MX2008010773A - Produccion de proteinas biologicamente activas. - Google Patents
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
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Abstract
La presente invención describe una proteína de fusión que se expresa en un ensamblaje recombinante de tipo cuerpo proteico (RPBLA) en células y organismos hospedadores eucariotas. Más particularmente, se expresa un polipéptido biológicamente activo fusionado a una secuencia de una proteína que media la inducción de formación de RPBLA y se acumula en células hospedadoras tras la transformación con un vector apropiado. La célula eucariota hospedadora no produce cuerpos proteicos en la ausencia de la proteína de fusión. También se describen métodos para la preparación y uso de los RPBLAs y de la proteína de fusión, así como ácidos nucleicos y moléculas que codifican las proteínas de fusión.
Description
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS BIOLÓGICAMENTE ACTIVAS
REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de número de serie 60/776.391 presentada el 23 de febrero del 2006.
CAMPO TÉCNICO La presente invención contempla la producción de proteínas y péptidos recombinantes biológicamente activos, denominados conjuntamente polipépt idos , en células eucariotas y en organismos como sistemas huésped. Más particularmente, se fusiona un polipéptido biológicamente activo se fusiona a secuencia inductora del cuerpo proteico (PBIS) que media la inducción de ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) para formar una proteína de fusión que se expresa de forma estable y se acumula en el sistema huésped como un RPBLA tras la transformación de las células huésped con un vector apropiado.
TÉCNICA ANTERIOR La producción de proteínas recombinantes para usos terapéuticos, nutracéuticos o industriales ha disfrutado de un gran éxito durante la pasada década. La introducción de genes heterólogos que presentan una secuencia de nucleótidos deseada conduce a la expresión de un polipéptido o proteina que presenta la correspondiente secuencia de residuos de aminoácidos o estructura primaria deseada. Sin embargo, en muchos casos la proteina o polipéptido expresado ha tenido la secuencia de residuos de aminoácidos de material producido de manera natural pero ha carecido de la actividad biológica de ese material. La actividad biológica, dada la adecuada estructura primaria del producto expresado, puede ser una función del producto que tiene el plegamiento adecuado y enlaces de hidrógeno, Van der Waals, iónicos y disulfuro apropiados, y que presenta también modificación tras la traducción apropiada, tal como por ejemplo, glucosilación . Por ejemplo, la formación de un enlace disulfuro tiene lugar de manera espontánea en el lumen del retículo endoplasmático (RE) , pero no en el citosol de procariotas, lo que hace a las células bacterianas tales como células E. Coli huéspedes pobres para la síntesis de proteínas de mamíferos correctamente plegadas que se estabilizan normalmente mediante enlaces disulfuro. La formación de enlaces disulfuro puede ocurrir en el espacio periplásmico de E. Coli en el que proteínas de tipo PDI son funcionales (Fernandez, et al., 2001. Mol. Microbiol. Apr 40 (2) : 332-436) , sin embargo, el sistema de oxidación-reducción-oxidación no es muy eficaz. Un caso particular se refiere a la eritropoietina (EPO) , una proteina que estimula la producción de glóbulos rojos. La EPO recombinante se describe en la patente de los EE.UU. número 4.703.008 concedida a Lin. La patente describe actividades para proteina EPO expresadas de la E. Coli, S. cerevisiae, y células de ovario de hámster chino (CHO) mamífero y de riñon de mono verde africano (COS-1). Aunque los anticuerpos anti-EPO inmunoreaccionaron con EPO expresada por cada tipo de células, sólo las proteínas expresadas a partir de células de mamífero mostraron actividad biológica in vivo sustancial como EPO, y concentraciones similares mediante ensayo de anticuerpos, ensayos in vitro e in vivo. La proteína expresada por mamíferos es la que se utiliza para tratar seres humanos. Se cree que esas diferencias en la actividad biológica eran función de la glucosilación ya que E. Coli, una procariota, no puede glucosilar sus proteínas expresadas. Las células de levadura son eucariotas, pero su patrón de glucosilación para proteínas secretadas es diferente de las de un mamífero. Por otro lado, las células CHO y COS-1 utilizadas para proporcionar a la proteina actividad biológica sustancial eran de mamíferos y la proteína expresada a partir de las mismas fue útil. Estudios publicados de la EPO glucosilada y sin glucosilar indican que la glucosilación desempeña un papel crítico en la estabilización de la eritropoietina en condiciones de desnaturalización. Narhi et al., (1991) J. Biol. Chem. 266 (3 ): 23022-23026. Además, se ha notificado que el tiempo de vida in vivo y la actividad de la EPO pueden relacionarse con la glucosilación de la molécula. Para la producción recombinante de proteínas terapéuticas, industriales y de otro uso de origen eucariótico, se prefieren enormemente las células eucariotas. Se ha mostrado que diferentes células eucariotas y organismos pueden producir productos terapéuticos basados en proteínas activas. Desafortunadamente, el alto coste derivado con frecuencia de los bajos niveles de producción de proteínas recombinantes y/o los procedimientos de aislamiento y purificación de proteínas, pueden invalidar su aplicación industrial. Se está llevando a cabo una investigación activa para mejorar tanto los niveles de producción como los procedimientos de purificación mediante diferentes enfoques.
Una forma de mejorar la eficiencia del aislamiento de proteínas recombinantes es mediante la concentración intracelular . Uno de estas aproximaciones es la agregación aleatoria de proteínas recombinantes en cuerpos de inclusión no-secretados, los cuales pueden separarse mediante técnicas de purificación basadas en gradientes de densidad de las células lisadas. Cuerpos de inclusión son depósitos de proteínas amorfos encontrados en las bacterias. Estudios de caracterización estructural mostraron que la naturaleza insoluble de los cuerpos de inclusión puede deberse a interacciones intermoleculares hidrófobas de proteínas plegadas no nativas. (Seshadri et al., 1999, Methods Enzymol. 309:559-576) . La estrategia general utilizada para recuperar proteínas activas a partir de cuerpos de inclusión requiere la solubilización de la proteína para romper los agregados aleatorios seguido de una o más etapas de replegamiento químico. Esto es un problema importante a resolver porque la eficiencia de la renaturalizacion de proteínas desnaturalizadas puede ser limitada, principalmente si la proteína contiene enlaces disulfuro (Clare, Ed., Apr. 2001 Curr. Open. Biotechnol. 12 (2 ) : 202-207 ) . Más particularmente, desnaturalizadores fuertes tales como altas concentraciones de agentes caotrópicos (es decir, urea e clorhidrato de guanidinio) se utilizan para solubilizar proteínas no plegadas que se acumulan en agregados. A continuación se separan los desnaturalizantes mediante diálisis en un intento de replegar la proteína en una conformación natural. La actividad biológica de tales proteínas replegadas es normalmente mucho menor que la de proteínas formadas nativas. Los cuerpos proteicos (PBs) son estructuras que ocurren de forma natural en algunas semillas de plantas que han evolucionado para concentrar proteínas de almacenamiento intracelularmente en células eucariotas manteniendo su correcto plegamiento y actividad biológica. Los cuerpos proteicos (PB) comparten algunas de las características de los cuerpos de inclusión de las bacterias. Son densos y contienen gran cantidad de proteínas agregadas que están estrechamente empaquetadas por medio de interacciones hidrófobas [Momany et al., 2006 J Agrie. Food Chem. Jan 25;54 (2) : 543-547 y Garrat, et al., 1993 Proteins Jan; 15 (1) : 88-99] . Además, la presencia de una gran cantidad de enlaces disulfuro en algunas de las PBIS, tal como por ejemplo, RX3, [Ludevid, et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:227-234 y Kawagoe et al., 2005 Plant Cell Apr 17 ( 4 ) : 1141-1153 ] , que están probablemente implicados en la formación de PB y la estabilización, podría representar una dificultad adicional para producir una proteína plegada nativa, biológicamente activa, particularmente una proteína que contiene residuos de cisteína . La observación de una actividad biológica sin necesidad de un replegamiento y renaturalización de una gran variedad de proteínas producida en los cuerpos proteicos (PBs) sintéticos en hospedadores eucariotas de naturaleza no-levadura, fue inesperada. Se ha desarrollado una nueva tecnología basada en la fusión de un dominio de proteínas de reserva de las semillas de plantas con la proteína de interés (documento WO 2004/003207) para aumentar la estabilidad y la acumulación de proteínas recombinantes en plantas superiores. Estas proteínas de reserva son específicas para semillas de plantas, en las que se acumulan en cuerpos proteicos de manera estable (Galili et al., 1993, Trends Cell Biol 3:437-442) . Las proteínas de reserva se insertan en el lumen del retículo endoplasmático (RE) por medio de un péptido señal y se ensamblan o bien en el retículo endoplasmático desarrollando orgánulos específicos denominados cuerpos proteicos derivados de RE (RE-PB) o bien en vacuolas de reserva de proteínas (PSV) (Okita et al., 1996 Annu . Rev.
Plant Physiol Mol. Biol . 47:327-350; Hermán et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Syerfoot et al., 1999 Plant Cell 11:629-642) . También se han descrito proteínas de reserva recombinantes de longitud completa para ensamblarse en orgánulos tipo PB en sistemas huésped no vegetales tales como Xenopus oocytes . Se ha descrito la expresión de las prolaminas de cereales (las proteínas de reserva de cereales más abundantes) en Xenopus oocytes tras la inyección de los ARNm correspondientes. Este sistema se ha utilizado como un modelo para estudiar las propiedades de selección como diana de estas proteínas de reserva (Simón et al., 1990, Plant Cell 2:941-950; Altschuler et al., 1993, Plant Cell 5:443-450; Torrent et al., 1994, Planta 192:512-518) y para someter a prueba la posibilidad de modificar la a-zeína de 19 kDa, una prolamina del maíz, mediante la introducción de los aminoácidos esenciales lisina y triptófano en su secuencia, sin alterar su estabilidad (Wallace et al, 1988, Science 240: 662-664) . También se han producido zeínas, el grupo complejo de las prolaminas de maíz, en levadura con varios objetivos. Coraggio et al., 1988, Eur J Cell Biol 47:165-172, expresó a-zeínas modificadas y nativas en levadura para estudiar determinantes de selección como diana de esta proteina. Kim et al., 2002, Plant Cell 14: 655-672, estudió las posibles interacciones entre a-, ß-, ?- y d-zeinas que conducen a la formación del cuerpo proteico. Para tratar esta cuestión, transformaron células de levadura con ADNc que codifica para estas proteínas. Además, esos autores construyeron proteínas de fusión de zeína-GFP para determinar la ubicación subcelular de las proteínas de zeína en las células de levadura pero no observaron la formación de estructuras densas, concentradas características de PBs bona fide. Debe observarse que Kim et al., 2002, Plant Cell 14: 655-672, concluyó que la levadura no es un buen modelo para estudiar las interacciones de zeínas porque las zeínas, por sí mismas, se acumulaban muy poco en la levadura transformada. Las células de levadura también se utilizaron como un modelo para estudiar los mecanismos que controlan el transporte y deposición del cuerpo proteico de las proteínas de reserva del trigo denominadas gliadinas (Rosenberg et al., 1993, Plant Physiol 102:61-69). La actividad biológica es particularmente relevante para vacunas, las cuales deben inducir una respuesta inmune correcta en un humano inmunizado u otro animal. Varias vacunas nuevas están compuestas por inmunógenos (antígenos) de subunidades sintéticos, recombinantes o altamente purificados que se cree que son más seguros que vacunas completamente inactivadas o vivas atenuadas. Sin embargo, la ausencia de componentes inmunomoduladores adyuvantes asociados con las vacunas atenuadas o muertas a menudo da como resultado una inmunogenicidad más débil para tales vacunas . Los adyuvantes inmunológicos son agentes que potencian las respuestas inmunitarias especificas frente a vacunas. Un adyuvante inmunológico puede definirse como una sustancia o formulación que, cuando se incorpora en una vacuna, actúa generalmente para acelerar, prolongar, o potenciar la calidad de las respuestas inmunitarias especificas frente a antigenos de vacunas. La palabra adyuvante se deriva del verbo en latín adjuvare, que significa ayudar o asistir. Los mecanismos adyuvantes de acción incluyen lo siguiente: (1) aumentar la semivida inmunológica o biológica de los inmunógenos de la vacuna; (2) mejorar la administración de antígeno de las células presentadoras de antígenos (CPA) , así como el tratamiento y presentación de antígenos por las CPA; y (3) inducir la producción de citocinas inmunomoduladoras . La fagocitosis supone la entrada de partículas grandes, tales como células apoptóticas o microbios enteros. La capacidad de las células para envolver partículas grandes apareció probablemente como una función nutricional en organismos unicelulares; sin embargo, organismos complejos han tomado ventaja del mecanismo fagocítico para satisfacer funciones adicionales. Por ejemplo, la fagocitosis de antígenos realizada por los macrófagos, las células-B o las células dendríticas representa un proceso clave en inmunidad innata y adaptativa. En efecto, la fagocitosis y la posterior destrucción de microbios en los fagosomas forman la base de la defensa innata de un organismo contra patógenos intracelulares . Además, la degradación de patógenos en el lumen del fagosoma y la producción de péptidos antigénicos, que se presentan por células fagocíticas para activar linfocitos específicos, también relacionan la fagocitosis a la inmunidad adaptativa (Jutras et al., 2005 Annual Review in Cell Development Biology. 21:511-27) . Las proteínas presentes en las partículas envueltas se encuentran con una serie de proteasas de degradación en los fagosomas. Sin embargo, este entorno destructivo genera péptidos que son capaces de unirse a moléculas del MHC de clase II. Los complejos de antígeno-MHC de clase II recién formados administran a la superficie celular para la presentación a las células T CD4+ (Boes et al., 2002. Nature 418:983-988) . La activación de estas células provoca el subconjunto Th2 de citocinas tales como IL-4 e IL-5 que ayuda a las células B a proliferar y a diferenciarse, y se asocia con la respuesta inmunitaria de tipo humoral. La mayoría de las pruebas indican que, además de la clara implicación de la ruta de MHC de clase II en la respuesta inmunitaria contra patógenos fagocitados, los antígenos de patógenos, incluyendo micobacterias, Salmonella , Brucella , y Leishmania , pueden provocar una presentación cruzada de antígenos. Es decir, la presentación de antígenos envueltos mediante fagocitosis por la respuesta dependiente de MHC de clase I provoca la proliferación de células T citotóxicas CD8+ (Ackerman et al., 2004 Nature Immunology 5(7) : 678-684 Kaufmann et al., 2005 Current Openions in Immunology 17 (1) : 79-87) . Las células dendríticas desempeñan un papel central de presentación de antígenos para provocar al sistema inmunitario (Blander et al., Nature Immunology 2006 10:1029-1035) . Aunque es poco común, las células dendríticas son las CPA más sumamente especializadas, con capacidad tanto para instigar como para regular la reactividad inmunitaria (Lau et al. 2003 Gut 52:307-314) . Aunque las células dendríticas son importantes para presentar antígenos, particularmente para iniciar respuestas inmunitarias primarias, los macrófagos son el tipo más destacado de CPA en sitios inflamatorios y se especializan para aclarar material necrótico y apoptótico. Los macrófagos pueden actuar no solo como CPA, sino que también pueden llevar a cabo papeles o bien proinflamatorios o bien antiinflamatorios, dependiendo de los medios por los que se activen. Considerando que la CPA desempeña un papel central en la inducción y regulación de la inmunidad adaptativa (humoral y celular) , el reconocimiento y la fagocitosis del antigeno por esas células puede considerarse como una etapa clave en todo el proceso de inmunización. Se ha desarrollado una amplia variedad de técnicas basadas en la captación de partículas fluorescentes para estudiar la fagocitosis por los macrófagos (Vergne et al., 1998 Analytical Biochemistry 255:127-132). Un aspecto importante de las vacunas veterinarias es la diversidad genética de las especies que se consideran y el requisito de sistemas genéricos que funcionen en diferentes especies. En gran parte, esta diversidad limita la utilización de técnicas moleculares de selección como diana a marcadores de superficie celular y moduladores inmunitarios tales como citocinas, porque para muchas especies incluyendo fauna salvaje, solo se dispone de un conocimiento mínimo de estas moléculas. Por tanto, deben preferirse adyuvantes que se basan en señales de activación universales de la respuesta inmunitaria innata (es decir, que son idénticos en diferentes especies). Teniendo en cuenta estos requisitos, los sistemas de administración de vacunas son apropiados para estrategias de vacunas veterinarias y para fauna salvaje ( Scheerlenck et al., 2004 Methods 40:118-124). Tal como se trata en mayor detalle a continuación en el presente documento, la presente invención da a conocer que la expresión de una proteina de fusión comprendida por (i) una secuencia de proteínas que media la inducción de los ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes ¦(RPBLA) unida a (ii) un polipéptido biológicamente activo (proteína de interés o diana) que induce la acumulación de esos RPBLA en células de organismos eucariotas tales como platas, hongos, algas y animales, produciendo una diana biológicamente activa (proteína).
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un sistema y método para producir una proteína de fusión que contiene una secuencia de inducción de cuerpo proteico (PBIS) y un péptido o proteína biológicamente activo (a menudo denominados conjuntamente como polipéptido o diana en el presente documento) de interés en células eucariotas. Las proteínas de fusión que contienen el polipéptido de interés se acumulan de manera estable como ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) en las células eucariotas, que pueden ser células de plantas, animales, hongos o algas. Las células de plantas superiores son células huésped eucariotas preferidas en algunas realizaciones, mientras que en otras realizaciones se prefieren células de plantas inferiores tales como algas, las células animales tales como mamíferos e insectos son células huésped eucariotas preferidas en otras realizaciones y los hongos son células huésped eucariotas preferidas todavía en otras realizaciones. Puede expresarse la proteína de fusión constitutiva o preferentemente en células particulares en eucariotas multicelulares. Las PBIS pueden mediar la inducción de la formación de RPBLA y la entrada y/o acumulación de la proteína de fusión en estos orgánulos, con modificaciones tras la traducción y/o el plegamiento apropiadas tales como la glucosilación basal y la formación de enlaces disulfuro para proporcionar actividad biológica al péptido expresado o proteína de interés (diana) .
Por tanto, se contempla como un aspecto de la presente invención, una célula huésped eucariota que contiene una proteina de fusión recombinante biológicamente activa en ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) . La proteina de fusión contiene dos secuencias unidas en la que una secuencia es una secuencia inductora del cuerpo proteico (PBIS) y la otra es la secuencia de al menos 20 residuos de aminoácidos de un polipéptido biológicamente activo. El polipéptido biológicamente activo, tal como se encuentra en la naturaleza, puede ser heterólogo a las células huésped eucariotas enumeradas y se expresa por tanto en un segundo tipo de células que es diferente de la célula huésped eucariota mencionada en primer lugar, o se produce de manera sintética. Además, la célula huésped eucariota no produce PB en ausencia de la proteina de fusión. Por tanto, es la expresión de la proteina de fusión y la PBIS lo que causa que la célula huésped forme los ensamblajes similares a cuerpos proteicos o RPBLA. En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico utilizada para la transformación comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una PBIS, y (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés. En una realización, el extremo 3' de la secuencia
(i) de ácido nucleico se une al extremo 5' de dicha secuencia
(ii) de ácido nucleico. En otra realización, el extremo 5' de una secuencia (i) de ácido nucleico se une al extremo 3' de una secuencia (ii) de ácido nucleico. Por tanto, la secuencia de PBIS puede encontrarse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de la proteina de fusión. Debe entenderse que todas las uniones de ADN que tratadas en el presente documento para la expresión de una proteina de fusión son de tal manera que los dos componentes de la proteina de fusión se expresan en marco. El polipéptido biológicamente activo de la proteina de fusión presenta al menos el 25 por ciento, preferiblemente al menos el 50 por ciento, más preferiblemente al menos el 75 por ciento, y lo más preferiblemente al menos el 90 por ciento de la actividad biológica de el mismo polipéptido aislado del segundo tipo de células anterior en un ensayo de la actividad de ese polipéptido. En otra realización particular, la secuencia de ácido nucleico utilizada para la transformación comprende, además de las secuencias (i) y (ii) de ácidos nucleicos mencionadas anteriormente, una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos ligadora o espaciadora. La secuencia de aminoácidos espaciadora puede ser una secuencia de aminoácidos escindible, o no escindible, por medios enzimáticos o autoproteólicos o químicos. En una realización particular, la secuencia (iii) de ácido nucleico se coloca entre las secuencias (i) y (ii) de ácidos nucleicos, por ejemplo, el extremo 3' de la secuencia (iii) de ácido nucleico se une al extremo 5' de dicha secuencia (ii) de ácido nucleico. En otra realización, el extremo 5' de dicha secuencia (iii) de ácido nucleico se une al extremo 3' de la secuencia (ii) de ácido nucleico. Además, en una realización particular, la secuencia de ácido nucleico utilizada con fines de transformación codifica para una secuencia según la solicitud de patente WO 2004003207, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos que puede escindirse específicamente por medios enzimáticos o químicos está presente o ausente. En una realización adicional, las proteínas de fusión pueden ser una fusión directa entre PBIS y el péptido o proteína de interés. En una realización adicional, el método de la invención comprende además aislar y purificar la proteína de fusión biológicamente activa.
En otra realización, el método de la invención comprende además aislar y purificar la proteina de fusión, y obtener una proteina de fusión biológicamente activa. Por tanto, cuando la proteina de fusión se ensambla fuertemente y se rodean por una membrana, puede ser difícil ilustrar que el polipéptido es biológicamente activo. Como consecuencia, puede someterse a ensayo la actividad biológica tras la eliminación de la membrana, y se requiere, la solubilización de la proteína de fusión. Se contempla por tanto un método para preparar un polipéptido biológicamente activo. En este método, se proporcionan ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) que comprenden una proteína de fusión rodeada por una membrana. Normalmente los RPBLA están presentes en forma generalmente esférica que presenta un diámetro de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 mieras (?) , pero en algunas ocasiones su forma es amorfa y pueden variar mucho en dimensión, pero todavía se derivan del RE. La proteína de fusión contiene dos secuencias unidas entre sí en la que una secuencia es una secuencia inductora del cuerpo proteico (PBIS) y la otra es un polipéptido biológicamente activo. Los RPBLA están en contacto con un tampón acuoso que contiene una cantidad desensambladora de membrana de un detergente (tensioactivo) . Se mantiene ese contacto durante un periodo de tiempo suficiente para desensamblar la membrana y a una temperatura que no desnaturaliza el polipéptido biológicamente activo para separar la membrana y la proteina de fusión. A continuación se recoge de una manera habitual la proteina de fusión separada, o puede actuarse adicionalmente sobre la misma sin recogerse . En algunas realizaciones, la proteina de fusión separada muestra la actividad biológica del polipéptido biológicamente activo. En otras realizaciones, la actividad biológica del polipéptido se muestra después de que la proteina de fusión se disuelva o se disperse en un tampón adecuado. Aún en otras realizaciones, la proteina de fusión tiene que escindirse para dar sus partes constituyentes antes de que se muestre la actividad biológica del polipéptido. Por tanto, el polipéptido biológicamente activo puede unirse a la PBIS mediante una secuencia de aminoácidos espadadora que puede escindirse por medios enzimáticos o químicos. Entonces, al escindirse, el polipéptido biológicamente activo muestra actividad biológica cuando se escinde de la PBIS de la proteína de fusión. En algunos casos, la proteína de fusión mantiene su actividad incluso cuando aún no se ha incorporado al RPBLA intacto.
En otra realización, el polipéptido biológicamente activo contiene al menos dos secuencias de glucosilación unidas por N. En aún otra realización preferida, el polipéptido de interés se fusiona con una proteina de reserva natural o modificada, tal como por ejemplo, dominios de prolamina o prolaminas naturales o modificadas. En otra realización, se utilizan los RPBLA que contienen el polipéptido biológicamente activo como un sistema de administración para el polipéptido biológicamente activo. Los beneficios de esta invención podrían aplicarse en la administración de fármacos, vacunas y nutrición. En aún otra realización, pueden utilizarse los RPBLA que contienen un antígeno de polipéptido como un sistema de administración para proporcionar capacidad adyuvante (aumentar la respuesta inmunitaria) . La administración de estos RPBLA puede representar una mejora en los parámetros de inmunización tales como velocidad, cantidad, calidad y duración de la inmunización. El efecto beneficioso de administrar antígenos en RPBLA puede alcanzarse porque (i) el antígeno está encapsulado y permanece más tiempo en la sangre o en el tracto gastrointestinal (efecto de liberación lenta) y/o (ii) el antígeno se expone mejor al sistema inmunitario (RPBLA como vehículo de presentación del antígeno) y/o (iii) la presencia de moléculas adyuvantes en preparaciones de RPBLA, y/o (iv) los RPBLA son portadores que pueden atravesar membranas que ellos mismos proporcionan capacidad adyuvante, y/u otros. Por tanto, otro aspecto de la invención es la vacuna o inoculo (composición inmunogénica) que comprende una cantidad efectiva inmunogénica de RPBLAs que contienen una proteína de fusión recombinante biológicamente activa disuelta o dispersada en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La proteína de fusión recombinante contiene dos secuencias unidas entre si en la que una secuencia es una PBIS y la otra es un polipéptido biológicamente activo frente al que debe inducirse una respuesta inmunológica mediante dicha vacuna o inoculo. Normalmente, la composición diluyente farmacéuticamente aceptable también contiene agua. En otra realización, se co-suministra con un antígeno aislado un RPBLA que no incorpora un antígeno pero que posee propiedades adyuvantes activas para inducir una respuesta inmune. En otra realización, la PBIS puede utilizarse como un portador para atravesar membranas. En una realización específica la PBIS es ZERA (RX3) o un fragmento de la misma.
La presente invención tiene varios beneficios y ventaj as . Un beneficio es que el uso de la invención permite la expresión relativamente sencilla y rápida de una proteina recombinante biológicamente activa en una célula eucariota de selección . Una ventaja de la invención es que proporciona una fuente de proteínas recombinantes biológicamente activas fácilmente obtenibles y purificables debido a las propiedades únicas por la expresión en RPBLAs . Otro beneficio de la invención es que los RPBLA que contienen la proteína de fusión pueden utilizarse para la administración de vacunas, incluyendo la administración de una vacuna oral. Otra ventaja de la presente invención es que los RPBLA que contienen proteína de fusión pueden utilizarse en sí en un inmunógeno en una vacuna inyectable. Otra ventaja de la presente invención es que los RPBLA pueden utilizarse como aislantes, estructuras unidas a membrana que aislan el polipéptido expresado del resto de los componentes celulares. Estos aislantes protegen a la célula de la actividad del polipéptido, y al polipéptido de la célula, aumentando la tasa de acumulación. Por tanto, puede expresarse satisfactoriamente polipéptidos difíciles biológicamente activos que son tóxicos y/o lábiles. A partir de la discusión que sigue, todavía otros beneficios y ventajas resultarán evidentes para el experto en la técnica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos que forman una parte de esta descripción, La Figura 1, el panel A es una representación esquemática de los constructos utilizados para los estudios de transfección de células CHO. El constructo pECFP-Nl corresponde al control que expresa el ECFP en el citosol. El pRX3-ECFP y pRX3-Gx5-ECFP son los constructos que expresan la proteína de fusión RX3-ECFP, en ausencia o presencia de un espadadora formado por cinco aminoácidos de glicina (Gx5) , respectivamente. El p22aZ-ECFP es el constructo que codifica para la alfa zeína (22 KDa) del maíz fusionada al ECFP. En la parte inferior, se representan los vectores basados en pcDNA3.1(-) (Invitrogen) junto con varios constructos que se tratan a continuación en el presente documento. El panel B muestra la representación esquemática de vectores binarios para la transformación de plantas (parte superior) y los vectores de baculovirus para la infección de insectos (parte inferior) . "RX3" = secuencia de gamma-zeina rica en prolina N-terminal ; "(Gly)x5" = espaciador formado por cinco glicinas; "ECFP" = gen de la proteina fluorescente cian reforzada; "PCMV" = promotor del citomegalovirus humano; "PPH" = promotor de la polihedrina; "PSv4o" = promotor temprano del SV40; "VMC35S x2" = promotor del virus del mosaico la coliflor doble; "PCbhi" = promotor principal de la celulasa; "t35S" = terminador del virus del mosaico de la coliflor; "VGT" = potenciador de traducción del virus de grabado del tabaco; "SV40 ter" = terminador de SV40; "VGT ter" = señal de poliadenilación de timidina cinasa del virus del herpes simple; "cbhl ter" = señal de poliadenilación de celulasa principal; "Kana/Neo" = gen de resistencia a la kanamicina/neomicina; "Amp R" = gen de resistencia a la ampicilina; "Gentamicina" = gen de resistencia a la gentamicina; "SPCbhi" = péptido señal de celulasa principal; "Ori fl" = origen de ADN de cadena sencilla fl; "Ori pUC" = origen de replicación plásmido; "BGH ter" = terminador de la hormona de crecimiento bovina; "P BLA" = promotor del gen de beta lactamasa; "GFP" = proteina fluorescente verde; "DsRED" = proteina fluorescente roja Dicosoma; "hHG" = hormona del crecimiento humano; "EGF" = factor de crecimiento epidérmico humano; "EK" = enterocinasa bovina; "GUS" = glucuronidasa ;
"RTB" = subunidad de lectina de la ricina {Ricinos comunis) ; "Casp2" = caspasa 2 humana; "Casp3" = caspasa 3 humana; "Int" = inteina Ssp DnaB de New England Biolabs; "mlnt" = versión mutada de inteina Ssp DnaB (sustitución Aspl54 —> Ala) . La Figura 2 muestra inmunot ransferencias de estudios de fraccionamiento subcelular de células CHO t ransfectadas con pRX3-ECFP, pRX3-G-ECFP y pECFP-Nl como control (panel A) ; plásmidos p3. l-RX3-hGH, p3.1-RX3, p3.1-RX3-EK, p3.1-RX3-C3, p3.1-RX3-C2, p3.1-RX3-GUS y p3. l-RX3-I-hGH (panel B) . En el panel B también se muestra la inmunotransferencia de estudios de fraccionamiento subcelular de plantas de tabaco agroinfiltradas con pB-RX3-RTB. El panel C corresponde a estudios de fraccionamiento subcelular de larvas de insectos infectadas con pF-RX3-DsRED y pF-DsRED como control. Se cargaron homogeneizados de células transíectadas en gradientes escalonados de sacarosa, y tras la centrifugación, se analizaron la acumulación de las proteínas de fusión correspondientes en el sobrenadante, inferíase y fracciones de sedimentos mediante inmunotransferencia . Los pesos moleculares y el anticuerpo utilizado en la inmunotransferencia se indican en la parte derecha. H, homogeneizado cargado en el gradiente de densidad; S, sobrenadante; Fx, inferíase superior del colchón de sacarosa al X% p/p; P, sedimento por debajo del 56% del colchón de sacarosa . La Figura 3 es una fotografía de microscopía confocal en seis paneles que muestra la ubicación de las proteínas de fusión RX3-ECFP (panel A) , RX3-Gx5-ECFP (panel B) , 22aZ-ECFP (panel D) , RX3-GFP (panel E) y RX3-DsRED (panel F) en RPBLA dentro de células CHO transfectadas . Algunas de las estructuras RPBLA que contienen las proteínas de fusión activas (fluorescentes) se indican mediante flechas. La ubicación del ECFP in el citosol y en el núcleo (panel C) en células CHO transfectadas por pECFP-Nl se muestra como control. "N" = núcleo. La Figura 4 es una fotografía de microscopía confocal en cuatro paneles que muestra la ubicación de las proteínas de fusión RX3 fluorescentes en diferentes huéspedes. En el panel A se muestran las secciones ópticas confocales de tejido de hojas de las plantas de tabaco epidérmicas co-agroinfiltradas con pB-RX3-GFP y un vector binario que codifica para HcPRO, un supresor del silenciamiento génico. Pueden observarse muchos RPBLA fluorescentes que contienen la proteína de fusión activa RX3-GFP. A la derecha, en el panel B, la fusión de la fluorescencia de RX3-GFP y la fase de contraste muestra el alto porcentaje de células transitoriamente transfectadas .
En el panel C se muestra la proyección de las secciones ópticas de células de insectos SF9 infectadas con pF-RX3-DsRED. Secciones ópticas de un micrómetro de tejido adiposo de larvas de insectos infectadas con pF-RX3-DsRED se muestran en el panel D. Algunas de las estructuras RPBLA que contienen las proteínas de fusión activas (fluorescentes) se indican con flechas. La Figura 5 es una fotografía en seis paneles (A-F) que muestra la ubicación de proteínas de fusión RX3 dentro de RPBLA en células de CHO, cuatro días después de su transfección . Se utilizó microscopía óptica para mostrar células CHO que expresan RX3-hGH (paneles A y B) inmunolocalizados mediante la utilización de suero anti-RX3 y anti-hGH. El panel C muestra la inmunolocalización de la proteína RX3 con antisuero Rx3. El suero anti-hGH se utilizó en el panel D para inmunolocalizar la proteína de fusión RX3-I-hGH. En el panel E se muestra la incubación de células CHO que expresan la proteína de fusión RX3-GUS con antisuero RX3. Se observaron RPBLA más pequeños en células CHO que expresan RX3-EK, incubadas con suero anti-RX3 (panel F) . Se indican el retículo endoplasmático (RE) y los RPBLA. La Figura 6 muestra inmunotransferencias de tipo western que ilustran la inducción de la autoescisión de inteina Ssp DnaB tras la solubilización de la proteína de fusión RX3-I-hGH de una preparación de RPBLA mediante una centrifugación a velocidad lenta. Los paneles A y B ilustran la autoescisión de la proteína de fusión RX3-I-hGH (inteina Ssp DnaB de tipo natural), tras la solubilización. Se incluyó la proteína de fusión RX3-Im-hGH (inteina Ssp DnaB mutada) como un control negativo. Se cargaron volúmenes equivalentes de las muestras por carril, y se realizó la inmunotransferencia de tipo western con suero anti-RX3 (panel A) o con suero anti-hGH (panel B) . La longitud total de las proteínas de fusión se indica con puntas de flechas blancas y los productos de la autoescisión de inteina Ssp DnaB (RX3-I en el panel A, y hGH en el panel B) se indican con puntas de flecha negras. El panel C ilustra la comparación de la eficacia de la autoescisión de la proteína de fusión RX3-I-hGH después de solubilización en SDS al 0,1% (SI) y bifásica (S2) . Se cargaron volúmenes equivalentes de las muestras por carril, excepto TO que se sobrecargó 4 veces. La incubación con suero anti-hGH muestra la proteína de fusión de longitud completa RX3-I-hGH (punta de flecha blanca) y la hGH liberada (punta de flecha negra) . "S" = fracción soluble; = fracción insoluble; "TO" = muestra anterior a la inducción de la autoescisión de la inteina.
La Figura 7 contiene micrografias que muestran la captación y tratamiento de RPBLA de RX3-DsRED de larvas de insectos por macrofagos. En el panel A, se muestra un análisis de microscopía confocal de macrofagos 1 hora después de la incubación con RPBLA de RX3-DsRED de insectos. A la izquierda pueden observarse 2 macrofagos mediante microscopía de contraste de fase. A la derecha, se muestra la imagen fusionada de fluorescencia con DsRED (puntas de flechas negras) y la autofluorescencia de los macrofagos (puntas de flechas blancas) a partir de la sección óptica de 1 micrómetro de las mismas células. La observación del núcleo (N) en esta sección óptica indica que los RPBLA se han cogido y son ahora intracelulares . El panel B muestra el transcurso de tiempo del estudio (1 y 10 horas) de la fluorescencia de DsRED emitida por los macrofagos, tras la incubación durante 1 hora con RPBLA que contienen RX3-DsRED. A la izquierda, la microscopía de contraste de fase muestra la presencia de macrofagos. A la derecha, la fluorescencia de DsRED de secciones ópticas de 1 micrómetro muestra la presencia de RPBLA no digeridas tras 1 hora (punta de flecha blanca) y un patrón de fluorescencia de DsRED más homogéneo a las 10 horas que indica RPBLAs digeridos y dispersos. La imagen insertada corresponde a un mayor aumento de los RPBLA no digeridos tras 1 hora. La Figura 8 contiene micrografias que muestran la captación de RPBLA de RX3-DsRED de larvas de insectos mediante células dendriticas. Las fotografías correponden a células dendriticas incubadas con RPBLA (panel A) y RPBLA sin membrana (panel B) a lo largo del tiempo (2, 5 y 10 horas) . En la parte superior de cada panel, el contraste de fase muestra la presencia de células dendriticas. En la parte inferior, la fluorescencia de DsRED de las mismas células dendriticas muestran la presencia de RPBLA absorbidos a la membrana plasmática (2 horas) o fagocitados en el interior de la célula (5 y 10 horas) . "N" = núcleo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un polipéptido recombinante biológicamente activo contemplado es una parte de una proteína de fusión que forma ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) , generalmente rodeados por una membrana, en las células huésped en las cuales se expresan. La formación de RPBLA se induce mediante una secuencia inductora de cuerpos proteicos (PBIS), que comprende un péptido señal y un dominio de proteína de reserva que forma depósitos de alta densidad en el interior de las células. Estos depósitos densos pueden acumularse en el citosol, un orgánulo de sistema de endomembrana , mitocondria, plastidio o puede secretarse. Con la excepción de algunas semillas de cereales, la célula huésped eucariota no produce por ella misma cuerpos proteicos (PB) en ausencia de la proteina de fusión. Por tanto, es la expresión de la proteina de fusión y su parte PBIS lo que causa que la célula huésped forme ensamblajes similares a cuerpos proteicos o RPBLA. Una proteina de fusión contemplada comprende dos secuencias de polipéptidos unidas entre si directa o indirectamente mediante un enlace peptidico, en la que una secuencia es la de una secuencia inductora de cuerpo proteico (PBIS) unida a la segunda secuencia que es un producto de polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, péptido o proteina) de interés (diana) . El polipéptido biológicamente activo, tal como se encuentra en la naturaleza, es heterólogo de las células huésped eucariotas enumeradas y por tanto se expresa en un segundo tipo de células que es diferente de la célula huésped eucariota mencionada en primer lugar, o se produce de forma sintética. Es decir, el polipéptido biológicamente activo es heterólogo de las células huésped eucariotas. PBIS son secuencias de aminoácidos de proteínas o polipéptidos que median la inducción de la formación de RPBLA y la entrada y/o acumulación de proteínas en orgánulos tal y como el RE. La proteína de fusión, cuando está libre y separada del PBIS, muestra actividad biológica similar a la del polipéptido. El polipéptido biológicamente activo de la proteína de fusión muestra al menos el 25 por ciento, preferiblemente al menos el 50 por ciento, más preferiblemente al menos el 75 por ciento y lo más preferiblemente al menos el 90 por ciento de la actividad biológica del mismo polipéptido aislado del segundo tipo de células anterior, o sintetizado in vitro. Un material se considera "biológicamente activo" o "bioactivo" si tiene interacción con, o efecto sobre, cualquier metabolito, proteína, receptor, organela, célula o tejido en un organismo. Estas actividades biológicas pueden determinarse y cuantificarse fácilmente utilizando técnicas habituales para determinar la actividad de ese polipéptido. Por ejemplo, pueden compararse resultados de ensayos para determinar la actividad biológica entre el polipéptido aislado del segundo tipo de células, o sintetizado in vitro, y el polipéptido expresado. Cuando se compara la actividad de una proteína de fusión, la proporción de ese material proporcionado mediante la PBIS y cualquier secuencia de ligador se tienen en cuenta en la comparación de ensayos. La actividad biológica se muestra mediante RPBLA expresados, la proteina de fusión como una proteina libre de una membrana que rodea o como un polipéptido diana que está libre de su PBIS. En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico utilizada para la transformación comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una PBIS, y (ii) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés. En una realización, el extremo 3' de la secuencia (i) de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha secuencia (ii) de ácido nucleico. En otra realización, el extremo 5' de la secuencia (i) de ácido nucleico está unido al extremo 3' de la secuencia (ii) de ácido nucleico. Por tanto, la secuencia PBIS puede estar en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de la proteina de fusión. Es necesario entender, que todas las uniones de ADN tratadas en el presente documento para la expresión de una proteina de fusión son tales que los dos componentes de la proteina de fusión se expresan en marco. La mayoría de los cuerpos proteicos tienen estructuras de forma redonda (generalmente esférica), con diámetros de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 ?. Cuando se expresan en células animales, los RPBLA tienen generalmente forma esférica, con diámetros de aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 3 mieras (?) y tienen una membrana que los rodea. Los RPBLA expresados en plantas también tienen generalmente forma esférica, tienen diámetros de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 ? . y están rodeados por una membrana. Los RPBLA expresados tanto en plantas como animales u hongos derivan del ER si se marcan allí mediante una señal especifica de secreción y se acumulan fuera de la envuelta del ER de la célula huésped después del ensamblaje. Se observa que los RPBLA que contienen EGF expresados en el RE de células vegetales no son generalmente esféricos, y eran de forma a morfa y de tamaño no uniforme. Los ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes presentan una densidad predeterminada que puede diferir entre diferentes proteínas de fusión, pero que se conoce para una proteína de fusión particular que está preparándose. Esa densidad predeterminada de los RPBLA es normalmente superior a la de sustancialmente todas las proteínas endógenas de células huésped presentes en el homogeneizado, y normalmente es de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,35 g/ml. La alta densidad de los RPBLA novedosos se debe a la capacidad general de las proteínas de fusión recombinantes para ensamblarse como multímeros y acumularse en agregados ordenados asociados con membranas. Los RPBLA contemplados se expresan en eucariotas y pueden caracterizase por sus densidades tal como se observó anteriormente, y su tamaño y forma. Se cree que la parte de polipéptido de la proteína de fusión obtiene su actividad biológica a partir del plegamiento en el interior del RE y en algunos casos a partir de la glucosilación en el RE. De manera interesante, la mayoría de plantas, animales tales como mamíferos y eucariotas unicelulares tales como hongos, N-glucosilan proteínas en el mismo patrón basándose en la secuencia de glucosilación de tripéptidos Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que "X" es cualquier residuo de aminoácidos excepto prolina. Por tanto, se forma inicialmente un polipéptido Glc3Mang (GlcNAc) 2 unido por N, y vuelve a cortarse tras la formación para dar un polipéptido Man7_9 (GlcNAc) 2 unido por N que puede excretarse al aparato de Golgi o retenerse en el RE. Esta glucosilación básica es marcadamente similar a lo largo del género eucariota. Además, la modificación post-traduccional tal como glucosilación específica de huésped terminal puede ocurrir en el aparato de Golgi para proteínas que no se han mantenido en RPBLA como son las proteínas de fusión contempladas en el presente documento. En este método, se proporcionan ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) que frecuentemente comprenden un ensamblaje ordenado de proteína de fusión rodeada por una membrana, preferiblemente están presentes en una forma generalmente esférica que presenta un diámetro de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 mieras. La proteína de fusión contiene dos secuencias unidas entre sí, en la que una secuencia es una secuencia inductora del cuerpo proteico (PBIS) y la otra es un polipéptido biológicamente activo. Los RPBLA se ponen en contacto con un tampón acuoso que contiene una cantidad desensambladora de membrana de un detergente ( tensioactivo) . Ese contacto se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para desensamblar la membrana y a temperatura que no desnaturaliza el polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, por encima de la congelación hasta aproximadamente 40°C) para separar la membrana y la proteína de fusión. La proteína de fusión separada se recoge a continuación de manera habitual, o puede actuarse adicionalmente sobre la misma sin recogerse. Tensioactivos útiles ilustrativos incluyen Triton-X 100, CHAPS y similares tal como son muy conocidos en bioquímica para solubilizar lípidos. La proteína de fusión separada está normalmente en forma insoluble debido a las interacciones entre partes de PBIS de la proteína de fusión mediada al menos en parte por la presencia de residuos de cisteína. Sin embargo, el polipéptido de interés, forma complejo con chaperones eucariotas y foldasas derivados del ER y por tanto, se mantiene ensamblado en una conformación correcta a pesar de ser atado al dominio de PBIS ensamblado (y por tanto insoluble) . Las interacciones PBIS-PBIS pueden alterarse y las proteínas de fusión solubilizarse poniendo en contacto la proteína de fusión con un tampón acuoso que contiene un agente reductor tal como ditiotreitol o 2-mercaptoetanol o ?-mercaptoetanol (D-ME) . Las condiciones se escogen de forma que no se rompe o despliega la proteína de interés biológicamente activa. Entonces se recoge la proteína de fusión solubilizada, separada, que contiene el polipéptido biológicamente activo o se usa de otra manera. Además, las dos partes de la fusión pueden escindirse la una de la otra al solubilizarse. Debe entenderse que la escisión no necesita tener lugar justo en los bordes entre las dos partes.
En algunas realizaciones, la proteina de fusión separada muestra la actividad biológica del polipéptido biológicamente activo. En otras realizaciones, la proteina de fusión se disuelve o dispersa en un tampón adecuado para mostrar la actividad biológica del polipéptido. Por ejemplo, tal como se trata en detalle a continuación en el presente documento, la hormona del crecimiento humana (hGH) expresada en RPBLAs en células de mamíferos y solubilizada como una proteína de fusión mostró actividad significativa y también como un polipéptido escindido mostró actividades sustancialmente similares a la de los polipéptidos nativos. Aún en otras realizaciones, la proteína de fusión debe escindirse para dar sus partes constituyentes antes de que se muestre la actividad biológica del polipéptido. Por tanto, el polipéptido biológicamente activo puede unirse al PBIS por medio de una secuencia de aminoácidos espaciadora que puede escindirse por medios enzimáticos o químicos. Después, al escindirse la proteína de fusión de la BPIS y someterse a ensayo, el polipéptido (biológicamente activo) diana muestra actividad biológica. Los estudios tratados a continuación en el presente documento ilustran la actividad biológica del polipéptido T-20 escindido de su pareja de fusión y producido en plantas.
Secuencias inductoras de cuerpos proteicos Una secuencia inductora de cuerpo proteico (PBIS) contemplada y la célula huésped provienen preferiblemente de diferentes filum biológicos. Por tanto, la PBIS es preferiblemente de una planta superior, un espermatofito, mientras que la célula huésped es un eucariota que es diferente de un espermatofito y puede ser una célula animal, tal como por ejemplo, células de mamíferos o insectos, un hongo, una célula de alga, todas las cuales son de un filum diferente al espermatofito . Una PBIS y la célula huésped también pueden ser del mismo filum de tal manera que pueden ser ambas de una planta superior, por ejemplo. Ejemplos no limitativos, ilustrativos de PBIS incluyen proteínas de reserva o proteínas de reserva modificadas, tales como por ejemplo, prolaminas o prolaminas modificadas, dominios de prolamina o dominios de prolamina modificados. Las prolaminas se revisan en Shewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53(370) :947-958. PBIS preferidas son las de compuestos de prolamina tales como gamma-zeína, alfa-zeína, delta-zeína, beta-zeína, prolamina de arroz y gamma-gliadina que se tratan a continuación en el presente documento.
Una PBIS también incluye una secuencia que dirige una proteina hacia el retículo endoplasmático (RE) de una célula vegetal, animal u hongo. Esa secuencia a menudo denominada secuencia líder o péptido señal puede ser de la misma planta que el resto de la PBIS o de una planta diferente. Péptidos señal ilustrativos son la secuencia de péptidos señal de gamma-zeína de 19 residuos que se muestra en el documento WO 2004003207 (documento US 20040005660), la secuencia de péptidos señal de 19 residuos de alfa-gliadina o la secuencia de péptido señal de gamma-gliadina de 21 residuos (véase Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450; Sugiyama et al., 1986 Plant Sci. 44:205-209; y Rafalski et al., 1984 EMBO J 3 ( 6) : 1409-11415 y las citas en el mismo). La proteína relacionada con la patogénesis de clase PR10 incluye una secuencia de péptido señal de 25 residuos que también es útil en el presente documento. También se notifican en la bibliografía péptidos señal de otras plantas y animales que funcionan de manera similar. Las características de los péptidos señal responsables de dirigir la proteína al RE se han estudiado de forma extensiva (von Heijne et al., 2001 Biochim. Biophys. Acta Dec 12 1541 ( 1-2 ): 114-119) . Los péptidos señal no comparten homología en una estructura primaria, pero tienen una estructura en tres partes común: una región-h hidrófoba central y regiones de flanqueo N-terminal y C-terminal hidrófilas. Estas similitudes, y el hecho de que las proteínas se trasladan a través de la membrana del RE utilizando rutas aparentemente comunes, permiten el intercambio de péptidos señal entre diferentes proteínas o incluso desde organismos diferentes que pertenecen a diferentes filum (véanse los ejemplos 1 y 2 a continuación en el presente documento, y Martoglio et al., 1998 Trends Cell Biol. Oct; 8 (10) : 410-415) . Por tanto, una PBIS puede incluir un péptido señal de una proteína de un filum diferente de plantas superiores. La Gamma-zeína, una proteína de reserva del maíz cuyo ADN y secuencias de residuos de aminoácidos se muestran a continuación en el presente documento, es una de las cuatro prolaminas del maíz y representa el 10-15 por ciento del total de proteínas en el endospermo del maíz. Como las prolaminas de otros cereales, la alfa- y gamma-zeínas se biosintetizan en polisomas unidos a membrana en el lado citoplasmático del RE rugoso, se ensamblan en el lumen y después se aisla en cuerpos proteicos derivados del RE (Hermán et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234 ; Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403) . La Gamma-zeína está compuesta por cuatro dominios característicos i) un péptido señal de 19 aminoácidos, ii) el dominio de repetición que contiene ocho unidades del hexapéptido PPPVHL (SEQ ID NO:l) [(53 residuos de aminoácidos (aa) ] , iii) el dominio ProX en el que los residuos de prolina se alternan con otros aminoácidos (29 aa) y iv) el dominio C-terminal rico en cisteina hidrófobo (111 aa) . La capacidad de la gamma-zeína para ensamblarse en
RPBLA derivados del RE no se restringe a las semillas. De hecho, cuando el gen de la gamma-zeína se expresó constitutivamente en plantas Arabidopsis transgénicas , la proteína de reserva acumulada en PBLS derivados del RE en células mesófilas de hojas (Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922) . Buscando una señal responsable de la deposición de gamma-zeina en los cuerpos proteicos derivados del RE (las prolaminas no tienen señal KDEL) , se ha demostrado que el dominio N-terminal rico en prolina incluye el dominio de repetición en tándem era necesario para la retención del RE. En este trabajo, se sugirió también que el dominio C-terminal podía estar implicado en la formación del cuerpo proteico, sin embargo, datos recientes (documento WO2004003207A1) demuestran que el dominio N-terminal rico en prolina es necesario y suficiente para retener en el RE y para inducir la formación del cuerpo proteico. Sin embargo, los mecanismos mediante los que estos dominios estimulan el ensamblaje del cuerpo proteico todavía se desconocen, aunque evidencias de estudios in vitro sugieren que la porción N-terminal de la gamma-zeína es capaz de autoensamblarse en estructuras ordenadas . Se prefiere que una PBIS basada en gamma-zeína incluya al menos una repetición y los nueve residuos amino-terminales del dominio de ProX, y más preferiblemente el dominio de ProX entero. La parte C-terminal de la gamma zeína no se necesita, pero puede estar presente. Esas secuencias se muestran en el documento US 20040005660 y se designan como RX3 y P4, respectivamente, y se notifican a continuación en el presente documento . Puesto que los cuerpos proteicos sólo se denominan así apropiadamente en semillas, estructuras parecidas producidas en otros órganos de plantas y en plantas no superiores se denominan generalmente como PBs sintéticos o ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) . Las zeínas son de cuatro tipos diferentes: alfa, beta, delta, y gamma. Se acumulan en una manera secuencial en los cuerpos proteicos derivados del RE durante el desarrollo endospérmico . La beta-zeina y la delta-zeina no se acumulan en gran cantidad en los PB del maíz, pero eran estables en tejidos vegetativos y se depositaron en estructuras similares a cuerpos proteicos derivadas de RE cuando se expresaron en las plantas del tabaco (Bagga et al., 1997 Plant Cell Sep 9 ( 9) : 1683-1696) . Este resultado indica que la beta-zeina, asi como la delta-zeina, puede inducir la retención RE y la formación de cuerpos proteicos. Las proteínas de reserva de la prolamina del maíz, gliadinas, son un grupo de proteínas sin K/HDEL cuyo transporte mediante el RE parece ser complejo. Estas proteínas se secuestran en el RE en el que o bien se retienen y se empaquetan en cuerpos proteicos densos, o bien se transportan desde el RE mediante el aparato de Golgi en vacuolas. (Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450). Las gliadinas parecen ser quimeras naturales, que contienen dos regiones autónomas plegadas por separado. El extremo N-terminal está compuesto por de aproximadamente 7 a aproximadamente 16 repeticiones en tándem ricas en glutamina y prolina. La secuencia de las repeticiones en tándem varía entre diferentes gliadinas, pero se basan en una o otra secuencia consenso PQQPFPQ (SEQ ID NO:47), PQQQPPFS (SEQ ID NO:48) y PQQPQ (SEQ ID NO:49). La región C-terminal de la proteina contiene de seis a ocho cisteinas que forman puentes disulfuro intramoleculares. El trabajo de grupo de Altschuler et al. indica que la región N-terminal y las secuencias consenso son responsables de la formación de PB en el RE a partir de gamma-gliadina . (Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450. ) Otras secuencias de tipo prolamina útiles ilustrativas se muestran en la tabla siguiente junto con sus códigos de identificación GenBank.
NOMBRE DE LA PROTEÍNA ID GENBANK ot-Zeína (22 kD) M86591 Albúmina (32 kD) X70153 y- Zeina (27 kD) X53514
?- Zeina (50 kD) AF371263
d- Zeina (18 kD) AF371265 Tipo vicilina o globulina 7S NM_113163 Tipo legumen o globulina 11S DQ256294 Prolamina 13 kD AB016504 Prolamina 16 kD AY427574 Prolamina 10 kD AF294580 ?-Gliadina M36999 Precursor de D-Gliadina AAA34272
Otras secuencias útiles se obtienen llevando a cabo una búsqueda en BLAST en todas las base de datos no redundantes de traducciones de CDS GeneBank+PDB+SwissProt+PIR+PRF (excluyendo muestras medioambientales) según se describe en Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 usando una consulta tal como se muestra a continuación: RX3 (SEQ ID NO: 2) Alfa-zeina (SEQ ID NO: 3) Prolamina del arroz (SEQ ID NO: 4) Una prolamina modificada ilustrativa incluye (a) una secuencia de péptido señal, (b) una secuencia de una o más copias del dominio de repetición del hexapéptido PPPVHL (SEQ ID NO: 1) de la proteina gamma7zeína, el dominio completo que contiene ocho unidades de hexapéptido; y (c) una secuencia del total o de parte del dominio ProX de gamma-zeina. Prolaminas modificadas especificas ilustrativas incluyen los polipéptidos identificados a continuación como R3, RX3 y P4 cuyo ADN y secuencias de residuo de aminoácidos también se muestran a continuación.
Prolaminas particularmente preferidas incluyen la gamma-zeina y sus partes componentes tal como se da a conocer en la solicitud publicada WO2004003207 , la proteina rP13 del arroz y la alfa-zeina de 22 kDa del maíz y su fragmento N-terminal. El ADN y secuencias de residuo de aminoácidos de la gamma-zeina, arroz y proteínas de alfa-zeina se muestran a continuación .
Gamma-zeína de 27 kD Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 5) Secuencia de proteína (SEQ ID NO: 6)
RX3 Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 7) Secuencia de proteína (SEQ ID NO: 8)
R3 Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 9) Secuencia de proteína (SEQ ID NO: 10)
P4 Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 11) Secuencia de proteína (SEQ ID NO: 12) XIO Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 13) Secuencia de proteina (SEQ ID NO: 14)
rP13 - prolamina de arroz de 13 kD homologa al clon AB016504 Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol . Biochem. 60 (2) : 335-337; Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3) :1115-1116; Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17 ( 4 ): 1141-1153; Mullens et al., 2004 J. Agrie. Food Chem. 52 ( 8 ): 2242-2246 ; Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (11) : 1851-1858
Secuencia de proteina (SEQ ID NO: 15) Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 16)
22aZt fragmento N terminal de alfa-zeina del maíz de 22 kD - V01475 Kim et al., 2002 Plant Cell 14 ( 3) : 655-672 ; oo et al., 2001 Plant Cell 13 ( 10 ): 2297-2317 ; Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys . Acta 1339 ( 1 ): 14-22 ; Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18 (4 ): 827-833.
Secuencia de proteina (longitud completa) : (SEQ ID NO:
17) Secuencia de ADN (longitud completa) : (SEQ ID NO: 18)
Precursor de gamma-gliadina - AAA34272- Scheets et al.,
1988 Plant Sci. 57:141-150.
Secuencia de proteina (SEQ ID NO: 19) Secuencia de ADN (M36999) (SEQ ID NO:20)
Beta zeina - AF371264 - Woo et al., (2001) Plant Cell 13 (10), 2297-2317.
ADN (SEQ ID NO: 21) Proteina (SEQ ID NO: 22)
Delta-zeina de 10 kD- AF371266- Woo et al., (2001) Plant Cell 13 (10), 2297-2317. y Kirihara et al., (1988) Gene. Nov 30; 71 (2) :359-70.
ADN (SEQ ID NO: 23) Proteina (SEQ ID NO: 24) Péptidos señal Gamma-Zeina (SEQ ID NO: 25) Alfa-Gliadina (SEQ ID NO: 26)
· Gamma-Gliadina (SEQ ID NO: 27)
PR10 (SEQ ID NO: 28)
Proteínas de interés Ejemplos de polipéptidos o proteínas de interés (dianas) incluyen cualquier proteína que presente usos terapéuticos, nutracéuticos , agriculturales , de biocontrol, o industriales. Actividades ilustrativas de tales proteínas incluyen (a) la captura y emisión de luz tal como se proporcionan mediante la proteína fluorescente verde (GFP) , proteína fluorescente cían reforzada (ECFP) , proteína roja fluorescente (DsRED) y similares; (b) actividad enzimática tal como puede asociarse con las rutas metabólicas y de señalización intracelulares primarias y secundarias, se ejemplifican mediante la enterocinasa , beta-glucoronidasa (GUS) , fitasa, anhidrasa carbónica, y enzimas industriales (hidrolasas, glucosidasas , celulasas, oxido-reductasas, y similares) ; (c) interacción proteína-proteína, proteína-receptor y proteína-ligando tal como, por ejemplo, anticuerpos (Acm tales como IgG, IgM, IgA, etc.) y fragmentos de los mismos, hormonas [calcitonina, hormona del crecimiento humana (hGH) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) y similares], inhibidores de la proteasa, antibióticos, antimicrobianos, inhibidores de entrada de VIH [Ryser et al., 2005 Drug Discov Today. Aug . 15 ; 10 ( 16) : 1085-1094], colágeno, lactoferrina humana, y citocinas; (d) antigenos de péptidos y proteínas para vacunas (virus de inmunodeficiencia humano, VIH; antígenos de pre-superficie, de superficie y de núcleo de la hepatitis B, ' virus de enfermedad de pies y manos (FMDV), gen Pl de poliproteína estructural [Dus Santos et al., 2005 Vaccine. Mar 7 ; 23 ( 15 ) : 1838-1843 ] , péptidos estimulantes de células T de la patente de los EE.UU. número 4.882.145, virus tipo corona de la gastroenteritis, virus del papiloma humano, y similares); e) interacciones proteína-no proteína tales como fitohemaglutinina (PHA), subunidad B de la toxina del ricino (RTB) y otras lectinas. Ensayos para la bioactividad de tales polipéptidos expresados se conocen bien en la técnica y están disponibles en una o más publicaciones. Por ejemplo, la actividad de ECFP (proteína fluorescente cían reforzada) puede medirse mediante la cuantificación de la fluorescencia emitida a una longitud de onda de 470 a 530 nm cuando la proteina se ha excitado a 458 nm. Véase Richards et al., 2003 Plant Cell Rep . 22:117-121. La actividad enzimática de la enterocinasa (EK) , por ejemplo, puede medirse mediante dos enfoques diferentes. La actividad puede determinarse mediante analizando la escisión de una proteina de fusión que contiene el sitio de escisión especifico de la enterocinasa mediante inmunotransferencia de tipo western, tal como se trata en el catálogo de Invitrogen Life Technologies (E180-01 y E180-02), y también cuantificando la actividad de la EK utilizando un sustrato de péptido fluorogénico para la EK (Sigma G-5261, CAS® RN 70023-02-8) ; la actividad de la enzima se mide por un aumento de fluorescencia (excitación a 337 nm, emisión a 420 nm) provocado por la liberación de D-naftilamina del péptido con el tiempo. Véase, LaVallie et al., 1993 J. Biol. Chem. 268 (31) : 23311-23317. La actividad de la enzima beta-glucuronidasa (GUS) puede medirse por la conversión del sustrato MUG ( 4-metilumbeliferilglucurónido) en el producto MU. Este producto puede cuantificarse mediante la medición de la fluorescencia con excitación a 365 nm, emisión a 455 nm en un espectrofluorimetro . Véase, Pai-Hsiang et al., 2001 J. Plant Physiol. 158 (2 ) : 247-254 ; y Jefferson et al., 1987 EMBO J 6:3901-3907. Los ensayos de fitasa se llevan a cabo mediante la cuantificación de ortofosfatos inorgánicos liberados del reactivo AAM que consiste en acetona, ácido sulfúrico 5,0 N, y molibdato de amonio 10 mM . Véase Ullah et al., 1999 Biochem. Biophys. Res. Commun . 264 ( 1 ): 201-206. Están disponibles ensayos similares para otras proteínas biológicas. Los ensayos de la actividad de la RTB pueden realizarse midiendo la unión de RTB a asialofetuina , lactosa y galactosa, tal como se describe en Reed et al., 2005 Plant Cell Rep. Apr; 24 ( 1 ): 15-24. El EGF es un factor de crecimiento implicado en la proliferación de fibroblastos. La actividad del EGF puede someterse a ensayo mediante la cuantificación de la inducción de la síntesis de ADN medida mediante la incorporación del análogo de la pirimidina 5-bromo-2 ' -desoxiuridina (BrdU) , en vez de timidina, en el ADN de células proliferantes usando el kit de ELISA de proliferación celular [Oliver, et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Physíol. 286:1118-1129; n° de catálogo 1647229, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania] Se observa que la captura y la emisión de luz es un tipo especial y separado de "actividad biológica" porque dicha actividad no proporciona un uso terapéutico, nutracéutico, agricultural , de biocontrol o industrial como lo hacen otros tipos de actividad mencionados anteriormente. Los polipéptidos de esta clase de dianas se incluyen en el presente documento como biológicamente activos porque comparten algunas de las características estructurales secundarias, terciarias y cuaternarias requeridas que poseen las moléculas diana que proporcionan usos terapéuticos, nutracéuticos , de biocontrol o industriales. Estas proteínas son útiles, sin embargo, como moléculas indicadoras en muchos tipos de ensayos o búsquedas empleadas en el análisis o descubrimiento de moléculas biológicamente importantes, y su actividad luminiscente requiere de la presencia de una estructura secundaria y terciaria de la proteína correcta. Es posiblemente más preciso referirse al grupo de dianas como aquellos polipéptidos que son biológicamente activos y/o luminiscentemente activos. A continuación se proporcionan secuencias ilustrativas de ADN y de residuos de aminoácidos para proteínas ilustrativas de interés.
ECFP ADN (SEQ ID NO: 29) ECFP proteína (SEQ ID NO
GUS1381 ADN (SEQ ID NO: 31) GUS1381 proteína (SEQ ID NO: 32) GUS1391Z ADN (SEQ ID NO: 33) GUS1391Z proteina (SEQ ID NO: 34)
Calcitonina de salmón BAC57417
Secuencia de proteína (SEQ ID NO: 35) Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 36)
hEGF - Construcción basada en AAF85790 sin el péptido señal
Secuencia de proteína (SEQ ID NO: 37) Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 38)
hGH - Construcción basada en P01241 sin el péptido señal
Secuencia de proteína (SEQ ID NO: 39) Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 40)
En otra realización, la proteína de fusión recombinante comprende además, aparte de las secuencias de la PBIS y el producto de interés, una secuencia de aminoácidos espadadora. La secuencia de aminoácidos espaciadora puede ser una secuencia de aminoácidos escindible por medios enzimáticos o químicos o que no es escindible. El término "no escindible" significa que la escisión del espaciador no se produce sin la destrucción de parte o todo el polipéptido biológicamente activo. En una realización particular, la secuencia de aminoácidos espaciadora se coloca entre la PBIS y el polipéptido biológicamente activo. Una secuencia de aminoácidos ilustrativa puede escindirse mediante una proteasa tal como una enterocinasa , endoproteasa Arg--C, endoproteasa Glu--C, endoproteasa Lys--C, Factor Xa, proteasas de SUMO [Tauseef et al., 2005 Protein Expr. Purif. 2005 Sep 43(1) :l-9] y similares. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos espaciadora corresponde a una secuencia 2A de autoprocesamiento viral de FMDV, inteínas tales como la inteína Ssp DNAb y similares tal como están disponibles de New England Biolabs y otros. Se prefiere el uso de una secuencia ligadora de inteína ya que tales secuencias pueden inducirse selectivamente para provocar la escisión de proteína y así eliminarse por sí mismas de una proteína expresada y recuperada. Las integrinas son particularmente interesantes ya que no requieren enzimas grandes para alcanzar su diana y escindir el PBIS a partir de la proteina de interés. Esta propiedad puede ser particularmente útil para asilar directamente proteínas de interés de RPBLAs intactos. Alternativamente, se codifica una secuencia de aminoácidos que puede escindirse específicamente mediante un reactivo químico, tal como por ejemplo, bromuro de cianógeno que escinde en residuos de metionina. En una realización adicional, la secuencia de ácido nucleico utilizada para fines de transformación es tal como se describe en la solicitud de patente coasignada WO 2004003207, con o sin la secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos escindible.
Métodos de preparación En una realización' preferida, las proteínas de fusión se preparan según un método que comprende transformar un sistema de células huésped eucariotas tal como un animal, un cultivo de células animales, un cultivo de plantas o de células vegetales, un cultivo de hongos, un cultivo de células de insecto o un cultivo de algas con una secuencia de ácido nucleico (ADN o ARN) que comprende (i) un primer ácido nucleico que codifica para una PBIS que está operativamente ligado en marco a (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de polipéptido de interés que es biológicamente activo; es decir, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la PBIS está unida químicamente (unida por enlace peptídico) a la secuencia que codifica para el polipéptido de interés de manera que ambos polipéptidos se expresan desde sus marcos de lectura correctos y la proteína de interés es biológicamente activa. También se contempla que estén presentes otras secuencias reguladoras apropiadas a cada lado de las secuencias de ácido nucleico que codifican para la PBIS y la proteína de interés tal como se describe a continuación en el presente documento. Tales secuencias de control se conocen bien y están presentes en vectores disponibles comercialmente . El empleo de medios indirectos para introducir ADN, como vía transducción o infección viral, también se contempla, y debería emplearse de forma intercambiable con métodos de administración directa de ADN como la transfección . La célula huésped o entidad transformada se mantiene durante un periodo de tiempo y en condiciones de cultivo apropiadas para la expresión de la proteína de fusión y el ensamblaje de la proteína de fusión expresada en ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) . Al expresarse, la proteína de fusión resultante se acumula en el sistema de huésped transformado como ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes de alta densidad. La proteína de fusión puede entonces recuperarse de las células huésped o puede utilizarse según se desee a las células huésped que contienen la proteína de fusión, tal como para un alimento para animales que contiene un nutriente o aporte complementario añadido. La proteína de fusión puede aislarse como parte de los RPBLA o libre de los RPBLA. Las condiciones de cultivo adecuadas para la expresión de la proteína de fusión son típicamente diferentes para cada tipo de entidad huésped o célula huésped. Sin embargo, esas condiciones son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden determinarse fácilmente. De manera similar, la duración del mantenimiento puede variar según las células huésped y con la cantidad de proteína de fusión que se desee preparar. Una vez más, esas condiciones se conocen bien y pueden determinarse fácilmente en situaciones específicas. Adicionalmente , pueden obtenerse condiciones de cultivo específicas de las citas en el presente documento. En una realización, el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico (i) se une (se enlaza) al extremo 5' de la segunda secuencia (ii) de ácido nucleico. En otra realización, el extremo 5' de la primera secuencia (i) de ácido nucleico se une (se enlaza) al extremo 3' de la segunda secuencia (ii) de ácido nucleico. En otra realización, la PBIS comprende una proteina de reserva o una proteina de reserva modificada, un fragmento o un fragmento modificado de la misma. En otra realización particular, se prepara una proteina de fusión según un método que comprende transformar un sistema de células huésped eucariotas tal como un animal, un cultivo de células animales, una planta, un cultivo de células de planta, hongos o algas con una secuencia de ácido nucleico que comprende, además de las secuencias (i) y (ii) de ácido nucleico mencionadas anteriormente, una secuencia (iii) de ácido nucleico dentro del marco que codifica para una secuencia de aminoácidos espadadora. La secuencia de aminoácidos espadadora puede ser una secuencia de aminoácidos espadadora .que puede escindirse por medios enzimáticos o químicos o que no puede escindirse, tal como se mencionó anteriormente. En una realización particular, la secuencia (iii) de ácido nucleico se coloca entre dichas secuencias (i) y (ii) de ácido nucleico, por ejemplo, el extremo 3' de la tercera secuencia (iii) de ácido nucleico se une al extremo 5' de la segunda (ii) secuencia de ácido nucleico. En otra realización, el extremo 5' de la tercera secuencia (iii) de ácido nucleico se une al extremo 3' de la segunda secuencia (ii) de ácido nucleico. Una secuencia (segmento) de ácido nucleico que codifica para una molécula de proteina de fusión descrita anteriormente o un complemento de esa secuencia de codificación también se contempla en el presente documento. Un segmento de ácido nucleico de este tipo está presente en una forma aislada y purificada en algunas realizaciones preferidas . En los organismos vivos, la secuencia de residuos de aminoácidos de una proteina o polipéptido está directamente relacionada a través del código genético a la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) del gen que codifica para la proteina. Por tanto, a través de la degeneración bien conocida del código genético, pueden prepararse ADN adicionales y secuencias de ARN (ácidos nucleicos) correspondientes, como se desee, que codifican a las mismas secuencias de residuos de aminoácidos de proteina de fusión, pero que son suficientemente diferentes de una secuencia génica descrita anteriormente, tal que las dos secuencias no hibridan con alta astringencia pero si hibridan con astringencia moderado.
Las condiciones de alta astringencia pueden definirse como que comprenden la hibridación a una temperatura de aproximadamente 50°-55°C en 6XSSC y un lavado final a una temperatura de 68 C en 1-3XSSC. Las condiciones de astringencia moderada comprenden la hibridación a una temperatura de aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 65°C en NaCl 0,2 M a 0,3 M, seguido de lavado a aproximadamente 50°C a aproximadamente 55°C en 0,2X SSC, SDS (dodecil sulfato sódico) al 0,1%. También se contempla en el presente documento una secuencia nucleica (secuencia de ADN o una secuencia de ARN) que (1) codifica por si misma, o su complemento codifica, una proteina de fusión que contiene una secuencia de inductora de cuerpos proteicos (PBIS) y un polipéptido de interés. Como se conoce bien, una secuencia de ácido nucleico tal como una secuencia de ácido nucleico contemplada se expresa cuando está unida operativamente a un promotor apropiado en un sistema de expresión apropiado tal como se describe en otro lugar en el presente documento. Esta secuencia de ácido nucleico se puede administrar directamente o indirectamente (a través de un organismo vector apropiado tal como un virus o una bacteria) a la célula huésped eucariota, y puede integrarse de forma estable en el núcleo del hospedador o en el genoma organelar, o expresarse de forma transitoria sin integración en el genoma. Los huéspedes diferentes a menudo tienen preferencias para un codón particular que va a utilizarse para codificar para un residuo de aminoácido particular. Tales preferencias de codón se conocen bien y una secuencia de ADN que codifica para una proteina de fusión deseada puede alterarse, utilizando mutagénesis in vitro por ejemplo, para que los codones preferidos por los huéspedes se utilicen para un huésped particular en el que va a expresarse la proteina de fusión . También se contempla en esta invención una molécula de ácido nucleico recombinante tal como una molécula de ADN, que comprende un vector que contiene una o más secuencias reguladoras (elementos de control) tales como un promotor adecuado para impulsar la expresión del gen en un organismo de células huésped eucariotas compatible unido operativamente a un segmento de ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un segmento o secuencia de ADN) que define un gen que codifica para una proteina de fusión contemplada, tal como se describió anteriormente. Más particularmente, también se contempla una molécula de ADN recombinante que comprende un vector que comprende un promotor para impulsar la expresión de la proteina de fusión en células del organismos huésped que están unidos operativamente a un segmento de ADN que define un gen que codifica para una secuencia inductora de cuerpos proteicos (PBIS) unido a un polipéptido de interés. Esa molécula de ADN recombinante, después de la transfección y expresión adecuadas en una célula huésped eucariota, proporciona una proteina de fusión tal como RPBLA. Como se conoce bien en la técnica, siempre que esté presente el ácido nucleico requerido, de manera ilustrativa la secuencia de ADN (incluyendo las señales de iniciación y terminación) , normalmente pueden estar presentes pares de bases adicionales en cualquier extremo del segmento de ADN, y ese segmento puede utilizarse para expresar la proteina. Esto, por supuesto, supone la ausencia en el segmento de una secuencia de ADN unida operativamente que reprime la expresión, expresa un producto adicional que consume la proteina de fusión deseada que va a expresarse, expresa un producto que consume un producto de reacción deseado producido por esa proteina de fusión deseada, o interfiere de otra manera con la expresión del gen del segmento de ADN. Por tanto, siempre que el segmento de ADN esté libre de tales secuencias de ADN de interferencia, un segmento de ADN puede tener una longitud de aproximadamente 500 a aproximadamente 15.000 pares de bases. El tamaño máximo de una molécula de ADN recombinante , particularmente un vector de expresión, se controla mayoritariamente por conveniencia y el tamaño del vector que puede acomodarse mediante una célula huésped, una vez que están presentes todas las secuencias de ADN mínimas que se requieren para la replicación y la expresión, cuando se desean. Los tamaños de vector mínimos se conocen bien. No se prefieren tales segmentos de ADN largos, pero pueden utilizarse. Un segmento de ADN que codifica para una proteína de fusión descrita anteriormente puede sintetizarse mediante técnicas químicas, por ejemplo, el método del fosfot riéster de Matteucci et al., 1981 J. Mi. Chem. Soc, 103:3185. Por supuesto, mediante la síntesis química de la secuencia de codificación, puede realizarse cualquier modificación deseada sustituyendo las bases apropiadas por aquellas que codifican para la secuencia residuos de aminoácidos nativa. Sin embargo, se prefieren los segmentos de ADN que incluyen secuencias descritas en el presente documento. Los segmentos de ADN que contienen un gen que codifica para la proteína de fusión se obtienen preferiblemente a partir de moléculas de ADN recombinantes (vectores plásmidos) que contienen ese gen. Un vector que dirige la expresión de un gen de proteina de fusión en una célula huésped se denomina "vector de expresión" en el presente documento. Un vector de expresión contiene elementos de control de expresión que incluyen al promotor. El gen que codifica para la proteina de fusión se une operativamente al vector de expresión para permitir que la secuencia del promotor dirija la unión de la polimerasa de ARN y la expresión del gen que codifica para la proteina de fusión. Son útiles en la expresión del gen que codifica para el polipéptido los promotores que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos tales como los descritos por Paszkowski et al., 1989 EMBO J. , 3:2719 y Odell et al., 1985 Nature, 313:810, asi como los regulados temporalmente, los regulados espacialmente, y los regulados espaciotemporalmente, como los proporcionados en Chua et al., 1989 Science, 244:174-181. Se contemplan en el presente documento los vectores de expresión compatibles con células eucariotas, tales como los compatibles con células de mamíferos, algas o insectos y similares. Tales vectores de expresión también pueden utilizarse para formar las moléculas de ADN recombinantes de la presente invención. Los vectores de expresión de células eucariotas se conocen bien en la técnica y están disponibles por varias fuentes comerciales. Normalmente, tales vectores contienen uno o más sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado y las secuencias del promotor. Opcionalmente , tales vectores contienen un marcador seleccionable especifico para el uso en células eucariotas. La producción de una proteina de fusión mediante la expresión de ADN recombinante en células de mamíferos se ilustra a continuación en el presente documento utilizando un vector de ADN recombinante que expresa el gen de proteína de fusión en células huésped de ovario de hámster chino (CHO) , células Cosí huésped de mono y células 293T huésped humanas. Esto se consigue utilizando procedimientos que se conocen bien en la técnica y se describen con más detalle en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2* ed., Cold Spring Harbor Laboratories (1989) . También puede utilizarse un sistema de células de insecto para expresar una proteína de fusión contemplada. Por ejemplo, en un sistema de este tipo, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) o el baculovirus como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda células o en larvas de Trichoplusia . Las secuencias que codifican para una proteína de fusión pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y ponerse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción satisfactoria de una secuencia de proteina de fusión hace inactivo al gen de polihedrina y produce virus recombinantes que carecen de revestimiento proteico. Los virus recombinantes pueden utilizarse entonces para infectar, por ejemplo, a células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que puede expresarse la proteina de fusión. E. Engelhard et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91:3224-3227; y V. Luckow, "Insect Cell Expression Technology", páginas 183-218, en Protein Engineering: Principies and Practice, J.L. Clely et al. eds . , Wiley-Liss, Ene, (1996) . Frecuentemente, los genes heterologos puestos bajo el control del promotor de polihedrina del virus de la polihedrina nuclear de Autographa cali fornica (AcNPV) se expresan en niveles altos durante las etapas tardías de la infección. Los baculovirus recombinantes que contienen el gen de la proteína de fusión se construyen utilizando el sistema de vector lanzadera de baculovirus (Luckow et al., 1993 <J. Virol., 67:4566-4579], vendido comercialmente como el sistema de expresión de baculovirus Bac-To-Bac™ (Life Technologies) . Se preparan reservas de virus recombinantes y se monitoriza la expresión de la proteína recombinante mediante protocolos convencionales (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, .H. Freeman and Company, Nueva York, 1992; y Keng et al., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, London, 1992) . También se contempla en la presente invención el empleo de baculovirus u otros vectores de transferencia en células de mamífero, como el sistema "BacMan" descrito por T. Kost y cois, (ver, por ejemplo Merrihew et al., 2004 Methods Mol Biol. 246:355-365) u otros sistemas tales que son conocidos para el experto en la materia. La elección de a qué vector de expresión y fundamentalmente a qué promotor se une operativamente el gen que codifica para la proteína de fusión depende directamente de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo la ubicación y el momento de la expresión de la proteína, y la célula huésped que debe transformarse. Existen limitaciones bien conocidas inherentes a la técnica de construcción de moléculas de ADN recombinantes . Sin embargo, un vector útil para poner en práctica la presente invención puede dirigir la replicación, y preferiblemente también la expresión (para un vector de expresión) del gen de proteína de fusión incluido en el segmento de ADN al que se une operativamente. Los vectores típicos útiles para la expresión en células de plantas y mamíferos superiores se conocen bien en la técnica e incluyen vectores de plantas derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium turnefaciens descritos por Rogers et al. (1987) Meth. in Enzymol . , 153:253-277 y los vectores pKSV-10, anteriormente, y pCI-neo de expresión de mamíferos (Promega Corp., #E1841, Madison, I) . Sin embargo, se sabe que varios otros sistemas de vectores de expresión funcionan en plantas incluyendo el vector pCaMVCN de control de transferencia descrito anteriormente por Fromm et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:58-24. El plásmido pCaMVCN (disponible de Pharmacia, Piscataway, NJ) incluye el promotor 35S del virus del mosaico de coliflor CaMV. Los sistemas de expresión de plantas proporcionan normalmente la expresión sistémica o constructiva de un transgén insertado. La expresión sistémica puede ser útil cuando se utiliza la mayoría o toda la planta como la fuente de RPBLA y sus proteínas de fusión. Sin embargo, puede ser más eficaz expresar los RPBLA y sus contenidos en proteína de fusión en un órgano de reserva de la planta tal como la raíz, la semilla o la fruta de la que las partículas pueden aislarse o ingerirse más fácilmente. Otra manera de logar la expresión del órgano de reserva es utilizar un promotor que exprese su gen controlado en uno o más órganos de la planta no fotosintéticos preseleccionados o predeterminados. La expresión en uno o más órganos de reserva preseleccionados con poca o ninguna expresión en otros órganos tales como las raices, la semilla o la fruta frente a hojas y tallos se denomina, en el presente documento, expresión potenciada o preferente. Un promotor a modo de ejemplo que dirige la expresión en uno o más órganos preseleccionados en comparación con otro órgano en una razón de al menos 5:1 se define en el presente documento como un promotor potenciado de órganos. La expresión sustancialmente en sólo un órgano de reserva y sustancialmente ninguna expresión en otros órganos de reserva se denomina expresión especifica de órganos, es decir, una proporción de productos de expresión en un órgano de reserva con respecto a otro de aproximadamente 100:1 o superior indican la especificidad de órganos. Por tanto, los promotores específicos de órganos de reserva son miembros de la clase de promotores potenciados de órganos de reserva. Los órganos de reserva vegetales a modo de ejemplo incluyen las raíces de zanahorias, taro o mandioca, tubérculos de patata, y la carne de frutas tales como guayaba roja, maracuyá, mango, papaya, tomate, aguacate, cereza, tangerinas, mandarinas, palma, melones tales como Cantaloupe y sandias y otras frutas carnosas tales como calabazas, pepinos, mangos, albaricoques , melocotones, asi como semillas de maíz, soja, arroz, planta de colza y similares. Normalmente, se considera que el promotor 35S de CaMV es un promotor constitutivo. Sin embargo, la investigación ha demostrado que la región de 21 pb del promotor 35S de CaMV, cuando está unido operativamente a otro promotor de tejido verde habitual heterólogo, el promotor rbcS-3A puede provocar que el promotor quimérico resultante se convierta en un promotor potenciado de raices. Esa secuencia de 21 pb se describe en la patente de los EE.UU. n° 5.023.179. El promotor rbcS-3A quimérico que contiene el inserto de 21 pb de la patente de los EE.UU: n° 5.023.179 es un promotor potenciado de raices útil en el presente documento. Un promotor potenciado de raices similar, que incluye el segmento de 21 pb es la región de -90 a +8 del propio promotor 35S de CAMV. La patente de los EE.UU. n° 5.110.732 describe que el promotor 35S de CaMV truncado proporciona la expresión potenciada en las raices y el radical de semillas, un tejido destinado a convertirse en una raíz. Ese promotor también es útil en el presente documento. Otro promotor potenciado de raices es el promotor de -1616 a -1 del gen de la planta de colza {Brassica napus L. ) descrito en el documento PCT/GB92 /00 16 (el documento O 91/13922 publicado el 19 de septiembre de 1991). DH5.alfa. de E. Coli que alberga el plásmido pRlambdaS4 y lambda . beta .1 del bacteriófago que contienen este promotor se depositaron en la Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas (National Collection of Industrial and Marine Bacteria) , Aberdeen, UK el 8 de marzo de 1990 y tienen números de registro NCIMB40265 y NCIMB40266. Una parte útil de este promotor puede obtenerse como un fragmento de 1,0 kb mediante la escisión del plásmido con HaelII. Un promotor potenciado de raices preferido es el promotor de manopina sintasa (mas) presente en el plásmido pKan2 descrito por DiRita y Gelvin (1987) Mol. Gen. Genet, 207:233-241. Este promotor puede eliminarse de su plásmido pKan2 como un fragmento Xbal-Xball. El promotor potenciado de raices de manopina sintasa preferido está comprendido por la región del núcleo del promotor de manopina sintasa hasta la posición -138 y el activador del la manopina sintasa desde -318 hasta -213, y se denomina colectivamente AmasPmas. Se ha encontrado que este promotor aumenta la producción de raices de tabaco en aproximadamente 10 a aproximadamente 100 veces en comparación con los niveles de expresión de hojas.
Otro promotor especifico de raices es la secuencia flanqueante 5' de aproximadamente 500 pb que acompaña al gen de glucoproteina rico en hidroxiprolina , HRGPnt3, expresada durante la iniciación de la raíz lateral e informada por Keller et al. (1989) Genes Dev. , 3:1639-1646. Otro promotor especifico de raices está presente en la región flanqueante 5' de aproximadamente -636 a -1 5' del gen especifico de raices del tabaco informado por Yamamoto et al. (1991) Plant Cell, 3:371-381. Esos autores ubican más específicamente los elementos que actúan en cis y que regulan la expresión en las región de aproximadamente -636 a aproximadamente -299 en la dirección 5' del sitio de iniciación de la transcripción. Yamamoto et al. informó de la producción de ARNm de estado estacionario a partir del gen ToRBF en las raíces, pero no en las hojas, meristemas de brotes o tallos. Aún otro promotor específico de órganos de reserva son las regiones flanqueantes 5' y 3' del gen E8 de la maduración de la fruta del tomate, Lycopersicon esculentum . Estas regiones y sus secuencias de ADNc se ilustran y se tratan en Deikman et al. (1988) EMBO J. , 7 ( 11 ) : 3315-3320 y (1992) Plant Physiol., 100:2013-2017. Tres regiones se ubican en las 2181 pb de la secuencia flanqueante en la dirección 5' del gen y una secuencia de 522 pb en la dirección 3' en el sitio de adición de poli (A) parecen controlar la expresión del gen E8. Se requiere una región desde -2181 hasta -1088 para la activación de la transcripción del gen E8 en fruta no madura mediante etileno y también contribuye a la transcripción durante la maduración. Dos regiones adicionales, de -1088 a -863 y de -409 a -263, no pueden proporcionar una respuesta al etileno en fruta no madura pero son suficientes para la expresión del gen E8 durante la maduración. Se ha informado de que el promotor de la sintasa-1 (Sh) de la sacarosa de maiz, que expresa en el maíz su enzima controlada a niveles altos en endosperma, a niveles mucho más reducidos en raices y no en tejidos verdes o polen, expresa un gen indicador quimérico, la ß-glucuronidasa (GUS) , específicamente en células de líber de tabaco que son abundantes en tallos y raíces. Yang et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci.r EE.UU., 87:4144-4148. Por tanto, este promotor es útil para órganos vegetales tales como frutas carnosas como melones, por ejemplo melones Cantaloupe, o semillas que contienen endosperma y para raíces que tienen niveles altos de células de líber. Otro promotor específico de tejidos a modo de ejemplo es el promotor de lecitina, que es específico para tejido de semilla. La proteina de lecitina en semillas de soja se codifica mediante un gen (Leí) único que solamente se expresa durante la maduración de la semilla y explica aproximadamente del 2 a aproximadamente el 5 por ciento del ARNm de semilla total. El gen de lecitina y el promotor especifico para semillas se han caracterizado completamente y se utilizan para dirigir la expresión especifica de semillas en plantas de tabaco transgénicas . Véase, por ejemplo, Vodken et al. (1983) Cell, 34:1023 y Lendstrom et al. (1990) Developmental Genetics, 11:160. Un promotor de expresión especifico de tubérculos particularmente preferido es la región flanqueante 5' del gen patatina de patata. El uso de este promotor se describe en Twell et al. (1987) Plant Mol. Biol., 9:365-375. Este promotor está presente en un fragmento de aproximadamente 406 pb del bacteriófago LPOTI . El promotor de LPOTI tiene regiones de homología superior al 90 por ciento con otros promotores de patatina y homología del 95 por ciento sobre todas las 400 bases con el promotor PGT5 de patatina. Cada uno de estos tres promotores es útil en el presente documento. Véase también Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol., 12:41-50.
Se describen aún otros promotores potenciados de órganos de plantas y promotores específicos de órganos vegetales adicionales en Benfey et al. (1988) Science, 244:174-181. Cada una de las secuencias de promotor utilizadas no está afectado sustancialmente por la cantidad de RPBLA en la célula. Tal como se usa en el presente documento, el término "no afectado sustancialmente" significa que el promotor no responde al control de realimentación directa (inhibición) mediante los RPBLA acumulados en células transformadas o plantas transgénicas . Normalmente, la transfección de células vegetales utilizando Agrobacterium turnefaciens se lleva a cabo mejor sobre plantas dicotiledóneas. Las plantas monocot iledóneas se transforman habitualmente y más fácilmente mediante la tal denominada transferencia génica directa de protoplastos . La transferencia génica directa se realiza habitualmente mediante electrotransporte, mediante la transferencia mediada por poliet ilenglicol o bombardeo de células por microproyectiles que portan el ADN requerido. Estos métodos de transfección se conocen bien en la técnica y no necesitan describirse de manera adicional en el presente documento. Los métodos para regenerar plantas enteras de células transíectadas y protoplastos también se conocen bien, así como las técnicas para obtener una proteína deseada a partir de tejidos vegetales. Véase, también, las patentes de los EE. UU. n° 5.618.988 y 5.679.880 y las citas en las mismas. Una planta transgénica formada usando la transformación por Agrobacterium, electrotransporte u otros métodos contiene normalmente un único gen en un cromosoma. Puede decirse que las plantas transgénicas de este tipo son heterocigóticos para el gen añadido. Sin embargo, en tanto que la palabra "heterocigótico" implica la presencia de un gen complementario en el mismo locus del segundo cromosoma de un par de cromosomas, y no hay ningún gen de este tipo en una planta que contiene un gen añadido como aquí, se cree que un nombre más exacto para una planta de este tipo es un segregante independiente, ya que el gen que codifica para la molécula quimérico, exógeno y añadido segrega independientemente durante la mitosis y la meiosis. Una planta transgénica que contiene un promotor potenciado de órganos que impulsa un único gen estructural que codifica para una molécula quimérica de HBc; es decir, un segregante independiente, es una planta transgénica preferida. Se prefiere más una planta transgénica que es homocigótica para el gen estructural añadido; es decir una planta transgénica que contiene dos genes añadidos, un gen en el mismo locus sobre cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigótica puede obtenerse mediante el apareamiento sexual (autofecundación) de una planta transgénica segregante independiente que contiene un único gen añadido, germinando algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes producidas para la acumulación de partículas quiméricas potenciadas con respecto a un control (nativo, no transgénico) o una planta transgénica segregante independiente. Una planta transgénica homocigótica exhibe acumulación de partículas quiméricas potenciadas en comparación con tanto una planta no transgénica nativa y una planta transgénica segregante independiente . Debe entenderse que dos plantas transgénicas diferentes también pueden cruzarse para producir vástagos que contienen dos genes exógenos (heterólogos ) añadidos que segregan independientemente. La autofecundación de la descendencia apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos añadidos que codifican para una molécula de HBc quimérica. También se contemplan el retrocruzamiento a una planta madre y la exogamia con una planta no transgénica.
Por tanto, una planta transgénica de esta invención tiene un gen estructural heterólogo que codifica para una molécula de Hbc quimérica contemplada. Una planta transgénica preferida es un segregante independiente para el gen estructural Hbc quimérico y puede transmitir ese gen a su descendencia. Una planta transgénica más preferida es homocigótica para el gen heterólogo, y transmite ese gen a todos sus vástagos al aparearse sexualmente. Los RPBLA expresados y sus proteínas de fusión pueden obtenerse a partir de las células huésped por los medios habituales usados en la recuperación bioquímica o biológica. Debido a que los RPBLA son densos con respecto a otras proteínas presentes en las células huésped, los RPBLA son particularmente capaces de recogerse mediante la centrifugación de un homogeneizado celular. Por tanto, las regiones de densidad diferente se forman en el homogeneizado para proporcionar una región que contiene una concentración relativamente potenciada de los RPBLA y una región que contiene una concentración relativamente reducida de los RPBLA. La región reducida de RPBLA está separada de la región de concentración relativamente potenciada de RPBLA, purificando así dicha proteína de fusión. A continuación, la región de concentración relativamente potenciada de RPBLA puede recogerse o tratarse con uno o más reactivos o someterse a uno o más procedimientos antes del aislamiento de los RPBLA o la proteina de fusión en los mismos. En algunas realizaciones, los RPBLA recogidos se usan como están, sin tener que aislar la proteina de fusión, como cuando los RPBLA se utilizan como una vacuna oral. La proteina de fusión que contiene el polipéptido biológicamente activo puede obtenerse mediante la disolución de la membrana envolvente en un tampón acuoso que contiene un detergente y un agente reductor tal como se describió anteriormente. Los agentes reductores ilustrativos incluyen 2-mercaptoetanol , ácido tioglicólico y sales de tioglicolato, ditiotreitol (DTT) , iones de sulfito o bisulfito, seguido de métodos de aislamiento de proteínas habituales. El dodecil sulfato sódico (SDS) es el detergente preferido, aunque pueden utilizarse otros tensioact ivos iónicos (desoxicolato, ' N-Lauroilsarcosina , y similares) no iónicos (Tween® 20, Nonidet® P-40, oct ilglicósido y similares) y zwitteriónicos (CHAPS, Zwittergent™ 3-X serie y similares) . Se utiliza una cantidad mínima de tensioactivo que disuelva o disperse la proteína de fusión.
VACUNAS E INÓCULOS En aún otra realización de la invención, los RPBLA se usan como el inmunógeno de un inoculo o vacuna en un paciente humano o huésped animal adecuado tal como un chimpancé, ratón, rata, caballo una oveja, bovino, perro, gato o similares. Un inoculo puede inducir una respuesta (estimulación) de células B o células T, tal como la producción de anticuerpos que inmunoreaccionan con el epitopo inmunogénico o determinante antigénico, o la activación de células T a un epitopo de este tipo, mientras que una vacuna proporciona una protección frente a la entidad de la que se ha derivado el inmunógeno a través de una o ambas respuestas de células T o células B. Los RPBLA de una vacuna o inoculo contemplados parecen actuar sobre células que presentan antigenos (SPCs) tales como células dendriticas y monocitos/macrófagos que rodean a los RPBLA y procesan sus contenidos. Al actuar sobre esos tipos celulares, los RPBLA mejoran la administración de antigenos a las células que presentan antigenos. Esos RPBLA también mejoran el tratamiento del antigeno y la presentación a las células que presentan antigenos. Por tanto, la invención también contempla una vacuna o inoculo que comprende una cantidad eficaz inmunogénica de ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) que se disuelven o dispersan en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Los RPBLA contienen una proteina de fusión recombinante que contiene en si dos secuencia unidas entre si en la que una secuencia es una secuencia inductora de cuerpos proteicos (PBIS) y la otra es un polipéptido biológicamente activo al que debe inducirse una respuesta inmunológica mediante dicha vacuna o inoculo. La activación de células T puede medirse mediante una variedad de técnicas. En la práctica habitual, se inocula un animal huésped con una vacuna o inoculo de RPBLA contemplada, y a continuación se recogen células sanguíneas mononucleares periféricas (PMBC) . Esas PMBC se cultivan entonces in vitro en presencia del polipéptido biológicamente activo (inmunógeno de células T) durante un periodo de aproximadamente tres a cinco días. Las PMBC cultivadas se someten a ensayo entonces para la segregación de una citocina tal como IL-2, GM-CSF de IFN-?. Los ensayos para la activación de células T se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. n° 5.478.726 y la técnica citada en la misma. Utilizando la formación de anticuerpos a modo de ejemplo, un inoculo o vacuna comprende una cantidad inmunogénicamente eficaz de RPBLA que se disuelven o dispersan en una composición de diluyente farmacéuticamente aceptable que normalmente también contiene agua. Cuando se administra a un animal huésped en el que va a inducirse una respuesta inmunológica al polipéptido biológicamente activo mediante la vacuna o inoculo tal como un animal huésped que necesita inmunización o en el que desean inducirse anticuerpos tal como un mamífero (es decir, un ratón, un perro, una cabra, una oveja, un caballo, un bovino, un mono, un simio o un ser humano) o un pájaro (por ejemplo, un pollo, un pavo, un pato o una oca), un inoculo induce anticuerpos que inmunoreaccionan con uno o más determinantes antigénicos del polipéptido biológicamente activo diana. La cantidad de inmunógeno de RPBLA usada en cada inmunización se denomina una cantidad inmunogénicamente eficaz y puede variar ampliamente dependiendo entre otros, del inmunógeno de RPBLA, el paciente inmunizado, y la presencia de un adyuvante en la vacuna, tal como se describe a continuación. Las cantidades inmunogénicamente eficaces para una (i) vacuna y un (ii) inoculo proporcionan la (i) protección o la (ii) actividad de anticuerpos o células T, respectivamente, descritos anteriormente en el presente documento . Las vacunas o inóculos normalmente contiene una concentración de inmunógeno de RPBLA de aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 1 miligramo por inoculación (dosis unitaria) y de manera preferible de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 50 microgramos por dosis unitaria. El término "dosis unitaria" en cuanto pertenece a una vacuna o inoculo de la presente invención se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir de manera individual o colectiva el efecto inmunogénico deseado en asociación con el diluyente requerido; es decir, portador o vehículo. Las vacunas o inóculos se preparan normalmente a partir de un inmunógeno de RPBLA recuperado dispersando el inmunógeno, en forma particulada, en un vehículo de diluyente fisiológicamente tolerable (aceptable) tal como agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina tamponada con acetato (ABS) , disolución de Ringer o similares para formar una composición acuosa. El vehículo de diluyente también puede incluir materiales oleaginosos tales como aceite de cacahuete, escualeno, o escaleno tal como se describe a continuación en el presente documento. La preparación de inóculos y vacunas que contienen materiales proteicos tales como principios activos también se conocen bien en la técnica. Normalmente, tales inóculos o vacunas se preparan como parenterales , o bien como disoluciones o suspensiones liquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la disolución en, o suspensión en, un liquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse, lo que se prefiere particularmente . Frecuentemente, los RPBLA inmunogénicamente activos se mezclan con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Adicionalmente , si se desea, un inoculo o vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tampón de pH que potencian la eficacia inmunogénica de la composición . La palabra "antigeno" se ha utilizado históricamente para designar una entidad unida por un anticuerpo o receptor, y también para designar la entidad que induce la producción del anticuerpo. El uso más actual limita el significado de antigeno a la entidad unida por un anticuerpo o receptor, mientras que la palabra "inmunógeno" se utiliza para la entidad que induce la producción de anticuerpos o se une al receptor. Cuando una entidad descrita en el presente documento es tanto inmunogénica como antigénica, normalmente se hace referencia a ella o bien como un inmunógeno o antigeno según su utilidad pretendida. Un "determinante antigénico" se refiere a la parte estructural real del antigeno que se une inmunológicamente mediante un sitio de combinación de anticuerpos o receptor de células T. Tal como se usa en el presente documento, el término "proteína de fusión" designa a un polipéptido que contiene al menos dos secuencias de residuos de aminoácidos que normalmente no se encuentran unidos entre sí en la naturaleza y que está unidas operativamente de extremo a extremo (de cabeza a cola) mediante un enlace peptídico entre sus residuos de aminoácidos carboxi y aminoterminal respectivos. Las proteínas de fusión de la presente invención son quimeras de una secuencia de inducción de cuerpos proteicos (PBIS) unida a una segunda secuencia que es un producto de polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, un péptido o una proteína) de interés (diana) . Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede utilizar la presente invención en su medida completa utilizando la descripción anterior y los siguientes ejemplos detallados. Por tanto, las siguientes realizaciones especificas preferidas deben considerarse como meramente ilustrativas y no limitativas del resto de la descripción de ninguna manera.
Ejemplo 1: Acumulación de proteínas de fusión derivadas de RX3-ECFP en fracciones densas de células de mamíferos transfectadas . La secuencia de polinucleótido que codifica para la secuencia RX3 que codifica para la gamma-zeína N-terminal
(documento WO2004003207 ) se fusionó directamente, o a través de un ligador que consiste en cinco glicinas, al extremo 5' de la secuencia que codifica para ECFP, un variante de fluorescencia cían de GFP. Esos constructos (figura 1A) que codifican para las proteínas de fusión RX3-ECFP o RX3-Gx5-ECFP se introdujeron en células CHO cultivadas de mamíferos mediante el método de transfeccion basado en la lipofectamina
( Invitrogen) . Las células CHO transfectadas con plásmido pECFP-Nl (Clontech) que contienen la secuencia génica de ECFP citosólico, se utilizaron como controles. Los extractos de células de mamíferos transfectadas se cargaron sobre gradientes de densidad escalonados y se centrifugaron. La acumulación de proteínas recombinantes en las distintas fracciones se analizó mediante inmunotrasferencia (figura 2A) . Los resultados que se muestran en esa figura indican que RX3-ECFP y RX3-Gx5-ECFP aparecieron en las fracciones F42, F56 y P que corresponden a RPBLA densos, (figura 2A, carriles 3-5) . Este resultado muestra que las proteínas de fusión pueden ensamblar e inducir la formación de RPBLA. También se detectó alguna proteína de fusión en la fracción del sobrenadante (figura 2A, carril 1), probablemente representando proteínas de fusión de los RPBLA parcialmente solubilizados durante el procedimiento de extracción, o proteínas de fusión que acaban de sintetizarse y que no se habían ensamblado. Por el contrario, cuando el extracto de células de mamíferos transíectadas con el plásmido pECFP-Nl de control se cargó sobre los mismos gradientes de densidad escalonados, la proteína de ECFP se observó exclusivamente en el sobrenadante. No se detectó ningún resto de ECFP en las fracciones densas, lo que indica que ECFP por sí mismo no puede agregar y formar estructuras similares a PB .
Ejemplo 2: Acumulación de ECFP activa fusionada a dominios PBIS en RPBLA de células de mamífero transfectadas Para determinar si las proteínas de fusión RX3-ECFP, RX3-Gx5-ECFP y 22aZ-ECFP son activas dentro de los RPBLA, se realizaron análisis de microscopía confocal en células CHO transfectadas con los constructos que codifican para las mismas (figura 1A) . Se recogieron imágenes de fluorescencia cian a una excitación de 458 nm con el láser de ión argón usando una ventana de emisión fijada a 470-530 nm. Tal como se muestra en la figura 3, las correspondientes proteínas de fusión, RX3-ECFP (figura 3A) y RX3-Gx5-ECFP (figura 3B) y 22aZ-ECFP (figura 3D) , se detectaron en el retículo endoplasmático, lo que indica que el péptido señal de la gamma-zeína y la alfa-zeína es funcional en células de mamífero en las que media la translocación de la proteína de fusión en el RE. Es importante observar que, de manera sorprendente, las proteínas de fusión parecen acumularse preferentemente en estructuras esféricas grandes y densas que recuerdan mucho a los cuerpos proteicos, naturales de semillas de cereales y a RPBLAs visualizados por inmunodetección en los sistemas heterólogos. La fluorescencia intensa observada en estas estructuras indica que la proteina de fusión permanece plegada apropiadamente, y por tanto activa, a pesar de estar altamente empaquetada dentro de los RPBLA. También es importante observar que los dominios RX3, asi como otras secuencias inductoras de cuerpos proteicos (PBIS) responsables de la formación de PB y estructuras similares a PB contienen múltiples restos de cisteina. Aunque puede predecirse que dichas cisteinas pueden formar enlaces disulfuro con cisteinas de proteínas diana e interferir así en el plegamiento apropiado de las proteínas diana, no se ha observado que este sea el caso. Se observaron ambas proteínas diana activas (ECFP fluorescencia) y PBIS funcionales (formación de RPBLAs). Como control, se usó el constructo pECFP-Nl para transfectar células CHO. La expresión de una ECFP citosólica mostró un patrón de fluorescencia homogéneo a lo largo de toda la célula, incluyendo el núcleo (figura 3C) .
Ejemplo 3: Localización subcelular de otras proteínas fluorescentes fusionadas a RX3 en células CHO. Se analizó mediante microscopía confocal la localización subcelular de las proteínas de fusión RX3-DsRED y RX3-GFP en células CHO transíectadas de forma transitoria para analizar si otras proteínas fluorescentes distintas a ECFP fusionadas a RX3 están plegadas apropiadamente dentro de los RPBLA y son bioactivas. Es importante observar que DsRED no comparte homología con ECFP, lo que implica un mecanismo de plegamiento completamente diferente. Se obtuvieron micrografías de las células t ransfectadas usando un microscopio de barrido láser confocal (Leica TCS SP, Heidelberg, Alemania) equipado con espectrofotómetros para la selección de la longitud de onda de la banda de emisión. Se recogieron imágenes de fluorescencia verde a una excitación de 488 nm con el láser de ión argón usando una ventana de emisión fijada a 495-535 nm. Se recogieron imágenes de fluorescencia roja tras una excitación a 543 nm con un láser de HeNe y una ventana de emisión de 550-600. las secciones ópticas tenían un espesor de 0.5 µp?. La expresión de las proteínas de fusión RX3-GFP (figura 3E) y RX3-DsRED (figura 3F) en células CHO produjo una gran cantidad de RPBLA de forma redonda altamente fluorescentes. Estos resultados confirman que ambas proteínas de fusión están plegadas apropiadamente dentro de los RPBLA.
Ejemplo 4: Localización subcelular de las proteínas de fusión de RX3 fluorescentes en plantas y insectos Con el fin de analizar si células huésped distintas a las células CHO pueden producir proteínas fluorescentes activas que contienen RPBLA fusionadas a dominios RX3, se transíectaron de manera transitoria plantas de tabaco con RX3-GFP mediante agroinfilt ración con jeringa. El análisis mediante microscopía confocal de las células epidérmicas (figuras 4A y 4B) mostró la presencia de una gran cantidad de RPBLA fluorescentes. Se obtuvieron resultados similares cuando se analizaron las células mesófilas transformadas de tabaco . Se obtuvieron resultados similares cuando se infectaron células de insecto Spodoptera SF9 o larvas de insecto (Trichoplusia ni) con baculovirus que codifica para la proteína de fusión RX3-DsRED. Tal como se muestra en la figura 4C, la proyección de las secciones ópticas de células de insectos infectadas acumularon una gran cantidad de RPBLA fluorescentes de aproximadamente 0,5 micrómetros de diámetro que contenían la proteína de fusión ZERA-DsRED activa. El análisis confocal de larvas infectadas también mostró una cantidad impresionante de RPBLA fluorescentes en cualquier tejido analizado. En la figura 4D, las células adiposas de larvas infectadas muestran RPBLA que contienen RX3-DsRED activa. Interesantemente, no se observó la fluorescencia DsRED en la hemolinfa de insecto, lo que sugiere que la proteina expresada se mantiene enteramente secuestrada dentro de los RPBLAs.
Ejemplo 5: Actividad de RX3-hGH ensamblada en RPBLA en células CHO. Se emprendieron estudios para determinar la actividad de la hormona del crecimiento humana (hGH) producida en RPBLAs. Se eligió la hGH porque esta molécula contiene 2 enlaces disulfuro que son importantes para el plegamiento apropiado de la proteina. El dominio RX3 también contiene residuos de cisteina que participan en enlaces disulfuro que son esenciales para el ensamblaje y la estabilización de los RPBLA, que podrían interferir en el plegamiento apropiado de la hGH. El constructo p3.1-RX3-hGH se introdujo en células CHO mediante transfección transitoria con el protocolo de la lipofectamina ( Invitrogen) . Cuatro días después de la transfección, las células se fijaron, permeabilizaron e incubaron con el anticuerpo anti-RX3 o un antisuero anti-hGH (figuras 5A y 5B, respectivamente) y el secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) . Se observó la presencia de grandes RPBLA (1-3 micrometros ) que contienen la proteina de fusión RX3-hGH mediante análisis de microscopía óptica, independientemente del anticuerpo primario usado. Con el fin de corroborar que los RPBLA eran orgánulos densos tal como se describió previamente, se homogenei zaron células CHO que expresan RX3-hGH y se cargaron los homogenei zados en un gradiente escalonado de densidad y se centrifugaron tal como se describe en otro momento. Se analizó la acumulación de RX3-hGH en las diferentes fracciones mediante inmunotransferencia . Tal como puede observarse, parte de la proteína de fusión estaba presente en el sobrenadante, representando la RX3-hGH no ensamblada, pero se detectó la mayor parte de la proteína de fusión en la fracción F56 correspondiente a RPBLA densos (figura 2B, carriles 2 y 5, respectivamente) . Esta fracción F56 se diluyó 3 veces con tampón PBP4 (Tris 100 mM pH 7,5, KC150 mM, MgCl2 5 m , EDTA5 mM) y se centrifugó a 80000 x g en un cabezal oscilante ("swinging bucket") para recuperar los RPBLA en el sedimento. La presencia de hGH se cuantificó empleando un ensayo ELISA (Active® Bioactive Human Growth Hormone ELISA-DSL-10-1900 ; Diagnostic Systems Laboratories, Ene) que era capaz de detectar la hGH incluso en presencia de la membrana de RPBLA intacta . Se aplicó esta misma muestra a un ensayo de bioactividad (Active® Bioactive Human Growth Hormone ELISA (ELISA para la hormona del crecimiento humana bioactiva) - DSL-10-11100; Diagnostic Systems Laboratories, Ene) . Este ensayo de bioactividad se basa en la capacidad de la hGH plegada apropiadamente para interaccionar con una proteina de unión a hGH proporcionada por el kit, dependiendo esta interacción de la conformación funcional de la hGH. La muestra dio un resultado positivo a 24 ng/ml de proteina bioactiva. Las proteínas hGH estaban evidentemente plegadas correctamente y presentadas sobre la superficie externa de los RPBLA densos.
La retirada de la membrana que rodea los RPBLAs lavando la preparación con Tris 50 mM, pH 3 y Tritón X-100 al 1% y mediante sonicación al 50% de amplitud y 50% de ciclo durante 1 minuto, repetido 5 veces (Ikasonic U200S - IKA Labortechnik) resultó en una actividad específica superior (45 ng/ml) debido a la exposición de moléculas adicionales de hGH en la superficie de los agregados. Al determinar la actividad de hGH fusionada a RX3, se solubilizó la proteína de fusión a partir de RPBLA aislados mediante un gradiente de densidad (F56, diluido 3 veces con tampón PBP4 y centrifugado a 80000 x g en un cabezal oscilante durante 2 horas) . Se solubilizó la proteina de fusión con tampón S (Tris 50 mM, pH 8 y 2% de ß-??) y se sónico (Clycle 5, amplitud del 50%, 1 minuto, repetido cinco veces; Ikasonic U200S - IKA Labortechnik) . Tras incubación a 37°C durante 2 horas, se centrifugó la muestra a 5000 x g durante 10 minutos, y se sometió a prueba el sobrenadante que contiene la proteina de fusión RX3-hGH soluble para cuantificar y evaluar el componente bioactivo de la fracción. Se determinó que la cantidad de proteina de fusión en el sobrenadante mediante ELISA fue de 250 ng/ml (Active® Human Growth Hormone ELISA (ELISA para hormona del crecimiento humana) - DSL-10-1900 ; Diagnostic Systems Laboratories, Ene) . La proteina sometida a prueba en el ensayo ELISA de bioactividad (Active® Bioactive Human Growth Hormone ELISA -DSL-10-11100; Diagnostic Systems Laboratories, Ene) dio un resultado de 70 ng/ml, indicando que aproximadamente el 30 % de la proteina de fusión RX3-hGH es activa. La pérdida de actividad de hGH podría ser una consecuencia de la alta concentración de agente reductor usado en la solubilización, o debido a algún efecto perjudicial del dominio RX3 sobre la hGh o la proteína de unión a hGH.
Finalmente, se escindió la proteina de fusión RX3-hGH mediante una proteasa específica del sitio para liberar la hGH de la proteína de fusión. La proteína de fusión RX3-hGH solubilizada se diluyó 2 veces y se realizó la digestión con EKmax según se describe por los fabricantes ( Invitrogen) . Después de eso, se aisló la hGH libre de la proteína de fusión no escindida (insoluble) mediante centrifugación a 16000 x g a 4°C durante 1 hora. La hGH soluble se recuperó del sobrenadante y se aplicó a los ensayos de cuantificación y bioactividad de Diagnostic Systems Laboratories. De manera sorprendente, los resultados de estos dos kits dieron el mismo valor de 90 ng/ml para los ensayos ELISA de cuantificación y bioactividad (Active® Human Growth Hormone ELISA - DSL-10-1900; Diagnostic Systems Laboratories, Inc) y Active® Bioactive Human Growth Hormone ELISA - DSL-10-11100 ; Diagnostic Systems Laboratories, Inc) lo que indica que toda la proteína presente detectada mediante el kit de cuantificación también se determina que es bioactiva. Se presenta a continuación una tabla resumen para la cuantificación y bioactividad de la proteína hGH en todas las formulaciones :
Cuantificación Bioactividad
Cantidad Cantidad Formulación ng/ml ng/ml
RPBLA 14 25 intactos
RPBLA con
eliminación 35 45 de membrana
RX3-hGH 250 70 soluble
hGH escindida 90 90
Es importante observar que se usaron células CHO tranfectadas de manera estable con el vector p3.1-RX3 como
control negativo. Tal como se muestra en la figura 2B, la
expresión de RX3 en células CHO también se acumula en
estructuras densas que pueden aislarse mediante gradiente
escalonado de densidad en F56 (figura 2B, carril 5) . Además,
el análisis óptico de células CHO transíectadas con p3.1-RX3,
mostró que la proteina RX3 se acumula en los RPBLA (figura
5C) Estas preparaciones control RX3 RPBLA y proteina RX3
aislada, mostró que no había actividad hGH en el ensayo ELISA
de bioactividad.
Ejemplo 6: Actividad de la inteína DNAb tras solubilización de RX3-Int-hGH de RPBLA procedentes de células CHO Se fusionó la secuencia de polinucleót ido que codifica para la inteina Ssp DNAb (New England Biolabs) en el marco al extremo 3' de la secuencia de RX3 (documento WO2004003207 ) , y al extremo 5' del ADNc de hGH. El constructo resultante se clonó en el vector pcDNA3.1(-) [figura 1A] para formar el vector p3. l-RX3-I-hGH . Como control negativo, se produjo una versión inactiva de la misma inteina mediante PCR en la que el residuo de aminoácido Aspl54 se mutó en Ala [figura 1A] para formar el vector p3. l-RX3-Im-hGH . Se ha notificado que el residuo de aminoácido Aspl54 es esencial para la actividad de autoescisión de Ssp DNAb (Mathys et al., GENE (1999) 231: 1-13) . El análisis inmunoquímico de células CHO transíectadas con p3. l-RX3-I-hGH usando antisuero anti-hGH reveló que la proteina de fusión RX3-Int-hGH se acumulaba en grandes RPBLA de forma redonda, similares a los observados en células CHO que expresan RX3-hGH (compárense las figuras 5B y 5D) . Este resultado indica que la proteina de fusión que contiene la inteina DNAb se autoensambla y se acumula en las estructuras de alta densidad.
Se homogeneizaron células CHO transfectadas con p3.1-RX3-I-hGH, se cargaron los homogeneizados en gradientes escalonados de densidad, y se analizaron las fracciones correspondientes a las diferentes densidades mediante inmunotransferencia . La mayor parte de la RX3-I-hGH se detectó en la fracción F56 correspondiente a los RPBLA densos (figura 2B) . Como para otras proteínas de fusión de RX3, la presencia de la proteína de fusión RX3-I-hGH en el sobrenadante probablemente representa la proteína de fusión no ensamblada contenida en el RE y solubilizada durante el proceso de homogeneización . Una vez que se demostró que la RX3-I-hGH se acumulaba en los RPBLA, se aislaron estos orgánulos derivados de RE mediante centrifugación a baja velocidad tal como se describe en otro momento en el presente documento. La centrifugación de los homoganeizados de células CHO transfectadas con p3.1-RX3-I-hGH a 1500 x g durante 10 minutos permitió la separación de las proteínas de fusión RX3-Int-hGH no ensambladas en el sobrenadante de las ensambladas en los RPBLA en el sedimento. Se realizaron estudios equivalentes con células CHO que expresan la proteína de fusión RX3-mInt-hGH inactiva.
Se solubilizaron los sedimentos que contenían las proteínas de fusión RX3-Int-hGH y RX3-mInt-hGH ensambladas en tampón SI (Tris 20 mM pH 7, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, SDS al 0,1% y TCEP 0,1 mM) a 37°C durante 2 horas, y se indujo la actividad enzimática de la inteína mediante incubación a 25°C durante 48 horas tras diálisis frente al tampón de inducción de escisión: Tris 20 mM pH 7, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM. Tras la inducción de la autoescisión de la inteína, se centrifugó la composición a 16000 x g durante 10 minutos y se analizaron el sobrenadante y el sedimento mediante inmmunotransferencia usando el antisuero anti-RX3 y anti-hGH. Se solubilizaron ambas proteínas de fusión, pero sólo pudo autoescindirse la proteína de fusión que contiene la inteína activa (RX3-Int-hGH) (figuras 6A y 6B, cabezas de flecha negras) . La ausencia de autoescisión de la proteína de fusión RX3-mInt-hGH mutada demuestra que la autoescisión observada con la RX3-Int-hGH se debe a la actividad específica de la inteína, y no se debe a la actividad proteasa endógena copurificada durante el proceso de aislamiento de RPBLA. Para optimizar la eficacia de autoescisión de la inteína, se sometieron a prueba protocolos de solubilización alternativos. Puede compararase la autoescisión de la inteína de la RX3-Int-hGH, tras la solubilización con tampón SI y el protocolo de extracción bifásica (S2) descrito en otro momento (figura 6C) . A partir de la razón entre el resto de la proteina de fusión de longitud completa y la aparición de la banda correspondiente a la hGH liberada, aun cuando el protocolo de extracción bifásica era el más eficaz, permitiendo más del 50% de escisión, puede concluirse que en ambos casos una gran proporción de la inteina DNAb era activa y podía autoescindirse .
Ejemplo 7: Actividad de RX3-EGF ensamblada en RPBLA en plantas de tabaco Se aislaron los RPBLA de plantas transgénicas de tabaco que expresan la proteína de fusión RX3-EGF mediante centrifugación a baja velocidad, esencialmente tal como se describe en el documento US11/289.264. Se solubilizó la proteína de fusión mediante sonicación (Ciclo 5, amplitud del 50%, 1 minuto, repetido cinco veces; Ikasonic U200S - IKA Labortechnik) en Tris 50 mM pH 8 y 2% de ß-?? e incubación a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, se centrifugó el material solubilizado a 16000 x g a 4°C durante 30 minutos para desechar la proteína de fusión no solubilizada en el sedimento. Se sometió a diálisis el sobrenadante frente a Tris 50 mM pH 8 para eliminar el ß- ?, se centrifugó de nuevo a 16000 x g a 4°C durante 30 minutos, y se cuantificó el sobrenadante mediante el kit de hEGF de Biosource International Inc. (KHG0062) . Se analizó la bioactividad de EGF determinando la tasa de proliferación (incorporación de timidina radiactiva en el ADN) de células MDA-MB231 (células de cáncer de mama que sobreexpresan el receptor EGF) incubadas con 1,2 ng/mL de proteina de fusión RX3-EGF. Como control positivo, se incubaron células MDA-MB231 con 10 ng/mL de EGF comercial (Promega) o suero de ternero fetal (FCS) . Los resultados, resumidos en la siguiente tabla, se representan como el porcentaje (%) de proliferación con respecto a la tasa de proliferación basal de células MB231 (100%), determinado como la tasa de proliferación de estas células cultivadas en ausencia de EGF (carentes) .
Proliferación de células MDA-MB231
Tal como se esperaba, la complementacion del cultivo de células MB231 con EGF comercial (Promega) o el FCS produjo un aumento significativo de la tasa de proliferación (158% y 145%, respectivamente). Inesperadamente, la adición de 1,2 ng/mL de RX3-EGF también produjo un aumento del 146% de la tasa de proliferación. Es importante observar que se observó casi la misma tasa de proliferación con una concentración de más de 10 veces de EGF comercial que con RX3-EGF. Este sorprendente resultado podría explicarse por los resultados previos que muestran que la saturación de la tasa de proliferación de células MB231 se observó a 5 ng/mL del EGF comercial. Otra posible explicación podría ser una conformación más activa de EGF cuando se fusiona a RX3. En cualquier caso, este resultado muestra que RX3-EGF es al menos tan activa como el EGF comercial (Promega) .
Ejemplo 8: Actividad de RX3-GUS ensamblada en RPBLA en células CHO.
La enzima ß-glucuronidasa (GUS) es una proteína indicadora ampliamente usada (Giiisen et al., Transgenic Res. (1998) 7 (3) : 157-163) . La expresión de una proteína de fusión RX3-GUS activa en los RPBLA suponía un reto, principalmente por la presencia de 9 residuos de aminoácido de cisteína, y también porque es una proteína grande (de aproximadamente 70 kDa) . La secuencia de polinucleótido que codifica para RX3 (documento O2004003207 ) se fusionó en el marco al extremo 5' de la secuencia que codifica para GUS (figura 1A. RX3-GUS) y la construcción resultante se usó para transfectar células CHO tal como se describe en el Ejemplo 7. El análisis inmunoquímico de células CHO transfectadas con p3.1-RX3-GUS incubadas con antisuero anti-RX3 reveló la presencia de RPBLA grandes (figura 5E) . Para verificar la densidad de esos RPBLA, se homogeneizaron células CHO transíectadas con el mismo plásmido y posteriormente se cargaron en gradientes escalonados de densidad. El análisis de las diferentes fracciones por inmunotransferencia mostró que las proteínas de fusión se localizaron en las fracciones de densidad superior (figura 2B. F56) , lo que indica que las proteínas de fusión RX3-GUS pueden ensamblarse y acumularse en RPBLA densos. Es importante observar que no se detectó proteína de fusión en el sobrenadante, lo que significa que toda la RX3-GUS se ensambla en estructuras densas (RPBLA) . Una vez que se demostró que la RX3-GUS se acumulaba en los RPBLA, se recuperó la proteína de fusión de la fracción F56 (según se describe en el ejemplo 5 para RX3-hGH) y se solubilizó en Tris 50 mM, pH 8, 2% de ß-?? y 0,1% de SDS a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, se centrifugó el material solubilizado a 16000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se sometió a diálisis el sobrenadante que contiene la proteína de fusión RX3-GUS desensamblada soluble a 4°C frente a disolución Tris 50 mM pH 8 durante la noche (aproximadamente 18 horas). La prueba de actividad GUS se basa en la catálisis de ácido metilumbeliferil-p-glucurónido (MUG) para el producto fluorescente de 4 -metilumbeliferona (4-MU), por la enzima GUS (Jefferson et al. 1987 EMBO J. 6 ( 13 ) : 3901-3907 ) . Se incubaron cincuenta µ]_, de la proteina de fusión RX3-GUS solubilizada
(aproximadamente 0,25 ng de en presencia de MUG a temperatura ambiente, y se llevó a cabo la medición de la apariencia de 4-MU en un fluorimetro (longitud de onda de excitación 355 nm; longitud de onda de emisión 420 nm) . Para descartar la posibilidad de medir actividad de tipo GUS endógena presente en la preparación de los RPBLA a partir de las células CHO, se aislaron los RPBLA de células CHO transfectadas con p3.1-RX3, y una vez que se solubilizó la proteina RX3, se incluyó esta muestra en la prueba de actividad como control. La siguiente tabla resume los resultados obtenidos:
Absorbancia a 420 nm
A partir de los resultados mostrados en esta tabla, está claro que la proteina de fusión RX3-GUS permanece activa una vez solubilizada a partir de los RPBLA. La actividad especifica de la RX3-GUS calculada a partir de estos experimentos fue de 0,2 pmol de 4-MU/min-l * 12,5 ng-1 de RX3-GUS. No se observó actividad de tipo GUS endógena cuando se analizó la preparación de RX3.
Ejemplo 9: Actividad de RX3-EK ensamblada en RPBLA en células CHO. La enterocinasa (enteropeptidasa) de Bos taurus es una serina proteasa unida a la membrana de la mucosa duodenal, que participa en el procesamiento del tripsinógeno en tripsina (DDDKj,) con un dominio de serina proteasa de tipo quimotripsina . La enteropeptidasa es un péptido bicatenario con enlaces disulfuro formado por la cadena pesada (EKHc _ 120 kD) y la cadena ligera catalítica (EKLC - 47 kD) . La subunidad catalítica (denominada en el presente documento como EK) es casi tan activa y específica por sí misma como la holoenzima (LaVallie et al. 1993 J. Biol. Chem. 268 ( 31 ) : 23311-23317 ) . Es importante señalar que la EK bovina tiene 4 enlaces disulfuro. Además, el extremo N-terminal de la proteína se pliega dentro de la proteína, y es esencial para el plegamiento apropiado de una EK funcional. Estos dos requisitos de la EK hacen que la proteína EK sea una proteína que supone un reto para expresarla como una proteína activa en RPBLA. La secuencia de polinucleótido que codifica para RX3
(documento WO2004003207 ) se fusionó a través de un ligador que comprende un sitio de escisión de FXa (IEGR) al extremo 5' de la secuencia de EK, y se clonó en pcDNA3.1(-) (figura 1A, p3.1-RX3-EK) . Este constructo se usó en la transfección de células CHO mediante el método de la lipofectamina ( Invitrogen) . El análisis de inmunoquímica de esas células transfectadas con antisuero anti-RX3 reveló la presencia de una gran cantidad de RPBLA pequeños. Estos orgánulos se observaron a todo lo largo del citoplasma de las células transfectadas , pero el tamaño no superó normalmente los 0,5 micrometros (figura 5F) . Para verificar la densidad de esos RPBLA pequeños, se homogeneizaron las células CHO transfectadas con el mismo plásmido y se cargaron en gradientes de densidad escalonados. La proteína de fusión RX3-EK estaba localizada en la fracción F56 (figura 2B) . La alta densidad de los ensamblajes de las proteínas de fusión RX3-GUS sugiere que esta proteína de fusión se acumula en RPBLA densos. Es importante observar que no se detectó proteína de fusión en el sobrenadante, lo que significa que casi toda la RX3-EK se ensambla en estructuras densas (RPBLA) . De manera interesante, se estimó que el peso molecular de la proteína de fusión RX3-EK era de 58 KDa, aproximadamente 15 KDa superior al peso molecular teórico. Este resultado sugiere que la EK en los RPBLA está altamente glucosilada, tal como se ha descrito para la proteína natural (LaVallie et al., 1993 J. Biol . Chem . 268 ( 31 ): 23311-23317 ) . Se recuperó la proteína de fusión de la fracción F56 (tal como se describe en el ejemplo 5 para RX3-hGH) y se solubilizó en Tris 50 mM, pH 8, 2% de ß-?? y 0,1% de SDS a 37°C durante 2 horas. Para aumentar la- solubilización, se sónico la muestra al 50% de amplitud y 50% del ciclo durante 1 minuto, repetido 5 veces (Ikasonic U200S - IKA Labortechnik) , antes de que se añadiera SDS. Posteriormente, se centrifugó la muestra a 5000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos, y el sobrenadante que contenía la proteína de fusión RX3-GUS desensamblada soluble se sometió a diálisis a 4°C frente a disolución Tris 50 mM pH 8 durante la noche (aproximadamente 18 horas). Luego, se digirió la proteína de fusión mediante FXa según describe el fabricante (Qiagen) , y se midió la actividad de EK mediante ensayo fluorimétrico (Grant, et al., 1979 Biochim. Biophys. Acta 567:207-215). La EK liberada de RX3-EK tenía actividad enteropeptidasa .
Ejemplo 10: Actividad de RX3-Casp2 y RX3-Casp3 ensambladas en
RPBLA en células CHQ Se emprendieron estudios para determinar la actividad de caspasas producidas en los RPBLA. Las caspasas son una familia de cisteina proteasas que se escinden con alta especificidad tras un ácido aspártico de una secuencia consenso. Son los principales ejecutores del proceso altamente regulado de apoptosis. Las caspasas existen como procaspasas inactivas con un prodominio de longitud variable seguido por una subunidad grande (p20) y una subunidad pequeña (plO) . Se activan a través de proteolisis y la caspasa activa madura consiste en el heterotetrámero p202-pl02 (Lavrik et al., 2005 J. Clin. Invest. 115:2665-2671). Las caspasas se dividen en caspasas iniciadoras y caspasas ejecutoras que difieren en su mecanismo de acción. La caspasa 2 (caspasa iniciadora) y la caspasa 3 (caspasa ejecutora) se han elegido como un ejemplo de proteínas que son activas en los RPBLA (Baliga et al., 2004 Cell Death and Differentiation 11:1234-12 1; Feeney et al., 2006 Protein Expression and Purification 47 ( 1 ): 311-318 ) . Esas proteínas suponen un reto especialmente porque se sintetizan como zimógenos que, para volverse activos, necesitan autoescindirse para formar el heterotetrámero.
Los constructos p3.1-RX3-C2 y p3.1-RX3-C3 (figura 1) se introdujeron en células CHO mediante transfección transitoria con el protocolo de la lipofectamina ( Invitrogen) . Cuatro días después de la transfección, para determinar si las caspasas se acumulan en orgánulos de RPBLA densos, se homogeneizaron células CHO que expresan RX3-Casp2 o RX3-Casp2, se cargaron en un gradiente escalonado de densidad y se centrifugaron tal como se describe en otro momento. Se analizó la acumulación de ambas proteínas de fusión de RX3-caspasas en las diferentes fracciones mediante inmunotransferencia (figura 2B) . Tal como puede observarse, la mayor parte de las proteínas de fusión RX3-Casp2 o RX3-Casp2 sedimentan en la fracción F56 y F42 correspondientes a RPBLA densos. Este resultado indica que estas dos proteínas de fusión pueden ensamblarse estrechamente en estructuras densas . En la inmunotransferencia presentada en la figura 2B, sólo se muestra la proteína de fusión de longitud completa, pero están presentes bandas de diferente peso molecular en esta fracción. Estas bandas que son reactivas o bien al anticuerpo anti-RX3 o bien al anticuerpo anti-CASP (SA-320 y SA-325, Biomol International) corresponden a las diferentes subunidades de caspasa, lo que indica que la activación autocatalitica ha tenido lugar dentro de los RPBLA. Estas observaciones indican que la caspasa 2 y la caspasa 3 son activas in vivo. Las fracciones F56 y F42 se diluyeron 4 veces con tampón PBP4 y se centrifugaron a 80000 x g en un cabezal oscilante para recuperar los RPBLA en el sedimento. La membrana de RE que rodea este orgánulo se eliminó mediante lavado de la preparación de los RPBLA Tris 50 mM pH 8 y Tritón X-100 al 1%. Tras la eliminación de la membrana de RE, se sometió a prueba la actividad de caspasa usando el sistema de ensayo BIOMOL QuantiZymeTM, kit de ensayo de la actividad celular de caspasa 3 PLUS-AK703 (caspasa 3) y el sistema de ensayo BIOMOL QuantiZymeTM, kit de ensayo de la actividad celular de caspasa 2 PLUS-AK702 (caspasa 2) . Este kit mide la actividad caspasa de manera colorimétrica con un sustrato especifico. Los RPBLA de RX3-Casp2 y RX3-Casp3 muestran actividad caspasa . Al determinar la actividad de caspasas fusionadas a RX3, la proteina de fusión se solubiliza a partir de RPBLA aislados mediante gradiente de densidad (F56 y F42, diluidos 4 veces con tampón PBP4 y se centrifuga a 80000 x g en un cabezal oscilante) . La proteina de fusión se solubiliza en tampón CA (Hepes 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 100 mM, CHAPS al 1%, glicerol al 10 %) tras sonicación (50% de amplitud y 50% de ciclo durante 30 segundos, 5 veces) . La solubilización se realiza mediante una incubación de 2 horas a 37°C y se desecha el material insoluble mediante centrifugación a 16000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante que contiene la proteina de fusión RX3-casp soluble se somete a diálisis frente al tampón de ensayo del kit (Hepes 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 10 mM, CHAPS al 0,1%, glicerol al 10%) . Se evalúa la actividad de la muestra dializada que contiene RX3-Casp2 y RX3-Casp3 con el sistema de ensayo BIOMOL Quant iZymeTM, kit de ensayo de la actividad celular de caspasa 3 PLUS-AK703 (caspasa 3) y el sistema de ensayo BIOMOL . QuantiZymeTM, kit de ensayo de la actividad celular de caspasa 2 PLUS-AK702 (caspasa 2) . Caspasa 2 y caspasa 3 son activas.
Ejemplo 11: Actividad de RX3-RTB ensamblada en RPBLA en plantas de tabaco agroinfiltradas Se fusionó la secuencia de polinucleótido que codifica para RTB (Reed et al., 2005 Plant Cell Report 24:15-24) en el marco al extremo 3' del dominio RX3 y se clonó en un vector binario (pB-RX3-RTB) .
Este constructo se usó en plantas de tabaco transformadas mediante agroinfiltración con jeringa, tal como se describe en otro momento. Se homogenei zaron las hojas de tabaco agroinfiltradas y se cargaron en gradientes de densidad escalonados. La proteina de fusión RX3-RTB estaba localizada en las fracciones F42 y F56 (figura 2B) , lo que sugiere que la proteina de fusión se autoensambla y acumula en RPBLA densos. Tal como se describió para RX3-EK, la proteina de fusión RX3-RTB aislada de los RPBLA tiene una movilidad electroforética menor comparado con el peso molecular teórico. Este resultado apoya que RTB también puede estar glucosilado en los RPBLAs . Se recuperó la proteina de fusión de esas fracciones densas (según se describe en el ejemplo 5 para RX3-hGH) y se solubilizó en Tris 50 mM, pH 8, 0,8% de ß- ? a 37°C durante 2 horas. Para aumentar la solubilización, se sónico la muestra al 50% de amplitud y 50% de ciclo durante 1 minuto, repetido 5 veces (Ikasonic U200S - IKA Labortechnik) . Posteriormente, se centrifugó la muestra a 5000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos y se analizó el sobrenadante que contiene la RX3-RTB desensamblada soluble mediante ELISA para determinar la unión a la glucoproteina fetuina tratada con sialidasa para exponer glucanos terminados en galactosa. La RX3-RTB se une a ella.
Ejemplo 12: Constructo de plásmido para la transformación de plantas Se obtuvieron sintéticamente las secuencias codificantes del factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF) y se modificaron con el fin de optimizar la utilización de codones para la expresión en plantas.
Proteina hEGF (SEQ ID NO: 41) ADN de hEGF (SEQ ID NO: 42)
Se obtuvo el gen sintético que codifica para los 53 aminoácidos de hEGF activo mediante el método de la PCR de extensión por solapamiento de cebador, utilizando 4 oligonucleotidos de aproximadamente 60 bases, con 20 bases solapantes. El ADNc de hEGF sintético incluyó una secuencia de ligador en 5' correspondiente al sitio de escisión especifico del factor Xa. Los oligonucleotidos se purificaron en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se purificó el ADNc de hEGF sintético a partir de gel de agarosa (Amersham) y se clonó en el vector pGEM (Promega) . El fragmento de ADNc de RX3 (que codifica para un dominio N-terminal de gamma-zeina) que contiene extremos cohesivos de BspHI y Ncol, se insertó en el vector pCKGFPS65C (Reichel et al., 1996 Proc. Nati. Acad. Sci . USA 93:5888-5893) digerido previamente con Ncol (tal como se describe en la solicitud de patente WO2004003207 ) . La secuencia que codifica para EGF se unió en marco a la secuencia de RX3. Se preparó el constructo RX3-EGF mediante la sustitución de la secuencia codificante de GFP por la secuencia sintética de EGF. El constructo resultante denominado pCRX3EGF contenia una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de una proteina como el promotor de 35S reforzado, un potenciador de la traducción como el virus del grabado del tabaco (VGT) , la secuencia codificante de EGF y las secuencias de poliadenilación en 3' del virus del mosaico de la coliflor (VMC) . El vector pl9RX3EGF de transformación en plantas eficaz se obtuvo finalmente mediante la inserción de los casetes de expresión HindIII/HindIII en el vector binario pBinl9 (Bevan, 1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721) . El ADNc que codifica para la alfa-zeina de 22 kD (22aZ) y la prolamina del arroz de 13 kD (rP13) se amplificaron mediante RT-PCR a partir de una biblioteca de ADNc de cultivos de maíz W64A y arroz Senia, respectivamente. Los oligonucleótidos utilizados en la reacción de PCR fueron:
22aZ-5' (SEQ ID NO: 43)
22aZ-3' (SEQ ID NO: 44)
Ricel3Prol-5 ' (SEQ ID NO: 45)
Ricel3Prol-3 ' (SEQ ID NO: 46)
Los fragmentos de PCR correspondientes se clonaron en el vector pCRII ( Invitrogen) , se secuenciaron y se clonaron en los vectores pUC18 que contenían el promotor 35S del VMC reforzado, la secuencia del VGT y el terminador oes en 3' . El pCRII-rP13 se digirió mediante Salí y Ncol, y se clonó en los plásmidos pUC18RX3Ct, pUC18RX3hGH y pUC18RX3EGF digeridos mediante las mismas enzimas para obtener el plásmido pUC18rP13EGF. El pCRII-22aZ se digirió mediante Sall/Ncol y se clonó en el plásmido pUC18RX3EGF digerido mediante las mismas enzimas para obtener el plásmido pUC1822aZtEGF . Finalmente, el vector derivado de pUC18 se clonó en pCambia 5300 mediante HindIII/EcoRI . El constructo pBIN m-gfp4-ER, contiene una GFP optimizada para la expresión en plantas (Haseldef et al., 1997 Proc. Nati. Acad. Sci . USA 94:2122-2127) . Este constructo se utilizó como molde para la amplificación por PCR de GFP. Los oligonucleót idos se diseñaron para eliminar el péptido señal y el motivo HDEL presente en la secuencia original, asi como para introducir los sitios de restricción para la clonación adicional.
Cebadores : GFP 5' (SEQ ID NO: 50) GFP 3' (SEQ ID NO: 51)
El producto de la PCR se clonó en un vector de clonación de PCR (vector PCR®II, Invitrogen) y se verificó la secuencia. El fragmento de GFP que contenia los extremos cohesivos Rcal/BamHI se clonó en pUC18RX3hGH (documento US2006123509 (Al)), proporcionando el cásete ZERA-GFP en un vector pUC18. Este cásete se liberó mediante digestión con HindIII/BamHI y posteriormente se insertó en un vector pCA BIA 2300 (pB-RX3-GFP) El clon RTB (número de registro de GenBank X03179) se amplificó mediante PCR (RTB5 y RTB3) y se digirió mediante Rcal/Smal. El fragmento de la PCR digerido se clonó en pUC18RX3hGH (documento US2006123509 (Al)) se digirió mediante Ncol/Smal para obtener pUC18RX3RTB. A continuación, este vector se digirió mediante HindIII/EcoRI y el fragmento liberado se clonó en el vector pCAMBIA 2300 digerido por las mismas enzimas de restricción (pB-RX3-RTB) .
Cebadores : RTB5 (SEQ ID NO: 52) RTB3 (SEQ ID NO: 53)
Material vegetal Se cultivaron plantas de tabaco {Nicotiana tabacuna var. Wisconsin) en una cámara de crecimiento in vitro a 24-26°C con un fotoperiodo de 16 horas. Las plantas adultas se cultivaron en invernadero entre 18-28°C, la humedad se mantuvo entre el 55 y el 65% con un fotoperiodo promedio de 16 horas. Las plántulas para el método de agroinfiltración (Vaquero et al., 1999 Proc. Nati. Acad. Sci., USA 96 (20) : 11128-11133; Kapila et al., 1997 Plant Sci. 122:101-108) se cultivaron a partir de las semillas durante 4-6 semanas en las condiciones in vitro descritas anteriormente.
Transformación estable del tabaco Los vectores binarios se transfirieron a la cepa LBA4404 A. turnefaciens . Se transformaron discos de la hoja del tabaco {Nicotiana tobaccum , W38) tal como se describe por Draper y Hamil 1988, En: Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual (Eds. Draper, J. , Scott, R. , Armitage, P. y Walden, R. ) , Blackwell Scientific Publications . Las plantas regeneradas se seleccionaron en medio que contenia 200 mg/L de kanamicina y se transfirieron a un invernadero. Las plantas de tabaco transgénicas que tenían los niveles de producto transgénico más elevados se cultivaron con el fin de obtener las generaciones TI y T2. Se detectaron los niveles de proteína recombinante mediante inmunotransferencia . Se cuantificaron los extractos de proteína total procedentes de las hojas del tabaco mediante el ensayo de Bradford, se separaron en SDS-PAGE al 15% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio Rad) . Las membranas se incubaron con antisuero de gamma-zeína (dilución 1/7000) (Ludevid et al. 1985, Plant Science 41:41-48) y se cultivaron después con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante (dilución 1/10000, Amersham Pharmacia). Se detectaron las bandas inmunorreact ivas mediante quimioluminiscencia intensificada (sistema de inmunotransferencia de tipo Western blotting de ECL, Amersham Pharmacia) .
Agroinfiltración de tabaco Agroinfiltración a vacío Las plántulas para el método de agroinfiltración se cultivaron a partir de las semillas durante 4-6 semanas en una cámara de crecimiento in vitro a 24-26°C con un fotoperiodo de 16 horas. La cepa LB4404 de A. turnefaciens que contiene un constructo deseado se hizo crecer en medio LB (triptona 10 g/1, extracto de levadura 5 g/1, NaCl 10 g/1) complementado con kanamicina (50 mg/1) y rifampicina (100 mg/1) a 28°C con agitación (250 rpm) durante la noche (aproximadamente 18 horas) . Las agrobacterias se inocularon entonces en 30 mi de LB también complementado con kanamicina (50 mg/1) y rifampicina (100 mg/1) . Tras el cultivo durante la noche a 28°C (aproximadamente 18 horas), se recogieron las células de agrobacterias mediante centrifugación durante 10 minutos a 3000 x g y se resuspendieron en 10 mi de medio MS liquido con MES (Sigma Chemical) 4,9 g/1 y sacarosa 30 g/1 a pH 5,8. El cultivo bacteriano se ajustó hasta una DC>6oo final de 0,1 para la agroinfiltración . Entonces, el cultivo celular se complementó con acetosiringona hasta una concentración final de 0,2 mM y se incubó durante 90 minutos a 28°C. Para la agroinfiltración, las plántulas se cubrieron totalmente con la suspensión y se aplicó vacio (100 KPa) durante 5 - 6 segundos. La suspensión se extrajo y las plántulas se mantuvieron en una cámara de crecimiento a 24 -26°C con un fotoperiodo de 16 horas durante cuatro días. El material vegetal se recubrió y se analizó la extracción de proteínas total mediante inmunotransferencia utilizando el anticuerpo ant i-gamma-zeína .
Agroinfiltración mediante jeringa La cepa EHA 105 de Agrobacterium turnefaciens se hizo crecer a 28°C en caldo L complementado con kanamicina 50 pg mL"1 y rifampicina 50 g mL-1 hasta la fase estacionaria. Se sedimentaron las bacterias mediante centrifugación a 5000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente y se resuspendieron en tampón MES 10 mM pH 5,6, MgCl2 10 mM y acetosiringona 200 µ? hasta una ??e?? final de 0,2. Se dejaron las células en este medio durante 3 h a temperatura ambiente. Se mezclaron juntos cultivos individuales de Agrobacterium que llevaban los constructos ZERA y los constructos supresores de silenciación de HC-Pro (Goytia et al., 2006) y se infiltraron en la cara abaxial de hojas de plantas de Nicotiana benthamiana de 2 - 4 semanas (Voinnet et al, 2003) .
Ejemplo 13: Aislamiento (purificación) de RPBLA mediante gradiente de densidad de tejidos vegetativos de plantas transgénicas Se introdujo el gen que codifica para proteínas de fusión derivadas de gamma-zeína RX3-EGF en plantas del tabaco por medio de Agrobacterium turnefaciens . Se analizaron las plantas transformadas mediante inmunotransferencia para determinar aquellas plantas con expresión de proteína recombinante más alta. Las bandas inferiores predominantes de las inmunotransferencias corresponden a la forma monomérica de las proteínas de fusión y las bandas superiores a los dímeros. Normalmente, las proteínas de fusión se acumulan como multímeros, y la cantidad de monómeros y oligómeros detectados en las inmunotransferencias depende del nivel de reducción de enlace disulfuro. Se cargaron extractos de la hoja del tabaco en gradientes de densidad escalonados y se analizó mediante inmunotransferencia la acumulación de proteínas recombinantes en las diferentes fracciones. Los resultados indicaron que RX3-EGF aparecía en fracciones correspondientes a RPBLA densos. La mayoría de estos orgánulos mostraban densidades superiores a 1,2632 g/cm3 y una parte significativa de ellos muestra una densidad superior a 1,3163 g/cm3. Estos RPBLA novedosos formados en las hojas del tabaco muestran densidades en el intervalo de los cuerpos proteicos del maíz natural (Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:227-234; Lending et al., 1989 Plant Cell 1:1011-1023), o, incluso son más densos. Se estimó que se recuperó más del 90 por ciento de la proteína recombinante en el sedimento y fracciones de RPBLA densos. Por tanto, el aislamiento de RPBLA mediante densidad parece ser un sistema útil para purificar (concentrar) las proteínas de fusión. Para evaluar la purificación de la proteína recombinante RX3-EGF mediante aislamiento de los RPBLA, se analizaron, las fracciones de diferente densidad mediante tinción con plata. Más del 90 por ciento de las proteínas endógenas del tabaco se localizaban en las fracciones de la inferíase y solubles del gradiente, fracciones en las que la proteína RX3-EGF estaba ausente o apenas detectada. Por tanto, podrían desecharse las proteínas solubles y la masa de las proteínas presentes en los orgánulos menos densos seleccionando una o dos fracciones del gradiente. Con respecto al grado de purificación de las proteínas de fusión en las fracciones de los RPBLA, se estimó que la proteína RX3-EGF representa aproximadamente el 80 por ciento de las proteínas detectadas en las fracciones que contienen PBLS . Este resultado indica que, usando un procedimiento de aislamiento de RPBLA, puede conseguirse un enriquecimiento importante de las proteínas de fusión en solamente una etapa de purificación.
Ejemplo 14: Recuperación de las proteínas recombinantes en RPBLA aislados a partir de tejidos de plantas secas Un punto importante en el cultivo molecular es la presencia de un medio sencillo para almacenar biomasa vegetal. En este contexto, el secado puede proporcionar un método conveniente para reducir el volumen de almacenamiento y conservar el producto. No obstante, el secado promueve frecuentemente la degradación de las proteínas de interés. El uso de plantas desecadas para aislar RPBLA que contienen proteínas recombinantes sería de gran interés para fines industriales .
Se secaron tal como se discutió anteriormente las hojas de tabaco transformadas que acumulan la proteina de fusión RX3-EGF tal como también se describió anteriormente. Se analizó la estabilidad de las proteínas recombinantes tras 5 meses de almacenamiento en seco. Se analizaron mediante inmunotransferencia los extractos de proteína a partir de cantidades equivalentes de tejido de hojas secas y húmedas (frescas) . La proteína RX3-EGF era estable en las plantas transformadas desecadas, siendo similar la cantidad recuperada en las plantas secas y húmedas. Se analizó mediante inmunotransferencia la distribución de los gradientes de densidad escalonados de la proteína de fusión RX3EGF a partir de homogeneizados de hojas secas. Se recuperó la proteína de fusión principalmente en estructuras densas que mostraban densidades superiores a 1,1868 g/cm3 y 1, 2632 g/cm3. Por tanto,. las proteínas recombinantes pueden purificarse a partir de tejidos secados por medio de aislamiento de RPBLA, ilustrando de ese modo que la purificación y extracción de la proteína recombinante y la recogida de la planta transgénica puede ser dependiente del tiempo. En concordancia con estos resultados, se acumularon las proteínas de fusión gamma-zeína en los RPBLA en las semillas de arroz.
Ejemplo 15: Recuperación de proteina recombinante mediante aislamiento de RPBLA a partir de plántulas de tabaco transformadas de manera transitoria. Los sistemas de expresión transitoria pueden ser una herramienta conveniente para someter a prueba el comportamiento de acumulación de las proteínas recombinantes en un corto periodo de tiempo. Por tanto, también se expresó y acumuló la proteína recombinante RX3-EGF en plántulas de tabaco transformadas de manera transitoria por medio de agroinfiltración . Los extractos de proteína a partir de las plántulas transformadas analizadas mediante inmunotransferencia muestran el patrón electroforético complejo característico observado en plantas transformadas de manera estable, indicando que las proteínas de fusión se ensamblan correctamente usando este método de transformación.
Ejemplo 16: recuperación de proteínas recombinantes mediante centrifugación a velocidad media y baja. Se realizaron dos métodos alternativos adicionales para simplificar el procedimiento usado para purificar las proteínas recombinantes por medio de ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes densos: i) se centrifugaron los homogeneizados clarificados a través de solamente un colchón de sacarosa denso y ii) se centrifugaron simplemente los homogeneizados clarificados mediante centrifugación a baja velocidad (es decir, 1000-2500xg durante 10 minutos) . En concordancia con los resultados descritos anteriormente, se recuperó la proteína RX3-EGF con altos rendimientos, (más del 90%) en los sedimentos obtenidos tras la centrifugación a través de colchones de sacarosa de 1,1868 g/cm3. Además, la purificación de la proteína RX3-EGF fue muy alta porque apenas se detectaron las proteínas endógenas del tabaco contaminantes en el sedimento correspondiente. La principal ventaja de este método comparado con los gradientes de densidad escalonados se encuentra en su escalabilidad sencilla para la producción industrial de proteínas recombinantes. Debe observarse que pueden ajustarse la densidad del colchón, así como otras propiedades tales como su viscosidad y osmolaridad en cada caso con el fin de optimizar la recuperación y purificación de las proteínas recombinantes . Además, también se realizó un ensayo de centrifugación a baja velocidad (LSC, low speed centrifugation) para concentrar y purificar estructuras similares a cuerpos proteicos que contienen proteína de fusión. Los resultados indicaron que, tras lOOOxg durante 10 minutos, se recuperó prácticamente toda la proteína de fusión RX3-EGF en el sedimento. Pero la tinción de las proteínas contenidas en este sedimento reveló que la proteína de fusión no estaba sumamente purificada comparado con lo obtenido tras centrifugación a través de un colchón de sacarosa de 1,1868 g/cm3. A continuación, se lavó el primer sedimento obtenido mediante centrifugación a baja velocidad usando un tampón que contenía Tritón® X-100 al 5%. Tras el lavado se centrifugó la muestra a 12.000xg durante 5 minutos y, de manera interesante, se eliminó la masa de proteínas contaminantes presente en el sedimento Pl tras el lavado y centrifugación, y el nuevo sedimento contenía una proteína RX3-EGF sumamente enriquecida. Se observa que la cantidad, así como el patrón de proteínas observadas en este estudio es similar a los obtenidos tras el lavado del sedimento obtenido tras centrifugación a través del colchón de sacarosa en el tampón que contiene Tritón X-100. La alternativa de la centrifugación a baja velocidad se basa en la alta densidad de las estructuras que contienen proteínas de fusión y pueden optimizarse las condiciones de centrifugación para cada objetivo antes de aumentar la escala. Se produjeron plantas del tabaco transgénicas que expresan proteínas de fusión que incluyen EGF unido a la prolamina del arroz o alfa-zeína en vez de a RX3, rP13-EGF y el 22aZ-EGF, mediante transformación de Agrobacterium turnefasciens . Se determinaron los mejores agentes de expresión mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo frente al EGF, y se usaron aquellas líneas celulares en un análisis comparativo con plántulas de tabaco agroinfiltradas con los mismos constructos. En todos los casos, se recuperaron los RPBLA en una única interfaz, sugiriendo que los RPBLA son muy densos y homogéneos. Reuniendo todos estos resultados, está claro que las prolaminas pueden inducir RPBLA de alta densidad, incluso cuando se fusionan a otras proteínas. Éste es un resultado inesperado, principalmente cuando casi no se observa homología entre ellos. Además, hay algunos datos que sugieren que las prolaminas interactúan para estabilizar los cuerpos proteicos, y que algunos de ellos no son estables cuando se expresan en tejido vegetativo solo, como por ejemplo alfa-zeína (Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345) Ejemplo 17: Extracción de proteínas recombinantes a partir de RPBLA aislados Se ha demostrado que el aislamiento de ensamblajes similares a PB recombinantes densos es un método ventajoso para recuperar proteínas recombinantes con alto nivel de purificación y alto rendimiento a partir de organismos transgénicos . En el presente documento se demuestra que pueden extraerse estas proteínas recombinantes a partir de los orgánulos de reserva. Tras una incubación durante la noche (aproximadamente 18 horas) de fracciones de RPBLA a 37°C en un tampón que contenía un detergente y agentes reductores (tampón SB que contenía borato sódico 12,5 mM pH 8, SDS al 0,1% y ß-mercaptoetanol al 2%; tratamiento), se solubilizó la proteína RX3-EGF. Se recuperó la proteína de fusión extraída en su forma soluble. Después, pueden someterse las proteínas extraídas a purificación adicional o usarse como extractos parcialmente purificados, como una función de su aplicación.
Ejemplo 18: Construcción del plásmido para la transformación de célula animal. Se amplificó la secuencia de RX3 mediante PCR para obtener los fragmentos de ADNc correspondientes a RX3 y RX3- (Gly)x5. Se digirieron estos fragmentos mediante SalI/BamHI clonado en el plásmido pECFP-Nl (Clontech) abierto mediante las mismas enzimas para obtener los plásmidos pRX3-ECFP y pRX3-G-ECFP, respectivamente. Cebadores: SPfor (SEQ ID NO:54) RX3ECFP3 ' (SEQ ID NO:55) RX3G5ECFP3 ' (SEQ ID NO:56)
El vector p22aZ-ECFP corresponde al siguiente fragmento de ADN de HindIII/Xbal en el plásmido pEGFP-Nl (Clontech) (SEQ ID NO: 57)
Se obtuvo la GFP mediante amplificación por PCR del plásmido pEGFP-Nl (Clontech) con oligonucleótidos específicos que contenían sitios de restricción de enzimas para clonación adicional :
ECFP Ncol 5' (SEQ ID NO: 58) ECFPN1 BamNotSac 3' (SEQ ID NO: 59)
Se clonó el producto (GFP) de PCR en un vector de clonación de PCR (PCR®II Vector, Invitrogen) y se verificó la secuencia. Se escindió el fragmento de GFP mediante digestión con NcoI/BamHI y se clonó en pUC18RX3hGH (documento US2006123509 (Al)), dando el cásete ZERA-GFP en un vector pUC18. Se liberó este cásete mediante digestión con SalI/BamHI y posteriormente se clonó en un pCDNA3.1(-) (Invitrogen) digerido previamente mediante Xhol/BamHI (p3.1-RX3-GFP) Un constructo que contiene la secuencia codificante de una proteina DSRed monomérica mejorada (mCherry; Shaner et al., 2004 Wat. Biotechnol. 22:1567-1572) fue un molde en una reacción de PCR (mCherry Real 5' /ECFPNl BamNotSac 3') .
mCherry Real 5' (SEQ ID NO: 60)
Se clonó el producto de PCR (DsRed) en un vector de clonación de PCR (PCR®II Vector, Invitrogen)) y se verificó la secuencia. Se escindió el fragmento de DsRed mediante digestión con Rcal/BamHI y se clonó en pUC18RX3hGH (documento US2006123509 (Al)), dando el cásete ZERA-DsRed en un vector pUC18. Se liberó este cásete mediante digestión con SalI/BamHI y posteriormente se clonó en un pCDNA3.1(-) (Invitrogen) previamente digerido mediante Xhol/BamHI (p3.1-RX3-DsRED) .
Para obtener un ADNc de RX3 con un codón de terminación en el extremo 3' , se amplificó el fragmento RX3 mediante PCR (SPF0R/RX3ST0P) y se digirió mediante SalI/BamHI. Se clonó el fragmento en pcDNA3.1(-) mediante las mismas enzimas de restricción para obtener p3.1-RX3.
RX3STOP3 ' (SEQ ID NO: 61)
El ADNc que codifica para hGH se fusionó a la secuencia codificante de la gamma-zeina N-terminal de RX3 (patente WO2004003207) y se introdujo en el vector pcDNA3.1(-) (Invitrogen) tal como se describió en otra parte. En el constructo resultante denominado p3.lRX3hGH, las secuencias de la proteina de fusión estaban bajo el promotor CMV y el terminador pA BGH. Se amplificaron mediante PCR la inteina Ssp DNAb del plásmido pTWINl (New England Biolabs) y el ADNc de hGH. Se fusionaron ambos fragmentos de PCR en marco, también mediante PCR, se digirieron mediante NcoI/BamHI y se clonaron en vector pUC18RX3hGH (documento US2006121573 (Al)) también digerido mediante NcoI/BamHI. Se obtuvo el inserto de RX3-Int-hGH mediante digestión con SalI/BamHI de este vector intermedio y se clonó en pcDNA3.1(-) (Invitrogen) digerido mediante Xhol/BamHI. El constructo resultante se denominó p3. l-RX3-I-hGH . El producto de PCR se digirió mediante BsRGI/BamHI y se clonó en plásmido p3. l-RX3-I-hGH digerido con las mismas enzimas de restricción.
Cebadores : 5' DNAb (SEQ ID NO: 62) 3' DNAb (SEQ ID NO: 63) DNAb-hGH (SEQ ID NO: 64) 3 ' hGH (SEQ ID NO: 65)
Como control negativo de inducción de escisión, se produjo por ingeniería una Ssp DnaB no escindible. La inteína Ssp DnaB (Aspl54 ? Alal54) mutada fusionada en marco a la hGH se obtuvo mediante PCR a partir de p3. l-RX3-I-hGH .
Cebadores : IM-for (SEQ ID NO: 66) IM-rev (SEQ ID NO: 67)
Los ADNc de longitud completa de caspasa-2 (IRAUp969A0210D6) y caspasa-3 ( IRATp970B0521D6) humanas se adquirieron de RZPD GmbH (Berlín) , a partir de una referencia original situada en la Nacional Lawrence Livermore Library. Se añadieron, mediante PCR, el sitio de escisión específico (DEVD y DEHD, respectivamente) de la caspasa-3 y la caspasa-2 en el extremo 5' terminal de la secuencia de caspasa correspondiente. Es importante observar que el fragmento amplificado correspondiente a caspasa-2 no contenía el predominio. Casp3 directo (SEQ ID NO: 68) Casp3 inverso (SEQ ID NO: 69) Casp2 directo (SEQ ID NO: 70) Casp2 inverso (SEQ ID NO: 71)
Se clonaron las secuencias amplificadas en pUC18RX3hGH (documento US2006123509 (Al)) digiriendo con Ncol y Kpnl . Luego se digirió el constructo resultante mediante Sall/Kpnl y se clonó en un vector pCDNA3.1 (Invitrogen) digerido mediante Xhol/Kpnl. Los vectores correspondientes se denominaron (p3.1-RX3-C2 y p3.1-RX3-C3 ) . Se digirió el vector pUC18RX3hGH (documento US2006123509 (Al)) mediante HindIII/EcoRI , y el inserto liberado clonado en pCambia2300 también se digirió mediante estas enzimas. Se digirió el vector correspondiente mediante HindIII/NcoI y el inserto se clonó en pCambial381 abierto mediante HindIII/NcoI (p4-17) . Se obtuvo el ADN que comprende el fragmento de RX3-(gly)x5-GUS digiriendo p4-17 mediante BstEII, luego se rellena con klenow y finalmente se digiere con Salí. Se clonó este fragmento en pcDNA3.1(-) digerido mediante Xhol/EcoRV para obtener el clon p3.1-RX3-GUS . El p3.1-RX3-EK corresponde al siguiente fragmento de ADN de Nhel/HendIII en pcDNA3.1(-) (Invitrogen) (SEQ ID NO: 72)
Ejemplo 19: Construcción de plásmidos para infección de insectos Se digirió el fragmento ZERA-DsRED del p3. l-RX3-DsRED mediante Xbal/HindIII y se clonó en pFastBacl (Invitrogen) digerido también mediante estas dos enzimas con el fin de obtener el vector pF-RX3-DsRED . Se amplificó el ADNc de DsRED mediante PCR a partir de pF-RX3-DsRED usando los siguientes cebadores: bGH rev (SEQ ID NO: 73) bGH rev2 (SEQ ID NO: 74)
Para obtener el vector pF-DsRED, se digirió el fragmento de ADN amplificado por PCR con Xbal/HindIII y se clonó en pFastBacl (Invitrogen) también digerido mediante
Xbal/HindIII .
Ejemplo 20: Infección de larvas y células de insectos Baculovirus y Larvas Se usó el sistema vector de expresión de baculovirus (pFastBac Invitrogen) como el vector de base para este trabajo. Se produjo y se amplificó el virus recombinante tal como se describió por el fabricante. Se obtuvieron los huevos de lagarta del girasol {Trichoplusia ni), de Entopath, Ene. (Easton, PA) . Se incubaron los huevos según las indicaciones proporcionadas por el fabricante; y se usaron larvas en el cuarto estadio para su infección. Infección de larvas Se extendieron diversas cantidades de disolución madre de baculovirus, que consistían en virus recombinante ocluido, en la dieta de las larvas, que se ordenó prefabricar en vasos de Styrofoam de Entopath, Inc. (Easton, PA) . Se cubrieron los vasos y se dejaron en reposo durante una hora de modo que el virus se absorbió completamente por el medio. Entonces se colocaron las larvas en el cuarto estadio en los vasos (aproximadamente de 10 a 15 larvas por vaso) , y se invirtieron los vasos. Se alimentaron las larvas desde la parte superior (parte inferior del vaso) de modo que la materia fecal se depositaba sobre la tapa, de la que se descargaba diariamente. La cantidad de alimento fue suficiente para al menos 5 días de crecimiento. Se recogieron diariamente de tres a cinco larvas para análisis de RX3-DsRED y DsRED. Infección de SF9 Spodoptera Se obtuvieron las células Sf9 de Invitrogen (San Diego, CA, EE.UU.) y se cultivaron tal como se describió previamente
(O'Reilly et al., 1992) usando medio de insectos Grace complementado con hidrolizado de lactalbúmina, hidrolizado de levaduras (yeastolate) , L-glutamina, suero bovino fetal inactivado por calor al 10% y disolución de penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco) . Las células se hicieron crecer o bien en matraces agitados (Bélico Glass, Veneland, NJ, EE.UU.) o en platos de cultivo tisular de plástico de 100 mm (Falcon) . Se produjeron los virus recombinantes usando el kit de transfección BaculoGold
(PharMengen, San Diego, CA, EE.UU.). Se aislaron y amplificaron placas individuales de dos a cuatro veces para obtener una disolución madre viral de alto titulo que se almacenó a 4°C hasta su uso. Para la infección de rutina, se dejó que las células Sf9 se unieran al fondo de un plato de cultivo de plástico de 100 mm (107 células/plato) . Tras la incubación durante de 15 minutos a 1 h, se añadió disolución madre viral y se mantuvieron los cultivos a 27°C en una atmósfera de aire humidificado . Se usaron comúnmente las células a las 30-36 horas tras la infección.
Ejemplo 21: preparación de los RPBLA a partir de células de mamífero y larvas de insecto Homogenización Células de mamífero Se recuperaron las células transíectadas a partir de los platos de cultivo raspando y se suspendieron en el medio B de homogenización (Tris-HCl 10 m pH 8,0, NaCl al 0,9%, EDTA 5 mM con inhibidores de proteasa) . Se tomó la suspensión celular en una jeringuilla de 5 mi equipada con una aguja de calibre 23 y se cogió y expulsó aproximadamente 30 veces. Se monitorizó la ruptura celular mediante un microscopio de contraste de fases. Larvas de insectos Se homogeneizaron larvas de Trichoplusia ni congeladas que expresaban proteínas RX3-DsRED y DsRED en tampón PBP5 (Hepes 20 mM pH 7,5, EDTA 5 mM) mediante un homogeneizador Polytron durante 2 minutos a 13500 rpm y mediante un homogeneizador Potter durante 5 minutos en hielo a 2000 rpm. Se centrifugó este homogeneizado a 200 g durante 10 minutos para eliminar residuos de tejidos y cutícula y se cargó el sobrenadante sobre un gradiente de densidad escalonado.
Aislamiento de RPBLAs por densidad Se aislaron RPBLA de células de mamíferos y larvas de insectos congeladas esencialmente tal como se describió para las plantas (gradiente de densidad escalonado o una centrifugación a baja velocidad) .
Ejemplo 22: Solubilización mediante Tritón X-114 basada en separación bifásica Se diluyó los homogeneizados celulares con PBS y se centrifugó a 16.000xg durante 15 minutos. Se retiró el sobrenadante y se secó el sedimento. Se añadieron al pellet 2 mi de tampón de solubilización enfriado en hielo (Tris 50 mM pH 7, Tritón X-114 al 5%, TCEP 20 mM, NDSB195 20 mM y MgCl2 100 mM) y posteriormente 1 mi de PBS que contenía urea 1 M, glicerol al 10% y MgCl2 100 mM. Se incubó esta composición sobre hielo durante 15 minutos con agitación con vórtex ocasional. Entonces se sónico la suspensión 4 veces durante 20 segundos al 50% del potencial, manteniéndola en hielo entre arranques durante 1 minuto para mantener la temperatura fría. Entonces se incubó la suspensión a 37°C durante 15 minutos para formar las 2 fases. Se añadieron tres mililitros de PEG al 10% a la capa hidrófoba inferior (rica en Tritón X-114) y se incubó la composición en hielo durante 20 minutos. Entonces, se incubó la disolución a 37°C durante 15 minutos para formar de nuevo las 2 fases. Se recuperó la fase superior (4 mi) y se almacenó para su análisis.
Ejemplo 23: Inmunolocalización Inmunocitoquimica usando un microscopio fluorescente (Vertical Eclipse icroscope Nikon E600A) . Entre 2 y 4 días tras la transíección, se fijaron las células durante 30 minutos en disolución de paraformaldehido al 1% y tras el lavado con tampón salino de fosfato, se incubaron durante 45 minutos con el anticuerpo frente a: (i) hGH (dilución 1/150), (ii) EK (dilución 1/500), (iii) RX3 (dilución 1/700) . Con el fin de detectar la reacción antigeno-anticuerpo, se realizó una incubación durante 45 minutos con anticuerpo anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 488 ( Invitrogen) Se realizaron análisis confocales con un microscopio de de barrido por láser confocal (Leica TCS SP, Heidelberg, Alemania) acoplado con espect ofotómetros para seleccionar la longitud de onda de la banda de emisión. Se recogieron imágenes fluorescentes verdes a 488 nm de excitación con el láser de ión de argón usando una ventana de emisión ajustada a 495-535 nm. Se recogieron imágenes fluorescentes rojas tras una excitación a 543 nm con un láser de HeNe y una ventana de emisión de 550-600. Las secciones ópticas fueron de 0,5 a 1 Dm de espesor.
Ejemplo 24: Pruebas de actividad Prueba de actividad de EGF Se siembran células MDA-MB231 (células de cáncer de mama que sobreexpresan el receptor del EGF) en placas de 96 pocilios a 5.500 células/pocilio. Se permitió que se adhiriesen las células durante 8 horas en medio de crecimiento con FCS (suero de ternero fetal) al 10% y entonces se dejaron en ayunas durante la noche en medio suplementado con un 0,1% de FCS. Posteriormente, se retiró el medio y se añade el EGF (control positivo) de Promega o la muestra correspondiente (RX3-EGF solubilizado) a diferentes concentraciones. Entonces se añade la timidina radioactiva hasta una concentración final de de 0,5 DCi . Se estudia la proliferación a la 48 horas tras la estimulación a 37°C. Entonces, se lavan las células dos veces con PBS frío, y se mantienen las células en hielo para detener el metabolismo celular. Se añade una disolución de ácido t ricloroacético (TCA) al 10%, y se incuban las células durante 20 minutos a 4°C. Una vez retirada la disolución de TCA, se lavan las placas dos veces con etanol al 70%, y se incuban las células durante 20 minutos a 37°C en 0,5 mi de disolución de lisis (C03Na2 al 2%, NaOH 0,1 N y SDS al 10%) . Las placas se mezclan mediante agitación con vórtex y no se mide la muestra antes de 12 horas para evitar fenómenos quimioluminiscentes indeseados .
Prueba de la actividad EK Se midió la actividad enzimática mediante ensayo fluorométrico (Grant et al. (1979) Biochim. Biophys . Acta 567:207-215) . Se inició la reacción añadiendo la enzima a de 0,3 a 1,0 mM del sustrato fluorogénico Gly- (Asp) 4-Lys-Cfnaftilamida (Sigma) en Tris-HCl 25 mM (pH 8,4), CaCl2 10 mM, DMSO al 10% (dimetilsulfóxido) a 37°C. Se determinó la concentración de D-naft ilamina libre a partir del aumento de fluorescencia (Dex = 337 nm y Dem = 420 nm) monitorizada continuamente durante 1 min. Se calculó la actividad como el cambio en la fluorescencia a lo largo del tiempo.
Prueba de la actividad GUS La prueba de la actividad GUS se basa en la catálisis de ácido metilumbeliferil- -glucurónido (MUG) para dar el producto fluorescente 4 -met ilumbeliferona (4-MU), mediante la enzima GUS (Jefferson RA, et al. (1987) EMBO J. 6(13) : 3901-3907) . Se añadieron 50 DI de RX3-GUS solubilizado (o RX3 solubilizado como control) a 200 DI de tampón de reacción (50 mM de tampón fosfato pH 7, EDTA 10 mM, SDS al 0,1% y Tritón X100 al 0,1%) más 66 DI de metanol. Se añadió el sustrato (MUG) hasta una concentración final de 10 mM. Se preparó el patrón añadiendo 0, 50, 100, 200, 300 ó 500 pmoles de 4-MU (el producto de la reacción) a 200 DI de tampón de reacción de la reacción (4-MU) . Se mezclaron las muestras y el patrón y se midieron en un fluorimetro (Víctor, Perken-Elmer ) a Dex = 355 nm y Dem = 460 nm. Se midieron las muestras cada 30 minutos durante 3 horas. Se calculó la actividad específica mediante la fórmula: actividad de GUS (pmoles de 4-MU/min-l*mg-l ) = (?em(Tl) - (Dem(TO) ) / (k * (T1-T0) ) . "K" = razón (unidades de fluorescencia) / (pmoles de 4-MU) .
Prueba de la actividad RTB (ELISA de unión a asialofetuína) Se determinó la funcionalidad de RX3-RTB en los extractos de proteínas de RPBLA mediante la unión a asialofetuína, glucoproteína fetuína tratada con sialidasa para exponer los glucanos terminados en galactosa. Se unieron doscientos microlitros de asialofetuína (Sigma) a una concentración de 300 mg/ml en tampón PBS modificado (mPBS) (fosfato de Na 100 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0) a los pocilios de una placa de microtitulación Immulon Q4HBX (Fisher, Pittsburg, Pa . ) durante 1 hora a TA. Se descartó la disolución de recubrimiento y se bloquearon los pocilios con 200 mi de BSA al 3%, Tween 20 al 0,1% en mPBS durante 1 hora a TA. Tras descartar la disolución de bloqueo, se aplicaron 100 mi de patrones de RTB y extractos de proteínas (véase a continuación) y se incubaron durante 1 h a TA. Entonces se lavaron los pocilios tres veces con 200 mi de mPBS, Tween 20 al 0,1%. Se aplicó Ac de conejo policlonal anti-lectina de R. communis (RCA60) (Sigma) a 1:4000 en tampón de bloqueo (tal como anteriormente) y se incubó durante 1 hora a TA. Entonces se lavaron los pocilios tal como anteriormente. Se aplicó IgG de cabra anti-conejo conjugada con AP (Bio-Rad) a una dilución de 1:3000 en tampón de bloqueó y se incubaron durante 1 h a TA. Se lavaron los pocilios tres veces tal como se describió anteriormente y se aplicaron 100 mi de sustrato pNPP (sal de disodio de pnitrofenilfosfato) (Pierce, Rockford, 111.) . Se detuvo la reacción tras 15 minutos mediante adición de 50 DI de NaOH 2 N. Se leyó la absorbancia (A405) en un lector de microplacas Bio-Tek EL808 Ultra. Se prepararon extractos de proteínas con una razón de 1 g de hoja PF (peso fresco) con respecto a 3 mi de tampón Tris-ascorbato (anteriormente) , y se compararon las muestras frente a una curva patrón de RTB derivada de ricino diluida en serie (Vector Labs, Burlengame, Calif.) en tampón Tris-ascorbato, oscilando las concentraciones desde 5 ng hasta 500 ng por pocilio.
Ejemplo 25: Captación potenciada de RX3-DsRED ensamblado en RPBLA de larvas de insectos mediante macrofagos Se clonó el ADNc que codifica para RX3-DsRED y DsRED en el vector de baculovirus FastBac (Invitrogen) para obtener pFB-RX3-DsRED y pFB-DsRED. Se usaron estos constructos para infectar larvas de Trichoplusia ni. Se homogeneizaron las larvas congeladas que expresaban proteínas RX3-DsRED y DsRED y se cargaron sobre un gradiente de densidad escalonado. Tras la centrifugación a 80000xg en un cabezal oscilante durante 2 horas, el análisis de la proteina de fusión RX3-DsRED y el control correspondiente a DsRED expresados en el citosol se realizó mediante inmunotransferencia (figura 2C) . Tal como se esperaba, cuando se expresó en el citosol de células de larvas, la proteina DsRED no se ensambló para dar estructuras sumamente densas y se localizó en el sobrenadante y la fracción F35 (figura 2C, carriles 2 y 3) . Por otra parte, la proteina de fusión RX3-DsRED pudo ensamblarse y acumularse en estructuras densas que pueden aislarse de F56 (figura 2C, carril 5) . Tal como se muestra mediante análisis de microscopía confocal en el ejemplo 4 (figura 4), la RX3-DsRED se acumuló en RPBLA de forma redondeada. Se diluyeron los RPBLA de RX3-DsRED de F56 3 veces en PBP5 (HEPES 10 mM pH 7,4, EDTA 2 mM) y se recogieron en el sedimento mediante centrifugación a 80000xg a 4°C en un cabezal oscilante durante 2 horas. Volvió a suspenderse el sedimento en tampón PBS y se cuantificó el número de RPBLA mediante FACS. A partir de 1 larva infectada con el vector pFB-RX3-DsRED, se obtuvieron aproximadamente lxlO9 partículas de RPBLA a una concentración de 500.000 RPBLA por microlitro (?1) - Se ha notificado que la presentación de antigeno por las células presentadoras de antigeno (CPA) tales como macrofagos y células dendriticas es un proceso clave necesario para inducir la respuesta inmunitaria (Greenberg et al, Current Op. Immunology (2002), 14:136-145). En este proceso, la CPA fagocita al antigeno, que se escindirá seguidamente en pequeños péptidos en el fagolisosoma . Estos péptidos interaccionan con el MHCII y se ordenan en la membrana plasmática para presentarse a las respuestas inmunitarias mediadas por células y por anticuerpos (Villandagos et al., Immunological Reviews (2005) 207:101-205). Para determinar la antigenicidad de proteínas de fusión de RX3 presentes dentro de los RPBLA, se incubó un cultivo celular de macrofagos con estos orgánulos a diferentes razones de RPBLA/célula (100:1 y 1000:1). Se hicieron crecer los cultivos celulares de macrofagos en condiciones de ayunas o en presencia de (M-CSF) . Se incubaron estos cultivos celulares con RPBLA durante 1 hora, y 1, 2, 5 y 10 horas tras la retirada de RPBLA, se lavaron extensamente los macrofagos con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 2%. Posteriormente, se analizaron estos macrofagos fijados mediante FACS para cuantificar la cantidad de RPBLA fluorescentes captados por los macrofagos así como el porcentaje de macrofagos que había fagocitado los RPBLA de
RX3-DsRED fluorescentes. Porcentaje de macrofagos fluorescentes
A partir de estos resultados, resulta claro que los macrofagos fagocitaron los RPBLA de RX3-DsRED con una avidez inesperada. Incluso a las razones inferiores de RPBLA/células (1:100) y en presencia de M-CSF, 1 hora tras la adición de RPBLA, el 65% de los macrofagos eran fluorescentes. Incluso la presencia de una citocina mitogénica, tal como M-CSF, que tenía un efecto negativo sobre la fagocitosis de macrofagos, no podía perjudicar significativamente la captación de RPBLA. A las 5 horas, casi todos (más del 80%) los macrofagos eran fluorescentes, lo que significa que la mayoría de las células habían captado algunos RPBLA del medio. Cuando se analizó la cantidad de fluorescencia asociada con los macrofagos a lo largo del tiempo de incubación, el resultado fue incluso más sorprendente. En cualquiera de las condiciones analizadas (razón RPBLA/células o presencia o ausencia de M-CSF) no se observó ningún efecto de saturación sobre la capacidad de los macrofagos para captar los RPBLA. Si se comparan los resultados de las tablas anterior y siguiente a las 5 y 10 horas de incubación, se observa que casi todos los macrofagos son fluorescentes, pero hay un aumento continuo de la fluorescencia total asociada a los macrofagos. Este resultado indica que los macrofagos fagocitan una gran cantidad de las partículas de RPBLA fluorescentes . Fluorescencia de macrofagos dependiente del tiempo En ayunas M-CSF M-CSF Tiempo (razón RPBLA / (razón RPBLA / (razón RPBLA / (horas ) célula 100:1) célula 100:1) célula 1000:1) media DE media DE Media DE 0 0, 975 0,31 0, 725 0,1 0, 725 0,1 1 8,9 0,42 10, 3 1, 13 24 1,7 2 16, 35 0, 07 16, 25 0,5 41,5 0,3 5 64, 65 2, 05 42, 35 4,45 93, 3 2,2 10 120, 7 1,84 79, 9 5, 66 125, 65 13, 08
Para demostrar que los RPBLA que contienen la proteina de fusión RX3-DsRED estaban dentro de los macrofagos y no simplemente adsorbidos en la membrana plasmática, se realizaron análisis de microscopía confocal. La figura 7A (panel izquierdo) muestra algunas de esas células de macrofagos incubadas con partículas de RX3-DsRED (a 100:1) durante 1 hora. En el panel izquierdo de la misma figura, una sección de 1 micrómetro de las mismas células muestra la autofluorescencia verde típica de macrofagos observada con un filtro verde (figura 7A, punta de flecha blanca) . La presencia del núcleo y las partículas de RPBLA con fluorescencia roja (figura 7A, punta de flecha negra) en la misma sección óptica indicó que los RPBLA se habían captado dentro de las células mediante fagocitosis. Otro factor importante que debe analizarse es la degradación del inmunógeno una vez fagocitado por el macrófago. Se necesita la degradación del antígeno para producir los péptidos antigénicos que se presentan en el receptor del HCII. El análisis del patrón fluorescente de DsRED de los macrofagos a lo largo del tiempo mostró que las partículas de RPBLA se digerían activamente. Otro conjunto de micrografías muestra que tras 1 hora de incubación, las partículas de RPBLA no se degradaban completamente y todavía podían observarse dentro de las células (figura 7B, paneles superiores). Tras 10 horas, el patrón de fluorescencia roja era más homogéneo a lo largo de todas las células, indicando que los macrofagos habían comenzado a degradar las partículas de RPBLA (figura 7B, paneles inferiores).
Ejemplo 26: Captación potenciada de RX3-DsRED en RPBLA de larvas de insectos mediante células dendríticas Las células dendríticas desempeñan un papel central de presentación de antígeno para inducir al sistema inmunitario (Blander et al., Nature Immunology (2006) 10:1029-1035). Aunque son poco frecuentes, las células dendríticas son las CPA más sumamente especializadas, con capacidad tanto para instigar como para regular la reactividad inmunitaria (Lau AH et al Gut 2003 52:307-314). Para evaluar la capacidad de esas células para fagocitar proteínas de fusión RX3-DsRED ensambladas en RPBLA de larvas de insectos, se incubó un cultivo de células dendríticas con estos orgánulos a una razón de 100 RPBLA/célula . Se prepararon dos clases de RPBLA: (i) RPBLA aislados tal como se describió anteriormente y (ii) los mismos RPBLA mediante lavado completo en Tris 50 mM pH 8, Tritón X-100 al 1%, con el fin de eliminar la membrana del RE. Se hicieron crecer los cultivos de células dendriticas en condiciones de ayunas en presencia de RPBLA, y se analizaron las muestras a las 0, 1, 2, 5 y 10 horas. Porcentaje de células dendriticas fluorescentes % de células dendriticas Tiempo fluorescentes (horas ) RPBLA RPBLA sin membrana Media DE Media DE 0 1,43 1,41 1 26,76 36,46 0,28 2 33,79 0,6 50,785 0,21 5 45,845 0,07 67,275 3,4 10 61,885 . 5,73 74,97 4,17
Fluorescencia de células dendriticas dependiente del tiempo
Fluorescencia asociada a las
células dendriticas Tiempo RPBLA RPBLA sin (horas ) membrana
Media DE Media DE
0 0,5 1,1 1 3,1 5,1 0, 28
2 3, 55 0, 6 5, 05 0,21
25, 15 0, 07 54 3,4
37, 05 5,73 74, 05 4,17
Tal como puede concluirse a partir de las tablas
anteriores, las células dendriticas muestran una avidez
sorprendente por RPBLA. Tal como se esperaba, tienen una
velocidad de fagocitosis más lenta comparado con los
macrófagos (comparando las tablas anteriores) , tal como se
describe en otras partes. El porcentaje de células
dendriticas fluorescentes aumenta durante todo el transcurso
de tiempo analizado, y no se observó ningún efecto de
saturación incluso a las 10 horas tras la incubación de
RPBLA. Pueden extraerse conclusiones similares cuando se analizan la cantidad de fluorescencia asociada con los macrófagos a lo largo del tiempo. La capacidad de las células dendriticas para captar los RPBLA no mostró un efecto de saturación. Esta falta de efecto puede explicarse por el hecho de que cada vez se inducen más células dendriticas a la fagocitosis (y se vuelven fluorescentes) con el tiempo. No obstante, también es posible que la capacidad de fagocitosis de esas células no se sature, tal como se ha observado con los macrófagos. - De manera inesperada, el análisis de FACS de células dendriticas incubadas con RPBLAs sin membranas mostró un porcentaje significativamente superior de células dendriticas fluorescentes que las mismas células incubadas con RPBLAs con membranas. Más aun, la fluorescencia de estas células dendriticas también era superior. Se obtuvieron resultados similares usando macrófacos con RPBLAs sin membrana. Esto resulta en cierto modo sorprendente ya que . se esperaba que la presencia de proteínas de membrana derivadas de insecto en RPBLAs con membrana se reconocería como proteínas extrañas por las células dendriticas murinas, y así se aumentaría la fagocitosis. Es por tanto, aparente que los RPBLAs derivados de insecto en presencia o ausencia de la membrana que lo rodea son vehículos de presentación de antígeno muy eficaz.
Para demostrar que los RPBLAs y RPBLA sin membrana que contienen la proteina de fusión RX3-DsRED se captaban por las células dendriticas, se realizó un análisis de microscopía óptica. La figura 8A (parte superior) muestra células dendriticas incubadas durante 2, 5 y 10 horas con RPBLA de RX3-DsRED (razón de 100:1) . En la parte inferior de la figura 8B, la fluorescencia roja de la proteína DsRED ilustra la captación de los RPBLA por esas células. A las 2 horas de incubación, puede observarse algo de fagocitosis, pero la mayoría de los RPBLA sólo se adsorben en la membrana plasmática. A las 5 horas, e incluso más a las 10 horas, se observaron muchos RPBLA fluorescentes rojos fagocitados . Se obtuvieron resultados similares cuando se incubaron células dendriticas con RPBLA sin membrana (figura 8B) . Es importante observar que incluso a las 10 horas de incubación con RPBLA o RPBLA sin membrana, la mayoría de las partículas fagocitadas permanecen visibles como partículas, lo que significa que había tenido lugar poca proteolisis. Esta observación concuerda con la observación anterior que muestra que la cinética de adquisición de proteasa, y por tanto de proteolisis, es más lenta en células dendriticas que en macrófagos (Lennon-Dum' enil et al. (2002) J. Exp. Med. 196:529-540). Estas condiciones pueden limitar la proteolisis de proteínas en células dendriticas y favorecer la generación de antígenos de péptidos de longitud apropiada para cargarlos en moléculas de MHC de clase II.
Ejemplo 27: Fagocitosis de macrofagos y células dendriticas Macrofagos Se obtuvieron macrofagos a partir de médula de ratones Balb/C. Se sacrificaron los ratones mediante una dislocación cervical y se extirparon el fémur y la tibia. Se cortaron los huesos y se extrajo la médula con medio DMEM usando una jeringuilla. Se cultivó la médula en una placa de Petri de 150 mm con medio DMEM completo (complementado con FCS al 20% y célula L al 30%) . Se obtuvo un cultivo de macrofagos al 99% de pureza tras 7 días de incubación a 37°C. Se cultivaron los macrofagos diferenciados en medio completo para producir 350.000 células por pocilio. Cuando se adhirieron las células, se retiró el medio y se incubaron las células con un nuevo medio que contenía RPBLA de RX3-DsRED de larvas. El experimento se realizó con 100 o 1000 partículas: 1 célula. Se contó el número de partículas (RPBLA) mediante Coulter Epics XL FACS usando el láser de argón a 488 nm para la excitación y FL2 a 575 nm +/-30 para la emisión. Se usaron contadores de flujo de Beckman Coulter, referencia 7547053 (lote 754896F) para comprobar el fluido. Tras diferentes tiempos (0, 1, 2, 5 y 10 horas) se retiró el medio y se realizaron dos lavados con PBS. Se dejaron las células recuperar y después se fijaron mediante PBS con el 2% de paraformaldehido . Se almacenaron los macrófagos tratados a 4°C y se analizó la fluorescencia mediante FACS (con el mismo programa usado para el recuento) .
Para verificar que las partículas de RX3-DsRED estaban fagüeitándose dentro de las células, se realizó un experimento de inmunocitoquímica . Se incubaron los macrófagos diferenciados (50.000 células/pocilio) con 100:1 partículas de RX3-DsRED durante 1 hora. Tras la incubación, se lavaron las células dos veces con PBS y se fijaron mediante PBS con el 2% de formaldehido durante 15 minutos. Se analizaron las células tratadas mediante microscopía confocal.
Células dendríticas Se cultivó la médula de ratones Balb/C con medio completo (DMEM, FCS al 10%, GM-CSF 5 ng/ml) durante un día. Con el fin de eliminar los granulocitos , se agitaron las placas y se cambió el medio dos veces. Se cambió entonces el medio dos veces sin agitación y se incubó durante 2 días para obtener células dendriticas inmaduras. Se incubaron células dendriticas con 100:1 partículas de Zera-DsRED durante 1, 5 y 10 horas. Tras los tratamientos, se fijaron las células con un 2% de paraformaldehído, se almacenaron a 4°C y se analizó la fluorescencia mediante FACS. Cada una de las solicitudes de patente, patentes y artículos citados en el presente documento se incorpora como referencia. Se pretende que el uso del artículo "un" o "una" incluya uno o más. Se pretende que la descripción anterior y los ejemplos sean ilustrativos y no deben tomarse como limitativos. Todavía otras variaciones dentro del espíritu y alcance de la invención son posibles y se les ocurrirán fácilmente a los expertos en la técnica.
Claims (35)
- REIVINDICACIONES 1. Célula huésped eucariota que contiene una proteína de fusión recombinante dentro de ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) , conteniendo dicha proteína de fusión dos secuencias unidas entre sí en las que una secuencia es una secuencia de inducción de cuerpo proteico (PBIS) y la otra es un polipéptido biológicamente activo, encontrándose dicho polipéptido biológicamente activo de manera natural en un segundo tipo celular que es diferente de dicha célula huésped eucariota, no produciendo dicha célula huésped eucariota cuerpos proteicos en ausencia de dicha proteína de fusión.
- 2. Célula huésped según la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión incluye además una secuencia ligadora entre la secuencia de inducción de cuerpo proteico y la secuencia del polipéptido biológicamente activo.
- 3. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de inducción de cuerpo proteico comprende una secuencia de prolamina .
- 4. Célula huésped según la reivindicación 3, en la que la secuencia de prolamina es gamma-zeina, alfa-zeina, gamma-gliadina o prolamina del arroz.
- 5. Célula huésped según la reivindicación 4, en la que la secuencia de prolamina es la secuencia RX3 de gamma-zeina.
- 6. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de inducción de cuerpo proteico incluye además una secuencia que dirige una proteina hacia el retículo endoplasmát ico (RE) de una célula vegetal.
- 7. Célula huésped según la reivindicación 6, en la que la secuencia de inducción de cuerpo proteico que dirige una proteína hacia el RE de una célula huésped vegetal es un péptido señal de la misma planta que el resto de la PBIS o de una planta diferente.
- 8. Célula huésped según la reivindicación 7, en la que dicho péptido señal se selecciona del grupo que consiste en el la secuencia de péptido señal de gamma-zeina de 19 residuos, la secuencia de péptido señal de alfa-gliadina de 19 residuos, la secuencia de péptido señal de gamma-gliadina de 21 residuos y la proteína relacionada con la patogénesis de secuencia de péptido señal de 25 residuos de clase PR10.
- 9. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido biológicamente activo de dicha proteina de fusión muestra al menos el 25% de la actividad biológica del mismo polipéptido aislado de dicho segundo tipo celular.
- 10. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido biológicamente activo de dicha proteina de fusión contiene al menos dos secuencias de glucosilación unidas por N.
- 11. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de inducción de cuerpo proteico y el polipéptido biológicamente activo de dicha proteina de fusión están unidos entre si por una secuencia de aminoácidos espadadora que puede escindirse por medios enzimáticos o químicos o que no puede escindirse.
- 12. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas células huésped son células de algas.
- 13. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas células huésped son células animales.
- 14. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas células huésped son células de plantas superiores.
- 15. Célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas células huésped son células fúngicas.
- 16. Ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) que comprenden una proteina de fusión rodeada por una membrana, conteniendo dicha proteina de fusión dos secuencias unidas entre si en las que una secuencia es una secuencia de inducción de cuerpo proteico (PBIS) y la otra es un polipéptido biológicamente activo.
- 17. RPBLAs según la reivindicación 16, que tienen una densidad de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,35 g/ml.
- 18. RPBLAs según las reivindicaciones 16 ó 17, en los que dicha PBIS incluye una secuencia de prolamina.
- 19. RPBLAs según la reivindicación 18, en los que dicha secuencia de prolamina se selecciona del grupo que consiste en gamma-zeina, alfa-zeina, prolamina del arroz y gamma-gliadina.
- 20. RPBLAs según la reivindicación 19, en los que la secuencia de prolamina es la secuencia RX3 de gamma-zeina.
- 21. RPBLAs según las reivindicaciones 16 a 20, en los que dicha PBIS también incluye una secuencia que dirige una proteina hacia el retículo endoplasmático (RE) de una célula vegetal .
- 22. RPBLAs según la reivindicación 21, en los que dicha secuencia que dirige una proteína hacia el RE de una célula vegetal es un péptido señal de la misma planta que el resto de la PBIS o de una planta diferente.
- 23. RPBLAs según la reivindicación 22, en los que dicho péptido señal se selecciona del grupo que consiste en la secuencia de péptido señal de gamma-zeína de 19 residuos, la secuencia de péptido señal de alfa-gliadina de 19 residuos, la secuencia de péptido señal de gamma-gliadina de 21 residuos y la proteína relacionada con patogénesis de secuencia de péptido señal de 25 residuos de clase PR10.
- 24. Método de preparación de un polipéptido biológicamente activo que comprende las etapas de: a) proporcionar ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) que comprenden una proteína de fusión rodeada por membrana, conteniendo dicha proteína de fusión dos secuencias unidas entre sí en las que una secuencia es una secuencia de inducción de cuerpo proteico (PBIS) y la otra es un polipéptido biológicamente activo; b) poner en contacto los RPBLA con un tampón acuoso que contiene una cantidad de un tensioactivo desensambladora de membrana; c) mantener dicho contacto durante un periodo de tiempo suficiente para desensamblar la membrana y a una temperatura que no desnaturaliza el polipéptido biológicamente activo para separar la membrana de la proteina de fusión; d) recoger la proteina de fusión separada que contiene el polipéptido biológicamente activo.
- 25. Método según la reivindicación 24, en el que la proteina de fusión separada muestra la actividad biológica de dicho polipéptido biológicamente activo.
- 26. Método según la reivindicación 24 ó 25, en el que dicho polipéptido biológicamente activo está unido a dicha PBIS mediante una secuencia de aminoácidos espadadora que puede escindirse por medios enzimáticos o químicos.
- 27. Método según la reivindicación 26, en el que dicho polipéptido biológicamente activo muestra actividad biológica cuando se escinde de la PBIS de la proteína de fusión.
- 28. Método según la reivindicación 24 a 27, en el que dichos RPBLA están presentes con una forma generalmente esférica que presenta un diámetro de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 mieras.
- 29. Vacuna o inoculo que comprende una cantidad inmunogénica eficaz de ensamblajes similares a cuerpos proteicos recombinantes (RPBLA) que contiene una proteina de fusión recombinante disuelta o dispersada en un diluyente farmacéuticamente aceptable, conteniendo dicha proteina de fusión recombinante dos secuencias unidas entre si en las que una secuencia es una secuencia de inducción de cuerpo proteico (PBIS) y la otra es un polipéptido inmunogénico biológicamente activo frente al que se induce una respuesta inmunológica por dicha vacuna o inoculo.
- 30. Vacuna o inoculo según la reivindicación 29, en la que dicha proteina de fusión incluye además una secuencia ligadora entre la secuencia de inducción de cuerpo proteico y la secuencia del polipéptido inmunogénico biológicamente activo.
- 31. Vacuna o inoculo según las reivindicaciones 29 ó 30, en la que la PBIS comprende una secuencia de prolamina.
- 32. Vacuna o inoculo según la reivindicación 31, en la que la secuencia de prolamina es gamma-zeina, alfa-zeina, gamma-gliadina o prolamina del arroz.
- 33. Vacuna o inoculo según la reivindicación 31, en la que la secuencia de prolamina es la secuencia RX3 de gamma-zeina .
- 34. Vacuna o inoculo según la reivindicación 29 a 33, en la que dichos RPBLA mejoran la administración de antigeno a células presentadoras de antigenos.
- 35. Vacuna o inoculo según la reivindicación 29 a 34, en la que dichos RPBLA mejoran el procesamiento de antigenos y la presentación a células presentadoras de antigenos.
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