MX2009000487A

MX2009000487A - Inductor de muerte celular.

Info

Publication number: MX2009000487A
Application number: MX2009000487A
Authority: MX
Inventors: Naoki Kimura; Shigeto Kawai
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-07-13
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2009-01-27
Also published as: JPWO2008007755A1; BRPI0714209A2; PE20081004A1; TW200808351A; AR061986A1; WO2008007755A1; KR20090038896A; AU2007273507A1; CA2657385A1; EP2048230A1; US20100150927A1; EP2048230A4; CL2007002057A1; IL196134A0; CN101517075A

Abstract

El objeto es proporcionar un anticuerpo que tiene un alto grado de actividad inductora de muerte celular. Para lograr el objeto, se inmuniza un ratón con una célula capaza de expresar tanto HLA humanos de clase IA como microglobulina humana ß2 (ß2M) para producir anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se seleccionan para un anticuerpo que tiene una actividad inductora de muerte celular, y se obtienen 10 clones. El análisis de los clones revela que tres clones (anticuerpos C3B3, C11B9, C17D11) que tienen un dominio a2 de antígeno HLA de clase I en sus epítopos pueden entrecruzarse con un anticuerpo anti- IgG murina para mostrar una actividad citotóxica potente. Cuando se produce un diacuerpo del anticuerpo C3B3, se encuentra que el diacuerpo presenta un efecto antitumoral más potente en comparación con el de un diacuerpo de un anticuerpo 2D7 que es un anticuerpo conocido contra HLA de clase IA.

Description

INDUCTOR DE MU ERTE CELU LAR Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos que reconocen HLA y agentes inductores de muerte celular que comprenden dichos anticuerpos como ingrediente activo. Antecedentes de la invención HLA es una molécula importante en la respuesta inmunitaria, que incluye el reconocimiento de antígenos exógenos, bacterias, células infectadas por virus y sustancias extrañas, y los elimina . El principal papel de la molécula de H LA consiste en presentar a las células T CD8+ los péptidos antigénicos producidos dentro de las células, los cuales están compuestos por aproximadamente ocho a diez aminoácidos, y en consecuencia , juega un papel muy importante en la respuesta inmunitaria y la tolerancia inmune inducida por la presentación del péptido. Las moléculas de HLA se categorizar en clase I y clase I I . Las moléculas de clase I forman un heterod ímero de una microglobulina ß2 de 1 2 KD (ß2?) y una cadena a de 45 KD que comprenden tres dominios, a1 -3. Las moléculas de clase I I forman un heterod ímero de una cadena a de 30-34 KD que comprende dos dominios, a 1 y a2 , y una cadena ß de 26-29 KD que comprende dos dominios, ß1 y ß2. También es sabido que el HLA de clase I (HLA-I ) también se puede clasificar en HLA-A, B, C y así sucesivamente (en adelante, HLA-A también se denomina "H LA clase IA (HLA-IA)").

Hasta la fecha se han informado efectos supresores de crecimiento celular e inductores de muerte celular en linfocitos ligados a un anticuerpo anti-H LA clase IA, lo cual sugiere que las moléculas HLA pueden ser moléculas de transducción de señal. Por ejemplo, se ha informado que el crecimiento celular de los linfocitos activados es suprimido por el anticuerpo B9.12.1 contra el dominio a1 de H LA clase IA humano, el anticuerpo W6/32 contra el dominio a2 y los anticuerpos TP25.99 y A1 .4 contra el dominio a3 (documentos no patentes 1 y 2). Además, se ha informado que dos anticuerpos contra el dominio a 1 , MoAb90 y YTH862 , inducen apoptosis en linfocitos activados (documentos no patentes 2, 3 y 4). Se ha demostrado que la apoptosis inducida por estos dos anticuerpos es una reacción mediada por caspasa (documento no patente 4), y en consecuencia también se postula que el HLA clase IA expresado en linfocitos interviene en la transducción de la señal de apoptosis. Además, se ha informado que el anticuerpo 5H7 contra el dominio a3 de H LA clase IA humano (documento no patente 5) y el anticuerpo RE2 contra el dominio a2 de M HC de ratón clase I (documento no patente 6) inducen muerte celular en linfocitos activados y similares. También se informó que el anticuerpo monoclonal 2D7 (documento no patente 9) obtenido al inmunizar células de mieloma humano es un anticuerpo que reconoce HLA clase IA y puede inducir rápidamente severa muerte celular en células de mieloma humano si se introduce en un anticuerpo molecular bajo (diacuerpo). El diacuerpo 2D7 está en desarrollo como agente terapéutico para mieloma, dado que muestra fuerte actividad inductora de muerte celular en diversas líneas celulares de mieloma humano y linfocitos activados, y muestra significativo beneficio de supervivencia en modelos de mieloma múltiple en ratón generados al trasplantar células de mieloma humano en ratones (documentos de patente 1 , 2 , 3 y 4, documentos no patentes 7 y 8). Es de esperar que ulteriores adelantos en los tratamientos que utilizan muerte celular que incluye HLA clase I conduzcan al desarrollo de agentes farmacéuticos altamente efectivos contra mieloma y similares. La bibliografía de la técnica previa referida a la presente invención de la presente solicitud se muestra a continuación, [documento de patente 1 ] WO2004/033499 [documento de patente 2] WO2005/056603 [documento de patente 3] WO2005/1 00560 [documento de patente 4] PCT/JP2006/309890 [documento no patente 1 ] Fayen et al. , Int. I mmunol . 1 0: 1 347-1 358( 1 998) [documento no patente 2] Genestier et al. , Blood 90: 3629- 3639 ( 1 997) [documento no patent 3] Genestier et al. , Blood 90: 726-735 ( 1 997) [documento no patente 4] Genestier eí al. , J . Biol . Chem . 273: 5060-5066 (1998) [documento no patente 5] Woodle et al., J. Immunol. 158: 2156-2164 (1997) [documento no patente 6] Matsuoka et al., J. Exp. Med. 181: 2007-2015 (1995) [documento no patente 7] Goto, et al. Blood 84: 1922-30 (1994) [documento no patente 8] Kimura, et al. Biochem Biophys Res Commun., 325:1201-1209 (2004) [documento no patente 9] Oka, T., "Sankyo Seimei-kagaku-zaidan Kenkyu Hokoku-shu (Informes de investigación de la Fundación Sankyo de Ciencias Biológicas)" 12:46-56 (1998) Breve descripción de la invención La presente invención se logró en vista de las circunstancias anteriores. Un objetivo de la presente invención consiste en proveer anticuerpos que comprenden regiones variables de cadena pesada que comprenden CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8 y 9. Además, un objetivo de la presente invención consiste en proveer anticuerpos que comprenden regiones variables de cadena liviana que comprenden CDR 1, 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 11 y 12. Más específicamente, un objetivo de la presente invención consiste en proveer anticuerpos que reconozcan HLA clase IA y tengan mayor actividad inductora de muerte celular que cualquiera de los anteriores. Los presentes inventores condujeron una dedicada investigación para resolver los objetivos antes mencionados. Primero, se inmunizaron los ratones con células que coexpresan HLA clase IA humano y ß2? humano, y se obtuvieron anticuerpos monoclonales. Luego se analizaron los anticuerpos obtenidos para producir diez clones de nuevos anticuerpos monoclonales con actividad inductora de muerte celular. Cuando se analizaron estos clones, se halló que tres clones (anticuerpos C3B3, C1 1 B9 y C1 7D 1 1 ) cuyo epitopo es un antígeno HLA clase I de dominio a2 , mostraban fuerte citotoxicidad celular al formar enlaces cruzados con un anticuerpo anti IgG de ratón. Además, al modificar el anticuerpo C3B3 obtenido a un anticuerpo de bajo peso molecular (diacuerpo C3B3), los presentes inventores tuvieron éxito en la construcción de un anticuerpo antagonista inductor de muerte celular con actividad antitumoral propia superior a la de los anticuerpos de bajo peso molecular anti-HLA clase IA convencionales (diacuerpo 2 D7). Más específicamente, la presente invención provee los siguientes [1 ] a [25] : [1 ] un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada que comprenden CDR1 , 2 y 3, que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO 7 , 8 y 9; [2] un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena liviana que comprenden CDR1 , 2 y 3, que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO 1 0, 1 1 y 1 2; [3] un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada que comprende CDR1 , 2 y 3, que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO 7 , 8 y 9, y regiones variables de cadena liviana que comprenden CDR1 , 2 y 3, que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO 10 , 1 1 y 12; [4] un anticuerpo que comprende la región variable de cadena pesada de cualquiera de: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2; (b) una región variable de cadena pesada que comprendes una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena pesada de (a); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; y (d) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; [5] un anticuerpo que comprende la región de cadena liviana de cualquiera de: (e) una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (f) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena liviana de (e); (g) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3; y (h ) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ I D NO: 3; [6] un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de cualquiera de: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2; (b) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena pesada de (a); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; y (d) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; y una región variable de cadena liviana de cualquiera de: (e) una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4; (f) una región variable de cadena liviana que comprendes una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena liviana de (e); (g) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3; y (h ) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3; [7] un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6; (b) una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, Inserciones y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 5; y (d ) una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5; [8] un anticuerpo que se fija al mismo epitopo que el epitopo de la proteína de antígeno leucocitario humano (HLA), a la que se fija el anticuerpo de cualquiera de [1] a [7]; [9] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [8], que es un anticuerpo monoclonal. [10] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [9] que reconoce un antígeno leucocitario humano (HLA); [11] el anticuerpo de [10], en donde el HLA es un HLA clase I; [12] el anticuerpo de [11], en donde el HLA clase I es un HLA- A; [13] el anticuerpo de cualquiera de [1] a [12], que es un anticuerpo de bajo peso molecular; [14] el anticuerpo de [13], en donde el anticuerpo de bajo peso molecular es un diacuerpo; [ 5] un polinucleótido de (a) o (b): (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3 ó 5; o (b) un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido de (a), y que codifica un anticuerpo con una actividad equivalente al anticuerpo de cualquiera de [1] a [14]; [16] un vector que comprende el polinucleótido de [15]; [17] una célula huésped que comprende el polinucleótido de [15] o el vector de [16]; [1 8] un método para producir el anticuerpo de cualquiera de [1 ] a [1 4], en donde el método comprende las etapas de: (a) producir el polinucleótido de [1 5]; (b) construir un vector que comprende el polinucleótido de (a); (c) introducir el vector de (b) en células huésped ; y (d) cultivar las células huésped de (c); [19] un agente inductor de muerte celular que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1 ] a [1 4] como ingrediente activo; [20] el agente inductor de muerte celular de [1 9] que induce muerte celular de una célula B o una célula T; [21 ] el agente inductor de muerte celular de [20] , en donde la célula B o la célula T es una célula B activada o una célula T activada; [22] un agente supresor de crecimiento celular que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1 ] a [14] como ingrediente activo; [23] un agente antitumoral que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1 ] a [1 4] como ingrediente activo; [24] el agente antitumoral de [23], en donde el tumor es un tumor hematopoyético; y [25] un agente terapéutico para enfermedades autoinmunitarias que comprende el anticuerpo de cualquiera de [1 ] a [14] como ingrediente activo. Breve descri pción de los dibujos La Fig. 1 muestra los resultados de confirmar el nivel de expresión de HLA clase IA en líneas celulares Ba/F3 que expresan HLA y células ARH77 por FACS. La Fig. 2 muestra un diagrama esquemático de las líneas celulares que expresan HLA clase IA quimérico humano-de ratón en el cual uno de los dominios de HLA clase IA (dominios a1-a3) es sustituido con el correspondiente dominio de MHC clase IA de ratón.

La Fig. 3 muestra una tabla de los resultados del análisis de epitopos en diez clones de anticuerpos obtenidos al inmunizar ratones con células Ba/F3 que coexpresan ???-?/ß2 microglobulina (ß2?). La actividad de fijación a cada tipo de células Ba/F3 que expresan HLA clase IA quimérico humano-de ratón (MHH, HMH y HHM) se analizó por FACS, y (+) denota ligadura confirmada, y (-) denota ausencia de ligadura. El epitopo de cada clon se determinó mediante los respectivos patrones de tinción. La Fig. 4 muestra el resultado de examinar la actividad inductora de muerte celular en ARH77 en presencia o ausencia de un anticuerpo secundario para diez clones de anticuerpo obtenidos al inmunizar ratones con células Ba/F3 que coexpresan ???-?/ß2 microglobulina (ß2?). La Fig. 5-1 muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada de 2D7 y los recién obtenidos C3B3, C17D11, y C11B9. La Fig. 5-2 muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena liviana de 2D7 y los recién obtenidos C3B3, C17D11, y C11B9. La Fig. 6 muestra un cuadro de separación obtenido por purificación del minicuerpo C3B3 mediante cromatografía por filtración en gel . La Fig. 7 muestra un gráfico que indica actividad citotóxica in vitro de cada uno de los picos ( 1 )-(3) del minicuerpo C3B3 separado por cromatografía por filtración en gel , en ARH77. La Fig . 8 muestra un gráfico que indica las actividades supresoras de crecimiento celular in vitro del diacuerpo C3B3 (C3B3 DB) y el diacuerpo 2D7 (2D7 DB) en ARH77. La Fig . 9 muestra gráficos que indican las actividades supresoras de crecimiento celular in vitro del diacuerpo C3B3 (C3B3 DB) y el diacuerpo 2D7 (2D7 DB) en células de mieloma humano (ARH77, I M-9, HS-Sultan , MC/CAR). La Fig. 10 muestra un gráfico que indica el de supervivencia de ratones trasplantados I M-9 cuando se administra PBS/Tween20 (control), el diacuerpo 2D7 (2D7 DB) o el diacuerpo C3B3 (C3B3 DB). La Fig . 1 1 muestra un gráfico que indica la cantidad de IgG sérico humano en ratones trasplantados I M-9 el día 1 4 después del trasplante. Se administró PBS/Tween20 (control), diacuerpo 2D7 (2D7 DB ) o diacuerpo C3B3 (C3B3 DB). La Fig . 1 2 muestra un gráfico que indica la actividad citotóxica in vitro del diacuerpo C3B3 y el diacuerpo 2D7 en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). La Fig . 1 3 muestra los efectos supresores de crecimiento del diacuerpo C3B3 y el diacuerpo 2D7 en células de tumores de células T humanas. Se muestra el efecto supresor de crecimiento de cada anticuerpo sobre células Jurkat cultivadas durante 3 días. Descri pción detallada de la i nvención La presente invención se refiere a anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende CDR 1 , 2 y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 7, 8 y 9. Además, la presente invención se refiere a anticuerpos que comprenden una región variable de cadena liviana que comprende CDR 1 , 2 y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 0, 1 1 y 1 2. Los presentes inventores usaron HLA clase I como antígeno para obtener nuevos anticuerpos que tienen actividad inductora de muerte celular. Entre ellos se halló que tres clones (anticuerpos C3B3, C1 1 B9 y C1 7D1 1 ) cuyo epitopo es un dominio de HLA clase I a2 , mostraban fuerte actividad citotóxica cuando se formaban enlaces cruzados con un anticuerpo anti-lgG de ratón . Además, al modificar el anticuerpo C3B3 en un anticuerpo de bajo peso molecular (diacuerpo) mediante técnicas de ingeniería de anticuerpos, los presentes inventores pudieron proveer un anticuerpo agonista (diacuerpo C3B3) que exhibe en sí mismo un efecto antitumoral más fuerte que un diacuerpo convencional del anticuerpo 2D7. La presente invención se basa en dichos hallazgos. La presente invención provee anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende CDR 1 , 2 y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 7, 8 y 9.

La presente invención también provee anticuerpos que comprenden una región variable de cadena liviana que comprende CDR 1 , 2 y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 0, 1 1 y 1 2. Los anticuerpos de la presente invención no están particularmente limitados mientras comprendan una región variable de cadena pesada que comprende CDR 1 , 2 y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 7, 8 y 9, o una región variable de cadena liviana que comprende CDR 1 , 2 y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 0, 1 1 y 1 2. Los ejemplos preferidos de anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada de cualquiera de (a) a (d) siguientes: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2; (b) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2 , y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena pesada de (a); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; y (d ) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 . Alternativamente, los ejemplos de anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos que comprenden una región variable de cadena liviana de cualquiera de (e) a (h) siguientes: (e) una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4; (f) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena liviana de (e); (g) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3; y (h ) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3. Además, los ejemplos de anticuerpos que comprenden dichas regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena liviana son anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a) a (d ) siguientes: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6; (b) una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 5; y (d ) una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 5. La secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o la región variable de cadena liviana puede contener sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Además, también puede carecer de porciones de región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena liviana, o se pueden agregar otros polipéptidos, siempre que el complejo de ligadura de las regiones variables de cadena pesada y las regiones variables de cadena liviana retengan su actividad fijadora de antígeno . Además, la región se puede quimerizar o humanizar. En la presente, el término "funcionalmente equivalente" significa que el anticuerpo de interés tiene una actividad equivalente al anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR 1 , 2 y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 7, 8 y 9, o una región variable de cadena liviana que comprende CDR 1 , 2 y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 0, 1 1 y 1 2 (por ejemplo, actividad fijadora de HLA-A, actividad inductora de muerte celular, o similar).

Los métodos para preparar polipéptidos funcionalmente equivalentes a cierto polipéptido son bien conocido por los expertos en la técnica e incluyen métodos para introducir mutaciones en polipéptidos. Por ejemplo, un experto en la técnica puede preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente a un anticuerpo de la presente invención al introducir mutaciones adecuadas en el anticuerpo mediante mutagénesis dirigida a sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al. ( 1 995) Gene 1 52, 271 -275; Zoller, MJ , y Smith , M . ( 1 983) Methods Enzymol . 1 00, 468-500; Kramer, W. et al. ( 1 984) Nucleic Acids Res. 12, 9441 -9456; Kramer W, y Fritz HJ( 1 987) Methods. Enzymol . 1 54, 350-367 ; Kunkel , TA (1 985) Proc Nati . Acad . Sci . USA. 82 , 488-492; Kunkel ( 1 988) Methods Enzymol . 85, 2763-2766). Las mutaciones de aminoácidos también pueden ocurrir naturalmente. En consecuencia, los anticuerpos de la presente invención también comprenden anticuerpos funcionalmente equivalentes a los anticuerpos de la presente invención , en donde los anticuerpos comprenden secuencias de aminoácidos con una o más mutaciones de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de la presente invención. La cantidad de aminoácidos mutados no está particularmente limitada, pero generalmente es de 30 aminoácidos o menos, de preferencia 1 5 aminoácidos o menos, y con mayor preferencia 5 aminoácidos o menos (por ejemplo, 3 aminoácidos o menos). De preferencia, los aminoácidos mutados conservan las propiedades de la cadena lateral de aminoácido respecto de los aminoácidos mutados. Los ejemplos de propiedades de cadenas laterales de aminoácidos incluyen: aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y y V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S y T), aminoácidos que comprenden las siguientes cadenas laterales: cadenas laterales alifáticas (G, A, V, L, I y P); cadenas laterales que contienen hidroxilo (S, T e Y); cadenas laterales que contienen azufre (C y M); cadenas laterales que contienen ácido carboxílico y amida (D, N, E y Q); cadenas laterales básicas (R, K y H); y cadenas laterales que contienen anillos aromáticos (H, F, Y y W) (los aminoácidos se representan con códigos de una letra entre paréntesis). Es sabido que los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos modificada, en la cual uno o más residuos de aminoácido se elimina, añade y/o sustituye con otros aminoácidos, retienen sus actividades biológicas originales (Mark, D. F. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500; Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland, G. er al., Proc. Nati. Acad. Sci. (1982) USA 79, 6409-6413). Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos en los cuales se han añadido varios residuos de aminoácido a una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de la presente invención. Las proteínas de fusión en las cuales dichos anticuerpos están fusionados con otros péptidos o proteínas también están incluidas en la presente invención. Se puede preparar una proteína de fusión por ligadura de un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención y un polinucleótido que codifica otro péptido o polipéptido de manera tal que coincidan los marcos de lectura, su inserción en un vector de expresión, y expresar la construcción fusionada en un huésped . Con este fin existen técnicas disponibles conocidas por los expertos en la técnica. Los péptidos o polipéptidos a fusionar con un anticuerpo de la presente invención incluyen , por ejemplo, FLAG (Hopp, T. P. et al. , Biotechnology ( 1 988) 6, 1204-1 21 0), 6x His que consiste en seis residuos de His (histidina), 1 0x His, hemaglutinina de gripe (HA), fragmento c-myc humano, fragmento VSV-GP, fragmento p1 8H IV, rótulo T7, rótulo HSV, rótulo E, fragmento de antígeno SV40T, rótulo Ick, fragmento de a-tubulina, rótulo B, fragmento de proteína C, y similares. Los ejemplos de otros polipéptidos a ser fusionados con los anticuerpos de la presente invención incluyen , GST (glutatión-S-transferasa), HA (hemaglutinina de gripe), región constante de inmu noglobulina , ß-galactosidasa, MB P (proteína fijadora de maltosa), y similares. Los polinucleótidos disponibles en el comercio que codifican estos péptidos o polipéptidos se pueden fusionar con polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la presente invención . El polipéptido de fusión se puede preparar por expresión de la construcción de fusión .

Además, la presente invención también provee anticuerpos que se fijan a los mismos epitopos que los epitopos a los cuales se fijan los anticuerpos descritos en la solicitud de la presente invención. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos que reconocen los mismos epitopos que los epitopos reconocidos por los anticuerpos de la presente invención , y sus usos. Dicho anticuerpo se puede obtener, por ejemplo, por los siguientes métodos. Se puede confirmar si un anticuerpo de prueba se fija al mismo epitopo que el epitopo con el cual se fija cierto anticuerpo, es decir, que un epitopo es compartido por un anticuerpo de prueba y cierto anticuerpo por competencia entre los dos anticuerpos por el mismo epitopo. En la presente invención, la competencia entre anticuerpos se puede detectar por FACS, ensayo de bloqueo cruzado, o similares. En FACS , un anticuerpo monoclonal se fija primero a las células que expresan HLA-IA en su superficie y se mide la señal fluorescente. Luego, después de hacer reaccionar un candidato de anticuerpo competitivo con las células, un anticuerpo de la presente invención se hace reaccionar con las mismas células y todo se analiza por FACS de manera similar. Alternativamente, un anticuerpo monoclonal de la presente invención y un anticuerpo competitivo de prueba se pueden hacer reaccionar con las mismas células al mismo tiempo. Si el patrón de análisis FACS del anticuerpo de la presente invención cambia cuando se hace reaccionar el anticuerpo competitivo con las células, se puede confirmar que el anticuerpo competitivo y el anticuerpo de la presente invención reconocen el mismo epitopo. Además, el ensayo competitivo por ELISA, por ejemplo, es un ensayo de bloqueo cruzado de preferencia. Más específicamente, en un ensayo de bloqueo cruzado, las células que expresan HLA-IA se fijan a las cavidades de una placa de microtitulación . Después de la preincubación con o sin un anticuerpo candidato competitivo, se añade un anticuerpo monoclonal de la presente invención . La cantidad del anticuerpo de la presente invención fijada a las células que expresan HLA-IA en las cavidades es inversamente proporcional a la capacidad de fijación del anticuerpo candidato competitivo (anticuerpo de prueba) que compite por la fijación al mismo epitopo. Más específicamente, cuanto mayor es la afinidad del anticuerpo de prueba por el mismo epitopo, menor cantidad el anticuerpo de la presente invención estará unida a las cavidades fijadas con las células que expresan proteína HLA-IA. En otras palabras, cuanto mayor sea la afinidad de un anticuerpo de prueba por el mismo epitopo, mayor cantidad del anticuerpo de prueba estará unida a las cavidades fijadas con las células que expresan proteína HLA-IA. La cantidad de anticuerpo que se fija a las cavidades se puede medir fácilmente por rotulado previo del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo marcado con biotina se puede medir con conjugado de avidina-peroxidasa y un sustrato adecuado. Los ensayos por bloqueo cruzado que utilizan rótulos de enzima tales como peroxidasas se denominan ensayos competitivos por ELISA, en particular. El anticuerpo se puede rotular con otras sustancias detectables o mensurables. Más específicamente, se conocen marcas radiactivas o fluorescentes. Además, cuando el anticuerpo de prueba comprende una región constante derivada de una especie diferente que la del anticuerpo de la presente invención , se puede medir cualquier anticuerpo fijado a las cavidades mediante un anticuerpo rotulado que reconozca específicamente la región constante derivada de cualquiera de las especies. I ncluso si el anticuerpo se deriva de la misma especie, si la clase es diferente, los anticuerpos fijados a las cavidades se pueden medir mediante un anticuerpo que distinga específicamente cada clase. Un anticuerpo candidato competitivo se considera un anticuerpo que se fija sustancialmente al mismo epitopo, o que compite por la fijación al mismo que el anticuerpo de la presente invención , si el anticuerpo candidato puede bloquear la fijación del anticuerpo monoclonal de la presente invención en al menos el 20% , de preferencia al menos el 20-50% , y con mayor preferencia al menos el 50% , comparado con la actividad de fijación obtenida en el experimento control realizado en ausencia del anticuerpo candidato competitivo. El anticuerpo que se fija al mismo epitopo que el epitopo al cual se fija el anticuerpo de la presente invención es, por ejemplo, el anticuerpo de [8] o [9] antes mencionado. Tal como se describió con anterioridad , el anticuerpo de [8] o [9] antes mencionado incluye no solo anticuerpos monovalentes sino también anticuerpos polivalentes. Los anticuerpos polivalentes de la presente invención incluyen anticuerpos polivalentes con los mismos sitios fijadores de antígeno, los anticuerpos polivalentes con sitios de fijación de antígeno parcialmente o completamente diferentes.

Tal como se describe más adelante, los anticuerpos de la presente invención pueden diferir en secuencia de aminoácidos, peso molecular y punto isoeléctrico, y también pueden ser diferentes en cuanto a presencia o ausencia de cadenas de azúcares y conformación , según la célula o huésped que produce el anticuerpo o el método de purificación. Sin embargo, siempre que el anticuerpo obtenido sea funcionalmente equivalente a un anticuerpo de la presente invención , se incluye en la presente invención . Por ejemplo, cuando un anticuerpo de la presente invención se expresa en una célula procarionte tal como E. coli, se añade un residuo de metionina al N terminal de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original . Los anticuerpos de la presente invención también incluyen dichos anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos conjugados fijados a diversas moléculas, incluso, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), sustancias radiactivas y toxinas.

Dichos anticuerpos conjugados se pueden obtener por modificación química de los anticuerpos obtenidos. Los métodos para la modificación de anticuerpo ya han sido establecidos en este campo (ver por ejemplo, los documentos US505731 3 y US51 56840). En consecuencia, el término "anticuerpo" tal como se usa en la presente incluye dichos anticuerpos conjugados. Los anticuerpos de ratón , los anticuerpos de rata , los anticuerpos de conejo, los anticuerpos de oveja, los anticuerpos de camello, los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos humanos, y similares se pueden usar según necesidad como anticuerpos de la presente invención . Además, los anticuerpos de bajo peso molecular y similares se pueden usar como anticuerpos de la presente invención . Para los anticuerpos de la presente invención se pueden usar anticuerpos modificados genéticamente producidos por incorporación de un gen de anticuerpo en un vector adecuado e introducir este vector en un huésped mediante técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, ver Cari , A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, TH ERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODI ES, publicado en el Reino Unido por MACM I LLAN PUBLI SH ERS LTD, 1 990). Más específicamente, cuando se obtienen ADN que codifican regiones variables de cadena pesada que comprenden CDR 1 , 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D N O: 7, 8 y 9, o regiones variables de cadena liviana que comprenden CDR 1 , 2 y 3 que consisten en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO: 1 0, 1 1 y 1 2 , se fijan a un ADN que codifica una región constante de anticuerpo (región C) y este luego es incorporado en un vector de expresión . Alternativamente, un ADN que codifica una región de anticuerpo variable se puede incorporar en un vector de expresión que comprende un ADN de una región de anticuerpo constante. El ADN se incorpora en el vector de expresión de manera tal que se expresa bajo el control de una región reguladora de expresión (mejorador o promotor). El anticuerpo luego se puede expresar por transformación de células huésped mediante este vector de expresión . La presente invención también provee polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la presente invención o polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas a los polinucleótidos de la presente invención y codifican anticuerpos con una actividad equivalente a la de los anticuerpos de la presente invención . Los polinucleótidos de la presente invención son pol ímeros que comprenden múltiples bases nucleicas o pares de bases de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y no están particularmente limitados, siempre que codifiquen los anticuerpos de la presente invención . Los polinucleótidos de la presente invención también pueden contener nucleótidos no naturales. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para expresar anticuerpos mediante técnicas de ingeniería genética . Además, se pueden usar como sondas en la búsqueda de anticuerpos funcionalmente equivalentes a los anticuerpos de la presente invención . Específicamente, los ADN que se hibridan en condiciones rigurosas a los polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la presente invención , y codifican anticuerpos con una actividad equivalente a la de los anticuerpos de la presente invención , se pueden obtener mediante técnicas tales como la hibridación y la amplificación genética (por ejemplo, PCR), mediante un polinucleótido de la presente invención o una de sus porciones como sonda. Dichos ADN se incluyen en los polinucleótidos de la presente invención . Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los expertos en la técnica (Sambrook, J . et al. , Molecular Cloning 2nd ed . , 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989). Las condiciones de hibridación pueden incluir, por ejemplo, las de baja rigurosidad . Los ejemplos de condiciones de baja rigurosidad incluyen lavado poshibridación en 0, 1 x SSC y 0.1 % SDS a 42 °C, y de preferencia en 0.1 x SSC y 0.1 % SDS a 50 °C. Con mayor preferencia, las condiciones de hibridación incluyen las de alta rigurosidad . Las condiciones de alta rigurosidad incluyen , por ejemplo, lavado en 5x SSC y 0.1 % SDS a 65 °C. En estas condiciones, cuanto mayor es la temperatura, mayor es la esperanza de obtener un polinucleótido con alta homología. No obstante, diversos factores tales como temperatura y concentración salina pueden incluir sobre la rigurosidad de la hibridación , y los expertos en la técnica podrán seleccionar de manera adecuada estos factores, a fin de obtener rigurosidades similares. Un anticuerpo codificado por un polinucleótido obtenido por hibridación y técnica de amplificación génica, y que es funcionalmente equivalente a un anticuerpo de la presente invención , generalmente tiene gran homología con la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la presente invención . Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos que son funcionalmente equivalentes y que tienen alta homología de secuencia de aminoácidos con los anticuerpos de la presente invención . El término "gran homología" significa generalmente identidad en el nivel de aminoácidos de al menos el 50% o superior, de preferencia 75% o superior, con mayor preferencia 85% o superior, con mayor preferencia aun 95% o superior. La homolog ía de polipéptido se puede determinar mediante el algoritmo descrito en Wilbur, W. J . y Lipman , D. J . Proc. Nati . Acad . Sci . USA 80, 726-730 ( 1 983). Los ejemplos preferidos de polinucleótidos que codifican los anticuerpos de la presente invención incluyen los polinucleótidos de (a) y (b): (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 , 3 ó 5; o (b) un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido de (a) y que codifica un anticuerpo con una actividad equivalente al anticuerpo de la presente invención . Se pueden usar combinaciones adecuadas de huésped y vector de expresión cuando se produce un anticuerpo al aislar primero el gen del anticuerpo y luego introducirlo en un huésped adecuado . La presente invención provee vectores que comprenden los polinucleótidos antes mencionados. Los vectores incluyen , por ejemplo, los vectores M 1 3, los vectores pUC, pBR322, pBluescript y pCR-Script. Además de los vectores anteriores, también se pueden usar, por ejemplo, pGEM-T, pDI RECT y pT7 para la subclonación y la excisión de cADN . Cuando se usan vectores para producir los anticuerpos de la presente invención , son particularmente útiles los vectores de expresión. Cuando un vector de expresión se expresa en E. coli, por ejemplo, debería tener las características anteriores a fin de ser amplificado en E. coli. Además, cuando se usan E. coli tales como JM109, DH5a, HB101 o XL1-Blue como célula huésped, el vector necesariamente tiene un promotor, por ejemplo, un promotor lacZ (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546; (1992) FASEB J. 6:2422-2427), un promotor araB (Better et al. (1988) Science 240:1041-1043) o un promotor T7, a fin de permitir la expresión eficiente del gen deseado en E. coli. Otros ejemplos de los vectores incluyen pGEX-5x-1 (Pharmacia), "sistema de expresión QIA" (QIAGEN), pEGFP y pET (en donde de preferencia se usa como huésped BL21, una cepa que expresa T7 ARN-polimerasa). Además, el vector puede comprender una secuencia señal para la secreción de polipéptido. Cuando se producen proteínas en el periplasma de E. coli, se puede usar la secuencia señal B (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. 169:4379 (1987)) como secuencia señal de secreción de proteína. Por ejemplo, se pueden usar los métodos de cloruro de calcio o de electroporación para introducir el vector en una célula huésped. Además de los vectores de expresión de E. coli, también se pueden usar los vectores de expresión derivados de mamíferos (por ejemplo, pcADN3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. (1990) 18(17):5322), pEF, pCDM8), células de insectos (por ejemplo, "sistema de expresión de baculovirus Bac-to-BAC" (GIBCO-BRL), pBacPAK8), plantas (por ejemplo, pMH1, pMH2), virus animales (por ejemplo, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus (por ejemplo, pZIPneo), levaduras (por ejemplo, "kit de expresión Pichia" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) y Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608, pKTH50) como vectores para producir los polipéptidos de la presente invención. A fin de expresar proteínas en células animales tales como células CHO, COS y NIH3T3, el vector necesariamente tiene un promotor necesario para la expresión en tales células, por ejemplo, un promotor SV40 (Mulligan et al. (1979) Nature 277:108), un promotor MMLV-LTR, un promotor EF1a (Mizushima et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:5322), un promotor CMV, etc.). Es aun más preferible que el vector también porte un gen marcador para seleccionar transformantes (por ejemplo, un gen resistente a fármacos que permita la selección por un fármaco tal como neomicina y G418). Los ejemplos de vectores con tales características incluyen pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13, y similares. Además, para expresar en forma estable un gen y amplificar la cantidad de copias del gen en las células, se pueden introducir células CHO con una vía de síntesis defectuosa de ácidos nucleicos con un vector que contiene un gen DHFR (por ejemplo, pCHOl) para compensar el defecto, y la cantidad de copias se puede amplificar mediante metotrexato (MTX). Alternativamente, una célula COS, portadora de un gen que expresa el antígeno SV40 T en su cromosoma, se puede transformar con un vector que contiene el origen de replicación SV40 (por ejemplo, pcD) para la expresión transitoria del gen. El origen de replicación se puede derivar de virus de polioma, adenovirus, virus de papelona bovino (BPV), y similares. Además, para aumentar la cantidad de copias en las células huésped , el vector de expresión puede contener, como marcador de selección , un gen de una aminoglucósido transferasa (APH ), un gen de timidina quinasa (TK), un gen de xantina-guaninfosforribolistransferasa de E. coli (Ecogpt), un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), y similares. Los métodos para expresar polinucleótidos de la presente invención en cuerpos animales incluyen métodos para incorporar los polinucleótidos de la presente invención en vectores apropiados e introducirlos en cuerpos vivos, por ejemplo, mediante un método de retrovirus, un método de liposomas, un método de liposomas catiónicos o un método de adenovirus. Los vectores usados incluyen vectores de adenovirus (por ejemplo, pAdexlcw) y vectores de retrovirus (por ejemplo, pZIPneo), pero sin limitaciones. Las manipulaciones genéticas generales tales como la inserción de polinucleótidos de la presente invención en vectores se pueden llevar a cabo de acuerdo con métodos convencionales (Molecular Cloning , 5.61 -5.63). La administración a organismos vivos se puede llevar a cabo por métodos ex vivo o in vivo. Además, la presente invención provee células huésped en los cuales se introduce un vector de la presente invención. Las células huésped no son particularmente limitadas; por ejemplo, están disponibles para este fin células de E. coli y diversas animales. Las células huésped de la presente invención se pueden usar, por ejemplo, como sistemas de producción para producir y expresar los anticuerpos de la presente invención. Los sistemas de producción in vitro e in vivo están disponibles para sistemas de producción de polipéptidos. Los sistemas de producción que utilizan células eucariontes o células procariontes son ejemplos de sistemas de producción in vitro. Las células eucariontes que se pueden usar incluyen , por ejemplo, células animales, células vegetales y células fúngicas. Las células animales conocidas incluyen : células de mam íferos, por ejemplo, CHO (J . Exp. Med . ( 1 995)1 08, 945), COS , N I H3T3, mieloma, B HK (riñon de hámster bebé), HeLa, Vero, células de anfibios tales como oocitos de Xenopus laevis (Valle, et al. ( 1 981 ) Nature 291 , 358-340), o células de insectos (por ejemplo, Sf9, Sf21 , y Tn5). Las células CHO en las cuales se eliminó el gen DHFR, tales como dhfr-CHO (Proc. Nati . Acad. Sci . USA ( 1 980) 77, 421 6-4220) y CHO K-1 (Proc. Nati . Acad . Sci . USA ( 1 968) 60, 1 275), son particularmente preferidas para el uso como células CHO. De las células animales, las células CHO son particularmente favorable para la expresión en gran escala. Los vectores se pueden introducir en una célula huésped , por ejemplo, por el método de fosfato de calcio, el método DEAE-dextrano, el método que usa ribosoma catiónico DOTAP (Boehringer-Mannheim), métodos de electroporación , métodos de lipofección, etc. Las células vegetales que incluyen , por ejemplo, células derivadas de Nicotiana tabacum, son conocidas como sistemas de producción de polipéptido. Los callos se pueden cultivar a partir de estas células. Las células fúngicas conocidas incluyen células de levaduras, por ejemplo, del género Saccharomyces, tales como Saccharomyces cerevisiae; y hongos filamentosos, por ejemplo , del género Aspergillus tales como Aspergillus niger. Las células bacterianas se pueden usar en sistemas de producción procariontes. Los ejemplos de células bacterianas incluyen E. coli (por ejemplo, JM 109, DH5a, HB101 y similares); y Bacillus subtilis. Los anticuerpos se pueden obtener por transformación de las células con un polinucleótido de interés, y luego cultivar dichos transformantes in vitro. Los transformantes se pueden cultivar mediante métodos conocidos. Por ejemplo, se puede usar DM EM , M EM , RPM I 1 640 o I MDM como medio de cultivo para células animales y se pueden usar con o sin suplementos séricos tales como suero fetal bovino (FCS). Los cultivos sin suero también son aceptables. El pH de preferencia es de aproximadamente 6 a 8 durante el curso del cultivo. Generalmente se lleva a cabo la incubación a una temperatura de aproximadamente 30 a 40 °C durante aproximadamente 1 5 a 200 horas. El medio se cambia, se airea o se agita, según necesidad . Por otra parte, se pueden usar sistemas de producción que utilizan huéspedes animales o vegetales como sistemas para producir polipéptidos in vivo. Por ejemplo, un polinucleótido de interés se puede introducir en un animal o planta , y luego se recupera el polipéptido producido en el cuerpo del animal o planta. Los "huéspedes" de la presente invención incluyen dichos animales y plantas. Cuando se usan animales hay sistemas de producción que utilizan mamíferos o insectos. Se pueden usar mam íferos tales como cabras, cerdos, ovejas, ratones y bovinos (Vicki Glaser SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). Alternativamente, los mamíferos pueden ser animales transgénicos. Por ejemplo, un polinucleótido de interés se puede preparar como gen de fusión con un gen que codifica un polipéptido producido específicamente en leche, tal como el gen de ß-caseína de cabra. Los fragmentos de polinucleótido que contienen el gen de fusión se inyectan en embriones de cabra, que luego son introducidos otra vez en las cabras hembras. El anticuerpo deseado luego se puede obtener de la leche producida por las cabras transgénicas, nacidas de las cabras que recibieron los embriones o de su progenie. Se pueden administrar las hormonas adecuadas para aumentar la cantidad de leche que contiene el polipéptido producido por las cabras transgénicas (Ebert, K. M . et al. , Bio/Technology 1 2, 699-702 ( 1 994)). También se pueden usar insectos tales como gusanos de seda. Se pueden usar baculovirus portadores de un polinucleótido de interés para infectar gusanos de seda, y el anticuerpo de interés se puede obtener de sus fluidos corporales (Susumu , M . et al. , Nature 31 5, 592-594 ( 1985)). Cuando se usan plantas, se puede usar tabaco, por ejemplo. Cuando se usa tabaco, se puede insertar un polinucleótido de interés en un vector de expresión vegetal , por ejemplo, pMON 530, y luego se introduce el vector en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. La bacteria luego se usa para infectar tabaco, tal como Nicotiana tabacum, y se recuperan los polipéptidos deseados de las hojas (Julián K.-C. Ma et al. , Eur. J . Immunol . 24, 1 31 -1 38 ( 1 994)). El anticuerpo de la presente invención obtenido se puede aislar del interior o el exterior (por ejemplo del medio) de las células huésped , y se purifica como anticuerpo sustancialmente puro y homogéneo. Se puede usar cualquier método estándar de aislamiento y purificación de anticuerpos, y los métodos no están limitados a un método específico. Los anticuerpos se pueden aislar y purificar por selección de una combinación adecuada, por ejemplo , de columnas de cromatografía, filtración, ultrafiltración , extracción salina , precipitación de solvente, extracción por solvente, destilación, inmunoprecipitación , electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida, focalización isoeléctrica, diálisis, recristalización , y otras. La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía por afinidad , cromatografía por intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, filtración en gel , cromatografía de fase inversa , cromatografía por adsorción y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual . Ed Daniel R. Marshak eí al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 996). Estas cromatografías se pueden llevar a cabo mediante cromatografías de fase l íquida tales como H PLC y FPLC. Los ejemplos de columnas usadas en cromatografía por afinidad incluyen columnas de proteína A y columna de proteína G. Las columnas que utilizan columnas de proteína A incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) y similares. La presente invención también incluye anticuerpos altamente purificadas mediante estos métodos de purificación. En la presente invención , la actividad fijadora de antígeno de los anticuerpos preparados (Antibodies. A Laboratory Manual . Ed Harlow, David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1 988) se puede medir mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, se pueden usar ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzimas), EIA (enzimoinmunoensayo), RIA (radioinmunoensayo), o fluoroinmunoensayo. La presente invención provee métodos de producción de anticuerpos que comprenden las etapas de producir el antes mencionado polinucleótido, producir un vector que comprende el polinucleótido, introducir el vector en células huésped y cultivar las células huésped . Alternativamente, en la presente invención se pueden usar anticuerpos recombinantes genéticamente modificados artificialmente, tales como anticuerpos quiméricos y humanizados, para reducir la antigenicidad heteróloga contra humanos y similares. Estos anticuerpos modificados se pueden producir mediante métodos conocidos. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo que comprende las regiones variables de cadenas livianas y pesadas de un anticuerpo proveniente de un mamífero no humano tal como un ratón, y las regiones constantes de cadenas livianas y pesadas de un anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico se puede producir por ligadura de un ADN que codifica una región variable de anticuerpo de ratón con un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano, lo incorpora en un vector de expresión y luego introduce el vector en un huésped. Los anticuerpos humanizados también se denominan "anticuerpos humanos reformados". Dichos anticuerpos humanizados se obtienen por injerto de la región determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de un mam ífero no humano, por ejemplo, un ratón , al CDR de un anticuerpo humano, y también se conocen dichos procedimientos generales de recombinación de genes. Específicamente, una secuencia de ADN diseñada para ligar un anticuerpo CDR de ratón a la región de marco (FR) de un anticuerpo humano es sintetizada por PCR, mediante diversos oligonucleótidos producidos para contener porciones superpuestas en las regiones terminales. El ADN obtenido se une a un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano, y esta luego se integra en un vector de expresión, y el anticuerpo se produce al introducir este vector en un huésped (ver solicitud de patente europea EP 239400 y solicitud de patente internacional WO 96/02576). El anticuerpo humano FR ligado por CDR se selecciona de manera tal que el CDR forma un sitio de fijación de antígeno favorable. A fin de que el CDR del anticuerpo humano reformado para formar un sitio de fijación de antígeno adecuado, los aminoácidos de la región marco de la región variable del anticuerpo se deben sustituir según sea necesario (Sato, K. et al. , 1 993, Cáncer Res. 53, 851 -856). Los métodos para obtener anticuerpos humanos también son conocidos. Por ejemplo, los linfocitos humanos se pueden sensibilizar in vitro con un antígeno deseado o con células que expresan un antígeno deseado, y los linfocitos sensibilizados se pueden fusionar con células de mieloma humano tales como U266, a fin de obtener el anticuerpo humano deseado con actividad fijadora de antígeno (ver publicación de solicitud de patente japonesa Kokoku N .° (JP-B) Hei 1 -59878 (publicación de solicitud de patente japonesa examinada, aprobada para oposición)). Además, se puede obtener un anticuerpo humano deseado mediante el uso de un antígeno deseado para inmunizar animales transgénicos con el repertorio completo de genes de anticuerpo humano (ver solicitudes de patentes internacionales WO 93/1 2227, WO 92/0391 8, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735). Además, también son conocidas las técnicas para obtener anticuerpos humanos por paneo mediante una biblioteca de anticuerpos humanos. Por ejemplo, las regiones variables de anticuerpos humanos se pueden expresar como anticuerpos de cadena única (scFvs) en la superficie de fagos que utilizan métodos de despliegue de fagos, y se pueden seleccionar fagos que se fijan a antígenos. Las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de anticuerpos humanos que se fijan a los antígenos se pueden determinar por análisis de los genes de los fagos seleccionados. Al revelar las secuencias de ADN de los scFvs que se fijan a los antígenos, se pueden producir vectores de expresión adecuados portadores de las secuencias para obtener anticuerpos humanos. Estos métodos ya son conocidos y se puede referir a las siguientes publicaciones: WO 92/01 047, WO 92/20791 , WO 93/0621 3, WO 93/1 1236, WO 93/1 91 72 , WO 95/01 438 y WO 95/1 5388. Los anticuerpos de la presente invención de preferencia son anticuerpos que reconocen antígeno leucocitario humano (HLA). Los anticuerpos de la presente invención que reconocen antígeno leucocitario humano (HLA) son útiles porque tienen actividad mejorada. En la presente, "actividad" se refiere a una acción biológica que se origina como consecuencia de una fijación antígeno-anticuerpo. Los ejemplos específicos de acción biológica incluyen inducción de muerte celular, inducción de apoptosis, supresión de crecimiento celular, supresión de diferenciación celular, supresión de división celular, inducción de crecimiento celular, inducción de diferenciación celular, inducción de división celular y regulación del ciclo celular, y similares. Se prefieren la inducción de la muerte celular y la supresión del crecimiento celular. Las células que se transforman en objetivo de las acciones antes mencionadas, tales como inducción de muerte celular y supresión de crecimiento celular, no tienen limitaciones particulares, aunque se prefieren las células hematopoyéticas y las células no adherentes. Los ejemplos específicos de células hematopoyéticas incluyen linfocitos (células B , células T), neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monolitos (de preferencia células mononucleares activadas de sangre periférica (PBMC)) y células tumorales hematopoyéticas (células de mieloma, células de linfoma y células de leucemia), y de preferencia son linfocitos (células B , células T, células B activadas y células T activadas), particularmente células B activadas o células T activadas, y con mayor preferencia células tumorales hematopoyéticas. Las "células no adherentes" se refieren a células que cuando se cultivan crecen en un estado no adherente, sin adherirse a la superficie de los recipientes de cultivo tales como vidrio o plástico. Los ejemplos preferidos de células no adherentes en la presente invención incluyen células Jurkat y células ARH77. Por otra parte, "células adherentes" se refiere a células que, cuando se cultivan, se adhieren a la superficie de los recipientes de cultivo tales como vidrio o plástico. En general , un anticuerpo anti-HLA de longitud total puede formar enlaces cruzados con un anticuerpo anti-lgG o similar para exhibir actividad inductora de muerte celular mejorada, y el enlace cruzado puede ser realizado por los expertos en la técnica mediante métodos conocidos. Se puede determinar si los anticuerpos de la presente invención inducirán muerte celular en las células no adherentes por observación de inducción de muerte celular en células Jurkat o células ARH77. Se puede determinar si los anticuerpos inducirán muerte celular en células adherentes por observación de inducción de muerte celular en células HeLa (documento WO 2004/033499). En la presente invención, la administración del anticuerpo que reconoce a HLA antes mencionado puede tratar o prevenir enfermedades tales como tumores, incluso tumores hematopoyéticos (los ejemplos específicos incluyen leucemia; síndrome mielodisplásico; linfoma maligno; leucemia mielógena crónica; trastornos de plasmocitos tales como mieloma, mieloma múltiple y macroglobulinemia; y enfermedades mieloproliferativas tales como policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis idiopática; y similares) y enfermedades autoinmunitarias (los ejemplos específicos incluyen reumatismo, hepatitis autoinmune, tiroiditis autoinmune, bulosis autoinmune, enfermedad adrenocortical autoinmune, anemia hemol ítica autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, gastritis atrófica autoinmune, neutropenia autoinmune, orquitis autoinmune, encefalomielitis autoinmune, enfermedad de receptor autoinmune, infertilidad autoinmune, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, enfermedad de Basedow, diabetes juvenil , enfermedad de Addison, miastenia grave, uveítis producida por lentes, psoriasis y enfermedad de Behcet). Además, la excelente estabilidad de los anticuerpos de la presente invención in vivo sería particularmente eficaz cuando se administra a sujetos vivos. En la presente invención , HLA se refiere a antígeno leucocitario humano. Las moléculas HLA se categorizar en clase I y clase I I . Los ejemplos conocidos de clase I son HLA-A, B , C, E , F, G , H , J y similares; y los ejemplos conocidos de clase I I son HLA-DR, DQ, DP y similares. Los antígenos reconocidos por los anticuerpos de la presente invención no tienen limitaciones particulares, siempre que sean moléculas H LA, y de preferencia moléculas clasificadas como HLA clase I , y con mayor preferencia HLA-IA. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos de bajo peso molecular. En la presente invención , los anticuerpos de bajo peso molecular incluyen fragmentos de anticuerpo en los cuales falta parte de un anticuerpo entero (por ejemplo, IgG entero) y no tienen limitaciones particulares siempre que tengan capacidad fijadora de antígeno. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención no tienen limitaciones particulares siempre que sean parte de un anticuerpo entero. Sin embargo, se prefieren los fragmentos que comprenden regiones variables de cadena pesada (VH) o regiones variables de cadena liviana (VL), y se prefieren particularmente los fragmentos que comprenden VH y VL. Los ejemplos específicos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab' , F(ab' )2, Fv, scFv (Fv monocatenario), sc(Fv)2 y similares, pero de preferencia son diacuerpos (Huston , J. S . et al. , Proc. Nati . Acad. Sci . U .S. A. ( 1 988) 85, 5879-5883; Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol .1 1 3, Resenburg y Moore ed. , Springer Verlag, Nueva York, pp.269-31 5, ( 1 994)). Dichos fragmentos de anticuerpo se pueden obtener por tratamiento de un anticuerpo con enzimas tales como papaína o pepsina para producir fragmentos de anticuerpo, o por construcción de genes que codifican dichos fragmentos de anticuerpo, su introducción en un vector de expresión, y luego la expresión den una célula huésped adecuada (ver por ejemplo, Co, M. S. ef al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. y Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. y Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). El peso molecular del anticuerpo de bajo peso molecular de la presente invención de preferencia es inferior al de todo el anticuerpo, pero se pueden formar multímeros tales como dímeros, trímeros y tetrámeros, y el peso molecular puede ser superior al peso molecular de todo el anticuerpo. Los anticuerpos de bajo peso molecular de la presente invención de preferencia es un anticuerpo que comprende dos o más VH y dos o más VL de un anticuerpo, y estas regiones variables están ligadas en forma directa o indirecta mediante ligadores o similares. Los enlaces pueden ser enlaces covalentes, enlaces no covalentes, enlaces covalentes y no covalentes. Un anticuerpo de bajo peso molecular de mayor preferencia es un anticuerpo que comprende dos o más pares VH-VL formados al ligar VH y VL con un enlace no covalente. En este caso, se prefiere un anticuerpo de bajo peso molecular con una menor distancia entre un par de VH-VL y el otro par VH-VL que la distancia en todo el anticuerpo . En la presente invención , se obtiene scFv al ligar una región V de cadena H de anticuerpo con una región V de cadena L de anticuerpo . En este scFv , la región V de la cadena H y la región V de la cadena L se ligan a través de un ligador, de preferencia a través de un ligador peptídico (Huston , J . S . ef al. , Proc. Nati . Acad . Sci . U . S . A. ( 1 988 ) 85 , 5879-5883). La región V de la cadena H y la región V de la cadena L de scFv se pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. Por ejemplo , se puede usar cualquier péptido monocatenario que consiste en 1 2 a 1 9 residuos de ami noácido como péptido l igador para ligar las regiones V. Los ADN que codifican scFv se pueden obtener mediante una plantilla , ADN que codifican la cadena H del anticuerpo o la región V de la cadena H y la cadena L del anticuerpo lo la región V de la cadena L antes mencionada, y entre estas secuencias , al amplificar una porción de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos por PCR med iante un par de cebadores que define sus dos extremos; y luego realizar una posterior amplificación mediante una combinación de un ADN que codifica la porción l igadora del péptido , y el par cebador que defines ambos extremos del ADN ligador que se liga a la cadena H y la cadena L, respectivamente. Una vez que se construye el ADN que codifica scFv , se pued e obtener un vector de expresión que contiene el ADN , y un huésped transformado con el vector de expresión de acuerdo con métodos convencionales . Además, se puede obtener scFvs mediante estos huéspedes de acuerdo con métodos convencionales. Estos fragmentos de anticuerpo se pueden producir en huéspedes al obtener sus genes y expresarlos de manera similar a la antes descrita. Estos fragmentos de anticuerpo se incluyen en los "anticuerpos" de la presente invención. Los anticuerpos de bajo peso molecular de particular preferencia en la presente invención son diacuerpos. Los diacuerpos son dímeros formados al ligar dos fragmentos (por ejemplo scFvs; en adelante referidos como fragmentos constituyentes de diacuerpo), en donde una región variable se liga a otra región variable mediante un ligador o similar. En general, los diacuerpos comprenden dos VL y dos VH (P. Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993); EP 404097; WO 93/11161; Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991); Holliger ef al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996); Perisic ef al., Structure, 2, 1217-1226, (1994); John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999); Holliger et al,. Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 90, 6444-6448, (1993); Atwell ef al., Mol. Immunol.33, 1301-1312, (1996)). Los enlaces entre fragmentos constituyentes de diacuerpos pueden ser enlaces no covalentes o covalentes, pero de preferencia son enlaces no covalentes. Alternativamente, los fragmentos constituyentes de diacuerpo se pueden ligar entre sí mediante un ligador y similar para formar un diacuerpo monocatenario (ver diacuerpo). En tal caso, la ligadura de fragmentos que constituyen diacuerpos mediante un ligador largo de aproximadamente 20 aminoácidos permite que fragmentos que constituyen diacuerpos en la misma cadena formen dímeros entre sí a través de enlaces no covalentes. Los fragmentos que constituyen diacuerpos incluyen los que tienen ligaduras entre VL-VH , VL-VL y VH-VH , y de preferencia son los que tienen ligaduras entre VH-VL. En los fragmentos que constituyen diacuerpos, el ligador usado para ligar una región variable con una región variable no tiene limitaciones particulares, pero es de preferencia un ligador lo suficientemente corto para impedir enlaces no covalentes entre regiones variables en el mismo fragmento. La longitud de dicho ligador puede ser determinada de manera adecuada por los expertos en la técnica, y generalmente es de 2 a 1 4 aminoácidos, de preferencia 3 a 9 aminoácidos, y con mayor preferencia 4 a 6 aminoácidos. En este caso, los ligadores entre VL y VH codificados en el mismo fragmento son cortos, y en consecuencia los VL y VH en la misma cadena n o forman un enlace no covalente y en consecuencia no se formará un fragmento de región V monocatenario. Más bien, un fragmento forma un dímero con otro fragmento mediante un enlace no covalente. Además, de acuerdo con el mismo principio de construcción de diacuerpo , tres o más fragmentos que constituyen diacuerpos se pueden ligar para formar anticuerpos multiméricos tales como trímeros y tetrámeros. Los ejemplos de los diacuerpos de la presente invención incluyen, sin limitaciones, un diacuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6; un diacuerpo que es funcionalmente equivalente a un diacuerpo que comprende la secuencia de SEQ I D NO: 6 y que tiene una secuencia de aminoácidos con una o más mutaciones de aminoácido (sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones) en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6; un diacuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de los CDR (o regiones variables) de SEQ I D NO: 2 y SEQ I D NO: 4; y un diacuerpo que es funcionalmente equivalente a un diacuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de los CDR (o regiones variables) de SEQ I D NO: 2 y SEQ I D NO: 4, y tiene una secuencia de aminoácidos con mutaciones de aminoácidos (sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones) en las secuencias de aminoácidos de los CDR (o regiones variables) de SEQ I D NO: 2 y SEQ ID NO: 4. En la presente, "funcionalmente equivalente" significa que el diacuerpo de interés tiene una actividad equivalente a la de un diacuerpo que comprende la secuencia de SEQ I D NO: 6, o la de un diacuerpo que comprende las secuencias de los CDR (o regiones variables) de SEQ I D NO: 2 y SEQ I D NO: 4 (por ejemplo, actividad fijadora de HLA-A, y actividad inductora de muerte celular). La cantidad de aminoácidos mutados no tiene limitaciones particulares, pero generalmente es de 30 aminoácidos o menos, de preferencia 1 5 aminoácidos o menos, y con mayor preferencia cinco aminoácidos o menos (por ejemplo, tres aminoácidos o menos). Además, un diacuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6, o un diacuerpo que comprende las secuencias de los CDR (o regiones variables) de SEQ I D NO: 2 y SEQ I D NO: 4 se puede humanizar o quimerizar para reducir la antigenicidad heteróloga contra humanos. En la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2, los aminoácidos 1 a 125 corresponden a la región variable, los aminoácidos 31 a 35 corresponden a CDR1 (SEQ I D NO: 7), los aminoácidos 50 a 66 corresponden a CDR2 (SEQ I D NO: 8) y los aminoácidos 99 a 1 14 corresponden a CDR3 (SEQ I D NO: 9). En la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4, los aminoácidos 1 a 1 07 corresponden a la región variable, los aminoácidos 24 a 34 corresponden a CDR1 (SEQ I D NO: 1 0), los aminoácidos 50 a 56 corresponden a CDR2 (SEQ I D NO: 1 1 ) y los aminoácidos 89 a 97 corresponden a CDR3 (SEQ I D NO: 12). En la presente invención , los anticuerpos de bajo peso molecular que reconocen HLA se fijan específicamente a HLA, y sin limitaciones particulares, siempre que tengan actividades biológicas. Los anticuerpos de bajo peso molecular de la presente invención se pueden preparar por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos, los anticuerpos se pueden preparar sobre la base de la secuencia de un anticuerpo que reconoce HLA (particularmente, las secuencias de las regiones variables y CDR), mediante técnicas de ingeniería genética conocidas por los expertos en la técnica. Para la secuencia de anticuerpo que reconoce HLA se puede usar una secuencia de anticuerpo conocida. Alternativamente, se puede preparar un anticuerpo anti-HLA por un método bien conocido por los expertos en la técnica mediante HLA como antígeno, y luego se puede obtener y usar la secuencia de este anticuerpo. Específicamente, por ejemplo, esto se puede llevar a cabo como sigue: se usa la proteína HLA o su fragmento como antígeno sensibilizante para llevar a cabo la inmunización de acuerdo con métodos convencionales de inmunización , los inmunecitos obtenidos se fusionan con células progenitoras conocidas de acuerdo con métodos convencionales de fusión celular, y luego se analizan las células productoras de anticuerpo monoclonal (hibridomas) mediante métodos de búsqueda generales. Los antígenos se pueden preparar por métodos conocidos, tales como los métodos que utilizan baculovirus (documento WO 98/46777 y similares). Los hibridomas se pueden preparar de acuerdo con el método de Milstein et al. (Kohler, G . y Milstein, C , Methods Enzymol . ( 1981 ) 73:3-46), por ejemplo. Cuando un antígeno tiene baja inmunogenicidad se puede realizar la inmunización por fijación del antígeno a una macromolécula inmunogénica tal como albúmina. Luego se sintetizan, cADN de la región variable del anticuerpo (región V) a partir de los mARN de los hibridomas mediante transcriptasa inversa y se pueden determinar las secuencias de los cADN obtenidos mediante métodos conocidos. Los anticuerpos que reconocen HLA no tienen limitaciones particulares, siempre que fijen H LA. Se pueden usar anticuerpos de ratón , anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de oveja, anticuerpos humanos y similares según necesidad . Alternativamente, se pueden usar anticuerpos recombinantes modificados genéticamente por medios artificiales, por ejemplo anticuerpos quiméricos y humanizados, para reducir la antigenicidad heteróloga contra humanos. Estos anticuerpos modificados se pueden producir mediante métodos conocidos. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo que comprende las regiones variables de cadena liviana y de cadena pesada de un anticuerpo proveniente de un mam ífero no humano tal como ratón, y las regiones constantes de cadena pesada y liviana de un anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico se puede producir al ligar un ADN que codifica regiones variables de anticuerpo de ratón con un ADN que codifica regiones constantes de anticuerpo humano, lo incorpora en un vector de expresión y luego introduce el vector en un huésped . Los presentes inventores descubrieron que los anticuerpos de la presente invención inducen muerte celular. Sobre la base de este hallazgo, la presente invención provee agentes inductores de muerte celular e inhibidores de crecimiento celular que comprenden un anticuerpo de la presente invención como ingrediente activo. Los presentes inventores previamente descubrieron que diacuerpos preparados al reducir el peso molecular de un anticuerpo anti-HLA tienen efecto antitumoral contra un animal modelo de mieloma humano (documento WO 2004/033499). Además, se considera que la actividad inductora de muerte celular de los anticuerpos de la presente invención tiene efecto significativo, particularmente en células activadas o células B activadas. En consecuencia, los anticuerpos de la presente invención serían particularmente efectivos para tratar o prevenir tumores tales como cánceres (específicamente tumores hematopoyéticos) y enfermedades autoinmunitarias. La presente invención también provee agentes antitumorales o agentes terapéuticos contra enfermedades autoinmunitarias, que comprenden un anticuerpo de la presente invención como ingrediente activo. Además, la presente invención provee agentes inductores de muerte celular y agentes supresores de crecimiento celular que comprenden anticuerpos de la presente invención como ingrediente activo. Se considera que la actividad inductora de muerte celular de los anticuerpos en la presente invención tiene efecto particularmente notable sobre células T o células B activadas; en consecuencia , se considera particularmente efectivo para el tratamiento y la prevención de tumores tales como cáncer (particularmente tumores hematopoyéticos) y enfermedades autoinmunitarias. En consecuencia, la presente invención provee métodos para el tratamiento y la prevención que utilizan los anticuerpos de la presente invención para tumores tales como cáncer (particularmente tumores hematopoyéticos) y enfermedades autoinmunitarias. Cuando se usan anticuerpos cuyo peso molecular no se ha reducido como ingrediente activos, de preferencia forman enlaces cruzados con un anticuerpo anti-lgG y similares. Los agentes farmacéuticos de la presente invención se pueden usar en combinación con un interferón. El uso combinado de un anticuerpo anti-HLA clase I con interferón mejora notablemente las actividades de anticuerpo anti-HLA clase I tales como la inducción de muerte celular y similares (WO 2006/1 23724). Generalmente, interferón es un término genérico para las proteínas o glucoproteínas que tienen acción antiviral y es inducido a partir de células animales por virus, ARN bicatenario, lectina y similares. Además de la acción antiviral , los interferones tienen acción supresora del crecimiento celular y acción inmunorreguladora. Se categorizar en diversos tipos de acuerdo con las células que los producen, la capacidad de fijación a receptores específicos y las características biológicas y fisicoquímicas. Los principales tipos son a, ß y Y, y se conoce la existencia de otros tipos I FNw e I F N T . Además, se conoce la existencia de 20 o más subtipos de interferón a. Al momento, se han desarrollado no solo las formulaciones derivadas naturales, sino también diversas formulaciones de tipo genéticamente recombinante, tales como PEG-interferón e interferón de consenso y similares, que están disponibles en el comercio. El interferón de la presente invención puede ser cualquiera de los tipos antes mencionados, pero de preferencia es a o ?. Además, mientras que se mejore la inducción de muerte celular por anticuerpo anti-HLA clase I , el interferón de la presente invención puede ser cualquiera de los tipos derivados naturales, de los tipos recombinantes modificados genéticamente en forma artificial , los mutantes naturales existentes, las proteínas de fusión o sus fragmentos. Sin particular limitación , el interferón de la presente invención se puede derivar, por ejemplo, de humanos, chimpancés, orangutanes, perros, caballos, ovejas, cabras, burros, cerdos, gatos, ratones, cobayos, ratas, conejos o similares, o de otros mamíferos. El interferón de preferencia es un interferón derivado de humanos. En la presente invención, el uso combinado de los anticuerpos de la presente invención con un interferón significa administrar o usar (en adelante, referido simplemente como "administrar") los anticuerpos de la presente invención junto con un interferón , y no hay limitación en el orden de administración o el intervalo entre administraciones. El orden con el cual se administran un anticuerpo de la presente invención e interferón puede ser administrar un anticuerpo de la presente invención después de administrar interferón , administrar un anticuerpo de la presente invención e interferón al mismo tiempo, o administrar un anticuerpo de la presente invención antes de administrar interferón, pero de preferencia es administrar un anticuerpo de la presente invención después de administrar interferón, o administrar un anticuerpo de la presente invención e interferón al mismo tiempo, y con mayor preferencia es administrar un anticuerpo de la presente invención antes de administrar interferón. Cuando se administra un anticuerpo de la presente invención después de administrar interferón , el intervalo entre las administraciones de interferón y el anticuerpo de la presente invención no tiene limitaciones particulares, y se puede fijar en base a factores tales como la vía de administración y la forma de dosificación . Un ejemplo de intervalo de administración es generalmente de 0 horas a 72 horas, de preferencia 0 horas a 24 horas, y con mayor preferencia 0 horas a 1 2 horas. Un anticuerpo de la presente invención se puede preparar en una única composición farmacéutica con un interferón . Además, los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar en composiciones farmacéuticas caracterizadas por el uso combinado con un interferón . Los agentes farmacéuticos de la presente invención se pueden administrar en la forma de un compuesto farmacéutico, y se pueden administrar en forma oral o parenteral y sistémica o tópica. Por ejemplo, se puede seleccionar inyección intravenosa tal como infusión por goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal , inyección subcutánea, supositorio, infusión colónica o agente oral con cubierta entérica, y se puede seleccionar un método de administración adecuado de acuerdo con la edad y los síntomas del paciente. La dosis efectiva se puede seleccionar del rango de 0.01 mg a 1 00 mg por kg de peso corporal en cada administración . Alternativamente, la dosis se puede seleccionar de 1 -1 000 mg por paciente, o de preferencia 5-50 mg por paciente. Por ejemplo , en el caso de un anticuerpo que reconoce HLA, la dosis y el método de administración de preferencia se refieren a una dosis efectiva, que es una cantidad que causa la presencia de anticuerpos libres en la sangre, y los ejemplos específicos incluyen métodos de administración tales como administrar 0.5 mg a 40 mg por mes (cuatro semanas) por kg de peso corporal , que es de preferencia un mg a 20 mg en una a varias dosis, por ejemplo, por métodos que incluyen inyección intravenosa tales como infusión por goteo o inyección subcutánea según un esquema de administración de dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada cuatro semanas, o similares. El esquema de administración se puede ajustar por extensión del intervalo de administración de dos veces por semana o una vez por semana a una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas al observar la condición posadministración y los cambios de los valores de las pruebas sangu íneas. Se pueden agregar portadores farmacéuticamente aceptables tales como conservadores y estabilizadores a los agentes farmacéuticos de la presente invención . "Portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador que por sí solo puede ser un material que tenga o no la actividad antes descrita, y el portador es un material farmacéuticamente aceptable que se puede administrar junto con el agente farmacéutico antes mencionado. Además, puede ser un material que no tenga la actividad antes mencionada, o un material que tenga efecto sinérgico o aditivo cuando se usa en combinación con un anticuerpo anti-H LA. Los ejemplos de materiales farmacéuticamente aceptables incluyen agua estéril , solución fisiológica, estabilizadores, excipientes, amortiguador, conservadores, agentes tensoactivos, agentes quelantes (por ejemplo, EDTA) y ligadores, y similares.

En la presente invención , se puede usar aproximadamente 0.2% de gelatina o dextrano, 0.1 -1 .0% de glutamato de sodio, aproximadamente 5% de lactosa, o aproximadamente 2% de sorbitol , o similares como estabilizantes, sin limitaciones. Los ejemplos típicos de conservadores incluyen aproximadamente 0.01 % de timerosal , aproximadamente 0.1 % de beta-propiolactona y similares.

En la presente invención , los ejemplos de agentes tensoactivos incluyen agentes tensoactivos no iónicos. Los ejemplos típicos incluyen , ésteres de ácidos grasos de sorbitán tales como monocaprilato de sorbitán, monolaureato de sorbitán o monopalmitato de sorbitán ; ésteres de ácidos grasos de glicerol tales como monocaprilato de glicerol, monomiristato de glicerol o monoestearato de glicerol; ésteres de ácido grasos de poliglicerol tales como monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo o monolinoleato de decaglicerilo; ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán tales como monolaureato de polioxietilensorbitán , monooleato de polioxietilensorbitán, monoestearato de polioxietilensorbitán , monopalmitato de polioxietilensorbitán , trioleato de polioxietilensorbitán o triestearato de polioxietilensorbitán ; ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitol tales como tetraestearato de polioxietilensorbitol , tetraoleato de polioxietilensorbitol ; ésteres de ácidos grasos de polioxietilenglicerol tales como monoestearato de polioxietilenglicerol ; ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol tal como diestearato de polietilenglicol; éter alquílico de polioxietileno tales como éter laurílico de polioxietileno; éter alquílico de polioxietilenpolioxipropileno tal como éter propílico de polioxietilenpolioxipropilenglicol , éter propílico de polioxietilenpolioxipropileno o éter cetílico de polioxietilenpolioxipropileno; éter alquilfenílico de polioxietileno tales como éter nonilfenílico de polioxietileno; aceites de ricino endurecidos con polioxietileno tales como aceite de ricino con polioxietileno o aceite de ricino endurecidos con polioxietileno (aceites de ricino con polioxietileno hidrogenado); derivados de ceras de abeja con polioxietileno tales como cera de abeja con polioxietilensorbitol ; derivados de lanolina con polioxietileno tales como polioxietilenlanolina; y amidas de ácidos grasos de polioxietileno con HLB 6 a 1 8 tales como polioxietilenestearilamida. Los agentes tensoactivos aniónicos también se pueden enumerar como agentes tensoactivos. Los ejemplos típicos de agentes tensoactivos aniónicos pueden incluir sales de alquilsulfato con un grupo alquilo de diez a 1 8 átomos de carbono, tales como cetilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio u oleilsulfato de sodio; sales de alquiléter de polioxietilensulfato con peso molar promedio de óxido de etileno añadido de dos a cuatro y la cantidad de átomos de carbono del grupo alquilo es de 1 0 a 18, tales como laurilsulfato de polioxietileno sódico; sales de éster de alquilsulfosuccinato de ocho a 1 8 átomos de carbono en el grupo alquilo, tales como éster laurilsulfosuccinato de sodio; agentes tensoactivos naturales tales como lecitina o fosfato lipídico de glicerol ; esfingofosfol ípidos tales como esfingomielina; y ésteres de ácidos grasos de sacarosa de 1 2 a 1 8 átomos de carbono en el ácido graso. Se puede agregar uno o una combinación de dos o más de estos agentes tensoactivos a los agentes farmacéuticos de la presente invención . El agente tensoactivos preferido usado en la formulación de la presente invención es un éster de ácido graso de polioxietilensorbitán, tal como Polisorbato 20, 40, 60, 80 o similares, y se prefiere particularmente Polisorbato 20 y 80. También se prefiere un polioxietilenpolioxipropilenglicol representado por Poloxámero (por ejemplo, Pluronic F-68 ®). La cantidad de agente tensoactivo agregado difiere según el tipo de agente tensoactivo usado, pero para Polisorbato 20 o Polisorbato 80, generalmente es de 0.001 -100 mg/mL, de preferencia 0.003-50 mg/mL, y con mayor preferencia 0.005-2 mg/mL. Los ejemplos de amortiguador en la presente invención incluyen ácido fosfórico, amortiguador de ácido cítrico, ácido acético, ácido málico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido láctico , fosfato de calcio, ácido glucónico, ácido caprílico, ácido desoxicólico, ácido salicílico, trietanolamina , ácido fumárico, otros ácidos orgánicos, amortiguador de ácido carbónico, amortiguador Tris, amortiguador de histidina , amortiguador de imidazol y similares. Las formulaciones en solución se pueden preparar por disolución en amortiguador acuosos conocidos en el campo de la formulación de soluciones. La concentración de amortiguador generalmente es de 1 -500 mM , de preferencia 5-1 00 mM , y con mayor preferencia 1 0-20 mM . Además, los agentes farmacéuticos de la presente invención pueden incluir otros polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas tales como albúmina sérica, gelatina e inmunoglobulina , aminoácidos, azúcares e hidratos de carbono tales como polisacáridos y monosacáridos y alcoholes de azúcar. Los ejemplos de aminoácidos de la presente invención incluyen aminoácidos básicos tales como arginina, lisina, histidina y ornitina , y las sales inorgánicas de dichos aminoácidos (de preferencia en la forma de sales de cloruros o sales de fosfatos, o más específicamente fosfatos de aminoácidos). Cuando se usan aminoácidos libres, se ajusta el pH a un valor de preferencia por agregado de un amortiguador adecuado fisiológicamente aceptable tal como ácidos inorgánicos, particularmente ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácido fórmico o una de sus sales. En tal caso, el uso de una sal de ácido fosfórico es de particular utilidad , dado que se puede obtener un producto particularmente estable por secado por congelación. Es particularmente ventajoso cuando la preparación no contiene sustancialmente un ácido orgánico tal como ácido málico , ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido fumárico, o cuando no está presente un anión correspondiente (ion malato, ion tartrato, ion citrato, ion succinato, ion fumarato o similares). Los aminoácidos preferidos son arginina, lisina , histidina u ornitina. Adicionalmente, se pueden usar aminoácidos ácidos tales como ácido glutámico y ácido aspártico, y sus sales (de preferencia sales sódicas); aminoácidos neutros tales como isoleucina, leucina, glicina, serina, treonina, valina, metionina, cisteína o alanina; o aminoácidos aromáticos tales como fenilalanina , tirosina, triptófano o N-acetiltriptófano derivado. Los ejemplos de azúcares e hidratos de carbono tales como polisacáridos y monosacáridos en la presente invención incluyen dextrano, glucosa, fructosa, lactosa , xilosa, mañosa , maltosa, sacarosa, trehalosa y rafinosa. Los ejemplos de alcoholes de azúcar de la presente invención incluyen manitol , sorbitol, inpsitol y similares. Las soluciones acuosas usadas para inyecciones incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que comprenden glucosa u otros agentes coadyuvantes tales como D-sorbitol , D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio. También se pueden combinar con adecuados agentes solubilizantes, tales como alcohol (por ejemplo, etanol), polialcohol (por ejemplo, propilenglicol o PEG) o agentes tensoactivos no iónicos (por ejemplo, polisorbato 80 o HCO-50). Si se desea, se pueden incluir diluyentes, agentes solubilizantes, agentes de ajuste de pH , agentes suavizantes, agentes reductores que contienen azufre y antioxidantes. Los ejemplos de agentes reductores que contienen azufre en la presente invención incluyen /V-acetilcisteína, A/-acetilhomocisteína, ácido tióctico, tiodiglicol , tioetanolamina, tioglicerol , tiosorbitol , ácido tioglicólico y sus sales, tiosulfato de sodio, glutatión y compuestos portadores de un grupo sulfhidrilo tales como ácido tioalcanoico de uno a siete átomos de carbono. Los ejemplos de antioxidantes en la presente invención incluyen ácido ertórbico, dibutilhidroxitolueno, butilhidroxianisol , a-tocoferol , acetato de tocoferol , ácido L-ascórbico y sus sales, L-ascorbilpalmitato, L-ascorbilestearato, bisulfito de sodio, sulfito de sodio, triamilgalato, propilgalato, y agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético disódico (EDTA), pirofosfato de sodio y metafosfato de sodio. De ser necesario, los agentes farmacéuticos se pueden contener en microcápsulas (microcápsulas preparadas de hidroximetilcelulosa, gelatina, poli[metil metacrilato], o similares), o se pueden preparar en sistemas de provisión de fármaco coloidales (tales como liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) (ver por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science 1 6a. edición" , Oslo Ed . , 1 980). Los métodos para preparar los agentes farmacéuticos como agentes farmacéuticos de liberación controlada también son bien conocidos, y dichos métodos se pueden aplicar a la presente invención (Langer et al. , J . Biomed . Mater. Res. 1 981 , 1 5: 1 67-277; Langer, Chem . Tech . 1 982, 1 2: 98-1 05; patente de los Estados Unidos N .° 3.773.91 9; solicitud de patente europea (EP) N .° 58.481 ; Sidman et al. , Biopolymers 1 983, 22: 547-556; EP 1 33,988).

Los portadores farmacéuticamente aceptables usados se seleccionan adecuadamente de los mencionados con anterioridad o sus combinaciones de acuerdo con la forma de dosificación, pero si n limitarse a ellos. Cuando se preparan inyecciones se agregan agentes de ajuste de pH , amortiguadores, estabilizantes, conservadores o similares según necesidad para preparar inyecciones subcutáneas, intramusculares e intravenosas por los procedimientos comunes. Se puede preparar una inyección como preparación sólida para la formulación inmediatamente antes del uso mediante secado por congelación de una solución almacenada en un recipiente. Una dosis única se puede almacenar en un recipiente o se pueden guardar dosis múltiples en un mismo recipiente. Diversos métodos conocidos se pueden usar para administrar los agentes farmacéuticos de la presente invención. En la presente invención, "administrar" incluye administrar por vía oral o parenteral . La administración oral incluye la administración en la forma de agentes orales, y la forma de dosificación para los agentes orales se puede seleccionar de gránulos, polvos, comprimidos, cápsulas, agentes disueltos, emulsiones, suspensiones y similares. La administración parenteral incluye la administración en forma inyectable, y los ejemplos de inyección incluyen inyección intravenosa tal como infusión por goteo, inyección subcutánea, inyección intramuscular e inyección intraperitoneal . Además, se pueden lograr los efectos de los métodos de la presente invención por introducción de un gen que comprende un oligonucleótido que se administra a un organismo vivo mediante técnicas de terapia génica. Los agentes farmacéuticos de la presente invención se pueden administrar localmente a una región tratada. Por ejemplo, los agentes se pueden administrar por infusión local o por el uso de un catéter durante cirugía, o por provisión génica dirigida de ADN que codifica un inhibidor de la presente invención . La administración a los pacientes se puede realizar, por ejemplo por inyección intraarterial , inyección intravenosa o inyección subcutánea, alternativamente por administración por vía intranasal , transbronquial , intramuscular, transdérmica u oral mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las dosis varían según el peso corporal y la edad del paciente, el método de administración y similares; no obstante, los expertos en la técnica podrán seleccionar dosis adecuadas. Además, si un compuesto puede ser codificado por un ADN , se puede incorporar el ADN en un vector de terapia génica vector para realizar terapia génica. Las dosis y los métodos de administración varían según ei peso corporal , la edad y los síntomas del paciente, pero nuevamente, pod rán ser seleccionados adecuadamente por los expertos en la técnica. Una dosis única de los agentes farmacéuticos de la presente invención varía según el objetivo de administración, el órgano objetivo, los síntomas y el método de administración . No obstante, una dosis común de adulto (con un peso corporal de 60 kg) en la forma de una inyección es de aproximadamente 0.1 a 1 000 mg, de preferencia aproximadamente 1 .0 a 50 mg , y con mayor preferencia aproximadamente 1 .0 a 20 mg por d ía, por ejemplo. Cuando se administra por vía parenteral , una dosis única varía según el objetivo de administración , el órgano objetivo, los síntomas y el método de administración; sin embargo en la forma de una inyección , por ejemplo, una dosis única de aproximadamente 0.01 a 30 mg , de preferencia aproximadamente 0.1 a 20 mg , y con mayor preferencia aproximadamente 0.1 a 10 mg por d ía se administra ventajosamente por vía intravenosa a un adulto normal (con un peso corporal de 60 kg). Para otros animales se puede administrar una cantidad convertida sobre la base de la cantidad para un peso corporal de 60 kg, o una cantidad convertida para una superficie corporal . El método de inoculación adecuado se determina en consideración al tipo de agente farmacéutico, el tipo de sujeto inoculado, y similares. Los contenedores que se pueden usar son viales y jeringas prellenadas. De ser necesario, se pueden usar soluciones o productos en polvo producidos por secado por congelación. El producto puede ser para inoculación única o múltiples inoculaciones. La dosis puede variar según el método de administración, el tipo, peso corporal y la edad del sujeto al que se inocula, y similares, peso una dosis adecuada puede ser seleccionada en forma apropiada por los expertos en la técnica. Todas las patentes, las solicitudes de publicación de patentes y las publicaciones citadas en la presente se incorporan en su totalidad por referencia. Ejemplos En adelante, la presente invención se describe específicamente con referencia a los Ejemplos, pero no se deben interpretar como limitantes. Ejemplo 1 Establecimiento de líneas celulares Ba/F3 que expresan HLA clase ??/ß2? Se establecieron células Ba/F3 que expresan HLA clase IA humano y ß2? humano. Primero se preparó un vector que expresa HLA clase IA (HLA-full) de longitud total como sigue. Se amplificó un fragmento de gen que codifica HLA clase IA de longitud total mediante PCR con un cADN que codifica el HLA clase IA de longitud total como plantilla y los siguientes cebadores (sHLA-1 y fHLA-3'): sHLA-1: TCC GAA TTC CAC CAT GGC CGT CAT GGC GCC CCG AAC (SEQ ID NO: 13); y fHLA-3': TTG CGG CCG CTC ACA CTT TAC AAG CTG TGA GAG ACA (SEQ ID NO: 14). El fragmento de ADN obtenido se digirió con EcoRI/Notl, y se insertó en la brecha EcoRI/Notl del vector de expresión de célula animal pCXND3 para construir un vector de expresión de HLA clase IA (fHLA-A) de longitud total (pCXND3-HLA-completo). A continuación se produjo un vector de expresión de microglobulina ß2 de longitud total (ß2?) como sigue. Se amplificó un fragmento de gen que codifica ß2? de longitud total mediante PCR con un cADN derivado de bazo humano (cADN de bazo humano, Clontech #S1206) como plantilla y los siguientes cebadores (ß2?-1 y ß2?-2): ß2?-1: AAG CGG CCG CCA CCA TGT CTC GCT CCG TGG C (SEQ ID NO: 15); y ß2?-2: TTT CTA GAT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA ACT (SEQ ID NO: 16). El fragmento de ADN obtenido se digirió con Notl/Xbal, y se insertó en el sitio Notl/Xbal de pCOS2-ZEO para construir un vector de expresión deß2M de longitud total (pCOS2zeo^2M). Luego se establecieron las líneas celulares Ba/F3 que expresan ??_?-?/ß2? como sigue. Veinte M9 de cada uno de pCXND3-HLA-completo y ?0052?ß?-ß2? se digirieron con Pvul y luego se introdujeron en células Ba/F3 suspendidas en PBS(-) (1 x 107 células/mL, 800 µ?_) por electroporación (BIO-RAD Gene Pulser, 0.33 kV, 950 pF, const. tiempo 27.0). Las células se diluyeron a una cantidad adecuada en medio de cultivo (RPMI1640 + 10% FCS + P/S + 1 ng/mL IL-3) y se emplacaron en una placa de 96 cavidades, y al día siguiente se añadieron G418 y Zeocin a las células a 400 Mg/mL y 800 pg/mL, respectivamente. Luego se cambió la mitad del medio cada tres a cuatro días, y diez días más tarde se seleccionaron clones aislados. Se determinaron los niveles de expresión de HLA clase IA en las l íneas celulares Ba/F3 que expresan ??_?-?/ß2? (#9, #1 0, y #22) y ARH77 células por tinción con 2D7 IgG (1 0 pg/mL), y se analizó la expresión de los antígenos en la membrana celular por FACS (COULTER, ELITE) (Fig . 1 ). Como consecuencia, se halló que la expresión de HLA clase IA en la l ínea celular #9 ten ía el mismo nivel que en las células ARH77. En consecuencia, esta l ínea celular se cultivó en gran escala en medio RPM I 1 640 que contiene 1 ng/mL I L-3, 500 pg/mL G41 8, 800 pg/mL de zeocina (Invitrogen #46-0072), y 10%FCS, y se usó para la inmunización celular. Ejemplo 2 Inmu nización celular La l ínea celular Ba/F3 que expresa ???-?/ß2? , BaF-HLA #9 , se lavó dos veces con PBS(-), se suspendió en PBS(-) hasta una concentración de 1 .5-2.0 x 107 células/200 pL, y se inmunizaron ratones (M RL/lpr, machos, de cuatro semanas, Japan Charles River) por inyección intraperitoneal de 200 pL de esa suspensión (jeringa de -mL Terumo , aguja 26 G). La inmunización se realizó una vez por semana hasta un total de ocho inmunizaciones, y la novena inmunización, que es la inmunización final , se realizó con 200 pL de una suspensión de 2.5 x 1 07 células/200 pL y se realizó fusión celular cuatro d ías después de la inmunización final . Ejemplo 3 Producción de hibridomas Se extrajeron asépticamente los bazos de ratones y se homogeneizaron en medio 1 [RPMI1640( + P/S)] para producir una suspensión de célula única. Se pasó a través de una malla de nailon de 70-µ?? (Falcon) para extraer tejido adiposo, y similares, y se contó la cantidad de células. Las células B obtenidas se mezclaron con células de mieloma de ratón (células P3U1) en una relación de células contadas de aproximadamente 2:1, se añadió 1 mL de 50% PEG (Roche, cat #: 783 641, lote #: 14982000) se realizó la fusión celular. Las células fusionadas se suspendieron en medio 2 [RPMI1640( + P/S, 10% FCS)] y se dispensaron a 100 pL/cavidad en una cantidad adecuada (diez) placas de 96 cavidades y se incubaron a 37 °C. Al día siguiente se añadieron 100 pL/cavidad de medio 3 [RPMI1640(+P/S, 10% FCS, HAT(Sigma, H0262), 5% BM Condimed H1 (Roche, cat #: 1088947, lote #: 14994800))], y luego se extrajeron 100 ? del medio de cada cavidad y se añadieron 100 pL/cavidad de medio fresco 3 cada día durante cuatro días. Ejemplo 4 Búsqueda de anticuerpos inductores de muerte celular La búsqueda de hibridomas con actividad inductora de muerte celular se realizó aproximadamente una semana después de la fusión celular. La búsqueda de anticuerpos inductores de muerte celular se realizó como sigue, mediante la capacidad para inducir agregación celular como indicador. Células Ba/F3 que expresan ???-?/ß2? ???-?/ß2? se emplacaron en una placa de 96 cavidades a razón de 2.5 x 104 células/cavidad, se añadió 80 pL del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma y las células se cultivaron a 37 °C durante 1 hora . Luego se añadió anticuerpo anti IgG de ratón (Cappel #55482, #55459) a una concentración de 6 g/mL. Después dé otras cuatro horas de incubación para realizar la reacción de formación de enlaces cruzados se observaron las células al microcopio, y se seleccionaron las cavidades que mostraban agregación celular. Como consecuencia de la búsqueda de sobrenadante de cultivo de 1 000 clones se obtuvieron diez hibridomas positivos. Las células de estas cavidades positivas se emplacaron nuevamente en una placa de 96 cavidades a 2.5 células/cavidad y se cultivaron durante aproximadamente diez d ías, y se volvió a analizar la actividad inductora de agregación celular. Esta operación produjo diez tipos de clones aislados. Ejemplo 5 Producción de panel de anticuerpos 5-1 . Purificación de anticuerpos Los anticuerpos obtenidos de 80 mL de los sobrenadantes de cultivo de hibridoma de los clones se purificaron mediante columna de 1 mL de HiTrap Protein G HP (Amersham Biosciences #1 7-0404-01 ). Los sobrenadantes de hibridoma se adsorbieron a una tasa de flujo de 1 mL/min , y después de lavar con 20 mL de 20 mM amortiguador fosfato (pH 7.0), se realizó la elución con 3.5 mL de 0.1 M Glicina-HCI (pH 2.7). Las fracciones eluidas se recolectaron en 0.5 mL por tubo en tubos Eppendorf precargados con 50 µ? de 1 M Tris-HCI (pH 9.0). Se midió D028o nm, se combinaron las fracciones que contienen anticuerpo, se añadió PBS(-) hasta un volumen total de 2.5 mL, y luego se sustituyó el amortiguador por PBS(-) con una columna PD-1 0 (Amersham Biosciences #1 7-0851 -01 ). Los anticuerpos purificados se pasaron por un filtro de 0.22 gm (M I LLI PORE #SLGV033RS) y se examinaron las propiedades de cada uno de los anticuerpos purificados en detalle, tal como se describe a continuación. 5-2. Determinación de subtipo La determinación de subtipo de anticuerpo se realizó con IsoStrip (Roche #1 493 027). Para la determinación de subtipo se usaron sobrenadantes de cultivo de hibridoma diluidos 1 0 veces en PBS(-). 5-3. Anál isis de epitopo 5-3-1 . Clonación del gen MHC clase IA de ratón Para analizar los dominios de la molécula de HLA clase IA que son reconocidos por los anticuerpos obtenidos, se establecieron l íneas celulares que expresan H LA clase IA quimérico con uno de los dominios de HLA clase IA (dominip a l , dominio a2 y dominip a3) sustituido con un correspondiente dominio de MHC clase I de ratón , como sigue (Fig . 2). Primero se realizó la clonación según el siguiente método, con gen MHC clase IA de ratón como plantilla. Se realizó PCR en cADN de bazo de ratón (MTC panel , Clontech) mediante los siguientes cebadores (mHLA-1 y mHLA-2) y pirobest-ADN-polimerasa (TAKARA #R005) para amplificar el fragmento génico de H LA clase IA de ratón . mHLA-1 : CTG CTC CTG CTG TTG GCG GC (SEQ I D NO: 1 7) mHLA-2: CAG GGT GAG GGG CTC AGG CAG (SEQ I D NO: 1 8) El fragmento génico obtenido se clonó por TA en pCRI I-TOPO (kit de clonacigon Invitrogen TOPO TA, #45-0640) para confirmar la secuencia de nucleótidos. 5-3-2. Construcción de vectores de expresión quiméricos de HLA-A para su uso en análisis de epitopo Luego se construyeron vectores de expresión quiméricos de HLA-A para su uso en análisis de epitopo como sigue. El vector de expresión MH H , pCOS2-chHLA-MH H-flag , en donde el dominio de HLA-Aa 1 es de ratón (MHH), se construyó por el siguiente método. La secuencia señal HLA-A (fragmento A) se amplificó por PCR mediante pyrobest ADN-polimerasa (TAKARA #R005) y un vector de expresión portador el HLA-A (pCXN D3-HLA completo) de longitud total como plantilla, con los siguientes cebadores (sH LA-A y chHLA-H 1 ): sHLA-A: TCC GAA TTC CAC CAT GGC CGT CAT GGC GCC CCG AAC (incluso el sitio EcoRI ) (SEQ I D NO: 1 9); y chHLA-H1 : AAT CTA GAC TGG GTC AGG GCC AGG GCC CC (incluso el sitio Xba l ) (SEQ I D NO: 20). La secuencia desde el dominio a2 hasta el codón de detención de HLA-A (fragmento B) se amplificó por PCR con los siguientes cebadores (chHLA-H2 y chHLA-H3): chHLA-H2: TTT CTA GAG CCG GTT CTC ACA CCA TCC AGA GG (incluso el sitio Xbal ) (SEQ I D NO: 21 ); y chHLA-H3: AAG GAT CCC ACT TTA CAA GCT GTG AGA GAC ACA T (incluso el sitio BamHI) (SEQ ID NO: 22). El fragmento A y el fragmento B se digirieron con Eco-RI-Xbal y Xbal-BamH I , respectivamente, y estos fragmentos se insertaron en el sitio EcoRI-BamHI de pCOS2-FLAG. Se confirmó la secuencia de nucleótidos del plásmido obtenido y se construyó pCOS2-(M )HH . Al mismo tiempo se amplificó el dominio a1 de MHC clase IA de ratón (fragmento C) por PCR mediante pyrobest ADN-polimerasa (TAKARA #R005) y el gen M HC clase IA de ratón como plantilla, con los siguientes cebadores (chHLA-M 1 y chHLA-M2): chHLA-M 1 : TTT CTA GAG CGG GCC CAC ATT CGC TGA GG (incluso el sitio Xbal ) (SEQ I D NO: 23); y chHLA-M2: TTT CTA GAC TGG TTG TAG TAT CTC TGT GCG GTC C (incluso el sitio Xbal ) (SEQ I D NO: 24). El fragmento C obtenido se digirió con Xbal , y se insertó en pCOS2-(M)HH abierto con Xbal . Se confirmó la secuencia de nucleótidos, y se completó la construcción de pCOS2-ch HLA-M H H-flag , un vector de expresión en el cual el dominio a1 está sustituido con M HC-A de ratón. Se construyó el HMH vector de expresión HMH, pCOS2-chHLA-HM H flag , en donde el dominio a2 es de ratón (HM H ), según el siguiente método. La secuencia señal HLA-A de dominio a1 (fragmento D) se amplificó por PCR con pyrobest ADN-polimerasa (TAKARA #R005) y un vector de expresión portador de HLA-A de longitud total (pCXN D3-HLA completo) como plantilla, con los siguientes cebadores (sHLA-A y chHLA-H4): sHLA-A: TCC GAA TTC CAC CAT GGC CGT CAT GGC GCC CCG AAC (incluso el sitio EcoRI ) (SEQ I D NO: 1 9); y chHLA-H4: TTG TCG ACC CGG CCT CGC TCT GGT TGT AGT AG (incluso el sitio Salí) (SEQ I D NO: 25). Se usaron los siguientes cebadores (chHLA-H5 y ch HLA-H3) para amplificar desde el dominio a3 al codón de detención de HLA-A (fragmento E) por PCR. chHLA-H5: AAG TCG ACG CCC CCA AAA CGC ATA TGA CT (incluso el sitio Sal í ) (SEQ I D NO: 26); y chHLA-H3: AAG GAT CCC ACT TTA CAA GCT GTG AGA GAC ACA T (incluso el sitio BamH I ) (SEQ I D NO: 22). El fragmento D y el fragmento E se digirieron con EcoRI-Sal l y Sal l-BamH I , respectivamente, y estos fragmentos se insertaron en el sitio EcoRI-BamHI de pCOS2-FLAG. La secuencia de nucleótidos del plásmido obtenido se confirmó y se construyó pCOS2-H(M )H . Al mismo tiempo se amplificó el dominio a2 de M HC clase IA de ratón (fragmento F) por PCR con pyrobest ADN-polimerasa (TAKARA #R005) y el gen de ratón M HC clase IA como plantilla, con los siguientes cebadores (chHLA-M3 y chHLA-M4): chHLA-M3: TTG TCG ACC ACG TTC CAG CGG ATG TTC GGC (incluso el sitio Sal í ) (SEQ I D NO: 27); y chHLA-M4: GAG TCG ACG CGC AGC AGC GTC TCA TTC CCG (incluso el sitio Sal í ) (SEQ I D NO: 28). El fragmento F obtenido se digirió con Sal í , y este se insertó en pCOS2-H(M )H abierto con Sal í . Se confirmó la secuencia de nucleótidos, y se completó la construcción de pCOS2-chHLA-HM H-flag, un vector de expresión en donde el dominio a2 es sustituido con MHC-A de ratón. El vector de expresión HHM , pCOS2-chHLA-HHM flag , en donde el dominio a3 proviene de ratón (HHM ), se construyó por el siguiente método. La secuencia señal del dominio de HLA-A a2 (fragmento G) se amplificó por PCR mediante pyrobest ADN-polimerasa (TAKARA #R005) y un vector de expresión portador de HLA-A de longitud total (pCXN D3-HLA completo) como plantilla, con los siguientes cebadores (sHLA-A y chHLA-H6): sHLA-A: TCC GAA TTC CAC CAT GGC CGT CAT GGC GCC CCG AAC (incluso el sitio EcoRI ) (SEQ I D NO: 1 9); y chHLA-H6: TTT CTA GAG TCC GTG CGC TGC AGC GTC TCC T (incluso el sitio Xbal ) (SEQ I D NO: 29). Se amplificó el dominio intracelular de HLA-A (fragmento H ) por PCR con los siguientes cebadores (chHLA-H7 y chHLA-H3): chHLA-H7: TTT CTA GAA TGG GAG CCG TCT TCC CAG CCC A (incluso el sitio Xbal ) (SEQ I D NO: 30); y chHLA-H3: AAG GAT CCC ACT TTA CAA GCT GTG AGA GAC ACA T (incluso el sitio BamH I ) (SEQ I D NO: 22).

El fragmento G y el fragmento H se digirieron con EcoRI-Xbal y Xbal-BamHI, respectivamente, y estos fragmentos se insertaron en un sitio EcoRI-BamHI de pCOS2-FLAG. Se confirmó la secuencia de nucleótidos del plásmido obtenido y se construyó pCOS2-HH(M). Al mismo tiempo se amplificó el dominio de ratón de MHC clase IA a3 (fragmento I) por PCR con pyrobest ADN-polimerasa (TAKARA #R005) y el gen de ratón MHC clase IA como plantilla, con los siguientes cebadores (chHLA-M5 y chHLA-M6): chHLA-M5: AAT CTA GAA AGG CCC ATG TGA CCT ATC ACC CC (incluso el sitio Xbal) (SEQ ID NO: 31); y chHLA-M6: TAT CTA GAG TGA GGG GCT CAG GCA GCC CC (incluso el sitio Xbal) (SEQ ID NO: 32). El fragmento obtenido I se digirió con Xbal, y se insertó en pCOS2-HH(M) abierto con Xbal. Se confirmó la secuencia de nucleótidos y se completó la construcción de pCOS2-chHLA-HHM-flag, un vector de expresión en donde el dominio a3 está sustituido con MHC-A de ratón. El vector de expresión MMM, pCOS2-chHLA-MMM flag, en donde los dominios a1-a3 provienen de ratón (MMM), se construyó por el siguiente método. El fragmento A y el fragmento H se digirieron con EcoRI-Xbal y Xbal-BamHI, respectivamente, y estos fragmentos se insertaron en un sitio EcoRI-BamHI de pCOS2-FLAG. Se confirmó la secuencia de nucleótidos del plásmido obtenido y se construyó pCOS2-(MMM). Se amplificaron los dominios de ratóns MHC clase ??a1-a3 (fragmento J) por PCR con pyrobest ADN-polimerasa (TAKARA #R005) y el gen de ratón de MHC clase IA como plantilla, con los siguientes cebadores (chHLA-M1 y chHLA-M6): chHLA-M1 : TTT CTA GAG CGG GCC CAC ATT CGC TGA GG (incluso el sitio Xbal) (SEQ ID NO: 23); y chHLA-M6: TAT CTA GAG TGA GGG GCT CAG GCA GCC CC (incluso el sitio Xbal) (SEQ ID NO: 32). El fragmento J obtenido se digirió con Xbal, y se insertó en pCOS2-(MMM) abierto con Xbal. Se confirmó la secuencia de nucleotidos y se completó la construcción de pCOS2-chHLA-MMM-flag, un vector de expresión en donde los dominios a1-a3 están sustituidos con MHC-A de ratón. 5-3-3. Establecimiento de líneas celulares Ba/F3 que expresan HLA-A/B2M quimérico para análisis de epitopo Veinte pg de cada uno de pCOS2-chHLA-MHH-flag, pCOS2-chHLA-HMH-flag, pCOS2-chHLA-HHM-flag, y pCOS2-chHLA-MMM-flag se digirieron con Pvul, y luego se introdujeron en células Ba/F3 suspendidas en PBS(-)(1 x 107 células/mL, 800 µ?_) por electroporación (BIO-RAD Gene Pulser, 0.33 kV, 950 pF, const. tiempo 27.0). Las células se diluyeron a una cantidad adecuada en un medio de cultivo (RPMI1640 + 10% FCS + P/S + 1 ng/mL IL-3) y se emplacaron en una placa de 96 cavidades y el día siguiente se agregó G418 a una concentración de 500 pg/mL. Diez días después se seleccionaron clones aislados por observación al microscopio. Respecto de estos clones, se disolvieron 1 x 105 células en 50 µ?_ de 0.5% ??40 de amortiguador de lisis (10 mM Tris-HCI (pH 7.5) que contiene 0.5% NP40, 50 mM NaCI, y 5 mM EDTA), y se realizó SDS-PAGE con 12 µ?_ del sobrenadante. Después de realizar inmunoelectrotransferencia sobre una membrana PVDF, se realizó inmunoelectrotransferencia Western con anticuerpo Anti-Flag M2 (SIGMA #F3165) y anticuerpo antide ratón HRP (Amersham Biosciences #NA9310) para buscar las líneas celulares productoras de chHLA. Se seleccionaron las que tenían mayor expresión de chHLA, chHLA-MHH #8, chHLA-HMH #6, chHLA-HHM #2, y chHLA-MMM #4, y se colocaron en medio RPMI1640 que contiene 1 ng/mL IL-3, 500 pg/mL G418, y 10% FCS para cultivo en gran escala. pCOS2zeo-p2M digerido con Pvul (15 pg) se introdujo en cada una de estas líneas celulares que expresan chHLA por electroporación. Al día siguiente se añadió G418 y Zeocin (Invitrogen #46-0072) hasta una concentración de 500 Mg/mL y 800 pg/mL, respectivamente. Doce días después se seleccionaron clones aislados por observación al microscopio. Estas células se tiñeron con anticuerpo ß2? antihumano (SIGMA #M7398) y anticuerpo IgG-FITC antide ratón (Beckman Coulter #IM0819), y se analizó la expresión de ß2? sobre la membrana celular mediante FACS (Beckman Coulter, ELITE). Los con mayor expresión de ß2?, ?????-???/ß2? #1-3, ??????-???/ß2? #2-1, chHLA-HHM^2M #3-4, y chHLA-???/ß2? #4-6, se colocaron en medio RPMI1640 que contiene 1 ng/mL IL-3, 500 pg/mL G418, 800 pg/mL Zeocin, y 10%FCS para cultivo en gran escala, y se usó para el análisis de epitopo. 5-3-4. Análisis de epitopo por FACS Para determinar los epitopos de los anticuerpos obtenidos (diez clones) se analizó su capacidad para fijarse a las células que expresan ??_?/ß2? quimérico. Las células que expresan ???/ß2? quimérico se emplacaron en una placa de 96 cavidades a 8 x 105 células/cavidad y se añadió cada uno de los anticuerpos hasta una concentración de 10 g/mL. Después de una hora de incubación sobre hielo, las células se lavaron con 150 iL de amortiguador FACS, se tiñeron con anticuerpo IgG-FITC antide ratón (Beckman Coulter #IM0819), y luego se analizaron por FACS (Beckman Coulter, ELITE) (Fig. 3). Como resultado, dado que C3B3, C11B9, y C17D11 no se fijaron a HMH/Ba/F3 (que tiene un dominio HLA a2 de ratón), se halló que el epitopo es un dominio a2. Por otra parte, si bien C17A4, C17E9, C23H12 y C26D8 no formaron enlaces cruzados con MHC clase I de ratón (resultados no mostrados), se unieron a todos los HLA quiméricos, y los patrones de tinción por FACS coincidían con los patrones de tinción observados con el anticuerpo anti-p2M; en consecuencia, se determinó que estos clones reaccionan con ß2? pero no con HLA. Dado que C7C5 y C20D4 no se fijaron a HLA de HMH (que tiene un dominio de HLA a2 de ratón) o HHM (que tiene un dominio de HLA a3de ratón), se infirió que estos clones reconocen la región entre a2 y a3. 5-4. Actividad inductora de muerte celular La actividad inductora de muerte celular de los anticuerpos obtenidos sobre las células ARH77 se evaluó como sigue. Cada uno de los anticuerpos purificados (5 pg/mL) se añadieron a células ARH77 , luego se cultivaron las células en presencia (1 20 pg/mL) o ausencia de anticuerpos secundarios (anticuerpos IgG antide ratóns, Cappel #55482, #55459) a 37 °C durante cuatro horas. Después del cultivo se recolectaron las células, se tiñeron con yoduro de propidio (Pl ), y se midió el porcentaje de células Pl-positivas (células muertas) por FACS (Beckman Coulter, ELITE) (Fig . 4). Como resultado se confirmó una relativamente fuerte actividad inductora de muerte celular para los anticuerpos C3B3, C1 7D 1 1 y C1 1 B9 en presencia de enlaces cruzados. 5-5. Clonación de la región variable El ARN total se purificó de aproximadamente 5 x 1 06 hibridomas con RNeasy Mini Kit (QIAGEN #74104) y QIAshredder (QIAGEN #79654). A partir de 1 pg de ARN total , se sintetizaron cADN con kit de amplificación de cADN SMART RACE (CLONTECH #PT3269-1 ). Se usó el cebador 5'-CDS incluido en el kit. Mediante el cADN obtenido como plantilla, las regiones variables de cadena pesada (VH) y las regiones variables de cadena liviana (VL) se amplificaron por PCR en las siguientes condiciones. Cebador: U PM < — > G2a (VH; lgG2a), UPM < — > k(VL; k) 94 °C durante 5 s, 72 °C durante 2 min , 5 ciclos 94 °C durante 5 s, 70 °C durante 10 s, 72 °C durante 2 min , 5 ciclos 94 °C durante 5 s, 68 °C durante 1 0 s, 72 °C durante 2 min , 27 ciclos Los fragmentos génicos obtenidos se clonaron por TA en pCRI I-TOPO (kit de clonación de Invitrogen TOPO TA, #45-0640) y se confirmaron las secuencias de nucleótidos. Las secuencias se confirmaron por análisis de al menos dos o más plásmidos por gen . Las secuencias de nucleótidos de la región variable de cadena pesada que incluyen la secuencia guía confirmada en el presente Ejemplo se muestran en SEQ I D NO: 46 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada que codifica esta secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ I D NO: 47. La secuencia de nucleótidos desde los nucleótidos 58 a 432 de SEQ I D NO: 46 (SEQ I D NO: 1 ) y la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 20 a 144 de SEQ I D NO: 47 (SEQ I D NO: 2) corresponden a la región variable de cadena pesada. Además, la secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena liviana que incluyen la secuencia guía confirmada en el presente Ejemplo se muestra en SEQ I D NO: 48, y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena liviana que codifica esta secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ I D NO: 49. La secuencia de nucleótidos desde los nucleótidos 61 a 381 de SEQ I D NO: 48 (SEQ I D NO:3), y la secuencia de aminoácidos desde los aminoácidos 21 a 127 de SEQ I D NO: 49 (SEQ I D NO: 4) corresponden a la región variable de cadena liviana. 5-6. Prod ucción de un panel de anticuerpos La información referida a los anticuerpos obtenidos que se describe a continuación se resumió en un panel. La información incluye la clasificación de isotipo de los anticuerpos, las secuencias genéticas que codifican las regiones variables de los anticuerpos, los epitopos, las actividades de fijación contra células ARH77, las actividades inductoras de muerte celular, y similares (Tabla 1). Los resultados de analizar las secuencias de aminoácidos que codifican la región variable demuestran que entre las regiones variables de cadena pesada de los tres clones (C3B3, C17D11 y C11B9) con el dominio a2 como epitopo, C3B3 y C17D11 tenían la misma secuencia de aminoácidos, pero C11B9 tenía una secuencia diferente en un aminoácido respecto de las de C3B3/C17D11 (Fig.5-1). Las secuencias de las regiones variables de cadena liviana eran idénticas para los tres clones (Fig.5-2). Tabla 1 Grupo ID del Cepa de Isotipo Epitopo Fijación Inducción de muerte clon ratón a ARH77 celular (proporción (modo X) de células muertas (%)) Enlace Enlace cruzado cruzado (-) (+) 2D7 Balb/c lgG2b 0.2 98.8 33.4 63.6 A C3B3 MRL/lpr lgG2a a2 74 14.3 47.7 C17D11 MRL/lpr lgG2a ot2 82 8.5 53.1 C11B9 MRL/lpr lgG2a a2 71 10.2 51.1 B C23H12 MRL/lpr lgG2a ß2? 69.6 4.8 42.3 C26D8 MRL/lpr lgG2a ß2? 66.5 11.2 45.1 C17E9 RL/lpr lgG2a ß2? 69.6 8.7 32 ' C17A4 MRL/lpr l gG2a ß2? 1 1 .6 4.2 10.4 c C20D4 MRL/lpr l gG2a a2/3 14.2 4.4 4.7 C7C5 MRL/lpr l gG1 /2a a2/3 7.8 4 4.8 D C14C7 MRL/lpr lgG 1 ? 2.9 3.8 5.2 Ejemplo 6 Producción de diacuerpos 6-1 . Producción de vectores de diacuerpo Si bien el anticuerpo C3B3 mostró actividad inductora de muerte celular contra las células ARH77 en presencia de un anticuerpo (GAM ), el anticuerpo solo no mostró fuerte actividad inductora de muerte celular. En consecuencia, se produjo un diacuerpo en donde las regiones variables de anticuerpo C3B3 están ligadas por un péptido 5 mero (GGGGS) (SEQ I D NO: 33). La porción de la secuencia señal de FR4 de la región variable de cadena H se amplificó por PCR mediante VH clonado por TA en pCRI I-TOPO como plantilla y pyrobest ADN-polimerasa (TAKARA #R005). Se usó un cebador 5' al que se agregó un sitio EcoRI y un cebador 3' al que se agregó una secuencia guía (aminoácidos GGGGS). De modo similar, la secuencia de FR1 a FR4 de la región variable de la cadena L se amplificó por PCR con VL clonado por TA en pCRI I-TOPO como plantilla. Se usó un cebador 5' al que se agregó una secuencia ligadora (aminoácido: GGGGS) y un cebador 3' al que se agregaron un rótulo Flag y un sitio Not I. Los VH y VL amplificados se hibridaron y se amplificó el gen del diacuerpo por PCR mediante cebadores en cada extremo. El fragmento obtenido se digirió con EcoRI/Notl y se insertó en el sitio EcoRI/Notl de pCXND3. Se confirmó la secuencia de nucleótidos y se completó la construcción del vector de expresión. Los cebadores y las condiciones de reacción de PCR usadas para producir el diacuerpo C3B3 (ligador: 5 aminoácidos) se muestran a continuación. Cebadores: C3B3DB-H1: cct gaa ttc CAC CAT GTA CTT CAG GCT CAG CTC AG (SEQ ID NO: 34) C3B3DB-H2: GGA TAT Cgc tac cgc ctc cae cTG AGG AGA CGG TGA CTG AAA TTC CTT (SEQ ID NO: 35) C3B3DB-L1: CAg gtg gag gcg gta gcG ATA TCC AGA TGA CAC AGA CTA CAT CCT CC (SEQ ID NO: 36) C3B3DB-L2: att gcg gee gct tat cae tta teg teg tea tec ttg tag tcT TTT ATT TCC AGC TTG GTC CCC GAT CCG (SEQ ID NO: 37) Condiciones de reacción de PCR: 94 °C durante 1 minuto 94 °C durante 30 minutos, 72 °C durante 30 minutos, 25 ciclos A continuación se purificaron los productos obtenidos por PCR con una columna S-300 HR (Amersham Biosciences #27-5130-01), y 1 [iL de cada VH y VL se fusionaron en las siguientes condiciones con pyrobest ADN polimerasa. 94 °C durante 1 minuto 94 °C durante 30 minutos, 72 °C durante 30 minutos, 5 ciclos 1 pL de la solución de reacción obtenida después de la fusión se sometió a PCR en las condiciones siguientes, con C3B3DB-5' y C3B3DB-3' que son cebadores más cortos que C3B3DB-H 1 y C3B3DB-L2. C3B3DB-5' : cct gaa ttc CAC CAT GTA CTT CAG GC (SEQ I D NO: 38) C3B3DB-3' : att gcg gcc gct tat cae tta teg (SEQ I D NO: 39) 94 °C durante 1 minuto 94 °C durante 30 minutos, 72 °C durante 1 minuto, 25 ciclos Los fragmentos amplificados se purificaron con una columna S-400 H R (Amersham Biosciences #27-51 40-01 ), se digirieron con EcoRI/Notl , y se insertaron en el sitio EcoRI/Notl de pCXN D3. Se confirmó la secuencia de nucleótidos insertada , y se completó la construcción de pCXN D3-C3B3DB-Flag. La secuencia de nucleótidos del diacuerpo que comprende una secuencia guía y una secuencia rótulo Flag, que se confirmó en el presente Ejemplo, se muestra en SEQ I D NO: 50, y la secuencia de aminoácidos del diacuerpo codificado por la presente secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ I D NO: 51 . En SEQ I D NO: 50, la secuencia de nucleótidos desde los nucleótidos 58 a 432 corresponden a la región variable de cadena pesada, la secuencia de nucleótidos desde los nucleótidos 433 a 447 corresponden a la secuencia ligadora, y la secuencia de nucleótidos desde los nucleótidos 448 a 768 corresponden a la región variable de cadena liviana. En la SEQ I D NO: 51 , la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 20 a 144 corresponden a la región variable de cadena pesada, la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 45 a 1 49 corresponden a la secuencia ligadora, y la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 50 a 256 corresponden a la región variable de cadena liviana. 6-2. Establecimiento de las líneas celulares que expresan diacuerpo Estos vectores se introdujeron en células DG44 para establecer las líneas celulares productoras de diacuerpo C3B3. Diez pg de cada vector de expresión de diacuerpo se digirió con Pvu l y se introdujo luego en células DG44 suspendidas en PBS(-) ( 1 x 1 07 células/mL, 800 pL) por electroporación (BIO-RAD Gene Pulser, 1 .5 kV, 25 pF). Las células se diluyeron a una cantidad adecuada en medio de crecimiento (CHO-S-SFM I I/PS), y se emplacaron en una placa de 96 cavidades. Al d ía siguiente se añadió G41 8 hasta una concentración final de 500 pg/mL. Aproximadamente dos semanas después se seleccionaron las cavidades con un único clon por observación en microscopio, y se realizó SDS-PAGE con 1 0 µ?_ de cada uno de los sobrenadantes de los cultivos. Después de realizar inmunoelectrotransferencia sobre la membrana PVDF, se realizó inmunoelectrotransferencia Western con anticuerpo anti-Flag M2 (SIGMA #F31 65) y anticuerpo anti-HRP de ratón (Amersham Biosciences # NA931 0), y se realizó el análisis para buscar las líneas celulares productoras de diacuerpo. Se realizaron cultivos en mayor escala para la l ínea celular que mostró mayor nivel de producción. 6-3. Purificación de diacuerpo 1 00 mL del sobrenadante de cultivo de la l ínea celular DG44 que expresa diacuerpo C3B3 se pasaron por un filtro de 0.22 pm (M I LLI PORE #SLGV033RS), que luego se adsorbió sobre una columna K9 (Amersham Biosciences #1 9-0870-01 ) llenada con 1 mL de gel de azarosa de afinidad ANTI-FLAG M2 (SIGMA #A-2220) con una bomba P1 a una velocidad de flujo de 1 mL/min . Después de lavar la columna con 6 mL de 50 mM Tris-HCI (pH ,4), 1 50 mM NaCI , 0.01 % Tween20, se realizó la elución con 7 mL de 0.1 M de Glicina-HCI (pH 3,5), 0.01 % Tween20. Se lavó y se realizó la elución con AKTAexplorer 10S a una velocidad de flujo de 1 mL/min . Mientras se vigilaba la absorbancia a 280 nm, se recolectaron fracciones eiuidas de 0.5 mL a la vez en tubos de 5 mL precargados con 50 pL de 1 M Tris-HCI (pH 8.0). Las fracciones recolectadas se combinaron , se concentraron a 300 pL con Centricon YM-1 0 (amicon #4205), y luego se sometieron de inmediato a cromatografía por filtración en gel . La cromatografía por filtración en gel se realizó con una columna Superdex 200 HR (Amersham #1 7-1 088-01 ) y AKTAexplorer 1 0S a una velocidad de flujo de 0,4 mL/min. Después de equilibrar con 0.01 % Tween20 en PBS(-), la muestra purificada M2 antes mencionada se inyectó manualmente. Mientras se vigilaba la absorbancia a 280 nm , se recolectaron 0.5 mL de las fracciones en tubos de 5 mL. Las fracciones correspondientes a cada pico se combinaron, se pasaron por un filtro de 0.22 µ?? (M I LLI PORE #SLGV033RS o SLGV004SL), y luego se guardaron a 4 °C. 6-4. Anál isis de la actividad inductora de muerte cel ular de los diacuerpos Tal como se indica en el gráfico de la Fig . 6, se separaron minicuerpos C3B3 por by cromatografía por filtración en gel en tres fracciones principales (Pico (1 ), Pico (2) y Pico (3)) de acuerdo con diferencias de peso molecular (estructura tridimensional ). Para cada una de estas fracciones se midió la actividad inductora de muerte celular y se comparó con la actividad inductora de muerte celular de diacuerpo 2D7. Como consecuencia , solo se observaron débiles actividades inductoras de muerte celular en las fracciones de alto peso molecular (Picos ( 1 ) y (2): multímeros C3B3), pero en la fracción de d ímero (Pico (3): diacuerpo C3B3), se observó fuerte actividad inductora de muerte celular superior a la del diacuerpo 2D7 (Fig . 7). 6-5. Comparación de los efectos de supresión de crecimiento entre el diacuerpo C3B3 purificado y el diacuerpo 2D7 Se compararon las capacidades supresoras de crecimiento del diacuerpo C3B3 purificado (Fig . 6, Pico (3)) y las del diacuerpo 2D7 conocido. Se emplacaron células ARH77 en una placa de 96 cavidades a una concentración celular de 1 -2 x 1 04 células/cavidad , se añadió cada uno de los anticuerpos obtenidos a una concentración adecuada , y se tomaron mediciones de recuento de células después de cultivar durante tres d ías. Se determinó el recuento de células viables con WST-8 (reactivo de recuento de células viables SF; Nacalai Tesque). Más específicamente, después de añadir este reactivo a las células a 1 0 pL/cavidad , las células se cultivaron a 37 °C durante 1 .5 horas, y se midió la absorbancia a 450 nm con un espectrofotómetro. Los valores se presentaron como recuento celular viable relativo (Fig . 8). Como resultado, el diacuerpo C3B3 mostró fuerte capacidad supresora de crecimiento a menos concentración , comparado con el diacuerpo C3B3. Esto demostró que el diacuerpo C3B3 es un anticuerpo de bajo peso molecular con mayor efecto antitumoral que el diacuerpo 2D7. Ejemplo 7 Preparación a gran escala de diacuerpo C3B3 7-1 . Preparación de sobrenadante de cultivo 1 x 1 07 células DG44 que expresan diacuerpo C3B3-Flag se suspendieron en 2 L de medio CHO-S-SFM I I (Invitrogen , c/n: 1 2052-098)/PS ( Invitrogen , c/n : 1 51 40-1 22) y se sembraron en cellSTACK (Corning , c/n : 3271 ). Las células se cultivaron a 37 °C en un incubador con 5% C02, cuando la tasa de supervivencia era inferior al 60% (cultivo de aproximadamente 7 días), se recolectó el sobrenadante del cultivo. El sobrenadante del cultivo juntado se centrifugó a 3000 rpm durante 20 minutos a 4 °C, y el sobrenadante se pasó por un filtro de 0.22 pm (Corning , c/n : 43051 3) y se guardó a 4 °C. 7-2. Purificación por cromatografía (1 ) 7-2-1 . Purificación gruesa con u na columna aniónica Una columna XK50 se llenó con Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences, c/n : 1 7-051 0-01 ) (volumen del lecho de 1 00 mL). Se lavó en secuencia con 500 mL de agua milliQ y 500 mL de 20 mM Tris-HCI (pH 7.5) que contenía 1 M NaCI y 0.01 % Tween20 (QB), y luego se equilibró con 500 mL de 20 mM Tris-HCI (pH 7.5) que contiene 0.01 % Tween20 (QA). Para una dilución a la mitad se añadió 2L de agua milliQ a 2 L de sobrenadante de cultivo, y después de ajustar el pH a 7 ,8 al agregar aproximadamente 20 mL de 1 M Tris, esto se adsorbió sobre la columna equilibrada. Se realizó la adsorción con una bomba P1 , con una velocidad de flujo máxima de 1 0 mL/min a 4 °C durante aproximadamente 1 5 horas. Luego se lavó y se eluyó con AKTAprime a una velocidad de flujo de 1 0 mL/min . Después de lavar al columna con 300 mL de 1 6% QB , se realizó la elución con 400 mL de 25% QB y 100 mL de 30% QB. Se recolectaron fracciones de 1 2 mL en tubos de 1 5mL. Mientras se vigilaba la absorbancia a 280 nm, se recolectaron fracciones del primer pico después de cambiar a 25% QB hasta que pasaron 1 00 mL de 30% QB. Después de combinar las fracciones juntadas y pasarlas por un filtro de 0.22 pm (Corning, c/n: 430626), se añadieron 0,6 equivalentes de QA, se ajustó la concentración salina a aproximadamente 1 50 mM , y se guardó a 4 °C. La columna se lavó en secuencia con 400 mL de QB , 200 mL de 0.1 M NaOH , y 200 mL de QB , luego se equilibró con 500 mL de QA para su regeneración. 7-2-2. Purificación por columna de afinidad ANTI-FLAG M2 (columna M2) La columna XK26 se llenó con gel de afinidad ANTI-FLAG M2 Freezer-Safe (SIGMA, c/n: A2220) (volumen del lecho de 10 mL). Se lavó con 50 mL de 50 mM Tris-HCI (pH 7,4) que contiene 150 mM NaCI y 0.01% Tween20 (MA), y 30 mL de 0.1 M Glicina-HCI (pH 3,5) que contiene 0.01% Tween20 (MB), y luego se equilibró con 50 mL de MA. Luego se adsorbieron 540 mL de la muestra purificada gruesa en la columna aniónica (correspondiente a aproximadamente 2 L de sobrenadante de cultivo) sobre dos columnas M2 conectadas en tándem. Se realizó la adsorción con una bomba P1, con una velocidad de flujo máxima de 1 mL/min a 4 °C durante aproximadamente 15 horas. Le siguió lavado y elución con AKTAexplorer 10S a una velocidad de flujo de 4 mL/min. Después de lavar la columna con 50 mL de MA, se realizó la elución con 30 mL de 100% MB. Mientras se vigilaba la absorción a 280 nm, se recolectaron 2 mL de eluido cada uno en tubos de 5 mL precargados con 200 µ? de 1 M Tris-HCI (pH 8.0). Después de combinar las fracciones juntadas y concentrarlas a 5 mL con Centriprep YM-10 (amicon, c/n: 4304), se lo sometió de inmediato a filtración en gel para intercambio de amortiguador. Cuando se halló materia insoluble por observación visual, se pasó la solución por un filtro de 0.22 µ?t? (MILLIPORE, c/n: SLGV013SL) y luego se sometió a filtración en gel.

Después de eluir la muestra, se equilibró la columna con 50 mL de MA y se guardó a 4 °C. Cuando no se iba a usar la columna durante más de una semana, se pasaban 30 mL o más de 50 mM Tris-HCI (pH 7,4) que contiene 1 50 mM NaCI y 0,02% NaN3 por la columna, y se guardó a 4 °C. 7-2-3. Purificación por cromatografía por filtración en gel Se realizó filtración en gel con HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (Amersham, c/n: 1 7-1071 -01 ) para separar el diacuerpo y realizar intercambio de amortiguador. Esta operación se realizó con AKTAexplorer 10S a una velocidad de flujo de 2 mL/min . Después de equilibrar con PBS(-) que contiene 0.01 % Tween20, la muestra purificada M2 antes mencionada se inyectó manualmente. Mientras se vigilaba la absorción a 280 nm , el pico de elusión en un volumen de retención de aproximadamente 200 mL se recolectó en 2.5 mL cada una en tubos de 5 mL. Las fracciones juntadas se combinaron , se pasaron por un filtro de 0.22 pm (M I LLI PORE, c/n : SLGV033RS), y se guardaron a 4 °C. Después de examinar la actividad de cada lote del diacuerpo purificado, se combinaron y se concentraron a aproximadamente 1 mg/mL con Centriprep YM-1 0 (amicon , c/n: 4304), se pasaron por un filtro de 0.22 pm (M I LLI PORE, c/n : SLGV033RS), y luego se guardaron. 7-3. Purificación por cromatografía (2) Del sobrenadante de cultivo obtenido con anterioridad (7-1 ), se purificó el diacuerpo C3B3 en tres etapas: cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por hidroxiapatita y cromatografía por filtración en gel. Después de una dilución al tercio del sobrenadante de cultivo con agua ultrapura, se ajustó el pH a 8.0 con 1 M Tris. Luego se sometió a columna de fluido rápido Q Sepharose (GE Healthcare) equilibrada con 20 mM Tri-HCI (pH 8.0) que contiene 0,02% Tween20, y se lavó la columna con el mismo amortiguador. Luego se fluyeron los polipéptidos adsorbidos en la columna con el mismo amortiguador con un gradiente lineal de concentración de NaCI de 0 M a 0,5 M. Las fracciones obtenidas se analizaron por SDS-PAGE, y se recolectaron todas las fracciones que contienen minicuerpos C3B3 (multímeros C3B3 y diacuerpo C3B3). La fracción C3B3 obtenida enel primer paso se añadió a una columna de hidroxiapatita (BIO-RAD, tipo I, 20 µ??) equilibrada con 10 mM de amortiguador fosfato (pH 7.0) que contiene 0.02% Tween20, y después de lavar la columna con el mismo amortiguador, se incrementó la concentración de amortiguador fosfato linealmente hasta 250 mM para eluir los polipéptidos adsorbidos en la columna. Se analizaron los picos eluidos por SDS-PAGE y filtración en gel con columna Superdex 200 PC 3.2/30 (GE Healthcare). Solo se recolectó el pico que muestra el peso molecular del diacuerpo C3B3 deseado.

La fracción de pico de diacuerpo C3B3 obtenido en la segunda etapa se concentró con corte ultra 10 kDa (MILLIPORE), se equilibró en PBS(-) que contenía Tween20 al 0.01%, y se agregó a columna HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (GE Healthcare). Las fracciones obtenidas se analizaron SDS-PAGE, y el pico principal que contiene el diacuerpo C3B3 deseado se determinó como fracción purificada. Cuando el diacuerpo C3B3 purificado se sometió a filtración por gel anal ítico con columna Superdex 200 PC 3.2/30 , se obtuvo un pico único y el peso molecular aparente era de aproximadamente 52 kDa. El análisis por SDS-PAGE del diacuerpo C3B3 demostró que en condiciones reductoras y no reductoras se observó una única banda en la posición del peso molecular de un monómero (aproximadamente 27 kDa). En consecuencia, se demostró que el diacuerpo C3B3 es un dímero en el cual dos moléculas de un Fv monocatenario están unidas no covalentemente. Ejemplo 8 Eval uación de eficacia del diacuerpo C3B3 8-1 . Efectos su presores del diacuerpo C3B3 sobre el crecimiento celular ¡n vitro Para analizar los efectos antitumorales del diacuerpo C3B3 en detalle se examinaron los efectos supresores de crecimiento del diacuerpo sobre varias l íneas celulares de tumores hematopoyéticos humanos como sigue. Las células usadas eran l íneas celulares B humanas transformadas por EBV ARH-77, IM-9, y MC/CAR; y la l ínea celular de linfoma de Burkitt humano, HS-Sultan. Se usó medio RPM I 1 640 que contiene 10% FCS para cultivar ARH-77 , IM-9 , y HS-Sultan. Se usó medio de Dulbecco modificado por Iscove que contiene 20% FCS para cultivar MC/CAR. Las células se emplacaron en placas de 96 cavidades con una concentración de 3 x 1 03 células/cavidad para ARH-77 y I M-9, 5 x 1 03 células/cavidad para MC/CAR, y 1 x 1 04 células/cavidad para HS-Sultan, y se cultivaron las células en presencia de diacuerpo C3B3 o diacuerpo 2D7 en un incubador de 5% C02 a 37 °C durante tres d ías. Después se agregó WST-8 (Cat. No. 07553-1 5, Nakalai Tesque) a cada cavidad , se continuó el cultivo durante otras cuatro horas, y luego se midió la absorción a 450 nm (longitud de onda de referencia 655 nm) con un lector de microplacas. La absorbancia en las cavidades sin adición de anticuerpo se definió como 1 00% y la absorbancia en cavidades sin adición de células se definió como 0% para medir el crecimiento celular. Se realizó el análisis por triplicado y se calcularon la media y la desviación estándar (Fig . 9). En todas las líneas celulares usadas para el experimento, el diacuerpo C3B3 y el diacuerpo 2D7 demostraron supresión de crecimiento celular dependiente de la concentración. Sin embargo, en comparación , el diacuerpo C3B3 mostró efectos supresores de crecimiento que superaron la actividad máxima de diacuerpo 2D7 con menor concentración . 8-2. Efectos antitumorales in vivo del d iacuerpo C3B3 8-2-1 . Ensayo de IgG humano de suero de ratón La cantidad de IgG humano contenido en suero de ratón se determinó por ELISA tal como se describe a continuación . Se colocaron 1 00 µ? de IgG antihumano de cabra (B IOSOURCE) diluido a 1 pg/rnL con 0.1 mol/L de amortiguador de bicarbonato (pH 9.6) en una placa de 96 cavidades (Nunc). Se incubó a 4 °C durante la noche y se inmovilizó el anticuerpo. Después del bloqueo se añadió 100 pl_ de suero de ratón en forma gradual o 1 00 pL de IgG humano (Cappel ) como muestra estándar. Esto se incubó a temperatura ambiente durante dos horas. Después de lavar, se añadió 1 00 µ?_ de anticuerpo IgG antihumano rotulado con fosfatasa alcalina diluida al 5000 (BIOSOURCE), y se incubó a temperatura ambiente durante dos horas. Después de lavar, se añadió solución de sustrato y se incubó, y luego se midió la absorbancia a 405 nm con M ICROPLATE READER (BIO-RAD). 8-2-2. Efectos antitumorales del d iacuerpo C3B3 en células B transformadas por EBV humano en ratones trasplantados ??-9) 8-2-2-1 . Producción de ratones trasplantados con IM-9 Los ratones trasplantados con I M-9 se produjeron como sigue.

Células IM-9 subcultivadas in vitro en medio RPM I 1 640 (SIGMA-ALDRICH) que contiene 10% FCS (Hyclone) se ajustaron a 5 x 106 células/mL en el medio antes mencionado. Ratones Scid (hembras de seis semanas, Japan Clea) pretratadas el día anterior con administración intraperitoneal de 1 00 pL de antiasialo-GM 1 (Wako Puré Chemical Industries) se sometieron a inyección de 200 pL de la solución de preparación de células I M-9 antes mencionada por la vena de la cola. 8-2-2-2. Admi nistración de anticuerpo Dos veces por d ía en los d ías primero, segundo y tercero después del trasplante de I M-9 hasta un total de seis administraciones, se les administró el anticuerpo (diacuerpo 2D7 o diacuerpo C3B3) a los ratones trasplantados IM-9 por la vena de la cola antes mencionados en 1 0 mg/kg. Para el grupo control , se administró PBS que contiene Tween20 por la vena de la cola a 1 0 mL/kg . 8-2-2-3. Evaluación de los efectos antitumorales de diacuerpo C3B3 sobre ratones trasplantados con IM-9 Los efectos antitumorales del diacuerpo C3B3 se evaluaron con el tiempo de supervivencia de los ratones y la cantidad de IgG humano en suero. Tal como se muestra en la Fig. 1 0, el tiempo de supervivencia de los ratones a los que se les administró diacuerpo C3B3 era claramente extendido, comparado con el grupo de ratones control . El tiempo de supervivencia era extendido incluso comparado con los ratones a los que se administró diacuerpo 2D7. Además, el d ía 1 4 después del trasplante con I M-9, se juntó suero de los ratones, y se realizaron mediciones por ELISA tal como se describió con anterioridad en 8-2-1 ( Fig. 1 1 ). Como resultado, se observó una notable reducción del nivel de IgG humano sérico en los ratones a los que se administró diacuerpo C3B3, comparado con el grupo de ratones control , tal como se muestra en la Fig . 1 1 . El nivel de IgG humano sérico mostró una tendencia descendente en los ratones a los que se administró diacuerpo C3B3, incluso comparados con los ratones a los que se les administró diacuerpo 2D7. En consecuencia , esto demostró que el diacuerpo C3B3 tiene efecto antitumoral más fuerte sobre ratones trasplantados con células B transformadas por EBV humanas queel diacuerpo 2D7. Ejemplo 9 Examen de la acción inductora de muerte celular del diacuerpo C3B3 sobre PBMC humanas Se analizó el efecto inductor de muerte celular de diacuerpo C3B3 y diacuerpo 2D7 sobre células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC). Las PBMC se aislaron de sangre periférica de un voluntario adulto sano por centrifugación con gravedad específica. Las PBMC se emplacaron en una placa de 96 cavidades a 5 x 1 04 células/cavidad (en el caso de estimulación con concanavalina A) o a 1 .5 x 1 05 células/cavidad (en el caso de estimulación con SAC). Se añadió concanavalina A (en adelante referida como ConA, Wako Puré Chemical I ndustries) hasta una concentración final de 10 pg/mL, y SAC (Pansorbin Células, Carbiochem ) se añadió hasta una concentración final de 0.01 % . Además, se añadió el diacuerpo C3B3 o diacuerpo 2D7 hasta una concentración final de 1 0 pg/mL. Las células se cultivaron en un incubador de 5% C02 a 37 "C durante tres d ías. El tercer d ía de cultivo se añadieron, 1 0 pL de Cell Counting Kit-8 ( Dojindo) a cada cavidad, y después de 7 horas de reacción en incubador con 5% C02 a 37 °C, se midió la absorbancia a 450 nm (longitud de onda de referencia 630 nm) con M ICROPLATE READER (B IO-RAD). Tal como se muestra en la Fig . 12, los resultados demostraron que el diacuerpo C3B3 muestra actividad inductora de muerte celular más fuerte que diacuerpo 2D7 cuando se estimula con ConA, además de cuando se estimula con SAC. Ejemplo 10 Efecto supresor de crecimiento celular In vítro del diacuerpo C3B3 Los efectos supresores de crecimiento de diacuerpo C3B3 sobre células T tumorales se examinaron como sigue. Se usaron células de la cepa Jurkat (E6-1) (adquiridas de ATCC). Se usó medio RPMI1640 que contiene 10% FCS para cultivar las células Jurkat (E6-1). Las células Jurkat se emplacaron en una placa de 96 cavidades a 2*104 células/cavidad y se cultivaron en incubador con 5% C02 a 37 °C durante 3 días en presencia de diacuerpo C3B3 o diacuerpo 2D7. Luego se añadió Cell Counting Kit-8(Código No. CK04, Dojindo Laboratories, Japón) a cada cavidad. Después de incubar durante dos horas se midió la absorbancia a 450 nm (longitud de onda de referencia 630 nm) con un lector de microplaca. Para medir el crecimiento celular se definió la absorbancia de las cavidades sin adición de anticuerpo como 100% y la absorbancia en las cavidades sin adición de células como 0%. Se realizó el examen por triplicado y se calcularon la media y el error estándar (SE) (Fig. 13). El diacuerpo C3B3 y el diacuerpo 2D7 demostraron supresión de crecimiento celular en células Jurkat dependiente de la concentración. Sin embargo, en comparación, el diacuerpo C3B3 mostró mayor efecto supresor de crecimiento que el diacuerpo 2D7, incluso con menor concentración.

Estudios previos han demostrado que los anticuerpos HLA muestran efectos sobre los linfocitos en general (documentos WO2004/033499 y WO2005/1 00560), y los anticuerpos de longitud total , y se espera que los anticuerpos de bajo peso molecular recién descubiertos en la presente invención de acuerdo con los resultados antes mencionados muestren efectos generales sobre los linfocitos. Aplicabilidad i ndustrial La presente invención proporciona un anticuerpo anti-HLA y un anticuerpo C3B3 novedosos, que tienen actividad inductora de muerte celular cuando se ligan de forma cruzada con un anticuerpo anti IgG de ratón . Los anticuerpos de bajo peso molecular del anticuerpo C3B3 (diacuerpos) mostraron fuerte actividad inductora de muestre celular sin la adición de un anticuerpo anti IgG de ratón, y su actividad excedió en gran manera la actividad de los anticuerpos convencionales de bajo peso molecular en un sistema de análisis de células tumorales ¡n vitro. Adicionalmente, los anticuerpos de bajo peso molecular también mostraron mayores efectos anti-tumorales que los anticuerpos convencionales de bajo peso molecular en modelos en ratón transplantados con tumor in vivo. Más específicamente, los anticuerpos C3B3 de bajo peso molecular son superiores a los anticuerpos convencionales de bajo peso molecular en los que ellos muestran alta actividad citocida contra células tumorales hematopoyéticas, y al mismo tiempo, presentan actividad inductora de muerte celular en menor concentración . Por lo tanto, puede esperarse que los anticuerpos de bajo peso molecular ejerzan una eficacia de fármaco superior que los anticuerpos convencionales de bajo peso molecular como agentes terepéuticos contra tumores hematopoyéticos , trastornos i nmunológicos mieloides, trastornos autoinmunitarios , y si mi lares.

Claims

REIVIN DICACION ES

1 . Un anticuerpo caracterizado porque comprende regiones variables de cadena pesada que comprenden CDR1 , 2 y 3, que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO 7, 8, y 9.

2. Un anticuerpo caracterizado porque comprende regiones variables de cadena liviana que comprenden CDR1 , 2 y 3, que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO 10, 1 1 y 1 2.

3. Un anticuerpo caracterizado porque comprende regiones variables de cadena pesada que comprenden CDR1 , 2, y 3, que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO 7, 8, y 9, y regiones variables de cadena liviana que comprenden CDR , 2 , y 3 que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ I D NO 1 0, 1 1 y 1 2.

4. Un anticuerpo caracterizado porque comprende la región variable de cadena pesada de cualquiera de: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2; (b) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena pesada de (a); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; y (d ) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 .

5. Un anticuerpo caracterizado porque comprende la región variable de cadena liviana de cualquiera de: (e) una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4; (f) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena liviana de (e); (g) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3; y (h) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3.

6. Un anticuerpo caracterizado porque comprende una región variable de cadena pesada de cualquiera de: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2; (b) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, 'deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 2, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena pesada de (a); (c) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; y (d ) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 ; y una región variable de cadena liviana de cualquiera de: (e) una región variable de cadena liviana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4; (f) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 4, y que es funcionalmente equivalente a la región variable de cadena liviana de (e); (g) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3; y (h) una región variable de cadena liviana que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 3.

7. Un anticuerpo caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6; (b) una secuencia de aminoácidos con una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de SEQ I D NO: 6; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 5 ; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que se híbrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 5.

8. Un anticuerpo caracterizado porque se fija al mismo epitopo que el epitopo de la proteína del antígeno leucocitarío humano (HLA) a la cual se fija el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .

10. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque reconoce un antígeno leucocitarío humano (HLA). 1 1 . El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 0, caracterizado porque el HLA es un HLA clase I . 1 2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 1 , caracterizado porque el HLA de clase I es un HLA-A. 1 3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 a 12 , caracterizado porque es un anticuerpo de bajo peso molecular. 14. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 3, caracterizado porque el anticuerpo de bajo peso molecular es un diacuerpo. 1 5. Un polinucleótido de (a) o (b): (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ I D NO: 1 , 3, o 5; o (b) un polinucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas con el polinucleótido de (a), y que codifica un anticuerpo con actividad equivalente al anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 4. 1 6. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 5. 1 7. Una célula huésped caracterizada porque comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 5 o el vector de acuerdo con la reivindicación 16. 1 8. Un método para producir el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 4, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) producir el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 5; (b) construir un vector que comprende el polinucleótido de (a); (c) introducir el vector de (b) en las células huésped ; y (d ) cultivar las células huésped de (c). 1 9. Un agente inductor de muerte celular caracterizado porque contiene el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como ingrediente activo. 20. El agente inductor de muerte celular de acuerdo con la reivindicación 1 9, caracterizado porque induce muerte celular de una célula B o una célula T. 21 . El agente inductor de muerte celular de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizado porque la célula B o la célula T es una célula B activada o una célula T activada. 22. Un agente supresor de crecimiento celular caracterizado porque comprende el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como ingrediente activo. 23. Un agente antitumoral caracterizado porque comprende el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 4 como ingrediente activo. 24. El agente antitumoral de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque el tumor es un tumor hematopoyético. 25. Un agente terapéutico para enfermedades autoinmunitarias caracterizado porque comprende el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 4 como ingrediente activo .