MX2007003341A - Selenio inorganico para el tratamiento de cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe el uso de selenato o sus sales farmaceuticamente aceptables, especialmente en cantidades supranutricionales, metodos y composiciones para inhibir el crecimiento o proliferacion de celulas tumorales. La presente invencion tambien describe el uso de selenato o sus sales farmaceuticamente aceptables en combinacion con uno o tanto una terapia de ablacion de hormona como un agente citostatico o agente citotoxico, para inhibir el crecimiento o proliferacion de celulas tumorales. En ciertas modalidades, los metodos de la invencion son utiles para tratar o prevenir canceres, en especial canceres en se activa la trayectoria de senalizacion de Akt, tal como cancer de prostata. Ademas, la presente invencion describe el uso de selenato o sus sales farmaceuticamente aceptables en combinacion con una terapia de ablacion de hormona y opcionalmente un agente citostatico o agente citotoxico en metodos y composiciones para tratar canceres dependientes de hormona.

Description

SELENIO ORG NICO PARA TRATAMIENTO DE CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en general al uso de selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables, especialmente en cantidades supra-nutricionales, en métodos y composiciones para inhibir el crecimiento o proliferación de células tumorales. La presente invención también se refiere al uso de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con al menos uno de una terapia de ablación de hormona, un agente citostático o agente citotóxico, para inhibir el crecimiento o proliferación de células tumorales. En ciertas modalidades, los métodos de la invención son útiles para tratar o prevenir cánceres, especialmente cánceres en donde la trayectoria de señalización Akt se activa, tal como cáncer de próstata. Además, la presente invención se refiere al uso de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con una terapia de ablación de hormona y opclonalmente un agente citostático o un agente citotóxico en métodos y composiciones para tratar cánceres dependientes de hormona.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ha habido mucho interés en el uso de compuestos de selenio como agentes preventivos de cáncer. Los estudios que se expanden a los últimos 20 años han documentado su acción preventiva de cáncer en tumores de la glándula mamaria (Ip, C. 1981, Cáncer Res. 41:4386-4390), colon (Reddy et al. 1981, Cáncer Res. 47:5901-5904), pulmón y próstata (Clark et al. 1996, Jama 276;1957-1963). Los ensayos clínicos tanto de fase II como lll para prevención de cáncer de próstata utilizando una selenometionina orgánica están actualmente en investigación (Nelson er al. 1999, supra). Los compuestos de selenio utilizados en estudios de quimioprevención ampliamente pueden ser clasificados en formas de selenio inorgánico y orgánico. La forma típica de selenio inorgánico, selenita de sodio, (Na2Se03) es relativamente tóxica, ocasionando daño al ADN de ruptura de sutura de cadena individual y doble, mientras que la entidad de selenio orgánico típica, seleniometionina (SeMet) es relativamente no tóxica y no daña al ADN (Lu ef ai. 1995, supra; Sinha et al. 1996, supra; Stewart eí al. 1999, supra). La selenometionina orgánica, el constituyente principal de una dieta de selenio, se incorpora en selenoproteínas celulares, tales como tioredoxin reductasa y glutationa peroxidasa a través de una serie de intermediarios complejos (Alian et al. 1999, Annu. Rev. Nutr. 19:1-16). Ya que esta selenoencima que contienen selenocisteina, tales como la glutatlonina peroxidasa antioxidante y las tioredoxinas redox-reguladoras, están involucradas en respuestas celulares a tensión oxidante mutagénica, se ha propuesto desde hace mucho que los niveles supra-nutricionales de consumo de selenio fomenta la actividad celular anticarcinogénica promoviendo un ambiente reductivo celular (Alian er al. 1999, supra). Sin embargo, se ha vuelto enormemente claro que la naturaleza de ia acción anti-tumorigénica de los compuestos de selenio depende de la forma química en la cual ei elemento se administra (IP, C. 1998, J.Nutr. 128:1845-1854). El selenio orgánico en la forma de ácido metilselenínico induce la detención de G1, así como la fragmentación de ADN y desdoblamiento mediado por caspasa de PARP, los cuales son dos marcadores de apoptosis, en células de cáncer de próstata DU145 (Jiang et al. 2001, Cáncer Res. 61:3062-3070). En contraste, la selenita induce la detención de fase S y fragmentación apoptótica de ADN, que es independiente de la función de caspasa (Jiang er al. 2002, Mol. Cáncer Ther. 1:1059-1066). También se han reportado diferencias para los compuestos de selenio inorgánico, la selenita y el selenato inhibiendo el crecimiento de linfocitos a través de diferentes mecanismos (Spyrou eí al. 1996, Cáncer Res. 56:4407-4412). Estas diferencias pueden ser explicadas en parte a través de variaciones en el metabolismo y biodisponibilidad entre un cultivo de célula in vitro y estudios in vivo (Dong eí al. 2003, Cáncer Res. 63:52-59). Los cánceres dependientes de hormona incluyen células tumorales que tienen receptores de hormona y el crecimiento y proliferación de estas células tumorales se ve fomentado por la presencia de la hormona. La terapia de ablación de hormona, ya sea quirúrgica o química, se utiliza para detener, por lo menos durante un período de tiempo, el crecimiento y proliferación de células tumorales en tumores dependientes de hormona, tales como cánceres de próstata, testicular, de tiroides, de mama, ovario y uterino. El cáncer de próstata es un cáncer prevaleciente en hombres humanos y el tratamiento de los pacientes con crecimiento de carcinoma de próstata avanzado típicamente involucra castración médica o quirúrgica (Huggins, C. and Hodges, C.V. 1941, Cáncer Res. 1:293-297). Hasta un 80% de los pacientes demuestran una respuesta temporal que dura un promedio de 12-18 meses, antes de que el crecimiento de tumor continuo sea evidente a pesar de los niveles de castración de testosterona (Petrylak, D.P. 1999, Urology 54:30-35). Una vez que se establece el crecimiento independiente de andrógeno, la esperanza de vida media es de 9-12 meses. Aunque la terapia tradicional puede mejorar los índices de dolor y aumentar la calidad de vida, no ofrecen ningún beneficio de sobrevivencia importante. Los mecanismos moleculares que subrayan la transición a crecimiento independiente de andrógeno se entienden en forma incompleta. Los cambios en la señalización del receptor de andrógeno juegan un papel importante, incluyendo la sobre-regulación de expresión de receptor, unión de ligando promiscua así como transactivación de receptor independiente de ligando a través de otras cascadas de señalización de crecimiento (Feldman, B.J. and Feldman, D. 2001, Nat. Rev. Cáncer 1:34-45).

Concomitantemente, la células de cáncer de próstata adquieren un número de mecanismos que las protegen de muerte celular inducida, explicando en parte su quimioresistencia (Gurumurthy eí al. 2001, Cáncer Metástasis Rev. 20:225-243). El papel de la trayectoria de P13K/Akt en esto está enormemente reconocido. Akt es una cinasa de serina/treonina que se activa en respuesta a la fosforilación de P13K estimulada por receptor de membrana. Akt, a su vez, regulan la actividad de varias proteínas involucradas en el control de apoptosis, incluyendo los factores de transcripción de Forkhead (FKHR), Bad, Caspase 9, GSK-3ß and Mtor (Vivanco, I. and Sawyers, C.L. 2002, Nat. Rev. Cáncer 2:289-501 ). La sobre-actividad de Akt es común en cáncer de próstata independiente de andrógeno, por lo general como un resultado de la hipofunción de PTEN, una fosfatasa que inactiva PI3K, y es suficiente para ocasionar crecimiento independiente de andrógeno (Whang et al. 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:5246-5250). La resistencia a radioterapia es células de tumor también se ha visto enlazada con la sobre-regulación de la trayectoria de PI3K/Akt Soderlund eí al. 2005, Int. J. Oncol, 26:25-32, Zhan eí al, 2004, Histol. Histopathol., 19:915-923; Tanno ef al. 2004, Cáncer Res., 64:3486-3490; Li eí al. 2004, Oncogene, 23:4594-4602; McKenna eí al., 2003, Genes Chromosomes Cáncer, 28:330-338; Liang ef ai. 2003, Mol. Cáncer Ther. 2:353-360). El interés en el uso clínico de compuestos que contienen selenio como un agente quimiopreventivo se ha diseminado después de la publicación de Clark ef al. (1996, supra). Estos resultados han diseminado un número de ensayos clínicos humanos utilizando selenometionina supra-nutricional como un agente quimiopreventivo para cáncer de próstata. (Meuillet ef al. 2004, J.Cell Biochem. 91:443-458). Sin embargo, dado el tiempo de intervención relativamente corto comparado con la historia natural larga de cáncer de próstata, es posible que en lugar de prevenir la transformación de epitelio de próstata normal a neoplasia, el selenio probablemente inhiba el crecimiento de células malignas (Corcoran et al. 2004, J.Urol. 171:907-910). La evidencia es acumular que la actividad anticáncer de selenio no está relacionada con el elemento per se sino que depende de su forma química (Menter et al. 2000, Cáncer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9:1171-1182; Jiang eí al. 2002, supra; Kim ef al. 2003, Biochem, Pharmacol. 66:2301-2311). El mecanismo de esta actividad también no está claro. Sin embargo, se ha observado que existen diferencias marcadas en la progresión de tumor de células tumorales de próstata humana in vivo, dependiendo del compuesto de selenio administrado. Por ejemplo, el selenato de sodio inorgánico significativamente reduce la progresión de tumor en comparación con selenometionina orgánica, metilselenocisteína o levadura selenizada (Corcoran ef al.2004, supra). Además, ciertos compuestos de selenio, tales como selenita de sodio se han encontrado ser tóxicos a células cuando se utilizan a ciertas dosis (Jiang eí al.2002, supra). Por lo tanto, existe la necesidad de identificar formas adecuadas de compuestos de selenio para tratar o prevenir el crecimiento de cáncer. En particular, existe la necesidad de entender los mecanismos moleculares subyacentes selectivos de acción de varios compuestos de selenio sobre células cancerosas con una vista para diseñar regímenes terapéuticos más efectivos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está dedicada en parte al descubrimiento de que un tipo especifico de compuesto de selenio inorgánico, principalmente selenato, significativamente inhibe la proliferación de célula tumoral, incluyendo la proliferación de célula tumorales independientes de hormona y células tumorales dependientes de hormona, especialmente cuando se utiliza a altas cantidades o cantidades supra-nutricionales, según comparado con otros compuestos de selenio. También se ha encontrado que el selenato y sus sales farmacéuticamente aceptables tienen un efecto inhibidor sobre células tumorales, especialmente células tumorales de próstata, en donde se activa la trayectoria de señalización de Akt, y tienen un fuerte efecto inhibidor sinergístico sobre el crecimiento de células tumorales cuando se utilizan en combinación con al menos uno de un agente citostático, un agente citotóxico y radioterapia que opcionalmente se administra con un agente de radiosensibilización. Además, se ha encontrado que selenato y sus sales farmacéuticamente aceptables tienen un efecto inhibidor sobre el crecimiento de célula tumoral dependiente de hormona, cuando se utiliza en combinación con una terapia de ablación de hormona y opcionalmente uno o más de un agente citotástico, un agente citotóxico y una radioterapia que opcionalmente se administra con un agente de radiosensibilización. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento o proliferación de células tumorales, en donde se activa la trayectoria de señalización de Akt. Estos métodos generalmente comprenden exponer las células tumorales a una cantidad de inhibición de activación de la trayectoria de señalización de Akt de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas modalidades, la activación de la trayectoria de señalización de Akt involucra la activación de por lo menos un miembro seleccionado de Akt, mTOR, GSK-3ß y FKHR. En ejemplos ilustrativos de este tipo, la activación de la trayectoria de señalización de Akt involucra la fosforilación Akt (por ejemplo, fosforilación de los residuos Thr 308 y Ser 473 de Akt). En otras modalidades, la activación de la trayectoria de señalización de Akt involucra la inactivación de PTEN. En algunas modalidades, la trayectoria de señalización de Akt está sobre-activada. En algunas modalidades, la cantidad de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable, a la cual se expone las células tumorales, es una cantidad supra-nutricional. Convenientemente, las células tumorales se seleccionaron de carcinoma de célula escamosa oral, cáncer de tiroides, carcinoma hepatocelular, carcinoma de próstata, fibrosarcoma, carcinoma de ovario, cáncer uterino o endometrial, carcinoma pancreático, cáncer de estomago, cáncer de mama, cáncer de pulmón, carcinoma de célula renal, cáncer de colón, melanoma, leucemia aguda y cáncer de cerebro (por ejemplo, astrocitoma y glioblastoma) en modalidades específicas, las células tumorales son células de cáncer de próstata, incluyen células de cáncer de próstata independiente de hormona. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar cáncer, especialmente un cáncer independiente de hormona o un cáncer dependiente de hormona, en un sujeto. Estos métodos en general comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad supra-nutricional. En modalidades específicas, el' cáncer es cáncer de próstata, especialmente cáncer de próstata independiente de hormona o dependiente de hormona. De esta manera, en un aspecto relacionado, la invención proporciona métodos para tratar cáncer de próstata, especialmente un cáncer de próstata independiente de hormona o dependiente de hormona, que comprende administrar a un sujeto con la necesidad de dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para inhibir crecimiento de células tumorales dependiente de hormona, que comprende exponer las células tumorales a una cantidad inhibidora de crecimiento de célula tumoral dependiente de hormona de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y una terapia de ablación de hormona. En otro aspecto más, la presente invención proporciona métodos para tratar un cáncer dependiente de hormona en un sujeto, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con una terapia de ablación de hormona. Los cánceres dependientes de hormona convenientemente se seleccionan de cánceres dependientes de andrógeno y cáncer dependiente de estrógeno. En ciertas modalidades, el cáncer dependiente de hormona es un cáncer dependiente de andrógeno tal como cáncer de próstata. En algunas modalidades, el cáncer dependiente de hormona se seleccionada de cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer uterino, cáncer endometrial, cáncer de tiroides y cáncer de pituitaria. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer en donde se activa la trayectoria de señalización de Akt. En otro aspecto más, la presente invención proporciona el uso de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer, en donde se activa la trayectoria de señalización de Akt, en donde ei cáncer es diferente a un cáncer seleccionado de cáncer de próstata PC-3, linfoma 3B6, linfoma BL41 y tumor mamario HTB123/DU4473. En otro aspecto, ia presente invención proporciona el uso de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer dependiente de hormona, en donde el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable se formula para administrarse en combinación con terapia de ablación de hormona. En otro aspecto más, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para tratar o prevenir cáncer. Las composiciones generalmente comprenden una cantidad supra-nutricional de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades de los métodos y usos ampliamente descritos aquí, el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable se administra en combinación con al menos un agente citostático, un agente citotóxico o una radioterapia que opcionalmente se administra con un agente de radio sensibilización. En otras modalidades, el selenato se formula en una composición con al menos un agente citostático o agente citotóxico. En otras modalidades más, el selenato se formula en una composición con un agente de radiosensibilización para utilizarse en combinación con radioterapia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación gráfica y fotográfica que muestra que el selenato de sodio inhibe la proliferación de célula tumoral de próstata, en un modelo de ratón ortotópico. Se inyectaron ratones sin pelo BALB/c machos de 6 semanas de edad en la próstata dorso lateral con 1 x 106 células PC-3. Diez animales por grupo después recibieron ya sea 5 ppm de selenato de sodio (NaSe) o ningún tratamiento (Con) en el agua para beber durante 5 semanas. Los animales después se sacrificaron de manera selectiva. (A) ia Figura 1(A) gráficamente indica que el peso de las glándulas de próstata que contienen el tumor se redujo en los ratones que recibieron selenato de sodio. (B) La Figura 1(B) gráficamente indica que los volúmenes de tumor, medidos con un calibrador de Vernier, se redujeron ligeramente (pero no significativamente) en ratones que recibieron selenato de sodio. (C) Después el retroperitoneo se exploró bajo ampliación cefadalmente al nivel de la vena renal y se contaron los nodos linfáticos (L.N.no) mayores que 0.5 mm. La Figura 1(C) indica el número de nodos linfáticos mayores que 0.5 mm que se redujeron en ratones que recibieron selenato de sodio. Los resultados ilustran la +/-SE media. Las Figuras 1(A) y 1(C) tienen p<0.05 contra del control. (D) la Figura 1(D) proporciona una compilación de núcleos de célula positivos BrdU y Túnel de muestras de tumor de próstata. Los resultados representan la +/-SE media por campo de alta energía para cuatro muestras de tumor de los grupos sin tratamiento (Con) y con selenato de sodio (NaSe). (E) la Figura 1(E) proporciona una muestra inmunohistoquímica representativa de núcleos positivos BrdU de muestras de tejido de tumor de próstata sin tratamiento (control) y con selenato de sodio (NaSe), a una amplificación de 100x. La Figura 2 es una representación gráfica y fotográfica que muestra que el selenato de sodio inhibe la proliferación de célula de carcinoma de próstata induciendo un bloque de ciclo de célula G1. (A) se sembraron 2 x 1 O5 células PC-3 en una placa de 6 cavidades y se incubaron durante 16 horas. Después se agregó selenato de sodio a las concentraciones indicadas y la incubación se continuó durante los puntos de tiempo indicados. Después se cosecharon las fracciones de célula no adherente y adherente y se combinaron y se contaron los números de células viables totales a través del ensayo de Exclusión de Azul de Trypan. La Figura 1(A) gráficamente indica el efecto de diferentes concentraciones de selenato de sodio en números de células viables. (B) se sembraron 2.5 x 104 células PC-3 en una placa de 24 cavidades y 16 horas después se expusieron a 0.05, 0.1, ó 0.25 nM de selenato de sodio durante 36 horas, después se agregó el reactivo de marcación de célula de proliferación BrdU/FrdU (Roche) durante 16 horas más. Las células se lavaron, se fijaron y se tiñeron para incorporación nuclear de BrdU/FrdU, y DAP1 para la identificación de núcleos de célula. Los resultados se muestran en ia Figura 2(B). (C) se sembraron 2 x 105 células PC-3 en un matraz T25 y se incubaron durante 16 horas. Las células después se lavaron y se encubaron en un medio libre de suero durante 48 horas más. Las células después se volvieron a estimular con suero fresco (FCS, 10%) conteniendo 0.0, 0.1, 0.25, ó 0.5 mM de selenato de sodio durante 24 ó 48 horas más. Las células después se cosecharon, se fijaron y se tiñeron con yoduro de proprio, y se realizó análisis de FACS. La representación gráfica de porcentajes medios de células en las fases G1 y G2/M del ciclo de célula para tres experimentos independientes se muestra en la Figura 2(D). (E) Se analizó la proliferación de célula a través del ensayo MTT. Se sembraron 1 x 104 células PC-3 en una placa de 96 cavidades y se incubaron durante 16 horas. Después se agregaron concentraciones indicadas de selenato de sodio o selenometionina y 73 horas después se midió el índice proliferativo de célula a través del ensayo de MTT. Los resultados se muestran en la Figura 2(E). Para todos los resultados, los valores mostrados representan la +S.D. media de al menos tres experimentos independientes. La Figura 3 es una representación fotográfica que muestra que selenato de sodio induce la sobre-regulación de las proteínas inhibidoras del ciclo de célula y la desfosforilación de la proteína de retinoblastoma. (A) se sembraron 7.5 x 105 células PC-3 en platos de 6 centímetros, después de 16 horas de crecimiento asincrónico, las células se trataron con 0.5 mM de selenato de sodio durante los tiempos indicados, después las células se lisaron en regulador de pH de ELB, y cantidades iguales de lisatos de célula entera (75 µg) se separaron en geles de SDS-PAGE al 12% y las membranas se sondearon con los anticuerpos primarios indicados. Los resultados se muestran en la Figura 3(A). (B) se sembraron 5 x 105 células PC-3 en una placa de 6 cavidades, se incubaron durante 10 horas, se lavaron, y se privaron de suero durante 16 horas, después se trataron con selenato de sodio (0.5 mM) durante los puntos de tiempo mostrados. Las células se lisaron en regulador de pH de ELB y los lisatos de célula entera (75 µg) se cargaron en geies de SDS-PAGE al 10% y las membranas se sondearon con los anticuerpos indicados. Los resultados se muestran en la Figura 3(B). (C) se sembraron 2 x 105 células PC-3 en una placa de 6 cavidades (incubadas durante 16 horas y después se trataron con selenato de sodio (Na2SeO4, 0.5 mM) o selenometionina SeMet, 0.5 mM)) durante los tiempos indicados y los lisatos de célula entera (75 µg) se operaron en geles de SDS-PAGE al 12.5% y las membranas se sondearon con los anticuerpos indicados. Los resultados se muestran en la Figura 3(C). La Figura 4 es una representación fotográfica que muestra que el selenato de sodio, pero no la selenometionina, inhibe la activación crónica de Akt en células PC-3 deficientes de PTEN. (A) las células PC-3 se privaron de suero durante 16 horas, después se agregó seienato de sodio (Na2Se0 , 0.5 mM) durante los períodos indicados y los lisatos de célula entera (75 µg) se cargaron en geles de SDS-PAGE al 10% y las membranas se sondearon con anticuerpos de Akt fosfo-específicos y pan-Akt. Los resultados se muestran en la Figura 4(A). (B) Se sondearon lisatos idénticos (75 µg) a partir de (A) con anticuerpos PDK1 fosfo-específicos y el anticuerpo de tubulina ßlll como un control de carga. Estos resultados se muestran en la Figura 4(B). (C) Las células PC-3 se privaron de suero durante 16 horas, después se agregaron selenato de sodio (Na2SeO , 0.5 mM, durante 10 minutos) de LY294002 (50 µM durante 1 hora) solo o en combinación, después las células se lisaron y los lisatos de células enteras (75 µg) se resolvieron en geles de SDS-PAGE al 10% y las membranas se sondearon con anticuerpos fosfo-específicos y pan Akt. Los resultados se muestran en la Figura 4(C). (D) Las células PC-3 se privaron de suero durante 16 horas, después se trataron ya sea con selenato de sodio (Na2Se04, 0.5 mM) o selenometionina (SeMet, 0.5 mM) durante los diferentes períodos de tiempo indicados, después cantidades iguales de lisatos de célula entera (75 µg) se revolvieron en geles de SDS-PAGE al 10% y las membranas se sondearon con anticuerpos fosfo-específicos y pan Akt. Los resultados se muestran en la Figura 4(D). La Figura 5 es una representación gráfica y fotográfica que muestra que el selenato de sodio, pero no la selenometionina, induce translocación nuclear del factor de transcripción Forkhead y la sub-regulación de la actividad de proteína efectora de la trayectoria de supervivencia de célula PI3K. (A) Se transfectaron células PC-3 con la construcción de expresión de GFP-Forkhead (GFP-FKHR, 0.8 µg) con el reactivo Lipofectamina 2000, después de 24 horas se privaron de suero durante 16 horas, después se trataron ya sea con selenato de sodio (Na2SeO , 0.5 mM), o selenometionina (SeMet, 0.5 mM) durante 3 horas, o con LY294002 (10 µM) durante 1 hora. Las células después se fijaron y se observó estado de fluorescencia GFP nuclear y citoplásmico. La tinción de DAPI indica núcleos de célula. Los resultados se muestran en la Figura 5(A). (B) La Figura 5(B) proporciona una ilustración gráfica de +S.D. medio de resultados en (A). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y por lo menos 70 células transfectadas se clasificaron para cada tratamiento. (C), (D) las células PC-3 se privaron de suero durante 16 horas, después se trataron con selenato de sodio (Na2SeO4, 0.5 mM) durante los períodos de tiempo indicados y los lisatos de célula entera (75 µg en (C) y 100 µg en (D)) se resolvieron en geles de SDS-PAGE y las membranas se sondearon con los anticuerpos indicados. La tubulina ßlll sirvió como un control de carga en (C). Las células PC-3 con crecimiento asincrónico se trataron ya sea con selenato de sodio (Na2Se04) a las concentraciones indicadas con o sin LY294002 (10 µM) durante 72 horas. Las células después se procesaron para el índice proliferativo, utilizando el ensayo de MTT. Los resultados ilustran la +S.D. media de por lo menos tres experimentos independientes. La Figura 6 es una representación gráfica y fotográfica que muestra resultados in vivo del tratamiento de tumor de próstata en ratones con selenio en la forma de selenato solo o en combinación con taxol (paclitaxel). Los tratamientos incluyen: Cont (grupo de control), selenio (selenato de sodio) y taxol (paclitaxel). El grupo de control se trató con el portador de solubilización de paclitaxel, cremofor, y etanol sin paclitaxel. El eje Y de la gráfica indica el peso del tumor de próstata (mg). Las figuras presentan la ±SD media. La Figura 7 es una representación fotográfica que muestra secciones de tejido de tumores de próstata tratados con taxol (paclitaxel) sólo o taxol en combinación con selenato de sodio. El selenato de sodio y el paclitaxel se sinergizan para reducir el tamaño de tumor de próstata. La Figura 7 muestra imágenes de secciones de un tumor de animales tratados solo con paclitaxel (taxol) contra animales tratados con una combinación de selenato de sodio y paclitaxei (taxol + selenato). Las secciones de tumor se tiñeron con HE. Ambas imágenes se tomaron a la misma amplificación y fueron directamente comparables. La Figura 8 es una representación gráfica que muestra resultados in vivo del tratamiento de tumores de próstata en ratones con taxol (paclitaxel) (T) solo o en combinación con selenato de sodio (S + T). El eje Y de la gráfica indica el volumen del tumor de próstata (mm3). Las Figuras representan la +SD media. La Figura 9 es una representación gráfica que ilustra los efectos de toxicidad de célula de 5 µM o 50 µM de selenato de sodio o selenita de sodio medidos a través de Exclusión de Azul Trypan después de 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas. Se midieron la toxicidad de célula de selenita y selenato a través de Exclusión de Azul Trypan. Los resultados ilustran la ± SD media de tres experimentos independientes. El porcentaje de células viables se comparó con números de célula totales en cada muestra y se indican en el eje y, y el tratamiento en el eje x. La Figura 10 es una representación fotográfica que tiene el efecto de taxol (paclitaxel) a 1 µg/mL o 10 µg/mL o selenato de sodio 500 µM (equivalente a una dosis de 19 mg/kg) o selenita de sodio 500 µM (equivalente a una dosis de 18 mg/kg) durante los tiempos indicados en células PC-3. Los llsatos de célula tratados se operaron en un gel SDS-PAGE y después de tiñeron y se sondearon con los anticuerpos indicados. Se muestra que la selenita induce daño a ADN mientras el selenato y paclitaxel no lo hacen. Los lisatos de célula entera de células PC-3 tratadas se transfirieron a membranas PVDF y se sondearon con un anticuerpo Histona H2A.X específico de fosforilación (P H2A.X) y después la membrana se separó y se volvió a sondear con un anticuerpo ß-tubulina como un control de carga (tubulina). La Figura 11 es una representación gráfica que muestra los efectos de diferentes compuestos de selenio sobre la activación de Akt. Tratamientos: control (con); selenato de sodio (ATE); ácido selenoso (ácido sel); selenita de sodio (ITE); dióxido de selenio (Se02); sulfuro de selenio (SeS2); metil selenocisteína (MSC); y selenocisteína (SeC). La intensidad de señal Akt activa relativa correlacionada con los niveles de proteína de Akt totales se ilustra en el eje y. La gráfica indica que solamente el selenato de sodio (ATE) inhibe la activación de Akt, reduciendo los niveles de Akt fosforilada por abajo de los niveles de control (con). En contraste, el ácido selenoso (ácido sel), selenita de sodio (ITE), dióxido de selenio (Se02), sulfuro de selenio (SeS2), metil selenocísteína (MSC), selenocisteina (SeC) todos inducen la activación de Akt por arriba de los niveles de control (con). La Figura 12 es una representación fotográfica que muestra los efectos de una alta dosis de selenita de sodio y selenato de sodio en la activación de Akt. La selenita de sodio (ITE) 500 µM no inhibe la activación de Akt en comparación con una dosis similar de selenato de sodio (ATE). Los lisatos de células PC-3 tratados se corrieron en geles SDS-PAGE y se tiñeron y sondearon con el anticuerpo P-Akt del anticuerpo Akt de fosforilación específica (ser 408). La Figura 13 es una representación fotográfica que muestra los resultados del tratamiento de células PC-3 con taxol (paclitaxel) a 1, 10, 100 ng/mL y 1 µg/mL, 10 µg/mL o selenato de sodio (ATE) a 100 µM, 250 µM o 500 µM (equivalente a una dosis de 4-19 mg/kg) o selenita de sodio (ITE) a 100 µM, 250 µM o 500 µM) (equivalente a una dosis de 3.6-18 mg/kg) durante 16 horas. Los lisatos de célula tratados se operaron en un gel SDS-PAGE y se tiñeron y se sondearon con anticuerpos específicos dirigidos a proteína PARP desdoblada y ß-Tubulina (control). El taxol y selenato se muestra que inducen escisión de la proteína PARP pro-apoptótica mientras la selenita no lo hizo. La selenita también induce a una degradación marcada de ß-Tubulina celular subrayando su toxicidad celular. La Figura 14 es una representación gráfica y fotográfica que muestra el porcentaje de inhibición de crecimiento de células LNCaP paternales desarrolladas en presencia o ausencia de andrógeno después de 3 días de tratamiento con selenato de sodio (50 µM). Se sembraron 5 x 104 células LNCaP sensibles a andrógeno de cáncer de próstata humanas en una placa de 6 cavidades y 8 horas más tarde se trataron con 50 µM de selenato de sodio, o sin selenato (control). Las células se cosecharon a las 72 horas después de la adición de selenato y se determinaron las cuentas de célula de células viable según analizado por la tinción de Azul Trypan. La Figura 15 es una representación gráfica que muestra el porcentaje de inhibición del crecimiento de la línea de célula CCS LNCaP desarrollada en presencia o ausencia de andrógeno después de 3 días de tratamiento con selenato de sodio (50 µM). Se sembraron 5 x 104 células CCS LNCaP independientes de andrógeno de cáncer de próstata en una placa de 6 cavidades y 8 horas más tarde se trataron con ya sea con 50 µM de selenato de sodio, o sin selenato (control). Las células se cosecharon a las 72 horas después de la adición del selenato de sodio y se determinaron las cuentas de célula de células viables según analizado por tinción de Azul Trypan.

La Figura 16 es una representación gráfica que muestra el curso de tiempo de proliferación de célula para células LNCaP paternales (suero normal, NS LNCaP) en presencia de andrógeno, después del tratamiento con selenato de sodio (50 µM) o LY294002 (10 µM). Se sembraron 1 x 105 células NS LNCaP sensibles a andrógeno de cáncer de próstata humanas en una placa de 6 cavidades y 8 horas más tarde se trataron con selenato de sodio (5 µM), LY294002 (10 µM), o sin tratamiento (control). Las células se cosecharon a los 3 días, 5 días y 9 días después de la adición del selenato o LY294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según analizado por tinción de Azul Trypan. La Figura 17 es una representación gráfica que muestra el curso de tiempo de la proliferación de célula para células NS LNCaP paternales desarrolladas en ausencia de andrógeno (en suero separado con carbón, CSS), después del tratamiento con selenato de sodio (5 µM) o LY294002 (10 µM). Se sembraron 1 x 105 células NS LNCaP sensibles de cáncer de próstata humanas en una placa de 6 cavidades y 8 horas más tarde se trataron con 5 µM de selenato de sodio, 10 µM LY294002, o sin tratamiento (control). Las células se cosecharon a los 3 días, 5 días y 9 días después de la adición del selenato o LY294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según analizado por tinción de Azul Trypan. La Figura 18 es una representación gráfica que muestra el curso de tiempo de la proliferación de célula para células LNCaP (CSS LNCap) independientes de andrógeno en presencia de andrógeno (en suero normal, NS), después del tratamiento con selenato de sodio (5 µM) o LY294002 (10 µM). Se sembraron 1 x 1 O5 células CSS LNCaP independientes de andrógeno de cáncer de próstata humana en una placa de 6 cavidades y 8 horas después se trataron con 5 µM de selenato de sodio, 10 µM LY294002, o sin tratamiento (control). Las células se cosecharon a los 3 días, 5 días y 9 días después de la adición de selenato de sodio o LY294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según analizado por tinción de Azul Trypan. La Figura 19 es una representación gráfica que muestra el curso de tiempo de la proliferación de célula para células LNCaP (CSS LNCap) independientes de andrógeno desarrolladas en ausencia de andrógeno (en suero separado con carbón, CSS), después del tratamiento con selenato de sodio (5 µM) o LY294002 (10 µM). Se sembraron 1 x 105 células CSS LNCaP independientes de andrógeno de cáncer de próstata humanas en una placa de 6 cavidades y 8 horas más tarde se trataron ya sea con 5 µM de selenato de sodio o LY294002 (10 µM ), o sin tratamiento (control). Las células se cosecharon a los 3 días, 5 días y 9 días después de la adición del selenato de sodio o LY294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según analizado por tinción de Azul Trypan. La Figura 20 es una representación gráfica que muestra el curso de tiempo de la proliferación de célula de células Q293 desarrolladas en presencia de andrógeno (en suero normal, NS), después del tratamiento con selenato de sodio (5 µM) o LY294002 (10 µM) o sin tratamiento (control). Se sembraron 1 x 105 células Q293 epiteliales de riñon humano en una placa de 6 cavidades y 8 horas más tarde se trataron ya sea con 5 µM de selenato de sodio o (10 µM) LY294002, o sin tratamiento (control). Las células se cosecharon a los 3 días, 5 días y 9 días después del tratamiento con selenato de sodio o LY294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según analizado por tinción de Azul Trypan.

La Figura 21 es una representación gráfica que muestra el curso de tiempo de la proliferación de célula de células Q293 desarrolladas en ausencia de andrógeno (en suero separado de carbón, CSS), después del tratamiento con selenato de sodio (5 µM) o LY294002 (10 µM). Se sembraron 1 x 105 células Q293 epiteliales de riñon humano en una placa de 6 cavidades, y 8 horas después se trataron con 5 µM de selenato de sodio o 10 µM LY294002, o sin tratamiento (control). Las células se cosecharon a los 3 días, 5 días y 9 días después de la adición de selenato de sodio o LY294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según analizado mediante tinción de Azul Trypan.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN /. Definiciones A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado comúnmente entendido por aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. Aunque se puede utilizar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí en la práctica o prueba de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Para los propósitos de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos. Los artículos "un, una" y "unos, unas" se utilizan aquí para referirse a uno o a más de uno (es decir, por lo menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. Como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" se refiere a una cantidad, nivel, valor, dimensión, tamaño o cantidad que varia tanto como 30%, 20%, o 10% a una cantidad, nivel, valor, dimensión, tamaño o cantidad de referencia. Como se utiliza aquí, el término "cantidad inhibidora de la activación de trayectoria de señalización de Akt" en el contexto del tratamiento o prevención de un cáncer o inhibir el crecimiento de células tumorales, representa la administración de una cantidad o serie de dosis de selenato, el cual es efectivo para antagonizar la trayectoria de señalización de Akt, incluyendo la prevención o reducción de la activación de Akt evitando o reduciendo la expresión de Akt o un miembro corriente arriba de la trayectoria, o reduciendo el nivel o actividad funcional de un producto de expresión del gen Akt o de un miembro de gen corriente arriba de la trayectoria, o previniendo reduciendo la fosforilación de Akt. La cantidad variará dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a tratar, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar, la formulación de la composición, la determinación de la situación médica, y otros factores importantes. Se cree que la cantidad caerá dentro de una escala relativamente amplia que puede ser determinada a través de ensayos de rutina. En modalidades específicas, una cantidad inhibidora de la activación de trayectoria de señalización de Akt es una cantidad supra-nutricional de selenato.

Por "andrógeno" se da a entender una hormona que fomenta el desarrollo de características sexuales masculinas. Ejemplos no limitantes de andrógenos incluyen testosterona, androstenodiona, dihidroepiandrosterona y dihidrotestosterona. El término "cáncer dependiente de andrógeno" o "célula tumoral dependiente de andrógeno" se refiere a un cáncer o célula tumoral que depende de un andrógeno para la supervivencia, crecimiento y/o proliferación de la célula. Típicamente, un "cáncer dependiente de andrógeno" resulta de la acumulación excesiva de un andrógeno (es decir, testosterona u otra hormona androgénica), sensibilidad incrementada de receptores de andrógeno a andrógeno, o un incremento en la transcripción estimulada por andrógeno, y generalmente se beneficiará de una reducción en la estimulación de andrógeno. El término "cáncer independiente de andrógeno" o "célula tumoral independiente de andrógeno" se refiere a un cáncer o célula tumoral que es insensible a la presencia o ausencia de andrógenos.

Las frases "cáncer en donde la trayectoria de señalización de Akt se activa" y "células tumorales en donde la trayectoria de señalización de Akt se activa" se refieren a cánceres y células tumorales en donde la trayectoria de supervivencia de célula clave, la trayectoria de PTEN/P13K/Akt, está des-regulada. Sin desear que esté unido a cualquier teoría o modo de operación, se considera que la activación de fosfoinosítida 3-cinasa PI3K, inducida por señales tróficas diversas, conduce a la acumulación de sub-membrana de los productos de lípido fosforilados, fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3) y fosfotidilisonitol-3,4-bisfosfato (PIP2) (Vanhaesebroeck ef al 2001, Annu. Rev. Biochem. 70:535; Cantley ef al 2002, Science, 296:1655). La concentración incrementada de estos fosfolípidos en el micro-ambiente de submembrana, a su vez, conduce a la acumulación de cinasas dependientes de fosfoinositida (PDK-1 y PDK-2), conduciendo a la activación de la serina/treonina cinasa, Akt. La proteína supresora de tumor PTEN normalmente actúa como un regulador negativo importante de PI3K a través de su acción como una fosfatasa de lípido que convierte PIP3 de regreso a PIP2. La inactivación de PTEN o la pérdida de la función de PTEN da como resultado la activación crónica de la trayectoria de señalización de Akt. Las células tumorales en las cuales se activa Akt o en las cuales se inactiva PTEN incluyen varios tipos de células tumorales, incluyendo carcinoma. Por ejemplo, los cánceres en donde se activa Akt o en donde se inactiva PTEN incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de célula escamosa oral, cáncer de tiroides, cáncer de pituitaria, cáncer hepatocelular incluyendo carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata incluyendo carcinoma de próstata, cáncer testicular, fibrosarcoma, cáncer de ovario incluyendo carcinoma de ovario, cáncer uterino incluyendo cáncer endometrial, cáncer pancreático incluyendo carcinoma pancreático, cáncer de estomago, cáncer de mama, cáncer de pulmón, carcinoma de célula renal, cáncer de colón, melanoma, leucemia aguda y cáncer de cerebro (por ejemplo, astrocitoma y glioblastoma). En algunas modalidades, el cáncer es un trastorno neoplástico hematopoyético, incluyendo enfermedades que involucran células hiperplásticas/neoplásticas de origen hematopoyético, tales como: linfoma y una leucemia linfocítica. Ejemplos no limitantes de linfomas incluyen: linfomas de célula T (incluyendo linfomas de célula T periféricos, leucemia/linfomas de células T en adultos (ATL); linfomas de célula T cutáneos (CTCLs); leucemias linfocíticas granulares grandes (LGFs); linfomas de célula B, linfoma de Hodgkin's y un linfoma que no es de Hodgkin's. Ejemplos ilustrativos de leucemias linfocíticas incluyen: leucemias agudas pobremente diferenciadas, por ejemplo, leucemia megacarioblástica aguda; trastornos mieloides, incluyendo, pero no limitándose a, leucemia promieloide aguda (APML), leucemia mielogenosa aguda (AML) y leucemia mielogenosa crónica (CML); malignidades linfoides, que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguda (ALL) la cual incluye ALL de línea B y ALL de línea T, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemina prolinfocítica (PLL), leucemia de célula pilosa (HLL) y macroglobulemia de Waldenstrom (WM). Las frases "cáncer en donde la trayectoria de Akt está sobre-activada", "cáncer en donde Akt está sobre-activada" y similares se refieren a un cáncer en donde no sólo Akt está sobre-expresado, sino que la actividad de cinasa de Akt está positivamente mejorada por la fosforilación de los residuos Thr 308 y Ser 473. Esto se ilustra por la isoforma de Akt Akt2, en donde en líneas de célula de cáncer de mama y cáncer de próstata los niveles de expresión de ARNm de Akt3 son de 2-4 veces mayores en células normales pero la actividad de cinasa Akt3 se eleva unas 20-60 veces (Nakatani ef al 1999, J. Biol. Chem.274:21528). Akt por lo regular se sobre-activa en tumores o cánceres resistentes a fármacos o refractarios. Ejemplos de cánceres en donde Akt se sobre-activa o constitutivamente se activa incluyen, pero no se limitan a cáncer de próstata independiente de andrógeno y cáncer de mama deficiente de receptor de estrógeno. El término "carcinoma" como se utiliza aquí se refiere a una forma de cáncer que se desarrolla en células epiteliales cubriendo o forrando órganos tales como la piel, el útero, los pulmones, el pecho o la próstata. Los carcinomas pueden, pero no necesariamente, directamente invadir órganos cercanos o pueden formar metástasis en sitios lejanos tales como hígado, nodos linfáticos o huesos. A través de esta especificación y las reivindicaciones que siguen a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprendiendo" y "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un entero establecido o paso o grupo de enteros o pasos, pero no la exclusión de ningún otro entero o paso o grupo de enteros o pasos. Como se utiliza aquí, el término "agente citostático" se refiere a una sustancia que puede inhibir la proliferación de célula o división de célula sin aniquilar necesariamente la célula. Convenientemente, el agente citostático inhibe la proliferación de células cancerosas. El término "agente citotóxico" o "terapia citotóxica" como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia terapia que es peligrosa a células y finalmente ocasionan la muerte de la célula. En algunas modalidades, el agente citotóxico daña rápidamente las células de división tales como células cancerosas y ocasiona la muerte de la célula cancerosa, especialmente la muerte de célula cancerosa mientras no ocasione daño a u ocasione menos daño a células no cancerosas. Un ejemplo de una terapia citotóxica es radioterapia. Como se utiliza aquí, los términos "resistente a fármaco" y "refractario" se refieren a un cáncer o célula tumoral que no es sensible o parcialmente no es sensible a tratamientos normalmente utilizados para tratar el cáncer o aniquilar la célula tumoral. Los términos "ablación de hormona" y "terapia de ablación de hormona" se refieren a la abstención total de hormonas que pueden ser requeridas para la supervivencia y crecimiento de células cancerosas. La ablación de hormona puede lograrse a través de remoción quirúrgica de órganos de producción de hormona tales como testículos u ovarios o se puede lograr químicamente con compuestos que interfieren con la biosíntesis o secreción de hormona, compuestos que antagonizan o bloquean receptores de hormona y en alguna forma evitan que la hormona ejerza su efecto biológico. Por ejemplo, la conversión de testosterona a la dihidrotestosterona más activa puede ser bloqueado por un inhibidor de 5 alfa-reductasa, tal como finasterida. El término "cáncer dependiente de hormona" o "célula tumoral dependiente de hormona" se refiere a un cáncer o célula tumoral que depende de la presencia de una hormona para la supervivencia, crecimiento y/o proliferación. Los cánceres dependientes de hormona incluyen, pero no se limitan a, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer uterino, cáncer endometrial, cáncer de tiroides y cáncer de pituitaria. Como se utiliza aquí, el término "cantidad inhibidora de crecimiento de célula tumoral dependiente de hormona" en el contexto para tratar o prevenir un cáncer o inhibir el crecimiento de células tumorales se refiere a la administración de una cantidad o serie de dosis de selenato, la cual es efectiva para inhibir el crecimiento y/o proliferación de cáncer o célula tumorales o para ocasionar la muerte de célula tumoral. La cantidad variará dependiendo de la salud y condición física del individuo que será tratado, ei grupo taxonómico del individuo que será tratado, la formulación de la composición, la determinación de la situación médica, y otros factores importantes. Se espera que la cantidad caerá dentro de una escala relativamente amplia que puede ser determinada por ensayos de rutina. En modalidades específicas, una cantidad inhibidora de crecimiento de célula tumoral dependiente de hormona es una cantidad supra-nutricional de selenato. Como se utiliza aquí, el término "en combinación con" se refiere al tratamiento de cáncer o exposición de una célula tumoral a por lo menos dos agentes, de manera que sus efectos sobre el cáncer o célula tumoral ocurre, por lo menos en parte, durante el mismo período de tiempo. La administración de por lo menos dos agentes puede ocurrir simultáneamente en una sola composición, o cada agente puede ser simultánea o secuencialmente administrado en composiciones separadas. La frase "inhibir crecimiento de células tumorales" se refiere a que el crecimiento de célula tumoral cesa o se reduce y la proliferación de célula o división de célula cesa o se reduce. Esto también es conocido como citostostasis. El crecimiento de células tumorales se puede medir en términos de peso o volumen o número de célula o actividad metabólica celular, es decir, ensayo de MTT. Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un llenador sólido o líquido, diluyente o sustancia de encapsulación que puede ser utilizada con seguridad en administración tópica, local o sistémica. El término "sal farmacéuticamente aceptable" como se utiliza aquí, con relación al selenato, se refiere a sales de ion metálico que son toxicológicamente seguras para administración a seres humanos y animales. Por ejemplo, las sales de ion metálico adecuada de selenato incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio, potasio, magnesio, calcio, fierro, níquel y zinc. Una sal preferida de selenato es la sal de sodio, Na2Se04. El término "radioterapia" como se utiliza aquí, se refiere al tratamiento o exposición de un cáncer o células cancerosas tales como células tumorales a una radiación de alta energía. La efectividad de la radioterapia puede ser mejorada a través del selenato o su sal farmacéuticamente aceptable. Además, la radioterapia puede ser mejorada aún más a través de la administración de un agente de radiosensibilización. Ejemplos ilustrativos de agentes de radiosensibilización incluyen, pero no se limitan a, efaproxiral, etanidazol, fluosol, misonidazol, nimorazol, temoporfin y tirapazamina. Los términos "sujetos" o "individuo" o "paciente", utilizados intercambiablemente aquí, se refieren a cualquier sujeto, en particular un sujeto vertebrado, y más particularmente un mamífero, para quien se desea la profilaxis o el tratamiento. Los animales vertebrados adecuados que caen dentro del alcance de la invención incluyen, pero no se limitan a, primates, aves, animales de corral (por ejemplo, cerdos, borregos, vacas, caballos, burros), animales de prueba de laboratorio (por ejemplo, conejos, ratones, ratas, conejillos de india, hámsteres), animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros) y animales salvajes cautivos (por ejemplo, zorros, venados, dingos (perros salvajes)). Un sujeto preferido es un ser humano con la necesidad del tratamiento profilaxis de un cáncer, en donde la trayectoria de señalización de Akt está activada o de un cáncer dependiente de hormona, especialmente cáncer de próstata. Sin embargo, se entenderá que los términos antes mencionados no implican que los síntomas estén presentes. El término "supra-nutricional" como se utiliza aquí, se refiere a una cantidad que es mayor que la cantidad considerada como un requerimiento nutricional. En adultos, la ración dietética recomendada de selenio es de 55 µ/día. Las mujeres embarazadas y en lactancia tienen una ración diaria recomendada de 60.70 µ/día.

Una cantidad supra-nutricional de selenio proporciona selenio a un sujeto a aproximadamente la ración diaria recomendada. Por ejemplo, una cantidad supra-nutricional de selenio puede ser de 0.15 mg/kg a 20.0 mg/kg, 0.1 mg/kg a 14 mg/kg, 0.1 mg/kg a 13 mg/kg, 0.1 mg/kg a 12 mg/kg, 0.1 mg/kg a 10 mg/kg, 0.1 mg/kg a 9 mg/kg, 0.1 mg/kg a 8 mg/kg, 0.1 mg/kg a 7 mg/kg, 0.1 mg/kg a 6 mg/kg, 0.15 mg/kg a 5 mg/kg, 0.15 mg/kg a 5 mg/kg, 0.15 mg/kg a 4 mg/kg, 0.15 mg/kg a 3 mg/kg, 0.15 mg/kg a 2 mg/kg, 0.15 mg/kg a 1 mg/kg, especialmente 0.1 mg/kg a 14 mg/kg, y más especialmente 0.15 mg/kg a 5 mg/kg, Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" en el contexto de tratar o prevenir cáncer o inhibir el crecimiento de células tumorales se refiere a la administración de una cantidad de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, ya sea en una dosis individual o como parte de una serie de dosis, que es efectiva para inhibir el crecimiento y/o proliferación de cáncer o células tumorales o para ocasionar la muerte de células cancerosas o tumorales. La cantidad efectiva variará dependiendo de la salud y condición física del individuo que será tratado, el grupo taxonómico del individuo que será tratado, y la formulación de la composición, la determinación de las situaciones médicas y otros factores importantes. Se espera que la cantidad caerá dentro de una escala relativamente amplia que puede ser determinada a través de ensayos de rutina. En modalidades específicas, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad supra-nutricional. 2. Métodos para inhibir el crecimiento y proliferación de célula tumoral y para tratar cáncer. La presente invención se pronostica en parte en la determinación de que el selenato, opuesto a otras formas de selenio tales como selenita, es efectivo para inhibir el crecimiento o proliferación de células tumorales, en donde se activa la trayectoria de señalización de Akt. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona métodos par inhibir el crecimiento o proliferación de células tumorales, en donde se activa la trayectoria de señalización de Akt, en donde los métodos generalmente comprenden exponer las célula tumorales a una cantidad inhibidora de la activación de trayectoria de señalización de Akt de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Convenientemente, la cantidad de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable es una cantidad supra-nutricional, la cual en general es de aproximadamente 0.015 mg/kg a 20.0 mg/kg, usualmente de aproximadamente 0.1 mg/kg a 14 mg/kg y más usualmente de alrededor de 0.15 mg/kg a 5 mg/kg. La presente invención puede ser utilizada efectivamente contra varios tipos de células tumorales y cánceres, incluyendo carcinomas, ejemplos ilustrativos, cánceres en donde se activa Akt o en donde se inactiva PTEN, incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de célula escamosa oral, cáncer de tiroides, cáncer de pituitaria, cáncer hepatocelular incluyendo carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata incluyendo carcinoma de próstata, cáncer testicular, fibrosarcoma, cáncer de ovario incluyendo carcinoma de ovario, cáncer uterino incluyendo cáncer endometrial, cáncer pancreático incluyendo carcinoma pancreático, cáncer de estomago, cáncer de mama, cáncer de pulmón, carcinoma de célula renal, cáncer de colón, melanoma, leucemia agua y cáncer de cerebro (por ejemplo, astrocitoma y glioblastoma). En algunas modalidades, el cáncer es un trastorno neoplástico hematopoyético, que incluye enfermedades que involucran células hiperplásticas/neoplásticas de origen hematopoyético, tales como: linfoma y una leucemia linfocítica. Ejemplos no limitantes de linfomas incluyen: linfomas de célula T (incluyendo linfomas de célula T periféricos, leucemia/linfomas de célula T en adultos (ATL); linfomas de células T cutáneos (CTCLs); leucemias linfocíticas granulares grandes (LGFs); linfomas de célula B, linfoma de Hodgkin y linfoma que no es de Hodgkin. Ejemplos ilustrativos de leucemia linfocíticas incluyen: leucemias agudas pobremente diferenciadas, por ejemplo, leucemias megacarioblasticas aguda; trastornos mieloides, incluyendo, pero no limitándose a, leucemia promieloide aguda (APML), leucemia mielogenoso agudo (AML) y leucemina mielagenosa crónica (CNL); malignidades linfoides, que incluyen, pero no se limitan a, leucemia linfoblástica aguada (ALL) que incluye ALL de línea B y ALL de línea T, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia prolimfosítica (PLL), leucemia de célula pilosa (HLL) y macroglobulinemia de Waldstrom (WM). En modalidades específicas, las células tumorales son cáncer de próstata o células de carcinoma. De esta manera, en un aspecto relacionado, la invención proporciona métodos para tratar un cáncer en donde se activa Akt, en donde los métodos generalmente comprenden administrar a un sujeto con la necesidad del mismo, una cantidad inhibidora de la activación de trayectoria de señalización de Akt de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas modalidades, la cantidad de selenato o su sai farmacéuticamente aceptable es una cantidad supra-nutricional como se definió ampliamente. En otras modalidades, el cáncer es cáncer de próstata, especialmente un cáncer de próstata resistente a fármaco o un cáncer de próstata independiente de andrógeno. En algunas modalidades, la célula tumoral o cáncer es resistente a fármaco. En algunas modalidades, la célula tumoral o cáncer tiene una trayectoria de Akt sobre-activa (por ejemplo, cáncer de próstata independiente de andrógeno y cáncer de mama deficiente de receptor de estrógeno. En ciertas modalidades, el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable se administra en combinación con al menos un agente citostático o agente citotóxico. Ejemplos no limitante de agentes citostáticos se seleccionan de: (1) agentes de estabilización de microtúbulo tales como, pero no limitándose a, taxanos, paclitaxel, docetaxel, epotilonas y laulimaiidas; (2) inhibidores de cinasa, los ejemplos ilustrativos de los cuales se incluyen Iressa®, Gleeve, Tarceva™, (Erlotinib CHI), BAY-43-9006, inhibidores del subgrupo de cinasa de tirosina de receptor de dominio de cinasa de división (por ejemplo, PTK787/ZK222584 y SU11248); (3) anticuerpos activados en cinasa de receptor, los cuales incluyen, pero no se limitan a, Trastuzumab (herceptin®), Cetuximab (Erbitux®), Bevacizumab (Avastin™), Rituximab (ritusan®), Pertuzumab (Omnitarg™); (4) inhibidores de trayectoria de mTOR, ejemplos ilustrativos de los cuales incluyen rapamicina y CCI-778; (5) Apo2L/Trail, agentes antiangiogénicos tales como, pero no limitándose a, endostatina, combrestatina, angioestatina, trombospondina e inhibidor de crecimiento endotelial vascular (VEGI); (6) vacunas de inmunoterapia antineoplásticas, ejemplos representativos de las cuales incluyen células T activadas, agentes de refuerzo inmune no específicos (es decir, interferones, interleucinas); (7) agentes citotóxicos antibióticos tales como, pero no limitándose a, doxorubicina, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, epirubicina, mitomicina y metozantrona; (8) agentes de alquilación, ejemplos ilustrativos de los cuales se incluyen Melfalan, Carmustina, Lomustina, Ciclofosfamida, Ifosfamida, Clorambucil, Fotomustina, Busulfan, Temozolomida y Tiotepa; (9) agentes antineoplástícos hormonales, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen Nilutamida, Acetato de Ciproterona, Anastrazol, Exemestano, Tamoxifen, Raloxifeno, Bicalutamida, Aminoglutetimida, Acetato de Leuprorelina, Citrato de Tiromifeno, Letrozol, Flutamida, Acetato de Megestrol y Acetato de Goserelina; (10) hormonas gonadales tales como, pero no limitándose a, acetato de Ciproterona y acetato de Medoxiprogesterona; (11) antimetabolitos, ejemplos ilustrativos de los cuales incluyen Citarabina, Fluoouracil, Gemcitabina, Tpotecan, Hidroxiurea, Tioguanina, Metotrexato, Colaspaso, Raltitrexed y Capicitabina; (12) agentes anabólicos tales como, pero no limitándose a, Nandrolona; (13) hormonas esteroidales adrenales, ejemplos ilustrativos de las cuales se incluyen acetato de Metilprednisolona, Dexametasona, Hidrocortisona, Prednisolona y Prednisona; (14) agentes neoplásticos tales como, pero no limitándose a, Irinotecan, carboplatin, Cisplatin, Oxaliplatin, Etoposida y Dacarbazina; y (15) inhibidores de topoisomerasa, ejemplos ilustrativos de los cuales incluyen topotecan e irinotecan. En algunas modalidades, el agente citostático es una molécula de ácido nucleico, convenientemente una molécula de ácido nucleico recombinante antisentido o ARNsi. En otras modalidades, el agente citostático es un péptido o polipéptido. En otras modalidades más, el agente citostático es una molécula pequeña. El agente citostático puede ser un agente citotóxico que es convenientemente modificado para mejorar el consumo o suministro del agente. Ejemplos no limitantes de dichos agentes citotóxicos modificados incluyen, pero no se limitan a, fármacos citotóxicos pegilados o marcados con albúmina. En modalidades específicas, el agente citostático es un agente de estabilización de microtúbulo, especialmente un taxano y de preferencia paclitaxel. En algunas modalidades, el agente citotóxico se selecciona de antraciclinas tales como idarubicina, doxorubicina, epirubicina, daunorubicina y mitozantrona, agentes de CMF tales como ciclofosfamida, metotrexato y 5-fluorouracilo u otros agentes citotóxicos tales como cisplatina, carboplatina, bleomicina, topotecan, irinotecan, melfalan, clorambucil, vincristina, vinblastina y mitomicina-C. La presente invención también describe el descubrimiento de que el selenato y sus sales farmacéuticamente aceptables tienen un efecto inhibidor sobre el crecimiento de célula tumoral dependiente de hormona cuando se utiliza en combinación con una terapia de ablación de hormona y opcionalmente un agente citostático o agente citotóxico. Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención proporciona métodos para tratar un cáncer dependiente de hormona en un sujeto, en donde los métodos en general comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con una terapia de ablación de hormona. Convenientemente, la cantidad de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo es una cantidad supra-nutricional de selenato, como se definió ampliamente antes. En algunas modalidades, el cáncer dependiente de hormonas se selecciona de cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer uterino, cáncer de tiroides o cáncer de pituitaria, especialmente cáncer de próstata o cáncer de mama. La terapia de ablación de hormona puede ser cualquier terapia que prive a las células cancerosas o tumorales de hormonas requeridas para la supervivencia, crecimiento y/o proliferación de células cancerosas o tumorales. La terapia de ablación de hormona puede lograrse quirúrgicamente a través de la remoción de órganos de producción de hormonas tales como testículos u ovarios. Alternativamente, la terapia de ablación de hormona puede lograrse químicamente con compuestos que interfieren con la biosíntesis o secreción de hormona, compuestos que antagonizan o bloquean los receptores de hormona o en alguna forma evitan que la hormona ejerza su efecto biológico. Ejemplos ilustrativos de terapia de ablación de hormona química incluyen agonistas de GnRH o antagonistas tales como Cetrorelix, agentes que interfieren con el receptor de andrógeno incluyendo agentes no esteroidales tales como Bicalutamida y agentes esteroidales tales como Ciproterona, y agentes que interfieren con la biosíntesis y eteroides tales como Cetoconazol. Los agentes químicos adecuados para utilizarse en combinación con selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables como terapia de ablación de hormona para cáncer de próstata incluyen, pero no se limitan a, anti-androgenos no esteroidales tales cmo como Nilutamida, Bicalutaida y flutamida; agonistas de GnRH tales como acetato de Goserelina, leuprorelina y triptorelina; inhibidores de 5-alfa-reductasa tales como finasterida; y acetato de ciproterona. Los agentes químicos adecuados para utilizarse en combinación con selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables como terapia de ablación de hormona en cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de aromatasa tale como Anastrazol; Exemestano, Tamoxifen, Aminoglutetimida, citrato de Toremifeno, Letrozol, acetato de Megestrol y acetato de Goserelina. Los agentes químicos adecuados para utilizarse en combinación con selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables como terapia de ablación de hormona en cánceres de ovario y uterino, incluyendo cáncer endometrial, incluyen, pero no se limitan a, progestinas tales como acetato de Megestrol, levonorgestrol y norgestrol. En algunas modalidades, el método para tratar un cáncer dependiente de hormona además comprende administrar un agente citostático tales como aquellos definidos anteriormente, o un agente citotóxico. Un agente citostático preferido es un agente de estabilización de microtúbulo, especialmente un taxano, y más especialmente paclitaxel. Ciertas modalidades de ia presente invención están dirigidas a métodos para tratar cáncer en un sujeto, dichos métodos en general comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable. Para practicar estos métodos, la persona que maneja al sujeto puede determinar la dosis efectiva de la forma de selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables para la condición y circunstancias particulares del sujeto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de selenato es una que es efectiva para el tratamiento o prevención del cáncer, incluyendo la prevención de incurrir en un síntoma (por ejemplo, proliferación de células cancerosas), mantener en verificación dichos síntomas, y/o tratar síntomas existentes asociados con el cáncer (por ejemplo, dolor, desarrollo de fluido, retención urinaria, nauseas, indigestión, gases, apetito, cambios en los hábitos del intestino y pérdida de peso). En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad supra-nutricional de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable. En modalidades específicas, el selenato convenientemente está en la forma de la sal, selenato de sodio (Na2Se04). A continuación se discutirán modos de administración, cantidades de selenato administrado, y formulaciones de selenato, para utilizarse en los métodos de la presente invención. Si el cáncer ha sido tratado se determina midiendo uno o más parámetros de diagnóstico indicativos del curso de la enfermedad, comparado con un control adecuado. En el caso de un sujeto ser humano, un "control adecuado" puede ser el individuo antes del tratamiento, o puede ser un ser humano (por ejemplo, uno de edad coincidente o control similar) tratado con un placebo. De acuerdo con la presente invención, el tratamiento de cáncer incluye y abarca sin limitación: (i) prevenir cáncer en un sujeto quien puede estar predispuesto al cáncer pero aún no se le ha diagnosticado el cáncer y, por consiguiente, el tratamiento constituye un tratamiento profiláctico para el cáncer; (ii) inhibir la tumorigénesis, es decir, detener el desarrollo de cáncer; o (iii) aliviar los síntomas que resultan del cáncer. Los métodos de la presente invención son adecuados para tratar a un individuo a quien se le ha diagnosticado un cáncer, quien tiene sospecha de tener cáncer, quien sabe que es susceptible y quien se considera probablemente a desarrollar un cáncer, o quien esta considerado probablemente a desarrollar una recurrencia de un cáncer previamente tratado. En modalidades específicas de los métodos anteriores, el cáncer es cáncer de próstata, especialmente un cáncer de próstata resistente a fármaco o independiente de andrógeno y el tratamiento opcionalmente comprende además la administración de un agente citostático tales como aquellos definidos anteriormente (por ejemplo, un agente de estabilización de microtúbulo tal como paclitaxel) o un agente citotóxico. En otras modalidades, el cáncer de próstata es un cáncer de próstata sensible a andrógeno y el tratamiento opcionalmente se administra en combinación con una terapia de ablación de hormona y/o un agente citostático como se definió anteriormente, o un agente citotóxico o radioterapia opcionalmente junto con un agente de radiosensibilización. Convenientemente, ia terapia de ablación de hormona se selecciona de castración quirúrgica, finesterida, Nilutamida, acetato de Ciproterona, Bicolutamída, acetato de Leuprorelina, Flutamida y acetato de Goserelina. De preferencia, el agente citostático es un agente de estabilización de microtúbulo, especialmente un taxano, y más especialmente paclitaxel. Los sujetos ilustrativos para el tratamiento con los métodos de la invención son vertebrados, especialmente mamíferos. En ciertas modalidades, el sujeto se selecciona del grupo que consiste de seres humanos, ovejas, ganado, caballos, bovinos, cerdos, perros y gatos.

Un sujeto preferido es un ser humano. El selenato o su sal farmacéuticamente aceptable se pueden formular siguiendo cualquier número de técnicas conocidas en el campo del suministro de fármaco anti-cáncer. El selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables, por supuesto, pueden ser administrados a través de un número de medios teniendo en mente que todas las formulaciones no son adecuadas para cada ruta de administración. El selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden ser administrados en forma líquida o sólida. La aplicación puede ser oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), o a través de inhalación. El selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables se pueden administrar junto con auxiliares, vehículos y/o díluyentes convencionales farmacéuticamente aceptables. Las formas sólidas de aplicación comprenden tabletas, cápsulas, polvos, pildoras, pastillas, supositorios y formas granuladas de administración. También pueden incluir vehículos o aditivos tales como sabores, colorantes, diluyentes, suavizantes, aglutinantes, conservadores, agentes de resistencia y/o materiales de cierre. Las formas líquidas de administración incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Estas también pueden ser ofrecidas junto con los aditivos antes mencionados. Las soluciones y suspensiones de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable, asumiendo una viscosidad adecuada para facilitar el uso, pueden ser inyectadas. Las suspensiones demasiado viscosas para inyección pueden ser implantadas utilizando dispositivos diseñados para tales propósitos, si es necesario. Las formas de liberación sostenidas generalmente se administran a través de medios parenterales o entéricos. La administración parenteral es otra ruta de administración del selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, utilizada para practicar la invención. "Parenteral" incluye formulaciones adecuadas para inyección y para administración nasal, vaginal, rectal y bucal. La administración de selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables puede involucrar una formulación de dosis prolongada oral. Las formulaciones de dosis orales preferiblemente se administran una vez al día a tres veces ai día, en la forma de una cápsula o tableta de liberación sostenida, o alternativamente como una solución de base acuosa. El selenato o su sal farmacéuticamente aceptable puede ser administrada intravenosamente, ya sea diariamente, continuamente, una vez a la semana a otras veces a la semana. La administración de selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables puede incluir administración diaria, de preferencia una vez al día en la forma de una cápsula o tableta de liberación sostenida, o una vez al día como una solución acuosa. Las combinaciones de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable y por lo menos un agente cltostático o un agente citotóxico pueden ser administradas en forma sólida o líquida en una sola formulación o composición o en formulaciones o composiciones separadas. En algunas modalidades, el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable y el agente(s) citostático o agente(s) citotóxico se administran oralmente como una tableta o cápsula individual o tabletas o cápsulas separadas. En otras modalidades, el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable y el agente(s) citostático o agente(s) citotóxico, se administran intravenosamente en una sola composición o composiciones separadas. Los métodos de la presente invención pueden ser empleados en combinación con otros tratamientos conocidos para el cáncer, por ejemplo, pero no limitándose a, cirugía, quimioterapia y radioterapia. En algunas modalidades, el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable se utiliza en combinación con radioterapias, tales como, pero no limitándose a, radioterapia de haz de luz externa conformacional (50-100 Gris dado como fracciones durante 4-8 semanas), ya sea de un solo disparo o fraccionado, braquiterapia de alta velocidad de dosis, braquiterapia intersticial permanente, radioisótopo sistémicos (por ejemplo, Estroncio 89). En algunas modalidades, la radioterapia puede ser administrada en combinación con un agente de radiosensibilización. Ejemplos ilustrativos de agentes de radiosensibilización incluyen, pero no se limitan a efaproxiral, etanidazol, fluosol, misonidazol, nimorazol, temoporfin y tirapazamina. En otras modalidades, el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable se utiliza en combinación con tumorectomía. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas para tratar o prevenir cáncer, que generalmente comprenden una cantidad supra-nutricional, convenientemente de alrededor de 0.5 mg a 1.0 g de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable está en una cantidad de aproximadamente 5.0 mg a aproximadamente 700 mg. En ejemplos ilustrativos, el selenato o su sal farmacéuticamente aceptable está en una cantidad de aproximadamente 7.5 mg a 250 mg, especialmente de 50 mg a 200 mg, por ejemplo, de 100 a 150 mg para una dosis diaria individual. La composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de un cáncer en donde se activa o sobre-activa Akt o un cáncer dependiente de hormona. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas son útiles para tratar cáncer de próstata, en especial un cáncer de próstata resistente a fármaco o independiente a andrógeno. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas además comprenden por lo menos un agente citostático o un agente citotóxico. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas además comprenden un agente de ablación de hormona químico. En otras modalidades más, las composiciones farmacéuticas además comprende por lo menos un agente citostático y/o un agente citotóxíco y un agente de ablación de hormona químico. En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas además comprenden un agente de radiosensibilización para utilizarse con radioterapia.

La composición farmacéutica de la presente invención puede incluir cualquiera de los componentes adicionales que son no inmunogénicos y biocompatibles con selenato, así como capaces de bioabsorción, biodegradación, eliminación como una molécula intacta. La formulación puede ser suministrada en una forma lista para uso o puede ser suministrada como un polvo estéril o líquido que requiere de la adición de un vehículo antes de la administración. Si se desea esterilidad, la formulación puede hacerse bajo condiciones estériles, los componentes individuales de la mezcla pueden ser estériles, o la formulación puede ser estéril filtrada antes de uso. Dicha solución también puede contener vehículos farmacéuticamente aceptables apropiados, tales como, pero no limitándose a, reguladores de pH, sales, excipientes, conservadores, etc. En algunas modalidades, se utilizan formulaciones orales de liberación sostenida para administrar selenato o su sal farmacéuticamente aceptable en los métodos de la invención. Estas formulaciones en general comprenden selenato o su sal farmacéuticamente aceptable teniendo una solubilidad reducida con el fin de retrazar la absorción en la corriente sanguínea. Además, estas formulaciones pueden ¡ncluir otros componentes, agentes, vehículos, etc., los cuales también pueden servir para retrazar la absorción de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable. También se pueden utilizar microencapsulación, sistemas de atrapamiento polimérico, y bombas osmóticas, que pueden ser o no bioerosionables, para permitir la difusión retrazada o controlada del selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo a partir de una cápsula o matriz. El selenato o sus sales farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar solos o como parte de otro agente. Por consiguiente, la invención también contempla un agente que comprende selenato o un sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el tratamiento de un cáncer en donde se activa Akt, o para el tratamiento de un cáncer dependiente de hormona, en donde el agente se formula para administrase en combinación con terapia de ablación de hormona. Con el fin de que la naturaleza de la presente invención pueda ser más claramente entendida y ponerla en efecto práctico, ahora se describirán sus modalidades particulares preferidas con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 SUPRESIÓN DE PROGRESIÓN DE TUMOR DE PRÓSTATA CON SELENATO DE SODIO INHIBIENDO LA CTIVACIÓN DE CINASA DE ROTEÍNA B/AKT Materiales y Métodos Cultivo de Célula Los experimentos de cultivo de célula involucraron una línea de célula PC-3, la cual se obtuvo de la Colección de Cultivo de Tipo Americano (Manassas, Virginia, USA). Las células se cultivaron en forma rutinaria en RPMI 1641 (Invitrogen) suplementado con suero de bovino fetal al 10% y una mezcla antibiótica/antimicótica al 1% (Invitrogen). Las células se mantuvieron a 37°C en 5% C02. El selenato de sodio y la selenometionina (Sigma) se hicieron como soluciones de abastecimiento de 10mM en agua destilada y se esterilizaron mediante filtro antes de la dilución en el medio para experimentos in vitro.

Experimentación Animal La experimentación animal involucró el uso de ratones sin pelo BALB/c. en el día uno del experimento, se anestesiaron ratones sin pelo BALB /c de 6 semanas de edad con una inyección intraperítoneal de cetamina 100 mg/kg y xilazina 20 mg/kg. Bajo amplificación se inyectaron 1 x 106 células PC-3 con viabilidad mayor que 95% en la próstata dorsolateral, esencialmente como se describió por Corcoran, N.M., Najdovska, M., and Costello, A.J. (2004), J. Urol, 171 :907-910. En ei día 3 del experimento, todos los ratones fueron cambiados a la dieta mínima de selenio D19101 con un contenido de selenio analizado de 0.07 ppm (Research Diets Inc., New Brunswick, New Jersey, USA). Los ratones después fueron aleatoriamente asignados para recibir ya sea 5 ppm de selenio como selenato de sodio en el agua para beber o agua no suplementada. Después de 5 semanas de suplementación los ratones fueron sacrificados de manera especial y después se pesaron y se midieron las glándulas de próstata conteniendo el tumor con un calibrador de Vernier. Después se exploró el retroperitoneo bajo amplificación cefadalmente al nivel de las venas renales y nodos linfáticos midiendo mayor que 0.5 mm identificados. Se determinó el grado de apoptosis en las muestras de tejido utilizando un equipo de detección de muerte de célula TÚNEL (in situ) (Roche Applied Science) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se contó el número de células tenidas en café a alta energía (x400) en 10 campos aleatoriamente seleccionados en áreas en donde estuvo ausente la necrosis en tensión de HY&E de secciones adyacentes. Se determinó la velocidad de proliferación de célula tumoral a través de incorporación de BrdU in vivo. Dos horas antes del sacrificio, los ratones fueron inyectados con 50 mg/kg BrdU (Sigma) intraperitonealmente. Se cortaron secciones de 5 µm, se fijaron en metanol absoluto a 4°C durante 10 minutos. Las secciones fueron rehidratadas en PBS y se incubaron en 2N HCl durante 1 hora a 37°C para desnaturalizar el DNA. EL ácido se neutralizó sumergiendo los portaobjetos en 0.1 M de regulador de pH de borato (pH 8.5). Después de 3 lavados con PBS las muestras fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal para bromodesoxiueidina (BrdU) (Roche Applied Science) a una concentración de 5 µg/mL diluido en 0.1% BSA en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, Después durante la noche a 4°C. Las muestras se lavaron 3 veces en PBS y se incubaron durante 1 hora con una mezcla de inmunoglobulina de enlace biotinilada (DAKO Corporation). Después de 3 lavados en PBS, las muestras se incubaron con estreptavidina-peroxidasa de rábano (BD Biosciences) y la inmunotinción reveló DAB (Enhanced Liquid Substrate System, Sigma). Se seleccionaron 10 campos a alta energía (x400) en forma aleatoria y se contó el número de células teñidas de color café.

Curva de crecimiento PC-3 Se obtuvieron curvas de crecimiento de PC-3 permitiendo la unión durante la noche de 2 x 1 O5 células PC-3 después de 16 horas, el medio se cambio para incluir selenato de sodio en presencia de suero a las concentraciones indicadas y se dejo creer hasta los puntos de tiempo especificados. Después se cosecharon los sobrenadantes y células, se combinaron y las células viables se determinaron a través del ensayo de exclusión de Azul Trypan Blue. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Ensayos de incorporación de BrdU e Inmunofluorescencia Se realizaron ensayos de incorporación de BrdU y de inmunofluorescencia colocando en placas 2.5 x 103 células PC-3 y dejándolas unir durante la noche. Después de 16 horas, el medio se cambio para incluir selenato de sodio a las concentraciones indicadas en presencia de suero. Después de 36 horas el medio conteniendo el selenato de sodio se refrescó con 1 µL/mL de Reactivo de Marcación de Proliferación de Célula (BrdU/FrdU, Amersham Biosciences). Las células se incubaron durante 16 horas más, después se lavaron 3 veces en PBS y se fijaron en PFA al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se utilizaron anti-BrdU y anticuerpos monoclonales de ratón como los anticuerpos primarios y Alexa anti-ratón 488, como los anticuerpos secundarios. Se determinó el porcentaje de células que incorporan BrdU contando el número de núcleos teñidos en verde por número de células positivas de DAPI. Se contaron 100 células positivas de DAPI por cubre objetos y el experimento se realizó por triplicado.

Determinación del nivel bloque de ciclo de célula La determinación del nivel de bloque de ciclo de célula implicó colocar en placas 5 x 105 células PC-3 que se sincronizaron a través de privación de suero durante 48 horas antes de que se agregará selenato de sodio en el suero fresco conteniendo el medio a las concentraciones indicadas. Las células se dejaron crecer hasta los puntos de tiempo indicados. Después se cosecharon, se lavaron en PBS y se fijaron en 70% de etanol enfriado con hielo durante 15 minutos. Las células se lavaron con PBS y se volvieron a suspender en PBS conteniendo 40 µg/mL de yoduro de propidio (Sigma) y 100 µg/L de RNase. Se generaron histogramas de DNA para cada lectura y se determinó la proporción de células presentes en los picos G1 y G2/M. Los resultados se obtuvieron para 3 experimentos independientes.

Ensayo de Crecimiento de MTT Los ensayos de crecimiento de MTT involucraron colocar en placas 1 x 103 células PC-3 por cavidad en una placa de 96 cavidades y permitiendo que las células se unieron durante la noche. A las 16 horas el medio se reemplazo con medio fresco conteniendo la concentración indicado de selenato de sodio selenometionina.

Para el experimento que determinó el efecto adicional de la inhibición de PI3K en la inhibición de crecimiento de selenato de sodio, se agrego LY294002 (Promega, Madison, Wl, USA) a una concentración de 50 µM con el selenato de sodio. Los controles para este experimento recibieron un volumen igual del diluyente LY294002 (DMSO). Después, se realizaron los ensayos de crecimiento de MTT de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma).

Anticuerpos e Inmunotinción Los siguientes anticuerpos se obtuvieron de Cell Signaiing Technology (Beverly, MA, USA) a menos que se indique otra cosa: anti-p27?lp1 (bd Pharmingen), anti-p21CIP1, ANTI- CYCLIN di, ANTI-CYCLIN d3, ANTI-CDK4, ANTI-CDK6, ANTI-PHOSPHO rb (Ser807/811), anti-RB, anti-fosfo Akt (Ser473), anti-fosfo Akt (Thre308), anti-Akt, antí-fosfo PDKI (Ser241), anti-fosfo PDKI (Tyr373/376), anti-fosfo GSK-3ß, anti-fosfo mTOR (Ser2448), anti-mTOR, anti-ßlll tubulina (Promega). Para determinar el efecto de selenato de sodio sobre la protesina reguladora del ciclo de célula, se trataron 5x105 células PC-3 con 0.5 mM de selenato de sodio durante los tiempos indicados. Para determinar el efecto del selenato en la fosforilación de la proteína retinoblastoma, 2x105 células se dejaron unir durante la noche, después se privaron de suero durante 24 horas antes de ser tratadas con 0.5 mM de selenato de sodio durante el tiempo indicado. Para determinar el efecto del selenato en la fosforilación de proteínas involucradas en la cascada de señalización de PI3K/Akt, 5x105 células PC-3 se dejaron unir durante 10 horas. Las células estuvieron privadas de suero durante 16 horas y después se trataron con 0.5 mM de selenato de sodio durante los tiempos indicados. Las células fueron lisadas en ELB (250 mM NaCI, 50 mM HEPES pH 7.0, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 0.2% TX100, 20 mM de fluoruro de sodio, 2 mM de pervanadato de sodio, cóctel Inhibidor de Proteasas Completo (Roche)). Los listaos se centrifugaron durante 15 minutos a 4°C. Se determinó la concentración de proteína utilizando el sistema BCA (Sigma) y se cargaron cantidades iguales de proteína en cada carril de un gel de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se transfirieron sobre membranas de PVDF (Millipore) y se detectaron con anticuerpos secundarios de anti-ratón o anti-conejo acoplados a peroxidasa de rábano (HRP) y quimioluminiscencia utilizando el SuperSignal West Dura (Pierce). Las membranas se separaron utilizando el Regulador de pH Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce).

Transfección de célula e Inmunofluorescencia El día antes de la transfección, se sembraron 5 x 105 células PC-3 en placas de 24 cavidades y pasajeramente se transfectaron con 0.8 µg de la construcción pcDNA3-GFP-FKHRwt (un tipo de regalo del Dr Bill Sellers, Dana-Farber Institute, Boston) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se permeabilizaron en 0.2% de Tritón X-100 y los contenidos nucleares se tlñeron con DAPI. Los cubreobjetos se montaron con un medio de montaje fluorescente (DAKO). La distribución celular de la fluorescencia verde se determinó en células fluorescentes dobles utilizando un microscopio epifluorescente Leica.

Análisis Estadístico Los datos se prestan como + SE medio a menos que se indique otra cosa. Se analizaron las diferencias entre grupos (Figure 1A-D) utilizando la prueba de Student's con importancia asumida a p<0.05.

Se realizaron todos los análisis estadísticos utilizando SPSS 9.05 para Windows (SPSS, Chicago, Illinois).

Resultados Los resultados indicaron que el selenato de sodio inhíbela proliferación de células de carcinoma de próstata en un modelo de ratón ortotópico. Una comparación de animales tratados con selenato de sodio con el grupo de control se hizo como sigue: Se compararon los pesos de próstata conteniendo el tumor medio como se muestra en la Figura 1A y se compararon ios volúmenes de tumor medio como se muestra en la Figura 1B. También se determinó ei número medio de metástasis de nodo linfático, el selenato de sodio mostró inhibir significativamente el crecimiento de tumor primario, comparado con los controles determinados por el índice de peso de próstata, mientras que las diferencias en volumen de tumor entre los dos grupos solo fallaron para alcanzar importancia. El número de nodos linfáticos retroperitoneales significativamente se redujo en el grupo de selenato de sodio comparado con los controles (Figura 1 C). La inhibición del crecimiento de tumor causada por el selenato de sodio pudo haber ocurrido debido a un efecto inhibidor sobre la proliferación de célula de tumor o a través de un incremento en la apoptosis de célula tumoral. Para distinguir estos dos mecanismos, la incorporación del análogo de nucleótido, BrdU en células de proliferación y para marcadores apoptóticos con el ensayo Túnel en las próstatas de control y tratadas con selenato de sodio, se analizó. El selenato de sodio significativamente daño la incorporación de BrdU en tumores de próstata contra los controles (Figura 1D,E), pero la apoptosis entre los dos grupos no fue significativamente diferente (Figura 1D). Estos resultados indicaron que el selenato de sodio actúa para impedir la proliferación de célula tumoral en lugar de mejorar la muerte de célula tumoral. Los resultados también indicaron que el selenato de sodio detiene células de carcinoma de próstata en la fase G1 del ciclo de célula. Para determinar si el efecto inhibidor de selenato de sodio en la progresión de tumor observada in vivo, podría conducir a una inhibición del crecimiento de célula tumoral in vitro, se sembraron células PC-3 de carcinoma de próstata humano y se cultivaron durante 16 horas. Las células después se incubaron en presencia o ausencia de concentraciones del incremento de selenato de sodio. Se contaron los números de célula totales 24, 48 y 72 horas después de la incubación. Como se indica en la Figura 2A, el número de células PC-3 cultivadas en ausencia de selenato de sodio se incrementó uniformemente durante el periodo de 72 horas. En contraste, el los números de célula PC-3 significativamente se redujo en una forma dependiente de dosis en presencia de selenato de sodio. Entre las dosis de 0.01 y 0.1 mM, la velocidad de incremento en el número de célula se impidió, mientras que las dosis más altas de 0.25 y 0.5 mM, todos los incrementos en el número de célula fueron bloqueados. Estos resultados sugirieron que el selenato de sodio interfiere con la progresión de ciclo de célula, las células PC-3 se sembraron esencialmente como se describió antes, en concentraciones de selenato de sodio variando de 0.05 a 0.25 mM, durante 54 horas. Después se determinó la incorporación de los análogos de nucleótido fluorescentes BrdU/FrdU en células progresando a través de la fase G1/S a través de microscopio de inmunofluorescencia. Una imagen típica de las células expuestas a 0.25 mM de selenato de sodio durante 54 horas se muestra en la Figura 2B. La exposición a esta dosis de selenato de sodio severamente impidió la progresión G1/S de las células PC-3 según determinado por núcleos positivos de BrdU/FrdU. La distribución del ciclo de célula en presencia o ausencia de concentraciones en incremento de selenato de sodio a través de citometría de flujo también se analizó. Un histograma típico del ciclo de células se muestra en la Figura 2C y los calores de porcentaje medios en la Figura 2D. El tratamiento de células PC-3 con 0.25 y 0.5 mM de selenato de sodio durante 24 horas incremento el porcentaje de la población de células en G1 de 55% en el grupo de control a una escala de 69-70% en las muestras tratadas con selenato de sodio (Figura 2D). En forma inversa, la incubación en presencia de concentraciones en incremento de selenato de sodio redujo el porcentaje de células a 19% y 24% a partir dei control de 28% en ia fase G2/M. El tratamiento con selenato de sodio durante un periodo de 48 horas incrementó el porcentaje de la población de célula en G1 en una forma dependiente de dosis y de tiempo, mientras que el tratamiento con fármaco redujo el porcentaje de células PC-3 en la fase G2/M. El efecto quimiopreventivo del cáncer del selenio no puede ser totalmente explicado por la presencia del elemento huella de selenio, y se ha vuelto enormemente claro que el compuesto selenio por sí mismo es importante en esta actividad. (Corcoran eí al 2004, supra; Kim eí al 2003, supra). Los efectos de selenato de sodio inorgánico con selenometionina orgánica en la proliferación de células PC-3 se compararon utilizando el ensayo MTT como una medida de índice proliferativo. Como se muestra en la Figura 2E, el selenato de sodio a dosis de 0.25 y 0.5 mM marcadamente redujo la proliferación de célula PC-3 al periodo de 72 horas, mientras que la selenometionina fue menos efectiva para reducir la proliferación de célula a las mismas dosis.. Un refuerzo ligero, pero reproducible en el número de célula a la dosis más baja de selenato de sodio, 0.01 mM, se observó (Figura 2E). En resumen, estos datos indican que el selenato de sodio inhibe la proliferación de célula impidiendo la entrada de ciclo de célula de la fase G1 a la S. Los resultados también indicaron que el selenato de sodio, pero no la selenometionina, indujo la sobre-regulación de proteínas inhibidoras de ciclo de célula. La progresión ordenada de células de proliferación a través de G1 se reguló principalmente a través de la activación secuencial del complejo de cinasa ciclina D/cdk4/cdk6 el cual regula la fosforilación de Rb y la liberación del factor de trascripción E2F. Para determinar el efecto del tratamiento con selenato de sodio sobre proteínas reguladoras de ciclo de célula clave, se trataron células PC-3 esencialmente como ya se describió, con 0.5mM de selenato de sodio durante diferentes periodos de hasta 24 horas. Después se resolvieron y se analizaron proteínas celulares totales a través de ensayos de inmunotinción para la presencia de ciclina D1, D3cdk4 y cdk6. Los niveles de expresión de ciclina D1 cayeron significativamente a partir del periodo de 14 horas, mientras que los niveles de cdk4 llegaron a un pico a las 6 horas y declinaron en una forma dependiente del tiempo a las 24 horas (Figura 3A). Los inhibidores de CDK tales como as p27 y p21 CIP 1/WAF1 son importantes reguladores negativos de la progresión de ciclo de célula. Estas moléculas bloquean la actividad de cinasa CDK uniéndose al complejo de ciclina D/CDK en la fase G1, evitando la fosforilación de miembros de la familia del gen Rb y la transición de la fase G1 a S. Para determinar el efecto del selenato de sodio sobre estos inhibidores de ciclo de célula, se analizaron, como se describió anteriormente, los niveles de expresión de p27?lp1 y p21CIP1 en los mismos lisatos de la célula PC-3. El tratamiento con selenato de sodio incremento los niveles de p27?,p1 en una forma dependiente de tiempo hasta las 24 hora cuando los niveles declinaron, mientras se observó un marcado incremento en los niveles de p21CIP1, llegando a un pico a las 6 horas y declinando después (Figura 3A). Una declinación marcada en la fosforilación de Rb (ser807/811) en una forma dependiente de tiempo en células PC-3 tratadas con selenato de sodio bajo las mismas condiciones también se observó (Figura 3B). Los efectos de compuestos de selenio orgánico contra inorgánico en los niveles de la proteína inhibidora de ciclo de célula p27?lp1 se compararon en las células Pc-3. Como se muestra en la Figura 3C, la selenometionina tubo poco efecto en los niveles de p27KIP1 durante el periodo de tiempo analizado, mientras que el selenato de sodio, marcadamente reforzó los niveles de proteína total p27K!P1 según comparado con los niveles de control (0 horas) y selenometlonina (Figura 3C). Estos datos indican la reducción en los niveles de ciclina D1 y fosforilización de Rb así como el incremento concomitante en las proteínas inhibidoras de ciclo de célula p27KIP1 y p2-]Cip./wAF. qUe probablemente juegan un papel importante en la regulación de la detención de G1 inducida por el compuesto de selenio inorgánico, y que el selenio orgánico es incapaz de inducir estos efectos. Los resultados de la presente también indican que el selenato de sodio, pero no la selenometionina, potenciaimente inhibe la activación de cinasa de proteína B/Akt. La pérdida de regulación de la trayectoria de supervivencia de la célula PI3K a través de la pérdida de la proteína supresora de tumor PTEN, es una marca común de la neoplasia humana (Vivanco, I. and Sawyers, CL. 2002, supra), particularmente tumores de próstata (Visakorpi, 1999, Ann. Chir. Gynaecol, 88:11-16; Li eí al 1997, Science, 275: 1943- 1947). La trayectoria de PI3K a través de su cinasa efectora Akt, tiene un papel importante para regular la proliferación celular, evitando la degradación de ciclina D1, y negativamente influenciando la expresión de las proteínas inhibidoras de ciclo de célula p27 IP1 y p2l¡wAF./cip, (Graff et a/ 2002, J. Biol. Chem., 275:24500-24505). Las células PC-3 tienen expresión perdida de PTEN y tienen una actividad de trayectoria PI3K constitutivamente activada (Chakraborty ef al 2001, Cáncer Res., 61:7255-7263. Beresford ef al 2001, J. Interferon Cytokine Res., 21:313-322), particularmente la actividad de cinasa de Akt. Para determinar si el selenato de sodio puede interferir con la actividad de la trayectoria de PI3K, se trataron células PC-3 con selenato de sodio (0.5 mM) durante varios tiempo de exposición. Se determinó el estado de fosforilización de Akt en iisatos de célula entera utilizando anticuerpos específicos de activación. Como se muestra en la Figura 4A, el selenato de sodio indujo un refuerzo pasajero en la fosforilación de Akt en Ser473 y Thr308 en 10 minutos de exposición a selenio inorgánico. Este refuerzo después fue seguido por una desactivación marcada y prolongada de Akt, mientras que los niveles totales de Akt celulares (pan Akt) permanecieron esencialmente sin cambio (Figura 3A). El Akt se fosforiló en Thr308 en la membrana celular a través de PDK1 (Vanhaesebroeck, B. and Alessi, D.R. 2000, Biochem. J., 346 Pt3:561-576). Para determinar si el selenato de sodio actúo para sub-regular la actividad PDKI corriente arriba del Akt, se analizó el estado de fosforilación de PDK1 utilizando los anticuerpos PDKl ser241 y tyr373/376 fosfo-específicos. Como se muestra en la Figura 4B la exposición de células PC-3 a 0.5 mM de selenato de sodio 6 horas no tuvo ningún efecto sobre el estado de fosforiiización de PDK1, indicando que el selenato de sodio no inhibe la activación de Akt bloqueando la actividad de cínasa PDK1. Para determinar si el refuerzo pasajero en la activación de Akt observado con selenato de sodio fue dependiente de componentes corriente arriba de la trayectoria PI3K, se trataron células PC-3 con selenato de sodio (0.5 mM) durante 10 minutos, con o sin pre-tratamiento (1 hora) con el inhibidor PI3K LY294002 (50µM). Como se observa en la Figura 4C, el tratamiento con selenato de sodio durante 10 minutos reforzó la activación de Akt según determinado por anticuerpos fosfo-específicos. Sin embargo, este refuerzo fue completamente bloqueado por el pre-tratamiento con LY294002, indicando que el refuerzo pasajero en la fosforilación de Akt inducido por selenato de sodio requiere de componentes corriente arriba de la trayectoria de PI3K. Los efectos de compuestos de selenio inorgánico sobre la activación de Akt en células PC-3 se compararon tratando células con 0.5 mM de selenato de sodio o selenometionina durante varios puntos de tiempo y determinado la fosforilación de Akt en Ser473. Como se muestra en la Figura 4D, la selenometionina fue capaz de afectar la fosforilación de Akt en todos los periodos de tiempo medidos, mientras que el selenato de sodio profundamente inhibió la activación Akt. Los resultados también indicaron que el selenato de sodio inhibe efectores corriente debajo de la supervivencia de célula, trayectoria PI3K. Los efectores potenciales de la señalización PI3K corriente abajo del supresor de tumor PTEN, incluyen un número de sustratos de la cinasa Akt, tales como BAD, caspase 9, IKKa y los factores de trascripción de Forkhead FKHR, FKHRLI and AFX (Biggs, eí al 1999, Proc. Nati. Acad. ScU USA, 96:7421-7426; Brunet ef al 1999, Cell, 96:857-868; Cardone ef al 1998, Science, 282:1318-1321. Datta eí al 1997, Cell, 91 :231-241; Kops eí al 1999, Nature, 398:630-634; Ozes eí al 1999, Nature, 401 :82-85; Tang eí al 1999, J. Biol. Chem., 274:16741- 16746).

Los miembros de la familia del factor de trascripción de Forkhead se des-regularon y se inactivaron en células nulas de PTEN, siendo aberrantemente localizadas en el citoplasma, en donde no pueden activar las trascripción (Nakamura eí al 2000, Mol. Cell. Biol, 20:8969-8982). La re-introducción de la función PTEN en dichas células induce a la traslocación de FKHR hacia el núcleo ocasionando finalmente la detención G1 en células carentes de PTEN (Nakamura ef ai 2000, supra). Por lo tanto, la inhibición con selenato de sodio de la activación de Akt en células PC-3 carentes de PTEN similarmente debe inducir la re-locación de FKHR desde el citoplasma hacia el núcleo. Se trataron células PC-3 trasfectadas con una construcción de expresión GFP-FKHR con LY294002 (50 µM, 1 hora) o selenato de sodio (0.5 mM, 3 horas) o selenometionina (0.5 mM, 3 horas) y se observaron los efectos de los tratamientos en la locaiización celular de la proteína fluorescente de Forkhead. Como se muestra en las Figuras 5A y B la proteína de fusión GFP-FKHR se localizó en el citoplasma de células PC-3 de control no tratadas. El tratamiento con LY294002 o selenato de sodio indujo una re-localización marcada de la proteína de fusión GFP-FKHR a partir del cicloplasma hacia el núcleo. Sin embargo la selenometionina fue incapaz de inducir la relocalización de GFP-FKHR del citoplasma hacia el núcleo. Estos resultados confirman la selectividad entre compuestos de selenio para bloquear la señalización de Akt inhibiendo la activación de la proteína de sustrato Akt clave, FKHR. Dos efectores/sustratos corriente abajo adicionales de Akt son glicogen-sintasa-cinasa-3ß, GSK-3ß, (Mouie eí al 1997, J. Biol. Chem., 272:7713-7719; Van Weeren eí al 1998, J. Biol. Chem., 273:13150-13156) y el objetivo de mamífero de rapamicína, proteína mTOR protein (Nave ef al 1999, Biochem. J., 344 Pt2:427-431; Sekulic et al 2000, Cáncer Res., 60:3504- 3513). Para determinar si el selenato de sodio también puede efectuar la activación de estos sustratos Akt se trataron células PC-3 con selenato de sodio (0.5 mM) durante varios periodos de tiempo y se sondearon lisatos de célula entera con anticuerpos fosfo-específicos a GSK-3ß y mTOR. Como se muestra en las Figuras 5 C y 5D el selenato de sodio indujo una declinación en el estado de fosforilación tanto de mTOR como de GAK-3ß.

Discusión Los resultados anteriores demuestran los efectos de suplementación de selenato de sodio a una dosis alta en cáncer de próstata refractario de hormona. El selenato de sodio mostró inhibir la proliferación de célula PC-3 induciendo la detención de G1, en una forma dependiente de dosis y de tiempo, pero no incremento el nivel de apoptosis. La detención de G1 estuvo acompañada por un incremento en la expresión de las proteínas inhibidoras de ciclo de célula p27KIP1 y p2?CIP1 / AF1 y p0r una reducción en la expresión de ciclina D1. la fosforilación de Rb también fue suprimida por selenato. El selenato, en contrate a la selenometionina, marcadamente redujo los niveles activos del efector PI3K, Akt. L activación de efectores corriente abajo clave de la trayectoria PI3K/Akt, mTOR, GSK-3ß y el factor de transcripción FKHR también fueron inhibidos por el selenato, pero no por la selenometionina. Estos resultados demuestran un efecto inhibidor específico de selenato inorgánico en la trayectoria de PI3K/Akt, sugiriendo que este compuesto puede ser uso en terapias para el tratamiento de cáncer, particularmente cáncer causado por la sobre-activación de la trayectoria PBK/Akt, tal como tumores carentes de PTEN. Los mecanismos moleculares involucrados en el efecto antl-tumorigénico de selenato de sodio contra selenometionina también han sido producidos en este estudio. El selenato de sodio inorgánico inhibió la progresión de tumor in vivo impidiendo la proliferación celar sin tener ningún efecto sobre la apoptosis. Una reducción dependiente de dosis y tiempo en la proliferación de célula PC-3 se observó con selenato de sodio capaz de inhibir la progresión de fase S de estas células induciendo la detención de G1 sin incrementar la proporción de células apoptóticas observadas por citometría de flujo.

La progresión a través del ciclo de células se controló a través de CDKs, cuya actividad se inhibió por los inhibidores CDK. La progresión a través de la transición G1-S se postuló ser controlada por la actividad de cicllnas G1 y CDKs. Las ciclinas tales como cdkl estimulan la progresión de ciclo de célula G1 (Baldin eí al 1993, Genes Dev., 7:812-821), mientras que Rb parece ser un objetivo corriente abajo clave acoplando el procedimiento de ciclo de célula a la regulación de gen (Weintraub ef al 1995, Nature, 375:812-815). La fosforilación de Rb a través de complejos cdk4/cdk6/cyclina D interrumpe al complejo Rb/E2F permitiendo que E2F active genes requeridos para la síntesis de ADN y la progresión de ciclo de célula (Harbour eí al 1999, Cell, 98:859-869). Los resultados de la presentes indican que los niveles de ciclina D1 se redujeron, como lo hizo la fosforilación de Rb en Ser807/811, mientras que los niveles de cdk6 y cdk4 permanecieron relativamente sin cambio. Estos resultados demuestran que el selenato a una dosis alta induce una detención de G1 en células PC-3 interfiriendo específicamente con los niveles y la activación de proteína de progresión de ciclo de célula clave. Se muestra que los niveles de p27KIP1 se elevan después de la exposición a una alta dosis de selenato, pero no con una alta dosis de selenometionína. Los niveles de p27KIP1 elevados son una marca clave y necesarios para la detención de Gl en una escala de células normales después deprivación de suero (Coats eí al 1996, Science, 272:877-880) o inhibición de contacto (Polyak eí al 1994, Cell 78:59-66). p27KIP1 juega un papel central como un regulador negativo de la progresión de ciclo de célula, por lo tanto, los nivele elevados de esta proteína proporcionan una base lógica para la detención de Gl observadas inducida por selenato. La expresión de P21CIP1 también conduce la detención de Gl inhibiendo los complejos de ciclina/CDK e inhibiendo síntesis de ADN (Johnson, G.G. and Walker, C.L. 1999, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39:295-312). La trayectoria de PI3K tiene un papel central en muchas funciones celulares que pertenecen a la proliferación y supervivencia y la des-regulación de esta materia, a través de la pérdida de le proteína supresora de tumor PTEN, es un evento común en malignidades de próstata (Whang ef al 1998, Proc. Nati. Acad Sci. USA 95:5246-5250). La activación de ia trayectoria de PI3K es requerida para la inducción de la expresión de ciclina D1 (Muise-Helmericks eí al 1998, J. Biol. Chem. 273:29864-29872) y la inhibición de esta trayectoria con el inhibidor específico de PI3K LY294002 recientemente ha sido reportado como que conduce a la detención de G1 en células de carcinoma de próstata DU145 y PC-3 (Gao, eí al 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun. 310: 1124-1132). Un efector corriente abajo principal de la trayectoria PI3K es la cinasa de proteína B/Akt. Akt es constitutivamente activado en tumores de próstata que carecen de PTEN, tales como células PC-3. Los resultados de la presente indican que el selenato a una dosis alta pero no la selenometionina, marcadamente puede reducir los niveles de Akt activado presente en estas células, un efecto que actúa específicamente al nivel de Akt activado ya que ningún cambio en la activación de PDK1 se detectó, una cinasa más bien directamente induce la activación de Akt corriente abajo de PI3K (Vivanco, I. and Sawyers, CL. 2003, supra). Estos resultados sugieren que el selenato puede actuar para reforzar la desfosforilación de Akt, a través de una fosfatasa pobremente caracterizada. De manera interesante, los efectos del selenato sobre ¡a activación de Akt parecen seguir dos modos distintos de acción. Inicialmente, el selenato induce un refuerzo en la fosforilación de Akt. Este refuerzo es dependiente de PI3K ya que es inhibido por el pre-tratamiento con LY294002. Este refuerzo pasajero después es seguido por una inhibición profunda de larga duración de la activiación de Akt, que no involucra componentes corriente arriba de Akt, ya que la inhibición proliferativa de selenato de sodio a una alta dosis no se mejoró por LY294002. El selenato de sodio también es capaz de impedir la activación de los efectores Akt corriente abajo, mTOR y GSK-3ß, así como el factor de trascripción FKHR, de acuerdo con el efecto inhibidor de selenato que se enfoca en la cinasa efectora PI3K clave, Akt. El ácido metilselenínico también induce la detención G1 de células DU-145 así como apoptosis a través de una trayectoria medida por caspasa en 24 horas de tratamiento (Jiang ef al 2001, supra). Las dosis tan bajas como 3µM indujeron la detención de G1 pero esto no se asoció con apoptosis o con fosforilación reducida de Akt (Jiang eí al 2002, supra). Sin embargo, dosis más altas de 5µM conducen a una declinación dependiente de dosis en la activación de Akt así como en la iniciación de apoptosis medida por caspasa. La inhibición de la trayectoria PI3K con LY294003 fallo para inducir apoptosis en células DU-145, indicando que el bloque en la trayectoria PI3K inducida por ácido metilselenínico no se involucró en la inducción de apoptosis inducción (Jiang ef al 2002, supra). Una baja dosis de ácido metilseleníníco, induciendo detención de G1, independiente de la Inhibición de Akt y la apoptosis a baja dosis pero bloqueando Akt e induciendo apoptosis a dosis más altas, está en contraste agudamente con los resultados de la presente. El selenato de sodio indujo la detención de G1 a través de la inhibición de la trayectoria PI3K, específicamente al nivel de Akt, sin inducción de apoptosis. Por io tanto, podría parecer que los efectos anti-proliferativos del selenato se enfocan más que aquellos observados con otros compuestos de selenio. Basándose en los hallazgos de la presente y dada que la activación crónica de Akt está asociada con la resistencia a quimioterapia en modelos de cáncer in vivo (Tanaka eí al 2000, Oncogene, 19:5406-5412), se proporciona una base mecánica atractiva para el uso de selenato con agentes quiomioterapéuticos en terapia de combinación en modelos de tumor.

EJEMPLO 2 REDUCCIÓN DE CRECIMIENTO DE TUMOR DE PRÓSTATA DEBIDO AL EFECTO SINERGÍSTICO DE SELENATO DE SODIO CON PACLITAXEL Materiales y Métodos Se inyectaron 1 x106 células PC-3 de tumor de próstata en la próstata de ratones sin pelo. Después de tres días, se administraron 5 ppm de selenio en la forma de selenato de sodio al agua para beber de los ratones que reciben selenato. Se administró paclitaxel a 10 mg/kg ¡ntraperitonealmente una vez a la semana en una solución de 10% Cremophor EL/25% etanol/65%PBS a aquellos animales que recibieron paclitaxel. Se utilizaron 10 animales por grupo. Después de 5 semanas después de la inyección, los animales fueron sacrificados, se removieron las próstatas, se disectaron los apéndices y los tumores se pesaron. Se exploró el retroperitoneo para linfadenopatía y se extirparon nodos linfáticos con un diámetro mayor que 0.5mm. Los tumores después se seccionaron escalonadamente a pasos de 50 mieras y se calcularon los volúmenes de tumor a partir de las imágenes digitalízadas utilizando la forma volumétrica estándar (a + b2/2).

Resultados La Figura 6 demuestra que el seienato sinergiza con paclitaxel para reducir los pesos de tumor de próstata. El grupo de control recibió el vehículo de solubilización paclitaxel Cremophor y etanol sin paclitaxel. Se sabe que Cremophor tiene algún efecto antitumoral que probablemente representa el hecho de que el efecto anti-tumoral del selenato solo no se redujo comparado con el control en este experimento. Los resultados mostrados en la Figura 6 indican que el selenato y el paclitaxel sinergizan para reducir los pesos de tumor mayores que los efectos aditivos del selenato y paclitaxel solos. El selenato inhibe una trayectoria de superviviencia de célula clave, la trayectoria PI3K/Akt. Esta trayectoria está sobre-regulada en una alta proporción de tumores humanos y la sobre-activación de esta trayectoria está altamente correlacionada con el desarrollo de quimioresistencia a agentes químioterapéuticos. Los resultados de la presente indican que el co-tratamiento de tumores de próstata in vivo con una terapia de combinación de selenato y paclitaxel puede inducir un efecto anti-tumoral mayor que cualquier tratamiento solo. El selenato puede interferir con la habilidad de las células tumorales para inducir quimioresistencia al fármaco quimioterapéutico, paclltaxel. Por lo tanto, los tumores de próstata se indujeron en ratones sin pelo inyectando células PC-3 en las próstatas de los animales y subsecuentemente tratando a los animales con el selenato o paclitaxel solos o en combinación durante 5 semanas y después se analizaron los tumores. Como se muestra en la Figura 6, la terapia de combinación tuvo un efecto sinergístico marcado para reducir pesos de tumor mayores que el efecto aditivo de cualquier tratamiento solo. El grupo de control recibió el portador de solubilización paclitaxel Cremophor EL y etanol sin paclitaxel. Se sabe que Cremophor EL tiene un efecto anti-tumoral que probablemente representa el hecho de que el selenato solo no se redujo comparado con el control en este experimento. Los efectos sinergísticos que se observaron son mayores in vivo que in vitro. Esto soporta el concepto de que el selenato está teniendo in efecto anti-angiogénico en células endoteliales de vaso así como en el crecimiento de células tumorales per se y que este efecto combinado solamente se puede observar in vivo y representa el efecto sinergístico. La Figura 7 muestra secciones de tejido de tumores. Se puede ver que el selenato en combinación con paclitaxel tiene un efecto sinergístico que significativamente reduce el tamaño de tumor y volumen, comparado con paclitaxel solo. Este efecto sinergístíco importante de selenato y paclitaxel también es evidente en las gráficas de volúmenes de tumor indicadas en la Figura 8. Los volúmenes de tumor de animales tratados solo con paclitaxel y animales tratados con terapia de combinación se midieron para determinar los efectos de los agentes en el crecimiento de tumor de próstata. La terapia de combinación tuvo un efecto marcado en la reducción de tamaño de tumor como se muestra en la Figura 7, y también tuvo un efecto marcado en los volúmenes de tumor (Figura 8). Este efecto fue estadísticamente importante (P<0.05). Por lo tanto, los datos in vivo mostrados en las Figuras 6 a 8 demuestran el efecto sinergístico de selenato con paclitaxel para reducir pesos y volúmenes de tumor de próstata. Este efecto fue mayor que los efectos aditivos del agente solo demostrando los efectos sinergísticos de los dos compuestos. Esto soporta el hallazgo de que el selenato está teniendo un efecto anti-angiogénico sobre células endoteliales de vaso así como sobre el crecimiento de células tumorales y que este efecto combinado observable in vivo representa el efecto sinergístico. El selenato solo tuvo un efecto mayor para reducir la densidad de microvaso en los tumores que en los volúmenes de tumor, indicando un efecto anti-angiogénico directo.

EJEMPLO 3 PRUEBAS COMPARATIVAS ENTRE SELENATO Y SELENITA Materiales y Métodos Toxicidad de Célula La toxicidad de célula después de tratamiento con 5 µM o 50 µM de selenato de sodio o selenita de sodio involucró medir la toxicidad de célula a través de Exclusión de Azul Trypan. Se sembraron 5x103 células PC-3 de cáncer de próstata humanas en una placa de 24 cavidades y 8 horas después se trataron ya sea con 5 µM o 50 µM de selenato o selenita. La escala de dosis de 5 µM o 50 µM es equivalente a 0.1 mg/kg a 1.25 mg/kg. Las células se cosecharon a 24, 48, 72 y 96 horas después de la adición de selenato o selenita y se determinó el porcentaje de células viables según determinado por la tinción de Azul Trypan. Los resultados mostrados en las gráficas de la Figura 9 ilustran los puntos medios y SD de tres experimentos independientes. La Figura 9 muestra que el selenato es citostático, mientras que la selenita a concentraciones similares es citotóxica. Por lo tanto, la selenita podría ser inadecuada para terapia de combinación en animales. Con el fin de distinguir entre los efectos citotóxicos relativos de selenato y selenita, se trataron células de carcinoma de próstata humanos PC-3 con dos diferentes concentraciones de selenato a 5 µM o 50 µM (equivalente a una dosis de 0.2 a 1.9 mg/kg) o selenita 5 µM o 50 µM (equivalente a una dosis de 0.18 a 1.8 mg/kg). Todas las células en las cavidades de cultivo de tejido se cosecharon después secuencialmente a periodos de entre 24 y 96 horas después de la adición de los tratamientos. El porcentaje de células viables se determinó después utilizando el ensayo de exclusión de Azul Trypan. El selenato en todos los puntos de tiempo y a concentraciones tanto más bajas como más altas fue no citotóxico a estas células. Los porcentajes de células viables en las muestras tratadas con selenato fueron equivalentes a las muestras no tratadas de control (Figura 9). Este efecto se mantuvo a través de todos los puntos de tiempo y alcanzó importancia estadística para un número de puntos de tiempo (ver puntos de tiempo marcados con asterisco, Figura 9). El selenato tuvo un efecto citostático demostrado en las células, mientras que selenita tuvo un efecto citotóxico.

Genotoxicidad de Célula Se colocaron en placas 5 x 105 células PC-3 en una placa de 6 cavidades y 24 horas después las células se trataron con paclitaxel a 1 µg/mL o 10 µg/mL o selenato 500 µM (19 mg/kg) o selenita 500 µM (18 mg/kg) durante los tiempos indicados. Las células después se lavaron en PBS, se lisaron en regulador de pH de lisis ELB y los lisatos de célula entera se operaron en un gel SDS-PAGE y se tiñeron y se sondearon con los anticuerpos indicados. La fosforilación de Histona H2AX ocurrió minutos después de daño al ADN, típicamente a través de rupturas de estructura de cadena doble o individual de ADN y es una lectura muy sensible del daño a ADN.

Para determinar las diferencias entre seienato, selenita y el taxano, paclitaxel para inducir el daño a ADN, se trataron células PC-3 con estos compuestos durante periodos de tiempo en incremento, y después se lisaron. Los extractos de proteína se sondearon para fosforilación de Histona H2A.X utilizando un anticuerpo específico de fosforilación. Los resultados se ilustran en la Figura 10. La Figura 10 indica que selenita es genotóxica, incluyendo rupturas de estructura de ADN mientras que el selenato y paclitaxel no lo son. Aún a una alta concentración de selenato (500 µM; equivalente a una dosis de 19 mg/kg), así como concentraciones en incremento de paclitaxel no indujeron ningún daño al ADN según determinado por la fosforilación de Histona H2A.X. En contraste, la selenita a la misma concentración (500 µM; equivalente a una dosis de 18 mg/kg) induces daño al ADN en 30 minutos de tratamiento, un efecto que se incrementa con el tiempo a pesar de los efectos tóxicos generales de este tratamiento según ilustrado por la reducción concomitante en niveles de ß-tubuiina en las mismas muestras (Figura 10).

Activación de Akt Se colocaron en placas 5x105 células PC-3 en una placa de 6 cavidades y 24 horas después las células se privaron de suero durante 16 horas, después se trataron con los compuestos de selenio indicados todos a 125 µM (equivalente a una escala de dosis de 4-9 mg/kg) durante 6 horas. Las células después se lavaron con PBS, se lisaron en regulador de pH de lisis ELB y los lisatos de célula entera se corrieron en un gel SDS-PAGE y se tiñeron y se sondearon, primero con un anticuerpo Akt de activación específica (Ser408), después las tinciones se separaron y se volvieron a sondear con un anticuerpo específico Akt total (pan Akt) como un control de carga. Se escanearon las intensidades de señal a partir de las películas desarrolladas y se graficaron las intensidades de Akt activo correlacionado a niveles totales de Akt. Para comparar los efectos de diferentes compuestos de selenio sobre el estado de activación de Akt, se trataron células PC-3 con siete diferentes compuestos de de selenio como se muestra en la Figura 11. La Figura 11 indica que solamente el selenato de sodio (ATE) inhibe la activación de Akt, reduciendo los niveles de Akt fosforilado por debajo de los niveles de control (con). En contraste, el ácido selenoso (ácido Sel), selenita de sodio (ITE), dióxido de selenio (Se02), sulfuro de selenio (SeS2), Metil seienocisteína (MSC), Selenocisteína (SeC) todos indujeron la activación de Akt por arriba de niveles de control (con). Para determinar los efectos de una alta dosis de selenita, se colocaron en placas 5x105 células PC-3 en una placa de 6 cavidades y 24 horas después las células se privaron de suero durante 16 horas después se trataron con selenita de sodio o selenato de sodio a 500 µM (equivalente a una escala de dosis de 18-19 mg/kg) durante 1 hora. Después las células en PBS, se lisaron en regulador de pH de lisis ELB y los lisatos de célula entera se corrieron en un gel SDS-PAGE y se graficaron y se sondearon primero con un anticuerpo Akt de activación específica (Ser408). La Figura 12 indica que aún a dosis más alta la selenita de sodio (ITE) 500 µM no inhibió la activación de Akt en comparación con una dosis alta similar de selenato de sodio (ATE). Para determinar si niveles de dosis altos de selenita podrían ser capaces de inhibir los niveles de activación de Akt similares a aquellos observados con selenato, se trataron células PC-3 con 500 µM (18-19 mg/kg) de selenato de sodio o selenita de sodio durante 1 hora y I activación de Akt se determinó utilizando un anticuerpo específico de fosforilación. Este periodo de tiempo se seleccionó ya que la selenita a 500 µM (18 mg/kg) no induce degradación de proteína general en este punto de tiempo. Como se muestra en la Figura 12, el selenato inhibió la activación de Akt comparado con células no tratadas de control mientras la selenita fue incapaz de inhibir la activación de Akt.

Apoptosis Se colocaron en placas 5 x 105 células PC-3 en una placa de 6 cavidades y 24 horas después las células se trataron con paclitaxel a 1, 10, 100 ng/mL y 1 µg/mL, 101µg/mL o selenato de sodio a 100 µM, 250 µM o 500 µM (equivalente de 4 a 19 mg/kg) o selenita de sodio a 100 µM, 250 µM o 500 µM (equivalente de 3.6 a 18 mg/kg) durante 16 horas. Las células después se lavaron en PBS, se lisaron en regulador de pH de lisis ELB y los lisatos de célula entera se corrieron en un gel SDS-PAGE y se graficaron y sondearon con anticuerpos PARP anti-desdoblado (PARP) y anti-ß-tubulina (tubulina) específico. Los agentes que inducen daño genotóxico producen programas apoptóticos a partir de mecanismos dependientes de p53 como se ha demostrado para selenita (Jiang, C. eí al, 2004 Mol. Can. Ther. 3:877). Los agentes de estabilización de microtúbulo tales como paclitaxel, inducen apoptosis a través de la trayectoria apoptótica intrínseca. Para diferenciar los mecanismos pro-apoptóticos de seienato y selenita se trataron células PC-3 con concentraciones incrementantes de estos compuestos durante 16 horas y se analizaron los niveles de la proteína de marcador apoptótico, PARP desdoblado. La Figura 13 indica que selenato y selenita inducen apoptosis a través de diferentes mecanismos. Paclitaxel y selenato inducen la escisión de la proteína PARP pro-apoptótica, mientras que selenita no lo hace. Selenita también induce una degradación marcada de tubulina celular subyacente a su toxicidad celular. Por lo tanto, parece que el selenato y selenita inducen apoptosís a través de diferentes mecanismos, como es evidenciado por sus efectos en PARP y -tubulina, todos los datos muestran una clara diferenciación en el efecto de varios compuestos de selenio en la trayectoria de Akt.

EJEMPLO 4 Se sembraron 5 x 104 células LNCaP células sensibles a andrógeno de cáncer de próstata humana en placas de 6 cavidades, y 8 horas después se trataron con 50µM de selenato de sodio o no (control). Las células se cosecharon a 72 horas después de la adición de los compuestos y se determinaron las cuentas de célula de células viables según determinado por tinción de Azul Trypan. Como se muestra en la Figura 14, el selenato sinergiza con ablación de andrógeno para reducir la proliferación de célula LNCaP paterna después de 72 horas de tratamiento.

EJEMPLO 5 Se sembraron 5 x 104 células CSS LNCaP independientes de andrógeno de cáncer de próstata humana en una placa de 6 cavidades y 8 horas después se trataron ya sea con 50 µM de selenato o no (control). Las células se cosecharon a 72 horas después de la adición del selenato de sodio y se determinaron las cuentas de célula de células viables según determinado por tinción de Azul Trypan. Como se muestra en la Figura 15, el selenato sinergíza con ablación de andrógeno para reducir la proliferación de célula CSS LNCaP después de 72 horas de tratamiento. Las células independientes de andrógeno aún son más sensibles al tratamiento de selenato que las células LNCaP células paternales.

EJEMPLO 6 Se sembraron 1 x105 células NS LNCaP sensibles a andrógeno de cáncer de próstata humana en una placa de 6 cavidades y 8 horas después se trataron ya sea con 5 µM de selenato de sodio o 10µM LY294002. Las células se cosecharon a los periodos indicados después de la adición del selenato de sodio o Ly294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según determinado mediante tinción de Azul Trypan. Como se muestra en la Figura 16, el selenato solamente a 5 µM reduce marcadamente (p<0.95) la proliferación de célula NS LNCaP sensible andrógeno después de 9 días de tratamiento.

EJEMPLO 7 Se sembraron 1 x 105 células NS LNCaP sensibles a andrógeno de cáncer de próstata humana en una placa de 6 cavidades y 8 horas después se trataron ya sea con 5 µM de selenato de sodio o 10 µM LY294002. Las células se cosecharon a los periodos indicados después de la adición de los compuestos y se determinaron las cuentas de células viables según determinado por tinción de Azul Trypan. Como se muestra en la Figura 17 el selenato solo a 5 µM sinergiza con ablación de andrógeno para reducir marcadamente (p<0.95) la proliferación de célula NS LNCaP sensible a andrógeno después de 9 días de tratamiento.

EJEMPLO 8 Se sembraron 1 x 105 células CSS LNCaP independientes de andrógeno de cáncer de próstata humana en una placa de 6 cavidades y 8 horas después se trataron ya sea con 5 µM selenato de sodio o 10µM LY294002. Las células se cosecharon a los periodos indicados después de la adición del seienato de sodio o LY294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según determinado por tinción de Azul Trypan. Como se muestra en la Figura 18, el selenato solamente a 5 µM marcadamente reduce (p<0.95) la proliferación de célula CSS LNCaP independiente de andrógeno después de 9 días de tratamiento, aún en presencia de testosterona.

EJEMPLO 9 Se sembraron 1 x 105 células CSS LNCaP independientes de andrógeno de cáncer de próstata humana en una placa de 6 cavidades y 8 horas después se trataron ya sea con 5 µM de selenato de sodio o con 10 µM LY294002. Las células se cosecharon a los periodos indicados después de la adición del selenato de sodio o LY294002 y se determinaron ias cuentas de célula de células viables según determinado por tinción de Azul Trypan. Como se muestra en Figura 19, el selenato solo a 5 µM sinergiza con ablación de andrógeno para reducir marcadamente (p<0.95) la proliferación de célula CSS LNCaP sensible a andrógeno después de 9 días de tratamiento.

EJEMPLO 10 Se sembraron 1 x 1 O5 células Q293 epiteliales de riñon humano en una placa de 6 cavidades y 8 horas después se trataron ya sea con 5 µM de selenato de sodio o 10 µM LY294002. Las células se cosecharon a los periodos indicados después de la adición del selenato de sodio o LY294002 y se determinaron las cuentas de célula de células viables según determinado por tinción de Azul Trypan. Como se muestra en la Figura 20, el selenato a 5 µM no afecta significativamente la proliferación de célula Q293 mientras que el inhibidor PI3K, LY294002 significativamente afecta la proliferación (p<0.95) después de 9 días de tratamiento. El efecto inhibidor de selenatos por lo tanto, es específico de célula.

EJEMPLO 11 Se sembraron 1 x 1 O5 células 0293 epiteliales de riñon humano en una placa de 6 cavidades y 8 horas después se trataron ya sea con 5 µM de selenato de sodio o 10µM LY294002. Las células se cosecharon a los periodos indicados después de la adición dei selenato de sodio o LY294002 y se determinaron cuentas de células de células viables según determinado por tinción de Azul Trypan. Como se muestra en la Figura 21, selenato a 5 µM no afecta significativamente la proliferación de células Q293 aún cuando se combinó con aleación de andrógeno (desarrollado en un medio CSS) mientras que el inhibidor PI3K, LY294002 significativamente efectúo la proliferación (p<0.95) después de 9 días de tratamiento. El efecto inhibidor de selenatos por lo tanto es específico de célula.

Materiales y Métodos para los Ejemplos 4 a 11 Cultivo de Célula La línea de célula LNCaP sensible a andrógeno paternal se obtuvo de Colección de Cultivo de Tipo Americano (Manassas, Virginia, USA) y se cultivó de manera rutinaria en RPMI 1641 (Invitrogen) suplementado son suero de bovino fetal al 10% y una mezcla antibiótica/antimicótica al 1% (Invitrogen). Las células se mantuvieron a 37°C en 5% C02. Para seleccionar células LNCaP independientes de andrógeno, se cultivaron LNCaPs en RPMI 1641 (Invitrogen) en suero separado de carbón al 5% (CSS) (Invitrogen) el cual removió todas las huellas detectables de testosterona, durante 6-8 semanas y las líneas de célula LNCaP obtenidas que ahora fueron capaces de proliferar libremente en ausencia de testosterona. Estas células se denominan como CSS LNCaPs. Las células Q293 son una línea de célula epitelial de riñon humano cultivadas de manera rutinaria en un medio de DMEM (Invitrogen) en suero de bovino fetal al 5% y una mezcla antibiótica, antimicótica al 1% (Invitrogen). El selenato de sodio se hizo en soluciones de abastecimiento de 10 mM en agua destilada y un filtro esterilizado antes de la dilución en los medios para experimentos in vitro. El inhibidor PI3K, LY294002 se disolvió en DMSO a una solución de abastecimiento de 50mM y se diluyó en el medio de cultivo de célula para experimentos in vitro.

Curva de Crecimiento de Célula De entre 5x104 (Figura 1-2) y 1x105 células LNCaP, CSS LNCaP o Q293 se dejaron unir durante la noche. Después de algunas horas, el medio se cambió para incluir selenato de sodio o LY294002 en presencia de suero ya sea normal o suero separado de carbón (CSS) como se indicó y se dejo desarrollar hasta los puntos de tiempo especificados. Los sobrenadantes y las células después se cosecharon, se combinaron y las células viables se determinaron mediante el ensayo de exclusión de Azul Trypan. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Análisis Estadístico Los datos se presentan como ±SE medio a menos que se indique otra cosa. Las diferencias entre los tratamientos y el grupo de control se analizaron utilizando la prueba t en par con una importancia asumida a p < 0.05. Los asteriscos representan valores significativamente diferentes del valor de control correspondiente. Se realizó un análisis estadístico utilizando el software SPSS 9.05 para Windows (SPSS, Chicago, Illinois). La descripción de cada patente, solicitud de patente, y publicación citadas aquí se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

La cita de cualquier referencia en la presente no debe ser construida como una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" en la presente solicitud. A través de la especificación, el objeto ha sido describir las modalidades preferidas de la invención sin limitar la invención a ninguna modalidad o grupo de características específicas. Aquellos expertos en la técnica, por lo tanto, apreciaran que, en vista de la descripción, se pueden hacer varios cambios y modificaciones en las modalidades particulares ilustradas sin apartarse del alcance de la presente invención. Todas estas modificaciones y cambios pretenden quedar incluidos dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (43)

REIVINDICACIONES

1. Un método para inhibir el crecimiento de una célula tumoral, en donde se activa la trayectoria de señalización Akt, el método comprende exponer la célula tumoral a una cantidad inhibidora de la activación de señalización Akt de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula tumoral es una en donde Akt es sobre-activa.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula tumoral es una célula tumoral de próstata.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el crecimiento de la célula tumoral es independiente de andrógeno o quimio-resistente.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde ía cantidad inhibidora de activación de trayectoria de señalización Akt de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable es de aproximadamente 0.015 mg/kg a aproximadamente 20.0 mg/kg.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además exponer la célula tumoral a un agente citostático o agente citotóxico.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el agente cltostático es un agente de estabilización de microtúbulo.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el agente de estabilización de microtúbulo es paclitaxel.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además exponer las células tumorales a radioterapia, opcionalmente junto con un agente de radiosensibilización.

10. Un método para tratar un cáncer, en donde se activa la trayectoria de señalización Akt, el método comprende administrar a un sujeto con la necesidad de dicho tratamiento, una cantidad inhibidora de la activación de trayectoria de señalización Akt de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el cáncer es uno en donde Akt es sobre-activa.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el cáncer es cáncer de próstata.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el cáncer es un cáncer de próstata independiente de andrógeno o un cáncer de próstata quicio-resistente.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la cantidad inhibidora de activación de trayectoria de señalización Akt de selenato es una cantidad supra-nutricional.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la cantidad inhibidora de la activación de trayectoría de señalización Akt de selenato es de aproximadamente 0.015 mg/kg a aproximadamente 20.0 mg/kg.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el selenato está en la forma de selenato de sodio.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además administrar un agente citostático o un agente citotóxico.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el agente citostático es un agente de estabilización de microtúbulo.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el agente de estabilización de microtúbulo es paclitaxel.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además la administración de radioterapia, opcionalmente en combinación con un agente de radiosensibilización.

21. Un método para tratar un cáncer dependiente de hormona en un sujeto, eí método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con terapia de ablación de hormona.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable es una cantidad supra-nutricional.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable es de aproximadamente 0.015 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el selenato está en la forma de selenato de sodio.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el cáncer dependiente de hormona se selecciona de un cáncer dependiente de andrógeno o un cáncer dependiente de estrógeno.

26. Un método de acuerdo con ia reivindicación 21, en donde el cáncer dependiente de hormona se selecciona de cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer uterino, cáncer endometrial, cáncer de tiroides o cáncer de pituitaria.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el cáncer dependiente de hormona es un cáncer de próstata dependiente de andrógeno.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende además la administración de un agente citostático o un agente citotóxico.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el agente citostático es un agente de estabilización de microtúbulo.

30. Un método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el agente de estabilización de microtúbulo es paciitaxel.

31. Un método de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende además la administración de radioterapia, opcionalmente junto con un agente de radiosensibilización.

32. Un método para tratar cáncer de próstata en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

33. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el cáncer de próstata es un cáncer de próstata independiente de andrógeno o un cáncer de próstata quimio-resistente.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad supra-nutricional.

35. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la cantidad terapéuticamente efectiva de selenato o su sai farmacéuticamente aceptable es de aproximadamente 0.015 mg/kg a aproximadamente 20.0 mg/kg.

36. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde el selenato está en la forma de selenato de sodio.

37. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende además administrar un agente citostático o un agente citotóxico.

38. Un método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde el agente citostático es un agente de estabilización de microtúbulo.

39. Un método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde el agente de estabilización de microtúbulo es paclitaxel.

40. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende además administrar radioterapia, opcionalmente en combinación con un agente de radiosensíbilízación.

41. El uso de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer, en donde se activa la trayectoria de señalización de Akt.

42. El uso de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer, en donde se activa la trayectoria de señalización Akt, en donde el cáncer es diferente á un cáncer seleccionado de cáncer de próstata PC-3, linfoma 3B6, linfoma BL41 y tumor mamario HTB123/DU 4475.

43. El uso de selenato o su sal farmacéuticamente aceptable en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer dependiente de hormona, el donde el medicamento se formula para la administración con terapia de ablación de hormona.