MX2007005719A - Particulas de virus de la influenza defectuosas. - Google Patents

Particulas de virus de la influenza defectuosas.

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Monique I J Spronken
Ron A M Fouchier
Albert D M E Osterhaus
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Abstract

La invencion se refiere al campo de virus de la influenza y la vacunacion contra influenza; la invencion provee una particula de virus de la influenza condicionalmente defectuosa que tiene siete segmentos de acido nucleico de influenza diferentes; la invencion tambien provee una particula de virus de la influenza condicionalmente defectuosa que carece de un segmento de acido nucleico de influenza seleccionado del grupo de segmentos que codifican esencialmente polimerasa acida (PA), la polimerasa basica 1 (PB1) y la polimerasa basica 2 (PB2); en particular, la invencion provee particulas de virus de la influenza defectuosas que tienen siete segmentos de acido nucleico de influenza diferentes y que carecen de un segmento de acido nucleico de influenza que codifica esencialmente polimerasa acida; ademas, la invencion provee el uso de una composicion que comprende una particula de virus de la influenza defectuosa de conformidad con la invencion para la produccion de una composicion farmaceutica dirigida a la generacion de proteccion inmunologica contra infeccion de un sujeto con un virus de la influenza, y provee un metodo para generar proteccion inmunologica contra infeccion de un sujeto con un virus de la influenza que comprende proveer a un sujeto que necesita el mismo con una composicion que comprende dicha particula de virus de la influenza defectuosa.

Description

PARTÍCULAS DE VIRUS DE LA INFLUENZA DEFECTUOSAS MEMORIA DESCRIPTIVA La invención se refiere al campo de virus de la influenza y la vacunación contra influenza. Los virus de la influenza (Orthomyxoviridae) son virus de ARN de cadena negativa cubiertos por envoltura con un genoma segmentado (Taubenberger y Layne, Molecular Diagnosis Vol. 6 No. 4 2001 ). Se dividen en dos géneros: uno que incluye influenza A y B y el otro que consiste de influenza C, basado en diferencias antigénicas significativas entre sus nucleoproteínas y proteínas de matriz. Los tres tipos de virus también difieren en patogenicidad y organización genómica. El tipo A se encuentra en una amplia gama de animales de sangre caliente, pero lo tipos B y C son predominantemente patógenos humanos. Los virus de la influenza A son además subdivididos por caracterización antigénica de la hemaglutinina (HA) y glicoproteínas de superficie NA que se proyectan desde la superficie del virión. Hay actualmente 15 subtipos HA y nueve subtipos NA. Los virus de la influenza A infectan a una amplia variedad de animales, incluyendo aves, cerdos, caballos, humanos, y otros mamíferos. Las aves acuáticas sirven como el reservorio natural para todos los subtipos conocidos de influenza A y probablemente son la fuente de material genético para cepas de influenza pandémicas humanas.
A diferencia de los paramixovirus relacionados, el virus de la influenza tiene un genoma de ARN segmentado. Los virus de la Influenza A y B tienen una estructura similar, mientras que la influenza C es más divergente. En donde los virus de tipo A y B contienen cada uno ocho segmentos de gen discretos que codifican para por lo menos una proteína cada una, el tipo C contiene siete segmentos discretos, combinando el segmento 4 y 6 de los tipos A y B. Los virus de la influenza A y B son cubiertos con proyecciones de tres proteínas: HA, NA, y matriz 2 (M2). El virus de la influenza C tiene sólo una glicoproteína de superficie. Cada segmento de ARN de influenza es encerrado en una cápside por nucleoproteínas (NP) para formar complejos de ribonucleótidonucleoproteína (RNP). Las tres proteínas de polímerasa están asociadas con un extremo del complejo de RNP. Los RNPs son rodeados por una membrana con la proteína principal (matriz 1 ) como una parte integral. La porción de fosfolípido de la envoltura se deriva de la membrana hospedera celular. También encontrada dentro de la partícula del virus está la proteína no estructural 2 (NS2). Los lineamientos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (World Health Organization o WHO) para la nomenclatura de los virus de la influenza son los siguientes. Primero, el tipo de virus es designado (A, B o C), después el hospedero (si es no humano), lugar de aislamiento, número de aislamiento, y año de aislamiento (separado por diagonales invertidas). Para influenza A, los subtipos HA y NA se indican entre paréntesis. Por ejemplo, las cepas incluidas en la vacuna trivalente reciente para la estación de 2000 a 2001 son A/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1 N1 ), y B/Yamanashi/16/98. Desde 1977, no ha habido subtipos de influenza A co-circulantes en humanos: H1 N1 y H3N2. Los virus de la Influenza accumulan mutaciones puntuales durante la replicación porque su complejo de ARN polimerasa no tiene actividad de revisión. Las mutaciones que cambian aminoácidos en las porciones antigénicas de glicoproteínas de superficie pueden dar ventajas selectivas para una cepa viral permitiéndole evadir inmunidad preexistente. La molécula de HA inicia la infección al unirse a receptores sobre ciertas células hospederas. Los anticuerpos contra la proteína HA impiden la unión a receptor y son muy efectivos para prevenir reinfección con la misma cepa. HA puede evadir inmunidad previamente adquirida ya sea por deriva antigénica, en la cual las mutaciones del gen HA actualmente circulante perturban la unión a anticuerpo, o cambio antigénico, en el cual el virus adquiere HA de un nuevo subtipo. Las presiones de la deriva antigénica son desiguales a través de la molécula de HA, con cambios positivamente seleccionados que ocurren predominantemente sobre la cabeza globular de la proteína HA. Estos cambios también se acumulan a un mayor grado en HA que NA. Los cambios en otras proteínas de influenza ocurren más lentamente. Asimismo, la presión de deriva antigénica es mayor en cepas de influenza adaptadas a humanos, intermedias en cepas adaptadas a cerdos y equinos, y menos en cepas adaptadas a aves. Puesto que los virus de la influenza tienen un genoma segmentado, la co-infección con dos cepas diferentes en el mismo hospedero puede conducir a la producción de cepas de influenza reclasificadas novedosas que contienen diferentes combinaciones de segmentos de genes progenitores. Se sabe que existen quince subtipos de HA en aves silvestres y proveen una fuente de HA's que son novedosos para los humanos. La emergencia en la circulación humana de una cepa de influenza con un subtipo novedoso por cambio antigénico ha sido la causa de las últimas dos pandemia de influenza en 1957 y 1968 y muy probablemente fue la causa de la pandemia de influenza de 1918. Para concordar con todo lo que se sabe acerca de la emergencia de virus de la influenza pandémicos, una cepa pandémica debe tener un HA antigénicamente distinto del que prevalece actualmente; este HA no puede haber circulado en humanos por 60 a 70 años; y el virus debe ser transmisible de un humano a otro. Tanto en 1957 como en 1968, la pandemia resultó de un cambio en HA, y en ambos casos, HA's de cepas pandémicas estaban estrechamente relacionadas con cepas de aves. Aunque uno de los requerimientos absolutos para una pandemia es que HA debe cambiar, el grado al cual el resto del virus puede o debe cambiar se desconoce. Únicamente los virus pandémicos de 1957 y 1968 están disponibles para estudio directo, el virus de la influenza pandémico de 1918 está siendo caracterizado usando arqueología molecular. En 1957, tres genes fueron reemplazados por genes similares a los de las aves: HA, NA, y una subunidad del complejo de polimerasa (PB1 ). En 1968, sólo HA y PB1 fueron reemplazados.
Un diagnóstico específico de infección por influenza se puede hacer mediante aislamiento de virus, prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl), detección de antígeno por inmunoensayo, pruebas serológicas, demostración de actividad de NA en secreciones, o pruebas basadas en moléculas. Los especímenes pueden ser recolectados como esputo, hisopo nasofaríngeo, o lavado nasofaríngeo obtenido por gárgaras con una solución salina regulada en su pH. El estándar para el diagnóstico de influenza ha sido caracterización inmunológica después de cultivo. El análisis serológico provee un método exacto pero retrospectivo para infección por influenza porque requiere recolección de sueros tanto agudo como convalesciente. Los virus de la influenza se pueden hacer crecer en huevos de gallina embrionados o un número de sistemas de cultivo de tejido. La adición de tripsina (para la activación de segmentación de HA) permite la propagación del virus de la influenza en células de riñon canino Madin-Darby (MDCK) y otras líneas. El principal método para producción de vacunas es aún el cultivo de virus de la influenza en huevos. El cultivo en líneas de células se usa comúnmente para el aislamiento primario de virus de la influenza humano (tanto el tipo A como el B). Muchos virus humanos virus de la influenza se pueden cultivar directamente en la cavidad alantoica de huevos embrionados. Algunos virus de la influenza A y B requieren cultivo inicial en la cavidad amniótíca y subsecuente adaptación a la cavidad alantoica. Después del aislamiento de cultivo, la mayoría de los asilados de influenza son definitivamente identificados usando inmunoensayos o inmunofluorescencia.
Las moléculas de HA de virus de la influenza se unen a residuos de ácido siálico sobre la superficie de células respiratorias para que el virus entre. Las cepas de influenza se pueden caracterizar antigénícamente al sacar ventaja de la capacidad de los virus de la influenza para aglutinar eritrocitos in vitro. Los anticuerpos anti-HA pueden inhibir la aglutinación. Por lo tanto, una prueba de inhibición de hemaglutinación (Hl) es uno de los métodos estándares usados para caracterizar cepas de la influenza. Las pruebas de Hl se usan para determinar si las cepas de muestra se relacionan inmunológicamente (es decir, reactivo cruzado) con cepas de vacunas recientes. La tipificación de sueros, generalmente producido en hurones, se añaden a pozos en una serie de diluciones duplicadas, y trabajadores de laboratorio realizan pruebas de puntuación al buscar glóbulos rojos suspendidos versus aglutinados. En la mayoría de las situaciones, un panel de suero se usa para hacer coincidir cepas de prueba contra vacuna y cepas de referencia, y durante cualquier estación de influenza dada, la vasta mayoría de cepas de muestra son exitosamente coincididas por pruebas de Hl. La OMS provee lineamientos y los centros de colaboración de la OMS proveen lineamiento sobre la identificación de características antigénícas de cepas de virus individuales. Las cepas de muestra se categorizan de acuerdo con pedigrí inmunológicos, tales como virus similares a A/Moscow/10/99 (H3N2), similares a A/New Caledonia/ 20/99 (H1 N1 ), y similares a B/Beijing/184/93. Por ejemplo, las cepas que fallan a la caracterización en pruebas de Hl, los trabajadores de laboratorio deben inocularlas en hurones para producir un antisuero específico de la cepa. Cuando el nuevo antisuero está listo, las pruebas de Hl se realizan nuevamente como se describió. Si el suero nuevo muestra espacios significativos en reactividad cruzada (usualmente definida como una diferencia de cuatro veces entre las cepas de muestra y de vacuna), se incorpora en el panel de laboratorio de rutina y se usa para buscar nuevas cepas endémicas. Por lo tanto, las pruebas de Hl son extremadamente importantes en el esfuerzo de vigilancia de virus de la influenza para selección de cepa de vacuna y son los métodos más comúnmente usados para evaluar deriva antigénica. Las cepas de influenza pueden ser caracterizadas genéticamente mediante comparación de secuencia de los segmentos de genes individuales, y nuevamente los lineamientos de la OMS (WHO) y los WHO Collaborating Centres for Reference and Research on Influenza (centros de colaboración de la OMS proveen lineamiento) sobre la identificación de la identidad individual de los segmentos de ARN que comprenden el genoma de la influenza; los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza A y B que codifican la nucleoproteína (NP), la polimerasa básica 1 (PB1 ), la polimerasa básica 2 (PB2), la polimerasa acida (PA), la hemaglutinina (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2), y los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza C que codifican la nucleoproteína (NP), la polimerasa básica 1 (PB1 ), la polimerasa básica 2 (PB2), la glicoproteína similar a hemaglutinina-neuraminidasa (HN), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2). Los requisitos para cepas de referencia para análisis antigénico, para comparación de secuencia de ácido nucleico y para identificación de virus de vacunas pueden ser dirigidos al WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, 45 Poplar Road, Parkville, Victoria 3052, Australia (fax: +61 3 9389 1881 , sitio web: http//www. influenza centre.org); el WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute of Infectious Diseases, Gakuen 4-7-1 , Musashí-Murayama, Tokyo 208- 0011 , Japón (fax: +81 42 5610812 or +81 42 5652498); el WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza, Centers for Disease Control and Prevention, 1600 Clifton Road, Mail stop G16, Atlanta, GA 30333, Estados Unidos de América (fax: +1 404 639 23 34); o el WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute for Medical Research, The Ridgeway, Mili Hill, London NW7 1AA, England (fax: +44 208 906 4477). Información epidemiológica actualizada está disponible en el sitio web de WHO en http://www.who.int/influenza y el sistema de información geográfica, FluNet, at http://www.who.int/flunet. La conciencia del impacto de la influenza y de los beneficios de salud y económicos de su prevención es cada vez mayor, y la década pasada ha visto el uso y beneficios de vacunación y un número de fármacos antiinfluenza aumentar considerablemente. Como resultado de una expectativa de vida más larga en muchos países, mucha más gente está en riesgo de complicaciones, la carga sobre los sistemas para el cuidado de salud durante epidemia de influenza es más ampliamente reconocido, y el viaje internacional más frecuente ha creado oportunidades para la diseminación del virus, mientras que la introducción de nuevos productos ha incrementado opciones para la prevención y tratamiento de la enfermedad. Aproximadamente 50 países tienen programas de inmunización contra influenza nacionales fundados por el gobierno y la vacuna está disponible en muchos otros. Recomendaciones específicas para el uso de la vacuna varían, pero generalmente implican inmunización anual para individuos de edad avanzada y aquellos de más de 6 meses que están en riesgo cada vez mayor de enfermedad severa debido a una condición médica crónica preexistente. En algunos países, la vacuna se usa para reducir la diseminación de influenza a quienes están en riesgo médico cada vez mayor. Los estados miembros necesitan considerar el beneficio de actividades de prevención de influenza en el contexto de sus prioridades da salud pública generales. Las vacunas ¡nactivadas se clasifican en varios tipos, dependiendo de si contienen partículas de virus enteras, partículas de virus parcialmente perturbadas (vacunas divididas) o antígenos envueltos purificados (vacunas en subunidades). Algunas vacunas en subunidades se han combinado con un adyuvante o sistema de suministro. Unos cuantos países han adquirido licencia sobre vacunas de la influenza atenuadas vivas para ciertos grupos objetivos. Dos formulaciones diferentes de 1 vacuna se han usado en adultos y niños sanos en la Federación Rusa, y otra vacuna viva se ha probado en forma extensiva. Sin embargo, hasta que las vacunas atenuadas vivas estén más ampliamente disponibles, no son generalmente recomendadas para la prevención de influenza. Dos clases de agentes antivirales se han desarrollado para la prevención y tratamiento de influenza. Los inhibidores de M2, amantadina y rimantadina, están limitados al tratamiento del virus de la influenza A y se ha reportado que son efectivos en la prevención de infección. Aunque ambos productos causan algunos efectos colaterales, los efectos colaterales neurológicos significativos son más comunes con amantadina. Los inhibidores de neuraminídasa, tales como zanamivír y oseltamivir, han sido recientemente autorizados para el tratamiento de los tipos A y B de influenza en un número de países, y se ha reportado que son efectivos para profilaxis. Se han detectado mutantes recientes en pacientes que reciben ambas clases de agente antiviral. Aunque este no se considera actualmente un problema de salud pública importante, la situación puede cambiar si estos fármacos se usan en una escala muy grande. La OMS mantiene un programa de vigilancia internacional global operado con la cooperación de 110 centros de influenza nacionales localizados en 82 países y 4 centros de colaboración de la OMS para referencia de investigación de influenza localizados en Atlanta (Estados Unidos), London (United Kingdom), Melbourne (Australia) y Tokio (Japón).
Estos centros proveen un sistema de advertencia temprana para cepas emergentes con potencial epidémico. Este sistema es importante porque la eficacia de las vacunas de la influenza es reducida si no contienen las cepas actualmente circundantes. La OMS expide recomendaciones para composición de vacuna, como se puede encontrar en el registro epidemiológico semanal (Weekly Epidemiological Record) (por ejemplo véase emisión 9, 2004, 79, página 88 o http://www.sho.int wer) publicada por la Organización Mundial de la Salud, en febrero para vacunas usadas en el hemisferio norte y en septiembre para vacunas usadas en el hemisferio sur. Puesto que la influenza tiene patrones estacionales menos definidos en regiones ecuatoriales, las consideraciones epidemiológicas influirán a las de estas recomendaciones (febrero o septiembre) si es apropiado para las vacunas para usarse en países ecuatoriales. Los centros de colaboración llevan a cabo análisis antigénico y genético de aislados de influenza sometidos por los centros nacionales. En donde la evidencia de variación antigénica se observa, esta es recopilada con datos epidemiológicos para evaluar el significado epidemiológico de las variantes. Los aislados representativos se comparan con las cepas de vacuna actuales usando paneles de sueros humanos recolectados antes y después de la vacunación, para evaluar si se podría esperar que las vacunas actuales protegieran contra estos virus. Después de la publicación de las recomendaciones de las vacunas anuales de la OMS, las cepas de crecimiento alto se desarrollan y se proveen a fabricantes como virus de referencia para ayudar en la generación de virus de siembra para producción de vacunas. Pruebas para seguridad y potencia de vacunas de influenza incluyen inactivación de vacunas, esterilidad microbiana, medición de compuestos químicos usados para alterar los virus y confirmación de la concentración de antígeno recomendado. Se recomienda que las vacunas cumplan con los requerimientos de la OMS, sin embargo, las autoridades de control nacional deben aprobar los virus de vacuna específicos usados en cada país. Las autoridades de salud pública nacionales son responsables de recomendaciones referentes al uso de la vacuna. También la OMS ha publicado recomendaciones sobre la prevención de influenza (véase WER No. 35, 2002, pp. 281-288). Se ha mostrado ya que las vacunas de influenza actuales no protegen a individuos intactos, un hecho que se vuelve de importancia inmediata en el caso de un brote pandémico de influenza cuando muchos individuos no ha encontrado una infección de influenza antes entonces están incluidas. Los virus generalmente inician su ciclo de vida al fijarse a los receptores de superficie de la celda hospedero, introduciéndose a las células y liberando su ácido nucleico viral, seguido por replicación del genoma viral. Después de que nuevas copias de proteínas y genes virales son sintetizadas, estos componentes se ensamblan en viriones de progenie, que después sales de la célula. Durante el paso de ensamble, el virus de la progenie debe seleccionar su ácido nucleico genómico de manera eficiente desde un acervo grande de ácidos nucleicos virales y celulares presentes en el citoplasma. El empaque de genomas virales en viriones típicamente implica el reconocimiento por los componentes virales de una secuencia de acción cis en el ácido nucleico viral, la llamada "señal de empaque". Al definir dichas señales es importante entender el ciclo de vida viral y proveer información que se podría usar para construir vectores virales para la expresión de proteínas extraños. De hecho, la utilidad de retrovirus como vehículos para vectores de suministro de gen para la expresión de proteínas extrañas se puede atribuir en gran medida al conocimiento bien establecido del proceso de su empaque de ARNv de los viriones de la progenie. Las señales de empaque genómicas de otros virus de ARN son poco entendidas, lo que impide el progreso en su uso como vectores para la expresión y suministro de genes extraño. El virus de la influenza A por ejemplo es un virus de ARN de cadena negativa envuelto cuyo genoma segmentado tiene una capacidad de codificación para la nucleoproteína (NP), la polimerasa básica 1 (PB1 ), la polimerasa básica 2 (PB2), la polimerasa acida (PA), la hemaglutinina (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y la proteína no estructural (NS1 y NS2). Este virus tiene dos glícoproteínas que abarcan la membrana, hemaglutínina (HA) y neuraminídasa (NA), sobre la envoltura. La proteína HA se une a los receptores que contienen ácido siálico sobre la superficie de la célula hospedero y media la fusión de la envoltura viral con membrana endosómico después de la endocitosis mediada por receptor. Por el contrario, la proteína NA juega un papel crucial tardío en la infección al remover ácido siálico de los sialiloligosacárídos, liberando así viriones recién ensamblados de la superficie celular y evitando la autoagregación de partículas virales. Dentro de la envoltura, el genoma viral, que comprende ocho segmentos de ARN virales diferentes (ARNv), es apretadamente enlazado a la nucleoproteína (NP) y proteínas de polimerasa (PA, PB1 , y PB2), formando los complejos de ribonucleoproteína. Todos los ocho (o en el caso de virus de tipo C: todos los sietes) segmentos de gen funcional se requieren para producir virus infeccioso. Varias mutaciones en los genes de polimerasa se han descrito (WO2004/094466, WO2003/091401 , US 5578473, Fodor et al, J. Virol 77,5017-5020, 2003) que cambian la actividad de polimerasa o alteran la polímerasa en otra forma pero no hacen que pierdan su funcionalidad en sintetizar ARN viral para hacer virus que contengan dichas polimerasas mutadas incapaces de replicarse. En WO2004/094466, virus infecciosos con un gen PA mutado se produjo, mostrando así los beneficios de un sistema de selección que permite la producción y recuperación de virus infeccioso con genes mutados. En WO2003/091401 , se muestra la producción de virus infecciosos con mutaciones en genes de polimerasa para permitir la producción y recuperación de virus de la influenza con propiedades deseables pertinentes a la producción de virus de vacuna atenuados vivos, tales como sensibilidad a la temperatura u otros tipos de atenuación. En US 55788473, los segmentos de gen de polimerasa que posiblemente alteran la especificidad y reducen la actividad de varias polimerasas son sugeridos. Sin embargo, estos no se usaron para reconstituir virus, dejando solos a virus reconstituidos que han perdido su actividad de polimerasa juntos. Además, en ninguna de las aplicaciones anteriormente identificadas, las partículas defectuosas que han perdido su capacidad para replicarse se producen. Es bien sabido que cuando el virus de la influenza A se hacen pasar en una alta multiplicidad de infección, las partículas de virus defectuosas se generan las cuales carecen de uno o más segmentos de gen funcional. En dichas partículas de virus, uno o más genes funcionales son reemplazados por segmentos de gen de interferencia defectuosos (DI) debido a errores hechos por la polimerasa de virus de la influenza. Debido a la alta multiplicidad de infección, y por lo tanto la infección de células con más de 1 partícula de virus, los defectos de virus que contienen ARN de DI son complementados por virus que contienen copias intactas de los genes funcionales faltantes. Se mostró recientemente que ciertas mutaciones en el gen de polimerasa acida podrían incrementar la eficiencia de generación de partículas de virus con genes defectuosos (Fodor 2003). Es importante notar que la generación de partículas de virus defectuosos en estos experimentos y la complementacíón ocurre ambas en forma aleatoria en dichos experimentos. Este proceso aleatorio limita el uso de ARN de DI y las partículas de virus condicíonalmente defectuosas en aplicaciones prácticas. Más aún, cuando las partículas de virus defectuosas se producen usando estos métodos publicados, los virus competentes en cuanto a replicación de tipo silvestre se producen además de los virus condicionalmente defectuosos deseados. Dichos virus competentes en cuanto a replicación pueden ser ya sea completamente de tipo silvestre (el virus auxiliar) o reclasifícaciones que resultan de mezclas genéticas del virus auxiliar con el virus defectuoso. El proceso de empaque de los segmentos de gen del virus de la influenza, ya sea a través de un mecanismo aleatorio o uno específico, ha estado bajo debate durante muchos años. Piezas de evidencia de ambas opciones se han descrito. La evidencia de empaque aleatorio es que las partículas de virus agregadas tienen una infectividad más alta que las partículas de virus no agregadas y que cuando el cultivo de células es infectado a un modo de infección (bajo), algunas células infectadas carecen de la expresión de un segmento que sugiere que hay viriones que no contienen el genoma de virus de la influenza entero. Evidencia adicional de empaque aleatorio es que los virus de la influenza contienen nueve segmentos han sido producidos experimentalmente. Un argumento para un empaque específico es que aunque todos los segmentos de gen están presentes en cantidades iguales en abastecimientos de virus, están presentes en las células productoras en diferentes cantidades. Además, cuando las partículas de interferencia defectuosas (DI) son generados, el ARNv de DI reemplaza el segmento del cual se deriva (una partícula de interferencia defectuosa es una partícula de virus en la cual uno de los segmentos de gen tiene una deleción interna grande. Estas partículas ocurren cuando el virus se hace pasar en un moi alto). Finalmente, la eficiencia de formación de virión incrementa con un número cada vez mayor de segmentos de gen.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Partículas de virus de influenza defectuosas (v.gr., Mena I. et al., J. Virol. 70:5016-24 (1996); Neumann G. et al., J. Virol 74:547-51 (2000), pueden ser útiles candidatos de vacuna porque inducirán anticuerpos contra otras proteínas virales además de HA y NA y, si son capaces de entrar a la célula hospedero, porque pueden inducir respuestas inmunes celulares contra el virus (v.gr., células T auxiliares, células T citotóxícas) además de respuestas humorales. Hasta ahora, la producción de partículas de virus de la influenza defectuosas han sido logradas por transfección (MENA I. et al., J. Virol. 70:5016-24 (1996); Neumann G. et al., J. Virol, 74:547-51 (2001 ), reduciendo las posibilidades produciendo grandes cantidades de dichas partículas. Una alternativa a este enfoque sería producir partículas de virus que sean condicionalmente defectuosas, permitiéndoles replicarse en un sistema de producción definido, pero no en células normales o sistemas de producción. Para este fin, las células de sistema de producción serían modificadas para permitir la producción de uno o más genes de virus de influenza o productos de genes, permitiendo la transcomplementación de una partícula de virus de influenza defectuosa. La presente invención por primera vez describe transcomplementación definida de partículas de virus de la influenza defectuosas. En el laboratorio, la transcomplementación de partículas de virus de la influenza se ha observado cuando virus de la influenza defectuosa son complementados en las mismas células por virus que portan la versión de tipo silvestre del segmento de gen de interferencia defectuosa. Este "sistema natural" de transcomplementación no es útil para producir partículas de virus de la influenza condicionalmente defectuosas definidas. Primero, el sistema requiere la complementación de un virus defectuosos (parcialmente) por lo menos un virus competente en cuanto a replicación (parcialmente) que pueda dar por resultado la producción no deseada de virus infeccioso. Segundo, puesto que la producción de partículas de interferencia defectuosa ocurre en forma aleatoria a los segmentos de gen diferentes, no es posible producir partículas de virus condicionalmente defectuosas definidas. Las partículas de virus de influenza condicionalmente defectuosas teóricamente se pueden basar en la deleción de segmentos de gen enteros o partes de los mismos. La capacidad para producir partículas de virus condicíonalmente defectuosas definidas al deletar segmentos de gen enteros (y producir el producto(s) de gen codificado in-trans) sería limitado si el empaque del genoma de virus de la influenza se basa en la presencia de todos los 8 segmentos, lo que es un asunto de gran debate (véase en otra parte de esta descripción). Si el proceso de empaque requiere la presencia de todos los 8 segmentos de gen, se sabe que todos los segmentos de gen necesitan estar presentes en una forma de longitud completa, lo cual complica la producción de partículas de virus condicionalmente defectuosas aún posteriormente. La presente invención ha resuelto estos problemas. La invención provee un método para obtener una partícula de virus de la influenza condicionalmente defectuosa que comprende un primer paso de transfectar una primera célula o células adecuadas tales como una célula 293T con una construcción de gen que tiene deleciones internas, tales como p?PB2, p?PB1 , p?PA o pDIPA como se provee aquí derivados al deletar internamente un ácido nucleico que codifica una polimerasa de influenza por lo que dicha construcción de gen es incapaz de producir una polimerasa funcional capaz de copiar o sintetizar ARN viral, y con segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza complementarios que codifican un virus de la influenza, tal como las siete construcciones complementarias que codifican A/WSN/33 (HW181-188, Hoffmann et al., 2000) y con un plásmido de expresión capaz de expresar dicha polimerasa en la célula, tal como uno de HMG-PB2, HMG-PB1 , HMG-PA como se provee aquí y cosechando por lo menos una partícula viral del sobrenadante de la primera célula o células en un punto de tiempo adecuado, tal como dentro de 10 a 50, preferiblemente a aproximadamente 20 a 30 horas después de la transfección; y un segundo paso de transfectar una segunda célula o células adecuadas tales como una célula MDCK con un plásmido de expresión capaz de expresar dicha polimerasa en la célula; y un tercer paso de transfectar la segunda célula o células con sobrenadante que comprende por lo menos la partícula de virus obtenida de la primera célula; y un cuarto paso que comprende cosechar por lo menos una partícula de virus (ahora condicionalmente defectuosa a que los virus carecen de un segmento de gen que expresa una polimerasa funcional capaz de copiar o sintetizar ARN viral porque han empacado el segmento de gen con una deleción interna) la partícula de virus del sobrenadante de la primera célula o células en un punto de tiempo adecuado, tal como de 24 a 96, preferiblemente de 48 a 72 horas después de la transfeccíón. Se prefieren deleciones internas que hacen al segmento de gen incapaz de producir una proteína funcional, pero que no sean tan grandes como para impedir el empaque de los segmentos de gen del virus en partículas virales. Preferiblemente, estas deleciones se cuentan respectivamente de las regiones no codificadoras 5' y 3'. Para Influenza A, dichas deleciones preferidas empiezan por ejemplo en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 75, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 50 para la proteína PA, empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 43 y 75, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 50 para la proteína PB1 , empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 34 y 50, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 50 para la proteína PB2. Muy preferiblemente, estas deleciones: empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 100, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 100 para la proteína PA, empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 43 y 100, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 100 para la proteína PB1 , empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 34 y 100, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 100 para la proteína PB2. Muy preferiblemente aún, estas deleciones: empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 150, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 150 para la proteína PA, empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótídos 43 y 150, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 150 para la proteína PB1 , empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 34 y 150, y terminan en un 3'-nucleótído situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 150 para la proteína PB2. Muy preferíblemente aún, estas deleciones: empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 175, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 175 para la proteína PA, empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 43 y 175, y terminan en un 3'-nucleótído situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 175 para la proteína PB1 , empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 34 y 175, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 175 para la proteína PB2. Muy preferiblemente todavía, estas deleciones: empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 207, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 194 para la proteína PA, empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 43 y 246, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 197 para la proteína PB1 , empiezan en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 34 y 234, y terminan en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 209 para la proteína PB2. Aquí, los segmentos complementarios se definen como los segmentos que conducen a un conjunto completo de ocho segmentos de genes de, por ejemplo, virus de la influenza A. Por lo tanto, si el segmento 1 ya se usaba para producir un segmento defectuoso, los segmentos complementarios (no defectuosos) son los segmentos 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8. Si el segmento 2 es defectuoso, los segmentos complementarios son los segmentos 1 , 3, 4, 5, 6, 7 y 8, y así sucesivamente. Ventajosamente, la invención produces un método por el cual el virus auxiliar no se requiere o está presente. La invención provee una partícula de virus de la influenza aislada y condicionalmente defectuosa que carece de un segmento de ácido nucleico de virus de la influenza funcional (aquí también llamada partícula viral de influenza condicionalmente defectuosa) que codifica una polimerasa seleccionada del grupo polimerasa acida (PA), la polimerasa básica 1 (PB1 ) y la polimerasa básica 2 (PB2), dicha partícula siendo incapaz de generar o servir como una fuente para generar polimerasa para copiar o sintetizar ARN viral por lo que sólo y condicionalmente permite la generación de partículas virales replicadoras en células trans-complementadas con una polimerasa funcional. Además, la invención provee un método para obtener una partícula de virus de influenza condicíonalmente defectuosa que comprende proveer una célula por transcomplementacíón con una polimerasa de virus de la influenza funcional. En una modalidad preferida, una partícula de conformidad con la invención se replica en una célula complementada con el segmento de ácido nucleico análogo que está faltando en la partícula misma, v.gr., una partícula que carece de segmento de PA de ácido nucleico de virus de la influenza funcional se replica en una célula que por lo menos se ha provisto con un segmento de PA de ácido nucleico de virus de la influenza funcional, una partícula que carece de segmento de PB1 de ácido nucleico de virus de la influenza funcional se replica en una célula que por lo menos se ha provisto con un segmento de PB1 de ácido nucleico de virus de la influenza funcional, una partícula que carece de segmento de PB2 de ácido nucleico de virus de la influenza funcional se replica en una célula que por lo menos se ha provisto con un segmento de PB de ácido nucleico de virus de la influenza funcional respectivamente. En una modalidad preferida, la invención provee una partícula de conformidad con la invención que tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican las glicoproteínas virales, muy preferiblemente que tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican la nucleoproteína (NP), la hemaglutinina (HA), la neuraminídasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2). En una modalidad, se provee una partícula de conformidad con la invención que tiene segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que se derivan de virus de la influenza A. También, una partícula de conformidad con la invención se provee con un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza. También, la invención provee una célula aislada que comprende una partícula de conformidad con la invención, dicha célula siendo libre de virus de la influenza de tipo silvestre o virus auxiliar pero preferíblemente también habiendo sido provista o complementada con polímerasa de virus de la influenza polimerasa o un segmento de gen que codifica para la misma. En una modalidad preferida, dicha célula es una células 293T o MDCK trans-complementada. En una modalidad, la invención provee una célula aislada que comprende una partícula que carece de segmento de PA de ácido nucleico de virus de la influenza funcional, dicha célula siendo libre de virus de la influenza de tipo silvestre o virus auxiliar pero por lo menos que ha sido provista o complementada con un segmento de PA de ácido nucleico de virus de la influenza funcional o PA funcional. En otra modalidad, la invención provee una célula aislada que comprende una partícula que carece de segmento de PB1 de ácido nucleico de virus de la influenza funcional, dicha célula siendo libre de virus de la influenza de tipo silvestre o virus auxiliar pero por lo menos que ha sido provista con un segmento de PB1 de ácido nucleico de virus de la influenza funcional o PB1 funcional. En otra modalidad más, la invención provee una célula aislada que comprende una partícula que carece de un segmento de PB2 de ácido nucleico de virus de la influenza funcional, dicha célula siendo libre de virus de la influenza de tipo silvestre o virus auxiliar pero por lo menos que ha sido provista o complementada con un segmento de PB2 de ácido nucleico de virus de la influenza funcional o functional PB2. Además, la invención provee una composición que comprende una partícula de conformidad con la invención o una célula o material derivado de una célula de conformidad con la invención, y el uso de dicha composición para la producción de una composición farmacéutica dirigida para generar protección inmunológica contra infección de un sujeto con un virus de la influenza. Aquí, la invención provee un método para generar protección inmunológica contra infección de un sujeto con un virus de la influenza que comprende proveer a un sujeto que necesita el mismo de una composición de conformidad con la invención. También, la invención provee el uso de una partícula de virus de la influenza de conformidad con la invención para la producción de una composición dirigida a suministrar un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a una célula. También, la invención provee el uso de una partícula de conformidad con la invención para la producción de una composición farmacéutica dirigida al suministro de un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a las células de un sujeto, y un método para el suministro de un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a una célula o sujeto que comprende proveer a dicha célula o sujeto una partícula de conformidad con la invención. La invención provee una partícula viral de influenza condicionalmente defectuosa que carece de un segmento de virus de la influenza funcional cuando se compara con su genoma natural, es decir: comparado con virus de tipo A o B de tipo silvestre o auxiliar, que tiene siete (en vez de ocho) segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza funcionales diferentes o comparado con virus de tipo C de tipo silvestre o auxiliar, que tiene seis (en vez de siete) diferentes segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza funcionales. Cuando aquí se usa el término "condicionalmente defectuoso" incluye, pero no se limita a, partículas virales en donde uno de los segmentos de gen del virus tiene una deleción interna grande que da por resultado una proteína no funcional que es expresada del mismo. Todos los ocho segmentos de genes de, por ejemplo, virus de la influenza A y todas las proteínas codificadas por ellos se requieren para la producción de virus infecciosos. Un virus que contiene un segmento de gen defectuoso es por lo tanto auto-defectuoso: puede infectar a una célula y pasar a través de una ronda de replícación debido a que todas las proteínas viralesl estaban presentes en el virión (esta proteína, por ejemplo, fue producida por un plásmido de expresión cuando el virus se produjo) pero no se produjeron partículas virales infecciosas en la célula infectada porque una de las proteínas virales no puede ser producida por el virus. Sin embargo, cuando se infectan células que expresan la proteína que es normalmente expresada por el segmento de gen defectuoso, el virus defectuoso se puede replicar en estas células porque todas las proteínas virales están presentes. Por lo tanto, estos virus son condicionalmente defectuosos: no se replican a menos que una célula con la condición correcta se provea (en este caso una célula que expresa la proteína viral que no es codificada por el virus debido a la deleción en el segmento de gen). Además, la invención provee una partícula viral de influenza condicíonalmente defectuosa que carece de un segmento de ácido nucleico de virus de la influenza funcional que codifica polimerasa. Aquí, un segmento de ácido nucleico de virus de la influenza funcional comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de influenza funcional que permite y es requerida para generación de virus replicativos. Por ejemplo, el virus de la influenza A es un virus de ARN de cadena negativa con un genoma de 8 segmentos. Los 8 segmentos de genes codifican 11 proteínas; los segmentos de genes 1-8 codifican polimerasa básica 2 (PB2), polimerasa básica 1 (PB 1 ) y PB1-ORF2 (F2), polímerasa acida (PA), hemaglutinina (HA), nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA), proteínas de matriz 1 y 2 (M1 , M2) y proteínas no estructurales 1 y 2 (NS1 , NS2), respectivamente. Las regiones de codificación de los 8 segmentos de genes son flanqueadas por regiones no codificadoras (NCRs), que se requieren para síntesis de ARN viral. Los nucleótidos 13 y 12 extremos en los extremos 5' y 3' de los ARN genómicos virales, respectivamente, son conservados entre todos los segmentos de virus de la influenza A y son parcialmente complementarios, para formar una estructura secundaría reconocida por el complejo de polímerasa viral. Las NCRs pueden contener hasta 60 nucleótidos adicionales que no son conservados entre los 8 segmentos de genes, pero son relativamente conservados entre diferentes virus de la influenza. Las NCRs y secuencias flanqueadoras en las regiones codificadoras se pueden requerir para empaque de genoma de virus eficiente. Por lo tanto, un segmento de ácido nucleico de virus de la influenza funcional consiste de una secuencia con potencial de codificación para una proteína e influenza funcional que permita la generación del virus replicativo (1 ó 2 marcos de lectura abierta por segmento), las NCRs requeridas para transcripción de ARNm, ARN viral (ARNv) y ARN complementario al ARN viral (ARNc) y la señal de empaque radicando en la NCR y secuencias de codificación flanqueadoras. Se prefiere que dicha partícula de virus de la influenza condicionalmente defectuosa que carece de un ácido nucleico de virus de la influenza que carece del segmento que codifica polimerasa funcional, sea PA, PB1 o PB2. Además, para propósitos de vacuna, se prefiere que dicha partícula tenga el segmento(s) de ácido nucleico del virus de la influenza que codifica la glicoproteína(s) viral. En una modalidad, la invención provee una partícula de virus de la influenza A que tiene siete segmentos de ácido nucleico de influenza A diferentes. El virus defectuoso de la partículas de influenza de conformidad con la invención son capaces de replicarse, a pesar de que sólo una vez en animales o células hospederas adecuadas, aunque no complementadas. En células adecuadamente complementadas, las partículas de conformidad con la invención pueden replicar más rondas. Para propósitos de vacuna y suministro de genes, es una gran ventaja que las partículas defectuosas no puedan replicarse indefinidamente en células normales, no transcomplementadas, reduciendo así el riesgo de diseminar el virus de vacuna de un hospedero a otro y reduciendo el riesgo de reversión a virus de tipo silvestre. Esta es la primera vez que los virus de la influenza A defectuosos se producen usando genérica reversible que contiene únicamente siete segmentos de genes funcionales y que pueden pasar por una ronda de replicación, o múltiples rondas de replicación cuando el segmento de gen defectuoso es transcomplementado. En una modalidad, la invención provee una partícula viral de influenza condicionalmente defectuosa que carece de un segmento de ácido nucleico de influenza que codifica esencialmente polímerasa acida (PA). Similar a la transcomplementación de PA, se puede contemplar la trans-complementación de otros genes de virus de la influenza. Sin embargo, puesto que los niveles de expresión de PA han mostrado ser menos críticos cuando se comparan con niveles de expresión de otros virus de la influenza proteins, PA es el segmento de gen preferído del grupo de polimerasa que es deletado, virus deletados de PB2 y PB1 podrían producirse también y virus deletado de NP podrían no ser transcomplementados. En una modalidad preferida, la invención provee una partícula de virus de la influenza A condicionalmente defectuosa que tiene siete segmentos de ácido nucleico de influenza A diferentes y que carece de un segmento de ácido nucleico de influenza A que codifica esencialmente polimerasa acida. Para propósitos de vacuna, una partícula de virus de la influenza A condicionalmente defectuosa preferida de conformidad con la invención tiene los segmentos de ácido nucleico de influenza A que codifican esencialmente las proteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), estas proteínas siendo el más inmunológicamente relevante para conferir transfección. Para seleccionar los segmentos de genes apropiados para inclusión en una vacuna, se prefiere que los segmentos de genes se seleccionen de un virus que es recomendado por la OMS para uso como vacuna. Desde luego, los subtipos HA y NA pueden variar, dependiendo de los subtipos HA y NA de la variante de influenza contra los cuales se desea vacunar. Es más preferido generar una partícula viral de influenza condicionalmente defectuosa de conformidad con la invención que tiene las segmentos de ácido nucleico de influenza A que codifican esencialmente la nucleoproteína (NP), la polimerasa básica 1 (PB1 ), la polimerasa básica 2 (PB2), la hemaglutinina (HA), la neuraminídasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2), que codifican esencialmente aquí en particular indicando que una proteína funcional se exprese a partir del segmento de gen respectivo. Dicha partícula se provee particularmente en una célula aislada provista con PA funcional o un segmento de gen funcional que codifica PA. En otra modalidad, aquí se provee una partícula viral de influenza condicionalmente defectuosa de conformidad con la invención que tiene los segmentos de ácido nucleico de influenza A que codifican esencialmente la nucleoproteína (NP), la polimerasa acida (PA), la polímerasa básica 2 (PB2), la hemaglutinína (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2), que codifican esencialmente aquí en particular indicando que una proteína funcional se expresa a partir del segmento de gen respectivo. Dicha partícula se provee particularmente en una célula aislada provista con PB1 funcional o un segmento de gen funcional que codifica PB1 . En otra modalidad, aquí se provee una partícula de virus de la influenza defectuosa de conformidad con la invención que tiene los segmentos de ácido nucleico de influenza A que codifican esencialmente la nucleoproteína (NP), la polímerasa acida (PA), la polimerasa básica 1 (PB1 ), la hemaglutinina (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2), que codifican esencialmente aquí en particular indicando que una proteína funcional es expresada desde el segmento de gen respectivo. Dicha partícula se provee particularmente en una célula aislada provista con PB2 funcional o un segmento de gen funcional que codifica PB2. En otra modalidad, la invención provee partículas de conformidad con la invención provistas además con un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza, v.gr., que codifica una proteína extraña o péptido útil para inducir una respuesta inmune, o provista con un ácido nucleico capaz de interferir con las funciones de una célula o patógeno en una célula. Además, la invención provee una célula que comprende una partícula de virus de la influenza de conformidad con la invención. Cuando la partícula no ha sido provista con un segmento de gen que codifica esencialmente la polimerasa requerida, es útil considerar una célula que haya sido provista con virus adecuadamente funcional de la influenza polimerasa, permitiendo múltiples rondas de replícación del virus defectuoso de la partículas de influenza en una célula así complementada. También, la invención provee una composición que comprende un virus defectuoso de la partícula de influenza de conformidad con la invención o una célula o material derivado de una célula de conformidad con la invención; dicha composición por ejemplo se puede usar para la producción e una composición farmacéutica dirigida a generar protección inmunológica contra infección de un sujeto con un virus de la influenza. También, la invención provee un método para generar protección inmunológica contra infección de un sujeto con un virus de la influenza que comprende proveer a un sujeto que necesita el mismo con dicha composición. Además del uso de partículas de conformidad con la invención como vacuna o composición inmunogénica, dichas composiciones se formulan preferiblemente como una vacuna, es decir, mezclando partículas vírales, o proteínas virales derivadas de dichas partículas (vacunas divididas) con un vehículo farmacéutico apropiado tal como una solución salina o adyuvante (v.gr., una sal de aluminio u otro excipiente comúnmente usado (véase, por ejemplo, http://wvw.cdc.gOv/nip/publjcations/pinMAppendices/A Excjpjent.pdf.). Las partículas de virus de la influenza condicionalmente defectuosas de conformidad con la invención también son vectores candidatos para suministro de gen extraño y para expresión de una proteína extraña, ya que un gen funcional, por ejemplo, puede ser insertado entre las secuencias de PA 5' y 3'. Considerando que la invención provee un método para obtener una partícula viral de influenza condicionalmente defectuosa, posiblemente provista con un segmento de ácido nucleico extraño u hospedero o fragmento del mismo, que comprende un primer paso de transfectar una primera célula o células adecuadas, con una o más construcciones de genes derivadas por deleción interna de un ácido nucleico que codifica una proteína de influenza por lo que dichas construcciones de genes son incapaces de producir a proteína funcional y no impiden el empaque de los segmentos de gen del virus en partículas vírales y con segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza complementarios que codifican un virus de la influenza, y con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar dichas proteínas en la célula, y cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de la primera célula o células en un punto de tiempo adecuadas después de la transfección; y un segundo paso de transfectar una segunda célula o células adecuadas con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar dichas proteínas en dicha célula; y un tercer paso de infectar la segunda célula o células con sobrenadante que comprende por lo menos una partícula de virus obtenida de la primera célula; y un cuarto paso que comprende cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de la segunda célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la infección. Aquí, la invención provee un método para obtener una partícula viral de influenza condicionalmente defectuosa que comprende el paso de transfectar una célula o células adecuadas, con una o más construcciones de genes derivadas de deleción interna de un ácido nucleico que codifica una influenza polimerasa por lo que dichas construcciones de genes son incapaces de producir una polimerasa funcional, pero sin impedir el empaque de los segmentos de gen del virus en las partículas virales y con segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza complementarios que codifican un virus de la influenza, y con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar las polimerasas en dicha célula, y cosechar por lo menos una partícula viral del sobrenadante de dicha célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la infección. El método para obtener una partícula de virus de influenza condicíonalmente defectuosa comprende un primer paso de transfectar una célula o células adecuadas con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar polimerasas de influenza en dicha célula; y un segundo paso de infectar dicha célula o células con sobrenadante que comprende partículas de virus de la influenza condícionalmente defectuosas; y un tercer paso que comprende cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de dicha célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la infección, o un método para obtener una partícula de virus de influenza condicionalmente defectuosa que comprende un primer paso de transfectar una primera célula o células adecuadas, con una o más construcciones de genes derivadas por dilución interna de un ácido nucleico que codifica una polimerasa de influenza por lo que dichas construcciones de genes son incapaces de producir una polimerasa funcional, pero no impiden el empaque de los segmentos de gen del virus en partículas virales y con segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza complementarios que codifican un virus de la influenza, y con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar las polimerasas en dicha célula, y cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de la primera célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la transfección; y un segundo paso de transfectar una segunda célula o células adecuadas con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar las polimerasas en dicha célula; y un tercer paso de infectar la segunda célula o células con sobrenadante que comprende por lo menos una partícula de virus obtenida de la primera célula; y un cuarto paso que comprende cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de la segunda célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la infección. En los métodos, las polimerasas pueden ser, por ejemplo, polimerasa acida (PA), polimerasa básica 1 (PB1 ) o polimerasa básica 2 (PB2). Preferiblemente, la invención provee un método por el cual la deleción interna resulta de deleción interna de un ácido nucleico que codifica una polimerasa de influenza que empieza en un 5'-nucleót¡do situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 207 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 194 contados desde la región no codificadora para la proteína PA, alternativamente empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 43 y 246 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótído situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 197 contados desde la región no codificadora para la proteína PB1 , alternativamente empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 34 y 234 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 209 contados desde la región no codificadora para la proteína PB2. En otra variante, un fragmento extraño es insertado en esta deleción interna. Además, la invención provee un método por el cual la célula o células que han de ser infectadas con sobrenadante que comprende partículas de virus de la influenza condícionalmente defectuosas ya expresan las polimerasas no funcionales, tales como una polimerasa acida (PA), polimerasa básica 1 (PB1 ) o polimerasa básica 2 (PB2), y partículas de influenza obtenidas por un método como se provee aquí. Por ejemplo, aquí se considera que la célula o células que han de ser transfectadas con las construcciones de genes y segmentos de ácido nucleico ya expresan las polimerasas no funcionales. En particular, la invención provee una partícula de virus de la influenza que comprende uno o más segmentos de ácido nucleico con una deleción interna en el segmento que hace al segmento incapaz de producir una polimerasa de influenza funcional, pero no impide el empaque del segmento de gene del virus en partículas virales, por lo que la polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa acida (PA), polimerasa básica 1 (PB1 ) o polimerasa básica 2 (PB2). Se prefiere que la deleción interna: empieza en un d'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 207 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 194 contados desde la región no codificadora para la proteína PA, empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 43 y 246 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótído situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 197 contados desde la región no codificadora para la proteína PB1 , empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótídos 34 y 234 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 209 contados desde la región no codificadora para la proteína PB2. En una modalidad preferida, la invención provee una partícula de conformidad con la invención que tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican las glicoproteínas virales. La invención también provee una partícula de conformidad con la invención que tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican la nucleoproteína (NP), la polímerasa básica 1 (PB1 ), la polimerasa básica 2 (PB2), la hemaglutinína (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2), o una partícula que tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican la nucleoproteína (NP), la polimerasa acida (PA), la polimerasa básica 2 (PB2), la hemaglutinína (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2), o una partícula que tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican la nucleoproteína (NP), la polimerasa acida (PA), la polímerasa básica 1 (PB 1 ), la hemaglutinina (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2). En particular, la invención provee una partícula de conformidad con la invención que tiene segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que son derivados de virus de la influenza A. La invención también provee una partícula de conformidad con la invención provista con un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza. Además, la invención provee una célula que comprende una partícula de conformidad con la invención, en particular una célula que ha sido provista con una o más polimerasas de virus de la influenza por lo que la polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa acida (PA), polimerasa básica 1 (PB1 ) o polímerasa básica 2 (PB2). Además, la invención provee una composición que comprende una partícula de conformidad con la invención o una célula o material derivado de una célula de conformidad con la invención, el uso de dicha composición para la producción de una composición farmacéutica dirigida a la generación de protección inmunológica contra infección de un sujeto con un virus de la influenza, y un método para generar protección inmunológíca contra infección de un sujeto con un virus de la influenza que comprende proveer a un sujeto que necesita el mismo con dicha composición. Además, la invención provee el uso de una partícula de conformidad con la invención para la producción de una composición dirigida al suministro de un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a una célula, y el uso de una partícula de conformidad con la invención para la producción de una composición farmacéutica dirigida al suministro de un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a las células de un sujeto. Dicho ácido nucleico (aquí también llamado un ácido nucleico extraño) puede codificar un gen o fragmento de gen extraño que codifique un epitope antigénico o proteína apropiada, o puede codificar una extensión de nucleótidos capaces de interferir con la transcripción de ácido nucleico en una célula. En una modalidad, la invención provee el uso de una partícula de virus de la influenza A de conformidad con la invención para la producción de una composición dirigida al suministro de un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a una célula o célula de un sujeto. Además, la invención provee un método para suministrar un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a una célula o un sujeto que comprende proveer a la célula o el sujeto con una partícula de virus de la influenza defectuosa provista con un ácido nucleico extraño de conformidad con la invención.
Leyendas de figura Leyenda con la figura 1 La producción y propagación de virus de influenza A condicionalmente defectuoso. Primero, células 293T fueron transfectadas con 7 plásmidos bídireccionales que codificaban A/PR/8/34, pHMG-PA y, si es apropiado, p?PA o pDIPA. 48 horas después de la transfección, los sobrenadantes de células transfectadas se cosecharon y se usaron para inocular células MDCK y células MDCK transfectadas con HMG-PA 24 horas más temprano. El sobrenadante de las células MDCK-PA positivas para replicación de virus se hicieron pasar sobre células MDCK y MDCK-PA 4 veces.
Leyenda con la figura 2 Construcciones usadas para generar partículas virales condícionalmente defectuosas. La parte superior muestra un segmento de gen PA del tipo silvestre. Regiones no codificadoras (NCRs), y codones de iniciación se indican. p?PA se construyó por digestión de pHW183, un plásmido bidireccional que contenía PA de A/WSN/33 (9) con Stuf y religación subsecuente. pDIPA se construyó clonando los 5' 194 y 3' 207 nts del segmento de gen PA de A/PR/8/34 en pSP72. El inserto después fue transfectado a un vector de genética inversa bidireccional. p?PB1 y p?PB2 se construyeron como se describe en el texto.
Leyenda con la figura 3 Análisis de RT-PCR para la presencia del segmento de gen PA en sobrenadantes rPR8-7, rPR8-?PA y rPR8-DIPA. Sobrenadantes de pasaje 4 de MDCK-PA se hicieron pasar a través de un filtro de 22 µM y se concentraron por centrifugación. Subsecuentemente, el ARN se aisló y RT-PCR se realizó usando iniciadores dirigidos a regiones no codificadoras del segmento PA. ARN aislado de A/PR/8/34 de tipo silvestre se usó como un control. Franja 1 : rPR8-7; franja 2: rPR8-?PA; franja 3: rPR8-DIPA; franja 4: A/PR/8/34 de tipo silvestre. Los tamaños del marcador se indican a la izquierda.
Leyenda con la figura 4 Partes más grandes adicionales de la construcción p?PA que fueron deletadas, dieron por resultado p?PA-2, p?PA-3, p?PA-4, p?PA-5.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLO 1 Generación de partículas de virus de la influenza A defectuosas a partir de ADN recombinante Virus de la influenza A es un virus segmentado de sentido negativo. El genoma consiste de ocho segmentos de gen. Todos los ocho segmentos de gen funcionales se requieren para producir virus infeccioso, es decir, virus replicativos que es capaz de ¡limitadas o por lo menos varias rondas de replicación en células comúnmente consideradas adecuadas para replicación de virus de la influenza. El proceso de empaque de los segmentos de gen del virus de la influenza A, ya sea a través de un mecanismo aleatorio o un mecanismo específico, ha estado bajo debate por muchos años. Piezas de evidencia para ambas opciones se han descrito. La evidencia para empaque aleatorio es que las partículas de virus agregadas tienen una ¡nfectividad mayor que las partículas de virus no agregadas (6) y que cuando un cultivo de células es infectado a un moi bajo, algunas células infectadas carecen de la expresión de un segmento (8), ambas sugiriendo que hay viriones que no contienen el genoma del virus de la influenza entero. La evidencia adicional de empaque aleatorio es que virus de la influenza que contiene 9 segmentos han sido producidos experimentalmente (4). Bancroft y Parslow encontraron que no hubo competencia entre ARNv que se originen del mismo segmento de gen para empacar en el virión (1 ). Un argumento para el proceso de empaque específico es que aunque todos los segmentos de gen están presentes en cantidades iguales en abastecimiento de virus, están presentes en las células productoras en cantidades diferentes (10). Además, cuando partículas de interferencia defectuosas (DI) se generan, el ARNv de DI reemplaza al segmento del cual se deriva (3) (una partícula de interferencia defectuosa es una partícula de virus en la cual uno de los segmentos de gen tiene una deleción interna grande. Estas partículas ocurren cuando el virus se hace pasar a un moi alto y también se piensan que ocurren debido a una mutación de R638A de la proteína acida de polimerasa [Fodor et al; J. Virol. 77, 5017-5020, 2003]). Finalmente, la eficiencia de formación de virión se incrementa con un número cada vez mayor de segmentos de gen (5). Fujii et al., también mostraron la región de segmento de NA que se requiere para la incorporación eficiente del segmento en el virión y posteriormente el mismo grupo también mostró la región de HA y NS importante o empaque en la partícula de virus [Fujii, 2005 #256; Watanabe, 2003 #184]. Aquí, los inventores de la presente presentan evidencia para empaque específico. A fin de producir partículas de virus que contienen únicamente segmentos de gen funcionales, necesitan determinar qué segmento de gen puede quedar sin anular la producción de virus. A la luz del uso de un virus deficiente en replicación como una vacuna, HA y NA no se dejaron, y tampoco lo fueron MA o NS porque en ese caso se necesitaron 2 plásmidos de expresión separados. Los inventores de la presente produjeron virus que carecían de gen de polimerasa. No pudieron producir virus cuando el segmento de gen deletado no estaba trans-complementado con un plásmído de expresión (cuadros 1 , 2 y 3, rPR8-7ntc) el virus se pudo producir bajo transfección de siete segmentos de gen y un plásmido que expresaba la proteína normalmente expresada por el segmento de gen deletado a títulos muy bajos (cuadros 1 , 2 y 3, rPR8-7). Por lo tanto, los mutantes por deleción de segmentos de gen 1 , 2 y 3 de virus de la influenza AA? SN/33 se produjeron los cuales portaron una delecíón interna de 1032, 528 y 1 120 nucleótídos, respectivamente. Esos mutantes por deleción se denominaron p?PB2, p?PB1 y p?PA, véase figura 2). Células 293T fueron transfectadas como se describió anteriormente (De Wit, E., M. I. Spronken, T.M. Bestebroer, G.F. Rimmelzwaan, A. D. Osterhaus, y R. A. Fouchier. 2004. Efficíent generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments. Virus Res 103:155-61 ) con uno de cada de estos segmentos de gen deletados y siete construcciones bidireccíonales complementarias que codificaban A/PR/8/34 (De Wit et. al, 204) y el plásmido de expresión apropiado. Los sobrenadantes se cosecharon 48 horas después de la transfección. Subsecuentemente, células MDCK fueron transfectadas como se describió anteriormente (2) con uno de los plásmidos de expresión HMG-PB2, HMG-PB1 o HMG-PA. Estas células transfectadas fueron inoculadas con el sobrenadante correspondiente de las células 293T transfectadas (véase figura 1 para explicación del procedimiento experimental). La replicación de virus en estas células MDCK se determinó por pruebas de HA. Inicialmente, no hubo replicación de virus en células MDCK no transfectadas. La replicación de virus se mostró en células MDCK transfectadas ya sea con HMG-PB2, HMG-PB1 o HMG-PA inoculadas con el sobrenadante correspondiente. Enseguida, los inventores de la presente clonaron un segmento de gen de PA defectuoso con base en la secuencia de un ARNv de PA de interferencia defectuoso del virus de la influenza A/PR/8/34 obtenido de la base de datos de secuencia de influenza (www.flu.lanl.gov, número de acceso K00867). El 5' 207 nt y 3' 194nt de PA fueron amplificados por PCR y clonados en un vector de transcripción bidireccional derivado de pHW2000 (7) que fue modificado como se describió anteriormente (De Wit et al., 2004). El plásmído resultante se denominó pDIPA, (véase figura 2). Células 293T fueron transfectadas con pDIPA, HMG-PA y 7 construcciones bidireccionales que codificaban los segmentos de gen restantes del virus de la influenza A PR 8/34 (véase figura 2). El sobrenadante se cosechó 48 horas después de la transfección y subsecuentemente, células MDCK transfectadas con HMG-PA 24 horas antes, fueron inoculadas con el sobrenadante. Una prueba de HA se realizó sobre el sobrenadante de estas células MDCK 72 horas después de la inoculación y se encontró que eran positivas, indicando replicación de virus en estas células. La inoculación de células MDCK no transfectadas tampoco dio por resultado en producción de virus como se determinó por prueba de HA. El paso subsecuente de sobrenadantes que contenían partículas de virus defectuosas de PA sobre células MDCK ya sean transfectadas o no transfectadas con HMG-PA condujo al mismo resultado (cuadro 1 ). Hasta el pasaje 4, el virus se produjo en células MDCK transfectadas con HMG-PA. El sobrenadante de MDCKp4 se diluyó en serie para obtener una indicación de título de virus, que se mostró que era de aproximadamente 104 TCID50/ml. Los pasos del método usados fueron: células 293T son transfectadas (para protocolo de transfección, véase De Wit et al., 2004) con una de las construcciones p?PB2, p?PB1 , p?PA, p?NP, las siete construcciones complementarias que codifican A PR 8/34 (De Wit et al. , 2004) y uno de HMG-PB2, HMG-PB1 , HMG-PA, (plásmídos de expresión son por ejemplo descritos en Pleschka, S., R. Jaskunas, O. G. Engelhardt, T. Zurcher, P. Palese, y A. Garcia-Sastre. 1996. A plasmad-based reverse genetics system for influenza A virus. J Virol 70:4188-92; obtenidos de A. Garcia-Sastre y P. Palese). A las 48 horas después de la transfección, el sobrenadante de las células 293T transfectadas se cosechan. Cuando los virus se produjeron, están presentes en el sobrenadante. Al mismo tiempo, células MDCK son transfectadas (para protocolo de transfección véase Basier et al., 2000) con uno de los plásmidos de expresión HMG-PB2, HMG-PB1 , HMG-PA, (dependiendo del mutante por deleción usado, por lo que en caso de usar p?PB2, las células MDCK ahora son transfectadas con HMG-PB2) debido a que los virus producidos carecen de un segmento de gen que expresa esta proteína porque ha empacado el segmento de gen con una deleción interna. A 24 horas después de la transfección, las células MDCK transfectadas son inoculadas con el sobrenadante obtenido a partir de las células 293T transfectadas. Cuando el virus está presente en el sobrenadante 293T, el virus ahora se replicará en las células MDCK transfectadas y se producen más virus. Este sobrenadante nuevamente puede ser cosechado 72 horas después de la inoculación. Para probar que no ocurrió recombinación de PA o DIPA que diera por resultado un segmento de gen PA funcional, el ARN se aisló del sobrenadante de MDCKp4. Primero, los sobrenadantes se hicieron pasar a través de un filtro de 22 µM y se concentraron por centrifugación. Subsecuentemente, el ARN se aisló y un RT-PCR se realizó usando iniciadores dirigidos a las regiones no codificadoras del segmento PA. RT-PCR realizado con iniciadores específicos para ARNv de PA mostraron que p? y DIPA permanecieron estables sobre múltiples pasos. En el sobrenadante de células MDCK infectadas con partículas de virus DIPA, una banda clara de aproximadamente 400pb aparece, en el sobrenadante de células MDCK infectadas con virus que contiene ?PA, una banda de 110pb aparece. En el sobrenadante de células MDCK infectadas con el tipo silvestre A PR/8/34 una banda de aproximadamente 2300nt es visible (figura 3). Estos resultados indican que el segmento de gen ?PAPR8 es establemente empacado en viriones.
Para producir virus que carecen de PB2, células 293T fueron transfectadas con 7 construcciones bidireccionales (Hoffmann, E., G. Neumann, Y. Kawaoka, G. Hobon, y R. G. Webster. 200. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Nati Acad Sci U S A 97:6108-13) que codificaban segmentos de gen 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 de virus de la influenza A/PR/8/34 (De Wit, E., M. I. Spronken, T. M. Bestebroer, G. F. Rimmelzwaan, A. D. Osterhaus, y R. A. Fouchier. 2004. Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight Cdna fragments. Virus Res 103:155-61 ), dando por resultado la expresión de ARNv y ARNm. Un plásmido que expresaba PB2 de A/PR 8/34, pHMG-PB2 (Pleschka, S., R. Jaskunas, O. G. Engelhardt, T. Zurcher, P. Palese, y A. Garcia-Sastre. 1996. A plasmad-based reverse genetics system for influenza A virus. J Virol 70:4188-92) fue co-transfectado. Como un control, sólo las 7 construcciones bidireccíonales que codificaban A/PR/8/34 fueron transfectadas, omitiendo pHMG-PB2. Los sobrenadantes se cosecharon 48 horas después de la transfección y se inocularon en células MDCK o células MDCK transfectadas con pHMG-PB2 (MDCK-PB2) en una caja de 100 mm 24 horas más temprano. Tres días después de la inoculación, el sobrenadante de las células MDCK inoculadas se probó para actividad de hemaglutinación usando eritrocitos de pavo como un indicador para la producción de virus. No se detectó virus en células inoculadas con sobrenadante de células 293T transfectadas con 7 segmentos de gen, sin pHMG-PB2 (rPR8-7ntc, cuadro 2). El sobrenadante de células MDCK-PB2 inoculadas con sobrenadante de células 293T transfectadas con 7 segmentos de gen más pHMG-PB2 fue positivo. Subsecuentemente, el sobrenadante rPR8-7 se hizo pasar en células MDCK y MDCK-PB2. rPR8-7 se replicó en células MDCK-PB2, pero no en células MDCK (cuadro 2). Los inventores de la presente generaron un mutante por deleción 103nt de un segmento de gen 1 del virus de la influenza A/WSN/33, dando por resultado una delecíón de 344 aminoácidos (p?PB2, figura 2). Virus recombinante que contenía ?PB2 (rPR8-?PB2) se produjo como se describió antes (figura 1 ). No se pudo detectar virus en células MDCK, mientras que el virus se detectó en las células MDCK-PB2 inoculadas con rPR8-?PB2. Después de pasar rPR8-?PB2 no hubo evidencia de producción de virus en células MDCK, en contraste con células MDCK-PB2 (cuadro 2). También se produjeron virus que carecían de PB1. Células 293T fueron transfectadas con 7 construcciones bidireccionales que codificaron segmentos de gen 1 , 3, 4, 5, 6, 7 y 8 de virus de la influenza A/PR/8/34, dando por resultado la expresión de ARNv y ARNm. Un plásmido que expresaba PB1 de A/PB/8/34, pHMG-PB1 fue co-transfectado. Como un control, sólo las 7 construcciones bidireccionales que codificaban A PR/8/34 fueron transfectadas, omitiendo pHMG-PB1. Los sobrenadantes fueron cosechados 48 horas después de la transfección e inoculados en células MDCK o células MDCK transfectadas con pHMG-PB1 (MDCK-PB1 ) en una caja de 100 mm 24 horas más temprano (2) (figura 1 ). Tres días después de la inoculación, el sobrenadante de las células MDCK inoculadas se probó para actividad de hemoglutinacíón usando eritrocitos de pavo como un indicador para producción de virus. No se detectó virus en células inoculadas con sobrenadante de células 293T transfectadas sólo con 7 segmentos de gen, sin ?HMG-PB1 (rPR8-7ntc, cuadro 3). El sobrenadante de células MDCK-PB1 inoculado con sobrenadante de células 293T transfectado con 7 segmentos de gen más pHMG-PB1 fue positivo. Subsecuentemente, el sobrenadante de rPR8-7 se hizo pasar en células MDCK y MDCK-PB1. rPR8-7 se replicó en células MDCK-PB1 , pero no en células MDCK (cuadro 3). Los inventores de la presente generaron un mutante por deleción 528nt de un segmento de gen 2 del virus de la influenza A/WSN/33, dando por resultado una deleción de 178 aminoácidos (p?PB1 , figura 2). Virus recombinantes que contenían ?PB1 (rPR8-?PB1 ) se produjeron como se describió antes (figura 1 ). No se pudo detectar virus en células MDCK, mientras que el virus fue detectado en las células MDCK-PB1 inoculadas con rPR8-?PB1 . Después de hacer pasar rPR8-?PB1 no hubo evidencia de producción de virus en células MDCK, en contraste con células MDCK-PB1 (cuadro 3). Los inventores de la presente por lo tanto han podido producir virus que carecen de segmentos 1 , 2, ó 3, al proveer construcciones p?PB2, p?PB1 , o p?PA/pDIPA y trans-complementación usando plásmidos de expresión PB2, PB1 o PA impulsados por ARN polimerasa II como se describió antes. Los virus condicionalmente defectuosos descritos aquí sólo pueden ir a través de una ronda de replicacíón en células que son no trans-complementadas, pero se pueden propagar en líneas de células de trans- complementación. Esta es la primera vez que los virus defectuosos son producidos usando genética inversa que contiene sólo siete segmentos de gen funcional y que pueden pasar por una ronda de replicación, o múltiples rondas de replicación cuando el segmento de gen defectuoso es transcomplementado. Las partículas virales defectuosas producidas de esta manera son candidatos a vacunas, ya que pueden ir a través de una ronda de replicación, sin producir virus infeccioso. Un resultado de esta ronda de replicación individual es que la vacuna induce tanto una respuesta inmune humoral como una celular. A pesar del hecho de que las partículas defectuosas no se replican en células regulares, para propósitos de producción una gran cantidad de virus pueden crecer en una línea de células que expresen la proteína defectuosa. Como lo han mostrado los inventores de la presente, múltiples rondas de replicación no afectan el genotipo del virus. Además, el uso de particulas virales defectuosas como vacuna, también son vectores candidatos para suministro de genes y para expresión de una proteína extraña, ya que un gen funcional puede ser insertado entre las secuencias PA, PB2 o PB1 5' y 3'. Esto también fue mostrado por Watanabe et al. (11 ) quienes reemplazaron tanto HA como NA con genes extraños y sin embargo pudieron producir virus.
Truncaciones adicionales de p?PA Además, partes más grandes de la construcción de p?PA que fueron deletados, dieron por resultado p?PA-2, p?PA-3, p?PA-4, p?PA-5 (figura 4). Células 293T fueron transfectadas como se describió anteriormente (De Wít et al., 2004) con uno de cada uno de estos segmentos de gen deletados y siete construcciones bidireccionales complementarias que codifican A/PR/8/34 (De Wit et al, 2004) y un plásmido de expresión que expresa PA. Los sobrenadantes se cosecharon 48 horas después de la transfección. Subsecuentemente, células MDCK fueron transfectadas como se describió anteriormente (Basier, C. F., et al., 2000. Proc Nati Acad Sci U S A 97:12289-94). Con el plásmido de expresión HMG-PA. Estas células transfectadas y células no transfectadas fueron inoculadas con el sobrenadante de las células 293T transfectadas. La replicación de virus en estas células MDCK y MDCK-PA se determinó por prueba de HA. No hubo replicación de virus en células MDCK no transfectadas. La replicación de virus se mostró en células MDCK transfectadas con HMG-PA inoculadas con cualquiera de los sobrenadantes. Todos los ARNv que resultaron de estas construcciones se empacaron por lo tanto en viriones (cuadro 4).
CUADRO 1 Replicación de virus de la influenza A/PR/8/34 recombinantes que carecen de un segmento de gen PA intacto en células MDCK y MDCK-PA Virus Actividad de hemaglutínación en Título de virus sobrenadante de MDCK MDCK-PA TCID50/ml P1 P2 P3 P4 P1 P2 P3 P4 P1 P4 rPR8-7ntc1 rPR8-7 + + + + 5.6x101 <101 rPR8-deltaPA + + + + 3.1 x105 3.1 x10" rPR8-DIPA + + + + 3.1 x104 3.1 x104 rPR8-wt + + + + + + 1.0x107 ND ntc: no trans-complementada (ninguna pHMG-PA fue transfectada en células 293T) CUADRO 2 Replicación de virus de la influenza A/PR/8/34 recombinantes que carecen de un segmento de gen PB2 intacto en células MDCK y IV8DCK- PB2 Virus Actividad de hemaglutínación en sobrenadante de MDCK MDCK-PB2 P1 P2 p1 p2 rPR8-7ntc rPR8-7 + rPR8-p?PB2 + + rPR8 + + ntc: no trans-complementada (ninguna pHMG-PB2 fue transfectada en células 293T) CUADRO 3 Replicación de virus de la influenza A/PR/8/34 recombinantes que carecen de un segmento de gen PB1 intacto en células MDCK y IMDCK- PB1 Virus Actividad de hemaglutinación en sobrenadante de MDCK MDCK-PB1 p1 p2 pl p2 rPR8-7ntc rPR8-7 + + rPR8-p?PB1 + + rPR8 + + ntc: no trans-complementada (ninguna pHMG-PB1 fue transfectada en células 293T) CUADRO 4 Replicación de virus de la influenza A/PR/8/34 recombinantes que carecen de un segmento de gen PA intacto en células MDCK-PA y MDCK EJEMPLO 2 Vacunación con virus recombinante defectuoso Un virus recombinante condícionalmente defectuoso que carece de un gen PA, PB1 o PB2 funcional, se produce como se describe aquí con base en una estructura de base de virus de alto rendimiento (v.gr., derivado de la cepa de vacuna A PR/8/34) con los genes de HA y NA de un virus epidémico relevante (v.gr., A/Moscow/10/99). El virus condícionalmente defectuoso se produce por transfección, por lo que la expresión de proteína de polimerasa se logra a través de transcomplementacíón. El virus es subsecuentemente amplificado en el substrato celular apropiado tal como células MDCK o células Vero que expresan establemente la polímerasa pertinente. El sobrenadante viral es aclarado por centrifugación durante 10 minutos a 1000 x g. El virus es concentrado y purificado por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa de 20-60%, formado en pastillas y resuspendido en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). La pureza y cantidad de la preparación de virus se confirman usando 12.5% de geles de SDS-poliacrilamida teñidos con azul brillante de coomassie y el título de virus del virus condicionalmente defectuoso se determina por infección de células MDCK y células MDCK que expresan la polimerasa pertinente y tiñendo con un anticuerpo monoclonal anti-nucleoproteína. Los ratones son inoculados con 1 x 10E5 50 por ciento de dosis infecciosa del cultivo de tejido (TCID-50) intra-traqueal o intra-nasal usando un nebulizador. Los títulos de anticuerpo contra HA, NA y proteínas internas de virus de la influenza en muestras de suero recolectado antes y después de vacunación se determinan usando pruebas de inhibición de hemaglutinación, pruebas de inhibición de neuraminidasa, ELISA, o pruebas de neutralización de virus. La respuesta inmune celular específica de antígeno en animales vacunados es cuantificada midiendo la expresión de citosina intracelular por flujometría, tiñendo con tetrámero células CD4 y CD8-positivas, actividad citolítíca, proliferación de células T, etc. Los animales vacunados y controlados son desafiados 6 semanas después de vacunación usando 1 x 10E6 TCID-50 del virus de la influenza A/Moscow/10/99 o un aislado de virus heterólogo. Después del desafío, muestras con hisopo nasales o faríngeos se recolectan de los animales sobre una base diaria durante 10 días y la cantidad de virus excretado por los anímales infectados se determinan por análisis de PCR cuantitativo o titulaciones de virus. La inmunidad humoral inducida por vacuna obtenida se detecta cuantificando el aumento en títulos de anticuerpo, la inmunidad celular inducida por vacuna obtenida cuantificando el aumento en respuestas de células T auxiliares y citotóxicas, y el nivel global de inmunidad al confirmar la protección contra infección con un virus desafiante.
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Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un método para obtener una partícula de virus de la influenza condícionalmente defectuosa que comprende un primer paso de transfectar una primera célula o células adecuadas, con una o más construcciones de genes derivadas por deleción interna de un ácido nucleico que codifica una proteína de influenza por lo que dichas construcciones de genes son incapaces de producir a proteína funcional, pero no impiden el empaque de los segmentos de gen del virus en partículas virales y con segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza complementarios que codifican un virus de la influenza, y con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar dichas proteínas en la célula, y cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de la primera célula o células en un punto de tiempo adecuadas después de la transfección; y un segundo paso de transfectar una segunda célula o células adecuadas con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar dichas proteínas en dicha célula; y un tercer paso de infectar la segunda célula o células con sobrenadante que comprende por lo menos una partícula de virus obtenida de la primera célula; y un cuarto paso que comprende cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de la segunda célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la infección.
2.- Un método para obtener una partícula de virus de la influenza condicionalmente defectuosa que comprende un primer paso de transfectar una primera célula o células adecuadas, con una o más construcciones de genes derivadas por deleción interna de un ácido nucleico que codifica una polimerasa de influenza por lo que dichas construcciones de genes son incapaces de producir a polimerasa funcional, pero no impiden el empaque de los segmentos de gen del virus en partículas vírales y con segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza complementarios que codifican un virus de la influenza, y con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar las polimerasas en dicha célula, y cosechar por lo menos una partícula viral del sobrenadante de dicha célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la infección.
3.- Un método para obtener una partícula de virus de influenza condicionalmente defectuosa que comprende un primer paso de transfectar una célula o células adecuadas con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar polimerasas de influenza en dicha célula; y un segundo paso de infectar dicha célula o células con sobrenadante que comprende partículas de virus de la influenza condícionalmente defectuosas; y un tercer paso que comprende cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de dicha célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la infección.
4.- Un método para obtener una partícula de virus de influenza condicionalmente defectuosa que comprende un primer paso de transfectar una primera célula o células adecuadas, con una o más construcciones de genes derivadas por dilución interna de un ácido nucleico que codifica una polimerasa de influenza por lo que dichas construcciones de genes son incapaces de producir una polimerasa funcional, pero no impiden el empaque de los segmentos de gen del virus en partículas virales y con segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza complementarios que codifican un virus de la influenza, y con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar las polimerasas en dicha célula, y cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de la primera célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la transfección; y un segundo paso de transfectar una segunda célula o células adecuadas con uno o más plásmidos de expresión capaces de expresar las polimerasas en dicha célula; y un tercer paso de infectar la segunda célula o células con sobrenadante que comprende por lo menos una partícula de virus obtenida de la primera célula; y un cuarto paso que comprende cosechar por lo menos una partícula de virus del sobrenadante de la segunda célula o células en un punto de tiempo adecuado después de la infección.
5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 y 4, en donde la deleción interna que resulta de deleción interna de un ácido nucleico que codifica una polimerasa de influenza: empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 207 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 194 contados desde la región no codificadora para la proteína PA, empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótídos 43 y 246 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 197 contados desde la región no codificadora para la proteína PB1 , empieza en un 5'-nucleótído situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 34 y 234 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 209 contados desde la región no codificadora para la proteína PB2.
6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde la célula o células que han de ser infectadas con sobrenadante que comprende partículas de virus de la influenza condicionalmente defectuosas ya expresan las polimerasas no funcionales.
7.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde la polimerasa es polimerasa acida (PA).
8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde la polimerasa es polimerasa básica 1 (PB1 ).
9.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde la polimerasa es polimerasa básica 2 (PB2).
10.- Una partícula de virus de influenza obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11.- Una partícula de virus de la influenza que comprende uno o más segmentos de ácido nucleico con una deleción interna en el segmento que hace al segmento incapaz de producir una polimerasa de influenza funcional, pero no impide el empaque del segmento de gene del virus en partículas virales, por lo que la polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa acida (PA), polimerasa básica 1 (PB1 ) o polimerasa básica 2 (PB2).
12.- Una partícula de virus de la influenza que comprende uno o más segmentos de ácido nucleico con una deleción interna en el segmento que hace al segmento incapaz de producir una polimerasa de influenza funcional, pero no impide el empaque del segmento de gene del virus en partículas virales, por lo que la polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa acida (PA), polimerasa básica 1 (PB1 ) o polimerasa básica 2 (PB2), y por lo tanto la delecíón interna empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 58 y 207 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 194 contados desde la región no codificadora para la proteína PA, empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 43 y 246 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 24 y 197 contados desde la región no codificadora para la proteína PB1 , empieza en un 5'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 34 y 234 contados desde la región no codificadora, y termina en un 3'-nucleótido situado entre, pero que no abarca, los nucleótidos 27 y 209 contados desde la región no codificadora para la proteína PB2.
13.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, caracterizada además porque tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican las glicoproteínas vírales.
14.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizada además porque tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican la nucleoproteína (NP), la polimerasa básica 1 (PB1 ), la polimerasa básica 2 (PB2), la hemaglutinina (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2).
15.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizada además porque tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifican la nucleoproteína (NP), la polimerasa acida (PA), la polimerasa básica 2 (PB2), la hemaglutinina (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2).
16.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizada además porque tiene los segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que codifica la nucleoproteína (NP), la polimerasa acida (PA), la polímerasa básica 1 (PB 1 ), la hemaglutinína (HA), la neuraminidasa (NA), las proteínas de matriz (M1 y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2).
17.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizada además porque tiene segmentos de ácido nucleico de virus de la influenza que son derivados de virus de la influenza A.
18.- La partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, caracterizada además porque está provista con un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza.
19.- Una célula que comprende una partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18.
20.- La célula de conformidad con la reivindicación 19, que ha sido provista con una o más polimerasas de virus de la influenza por lo que la polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa acida (PA), polimerasa básica 1 (PB1 ) o polimerasa básica 2 (PB2).
21.- Una composición que comprende una partícula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18 o una célula o material derivado de una célula de conformidad con la reivindicación 19 ó 20.
22.- El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 21 para la producción de una composición farmacéutica útil para la generación de protección inmunológica contra infección de un sujeto con un virus de la influenza.
23.- El uso de una partícula de conformidad con la reivindicación 18 para la producción de una composición útil para el suministro de un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a una célula.
24.- El uso de una partícula de conformidad con la reivindicación 18 para la producción de una composición farmacéutica útil para el suministro de un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a las células de un sujeto.
25.- Un método para suministrar un ácido nucleico que no codifica un péptido de influenza a una célula que comprende proveer a la célula con una partícula de virus de la influenza defectuosa de conformidad con la reivindicación 18.
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