivado de porciones de una membrana de célula hospedadora incorporada por las partículas virales durante la germinación viral.
Composiciones y Métodos de Uso Para trabar un humano o mamíferos no humanos que padecen de un estado de enfermedad asociado con la desregulación de TNF-a, IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, T EAK, CSF2, IGF1, IGF2, BLyS/APRIL o IL10, se administra una proteína de fusión multi -específica de esta descripción, a un sujeto en una cantidad efectiva para mejorar los síntomas del estado de la enfermedad siguiendo un transcurso de una o más administraciones. Siendo polipéptidos, las proteínas de fusión multi -específicas de esta descripción se pueden suspender o disolver en un diluyente farmacéuticamente aceptable, que incluye opcionalmente un estabilizador de otros excipientes farmacéuticamente aceptables, que se pueden usar para administración intravenosa por inyección o infusión, como se analiza más completamente más adelante.
Una dosis terapéuticamente efectiva es aquella dosis requerida para prevenir, inhibir la ocurrencia de, o para tratar (aliviar un síntoma en algún grado, de manera preferente todos los síntomas de) un estado de enfermedad. La dosis farmacéuticamente efectiva depende del tipo de enfermedad, de la composición usada, de la ruta de administración, del tipo de sujeto que se trate, de las características físicas del sujeto específico bajo consideración para tratamiento, medicación concurrente, y otros factores que reconocerán los expertos en las técnicas médicas. Por ejemplo, se puede administrar una cantidad entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal (que se puede administrar como una dosis individual, o en múltiples dosis dadas por hora diariamente, semanalmente , mensualmente o cualquier combinación de los mismos que es un intervalo apropiado) de un ingrediente activo, dependiendo de la potencia del polipéptido del dominio de unión o proteína de fusión multi-específica de esta descripción.
En ciertos aspectos, por esta descripción se proporcionan composiciones de proteínas de fusión. Las composiciones farmacéuticas de esta descripción comprenden en general uno o más tipos de dominios de unión o proteínas de fusión en combinación con un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los portadores serán no tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. Los portadores farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, P°r ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co . (A.R. Gennaro (Ed. ) 1985). Por ejemplo, se puede usar solución salina estéril y solución salina amortiguada con fosfato a pH fisiológico. Se pueden proporcionar conservadores, estabilizadores, tintes y similares en la composición farmacéutica. Por ejemplo, se puede adicionar benzoato de sodio, ácido sórbico, o ásteres de ácido p-hidroxibenzoico como conservadores. Id. en 1449. Además, se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión Id. Los compuestos de la presente invención se pueden usar ya sea en las formas de sal o de base libre, con ambas formas que se consideran como que están dentro de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas también pueden contener diluyente tal como amortiguadores; antioxidantes tal como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) , proteínas, aminoácidos, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sucrosa, o dextrinas) , agentes queladores (por ejemplo, EDTA) , glutationa u otros estabilizadores o excipientes. La solución salina amortiguada neutral o la solución salina mezclada con albúmina sérica no específica son diluyentes apropiados de ejemplo. De manera preferente, el producto se formula como un liofilizado usando soluciones apropiadas de excipiente como diluyentes.
En ciertas modalidades, se puede reducir al mínimo o no se inhibe la cis-señalización de IL6 , es decir, cualquier inhibición de la cis-señalización no es sustancial, significando que la inhibición no es inexistente, asintomática o no detectable. El grado de inhibición de la transseñalización de IL6 puede variar, pero en general la transseñalización se altera un grado que tiene un efecto positivo en los síntomas de un estado de enfermedad mediado por, o asociado con esta señalización. En ciertas modalidades, la inhibición de la trans-señalización de IL6 por los polipéptidos del dominio de unión o proteínas de fusión de los mismos, de esta descripción, puede retardar, detener o invertir el progreso de la enfermedad.
Las composiciones de esta descripción se pueden usar para tratar estados de enfermedad en humano y mamíferos no humanos que se medían por la señalización de TNF-a, IL6, RANKL, IL7, IL17A/F, TWEAK, CSF2 , IGF1, IGF2 , BLyS/APRIL o IL10.
La producción incrementada de IL-6, y de esta manera la señalización de IL-6, se ha implicado en varios procesos de enfermedad, que incluyen enfermedad de Alzheimer, autoinmunidad (por ejemplo, artritis reumatoide, SLE) , inflamación, infarto al miocardio, enfermedad de Paget, osteoporosis , tumores sólidos (por ejemplo, cáncer de colon, cánceres de vejiga y prostático de RCC) , ciertos cánceres neurológicos , malignidades de células B (por ejemplo, enfermedad de Castleman, algunos subtipos de linfornas, leucemia linfocítica crónica, y, en particular, melanoma maligno) . En algunos casos, IL-6 está implicada en las rutas de proliferación de debido a que actúa con otros factores, tal como factor de crecimiento epitelial de unión a heparina y factor de crecimiento de hepatocitos (ver, por ejemplo, Grant et al. (2002) Oncogene 21:460; y Badache y Hynes (2001) Cáncer Res. 61:383; Wang et al. (2002) Oncogene 21:2584). De manera similar, se sabe que la superfamilia de TNF está comprendida en una variedad de trastornos, tal como cáncer (tumorigénesis , incluyendo proliferación, migración, metástasis) , autoinmunidad (SLE, diabetes) , falla cardíaca crónica, reabsorción ósea y aterosclerosis , por nombrar una pocas (ver, por ejemplo Aggarwal (2003) Nature Rev. 3:745; y Lin et al. (2008) Clin Immunol, 126:13 Las mutaciones en el gen de RA K que provocan un incremento en la señalización mediada por RANK, se ha mostrado que dan por resultado un incremento en la formación de osteoclastos y son responsables de la osteolisis incrementada vista en algunos pacientes con enfermedad familiar de Paget (ver, por ejemplo, Boyce y Xing, Arthritis Research and Therapy 2007;9 Suppl 1:S1). Se piensa que RANKL juega un papel en la inducción de la proliferación de células tumorales, como se expresa por algunas células tumorales malignas, así como en artritis psoriática (ver, por ejemplo, Ritchlin et al. (2003) J. Clin Invest 111:821; Mease (2006) Psoriasis Forum 12:4). El tratamiento de mujeres post-menopáusicas con baja densidad ósea con denosumab, un anticuerpo monoclonal que inhibe RANKL, se ha mostrado que incrementa la densidad mineral ósea y suprime marcadores de recambio óseo. De manera similar, se ha usado denosumab de forma clínica para tratar individuos con artritis reumatoide (ver, por ejemplo, Cohén et al. (2008) Arthritis Rheum. 58:1299) y cáncer osteolítico (ver, por ejemplo, Lipton et al. (2007) J. Clin. Oncol . 25:4431). Se ha mostrado que la inyección directa de OPG disminuye la resorción ósea (ver, por ejemplo, Morony et al. (1993) J. Bone . Min. Res. 14:1478).
La ruta de IL7 se ha enlazado a enfermedades óseas, tal como artritis reumatoide, mieloma múltiple y periodontitis (Colucci et al. (2007) J. Pathol . 212:47). La ruta de IL7 también está implicada en artritis reumatoide, ya que se produce por sinoviocitos inflamados e induce producción de Thl-citosinas dependiente de contacto celular en co-cultivos de células T sinoviales y monocitos (van Roon et al., (2008) Ann. Rheum. Dis. 67:1054). IL7 promueve numerosas respuestas pro-inflamatorias que incluyen activación de células T, que pueden predominar la función reguladora de células T en artritis reumatoide. IL7 también induce pérdida ósea in vivo al provocar una producción de células T y citosinas osteoclastogénicas clave RA KL y TNFa . Además, IL7 conduce a la expansión de la mezcla de precursores de OC al inducir la proliferación de células B220+ de médula ósea (Toraldo et al. (2003) Proc. Nat'l Acad. Sci. (EUA) 100:125). Los niveles y la actividad de IL7 en pacientes con artritis reumatoide no responden a tratamiento anti-TNFOt, indicado que IL7 puede ser un buen objetivo o diana para el tratamiento en estos pacientes (van Roon et al., 2008) .
Se han asociado altos niveles de IL17A con varias enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo artritis reumatoide, psoriasis y esclerosis múltiple. Por ejemplo, se han reportado niveles elevados de IL17 que se presentan en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (RA) y se cree que juegan un papel en la destrucción ósea característica de RA. También se ha mostrado que IL17 induce producción de NO en condrocitos y en explantes de cartílago osteoartrítico humano (Attur et al. (1997) Arthritis Rheum 40:1050).
Adicionalmente , se ha mostrado que los reactivos que neutralizan IL17A mejoran de forma significativa la severidad de la enfermedad en varios modelos de ratón de enfermedad humana .
Se ha asociado IL17F con el desarrollo de varias enfermedades autoinmunitarias , que incluyen artritis (incluyendo artritis reumatoide y artritis de Lyme) , lupus eritematoso sistémico (SEL) , esclerosis múltiple y asma (Betteli y Kuchroo (2005) J. Exp . Med. 201:169-71; Oda et al. (2006) Am. J. Resp. Crit . Care Med. 15 de Enero 2006; Numasake et al. (2004) Immunol . Lett . 95:97-104). Los estudios por Hymowitz et al. han indicado que IL17F es único entre las citosinas inflamatorias conocidas, ya que incrementa la descomposición de proteoglicano y disminuye la síntesis de proteoglicano por cartílago articular (Hymowitz et al. (2001), EMBO J. 20 :5332-41) .
Se ha mostrado que IL17RA juega un papel en varias condiciones inflamatorias que incluyen artritis, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple y asma (Li et al. (2004) Huazhong Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 24:294; Fuj ino et al. (2003) Gut 52:65; Kauffman et al. (2004) J. Invest. Dermatol . 123:1037-1044; Mannon et al. (2004) N. Engl . J. Med. 351:2069; Matusevicius et al. (1999) Mult . Scler. 5:101; Linden et al. (2000) Eur. Respir. J. 15:973; y Molet et al. (2001) J.
Allergy Clin. Immunol . 108:430).
El receptor TWEAK cognado, TWEAKR o factor- inducible 14 de crecimiento de fibroblastos (Fnl4)( es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF expresado por tipos celulares no linfoides ( iley et al. (2001) Immunity 15:837). La expresión de TWEAK y TWEAKR es relativamente baja en tejidos normales, pero se favorece de forma significativa en la reparación de tejido y en enfermedades. La ruta de TWEAK/R facilita las funciones de reparación aguda de tejidos y de esta manera funciona de manera fisiológica después de la lesión aguda, pero funciona de manera patológica en escenarios de enfermedad inflamatoria crónica. En contraste a TNF, el TWEAK no juega un papel evidente en el desarrollo u homeostasis. Una revisión de la ruta de TWEAK/R se proporciona en Burkly et al. (2007) Cytokine 40:1. TWEAK persistentemente activado promueve la inflamación crónica, hiperplasia patológica y angiogénesis , e impide de forma potencial la reparación del tejido al inhibir la diferenciación de células progenitoras . Se ha identificado la proteína de TWEAK en la superficie de monocitos activados y células T y en líneas de células tumorales, y de manera intracelular en monocitos activados y en descanso, células dendríticas y células NK. Se incrementa de forma significativa la expresión de TWEAK localmente en lesión aguda, enfermedad inflamatoria y cáncer, todo lo cual se asocia con infiltración de células inflamatorias y/o activación de tipos de células inmunitarias, innatas, residentes. Se ha mostrado que los niveles en circulación de TWEAK se incrementan de forma significativa en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas tal como esclerosis múltiple y lupus eritematoso sistémico.
Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales bloqueadores de TWEAK son efectivos en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) en ratones (Kamata et al. (2006) J. Immunol 177:6433; Perper et al. (2006) J. Immunol . 177:2610). Las actividades artritogénicas de TWEAK y TNF en sinoviocitos humanos frecuentemente son aditivas o sinérgicas y parecen ser independientes una de otra, indicado que TWEAK y TNF puede actuar en paralelo en la patología de artritis reumatoide . Se ha especulado que la heterogeneidad de los pacientes con RA con respecto a su respuesta clínica a inhibidores de TNF puede reflejar una contribución patológica de TWEAK.
La patente de los Estados Unidos No. 7,169,387 describe la preparación de un anticuerpo monoclonal específico para TWEAK y su uso para bloquear aspectos del desarrollo de la enfermedad de injerto versus hospedadora (GVHD) , usando un modelo en ratón de GVHD crónica. La publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2007/0280940 describe receptores de señuelo de TWEAKR y anticuerpos contra TWEAKR y TWEAK, conjuntamente con su uso en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, asociadas con edema cerebral y muerte celular.
Varios grupos han mostrado que CSF2, así como su receptor, están presentes en la articulación sinovial de pacientes con artritis (ver, por ejemplo, Alvaro-Gracia et al. (1991) J. Immunol . 146:3365). Adicionalmente , se ha mostrado que CSF2 provoca protuberancias de artritis reumatoide en pacientes tratados con CSF2 para neutropenia en el síndrome de Felty (Hazenberg et al. (1989) Blood 74:2769) o después de quimioterapia (de Vries et al. (1991) Lancet 338:517). En esclerosis múltiple, los niveles elevados de CSF2 correlacionan con la fase activa de la enfermedad (Carrieri et al. (1998) Immunopharmacol . Immunotoxicol 20:373; McQualter et al. (2001) J. Exp. Med. 194:873). Se han encontrado niveles elevados de CSF2 en el pulmón, conjuntamente con eosinófilos (Broide y Firestein (1991) J. Clin. Invest . 88:1048).
Se ha identificado IGF1R en el tratamiento de cánceres, incluyendo sarcomas (Scotlandi y Picci (2008) Curr. Opin. Oncol . 20:419-27; Yuen y Macaulay (2008) Exper Opin They. Targets 12:589-603).
Se han encontrado niveles elevados de BLyS/APRIL en pacientes con trastornos autoinmunitarios tal como lupus eritematoso sistémico (SLE) , artritis reumatoide y síndrome de Sjogren, con los mayores niveles de BLyS que están asociados con severidad incrementada de la enfermedad (Cheema et al. (2001) Arthritis Rheum 44:1313; Groom et al . (2002) J. Clin Invest. 109:59; Zhang et al . (2001) J. Immunol 166:6). Además, APRIL, BLyS y TACI, conjuntamente con BCMA, se ha mostrado que transportan poderosas señales de supervivencia e inductoras de crecimiento in vitro a células malignas tomadas de tejido tumoral de linfoma de Hodgkin (HL) , indicado un posible papel de estas proteínas en el tratamiento de HL y otras formas de cáncer (Chiu et al. (2007) Blood 109:729).
Se conoce que IL10 tiene propiedades inmunosupresoras (Commins et al. (2008) J. Allergy Clin. Immunol . 121:1108-11; Ming et al. (2008) Immunity 28:468-476), y se han visto respuestas benéficas después de la administración de IL10 a pacientes con psoriasis (Asadullah et al. (1999) Arch. Dermatol . 135:187-92) y enfermedad inflamatoria del intestino (Schreiber et al. (2000) Gastroenterology 119:1461-72).
Los agentes que comprenden el dominio de unión de esta descripción son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y otras incluyendo enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, artritis idiopática juvenil, artritis psoriática, psoriasis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , enfermedad de Chron, colitis ulcerativa, asma refractaria severa, síndrome periódico asociado a TNFRSF1A (TRAPS) , endometriosis , lupus eritematoso sistémico (SLE) , enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , síndrome de Sjógren, esclerosis múltiple, enfermedad de Graves, asma refractaria severa, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Castleman, inflamación del sistema nervioso central, ataque, edema cerebral, rechazo de trasplante, enfermedad del injerto versus hospedador (GVHD) , inflamación aguda y crónica, dermatitis atópica, choque, artritis enteropática, artritis reactiva, síndrome de eter, síndrome de SEA, (Seronegatividad, entesopatía, Síndrome de Artropatía) , dermatomiositis, escleroderma, vasculitis, miolitis, osteoartritis, sarcoidosis, esclerosis, dermatitis, dermatitis atópica, lupus, enfermedad de Still, miastenia gravis, enfermedad celíaca, enfermedad de Guillain-Barre, diabetes mellitus tipo I, enfermedad de Addison, enfermedad de Paget, enfermedad degenerativa de articulaciones, osteoporosis y otros trastornos que comprenden pérdida de masa ósea, y cánceres, incluyendo cáncer de próstata independiente de hormonas, cáncer osteolítico, mieloma múltiple, trastornos proliferativos de células B, tal como linforma no de Hodgkin de células B y cánceres avanzados de riñon, mama, colon, pulmón, cerebro y otros tejidos.
También se contempla la administración de composiciones de proteínas de fusión multi -específicas , de esta descripción, en combinación con un segundo agente. Un segundo agente puede ser uno aceptado en la técnica como un tratamiento normal para un estado particular de enfermedad, tal como inflamación, autoinmunidad y cáncer. Los segundos agentes de ejemplos contemplados incluyen citosinas, factores de crecimiento, esteroides, NSAID, DMARD, quimioterapéuticos , radioterapéuticos , u otros agentes activos y auxiliares, o cualquier combinación de los mismos.
"Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de un polipéptido de dominio de unión, o proteína de fusión, de esta descripción, que es farmacéuticamente aceptable y que posee la actividad farmacológica deseada del compuesto progenitor. Estas sales incluyen las siguientes: (1) sales de adición de ácido, formadas con ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares; formadas con ácidos orgánicos tal como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclo pentapropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido 3- (4-hidroxibenzoil) benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 1,2-etano-disulfónico, ácido 2 -hidroxietanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 4 -clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluensulfónico, ácido camforsulfónico, ácido 4 -metilbiciclo [2.2.2] -oct-2-eno-l- carboxílico, ácido glucoheptónico, ácido 3 -fenilpropionico, ácido trimetilacético, ácido ter-butilacético, ácido lauril-sulfónico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido hidroxinaftoico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico, y similares; o (2) sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto progenitor ya sea se reemplaza por un ión metálico, por ejemplo, un ión de metal alcalino, un ión de metal alcalino térreo o un ión de aluminio; o coordinados con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina, o similares.
En modalidades ilustrativas particulares, se administra de manera intravenosa un polipéptido o proteína de fusión de esta descripción, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión. Las rutas de administración además de la intravenosa incluyen oral, tópica, parenteral (por ejemplo, sublingual o bucal), sublingual, rectal, vaginal, e intranasal . El término parenteral como se usa en la presente incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraesternal , intracabernosa, intratecal, intrameatal, intrauretral , periespinal o técnicas de infusión. La composición farmacéutica se formula para permitir que los ingredientes activos contenidos en la misma estén biodisponibles en la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un paciente toman la forma de una o más unidades de dosis, donde por ejemplo, una tableta puede ser una dosis unitaria individual, y un recipiente de uno o más compuestos de esta descripción en forma de aerosol puede detener una pluralidad de dosis unitarias .
Para administración oral, puede estar presente un excipiente y/o aglutinante, tal como sacarosa, caolín, glicerina, almidón-dextrano, ciclodextrinas , alginato de sodio, etil-celulosa y carboxi-metilcelulosa . Opcionalmente pueden estar presentes agentes edulcorantes, conservadores, tintes/colorantes, intensificadores de sabor, o cualquier combinación de los mismos. También, opcionalmente, se pueden, se puede usar un revestimiento.
En una composición propuesta para ser administrada por inyección, se pueden incluir de manera opcional uno o más de un agente tensioactivo, conservador, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, amortiguador, estabilizador, agente isotónico o cualquier combinación de los mismos .
Para formulaciones basadas en ácido nucleico, o para formulaciones que comprenden productos de expresión de acuerdo a esta descripción, se administrarán, por ejemplo, de aproximadamente 0.01 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, por la ruta intradérmica, subcutánea, intramuscular, o intravenosa, o por cualquier ruta conocida en la técnica como que es adecuada bajo un conjunto dado de circunstancias.
Una dosis preferida, por ejemplo, es de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, con aproximadamente 5 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg que es particularmente preferido. Será evidente para los expertos en la técnica que el número y frecuencia de administración dependerá de la respuesta del hospedador .
Las composiciones farmacéuticas de esta descripción pueden estar en cualquier forma que permita la administración a un paciente tal como por ejemplo, la forma de un sólido, líquido o gas (aerosol) . La composición puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión, para la administración por cualquier ruta descrita en la presente.
Una composición farmacéutica líquida como se usa en la presente, ya sea en la forma de una solución, suspensión u otra forma similar puede incluir uno o más de los siguientes componentes: diluentes estériles tal como agua para inyección, solución salina por ejemplo, solución salina fisiológica) , solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tal como mono- o di -glicéridos sintéticos que sirven como solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles , glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno ; antioxidantes tal como acido ascórbico o bisulfito de sodio; amortiguadores tales como acetatos, hidratos o fosfatos; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetrácetico; y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como sodio, cloruro o dextrosa. La preparación parenteral se puede encerrar en ampolletas, jeringas desechables o frascos de múltiples dosis producidos de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un aditivo preferido. Una composición farmacéutica inyectable esta preferentemente estéril.
También, puede ser deseable incluir otros componentes en la preparación, tal como vehículos de distribución o administración que incluyen sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vehículos de aceite biodegradable, emulsiones de aceite en agua, micro capsulas biodegradables y liposomas. Los ejemplos de adyuvantes para el uso de estos vehículos incluyen N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP) , lipopolisacáridos (LPS) , glucano, IL-12, GM-CSF, ?-interferón, y IL-15.
En tanto que se puede emplear cualquier portador adecuado conocidos por los expertos en la técnica, en las composiciones farmacéuticas de esta descripción, el tipo de portador variedad dependiendo del modo de administración y de sí se desea una liberación sostenida. Para la administración Parenteral, el portador puede comprender agua, solución salina, alcohol, o una grasa, una cera, un amortiguador, o cualquier combinación de los mismos. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los portadores anteriores o un portador sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio o cualquier combinación de los mismos. 5 Esta descripción contempla una dosis unitaria que comprende una composición farmacéutica de esta descripción. Estas dosis unitarias incluyen, por ejemplo, un frasco o jeringa de una sola dosis o de múltiples dosis, incluyendo un frasco o jeringa de dos compartimientos, uno que comprende la -]_Q composición farmacéutica de esta descripción en forma liofilizada y el otro un diluyente para reconstitución. Una unidad de dosis de múltiples dosis también pueden ser, por ejemplo, una bolsa o tubo para conexión a un dispositivo de infusión intravenosa. 15 Esta descripción también contempla un equipo que comprende una composición farmacéutica en un recipiente de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, un frasco y un conjunto de instrucciones para administrar la composición a pacientes que padecen de un trastorno como se describe en la 20 presente.
Todas las patentes Norteamericanas, publicaciones en solicitudes de patente Norteamericana, solicitudes de patente Norteamericana, patentes Extranjeras, solicitudes de patentes Extranjeras, publicaciones no de patente, tablas, secuencias, 25 páginas Webs o similares referidas en esta especificación, se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Los siguientes ejemplos se proponen para ilustrar, pero no para limitar, esta descripción.
Ej emplos Secuencias Xceptor Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión, multi-específicas de ejemplo que tienen un ectodominio de TNFRSF1B y un dominio de unión anti-IL6xR se proporcionan en SEQ ID NO:607-668, con los correspondientes casetes de expresión de nucleótidos que se proporcionan en SEQ ID NO: 673-734, respectivamente (se señala que las proteínas maduras carecen de la secuencia de péptido señal encontrada en SEQ ID NO:607-668). Las proteínas de fusión multi-específicas que tienen un ectodominio de TNFRSF1B en el amino-terminal y un dominio de unión anti-IL6xR en el carboxi -terminal se refieren en la presente como TRU(XT6)- 1001 a TRU (XT6 ) -1062. Las proteínas de fusión en la orientación invertida - es decir, que tiene un dominio de unión anti-IL6xR en el amino-terminal y un ectodominio de TNFRSF1B en el carboxi-terminal , se refieren en la presente como TRU (X6T) - 1008 y TRU (X6T) -1019.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión, multi-específicas de ejemplo que tienen un ectodominio de TNFRSF1B y un dominio de unión, antagonista de T EAK, RANKL, IGF1, IL7 , IL17 o IGF se proporcionan en SEQ ID NO: 798-804, con los correspondientes casetes de expresión de nucleótidos que se proporcionan en SEQ ID NO: 80-811, respectivamente .
Se examinó una biblioteca de fagos de dominios de unión de Fab para los dominios de unión específicos para un complejo IL6xR esencialmente como se describe por Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol . 23:344. Los dominios de unión se clonaron por amplificación por PCR, de forma breve, las regiones VL y VH de los clones de la biblioteca de Fab se amplificaron usando PCR SuperMix (Invitrogen, San Diego, CA) y los cebadores apropiados que crean el ligador GS mediante traslape, con una fijación inicial a 56°C durante 9 ciclos, luego 62°C durante 20 ciclos adicionales. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa y se purificaron usando una columna de purificación de PCR Qiagen (Chatsworth, CA) . La reacción de costura de segunda ronda comprendió el mezclado un equivalente molar de los productos de VL y VH con amortiguador Expand y agua, desnaturalizando a 95 °C durante 5 segundos, luego enfriando lentamente a temperatura ambiente. Para amplificar, se adicionó una mezcla de dNTP con enzima Expand y se incubó a 72°C durante 10 segundos. Los cebadores exteriores se adicionaron (5'VH y 3'VL) y la mezcla se sometió a ciclos 35 minutos con una fijación a 62 °C y una reacción de extensión de 45 minutos. El producto resultante de 750 pares de bases se purificó en gel, se digirió con EcoRI y Notl, y se clonó en el plásmido pD28 (para más detalles, ver publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2005/0136049 y publicación de solicitud de PCT No. WO 2007/146968) . La actividad de unión se examinó por ELISA como se describe en Hoet et al . (2005) .
Para la actividad como se describe más adelante se probaron varias proteínas de fusión SMIP y Xceptor descritas en la presente. Las abreviaturas usadas en los siguientes ejemplos incluyen los siguientes términos: PBS-T: PBS, pH 7.2-7.4 y TweenMR20 al 0.1 %; amortiguador de trabajo: PBS-T con 1 % de BSA; amortiguador de bloqueo: PBS-T con 3 % de BSA. Ejemplo 1 Expresión de Xceptores Se realizó la expresión de ciertas proteínas de fusión Xceptor descritas en la presente en células 293 usando el sistema de expresión FreeStyleMR 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
Por cada 30 mi de transíección, se usaron 3 x 107 células en 28 mi del medio de expresión FreeStyle 293. En el día de la transfección, se transfirió una alícuota pequeña de Ia suspensión celular a un tubo de microcentrífuga , y se determinó la viabilidad y la cantidad de aglomeración celular usando el método de exclusión de tinte de azul de tripano. La suspensión se sometió vigorosamente a vórtice durante 45 segundos para romper los aglomerados y se determinaron las cuentas celulares totales usando un contador Coulter o un hemacitómetro. La viabilidad de las células fue de más de 90 %. Un matraz agitador ue contiene la célula requerida se colocó en una incubadora a 37°C en un agitador orbital.
Para cada muestra de transfección, se prepararon complejos de lípido-ADN como sigue. Se diluyeron 30 µg del ADN de plásmido en Opti-MEM® I a un volumen total de de 1 mi y se mezclaron suavemente. Se diluyeron 60 µ? de 293fectinR en Opti-MEMMR I a un volumen total de 1 mi, se mezclaron suavemente y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de 5 minutos, el ADN diluido se adicionó al 293fectinMR diluido para obtener un volumen total de 2 mi y se mezcló suavemente. La solución resultante se incubó durante 20-30 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos de DNA-293fectinMR.
En tanto que se estaban incubando los complejos de ADN-293fectinMR, se removió la suspensión celular de la incubadora y se colocó el volumen apropiado de la suspensión celular en un matraz agitador Erlenmeyer de 125 mi desechable, estéril. Se adicionó medio de expresión FreeStyleMR 293 pre-calentado, fresco hasta un volumen total de 28 mi para una transfección de 30 mi.
Después de que se terminó la incubación del complejo de ADN-293ÍectinR, se adicionaron 2 mi del complejo ADN-293fectinMR a los matraces agitadores. Se adicionaron 2 mi de Opti-MEM® I al matraz de control negativo, en lugar del complejo ADN-293fectinMR. Cada matraz contuvo un volumen total de 30 mi, con una densidad celular final de aproximadamente 1 x 106 células viables/ml. Las células se incubaron en una incubadora a 37 °C con una atmósfera humidificada de C02 al 8 % en aire en un agitador orbital que gira a 125 rpm. Las células se recolectaron en aproximadamente 7 días después de la transfección y se valoraron para la expresión de proteína recombinante .
En céululas 293, como se describe anteriormente, se expresaron moléculas Xceptor que tienen un ectodominio de TNFRSF1B y ya sea un dominio de unión de IL6/HIL6, un ectodominio de TWEAKR, un ectodominio de OPG, un ectodominio de IL7R, un ectodominio de IL17R o un ectodominio de ?T?ß ??. Ejemplo 2 Unión de Xceptor a IL6 e Hiper-IL6 por ELISA Se examinó la actividad de unión de Hiper-IL6 (HIL6 o IL6xR) , recombinante IL6 (rhIL6) , e IL6R humano, soluble para los Xceptores de ejemplo, TRU(XTo)- 1002, 1019, 1025, 1042, 1058, y TRU (X6T) -1019 (SEQ ID O:608, 625, 631, 648, 664 y 670, respectivamente), sustancialmente como sigue.
Unión a HIL6 e IL6 Adicionado a cada concavidad de una placa de 96 cavidades fueron 100 µ? de IgG-Fc anti -humano de cabra (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) a partir de una solución de 2 yg/ml en PBS, pH 7.2-7.4. La placa se cubrió, y se incubó durante la noche durante 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA o 10 % de suero normal de cabra) a cada concavidad, la placa se cubrió, se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron concavidades duplicadas a la placa revestida con IgG-Fc anti-humano 100 µ? / concavidad de muestras de Xceptor TNFRSF IB : : anti-HIL6 y quimera de gpl30-Fc humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) diluida en serie tres veces en amortiguador de trabajo iniciando a 300 ng/ml, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionó en duplicado 100 µ?/concavidad de Hyper-IL-6 de humano o IL-6 humana recombinante a partir de una solución 150 pM en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ?/concavidad de IL-6-biotina anti-humano (R&D Systems) a partir de una solución de 150 ng/ml en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Zymed, San Francisco, CA) diluida 1:4,000 en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió y se incubó a temperatura durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de solución de substrato de 3,3,5,5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 3 a 5 minutos y luego la reacción se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (H2S04 1N) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm- Unión a SIL6R Se adicionaron a cada concavidad de una placa de 96 concavidades 100 µ? de IgG-Fc anti-humano de cabra (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) de 2 µ9/p?1 en PBS, pH 7.2-7.4. Las placas se cubrieron, y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? De amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA o 10 % suero normal de cabra) a cada concavidad, la placa se cubrió, y se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionó en concavidades duplicadas a una placa revestida con IgG-Fc anti-humano 100 µ?/concavidad de muestras de Xceptor TNFRSF IB : : anti-HIL6 , IL-6R anti-humano de control, positiva (R&D Systems, Minneapolis , MN) y los controles negativos, IgG humana o quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems) , cada una se diluyó en serie tres veces en amortiguador de trabajo iniciando a 300 ng/ml, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionó en concavidades duplicadas 100 µ?/concavidad de SIL-6R humano recombinante (R&D Systems) a partir de una solución 75 pM en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ?/concavidad de IL-6R-biotina anti-humano (R&D Systems) a partir de una solución de 100 ng/ml en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de estreptavidina conjugada peroxidasa de rábano picante (Zymed, San Francisco, CA) diluida 1:4,000 en Amortiguador de trabajo, la placa se cubrió y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de solución de substrato de 3,3,5,5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 3 a 5 minutos y luego la reacción se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (IN H2S04) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm .
Los datos en las Figuras 1A-1C demuestran que todas las proteínas de fusión Xceptor, si el ectodominio de TNFRSF1B estuvo en el amino- o carboxi-terminal de las moléculas de proteína de fusión, pueden unirse a HIL6. Adicionalmente, estos ensayos muestran que las proteínas Xceptor tienen especificidad para el complejo IL6xR debido a que solo dos de los Xceptores se unen a rhIL6 (Figura IB) y ninguno se une a SIL6R (Figura 1C) . En estudios relacionados, el xceptor TRU(XT6) -1002 y el SMIP TRU(S6)-1002 se encontraron que reaccionan de forma cruzada con IL6 del primate no humano Mucaca mulatta.
Ejemplo 3 Unión de Xceptor a TNF-a por ELISA Se examinó la actividad de unión de TNF-OÍ para los Xceptores TRU (XT6) -1002 , 1042, 1058, 1019, y . TRU (X6T) - 1019 (SEQ ID NO:608, 648, 664, 625 y 670, respectivamente), sustancialmente como sigue.
Se adicionaron a cada concavidad de una placa de 96 concavidades 100 µ? de IgG-Fc anti-humano de cabra (ICN Pharmaceuticals , Costa Mesa, CA) a partir de una solución de 2 pg/ml en PBS, pH 7.2-7.4. La placa se cubrió, y se incubó durante la noche durante 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? de amortiguador de bloqueo a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas a la placa revestida con IgG-Fc antihumano 100 µ?/concavidad de muestras de Xceptor TNFRSF IB : : anti-HIL6 , los controles positivos EnbrelMR (etanercept) y la quimera TNFR2 (TNFRSF IB) -Fe recombinante de humano (R&D Systems, Minneapolis, M ) , los controles negativos IgG o quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems) , cada uno diluido en serie tres veces en amortiguador de trabajo iniciando a 300 ng / mi, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas 100 µ?/concavidad de TNF- humano recombinante (R&D Systems) a partir de una solución de 2 ng/ml en Amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ?/concavidad de TNF-a-biotina anti -humano (R&D Systems) a partir de una solución de 200 ng/ml en Amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluida 1:1,000 en Amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de solución de substrato de 3,3,5,5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 3 a 5 minutos la reacción entonces se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (IN H2S04) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm .
Los datos en la Figura 2 muestran que todas las proteínas de fusión Xceptor probadas pueden unirse a TNF-OÍ, ya sea si el ectodominio de TNFRSF1B estuvo en el amino- o carboxi-terminal de la proteína de fusión.
Ejemplo 4 Unión a Ligados Duales de Xceptor por ELISA Se examinó la unión concurrente a TNF-a al complejo IL6xR para la proteína de fusión Xceptor TRU (XT6) -1006 (SEQ ID NO:612), sustancialmente como sigue.
Se adicionaron, a cada concavidad de una placa de 96 concavidades, 100 µ? de solución de HIL-6 humana (5 µg/ml en ???, pH 7.2-7.4) . La placa se cubrió y se incubó durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, entonces se adicionaron 250 µ? de amortiguador de bloqueo a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas una placa revestida con HIL-6 100 µ?/concavidad de muestras de Xceptor TNFRSF1B : :HIL6 diluidas en serie tres veces en amortiguador de trabajo iniciando a 300 ng / mi. Los controles negativos incluyeron quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) , 5 EnbrelMR (etanercept) , y solo amortiguador de trabajo. La placa se cubrió y se incubó a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS- T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de TNF-OÍ humano recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN) a 2 ng / mi en ¦^Q amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de TNF- -biotina anti-humano (R&D Systems) a 200 ng/ml en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, T_5 y se incubó a temperatura ambiente durante 1.5 horas.
Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch , West Grove , PA) diluida 1:1000 en 20 amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de solución de substrato de 3,3,5,5- tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante 25 3-5 minutos y luego la reacción se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (H2S04 1N) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm.
Los datos en la Figura 3 demuestran que las proteínas Xceptor pueden unirse a dos ligando de forma simultánea (en este caso TNF-a e Hiper-IL6) .
Ejemplo 5 Bloqueo de Xceptor de Unión de Hiper-IL6 a gp!30 por ELISA Se examinó el bloqueo de la unión de Hiper-IL6 (IL6xR) al receptor gpl30 soluble por las proteínas de fusión Xceptor TRU (XT6 ) - 1004 , 1006, 1007, 1008, 1013, y 1019 (SEQ ID NO:610, 612, 613, 614, 619 y 625), sustancialmente como sigue.
Se adicionaron a cada concavidad una placa de 96 concavidades 100 µ? de quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems, Minneapolis, MN) de una solución de 0.25 - 0.5 yg/ml en PBS, pH 7.2-7.4. Las placas se cubrieron y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µ? de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA o 10 % de suero normal de cabra) a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Se hicieron diluciones en serie cinco veces en amortiguador de trabajo iniciando a 50 µg/ml de las siguientes muestras: muestras de Xceptor TNFRSF1B : : anti-HIL6, los controles positivos, quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems) e IL-6R anti-humano (R&D Systems), y los controles negativos IL-6 anti-humano (R&D Systems), IgG humana o EnbrelM (etanercept) . Se mezclaron volúmenes iguales de las muestras de Xceptor diluidas en serie con Hiper-IL-6 (concentración final de Hiper-IL-6 de 2.5 ng/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas a la placa revestida con gpl30-Fc de humano 100 µ?/concavidad de las diluciones en serie de las mezclas de Xceptor / HIL6, quimera de gpl30-Fc de humano, IL-6R anti-humano, IL-6 anti-humano, IgG humano, y EnbrelMR (etanercept), la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de IgG-Fc anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano (Pierce, Rockford, IL) diluida 1:10,000 en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ? por concavidad de la solución de substrato de 3 , 3 , 5 , 5-tetramentilbenzidine (TMB) (Pierce) durante aproximadamente 5 a 15 minutos y luego la reacción se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (H2S04 1N) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm .
Los datos en la Figura 4 demuestran que las proteínas Xceptor que comprenden el dominio de unión anti-IL6xR pueden bloquear gpl30 soluble de la unión a HIL6. Ejemplo 6 Bloqueo de Xceptor de la Proliferación Celular Inducida por IL6 e Hiper-IL6 Se examinó el bloqueo de la proliferación celular de células TF-1, inducida por IL6 o Hiper-IL6 (IL6xR), para las proteínas de fusión Xceptor TRU(XT6)-1011, 1014, 1025, 1026, 1002, y TRU (X6T) - 1019 (SEQ ID N0:617, 620, 631, 632, 608 y 670), sustancialmente como sigue.
Se adicionaron a cada concavidad de una placa de fondo plano de 96 concavidades, 0.3 x 106 células TF-1 (células humanas de eritroleucemia) en medio fresco de crecimiento (10 % de FBS-RPMI 1640; L-glutamina 2mM; 100 unidades /mide penicilina; 100 g/ml de estreptomicina; HEPES 10 mM; piruvato de sodio 1 mM; y 2 ng/ml de Hu GM-CSF) un día antes del uso en el ensayo de proliferación. Las células entonces se recolectaron y lavaron dos veces con el medio de ensayo (mismo como el medio de crecimiento excepto sin GM-CSF, libre de citosina) , luego se resuspendieron a 1 x 105 células/ml en medio de ensayo. Para bloquear la actividad IL-6, las diluciones en serie de un Xceptor TNFSFR1B : : anti-HIL-6de interés o anticuerpo de pre- incubaron con una concentración fija de IL-6 humana recombinante (rhIL-6) (R&D Systems, Minneapolis , MN) o hiper-IL-6 (HIL-6) en placas de 96 concavidades durante 1 hora a 37°C, 5 % de C02. Los controles usado incluyeron IgG humana; quimera de gpl30-Fc de humano (R&D Systems); anticuerpo anti-hIL-6 (R&D Systems); y anticuerpo anti-hIL-6R (R&D Systems) . Después del período de pre-incubación, se adicionaron lxlO4 células (en 100 µ?) a cada concavidad. La mezcla de ensayo final, en un volumen total de 200 yL/concavidad, que contiene TNFSFR1B : : HIL- 6 , rhIL-6, o HIL-6 y células se incubó a 37°C, 5 % de C02 durante 72 horas. Durante las últimas 4-6 horas de cultivo, se adicionó 3H-timidina (20 yCi/ml en medio de ensayo, 25 L/concavidad) . Las células se recolectaron en placas UniFilter-96 GF/c y se determinó la 3H-Timidina incorporada usando un lector TopCount (Packard) . Los datos se presentan como la media de cpm ± SD de triplicados. El porcentaje de bloqueo = 100 - (cpm de prueba- cpm de control/cpm máximo - cpm de control)* 100.
Los datos en la Figura 5A y en la Figura 5B demuestran que todas las proteínas Xceptor, ya sea si el ectodominio de TNFRSF1B estuvo en el amino- o carboxi-terminal de las moléculas de proteína de fusión, pueden bloquear la proliferación celular inducida por IL6 o Hiper-IL6, respectivamente, o ambos.
Ejemplo 7 Bloqueo de Xceptor de Unión de TNF-a a TNFR por ELISA Se examinó el bloqueo de la unión de TNF-a al receptor de TNF por las proteínas de fusión Xceptor TRU(XT6)-1004, 1006, 1007, 1008, 1013, 1019 (SEQ ID N0:610, 612, 613, 614, 619 y 625, respectivamente) sustancialmente como sigue.
Se adicionaron a cada concavidad de una placa de 96 concavidades 100 µ?? de quimera de TNFR2-Fc recombinante humana (R&D Systems, Minneapolis, MN) a partir de una solución de 0.25 - 0.5 yg/ml en PBS, pH 7.2-7.4. Las placas se cubrieron, se incubaron durante la noche a 4°C. Después de lavar cuatro veces con PBS-T, se adicionaron 250 µL de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % de BSA o 10 % de suero normal de cabra) a cada concavidad, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas (o a 4°C durante la noche) . Las diluciones en serie de cinco veces en amortiguador de lavado iniciando a 50 a 250 µ? se hicieron de las siguientes muestras: muestras de Xceptor TNFRSF IB : : anti-HIL6 , controles positivos EnbrelMR (etanercept) y anti-TNF-a (R&D Systems) , y controles negativos quimera de gpl30-Fc humana (R&D Systems) e IgG humana. Se mezclaron volúmenes iguales del as muestras diluidas en serie de Xceptor con TNF-a (concentración final de TNF- de 2.5 ng/ml) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la placa tres veces con PBS-T, se adicionaron en concavidades duplicadas a la placa revestida con TNFR2-Fc humana recombinante 100 µ?/concavidad de las diluciones en serie de la mezcla de Xceptor / TNF-a, EnbrelMR (etanercept). , anti-TNF-a, quimera de gpl30-Fc humana, e IgG humana, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1.5 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 L por concavidad de TNF-a-biotina anti-humano (R&D Systems) a partir de una solución de 200 ng/ml en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. Después de lavar la placa cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 pL por concavidad de estreptavidina conjugadas con peroxidasa de rábano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) diluida 1:1,000 en amortiguador de trabajo, la placa se cubrió, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar la placa seis veces con PBS-T, se adicionaron 100 µ??? por concavidad de solución de substrato de 3,3,5,5-tetramentilbenzidina (TMB) (Pierce, Rockford, IL) durante aproximadamente 3 a 5 minutos y la reacción entonces se detuvo con 50 µ? de amortiguador de detención (H2S04 1N) por concavidad. La absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm .
Los datos en la Figura 6 muestras que las proteínas Xceptor bloquearon la unión de TNF-a al receptor de TNF, que fue aproximadamente equivalente al bloqueo por TNFR-Fc.
Ejemplo 8 Bloqueo de Xceptor de Aniquilación Celular Inducida por TNF-g Se examinó el bloqueo de la aniquilación de células L929 inducida por TNF-OÍ por las proteínas de fusión Xceptor TRU (XT6 ) - 1011 , 1014, 1025, 1026, 1002, y TRU(X6T)-1019 (SEQ ID NO:617, 620, 631, 632, 608 y 670, respectivamente), sustancialmente como sigue.
Se preparó una suspensión de células de fibroblasto de ratón, L929 (ATCC, Manassas, VA) a una densidad de 2 x 105 células/ml en medio de cultivo (FBS-RP I 1640 al 10 % ; L-glutamina 2 mM ; 100 unidades/ml de penicilina; 100 g/ml de estreptomicina; y HEPES 10 mM) , luego se adicionaron 100 µ? a cada concavidad de una placa negra de fondo plano de 96 concavidades se incubó a 37°C durante la noche, 5 % de C02 en una incubadora humidif icada . Las muestras de Xceptor TNFRSF1B : : anti -HIL6 diluidas en serie en medio de ensayo (mismo como medio de cultivo pero complementado con FBS al 2 %) se mezclaron con un volumen igual de TNF- humano recombinante (rhTNF-OÍ; R&D Systems, Minneapolis , MN) , y se incubaron a 37°C, 5 % de C02 en una incubadora humidificada durante 1 hora. Los controles positivos (es decir, aquellos agentes que bloquean la aniquilación de células L929 inducida por TNF-OÍ) incluyeron EnbrelMR (etanercept) , quimera rhTNFR2 - Fe (R&D Systems, Minneapolis, MN) , y anticuerpo anti-TNF-a (R&D Systems, Minneapolis, ?) . Los controles negativos incluyeron medio de ensayo solo (sin TNF-a adicionados) y el anticuerpo hlgG (sun TNF-a adicionado) . Para analizar la actividad de TNF-a, se removió el medio de cultivo de las células L929 y luego cada concavidad recibió 50 µ? de una mezcla de TNF-a/Xceptor o de control, y 50 µ? de actinomicina D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (de una solución de trabajo recién preparada de 4 µg/ml). Las células entonces se incubaron durante 24 horas a 37°C, 5 % de C02 en una incubadora humidificada . Para medir la viabilidad celular, se adicionaron a cada concavidad 100 µ? de reactivo gradual ATPlite 1 ( PerkinElmer, Waltham, MA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante, se agitó durante dos minutos, y luego se mide la luminiscencia usando un lector TopCount (Packard) .
Los datos en la Figura 7 demuestran que todas las proteínas Xceptpr, si el ectodominio de TNFRSF1B estuvo en el amino- o carboxi-terminal de las moléculas de proteína de fusión, pueden bloquear la aniquilación celular inducida por TNF-a en este ensayo.
Ejemplo 9 Unión de Xceptor a Ligandos por ELISA La capacidad de las moléculas xceptor que comprenden un ectodominio de TNFRSF1B y ya sea un ectodominio de TWEAKR (SEQ ID NO: 798), un ectodominio de OPG (SEQ ID NO: 799), un ectodominio de ???ß??.? I o un ectodominio de IL7R (SEQ ID NO: 801) para unirse a los ligandos T EAK, RANKL, TGF O IL7, respectivamente, se examinó sustancialmente como sigue.
Se adicionaron ligandos de humano y ratón (R&D Systems, Minnesota, MN) a concavidades de una placa de 96 concavidades a una concentración de 1 µg/ml en PBS (100 pL/concavidad) . Las placas se incubaron a 4°C durante la noche. Después de lavar cinco veces con PBS-T, se adicionaron 250 L de amortiguador de bloqueo (PBS-T con 3 % BSA) a cada concavidad, y la placa se cubrió y se incubó a temperatura ambiente (RT) durante 2 horas. Se hicieron diluciones en serie de tres veces de xceptores en el amortiguador de trabajo (PBS-T con 1 % de BSA) iniciando 300ng/ml. Como un control negativo, se usó un xceptor irrelevante. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar cinco veces con PBS-T, se adicionaron 100 pL por concavidad de IgG-Fc anti-humano conjugada a HRP (1:5000 en amortiguador de trabajo) la placa se cubrió, y se incubó a RT durante 1 hora. Después de lavar cinco veces con PBS-T, se adicionaron a cada concavidad 100 pL de substrato Quant-Blu (Pierce, Rockford, IL) . La placa se incubó a RT durante 10-30 minutos, y se midió la fluorescencia a 325/420 nm.
Los resultados se muestran en la Tabla 3 posterior. La unión del TNFRxTGFPRI I a TGF de ratón no se probó, sin embargo, se señala que TGF de ratón y de humano fueron 99 % idéntica.
Tabla 3. Unión de Xceptor a Ligandos ND = No realizado Ejemplo 10 Bloqueo de Xceptor de Aniquilación Celular Inducida por TWEAK Se examinó el bloqueo de la aniquilación de células HT29 inducida por TWEAK para un Xceptor que comprende un ectodominio de TNFRSF1B y un ectodominio de TWEAKR (SEQ ID NO: 798) usando el método descrito por Nakayama et al. (J. Immunol. 168:734, 2002).
De forma breve, en una placa de fondo plano de 96 concavidades, se diluyeron en serie muestras de Xceptor en medio de cultivo (RPMI con FCS al 10 % y piruvato de sodio 1 mM) que contiene 200 ng/ml TWEAK humana (R & D Systems, Minneapolis, MN) con 100 L por concavidad y se incubó a 37°C, 5 % de C02 en una incubadora humidificada durante 1.5 horas. Los controles negativos incluyeron una proteína Xceptor irrelevante (con TWEAK adicionada) y medio de ensayo solo (con y sin TWEAK adicionada) . Después de la incubación, a cada concavidad se adicionaron 5xl03 células HT29 (ATCC, Manassas, VA) en 100 ul en medio de cultivo que contiene 40 ng/ml de IFN-? humano (R & D Systems, Minneapolis, N) . La placa entonces se incubó a 37°C, 5 % de C02 en una incubadora humidificada durante 96 horas. Para analizar la actividad de TWEAK al medir la viabilidad celular, se removieron 100 L de medio de cultivo de las células HT29, y luego a cada concavidad se adicionaron 10 L de reactivo WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD) . La placa se incubó a 37°C, 5 % de C02 durante 2 horas, y la absorbancia de cada concavidad se leyó a 450 nm.
Los datos en la Figura 8 demuestran que la proteína de fusión xceptor que contiene el ectodominio del receptor de TWEAK humano bloqueó la aniquilación celular inducida por TWEAK en este ensayo.
Ejemplo 11 Bloqueo de Xceptor del Bloqueo de Osteoclastogénesis Mediada por RANKL El bloqueo de la osteoclastogénesis mediada por RANKL en células RAW 246.7 por un Xceptor que comprende un ectodominio TNFRSF1B y un ectodominio de OPG (SEQ ID NO: 799) se examinó usando el método de Lee et al. (J. Biol . Chem. 280 (33) :29929, 2005) .
De forma breve, en una placa de fondo plano de 96 concavidades, se diluyeron en serie los xceptores (50 ul/concavidad) en medio de cultivo (DMEM con FCS al 10 %) que contiene 30 ng/ml de RANKL (R & D Systems, Minneapolis, MN) . La placa se incubó a 37°C, 5 % de C02 en un incubadora humidif icada durante 1.5 horas. Después de la incubación, se adicionaron 5xl03 células RAW246.7 (ATCC, Manassas, VA) a cada concavidad en 50 ul de medio de cultivo. La placa se incubó a 37°C, 5 % de C02 en una incubadora humidificada durante 6 días. Los controles negativos incluyeron una proteína xceptor irrelevante (con RANKL) y medio de cultivo solo (con y sin RANKL) .
Después de 6 días, se valoró la actividad de fosfatasa ácida resistente a tartrato generada por osteoclasto (TRAP) mediante ELISA (IDS, Fountain Hills AZ) . De forma breve, se removieron 25 ul de cada concavidad y se adicionaron a una placa preparada de micro-título que se revistió con un anticuerpo anti-TRAP de ratón. A cada concavidad entonces se adicionaron 75 ul de NaCl al 0.9 %, seguido por 25 uL de Reactivo de Liberación. Los controles positivos de ELISA de cantidades variables de TRAP de ratón recombinante y proteínas incluyeron del equipo. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar la placa tres veces en PBS-T, se adicionaron 100 ul de solución de sustrato NPP a todas las concavidades, y la placa se incubó a 37°C durante 2 horas. La reacción en cada concavidad se detuvo con 25 ul de NaOH 0.32M, y la absorbencia se leyó a 405 nm .
Los datos en la Figura 9 muestran que la proteína de fusión xceptor que contiene OPG humana bloqueó el desarrollo de osteoclastos , como se determina al medir la actividad de TRAP en células RA 246.7 tratadas con RANKL .
Ejemplo 12 Afinidad de Unión a TNFa como se Mide por Biacore™ La capacidad de la proteína de fusión xceptor, TRU (XT6) -1002 (SEQ ID NO: 608) y de Enbrel R para unirse a TNFa se determinó usando un instrumento BiacoreMR T100 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) como sigue.
Se capturaron aglutinantes de TNFa por una Fe anti-humano de ratón monoclonal, que se conjugó de manera covalente a una superficie de carboximetil-dextrano (CM4) mediante aminas usando clorhidrato de N- etil - ' - ( 3 -dimetilaminopropil ) -carbodiimida y N-hidroxisuccinimida . Los sitios no ocupados de la superficie activada se bloquearon por etanolamina. El anticuerpo de captura (referido como anti hFc) se une a los dominios CH2 de Fe de IgG para todas las sub-clases y no mostró disociación discernible de los aglutinantes capturados de TNFa durante el transcurso del ensayo. Cada ciclo, se capturó un aglutinante dado de TNFoc en la celda 2 de flujo a una densidad baja (<100RU) y la celda 4 de flujo a una alta densidad (>300RU) , en tanto que las celdas 1 y 3 de flujo se usaron como celdas de referencia. Cada ciclo, se inyectó una concentración individual (0-8 nM) de TNFoc durante 525 segundos a 40 microlitros por minuto. El tiempo de disociación fue ya sea 1 minuto para TNFoc 0-4 nM, o 1 hora TNFoc 0 y 8 nM . Al final del ciclo, la superficie se regeneró suavemente usando MgCl2 3M, que disocia la proteína unida al anticuerpo de captura anti-hFc . Los datos de las inyecciones de TNFoc 8 nM sobre la superficie de alta densidad se usaron para calcular la constante de disociación, kd . El valor de este parámetro entonces se fijó y los datos de la superficie de baja densidad se usaron para calcular la constante de asociación, ka y la Rmax · Esta estrategia aumenta al máximo la señal a ruido para los datos de la fase de disociación y reduce la limitación del transporte de masa para los datos de fase de asociación. El software BIAevaluation se usó para analizar estos análisis. Los resultados de este estudio se muestran en la Tabla 4.
Estos datos demuestran que la porción de TNFaR de la molécula bioespecífica , TRU (XT6) -1002 , se une TNFoc con una afinidad similar a aquella de EnbrelMR.
Tabla 4.
Ejemplo 13 Especificidad de Unión a Hiper-IL6 Y no Otras Citosinas de GP130 Se examinó el efecto de las proteínas de fusión Xceptor en la inducción de la proliferación de células TF-1 por IL6 y la citosinas de gpl30, IL-11, factor inhibidor de leucemia (LIF) , oncostatina M (OSM) y cardiotrofina- 1 (CT-1) .
Se adicionaron a cada concavidad de una placa de fondo plano de 96 concavidades 0.3xl06 células TF-1 (células humanas de eritroleucemia) en medio fresco de crecimiento (SFB-RPMI 1640 al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 2 ng/ml de Hu GM-CSF) un día antes del uso en el ensayo de proliferación. Las células se recolectaron y se lavaron dos veces con medio de ensayo (mismo como medio de crecimiento, excepto sin GM-CSF, libre de citosinas) , luego se resuspendieron a 1 x 105 células/ml en medio de ensayo. Para examinar el bloqueo de la actividad de LIF, OSM y CT-1, se pre- incubaron diluciones en serie de los xceptores TNFSFR1 : : anti-HIL-6 TRU (XT6 ) - 1002 (SEQ ID NO : 608), TRU(XT6) -1019 (SEC ID NO : 625), TRU (XT6 ) -1022 (SEQ ID NO : 628) y TRU(XT6) -1025 (SEQ ID NO : 631) con una concentración fija de cada citosina de gpl30 de manera individual o hiper IL-6 (HIL-6) en placas de 96 concavidades durante 1 hora a 37°C, 5 % de C02. Después del período de pre-incubación, se adicionaron a cada concavidad lxlO4 células (en 100 µ?) . La mezcla final de ensayo, en un volumen total de 200 µ11?/s???3???3?, que contiene TNFSFR1B: : HIL-6, citosina gpl30 o HIL-6 y células, se incubó a 37°C, 5 % de C02 durante 72 horas. Después de las últimas 4-6 horas de cultivo, se adicionó 3H-timidina (20 µ(??/t?1 en medio de ensayo, 25 µ?-?/concavidad) . Las células se recolectaron en placas UniFilter-96 GF/c y se determinó la 3H-timidina incorporada usando un lector TopCount (Packard) . El porcentaje de bloqueo = 100 - (cpm de prueba - cpm de control/cpm máximo - cpm de control) *100.
Los resultados mostraron que xceptor bloqueó la actividad de IL6, pero no IL-11, LIF, OSM o CT-1 (datos no mostrados) , y por lo tanto se unió a hiper IL6, pero no tiene efecto en las otras citosinas de gpl30 probadas.
Ejemplo 14 Unión de SMIP y Xceptor a IL6R en Células de Hígado Se examinó la capacidad de TRU (S6 ) -1002 , TRU(XT6)-1019 y el anticuerpo anti-IL6 hu-PMl para unirse a IL6R en células HepG2 derivadas de hígado, como sigue.
Se lavaron células HepG2 en amortiguador FACS y se ajustaron a 2 x 106 células/ml en amortiguador FACS (PBS + FBS al 3 %) . A las concavidades de una placa de 96 concavidades se adicionaron 50 yL de esta solución (105 células/concavidad) . Las placas se mantuvieron a 37°C hasta que estuvieron listas para adicionar las moléculas diluidas de prueba. Se prepararon diluciones en serie de las moléculas de prueba en amortiguador FACS para dar una solución concentrada de trabajo 2X que se diluyó a IX, cuando se adicionó a las células. Las moléculas diluidas de prueba se adicionaron a las células (50 uL/concavidad) y las células se incubaron durante 20 minutos sobre hielo. Se usó IgG entera como un control . Las células entonces se lavaron dos veces con amortiguador FACS y resuspendieron en anticuerpo anti-humano de cabra conjugado con ficoeritrina (Jackson Labs; diluido 1:200 en amortiguador FACS) . Después de que se incuba durante 20 minutos en hielo en la oscuridad, las células se lavaron dos veces con amortiguador FACS, se re- suspendieron en 200 µ? de PBS y se leyeron en un citómetro de flujo LSRIIMR (BD Biosciences, San José, CA) .
Como se muestra en la Figura 10, TRU(S6)-1002 y TRU(XT6) -1029 no mostraron esencialmente unión a células HepG2.
Ejemplo 15 Bloque de SMIP y Xceptor de la Actividad de IL-6 y TNF en Ratones Se examinó la capacidad de las proteínas de fusión SMIP y Xceptor descritas en la presente, para bloquear la producción inducida por IL-6 o TNF de proteína amiloide A sérica (SAA) , como se describe a continuación. La SAA es una de las proteínas principales de fase aguda en humanos y ratones. Se encuentra elevación prolongada de niveles en plasma de SAA en inflamación crónica y conduce a amiloidosis que afecta el hígado, riñon y bazo (Rienhoff et al., (1990) Mol. Biol . Med. 7:287). Se ha mostrado que tanto IL-6 como TNF inducen SAA cuando se administran solos (Benigni et al., (1996) Blood 87:1851; Ramadori et al, (1988) Eur . J. Immunol 18 : 1259) . (a) Bloqueo de la Actividad de hiper IL-6 Se inyectaron ratones BALB/C hembras de forma retro-orbital con 0.2 mi de PBS, o EnbrelMR (200 pg) , TRU(S6) -1002 (200 ug) o TRU(XT6) -1002 (300 ig o 500 ]ig) en PBS. Una hora roás tarde, los ratones se inyectaron IP con 0.2 mi de PBS o 2 ]ig de hiper-IL6 de humano en PBS. Se recolectó suero de ratón a las 2 horas y 24 horas después de la inyección IP. La concentración en suero de SAA se determinó por ELISA, y la concentración de sgpl30 se determinó por un ensayo de receptor soluble de ratón basado en Luminex. Como se muestra en las Figuras 11 y 12, TRU(S6)-1002 y TRU (XT6 ) - 1002 bloquearon la expresión inducida por hiperIL6 tanto de sgpl30 como de SAA. (b) Bloqueo de Actividad de TNF Ratones BALB/C hembras se inyectaron de manera retro-orbital con 0.2 mi de PBS, o EnbrelMR (200 mg) , TRU(S6)-1002 (200 mg) o TRU (XT6 ) -1002 (300 mg) en PBS. Una hora más tarde, los ratones se inyectaron IP con 0.2 mi de PBS o 0.5 µg de TNF-OÍ de ratón en PBS. Se recolectó el suero de ratón a las 2 horas y 24 horas después de la inyección IP. La concentración en suero de SAA se determinó por ELISA, y se determinó la concentración de sgpl30 por un ensayo de receptor soluble de ratón basado en Luminex. Como se muestra en las Figuras 13A y 13B, el Xceptor TRU(XT6) -1002 bloqueó la expresión inducida por TNF-A de SAA, con el nivel de SAA observado a las 2 horas después de la inyección que es similar a aquel visto con EnbrelMR.
Ejemplo 16 Actividad In vivo de Xceptor Se examina la eficacia terapéutica de las moléculas Xceptor descritas en la presente en modelos animales de enfermedad como se describe a continuación. (a) Mieloma Múltiple La actividad de moléculas Xceptor se examina en al menos uno de dos modelos de ratón bien caracterizado de mieloma múltiple, específicamente, el modelo de mieloma múltiple 5T2 (5T2MM) y el modelo de mieloma múltiple 5T33 (5T33MM) . En el modelo 5T33, los ratones se tratan con Xceptores desde el momento de la inyección de células de tumor (modo profiláctico) . En el modelo 5T2MM, los ratones se tratan desde el comienzo de la enfermedad (modo terapéutico) . El efecto del tratamiento en el desarrollo del tumor y la angiogénesis se valora en ambos modelos, con los estudios óseos que se realizan en el modelo 5T2MM.
El modelo murino 5TMM de mieloma se desarrolló inicialmente por Radl et al. (J. Immunol (1979) 122:609; ver también Radl et al. Am. J. Pathol . (1988) 132:593; Radl J. Immunol TOday (1990) 11:234). Sus características clínicas se asemejan cercanamente a la enfermedad humana: las células tumorales están localizadas en la médula ósea, la concentración de paraproteína sérica es una medida del desarrollo de la enfermedad, se incrementa la neovascularización tanto en el modelo 5T2MM como en el 5T33MM (Van Valckenborgh et al. Am J. Pathol. (1988) 132:593), y en ciertas líneas, se desarrolla una clara enfermedad ósea osteolítica. El modelo 5T2MM incluye crecimiento tumoral moderado y el desarrollo de lesiones óseas osteolíticas . Estas lesiones están asociadas con una disminución en el volumen óseo esponjoso, densidad mineral ósea disminuida y números incrementados de osteoclastos (Croucher et al., Blood (2001) 98:3534). El modelo 5T33MM tiene una captación tumoral más rápida y además de la médula ósea, las células tumorales también crecen en el hígado (Vanderkerken et al., Br. J. Cáncer (1997) 76 :451) .
Los modelos 5T2 y 5T33MM se han caracterizado de forma más extensiva. Se han formulado anticuerpos monoclonales específicos contra el idiotipo tanto de 5T2 como de 5T33MM permitiendo la detección, con mayor sensibilidad, de la paraproteína sérica por ELISA, y la tinción específica de las células tumorales, tanto por el análisis de FACS como por la inmunotinción de secciones histológicas (Vanderkerken et al., Br. J. Cáncer (1997)76:451). El análisis de secuencia del gen de VH permite la detección de células por RT-PCR y el análisis por Northern Blot (Zhu et al. Immunol . (1998) 93:162). Los modelos 5TMM que se pueden usar tanto para experimentos in vitro como in vivo, generan una enfermedad MM típica y diferentes métodos están disponibles para valorar la carga tumoral en la médula ósea, concentraciones séricas de paraproteína, angiogénesis de médula ósea (al medir la densidad de microvasos) y lesiones óseas osteolíticas (por una combinación de radiografía, densitometría e histomorfometría) . La investigación de estos últimos parámetros permite el uso de los modelos 5TMM en un escenario preclínico y el estudio del crecimiento y biología de las células de mieloma en un microambiente singeneico completo. Ambas moléculas tienen como objetivo las células MM en sí mismas y se pueden estudiar moléculas que tienen como objetivo el microambiente de la médula ósea. Específicamente, en tanto que se puede usar el modelo 5T33MM para estudiar tanto el microambiente como las células MM en sí mismas, el modelo 5T2MM también se puede usar para estudiar la enfermedad ósea asociada a mieloma.
Para estudiar la eficiencia profiláctica de las moléculas Xceptor descritas en la presente, se inyectaron ratones C57BL/KaLwRij con 2 x 10s células 5T33 MM y con Xceptor en el día 0. Los ratones se sacrifican el día 28 y se valora el desarrollo tumoral al determinar la concentración sérica de paraproteína y el porcentaje de células tumorales en células aisladas de médula ósea (determinado por citometría de flujo con anticuerpos anti-idiotípicos o por citomanchas) . Se determina el peso del bazo e hígado y estos órganos están fijan en formaldehído al 4 % para análisis adicional. Se fijan las muestras óseas para procesamiento adicionales incluyendo inmunotinción de CD31 en secciones de parafina y la cuantificación de la densidad de microvasos.
Para estudiar la eficiencia terapéutica de las moléculas Xceptor descritas en la presente, se inyectan ratones con células 5T2MM en el día 0, y se administra Xceptor después del comienzo de la enfermedad, como se determina por la presencia de niveles detectables de paraproteína sérica. Se sacrifican los ratones aproximadamente cinco semanas después de la administración del Xceptor, y se valora el desarrollo tumoral como se describe anteriormente para el estudio profiláctico. Además, se realiza el análisis óseo usando rayos X para determinar el número de lesiones óseas y el área del hueso trabecular, y la tinción de TRAP para evaluar el número de osteoclastos . (b) Artritis Reumatoide Se examina la eficiencia terapéutica de las moléculas Xceptor descritas en la presente en al menos uno de dos modelos murinos de artritis reumatoide (RA) , específicamente, la artritis inducida por colágeno (CIA) y modelos de glucosa-6-fosfato- isomerasa (G6PI) . Cada uno de estos modelos se ha mostrado por otros que son útiles para predecir la eficiencia de ciertas clases de fármacos terapéuticos en RA (ver Holmdahl (2000) Arthritis Res. 2:169; Holmdahl (2006) Immunol . Lett . 103:86; Holmdahl (2007) Methods Mol. Med. 136:185; McDevitt (2000) Arthritis Res. 2:85; Kamradt y Schubert (2005) Arthritis Res. Ther. 7:20). (i) Modelo de CIA El modelo de CIA es el modelo de ratón mejora caracterizado para artritis en términos de su patogénesis y base inmunológica . Además, es el modelo más ampliamente usado de RA y, aunque no es perfecto para predecir la capacidad de los fármacos para inhibir la enfermedad en pacientes, se considera por mucho que es el modelo de elección cuando se investigan nuevos terapéuticos potenciales para RA (Jirholt, J. et al. (2001) Arthritis Res. 3:87-97; Van den Berg, W.B. (2002) Curr. Rheumatol . Re . 4:232-239; Rosloniec, E. (2003) Collagen-Induced Arthritis. In Current Protocols in Immunology, eds . Coligan et al., John iley & Sons, Inc, Hoboken, NJ) .
En el modelo de CIA, se induce artritis por la inmunización de ratones macho de DBA/1 con el colágeno II (CII) en adyuvante completo de Freund (CFA) . Específicamente, se inyectaron ratones de manera intradérmica/subcutánea con CII en CFA en el día -21 y se refuerzan con CII en el adyuvante incompleto de Freund (IFA) en el Día 0. Los ratones desarrollan signos clínicos de artritis en el espacio de días del refuerzo con CII/IFA. Un subconjunto de ratones (0 % a 10 %) inmunizados con CII/CFA desarrollan signos de artritis en o alrededor del Día 0 sin un refuerzo y se excluyen de los experimentos. En algunos experimentos de CIA, el refuerzo se omite y los ratones en cambio se tratan con Xceptor o control iniciando el 21 días después de la inmunización con CII/CFA (es decir, el día del primer tratamiento es el Día 0) .
Los ratones se tratan con Xceptor, vehículo (PBS) , o control negativo o positivo en un régimen preventivo y/o terapéutico. El tratamiento preventivo inicia en el Día 0 y continúa a todo lo largo del pico de la enfermedad en ratones de control (no tratados) . El tratamiento terapéutico inicia cuando la mayoría de los ratones muestran signos leves de artritis. EnbrelMR, que se ha mostrado que tiene buena eficiencia, tanto en los modelos de artritis inducidos por CIA como por G6PI, se usa como un control positivo. Los datos recolectados en cada experimento incluyen puntuaciones clínicas e índice acumulativo de artritis. Los signos clínicos de artritis en el modelo de CIA se clasifican usando una escala de 0 a 4 como se muestra en la Tabla 5 a continuación : Tabla 5. (ii) Modelo de G6PI En el modelo de G6PI, se induce la artritis por inmunización de ratones DBA/l con G6PI en adyuvante (Kamradt y Schubert (2005) Arthritis Res. Ther. 7:20; Schubert et al. (2004) J. Immunol. 172:4503 Bockermann, R. et al. (2005) Arthritis Res. Ther. 7:R1316; Iwanami et al. (2008) Arthritis Rheum. 58:754; Matsumoto et al . (2008) Arthritis Res. Ther. 10:R66) . La G6PI es una enzima presente virtualmente en todas las células en el cuerpo y no se conoce porque la inmunización induce una enfermedad específica de las articulaciones. Se ha mostrado que varios agentes, tal como CTLA4-Ig, antagonistas de TNF (por ejemplo, EnbrelMR) y anticuerpo monoclonal anti-receptor de IL-6, inhiben el desarrollo de la artritis en el modelo de G6PI .
Se inmunizaron ratones DBA/1 machos con G6PI en adyuvante Completo de Freund (CFA) a fin de inducir artritis. De forma específica, se inyectaron ratones de manera intradérmica/subcutánea con G6PI en CFA en el Día 0 y desarrollan signos clínicos de artritis en el espacio de días de la inmunización. Como con el modelo de CIA analizado anteriormente, los ratones se tratan con Xceptor, vehículo (PBS) , o control negativo o positivo en un régimen preventivo y/o terapéutico. El tratamiento preventivo inicia el Día 0 y continúa a todo lo largo del pico de la enfermedad en los ratones control. El tratamiento terapéutico inicia cuando la mayoría de los ratones muestran signos moderados de artritis. EnbrelMR, que se ha mostrado que tiene buena eficiencia en los modelos de artritis inducidos tanto con CIA como con G6PI, se usa como un control positivo. Los datos recolectados en cada experimento incluyen puntuaciones clínicas e incidencia acumulativa de artritis. Los signos clínicos de artritis en el modelo de G6PI se clasifican usando una escala similar a aquella empleada para el modelo de CIA. (c) Enfermedad de Riñon Poliquístico La eficiencia de una proteína de fusión xceptor que contiene un antagonista de TNF como se describe en la presente; en el tratamiento de enfermedad de riñon poliquístico se prueba en modelos murinos como se describe en Gattone et al., Nat . Med. (2003) 9:1323; Torres et al. Nat . Med. (2004) 10:363; ang et al. J. Am. Soc . Nephrol . (2005) 16:846; y Wilson (2008) Curr. Top . Dev. Biol . 84:311.
En tanto que esta invención se ha descrito en unión con las modalidades específicas resumidas anteriormente, es evidente que para los expertos en la técnica serán evidentes muchas alternativas, modificaciones y variaciones. Por consiguiente, las modalidades de de esta descripción como se expone anteriormente se propone que sean ilustrativas y no limitantes. Se pueden hacer varios cambios sin apartarse del espíritu y el alcance de esta descripción como se define en las siguientes reivindicaciones. Todas las publicaciones referidas en la presente se incorporan en la presente como referencia como si expusieran completamente.
La SEQ ID NO: 1-834 se exponen en el listado anexo de secuencia. Los códigos para las secuencias de nucleótidos usadas en el listado anexo de secuencias, incluyendo el símbolo "n" , se ajustan a la norma ST.25 de la WIPO (1998), anexo 2, tabla 1.
Se hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención.

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una proteína de fusión multi-específica que tienen una de las siguientes estructuras desde el amino-terminal al carboxi-terminal : (a) BD-ID-ED; (b) ED-ID-BD; o (c) ED1-ID-ED2 caracterizada porque: ED es un antagonista de TNF, y EDI y ED2 son los diferentes dominios de unión, o ectodominios , en donde EDI o ED2 es un antagonista de TNF; ID es un dominio interpuesto; y BD es un antagonista de IL6, antagonista de RANKL, antagonista de IL7, antagonista de IL17A/F, antagonista de T EAK, antagonista de CSF2 , antagonista de IGF, antagonista de BLyS/APRIL o agonista de IL10.
2. La proteína de fusión multi -específica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque BD es un dominio de unión, variable, de inmunoglobulina .
3. La proteína de fusión multi-específica de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque EDI y ED2 son ectodominios de unión de ligando de receptor.
4. La proteína de fusión multi-específica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el dominio interpuesto tiene la siguiente estructura : -L1-CH2CH3-, en donde : Ll es un ligador de charnela de inmunoglobulina, opcionalmente, una charnela de IgGl que tiene la primera cisteína sustituida con un diferente aminoácido; -CH2CH3 - es la región CH2CH3 de un dominio de Fe de IgGl, opcionalmente mutado para eliminar la unión de FcyRI-III en tanto que retiene la unión de FcRn.
5. La proteína de fusión multi-específica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el BD está conectado al dominio interpuesto por un primer ligador y el ED está conectado al dominio interpuesto por un segundo ligador, en donde el primero y segundo ligadores pueden ser los mismos o diferentes .
6. La proteína de fusión multi-específica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el primero y segundo ligadores se seleccionan del grupo que consiste de SEQ ID NO:497-604 y 791-796, opcionalmente, en donde el primer ligador es SEQ ID NO: 576 y el segundo ligador es SEQ ID NO: 791.
7. La proteína de fusión multi-específica de conformidad cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NOS: 607-670 y 798-804.
8. Una composición, caracterizada porque comprende una o más proteínas de fusión multi-específicas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. Una composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteína de fusión multi-específica existe como un dímero o un multímero en la composición .
10. Un polinucleótido, caracterizado por que codifica para una proteína de fusión multi -específica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
11. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10 operablemente enlazado a una secuencia de control de expresión.
12. Una célula hospedadora, caracterizada porque comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 11.
13. Un método para tratar a un sujeto con un trastorno inflamatorio, autoinmunitario, o hiperproliferativo, caracterizado porque comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión multi -específica o composición de la misma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
14. Método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el trastorno es artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, artritis idiopática juvenil, artritis psoriática, psoriasis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, asma refractaria severa, síndrome periódico asociado a TNFRSF1A (TRAPS) , endometriosis , lupus eritematoso sistémico o enfermedad de Alzheimer.
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