MX2010007043A - Medios para cultivo de celulas de mamiferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de cohn y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a medios de cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de algunas de las fracciones del fraccionamiento del plasma humano según el método de Cohn, más en particular, el sobrenadante de las fracciones I y II+III. Cuando dicho sobrenadante es adicionado como suplemento de medios de cultivo proporciona diferentes nutrientes y factores para un adecuado mantenimiento y/o proliferación de las células de mamíferos cultivadas. Además, la presente invención se refiere al procedimiento de preparación y al uso de dicho medio en el cultivo de células de mamíferos.

Description

MEDIOS PARA CULTIVO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS QUE COMPRENDEN SOBRENADANTE DE ETAPAS DEL FRACCIONAMIENTO DE COHN Y USO DE LOS MISMO DESCRIPCIÓN ?Q DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un su a su uso en medios de cultivo de células de ma ho suplemento se obtiene a partir del plasma desf stancialmente libre de fibrinógeno y fibrina) d ano y, cuando es adicionado como suplemento de m tivo proporciona los diferentes nutrientes y facto adecuado mantenimiento y/o proliferación de tivadas .

ECEDENTES erentes lineas celulares se necesita un medio q condiciones del medio interno donde se encontrarí ulas in vivo. Generalmente, el medio de cultivo c medio basal que garantiza el pH,' los nutriente es y se pueden añadir una serie de suplemen miten la proliferación celular. Uno de los supleme lizados es el suero sanguíneo de origen animal. E mal de este suero puede implicar serias restriccio utilización en la obtención de productos para anos, ya que al reconocer los residuos de orige o antígenos extraños se pueden originar re ersas en los receptores. Además, los sueros een el inconveniente de que su composición no es d s existe una gran variabilidad entre fabricantes de diferentes- razas animales. También, de mer grupo de medios, tales como el medio basal M) (Eagle, H. (1955) . "The specific aminoacid requ mammalian cells (strain L) in tissue culture". ra. 214 : 839.) y el más complejo 199 de Morgan rgan, J.G., Morton, J.H. y Parker, R.C. (1950). "N animal cells in tissue culture. I Initial studi thetic médium". Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73 : ios definidos pero que precisan de un suplemento re el 5 y el 20%.

A fin de eliminar el aporte de medios comp inidos se han ido formulando medios más comple C 109 (Evans, V.J., Bryant, J.C., Fioramonti uilkin, W.T., Sanford, K.K., y Earle, W\R. udies of nutrient media for tissue C cells in vi tein-free chemically defined médium for cultiv mically defined synthetic médium". Proc. Nati. Sci 288.), serie de los MCDB (Ham, R.G. y McKeeha 78) . "Development of improved media ans culture co clonal growth of normal diploid cells". In vit 22.) y los medios de Sato suplementados con rnés, D. y Sato, G. (1980). "Methods for gr tured cells in serum free-medium" . Anal. Bioche -270) .

La aproximación recomendada para establ io definido es empezar con un medio rico, por eje , suplementado con elevada concentración de suero bar suplementos que permitan reducir la cantidad ta poderla reducir o suprimir.

Después de años de investigación en la coxc los medios, la elección de éstos sigue siendo empi centración que el BME . Se usa para cada casi todo tivos y requiere la adición de suero (10%) .

- R.P.M.I. 1640: es un medio diseñado cimiento de linfoblastos y lineas celulares leucé pensión. Tiene un amplio rango de aplicació lementos adecuados.

- Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM) : tro veces la concentración de aminoácidos y vitam BME. Se usa para la selección de hibridomas supl HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) poxantina-timidina) .

- Modificación de Iscove del medio DMEM (I medio muy completo que incluye en su formulación ina, transferrina, selenito, entre otros elementos l para el cultivo de linfocitos en medio libre d cimiento de lineas celulares humanas, de lementado con proteínas y hormonas. Contiene meta Cu, Zn. Es útil para el cultivo de células amniót - Medio F-12 de Ham: es un medio útil cimiento de líneas celulares con suplementos prot ibinado con IMDM es un medio que se usa como ro .

- Medio 199: es un medio muy utilizado tivo de células no diferenciadas y estu mosomopatías .

Todo medio de cultivo está formado uientes elementos : 1. Soluciones salinas equilibradas (BSS) . 2. Aminoácidos. 3. Vitaminas. leados son suero de ternera {"calf serum", CF) ino fetal ("fetal calf serum", FCS), suero de orse serum", HS) y suero humano ("human serum", utilizado es el suero de ternera, mientras que ino fetal es usado en lineas más exigentes, y ano en lineas humanas .

La utilización de suero es problemática ar de que la composición del suero es conocida e sten gran cantidad de componentes presentes en ca iables que pueden influir notablemente en el más, el suero varia de lote a lote, debid iabilidad de la propia técnica de obtención de la proceso de obtención del suero (coagulación de la e las condiciones de separación del suero, asi erencia entre las distintas fuentes de suero. Adem ablecimiento de cultivos primarios especia ecialménte si se produce una gran variación tenido.

En conjunto, la inclusión de suero en los m tivo supone un gran inconveniente para la estanda protocolos experimentales y de producción de célu o se realizan importantes esfuerzos p áblecimiento de medios de composición definida cimiento celular. Esto, además de la reproduc cada, permite establecer medios selectivos en zca el tipo celular deseado. La desventaja de esto que en muchos casos el crecimiento de las células as lineas celulares permanecen viables menos gener Se han realizado diferentes intentos para c lementos de los medios de cultivo celulares que ev m Soc," 1946) y variaciones del mismo (Kistler and chmann; en Curling, JM ed, Methods of ctionation. Academic Press 1980), estando todo ayos dirigidos al uso de los diferentes prec enidos en el fraccionamiento, especialmente las fr II, III, IV (IVi ó IV4) y V, o sus equivalentes erentes variaciones del método de fraccionamiento.

El objetivo inicial de la separación cionadas fracciones (precipitado) es la obtenció cipitado enriquecido en una determinada protein to de partida para la purificación de la mis mplo ?-globulinas y a y ß-globulinas en el caso cciones II+III ó III; a-globulinas y transferrin cción IV y albúmina en la fracción V. Por ello cciones se presenta de forma mayoritaria un único ficiente de suplementar los medios de cultivos ce uramente esta sea la causa de la disparidad de re enidos, ya que pequeñas variaciones en el mé ccionamiento no variarán significativamen uperación de la proteína mayoritaria, pero roducir gran variabilidad en la recuperación erentes proteínas acompañantes. Por ejemplo, la o la fracción II+III, según el método de Cohn, se r concentración de etanol de entre 20 y 25% a -5 . Según el método de Nitschmann, partiendo de un ivalente, se precipita a una concentración de e a -5°C y pH 5,8. Con esta variación de pH se cciones con características diferentes, especial contenido de ?-globulinas y otras proteínas acompa Por otra parte la utilización de sobren leadas para precipitar la fracción II+III en dete diciones (25%) o las fracciones IV1+IV4 y V nol) .

El documento EP0143648 (Macleod) describe e fracciones II+III, III, IVi y IV4 como suplement ios de cultivo en sustitución del suero animal, ica que ni la fracción II ni la fracción V p lidad para este uso. En todos los casos, este docu iere exclusivamente a las fracciones precipitada ccionamiento de Cohn o sus variantes. Ademá umento da a conocer un proceso para obtener el cuado como suplemento de medios de cultivo a parti cciones anteriormente mencionadas. Este proceso icamente en la suspensión del precipitado en ogenización del mismo. Posteriormente, se pr endiente del proceso especifico de preparación.

En otro documento de Macleod (Advan chemical Engineering Biotechnology, Vol . 37; 1988 las fracciones II, III y IV producen poco o ningú el crecimiento celular, debido posiblemente a la p inhibidores del crecimiento y dirige la atenci cción IV como material ideal para suplementar m tivo.

La EP 0 440 509 (Macleod). describe un su a medios de cultivo celulares basado .en la fracc la fracción II+III de Cohn, y el proceso ención. Mediante el proceso descrito se obt ducto sustancialmente libre de inmunoglo ctivado de virus y estable. Se procede a la separ inmunoglobulina por precipitación con Polietilengl as .

El sobrenadante de la fracción V es el al de desecho del fraccionamiento de Cohn, por l obviamente no presenta un coste económico como de el rendimiento de dicho fraccionamiento. Este senta un alto contenido de etanol (40%), que es a ico, y que en este documento no se menciona como minado. Por otra parte, para el tratamiento de C deberla ser necesaria la estabilización de la sente, pero también se obvia este detalle en el do lo que la invención es difícilmente realizable ta á descrita. Tampoco., debe despreciarse el naturalizante del etanol a una concentración tan o este caso.

La WO 94/18310 (Mankarious) describe un mét es suplementado con una fracción sérica obtenida ro o plasma al que se ha eliminado el fibrinógeno acteriza por que se le ha extraído la prealbúmin maglobulinas (pág. 1, líneas 30-34) . En una rea ferente, esta fracción se purifica por precipita ohol entre el 10 y el- 20 %, a un pH de 5.85 eas 37-38) . En una realización particular (obtenci cción EPF) , el sobrenadante usado como medio de cu iene a una concentración de etanol del 19 % a 5 (pág. 2, líneas 44-45) . El sobrenadante obt liza con objeto de eliminar el etanol, teriormente liofilizado para su conse ionalmente se liofiliza sin diálisis previa, con bién se elimina el etanol. Según los inventores, io de cultivo (RPMI) suplementado con dicha fra ortantes en el producto obtenido, siendo la conce etanol y el pH, los factores determinantes posición del precipitado y sobrenadante obtenidos.

Se han realizado otros intentos de sup ios de cultivo celulares a partir de suero o fr icas de origen humano, en sustitución del suer ino, como muestran los documentos O ' 2004/055 0852 ó CA 1177424. El suero obtenido a partir d al, o a partir de plasma, no puede, equiparars cción plasmática concretamente definida y carácte senta el inconveniente de la falta de reproduc e a lote. Además, ninguno de estos documentos inir y caracterizar la composición exacta del lizado. De esta manera, se siguen presentando gr los problemas asociados al uso del suero de origen del suero fetal, pero la homogeneidad de este mat comparable a las mezclas de plasma de miles de d ún se describe más adelante.

Como se ha descrito anteriormente, se han r erosos intentos para sustituir el suero anim lemento de medios para el cultivo celular. Una os intentos se ha realizado a partir de fracc sma humano, especialmente de fracciones del m n. A pesar de ello, en la actualidad se sigue ut mmente el suero animal como suplemento de m tivo de células de mamíferos y se ha fracasado entos de sustituirlo por un derivado del plasma hu Por todo lo anteriormente mencionado, se de el estado de la técnica actual no se dispon erial de origen humano que sea útil como suple iemento de medios de cultivo por fracciones del ano y han encontrado, de manera sorprenden tiendo de un sobrenadante del fraccionamiento ecíficamente el sobrenadante de la fracción II+I renadante de la fracción I, es posible suplementa cultivo celulares, obteniendo excelentes result nto a crecimiento celular. El uso de este uciona los problemas antes mencionados, ya qu gen humano, se obtiene de forma industrial bajo n recta fabricación (GMPs) , con un coste y ren ptables, presenta una adecuada uniformi roducibilidad lote a lote y posee una calidad macéutico. Además, este material puede ser trat odos que eviten la transmisión de patógenos .

Para la preparación de estos derivados se sto que el plasma empleado en la invenci tancialmente libre de células, al poderse haber plasmaféresis en presencia de anticoagulante, en donación de sangre total.

Las cantidades de anticoagulante, asi co mativas que debe cumplir el procedimiento de ob iacenamiento y manipulación de plasma human critas en normativas internacionales de carácter afectan a la industria fraccionadora del plasma io son, por ejemplo, el "Code of Federal Regulat EE.UU. de América, las directrices y normativa inistración Federal de los Fármacos y Alimentos UU. de América (Food and Drug Administration, FDA) ncia Europea de Evaluación de Medicamentos ( icines Evaluation Agency, EMEA) , asi como ccionamiento del plasma humano con fines farmace ho conjunto de normativas también son de aplicació pas de la invención que se describen a continuació Una vez obtenido el plasma humano, se acena y transporta de acuerdo con el conj mativas que afectan al fraccionamiento del plasm fines farmaceúticos y, en una utilización prefe invención, específicamente de acuerdo c uerimientos de la monografía 0853 de la Fa opea. Cada unidad (donación) de plasma se anal cartar la presencia de marcadores de infección v donantes, que previamente han sido somet stionarios y exámenes físicos de acuerdo mativas mencionadas anteriormente. En ap ferente de la invención, el plasma de un posible us de hepatitis B y C (VHB y VHC) y otros virus p a el hombre. Forma parte de la invención un almace trolado de las donaciones de plasma durante un pe erior a 60 dias, preferentemente no inferior a permitirla retirar donaciones previas si un viamente sano, diese indicios, con posteriorid ación, de infección por agentes patógenos u otros riesgo sanitario. En una aplicación preferent ención, los análisis de las muestras de cada don iten una o varias veces tras preparar mezcla inipools" o "pilot pools") de un número vari aciones que, por ejemplo, pueden oscilar entre 10 ferentemente entre 90 y 2000 y más pref rentemen y 1000. Para estas repeticiones de análisis s lear métodos de amplificación del material genétic La siguiente etapa consiste en des aciones, en número no inferior a 100 u ferentemente superior a 1000 unidades ferentemente superior a 4000 unidades. La descon puede realizar, en una aplicación preferente ención, entre 0 y 4 °C de temperatura. Las donac clan durante el proceso de descongelación dando mezcla plasmática ("plasma pool") . Opcionalme de separar un material que precipita, ya que es i ido al proceso de descongelación y que suele des o "crioprecipitado" y es rico en factor von Wi í), factor VIII (FVIII), fibrinógeno (FBN), fibr íC) y otras proteínas.

A continuación, en una utilización preferen ención, se añade al plasma etanol (96 %) d diciones precipita una fracción de proteínas muy rinógeno y que incluiría la mayor parte de las p sentes en el crioprecipitado si este, en una aplic invención, no se hubiese separado con anteriorid ción de alcohol. Esta fracción se denomina genér o fracción I (Fr-I) de Cohn, ya que se obtiene cedimiento esencialmente correspondiente al desc ?? J. Cohn (Cohn E.J. et al; J Am Chem Soc, 1946) separa el precipitado obtenido en esta etapa, la renadante se encuentra sustancialmente li rinógeno, y por tanto libre de cualquier interfere iera causar el fibrinógeno en los cultivos ce ndo adecuada para el objeto de la invenció lemento para medios de cultivo de células, una mina el alcohol añadido, por su toxicidad p nol en el plasma, la adición se realiza con un c ción controlado. Simultáneamente y con el mismo o temperatura del pool de plasma se hace d dualmente hasta aproximadamente -5 °C. La pres nol evita la congelación del plasma. En estas con cipita una fracción de proteínas muy rica en las eriormente descritas como presentes en el criopre n la Fr-I (si no se han separado previamente, cribe con anterioridad) y, además, muy unoglobulinas , principalmente IgG e IgM. Esta fra omina genéricamente como fracción I+II+III (Fr-I+ no se ha separado previamente la Fr-I, o fracció -II+III) de Cohn, si se separó previamente la Fr-I separa el precipitado obtenido en esta etapa, la renadante se encuentra sustancialmente li sma, para garantizar que los procesos se realiza las especificaciones requeridas en cuanto a conce proteina, pH, contaje de microorganismos , etc.

Estos sobrenadantes se obtienen cedimiento esencialmente correspondiente al desc i J. Cohn, si bien pueden existir diferen posición, tanto debidas a . los cambios de es ducción (número de donaciones y volumen de los p sma), como a variaciones entre el procedimient ención y el procedimiento aplicado en aquella époc Estos sobrenadantes obtenidos directame ccionamiento industrial del plasma humano (basad odo de Cohn) , aparte de la eliminación del et tienen (aproximadamente 8% en el sobrenadante cción I y 20-25% aproximadamente en el sobrenadan ustrializables .

Una forma de preparación válida para ob ducto totalmente estable consiste en partir de cu los sobrenadantes descritos y, opcionalmente, d venientemente con agua para inyección, solució iológica o tampón, a pH 7-8 y temperatura entre 2 ución se clarifica por placas de . celulosa fundidad, que sean inertes en cuanto a adsor teina, y finalmente se clarifica hasta aproximadam ras de poro. Posteriormente se somete el pro filtración, utilizando membranas de aproximadament corte molecular nominal, frente 2 volúmenes o más a inyección, solución salina fisiológica o tampón, ferente de 7 aproximadamente. Preferentemente, e volúmenes de intercambio en la diafiltra carga aplicada es preferentemente alrededor ros/m2 de área para el filtro de menor tamaño de p El producto obtenido puede concentra rafiltración hasta el mismo valor de concentra teina total del material de partida (sobrenadante centrado si se prefiere.

En cualquier caso, el material obtenido se viales o botellas de vidrio y se guarda al ferentemente a -30°C o temperatura inferior h entó de su uso. Como paso previo a la dosifica renadante en viales, se puede proceder a real tración esterilizante, por un tamaño de poro ent mieras.

Este producto congelado puede filizarse, o someterse a otros tratamientos, para de proceder a realizar una filtración esteriliza tamaño de poro entre 0.1 y 0.2 mieras. El ificado se congela preferentemente a temperatura al a -30°C, y se somete a liofilización y radiaci y como se conocen estas técnicas.

De manera opcional, este material puede ser métodos- de eliminación/inactivación de agentes pa forma preferente se puede proceder a la irradia erial, congelado o liofilizado_con radiación gamm y 35 kilo-greys, obteniéndose con 25 kilo-greys e re estabilidad de la composición y eliminación de El producto liofilizado puede alma ferentemente entre 2-8°C, durante largo periodo de A nivel de proliferación celular, el sobr Fr-II+III se mantiene estable (porcenta Una forma de conservación preferente del ta su uso es como liofilizado en su envase final, e a, puede procederse a su dosificación directa y minar el etanol en el propio proceso de liofilizac Estos sobrenadantes se añaden a medios de vencionales libres de suero, que contiene rgánicas, aminoácidos, vitaminas, entre otros coi esarios para el crecimiento celular, como por ej io F12 de Ham o el medio de Dulbecco modificado (D El medio resultante puede ser utiliza tivar una gran variedad de células de mamíferos.. P utilizadas técnicas y condiciones de vencionales, que son conocidas por un expert eria .

El. sobrenadante liofilizado puede reconstit de fracción II+III reconstituido en medio a 9 io base (2%) otro ejemplo seria añadir 50 renadante de Fracción .1 o de fracción II+III recon medio a 50 mi de medio base (50 %) .

El sobrenadante reconstituido en agua, so inas o tampones aptos para cultivo celular se re cionarlo al medio de cultivo base entre un 2% y v) por ejemplo 20 mi de sobrenadante reconstitui de medio (20%) . En el caso de ser necesario centraciones del 50% (v/v) seria necesario adic renadante reconstituido a medio base doble con ) por ejemplo añadir 50 mi de sobrenadante de frac fracción II+III en agua a 50 mi de medio base 2X.

El medio de cultivo suplementado puede ut a las técnicas habituales de cultivo, est - SO - esario llegar a concentraciones del 50% (v/v) lementación del medio seria necesario adici renadante de fracción I o de fracción II+II centrado (2X) por ejemplo añadir 50 mi de sobrena cción II+III a 50 mi de medio base 2X.

El medio de cultivo suplementado puede ut a las técnicas habituales de cultivo, est lementado puede utilizarse directamente o f viamente por 0,22 µp?. mplo 1 Preparación del sobrenadante de las fracci III .

Se procede a la mezcla y descongela aciones individuales de plasma proceden smaféresis, la descongelación se realiza en un r oprecipitado (S/C) , que debe ser del 5 % aproxima es superior se diluye con agua para inyección. Asi sta el pH a 7 aproximadamente.

Partiendo del S/C, se le adiciona etanol h centración del 8 % (volumen/volumen) . La veloc ción del etanol debe ser lenta (menor o igual a 2 on agitación moderada para evitar la desnatúral ante la adición del etanol se disminuye gradual peratura del sobrenadante, en el reactor de precip ta llegar a una temperatura final de -2 °C. El e situarse aproximadamente en 7.

Después de aproximadamente 2 horas de rea cede a la centrifugación para la separación de la Esta centrifugación se realiza entre 9000 y 1200 renadante obtenido (S/Fr-I) se mantiene a una tem lumen/volumen) . La velocidad de adición del eta lenta (menor o igual a 2 kg/min) y con agitación a evitar la desnaturalización. Durante la adíe nol se disminuye gradualmente la temperatu renadante, en el reactor de precipitación, hasta temperatura final de aproximadamente -5 °C. El e situarse cercano a 7.

En este ejemplo, después de aproximadamente reacción se procede a la separación de la fracción En este punto (sobrenadante de la fracción n el S/C, o en el S/FrI puede procederse a la ex ional de la Antitrombina, por cromatografía de af arina (Fernandez J. et al. Sangre 41(supl. 3) 42 ( mpio 2 Dosificación y Liofilización ero de volúmenes de intercambio en la diafiltraci La solución es clarificada por filtración gradiente de filtros de 0,2 mieras hasta 0,1 m año de poro. Posteriormente el producto opcional ofiltra por 35 nm y 20 nm de tamaño de poro, con celulosa cupra-amonio, a una temperatura entre 2 una presión transmembrana inferior a 1 bar, h queo de los filtros como máximo.

El producto se concentra por ultrafiltraci mismo valor de concentración de proteína to erial de partida y previa filtración esterilizante año de poro de 0.2 mieras, se dosifica en viales d e guarda almacenado a -30 °C hasta el momento de s Este producto congelado puede liofilizar Sobrenadante Suero Fetal Sob de f acción Bovino de II+III LOTE n=3 (x±DT) n=3 (x±DT) n= oteina total (BIORAD) (mg/ml) 32, 13 ± 2, 07 30,81± 2,29 ectroforesis (Albúmina %) 46,86 f 1,22 76,27 ± 1,73 ectro oresis (Alfaglobulina 1 '%) 4,64 ± 0,18 44,93 ± 1,49 ectroforesis (Alfag obulina 2 %) S,28 ± 1,48 ectroforesis (Betaglobulina ¾) 6,13 ± 0,32 7, 4 ± 0, 3 ectroforesis (Gazomaglobulinas %) 1,02 ± 0,16 1, 63 ± 0, 0 ectrof resis (restos %) 0 - 0,26 0,08 - 0,63 Albúmina (g/1) m 23, 8 2,1 a-ANTITRIPSINA (g/1) m 0,915 ± 0,05 1,2 Alfa-l-glicoproteina ácida (g/1) 0, 574 ± 0, 06 0, T Apo-AI (g/L) MD 0,354 ± 0, 07 0, 8 Haptoglobina (g/1) MD 0, 826 ± 0, 05 a2-Macroglobulina (g/1) ND 0,256 ± 0, 04 1,5 ATIIT (g/1) 0, 200 ± 0,01 o, 2 arfcc ato (mmol/L) 13,00 ± 1,73 2 - € 106,00 ± ruros (mmol/l) 71,80 ± 3,12 1,00 tasio (nnaol/1) 10,67 ± 0,58 2,87 ± 0,23 137,33 ± 130,33 ± io (mmol/1) 3,21 4,93 139,90 ± cio (mg/L) 53,07 ± 6,45 65, 8,03 sforo (mg/dL) 9, 37 ± 1, 09 2, 17 ± 0,21 2, Sobrenadante Suero Fetal Sob de fracción Bovino de II+III LOTE n=3 (x± T) n=3 (x±DT) tribución laolecular (%) Polímeros y agregados 7,26 - 16,63 2,85 - 8,12 Formas intermedias S,84 ± 3,08 10,18 ± 1,48 Monómero 78,34 i 1,83 84,20 ± 0,87 PM < Monomero 0 - 0,17 0 - 1,47 • COSA (mg/-X) 46 -77 63,33 ± 6,66 82, A (mg/dL) 34,67 ± 1,53 18, 33 ± 3, 06 23, DO URICO (mg/dL) 1,83 ± 0,15 3,17 ± 0,35 4, -NITROGENO ÜREICO (mg/dL) 16,29 ± 0,72 8,62 ± 1,44 11, ATININA (mg/dL) 2,95 ± 0,40 0,52 ± 0,12 0, /Creatinina Ratio 5,52 ± 1,02 16,75 ± 1,40 13, IRRÜBINA TOTAL (mg/dL) 0,20 t 0,03 0,23 ± 0,03 0, 76,97 ± ÜLINA BAS L (µ?/mLj <2 - 2,53 12, 12,45 - BETA ESTRADIOL (pg/mL) 30,77 ± 7,45 41,13 ± 8,09 46, GESTERONA (ng/mL) <0,20 - 0,20 0,46 - 0,85 0, TOSTERONA TOTAL (ng/mL) 0,14 ± 0,02 1,79 ± 0,28 2, TOSTERONA LIBRE (pg/mL) <0,03 - 0,17 3,69 ± 0,49 OXINA (T4) TOTAL (ug/dL) 13,07 ± 0,47 4,12 ± 0,34 6, LIBRE (ng/dL) 3,00 - >6 0,99 ± 0,09 1, 6LICERID0S {mg/dL) 59 ± 6,56 18,67 ± 0,58 117 ESTEROL (mg/dL) 34 ± 4,36 31 ± 4,58 137 -COLESTEROL (mg/dL) 5,67 i 1,53 9,33 ± 2,08 -COLESTEROL (mg/dL) 10 - 17 17,67 ± 3,06 105 11,67 ± L-COLESTEROL (mg/dL) 23, 1,53 DOS GRASOS LIBRES (mEq/L) <0f 10 0,19 ± 0,03 0, FOLÍPIDOS TOTALES (mg/dL) 44,33 ± 4,04 57 ± 5,00 152 3 LOTES SE ANALIZAN ANTES DE SU LIOFILIZACION.

Sobrenadante Suero Fetal Sob de fracción Bovino de II+III n LOTE n=3 (x±DT> n=3 <x±DT) OS GRASOS SA3^R )OS (%} et decanoico (Miristico , Cl4 : 0) 0f30 - 0,90 0,50 - 1,45 0, exadecanolco {Palmitico C16:0) 25,80 ± 0,66 25,67 ± 0,49 23, ctadecanoico (esteárico C18:0) 21,03 ± 2,40 11,50 ± 0,23 5, icosanoico (Araqaidico C20 : 0) 0,20 - 0,40 0,20 ocosanoico {Behenico C22:0) 0,23 ± 0,06 0, 10 OS GRASOS MONOINSATÜRADOS (%) exadecenoico {Palmitoleico €16:1) 1,10 - 2,10 1,13 ± 0,06 is-9-octadecenoico (Oleico C18:l) 19,43 ± 3,48 16, 92 ± 0,26 11, is-ll-octadecenoico {Cis-Vaccenico 0,20 - 6,60 1,05 - 2,40 <0 1-eicosenoico (Gondoico C20:l) 0,23 ± 0,06 0,10 OS GRASOS POLIINSA ÜRADOS <?3 ß6) S , OÍS , is- , 12 ,15-octadecatrienoico 0,23 ± 0,06 0,10 - 0,30 0, is-6, 9, 12-octadecatrienoico (gainn-a-Linolénico C18:3) is-11, 14-eicosad-ieiiqico <C20:2) 0,23 ±0,06 0, 10 ihomo-gamm -Linolénico {C20 :3) 2,27' ± 0,31 1,70 ± 0,09 0, is , cis , cis , is-5 , 8 , 11, 14-eicosatretraenoico 4,60 - 7,80 8,62 i 0,62 7, (Araquidónico C20:4) ll-cis-7,10, 13, 16, 3,83 ± 0,68 0,45 - 0,75 0, 9-Docosapentaenoico {C22:5) 3 LOTES SE ANALIZAN ANTES DE SU LIOFILIZACION. m io : Ensayo de proliferación celular de la linea io suplementado con sobrenadante de fracción I .

La linea celular CHO corresponde a cél rio de hámster chino, estas células presentan mo telial y* crecen en modo adherente. El cultivo u ; .60%; 80% y 100%) asi como medio suplementado co v) de suero fetal bovino (FBS) y medio sin supleme Se siembra en una placa de 96 pocilios 50 illo de una suspensión de células CHO a una conce re 5 x 105 y 1 x 106 células/ml en medio de cul iementar.

Se añade a cada columna de la placa 50 illo del medio que deseamos testar de forma ución final proporcionará medio sin supl iementado con un 10% FBS y suplementado con un 10 30; un 40 y un 50 % de sobrenadante de fracción I.

La placa de 96 pocilios se incuba a 37 °C; ósfera con un 8% CO2 y alta humedad relativa (i a cultivos celulares) durante 48 horas.

Se añaden 100 µ? de medio sin suplementa tor de microplacas a una longitud de onda de 420 do la lectura de longitud de onda de referencia 600 nm (generalmente las placas se leen en un RISE de Tecan a una longitud de onda de 450 n gitud de onda de referencia de 620 nm utilizando trol del equipo, la lectura y análisis de d tware Magellan V 6.3).

Los valores de absorbancia superiores al bl veces la desviación estándar de éste se co itivos para la técnica.

En el próximo paso se resta el valor prom nco al resto de pocilios de la placa.

Se calculan los valores promedio de los poc a columna (una vez restado el blanco de la ¦ respondiendo el valor promedio de cada columna El valor de absorbancia del medio de re dió F12 de Ham suplementado con un 10% de sidera el valor 100% de proliferación por lo iden todos los valores promedio del punto anter se les ha restado el valor del medio sin suplemen e valor para obtener el porcentaje de proli pecto al medio de referencia.

Con los medios suplementados entre un 20 sobrenadante de fracción I como norma general se centajes de proliferación similares al medio de re dio con 10% de Suero Fetal Bovino) o muy superiore 50% de sobrenadante de fracción I) . ' A continuación se muestran los result liferación en porcentaje. liferación celular (%) CHO en medio Ham' s F12 supl sin suplemento; FBS: suero fetal bovino; alb: abú mplo 5 : Ensayo de proliferación celular de la linea con medio suplementado con sobrenadante de fracc .

Este ensayo se realiza de forma idéntica a erior, suplementando los medios con sobrenad cción II+III en lugar de sobrenadante de fracción Respecto a los resultados de prolifera tir de un 20 % de sobrenadante de fracción II+ lemento del medio, los resultados son similare enidos con el medio de referencia (suplementado co ) y al emplear medios suplementados con un renadante de fracción II+III los resulta liferación son superiores a los obtenidos con el i 20% 30% 40% 50 10% FBS S/Frll+III S/Fr.II+III s/Fr.ir+rii 5/Fr.I s/s (2,5 mg {4,8 mg/ml (7,1 mg/iiil (9,5 mg/tnl (11,9 (mg/ml alb) alb) alb) alb) al 0 100 85 104 123 16 sin suplemento; .h'BS: suero te al bovino; álb: abúmina m lo 6 : Ensayo de proliferación celular de la linea con medio suplementado con sobrenadante de II Gamma irradiado.

Este ensayo se realiza de forma idéntica a erior suplementando los medios con sobrenad cción II+III irradiado con radiación gamma, a las y 35 kGy (kilo Greys) .

Respecto a los resultados de prolifera liferación celular (%) CHO en medio Ham' s F12 supl con FBS , S/Fr-XI+XII o S/Fr-II+III gamma irradia sin suplemento; FBS: suero fetal bovino; kGy: kiloGreys m lo 7 : Ensayo de proliferación celular de la linea o con medio suplementado con sobrenadante de Gamma irradiado (25kGy) Este ensayo se realiza de forma idéntica a ejemplo 1 utilizando como medio de cultivo bas imo esencial modificado por Dulbecco (DMEM) , y ular Vero en lugar de la linea CHO. enido con el medio de referencia a partir de un lementación con sobrenadante de fracción II+II adiado El medio suplementado con un 20% de sobrena cción II+III gamma irradiado proporciona unos re similares al medio de referencia (medio base supl 10% FBS) .

A continuación se muestran los result liferación en porcentaje. roliferación celular (%) Vero en medio DMEM suple con FBS o S/Fr-II+III gamma irradiado (n=8) 25 kGy 25 kGy 25 kGy 25 kGy 2% FBS 5 % FBS 10% FBS 10% S/Fr 20% S/Fr 30% S/Fr 40% S/Fr (0.5 {1.3 (2-5 II+III II+III II+III II+III /S mg/ml mg/ml mg/ml (2.4 {4.8 (7,1 (9.5 alto) alb) alb) mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml alb) alb) alb) alb) 0 77 104 100 65 71 B2 84 Se utiliza un frasco con un cultivo de cél eralmente próximo a la confluencia.

Se decanta el medio de cultivo.

Se lava la monocapa celular con tampón ino (PBS) , a una temperatura entre 20 y oximadamente se utilizan 10 mi por cada 25 c anta.

Se añade una solución de tripsina 0,05% /ED tripsina puede ser recombinante o de origen lizando 2 mi por cada 25 cm2 de superficie culti ución se extiende por toda la superficie de f de como una fina película y se decanta ' el ex ución .

El frasco se mantiene a una temperatura en °C hasta que las células se separen de la superfic El volumen total de medio F12 de Ham supl un 50% de sobrenadante de fracción II+III (25 nuevos frascos de cultivo debe ser de 0,2 a 0, superficie de cultivo.

El frasco se incuba en un incubador para ular a 37 °C con alta humedad relativa y concentr adecuada al medio de cultivo utilizado (en este .

El medio de cultivo se debe renovar entre s .

Después de diferentes pases utilizando el r tivo suplementado con un 50% de S/Fr-II+III {25 erva que el cultivo sigue viable y con capac cimiento .

Se monitorizó la viabilidad, el tie as y un número total de células promedio de 1. ulas/75 cm .

En una segunda experiencia se monitorizar mos parámetros en células (CHO) cultivadas con un % de S/Fr-II+III durante 3 a 7 pases. Para tivadas en medio suplementado con 50 % de S/Fr-I uvo: TDP 103.22, viabilidad 90.21 % y 6.14 x 106 75 cm2. Para células cultivadas en medio suplemen % de S/Fr-II+III se obtuvo:_TDP 70.45, viabilidad 2 x 106 células en 75 cm2. Para células cultivadas lementado con 10 % de S/Fr-II+III se obtuvo: TD bilidad 91.07 %, 5.87 x 106 células en 75 cm2. m io 9 : Subcultivo de la linea celular CHO con medi ' s suplementado con un 20% de sobrenadante de cimiento .

En este caso se monitorizó la viabilidad ero de células totales en 75 cm2 durante secutivos siendo la viabilidad promedio del 97,1 promedio de 86,32 horas y un número total de medio de 5.96 x 106 células/75 cm2. m lo 10 Estabilidad del sobrenadante de la Fr ida como el porcentaje de -proliferación de célu lementadas con 50 % de sobrenadante de la F onstituido en HAM's F12, respecto al medio supl 10 % de Suero Fetal Bovino.

Tabla 1 Estabilidad liofilizado a 4°C T=0 T=105 días T= 112 dias = Tabla 2 Estabilidad reconstituido = -18° C Este material, reconstituido en Medio cult , es estable al menos 113 dias a temperatura menor -18°C {porcentajes de proliferación celular ig eriores a tiempo cero) .

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Medio para el cultivo de células de m acterizado porque , comprende, además de los nu ituales de los medios de cultivos básales para cu ulas de mamíferos, t sobrenadante de alguna de la fraccionamiento del plasma humano según el m n . 2. Medio de cultivo, según la reivindic acterizado porque el sobrenadante se corresponde renadante de la fracción I del método de Cohn. 3. Medio de cultivo, según la reivindic acterizado porque el sobrenadante se corresponde renadante de la fracción II+III del método de Cohn . Medio de cultivo, según cualquiera vindicaciones anteriores, caracterizado porq 6. Medio de cultivo, según cualquiera indicaciones anteriores, caracterizado por renadante de la fracción de Cohn se encuentra gelada . 7. Procedimiento de preparación de un tivo de células de mamíferos, según las reivindica 6, caracterizado porque ¦ la preparación de renadante de alguna de las etapas del fraccionami sma humano según el método de Cohn comprende las e precipitación con etanol separación del sobrenadante congelación o desecación y opcionalmente las etapas de - dilución y/o diálisis o diafiltración y/o 9. Procedimiento, según las reivindicaci acterizado porque el sobrenadante desecado se reco el medio de cultivo basal. 10. Procedimiento, según las reivindicaci caracterizado porque el plasma humano es obtenido mezclas ("pooles") de, como mínimo, 1000 donantes 11. Uso del medio de cultivo que c renadante de algunas de las etapas del método ún las reivindicaciones 1 a 6, para cultivar cé íferos . 12. Uso, según la reivindicación 7, carac que dicho sobrenadante se corresponde con el sobr la fracción I del método de Cohn. 13. Uso, según la reivindicación 7, carac que dicho sobrenadante se corresponde con el sobr la fracci n II+III del método de hn.