MX2007009566A - Inhibicion de la difusion de la her2 con antagonistas de la metaloproteasa de matriz. - Google Patents

Inhibicion de la difusion de la her2 con antagonistas de la metaloproteasa de matriz.

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Abstract

La presente solicitud describe el uso de antagonistas de las metaloproteasas de matriz (MMPs), especialmente la MMP-15, para inhibir la difusión de la HER2.

Description

INHIBICIÓN DE LA DIFUSIÓN DE LA HER2 CON ANTAGONISTAS DE LA METALOPROTEASA DE MATRIZ Ésta es una solicitud no provisional, que reclama la prioridad, según 35 USC §119, a la solicitud provisional No. 60(651,348, presentada el 9 de Febrero del 2006, cuya descripción total s incorpora aquí como referencia.
Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de antagonistas de las metaloproteasas de matriz (MMPs) especialmente de la MMP-15, para inhibir la difusión de HER2.
Antecedentes de la Invención La familia de HER de las cinasas de tirosina del receptor son mediadores importantes del crecimiento, diferenciación y supervivencia celular.. La familia del receptor incluye cuatro miembros distintos, que incluyen el receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR, Erbl o HERI) HER2 (ErbB2 o pl85neu) , HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2) .
El EGFR codificado por el gene erbBl, ha sido causalmente implicado en la malignidad humana, En particular, la expresión aumentada del EGFR se ha observado en el cáncer del pecho, vejiga, pulmón, cabeza, cuello y estómago, al igual que glioblastomas . La expresión de receptor del EGFR aumentada está a menudo asociada con la producción aumentada de la ligadura del EGFR, que transforma el factor de crecimiento alfa (TGF-oc) por las mismasa células de tunor que resultan en la activación del receptor por una trayectoria estimuladora autócrina . Baselga y a y EGF, se han evaluado como agentes terapéuticos en el tratamiento de tales malignidades. Véanse, por ejemplo, Baselga y Mendelsohn, anteriores: Massui et al. Ancer Research 44: 1002-1007 (1084) y Wu et al., J. Clin. Invest 95 : 1897 -1905 (1995). El segundo miembro de la familia HER, pl85neu, se identificó originalmente como el producto del gene de transformación de los neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. La forma activada del foto-oncógeno neu resulta de una mutación de punto (valina al ácido glutámico) en la región de la transmembrana de la proteína codificada. La amplificación de la homología humana de neu se observó en cánceres del pecho y el ovario y se correlaciona con una pobre prognosis (Salmón et al., Science, 235: 177-182 (1987). Salmón et al ., Science 244 707-712 (1989) y la patente US No. 4 , 968 , 603 ). Hasta ahora ninguna mutación de punto análoga a aquella en el proto-oncógeno neu se ha reportado en tumores humanos . La sobreexpresión de HER2 (frecuente, pero no uniformemente, debido a la amplificación de gena) también se ha observado en otros carcinomas, que incluyen los carcinomas del estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñon, colon, tiroides, páncreas vejiga. Véase, entre otros, King et al., Science 229-974 (1935). Yokota et al., Lancet 1:765-767 (1986): Fukushige et al., Mol. Cell . Biol .. , 6:955-958 (1986); Guerin et al., Oncogene Res. 3:32-31 (1988). Cohén et al., Oncogene, 4-81-88 (1980). Yonemura et al., Cáncer Res., 61:1034 (1991); Borst et al., Gyneol . Oncol . 38:364 (1990) :Weiner et al., Cáncer Res. 50:421-425 (1990), , Kem et al., Cáncer Res., 50:5184 (1990), Perk et al., Cáncer Res. 49:6605 (1989), Zhau et al., Mol. Carcinog, 3:254-257 (1990); Aasland et al. Br. Cáncer Res. 57 : 358-373 (1989); Williams et al., Pathbobiology 59:46-52 (1991) y McCann et al., Cáncer; 65_88-92 (1990) . HER 1 puede ser sobreexpresado en el cáncer de próstata (Gu et al., Cáncer Lett: 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol, 28:827-33; Ross et al., Cáncer 79:3252-70 (1997) y Saadasivan et al., J. Urol . , 150:127-31 (1993)).
Se han descrito los anticuerpos dirigidos contra la rata pl85neu y los productos de proteína de la HER2 humana. Drebin y colegas han llevado anticuerpos contra el producto del gene neu de la rata, pl85neu. Véase, por ejemplo, Drebin et al ., Cell 41 695-706 (1985). Myers et al., Meth. Enzym 198:377-290 (1991) y W094/22478. Drebin et al., Oncogene 2-273-277 (1988) reporta que mezclas de anticuerpos reactivos con dos regiones distintas de pl89neu resultan en efectos contra el tumor sinergéticos en las células NIH-3T3 neu-transformadas , implantas en ratones desnudos. Véase también la patente US 5,824,311, expedida el 20 de octubre de 1997. Hudziak et al., Mol. Ell. Biol .. 9 (3) " 1165-1172 (1989) describen la generación de un panel de anticuerpos de HER2 , que se caracterizan usando la línea celular del tumor del pecho humano S-BR-s. La proliferación celular relativa de las élulas SK-BR-3 en seguida de la exposición a los anticuerpos, se determinó por el teñido de violeta cristal de las monocapas, después de 72 horas. Usando este ensayo, la inhibición máxima se obtuvo con el anticuerpo llamado 4D5, el cual inhibió la proliferación células por el 56%. Otros anticuerpos en la proliferación celular reducida del panel ocurren en una menor extensión en este ensayo. El anticuerpo 4D5 se encontró además sensibiliza la sobreexpresion HER2 de las línesa celulares del tumor del pecho a los efectos citotóxicos de TNF-oc. Véase también la patyente US No. 5,667,171, expedida el 14 de octubre de 1997. L os anticuerpos de HER2 discutidos en Hudziak et al., se caracterizan además en Fendly et al. Cáncer Reearch 50:1550-1558 (1990) Knotts et al, in Vitro 26(3) :59a (1990). Sarup et al., Grow Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol . 11(3): 117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Ell . Biol .. 11 (2 ).979- 986 (1991); Lewis et al, Canee Inmmunol , Immunothe, 37:255-264 (1993); Pietras et al. Oncogene 8:1829-1838 (1994); Vitella et al., Cáncer Research 54:5301-5300 (1994). Liwkowski et al . , J. Biol .. Chem. , 159 (20) : 14661-14885 (1994), Scott et al., J. Biol. Hem. 266:14300-5 (1992); D'souza et al., Proc . Nati. Aad, Sci . 91_7202-7209 (1994); Lewis et al. Cáncer Research 67:1457-1465 (1996) y Schaefer et al., Oncogene 15 : 1385-1395 (1997) . Una versión humanizada recombinante del anticuerpo HER2 del murino 4D5 (huMab4D5-8, rumba JER2 , trastuzumab o HERCEPTIN7 ; patente US No. 5,821,337 es activo clínicamente en pacientes con sobreexpresion de HER2 de los cánceres del pecho metastáticos que han recibido una terapia extensa anterior dcontra el cáncer (Baselega et al., J. Clin. Oncol . 14:737-744 (1996)). El trastuzumab recibió la aprobación del mercadero de la Administración de Alimentos y Drogas, el 25 de septiembre de 1998, para el tratamiento de pacientes con cáncer del pecho metastáticos , cuyos tumores sobreexpresan la proteína de HER2. Otros anticuerpos de HER2 con varias propiedades se han decrito en Tagliabue et al, Int. J. Ancer 47:933-937 (1991) McKensie et al., Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al, Cáncer Res. 51:5362-5369 (1991)Bacus et al., Molecular carcinogenesis 3:350,362 (1990). Stancovski et al, PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); bacus et al., Cancdf Research 52:2580-2589 (1992 (; Xu et al., Int. J. Cáncer 53:401-409 (1993). WO94/00136; Kasprzyk et al., C ncer Research 52:2771-2778 (1992); Hancock et al., Cáncer Res. 54:1367-1373 (1994) Arteaga et al., Cáncer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwrt et al., J. Biol .. Chem. 267-15160-15167 (1992); Patente US No. 5,783,186 y lapper et al., Oncogene 14-2099-2109 (1997). La clasifiación de la homología ha resultado en la identificación de dos otros miembros de la familia del receptor HER (patente US Nos. 5,183,884 y 5,480,968, al igual que Kraus et al., PNAS (USA) 86:9293-9197 (1989) y HER4 (Solicitud de patente EP No. 499,274; Plowman et al., Proc. Nati., Acad. Sci . USA, 90 : 1746-1750 (1993) y Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993). Ambos de estos receptores exhiben una expresión auj mentada en al menos algunas líneas celulares del cáncer del pecho. Los receptores HER son encontrados generalmente en varias combinaciones en células y la heterodimerizaciónby se piensa aumenta la diversidad de respuestas celulares a una variedad de ligaduas HER (Earp et al., Breast Cáncer Research y Tratment 35-115-132 (1995)). El RGFR está unidoo por seis diferentes ligaduras; el factor del crecimiento epidermal (EGF) , el factor del crecimiento de transformación alfa (TGFa) , enfiregulina , factor del crecimiento epidermal que se une a la heparina (HB-EGC) , betacelulina y epiregulina (Gronen et al., Growth Factors 11:235-257 (1994)). Una familia de proteínas de heregulina que resultan del empalme alternativo de un solo gene, son las ligaduras para HER3 y HER4. La familia de heregulina incluye las heregulinas alfa, beta y gamma (Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992). Patente US No. 5,641,969 y Schaefer et al., Oncogene 15:1385-1394 (1997)) . Factores de diferenciación neu (NDFs, factores de crecimiento glial (GGFs) , receptor de la acetilcolina que induce actividad (ARIA) y factor derivado de neuronas sensoras y motoras (SMDG) . Para una revisión, véase Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994); lamke G. Molec. & Cell Neurosi. 7.247-272 (1996) y Lee et al Kpharm Rev. 47:51-85 (1995) . Recientemente, tres ligaduras HER adicionales se identificaron, neuregulin-2 (NRG.2), que se reportó unióa cualquiera de HER3 o HER4 (Chang et al., Nature 387:508-512 (1997) y arraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neuregulin-3 que une HER4. (Zhang et al., PNAS (USA) 94/(18)9562-7 (1997)) y neuregulin-4 que une HER4 arari et al, Oncogene 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, beta-celulin y epiregulin también unidos a HER4. Mientras el EGF y TGFa no se unen a HER2 , el EGF estimula EDFR y HER2 para formar un heterodímero , el cual activa EHFR y resulta en la transforilación de HER2 em el heterodímero. La dimerización y/o transfosforilación parece activan la cinasa de tirosina de HER2. Vése Earp et al., anterior. Similarmente , cuando HER3 se co-expresa con HER2 , se forma un compljo de indicación activo y los anticuerpos dirigidos cotra HER2 son capaces de interrumpir este complejo (Sliwkowski et al. J". Biol .. Chem. 259(20)14661-14665 (1994)). Adicionalmente, la afinidad de HER3 para la heregulina (HRD) es aumentada a un estado de afinidad mayor, cuando se co-expresa con HER2. Vése también Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Nati. Acad, Sci, USA 92: 1431-1436 (1995) y Lewis et al., Cáncer Res. 56: 1457-1465 (1996) con respecto al complejo de proteína de HER2-HER3. HER4 , como HER3 , forma un complejo de señalización activo con HER2 (Carraway y Cantley, ell 78 ; 5-8 (1994) ) . La red de señalización de HER se ilustra en la Figura 4. Publicaciones de patentes relacionadas a los anticuerpos de HER incluyen: US 5,677,171, US 5,720,937, US 5,720,954, US 5,725,856, US 5,770,195, US 5,772,997, US 6,165,464, US 6,387,371, US 6,399,063, US2002/0192211A1 , US 6,015,567, US 6,333,169, US 4,968,603, US 5,821,337, US 6,054,297, US 6,407,213, US 6,719,971, US 6,800,738, US2004/0236078A1, US 5,648,237, US 6,267,958, US 6,685,940, US 6,821,515, W098/17797, US 6,127,526, US 6,333,398, US 6,797,814, US 6,339,142, US 6,417,335, US 6,489,447, WO99/31140, US2003/0147884A1, US2003/0170234A1 , US2005/0002928A1, US 6,573,043, US2003/0152987A1 , W099/48527, US2002/0141993A1 , WO01/00245, US2003/0086924 , US2004/0013667A1, WO00/69460, WO01/00238, WOOl/15730, US 6,627,196B1, US6 , 632 , 979B1 , WOOl/00244, US2002/0090662A1 , WO01/89566, US2002/0064785 , US2003/0134344 , WO 04/24866, US2004/0082047 , US2003/0175845A1 , WO03/087131, US2003/0228663 , WO2004/008099A2 , US2004/0106161 , WO2004/048525, US2004/0258685A1 , US 5,985,553, US 5,747,261, US 4,935,341, US 5,401,638, US 5,604,107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 Bl, EP 494,135 Bl, US 5,824,311, EP 444,181 Bl, EP 1,006,194 A2 , US 2002/0155527A1 , WO 91/02062, US 5,571,894, US 5, 939, 531, EP 502,812 Bl, WO 93/03741, EP 554,441 Bl, EP 656,367 Al, US 5,288,477, US 5, 514, 554, US 5, 587, 458, WO 93/12220 , WO 93/16185, US 5, 877, 305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5,856,089, WO 94/22478, US 5, 910,486, US 6, 028, 059, WO 96/07321, US 5, 804, 396, US 5, 846, 749, EP 711, 565, WO 96/16673, US 5 , 783 , 404 , US 5, 977, 322 , US 6, 512, 097, WO 97/00271, US 6, 270, 765, US 6,395,272, US 5, 837, 243 , WO 96/40789, US 5,783,186, US 6,458,356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6, 214 , 388, US 5, 925, 519, WO 98/02463, US 5, 922, 845, WO 98/18489, WO 98/33914 , US 5, 994, 071, WO 98/45479, US 6, 358, 682 Bl, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 Al, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, US 6,582,919, US2002/0192652A1 , US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6,602,670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1,357,132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5,705,157, US 6,123,939, EP 616,812 Bl, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6,403,630 Bl, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6,333,348 Bl, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 Al, US 6,767,541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 Al, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 y WO 03/86467. El dominio extracelular de HER2 , (ECD, es difundido proteolíticamente de las células de carcinoma del pecho en el cultivo (Petch et al., Mol. Cell . Biol . , 10:2973-2982 (1990); Scott et al., Mol. Cell. Biol. 13:2247-2257 (1993) y Lee y Maihle, Oncogene 16:3243-3252 (1998)) y se encuentra en el suero de algunos pacientes de cáncer (Leitzel et al., J. Clin. Oncol 10:1436-1443 (1992)) . La HER2 ECD puede ser un marcador de suero del cáncer del pecho metastático (Leitzel et al., J. Clin. Oncol 10: 1436-1443 (1992)) y puede permitir escapar de los tumores de sobreexpresión de HER2 del control inmunológico (Baselga et al., . Clin. Oncol, 14:737-744 (1997), Brodowics et al., Int. J. Cáncer 73;875-879 (1997)) . La diffusion de niveles de suero de HER2 ECD representa un marcador independiente de la pobre resultado clínico en pacientes con cáncer del pecho metastático sobreexpresado de HER2 (Ali et al., Clin. Chem .48©1314 - 1320 (2002), Molina et al., Clin. Cáncer Res. 8:347-363 (2002)). Un dominio extracelular truncado de HER2 es también el producto de una transcripción alternativa de 2.3 kb generada por el uso de una señal de poliadenilacion, dentro de un intron (Scott et al., Mol. Cell. Biol . , 13:2247-2257 (1993. La transcripción alternativa fue primero identificada en la línea celular del carcinoma gástrico MK 7 (Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986) y Scott et al., Mol. Cell. Biol.. 13:2247-2257 (1993)) y el receptor truncado se ubicó dentro del citoplasma perinuclear más bien que secretado de estas células de tumor (Scott et al., Mol. Cell. Biol.. 13 -.2247-2257 (1993) ) . Otro producto alternativamente empalmado de HER2 , llamado "herstatin" se ha definido también (Doherty et al., Proc. Nati. Acad. Sci . 96:10859-10874 (1999). Azios et al., Oncogene 20:5188-5209 (20019; Justman y Clinton,. J. Biol.. Chem. 277:20618-20624 (2002)). Esta proteína consiste de subdominios I y II del dominio extracelular, seguidos por una secuencia C-terminal única codificada por intron 8. Otro meanismo que puede contar para el pobre resultado clínico en tumores que sobreexpresan HER2 se sugiere por la observación que, en algunas células de tumor que sobreexprean HER2 , el receptor se procesa por una metaloproteasa desconocida (o metaloproteinasa) para proporcionar el receptor asociado con la membrana truncada (algunas veces referido como "un "resto" y también conocido como p95) y un dminio extracelular soluble (también conocido como ECD , ECD105 o pl05) . Como con otros receptores de HER, la pérdida del dominio de unión de ligadura extracelularhace al dominio asociaado con la membrana intraelular HER2 una cinaasa de tirosina activa constitutivamente. Por lo tanto, se ha postulado que el proceso de HER2 ED crea un receptor activo consttutivamente que puede entregar directamente señales de crecimiento y supervivencia a a las células del cáncer . Véase , US Pat No. 6,541,214 (Clinton) y Solicitud de Patente US No. 2004/0247602al (Friedman et al).). Saez et al, Clin. Cáncer Res. 12(2): 424-431 (Enero del 2006) reportan que pacientes cuyos tumores expresan altos niveles de p95, tienen un resultado significantemente peor que pacientes quienes no lo expresan. En el presente nivel de p95, puede solamente ser determinado por la mancha Western.
Compendio de la Invención En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para inhibir la difusión de HER2 , que comprende tratar una célula que expresa la HER2 con un antagonista de metaloproteasa de matriz (MMP) , en una cantidad efectiva para inhibir la difusión de la HER2. Además, la invención proporciona un método para reducir el nivel del suero del dominio extracelular de la HER2 ) ECD) en un mamífero, que comprende administrar un antagonista de metaloproteasa de matriz (MMP) , en una antidad efectiva para reducir el nivel del suero de la GER2 ECD en este mamífero. En aún otro aspecto, se proporciona un método para tratar el cáncer en un mamífero, el cual comprende administrar un antagonista de metaloproteasa de matriz (MMP) al mamífero, en una cantidad efectiva para tratar el cáncer. Igualmente, la invención se refiere a un método para tratar un cáncer resistente al inhibidor de la HER en un mamífero, que comprende administrar al mamífero un antagonista de metaloproteasa de matriz (MMP) , en una cantidad efectiva para tratar el cáncer. En aún otro aspecto, la invención se refiere a un método para reducir el nivel de p96 HER2 en una célula,, que comprende exponer la célula a un antagonista de metaloproteasa de matriz (MMP) , en una cantidad efectiva paraa reducir el nivel de p96 HER2. La invención también se refiere al diagnóstico (o prognosis) , que comprende evaluar una MMP-15 (MT2-MMP) en una muestra de un paciente del cáncer, en que el nivel o actividad de la MMP-15 elevado y/o el nivel del suero de HER2 de difusión, y/o tendrá un resultado clínico pobre. Preferiblemente, el nivel de la MMP-15 (proteína o ácido nucleico) se evalúa en el método y se usa para identificar pacientes con una pobre prognosis o quienes tendrán un pobre resultado clínico. Opcionalmente , el cáncer del paciente además exhibe la expresión HER, amplificación o activación, más preferiblemente la sobreexpresión o amplificación del HER2.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 proporciona una ilustración esquemática de la estructura de proteína HER2 de longitud completa, y secuencias de aminoácidos para los Dominios I-IV (SEQ ID Nos. 1-4), respectivamente) de su dominio extracelular .
Las Figuras 2A y 2B muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera trastuzumab (Figura 2A, SEQ ID No. 5) y la cadena densa (Figura 2B, SEQ ID No.6), respectivamente . Las Figuras 3A y 3B muestran las secuenciasa de aminoácido de la cadena ligera de pertuumab (Figura 3A; SEQ ID No.7 y la cadena densa (Figura 3B; SEQ ID No. 8), los CDR se muestran en negritas . La masa molecular alculada de la cadena ligera y la cadena densa son 23,516.22 Da y 49,216.56 Da (cisteínasa en forma reducida) . La parte de carbohidrato se adjunta a Asn 299 de la cadena densa. La Figura 4 ilustra la red de señalización de HER. La Figura 5 ilustra la inhibición de trastuzumab de la difusión de HER2 ECD de HER2 , que sobre expresa las línes celulares del cáncer del pecho (SKBE3, MT474) comparado a la línea celular del cáncer del peso no sobreexpresada ( CF-7) . La Figura 6 ilustra lasa diferencias en p95 HER2 y los niveles de HER2 ECD difundidos, en tumores transgénicos MMTVHER2 tumores f2:f282, tumores sensibles al trastuzumab y tumores Fo5 , resistentes al trastuzumab= . La Figura 7 ilustra la estrategia usada para identificar la Sheddase de HER2.
La Figura 8 ilustra experimentos que demuestran que la sheddase tiene propiedades de una metaloproteasa. La Figura 9 muestra la expresión de las MMPs en los tumores MMTV-HER2 y las líneas celulares. La MMP-15 es un candidato para explicar las diferencias entre los tumores f2:1281, que son sensible al trastuzumab y los tumores Fo5, ue son resistentes al trastuzumab. La Figura 10 refleja la interacción entre la bandera-HER2 y la MMP-15. La Figura 11 muestra la interacción entre la bandera HER2-f2:1282 y la bandera HER2-Fo5 y la MMP-15. Las diferencias entre f2_1282 y Fo5 no se opueden explicar por la unión diferencial de los mutantes a la MMP-15. La Figura 12 ilustra mutaciones somáticas encontradas en ratones transgénicos MMTVHER2. Las secuencias son: sitio de Sheddase (SEQ ID No. 23), tipo silvestre ( T) (SEQ ID No. 24), empalme (SEQ ID No. 25), Fo5 (SEQ ID No.26) y f2 : 2078.10 V 27) . La Figura 13 ilustra los resultados del ensayo de la sheddase in vi tro, gDHER29 (DIV) - IgG en un substrato para los dominios catalíticos de la MMP-15, MMP-16, MMP-19 y MMP-25. Las secuencias para digestiones de proteasa son MMP-15 (SEQ ID No. 28), la MMP-16 (SEQ ID No. 29 { , MMP-19 (SEQ ID No.30), MMP-25 (SEQ ID No. 31), todos otros (SEQ ID No. 32) y el sitio terminal C de HER2-ECD (SEQ ID No. 33) . La Figura 14 muestra los resultados del experimento que demuestra que la MMP-15 no recorta otros receptores de HER. Las secuencias que demuestran la variación de secuencia cerca del dominio de la transmembrana son HER2 (SEQ ID No. 34) EGFR (SEQ ID No.35) HER3 (SEQ ID No. 36), HER4 (Jma) (SEQ ID No. 37) y HER4 (Jmb) 38) . La Figura 15 muestra recortes de "longitud completa" de la MMP-15 en HER2(+)-IgG. La Figura 16 demuestra un experimento el cual indica que p95HER2 está constitutivamente fosforilado, pero debe heterodimerizar con HER3 para activar Akt . La Figura 17 muestra que el inhibidor del ARN de la MMP-15 (ARNi) reduce la difusión de HER2 ECD y los niveles de p06 HER2 en células SKBR3 y BT47A. La Figura 18 ilustra cómo la inhibición del crecimiento, mediado por trastuzumab, en células SJBR3 es independiente de la inhibición de la difusión de HER2. La Figura 10 demuestra que la inhibición de la actividad de la metaloproteasa en los tumores de xenoinjertos Fo5, reduce la difusión de HER2 e inhibe los niveles de p95HER2.
La Figura 20 ilustra miembros de la familia de metaloproteiasa de matriz. Los miembros de la familia MMP se agrupan de acuerdo con la estructura e dominio. Las abreviatura usas en este figura son: PRE, pre-dominio; PRO, pro-dominio, CAT, dominio catalítico; H, bisagra, HEM, dominio de hemopexina, F, dominio de consenso del desdobamiento de furina; FN, dominio de tipo fibronectina , GPI , ancla de inositol de glicofosfatidilo , TM, dominio de transmembrana; Ig dominio de tipo inmunoglobulina ; CA, arreglo de cistaína; CL dominio de tipo colágeno.
Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas 1. Definiciones Los términos de "metaloproteasa de matriz" o "MMP" se refieren aquí a una proteína la cual es un miembro de una superfamilia de metalpropteasa de matriz (MMP) , dependiente en Zn o Ca para la actividad. La MMP aquí incluye la preproteína, proteína madura y sus formas variantes. Véase, también, la Figura 20, para ejemplos de las MMP con varios dominios. Las MMP se revisaron en Waneaar-Miller et al, Caancer y Metástasis Reviews 23, 119-136 (2004) . Una "MMP de atadura de membrana" o "MT-MMP" aquí es una MMP, según se definió antes, donde esta MMP es capaz de ser unida a una membrana celular por cualquiera de un dominio de transmembrana (TM) o un ancla de inositol de glicofosfatidilo (GPI). Ejemplos de MT-MMPs ancladas por un dominio de transmembrana aquí incluyen: MT1-MMP (MMP-14) , MT2-MMP (MMP-15) , MT3-MMP (MMP-16, MT5-MMP (MMP-24). Ejemplos de las MT-MMPs ancladasa por un ancla de GPI incluyen: MT4-MMP (MMP-17) y MT6-MMP (MMP-25) . La MMP-15 es aquí la MT-MMP preferida . "MT2-MMP" y "MMP-15" son aquí sinónimos y describen la preproteína NP_002415 en la base de datos de NCB1, la proteína madura que comprende los aminoácidos 132-699, al igual que sus formas variantes. Sustraía conocidos para MMP-15 incluyen el colágeno, fibronectiba , CD44 y complemento, MMP-15 es sobre-regulado en algunos cánceres y la sobreexpresión de esta proteasaa aumenta la invasión del tumor y el crecimiento de células del tumor. Un "antagonista de MMP" es un agente que se une a, y/o interfiere, en alguna extensión, con, la actividad proteolítica de al menos una MMP. Preferiblemente, el antagonista de la MMP se une selectivamente a, o inhibem la MMP, sin unirse significantemente a, o inhibir otras proteasas, tal como las proteaas en la familia ADAM (un disintegrin y metaloproteasa) . Ejemplos de antagonistas de la MMP incluyen aquí los anticuerpos que se unen a una MMP, inhibidores de moléculas pequeñas, pseudop 'pepidos que semejan substratos de la MMP, moléculas no de péptidos que se unen al zinc catalítico de las MMP, inhibidores de tejidos naturales aislados de MMPs (TIMPs) inhibidores del ácido nucleico, tal como el ARN, o inhibidores antisentido, etc. "Un antagonistas de MT-MMP" es un agente que se une a, y/o interfiere, en alguna extensión, con, la actividad proteolítica de al menos una MT-MMP. Preferiblemente, el antagonista de la MT-MMP se une selectivamente a, o inhibe, la MT-MMP, sin unirse significantemente a, o inhibir, otras proteaas (que incluyen otras MMPs que no se atan a la membran) . Ejemplos de antagonistas de la MT-MMP incluyen los anticuerpos que se unen a una MT-MMP, inhibidores de moléculas pequeñas, pseudopéptidos que semejan los substratos de la MT-MMP, moléculas no de péptidos que se unen al zinc catalítico de una MT MMP, inhibidoes del tejido natural aislados de la MT-MMOs, inhibidores del ácido nucleído de la MT-MMP, tal como el ARN o inhibidores antisentido, etc. "Un antagonista de MMP! es un agente que se une a, y/o interfiere, en alguna extensión con, la actividad proteolítica de la MMP-15. Preferiblemente, el antagonista de la MMP-15 se une selectivamente a, o inhibe, la MMP-15 sin unirse significantemente a, o inhibir otras proteasas (que incluyen otras MMPs además de la MMP-15) . Ejemplos de antagonistas de la MMP-15 incluyen los anticuerpos que se unen a la MMP-15, inhibidores de moléculas pequeñas, pseudopéptidos que semejan substratos de la MMP-15, moléculas no de péptidos, que se unen al zinc catalítico de la MMP-15, inhibidores del tejido natural aislado de la MMP-15, inhibidores del ácido nucleico de la MMP-15, tal como la ARN, o inhibidores antisentido, etc. Por "nivel de MMP elevado", se entiende una cantidad de la MMP en una muestra biológica, tal como una muestra de tumor, que excede la cantidad normal de la MMP, por ejemplo la cantidad de una muestra normal o no de tumor, del mismo tipo de tejido. Tal "cantidad normal" de la MMP (por ejemplo de la MMP-15) no incluye o incluye una cantidad no detectable de la MMP-15. Niveles de la MMP elevados pueden ser determinados en varias maneras, que incluyen aquellas que miden la proteína de la MMP o el ácido nucleido de la MMP. Un receptor de AHER@ es una cinasa de tirosina de proteína del receptor, que pertenece a la familia de receptores HER e incluye los receptores EGFR, HER2 , HER3 , y HER4. El receptor HER incluye el receptor HER de secuencia nativa y sus variantes. Preferiblemente, el receptor HER es un receptor HER humano de secuencia natuca Un receptor HER de "longitud completa" comprende un dominio extracelular , el cual se puede unir una ligadura HER y/o dimerizar con otra molécula del receptor HER; un dominio de transmembrana lipofílico, un dominio de cinasa de tirosina intracelular, y un dominio de señalización de la Terminal de arboxilo, que alberga varios residuos de tirosina, los cuales pueden ser soforilados. Los términos de AErbB2 , "AHER1 " , receptor @ del factor de crecimiento Aepidermal y AEGFR® se usan intercambiablemente aquí y se refieren a EGFR, como se describe, por ejemplo, en Carpenter et al. Ann, Rev. Biochem. 56:881-814 (1987), que incluyen sus formas variantes (por ejemplo un borrado del mutante EGFR como en Humphrey et al, PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). Las expresiones AErb2 " y AHER2 " se usan intercambiablemente aquí y se refieren a la proteína HER2 descrita, por ejemplo, en Semba et al, PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985 ( y Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986) (Número de acceso del Genebank X03363) al igual que sus formas variantes, tal como las formas alternativamente empalmadas (Siegel et al EMBO J. 18(8) 2149-2164 (1999)).
Aquí, el "dominio extraelular HER2 " o HER2 ECD" se refiere a un dominio de HER2 que está fuera de una célula, o anclado a una membrana celular o en circulación, que incluye sus fragmentos. En una modalidad, el dominio extracelular de HER2 puede comprender cuatro dominios: Adominio 1® (residuos de aminoácido de aproximadamente 1-195 (SEQ ID NO 1), ADominio (residuos de aminoácidos de aproximadamente 196-319, SEQ ID NO: 2) ADominio II® III® (residuos de aminoácidos de aproximadamente 320-488 SEQ ID NO: 3) y ADominio IV® (residuos de aminoácidos de aproximadamente 3480-639: SEQ ID NO. 4) (numeración de residuos sin péptido de señal). Vésae Garrett et al, Mol. Cell . 22: 495-505 (2003) Cho et al, Nature 421, 756-760 (2003) . Franklin et al, Cáncer Cell 5:317-328 (2004) y Plowman et al, Proc . Nati Acad. Sci 90 : 1746-1750 (1992) al igual que aquí la Figura 2. Aquí, la "difusión de HER2 " se refiere a un fragmento de dominio extracelular soluble (ECD) de HER2 de la superficie de célula de una célula que expresa HER2. al difusión puede ser causada por el desdoblamiento proteolítico de la superficie celular HER2 , que resulta en la liberación de un fragmento de ECD de la superficie de la célula o el ECD soluble o su fragmento pueen ser codificados por una transcripción alternativa.
Por "nivel de suero de HER2 difundido" se entiende la cantidad de HER2 ECD presente en el suero o la circulación de un mamífero. Tales niveles pueden ser evaluados por variass técnicas que incluyen aquellas descritas en: Ali et al., lin. Chem 48: 1314-1320 (2002): Molina et al. Clin. Cáncer Res. 8:347-363 (2992); patente US No. 4,933,294, expedida el 12 de junio de 1990; W091/95264, publicada el 18 de abril de 1991; patente US 5,401,638, expedida el 28 de marzo de 1995 o Sias et al., J". Immunol Methods, 132:73-80 1990) . Aquí, "nivel de suero de HER2 de difusión elevada" se refiere a una cantidad de HER2 o HER2 ECD difundida en el suero de un mamífero (o humano) que excede la cantidad presente en el suero en un mamífero normal (por ejemplo, un humano) . Los niveles de suero de HER2 ECD elevados, pueden correlacionarse con una pobre prognosis y una responsividad disminuida a la terapia endocrina y la quimioterapia en pacientes con cáncer del pecho avanzado. La expresión "o85 HER2) aquí se refiere a la proteína de HER-2 truncada en la Terminal de NH2. Generalmente, p95 es un fragmento pequeño unido a la membrana, el cual puede surgir del desdoblamiento de longitud completa de HER2 , por una proteasa o shedasa (Yuan et al . , Protein Expresión y Purífication 29: 217-222 (2003)). p) 5 puede tener un Mr de aproximadamente 95,000 y puede ser fosforilada (Molina et al., Cáncer Research 4744-4749 (2001) ) . p95 se ha encontrado en algunas muestras de cáncer del pecho (Christianson et al., Cáncer Res. 14:5123-5129 (1998) . Por "nivel p95 elevado" se entiende un nivel de p95en una célula de cáncer que excede el nivekll normal, por ejemplo, el nivel en una célula normal o no cancerosa del mismo tipo de tejido, como la célula del cáncer. Tal nivel de p95 elevado puede resultar en el señalamiento constitutivo y la metástasis nodal (Molina et al., Clin. Cáncer Reearch 8: 347-353 (2002): Christianson et al., Cáncer Res 15:5123-5129 (1998) ) . Por la "evaluaci'n" de un marcador, tal como la MMP-15, se intenta un diagnóstico y/o su análisis prognóstico, que incluye un análisis de la presencia o ausencia de ese marcador, medición de su cantidad y/o un análisis de su actividad (por ejemplo, una actividad aumentada) . Un paciente e cáncer con "un resultaado clínico pobre" es uno con una pobre prognosis, quien es menos probable responda a la terapia del cáncer, tal como la quimioterapia o terapia con un anticuerpo de HER2 , como trastuzumab. El resultado clínico puede ser medido por medios estándar, tal como supervivencia, que incluye la supervivencia libre de la enfermedad, etc. AErbB3 ! y AHER3 ! se refieren al polipéptido del receptor, como se describe, por ejemplo, en las patentes US 5,183,884 y 5,480,968, al igual que Graus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989) que incluye sus formas variantes. Los términos de AErbB4 " y AHER4 " se refieren aquí al polipéptido receptor, como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente EP No. 599,274; Plowman et al., Proc . Nati. Acad. Sci . US 80:1746-1759 (1993) Y Plowman et al., Nature, 366: 473-475 (1993), que incluye sus formas variantes, tal como las isoformas descritasa en W099/19488, publicada el 22 de abril de 1999. Por ligadura® AHER se entiende un polipéptido que se une a, y/o actva, un receptor de HER. La ligadura de HER de interés particular aquí es una ligadura HER nativa de secuencia humana, tal como el factor de crecimiento epidermal (EGF) (Savage et al., J. Biol . Chem. 247.-7612-7621 (1972)), que transforma el factor de crecimiento ala(TGF-c (marquardt et al. Sciende 223 : 1979-1072 (1984)), el factor de crecimiento de la anfiregulina, también conoida como schwanowa o queratinoci to (Shoyab et al . Science 243:1074-1076 (1989), Kimura et al . , Nature 348: 257-260 (1990) y Cook et al., Mol. Cell . Biol . 11 : 2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al , Science 259 : 1604 -1607 (1993) y Sasada et al., Biochem Biohys, Res. Commun 190:1173 (1993)) el factor de crecimiento epidermal que se une a la heparina (HB-EGF) (Higashiya a et al. Science 251 : 936-939 (1992)) epiregulin /Yoyoda et al., J. Biol. Chem, 270.-7495-7500 (1995) y Komurasaki et al., Oncogene 15 : 2841-2848 (1997)), una heregulina (véase abajo), neuregulina- (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387-512-516 (1997) ) , neuregulin- 3(NRG-3) (Zhanbg et al., Proc . Nati. Acade . Sci 94:9562-9567 (1997)), neuregulin-4 (NRG-4) (Harari et al, Oncogene 18: 2681-89 (1999)) y cripto (CR-1) (Kankan et al, J. Niol. Chem. 272 (6) : 3330-3335 (1997)) ligaduras HER que unen a RGFR incluen EGF, TGF-a, anfiregulin, betacelulin, HB-EGF y epiregulin. Ligadurs HER que se unen a HER3 incluyen la heregulinas. Las ligaduras HER capaces de unirse a HER4 incluyen la betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y heregulinas. La "heregulina" (HRG) , cuando se usa aquí, se refiere a un polipéptido codifiado por el producto del gener heregulin, como se desribe en la patente US No. 5,641,860 o archionni et al., Nature 382-312-318 (1993). Ejemplos de heregulinas incluyenla heregulina a, hereguina-beta 1 y heregulina beta 3 (Colmes et al., Science, 256: 1206-1219 (1992) y la patente US No. 5, 641, 869 (; el factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al., Cell 69 205-216 (1992) ) ; actividad que induce el receptor de la acetilcolina (ARIA) (Falls et al, Cell 72:801-815 (1993)), factor de crecimiento glial (COFs) ((Marchionni et al, Nature 362:312-318 (1993)), factor derivado de neuronas sensors y motors (SMF) (Ho et al., J. Biol . Chem. 270 14523-14532 (1995) y heregulin (Schaefer et al., Oncogene 15: 1385-1384 (1997)). Un "dímero HER" aquí es un dímero asociado no covalentemente , que comprende al menos dos receptores HER. Tales complejos pueden formarse cuando una célula que expresa dos o más receptores HER se expone a una ligadura HER y puede ser aislada por inmunoprecipitación y analizada por SDS-PA, como se describe en Sliwkowski et al., J. Biol.. Chem., 269(20), 14661-14665 (1994), por ejemplo. Ejemplos de tales dímeros HER incluyen los heterodímeros EGFR—2 , HER2-HER3 y HER3-HER4 . Asimismo, el dímero HER puede comprender dos o más receptores de HER2 combinados con un diferente receptor de HER, tal como HER3 , HER4 o EGFR. Otras proteínas, tal como una subunidad del receptor de citosina (por ejemplo, gpl30) pueden estar asociadaas con el dímero. Una célula, CÁNCER o muestra biológica, que "exhibe la expresión HER, amplificación o activación" es una la cual, en una prueba de diagnóstico, expresa (incluyendo sobreexpresiones ) HER, tiene el gene HER amplificado y/o demuestra de otra manera la . activación o fosforilación de los receptores HER. Tal activación puede ser determinada directamente (por ejemplo por el perfil de la expresión del gene o por detectar los heterodímeros HER) . Un cáncer o célula de tumor, con la sobreexpresión o amplifiación® del receptor AHER2 , es uno el cual tiene niveles significantemente mayores de una proteína o gene de HER2 , comparado a una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser causada por la amplificación de gene o por la transcripción o translación aumentada. La sobreexpresión de HER2 o amplificación puede ser determinada en un ensayo de diagnóstico o prognóstico evaluanado niveles aumentados de la proteína HER2 presente en la superficie de una célula (por ejemplo por vía de un ensayo de inmunohistoquímica , IHC) . Alternativa o adicionalmente , uno puede medir niveles del ácido nmucleico de HER2 en la célula, por ejemplo por la hibridiación in si tu fluorescente (FISH, véae 098/45479, publicada en Octubre de 1998) . Las técnicas de mancha Souther, o la reacción de cadena de polimerasa (PCR) , tal como la PCR de tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) . Uno puede también estudiar la sobreexpresión o amplificación de HER2 midiendo la difusión de HER2 en un fluido biológico, tal como el suero (véase, por ejemplo, la patente US No. 4,933,294, expedida el 12 de junio de 1990; WO92/05264, publicada el 18 de Abril de 1991; patente US 5,401,638 expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et al., J. Immunol, Methods 132; 73-80(1990)) . Aparte de los ensayos anteriores, varios ensayos in vivo están disponiblesa los practicantes expertos. Por ejemplo, uno puede exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo, el cual está opcionalmente rotulado con una etiqueta detectable, por ejemplo, un isótopo radioactivo, y la unión del anticuerpo a las células en el paciente puede ser evaluada, por ejemplo, por la exploración externa para la radioactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente, previamente expuesto al anticuerpo. A la invera, un cáncer o célula de tumor, el cual no sobreexprese o amplifique el receptor HER es uno que no tiene niveles mayores de los normales de la proteína del receptor HER o gene, comparado a una cálula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Anticuerpos que inhiben la dimerización HER, tal como pertuzumab, pueden ser usados para tratar el cáncer, que no sobreexprese o amplifique el receptor HER2. Un inhibidor de la HER es un agente que interfiere con la actvación o función de HER. Ejemplos de inhibidores de HER incluyen los anaticuepros de HER (por ejemplo, EHFR, HER2 , HER3 o HER4 ) ; Inhibidores de la dimerizaación de HER; drogas con objetivo de EGFR; antagonistas de HER de molécula pequeña; inhibidores de cinasa de tirosina de HER; inhibidores de cinasa de tirosina dobles de HER2 y EGFR, tal como lapatinib/GW572016 ; moléculas antisentido (véase, por ejemplo, WO2004/87207) ; y/o agentes que se unen a, o interfieren con la función de, moléculas de señalización corriente abajo, tal como MAPK o Akt . Preferiblemente, el inhibidor HER es un anticuerpo o molécula pequeña que se une a un receptor de HER. Ejemplos específicos dinhibidores de HER incluyen los trastyzynav, m oertruzumb, cetuximab, ABX-EGF, EMD7200, gefinitib, erlotinib, CP724714, C11033, GW572016, IMC-1158 y TAK165. Un "inhibidor de dimerización HER" es un agente que inhibe la formación de un dímero HER. Preferiblemente, el inhibidor de la dimerización HER es un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo que se une a HER2 en su sitio de enlace heterodimérico . El inhibidor de dimerizacion mása preferido aquí es el pertuzumab o el anticuerpo monoclonal 2C4 (Mab 2C4) . Otros ejemplos de los inhibidores de dimerizzación de HER incluyen los anticuerpos que se unen a EGFR e inhiben su dimerizacion con uno o más de otros receptores de HER (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal EGFR 806, MAb 806, qe se une al EGFR activado o "sin atar", véase Johns et al., J. BioL.Chem, 279(29); 30375-30384 (2004)), anticuerpos que se unen a HER3 e inhiben su dimerizacion, con uno o más de otros receptores de HER; anticuerpos que se unen a HER4 e inhiben su dimerizacion con uno o más de otros receptores de HER; inhibidores de la dimerizacion de péptidos (patente US No. 6,417,168; inhibidores de la dimerizacion antisentido; etc. Un "anticuerpo de HER" es un anticuerpo que se une a un recetor de HER. Opcionalmente , el anticuerpo de HER ademása interfiere con la activación o función de HER. Preferiblemente, el anticuerpo de HER se une al receptor de HER2. Los anticuerpos de HER2 de interés particular aquí son el trastuzumab y pertuzumab. Ejemplos de anticuerpos de EGFR incluyen el cetuximab, ABX0303, EMD7200 e IMC11F5. La activación de HER se refiere a la actvación, o fosforilación, de cualquiera de uno o más receptores de HER Generalmente, la activación de HER resulta en la transducción de señal (por ejemplo, que se causó por el dominio de cinasa intracelulas de residuos de tirosina que fosforilan el receptor de HER én este receptor de HER o polipéptido de substrato) . La activación de HER puede ser mediada por la ligadura de HER que se une a un dimero HER que comprende el receptor de HER de interés. La ligadura de HER que se une a un dímero HER, puede activar un dominio de la cinasa de uno o más de los receptores de HER en el dímero y resulta así en la fosforilación de los residuos de la tirosina en uno o más de los receptores de HER y/o la fosforilación de los residuos de tirosina en polipéptidos de substratos adicionales, tal como las cinasas intracelulares Akt y MAPK. La fosforilación se refiere a la adición de uno o más grupos de fosfato a una proteína, tal como un receptor de HER o su substrato. Un anticuerpo que "inhibe la dimerización de HER" es un anticuerpo que inhibe, o interfiere con, la FORMACIÓN de un dímero de HER. PREFERIBLEMENTE, tal anticuerpo se une a HER2 en su sitio de unión heterodimérico . El anticuerpo de INHIBICIÓN de la dimerización más preferido aquí es el pertuzumab o MAb 2C4. Otros ejemplos de anaticuerpos que inhiben la dimerización de HER incluyen los antiuerpos que se unen a EGFR e inhiben su simerización con uno o más de otros receptores de HER (porej enripio , el anticuerpo monoclonal 805 de EGFR, Mab 806, el cual se une al EGFR activado o sin enlazar, véase Johns et al, J. Biol .. Chem 270 (29):30375-30384 (2004)), los anticuerpos que se unen a HER3 e inhiben su dimerización con uno o más de otros receptores de HER, y anticuerpos que se unen a HER4 e inhiben su dimerización con uno o más de otros receptores de HER. Un sitio de unión heterodimérico en HER2 se refiere a una región en el dominio extracelular de HER2 qu hace contacto, o interfaz con, una región en el dominio extracelular de EGFR, HER3 o HER4 en la formación de un dímero con éste. La región se encuentra en el Dominio II de HER2. Franklin et al., Cáncer ell 517-328 (2004). El anticuerpo de HER2 puede ser uno el cual, como trstuzumab, inhibe el desdoblamiento de ectodominio de HER2 (Molina et al., Cáncer Res. 61:4744-4740(2001)) o puede ser uno que, como pertuzumab, no inhibe significativamente el desdoblamiento del ectodominio de HER2. Un anticuerpo HER2 que se una a un sitio de unión heterodimérico de HER2 , se une a residuos en el dominio II (y, opcionalmente , también se une a residuos en el otro de los dominios del dominio extracelular de HER2 , tal como los dominios I y III) y puede ocultar estéricamente , al menos en alguna extensión, la formación del heterodímero HER2-EGFR, HER3-HER3 o HER2-HER4. Franklin et al, Cáncer Cell : 317-38 (2004) caracteriza la estructura de cristal de pertuzumab de HER2 , depositada con el Banco de Datos de Proteínas RCSB (Código de ID: IS78) , que ilustra un anticuerpo ejemplar que se une a un sitio de unión heterodimérico de HER2. Un anticuerpo que se une a un dominuio II de HER2 , se une a los residuos en el dominio II y, opcionalmente , los residuos en otros dominios de HER2 , tal como los dominios I y III. Preferiblemente, el anticuerpo que se une al dominio II se enlaza a la junta entre los dominios I, I y II de HER2. Un polipéptido de una secuencia natiuva es uno el cual tiene la misma secuencia de aminoácidos como un polipéptido (por ejemplo, el receptor de HER o ligadura de HER) derivada de la naturaleza. Tales polipéptidos de secuencia natva pueden ser aislados de la naturleza o pueden ser producidos por medios recombinantes o sintéticos. Así, un polipéptido de secuencia natura puede tener la secuencia de aminoácidos del polipéptido humano, que ocurre naturalmente, el polipéptido del murino o el polipéptdo de cualquier otra especie de mamífero . El término de "anticuerpo" aquí se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) formados de cuando menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, en tanto ellos exhiban la actividad biológica deseada. El término de "anticuerpo monoclonal" , según se usa aquí, se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen a los mismos epítopes, excepto para posibles variantes que pueden surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, tales variantes generalmente están presentes en cantidades menores. Tal anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se une a un objetivo, en que la secuencia de polipéptidos que se une al objetivo se obtuvo por un proceso que incluye la selección de una secuencia de polipéptidos que se une a un solo objetivo, de una pluralidad de secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, al proceso de selección puede ser la selección de una clona única de una pluralidad de clonas, tal como un conjunto de clonas de hibridoma, clonas de fagos o clonas del ADN recombinante . Se debe entender que la secuencia de unión del objetivo seleccionada puede además ser alterada, por ejemplo, para mejorar la afinidad para el objetivo, para humanizar la ecuencia de unión del objetivo, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogeniicdad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico , etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión de objetivo alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contrsate a las preparaciones del anticuerpo policlonal el cual incluye típidamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un simple determinante en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones del anticuerpo monoclonales son ventajosas, de manera que ellas típicamente no se contaminan por otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como requiriendo la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que serán usados de acuerdo con la presente invención pueden ser hechos por una por una variedad de técnicas, que incluyen, por ejemplo, el método de hibridoma (por ejemplo Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) Harlow et al., Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio (Cold Spring Harbor Laboratory Pres, 2a ed. 1988) : Hammerilin et al, en Anticuerpos Monoclonales e Hibridomzas de Células T, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), métodos del ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente US No. 4,816,567), tecnologías de exhibición de fagos (vése, por ejemplo, Claxon et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al. J. Mol. Biol .. 222-581-597 (1991); Soidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) :299-310 (2004); Lee et al., J. Mol Biol.. 340(5): 2073-1093 (2004). Fellose, Proc.Nat Acad. Sci USA 101(34) 12467-12372 (2004) y Lee et al. J. Immunol Methods 284(1-2); 119-132 (2004), y las tecnologías para producir anticuerpos humanos o de tipo humano, en animales que tienen partes o todos los sitios o genes de la inmunoglobulina humana, que codifican las secuencias de la inmunoglobulina humana (véae, por ejemplo, WO 1998/24893; WO1996/34096 , WO 1996/33735; WO 1991/20741; Jakobovits et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993), Jakobovits et al, Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno 7: 33 (1993); patentes US Nos.. 5,545,807; WO 1997/17852; U.S. Patentes Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Wature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al . , Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern . Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995). Los anticuerpos monoclonales incluyen aquí específicamente los anticuerpos "quiméricos" , en donde una porción de las cadenas densas y/o ligerasa es idéntico con, u homólogo a, las ecuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientrs el resto de las cadenas es idéntico, con, u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, al igual que los fragmentos de estos anticuerpos, en tanto ellos exhiban la actividad biológica deseada (U.S. Patente No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)) . Los anticuerpos quiméricos se interés aquí incluyen los anticuerpos primatizados qu comprenden seuencias de unión a antígenos de dominio variable, derivadas de un primate no humano (por ejemplo el Mono del Viejo Mundo, simios, etc.) y secuencias de regiones constantes de humanos .
"Fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que incluye preferiblemente su región de unión del antígeno. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, fab' , F(ab' ) 3 y Fv; aiant icuerpos , anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpos. Un anticuerpo intacto aquí es aquel que comprende dos regiones de unión del antígeno, y una región de Fe. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones de efector. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas densas, los anticuerpos intactos pueden ser asignados a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de ellos pueden ser divididos ulteriormente en subclases (isotipos) , por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 , IgA, e IgA2. Los dominios constantes de cadenas densas, que corresponden a aiferentes clases de anticuerpos, se llaman , d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructurasa de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clasaes de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Las funciones del efecto de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a una región Fe (una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones del efector de anticuerpo incluyen la unión Clq; la citotoxidad dependiente completamente; La citotoxicidd mediada por células, dependiente del anticuerpo de unión del receptor de Fe (DAC) fagocitosis, regulación descendente de receptores de la superficie de la célula (por ejemplo, receptor de la célula B; BCR) , etc. La citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo y DAC se refiere a una reacción mediada por células en la cual celas citotóxicas que expreaan los receptyores Fe (FcRs) (por ejemplo células destructuras (NK) naturales, neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo de unión en una célula objetivo y causan subsiguientemente la lisis de la célula objetivo. Las células primarias mediadas para ADAC , células NK, expresan FcyRIII solamente, en tanto los monocitos expresan FcyRI , FCyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en las células hematopoiéticas ese resumen en la Tabla 3, en la página 464 de Ravetech y Kinet, Annu, Rev. Immunol 9;457-92 (1991) . Para evaluar la activida de AD de una molécula de interés, como en el ensayo de ADC in vitro, tal como se describe en las patentes de US No. 5,500,362 ó 5,821,337, puede ser realizado. Células efector útiles para estos ensayos incluyen las células mononucleares de la angre periféricas (PBMC) y las células destructoras naturales (NK) . Alternatvamente , o adicionalmente , la actividad de DAC de la molécula de interés puede ser evaluada in i o, por ejemplo en un modelo de animal, tal como se describe en Clynes et al., PNAS (USA) 95:651-656 (1998). Las células del efector humano son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones de efector. Preferiblemente, la célula expresa al menos FcyRIII y realiza la función del efector de DAC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADC incluyen las células mononucleares de la sangre periféricas (PRMC) , células supresors naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; con células PBMCs y NK siendo preferidas. Las células efector pueen ser aisladaas de su fuente nativa, por ejemplo de la sangre o PBMC, como se describe aquí. El término de "receptor de Fe" o FcR@ se usan para describí un receptor que se une a la región de Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Asimismo, un FR preferido es aquel que se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores délas subclases FcyRI , FcRyII y FcyRIII, que incluyen las variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores Fcyll incluyen FcyRIIA (un "reeptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor") que tienen secuencias de aminoácidos similares, que difieren primariamente en sus dominios citoplásmicos . El receptor de activación FcyRIIA contene un tipo de activación basado en la inmuno-receptora (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor e inhibición FcyRIIB contiene un tipo de inhibición basado en la tirosina inmuno-receptora (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase la revisión M in Daeron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1887)). Los FcRs son revisados en Tabeth yKinet, Annu, Rev. Immunol 9 457:92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4; 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs que incluyen aquellos que serán identificados en el futro, son incorporados por el término "FcR" aquí . El término también incluye el receptor neonatal FcRn, que es responsable de la transferencia de la IgGs maternal al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol, 24:249 (1994)) y regula la homeostasis de las inmunoglobulinas . Una citotoxicidad dependiente del complemento o CDC@ se refiere la habilidad de una molécula a lisar un objetivo en la presencia del complemento. La trayectoria de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) que forma acomplejo con un antígeno afin. Para evaluar la activación del complemento, un ensayo CDC, por ejemplo como se describió por Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1966) puede ser realizado . Los "anticuerpos nativos" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas densas (H) idénticas. Cada caena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientrs el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas densas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas . Cada cadena densa y ligera también tiene puentes de disulfuro intracadena, espaciados regularmente. Cada caena densa tiene en un extremo un dominio variable (Vi4) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena densa, y el dominiovariable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena densa o pesada. Residuos de aminoácidos particulares se cree forman una interfa entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena densa. El término de "variable" se refiere al hecho que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia, entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no es distribuida uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables , tanto en los dominios variables de la cadena ligera como en la cadena pesada. Las porciones más altamente concentrads de dominios variables se llaman regiones de armazón (FRs) . Estos dominios variables de cadenas nativas, pesads y ligeras, comprenden cuatro FRs, que adoptan grandemete una configuración de hoja ß, conectaas por tres regiones hipervariables, las cuales forman lazos que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de la hoja ß. Las regiones hipervariables en cada caena sae retienen juntas en proximidd estrecha por los FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cdena, contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de anticuerpos (vése, Kabat et al., Secuencisas de Proteínas de Interés Inmunológico, 5 a Ed . Public Health Sservice, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constants no son implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino exhibe varias funciones de efector, tal como la particupación del anticuerpo en la citotoxicidd celular dependiente del anticuerpo (ADC) . El término de región hipervariabl , cuando se usa aquí, se refiere a los resisduos de aminoácio de un anticuerpo, el cual es responsable de la unión del antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácidos de una región determinante complementaria o CDR (por ejemplo los residuos 24-34 (L211) 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 85-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada. Kabat et al., Secuencias de Proteínasa de Interés Inmunológico, 5a Ed. Public ealth Service, Natiional Institutes of Healt, Bethesda MD. (1991)) y/o esos residuos de un lazo hipervariable (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio de variable de caena ligera y 25-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-202 (H3) en el dominio de variable de cadena pesada. Chotyhia y Lesk J. Mol. Biol .. 196:901-917 (1937)). Los residuos de la "Región de Armazón" o "FR" son esos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable , como se definen aquí . La digestión de la papaína de anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión de antígeno, llamados fragmentos "Fab" , cada uno on un sitio sencillo de unión de antígeno, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad a cristalizar fácilmente. Los fragmentos de pepina suministran un fragmento F/ab' ) 2 que tiene dos sitios de unión de antígeno y es aún capaz del entrelazamiento del antígeno. "Fv" es un fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento de antígeno completo y un sitio de unión de antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y una cadena ligera en leve asociación covalente . Es en esta configuración que las tres regiones hipervaiables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión de antígeno en la superficie del dímero VH-VL . olectivamente , las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un simple dominio variable ( o la mitad de un Fv, que comprene tres regiones hiopervariables específicasa para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y unir el antígeno, aunque con una afinidd menor que todo el sitio de unión. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la adena pesada. Fab = fragmentos que difieren de ls fragmentos de Fab por la adición de unos cuantos residuos en la terminal carboxi del dominio de la cadena pesada CH1, que incluyen una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab' -SH es la designación aquí para Fab' en donde los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan al menos un grupo de tilo libre. F(ab')2 son los fragmentos de anticuerpo originales, producidos como parejas de fragmentos de Fab', que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpo son también conocidos. Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado, pueden ser asignadaa a uno de los dos tipos claramente distintos, llamados kappa (?) y lambda (?) , basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Los fragmentos de anticuerpos de "cadena sencilla Fv" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en que estos dominios están presentes en una simple adena de polipéptidos . Preferiblemente, el polipéptido Fv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que habilita que scFv forme la estructura deseda para la unión de antígeno. Para una revisión de scFv, véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp . 269-315 (1994) . Los fragmentos de scFv del anticuerpo HER2 se describen en W093/16185; U.S. Patente No. 5,571,894; yd U.S. Patente No. 5,587,458. El término de "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos ditios de unión de antígeno, estos fragmentos comprenden un dominio pesaado variabla (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) Usando un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre lod sos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a la pareja con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión de antígeno. Loa diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90 : 6444-6448 (1993) . Las formas "humanizadas" de anticuerps no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en que los resiuos de una región hiervariable del receptor, son reemplazados por residuois de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) , tal como del ratón, rata, conejo o primate no humano, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de armazón (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos qe no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar más el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los lazos de la hipervariabe , corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos, o sustancialmente todos, los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente , al menos una porción de una región constante (Fe) de la inmunoglobulina, típicamente de una inmunoglobul ina humana. Para otros detalles, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct. Biol . 2:593-596 (1992) . Los anticuerpos de HER2 humanizados incluyen: huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5 -5 , huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 o trastuzumab (HERCEPTIN7) como se describen en la Tabla 3 de U.S. Patente 5,821,337 incorporada expresamente aquí como referencia; 520C9 (W093/21319) ; y 2C4 humanizado y anticuerpos, tal como pertuzumab como se describen aquí . Para los fines de la presente, Atrastuzumab, @ AHERCEPTIN7 , @ y AhuMAb4D5 - 8 " se refieren a un anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada, en las SEQ ID NOS. 5 y 6, respectivamente. Aquí, pertuzumab® y AOMNITARGJ® se refieren a un anticuerpo que comprende secuencias de aminoácidos de cadenasa ligera y pesada, en SEQ ID NOS. 7 y 8, respectivamente . Un anticuerpo solo o desnudo es un anticuerpo que no conjuga a una molécula heteróloga, tal como una parte citotóxica o radioeqtiqueta .
Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes de contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo sera purificado (1) a más del 95% en peso del anticuerpo, como se determina por el método Lowrty y, más preferiblemente, a más del 99% en peso; (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencias de aminoácidos internos o de terminal N, por el uso de un secuenciador de copa giratoria; o (3) a la homogeneidad por SDS-PAGE, bajo condiciones reductoras o no reductoras, usando azul de Coomassie o preferiblemente, tinte de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinante , , puesto que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo, no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el anticuerpo aislado será preparado por al menos un paso de purificación. Un anmticuerpo madurado de afinidad, es aquel con una o más alteraciones en una o mása regiones hipervariables del mismo, que resulta en una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno, comparado con un anticuerpo afín que no posee estasa alteraciones. Anticuerpos madurados de afinidd preferidos tendrán afinidades nanomolares o aún picomolares para el antígeno objetivo. Anticuerpos madurados de afinidad son producidos por procedimientos conocidos en el arte. . Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración de afinidad por mezclar los dominios VH y VL, . La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de armazón se describen por: Barbas et al. Proc Nat . Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 ( 7 ) : 3310 - 9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol . 226:889-896 (1992). El término de anticuerpos de especies principales aquí se refiere a la estructura de anticuerpo en una composición, la cual es la molécula de anticuerpo predominante cuantitativamente en la composición. Un anticuerpo de variante de secuencia de aminoácidos aquí es un anticuerpo con una secuencia de aminoácidos, que difiere de un anticuerpo de la especie principal. Ordinariamente, las variantes de secuencias de aminoácidos poseerán al menos alrededor del 70% de homología, con el anticuerpo de especie principal, y preferiblemente, ellas serán de al menos alrededor del 80%, más preferiblemente al menos una homología de alrededor del 90% con el anticuerpo de especie principal. Las variantes de la secuencia de aminoácidos poseen susstituciones , omisiones y/o adiciones en ciertas posiciones, con o adyacentes a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de especie principal . Un anticuerpo de variante de glicosilación aqui es un anticuerpo con una o más moléulas de carbohidratos unidas ahí, las cuales difieren de una o más moléculas de carbohidratos adjuntas al anticuerpo de especie principal. Un anticuerpo desamidado es aquel en que uno o más residuos de asparagina del mismo se han derivatizado, por ejemplo a un ácido aspártico, una sucinimida o un ácido iso-aspárico . Los términos de "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferor, que se caracteriza típicamente por el crecimiento irregular de células. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfomo, blastoma, (que incluye la meduloblastoma y etinoblstoma) , sarcoma (que incluye liposarcoma y sarcoma celular isnovial), tumores neuroendocrinos (que incluyen tumores cardinoides, gastrinoma e islas de cáncer celular), mesotelioma, schwannoma (que incluye el neuroma acústico) , meningioma, adenocarcinoma , melanoma y leucemia o linfoides maligna. Más particular, ejemplos de estos cánceres incluyen el cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de célulasa escamosas epitelial), cáncer del pulmón, que incluyen cáncer del pulmón de células pequeñas (SCLC) , cáncer del pulmón de células no pequeñas (NSCLC) , adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, áncer gástcio o del estómago, que incluye el cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer del ovario, cáncer del hígado, cáncer de la vejiga, hepatoma, cáncer del pecho (que incluye el cáncer del pecho metástatitico) cáncer del colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, cáncer de la glándula saluivar, cáncer del riñon o renal, cáncer de la próstata, cáncer vulval , cáncer de la tiroids, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, cáncer testicular, cáncer esofageal, tomores del tracto biliar, al igual que cáncer de la cabeza y el cuello.. Un mamífero con un "cáncer resistente al inhibidor de HER" es aquel que ha progresado mientrs recibe la terapia basada en el inhibidor de HER (es decir, el paciente es "resístete al inhibidor de HER") o el mamífero ha progresado dentro de 12 meses (por ejemplo, dentro e 6 mess) después de completar el régimen de la terapia basada en el inhibidor de HER. La terapia basada en el inhibidor de HER incluye la terapia con el inhibidor de HER solo o conjugado, donde este inhibidor de HER se administra como un solo agente o en combinación con otras drogas anti-trumor. El inhibidor de HER puede ser el trastuzumab, pertuzumab, cetuximab, ABX-EGF, EMD7200, gefitinib, erlotinib, CP724714, C11933, GW572016, I C-11F8 o TAK165, pero preferiblemente el trstuzumab. Un "mamífero", para fines de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificaado como un mamiero, que incluye los humanos y animales domésticos y de rancho, y animales del zoológico, deportes o mascotas, tal como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano . Una muestra de tumor aquí es una muestra derivada de o que comprende células d etumor de, un tumor s de un paciente. Ejemplos de muestras de tumor aquí incluyen, pero no se limitan a, biopsias de tumor, células de tumor circulantes, proteínas de plasma circulantes, fluido asacítico, cultivos de células primarias o líneas celulares derivadas de tumores o que exhiben propiedades de tipo tumor, al igual que muestras de tumor preservadas, tal como muestrazas de tumores incrustadas en parafina, fijas en formaldehído o muestras de tumor congeladas. Una muestra de tumor fija es aquella que se ha presevado histológicamente usando un fijador. Una muestra de tumor fija en formalina es aquella que se ha preservado usando el formaldehído como el fijador. Una muestra de tumor incrustada es aquella rodeada por una medio firme y generalmente duro, tal como la parafina, cera, celoidina o una resina. La incrustación hace posible recortar secciones delgadas para el examen microscópico o para la generación de microarreglos de tejidos (TMAs) . Una muestra de tumor incrustada en parafina es aquella rodeada por una mezcla purificada de hidrocarburos sólidos derivados del petróleo. Aquí, una muestra de tumor congelada se refiere a una muestra de tumor la cual está, o se ha congelado. Un "agente inhibidor del crecimiento" , cuando se usa aquí, se refiere a un ompuesto o composición el cual inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que expresa HER. Ualquiera de in vi tro o in vivo. Así, el agente inhibidor del crecimiento puede ser una que reduzca significantemente el porcentaje de células que represan HER en la fase S. Ejemplos de agentes que inhiben el crecimiento incluyen los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un sitio diferente de la fase S) , tal como agentes que inducen la detención de la Fase Gl o la fase M. Bloqueadores clásicos de la fse M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topo II, tal como la doxorubicina , epirubicina, daunorubicina , etoposido y bleomicina. Esos agentes que detienen Gl también tienen influencia sobre la detención de la fase S, por ejemplo, agentes de alquilación del ADN, tal como el tamoxifen, prednisona, dacarbaxina, mecloretamina , cisplatina, metotrexato, 5 - fluorouraacilo y ara-C. Información adicional puede encontrarse en La Base Molecular del Cáncer, Mendelsohn e Israerl, Eds . Capítulo 1, intitulada "Eegulación dei ciclo celular, oncógenos y drogas antineoplásticas" por Murakami et al (WB Saunders, Philadelphia , 1995), especialmente, p. 13. Ejemplos de anticuerpos inhibidores del crecimiento son aquellos que se unen a HER2 e inhiben el crecimiento de las células del cáncer que sobreexpresan HER2. Anticuerpos de HER2 Inhibidores del crecimiento preferidos, inhiben el crecimiento de células del tumor del pecho SK-BR-3, en cultivos celulares, por más del 20%, preferiblemente por más del 50% (por ejemplo de alrededor del 50% a alrededor del 200%) , en una concentración del anticuerpo de alrededor de 0.5 a 30 µG?/ml , donde la inhibición del crecimiento se determina seis días después de la exposición de las células SK-BR-3 Al anticuerpo (véase la patente US No. 5,677,171, expedida el 14 de octubre de 1997) . El ensayo de la inhibición del crecimiento celular de SK-BR-3 se describe en mayor detalle en esa patemnte y aquí abajo. El anticuerpo del inhibidor de crecimiento preferido es una variante humanizada del anticuerpo 4D5 monoclonal del murino, por ejemplo trastuzumab . Un anticuerpo que "induce la apoptosis" es aquel que induce la muerte celular programada, según se determina uniendo la anexina V, fragmentación del ADN, encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (llamadas cuerpos apoptóticos) . La célula es usualmente una que sobreexprese el receptor de HER2. Preferiblemente, la célula es una célula de tumor. Por ejemplo una célula del pecho, el ovario, estómago, endometrial, glándula alivar, pulmón, riñon, colon, tiroies, pancreática o de la vesícula. In vi tro, la célula puee ser una SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA.MB-453 , MDA-MB-361 o SK0V3. Varios métodos están disponibles para evaluar los eventos celulres asociados con la apoptsosis. Por ejemplo, la traslocación de la serina de fosfatidilo (PS) puede ser medida por la unión de la anaexina la fragmentación del D puede ser evaluada a través de la inclinación del aDN; y la condensación nuclear/cromalina junto con la fragmentación del ADN, puede ser evaluada por cualquier aumento en las células hiodiploides . Preferiblemente, el anticuerpo, el cual induce la apoptosis es uno que resulta en alrededor de 2 a 50 veces, preferiblemente de 5 a 50 veces, y más preferiblemente de alrededor de 20 a 50 veces, la inducción de la unión de anexina, con relación a la célula no tratada en un ensayo de unión de la anexina, usando células BT474 (véase abajo) . Ejemplos de anticuerpos de HER2 que inducen la apoptosis son 7C2 y 7C3. El "epítope 2C4" es la región en el ldominio extracelular de HER2 al cual se une el anticuerpo 2C4. Con el fin de clasificar los antiuerpos que se unen al rpítope 2C4, un ensayo de rutina de bloque cruzado, tal como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labortory, Ed . Harlow y David Lañe (1888) puede realizarse. Preferiblemente, los bloques de anticuerpo de unión a HER2 por alrededor del 50% o más. Alternatvament , el mapa de epítopes se puede realizar para evaluar si el anticuerpo se une al epítope de 2C4 de HER2. El epítope 2C4 comprende residuos del Dominio II en el dominio extracelular de HER2. 2C4 y pertuzumab se unen al dominio extracelular de HER2 en la junta e los dominios I, II y III. Franklin et al., Cáncer Cell 5 : 317-328 (2004) . El "epítope 445" es la región en el dominio extracelular de HER2 a la cual el anticuerpo 4D5 (ATCC CR 10463) y trastuzumab se unen. Este epítope está cerca del dominio de la transmembrana de HER2 , y dentro del Dominio IV de HER2. Para clasificar los anticuerpos que se unen al epítope 4D5,un ensayo de rutina de bloque cruzado, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labortory, Ed. Harlow y David Lañe (1888) puede realizarse. Lternativamente el mapa del epítope se puede realizar para evaluar si el anticuerpo se une al epítope 4D5 de HER2 (por ejemplo por cualquiera de uno o más residuos en la región desde alrededor del residuo 529 a alrededor el residuo 625, inclusive del HER2 ECO, numeración de residuo incluyendo el péptido de señal) . El "epítope 7C2/7F3" es la región en ela Terminal N, dentro del Dominio I, del dominio extracelular de HER2 a la cual los anticuerpos 7C2 y/o 7Fw (cada uno depositadoo con AT, vése abajo) se unen. Para clasificar los anticuerpos que se unen al epítope 7C2/7F3,un ensayo de rutina de bloque cruzado, tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labortory, Ed. Harlow y David Lañe (1888) puede realizarse. Alternativamente el mapa del epítope se puede realizar para evaluar si el anticuerpo se une al epítope /c2/7F3 en HER2 (por ejemplo por cualquiera de uno o más residuos en la región desde alrededor del residuo 22 a alrededor del residuo 53 del residuo HER2 ECD529 a alrededor el residuo 625, inclusive del HER2 ECO, numeración de residuo incluyendo el péptido de señal) . El "tratamiento" , se refiere a tanto el tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas. Aquellos que necesitan un tratamiento incluyen los que ya tienen la enfermedad al igual que aquellos en que la enfermedad se va a prevenir.. Así el paciente que se va a tratar aquí puede haber sido diagnosticado como teniendo la enfermedad o puede estar predispuesto o susceptible a la enfermedad. El término de "cantidad efectiva" se refiere a una cantida de una droga efectiva para tratar el cáncer en el paciente. La cantidad efectiva de la droga puede reducir el número de células cancerosas, reducir el tamaño del tumor, inhibir (es decir, disminuir, en alguna extensión, y preferiblemente detener) la infiltración de células del cáncer en órganos periféricos; inhibir (es decir, disminuir en alguna extensión y preferiblemente detene) la metástasis del tumor; inhibir, en alguna extensión, el crecimiento el tumor y/o aliviar, en alguna extensión, uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la extensión que la droga puede prevenir el crecimiento y/o la destrucción de las células del cáncer existentes, puede ser citostática y/o citotóxica. La cantidad efectiva puede extender la progresión de la supervivencia libre, resultar en una respuesta objetivo (que incluye una respuesta parcial, PR o respuesta completa, CR) , aumentar el tiempo general se supervivencia y/o mejorar uno o más de los síntomas del cáncer. Por respuesta completa o remisión completa, se intenta la desaparición de todos los signos del cáncer en respuesta al tratamiento. Esto no siempre significa que el cáncer se ha curado. La respuesta parcial se refiere a una disminución en el tamaño de uno o más tumores o lesiones, o en la extensión del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento .
El término de "agente citotóxico" , según se usa aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término se intenta incluyendo los isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I 131 , I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) . Los agentes quimioterapéuticos , y toxinas, tal como las tioxinas de moléculas pequeñas o toxinas activas enzimáticamente de bacterias, hongos, de origen de plantas o animal, que incluyen los fragmentos y/o sus variantes. Un "agente quimioterapéutico" útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen los agentes de alquilación, tal como thiotepa y cytoxan ciclofosfamida , sulfonatos de alquilo, tal como busulfan, improsulfan y piposulfan, aziridinas, tal como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas , que incluyen la altretamina, trietilenmelamina , trietilenfosforamida , trietilenetiofosforamida y trimetilolmelamina ; tlk 286 (telcyta) , acetogenins (especialmente bulatacin y bulatacinona= , delta- 9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, marinol): beta- lapacona , lapacol, cochincinas, ácido betúlico, una canfotecina (que incluye el topotecan análgo sintético (hycamtin) , cpt-11 (irinotecan, camptosar) , acetilcamptotecina , escopolectin y 9 -aminocamptotecin) , briostatin, calistatin, cc-1065 (que incluye su adozelesin, carzlesin y análogos sintéticos del bizelesin) : podofilatoxina , ácido podofilínico, ; teniposida, criptoficinas (particularmente criptoficin 1 y criptoficin 8 ) , dolastyatina , duocarmicina (que incluye los análogos sintpéticos, KW-3289 y CB2 -TM1 ) , eleuterobin; pancratstatin, una sarcodictina , espongistatin; mostazas de nitrógeno, tal como clorambucil, cloronafazina , olofosfamida , estremustina , clorhidrato de óxido de mecloroetamina , metacloroetamina , melfalan, novembichin, nitrosureas, tal como carustina, clorozotocina , fotemustina, lomustina, nimustna y ranmnustina ; bifosfonatos tal como clodronato, antibióticos, tal como antibióticos de enedivna (por ejemplo calicheamicina, especialmente calicheamicina gamma 1) y calicheamicina omega 1 (véase, Agnew. Chem. Intl. Ed. Engl . 33; 183-186 (1994)) y antraciclinas , tal como annamicina, AD32, alcarubicina , daunorubicina , dexrazoxana, DS-51-1, epirubicina, GPX-100, idarubicina, KR 5500, meniogaril, dinemicina, que incluye la dinemicina A, una esperamicina , neocarzinostatina cromófora y cromóforos antibióticos de enedina de cloroproteína relacionados, aclacinomicinas , antinomicina, autoramicina , azaserina, bleomicinas, cactinomicina , carabicina, carminomicina , carzinofilina , cloromomicinis , dactinomicina, detorubicina , 6 -diazo- 5 -oxo-L norleucina, ADRIA YCIN doxorubicina (que incluye mofolino-doxofubicina , cianomorfolino-doxorubicin, 2-iyrrolino-doxorubicin, liposomal doxorubicin, y deoxidoxorubicin) , esorubicin, marcellomicin, mitomicins tall como mitomicin C, ácido micofenólico , nogalamicin, olivomicinas , peplomicin, potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, estreptonigrin, estreptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, y zorubicin; análogos del ácido fólic , tal como denopterin, pteropterin, y trimetrexato ; , análogos de la purina, tal como fludarabina, 6-mercaptopuriae, thiamiprina, y tioguanina; análogos de la pirimidine, tal como ancitabina azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina , doxifluridina , enocitabina, y floxuridina ; androgenes, tal como calusterona, dromostanolona-propionato epitioetanol , mepitiostano y testolactona , anti -adrenale tal como inoglutethimida mitotano y trilostano, repuestos de ácido fólico (leucovorin) ; aceglatona agentes de anti-neoplastic agents such as ALIMTA7 , LY231514 pemetrexado, inhibidores de reductasaa de dihidrofolato pemetrexado, tal como el methotrexata , anti -metabolitos tal comoel 5- fluorouracilo (5-FU) y sus prodrogas, tal como UFT, S-l y capecitabina , e inhibidores de timidilato y glycinamida inhibidores de ribonucleotido formiltransferase , tal como (TOMUDEXRM, TDX) ; raltitexado, inhibidores de dihidropirimidina- deshydrogenasa , tal como eniluracil; aldofosfamida glucóosido; ácido aminolevulínico ; amsacrina; bestrabucil ; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina ; diaziquona; elfornitina ; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tal como as maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona ; mopidanmol ; nitraerina; pentostatina ; fenameto; pirarubicina ; losoxantrona ; 2 -etilhidrazida ; procarbazina ; PSK complejo de polysacárido (JHS Natural Products, Eugene, O); razoxana; rhizoxina; sizofiran; espirogermanio ; ácido tenuazónico; triaziquona ; 2 , 2 ' , 2 " -triclorotrietilamina ; tricotecenas (especialmente T-2 toxina, verracurin A, roridin A y anguidina) ; urethano; vindesina (ELDISINE7 , FILDESIN) ; dacarbazina; mannomustina ; mitobronitol ; mitolactol ; pipobroman; gacytosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida ; tiotepa; taxoides y taxanos, e.g., TAX0L7 paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), AB AXANE™ libre de Cremóforo, formulación de nanopartículas de ingeniería de albúmina, de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y TAX0TERE7 docetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) ; cloranbucil; agente antimetabolito-quimioterapéutico, tal como la gemcitabina (GEMZAR7) , 5 - fluorouracil (5-FU) , capecitabina (XELODAJ) , 6-mercaptopurina, metotrexato, 6 -1ioguanina , pemetrexada, raltitrexada , arabinosilcitosine ARA-C citarabina (CYT0SAR-U7) , dacarbazina (DTIC-D0ME7 ) , azocitosina, desoxycitosina , piridmideno, fludarabina (FLUDARA7) , cladrabina, y 2 -deoxy-D-glucosa ; 6-thioguanina; mercaptopurina ; agente quimioterapéutico basado en el platino, tall como carboplatino , cisplatino,u oxaliplatino ; vinblastina (VELBA 7) ; etoposido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristine (0NC0VIN7) ; vinca alcaloide; vinorelbina (NAVELBINE7) ; novantrona; edatrexato; daunomicina ; aminopterina ; xeloda; ibandronata ,· topoisomerasa inhibitor RFS 2000; difluorometilornithina (DMFO) ; retinoides tal como el ácido retinóico, sales, ácidos o derivaados, aceptables farmacéutiamente , de cualquiera de los anteriors, al igual que combinaciones de dos o más de ellos, tal como CHOP, una abreviatura para la terapia combinada de la ciclofosfamida , doxorubicina , vincristina y prednisolona , y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina. Gualmente incluidos en esta definición están los agentes anti -hormonas , que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas en tumores, tal como los anti- estrógenos y moduladores del reeptor de estrógeno selectivo (SDERMs) , que incluyen, por ejemplo el tamoxifen (que comprende el NOLVADEX, tamoxifen), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON, inhibidores de toremifeno; aromatasae, que inhiben la aromatasa de enzima, la cual regula la producción del estrógeno en las glándulas adrenales, tal como, pot ejrmplo, 4 ( 5 ) -imidazoles , aminoglutetimida, MEGASE7 acetato de megestrol, AROMASIN7 exemestano, formestanie, fadrozol, RIVISOR7 vorozol, FEMARA7 letrozol, y ARIMIDEX7 anastrozol; y anti -andrógenos tal como la flutamida, nilutamida, bicalutamida , leuprolida, y goserelin; al igual que la troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolano-nucleósido-tirosina) oligonucleótidos antisentido. Particularmente aquellos que inhiben la expression de genes en las trayectorias de señalización implicadas en la proliferación celular abherante, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y el recepytor del factor de cecimiento epidermal (EGF-R) vacunas, tal como las vacunas de terapia de genes, por ejemplo la vacuna ALLOVECTIN, vacuna LEUVECTIN, y vacuna VAXID; PR0LEUKIN7 rIL-2; LURT0TECAN7 inhibidor de topoisomerasa ; ABARELIX7 rmRH; y sus sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores . Un agente anti -angiogénico se refiere a un compuesto el cual bloquea o interfiere, en algún grado, con el desarrllo de los vasos de la sangre. El factor anti-angiogénico puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña o anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o receptor del factor de crecimiento en promover la angiogénesis . El factor anti -angiogénico preferido aquí es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF ( tal como bevacizumab (AVSTIN) . El término de "citosina" es un término genérico para las proteínas liberas por una población de células, que actúan en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son las linfocinas, monoinas y las hormonas tradicionales de polipéptidos . Incluidas entre las citocinas están la hormona del crecimiento, tal como la hormona del crecimiento humana, hormona del crecimiento humana de N-metionilo y hormona del crecimiento del bovino; tiroxina de hormona paratiroide; insulina, proinsulina, relaxina, prorelaxina, hormonas de glicoproteínas , tal como la hormona que estimula los folículos (FSH) , hormona que estimula la tiroides (TSH) y hormona luinizante (LH) ; factor de crecimiento depático, factor de crecimiento de fiboblsto; prolactina, lactógeno placental; factor a y ß de necrosis de tumor, sustancia que inhibe la muleriana; péptido asociado con la gonadotropia del ratón; inhibina, activina, factor de crecimiento endotelial vascular, integrina, trombopoietina , (TPO; factores del crecimiento de nervios tal como NGF-ß, factor de crecimiento de piquetas, factores de crecimiento de transformación (TGFs) , tal como TGF-a y TGF-ß; factor I y II de crecimiento de tipo insulina; eritropoietna (EPO) , factores osteoinductivos ; interferonas , tal como la interferonaa, ß y ?; factores que estimula las colonias (CSFs) tal lcomo macrofagos-CSF (M-CSF) ; granulositos-macrofagos-CSF (GM-CSF) , y granulosito-CSF (G-CSF) ; interleucins (lis) , tal como IL-1 IL-?a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis de tumor, tal como TNF-oc o TNG-ß; y otros factores de polipéptidos que incluyen LIF y la ligadura de estuche (KL) . Según se usa aquí, el término de citosina incluye prote'nas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes activos biológicamente de citocinas de secuencias nativas. Según se usa aquí, el término de droga objetivo de EGFR se refiere a un agente terapéutico que se une al RGFR, opcionalmente , inhibe la aactivación del EGFR. Ejemplos de tales agentes incluyen los anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen al EGFR. Ejemplos de anticuerpos que se unen a EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506) , MAb 455 (ATCC CRL HB8507) , MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase la patente US Patent No. 4,943, 533, Mendelsohn et al.) y sus variants, tal lcomo quimerizadas 225 (C225 (ATCC CRL HB8507) (C225 o Cetuximab; ERBUTIX7) y humana reconfigurada 225 (H225) (véase WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, un anticuerpo objetivo de GFR completamente humano (Imclone) ; anticuerpos que se unen al mutante tipo II de EGFR (patente US No. 5,212,290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a RGFR, como se describen en la patente US No.. 5,212,290); anticuerpos humanizados que se unen a EGFR, tal como ABX-EGF (véase WO98/50433, Abgenix) ; EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cáncer 32A: 636-640 (1996) ) ; EMD7200 (matuzumab) a antiuerpo humanizado de EGFR dirigido contra EGFR, que compite con tanto EGF como TGF-alfa para la unión a EGFR, y mAB 806 o mAB 8006 humanizado (Johns et al., J. Biol.. Chem. 279(29); 30375-30384 (2004)). El anticuerpo anti-EGFR puede ser conjugado con un agente citotóxico, generando así un inmunoconjugado (vésaae, por ejemplo, EP659, 439a2, Merck Patent GmbH). Ejemplos de moléculas pequeñas que se unen a EGFR incluyen ZD1839 o Geftinib (IRESSA; Astra Zeneca) CP-358774 o Erlotinib (TARCEVAJ; Genentech/OSI ) ; y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen) ; EMD-7200. Un inhibidor de la cinasa de tirosina es una molécul que inhibe la actividad déla cinasa de tirosina de una cinasaa de tirosina, tal como un receptor de HER. Ejemplos de tales inhibidores incluyen las drogas objetivo de EGFR mencionadasa en el párrafo preceente; el inhibidor de cinasa de tirosina de HER2 de molécula pequeña, tal como TAK165, disponible de Takeda C-724, 714, un inhibidor selectivo oral de la cinasa del receptor de ErbB2 (Pfizer y OSI) , inhibidores de HER dobles, tal como EKB-560 (disponible de Wyeth) que se unen preferiblemente al inhibidor de cinasaa de tirosina de EFGR; PKI-166 (disponible de Novartis) , inhibidores de pan-HER tal como canertinib (CI-1033, Pharmacia), inhibuidores de Raf-1, tal como el agente antisentido SIS-5132 disponible de ISIS Pharmaceuticals , que inhiben la señalización Raf-1; inhibidores de TK objetvo no de HER, tal lcomo Imatinib-mesilato (Gleevac) disponible de Glaxo; inhibidor de la cinaaa I regulada extraelular de mapk, ci-1040 (DISPONIBLE DE Pharmacia) ; quinazolinas , tal lcomo PD 153035, 4- (3 -cloroanilino) , auinazolina ; pirimidopirimidinas ; pirimidopirimidinzas , pirrolopirimidinas , tal como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolopirimidines , 4 - ( fenylamino) -7H-pirrolo [2 , 3 -d] pirimidines ; curcumin (diferuloyl metano, 4,5-bis (4 -fluoroanilino) fthalimida) ; tirphostinas que contienen partes de nitrotiofeno ; PD-0183805 (Warner-Lamber) ; moléculas antisentido por ejemplo aquellas que se unen al ácido nucleico que codifica HER) quinoxalinas (patente US No. 5,804,396); trifostinas (patente US No. 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca) , PTK-797 (Novartis/Schering AG) ; inhibidores de pan-HER tal como CI-1033 (Pfizer) ; Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly) ; Imatinib mesylate (Gleevac; Novartis) ; PKI 166 (Novartis) ; GW2016 (Glaxo SmithKline) ; CI-1033 (Pfizer) ; EKB-569 (Wyeth) ; Semaxinib (Sugen) ; ZD6474 (AstraZeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-1C11 (Imclone) ; o como se describen en cualquiera de las siguientes publicaciones de patentes: US Patente No. 5,804,396; WO99/09016 (American Cyanimid) ; WO98/43960 (American Cyanamid) ; W097/38983 (Warner Lambert) ; WO99/06378 (Warner Lambert) ; WO99/06396 (Warner Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc) ; W096/33978 (Zeneca); W096/3397 (Zeneca) ; y WO96/33980 (Zeneca) M Inhibiciópn de la Difusión de HER2 La presente solicitud se refiere a un método para inhibir la difusión de la HER2 , que comprende traatar o exponer una célula que exprese una HER2 con o a un antagonista de una metaloproteasa de matriz (MMP, en una cantidad efectiva para inhibir la difusión de la HER2. Preferiblemente, el antagonista de MMP es un antagonista de MMP atado a la membrana (MT-MMP) tal como MT1-MMP (MMP.14), MT2-MMP (MMP-15) , MT3-MMP (MMP-16) , MT5-MMP (MMP-24) , MT4-MMP (MMP-17) , o MT6-MMP (MMP-25) . Más preferiblemente, el MT-MMP es el MMP-15, y convenientemente, el antagonista se une selective o preferiblemente al MMP-15 unirse significantemente a otras proteasaas al MMP-15, o MMPs ademása de la MMP-15, y/o el antagonista interfiere con la función proteolítica del MMP-15 sin interferir significantemente con la función de otraas proteasas o MMPs, además de la MMP-15.
En la modalidad preferida, las células tratadas exhiben la HER y/o expresión, amplifiación o activación de lae MMP. Por ejemplo, la célula puede exhibir la sobreexpresión o amplificación de la HER2 y/o MMP- 15. La actividad del antagonista de MMP puede ser aumentada por combinarlo con otras drogas anti-tumor. El inhibidor de la HER, o anticuerpo de HER2 (tal como trasstuzumab o pertzumab) . Ejemplos de inhibidores de ER que se pueden com, binar con el antagonista de MMP incluyen el trastuzumab, pertuzumab, cetuximab, ABX-EGF, EMD7200, gefitinib, erlotinib, CP724714, CI1033, G 572016, IMC-11F8, y TAK165. La invención también se refiere a un método para reducir el nivel del suero del dominio extracelular de la HER2 (en un mamífero, que comprende administrar un antagonista de la metaloproteasa de matriz (MMP) al mamífero, en una cantidad efectiva para reducir el nivel del suerpo de HER2 ECD en el mamífero. Este mamífero tiene un nivel de MMP opcionalmente elevado. La invención también suministra un métdo para tratar el cáncer en un mamífero, ete método comprende administrar un un antagonista de la metaloproteasa de matriz (MMP) al mamífero rn uns cantidad efectiva para tratar el cáncer . Este cáncer puede exhibir la expresión, amplificación o activación de la HER y/o la MMP. Por ejemplo, el cáncer puede exhibir la sobreexpresion o amplificación de la HER2 o la MMP-15. En una modalidaad, el mamífero tratado tiene una difusión elevada del nivel del suerpo de la HER2 o un nivel elevaado de p96 HER2. Esta invención también se refiere a un método para tratar un cáncer resistente al inhibidor de GER en un mamífero, qu comprende administrar al mamífero un un antagonista de la metaloproteasa de matriz (MMP) , en una cantidad efectiva para tratar el cáncer. Por ejemplo, el mamífero puede ser resistente al anticuerpo de HER tal como el trastuzumab. También se proporciona un método para reducir el nivel de p96 HER2 en una célula, que comprende exponer la célula a un un antagonista de la metaloproteasa de matriz (MMP) , en una cantidad efectiva para reducir el nivel de HER2 del p95- . Se pueden usar varios antagonistas de la MMP, pero preferiblemente, el antagonista de la MMP es un inhibidor de molécula pequeña o un anticuerpo. Métodos para obtener anticuerpos, se describen abajo.
III. Production of Antibodies Sigue una descripción de técnicas ejemplares para la producción de anticuepros usados de acuerdo con la presente invención. El antígeno que se va a usar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del ant 'geno o una porción del mismo, que contiene el epítope deseado. Alternativamente, las células que expresan el antígeno en su superficie e célula (por ejemplo células NIH-373, transformadsa para sobreexpresar HER2 , o una línea celular de carcinoma, tal como células SK-BR-3, véase Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) pueden ser usadasa para generar anticuerpos. Otras formas de antígenos útiles para generar anticuerpos serán evidentes a los expertos en la técnica. (i) Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos ñpoliclonales son obtenidos preferiblemente en animáis por inyecciones múltiples subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un auxiliary. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína, que sea inmunogénica en las especies que se van a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa, albúmina de suero, tiroglobulina del bovino o inhibidor de tripsina de la soya, usando un agente bifuncional o derivatizador, por ejemplo, el éster de sulfosuccinimida de maleimidobenzoilo (conjugación a través de los residuos de la cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehío , anhídrido succínico, OCL2 o R1N=C=NR, donde R y Rl son grupos diferentes de alquilo. Los animnales se inmunizaan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos , o derivados, combinando, por ejemplo, 100 o 5 jig de la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes del auxiliary completo de Freund e inyectando la solución intradermalmente en múltiples sitios. Un mes después, los animáis son excitados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en el auxiliary completo de Freund, por la inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 díasa después, los animáis se sangraron y el suero se ensayó para el título de anticuerpo. Los animáis son impulsados hasta estabilizar el título. Preferiblemente,. El animal es impulsado con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrelazaiento . Los conjugados pueden también ser obtenidos en el cultivo de células recombinants , comoi fusions de proteína. Igualmente, el agregado de agents tal como el alumbre, es usado adecuadamente para aumentar la respuesta immune . ( ii ) Anticuerpos Monoclonales Varios métodos para obtener anticuerpos monoclonales aquí son adecuados en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos usando el método de hibridoma primero, descrito por Kohler et al., Nature, 256-495 (1975) por los métodos de ADN recombinantes (patente US No. 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón, u oitro anima huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describió antes, para desarrollar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos, que se unirán específicamente a la proteína, usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Estos linfocitos se fuñen con células de mieloma, usando un agente de fusión adecuado, tal como el polietilen-glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, onoclonal Antibodies: Principies y Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) .
Las células de hibridoma, así preparadas, se siembran y cecen eun un medio de cultivo adecuado, que contiene preferiblemente uno o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma padres sin fundir. Por ejemplo, si laas células de mieloma padres carecen de la enzima de hipoxantina guanina fosforibosil -transferasa (HGPRT o GPRT) el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá la hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , estaas sustancias previenen el crecimiento de lasa células deficientes de HGPRT. Células de mieloma preferidasa son aquéllas que funden eficientemente, soportan la producción estable de alto nmivel del anticuerpo, por las células seleccionadas que producen el anticuerpo, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre ellas, líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma del murino, tal como aquellas derivadas de MDPC-21 o MPC22, tumores del ratón disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y SP-2 o X63-Ag8-653 ccélulas disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las líneaas celulares de mieloma humano y heteromieloma del ratón-humano, también se han descrito paa la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J".
I wunol . , 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques y Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo, en el cual crecen las células de hibridoma, se ensayaron para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de uión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma es determinado por la inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) . La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinado por el análisis de Scatchand de Munson et al. Anal. Biochem. , 107:330 (1980). Después que las células de hibridoma se identificaron que producen antiuerpos de la especificidad deseada, afinidad y/o actividad, las lonas pueden ser subclonadas limitando los procedimientos de dilución y crecimiento, por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies y Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Medios de cultivo adecuados paa este propósito incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640 Además, las células de hibridoma pueden creer in vivo como tumores ascites en un animal . Los anticuepros monoclonales secretados por las subclonas, son separados adecuadamente del medio de cultivo, el fluido de ascites, o suero por procedimientos de purificación de anticuepros convencionales, tal como, por ejemlo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita , electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es un aislado listo y con secuencia, usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos qu son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas densas y ligeras de los anticuerpos del murino) . Las células de hibrodoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez, aisladdo el ADN puede ser colocado en los vectores de expresión, los cuales son luego transfectados en las células huésped, tal como las células de E. Colí, células COS e simio, células del Ovario del Hámster Chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera proteínas de anticuepro, para obtener la síntesis de anticuepros monoclonales en las células huésped recombanantes . Artículos de revisión en la expresión recombinante en bactrias del ADN que codifian el anticuepro incluyen Skerra et al., Curr . Opinión un Immunol . 5-256-262 (1992) y Plückthun, Immunol . , Revs , 130-151-188 (1992). En otra modalidad, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo, pueden ser aislados de las colecciones de fagos del anticuepro, generados usando las t'cnicas descritas en cCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991) describe el aislamiento de los anticuerpos del murino y humanos, respectivamente, usando colecciones de fagos. Publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuepros humanos (rango nM) de alta definida, por la mezcla de cadenzas (Mark et al., Bio/Tecnology 10:779-783 (1992), al igual que la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir colecciones de fagos muy grandes ( (Waterhouse et al., Nuc . Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternatvas viables para las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicional, para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El Y puee también ser modificaado , por ejemplo sustituyendo la secuencia de codifiación por dominios constants humanos de cadena pesadaa y cadena ligera, en lugar de las secuencias del murino análogas. U.S. Patent No. 4,816,567; y Morrison, et al., Proc . Nati Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o por la unión covalente a la secuencia que codifica la inmunoglobulina , toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no de nmunoglobulina . Típiamente , tales poipéptidos no de inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constants de un anticuerpo o ellos están sustituidos por los dominios variables de un sitio que ombina un antígeno de un anticuepro, para crear un anticuerpo bivalente quimérico, que comprende un ditio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio que combina el antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente, (iii) Anticuerpos Humanizados Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos, se han descrito en la técnia. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más resiuos de aminoácidos introducidos en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos, son a menudo referidos como de dominio variable de "importación" . La humanización puee ser realizada esencialmente siguiendo el método de inter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321-622-525(1096), Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), por ustituir las secuencias de la región hipervariable por laas secuencias correspondientes de un anticuepro humano. Por lo tanto, tales anticuerpos "humanizados! Son anticuerpos quiméricos ((U.S. Patent No. 4,816,567) en que sustancilmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuepros humanizados son típicamente anticuerpos humanos, en los cuales algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La selección de dominios variables humanos, de cadenzas tanto ligera como pesada, seráan usados en obtener los anticuerpos humanizados , y es muy importante para reducir la antigenicidad . De acuerdo con el método llamado el "major adaptado", 1 secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se clasifica contra toda la colección de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana, que es la más cercana a aquella el roedor, es luego aceptada como la región de armazón humana (FR) para el anticuepro humanizado (Sims et al., J. Immunol . 151.2296 (1993) hothia et al., J Mol .. Biol . 196-901 (1987)). Otro método usa una región de armazón particular, derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenzas ligera o pesada. El mismo armazón puede ser usado para varios diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al., Proc . Atl . Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol , 151-26.23 (1993). Es ademas importante que los anticuepros sean humanizados con retención de la alta afinidad paraa el entígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan por el proceso de análisis de las secuencias pares y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias padres y huamizadas. Estos modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnment disponibles y son amillares a los expertos en la técnica. Programas de computadora están disponibles, que ilustran y exhiben estructuras conformocionales tridimensionales probebles de secuencias de inmunoglobulina candidatos seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de los residuos que tienen influencia en la capacidad de que la inmunoglobulina se una al antígeno. En esta forma, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados desde el receptor e importar secuencias de modo que leí anticuerpo deseado característico, tal como la afinidad aumentada para los antígenos objetivo se logre. En general, los residuos de la región hipervariables son directa y más sustanialmente logrados en la influencia del unión del antígeno (iv) Anticuerpos Humanos Como una alternativa a la humanización, los anticuerpos humanos pueden ser generados. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, en la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos, en la ausencia de la producción de la inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homozigotica del gene (JH) de la región de uni'+on de la cadena pesada del anticuerpo, en ratones mutantes de la línes quimérica y germ, resulta en la inhibición completa de la producción del anticuepro endógeno. La transferencia del arreglo del gene de inmunoglobulina de la línea germ humana en tal ratón mutante de la línea germ, resultará en la producción de anticuerpos humanos en el reto del antígeno. Véase por ejemplo, Jakobovits et al., Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Inmuno., 7:33 (1993); y U.S. Patentes Nos. 5,591,669, 5, 589, 369 y 5, 545, 807. Alternativemente , la tecnología de exhibición de fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) puede ser usada para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, de los repertorios del gene de dominio variable (V) de la inmunoglobulina . De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo son clonados en el marco en cualquiera de un gene de proteína de recubrimiento mayor oo menor de un bacteriófago filmentoso, tal como M13 o fd, y exhibe como fragmentos del anticuerpo funcional rn la superficie de las partículas de fagos. Debido a que la particular filamentosa contiene una copia de Y de cordón sencillo del genoma fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gene que codiicael anticuepro, que exhibe esas propiedades. Así, el fago semeja algunasas de las propiedades de la célula B. El fago puede ser realizado en una variedd de formatos, para su revisión véase, por ejemplo Johnsn, Kevin S. Y Chiswell, David. J. Urrent Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias Fuentes de fragmentos del gene V pueden ser usadas para la exhibición del fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislado un arreglo diverso de anticuerpos de anti -oxazolona desde una colección combinatorial aleatoria pequeña de los genes V derivados del hazo de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados puede ser construido y los anticuerpos a un arreglo diverso de antígenos (que incluyen los auto-antígenos) pueden ser aislados esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). See, also, U.S. Patent Nos. 5, 565,332 y 5, 573 , 905. Como se discutió antes, los anticuerpos humanos pueden también ser gnerados por las células B activads in vitro (véanse las patentes US 5,567,610 y 5,229,275). os ANTICUERPOS DE HER HUMANOS SE DESCRIBEN EN LAS PATENTES US Nos 5,772,997 expedida el 30 de junio de 1998 y WO 97/00271 publiada el 3 de enero de 1997. v) Fragmentos de Anticuerpos Se han desarrollado varias técnicas paa la producción de fragmentos de anticuerpos, que comprenden una o más regiones de unión de entígenos . Tradicional ente, estos fragmentos se derivaron por medio de la digestión proteolítica de anticuerpos intactios (vése, por ejemplo, Mori oto eta . , Journal of Bioche ical y Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fraagmentos pueden ahora ser producidos directamente porcélulas huésped recombinants . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las colecciones de fagos de anticuerpos antes discutidas. Alternativamente, los fragmentos fab' -SH pueden ser recuperaos directamente de E.coli y acoplados auímicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)) . De acuerdo con otro aceramiento, los fragmentos F(ab')2, pueden ser aislados directaamente del cultivo de células huésped recombinante . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes al practicante experto. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) Véase WO 93/16185; U.S. Patent No. 5,571,894; y U.S. Patent No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo puede también ser un anticuerpo lineal, por ejemplo como se describe en la patente US 5,641,870 por ejemplo, Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecífióos o biespecífieos . (vi) Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dosepítopes diferentes. Anticuerpos ejemplares biespecíficos pueden unirse a dos diferentes epítopes de la proteína de HER2. Otros de tales anticuerpos pueden combinar con un sitio de unión de HER2 , con sitios de unión para EGFR, HER3 y/o HER4. Alternativamente, un brazo de HER2 puede ser combinado con un brazo el cual se une a una molécula de disparo en un leucocito, tal como una molécula receptyora de una célula T (por ejemplo CD2 ó CD3 ) o receptore de Fe para la IgG (FcyR) tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para así enfocar mecanismos de defensa celular a la célula que expresa HER22. Los anticuerpos biespecíficos pueden también ser usados paraa localizar agentes citotóxicos a células que exprean HER2. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión de HER2 y un brazo el cual se une al agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti . interferon- , vinca-alcaloide, cadena de ricina A, metotrexaato oel isótopo hapten radiactivo. Anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F/ab' )2) · La publicación O 96/16673 describe un anticuerpo HER2 /FCYRI I I biesspecífico y la U.S. Patente No. 5,837,234 revela un anticuerpo biespecífico HER2/FCYRI IDM1 (Osidem) . Un anticuerpo HER2/Fca biespecífico se muestra en WO98/02463. La U.S. Patente No. 5,821,337 enseña un anticuepro HER2/CD3 biespecífico. DX-210 es un HER2-FCYRIII Ab nbiespecífio . Métodos de obtener anticuerposbiespecífieos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerps biespecífieos de longitud completa se basaa en la co-expresión de dos parejas de cadena pesada y cadena ligera de la inmunoglobulina, donde laas dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)) . Debido ala clasificación aleatoria de lasa cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solamenttte una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace usualmente por pasos de cromatografía de afinidad, es más ben embarazosa y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) .
De acuerdo con un acercamiento diferente, los dominios de la variable anticuerpo con especificidades de unión deseadaas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fuñen a las secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina . Esta fusión es preferiblemente con un dominio constante de la caadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de lasa regiones CH2 y CH3 de bisagra. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina , se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organimso huésped adecuado. Esto proporciona mayor flexibilidad en ajustar las proporciones mutas de los tres fragmentos de polipéptidos en modalidades, cuando relaciones desiguales de lasa tres cadenas de polipéptidos, usadas en la construcción, proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificción para dos o todos las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión, cuando la expresión de al menos dos cadenaas de polipéptidos en relaciones iguales resultan en altos rendimientos o cuando lasa relaciones no son de significado particular . En una modalidad preferida de este acercamiento, los anticuerpos biespecificos se componen de uina cadena pesada híbrida de la inmunoglobulina , con una primera especificidaad de uión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha encontrado que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de la inmunoglobulina indeseaads, ya que la presencia de una cadena ligera de la inmunoglobulina en solamente la mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera fácil de separación. El acercamiento se revela en WO 94/04690. Par<a detalles ulteriores de la generación de anticuerpos biespecífieos , vése, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121 :210 (1986) . De acuerdo con otro acercamiento, descrito en la U.S. Patente No. 5,731,168, la interfaz entre una pareja de moléculasa de anticuerpo puede ser tratada para maximizar el porcentaje de heterodímeros , · los cuales se recuperan del cultivo de células recombinantes . La interfaz preferida comprende al menos parte del dominio de CH3 , de un dominio constante de anticuerpo. En este método, , una o más cadenas laterales de aminoácidos m'+as pequeñasa desde la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (por ejemplo la tirosina o triptófano) .
"Cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes, se crean en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo, reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes con pequeños (por ejemplo la alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos terminales indeseados, tal como los homodímeros . Anticuerpos biespecíficos incluyen los anticuerpos entrelazados o "heteroconj ugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a la avidina, el otro a la biotina. Talaes anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto a célulasa de sistemas inmunologios objetivo a las células indeseadas (U.S. Patente No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección de HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Anticuerpos Heteroconj ugados pueden ser obtenidos usando culquier método conveniente de entrelamiento . Agentes de entrelazamiento adecuados son bien conocidos en la técnica y se revelan en la U.S. Patente No. 4,676,980, junto con un número de técnics de entrelazamiento. Técnicas para generaar anticuerpos biespecífieos de fragmentos de anticuerpo se han descrito también en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecífieos pueden ser preparados usando enlaces uímicos . Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en qu los anticuerpos intactos son desdoblados proteolíticamente para generar fragmentos de F(ab')21. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente de complejo de tilo de arsenito de sodio, para estabilizar ditioles vecinales y prevenir la formación intermolecular de disulfuro. Los fragmentos de Fab' generados son luego convertidos a los derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB es luego reconvertido al Fab¿-tiol por reducción con la mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecífieos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectva de las enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab' -SH de E. Coli, los cuales pueden ser acoplados químicamente para formar anticuerpos biespecífieos . Shalaby et al., J. Exp . Med. 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento de Fab' fue secretado separadamente de E. Coli y sometido al acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. Este anticuerpo biespecífico, así formado, fue capaz de unirse a las células que sobreexpresan el receptor de HER2 y las células T humanas normales, al igual que disparaar la activdad lítica de los linfocitos citotoxicos humanos, contra objetivos de tumor del pecho humano . Varias técnicas para obtener y aislar fragmentos de anaticuerpos biespecífieos de cultivos celulares recombinantes taambién se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecífieos se han producido usando "cierres" de leucina. Kostelny et al., J. I unol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992) . Estos péptidos de cierres de leucina de las proteínas Fos y Jun, se enlazan a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos por fusión de gene. Los homod'meros de anticuerpos se reducen en la región de bisagra para formar monómeros y luego se re-oxidan para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método puede también ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionaado un mecanismo alternativo para obtener fragmentos de anticuerpo biespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador, el cual es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por lo tanto, los dominios VL y VH de un fragmento son forzados a emparejar con los dominios VL y VH complementarios, de otro fragmento, formando así los sitios de unión de dos antígenos. Otra estretegia para obtener fragmentos de anticueroo biespecíficos por el uso de dímeros Fv(sFV) de cadena sencilla también se han reportado. Véase Gruber et al., J. I munol . , 152:5368 (1994). Los anticuerpos con más de dos valencias son considerados. Por ejemplo, anticuerpos trisespecífieos pueden ser preparados. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). (vii) Otras modificaciones de secuencias de aminoácidos Se consideran modificaciones de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se preparan por introducir cambios de nucleótidos apropiados en elácido nucleico del anticuerpo, o por la síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se puede hacer para llegar a la construcción final, con la condiciónm que esta construcciónn final posea las características deseadas. Los ambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-translación del anticuerpo, tal como cambiando el número o posición de los ditios de glieosilación . Un méttodo útil de identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo, que son ubicaciones preferidas para la mutagpénesis , se llama la "mutagénesis de exploración de alanina" , como se describe por Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo se identifican (por ejemplo, residuos caargados, tal como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido neutral o cargado negativamente (más preferiblemente la alanina o poialanina) para efectuar la iteración de los aminoácidos con el antígeno. Esas ubicaciones de aminoácidos demostraron sensibilidad funcional a las susttuciones , kuego se refinan por introducir además otras variantes en o para los sitios de sustitución. Así, mientras el sitio para la introducción de una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminad, la naturaleza de la mutación de por sí no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se conduce la exploración o mutagénesis aleatoria de ala en el codón o región objetivo y las variantes del anticuerpo expresadas se clasifican en su actividad deseada. Ginserciones de secuencia de aminoácidos incluyen las fusiones de amino y/o terminal carboxilo que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, al igual que las inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen el anticuerpo con un residuo de metionilo en la terminal N, o el anticuerpo fundido al polipéptido citotóxico. Otras variantes de inerción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión de la terminal N o del anticuerpo a una enzima (por ejemplo para ADPT) o un polipéptido que aumenta la vida media del suero del anticuerpo .
Otro tipo de variante es la variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula del anticuerpo, reemplazada por un residuodiférente . Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hiervariables , pero las alteraciones FR son también consideradas . Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada del anticuepro, puede también ser sustituido generalmente con serina, para mejorar lka estabilidad oxidativa de la moléula y prevenir el entrelazamiento aberrante. A la inversa, los enlaces de cisteína pueden ser agregados al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente conde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpi, tal como un fragmento de Fv) . Un tipo particularmentte preferido de variante sustitucional implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo padre (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano) . Generalmente las variantes resultantes, seleccionadas paraca el desarrollo ulterior tendrán propiedades biológicas mejorads con relación al anticuerpo padre desde el cual ellas se generan. Una manera conveniente para generar tales variantes sustitucionales implica la maduración de afinidad usando la exhibición de fagos. En breve, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones de amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo, así generadaas, son exhibidas en una manera monovalente de las partículas de fago filamentosasa , como fusiones al producto de gene III de M13 empacado con cada partícula. Las variantes exhibidas de fago son luego clasificadsa para su actividad biológica (por ejemplo afinidad de unión) como se revela aquí. Con el fin de identificar los sitios de la región hipervariable candidato para la modificación, la mutagénesis de exploración de alanina puede ser realizada para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significantemente a la unión de antpígeno. Alternativa, o adicionalmente , puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo antígeno-anticuerpo , para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y la HER2 humana. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución, de acuerdo con lasa t+écnicas aquí elaboradas.
Una vez que tales variantes se generan, el panel de variantes se somete a la clasificación, según se describe aquí, y los anticuerpos con propiedaes superiores en uno o mása ensayos relevantes pueden ser seleccionadas para el desarrollo ulterior . Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón original de glicosilacion del anticuerpo, . Por alterar significa suprimir una o más partes de carbohidrato encontradas en el anticuepro, y/o agregar uno o más sitios de glicosilacion que no estén presentes en el antiuerpo . La glicosilacion de anticuerpos es típicamente o enlazada a N o enlazada a 0. El enlazado a N se refiere a la unión de la parte de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagin. Las secuencias de tripéptido de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido, excepto la prolina, son secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la parte de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilacion potencial. La glicosilacion O-enlazada se refiere a la unión de una de las azúcares de N-acetilgalactosamina , galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamínico , más comúnmente la serina o treonina, aunque la 5- hidroprolina o 5-hidroxilisina pueden también ser usadas .
La adición de los sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos que contiene una o más de las secuencias de tripéptido descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración puede también ser hecha por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación O-enlazados) . Cuando el anticuerpo comprende una región de Fe, el carbohidrato ahí unido puede ser alterado. Por ejemplo, anticuerpos con una estructura de carbohidrato madura, que carece de fucosa unida a una región de Fe del anticuerpo se describe en la Solicitud de Patente US No US 2003/0157108 Al, Presta, L. See also US 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co . , Ltd) . Los anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región Fe del anticuerpo, se reportaron en WO03/011878, Jean-Mairet et al. y US Patente No. 6,602,684, Umana et al. Los anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a una región de Fe del anticuepro, se reportaron en O97/30087, Patel et al. See, also, W098/58964 (Raju, S.) y W099/22764 (Raju, S.) que se refieren a anticuerpos con carbohidratos alterados unidos a su región Fe.
Puede ser conveniente modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función del efector, por ejemplo para así aumentar la citotoxicidad (ADCC) meiada por c'' elulas dependientes del antígeno y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede ser logrado introduciendo uno o mas sustituciones de aminoácido en la región de Fe del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente , los residuos de la cisteína pueden ser introducidos en la región de Fe, permitiendo así la formación de enlace de disulfuro entrecadena en esta región. El anticuerpo homodimérico , así generdo, puede tener una capacidad de internalizción mejorada y/o destrucción clular mediada por el complemento, aumentada y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Vvése Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con una actividad antitumor aumentada pueden también ser preparados usanado los entrelazamientos heterobifuncionales , como se describen en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativemente , un anticuerpo puede ser tratado el cual tenga regiones de Fe dobles y puede así tener una lisis de complemento aumentada y capacidades de AADCC . Vése Stevenson et al. Anti -Cáncer Drug Design 3:219-230 (1989). WO00/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con una función de ADCC mejorada en la presencia de células del efector humano, donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoácidos en su región de Fe. Preferiblemente, el anticuerpo con ADCC mejorado comprende sustituciones en las posiciones 208, 333 y/o 334 de la región de Fe. Preferibleente , la región de Fe alterada es una región de Fe de la IgGl humana, que comprende o consiste de sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones. Los anticuerpos con la unión de Clq alterada y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se describen en W099/51642, US Patent No. 6,194,551B1, US Patent No. 6,242, 195B1, US Patent No. 6,528,624B1 y US Patent No. 6,538,124 (Idusogie et al.) . Los anticuerpos comprenden una sustitución de aminoáciudo en una o más posiciones a aminoácidos 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de su región de Fe (usando la numeración Eu de los residuos de la región de Fe como en Kabat) . Para aumentar la vida media del suero del anticuerpo, uno puede incorporar un epítope de unión de receptor de salvamento en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) , como se describe en la patente US 5,739,277, por ejemplo. Según se usa aquí, el término de "epítope de unión del receptor de salvamentoO" se refiere a un epítope de la región de Fe de una molécula de la IgG (por ejemplo IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable del aumento en la vida media del suero in vivo de la molécula de IgG. Los anticuerpos con la unión mejoraa al receptor de Fe neonatal (FcRn) y vidas medís aumentadas, se describen en WO00/42072 (Presta, L.) y US2005/0014934A1 (Hinton et al.) . Estos anticuerpos comprenden una región de Fe con una o más sustituciones ahí, que mejoran la unión de la región de Fe a FcRn. Por ejemplo, la rgeión de Fe puee tener sustituciones en una o más de las posiciones 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 o 434 thereof (usando la numneración de Eu de los residuos de la región de Fe como en Kabat) . La región de Fe preferida que comprene la variante del anticuerpo con la unión FcRn mejorada, comprende ustituciones de aminoácidos en una, dos o tres de las posiciones 307, 380 y 434 de su región de Fe. Los anticuerpos de ingenie 'ria con tres o más (preferiblemente cuatro) sitios de unión de antígenofuncionales , son también considerados (Solicitud de Patente de US No. US2002/0004587 Al, Mi 11er et al.) . Las moléculas del ácido nucleico que codifican las variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo, se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnia. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que ocurren naturalmente) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dde sitio dirigido) , La mutagénesis de la PCR y la mutagénesis de cásete de una variante preparada antes o una versión no variante del anticuerpo. (viii) Inmunoconjugados La invención también pertenece a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico , toxina (por ejemplo una toxina de molécula pequeña o una toxina activa enzimát icamente de origen bacterial, f ngal , de planta o de animal, que incluyen fragmentos y/o sus variantes) o un isotipo radioactivo (es deir, un radioconj ugado) . Agentes quimioterapéut icos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tal como una calicheamicina , una maytensina (U.S. Patenet No. 5,208,020), un tricoteno y CC1065 son también considerados aquí . En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo se conjugó a una oo más moléculas de maytansina (por ejemplo alrededor de 1 a alrededor de 10 moléculas de maytansina por molécula de anticuerpo) . La maytansina puede, por ejemplo, ser convertida a May-SS-Me, que puede ser reducida a May-SH3 y reaccionada con el anticuerpo modificado ( (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) para generar un inmunoconj ugado de anticuerpo maytansinoide Otro inmunoconj ugado de interés comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. La familia de calicheamicina de antbióticos es capaz de producir rupturs del Y de cordón doble en las concentraciones sub-picomolares . Análogos estructurles de lia calcheamicina, que pueden sewr usados incluyen, pero no se limitan a ??1, OÍ21 , , N-acetil -??1 , PSAG y T1! (Hinman et al. Cáncer Research 53: 3336-3342 (1993) y Lode et al. Cáncer Research 58: 2925-2928 (1998)). Véase también, por ejemplo, las patentes de US Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; y 5,773,001 expresaamengte incorporadas aquí como referencia.
Las toxinas activas enzimáticamente y sus fragmentos, los cuales se pueden usar, incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no unidos de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina A cadena A de abrina, cadena A de modeccina, sarcina-alfa, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momardica charantia, curcin, crotin, inhibidor de officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin y los tricotecenos . Vése, po ejemplo WO 93/21232 publicada el 28 de octubre de 1993. La presente invención además considera un inmunoconj ugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o endonucleasa del ADN, tal lcomo una deoxyribonucleasa ; DNase) . Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de los anticuerpos de HER" radioconjugados . Ejemplos incluyen: At211, I131, I125, Y90, Re186 Re188, Sm153, Bi212, P32 y los isótopos radiactivos de Lu. Conjugados del anticuerpo y agente citotoxico pueden ser obtenidos usandouna variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales , tal como el propionato de N- succinimidyl -3 - (2 -pyridyldithiol ) (SPDP) , de succinimidyl -4 - (N-maleimidomethyl ) cyclohexane-1-carboxylate, iminothiolane (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como el adipimidato de dimetilo HC1) . Esteres activos (tal como el suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como el glutaraldehído) , compuestos de bis-azido (tal como el bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniumbenzooñp) -etiylenediamina) , diisocianatos (tal como el toliene 2 , 6 -diisocyanato) , y compuestos bis - fluoro-activos (tal como el 1 , 5 -difluoro-2 , 4 -dinitrobenzeno) . Por ejemplo , una inmunotoxina de ricina puede ser preparaa como se describió en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Ácido l-isothiocyanatobenzil-3-metiyldietilleno triaminepentaacético rotulado con carbono- 14 (MX-DTPA) es un agente de quelación ejemplar para la conjugación de radionucleótidos al anticuepro. Véase WO94/11026. El enlazador puede ser un enlazador que se puede desdoblar, que facilita la liberación de la droga citotoxica en la célula. Por ejemplo, un enlazador lábil al ácido, enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) se pueden usar.
Alternativemente , una proteína de fusión que comprende el anticuerpo yu el agente citotóxico pueden ser obtenidos, por ejemplo, por técnicas recombinantes o la síntesis de péptidos. Se consideran aquí otros inmunoconj ugados . Por ejemplo, el anticuerpo puede estar enlazado a uno de una variedd de polímeros no proteináceos , por ejemplo el polietilen-glicol , polipropilen-glycol , polioxialquilenos , o copolímeros del poliethilen-glicol y polipropilene-glycol. El anticuerpo también puede estar atrapado en microcápsulasa preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por la polimerización interfacial (por ejemplo, cápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas coloidales de entrega de droga (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículs y nanocápsulas) oen macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980). Los anticuerpos, aquí descritos, pueden tambi'pen ser formulados como inmunoliposomas . Liposomas que contienen el annicuerpo son preparados por métodos conocidos en el arte, tal como se describen en Epstein et al., Proc . Nati.
Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al . , Proc . Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); U.S. Patntes . Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicadas el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado se describen en U.S. Patente No. 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden ser generados por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lipidos que comprende la fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poros definido, para suministrar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos de Fav' del anticuerpo de la presente invención, pueden ser conjugados a los liposomas, como se describe en Martin et al. J. Biol . Chem. 257: 286-288 (1982) por vía de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido, opcionalmente , dentro del liposoma. Vésae Gabizon et al. J. National Cáncer Inst.81 (19) 1484 (1989) . iv. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS Lasa formulaciones terapéuticas de los antagonistas de la MMP, usados de acuerdo con la presente invención, se preparan para el almacenamiento mezclando un antagonista de la MMP, que tiene un grado deseado de pureza, con portadores aceptables farmacéuticamente, opcionale, excipientes o estabilizadores {Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed . (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores aceptables, ecipientes o estabilizadores son no tóxicos a los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen reguladores, tal como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, antioxidantes, que incluyen el ácido ascórbico, metionina, preservativos (tal como el cloruro de octadecildimetilbencil -amionio , cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico, parabens de alquilo, tal como 1 metil o propil -paraben ; catecol, resorcinol, ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol ) ; polipéptidos de bajo peso molecuylar (menos de aproximadamente 10 residuos) , proteínas, tal como la albúmina de suero, gelatina o polímeros hidrofílicos de inmunoglobulinas , tal como la polivinilpirrolidona, aminoácidos, tal como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , diacáridos y otros carbohidratos, que incluyen la glucosa, mañosa, o dextrinas; aagentes de quelación, tal como EDT, azúcares, tal lcomo la sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra- iones que forman sales, tal como el sodio; complejos de metales (por ejemplo complejos de Zn-proteínas) ; y/o agentes tensoactivos no iónicos, tal como TWEENJ, PLURONICSJ o polithylen-gliol (PEG) . Las formulaciones de anticuerpos liofilizados se describen en WO 96/04801, que se incorpora aquí expresamente como referencia. La formulación aquí puede también contener más de un compuesto activo, según sea necesario, para la indicación particular que se trata, preferiblemente esas con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Varias drogas, lass cuales se pueden combinar con el antagonista de la MMP, se describen en el método de tratamiento siguiente. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para los propósitos intentados. Los ingredientes activos pueden también ser contenidos en las microcápsulas preparadsa, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por la polimerización interfacial, por ejemplo, cápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina, y microcápsulas de metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de entrega de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas ) o en microempulsiones . Tales técnicas son reveladasa en Remington's Phar aceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. (1980) . Las preparaciones de liberación sostenida, pueden ser preparadass. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida inluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos, que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en la forma de artículos configurados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliéstres, hidrogeles (por ejemplo, poly (2 -hidroxiethyl -metacrilatp) , o poli(vinyl-alcohol)), polyláctidos (U.S. Pat . No. 3,773,919), copolímeros of ácido L-glutámico ? ethil -L-glutamato, ethylene-vinyl acétate no degradable, copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico no degradables , , tal como , LUPRON DEPOTJ (microesferas inyectables compuetas del copolímero de ácido láctico y ácido glicóico y el acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- (-) -3 -hidroxibutírico Las formulkacioneas que se van a usar para la administración in vivo, deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranes de filtración estériles .
Tratmiento Ejemplos de varios cánceres que se pueden tartar con el antagonista de MMP, se listann en la sección de definición anterior. La administración del antagonista de la MMP resultará en una mejora en los signos o síntomas del cáncer . El antagonista de la MMP se administra a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tal como la administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por la infusión ontinua, en un período de tiempo, por rutas intraamuscular, intraperitoneal , intracerebroespinal , subcutánea, intraa-auricular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica o por inhalación. Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosis del antagonista de la MMP dependerá del tipo de cáncer que se va a tratar, como se definió antes, la severidad y el curso del cáncer, si el anticuerpo se administra para fines de prevención o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo y la discreción del médico que atiende .
Mientras el antagonista de la MMP puede ser la únicaa droga anti-tumor administrada, el paciente se trata, opcionalmente , con una combinación del antagonista de la MMP y uno o más de otros agents anti-tumores . La administración combinada incluye la co-administración o la administraciónn concurrente, usando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y la administración consecutiva en cualquier orden, en que preferiblmente hay un período de tiempo mientras ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Así, el otro agente anti-tumor puede ser administrado antes de, o en seguida de, la administración del antagonista de la MMP. En esta modalidad, el tiempo entre al menos una administración del antagonista de la MMP y al menos una administración del otro agente anti-tumor, es preferiblemente de alrededor de 1 mes o menos, y más preferiblemente de alrededor de 2 semanas o menos. Alternativamente, el antagonista de la MMP y el otro agente anti-tumor son administrados concurrentemente al paciente, en una sola formulación o en formulaciones separadaas . El tratamiento con una combinación del antagonista de la MMP y el otro agente anti-tumor puede resultar en un beneficio sinergístico, o mayor que el aditivo, al paciente.
Ejemplos del segundo agente anti-tumor, que pueden ser combinados con el antagonista de la MMP, incluyen uno o más agentes quimioterapéuticos , un inhibidor de HER (por ejemplo, trastuzumab, pertuzumab, cetuximab, ABX-EGF, E D7200, gefitinib, erlotinib, CP724714, CI1033, GW572016, IMC-11F8, TAK165, etc) ; Raf y/o un inhibidor de ras (véase, por ejemplo WO 2003/86467); un anticuerpo de HER2 inhibidor del crecimiento, tal como el trasatuzumab, un inhibidor de la dimerización de HER, tal como Pentuzumab; un anticuerpo de HER2 , que induce apoptosis de una célula de sobreexpresion de HER2 , tal como 7C2 , 7F3 o variantes humanizadasde los mismos, un anticuerpo dirigido contra un antígeno asociado al tumor, tal como EGFR, HER3 , HER4 ; un compuesto anti -hormonal , por ejemplo un compuesto anti-estrógeno, tal como el tamoxifen, o un inhibidor de aromatasa, un cardioprotector (para prevenir o reducir cualquier disfuncion del miocardio asociada con la terapia) ; una citocina, una droga objetivo del EGFR (tal como TARCEVA7 , IRESSA7 o Cetuximab); un agente anti -angiogénico (especialmente el bevacizumab, vendido por Genentech bajo la marca comercial de AVASTIN) ; un inhibidor de la cinasaa d etirosina; un inhibidor de COX (por ejemplo, un inhibidor del CO-1 o Celecoxib (CELEBREX7) ; un inhibidor de la farnesil-transferase (por ejemplo, el Tipifarnib/ZARNESTRA7 R115777 disponible de Johnson y Johnson o Lonafarnib SCH66336 disponible de Schering-Plough) ; anticuerpo que se une a la proteína onofetal CA 125, tal como Oregovomab (MoAb B43.13); vacuna HER2 (tal como la vacuna HER2 AutoVac de Pharmexia, o la vacuna de proteína APC8024 de Dendreon, una vacuna del péptido de HER2 de GSK/Corixa) ; inyección de liposoma de doxorubicin HC1 (DOXIL®) ; inhibición de , tyal como topotecan, taxano, inhibidor de cinasa de tirosina doble de HER2 y EGFR, tal como lapatinib/GW572016 ; TÑK 186 Un medicamento que reduce la temperatura, tal como el aetaminofen, difenhidramina o meperidina; un factor del crecimiento hematopoiético , etc. Dosis adecuadas de cualquiera de los agentes coadministrados anteriores, son aquellas presentemente usadas y que pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el antagonista de la MMP. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sometido a la remoción quirúrgica de las células cancerosas y/o la terapia de radiación. Aparte de la administración de los antagonistas de la proteína de la MMP al paciente, la presente solicitud considera la administración de los antagonistas de la MMP por la terapia de genes. Véase, por ejemplo, WO96/07321 publicada el 14 de marzo de 1995, en relación al uso de la terapia de genes para gene4rar anticuerpos intracelulares . Existen dos acercaamientos principales para obtener el ácido nucleico contenido, opcionalmente , en un vector) en las células del paciente in vivo y ez vivo. Para la entrega in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente al paciente, usualmente en el sitio donde se requiere el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo se remueven lass células del paciente, el ácido nucleico se introduce en estas c+elulas aisladas y las células modificadas se administran al paciente, o directamente o, por ejemplo, encapsulado dentro de membranas porosas, que se implantan en el paciente (véaase, por ejemplo, las patentes US Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existen una variedad de técncias disponibles para introducir ácidos nucleicos en las células viables. Las técncias varían dependiendo si el ácido nucleico se transfiere en las células cultivadas in vitreo o in vivo, en oas células del huésped intentado. Técnicas adecuadas para la transferencia del ácio nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen el usso de liposomes, electroporación, microinj ectión, fusión de células, DEAE-dextrano, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector usado comúnmente para la entrega ex vivo del gene es un retrovirus. Las técnicas de transferencia del ácido nucleico in vivo, actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores virales (tal como el adenovirus, virus Herpes simplex I o virus adeno-asociados ; y sistemas basados en lípicos (lípidos útiles para la transferencia mediada de lípidos, del gene son DOTMA, DOPE y DC Choi, por ejemplo) . En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente del ácido nucleico con un agente qyue se dirige a las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, una ligadura para un reeptor en la célula objetivo, etc. Cuando se emplen liposomas, proteínas que se unen a la proteína de la membrana de la superficie elular, asociadas con la endocitosis, pueden ser usads para dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo sus proteínas o fragmentos de capsida trópicos para un tipo de céluila particular, , anticuerpos para proteínas que se someten a internalización en ciclos, y proteínas que se dirigen a la localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por el receptor se describe, por ejemplo por Wu et al., J. Biol . Chem. 262:4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 87:3410-3414 (1990) . Para una revisión de los protocolos de terapia del gene y marcar el gene, actualmente conocidos, véase Anderson et al., Science 256:808-813 (1992) . Véase también WO 93/25673 y las referencias ahí citadas.
VI: DEPÓSITO DE MATERIALES Las siguientes líneas celulares de hibridoma se han depositado en American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : Antibody Designation ATCC No. Deposit Date 7C2 ATCC HB-12215 Octubre 17, 1996 7F3 ATCC HB-12216 Octubrer 17, 1996 4D5 ATCC CRL 10463 Mayo 24, 1990 2C4 ATCC HB-12697 Abril 8, 1999 Otros detalles de la invención se ilustran por los siguientes Ejemplos no limitativos. Las exposiciones de todasa las citas en la especificación, se incorporan expresamente aquí como referencia.
EJEMPLO 1 Los siguientes ejemplos investigaron el papel de las metaloproteasasa de matriz (MMPs) en la difusión de HE2 MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo Celular y Transfecciones (Introducciones Todas las líneasa celulares, en este estudio, se obtuvieron de American Type Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células BT 474, MCF-7, y SKBR-3 se mantuvieron en DMEM : Ham' s F12 (50:50) de alta glucosa, supplementado con FBS y 2mM L-Glutamine al 10%, inactvado por calor. Las células Cos-7 se mantuvieron en DMEM de Alta lucosa suplementado con FBS y 2mM L-Glutamine al 10, inactivada por calor. Las líneas celulares se mantuvieron a 37°C en una incubadora humidificada , surtida con 5% de C. Las células BT 474 y SKBR-3 se transfirieron transitoriamente con contructores , como se describió por la electroporación, usando el equipo V, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (AMAXA™) AS CÉLULAS COS-7 SE TRANSFECTARON (INTRODUJERON) COMO SE DECRIBIÓ, USANDO LIPOFECTAMINE™ 2000 (Invitrogen) , de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Líneas del Tumor de Xenoinjerto del Ratón Fo4 y f2:1282 Las líneas Fo4 y f2:1282 se han descrito previamente (Finkle et al., Clin. Cáncer Res. 10: 2499-2511 (2004)) . Estas líneas se derivaaron de tumors primaries de un ratón transgénico MMTV HER2 y se pasaron en el cojín de grasa mamario del ratón FVB .
Inyecciones de GM6001 Los tumors Fo5 se transplantaron en ratones FVB y se permitieron crecer a un tamaño promedio 400-800 mm3 , antes de iniciar el estudio. La GM6001 (3 - [N-hidroxicarbomil] - [2R] -isobutilpropionil -L- triptofan metilamide) se obtuvo de Calbiochem y se reconstituyó en una pasta acuosa de carboximeticelulosa/0.9% PBS y se administró diariamente por inyección intraperitoneal a 100 mg/kg de peso corpóreo durante 3 días. Veinticuatro hors después del tercer día de inyección, los animáis se sacrificaron y se recogió el suero por punción cardiaca. El tamaño de los tumores se midióen el día 0 y el día 4. os tumores se removieron y se congelaron rápidamente para el análisis ulterior.
PREPARACIÓN DEL AR N Y ARREGLOS ADDYMTRIX El ARN total se aisló de las muestrss de tumor congelaas usando el equipo (Qiagen, Chatsworth, CA) . El AND genómico resisdual se removió por el tratamiento de DNAsa I (Roche Molecular Biochemicls) , Los experimentos se ejecutaron y analizaron como se describió previamente (Jin, H et al., Circulation 103:736-742 (2001)). Las muestras se hibridizaron para el arreglo sencillo del genoma del ratón ADDYMTRIX™ (MOE$#0O) y el areglo de genes conocidos (MOE430A) (AFFYMETRIX™, Inc., Santa Clara, CA. Los experimentos se hicieron en tres réplicas para tres Fo5 y tres muestrs de tumor f2:1281. Se realizó una comparación en parejas Mann-Whitney y esos genes con 70% se consideraron significantes. The GeneLogic Bioexpress Datábase (GeneLogic, Gaithersburg, MD) , una colección de datos de expression de genes del análisis de microarreglo AFFYMETRIX™ de las línes celulares y tejidos, se usó para examinar la expresión de las proteasas identificas de la clasificación diferencial de tumor Fo5- f2:1282 para la expresión de las líneas celulares SKBR-3 y BT 474.
HER2 ECD ELISA El suero de los ratones que tienen tumpores de xenoinjerto Fo5 o F2:1282 se recogió por unción cardiada y los niveles de HER2 ECD detectados usando el ensayo HER2 ELISA (Finkle et al. Clin. Cáncer Res. 10: 2499-2511 (2004)), previamente descrito. El suero se diluyó 1:50 usando el regulador de ensayo (PBS/0.5% BSA, 0.05% TWEEN® 20/10 ppm PROCLIN® 300/0.2% BGG/0.25% CHAPS/0.15 M NaCl/5mM EDTA (pH 7.4) seguido por diluciones adicionales en serie 1:2. El HED2 difundido se capturó usando un anticuerpo policlonal anti-HER2 de la cabra (Genentech) sobre placas NU C® Maxisorp y se detectó usando un anticuerpo poiclonal anti-HER del conejo conjugado de biotiona (Genentech) , seguido por un anticuerpo AMDEX™-estrepavidin- peroxidasa de rábano fuerte seguido por el procedimiento descrito previamente. (Sias et al., J. Immunol . Meth. 109:219-27 (1990)). Para los experimentos del cultivo cellular, las células se trataron como se indicó y medios acondicionados se recogieron y diluyeron en el regulador de ensayo en serie 1:2. La concentración de la HER2 difundida en el suero o en el medio aacondicionado , se determinó de un ajuste de cuatro parámetros de una curva estándar, usando la proteína HER2 ECD reombinante purificada (Genentech) como un estándar.
Onstructores de AND y Purificación de Proteínas La MMP-ql5 humana se clonó en pRK5 por la PC, usando una clona de oxígeno como un modelo. Una versión de longitud completa, etiquetada V5His terminal C, se generó por la PCR usando los aprests: 5 ' -GCCGAAGCTTGCCACCATGGGCAGCGACCCGAGCGCG-3 ' (SEQ ID NO. 9) y 5 ' -GCTGTCTAGAGTTCACCGTCCGTGCCAGTGCCACCTCCTCC-3 ' (SEQ ID NO. 10) y clonado en pcDNA3. lV5His . Una versión soluble de la MMP-145 que carece del dominio de transmembrana, se generó por la PCR, usando los aprestos : 5 ' -GCCGAAGCTTGCCACCATGGGCAGCGACCCGAGCGCG-3 ' (SEQ ID NO. 11) y 5 ' -GCTGTCTAGAGACCCACTCCTGCAGCGAGCG- 3 ' (SEQ ID NO. 12).
Un mutante muerto catalíticamente de la MMP-15 se generó sustituyendo un residuo de la alanina por la glutamina en el aminoácido 260 de la proteína madura por la mutagénesis dirigida de sitio. pRK5. gDHER2 -Fe (pRK5. gDHER2 - IgG) se generó por la PCR usando los aprestos : 5 ' -CGAGTCGACCTCGAGGCCAGCCCTCTGACGTCC- 3 ' (SEQ ID NO. 13) y 5 ' -GGCACGCGTCGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG-3 ' (SEQ ID NO. 14) y clonado en Xhol-Mlu digested pRK5. gDHER2 -Fe (Fitzpatrick et. al., FEBBS Lett. 431(1) :102-6 (1998)). Esto introdujo el sitio de desdoblamiento supuesto de HER2 identificado de HER2 ECD E purificado aislado del medio acondicionado de se SKBR-3 (Yuan et . al., Protein Expression y Purification 29:217-222 (2003) ) . Una versión turneda de gDHER2-Fc fue también generada, que contiene solamente el dominio IV de HER2 , usando los aprestos de la PCR : 5 ' -GGCCTCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAG-3 ' (SEQ ID NO. 15) y 5 ' -GGCACGCGTCGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG-3 ' (SEQ ID NO. 16). pRK5.HER3-Fc y pRK5.HER4-Fc se han descrito previamemnte (Fitzpatrick et al., FEBBS Lett. 431(1): 102-6 (1998)). Un epítope de BANDERA Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; (SEQ ID NO. 17)) se introdujo en la terminal N de pEK5. Las proteínas de fusión er-Fc se introujeron en 293 células y se purificaron del suero libre del medio acondicionado, como se describió previamente. (Fitzpatrick et. al., FEBBS Lett., 431(1) :102-6 (1998)). La proteína soluble MMP- 15V5HÍS y sMMP-15V5His (E260A) se generó del medio acondicionado de 293 células transíectadas treansitoriamennte , y purificadas usando la agarosa Ni-NTA, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Qiegen) .
DeErribado de ShARN de ta MMP-15 Se eveluaron varios diferentes shARN en la habilidad de reducir los niveles de proteína de la MMP-15, cuando se introducen en células. El shAR más efectivo dirigido contra la MMP-15 humana se encontró reconoce: bp 5 ' -CCACCATCTGACCTTTAGCTT-3 ' (SEQ ID NO. 18) que corresponde a nt 1396-1414 (GENBANK™ número de acceso NM_002428) . El ARNi a la MMP-15 se introdujo en los sitios BamHl-EcoRI del vector pSIREB (BD Biosciences) como oligos: 5' - GATCCGCCACCATCTGACCTTTAGCTTCAAGAGAGCTAAAGGTCAGATGGTGGTTTTTTGC TAGCG-3 ' (SEQ ID NO. 19) y 5' -AATTCGCTAGCAAAAAACCACCATCTGACCTTTAGCTCTCTTGAAGCTAAAGGTCAGATGG TGGCG-3 ' (SEQ ID NO. 20) El cual contiene un pasador interno para formar shRNA. Un shRNA to MMP-25 se compró de OPENBIOSYSTEMS™ . OS CONSTRUCTORES DE pSIREN shRNA o el vector solo, se introdujeron transitoriamente en células SKBR-3 y BT 474 usando el equipo V AMAXA™ , siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después de 48 horas, él medio acondicionado se recogió y ensayó para la difusión de HER2 por HER2 ELISA y las células se Usaron directamente sobre la placa usando el regulador 2xMuestra. MMP-15, HER2 de longitud completa y las proteínas p95 HER2 se detectaron por la mancha Western usando un anticuerpo anti-MMP-15 policlonal del conejo (Labvision cat . No. RB-1546-P) o el anticuerpo anti-HER2 monoclonal del ratón Ab-15 (Labvision, cat. no. MS-599-P0) .
Ensayo de desdoblamiento de HER2 in vitro La habilidad de las proteasas candidato para desdoblar HER2 ECD se determinó in vitro usando la proteína gDHER2-Fc purificada como un substrato. Los dominios catalíticos purificados de MT1-MMP (MMP-14) , MT2-MMP (MMP-15) , MT3-MMP (MMP-16) , MT4-MMP (MMP-19) , y MT5-MMP (MMP-25) se compraron de R&D sistems. Las proteínas purificaa se mezclaron con gDHER2 -Fe , u otras proteínas HER-Fc , como se describió en el regulador de ensayo (lOOmM Tris (pH=7.4) , 100 mM NaCl, 2.5 µ? ZnCl2, 10 mM CaCl2, 0.001% Brij35) en una relación de 1:100, substrato de enzima y se incubó a 37°C durante 20 minutos. Las reacciones se detuvieron usando un volumen igual de 2 vecs el regulador de muestra (Invitrogen) y se hirbvió por 5 minutos antes de cargar en un gel de bgradiente de tris-glicina de .1 4-20% (Invitrogen) . Las proteínas se visualizaron por teñido con el reactivo de tinte GEL CODE BLUE™ (Pierce cat . no . 24592) siguiendo las recomendaciones del fabricante. El sitio de desdoblamiento de MMP se determinó por la secuencia de proteínas de terminal N por la degradación Edman sutomática, usando un secuenciador de proteínas automático (Kishiyama, A., Anal. Chem. 72 (21) : 5431-6 (2000) ) .
Ensayos de Inmunoprecipitación y Mancha Western Las células os-7 se co- introduj eron con los constructors pRK5. Flag-HER2 y pcDNA3. MMP- 15 constructs o el vector solo pcDNA3.1 usando LIPOFECTAMINE™ 2000. Las células s dejaron recuperar durante 48 horas. Las células introducidas se enjuagaron con PBS y las células se rompieron en el regulador de lisis ( (1%TRIT0N X-100™, 50mMTris (pH=7.4), 150mM NaCl , lmM PMSF, l(^g/ml leupeptina, 10U/ml aprotinina, y 2mM Na2 04) . Los lisados se limpiaron del material insoluble por centrifugación y los niveles de proteína totales se determinaron usando un equipo de ensayo de proteína BCA (Pierce cat. No. 23339). Doscientos monogramas de la proteína cellular total se agregaron al regulaor de lisis a un volumen final de 1 mi y la Bandera-HE2 se inmunoprecipitó usando la anti -Bandera M2-agarosa o con el anticuerpo anti-MPP-15 complejado a la Protegía A/G agarosa .
Los complejos inmunes se lavaron dos veces con el regulador de lisis y se resuspendieron en el regulador de la muestra SDS y se hirvieron. Las muestras se separaron en un 4-12%. El gel de gradiente de tris-glicina (Invitrogen) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa . Las manchas se bloquearon en 5% BSA/TBST y se probaron con anticuerpos a cualquiera de MP-14 o HER2 , seguido por un anticuerpo secundario anti-retón o de conejo, conjugado de peroxidasa, como se describió. Las manchas se desarrollaron por quimioluminescencia aumentada (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) . Los tumores Fo5 y f2:1282 se resuspendieron en el regulador de lisis con inhibidores de protease y se homogeneizaron usando un POLYTRON TISSUEMIZER™ (PT2100) en hielo. Los Usados de tumor se limpiaron de material insoluble por centrifugaciónm y los niveles de proteínas totalaes se determinaron usando el equipo de ensayo de proteías BC . La HER2 se inmunoprecipitó de 1 mg de proteína total de al menos tres lissaados de tumor independientes, usandpo el anticuerpo Ab-15 monoclonal del ratón (Labvision, cat . no. MS-599-P0) en complejo con la Protein A/G sefaraose, durante la noche a 4°C. Se formaron pellas de los complejos por centrifugación, se lavaron dos veces con el revgulador de lisis y se resuspendieron en el regulador de muestra SDS y se hirvieron. Las muestras se separaron en 4-12% de gel de Tris-Glicina y se transfirieron a membraas de nitrocelulosa . Las manchas se sondearon con anticuerpo monoclonal del ratón Ab-18 y detectaron la HER2 fosforilada (Labvision, cat . no. MS-1072-P) o with Ab-15 (Labvsion cat. no., MS-599-P0). La expression de la MMP-14, MMP-15 y M P-25 se evaluó por la mancha Western de 50 ug de lisado de tumor desde 50 ug de BT 474, o MCF-7, o el lisado cellular SKBR-3 usando Ab-1 policlonal del conejo (Labvision cat no. RB-1544-P), para detectar la MMP-14, el Ab-1 policlonal el conejo (Oncogene Research Products cat. no. PC499) para detectar la MMP-25. El MARK activado (Cell Signaling Technology cat. no. 9101), PhosphoAkt Ser473 (Cell Signaling Technology cat. no. 9271), total Akt (Cell Signaling Technology cat. no. 9272), total Erk (Cell Signaling Technology cat. no. 9102, o phosphoHER3 (Cell Signaling Technology cat. no. 4791) se determineó por la mancha Western deof 50 µg del lisado cellular .
Ensayos de Proliferación Las células se sembraaron en placas de 96 pozos (Nunc) a una densida de 10*4 células por pozo en cuadruplicado y se dejaron adherir durante la nooche . Las células se trataron como se indicó, o se introdujeron como se indicó. En seguida de una incubación de 3 días. 25 µ? del reactivo de azul de Almar (Trek Diagnostic Systems, cat . no. 00-100) se agregaron a cada pozo, y se incubaron durante 3 horas más. as placas se leyeron en un fluorómetro con longitud de onda de excitación de 530 nm y longitud d onda de emisión de 590 nm, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La proliferación relativa a las células no estimulaas o de control se determinó como se describió previamente (Lewis et al., Cáncer Res. 56 (6) : 1457-65 (1996)).
RESULTADOS El ECD de la HER2 se difundió proteolíticamente desde las células del carcinoma del pecho en el cultivo y se han detectado en el suero de los pacientes con cáncer de pecho metastático, donde se asocian con una pobre prognosis clínica (Molina et al. Cáncer Res. 61: 4744-4749 (2001)). Sin embargo, el papel biológico de la diffusión de HER2 no es clara. Los experimentos aquí se llevaron a cabo con el fin de identificar la difusi (sheddasa) ón de la GER2 La identificación de la diffusion de la HER2 puede también ser importante ya que el trastuzumab se ha demostrado previamente inhibe la diffusion en las líneas celulares del carcinoma del pecho (Molina et al. Cáncer Res. 61:4744-4749 (2001)) . Consistente con los resultados eportados, el trstuzumab redujo la ifusión en las línesa de células BT 474 y SKBR 3 ddel cáncer del pecho, por más del 60%, a una concentración de 10 ig/ml (Figura 5, panel izquierdo) y redujo la proliferación celular en estas líneas de células por el 50% (Figura 5, panel derecho) . Un sistema de modelo animal, donde los tumors mamarios derivados del ratón transgénico MMTVHER2 (Finkle et al. Clin. Cáncer Res. 10:2499-2511 (2004)) se usó para identificar la diffusion de HER2. Este sistema de modelo de animal reprodujo diferentes niveles de difusión de HER2 en el suero y exhibió una sensibilidad diferencial al trastuzumab (Figura 6, panel derecho) . Esta diferenia en el nivel del suero HER2 también se correlacionó bien con la presencia de un fragmento de proteína inmunoprecipitado de tres lisados de células de tumor Fo5 independientes, que tienenun peso molecular aparente de 95 kD, consistente con el tamaño de p95 HER2 (Figura 6, panel izquierdo inferior) . Este fragmento está constitutivamente fosforilado en los lisados de células de tumor Fo5 , que indican que este fragmento puede tener actividad biológica en estos tumores. Los niveles aumentados de una difusión de HER2 pueden contribuir a la resistencia del trastuzumab de este línea, puesto que el epítope de trastuzumab se perdería por el desdoblamiento proteolítico (Cho et al. Nature 421: 756-760 (2003)). Puesto que la línea de tumor Fo5 difunde mayors niveles de HER2 y tiene altos niveles del fragmento de p95HER2, se usó el análisis de expression diferencial como un acercamiento para identificar las transcripciones que se regulan en forma aascendente en los tumors de Fo5 con relación a los tumors de f2:1282. El ARN se preparó de 3 muestrasa de tumor individuales de cualquiera de los tumors de Fo5 y f2:1282, con un tamaño promedio del tumor de 300-600 mm3. El ARN de cada muestra de tumor independiente se hibridizó en triplicado al chip de arreglo sencillo del genoma del ratón AFFYMETRIX™ (MOE430P) y el arreglo del gene conocido (MOE430A) . Una comparación emparejada de Mann-Whiney se realizó identificando 638 transcripciones regulads en forma ascendente en las muestras del tumor Fo . Puesto que las línesa celulares de BT 474 y SKBR-3 también difunden HER2 ECD en el medio acondicionado (Figura 5, panel izquierdo), esta lista se comparó a ranscripciones que expresan en ambas línes celulares, que usan la base de atos de Genelogic Bioexpress .
Este aceramiento se tomó para identificar la diffusion de HER2 , y se ilustra en la Figura 7. Con el' fin de estrechar el número de genes candidatos, el inhibidor de la metaloproteasa general G 6001 se usó para evaluar si la actividad de MMP juega un papel en regular la difusión de HER2. La dosis del GM5001, pero no su estereoisómero , inhiben dependientemente la difusión de HE2 en las células SKBR-3, como se determinó por HER2 ECD ELISA (Figura 8, panel izquierdo) . Este resultado es consistente con los reportes, publicados previamente, que el inhibidor BB-94 de la metalproteasa general inhibió la difusión de HER2 ECD en las líneas celulares del carcinoma del pecho (Codony-Servat et al. Cáncer Res . 59:1196-1201 (1999)). Timp-1, Timp-2 y Timp-3 son péptidos, que ocurren naturalmente, que regulan la actividad de la metaloproteasa (Overall y Lopez-Otin Nature Reviews Cáncer 2:657-672 (2002)). Agregando las Timp-1, Timp-2, o Timp-3 purificadasa al medio acondicionado de las células SKBR-3, a una concentración de 1 /xg/ml se redujeron los niveles de HER2 ED (Figura 8, panel derecho) . Sin embargo, la Timp-2 rdujo la diffusion de HER2 ECD más eficientemente (Figura 8, panel derecho) . La Timp-2 se conce inhibe eficientemente la subfamilia de MT-MMP de las metaloproteasas (Overall y Lopez-Otin Nature Reviews Cáncer 2:657-672 (2002)) . Estos datos sugieren que la proteasa responsable de la diffusion de HER2 en las células SKBR-3 y BT 474 es una metaloprotasa que reduce significantmente el número de candidatos identificados cd la clasifiación de bioinformática . Varios miembros de la familia de MT-MMP se exprean en las células SKBR-3 y BT 474 se basan en la baase de datos GENELOGIC™ Tanto MT2-MMP como T2-MMP son también expresadas en tumores de Fo5 de los datos del microarreglo AFFYMETRIX™ Para determinar si estas transcripciones se expresan, los tumores Fo5 y f2:1282 y los lisados de la línea celular del carcinoma del pecho se inmuno-mancharon con anticuerpos polic , lonales a estos MT-MMP3, que reconocen proteínas tanto humanas como del ratón (Figura 9) . Todas las lines celulares expresan lasa MMP-14, MMP-15, y MMP-25, en diferentes niveles. Mientrasa la MMP-24 se expresa en los lisados de células d etumor de tanto f2:1282 como Fo4 , la MMP-15 se expresó abundantemente en los lisados de tumores de For. Este resultado fue consistente con la comparación de Mann-Whitney, que indica un nivel 2 veces mayor de la MMP-15 se expresó en las célulasa epiteliales del tumor y no las células estromales rodeantes, los tumores Fo5 y f2:1282 se seccionaron y tiñeron con cualquiera del anticuerpo anti-HER2 (Dako) o un anticuerpo anti MP-15 (Ab-1) . Los tumores tanto f2:1292 como Fo5 expresan la HER2 , pero la MP-15 es expresada más abundantemente en los tumores de Fo5 que los tumores f2:1282. Los substratos para los miembros de las T-MPS, han sido tradicionalmente a través de las proteínas de matriz extracelular . Un ensayo bioquímico se ajustó para probar candidatos identificados de los datos del microarreglo para desdoblar la HER2 de longitud completa in vi tro. Este ensayo usa una proteína de fusión recombinante purificada como un substrato para las proteasaas candidato y consiste de epítope gD terminal N rotulado a HER2 ECD en el maro, con una cadena pesa da de Fe de la IgG humana. Varias diferentes proteínas se usaron en estos estudios. Los aminoácidos que contienen la gDHER2 (+) -IgG 2-656 of HER2 ECD (GenBank accesso AAA75493) y y los aminoácidos que contienen gDHER2 ( - ) - IgG 2-626 de HER2 ECD. La protína recombinante de gDHER2 ( + ) - IgG contiene una secuencia de yuxtamembrana que se ha mostrado previamente contienen un sitio de difusión de HER2 supuesto (PA/EQR/ASP; SEQ ID NO. 23) mientras 1 proteína gDHER2 ( - ) - IgG carece de esta (Yuan et al. Protein Expression y Purification 29:217-222 (2003)). Una versión truncada gDHER2 (+) -IgG fue también usada en este ensayo, gDHER2 (DIV) - IgG, que tiene solamente el dominio IV (DIV) de HER2 en el marco, con el Fe humano. Los dominios catalíticos purificados de MMP-14 MMP-15, MMP-16, MMP-19, y MMP-25 se incubaron con gDHER2 (DIV) - IgG durante 20 minutos. A 37°C. Todas las MT-MMPs , excepto MMP-14, desdoblan eficientemente el substrato de gDHER2 (DIV) - IgG (Fig. 13, panel izquierdo) Los productos de proteína desdoblados se cortan y forman secuencias de terminal N para identificar el sitio de desdoblamiento. Todas las cuatro MT-MMPs desdoblaron HER2 cerca del sitio de secuencia publicada (Yuan et al. Protein Expres ion y Purification 29: 217-222 (2003)) (Fig. 13, panel derecho) Las proteínas de fusión de HER2-Fo, que tienen la secuencia PINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPASPLTSIV (SEQ ID NO. 21) son substratos para estas cuatro MMPs in vitro (Figura 114) . Estos datos sugieren que la HER2 es un substrato para MMP-15. El reconocimiento del substrato de la MT-MMP puede ser influenciado por el dominio de la hemopexina (Overall y Lopez-Otin Nature Reviews Cáncer 2:657-672 (2002)). Una forma soluble de la MMP-15 con un epítope V5 His de terminal C, se expresó transitoriamente en 293 células y se purifeó de 293 medios acondicionados por la cromatografía de afinidad. Como se muestra en la Figura 15, esta forma soluble de la MMP-15 puee también desdoblar gDHER2 (+) -IgG in en ensayo de difusión in vitro.
Para determinar si la MMP-15 y ER2 pueden asociarse en la membrana, se realizaron ensayos de co-inmunoprecipitación, usando células os-7 introducidas transitoriamente. pRK5. FlagHER2 se co-transfectaron con cualquier vector, pcDNA3. MMP- 15V5His , pcDNA3. sMMP- 15V5His , o pcDNA3.MMP-15 (E26OA) . FlagHER2 se inmunoprecipitaron con una resina anti-FLAG (anti -BANDRRA) . La Figura 10 muestra que tanto la MMP-15 soluble como la mutante (E26A= muerta catalíticamente, pueden ser asociados con Flag-HER2. esto es consistente con la noción que la MMP-15 puede desdoblar HER2 en membranas, puesto que la versión de tipo silvestre de la proteasa, pcDNA3. MMP- 15V5His , remover+á la y un complejo de HER2-MMP no será co- inmunoprecipitado . Variantes de mutaciones y supresiones y empalmes del punto somático han identificado tumores mamarios de animales transgénicos MMTVHER2. (Siegel et al. EMBO J. 18:2149-2164 (1999)); y Finkle et al. Clin. Cáncer Res . 10:2499-2511 (2004)). Estas mutaciones ocurren más frecuentemente en el dominio extracelular de HER2 cercano al dominio de la transmembrana. La línea d etumor Fo4 tiene una supresión de cinco aminoácidos DLDDK (SEQ ID NO. 22) que está adyacente al sitio de desdoblamiento de HER2 , mientras la línea del tumor f2:1282 tiene una mutación de punto sencillo C para R (Figura 12. Eastas mutaciones no tienen influencia en la asociación de la MMP-15 (Figura 11) . Sin embargo, es possible que la proximidad de la supresión DLDDK (SEQ ID NO. 22) al sitio de desdoblamiento de HER2 MMP, pueda tener incluencia en la actividda enzimática de la proteasa. La inhibición del ARN (ARNi) es un método que puede regular en forma descendente la transcripción objetivo y los niveles de proteína. Para examinar el papel biológico de la MMP-15 en las células SKBR-3 y BT 474, se usó un constructor ARBi anti-MMP-15. Cuando se introduce en las células S-3 o BT-474, esta plasmida de expresión de shARN reduce los niveles de proteína endógenos de la MMP-15, en ambos tipos de células (Figura 17 en el panel superior izquierdo) . La transfección de esta shARN también reduce la antidad de p) 5 HER2 en ambas líneas de células (Figura 17, panel inferior izquierdo) . La pérdida de la proteína MMP-15 en ambas células reduce significantemente la difusión de HER2 ECD en ambas líneas (Figura 17, panel derecho) . Sin embargo, ninguna reducción significante en la difusión de HER2 ECD se observó cuando una shARNi a la MMP-26 se introduce en cualquier línea celular (Figura 17, panel derecho) . Estos experimentos sugieren fuertemente que la pérdida de la MMP-15 tiene efectos dramáticos en la difusión de HER2 ECD.
Reduciendo los niveles de proteína de a MMP15 por el AR i , también tiene efecto en los regímenes del crecimiento de las células SKBR-3 y BT 575 (Figura 18, panel izquierdo) . Este efecto es también duplicado por shAR i a la MMP-25. Esto sugiere que reduciendo la difusión de HER ECD también se regula hacia abajo la cantidad de las células p95 HER2 in BT 474 y SKBR-3, reduciendo así los regímenes de crecimiento de las células. Uando el constructr objetivo de gF p95 HER2 se introduce en estas línesa celulares, un aumento en los regímenes del crecimiento celular se detectó en ambos tipos de células con relación a laas células transfectads de control (Figura 18, panel izquierdo) . Este constructor está constitutvamente fosforilado y activa MAPK, cuando se introduce en las células Cos-7 en una manera independiente de la ligadura (Figura 16) . Sin embargo, este constructor debe aún heterodimerizarse con HER3 o EGFR con el fin de actvar Akt , trayectorias de señaliación consistentes con el estudio publicado previamente (Xia et al., Oncogene 23:646-653 (2004)). La sobreexpresión de gDp95HER2 en las células SKBR-3 no inhibe significantemente la inhibición del crecimiento mediado por traastuzumab, en estas células (Figura 18, panel derecho) .
Un acercamiento farmacológico se usó para determinar si la actividad de M P juega un papen el regular la difusión de HER2 y los niveles de p95 HE2 en los tumores de Fo5. Ratones FVB con tumores Fo5 , on un tamaño promedio de 400 a 600 mm3 , se inyectaron con GM6001 intraperitonealment , o con un vehículo de control, diariamente en el curso de tres días. En el día cuatro, el suero se recogió y ensayó para HER2 y ECD por ELISA, y los tumors se recogieron y pesaron. L HER2 se nmunoprecipito de los lisados de células de tumors y se ensayaron paa los niveles de p95 HER2 por la manha_Western . Los animales tratados con GM6001 mostraron una reducción significante en la cantidad del p05 HER2 , en comparación con los animales de control. (Figura 19, panel derecho) . Ls niveles de suero HER2 ECD se redujeron en los animales tratados tanto con el vehículo como con GB6001 (Figura 19, panel izquierdo) , sin embargo, se observó una mayor reducción en los animales tratados con GM6001.
SUMARIO Los experimentos anteriores demuestran que la metaloproteasa de matriz, MMP- 15, desdobla HER2 in vi tro, en un sitio que es consistente con el ECD purificado y difundido de las células SKBR3 , e interactúa con la HER2 de longitud completa. La reducción de los niveles de la MMP se correlaciona bien con la difusión reducida del receptor de HER2 y disminuye los niveles de proliferación basal en las líneas de células SKBR3 y BT474. El trastzumab parece inhibe la difusión del receptor de la HER2 por regular indirectamente la actividad de la MMP- 15, pero no compite con la MMP- 15 para la unión y desdoblamiento del substrato. La reducción de la difusión de la HER2 con un antagonista de la MMP, tal como un antagonista de la MMP- 15, representa un acercamiento terapéutico para tratar el cáncer, que incluye el cáncer resistente al trastuzumab.

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES Un método para inhibir la difusión de la HER2 , este método comprende tratar una célula de expresión de la HER2 con un antagonista e la metaloproteasa de matriz (MMP) , en una cantidad efectiva para inhibir dicha difusión de la HER2.
  2. El método de la reivindicación 1, en que el antagonista de la MMP es un antagonista de la MMP atado a la membrana (MT-MMP) .
  3. El método de la reivindicación 2, en que la MT-MPP se selecciona del grupo que consiste de la MMP- 15 (MT2-MMP), MMP-16 (MT3-MMP), MMP-24 (MT5-MMP), MMP-17 (MT4-MMP) , y MMP-25 (MT6-MMP) .
  4. El método de la reivindicación 3, en que la MT-MMP es la MMP-15.
  5. El método de la reivindicación 1, en que la célula exhibe la sobreexpresion, amplificación o actvación de la HER2.
  6. El método de la reivindicación 5, en que la célula exhibe la sobreexpresion o amplifiación de la HER2.
  7. El método de la reivindicación 1, que además comprende tratar la célula con un inhibidor de la HER.
  8. El método de la reivindicación 7, en que el inhibidor de la HER es un anticuerpo de la HER2.
  9. El método de la reivindicación 8, en que el anticuerpo de la HER2 es el trastuzumab o el pertuzumab .
  10. El método de la reivindicación 7, en que el inhibidor de la HER se selecciona del grupo que consiste del trastuzumab, pertuzumab, cetuximab, ABX-EGF, EMD7200, gefitinib, erlotinib, CP724714, CI1033, GW572016, IMC-11F8, y TAK165.
  11. Un método para reducir el nivel del suero del dominio extracelular de la HER2 en un mamífero, este método comprende administrar un antagonista de la metaloproteasa de matriz (MMP) al mamífero, en una cantidad efectiva para reducir el nivel del suero del HER2 ECD en este mamífero.
  12. El método de la reivindicación 11, en que el mamífero tiene un nivel de la MMP elevado.
  13. 13. El método para tratar el cáncer en un mamífero, este método comprende administar un antagonista de la metaloproteasa de matriz (MMP) al mamífero, en una cantidad efectiva para tratar el lcáncer.
  14. 14. El método de la reivindicación 13, en que el cáncer exhibe una expresión, amplificación o activación de la HER.
  15. 15. El método de la reivindicación 14, en que el cáncer exhibe una sobreexpresión o amplificación de la HER2.
  16. 16. El método de la reivindicación 133, en que el mamífero tiene un nivel del suero de la HER2 de difusión elevado o nivel de p95 HER2 elevaado.
  17. 17. Un método para tratar un CÁNCER resistente al inhibidor de la HER en un mamífero, este método comprende aministrar al mamífero un antagonista de la metaloproteasa de matriz (MMP) , en una cantidad efectiva para tratar el cáncer.
  18. 18. El método de la reivindicación 17, en que el inhibidor de la HER es el trastuzumab.
  19. 19. El método de para reducir el nivel de p95 HER en una célula, este método comprende exponer la célula a un antagonista de la metaloproteasa de matriz (MMP) , en una cantidad efectiva para reducir el nivel de p95 HER2. Un método de diagnóstico , que comprende evaluar la MMP- 15 (MT2-MMP) en una muestra de un paciente de cáncer, en que el nivel o actividad de la MMP- 15 elevado indica que el paciente tiene un nivel del p95 HER elevado o nivel de la HER2 difundida elevado, o tiene un pobre resultado clínico. El método de la reivindicación 20, en que el nivel de la MMP- 15 elevado indica que el paciente tiene un pobre resultado clínico.
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