PREVENCIÓN DE FORMACIÓN Y/O ESTABILIZACIÓN DE TROMBO El objeto de la presente invención es, en el aspecto más general, la prevención de la formación y/o estabilización de trombos (coágulos) arteriales o venosos tridimensionales En particular la presente invención se relaciona con el uso de cuando menos un anticuerpo y/o un inhibidor para inhibir la actividad de factor XII y prevenir la formación y/o la estabilización de bromos y crecimiento de trombo. También se relaciona con una formulación farmacéutica y el uso de factor XII como un agente anti-trombótico. El daño de pared de vaso dispara la adhesión y agregación repentina de plaquetas de sangre, seguida por la activación del sistema de coagulación de plasma y la formación de trombos que contienen fibrina, que ocluyen el sitio de daño. Estos eventos son cruciales para limitar la pérdida de sangre post-traumática, pero también pueden ocluir vasos enfermos conduciendo a isquemia e infarto de órganos vitales. En el modelo de catarata o cascada, la coagulación de sangre prosigue por una serie de reacciones que involucran la activación de zimógenos por proteólisis limitada que culmina en la generación fulminante de trombina, que convierte el fibrógeno de plasma en fibrina y activa
potencialmente las plaquetas. A su vez, las plaquetas adherentes de colágeno o fibrina facilitan la generación de trombina por varios órdenes de magnitud exponiendo la serina de fosfatidilo (PS) procoagulante en su superficie externa que propaga el ensamblado y activación de complejos de proteasa de coagulación y por interacción directa entre receptores de plaqueta y factores de coagulación. Existen dos trayectorias convergentes para coagulación que se disparan ya sea por componentes extrínsecos (pared de vaso) o intrínsecos (llevados por la sangre) del sistema vascular. La trayectoria "extrínseca" se inicia mediante el complejo de factor VII de plasma (FBI) con el factor de tejido (TF) de proteína de membrana integral, un cofactor de coagulación esencial que está ausente en la superficie luminal pero expresado fuertemente en capas subendoteliales del vaso. TF expresado en microvesículas circulantes podría también contribuir a propagación de trombo sosteniendo la generación de trombina sobre la superficie de plaquetas activas. La trayectoria de activación "intrínseca" o de contacto se inicia cuando el factor XII (FXII, factor Hageman) se pone en contacto a superficies negativamente cargadas en una reacción que involucra quininógeno de alto
peso molecular y calicreína de plasma. El FXII se puede activar mediante constituyentes macromoleculares de la matriz subendotelial tal como glicosaminoglicanos y colágenos, sulfáticos, nucleótidos y otros polianiones solubles o material no fisiológico tal como vidrio o polímeros. Uno de los activadores de contacto más potentes es caolín y esta reacción sirve como la base mecánica para la prueba de coagulación clínica principal, el tiempo de tromboplastina parcial (activada9 (PTT, Aptt) . En reacciones propagadas por plaquetas, FXII activado luego activa FXI y FXIa a su vez activa el factor IX. A pesar de su elevada potencia para inducir coagulación de sangre in vitro, el significado (pato) fisiológico de la trayectoria de coagulación intrínseca disparada por FXII se cuestiona por el hecho de que deficiencia hereditaria de FXII así como de quininógeno de alto peso molecular y calicreina de plasma no está asociado con complicaciones de sangrado. Junto con la observación que los humanos y ratones que carecen los constituyentes de trayectoria extrínsecas, tales como TF, FBI o factor IX, sufren de sangrado severo esto ha conducido a la hipótesis actual de que la formación de fibrina es in vivo exclusivamente iniciada por la cascada extrínseca (Mac man, N. (2004). El papel del factor de tejido en hemostasis,
trombosis, y desarrollo vascular. Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol. 24, 1015-1022). Como todos los mecanismo fisiológicos, la cascada de coagulación puede quedar activada inapropiada ente y resultar en la formación de tapones hemostáticos dentro de vasos sanguíneos. De esta manera, los vasos pueden quedar bloqueados y el suministro de sangre a órganos distantes limitado. Este proceso se conoce como tromboembolia y está asociado con alta mortalidad. Además, el uso de dispositivos prostéticos que están en contacto con sangre es severamente limitado debido a la activación de la cascada de coagulación y revestimiento de la superficie prostética, comprometiendo frecuentemente su función. Ejemplos de dichos dispositivos prostéticos son hemodializadores, circuitos de desviación cardiopulmonar, dispositivos y catéteres interiores. En los casos en donde estos dispositivos se usan, los anticoagulantes, tales como heparina, se usan para impedir que la fibrina se deposite sobre la superficie. Sin embargo, algunos parecientes son intolerantes de heparina, que pueden ocasionar trombocitopenia inducida por heparina (HIT) que resulta en agregación de plaqueta y trombosis que amenazan la vida. Además, un riesgo intrínseco de todos los anticoagulantes usados en clínicas es un riesgo aumentado
asociado de sangrado serio. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos tipos de anticoagulante que no esté asociado con dichas complicaciones y que se pueda usar en pacientes afectados o como concepto de terapia superior que impide la trombosis s tendencias de sangrado aumentadas. Por lo tanto, es evidente que todavía existe la necesidad de medicación mejorada para el tratamiento de profilaxis de trombosis y desórdenes similares. Por lo tanto, es un objeto de la presente invención satisfacer dicha necesidad. Durante más de cinco décadas se ha sabido que la deficiencia del factor XII de coagulación no está asociado con aumentos espontáneos o daño relacionado con complicaciones sangrantes (Ratnoff. O.D. y Colopy, J.E.
(1955) Un tratado hemorrágico familiar asociado con una deficiencia de fracción de promoción de coágulo de plasma. J. Clin Invest34, 603-13) . En realidad, aún cuando se presenta un aPTT patológico (una prueba de coagulación clínica que dirige la trayectoria intrínseca de coagulación) de humanos que son deficientes en FXII no sufren de sangrado anormal aún durante procedimientos quirúrgicos mayores (Colman, R. .
Hemostasis y Trombosis, Basic principies & clinical practice
(eds. Colman R.W., Hirsch, J., Mader V. J., Clowes A. ., &
George J. ) 103-122 (Lippincott Williams & Wilkins,
Philadelphia, 2001). En contraste, la deficiencia de FXII se había asociado con riesgo aumentado de trombosis venosa (Kuhli, C, Scharrer, II., Koch, F., Ohrloff, C. & Hattenback, L.O. (2004) deficiencia de factor XII: un factor de riesgo trombofílico para oclusión de vena retinal. Am. J. Ophthalmol. 137, 459-464., Halbmayer, W.M., Mannhalter, F., Feichtinger, C, Rubi, K. & Fischer, M. (1993) Deficiencia de Factor XII (factor de Hageman) : un factor de riesgo para desarrollo de tromboembolia. La incidencia de deficiencia de factor XII en pacientes después de tromboembolia venosa o arterial recurrente e infarto al miocardio. Wien. Med. Wochenschr. 143, 43-50). Los estudios y reportes de caso que soportan esta idea se refieren al caso de índice para deficiencia de FXII, Sr. John Hageman, quien murió de embolia pulmonar. La hipótesis que la deficiencia de FXII está asociada con un riesgo protoembólico aumentado se reta por una nueva evaluación reciente de varios reportes de caso que enlazan la deficiencia de FXII con trombosis (Girolami, A., Randi, M.L., Gavasso, S., Lo bardi, A.M. & Spiezia, F. (2004) Las Trombosis Venosas Ocasionales Vistas en Pacientes con Deficiencia de XVII Severa (Homozigosa) y Probablemente Debida a factores de Riesgo Asociados: Un estudio de Prevalencia en 21 Pacientes y Revisión de la Literatura. J.
Throm. Thrombolysis 17, 139-143) . En la mayoría de los casos los autores identificaron factores de riesgo protrombótico congénito o adquirios en combinación c deficiencia de factor FXII que podría sea responsable del evento trombótico independientemente de VXII. Los estudios epidemiológicos mayores que usan pacientes bien caracterizados (Koster, T., Rosendaal, F.R., Briet, E. & Vandenbroucke, J.P. (1994) factor de John Hageman y trombosis de vena profunda: Leiden Thrombophilia Study. Br. J. Haematol. 87, 422-424) y familias deficientes en FXII (Zeerleder, S., y col. (1999) Reevaluación de la incidencia de compilaciones tromboembólicas en dcia de factor XII congénita - un estudio en 73 sujetos de 14 familias suizas. Thromb. Haemost, 82, 1240-1246) indicó que o hay correlación de deficiencia de VXII y cualquier riesgo pro- o anti-trombótico . Sorprendentemente y en contraste con la creencia común de aquellos expertos en el ramo el solicitante a descubierto que la trayectoria de coagulación intrínseca impulsada por factor XII es esencial para la formación de trombo arterial en vivo pero no necesario para hemostasis específica de tejido normal. Inesperadamente, estos resultados cambian el concepto de larga duración de que la coagulación de sangre en vivo es exclusivamente mediada por
la trayectoria extrínseca y coloca el factor XII en una posición central en el proceso de formación patológica de trombo. Consecuentemente, el primero objeto de la invención es el uso de cuando menos un anticuerpo y/o por lo menos un hibidor para inhibir el factor XII e impedir la formación y/o estabilización de trombos arteriales o venosos tridimensionales. El inhibidor respectivo de anticuerpo contra FXII por la presente puede funcionar de manera de inhibir la activación de FXII y/o interferir con otras porciones de la molécula de FXII y están críticamente involucradas en la activación de FXII. Junto con el hecho de que la trayectoria intrínseca no se requiere para hemostasis, esto establece al factor XII como un a nueva meta promisoria para terapia antitrombótica poderosa. Además estos resultados son importantes para el desarrollo de agentes anti-FXII para controlar otros
(pato) mecanismos enlazados con sistema de contacto tales como inflamación, activación de complemento, fibrinolisis, angiogenesis y formación de quinino. Por lo tanto, la presente invención provee además el uso de dicho anticuerpo y/o inhibidor en el tratamiento o profilaxis de una condición o desorden relacionado con
formación de trombo arterial, es decir, ataque o infarto al miocardio, inflamación, activación de complemento, fibrinolisis, angiogenesis y/o enfermedades enlazadas con formación de quinina. Por lo tanto, la presente invención provee además el uso de dicho anticuerpo y/o inhibidor en el tratamiento o profilaxis de una condición o desorden relacionado con formación de bromo arterial, es decir, ataque o infarto al miocardio, inflamación, activación de complemento, fibrinolisis, angiogenesis y/o enfermedades enlazadas con formación de quinina patológica tales como choque hipotónico, edema incluyendo angioedema hereditaria, infecciones bacterianas, artritis, pancreatitis, o gota articular. En particular, el uso de cuando menos un anticuerpo anti-FXII (v.gr., como anticuerpo Fl (MoAb Fl, Rabón y col., Blood, 1995 Dic. 1 ; 86 ( 11 ): 4143-43) ) y/o el uso de cuando menos un inhibidor de proteasa para inhibir la formación de trombo impulsado por FXII está de conformidad con la presente invención . Es especialmente preferida el inhibidor de proteasa seleccionado de, por ejemplo, inhibidor AT III, inhibidor de enzima de conversión de angiotensia, inhibidor Cl, aprotinina, inhibidor de proteasa alfa-1, antidolor {(S)-l-
Carboxil-2-Feniletil } -Carbamoil-L-Arg-L-Val-Arginal) ) , acetato de Z-Pro-Prop-aldehído-dimetilo, DX 88 (Dyax Inc., 300 technology Square, Cambridge, MA 02139, EUA; citada en: William s A. , y Baird LG., Transfus Apheresis Sci. 2003 Dic. 29 (3):255-8), leupeptina, inhibidores de oligopeptidasa de prolilo tales como Fmoc-Ala-Pyr-CN, inhibidor detripsina de maíz, mutantes de inhibidores detripsina pancreática bovina, ecotina, YAP (proteína anticoagulante única de aleta amarilla) e inhibidor-V de tripsina Curcubita máxima, incluyendo isioinhibidores de Curcubita máxima. Consecuentemente, la presente invención provee el uso de dicho anticuerpo y/o inhibidor descrito en la presente en medicina; y también el uso de dicho anticuerpo y/o inhibidor en la fabricación de un medicamento. Por lo tanto, de conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende cuando menos un anticuerpo y/o un inhibidor, que es apropiado para inhibir el factor XII y que impide la formación y/o la estabilización de trombos arteriales o venosos tridimensionales. En particular, el anticuerpo utilizado para la formulación farmacéutica es un anticuerpo anti-FXII (v.gr., como anticuerpo Fl (MoAb Fl, Rabón y col., Blood. 1995 Dic
1; 86 (11) : 4134-43) ) , y el inhibidor es un inhibidor de proteasa, por ejemplo pero nolimitado a inhibidor AT III, inhibidor de enzima de conversión de angiotensia, inhibidor Cl, aprotinina, inhibidor de proteasa alfa-1, anticolor ( { (S) -l-Carboxi-2-Feniletil}-Carbamoil-L-Arg.L-Val-Arginal) , acetato de Z-Pro-Pro-aldehído-dimetilo, DX88 (Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, Ma 02139, EUA; citada en: williams. A., y Baird LG., Transfus Apheresis Sci. 2003 Dic: 29 (3):255-8), leupeptina, inhibidores de oligopeptidasa de prolilo tal como Fmoc-Ala-Pyr-CN, inhibidor de maíz-tripsina, mutantes de inhibidor de tripsina pancreática bovina, ecotina, YAP (proteína anticoagulante solo de aleta amarilla) e inhibirod-V de tripsina de cucúrbita máxima incluyendo isoinhibidores de Curcubita máxima. El anticuerpo también puede ser un fragmento del mismo o un mimético que retiene la actividad inhibitoria, por ejemplo análogos de Inhibidor de proteasa Kunitz dominio de proteína precursora de amiloide como se describe en la Patente de EUA 6,613,890 especialmente en las columnas 4 a 8. Otros inhiubidores apropiados pueden ser Hamadarina como se describe por Harahiko Isawa y col., en The Journal of Biological Chemistry, m Vol. 277, No. 31 (agosto 2, pág. 27651 - 276587, 2002) . Un Inhibidor de Tripsina de Maíz apropiado y
métodos de su producción se describen en Zhi-Yuan Chen y col., Applied and Environmental Microbiology, marzo de 1999, pág. 1320 - 1324 y referencia 19 citada ibide . Todas las referencias citadas se incorporan por referencia incluyendo su contenido total en esta solicitud. Ultima pero no menor, moléculas pequeñas aisladas por ejemplo a través de uso de inhibición de VXIIa respectiva de FXII como el ensayo en el que se basa la selección son parte de la invención, así como su uso respectivo descrito arriba o abajo. Estos inhibidores de FXIIa de molécula pequeña se podría diseñar sobre las bases de la estructura de cristal de FXII. Por lo tanto, varios dominios de FXII o la cadena de luz podría expresarse de manera recombinante en sistemas de expresión tales como E. Coli, levadura o células de mamífero. Luego la proteína se purifica y cristaliza usando procedimientos convencionales como se describe para el substrato FXI de FRXII (Jin L, y col. 82005) estructuras de cristal del dominio catalítico de FXIa en complejo con mutantes de ecotina revelan interacciones semejantes a substrato. J Biol. Chem. 280 (6) :4704-12. ) Alternativamente, los inhibidores de proteasa de serina de molécula pequeña se podrían incluir para estabilizar la estructura de FXII. Estas formulaciones que comprenden inhibidores de molécula pequeña de metas de
proteína, que pueden, por ejemplo, ser guiadas por diseño por cristales de estas proteínas de meta, son bien conocidas en el ramo e incluyen formulaciones farmacéuticas que, por ejemplo, se pueden administrar a un paciente sistémicamente, tal como parenteral, u oral o tópicamente. El término "parenteral" como se utiliza en la presente incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-arterial e intra-traqueal, instilación, aplicación de rociadura y técnicas de infusión. Las formulaciones parenterales de preferencia se administran intravenosamente, ya sea en forma de bolo o como una infusión constante, o subcutáneamente, de conformidad con procedimientos conocidos. Los portadores líquidos preferidos, que son bien conocidos para uso parenteral, incluyen agua estéril, salina, dextrosa acuosa, soluciones de azúcar, etanol, glicoles y aceites. Las tabletas y cápsulas para administración oral pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, rellenos, lubricantes y agentes humectantes, etc. Las preparaciones líquidas orales pueden estar en la forma de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes, elíxires o lo semejante, o se pueden presentar como un producto seco para reconstitución con agua
u otro vehículo apropiado para uso. Estas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales, tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservadores. Las formulaciones apropiadas para aplicación tópica pueden estar en la forma de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, geles, o, de preferencia, ungüentos en emulsión. Las formulaciones útiles para aplicación de rociadura pueden estar en la forma de un líquido rociable o un polvo seco. De conformidad con un tercer aspecto de la presente invención, el uso de factor XII como un blanco antitrombótico inhbiendo del factor XII por cuando menos un anticuerpo y/o un inhibidor e impedir por lo tanto la formación y/o la estabilización de trombos tridimensionales en el vaso se proporciona . La naturaleza, beneficio y particularidades adicionales de la presente invención se hacen aparentes de la siguiente descripción detallada de los experimentos realizados y sus resultados cuando se lee en conjunción con las figuras que se acompañan abajo descritas. Se utilizaron ratones deficientes en factor XII para analizar la función de la cascada de coagulación
intrínseca en hemostasis y trombosis. La microscopía de fluorescencia intravital y mediciones de flujo ultrasónico revelaron un defecto severo en la formación y estabilización de trombos tridimensionales en diferentes ramificaciones arteriales del sistema vascular. La resonstitución de los ratones mutantes con factor XII humano restauró la trayectoria de coagulación intrínseca in vitro y la formación de trombo arterial en vivo. De manera mecánica, la actividad procoagulante en la trayectoria intrínseca se promovió críticamente por plaquetas activadas. Estos resultados colocan la cascada de coagulación de sangre intrínseca inducida por FXII en una posición central en el proceso de formación de trombo arterial que liga la coagulación plasmática con agregación de plaqueta. La figura 1 descrita el análisis de coagulación de ratones deficientes en FXII: (A) Tiempos de sangrado de cola de ratones tipo salvado (n=12) y FXII-/- (n=ll) . Cada símbolo representa un individuo. (B) cuentas de sangre periférica en miles/ul y parámetros de coagulación global de FXIIU-/- y peso de ratones. Las abreviaturas son cuentas de sangre blanca (WBC) , tiempo de tromboplastina parcial activada
(aPPT) y tiempo de protrombina (PT) . Los valores proporcionan valores medios + SD de 10 ratones en cada genotipo. (C)
proteínas FXII de sistema de contacto, calicreina de plasma
(PK) y quininogeno de alto peso molecular (HK) sondeado en
0.3 ul peso y plasma de VXII-/- por manchado Western utilizando anticuerpos específicos. Una norma de peso molecular se proporciona en la izquierda. (D) Se determinaron tiempos de coagulación de reclacificación en plaqueta libre
(panel superior) y plasma rica en plaqueta (panel inferior) de C57BL/6 y 129sv peso, FXII-/-, FcR?-/- y ratones deficientes en integrina a2 después de la activación con caolín (columnas oscuras) o colágeno (columnas claras) . El efecto de JON/A se analizó en plasma C57BL/6 suplementada con 50 ug/ml de anticuerpo. Medios + STD de 6 experimentos se proporcionan. Figura 2. (A) mortalidad tromboembólica se observó después de la inyección intravenosa de colágeno (0.8 mg/kg) y epinefrina (60 ug/kg) . Todos los ratones tipo salvaje murieron dentro de 5 minutos. Los animales que estuvieron vivos 30 minutos después del reto se consideraron sobrevivientes. (B) cuentas de plaqueta en control (n ¿ 19), FXII-/- (n = 14) y FcR?-/- (n = 5) raones 2 minutos des pues de infusión de colágeno/epinefrina. (C) plasma rica en plaqueta heparinizada de ratones tipo salvaje y FXII-/- se estimuló con colágeno (10 ug/ml) o ADP (5 uM) y la
transmisión de luz se registró en un agregómetro convencional. Los resultados mostrados son representativos de seis ratones por grupo. (D) secciones manchadas con hematoxilina/Eosina se pulmones de los ratones indicados 2 minutos después de inyección de colágeno/epinefrina. Los trombos por campo de vista se contaron en amplificación de 20 x. Las barras representan medios + SDT de 100 campos de vista. La Figura 3 describe la formación de trombo defectuosa en ratones que carecen de factor XII en vivo. La formación de trombo en vivo se supervisó en arteriolas mesentéricas mediante daño inducido con 20% de FeCI3. (A) Se detecta adhesión de plaqueta sencilla 5 minutos después de daños en todas las cepas de ratón, 7 a 8 minutos después del daño se observaron los primeros trombos en peso de ratón, mientras que en FXII-/- los primeros trombos ocurrieron 14 a 35 minutos después de daño y en FXI-/- 5 a 35 minutos después del daño. (B) Se observó formación de trombo en 100% de arterias mesentéricas en ratones tipo salvaje, pero solamenteen 50% de ratones de FXII-/- y en 44.4% de ratones de FXI-/-. (C) Los trombos formados en peso de ratones ocluyeron el vaso en promedio 25 minutos después del daño, mientras que los trombos formados en ratones deficientes en
FXII y FXI no condujo a oclusión. Cada símbolo representa una sola arteriola supervisada. (D) Imágenes representativas de un experimento. Figura 4. (A) Tipo salvaje (n=10) , FXII-/-(n= 10) y FXI-/- (n= 11) se analizaron en un modelo de oclusión arterial. La trombosis se indujo en la aorta por una compresión firme con un fórceps. El flujo de sangre se supervisó con una sonda de flujo ultrasónica perivascular hasta que la oclusión es completa. El experimento sedetuvo después de 40 minutos. Cada símbolo representa un individuo.
(B) Daño mecánico en la arteria carótida se indujo mediante un ligado. Después de la remoción del área de trombo de filamento en tipo salvaje (n = 10) y FXII-/- (n ¿ 10) se midióen um2. (C) Las fotomicrografías muestran imágenes representativas 2 minutos después del daño. La Figura 5 describe el defecto en formación de trombo en animales deficientes den FXII que se restaura mediante FXII humano. (A) Formación de trombo después de daño inducido con FeCl3 se obsevó en 100% de arterias mesentéricas en ratones tipo salvaje así como en ratones FXII-/-inyectados con FXII humano. (B) Los trombos formados ocluyeron el vaso en promedio 25 minutos después del daño en ratones tipo salve y en 22.7 minutos después del daño en
ratones FXII-/- inyectados con FXII humano. Cada símbolorepresenta un individuo. (C) Se muestran imágenes representativas. (D) ratones FXII-/- recibieron 2 mg/kg de hFXII-/- y la trombosis se indujo en la aorta mediante una compresión firme con un fórceps. El flujo de sangre se supervisó con una sondea de flujo ultrasónica perivascular hasta que se completa la oclusión. El experimento se detuvo después de 40 minutos. Cada símbolo representa un individuo. La Figura 6 describe los anticuerpos anti-FXII que inhiben formación de trombo en ratones en vivo. Ratones tipo salvaje recibieron 2 mg/kg de anticuerpos anti-FXII o IgG no inmune i.v.. Después de 15 minutos, se supervisó la formación de trombo en vivo en arteriolas mesentéricas después de daño inducido con 20% de FeCl3. (A) Se detecta la adhesión de plaqueta sencilla 5 minutos después del daño en ambos grupos. Después de 7 a 8 minutos los ratones de primeros trombos en ratones de control tratados con IgG se observaron, mientras que en ratones tratados con anti-FXII los primeros trombos ocurrieron 12 a 32 minutos después del daño. (B) La formación de trombo se observó en 100% de arterias mesentéricas en ratones de control, , pero solamente en 60% de ratones tratados con anti-FXII. (C) Se muestra el tiempo a oclusión completa. Cada símbolo representa un individuo.
La Figura 7 describe un modelo revisado de formación de trombo arterial. Inicialmente, en sitios de lesiones vasculares la formación de trombina se debe predominantemente a exposición de factor de tejido (TF) en la matriz subendotelial . TF en complejo con FBI inicia la trayectoria extrínseca de coagulación. En el sitio de daño, la contribución del FXII que impulsa la trayectoria intrínseca a través de VXI para generación de trombina (FII) es menor y omisible para hemostasis normal. Consecuentemente, los individuos con deficiencia en FXII no sufren de sangrado. La trombina generada inicia la formación de coágulo formando fibrina y activando plaquetas. La propagación de crecimiento de trombo: Sobre superficies expuestas en el trombo que crece la trayectoria intrínseca inducida por FXII genera fibrina adicional a través de FXI. Consecuentemente, la deficiencia en FXII- así como FXI- daña severamente la formación de trombos . En la presente invención, una contribución potencial de la trayectoria intrínseca de coagulación para formación de trombo patológico en vivo se determinó mediante microscopía intravital y modelos basados en medición de flujo de trombosis arterial utilizando ratones que carecen de factor XII. Mientras que la adhesión inicial de plaquetas en
sitios de daño no se altera en los animales mutantes, la formación y estabilización subsecuente de trombos tridimensionales es severamente defectuosa. Este defecto se vio en ramificaciones diferentes del vascultivo y se pudo restaurar completamente por factor XII humano exógeno. Estos descubrimientos establecen la trayectoria de coagulación intrínseca impulsada por factor XII como un enlace principal entre hemostasis primaria y secundaria en un modelo revisado de formación de trombo. Para analizar la función de FXII para coagulación en vivo, ratones deficientes en FXII se generaron. Los ratones FXII-/- son sanos, fenotípicamente no distinguibles de sus compañeros de tipo salvaje, y fértiles. Análisis histológicos y hemostasiológicos detallados no mostraron correlaciones para trombosis aumentada o sangrado en ratones FXII-/- a pesar de un aPTT prolongado de 68 + 17 segundos y tiempo de recalcificación de 412 + 78 segundos en plasma recogido retroorbitalmente (peso: 23 + 4 y 210 + 31 seg) (Pauer, H.U., y col. (2004). La omisión dirigida de modelo de gene-a de factor XII de coagulación de murina para activación de fase de contacto en vivo. Thromb. Haemost. 92, 503-508). De manera similar a humanos deficientes e FXII, los ratones FXII-/- no presentan tendencia a sangrado aumentado como se
indica por los tiempos de sangrado de cola similares a aquellos encontrados en animales tipo salvaje (369.5 + 201.7 y 355.9 + 176.1 seg, respectivamente, n = 12 por grupo, Figura 1A) . Las cuentas de células de sangre periférica de ratones mutantes no difirió de controles de tipo salvaje. Notablemente, el tiempo de protrombina (PT) de ratones FXII-/- fue similar al tipo salvaje (8.9 + 1.3 contra 9.1 + 1.3 seg) indicando que la deficiencia en FXII no afecta la formación de fibrina por el sistema de coagulación extrínseca (Figura IB) . Para determinar las diferencias potenciales en actividad procoagulante de FXII entre humanos y ratones, humano deficiente en FXII (FXII < 1%) con plasma tipo salvaje de murina o iceversa se reconstituyeron y el PTT de las mezclas se determinó. En cualquier caso, la formación de coágulo se normalizó soportando la noción que la función de FXII para coagulación es comparable en humanos y ratones. En seres humanos de manera similar a la deficiencia en FXII la deficiencia en kalicreina de plasma (PK) de proteínas de sistema de contacto y quininógeno de elevado peso molecular HK) no resulta en un riesgo de sangrado aumentado a pesar de un aPTT prolongado. Para confirmar que la prolongación de aPTT en ratones FXII-/- no se debe a defectos adicionales de proteínas de fase de contacto, se
analizaron PK, y HK en FXII-/- y plasma wt . La mancha western indicó que los niveles de HK y PK son equivalentes en ratones mutantes y tipo salvaje (Figura 1C) . Funcionalmente, el plasma de FXII-/- expuesto a colágeno o caolín la procesión de HK y formación de trombina se dañó severamente comparada con el tipo salvaje. La coagulación de sangre y activación de plaqueta son procesos complementarios y mutuamente dependientes. Las plaquetas interactúa con y contribuyen a la activación de varios factores de coagulación y la trombina producto de coagulación central es un activador de plaqueta potente. Por lo tanto, a continuación se examinó la contribución de plaquetas y FXII a formación de coágulo con mayor detalle. Para esto, se indujo la coagulación usando ya sea caolín que activa clásicamente FXII pero no tiene efecto directo sobre plaquetas o colágeno, que activa tanto FXII y plaquetas en donde interactúa con numerosos receptores, de manera más importante integrina a2ßl y GPVI . En presencia, pero no en ausencia de plaquetas, el colágeno fue superior al caolín para formación de coágulo en plasma tipo salvaje (Figura ID) . En contraste, en plasma quecontiene plaquetas FcR?-/-defectuosas en activación, la potencia relativa de caolín y colágeno fuesimilar dePFP y se vio un efecto similar con
PRPde ratones de integrina a2-/-. La actividad procoagulante de plaqueta también se dispara eficientemente al coagular plasma y el receptor de fibrin (ógeno) allbß3 se ha mostrado que juega un papel crucial en este procesó aún cuando los mecanismos subyacentes no se entienden completamente. De conformidad con estos reportes, el anticuertpo de bloqueo de función allbß3 JON/A inhibió en gran parte la disminución dependiente de plaqueta en el tiempo de coagulación, (figura ID) . Juntos, estos resultados demostraron que las plaquetas en un estado precoagulante pueden promover formación de coágulo inducido por FXII. Para probar si la activación de FXII inducida por colágeno tiene consecuencias funcionales en vivo, ratones tipo salvaje y FXII-/- se sometieron a un modelo de tromboembolia pulmonar letal inducida por la infusión de una mezcla de colágeno (0.8 mg/kg de peso corporal) y epinefrina
(60 ug/kg de peso corporal). Todos los raones de control
(19/19) murieron dentro de 5 minutos de trombosis pulmonar dispersa y paro cardíaco que fue acompañado por una reducción de >95% en cuentas de plaqueta circulante tan pronto como 2 minutos después del reto (Figura 2A, B) . Bajo estas condiciones expermentales, 35.7% (5/14) de los ratones FXII-/- sobrevivieron aún cuando sus cuentas de plaqueta
periférica fueron similarmente reducidas que en el control de tipo salvaje, sugiriendo que la protección observada no se basó en un defecto de activación de plaqueta. Esta suposición se confirmó mediante estudios in vitro que muestran que las plaquetas FXII-/- expresan nivelesnormales de las glicoproteínas superficiales principales, incluyendo receptores de colágeno, y que las células se pueden activar normalmente medianteagonistas clásicos tales como trombina, difosfato de adenosina (ADP) , o el agonista específico de GPVI, péptido relacionado con colágeno (como se mide mediante activación de integrina allbß3 y P-selectina) . De conformidad con esto, las plaquetas FXII-/- exhibieron una respuesta de agregación no alterada de colágino, ADP (Figura 2C) , PMA, o trombina. En un juego de experimentos paralelo, ratones FcR?- /- se retaron con colágeno/epinefriña . Estos ratones se protegieron completamente de letalidad y cuentas de plaqueta se redujeron solo moderadamente 2 minutos después del reto confirmando el requerimiento estricto de activación de plaqueta para letalidad en este modelo. Estos datos se sustentaron además de análisis histológico para secciones de pulmón derivadas de ratones de los diferentes grupos. Mientras que la gran mayoría de los vasos se obstruyó en
ratones tipo salvaje, esto fue significativamente reducido en ratones FXII-/- (sobrevivientes y no sobrevivientes) . De conformidad con reportes previos, virtualmente no se encontraron trombos en pulmones de ratones FcR?-/- (Figura 2D) . Estos resultados sugieran que en vivo el colágeno dispara tanto activación de plaqueta como la trayectoria de coagulación intrínseca dependiente de FXII que en este modelo se sinergiza para formar trombos pulmonares oclusivos. La formación de trombo patológica frecuentemente se inicia mediante fisuración o interrupción abrupta de la placa ateroesclerótica en la ramificación arterial del vascultivo que conduce a activación de plaquete no fisiológicamente fuerte y actividad procoagulante en la superficiesobre las capas subendoteliales . Para probar el papel de FXII en estos procesos, la formación de trombo se estudió en ratones tipo salvaje y FXII-/-, empleando diferentes modelos de daño arterial. En el primer modelo, se indujo daño oxidante en arteriolas mesentéricas (60 - 100 um de diámetro) y la formación de trombo se examinó mediante microscopía de fluorescencia en vivo. Ratones tipo salvaje y FXII-/-recibieron plaquetas fluorescentemente etiquetas (1 x 108) del mismo genotipo y se indujo daño mediante aplicación tópica de un papel de filtro saturado con 20% de cloruro
férrico (FeCl3) durante 1 minuto que provoca la formación de radicales libres que conduce a la interrupción del endotelio. Las interacciones de plaquete con la pared de vaso dañada inició rápidamente y cinco minutos después del daño, el número de plaquetas firmemente adherentes fue similar en ambos grupos de ratones (Figura 3A) . Sin embargo, mientras que en los ratones tipo salvaje las plaquetas adherentes reclutaron consistentemente plaquetas adicionales de la circulación, resultando en la formación de agregados, este proceso fue severamente defectuoso en los ratones mutantes. En 100% de los vasos de control 717/17) los trombos estables >20 um de diámetro se habían formado con 20 minutos después del daño que crecieron continuamente durante el tiempo y finalmente condujeron a oclusión completa en 94.1% (16/17) de los vasos dentro del período de observación de 40 minutos
(tiempo de oclusión medio: 25.6 + 8.9 minutos) (Figura 3). En contraste agudo, en ratones mutantes la formación de microagregados o trombos ocurrió fue completamenteausente en
50% (7/14) de los vasos. En el 505 restante (7/14) de los recipientes, los trombos se formaron que, sin embargo, fueron consistentemente inestables y se separaron rápidamente de la pared de vaso. En ninguno de los vasos, un trombo de >20 um de diámetro permaneció fijado en el sitio de daño por más de
1 minuto. Consecuentemente, ningún vaso ocluido en ratones FXII-/- dentro del período de observación (40 minutos) . Este resultado inesperado demostró que FXII se requiere para la generación y estabilización de trombosricos en plaqueta en arteriolas dañadas con FeCl3 y sugirió que la trayectoria de coagulación inducida por FXII contribuye esencialmente a la respuesta trombótica observada. Esta suposición se confirmó cuando ratones deficientes en FXI se analizaron en el mismo modelo. Puesto que FXI es el substrato principal de FXII en la cascada "intrínseca", un defecto similar en la formación de trombo tendría que esperarse en esos ratones. En realidad, muy similar a ratones FXII-/-, la adhesión de plaqueta virtualmente normal en el sitio de daño fue detectable durante los primeros tres minutos después del daño, mientras que la formación de trombos se inhibió completamente en 55.6%
(5/9) de los vasos. En los vasos restantes, los microagregados formados y trombos fueron inestables y embolizaron continuamente (Figura 3) . Como resultado, ninguno de los vasos ocluidos dentro del período de observación (40 minutos) . Este dato muestra que los ratones deficientes en FXI estaban protegidos en un modelo inducido por FeCl3 de la arteria carótida. La formación de trombo arterial inducida por FeCl3
es sabido que depende de plaquetas y generación de trombina pero no es claro que tan bien este tipo de daño se parece al medio trombogénico producido en vasos enfermos, v.gr., después de la ruptura de la placa ateroesclerótica. Por lo tanto, para excluir la posibilidad de que el daño oxidante inducido por FeCl3 masivo produzca condicionesno fisiológicas que pueden favorecer artificialmente la activación de fase de contacto dependiente de FXII, la función de FXII se determinó en un segundo modelo de trombosis arterial bien establecido en donde el daño se induce mecánicamente en la aorta y el flujo de sangre se supervisa con una sonda de flujo ultrasónica. Después de un aumento transiente directamente después del daño, el flujo de sangre disminuyó progresivamente durante varios minutos en todos los ratones probados. En todos los ratones tipo salvaje probados (10/10), esta disminución resultó en oclusión completa e irreversible del vaso dentro de 1.6 a 11.1 minutos después del daño (tiempo de oclusión medio 5.3 + 3.0 minutos, Figura 4A) . Una imagen diferente de encontró en ratones FXII-/- en donde la formación de trombo estable fue severamente defectuosa. Mientras que en todos los animales se observó una reducción progresiva en flujo de sangre durante los primeros minutos después del daño, la oclusión ocurrió solamente en 4 de 10
ratones. Además, los trombos oclusivos en esos ratones en todos los casos fueron inestables y se embolizaron rápidamente de modo que el flujo de sangre se reestableció entre 10 s y 115 s después de la oclusión. Ninguno de los vasos nuevamente abiertos se ocluyó una segunda vez. Consecuentemente, todos los ratones FXII-/- mostraron regímenes de flujo esencialmente normales a través del vaso dañado al final del período de observación (40 min) . Se obtuvieron resultados muy similares con ratones FXI-/-, en donde 9 de 11 fueron incapaces de establecer un trombo oclusivo dentro del período de observación 830 min) (Figura 5A) . El defecto severo en formación de trombo arterial en ratones FXII-/- se confirmó en un tercer modelo independiente en donde el reclutamiento de plaqueta en la arteria carótida dañada se estudió por microscopía de fluorescencia en vivo. Las plaquetas se purificaron de ratones donadores, se etiquetaron fluorescentemente y se inyectaron en ratones recipientes del mismo genotipo. El daño vascular se indujo mediante ligado vigoroso de la arteria carótida que ocasiona consistentemente interrupción de la capa endotelial y frecuentemente rompe la lámina elástica interna seguida por adhesión de plaqueta disparada por
colágeno rápida y formación de trombo en el sitio de daño (Gruner y col., Blood 102:12/8/2005 2003). Mientras que los animales tipo salvaje formaron rápidamente trombos estables grandes (área de trombo: 102.821 + 39.344 um2; t = 5 min), que no embolizaron, solamente agregados de tamaño pequeño y medio formados en ratones mutantes, que frecuentemente se separaron del sitio de daño (Figura 4B, C) . Consecuentemente, el área de trombo se redujo dramáticamente en los ratones mutantes (8.120 + 13.900 um2 ; t = 5 min) aún cuando la adhesión de plaqueta primaria en la pared de vaso no pareció ser defectuosa. Para probar si el defecto severo en formación de trombo en ratones FXII-/- resulta de la falta de FXII de plasta o FXII de plaqueta, o posiblemente de efectos secundarios, no identificados de deficiencia de FXII tales como alteraciones en la vasculatura, la formación de trombo arterial se estudió en ratones FXII-/- después de la administración de FXII huna (2 ug/g peso corporal) . Este tratamiento normalizó el PTT (27 + 6 seg) y restauró completamente la formación de trombo arterial. En 100% de los arteriolos dañados con FeCl3, se habían formado trombos de >20 um dentro de 10 min después del daño y todos los vasos se ocluyeron completamente dentro del período de observación
(Figura 5A-C) . Hubo aún una tendencia hacia oclusión más rápida detectable en los ratones FXII-/- reconstituidos en comparación con los ratones de control tipo salvaje no tratados (tiempo de oclusión medio: 22.7 + 9-2 min contra 25.5 + 8.9 min). Se obtuvo un resultado similar cuando el daño se indujo mecánicamente en la aorta. En todos los vasos probados, ocurrió oclusión completa e irreversible dentro de 10 minutos después del daño. (Figura 5D) , confimando que la falta de cuentas de FXII de plasma para el defecto trombótico observado en ratones FXII-/-. Los estudios arriba descritos demostraron que FXII es crucial para la formación de trombo arterial y, por lo tanto, puede servir como una meta antitrombótica. Para determinar esto directamente, los ratones se trataron con 2 mg/kg de peso corporal de anticuerpos FXII contra ratón de conejo policlonal o anticuerpos de conejo no inmune y se determinó el reclutamiento de plaqueta y frormación de trombo en arterias mesenteriales, seguido por daño inducido por FeCl3. Como se muestra en la Figura 6A, la adhesión de plaqueta en sitios de daño fue comparable en ambos grupos de ratones. Sin embargo, mientras que en 100% de los vasos de control, se habían formado trombos de >20 um dentro de 10 minutos después del daño y todos los vasos se
ocluyeron completamente dentro del período de observación (Figura 6B, C) , trombos de >20 um se observaron únicamente en 67% de los vasos y la oclusión ocurrió solamente en 50% de los vasos de los animales tratados con anticuerpo anti-FXII. Alternativamente, para probar el impacto de inhibidores de FXII de molécula pequeña, ratones tipo salvaje se infundieron con el inhibidor FXII inhibidor de tripsina de maíz (CTI, 50 ug/g peso corporal) 5 minutos antes del daño inducido con FeCl3 en la arteria carótica (Wang y col. (2005) J. Thromb. Heamost 3: 695-702). El tratamiento de inhibidor prolongó el aPTT (62+11 seg, n=4) pero no afectó el sangrado durante el procedimiento quirúrgico. En ninguno de los animales probados (0/4) se desarrollaron trombos que ocluyen vaso dentro de 30 minutos después de la aplicación de FeCl3. Estos resultados demostraron que las terapéuticas de anti-FXII como anticuerpos anti-FXII o inhibidores de FXII de molécula pequeña proporcionan protección significativa contra formación de trombo arterial . Aún cuando la activación de contacto de FXII se ha reconocido como el punto de partida de la cascada de coagulación de sangre intrínseca por más de 50 años, esta trayectoria se consideró irrelevante para coagulación de sangre. El la presente invención, se usaron tres modelos
diferentes en vivo para analizar el reclutamiento de plaqueta y formación de trombo en sitios de daño arterial en ratones deficientes en FXII mediante microscopía de video in situ y mediciones de flujo ultrasónicas y mostraron una severa incapacidad de formar trombos tridimensionales estables. Este defecto se basó en la falta de FXII en plasma, pero no otros compartimentos, ya que se invirtió completamente mediante inyección intravenosa de FXII humano exógeno (Figura 6) excluyendo de esta manera también que efectos secundarios de deficiencia de FXII contribuyen al fenotipo observado. Estos resultados son inesperados ya que FXII se ha considerado como un antitrombótico más bien que una enzima protrombótica basado en unos pocos reportes que muestran una asociación de deficiencia de FXII con una incidencia aumentada de trombosis venosa (Kuhli,C, Scharrer,I., Koch,F., Ohrloff,C, y Hattenbach, L.. (2004). Deficiencia de factor XII: un factor de riesgo tro bofílico para oclusión de vena retina. Am. J. Ophthalmol. 137, 459-464; Halbmayer, W.M., Mannhalter, C. , Feichtinger, C. , Rubi,K., y Fischer,M. (1993) . {Dcia de factor XII (factor de Hageman) : un factor de riesgo para desarrollo de tromboembolia. La incidencia de deficiencia de factor XII en pacientes después de tromboembolia venosa o arterial e infarto al miocardio}.
Wien. Med. Wochenschr, 143, 43-50) . Los ratones deficientes en FXII muestran tiempos de sangrado normales (Figura 1A) y no muestran signos de sangrado post-traumático espontáneo o aumentado confirmando que FXII es desechable para hemostasis normal. A primera vista, estos resultados parecen contradecir un dogma de hemostasis central que solamente aquellos factores cuya deficiencia está asociada con sangrado o trombosis s relevantes para coagulación de sangre. En una mirada más cercana, sin embargo, los datos no reten este teorema sino más bien elevan la interesante posibilidad de que la hemostasis y trombosis arterial pueden ocurrir a través de mecanismo diferente. Aún cuando los mecanismos arriba discutidos de generación de trombina sostenida pueden ser suficientes para generar un tapón hemostático, los datos muestran que la formación de trombos arteriales estables requiere la activación adicional de trayectoria de coagulación intrínseca, cuando menos en ratones. No hay evidente de la posibilidad que existan diferencias específicas de especies en la función de FXII o un substrato de la enzima. Todos los parámetros de coagulación y el fenotipo hemostático de los ratones mutantes están en línea con deficiencia en FXII
humana y todas las alteraciones observadas en animales se normalizaron mediante reconstitución con FXII humano (Figura 5) . Además, se excluye que el defecto trombótico esté restringido a un modelo experimental particular ya que se encontró en diferentes ramificaciones arteriales de la vasculatura e independiente del tipo de daño. Puede ser difícil determinar que tipo de daño refleja mejor la lesión vascular producida por ruptura de una placa arterioesclerótica, que se considere el disparo principal de síndromes cardiovasculares agudos. Las lesiones arterioescleróticas son ricas en constituyentes trombogénicos, de manera más importante TF y colágenes fibrilares. En el proceso de arteriogenesis, la síntesis de colágeno mejorada por células musculares suaves íntimas y fibroblastos se ha mostrado que contribuyen significativamente a estrechamiento luminal. La ruptura o fisuración de placa resulta en exposición de fibrilas de colágeno a la sangre que fluye lo que dispara la adhesión y agregación de plaquerta. Además, inducen activación de FXII comosemuestra aquí para colágeno fibilar tipo I, que es el tipo de colágeno principal encontrado en la pared de vaso. Pero los colágenos no son probablementeel único activador (pato) fisiológico de FXII en sitios de daño. Otros cantidados
podrían ser substancias liberadas de células desintegrantes o expuestas en el ECM incluyendo HSP90 o polianiones solubles e insolubles, v.gr., nucleosomas o glicosaminoglicanos . Entre estos activadores de FXII, los colágenos son en mucho más trombogénicos debido a que también activan potentemente las plaquetas. En sitios de daño, las plaquetas se traban al ECM por la interacción reversible de plaqueta GPIb-V-IX con vWf ligado a colágeno que reduce la velocidad de las células y de esta manera permite en enlace de otros receptores. Entre estos, el receptor GPVI de colágeno es de importancia central ya que activa integrinas a2ßl y allbß3 que luego median la adhesión estable y contribuyen a activación celular. Además, la activación de plaqueta a través del complejo de GPVI/FcR?-cadena induce un estado procoagulante de las células que se caracteriza por la exposición de fosfatidilserina (PS) y la producción de (exponiendo PS) vejigas de membrana y microvesículas . La integrina a2ßl facilita este proceso directamente mediante señale3s de "fuera-dentro" e indirectamente reforzaqndo interacciones de GPVI-colágeno. Se establece que membranas que contienen PS aceleran fuertemente dos reacciones centrales del proceso de coagulación y reacciones de tenasa y protrombinasa . La presente invención muestra que las
plaquetas de procoagulante facilitan la coagulación dependiente de VXII in vitro mediante un mecanismo que involucra ambos el complejo de GPVI/FcR?-cadena así como a2ßl (Figura 2) . Esto podría explicar cuando menos parcialmente por qué ratones deficientes en a2ßl, a pesar de adhesión de plaqueta no alterada en sitios de daño arterial, muestran defectos parciales en la formación de trombos oclusivos. Además de colágenos, el plasma de coagulación estimula potentemente la actividad procoagulante de plaquete mediante un mecanismo dependiente allbß3 integrina. En los presentes experimentos, el bloqueo de llbß3 inhibió casi completamente la participación de plaqueta en coagulación dependiente de FXII, indicando que la actividad anticoagulante bien conocida de antagonistas de allbß3 puede estar basada parcialmente en la inhibición de trayectoria de coagulación intrínseca impulsada por FXII. Juntos, la presente invención indica que el sistema de contacto impulsado por FXII y activación de plaqueta pueden ser procesos mutuamente dependientes que cooperan en la formación de trombo patológico. Basado en los resultados experimentales, un modelo de formación de trombo patológico ilustrado en la figura 7 se propuso. En sitios de daño vascular, la primera capa de plaquetas se pone en contacto con colágenos en un ambiente
que está adicionalmente enriquecido en TF y fibrina. Por lo tanto, no es sorprendente que la adhesión de plaqueta de la pared de vaso dañada no se dañe en ratones de FXII-/- y es muy probable que estas células estuvieran completamente activadas en un estado procoagulante. En un trombo creciente, sin embargo, los colágenos están ausentes y las concentraciones de TF provistas por microvesículas pueden ser inferiores en comparación con la pared de vaso y reducidas en su actividad por TFPI liberado en cantidades grandes de plaquetas activadas. Bajo estas condiciones, se requieren mecanismos adicionales para mantener generación de trombina espacio-temporal para activar plaquetas recientemente reclutadas y, a través de la formación de fibrina provan su actividad coagulante. La incapacidad severa de ratones FXII-/- de establecer trombos estables demuestra de manera no ambigua que la trayectoria de coagulación intrínseca impulsada por FXII es una jugador esencial en este proceso. Junto con la observación que ratones bajos en TF también mostraron trombosis arterial dañada, estos resultados sugieran que ambas la trayectoria extrínseca e intrínseca deben ser operativas y sinergizar para promover la formación del trombo tridimensional y que ocluye eventualmente. En contraste, la falta de sangrado en ratones FXII-/- indica que
el crecimiento de trombo en la tercera dimensión puede no ser necesario para sellar un hoyo en la pared de vaso. Esto poderla explicar por qué la trayectoria extrínseca, que produce la primera capa delgada de fibrina y plaquetas activadas, es suficiente para mediar la hemostasis normal. Nuestros resultados elevan la interesante posibilidad de que la formación de un trombo tridimensional sirve funciones distintas a la hemostasis. Estas podrían incluir el arresto de flujo de sangre en ciertas áreas de trauma de tejido a fin de prevenir la distribución de patógenos o toxinas invasoras con la corriente sanguínea. Procedimientos Experimentales Animales Todos los experimentos y cuidado fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal local. Ratones clásicos mutantes que carecen del factor XI (FXI-/-) , factor XII
(FXII-/-), a2 integrina (a.2-/-) se produjeron como se describe (Gallani,D., Lasky,N.M., y Broze,G.J., Jr . 81997).
Un modelo de murino de deficiencia de factor XI. Blood Coagul. Fibrinolysis 8, 134-144; Pauer, H.U., Renne,T.,
Hemmerlein, B. , Legler,T., Fritzlar,S., Adham, I . , Muller- Esterl,W., Emons,G., Sancken,U., Engel,W., y Burfeind, P.
(2004). Omisión dirigida de factor XII de coagulación de
murino de modelo de gene-a para activación de fase de contacto en vivo. Thromb. Haemost. 92, 503-508; Holtkotter, O. , Nieswandt, B. , Smyth,N., Muller, W., Hafner,M., Schulte,V., Krieg, T., y Eckes,B. (2002). Ratones deficientes en integrina alfa 2 se desarrollan normalmente, son fértiles, pero muestran interacción de plaqueta parcialmente defectuosa con colágeno. J Biol. Chem JID - 3985121R 277, 10789-10794). Como un control ratones C57B/6J (FXI-/-) o Svl29 (FXII-/-) se usaron. Ratones deficientes en la FcR?-a (Takai,T., Li,M., Silvestre, D. , Clynes,R., y Ravetch,J.V. (1994). Resulta omisión de cadena FcR gamma resulta en defectos de célula efectora pleiotrófica. Cell 76, 519-529) fueron de (Taconics, Germantown) . Eración de anticuerpos anti-FXII El RNA celular total se aisló de un hígado de un ratón de peso de 129 sv y la síntesis de cADN-FXIUI se realizó con el "Equipo RT-PCR de un paso" de Qiagen de conformidad con las instrucciones del fabricante. La cadena pesada de factor FXII (posiciones 61-1062, correspondientes a residuos 21-354) se amplificó usando 25 pmol cada uno de los 5- y 3-imprimadores (ttggatccccaccatggaaagactccaag y ttgaattcgcgcatgaacgaggaca g) introduciendo un sitio de restricción BamH I y Ecor I, respectivamente con el siguiente
protocolo: 30 s a 95°C, 60 s a 58°C, y 1 min a 72°C durante 30 ciclos en el ciclador térmico (Biometra, Góttingen, Alemania) . El producto PCR se clonó en el sitio BamH I y EcoR I del vector de expresión pGEX-2T (Pharmacia) . Siguiendo la proteína de secuencia se expersó en E.coli cepa BL21. Las bacterias que crecen exponencialmente se estimularon con 0.5 mM de isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida durante 1 h, se cosecharon, resuspendieron en 10 mM de Tris-HCl, pH 7.4, conteniendo 1 mM de EDTA, 200 mM de NaCI, 10 ug/ml de clorhidrato de benzamidina, 10 ug/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y se sonicarón durante 3 min en impulsos de 15 s cada uno. Después de la centrifugación a 15,000 x g durante 20 min a 4°C, el sobrenadante se removió y transfirió a un a columna de GST-sefarosa (Pharmacia) para purificación. La proteína eluida fue >95% pura como se deduce de Coomassie manchada SDS-PAGE. Los anticuerpos policlonales contra cadena GST-pesada de FXII se elevaron en conejos siguiendo procedimientos convencionales. Los anticuerpos se seleccionaron del hiperiminosuero utilizando columnas con cadena pesada de FXII fundida a proteína de enlace de maltosa (MBP) . Estas proteínas de fusión se expresaron y purificaron el sistema de expresión poMAL-c2 y columnas de resina de amilosa similarmente como se describe para la construcción de
GST-fusión. Preparación de Plaqueta Se sangraron ratones bajo anestesia con éter del plexo retroorbital. La sangre se recogió en un tubo que contiene 20 U/mL de heparina, un plasma rico den plaqueta (prp) se obtuvo mediante centrifugación a 300 g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) . Para plaquetas lavadas, prp se centrífugo a 1000 g durante 8 min y el granulo se resuspendió dos veces en tampón Tyrodes-Hepes modificado (134 mM de NaCI, 0.34 mM de Na2HP04, 2.9 mM de KCl, 12 mM de NaHC03, 20 mM de Hepes, 5 mM de glucosa, 0.35% de albúmina de suero bovino, pH 6.6) en presencia de prostaciclina (0.1 ug/ml) y apirasa (0.02 u/mL) . Las plaquetas luego se resuspendieron en el mismo tapón (pH 7.0, 0.02 u/mL de apirasa) y se incubaron a 37°C durante cuando menos 30 min antes deanálisis Citometría de flujo Sangre entera heparinizada se diluyó a 1:20 con tampón Tyrode-HEPES modificado (134 mM de NaCI, 0.34 mM de Na2HP045, 2.9 mM de KCl, 12 mM de NaHC034, 20 mM de HEPES ácido {N-2-hidroxietilpiperazina-N' -2-etansulfónico} , pH 7.0) que contiene 5 mM de glucosa, 0.35% de albúmina de suero bovino (BSA), y 1 mM de CaCI2. Las muestras se incubaron con
anticuerpos etiquetados con fluorofor durante 15 minutos a temperatura ambiente y se analizaron directamente en un FACScalibur (Becton Dickinson, Heildelberg, Alemania) (Nieswandt,B. , Schulte,V., y Bergmeier,W. (2004). Análisis citométrico de flujo de función de plaqueta de ratón. Métodos Mol. Biol.. 272, 255-268). Agregometría Para determinar la agregación de plaqueta, la transmisión de luz semidió utilizando prp (200 uL con 0.5 x 106 plaquetas/uL) . La transmisión se registro en un Fibrinti er 4 agregomedidor de canal (APACT Laborgeráte und analysensysteme, Ha burgo, Alemania) durante 10 min y se expresó como unidades arbitrarias con 100% de transmisión ajustada con plasma. La agregación de plaquete se indujo mediante adición de colágeno (10 ug/mL) y ADP (5 Um) . Experimentos de tiempo de sangrado Se anestesiaron ratones mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol (Aldrich) (0.15 ml/lOg de peso corporal) y segmento de 3 mm de la punta de cola se cortó con un escalpelo. El sangrado de cola se supervisó absorbiendo suavemente la cuenta de sangre con un papel de filtro sin poner en contacto el sitio de herida. Cuando no se observó sangre en el papel después de intervalos de 15
segundos, sel sangrado se determinó que había cesado. Cuando fue necesario, el sangrado se detuvo manualmente después de 20 minutos. Cuando se indica, se trataron ratones con 100 ug/ratón de hFXII. Preparación de plaquetas para microscopía intravital. Se recogió sangre de ratón (1 vol) en 0.5 vol de tampón Hepes que contiene 20 u/mL de heparina. La sangre se centrífugo a 250 g durante 10 minutos y plasma rico en plaqueta se transfirió suavemente a un tubo fresco. Las plaquetas se etiquetaron con éster de succinimidilo de diacetato de 5-carboxifluoresceína (CDF) y se ajustó a una concentración final de 200 x 106 plaquetas/250 ul
(Massberg, S . , Sausbier,M., Klatt,P., Bauer,M., Pfeifer,A.,
Siess,W., Fassler,R., Ruth,P., Krombach,F., y Hoffmann, F. (1999) . La adhesión y agregación aumentadas de plaquetas que carecen de cinasa de 3' , 5'monofosfato de guanosina cíclica I. J Exp. Med. 189, 1255-1264) . Modelo de trombosis en vivo con daño inducido con FeCI3. Ratones macho y hembra en la edad de 4-5 semanas se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol y 2-metil-2-butanol (Sigma) (0.15 ml/lOg de peso corporal de 2.5% de solución). Las plaquetas etiquetadas fluorescentemente se inyectaron intravenosamente. Arteriolos
(35 - 50 um de diámetro) se visualizaron con un microscopio invertido Zeiss Axiovert 200 (xlO) equipado con una fuente de lámpara fluorescente de 100-W HBO y una cámara CCD (CV-M300) conectada a una grabadora de video S-VHS (AG-7355, panasonic, Matsushita Electric, Japón) . Después de aplicación tópica de FeCI3 (20%) que indujo daño de vaso y desnudo del endotelio, fueron arteriolas supervisadas durante 40 min o hasta que ocurrió la oclusión completa (el flujo de sangre se detuvo durante >1 min) . La adhesión de plaqueta firme se determina como el número de plaquetas fluorescentemente etiquetadas que se depositaron en la pared de vase hasta 5 minutos después del daño, el trombo se caracteriza como un agregado de plaqueta en un diámetro mayor a 20 um, el tiempo de oclusión de vaso se caracteriza como tiempo requerido para que la sangre deje de fluir durante cuando menos un minuto. En todos los experimentos el máximo de dos arteriolas se seleccionaron de cada ratón basado en calidad de exposición. Se estudiaron un total de 17 peso, arteriolas 14 FXII-/- y 9 FXI-/-. Microscopía Intravital - arteria carótida. La microscopía intravital de la arteria carótida dañada se realizó esencialmente como se describe (Massberg, S . , Gawaz,M., Gruner,S., schulte,V., Konrad,Il, Zohlnhofer, D. , Heinzmann, U. , y Nieswandt,B. (2003). Un papel
crucial de glicoproteína VI para reclutamiento de plaqueta a la pared arterial dañada en vivo. J Exp Med JID - 2985109R 197, 41-49) . Brevemente, los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de cetamina/xilazina (cetamina 100 mg/kg, Parke-Davis, Karlruhe, Alemania; xilazina 5 mg/kg, Bayer AG, Leverkusen, Alemania) . Catéteres de polietileno (Portex, Hythe, Inglaterra) se implantaron en la vena yugular derecha y plaquetas fluorescentes (200 x 106/250 ul) se infundieron intravenosamente. El daño de carótida para desnudo endotelial se indujo mediante ligado vigoroso. Antes de y después del daño vascular, las plaquetas fluorescentes se visualizaron in situ por microscopía de video en vivo de la arteria carótida común derecha usando un microscopio Zeiss Axiotech (20 x objetivo de inmersión de agua, W 20x/0.5, Zeiss. Gottingen, Alemania) con lámpara de mercurio 100 W HBO para epi-ilu inació . La adhesión de plaqueta y formación de trombo se registró durante 5 minutos después de la inducción de daño y las imágenes grabadas en video se evaluaron utilizando un programa de análisis de imagen ayudado por computadora (Visitron, Munich, Alemania) . Tromboembolia pulmonar Se anestesiaron ratones mediante inyección intraperitoneal de 2, 2, 2-tribromoetanol y 2-metil-2-butanol
(Aldrich) (0.15 ml710g de peso de cuerpo de 2.5% de solución) . Los ratones anestesiados recibieron una mezcla de colágeno (0.8 mg/kg) y apinefrina (60 ug/kg) inyectada hacia la vena yugular. Las incisiones de ratones sobrevivientes se cosieron, y se dejaron recuperar. La necrostopía y estudios histológicos se realizaron en pulmones fijados en 4% de formaldehído y secciones de parafina se mancharon con hexatoxilina/eosina. Cuenta de plaqueta La cuenta de plaqueta se determinó mediante citometría de flujo en un FACScalibur (Becton Dickinson, Heidelger, Alemania) . Los resultados se expresan como medio +_ S.D., op como por ciento de control (peso, n = 19; FXII-/-, n
= 14 y FcR?-/-, n = 5) . Tiempo de oclusión La cavidad abdominal de ratones anestesiados se abrió longitudinalmente y la aorta abdominal se preparó. Una sonda de flujo ultrasónica se colocó alrededor de la aorta y la trombosis se indujo mediante una compresión firme con un fórceps. El flujo de sangre se supervisó hasta que ocurrió la oclusión completa. El experimento se detuvo manualmente después de 45 minutos. Cuando se indicó, el Factor XII humano se substituyó intravenosamente directamente antes del
experimento. Análisis histopatológico Se sacrificaron ratones, los pulmones se removieron rápidamente y se fijaron a 4 C durante 24 horas en 4% de formalina tamponada (pH 7.4; Kebo) . Los tejidos se deshidrataron e incrustaron en parafina (Histolab Products AB) , se cortaron en secciones de 4 um, y se montaron. Después de la remoción de la parafina, los tejidos se mancharon con hematoxilina Mayers (Histolab Products AB) y eosina (Surgipath Medical Industries, Inc.). Electroforesis de Gel de SDS-Poliacrilamida, Manchado Western, e inmunoimpresión Se separó plasma (0.3 ul/zona) mediante electroforesis de 12.5% (peso/volumen) de gel de poliacrilamida en presencia de 1% (p/v) de SDS (Laemmli, 1970) . Las proteínas se transfirieron hacia membranas de nitrocelulosa durante 30 minutos a 100 mA. Las membranas se bloquearon con PBS que contiene 4% (p/v) de polvo de leche seco y 0.05% (p/v) de Tween 20, pH 7.4. Las membranas de sometieron a sonda con 0.5 ug/ml de anticuerpo monoclonal contra MBK3 (Haaseman J. Immunology 1988) . Los anticuerpos ligados se detectaron usando anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa contra ratón IgG (dilución
1:5000) seguido por un método de detección de quimiluminiscencia . Ensayos de coagulación Para la determinación del tiempo de coatulación de recalcificación, 100 ul deplasma de ratón anticoagulada con citrato (0.38u% de citrato de sodio), se incubaron con 100 ul cada uno de colágeno tipo Horm (Nycomed, München, Alemania) , ácido elágico, sulfato de condroitina (ambos de Sigma) , caolín o tampón (concentraciones finales de 30 ug/ml) durante 120 seg a 37°C en un "Kugelkoaculometer" KC10 (Amelung, Lemgo, Alemania) . Para probar el efecto de activación de plaquetas en plaquetas lavadas dee coagulación dependiente de FXII se resuspendieron en tampón de Tyrode incluyendo 4 mM de Ca2+ y 5 uM de Ca2+-ionoforo A23187 (Sigma) durante 10 minutos antes de la adición a plasma libre de plaqueta. La formación de coágulo se inició mediante recalcificación con 100 ul de 25 mM de CaC12-solución, y el tiempo hasta que ocurrió la coagulación se registró usando el cronómero de coagulación KC4 (A eling) . Análisis de coagulación Se determinaron parámetros de coagulación global y sencilla con un sistema de coagulación automatizado (BCS, Dade Behring) con reactivos de Dade Behring de conformidad
con los protocolos para muestras humanas detallados por el fabricante. Los principios de protocolos de ensayo de BCS están disponibles de inserciones de paquete de Dade Behring, que se pueden encontrar en el sitio web de Dade Behring (http : //www . dadebehring . com) . Se midieron D-dímeros con el ELISA de Asserachrom (Roche) . Las cuentas de sangre periférica se determinaron en el Sysmex XE 2100 de conformidad con protocolos convencionales. Mediciones de trombina La generación de trombina se midió de conformidad con el método de Aronson y col. (Circulation, 1985), con ligeras modificaciones. Alícuotas de plasma ricas en plaqueta o libres de plaqueta (0.5 ml) se colocaron en tubos de polipropileno de fondo redondo que se revistieron con colégeno tipo Horms (100 ug/ml, 24 h, 4°C), y 20 ul de 1 M Ca2+ se añadió para iniciar la coagulación. Se añadieron muestras (10 ul) de los pozos de una placa de microtítulo que contiene 90 ul de 3.8% de citrato de sodio a intervalos de 2.5-10 min durante 60 minutos. El color se desarrolló durante 2 minutosmediante la adición de 50 1 de 2 mmol/litro de S-2238 (H-D-Phe-Arg-NH-N02-HCI, un substrato específico de trombina; Chromogenix, Mólndal, Suecia) en 1 mol/litro de Tris (pH 8.1) . La absorción del producto de color liberado se
midió espectrofotométricamente a una longitud de onda de 405 nm usando un lector de placa de microtítulo Vmax (Easy Reader, EAR 340AT, SLT Lab Instruments GMBH, Viena, Austria) . Las mediciones se obtuvieron en triplicado en cada punto de tiempo. Evaluación estadística Se realizó análisis estadístico utilizando la prueba de Student no emparejada. Aún cuando solamente se han ilustrado y descrito específicamente en la presente, se apreciará que muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles en la luz de las enseñanzas anteriores y dentro del alcance de las reivindicaciones anexas sin abandonar el espíritu y alcance pretendido de la invención.