MX2010011007A

MX2010011007A - Fibras de dextran electrohiladas y dispositivos formados de las mismas.

Info

Publication number: MX2010011007A
Application number: MX2010011007A
Authority: MX
Inventors: Gary L Bowlin; David G Simpson; James R Bowman; Stephen W Rothwell
Original assignee: Univ Virginia Commonwealth
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-10
Publication date: 2011-05-25
Also published as: WO2009126870A3; HK1153513A1; CA2721162A1; EP2276879A2; WO2009126870A2; MX338212B; EP2276879A4; AU2009234203A1; JP2011516751A; US9399082B2; JP5539959B2; US20110150973A1; IL208571A; CA2721162C; EP2276879B1; IL208571A0; AU2009234203B2

Abstract

La invención se refiere en general a fibras de dextran que preferentemente se elecrohilan y dispositivos formados de tales fibras. En particular, tales dispositivos pueden incluir sustancias de interés (tal como sustancias terapéuticas) asociadas con las fibras electrohiladas. Al exponerse a un líquido, las fibras electrohiladas se disuelven inmediatamente y las sustancias de interés se liberan en el líquido. Los dispositivos ejemplares incluyen vendajes formados de fibras de dextran electrohiladas y agentes asociados que promueven la hemostasis, tal como trombina y fibrinógeno.

Description

I FIBRAS DE DEXTRAN ELECTROHIUVDAS Y DISPOSITIVOS FORMADOS DE i LAS MISMAS ! DESCRIPCIÓN |' i ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ¡ Campo de la Invención j La invención se refiere en general a fibras de dextran, preferentemente fibras de dextran electrohiladas, y dispositivos formados de las mismas. En particular, tales dispositivos¦ pueden ser vendajes que incluyen sustancias terapéuticas asociadas con las fibras electrohiladas las : ü cuales, al exponerse a un liquido que disuelve las fibras electrohiladas, se liberan en el liquido.

Antecedentes de la Invención j La respuesta natural del cuerpo al , sangrado derivado de una herida es iniciar la coagulación sanguínea a través de un complejo proceso conocido como la ca'scada de coagulación. La cascada implica dos trayectorias que finalmente conducen a la producción de la enzima trombina, la cual cataliza la conversión del fibrinógeno a fibrina. La fibrina se retícula entonces para formar un coágulo, dando como resultado la hemostasis. Para heridas que Í; no son severas, y en individuos que no tengan condiciones que se opongan, el cuerpo comúnmente es capaz de llevar a cabo este proceso e icientemente de manera que evita la i' pérdida excesiva de sangre de la herida. Sin embargo, en elj: caso de i \ |i I ji i ¡i heridas severas o en individuos en quienes se encuentra comprometido el mecanismo de coagulación, este puede no ser el caso. Sin embargo, es posible para estos individuos, administrar componentes de la cascada de coagulación, especialmente trombina y fibrinógeno, directamente a la herida para originar la hemostasis. El vendado deji heridas sangrantes es también una práctica común, en parte para aislar y proteger el' área lesionada y también para proporcionar un medio para ejercer presión sobre la herida, lo cual también puede ayudar a controlar el sangrado.' Aunque estos métodos pueden llevarse ¡' a cabo satisfactoriamente en casos de un trauma ligero, o bajo condiciones de heridas "controladas" (e.g., cirugía)', muchas situaciones en las cuales se necesitan más tales tratamientos son también aquellas en las cuales es más difícil proporcionarlos. Ejemplos de tales heridas incluyen, por ejemplo, aquellas infligidas durante combate, o heridas no previstas que se presentan como resultado de accidentes. En tales circunstancias, la supervivencia del individuo herido puede depender de detener la pérdida de sangre de la , herida y lograr la hemostasis durante los primeros minutos después de la lesión. Desafortunadamente,' dadas las circunstancias de tales lesiones, puede no encontrarse inmediatamente disponible la apropiada intervención médica. ¡' En particular, es problemático el tratamiento de heridas penetrantes tales como heridas de bala o d'e algunas heridas de granada de metralla. Esto se debe a la dificultad i de colocar un vendaje y/o agentes terapéuticos en ; el sitio real de la lesión, la cual incluye un área que se ^encuentra muy por debajo de la superficie corporal y a laj; cual es difícil o imposible acceder utilizando : j técnicas convencionales. | Jiang et al., (Biomacromolecules 2004, 5, '326-333) muestran fibras de dextran electrohiladas . Losj, agentes asociados con las fibras (e.g., BSA, lisozima) se electrohilan directamente en las fibras. Las fibras también pueden incluir otros polímeros electrohilados con el ¡dextran.

Jiang et al., (2006, Journal of Biomedical ; ¡I Materials Research Part B: Applied Biomaterials (D(íario de Investigación de materiales biomédicos Parte B: biomáteriales i aplicados) 50-57, iley Periodicals, Inc.) describe fibras i electrohiladas que son un compuesto de poli ( -caprol ctona) y una cubierta y dextran como un núcleo. Estás1 fibras i proporcionan la liberación lenta de los agentes (albúmina de suero bovino, BSA) que también se encuentran electrohilados en las fibras. : !' La patente de los Estados Unidos 6,753,454 para Smith et al., (Junio 22 de 2004), describe; fibras electrohiladas que comprenden una mezcla sustanc|ialmente homogénea de un polímero hidrófilo y un polímero que es al menos débilmente hidrófobo, que pueden utilizarse paca formar un vendaje. El vendaje puede comprender agentes1 activos (e.g.; dextran) . Sin embargo, las fibras descritas no son fácilmente solubles en líquidos.

La patente de los Estados Unidos 6 , 7 62 , 335 para MacPhee et al., (Julio 13 de 2004 ) muestra un ¡i vendaje hemostático multicapas que comprende una capa de 'trombina entre dos capas de fibrinógeno. El vendaje puede ¡contener otros materiales reabsorbibles tales como polímeros o copolímeros a base de ácido glicólico o ácido láctico. Ni las fibras electrohiladas ni las fibras de dex Itran se muestran como componentes del vendaje.

¡I La patente de los Estados Unidos 6 , 821 , 47 9 para Smith et al., (Noviembre 23 de 2004 ) muestra un métjodo para preservar un material biológico en una matriz protectora seca, comprendiendo la matriz fibras tales como l'ajs fibras electrohiladas. Un componente de las fibras puede ser dextran, pero no se describen las fibras homogéneas de dextran. |¡ La patente de los Estados Unidos 7 , 101 , 862 para Cochrum et al., (Septiembre 5 de 2006) muestra composiciones hemostáticas y métodos para controlar el sangradó. Las composiciones comprenden un artículo que contiene 'celulosa (e.g., gasa) en el cual se retícula covalenteimente o i iónicamente un polisacárido . El polisacárido reticulado ' i' i¡ ' ¡i ¡i puede ser dextran. Sin embargo, las composiciones no se electrohilan y no se incluyen en las composiciones agentes exógenos de coagulación.

I La solicitud de patente de los Estados Unidos 2004/0018226 (Wnek et al., publicada en Enero 20 |;de 2004) describe fibras producidas por medio de una técnica de i : electroprocesamiento tal como electrohilado . Las fibras i comprenden cavidades dentro de las fibras para ¡'contener sustancias que no se mezclan con las fibras. El dextran no se muestra como un componente de la fibra.

La solicitud de patente de los Estados Unidos 2007/0160653 (Fisher et al., publicada en Julio 12 j.de 2007) muestra una tela hemostática que comprende . ' factores hemostáticos (e.g., trombina, fibrinógeno) , pero la's fibras se forman de vidrio electrohiladas más una fibra secundaria (e.g., seda, cerámica, bambú, yute, rayón, etc.). ¡ La solicitud de patente de los Estados Unidos i 2008/0020015 (Carpenter et al., publicada en Ene;rió 24 de 2008) describe un aposito para heridas que comprende varios polímeros biodegradables e hidrogeles que tienen células precursoras alogénicas o autólogas (e.g., I células progenitoras ) dispersadas dentro de los polímeros. Los i polímeros pueden prepararse mediante electrohilado y un componente del polímero puede ser dextran. Sin embargo, los polímeros no pueden ser inmediatamente solubles al: ¡contacto con líquidos, dado que deben proporcionar una plataforma para I el suministro de las células al paso del tiempo, aunque los polímeros se degradan eventualmente in situ. j La solicitud de patente de los Estados Unidos 2008/0265469 (Li et al., fecha de prioridad: Noviembre 10 de 2006) describe nanofibras electrohiladas que j1 pueden comprender dextran. Sin embargo, las nanofibras no se describen como fácilmente solubles en líquidos. |j La solicitud de patente de los Estados Unidos 2009/0053288 (Eskridge et al., publicada en Febrero 26 de 2009) muestra una tela hemostática tejida que comprende aproximadamente 65% de hilo de fibra de vidrio y aproximadamente 35% de hilo de bambú. El componente · de fibra de vidrio puede encontrarse electrohilado y los' j factores hemostáticos tales como trombina pueden encontrarse , asociados ¦ li con la tela, e , g. , embebiendo el material en una solución de ¦ i trombina. Puede agregarse dextran como un¡. agente higroscópico.

Existe una necesidad constante de proporcionar métodos y medios para iniciar la coagulación sanguínea en heridas a fin de detener o al menos retardar la pérdida de sangre. En particular, existe una necesidad constante de mejorar la capacidad para promover rápidamente la hémostasis en heridas severas de una manera fácil, especialmente bajo circunstancias en donde el tratamiento inmediato por ¡¡personal médico es limitado o no se encuentra disponible.' ¡¡ SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se demuestra en la presente que las f;ibras de dextran electrohiladas (EDFs) son útiles como "plataforma" i temporal para secuestrar y transportar una o más de las sustancias asociadas de interés a una ubicación de ¡ interés.

Un solvente liquido se encuentra presente, o se encontrará i presente en la ubicación de interés y la plataforma es ' ? temporal debido a que las fibras de dextran electrohiladas se disuelven al contacto con el liquido, liberando las sustancias asociadas de interés hacia el liquido. 1 En una modalidad de la invención, las EDFs se fabrican en un vendaje i que también incluye agentes activos terapéuticamente ; i! benéficos, comúnmente agentes bioactivos. Por ejemplo, el trombina y los fibrinógenos se encuentran presentes dentro del vendaje en formas que son activas al contacto con líquidos tales como sangre. La aplicación del vendaje a una I' ¡I herida sangrante da como resultado la disolución; de las fibras de dextran en la sangre líquida y la liberación de la trombina activa y el fibrinógeno directamente hacia el lecho de la herida. La trombina activa rápidamente cataliza la conversión del fibrinógeno a fibrina y sobreviene la i! formación de un tapón o coágulo hemostático a partir de la fibrina. Dando como resultado la hemostasis. , {, El uso de dextran electrohilado para el súministro de las sustancias de interés a un ambiente liquido de interés tiene muchas ventajas sobre la técnica anterior. Por i ejemplo, las fibras de dextran electrohiladas son de un peso extremadamente ligero y flexibles (maleables) y, po|r tanto, los . dispositivos producidos de fibras de dextran electrohiladas tienen huellas muy pequeñas. Esto es importante en muchas situaciones. Por ejemplo, los jyendajes producidos de acuerdo con la invención se ¡acomodan fácilmente, e.g., en los utensilios que lleva un soldado, sin agregar un peso o volumen excesivo. Además, al contacto con : i: el liquido, el dextran electrohilado se !disuelve instantáneamente (o casi instantáneamente) y completamente.

En consecuencia, al colocarse, por ejemplo, en o sobre una herida sangrante, los agentes incluidos en el ve ¦nI1daje se suministran rápida y directamente al sitio de la hervida y se forma un coágulo. No es necesario retirar los componentes de dextran del vendaje, rompiendo posiblemente el ¡coágulo, debido a que el componente de dextran se disuelve. Ventajosamente, la implementación de esta técnjica que potencialmente salva vidas no requiere el uso de i instrumentación sofisticada o de un alto nivel de adiestramiento o habilidad; tales dispositivos!' pueden administrarse por un novato e incluso pueden auto- !i administrarse si es necesario. Por ejemplo, un soldado herido puede ser capaz de auto-administrarse un vendaje de i ' dextran a fin de detener el flujo de sangre de una herida, mientras espera que el personal médico loj¡ asista I posteriormente. ¡ En algunas modalidades, el dispositivo de ¡ fibra de dextran electrohilada incluye un material de soporte no soluble o parcialmente soluble o lentamente soluble para proporcionar una estabilidad adicional a las fibras electrohiladas "algodonosas". El material de soporté también puede formarse de un material electrohilado, tal como dextran comprimido electrohilado, u otras fibras electrohiiladas, o completamente de otro tipo de material. Si se utilizan fibras de dextran comprimidas, en general un vendaje de i tamaño total contiene de 5 a 10 gramos de dextran y tal vez ¡ j¡ tiene de aproximadamente 0.97 era (2.5 pulgadas) a aproximadamente 1.56 cm (4 pulgadas) de ancho y longitud, y aproximadamente 0.78 cm (2 pulgadas) de alto (profundidad) y tal vendaje puede comprimirse a aproximadamente 0.1 cm (0.5 pulgadas) de profundidad para formar un material de ' i1soporte. vendaje, la presencia del material de soporte hacei: posible I aplicar presión a través del vendaje y sobre una herjida a la cual se aplica el vendaje, aunque las fibras de dextran y los agentes activos se disuelvan inmediatamente al exponerse a la sangre liquida. ¦ i¡1 Un objetivo de esta invención es proporcionar un método para suministrar uno o más de los agentes de ¡interés a i una ubicación de interés. El método comprende la ¡etapa de aplicar o suministrar a dicha ubicación de interés un dispositivo, comprendiendo el dispositivo 1) fibras de dextran electrohiladas que se disuelven líquidos; y 2) uno o más de los agentes de con las fibras de dextran electrohiladas. La etapa de aplicación o suministro da como resultado la disoljución de las fibras de dextran electrohiladas en el líquido en la ubicación de interés, liberando así los uno o más agentes de interés en el líquido. En algunas modalidades, las fibras de dextran electrohiladas tienen un diámetro que varíaj de 0.75 i: mieras a 1.00 mieras. En algunas modalidades, la ' ubicación de interés es un sitio en el cuerpo de un individúo; y el líquido en el sitio puede ser un fluido corporal/ j¡ Además, los uno o más agentes de interés pueden ser ¡ agentes bioactivos. ; La invención proporciona además un vencíaje . que comprende fibras de dextran electrohiladas que tienen un diámetro que varía de 0.75 mieras a 1.25 mieras y que se i, - li - ¦ r ? disuelven al contacto con líquidos; y al menos, uno de i trombina y fibrinógeno se encuentran asociados con las fibras de dextran electrohiladas en el vendaje. En una modalidad de la invención, la trombina y el fibrinógeno son trombina de salmón y fibrinógeno de salmón, los cuales pueden encontrarse en forma de partículas. Alternativamente, la trombina y el fibrinógeno pueden encontrarse presentes dentro ¡de gotas electrohiladas. En algunas modalidades de la invención, tanto la trombina como el fibrinógeno se encuentran asociados con las fibras de dextran electrohiladas. otras modalidades, el vendaje comprende además uno o más agentes bioactivos adicionales. Aún en otras modalidades, eí vendaje comprende un material de soporte. En algunas modalidades, el material de soporte comprende un material seleccionado de gasa, dextran comprimido electrohilado, polímeros de ácido i poliglicólico, polímeros de ácido poliláctico, polímeros de ¡i caprolactona y nylon cargado.

La invención también proporciona un método para inducir la hemostasis en una herida. Este método 1 comprende la etapa de aplicar a la herida un vendaje hemostático que comprende: 1) fibras de dextran electrohiladas que (tjienen un diámetro que varía de 0.75 mieras a 1.25 mieras y que se disuelven al contacto con líquidos; y 2) al menos,; uno de ' i' trombina y fibrinógeno asociado con las fibras de ¡ dextran electrohiladas. La etapa de aplicación da como resultado la disolución de las fibras de dextran electrohiladas dentro de la herida y la liberación de la trombina y el fibrinógeno en la sangre dentro de dicha herida, induciendo . asi la hemostasis en la herida. En algunas modalidades,: ¡tanto la i trombina como el fibrinógeno se encuentran asociados! con las fibras de dextran electrohiladas. |l BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ¡ La Figura 1 es una esguemática del aparato de electrohilado . Los elementos clave del sistema de electrohilado incluyen un suministro de energía' |'de alto voltaje, un depósito de fuente para el polímero y un mandril puesto a tierra. Este sistema utiliza un mandril dejobjetivo cilindrico; sin embargo, el proceso de electrohilado puede adaptarse para producir formas mucho más complejas.1 Pueden suministrarse polímeros únicos y/o múltiples independientemente o simultáneamente al campo elécítrico de uno o más depósitos de fuente. Pueden utilizarse polímeros de electrohilado distintos y únicos de una secuencia temporal para producir una Las Figuras 2 A y B son, A, procesamiento del dextran en base a pulverizadores; de aire comprimido; B, fibras de dextran producidas por medio de un procesamiento de electroaerosol . La 'cantidad de ^material representada es probablemente el material suficiente para aproximadamente dos vendajes. Nótese el depósito del ¦ I material. Se utilizó un campo eléctrico para dirigir el dextran al mandril.

La Figura 3 es una micrográfica de es'caneo de electrón de las fibras de dextran electrohiladá Is . El diámetro promedio nominal en corte transversal de las fibras individuales fue de 1 miera, proporcionando una gran! área de i superficie. Las Figuras 4 A-E son* representaciones esquemáticas de vendajes ejemplares formados de f'ibras de dextran electrohiladás. A, un vendaje con material de soporte no permeable como refuerzo; B, un vendaje con i material de soporte tipo red; C, un vendaje con refuerzo no permeable y un material de soporte tipo red las fibras electrohiladás en su sitio en el un vendaje (dispositivo) para el suministro de terapéuticos a una herida profunda; E, una modalidad alternativa ¡ para un dispositivo para el suministro de terapéuticos a una herida profunda.

\; Las Figuras 5 A y B muestran los cambios en los i niveles de citosina en animales expuestos al veri'daje de fibrinógeno/trombina de salmón. (A) Los niveles de IL-1, IL-6, TNF- , IFN-?, IL-4 e IL-10 se muestran como la 'relación logarítmica del nivel de citosina determinada en la sangre i extraída en la cirugía inicial para implantar el puerto vascular en comparación con los niveles pico después de la exposición. Se observaron cambios tanto en las respuestas 1 pro-inflamatorias (IL-?ß, IL-6, TNF-a, IFN-?) como en las respuestas humorales (IL-4 e IL-10) . (B) Los cambios en las citosinas dentro de un individuo animal muestran' que la exposición inicial (primera flecha) y la subsecuente infusión intravenosa de las proteínas (segunda flecha) emitieron una i respuesta que pudo detectarse en muestras tomadas en la siguiente extracción de sangre. | Las Figuras 6 A a F muestran la evaluación cualitativa de la producción de inmunoglobulina en cerdos en respuesta a las proteínas de salmón mediante inmunoanálisis j Western. (A) PAGE de preparaciones de fibrinógeno de salmón (Sal) , humano (Hu) y de cerdo (Sw) e inmunoanálisis1 Western correspondientes con suero de dos animales (B y C) . ¡El suero de la pre-exposición y las extracciones de sangr¡é en la eutanasia final se presentan en estos paneles. Los ! isotipos IgG presentes en el suero se visualizaron mediante I segundos anticuerpos de IgG de HRP anti-cerdo y se detectan, como el enlace de las proteínas en muestras en gel. Las¡ flechas indican las posiciones de los componentes de IgG de cadena pesada y ligera en campos de proteína de cerdo que también se reconocen por medio del segundo anticuerpo. Los pesos r moleculares se muestran a la izquierda (kDa 1 x 10; ). (D) PAGE de preparaciones de trombina de salmón (Sal), humano (Hu) y de cerdo (Sw) e inmunoanálisis i Western correspondientes con suero de los mismos animales , mostrados en (C y D) . En estos animales la trombina no se reconoció en E, pero existe una reacción de desfallecimiento en : el campo 1 de proteina de salmón en F (flecha) . La cámara en el sistema de detección detectó la fuerte proteina de trombina!1 en cerdo |i en la membrana como una banda blanca en F. ! Las Figuras 7 A a D muestran el curso de tiempo del desarrollo del anticuerpo en animales expuestos a vendajes de trombina/fibrinógeno de salmón a través del protocolo de parche dérmico. Se llevaron a cabo ELISAs utilizando reactivos anti-IgG. Se utilizaron los siguientes ántigenos como los objetivos en los ELISAs: (A) fibrinógeno de salmón, (B) trombina de salmón, (C) fibrinógeno humano y (D) ¡trombina : I1 humana. Los incrementos en la absorbencia observadas en las últimas muestras, paneles A, B, C, se presentaron después de la infusión intravenosa de proteínas de salmón. Cada curva representa los datos de un animal diferente.

Las Figuras 8 A a D muestran el curso de tiempo del desarrollo del anticuerpo en animales expuestos a veridajes de trombina/fibrinógeno de salmón a través del protocolo de parche abdominal. Se llevaron a cabo ELISAs utilizando reactivos anti-IgG. Se utilizaron los siguientes a'ntígenos como los objetivos en los ELISAs. (A) fibrinógeno de¡! salmón, (B) trombina de salmón, (C) fibrinógeno humano y (D) jtrombina humana. : ; Las Figuras 9 Á a D muestran el progreso de la cicatrización dérmica después de una herida de grosó,r total. i' Las imágenes de las muestras tomadas a 7 días del control (A) y las lesiones tratadas con el vendaje de salmón (B) ¡muestran un coágulo fibrinonecrótico que rellena el defecto de la herida (*) y una proyección de células epiteliales jhacia el centro de la herida en ambos casos a medida que progresa la cicatrización de la herida después de la coagulación : inicial . (manchado H & E, bars = 100 um) . Las muestras tomadas a 28 días del control (C) y las lesiones tratadas con el| vendaje de salmón (D) muestran una re-epitelización completa por medio de una epidermis hiperplástica e hiperqueiiatótica . (manchado H & E, bars = 100 um) .

La Figura 10 es una esquemática de la cascada de coagulación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA ¡ La invención proporciona fibras de ¦ ['dextran, especialmente fibras de dextran electrohiladas . Las fibras ¦ I: de dextran electrohiladas (EDFs) pueden formarse) en una variedad de dispositivos para una variedad de propósitos.

Generalmente, una o más sustancias de interés se encuentran asociadas con las EDFs en el dispositivo, comunmentíe con el propósito de suministrar las una o más sustancias dé interés a un liquido de interés. Al contacto con el liquido, las EDFs se disuelven casi inmediatamente y las sustancias asociadas se liberan en el medio liquido.

En una modalidad de la invención, las;, EDFs se i forman en un vendaje. El vendaje incluye generalmente agentes activos asociados con las EDFs, siendo suministrados los agentes activos a un sitio de acción (e.g., ) a través de la aplicación del vendaje al sitio. de ación contiene o contendrá un liquido y, cuando el vendaje al sitio de acción, las EDFs del vendaje se disuelven en el liquido y los agentes activos, asociados con o secuestrados en o alrededor del tapete de fibras de|,dextran, se liberan en el liquido. En una modalidad, el I sitio de acción es un lecho de herida y los agentes activojs que se suministran por medio del vendaje son factores o agentes que participan en la cascada de coagulación tales como trombina y fibrinógeno. La aplicación de un vendaje de EDF a úijia herida da como resultado la disolución de las fibras de dextran en la sangre dentro del lecho de la herida, lo cual a su vez da como resultado la liberación o el suministro de los agentes activos en el sitio. La trombina y el fibrinógeno que se encuentran asociados con el vendaje se encuentran e|h formas i biológicamente activas cuando se ponen en contacto, con la sangre. De aquí que, al disolverse, la trombina act|úa en el fibrinógeno, convirtiéndolo en fibrina, que después ¡forma un coágulo dentro de la herida, deteniendo el flujo de sangre. En algunas modalidades de la invención, se utilizan s!blamente fibras de dextran hiladas y, por tanto, después de la - 1 formación del coágulo, no es necesario perturbar el coágulo a fin de retirar los componentes del vendaje, dado que1 ninguno i1 permanece en el sitio. En otras modalidades, ¡como se de la herida mediante métodos convencionales. ; El electrohilado es una estrategia de procesamiento no mecánica y puede adaptarse a escala para adaptar los ¦ r grandes volúmenes necesarios para cubrir las necesidades de un procesamiento comercial. Una representación esquemática de un tipo de implementación para electrohilado, se desbalance de la carga comienza a superar la terisión de superficie de la fuente polimérica, formando un chorro eléctricamente cargado. Dentro del campo eléctrico, el chorro se dirige hacia el objetivo puesto a tierra y el vehículo solvente se evapora. Dependiendo de las condiciones de reacción y de los polímeros utilizados en el proceso, puede utilizarse el electrohilado para producir ¡un fino aerosol del material o un tapete continuo no tejjido del material de fibra, como se muestra en la Figura ?. Para muchos polímeros, la naturaleza del proceso de electrohilado proporciona un alto grado de control sobre el diámetro de las fibras resultantes. Pueden lograrse selectivamente diámetros en mieras o nanoescala simplemente regulári'do las concentraciones iniciales de los polímeros presentes en las soluciones de electrohilado. Controlando el movimiento del ' i objetivo puesto a tierra con respecto a la solución fuente, las fibrillas pueden depositarse en la matriz aleatoria o en disposiciones alineadas que se a lo largo de un eje definido.

Una segunda esquemática de un aparato de ' electrohilado se muestra en la Figura 2A. Los elementos clave del sistema de electrohilado incluyen un suministro de energía de alto voltaje, un depósito fuente para el polímero y un mandril objetivo puesto a tierra. El sistema que se representa utiliza un mandril de objetivo cilindrico; sin embargo, el proceso de electrohilado puede adaptarse para producir formas mucho más complejas. Pueden suministrarse polímeros únicos y/o múltiples independientemente o simultáneamente al campo eléctrico desde uno de los d'epósitos li fuente. Además, pueden utilizarse políme'ros de electrohilado distintos y únicos de fuentes separadas en una secuencia temporal para producir una estructura laminada. La Figura 2B muestra el resultado del electrohilado de aproximadamente 10 g de dextran disuelto en agua desionizada sobre un objetivo de mandril redondo, como se describe en detalle en el Ejemplo 1 siguiente. La Figura 3 muestra una micrográfica de escaneo de electrón de las fibras dJl dextran electrohiladas, en la cual el diámetro promedio en corte transversal de las fibras individuales es de aproximadamente 1 miera.

Los expertos en la técnica reconocerán i que el electrohilado no es la única manera de producir fibras de ayuda a la eficiente recolección de las fibras y el i I electrohilado puede producir fibras uniformes. Otras I tecnologías que podrían también emplearse para hilar fibras de dextran, incluyen las descritas en las patentes , de E.U. 7, 067, 444 para Luo et al., (Junio 27 de 2006); patente de • i E.U. 6,116,880 para Bogue et al., (Septiembre 12 de :2000) ; y patente de E.U. 5,447,423 para Fuisz et al., (Septiembre 5 de : i1 1995) , cuyos contenidos completos se incorporanj en la presente mediante la referencia. En particular, las 'llamadas "máquinas de algodón de azúcar" (con o sih¡¡ fuerza electrostática aplicada) pueden ser adecuadas para su uso en la fabricación de las fibras de dextran de la invención. En el Ejemplo 2 más adelante se proporcionan descripciones más detalladas de los métodos de preparación de las fibras de dextran de la invención. Otros métodos incluyen comprimir una solución de dextran entre dos placas u otras superficies I planas y separar una de la otra las placas o superficies, comúnmente repetidamente. Se forman fibras de dextian entre las dos superficies.

En algunas modalidades, se utilizan diferentes al dextran para formar las fibras para su uso en los dispositivos de la invención, especialmente ^(pero no exclusivamente) cuando se emplea una máquina de aJJgodón de azúcar. Ejemplos de tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, azúcares tales como dextrosa, sucrosa, etc.

El dextran comercialmente disponible que sé utiliza . 11 para producir las fibras electrohiladas de la invención, se sintetiza a partir de sucrosa mediante enzimas! en la i superficie celular de ciertas bacterias de ácido; ¡láctico, ¡I siendo las más conocidas Leuconostoc mesenteróides y i Streptococcus mutans. El dextran es un glucano ¡complejo ramificado (un polisacárido producido de muchas moléculas de d-glucosa) compuesto de cadenas de longitudes variadas (e.g., de 10 a 200 kilodaltons) . La cadena recta consiste de enlaces de a -1,6 glicosidico entre moléculas de glucosa, mientras que las ramas provienen de enlaces a -1,¡4 (y en algunos casos, también de enlaces -1,2 y -1,3;). Los j dextranos se encuentran comercialmente disponibles en un ?: i amplio rango de. pesos moleculares, e.g., de aproximadamente i 10 kilodaltons (kDa) a aproximadamente 200 kDaj. Las preparaciones comerciales son mezclas de dextranos 'de pesos i moleculares variados, más estrechos y pueden como dextranos de "bajo" o " , el "Dextran 40" tiene un peso molecular promedio de 40 ¡kDa. El "Dextran 75" tiene un peso molecular promedio de 75 k'Da, etc. En la práctica de la presente invención, los ¿extraños utilizados para electrohilado se encuentran típicamente en un rango de peso molecular de desde aproximadamente 10 a i aproximadamente 200 kDa, o de aproximadamente 25 a aproximadamente 200 kDa, o de a aproximadamente 200 kDa, o de a aproximadamente 200 kDa, y comúnmente de aproximadamente 60 a para formar la cantidad de fibras deseada.

En general, las condiciones para electrohilar el dextran son como sigue: una temperatura ambiente de desde aproximadamente 15.55 hasta aproximadamente 23.88 °C (de 60 hasta aproximadamente 75 °F) ; una humedad relativa, ¡de desde aproximadamente 30% hasta aproximadamente 40% y, típicamente, de al menos aproximadamente 20%. Las fibras resultantes se encuentran típicamente en el rango de nanómetros o mm de diámetro en corte transversal, comúnmente de desde aproximadamente 0.75 mieras hasta aproximadamente 1.25 mieras. Las fibras electrohiladas son "secas" i y deben protegerse de la exposición a la humedad para evitar su disolución prematura. Sin embargo, un poco dé j agua se encuentra asociada con las fibras y las composiciones de ¦ i fibra pueden contener de aproximadamente 7 a aproximadamente 8% de agua, pero debe ser menor que aproximadamente 5% cuando las fibras se encuentran esterilizadas por medio de, radiación i de rayos x. |i Los dispositivos de la invención s(e forman comúnmente de dextran hilado sustancialmente homogéneo. La cantidad de dextran por dispositivo puede variar ampliamente dependiendo del tamaño del dispositivo que se1 ¡fabrica, utilizando las formulaciones de dispositivo típicas de i aproximadamente 5 a 10 g de dextran (comúnmente de 100,000 a 200,000· Mr) por dispositivo. Sin embargo, el rango puede extenderse ampliamente, e.g., de tan baja como 0.5 ig o menos (para dispositivos pequeños) a tan alta como 100 g o más por dispositivo, para dispositivos grandes. En algunas modalidades de la invención, puede ser útil ¡utilizar cantidades menores de dextran (e.g., de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 g de dextran por dispositivo) : fin de i concentrar los agentes activos que se suministran por medio I del dispositivo en un volumen más pequeño. i ¡ De más consecuencia, es la concentración de dextran en la solución a partir de la cual se hilan las fibras. Generalmente, una i solución de dextran para electrohilado será de una concentración en el rango de aproximadamente ¡ 0.1 a aproximadamente 10 gramos por mi del solvente;, o de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5 gramos por mi y, ¦ ¡j comúnmente, tal solución se encuentra a una concentración de aproximadamente 1 gramo por mi, + aproximadamente ¡0.15 mg.

: I Un rango preferido seria de desde aproximadamente 0.9 a aproximadamente 1.1 gramos de dextran por mi de la ¡solución que va a hilarse. Los expertos en la técnica reconocerán que, debido a la variabilidad de los rangos de peso 'molecular en las preparaciones de dextran, y debido a la inherente variabilidad de lote a lote de las preparaciones comercialícente disponibles que se pretende se encuentren en un rango de peso molecular particular, típicamente es i necesario probar cada lote de dextran con respect'o a sus I propiedades de electrohilado. Tales pruebas se encuentran dentro de la concepción del experto en la técnica y comúnmente implican pruebas de electrohilado de un¡ ^rango de concentraciones de dextran disuelto en un solvente adecuado, a fin de establecer cuál (es) concentración (es) dá;(n) como resultado las características de fibra más deseables, e.g., "salte" desde la aguja, mientras que demasiado dextran da como resultado la producción de gotas secas o que jfalle el hilado. De manera similar, cuando la humedad es demasiado baja, pueden presentarse resultados similares, i¿e., las fibras no se forman y, en algunos casos, no se¡' dirigen eficientemente a tierra. Estas características pueden evaluarse de acuerdo con métodos muy conocidos ara los expertos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, observación visual, prueba de resistencia y flexibilidad de la fibra, observación mediante microscopía de electrón, prueba de solubilidad, resistencia al calor y/ó a la irradiación, color y tendencia a la decoloración, etc. Como lo entenderán los expertos en la técnica, todas talés¡¡ pruebas i pueden llevarse a cabo bajo condiciones variables de calor, i humedad, etc. Las formulaciones también pueden evaluarse utilizando pruebas en animales. : ¦ I1 El área (longitud y anchura) de un dispositivo de la invención, puede variar ampliamente y puede ajustarse ajustando los parámetros de hilado. Además, los tapetes de I 1 l; i ? fibras de dextran pueden cortarse al tamaño deseado después de hilarse. Generalmente, un dispositivo será de aproximadamente 0.5 cm o menos a aproximadamente 30 cm o más de longitud y/o anchura, pero también se contemplan tamaños más grandes o más pequeños. La altura o el grosor de un dispositivo puede variar muy considerablemente de manera similar, e.g., de 0.5 cm o menos (e.g., aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3 o 0.4 cm) hasta cualquier grosor deseado, ¡e.g., de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 cm, o comúnmente menos, e.g., de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 cm o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 cm, o incluso de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 cm, e.g., son comunes los dispositivos con un grosor de aproximadamente 1, j2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 cm. El grosor del dispositivo! (que se relaciona con el volumen) puede tener impacto en lajj tasa de disolución del dextran al contacto con líquidos. Por ejemplo, un dispositivo delgado (e.g., de aproximadamente 2 cm o menos, o de aproximadamente 1 cm o menos, o incluso de aproximadamente 0.5 cm o menos, e.g., de aproximadamente 0.4, 0.3, 0.2 o 0.1 cm) , e.g., una capa delgada, · se disolverá más rápidamente que un dispositivo más grueso, siempre que el depósito de las fibras sea comparable. En la mayoría de las modalidades, la disolución de las fibras de dextran es i! extremadamente rápida, e.g., de aproximadamente 5 minutos o menos después de su exposición al líquido,: o de aproximadamente 4 minutos o menos, o de aproximadamente 3 minutos o menos, o de aproximadamente 2 minutos o menos, o de aproximadamente 1 minutos o menos, e.g., el dispositivo típicamente solo toma algunos segundos para disolverse (e.g., de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 segundos o de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 segundos, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 segundos, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, 15, 10 o 5 segundos o menos para disolverse. Esta rápida disolución puede referirse en la presente como disolución "insta'njtánea" o "inmediata". Puede utilizarse la compresión de un tapete de dextran electrohilado para modular la tasa de disolución, teniendo impacto inversamente en la tasa los mayores niveles de compresión, i.e., generalmente, entre mayor sea jel grado de compresión, es más lenta la tasa de disolución. La rápida tasa de disolución es ventajosa, particularmente cuando se suministran agentes biológicamente activos (e.g.,1 agentes hemostáticos) a un sitio de acción tal como una herida. La rápida disolución de las fibras de dextran de transporte proporciona un suministro extremadamente rápido ¡ de los agentes hemostáticos a la herida al despliegue del dispositivo. ! Los expertos en la técnica reconocerán que existe una multitud de solventes líquidos en los cuales es¡ posible disolver el dextran. Sin embargo, generalmente sé logran resultados superiores para el electrohilado del ¡! dextran cuando el solvente es agua, especialmente desionizada o destilada o desionizada, destilada (ddH20) u otras 'formas de agua relativamente pura. Además, existe un mucho menor impacto ambiental asociado con el uso de agua., , Se ha descubierto que, generalmente, deben evitarse altas concentraciones de sal en el solvente. Aunque lá sal se utiliza frecuentemente para facilitar el hilado de' algunos , i polímeros electrohilados, este no es el caso para el ¡dextran.

La concentración de sales en la solución de hilado debe G mantenerse a un mínimo para formar con éxito fibras de dextran. : lj Los uno o más agentes activos que se encuentran asociados con las fibras de dextran del vendaje pueden ser cualquier agente activo que sea deseable o ventajoso para suministrarse al sitio en donde va a utilizarse o aplicarse I el dispositivo de EDF. En una modalidad de la invención, el dispositivo de EDF es un vendaje y se utiliza para i ! j suministrar agentes benéficos, por ejemplo, a una herida. Tales heridas incluyen heridas y aberturas corporales o en la integridad de tejidos que se presentan como resultado de trauma (e.g., trauma accidental, trauma resultante de conflictos tales como heridas de arma de fuego, cüchillos, etc.), así como heridas incurridas con un propósito, tales como incisiones quirúrgicas, perforaciones corporales, etc.

Comúnmente los agentes son agentes bioactivos que tienen un efecto benéfico o terapéutico en el sitio de la hérida. En una modalidad, el sitio es una herida sangrante en la cual se desea formar un coágulo de sangre a fin de detener p j retardar el sangrado. En esta modalidad, las sustancias terapéuticas de interés pueden incluir, por ejemplo, trdmbina y fibrinógeno, aunque también pueden incluirse otrqsj agentes activos en la promoción de la hemostasis, incluyendo I pero sin limitarse a, capscian. Además, también puede utilizarse I colágeno electrohilado o no electrohilado, agentes que i absorben agua, varias sales secas que tenderían a ¡absorber fluidos al colocarse en contacto, e.g., con sangre fabricada o imitadores de trombina; fibrinógeno agentes que ocasionan vasoespasmos (e.g., ÁDP, 5-hidroxitriptamina, 5-HT y tromboxano (TXA-2) para: láyudar a contraer y sellar el vaso sangrante, etc. Además, pueden I agregarse al vendaje otros componentes de la cascada de coagulación, por ejemplo: factores de tejidos que normalmente se encuentran expresados solo en la superficie de' células dañadas y que inician la cascada - de coagulación ¡; normal; serotonina que mejora la agrupación de plaquetas y Ipromueve la constricción de los vasos; y otros agentes para reemplazar los componentes faltantes de coagulación en la hemofilia, por ejemplo, el activa la llamada cascada externa extrínseca y extractos en crudo de plaquetas. Estos agentes funcionan esencialmente para el "salto de inicio" de la coagulación iniciando la cascada adicionalmente hacia la red de reacción, como se' ilustra en la Figura 10. En la Figura ,10, los diversos factores (y sus nomenclaturas y/o características I y/o actividades, alternativas) son como sigue: ¡ j Factor XII (factor Hageman) : serina pro'tjeasa, la proteína en plasma se enlaza al colágeno; Factor XI (antecedente de tromboplastina en plasma) : serina proteasa, proteína en plasma; Factor IX (Factor de Nochebuena) : serina pr'oteasa; Factor VIII: La glicoproteína se enlaza a vWF, producido por el endotelio y el hígado; Factor VII ( Proconvertin) : serina proteasa, síntesis dependiente de vitamina K en el hígado; Factor X (Factor Stuart-Prowler, Factor de Coagulación X) : serina endopeptidasa, convierte la protrombina en trombina; y i Factor XIII (Enzima estabilizadora de fibrina) : estabiliza el polímero de fibrina, proteína en ¡ plasma, también presente en el linaje de plaquetas y monoci os.

En la Figura 10, se muestran las trayectorias en itálicas denotan la inhibición y el papel central de la : I: trombina en la activación de la coagulación y en la inactivación de los procesos de coagulación, en donde: VI = Cofactor para Xa en la conversión protrombina a trombina; Proteina C activada, una molécula de señal extracelular , inhibe el FV1 (equivalente al FVa, un ¡ cofactor de XA en la conversión de protrombina en trombina) y FVIIIa a través de un evento proteolitico; y \ TAFI = Inhibidor de Fibrinólisis Activáble por Trombina, un inhibidor de la lisis del coágulo.

Además, también pueden incluirse agentes que , l! funcionan para promover las ultimas etapas de cicatrización de heridas, por ejemplo, para facilitar la migración y la remodelación celular. La incorporación de colágén'o es un ejemplo de un agente tal. j Puede utilizarse uno o más de estos agentes en la práctica de la presente invención. Los agentes terapéuticos deben ser dóciles al secado y se encuentran asociados con fibras de dextran electrohiladas en estado seco, da ;dío que el liquido disolverla las fibras. Por ejemplo, los¦, agentes pueden desecarse o liofilizarse, o puede retirarse ¡' el agua mediante algún otro método. Generalmente, la cantidad de agua que se encuentra presente en las sustancias cuando se encuentran asociadas con EDFs es menor que aproximadamente 5% y preferentemente menor que aproximadamente 2¾.; Estas sustancias pueden retener su actividad total o parciajl cuando se rehidratan, e.g., en sangre. Generalmente, las sustancias asociadas con los dispositivos de la invención retienen, al contacto con líquidos, al menos aproximadamente! 25%, o aproximadamente 50% o incluso aproximadamente de 75 a 100% de su actividad antes de secarse o desecarse, en comparación con I las preparaciones estándar de la sustancia utilizando i análisis estándar conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, la trombina |! o el fibrinógeno, o ambos, se encuentran asociados con el vendaj e .

En algunas modalidades, la trombina y el fibrinógeno son trombina y fibrinógeno de salmón. Las ventajas dé !utilizar salmón como fuente de estos materiales incluyen, pero no se limitan a, la falta de preocupación acerca de la transmisión de agentes etiológicos (e.g., virus) que puede presentarse cuando se utiliza una fuente humana y otras de mamíferos de trombina o fibrinógeno (e.g., bovinas). Como se demuestra en la sección ' de Ejemplos mas adelante, la trombina y el i fibrinógeno de salmón son altamente eficaces y no tienen efectos secundarios nocivos, cuando se utilizan en el modelo j de cerdo, el cual es un modelo animal 'reconocido, que se considera indicativo de los resultados en humanos. La cantidad del fibrinógeno en partículas agregado alj' vendaje generalmente se encuentra en el rango de1 desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 gramos por ^vendaje, y comúnmente desde aproximadamente 1.5 hasta aproximadamente 2 gramos por vendaje. Para trombina, la cantidad puede ser de desde aproximadamente 100 a 10,000 unidades por vendaje y típicamente es de aproximadamente 4000 a 6000 uníd des por vendaje.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos i pueden electrohilarse en sí, ya sea con el dextran , (i.e., se disuelven y se hilan a partir de la misma solución que el dextran) o .por separado (se disuelven y se hilan a partir de una solución separada que no incluye dextran) . En1 algunas i modalidades, los agentes pueden electrohilarse en' fibras, como es el caso para el dextran. En otras modalid .a¡ides, los agentes activos pueden electrohilarse en otras formas tales ' [I como gotas, perlas, etc. En algunas aplicaciones, los agentes activos tales como trombina pueden electrorrociarse con sucrosa para formar gotas de azúcar, las cuales ' trienden a estabilizar la trombina y también pueden "atrapar" otras sustancias de interés para su suministro al vendaje, j En particular, para la trombina y el fibrinógeno, en la mayoría de las modalidades, estos (u otros) agentes se encuentran asociados con o agregados a las fibras de dextran electrohiladas en una forma seca, particulada o ¡granular finamente dispersada, e.g. , un polvo o tierra fina, jdado que el electrohilado puede tender a disminuir su actividad. En otras palabras, los agentes no se electrohilan por si mismos ' ij o con el dextran. La provisión de las sustancias en ¡forma de un polvo fino proporciona una gran área de superficie de contacto para su' disolución cuando los materiales entran en i contacto con fluidos. Generalmente, tales partículas tendrán diámetros promedio en el rango de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10,000 mieras y, comúnmente, de i aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 mieras., Tales partículas sólidas secas pueden formarse mediante cualquiera de varios medios, incluyendo pero sin limitarse a, trituración, pulverización, molido, etc. Sin embJrgo, los expertos en la técnica reconocerán que también pueden incluirse en el vendaje otras formas de estos agentes, e.g., hojuelas, láminas, cuerdas, etc. Además, en ¡ algunas modalidades, la trombina y el fibrinógeno se encüejhtran en forma de gotas cuando se asocian con las EDFs .

La asociación de las sustancias de interés' con las i EDFs puede lograrse mediante cualquiera de muchas1 jjtécnicas adecuadas que se conocen por los expertos en la tjécnica y dependerán, en parte, de la forma precisa de la y del medio disponible. Por ejemplo, para tíqmbina y fibrinógeno particulados en polvo, la asociación puede llevarse a cabo mediante aspersión, agitación, soplado, etc., de los agentes sobre una capa de EDFs. Dependiendo de la densidad del tapete de fibra, las sustancias de j interés pueden dispersarse de forma relativamente uniforme través de todo el tapete tejido de fibras o pueden confinarse en gran medida a la sección más superior del tapete de fibra, Si no se encuentra presente ningún refuerzo, es preferible la última modalidad para evitar que la sustancia particulada de interés caiga a través y fuera del tapete. La densidad del tapete fibroso puede ajustarse (e.g., incrementarse), por ejemplo, ajustando su grosor y/o comprimiendo el tapete bajo presión de manera que las fibras se junten entre si. i También existen otras técnicas de asociación, e.g., la colocación de capas o cintas secas pero solubles en líquidos del j material i sobre o entre las capas de dextran electrohilado, el electrohilado de los materiales agregados como lina capa I discreta o en capas discretas, etc., y cualquiera |de tales técnicas puede emplearse. Las técnicas para ensamblar los dispositivos de la invención pueden llevarse j a cabo manualmente o pueden mecanizarse, o puede utilizarse una combinación de manipulación manual y mecanización.1 J Para la trombina en particular, 5000 unidades de trombina es un volumen de polvos muy pequeño. En consecuencia! pueden agregarse vehículos inertes o agentes de volumen tales como dextrosa para asegurar una dispersión más completa' de los agentes activos en el vendaje.

La asociación de las sustancias de interésji con las EDFs puede llevarse a cabo de acuerdo con! muchas disposiciones diferentes. Por ejemplo, puede formarse una primera capa de EDFs y una o más de las sustanciks puede asociarse con la primera capa. Después, puede formarse otra ¡' I ! i! segunda capa de EDFs en la parte superior 'de la(s) i I sustancia (s) de ínteres, y la misma u otras sustancias de interés pueden asociarse con la segunda capá , y asi sucesivamente. Puede agregarse una capa final o más externa de EDFs para evitar el desalojo de las sustancias del interés de la(s) capa(s) inferior (es) . El número de capas de EDFs que se utilizan en un ' dispositivo de la invención puede variar ampliamente, de tan pocas como 1 a 2 hasta tantas como i varias docenas, o incluso varios cientos, dependiendo de las características del dispositivo deseadas. Típicamente, un dispositivo contendrá de aproximadamente 1 a 2 ¡y hasta aproximadamente 5 a 10 capas. La muy ligera cantidad de humedad que se encuentra presente en un vendaje preparado puede ayudar a atrapar y retener las partículas dé material en la superficie del vendaje. ¡ En algunas modalidades de la invención, los dispositivos de EDF también incluyen una o más estructuras de . i soporte o materiales de soporte incorporados en lo,si mismos. Por ejemplo, puede incorporarse en el dispositivo un refuerzo. El material de soporte puede formarse de varios materiales electrohilados tales como ácido poliglicólico (PGA), ácido poliláctico (PLA) y sus copolímeros j(PLGAs); nylon cargado, etc. En una modalidad, el material de: soporte es fibras de dextran electrohiladas comprimidas. Por "EDFs comprimidas" se entiende que las EDFs se encuentran comprimidas entre si bajo presión. La compresión de las EDFs se lleva a cabo, por ejemplo, bajo presión entre dós placas (e.g., un tornillo de banco) y puede comprimir un tapete de fibras con una altura (grosor) de aproximadamente 3 |i pulgadas I con una capa con una altura de aproximadamente 0.5 pulgadas o incluso menor (e.g., aproximadamente de 0.1 a aproximadamente 0.4 pulgadas) . En algunas modalidades, las EDFs se electrohilan directamente sobre un material dé 1 soporte previamente electrohilado mientras que, en otras modalidades, el material de soporte y las EDFs se encuentran ; asociados después de electrohilar cada uno, e.g., uniendo una o más capas de cada uno. ¡ En otras modalidades, el material de soporte no es un material electrohilado, pero es algún otro material (comúnmente de peso ligero) sobre el cual pueden formarse o con el cual pueden asociarse las EDFs des 'pui'és del electrohilado. Ejemplos de tales materiales incluyen, pero no se limitan a, gasa; diversos plásticos; hidrogelesi' y otros i materiales absorbentes que pueden facilitar la abso ción de la sangre y, en consecuencia, la formación del coágulo; etc.

El material de soporte puede o no ser soluble en líquidos o puede .ser lentamente soluble en líquidos,: y puede o no ser permeable a líquidos. Los materiales lentamente ; i1 solubles incluyen aquellos de los cuales se forman las puntadas o suturas absorbibles o disolubles (biodegradables ) , ! incluyendo PGA, polímeros polilácticos y de caprdlactona . Tales materiales de soporte típicamente se disuelven dentro de aproximadamente 10 días a 8 semanas, dependiendo del material que se utiliza y proporcionan la ventaja, en algunos casos, dé no tener que retirar el vendaje a riesgo de romper el coágulo. Sin embargo, en cualquier caso, el material de soporte- no debe interferir con la disolución inmediata de las EDFs y el suministro de los agentes activos asociados con las mismas en el líquido que disuelve las EDFs. Por tanto, el material de soporte puede encontrarse solamente en |' un lado del dispositivo de EDF, de manera que cuando el dispositivo es, por ejemplo, un vendaje, y se aplica a una he!rida, el vendaje se encuentre orientado a fin de que las ¡ EDFs se encuentren en contacto directo con la sangre en el llecho de i1 la herida y el material de soporte no, i.e., el material de soporte es la "parte superior" o superficie más externa del ; ¡i vendaje cuando se coloca sobre la herida. Esta modalidad se ilustra, por ejemplo, en la Figura 4A, en la cual las EDFs 10 se muestran depositadas sobre el material de soporte no poroso impermeable a líquidos 20. Cuando se aplican a una herida, las EDFs 10 se encuentran orientadas hacia jábajo en la herida, y el material de soporte no poroso 20 se encuentra orientado alejado de la herida. Esta disposición podría proporcionar la ventaja de que podría aplicarse presión a la herida a través del material de soporte, para facilitar la detención del sangrado. Alternativamente, el material de soporte puede contener poros, aberturas o separaciones para permitir que el liquido tenga acceso a las ' EDFs del dispositivo incluso encuentra presente. puede ser una red o lentamente soluble) pero que permita que el liquido acceda libremente a las EDFs y a las sustancias asociadas de interés. Esta modalidad se ilustra esquemáticamente en la El experto en la técnica será capaz de contemplar muchas otras combinaciones materiales de soporte que escenarios particulares . encontrarse envueltas o enrolladas alrededor de un(| soporte alargado tal como un filamento o cuerda, o envueltas alrededor de una forma particular con la configuración de una ' i: cavidad en la cual posiblemente se coloca el dispositivo, tal como un orificio de bala, etc. Lo crucial del probléma en el ; i sitio de una lesión de penetración es que el te ido : lesionado se encuentra relativamente inaccesible. Por ejemplo, para una herida de bala (e.g., en la pierna o el tobillo) el sangrado no se presente tanto en la superficie sino más profundo dentro del tejido, dentro de una cavidad formada por la bala, en donde éste no puede tratarse fácilmente por medio de un vendaje que simplemente se extiende sobre él sitio externo de la lesión (e.g., el punto de entrada de |la bala, cuchillo, metralla, espada, bayoneta, etc. u otra' ¡causa de lesión) . Este aspecto de la invención resuelve los problemas asociados con lesiones de penetración, que pueden ocasionar i un extenso sangrado en tejidos profundos, y toma ventaja de la naturaleza altamente soluble del vendaje de dextran. Un factor de complicación en este tipo de lesión concíe;rne a la capacidad' de suministrar materiales hemostáticos: !:que son altamente solubles a tal sitio. Puede existir sangrado y otros fluidos evidentes en la entrada del sitio de la herida y la aplicación de un vendaje a este sitio superficial puede dar como resultado la completa disolución del vendaje en la li superficie sin suministro de los materiales activos' hacia la fuente subyacente del sangrado dentro de la cavidad de la herida. La invención contempla esta ocurrencia proporcionando el suministro de los agentes activos profundamente en la herida. Los vendajes de la técnica cigarrillo" comprend do de extran a o como se describe en la presente, y que también contiene trombina y fibrihógeno en partículas o ambos, y que puede contener un material de soporte. El dispositivo se almacena dentro de una ¡cubierta protectora o empaque o tubo. El tubo protege el vendaje (dispositivo) del entorno ambiental. Tanto el vendaje como el tubo son preferentemente estériles y pueden encontrarse, por ejemplo, encerrados además en una envoltura ¡externa, e.g., de papel, polímero, empaque de cavidades, s'imilar al utilizado para jeringas desechables, para evitar la; pérdida i de esterilidad. Cuando se utiliza, la envoltura externa se abre y. se tiene acceso al tubo estéril que contiene el vendaje. En algunas modalidades, un extremo del jjtubo se retira y se coloca sobre la porción accesible más externa de i la lesión. El tubo también puede comprender un "émbolo" o un medio similar que permite que el usuario expela e vendaje del tubo hacia la herida, "inyectando" de hecho el vendaje en la herida. Pueden emplearse medios tales como los utilizados para el suministro vaginal, por ejemplo, de tamponés (i.e., un "cilindro dentro de un cilindro") , o pueden utilizarse |i medios de suministro similares a una jeringa. El dispositivo puede, por tanto, introducirse profundamente en el ¡tejido a lo largo de la trayectoria de s la herida y los : agentes terapéuticos en el dispositivo se suministran a donde son más necesarios, i.e., al interior de la herida. En otras modalidades, no se incluye un émbolo per se, pero el tubo se encuentra diseñado de manera que ambos extremos puedan ?' abrirse, y el dispositivo de dextran hilado puede empujarse hacia la herida desde un extremo abierto ejerciendo, presión en el extremo abierto opuesto del tubo utilizando cualquier objeto que se ajuste al menos parcialmente dentro el ' tubo, de manera suficiente para impulsar el dispositivo fuera del tubo y hacia la herida, e.g., un dedo, vara, etc. Tal objeto puede encontrarse incluido con el dispositivo 1 de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán que, debido a la relativamente alta maleabilidad delji dextran hilado, esta modalidad del dispositivo puede, incluir un material de soporte alrededor o dentro del dextran hilado (e.g., una red biológicamente compatible, una barr¡a, etc., que se desintegrará mediante biodegradación) a fin ¡de hacer el dispositivo más fuerte y menos flexible a medida que se introduce en la herida. Además, el extremo más externo del dispositivo, ese extremo sobre el cual se ejerce¡! presión (e.g., con un émbolo) a fin de expeler el dispositivo del tubo hacia la herida, puede reforzarse con un material de soporte de manera que el émbolo u otro objeto utilizado para impulsar el dispositivo pueda suministrar unaj fuerza suficiente para retirar el dispositivo del tubo. ! j i Una representación esquemática ejemplar 'de esta modalidad de la invención se proporciona en la Figura 4D, en donde el dispositivo 100, comprendido de fibras de; dextran hiladas 110 y (opcional) y material de soporte 12Gj, y que tiene un primer extremo 130 y un segundo extremo ¡ 140, se ilustra encerrado dentro del tubo 200. El dispositivo 100 se encuentra encerrado dentro del tubo 200, pero no se muestra i en fantasma por motivos de claridad. El tubo 200 tiene aberturas 210 y 220, ambas de las cuales pueden en !cÍontrarse i tapadas previo a su uso (tapas no mostradas) o pueden dejarse abiertas, especialmente si el aparato completo se encuentra empacado en un empaque estéril 400. El empaque estéril 400 se retira o se abre para proporcionar el acceso alj! aparato previo a su uso. a fin de utilizar el aparato, las alberturas 210 y 220 del tubo deben encontrarse abiertas.! Para suministrar el dispositivo 10 a una herida penetrante, un objeto tal como un émbolo 300 se inserta en el extremo 210 del tubo. se ejerce presión en el dispositivo 100 ¡a medida que el émbolo 300 hace contacto con el extremo del dispositivo 130, y el dispositivo 100 se impulsa hacía afuera del tubo 200 en consecuencia a través de la abertura 220 (en la dirección indicada por las flechas) y hacia la herida penetrante (no mostrada) . Una segunda representación esquemática de tal dispositivo se proporciona en la Figura ¦ G 4E. En esta representación, el material de soporte no se encuentra incluido y el material de vendaje seco,, ¡ estéril (e.g., fibras de dextran) con agentes terapéuticos asociados encuentra ubicado o colocado dentro de un pequeño cilindro sellado con una tapa en un extremo y un émbolo en ;el otro. Al desplegarse, la tapa se desecha, el extremo abierto del ? cilindro se coloca sobre la boca de la herida1 |¡y puede insertarse en la herida, y el émbolo se oprime, desplazando o inyectando el material de vendaje profundamente en la herida. Pueden utilizarse diseños similares para suministrar el dispositivo de la invención a orificios o canales t les como los pasajes nasales, el canal del oído, la vagina, el ano, en i vasos sanguíneos, etc. Las fibras de dextran que se ¡utilizan en tal aplicación se formarán en un dispositivo! que se encuentra en el orden de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 pulgadas de longitud y de aproximadamente ¾ de pulgada a 1 pulgada de diámetro, i.e., las dimensiones serán adecuadas para su inserción a través de la abertura externa y profundamente dentro de un orificio o una cavidad de herida.

Todas tales disposiciones, formas y modalidades de capas de EDF y materiales de soporte como se describen en la presente, pretenden encontrarse abarcadas por la invención.

Los dispositivos de la invención j pueden ' I! esterilizarse previo a su uso, generalmente utilizando radiación electromagnética, por ejemplo, rayos X, rayos gamma, luz ultravioleta, etc. Si se incluye tromb na en el I dispositivo, el contenido de humedad del dispositivo (e.g., un vendaj e) debe reducirse a 5% o menos, a fin de preservar la actividad de la trombina durante la esterilización. Esto puede lograrse secando el vendaje fabricado, e.g., 'bajo un Cualquier método que no destruya las fibras de dextiran o la actividad de las sustancias asociadas con las fibras, puede utilizarse para esterilizar los di Cuando el dispositivo vendaje, las sustancias de interés que se encuentran asociadas con las fibras del vendaje pueden incluir 'trombina y fibrinógeno, y el vendaje puede utilizarse para detener el i !: sangrado. Sin embargo, el rango de los ingredientes! activos puede variar con la aplicación específica del vendaj:e. Por ejemplo, pueden utilizarse vendajes comprendidos solamente de dextran o solamente de trombina para lesiones pequeñas o en combinación con otras intervenciones. Además, también otras sustancias terapéuticamente benéficas pueden encontrarse asociadas con el vendaje, incluyendo, pero sin limitarse a: antibióticos, medicamentos que alivian el dolor, factores de I crecimiento, materiales vasoactivos (e.g., sustancias que ocasionan vasoespasmos), esteroides para redúcir la inflamación, etc. En otras modalidades, los dispositivos de la invención no necesitan comprender agentes que promuevan la coagulación. Los expertos /en la técnica reconocerán1 que los dispositivos de la invención son altamente adecuados para ! suministrar muchas sustancias de interés a un ambiente o i ubicación liquida deseada. Por ejemplo, los dispositivos pueden encontrarse diseñados para el suministró de las sustancias terapéuticas o benéficas a cualquie ambiente húmedo del cuerpo, en donde exista suficiente liquido para disolver las EDFs y liberar la sustancia activa, y jen donde I el dextran disuelto no sea problemático. Los ¡ejemplos r incluyen, pero no se limitan a, el suministro orajl nasal, traqueal, anal, pulmonar y vaginal de sustancias tales como agentes antimicrobianos, agentes es nutritivos, etc. Las aplicaciones el suministro de sustancias útiles para tratamientos dentales, e.g., antibióticos, medicaciones para el dolor, !, agentes blanqueadores, etc. Además, los dispositivos de la invención I-pueden ingerirse para proporcionar una rápida liberación hacia el tracto gastrointestinal de sustancias tales como suplementos nutritivos (vitaminas, aminoácidos, azúcares, etc.)- En el sitio de suministro, comúnmente un fluido corporal se encuentra o se encontrará presente, y lÍs fibras : i de dextran se disuelven en el fluido, liberando o suministrando asi los agentes activos asociados de iríterés al I sitio. Tales fluidos corporales incluyen fluido^ que se excretan o se secretan desde el cuerpo asi como fluidos que normalmente no, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, sangre, sudor, lágrimas, moco (incluyendo drenajej nasal y flemas) , fluido pleural, pus u otro exudado de la|' herida, saliva, secreciones vaginales, y lo similar. Sin emtjargo, en algunas modalidades, no se encuentra presente ningún fluido corporal (o si se presenta un fluido corporal insuficiente) y el dispositivo aplicado puede "activarse" humedeciéndolo, e.g., por rocío, o de otra manera aplicando una fuente de humedad (e.g., exponiendo el dispositivo a un material húmedo tal como una esponja) o colocando los dispositivo;s en un liquido (e.g., un cuerpo de agua), a fin de ocasionar la liberación de los agentes de interés asociados con las fibras de dextran. Esta modalidad de la invención puede ser especialmente útil, por ejemplo, para la liberación de materiales en el sitio de interés, cuando se desea1! que se presente la activación a su exposición a líquidc-s. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: suministrar nutrientes, fertilizantes, insecticidas, etc., a pjlantas o pasto utilizando capas de fibras de dextran; la aplicación de cosméticos, etc. Los agentes de interés pueden ser materiales relativamente inocuos (benignos) para íos cuales se desea un mantenimiento o almacenamiento en estado seco hasta su uso; o pueden ser materiales peligrosos J tóxicos interés que pueda secarse suficientemente de manera que no disuelva las EDFs prematuramente (antes de su colocación en una ubicación de interés) y que retenga la actividad al rehidratarse cuando se suministra a una ubicación de interés, puede suministrarse mediante los métodos y dispositivos de la presen <t.e i¦nvención. ' I!1 i Debido a las características de huella pequeña y peso ligero de los dispositivos de la invención, ' ;éj!sitos son ideales para situaciones en donde es apremiante el espacio y el peso de suministros. Ejemplos de tales situaciones incluyen, pero no se limitan a: operaciones militares, en donde el peso y el tamaño de los componentesj; de los utensilios de un soldado son un problema; para cui'dados de emergencia durante un viaje (e.g., durante un vuelo espacial, un campamento, etc.); etc. Sin embargo, no es necesario que este sea siempre el caso. Los dispositivos pueden utilizarse i en una variedad de situaciones y para una variedad de propósitos en los cuales el espacio y el peso' no son i j consideraciones. Por ejemplo, los vendajes de la invención proporcionan un medio conveniente para administrar trombina y fibrinógeno a heridas quirúrgicas en una sala de operaciones I convencional. Los dispositivos de la invención| también pueden utilizarse ventajosamente cuando se desea empacar y ¡i eventualmente liberar una o más sustancias secas, pero en I donde es improbable o indeseable manejar las sustancias secas directamente, e.g., cuando la cantidad pequeña o la sustancia es tóxica. En dispositivos de EDF de la invención pueden servir 'como una "plataforma" o vehículo para contener, almacenar y/o transportar la(s) sustancia (s) hasta su uso, i. el , hasta ponerla (s) en contacto con un líquido que disuelve las EDFs, ; i: liberando de manera concomitante las sustancias'! en el líquido. Tales sustancias pueden incluir, por! j ejemplo, enzimas o sus precursores (e.g., proenzimas o zymógenos) y sus sustratos, sustancias que activan una protei .na i l¡1o enzima (e.g., proteasas, cofactores, etc.) y lo similar. ¡ í EJEMPLOS ' ¡; EJEMPLO 1. Fabricación de vendajes j Aproximadamente 5 g de dextran (100,000 a; 200,000 Mr) se utilizaron para producir un vendaje que tiene' un peso total de aproximadamente 7 g después de la adición de 2 g de fibrinógeno en partículas. Se suspendieron aproximadamente 5 í g de dextran en 'agua destilada a una concentración de 1.0 g/ml. Esta solución se incubó durante la noche en un equipo giratorio cilindrico para girar a 1-5 rotaciones por minuto. Estas condiciones se utilizaron para asegurar que el dextran se encontrara completamente en solución. La solución de dextran se cargó en una jeringa tapada con una aguja de punta roma y se utilizaron aproximadamente 5 mi por venda!je en el proceso de fabricación. Para el electrohilado, la jeringa se instaló en un conductor de jeringa calibrado para suministrar de 3 a 5 ml/hora al campo eléctrico. El conductor de jeringa se utiliza para medir el suministro del material, 'al campo i' eléctrico y esta instalación no necesariamente refleja con precisión la tasa de fabricación a medida que : él campo eléctrico extrae el dextrano de la jeringa. \ El fibrinógeno de salmón se suministró por Sea Run Holdings (Evelyn Sawyer, Freeport ME) y se utilizarojn de 1.5 a 2.0 g del fibrinógeno por vendaje. La trombina de salmón se suministró por Sea Run Holdings (Evelyn Sawyer, ¡¡Freeport ME) y se utilizaron 4500 unidades de la actividad de 'trombina por vendaje. El fibrinógeno de salmón se suministró;1 por Sea ' Run Holdings como un polvo seco. El material en bruto se retiró y se procesó en un polvo muy fino con un mortero y mano.

Se utilizaron aproximadamente de 1.5 a 2¡i0 g del I fibrinógeno por vendaje. La trombina de salmón se proporcionó por Sea Run Holdings en un estado físico similar (un polvo seco) . La trombina se agregó al fibrinógeno y se proceso en un polvo fino. La mezcla bien mezclada de fibrinógeno seco y trombina seca se colocó en un agitador de sal u otro dispositivo de cernido. ¡i Para el electrohilado, se utilizaron dos i' suministros de energía de alto voltaje separados para procesar el dextran en una matriz fibrosa. El polo ! positivo de una fuente de energía se unió al depósito dej jeringa conteniendo el dextran utilizando una pinza de palanca. El polo negativo de la segunda fuente de energía se i unió al objetivo puesto a tierra. Típicamente, se utiliza como objetivo una lámina plana de acero de aproximadamente 5 5 pulgadas. fibras de el papel se retiró electrohilado reconocerá que es posible cambiar la pplaridad de los suministros de energía. i¡' Para el electrohilado, los suministros de^ energía se ajustaron a aproximadamente +20-25 kV ( kilovoltios ) en la jeringa conteniendo la solución de dextran1! y a aproximadamente -20-25 kV en el objetivo puesto a tierra. El electrohilado se condujo a través de una separación*, de aire que puede variar de 12 pulgadas a 24 pulgadas y el conductor dextran se suministró al objetivo en donde se recolectó como un pequeño disco de material aplanado. El campo eléctrico finalizó en el objetivo puesto a tierra y un alícuota de ' i fibrinógeno y trombina se agitó sobre las fibras de¡ dextran en formación.

Se reinició el electrohilado hasta que la zcla de fibrinógeno/trombina se cubrió con fibras de dextraa nuevas.

El proceso se repitió hasta completar el vendaje. El I suministro de pequeños volúmenes/cantidades de fibrinógeno en frecuentes alícuotas pequeños de material se utilizó para distribuir los ingredientes activos a través de, j todo el vendaje. También es posible formar capas de fibr 1iIn'ógeno y trombina en el vendaje en formación por separado fin de separar los componentes activos por una capa de dextran. El 1 producto final se observa y se siente muy similar a una bola de algodón.

I EJEMPLO 2: Adaptación a escala del Electrohilado para i Fabricación ! El electrohilado es un método para producir una matriz fibrosa compuesta de fibras de pequeño dijámetro a escala de nano a mieras. Este proceso puede ada'ptarse a escala para la fabricación por medio de al menos tres métodos j diferentes: Chorros Múltiples. El uso de chorros ', múltiples representa una solución simple para la adaptación \a escala del proceso de fabricación. Como se representa en la Figura i 1, es posible utilizar chorros múltiples para incrementar el rendimiento del electrohilado. Este puede realiz rse con dextran, sin embargo, el nivel de humedad del ambiente del proceso debe controlarse, el exceso de humedad limita el volumen de material que puede recolectarse y pequeñas gotas de sobreaspersion pueden ocasionar que disuelva. El nivel de humedad debe controlarse para ser de aproximadamente 30% a aproximadamente 40% y típicamente de al menos aproximadamente 20%. En una modalidad, se .disponen chorros múltiples arriba de una banda transportadora. Cada chorro suministra una cantidad establecida de , el proceso se detiene, la banda puede moverse hacia para permitir la adición de una dosis, e.g., de fibrinógeno y/o trombina a cada pila de dextran, la banda se se reinicia el electrohilado.

Electroaerosol . El dextran puede ¡electro-aerosolizarse bajo presión desde un aspersor de pintura y/o un pulverizador de aire comprimido. Se suministran dextran y aire bajo presión al pulverizador de aire comprimido!. En la porción terminal del pulverizador de aire comprimido, la material muy rápidamente. Si se utiliza una corriente de aire a temperatura ambiente en el proceso, la p nta del chorro de electrohilado puede secarse y tapar el dispositivo de rociado. Esto puede manejarse controlando el contenido de humedad en el gas utilizado para conducir el aerosol,, No es ¦ I1 absolutamente necesario un campo eléctrico para formar fibras I cuando se utiliza este método para procesar el dextran. Las fibras se formarán en el chorro en aerosol y el chorro parece recolectar las capas de dextran fibroso. Al cargar la solución y la banda, el dextran puede dirigirse efectivamente \ |j al sitio de recolección deseado. El objetivo puesto ¡a tierra puede colocarse, por ejemplo, detrás o debajo de jla banda transportadora. La tierra no tiene que encontrarse en contacto directo con el dextran. También podrían emplearse chorros múltiples en este procedimiento. Al operar múltiples chorros de aerosol sobre una banda transportadora en movimiento que se encuentra intercalada con "tamices" (para suministrar el fibrinógeno y la trombina) , los materiales en polvo podrían agregarse secuencialmente en capas discretas al vendaje en formación. ¡ Procesamiento Electrostático. La fabricación de dextran en fibras puede llevarse a cabo utilizando una "máquina de algodón de azúcar". Una máquina de algodón de azúcar representa una cruza entre un dispositivo de electrohilado real y un dispositivo tipo aerosol. El contenido de humedad en las fibras en formación puede controlarse controlando la temperatura de entrad^ (y el volumen) del aire suministrado a la cámara de fabricación donde se forman las fibras. Una ventaja adicional es que j pueden procesarse azúcares simples en fibras utilizando este I' tipo de instrumento. ! iI¡ EJEMPLO 3. Dextran Electrohilado para su uso como Refuerzo : Se utilizan PGA y PLA (2 polímeros sintéticos biocompatibles) para proporcionar resistencia al material de i refuerzo. Se agrega fibrinógeno a la mezcla de PGA/PLA y claramente representa un elemento de proteína jl de la composición. Se prepara una mezcla de 90:10 de hexafluoroisopropanol (HFP) se agrega al solvente acuoso (agua, medio de cultivo, PBS, etc.) saturado con solución de cloruro de calcio (el calcio ayuda a promover la cascada de j coagulación, u otra sal) . Los polímeros PGA/PLA y el fibrinógeno se agregan a esta solución y se dejan convertir i en solución. Las condiciones típicas son 100 mg de! la mezcla de PGA/PLA (variando en una relación de 99:1.0 de PGA/PLA a 1.0:99 de PGA/PLA), de 10 a 50 mg de fibrinógeno por mi de solución de electrohilado . Luna vez en solución, la i composición se electrohila para formar un tapete del material. Los polímeros sintéticos proporcionan resistencia; el componente de fibrinógeno proporciona sitios reticulables para que los ingredientes activos interactúen durante la formación del coágulo. Idealmente, el coágulo se formará en el sitio de la lesión a medida que los ingredientes activos se liberan del vendaje, el coágulo se adherirá al lécho de la I herida, al tejido circundante y al refuerzo del vendaje. El refuerzo proporciona el soporte estructural necesario para estabilizar el lecho de la herida. El refuerzo y los remanentes del vendaje y el coágulo pueden retirarse i quirúrgicamente una vez que el paciente se encuentrá estable y/o se le transporta.

EJEMPLO 4. Determinación de la respuesta 'ijhmune e inflamatoria a la trombina y el fibrinógeno de salmón.

El propósito de los experimentos llevados cabo en este Ejemplo fue determinar si la trombina y el fibrinógeno de salmón ocasionarían una respuesta inmune e inflamatoria adversa y examinar la base celular para esa réspuesta. i Evaluamos la producción de anticuerpos para los componentes de salmón y determinamos si la actividad de coagulación del 1 'I cerdo se alteró. Examinamos la histopatologia para caracterizar la respuesta en tejido a los apositos de salmón en cerdos después de una cirugía de excisión cutánea ¡'que creó heridas con bordes separados y encontramos una resp'uesta de linfocitos que incluyó proliferación celular y sec'rjeción de citosina. Sin embargo, la cicatrización se ¡presentó I' normalmente y no hubo signos de reacciones inmuriplógicas adversas a los apositos en el sitio de herida. i MÉTODOS ! ¡, Ü Purificación de fibrinógeno y trombina de salmón Las proteínas de salmón se purificaron a partir de sangre de salmón como se describió previamente. [13] Brevemente, -se extrajo sangre de salmón de un salmón de -2 a 5 kg y se centrifugó para obtener el plasma. El plasma se convirtió en 10 mM con benzamidina, 2 g/dl de CaP04 y 3 g/dl de ácido epsilon-aminocaproico . El plasma se pasó sobre una columna de gelatina-sefarosa para retirar la fibrohectina .

El fibrinógeno se precipitó en sal dos veces con sulfato de i i! amonio en un método modificado de Mosher y Blout (Mosher DF, Blout ER, J. Biol. Chem., 1972 Octubre 10; 248 (19):6896-903) . La trombina de salmón se purificó a partir dei gránulo I de CaP04 mediante el método de Michaud et al., (Midhaud SE, ang LZ, Korde N, Bucki R, Randhawa PK, Pastore JJ,|, et al., Thromb. Res. 2002 Septiembre 1; 107 ( 5 ): 245-54 ) . El gránulo se dializó durante 5 horas contra 20 mM de Tris/HCl, pH 7.5, 0.15 M de NaCl, 1 mM de EGTA y 0.1 M de EDTA yj después durante la noche contra el mismo amortiguador sin EDTA. La solución se centrifugó a 12, 000 x g para retí|rar las partículas contaminantes. Se utilizó el fibrinógeno a una i concentración de 19.4 mg/cm2 (2000 mg en total) y sé utilizó la trombina a una concentración de 50 U/cm (5200 U en ' i total) . , ; Electroforesis, Inmunoanálisis Western y ELISA La reactividad inmunológica se determinó ¡mediante inmunoanálisis Western y ELISA. Para la electroforesis, las proteínas se disolvieron 4 x en amortiguador ¡ muestra (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) , se calentaron a 801;°C y se I : |l separaron durante 45 minutos a 200 V en geles Irívitrogen NuPAGE 4-12%, Tris-Bis. Las proteínas se transfirieron de Los ELISAs se llevaron a cabo con trómbina y fibrinógeno como el sustrato. Se recubrieron placas Bl Immunolon con 1 ug de protema/pozo, los pozos se bloquearon y después se incubaron con suero porcino a una dilución de 1/10. Las curvas de titulación se llevaron a ¡cabo en diluciones de hasta 1/5000. El enlace del anticuerpo a las I1 proteínas de salmón se cuantifico mediante incubación con peroxidasa horse radish (HRP)-swAB y sustrato Millippre y se leyó a una OD45o con un lector de placa Molecular Devijses. i Los niveles de citosma para IL1, IL2, IL4, IL8, IL10, IL12 p40, IFNy y TNFa se analizaron por un; |servicio I' comercial, Searchlight Cytokine Custom Multiplex '· Arrays, (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) . La disposición de proteína humana Protoarray, una disposición de proteínas de Invitrogen Corp., se analizó para visualizar el. de ' i' cinco animales por la presencia de anticuerpos anti-humano generados después de la exposición del cerdo a las proteínas de salmón. Este análisis detecta las proteínas que reconocen anticuerpos que no se encuentran incluidas en la trayectoria normal de coagulación y, en consecuencia pueden no detectarse mediante nuestros análisis estándar. El suero de la sangre tomada al momento de la cirugía para implantar los puertos de acceso vascular (VAP) se comparó con el suero tomado en la eutanización de los animales después de su exposición a proteínas de salmón. | Preparación quirúrgica de los animales Se prepararon cerdos Yorkshire hembra (Sus scrofa Domestica/ (25-28 kg) para la cirugía y se monitorearon durante el procedimiento como se describió previamente . Se insertó una vía de catéter de puerto de acceso vascular (VAP) (Access Technologies, Skokie, IL) en la vena ' yugular I utilizando una técnica Seldinger modificada (Knebel P..

Frohlich B, Knaebel HP, Kienle P, Luntz S, Buchle 1rP MW, et al., Triáis, 2006:7:20) para permitir el muestre© de la sangre. Se insertó una aguja de introducción- e 2.5 a 3" . í; calibre 16-18 en la vena de manera percutánea, seguida por un cable j . Se alimentó un catéter de expansión sobre Jel cable j a través de la piel y en la yugular. El catéter de expansión se retiró permaneciendo el cable j en la vena j¡ yugular y se alimentó un catéter venoso central sobre el j! cable j en la vena yugular. El catéter se aseguró a los tejidos subcutáneos en un patrón simple interrumpido con 3-0 : l¡ PDS y el catéter se lavo con una solución anticoagulante de citrato para verificar su colocación en la vena y P^ra crear un cierre de citrato. El catéter se unió entonces al puerto, que se hundió en una cavidad subcutánea en el hombro.j! I La exposición a la proteina de salmón se, jlogró de varias maneras. En el primer procedimiento, se inyectaron la i trombina y el fibrinógeno de manera intravenosa a ;través de los puertos de acceso vascular. En el segundo método, se crearon quirúrgicamente heridas dérmicas en pares i'dénticos de grosor total en la superficie de la piel dorsal derecha e lj vendó con un aposito compuesto del fibrinógeno liojfilizado i producido mediante el electrohilado de la proteína sobre un mandril giratorio (Nanomatrix, Inc., Baton Rouge, LÁ) . Los apositos se aplicaron a una lesión dérmica de grosor jtotal de aproximadamente 2 x 2 cm. La lesión dorsal izquierda se cubrió con un vendaje no hemostático comercjialmente disponible. Para los animales de 28 días, esto se invirtió y M - 62 - i se aplicó al lado izquierdo un aposito electrohilado conteniendo fibrinógeno (500 mg) y trombina (400 ÍU) . Se inyectó a los animales en el grupo de 28 días con ¡ trombina (60 IU) y fibrinógeno (200 ug) ) en el día siete para estimular la re-exposición al aposito. Al final de tiempo se eutanizaron los animales en cada cuerpos se presentaron para su necropsia. ; J ' i! Para el tercer método de exposición, se efectuó una incisión abdominal media y el vendaje de fibrinógeno trombina se insertó en la cavidad peritoneal. La incisión sé j'suturó y el animal se recuperó. Se mantuvo a los animales durante dos semanas y se extrajo sangre para un análisis de generación de anticuerpos. ! Preparación del tejido para el examen histológico En la necropsia, cada cerdo se colocó en jdecúbito lateral y se midieron los defectos en la piel, se' notaron grandes lesiones y se registraron, y se tomaron fotografías. El tejido de las lesiones tratadas con fibrinógeno/trombina de salmón y las tratadas con vendajes no hemostáticos , los nodos linfáticos pre-femorales , los nodos linfáticos mesentéricos y el bazo se cosecharon para la histopatologia. Las muestras de tejido se fijaron en formalina amortiguada neutra al 10% y después se prepararon rutinariamente, se i 1 procesaron y se embebieron en cera parafina para su1 corte y manchado. Se llevó a cabo la evaluación de histopatologia de i manera no blindada utilizando un microscopio lumi'ndso. Los parámetros de evaluación en las secciones de piel incluyeron la comparación del borde de la herida con el centro de la herida del tratamiento con vendaje de fibrinógeno/trombina de i salmón contra el tratamiento con vendaje no hemostático por I signos de inflamación, re-epitelización, granulación del i tejido, fibrosis, formación de incrustaciones y necrosis. Se , ¡i efectuó una puntuación semi-cuantitativa de las muestras de piel para inflamación superficial y profunda en base 'al grado de la respuesta inflamatoria evidente en las secciones de tejido manchadas con H & E estándar. La graduación fue (1) mínima, (2) suave, (3) moderada, y (4) marcada ('datos no mostrados) . También se evaluó por histopatología ¡ el nodo linfático mesentérico, los nodos linfáticos pre-femdrales y el bazo de cada animal. ! ¦ I Análisis estadístico Se analizaron las diferencias entre los grupos utilizando una prueba T de dos vías asumiendo variaciones iguales. Los valores se expresan como medias + d^l error estándar. Los valores N y los valores P se incluyen !con cada medición. i RESULTADOS j Inflamación y re-epitelización de la lesiónj, en piel en el grupo de 7 días.

Se produjeron lesiones dérmicas en pares,; en los ¡i animales y los sitios lesionados se cubrieron en un lado con el aposito de fibrinógeno de salmón y en el otro, con un aposito estándar sin fibrinógeno. Después de 7 días, se eutanizaron los animales y se tomaron para necropsiaj ("grupo de 7 días") . En el centro de la herida, todos lojs cuatro cerdos tanto en el lado izquierdo como en el jj derecho exhibieron un borde guía de células epiteliale's y un rellenado de la herida superficial por un coágulo compuesto de polvo celular necrótico, neutrófilos, hemorragia y edema.

Las células inflamatorias, el tejido de granulación y el edema expandieron la dermis superficial tanto en el lado izquierdo como el en derecho subyacentes a estér coágulo fibrinonecrótico . Histológicamente, este tejido de granulación se compuso de muchos vasos sanguíneos calibre cubiertos por el endotelio hipertrofiado y orientados I' perpendiculares a la superficie de la piel. El edema separó los bultos de colágeno dérmico y los fibroblastos. La |j evidencia de fibroplasia, caracterizada por numerosos i fibroblastos gruesos activados con deposición de , abundante ¦ i! colágeno, se extendió desde la unión de la dermis jprofunda hasta el panículo adiposo. Esta fibroplasia fue moderada en su severidad con una distribución de multifocal a difusa en todos los cuatro cerdos tanto en el lado derecho como en el izquierdo. J I La inflamación superficial de todas ^as ocho ? !| , i1 1 ¡i heridas fue de moderada a marcada en severidad y sé compuso principalmente de neutrófilos, menos macrófagos 1 y raras células gigantes inflamatorias multinucleadas subyacentes a la costra fibrinonecrótica . Una profunda inflamación fue I marcada en una lesión tratada con fibrinógeno/trombina de salmón, y de media a moderada en las lesiones restantes del lado derecho. Una profunda inflamación tratadas sin hemostático fue marcada en dos á moderada en dos casos.

Un intento de re-epitelización en herida fue evidente en todas las ocho heridas en el : punto de tiempo de 7 dias. Los descubrimientos típicos · 'en estos márgenes incluyeron hiperplasia epidérmica, acantosis, espongiosis, rebordes y trozos dérmicos profundos, I hiperqueratosis paraqueratótica y proyecciones de; células epiteliales de regeneración hacia el centro de la herida.

Para resumir el grupo de 7 días, todas las heridas 1 j se encontraron rellenas con un coágulo fibrinonécrótico . Cada herida exhibió tejido de granulación superficial en la dermis tanto en los lados tratados como en los no tratados. Hubo numerosos neutrófilos, menos macrófagos y hemorragia I multifocal. La inflamación se extendió de manera ¡variable profundamente en el subcutis y se compuso de lihfocitos, células de plasma y macrófagos. La re-epitelización en los márgenes y una moderada fibroplasia fueron evidentes ien todas las ocho heridas. Se anota que la adición de otros materiales activos tales como factores de crecimiento o colágeno, como se describe en la presente, puede ser hde ayuda 1 !' para reducir la inflamación y promover la cicatrización.

Inflamación y re-epitelización de la lesión en piel en el grupo de 28 días ¡I Para investigar completamente el proceso de cicatrización, se repitieron las lesiones dérmicas en un segundo grupo de animales y se siguió el curso de la cicatrización durante al menos 28 días ("grupo de 28¡ días"). j: En este grupo de 28 días, siete de ocho heridas exhibieron una re-epitelización completa que se caracterizó por hiperplasia e hiperqueratosis y de manera multifocal hubo un coágulo superficial similar en su composición celular al i grupo de 7 dias. En estas siete heridas, la inflamación superficial fue de mínima a suave. Una herida trJtada con vendaje no hemostático en el grupo de 28 días desplegó una i re-epitelización incompleta y el defecto de la herida se llenó por un coágulo fibrinonecrótico junto con unaj, marcada inflamación superficial. El borde de la herida en este caso ? exhibió cambios hiperplásticos de células epiteliales i similares al grupo de 7 días. Todas las ocho heridas exhibieron cantidades suaves de tejido de granulación dérmica I y una inflamación profunda compuesta de linfocitos perivasculares y macrófagos. La fibroplasia y la deposición de colágeno fueron fuertes en comparación con el grupo de 7 días. Este cambio se extendió desde la unión de la dermis hasta la grasa subcutánea en todas las ocho heridas. ¡ La inflamación superficial fue de mínima aji suave en i las cuatro lesiones tratadas con el vendaje no hemostático y generalmente se compuso de pocos linfocitos, células de ¡j plasma y macrófagos. La inflamación superficial en1 el lado tratado con vendaje de fibrinógeno/trombina de salmón varió de mínima en un caso, suave en dos casos y marcada en un caso. El infiltrado celular de mínimo a suave fue similar al de las heridas tratadas con el vendaje no hemostático . Sin embargo, el un caso de inflamación marcado en una ^h'erida en el lado del vendaje de fibrinógeno/trombina de (salmón se compuso de numerosos neutrófilos con menos macrófagos dérmicos, linfocitos, células de plasma y eosinófilps. Los neutrófilos se formaron raramente en pústulas¡! intra-epidérmicas. Adicionalmente, hubo hemorragia, fibrina y edema con necrosis en esta herida. | ' i La profunda inflamación en el tratamiento con el vendaje no hemostático varió de mínima a suave en tres casos y fue moderada en un caso. Esta inflamación subaguda se agrupó predominantemente alrededor de los vasos. : En el ; i! tratamiento con fibrinógeno/trombina de salmón, la inflamación profunda fue mínima en dos casos y moderada en dos casos; subaguda y principalmente perivascular. ¡¡ En resumen, el grupo de 28 días exhibió < una re-epitelización completa en siete heridas, las cuales se encontraron cubiertas por una costra fibrinonecrótíca . El tejido de granulación fue evidente en la dermis superficial. La inflamación se compuso principalmente de j células mononucleares . La fibroplasia fue abundante. Una herida tratada con el aposito de fibrinógeno/trombina dé salmón exhibió lesiones de histopatologia similares a las del grupo I de 7 días, incluyendo re-epitelización incompleta yi marcada inflamación. ¡¡I Implicación de órgano inmune j Los nodos linfáticos y el bazo se examinaron histológicamente por signos de activación, incluyendo la formación de folículo linfoide y linfocitolisis . Se descubrió que los nodos linfáticos mesentéricos y el bazo son similares histológicamente entre los cuatro cerdos ¡en cada punto de tiempo. La cantidad de pulpa blanca ¡ (tejido linfoide que contiene linfocitos T y B) contenida en' el bazo se incrementó ligeramente en las muestras de 28 días en comparación con las muestras de 7 días. ! Aunque los nodos linfáticos mesentéricos mostraron i poca diferencia entre los grupos de 7 días y los de '28 días, los nodos linfáticos pre-femorales que drenan !el área ipsilateral de la herida en piel desplegaron diferencias al examinarse en el punto de tiempo de 7 días. El nodo que drena la herida del vendaje no hemostático , exhibió i generalmente menos y menores folículos linfoides y un vuelco disminuido de células linfoides, que los nodos pre-:femorales que drenaron la herida con fibrinógeno/trombina de salmón. En el punto de tiempo de 28 días, los nodos linfáticos de ambos lados mostraron un tamaño de los centros germinales y i una cantidad de linfocitolisis equivalente. ! Cambios sistémicos en el estado inmune determinados ' i por los niveles de citosina Para determinar si los cambios morfológicos observados en los nodos linfáticos y el bazo se reflejaron en la circulación sistémica de las moléculas de señalización inmunomoduladoras o inflamatorias, se midieron los niveles de un panel de citosinas en los grupos de animales expuestos a heridas dérmicas y después se infundieron de manera j intravenosa dos semanas más tarde con proteínas de salmón solubles. Los niveles de IL-?ß, IL-6, TNF-a , IFN-?, IL-4 e II IL-10 se muestran en la Figura 5A como la ¡relación logarítmica del nivel de citosina determinada en la sangre i extraída en la cirugía inicial para implantar el puerto vascular en comparación con los niveles después!' de la i exposición. Las respuestas variaron entre janimales individuales desde casi ninguna respuesta hasta incrementos de 20 a 30 veces. Se observaron cambios tanto en las respuestas pro-inflamatorias (IL-?ß, IL-6, TNF-a, IFN-?) como en las respuestas humorales (IL-4 e IL-10) . Los cambios en las citosinas dentro de un individuo animal se muestran en la Figura 5B en donde puede observarse que la exposición inicial y la subsecuente infusión de las proteínas emitieron una I respuesta que pudo detectarse en muestras tomada's en la siguiente extracción de sangre . 1 Caracterización de la producción de anticuerpos en animales tratados contra trombina y fibrinógeno La sangre extraída de los animales (n = 241) que se i habían expuesto a trombina y fibrinógeno de salmón sé analizó por la generación de anticuerpos utilizando inmunoanálisis Western y ELISA. El suero de los animales expuestos a la proteína de salmón por medio del protocolo dérmico y el abdominal, se evaluó por la producción de anticuerjos, como se describió en las Figuras 6A-F. El suero con anticuerpos detectables ( + ) , los anticuerpos no detectables (!-) y el suero no analizado (NA) se listan en la Tabla 1, en donde "Abd" es abdomen. Si los anticuerpos fueron detectables enlazados a cualquier subunidad de fibrinógeno o de itrombina o protrombina, ese suero se contó como positivo. La' mayoría de los animales (94%, ver Tabla 1) que se expusieron a proteínas de salmón generaron anticuerpos que reconocieron el fibrinógeno de salmón (Figura 6) y el 66% de losl ^animales desarrolló anticuerpos que reaccionaron con fibrinógeno humano. En contraste, los anticuerpos de trombina fueron bajos o no detectables después de una exposición, pero fueron detectables a titulaciones bajas (1/10) después; de una segunda exposición (Figura 6) en algunos animales1 (4/24). Estos anticuerpos variaron en que algunos : solamente reconocieron la forma protrombina mientras que otros reconocieron la molécula de trombina dividida. Los j! isotipos de IgM e IgG se detectaron para ambos antigenos, ¡pero los : i: anticuerpos de IgA no se detectaron con inmunóanálisis Western ni con ELISA. j Tabla 1. Respuesta del anticuerpo en cerdos expuestos al aposito de fibrinógeno/trombina de; salmón evaluada por inmunóanálisis Western Número de procedimient FIB de FIB FIB de THR de THR THR de 3??G?3.63 O ' salmón humana cerdo salmón humana cerdo 12171 Parche dérmico 12172 Parche dérmico 12173 Parche dérmico 12174 Parche dérmico 13085 Parche abd + + +* + 13086 Parche abd + + +* - 13087 Parche abd ** 13088 Parche abd + + +* + + 14029 Parche abd† + + Número de procedimiento FIB de FIB FIB de THR de THRl THR de animales salmón humana cerdo salmón humana cerdo 14031 Parche abd 14032 Parche abd 14033 Parche abd 14871 Parche abd + + 14872 Parche abd + + 14873 Parche abd 14874 Parche abd 16954 Parche abd + + 16955 Parche abd + + + 16956 Parche abd + + + 16957 Parche abd + + + 17218 Parche abd + + + 17219 Parche abd + + + + 17220 Parche abd + + + + 17222 Parche abd + + + + . I1 El curso de tiempo de desarrollo del anticuerpo se determinó mediante ELISA en muestras de sangre secüenciales : G !¦ tomadas de dos series de cerdos, un conjunto sometido a animales con lesión en piel y un conjunto que recibió la colocación de parche abdominal. Los resultados se representaron como densidad óptica contra tijémpo de recolección de sangre, iniciando con la sangre recolectada en la implantación del VAP hasta la terminación del expérimento.

Los animales que se expusieron al vendaje a través de la modalidad de lesión en piel (Figura 7A-C) desplegaron respuestas ligeramente diferentes en comparación \\ con los animales que se expusieron mediante la colocación , abdominal : l¡ del parche (Figura 8A-D) . Los animales que se encontraban en el grupo de parche abdominal tuvieron muy bajas respuestas al fibrinógeno humano y bajas respuestas tanto a la trombina de salmón como a la trombina humana. Los inmunoanáiisis en general probaron ser más sensibles para detectar muy bajos niveles de respuestas a la proteina, pero los ELISAs permitieron rastrear fácilmente el progreso de la rjespuesta inmune y la producción de anticuerpos en cada animal.

Identificación de anticuerpos humanos de ¡reacción cruzada en el suero de cerdos expuestos a proteina de, salmón '' I1 El servicio de micromatriz multigénica de proteínas I humanas Protoarray de Invitrogen Corp., se utili¡zó para I visualizar el suero de cinco animales que se habían expuesto a las proteínas de salmón por la presencia de anticuerpos reactivos contra las proteínas generadas después;; de la exposición del cerdo a las proteínas de salmón por colocación ya sea en la piel o en el abdomen. Estas proteínasj1 podrían caer en dos categorías, 1) proteínas que fueron parte de la í cascada de coagulación y cuya función podría inhibirse posiblemente por anticuerpos que interfieren o 2) 'proteínas que no tienen una relación percibida con el proceso de coagulación, pero que aún pueden reaccionar con anticuerpos inducidos durante la exposición. El suero de los animales se analizó mediante Invitrogen por su reactividad^ a una I' micromatriz multigénica que despliega 5000 proteínas para i, determinar si los anticuerpos se habían generado en ¡el cerdo tratado que puede reconocer la proteína humana que no se analizó mediante inmunoanálisis Western. Como se muestra en la Tabla 2, la disposición tuvo 4 proteínas que eranjparte de la cascada de coagulación y 5 que se encontraban relacionadas con la actividad de transglutaminasa (Factor XIII) o que se encontraban relacionadas con la coagulación. Todos los 5 animales probados tuvieron fuertes reacciones iniciales contra la transglutaminasa 2 humana, pero ninguno mostró un . i1 incremento después de la exposición y ninguno de los 'animales tuvo respuestas de coagulación dañadas (ver más adelante) . La mayoría de los anticuerpos para proteínas de coagulación no mostraron cambios significativos pre-a pos,t-exposición en este sistema de análisis. Un segundo grupo de proteínas también se presenta en la Tabla 2. Estas son proteínas que mostraron incrementos significativos en las respuestas al anticuerpo después de la exposición de los animalés a las proteínas de salmón, pero que no se encuentran relácionadas con el proceso de coagulación. Hubo 15 proteínas de no coagulación que mostraron una reactividad incrementada a anticuerpos después de la exposición a las proteínas de salmón, que recayeron en esta clase con un umbral de valor p (valor inicial vs. final) de < 0.05.

Tabla 2. Detección sistemática de interacciones de proteína humana-anticuerpo de cerdo con la micromatriz multigénica de proteínas Invitrogen ProtoArray Coagulación o proteínas relacionadas con la coagulación contenidas en el Nivel de señal ProtoArray 5000 (unidades arbitrarias*) Factor Nombre común Contenido en ProtoArray relacionado Pre Post Fibrinógeno fibrinógeno-similar a 1 , inhibidor de 0.5 0.5 serina (o cisteina) proteinasa de variante 1 de transcrito, ciado C (antitrombina) Protrombina Miembro 1 0.5 0.5 Factor de tejido, factor III de coagulación (factor de tejido 0.5 0 5 tromboplastina de tejido de tromboplastina) (F3) ! Factor antihemofílico A Factor de coagulación VIII, componente 0 5 0 5 (globulina) (AHG) procoagulante (hemofilia A) (F8) !' protransglutaminasa, factor estabilizador de fibrina Fibrinoligasa Ver abajo Otras proteínas relacionadas Deficiencia 2 del factor de coagulación con la coagulación múltiple (MCFD2) Otras proteínas relacionadas Inhibidor de la trayectoria del factor de con la coagulación tejido (inhibidor de coagulación asociado con lipoproteinas) Otras proteínas relacionadas Transglutaminasa 2 (polipéptido C, con la coagulación proteina-glutamina-gamma- glutamiltransferasa), variante 2 de transcrito Otras proteínas relacionadas Transglutaminasa 4 (próstata) con la coagulación i1 Coagulación o proteínas relacionadas con la coagulación contenidas en el Nivel de señal ProtoArray 5000 (unidades arbitrarias*) Factor Nombre común Contenido en ProtoArray relacionado Pré Post Otras proteínas relacionadas Transglutaminasa 1 (polipéptido K 0.2 0.1 con la coagulación epidérmico tipo 1 , proteína-glutamina- gamma-glutamiltransferasa (TGM1 ) Otras proteínas relacionadas CTL21 14 TRANSGLUTAMINASA- 0J2 0.2 con la coagulación autoantigeno conocido Proteínas no relacionadas contenidas en el ProtoArray 5000 que muestran reactividad Contenido de ProtoArray Pip Post Proteasa especifica SUMO/sentrin, 8 Ó 4 Proteína 2 de enlace al dominio WW 1 5 (WBP2) Proteína 2 de enlace al ácido retinoico celular Factor nuclear 1/A proteína que 0 interactúa con RAB3A-similar a 1 Factor nuclear 1/A •i" 5 I Secretogranina III "|¡ 5 glicina-N-aciltransferasa-similar a 2 o 5 CLL de célula B/linfoma 7C 1 5 FosfatidilinositoM-fosfato 5-cinasa 4 Mahogunina, indicador 1 en anillo 1 5 Inhibidor de serpin peptidasa, 6 Q 4 Ataxina 3 o 4 Caseína cinasa 1 , gamma 2 f 5 Proteína ribosomal S6 cinasa o 4 cinasa 11 relacionada a NIMA 1 5 i! EXPOSICIÓN ! Cicatrización de heridas en animales tratados con ' ! ! apósitos de fibrinógeno/trombina de salmón ' Debido a la introducción de proteínas ¡' externas derivadas de sangre de salmón en un sitio de herida, nos preocupó que pudiera impedirse el proceso de cicatrización de heridas y que pudiera inducirse una coagulopatía por el inicio de una respuesta inmune adversa. Para investigar estas posibilidades, se trataron heridas en piel de grosor total con apósitos de fibrinógeno/trombina, apósitos de control, y se comparó el progreso de la cicatrización de heridas y el estado de activación de los nodos linfáticos y el bazo.

Se crearon quirúrgicamente heridas cutáneas por excisión en estos ocho cerdos, se vendaron con dos tipos ¡i diferentes de apósitos y se monitorearon durante do's puntos de tiempo de siete a veintiocho días después de la íícirugía. Los puntos de tiempo de 7 días y de 28 días generalmente siguieron los modelos muy establecidos de cicatrización de heridas cutáneas mediante un segundo intento en donde, existen i' bordes separados y ninguna oposición quirúrgica. Las, heridas cutáneas cicatrizaron mediante el segundo intento después de un complejo proceso para cerrar el defecto. Estos tipos de heridas despliegan una robusta respuesta inflamatoria localizada, forman abundante tejido de granulación |y tienen un tejido de costra superficial de epidermis delgada. Como i1 se esperaba, el grupo de 28 días exhibió una comp'leta re-epitelización en siete de ocho heridas. Al paso del! tiempo, i es probable que estas heridas mostraran algunos signos de costra con contractura si se dejaran progresar ! durante ' I1 semanas y meses adicionales.

Una notable diferencia histopatológica en ¡el punto de tiempo de 7 días fue la incrementada activación de los nodos linfáticos pre-femorales en el lado tratado' con el vendaje de fibrinógeno/trombina de salmón en contrjaste con los nodos del lado tratado con no hemostático. Estj no fue inesperado dado que puede reflejar un mayor grado de estimulación inmune en el lado expuesto a los vendajes de proteina de salmón o puede deberse a una respuesta de coagulación incrementada en el momento de la herida | inicial, que resulta de los vendajes de fibrina/trombina . ! La respuesta inmune de cerdos después! de la exposición a apositos de fibrinógeno/trombina de salrrtón Los animales expuestos a fibrinógeno/trombina de salmón fueron monitoreados por complicaciones de salud y se extrajo sangre para determinar la respuesta inmunjé a las proteínas de salmón. Los niveles de las citosinas que se midieron proporcionaron una buena representación del estado , !! i i| i' de la respuesta. Las citosinas inflamatorias (IL-1, IL-6, TNF-a e IFN-?) frecuentemente imitaron las manipulaciones quirúrgicas mientras que las señales humorales (IL-4je IL-10) se incrementaron consistentemente con los cambios! en las titulaciones del anticuerpo. Nuestros resultados j,muestran que los animales rutinariamente convirtieron las inmunoglobulinas en fibrinógeno y, como se esperatj'a, estas fueron de la clase IgM e IgG. Además, en la mayoriia de los i animales estos anticuerpos reconocieron todos los tres ' I! antigenos de fibrinógeno que se analizaron, fibrinógeno de ¡ ¡ salmón, cerdo y humano. La trombina, por otra parte, no indujo una respuesta tan universal como el fibrinógéno, con solo 6 de los animales generando una respuesta a trombina y solamente 4 de ellos produciendo anticuerpos que reconocieron j la trombina de cerdo. Las titulaciones de todos los anticuerpos fueron bajas y los inmunoanálisis Western se condujeron con una alta concentración del suero (.dilución 1/10) para permitir la visualización de las bandas de proteina. Hubo alguna diversidad en los antigenos reconocidos por los anticuerpos reconociendo, algunos de los anticuerpos, solamente la protrombina y no la :trombina, aunque la protrombina fue un porcentaje relativamente1 pequeño de la muestra. i Se condujeron mediciones de los parámetros de coagulación para determinar si los anticuerpos inhibieron el proceso de coagulación, pero todos los valores medidos permanecieron en el rango normal. Con el razonamiento de que podrían existir efectos ocultos en la coagulación humana que no se detectaron en las mediciones de los tiempos de coagulación en plasma de cerdo, se mezclaron entre sí los plasmas de cerdo y humano. En este experimento también se i midieron los niveles normales de coagulación. A partir de una evaluación aproximada de la salud de los animales así como de los análisis bioquímicos descritos anteriorménte, los anticuerpos no parecieron ocasionar una respuesta adversa. j¡ Generación de factores de coagulación inhibidores en instalaciones clínicas ; ¡' La coagulopatía adquirida es un trastorno , ,aro pero serio que puede surgir cuando un paciente genera anticuerpos que reconocen e interfieren con la función normal de los componentes de la trayectoria de coagulación. : |l Se ha reportado que los anticuerpos reconocen e inhiben un rango de proteínas de coagulación. La enfermedad de von Willébrand es i; el trastorno sanguíneo más ampliamente heredado (Ródeghiero F, Castaman G, Dini E . , Blood, 1987 Febrero; 69(2). :¡, 54-8 ) y más comúnmente se debe a bajos niveles de expresiórt del VWF funcional. Sin embargo, también puede ocasionarse por la inapropiada producción de anticuerpos que pueden interferir con el polipéptido von Willébrand mismo o con la ' proteasa ADA TS-13 (Shelat SG, Smith P., Ai J. Zheng XL, J. Thromb Haemost, 2006 Agosto; 4 (8 ): 1707-17) . Aunque la causa subyacente para estos autoanticuerpos puede deberse a la I disfunción inmune en el paciente o a una crisis 'de salud desencadenada que precipita la respuesta autoinmune^, el uso de agentes de coagulación en cirugía como ' agentes hemostáticos también se ha implicado como la causa de anticuerpos inhibidores que procesan el polipéptido. Los autoanticuerpos para los Factores VIII o IX, aunque son muy raros, pueden conducir al síndrome de hemofilia adquirido (Franchini M, Rituximab, Critical reviews in oncology/hematology. 2007 Julio; 63 ( 1) : 47-52 ). : !! Se ha extendido el uso de trombina bovina como un agente : ópico en todo tipo de procedimientos quirúrgicos con estimaciones de más de un millón de usos en 2006. Los reportes han documentado ahora efectos adversos resultantes j de los anticuerpos desarrollados contra trombina, pró rombina, factor V, y cadiolipina después del uso de i, agentes hemostáticos. Muchos otros casos de coagulopatía adquirida se encuentran asociados con la cirugía sin referencia específica en cuanto a si se había utilizado o no ! trombina bovina en esos procedimientos. Un procedimiérito para i combatir la respuesta autoinmune ha sido el intento de i! I suprimir el sistema inmune, y el fármaco rituximab, un anticuerpo monoclonal dirigido a CD20, ha ser efectivo en el tratamiento de muchos casos. Una desventaja de este tratamiento es el riesgo incrementado de que se presente leucemia y otros cánceres cuando el sistema de defensa del huésped se daña. Claramente, cualquier agente ¡i terapéutico pro-coagulatorio a base de proteínas necesitará, probar que el riesgo de inducción autoanticuerpos y la subsecuente coagulopatía adquirida es bajo. Nuestro estudio ha demostrado que el sistema inmune de los cerdos, aunque es capaz de reconocer las proteínas de salmón y d;ej' generar anticuerpos, no ha instalado una respuesta que conduzca a la coagulopatía y, a corto plazo, los animales permanecen sanos. EJEMPLO 5. Despliegue de un vendaje de dextran elecdrohilado Se preparó generalmente a los .animales I (anestesiados, instrumentados para cirugía) como se describió en el Ejemplo 4. Brevemente, se efectuó una incisij n media para exponer la aorta abdominal. Esto implica mjover los intestinos grueso y delgado hacia un lado y cortar a través del peritoneo para aislar la aorta. La lesión en la!aorta (4 I mm punzados) se llevó a cabo y se permitió el ¡¡.sangrado i durante 3 a 4 segundos. Después, se aplicó un vendaje con presión durante 4 minutos. La presión se liberó y 'la lesión se revisó por hemostasis y se midieron la pérdida dé ¡¡sangre y I los signos fisiológicos. El experimento se terminó, ¡a los 60 minutos o si la presión arterial media cayó por debájo de 20 mm Hg .

RESULTADOS |? Las formulaciones previas de vendajes lio;fili zados ' ! ' no funcionaron bien. Por ejemplo, cuando se liofilizaron trombina y fibrinógeno en el vendaje, el vendaje exhibió baja textura y 0/4 animales sobrevivieron. Los jj vendajes i liofilizados con lípidos agregados dieron como resultado 5/7 ¡ supervivencias durante 60 minutos. Cuando se utilizó una cantidad reducida de material para fabricar los vendajes, 4/6 animales sobrevivieron durante 60 minutos. · i; Los vendajes de dextran se formularon primero con I solventes orgánicos y los vendajes fueron muy duros en textura, y no se disolvieron bien, y la mayoría de los i animales (8/10 probados) murieron. El critjerio de supervivencia se incrementó a 3 horas debido a que notamos que algunos animales listados como "supervivientes" a los 60 minutos en experimentos previos, no habrían durado mucho más. De manera importante, las pruebas in vitro de' ''trombina resultados mejoraron con mucho. La textura del vendaje fue suave y plegable y el vendaje podía doblarse y conformarse para ajustarse al sitio de la herida. Las mediciones in vitro de trombina y resistencia del coágulo mostraron gran mejoría. La trqmbina se encontró activa y ocasionó la polimerización del fibrinógeno. De los animales probados, l¡ I ¦ I! 7/9 animales sobrevivieron. Durante los experimentos, las presiones sanguíneas cayeron a presiones arteriales medias de 30 a 50 mm Hg y después se recuperaron a 50 a 7 mm' Hg. Los ritmos cardiacos típicamente se incrementan a 160-180 bpm y eventualmente caen de nuevo a 120 bpm o menos estabilizar la herida. Los parámetros de permanecieron normales por tres horas. ; También se ha examinado el efecto de los j endajes en el proceso de coagulación y cicatrización al paso del tiempo durante tres diferentes períodos de tiempo: 1 semana, 4 semanas y 6 meses. Estos animales no fueron "lesionados" como se describió anteriormente sino que se expusieron quirúrgicamente a los vendajes. Durante cada período de I tiempo, todos los valores de coagulación fueron normales, toda la cicatrización fue normal (probada por m I1edio de heridas dérmicas) y los vendajes aplicados al abdomen se absorbieron son efectos adversos. La necropsia mostró mínima adhesión en el sitio de inserción. Todos los :animales produjeron anticuerpos contra el fibrinógeno de ; salmón. Estos anticuerpos reconocen el fibrinógeno humano, pejro no el fibrinógeno de cerdo (auto antígenos) . Los anticuerpos se produjeron a bajas titulaciones contra la trombina dé salmón, pero no reaccionaron de manera cruzada con trombini ya sea humana o de cerdo. j Las Figuras 9A-D muestran esa cicatrización de heridas que procede normalmente al tratarse con el: vendaje. Los parámetros hematológicos se midieron para determinar si los anticuerpos desarrollados después de la exposición a ' I1 proteínas de salmón alteran la composición celular^ 'sanguínea ' ¡i o los valores normales de coagulación. Los valores medios, de desviación estándar y p, se presentan en forma ; tabular a i continuación. En la Tabla 3A y B y en la Tabla 4. Para la ; i! Tabla 4, se mezcló el plasma humano y el plasma de cerdo de 2 animales expuestos y se analizaron por parámetros de coagulación para determinar si pueden existir, ¡(factores crípticos que podrían interferir con la coagulación. Como puede observarse, ninguno de los parámetros se alteró significativamente después de la exposición a los vendajes de i la invención. ( · ' i Tabla 3A y B. Cambios en los parámetros de hematología y coagulación antes y después de la exposición al aposito de fibrinógeno/trombina de salmón ' ,· A.

Células de glóbulos Células de glóbulos HCT (%) PLT (x 10s/l) blancos (x 109/l) rojos (x 10,2/l) inicial Final inicial Final inicial final inicial final Media n 19.88 17.30 5.79 5.98 29 30 444 426 = 30 Desvia3.96 3.10 0.43 0.50 3.23 2.74 89: 126 ción i' estándar prueba T 0.03 0.24 0.49 0.62 Valor p Aunque la invención se ha descrito en términos de sus modalidades preferidas, los expertos en la ; técnica reconocerán que la invención puede practicarse con modificaciones dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas. Por consiguiente, la presente invención no debe limitarse a las modalidades como se describieron anteriormente, sino de debe incluir además todas i las modificaciones y equivalentes de las mismas dentro del espíritu y alcance de la descripción proporcionada en la presente. > |

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para suministrar uno o más agentes de interés en una ubicación de interés, que comprende las etapas de: ; I I aplicar o suministrar a dicha ubicación dé| interés un dispositivo, comprendiendo dicho dispositivo fibras de dextran electrohiladas que se disuelven al contacto con líquidos; y í uno o más agentes de interés asociados cqn dichas fibras de dextran electrohiladas, i en donde dicha etapa de aplicar o suministrar da como resultado la disolución de dichas fibras de1 dextran electrohiladas en el líquido en dicha ubicación d ¡'interés, liberando así dichos uno o más agentes de interés ¡en dicho líquido. I

2. El método de la reivindicación 1, en donde dichas fibras de dextran electrohiladas tienen un diámetro I que varía de 0.75 mieras a 1.00 mieras. : ¡¡

3. El método de la reivindicación 1, jsn donde dicha ubicación de interés es un sitio en el cuerpo de un i individuo. 1

4. El método de la reivindicación 3, donde dicho líquido en dicho sitio es un fluido corporal, j1

5. El método de la reivindicación 1, en donde l' dicho uno o más agentes son agentes bioactivos. ;

6. Un vendaje que comprende: í1 fibras de dextran electrohiladas que tienen un diámetro que varia de 0.75 mieras a 1.25 mieras ! que se disuelven al contacto con líquidos, y , jj al menos uno de trombina y fíbrinogeno . asociados con dichas fibras de dextran electrohiladas en dicho | vendaj e .

7. El vendaje de la reivindicación 6, ¡en donde dicha trombina y fibrinógeno son trombina de salmón y fibrinógeno de salmón. j.

8. El vendaje de la reivindicación 6, ien donde dicha trombina y fibrinógeno se encuentran en forma de I partículas. |¡

9. El vendaje de la reivindicación 6, jen donde dicha trombina y fibrinógeno se encuentran presentes dentro de las gotas electrohiladas.

10. El vendaje de la reivindicación 6, en donde tanto la trombina como el fibrinógeno se encuentran asociados con dichas fibras de dextran electrohiladas. í¡

11. El vendaje de la reivindicación i 6, que comprende además uno o más agentes bioactivos adicionales.

12. El vendaje de la reivindicación 6, en donde dicho vendaje comprende además un material de soporte.

13. El vendaje de la reivindicación 12, en donde dicho material de soporte comprende un material seleccionado del grupo que consiste de gasa, dextran electtohilado comprimido, polímeros de ácido poliglicolítico, polímeros de l! ácido poliláctico, polímeros de caprolactona y nylon ^cargado .

14. Un método para inducir la hemostasis en una herida, que comprende la etapa de: ¡! aplicar a dicha herida un vendaje hemostático, comprendiendo dicho vendaje hemostático: 1 ¡ fibras de dextran electrohiladas que tienen un diámetro que varía de 0.75 mieras a 1.25 mieras, y que se disuelven al contacto con líquidos; y al menos uno de trombina y fibrinógeno asociado con dichas fibras de dextran electrohiladas; en donde dicha etapa de aplicación da como resultado la disolución de dichas fibras de !' dextran electrohiladas en la sangre dentro de dicha herida y la liberación de dicha al menos una de trombina y fibrinógeno en dicha sangre dentro de dicha herida, induciendo: así la hemostasis en dicha herida. i

15. El método de la reivindicación 14, jen donde tanto la trombina como el fibrinógeno se encuentran ¡ asociados con dichas fibras de dextran electrohiladas.

16. El método de la reivindicación 14, en donde dicha herida es una herida penetrante y dicha etapa de aplicación incluye insertar dicho vendaje hemostáticb en una cavidad de dicha herida penetrante. , ^ ¦ ; trombina y fibrinógeno. j ¡I