MX2007000265A - Compuestos utiles para inhibir chk1. - Google Patents

Compuestos utiles para inhibir chk1.

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MX2007000265A
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John Joseph Gaudino
Adam Wade Cook
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Abstract

Se describen compuestos de urea sustituidos utiles en el tratamiento de enfermedades y condiciones relacionadas con dano o lesiones al ADN en la replicacion de ADN. Tambien se describen metodos para elaborar los compuestos, y su uso como agentes terapeuticos, por ejemplo, para tratar cancer y otras enfermedades caracterizadas por defectos en la replicacion de ADN, segregacion cromosomica, o division celular.

Description

COMPUESTOS ÚTILES PARA INHIBIR CHKl CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos útiles para inhibir enzimas que mantienen y reparan la integridad del material genético. De manera más particular, la presente invención se refiere a una serie de compuestos de urea sustituidos con arilo y heteroarilo, métodos para elaborar los compuestos, y su uso como agentes terapéuticos, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer y otras enfermedades caracterizadas por defectos en la replicación de ácido desoxirribonucleico (ADN) , segregación cromosómica, o división celular.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una gran variedad de enfermedades, condiciones, y trastornos (de aquí en adelante "indicaciones") se caracterizan porque involucran células que proliferan de • manera aberrante. Tal como se utiliza en la presente invención, "células que proliferan de manera aberrante" (o "proliferación celular aberrante") significa proliferación celular que se desvía del curso normal, apropiado, o esperado. Por ejemplo, proliferación celular aberrante incluye proliferación inadecuada de células en las cuales el ADN u otros componentes celulares se han dañado o están defectuosos. Proliferación celular aberrante también incluye indicaciones ocasionadas por, mediadas por, o que dan como resultado niveles inadecuadamente elevados de división celular, niveles inadecuadamente bajos de muerte celular (por ejemplo, apoptosis), o ambos. Dichas indicaciones se pueden caracterizar, por ejemplo, mediante proliferaciones anormales individuales o múltiples locales de células, grupos de células o tejido o tejidos, e incluyen indicaciones cancerosas (benignas o malignas) y no cancerosas . Por definición, todos los cánceres (benignos y malignos) implican cierta forma de proliferación celular aberrante. Algunas indicaciones no cancerosas también implican proliferación celular aberrante. Los ejemplos de indicaciones no cancerosas que implican proliferación celular aberrante incluyen artritis reumatoide, psoriasis, vitíligo, granulomatosis de Wegener y lupus sistémico. Una estrategia para tratar indicaciones que implican células que proliferan de manera aberrante implica el uso de agentes que dañan al ADN. Estos agentes están diseñados para aniquilar las células que proliferan de manera aberrante alterando procesos celulares vitales tales como metabolismo de ADN, síntesis de ADN, transcripción de ADN, y formación del huso de microtúbulo. Estos también pueden funcionar, por ejemplo, introduciendo lesiones en el ADN que perturban la integridad estructural cromosómica. Los agentes que dañan al ADN se diseñan y administran en formas que intentan inducir el daño máximo y la muerte celular consecuente en células que proliferan de manera aberrante con un mínimo de daño a células sanas, normales. Hasta la fecha se ha desarrollado una gran variedad de agentes que dañan al ADN, incluyendo agentes quimioterapéuticos y radiación, y otros están en desarrollo. Por desgracia, la efectividad de los agentes que dañan al ADN para tratar condiciones que implican proliferación celular aberrante ha sido menos que lo deseado, particularmente en el tratamiento de cáncer. La selectividad de dichos agentes para las células que proliferan de manera aberrante con respecto a células sanas (algunas veces conocida como el índice terapéutico) con frecuencia es marginal. Asimismo, todas las células tienen mecanismos detectores y de reparación que pueden funcionar en propósitos cruzados para los agentes que dañan el ADN. Dichos mecanismos de detección, denominados puntos de comprobación del ciclo celular, ayudan a mantener el orden de las diversas etapas de duplicación celular y a asegurar que cada paso se ejecute con una alta fidelidad (Hartwell et al . , Science, 246:629-34 (1989); Weinert et al . , Genes Dev. , 8:652 (1994)). Cuando las células detectan daño al ADN, incluyendo daño inducido intencionalmente mediante agentes que dañan al ADN, ciertas rutas de señalización activan los puntos de comprobación del ciclo celular y el ciclo de replicación celular temporalmente cesa ("se detiene") . Esta detención permite a las células tiempo para reparar su ADN, con frecuencia hasta un grado suficiente para permitir que las células afectadas continúen viviendo y proliferen. En el caso de células que proliferan de manera aberrante, esta reparación es indeseada, debido a que ésta puede socavar los esfuerzos para inducir daño al ADN suficiente para aniquilar dichas células. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico denominado GEMZAR™ (gemcitabina, o 2', 2 ' difluoro-2'-desoxicitidina) daña al ADN incorporándose por sí mismo en el ADN durante la síntesis. Si se deja sin reparar, el ADN dañado por lo general se torna incapaz de sostener la vida. En muchas células elegidas como blanco, sin embargo, los puntos de comprobación del ciclo celular detectan el ADN elaborado de manera inapropiada (o dañado de alguna otra manera) . Los puntos de comprobación del ciclo celular activados disparan el descanso de ciclo celular durante un tiempo suficiente para permitir que se pueda reparar el ADN dañado. Esta es una manera en la cual se cree que las células que proliferan de manera aberrante resisten el efecto aniquilador de célula de los agentes que dañan el ADN tales como agentes quimioterapéuticos, radiación, y otras terapias . Otros agentes que dañan al ADN hacen que las células de tumor se detengan en la fase S. Se ha observado que las células de tumor resisten ciertos agentes quimioterapéuticos simplemente deteniéndose en la fase S mientras el agente quimioterapéutico está siendo administrado. Después, tan pronto como se retire el fármaco, se repara el daño al ADN, cesa la detención del ciclo celular, y las células avanzan a través del resto del ciclo celular (Shi et al . , Cáncer Res . 61:1065-72, 2001). Otros agentes terapéuticos ocasionan la suspensión del ciclo celular en otros puntos de comprobación, incluyendo Gl y G2. Por lo tanto, se espera que la inhibición de diversos puntos de comprobación de daño de ADN ayude a evitar que las células reparen terapéuticamente el daño al ADN inducido y sensibilicen las células elegidas como blanco a los agentes que dañan el ADN. A su vez, se espera que dicha sensibilización incremente el índice terapéutico de estas terapias . El ciclo celular es estructural y funcionalmente el mismo en su proceso básico y modo de regulación a través de todas las especies eucariotas. El ciclo celular mitótico (somático) consiste de cuatro fases: la fase Gl (espacio), la fase S (síntesis), la fase ,G2 (espacio), y la fase M (mitosis) . Las fases Gl, S, y G2 son llamadas colectivamente como la interfase del ciclo celular. Durante la fase Gl, las actividades biosintéticas de la célula avanzan a una velocidad elevada. La fase S comienza cuando inicia la síntesis de ADN, y termina cuando el contenido de ADN del núcleo de la célula se ha duplicado y se forman dos conjuntos idénticos de cromosomas. La célula entonces entra a la fase G2 la cual continua hasta que comienza la mitosis. En la mitosis, los cromosomas se aparean y se separan, se forman dos nuevos núcleos, y se presenta la citocinesis en la cual la célula se divide en dos células hijas cada una de las cuales recibe un núcleo que contiene uno de los dos conjuntos de cromosomas. La citocinesis termina la fase M y marca el comienzo de la interfase del siguiente ciclo celular. La secuencia en la cual los eventos del ciclo celular proceden está estrictamente regulada, de manera tal que el inicio de un evento de ciclo celular depende de la conclusión del evento del ciclo celular previo. Esto permite fidelidad en la duplicación y segregación del material genético de una generación de células somáticas a la siguiente. Se ha reportado que los puntos de comprobación del ciclo celular comprenden por lo menos tres clases distintas de polipéptidos, los cuales actúan en forma secuencial en respuesta a las señales del ciclo celular o defectos en los mecanismos cromosómicos (Carr, Science, 271:314-15, 1996). La primera clase es una familia de proteínas que detecta o percibe el daño al ADN o anormalidades en el ciclo celular. Estos detectores incluyen la proteína mutada de Ataxia-Telangiectasia (Atm) y la proteína relacionada Rad de Ataxia-Telangiectasia (Atr) . La segunda clase de polipéptidos amplifica y transmite la señal detectada por el detector y queda ejemplificada por Rad53 (Alen et al . , Genes Dev, 8:2416-88, 1994) y Chkl. Una tercera clase de polipéptidos incluye los efectores de ciclo celular, tales como p53, los cuales median una respuesta celular, por ejemplo, la detención de mitosis y apoptosis. Gran parte del entendimiento actual de la función de los puntos de comprobación del ciclo celular se ha obtenido a partir del estudio de líneas de célula derivadas de tumor. En muchos casos, las células de tumor han perdido puntos de comprobación de ciclo celular claves (Hartwell et al . , Science 266:1821-28, 1994). Se ha reportado que un paso clave en la evolución de las células hacia un estado neoplásico es la adquisición de mutaciones que inactivan las rutas de punto de comprobación del ciclo celular, tales como aquellas que involucran a p53 (Weinberg, Cell 81:323- 30, 1995; Levine, Cell 88:3234-31, 1997). La pérdida de estos puntos de comprobación de ciclo celular da como resultado la replicación de las células de tumor a pesar del daño al ADN. El tejido no canceroso, el cual tiene los puntos de comprobación de ciclo celular intactos, típicamente está aislado contra la perturbación temporal de una sola ruta de punto de comprobación. Sin embargo, las células de tumor tienen defectos en las rutas que controlan el avance del ciclo celular de modo tal que la perturbación de puntos de comprobación adicionales las hace particularmente sensibles a los agentes que dañan el ADN. Por ejemplo, las células de tumor que contienen p53 mutante son defectuosas tanto en el punto de comprobación de daño al ADN en Gl como en la capacidad para mantener el punto de comprobación del daño a ADN de G2 (Bunz et al . , Science, 282:1497-501, 1998). Se espera que los inhibidores de punto de comprobación que eligen como blanco el inicio del punto de comprobación de G2 o el punto de comprobación de la fase S disminuyan adicionalmente la capacidad de estas células de tumor para reparar el daño al ADN y, por lo tanto, son candidatos para incrementar el índice terapéutico tanto de radiación como de quimioterapia sistémica (Gesner, Abstract at SRl Conference: Protein Phosphorylation and Drug Discovery World Summit, marzo de 2003) .
En presencia de daño a ADN o de cualquier impedimento para la replicación del ADN, las proteínas de punto de comprobación Atm y Atr inician una ruta de transducción de señal que conduce a la detención del ciclo celular. Se ha demostrado que Atm desempeña una función en el punto de comprobación de daño al ADN en respuesta a radiación ionizante. Atr es estimulada por agentes que ocasionan rupturas en el ADN de doble cadena, rupturas en el ADN de cadena sencilla, y agentes que bloquean la radiación de ADN. Chkl es una proteína cinasa que se encuentra corriente abajo de Atm y/o Atr en la ruta de transducción de señal de punto de comprobación de daño al ADN (Sánchez et al . , Science, 277:1497-501, 1997; patente E.U.A. No. 6,218,109). En células de mamífero, Chkl se fosforila en respuesta a agentes que ocasionan daño al ADN incluyendo radiación ionizante, luz ultravioleta (UV) e hidroxiurea (Sánchez et al . , supra; Lui et al . , Genes Dev. , 14:1448-59, 2000) . Esta fosforilación, la cual activa a Chkl en células de mamífero, es dependiente de Atm (Chen et al . , Oncogene, 18:249-56, 1999) y Atr (Lui et al . , supra). Asimismo, se ha demostrado que Chkl fosforila tanto a weel (O'Conell et al . , EMBO J. , 16: 545-54, 1997) como a Pdsl (Sánchez et al . , Science, 286: 1166-11, 1999), productos génicos que se sabe son importantes en el control del ciclo celular.
Estos estudios demuestran que Chkl de mamífero juega un papel en el punto de comprobación de daño a ADN dependiente de Atm que conduce a la detención en fase S. Recientemente se ha esclarecido un papel para Chkl en las células de mamífero en fase S (Feijoo et al., J. Cell. Biol., 154:913-23, 2001; Zhao et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 55:14795-800, 2002; Xiao et al., J Biol Chem., 278(24) : 21767-773; Sorensen et al., Cáncer Cell, 3(3):241-58, 2003) que resalta el papel de Chkl en el monitoreo de la integridad de la síntesis de ADN. Chkl invoca una detención en fase S fosforilando a Cdc25A, la cual regula la actividad de ciclinaA/Cdk2 (Xiao et al., supra y Sorensen et al., supra). Chkl también invoca una detención en G2 fosforilando e inactivado Cdc25C, la fosfatasa de especificidad doble que normalmente desfosforila a ciclina-B/cdc2 (también conocida como Cdkl) a medida que la célula pasa de G2 hacia la mitosis (Fernery et al., Science, 277:1495-7 , 1997; Sánchez et al., supra; Matsuoka et al., Science, 282:1893-91 , 1998; y Blasina et al., Curr. Biol., 5:1-10, 1999). En ambos casos, la regulación de la actividad de Cdk induce una detención del ciclo celular para evitar que las células entren a la mitosis en presencia de daño al ADN o de ADN sin duplicar. Clases adicionales de inhibidores de punto de comprobación de ciclo celular funcionan en cualquiera de la fase Gl o G2/M. UCN-01, o ' 7-hidroxiestaurosporina, originalmente se aisló como un inhibidor de cinasa no específico que tiene su efecto primario sobre la proteína cinasa C, pero recientemente se ha descubierto que inhibe la actividad de Chkl y abroga el punto de comprobación de ciclo celular en G2 (Shi et al . , supra) . Por lo tanto, debido a que UCN-01 es un inhibidor de Chkl no selectivo, éste es tóxico para las células a dosis elevadas. A dosis bajas, éste inhibe de manera no específica muchas cinasas celulares y también inhibe el punto de comprobación en Gl (Tenzer et al . , Curr. Med. Chem . Anti-Cancer Agents, 3: 35-46, 2003) . UCN-01 se ha utilizado en conjunto con terapias contra cáncer, tales como radiación, el agente anti-cáncer camptotecina (Tenzer et al . , supra), y gemcitabina (Shi et al . , supra), con éxito limitado. Además, UCN-01 se ha utilizado para potenciar los efectos de la reparación de no apareamiento de ADN (MMR) inducida por temozolomida (TMZ) en células de glioblastoma (Hirose et al . , Cáncer Res . , 61:5843-49, 2001). En la clínica, UCN-01 es un agente quimioterapéutico no tan efectivo como se esperaba, posiblemente debido a una falla en el programa de tratamiento y a la falta de identificación de objetivos moleculares clave particulares (Grant et al . , Drug Resistance Updates, 5:15-26, 2003), Por lo tanto, Mack et al . reportan la potenciación dependiente del ciclo celular de cisplatina mediante UCN-01 en una línea de célula de carcinoma de pulmón de célula no pequeña en cultivo, pero no identifican con especificidad el punto o puntos de comprobación de ciclo celular claves elegidos como blanco por UCN-01. (Mack et al . , Cáncer Chemother. Pharmacol . , 51 (4) -.337-48, 2003) . Existen muchas otras estrategias para sensibilizar las células de tumor al tratamiento con agentes quimioterapéuticos que afectan el ciclo celular. Por ejemplo, la administración de 2-amino-purina abroga los mecanismos de punto de comprobación múltiples de ciclo celular, tales como la detención de Gl inducida por mimosina o la detención en fase S inducida por hidroxiurea, lo que permite que la célula pase a y a través de la mitosis (Andreassen et al . , Proc Na ti Acad Sci USA, 86: 2212-16, 1992). Cafeína, una metilxantina, también se ha utilizado para incrementar la citotoxicidad de los agentes que dañan al ADN, tales como cisplatina y radiación ionizante, mediando el avance a través del punto de comprobación de G2 y de esta manera inducir la muerte celular. (Bracey et al . , Clin . Cáncer Res . , 3:1371-81, 1997) . Sin embargo, la dosis de cafeína utilizada para lograr la abrogación del ciclo celular supera los niveles clínicamente aceptables y no es una opción terapéutica viable. De manera adicional, se han utilizado nucleótidos anti-sentido para la cinasa Chkl para incrementar la sensibilidad al inhibidor de topoisomerasa BNP1350 (Yin et al . , Biochem . Biophys . Res . Commun . , 255:435-44, 2002), pero demuestran problemas típicamente asociados con el tratamiento de anti-sentido y terapia de genes. Se han descrito inhibidores de Chkl, incluyendo compuestos de urea sustituida con arilo y heteroarilo descritos en la solicitud de patente E.U.A, No. 10/087,715 y las solicitudes de patente provisionales E.U.A. Nos. 60/583,080 y 60/602,968; compuestos de diarilurea descritos en la publicación de patente E.U.A. No. 2004/0014765, publicación de patente E.U.A. No. 2003/199511, publicación de patente E.Ü.A. No. 2004/0014765, y en el documento WO 03/101444; metilxantinas y compuestos relacionados descritos en Fan et al . , Cáncer Res . 55:1649-54, 1995; ureidotiofenos descritos en los documentos WO 03/029241 y WO 03/028731; N-pirrolopiridinil-carboxamidas descritos en el documento WO 03/028724; oligonucleótidos de Chkl anti-sentido descritos en el documento WO 01/57206 y en la patente E.U.A. No. 6,211,164; antagonistas de receptor de Chkl descritos en el documento WO 00/16781; derivados de carboxamida heteroaromáticos descritos en el documento WO 03/037886; aminotiofenos descritos en el documento wp 03/029242; (indazolil) bencimidazoles descritos en el documento WO 03/004488; benci idazol-quinolinonas descritos en la publicación de patente E.U.A. No. 2004/0092535 y en el documento WO 04/018419; heterociclil-hidroxi-imino-fluorenos descritos en el documento WO 02/16326; derivados de escitonemano, tales como escitonemina, descritos en la patente E.U.A. No. 6,495,586; heteroarilbenzamidas descritas en el documento WO 01/53274; indazoles descritos en el documento WO 01/53268; indolacarbazoles descritos en Tenzer et al . , supra; derivados de cromano descritos en el documento WO 02/070515; paulonas descritas en Schuitz et al . , J. Med. Chem . , Vol:2909-19, 1999; indenopirazoles descritos en el documento WO 99/17769; flavonas descritas en Sedlacek et al . , Int J. Oncol . , 5:1143-68, 1996; derivados peptídicos del bucle peptídico de serina treonina cinasas descritos en el documento WO 98/53050; oxindoles descritos en el documento WO 03/051838; diazepinoindolonas descritas en el documento WO 04/063198; pirimidinas descritas en el documento WO 04/048343; compuestos de urea descritos en el documento WO 04/014876; y pirrolo-carbazoles, benzofuroisoindoles, y azaciclopentafluorenos descritos en el documento WO 03/091255. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad en la técnica respecto a inhibidores de Chkl efectivos y selectivos. La presente invención enfrenta estas y otras necesidades.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a inhibidores de la cinasa de punto de comprobación Chkl , Los presentes inhibidores de Chkl son útiles para tratar indicaciones que implican proliferación celular aberrante, y como agentes quimio-sensibilizadores y radio-sensibilizadores en el tratamiento de indicaciones relacionadas con el daño o lesiones al ADN en la duplicación del ADN. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es proveer compuestos de la fórmula estructural (I) . Los compuestos son útiles en un método para inhibir Chkl que comprende un paso de administrar una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula estructural (I) a un individuo en necesidad del mismo. Los compuestos de la fórmula (I) tienen una fórmula estructural : en la cual X1 es nada, -0-, -S-, -CH2-, o -N(RX)-; X2 es -0-, -S-, o -N(Ra)-; Y es 0 ó S; o =Y representa dos átomos de hidrógeno unidos a un átomo común de carbono; W se selecciona a partir del grupo que consiste de heteroarilo, arilo, heterocicloalquilo, cicloalquilo, y alquilo de C?_6 sustituido con un grupo heteroarilo o arilo, en los cuales dicho grupo arilo de W está opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes representados por R2, dicho grupo heteroarilo de W está opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes representados por R5, y dichos grupos heterocicloalquilo y cicloalquilo de W están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes alquilo de C?_6; R1 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C?_6, alquenilo de C2_6, alquinilo de C2-6, y arilo; R2 se selecciona a partir del grupo que consiste de halógeno, alquilo de C?_6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2_6, 0CF3, N02, CN, NC, N(R3)2, OR3, C02R3, C(0)N(R3)2, C(0)R3, N(R1)COR3, N (R1) C (O) OR3, N (1^)0(0) -alquilen (Cx-g) -C (0) R3, N (R1) C (0) -alquilen (C?_6) -C (0) 0R3, N(Ra)C(0) -alquilen (C?_6)-OR3, N (R1) C (0) -alquilen (d-e) - NHC(0)0R3, NÍR^CÍO) -alquilen (C?_6) -S02NR3, alquilen (C?_6) -OR3, y SR3; R3 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, halógeno, alquilo de C?_6, alquenilo de C2-6, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, S02R4, alquilo de C?-6 sustituido con uno o más de halógeno, hidroxi, arilo, heteroarilo, heterocicloalquilo, N(R4)2, y S02R4, alquilen (C±-ß) -arilo, alquilen (Ci-ß) -heteroarilo, alquilen (C?_6) -heterocicloalquilo de C3_8, alquilen (C?_6) -S02-arilo, alquilen (Ci-ß) -N (R4) 2 opcionalmente sustituido, OCF3, alquilen (C?_6) -N (R4) 3+, heterocicloalquilo de C3_8, y CH (alquilen (C?-6) -N (R4) 2) 2, o dos grupos R3 se toman juntos para formar un anillo alifático de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; R4 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C?_6, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquilen (C?_6) -arilo, y S02-alquilo de C?_6, o dos grupos R4 se toman juntos para formar un anillo de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; R5 se selecciona a partir del grupo que consiste de alquilo de C?_6, alquinilo de C2_6, arilo, heterocicloalquilo, N(R3)2, OR3, halógeno, N3, CN, alquilen (C?_6) -arilo, alquilen (C?_6) -N (R3) 2, C(0)R3, C(0)OR3, C(0)N(R3)2, lR^CfOlR3, N (R1) C (O) OR3, y Alquilen (C?_3 R6 es -C=C-R7 o heteroarilo; R7 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C?-6, arilo, alquilen (C?_g) -arilo, heteroarilo, alquilen (C?-ß) -heteroarilo, alcoxi; R8, R9, y R10, de manera independiente, se seleccionan a partir del grupo que consiste de halógeno, alquilo de C?_6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2_6, alquinilo de C2_6, OCF3, CF3, N02, CN, NC, N(R3)2, OR3, C02R3, C(0)N(R3)2, C(0)R3, NÍR^COR3, N (R1) C (0) OR3, N (R8) C (0) OR3, N (R1) C (0) -alquilen (d_3) -C (0) R3, N (R1) C (0) -alquilen (C?_3) -C (0) OR3, N (R1) C (0) -alquilen (C?_3) -OR3, N (R1) C (0) -alquilen (C?_3) -NHC(0)0R3, N(R1)C(0) -alquilen (C!--3)-S02NR3, alquilen (C?_3) -OR3, y SR3; o una sal, o profármaco, o solvato de los mismos farmacéuticamente aceptables. Otro aspecto de la presente invención es proveer composiciones farmacéuticas que comprendan uno o más compuestos de la fórmula estructural (I) , y el uso de las composiciones en un tratamiento terapéutico de una indicación, en el cual la inhibición de Chkl, in vivo o ex vivo, provee un beneficio terapéutico o de interés en investigación o para diagnóstico. Incluso otro aspecto de la presente invención es proveer un método para sensibilizar células en un individuo sometido a tratamiento quimioterapéutico o radio-terapéutico para una indicación que comprende administración de un compuesto de la fórmula estructural (I) en combinación con un agente quimioterapéutico, un agente radioterapéutico, o ambos, al individuo. Una indicación no limitativa tratada mediante este método es un cáncer. Otro aspecto de la presente invención es proveer un método para inhibir o evitar la proliferación celular aberrante. En una modalidad, un método comprende poner en contacto una población de células que comprende células que proliferan de manera aberrante con por lo menos un activador de Chkl en una cantidad y durante un tiempo suficiente para sincronizar sustancialmente la detención del ciclo celular entre las células que proliferan de manera aberrante. Después de lograr la sincronización sustancial de la detención del ciclo celular en la población de células, la población de células se pone en contacto con por lo menos un inhibidor de Chkl en una cantidad durante un tiempo lo suficiente para abrogar sustancialmente la detención del ciclo celular. Otro aspecto de la presente invención es proveer un artículo de fabricación para uso farmacéutico en humanos que comprende : (a) una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula estructural (I) ; (b) un inserto de material de empaque que informa que la composición es útil en el tratamiento de indicaciones que implican proliferación celular aberrante; y, de manera opcional, (c) un contenedor. Otro aspecto de la presente invención es proveer: (a) una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula estructural (I) ; (b) un inserto de material de empaque que informa que la composición es útil como un quimio-sensibilizador o radio-sensibilizador en un tratamiento de una indicación relacionada con lesiones al ADN o replicación de ADN; y, de manera opcional, (c) un contenedor. Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los compuestos de la presente invención tienen una fórmula estructural (I) : en la cual X1 es nada, -O- , -S- , -CH2- , o -N R1) -; X2 es -O-, -S-, o -N(RX)-; Y es O ó S; o =Y representa dos átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono común; W se selecciona a partir del grupo que consiste de heteroarilo, arilo, heterocicloalquilo, cicloalquilo, y alquilo de Ci-e sustituido con un grupo heteroarilo o arilo, en los cuales dicho grupo arilo' de W está opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes representados por R2, dicho grupo heteroarilo de W está opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes representados por R5, y dichos grupos heterocicloalquilo y cicloalquilo de W están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes alquilo de C?-6; R1 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C-6, alquenilo de C2-6, alquinilo de C2-6, y arilo; R2 se selecciona a partir del grupo que consiste de halógeno, alquilo de C?_e opcionalmente sustituido, alquenilo de C2_6, OCF3, N02, CN, NC, N(R3)2, OR3, C02R3, C(0)N(R3)2, C(0)R3, N(RX)COR3, N (R1) C (O) OR3, N(Rx)C(0)-alquilen (Cx-s) -C (O) R3, N (R1) C (O) -alquilen (C?-6) -C (O) OR3, N (R1) C (O) -alquilen (C?_6) -OR3, N (R1) C (O) -alquilen (C?_6) - NHC(0)OR3, N(RX)C (O) -alquilen (C?_6)-S02NR3, alquilen (C?_6) -OR3, y SR3; R3 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, halógeno, alquilo de C?_6, alguenilo de C2_6, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, S02R4, alquilo de C?_6 sustituido con uno o más de halógeno, hidroxi, arilo, heteroarilo, heterocicloalquilo, N(R4)2, y S02R4, alquilen (C?_6) -arilo, alquilen (C?_6) -heteroarilo, alquilen (Ci-ß) -heterocicloalquilo de C3_8, alquilen (d_6) -S02-arilo, alquilen (C?_6) -N (R)2 opcionalmente sustituido, OCF3, alquilen (Ci-ß) -N (R4) 3+, heterocicloalquilo de C3_g, y CH (alquilen (Cx-e) -N (R4)2) 2, o dos grupos R3 se toman juntos para formar un anillo alifático de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; R4 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C?-e, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquilen (C?-6) -arilo, y S02-alquilo de C?_6, o dos grupos R4 se toman juntos para formar un anillo de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; R5 se selecciona a partir del grupo que consiste de alquilo de d_6, alquinilo de C2_6, arilo, heterocicloalquilo, N(R3)2, OR3, halógeno, N3, CN, alquilen (C?_6) -arilo, alquilen (d_6) -N (R3) 2, C(0)R3, C(0)OR3, C(0)N(R3)2, ÍR^CÍOJR3, N (R1) C (O) OR3, y Alquilen R6 es -C=C-R7 o heteroarilo; R7 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C?_6, arilo, alquilen (C?_6) -arilo, heteroarilo, alquilen (C?-6) -heteroarilo, alcoxi; R8, R9, y R10, de manera independiente, se seleccionan a partir del grupo que consiste de halógeno, alquilo de C?_6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2_6, alquinilo de C2_6, OCF3, CF3, N02, CN, NC, N(R3)2, OR3, C02R3, C(0)N(R3)2, C(0)R3, N(RX)C0R3, N (R1) C (0) OR3, N (R8) C (0) OR3, N(R1)C(0) -alquilen (d-3) -C (0) R3, N (R1) C (0) -alquilen (d_3) -C (0) 0R3, N (R1) C (0) -alquilen (C?_3) -0R3, N (R1) C (0) -alquilen (C?_3) -NHC(0)0R3, N (R1)C(0) -alquilen (d-3)~S02NR3, alquilen (C?_3) -OR3, y SR3; y una sal, o profármaco, o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos preferidos de la presente invención son aquellos en los cuales X1 y X2 son -N(H)-; Y es 0 ó S; y W es heteroarilo opcionalmente sustituido. En una modalidad, W es heteroarilo que contiene por lo menos dos heteroátomos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de N, 0, y S, dicho anillo heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes que se seleccionan a partir del grupo que consiste de alquilo de C?_6 opcionalmente sustituido, arilo, N(R3)2, 0R3, C(0)N(R3)2, C02R3, CN, y halógeno, en los cuales R3 es como se definió previamente. Otros compuestos preferidos de la fórmula estructural (I) son aquellos en los cuales W se selecciona a partir del grupo gue consiste de piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, y triazinilo, opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes que se seleccionan a partir del grupo que consiste de alquilo de d-6, arilo, N(R3)2, C(0)N(R3)2, C02R3, OR3, y halógeno. En algunas modalidades preferidas, W se selecciona a partir del grupo que consiste de y sustituidos opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes que se seleccionan a partir del grupo que consiste de alquilo de C?_6, alquinilo de C2_6, arilo, heteroarilo, CN, C02R3, N(R3)2, OR3, y halógeno. En modalidades más preferidas, W es En una modalidad más preferida, W es pirazinilo y X1 y X2 son cada uno N(H) . Incluso en otra modalidad preferida, R6 es heteroarilo que se selecciona a partir del grupo que consiste de y opcionalmente sustituidos con alquilen (C?-3) -N(R)2. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "alquilo" significa grupos hidrocarburo de cadena recta y ramificados que contienen el número indicado de átomos de carbono,- típicamente metilo, etilo, y grupos propilo y butilo de cadena recta y ramificada. A menos' que se indique de otra manera, el grupo hidrocarburo puede contener hasta 20 átomos de carbono. El término "alquilo" incluye "alquilo con estructura en puente", es decir un grupo hidrocarburo bicíclico o policíclico de Cs-Ciß, por ejemplo, norbornilo, adamantilo, biciclo [2.2.2] -octilo, biciclo [2 . 2 .1] -heptilo, biciclo [3.2.1] -octilo, o decahidronaftilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos, por ejemplo, con hidroxi (OH), halógeno, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, amino (N(R)2), y sulfonilo (S02R ) , en los cuales R3 es como se definió previamente. El término "cicloalquilo" significa un grupo hidrocarburo de C3-8 cíclico, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciciohexilo, o ciclopentilo. "Heterocicloalquilo" se define en forma similar a la de cicloalquilo, excepto que el anillo contiene uno a tres heteroátomos que se seleccionan de manera independiente a partir del grupo que consiste de oxígeno, nitrógeno, y azufre. Los grupos cicloalquilo y heterocicloalquilo pueden ser sistemas de anillo saturado o parcialmente insaturado sustituidos opcionalmente con, por ejemplo, uno a tres grupos, que se seleccionan de manera independiente a partir del grupo que consiste de alquilo de C?_4, alquilen (C?_3) -OH, C(0)NH2, NH2, oxo (=0), arilo, trifluoroetanoilo, y OH. Los grupos heterocicloalquilo opcionalmente también pueden estar sustituidos en N con alquilo de C?_e, hidroxi-alquilo de C?_6, alquilen (C?_3) -arilo, o alquilen (C?_3) heteroarilo. El término "alquenilo" se define en forma idéntica a la de "alquilo", excepto que el grupo contiene un doble enlace carbono-carbono. El término "alquilino" se define en forma idéntica a la de "alquilo", excepto que el grupo contiene un triple enlace carbono-carbono. El término "alquileno" significa un grupo alquilo que tiene un sustituyente. Por ejemplo, el término "alquilen (d-g) -C (O) OR" se refiere a un grupo alguilo que contiene uno a seis átomos de carbono sustituido con un grupo -C(0)OR. El grupo alquileno está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes previamente listados como un sustituyente opcional de alquilo. El término "halógeno" o "halo" significa flúor, bromo, cloro, y yodo. El término "arilo", solo o en combinación, significa un grupo aromático monocíclico o policíclico, de preferencia un grupo aromático monocíclico o bicíclico, por ejemplo, fenilo o naftilo. A menos que se indique de otra manera, un grupo arilo puede no estar sustituido o estar sustituido con uno o más, y en particular uno a cuatro grupos que se seleccionan de manera independiente a partir de, por ejemplo, halógeno, alquilo de d_6, alquenilo de C2-6, OCF3, N02, CN, NC, N(R3)2, OR3, C02R3, C(0)N(R3)2, C(0)R3, N(R1)COR3, N(Ra)C(0)OR3, N (R1) C (O) OR3, N (1^)0(0) -alquilen (d-3) -C (0) R3, N (R1) C (0) -alquilen (d-3) -C (0) 0R3, N (R1) C (0) -alquilen (C?_3) -0R3, N (R1) C (0) -alquilen (C1-3) -NHC(0)0R3, N(Rx)C(0) -alquilen (C?_3)-S02NR3, alquilen (d_3) -OR1, y SR3, en los cuales R1 y R3 son como se definieron previamente. Los grupos arilo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, clorofenilo, metilfenilo, metoxifenilo, trifluoro-metilfenilo, nitrofenilo, 2, 4-metoxiclorofenilo, y similares. Los términos "aril-alguilo de C?_3" y "heteroaril-alquilo de C?-3" significan un grupo arilo o heteroarilo que tiene un sustituyente alquilo de C?_3. El término "heteroarilo" significa un sistema de anillo monocíclico o bicíclico, que contiene uno o dos anillos aromáticos y que contiene por lo menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre en un anillo aromático. A menos que se indique de otra manera, un grupo heteroarilo puede estar no sustituido o estar sustituido con uno o más, y en particular uno a cuatro, sustituyentes que se seleccionan a partir de, por ejemplo, alquilo de C?-6, arilo, heteroarilo, CF3, CN, C(0)N(R3)2, C02R2, N(R3)2, OR3, y halógeno, en los cuales R3 es como se definió previamente. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, tienilo, furilo, piridilo, oxazolilo, quinolilo, isoquinolilo, indolilo, triazinilo, triazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, imidizolilo, benzotiazolilo, pirazinilo, pirimidinilo, tiazolilo, y tiadiazolilo. El término "hidro" es -H. El término "hidroxi" es -OH, El término "nitro" es -N02. El término "ciano" es -CN. El término "isociano" es -NC. El término "trifluorometoxi" es -OCF3. El término "azido" es -N3.
El término "anillo de 3 a 8 miembros" significa grupos carbocíclicos y heterocíclicos alifáticos o aromáticos, incluyendo, pero sin limitarse a, morfolinilo, piperidinilo, fenilo, tiofenilo, furilo, pirrolilo, imidazolilo, pirimidinilo, y piridinilo, opcionalmente sustituidos con uno o más, y en particular uno a tres, grupos ejemplificados anteriormente para grupos arilo. El contenido de átomos de carbono de las porciones que contienen hidrocarburo se indica mediante un subíndice que designa el número mínimo y máximo de átomos de carbono en la porción, por ejemplo, "alquilo de d-6" se refiere a un grupo alquilo que tiene de uno a seis átomos de carbono, inclusive. En las estructuras en la presente invención, para un enlace que carece de un sustituyente, el sustituyente es metilo, por ejemplo, Cuando se indica que no está unido un sustituyente a un átomo de carbono en un anillo, se entiende que el átomo de carbono contiene el número apropiado de átomos de hidrógeno. Además, cuando se indica que no está unido un sustituyente a un grupo carbonilo o a un átomo de nitrógeno, por ejemplo, se entiende que el sustituyente es hidrógeno, por ej emplo , O O 11 II R— C es R— C— H y R-N es R-NH2 .
La abreviatura "Me" es metilo. La abreviatura CO y C(0) es carbonilo (C=0) . La notación N(RX) (en la cual x representa un carácter alfanumérico o numérico, tal como, por ejemplo Ra, Rb, R3, R4 y similares) se utiliza para indicar dos grupos Rx unidos a un átomo común de nitrógeno. Cuando se utiliza en dicha anotación, el grupo Rx puede ser el mismo o diferente, y se seleccionan a partir del grupo como el definido por el grupo Rx. Los agentes para daño al ADN que activan los puntos de comprobación de ciclo celular son conocidos generalmente en la presente invención como "activadores de punto de comprobación". Los agentes para daño el ADN que activan el punto de comprobación designado "Chkl" (pronunciado "check-uno") son conocidos en la presente invención como "activadores de Chkl". De igual manera, los inhibidores de dichos puntos de comprobación son conocidos en la presente invención como "inhibidores de punto de comprobación" e "inhibidores de Chkl", respectivamente. Tal como se utiliza en la presente invención, los inhibidores de Chkl son compuestos que pueden abrogar por lo menos parcialmente la actividad de punto de comprobación del ciclo celular de la proteína Chkl. La abrogación del punto de comprobación de ciclo celular se logra cuando el mecanismo de punto de comprobación celular se supera lo suficiente para permitir que la célula pase desde la fase de ciclo celular en la cual ésta está detenida hacia la siguiente fase en el ciclo celular o para permitir que la célula pase directamente a muerte celular. La abrogación del punto de comprobación de ciclo celular permite que las células acarreen el daño o . imperfecciones a fases subsiguientes del ciclo celular, con lo cual se induce o se promueve la muerte celular. La muerte celular puede ocurrir mediante cualquier mecanismo asociado, incluyendo apoptosis y catástrofe mitótica. Los compuestos de la invención son inhibidores de Chkl. Activador de Chkl incluye cualquier agente conocido o que se descubra posteriormente que tenga la capacidad de activar la actividad de cinasa Chkl, y por lo tanto induzca la detención por lo menos parcial del ciclo celular. Los activadores de Chkl incluyen agentes que pueden detener el ciclo celular en cualquier fase del ciclo de la célula, cuya fase puede ser conocida en la presente invención como la "fase objetivo" para dicho activador. Las fases objetivo incluyen cualquiera de las fases del ciclo celular excepto mitosis, es decir, la fase Gl, fase S y fase G2. Los activadores de Chkl útiles en la invención incluyen agentes que dañan el ADN, tales como agentes quimioterapéuticos y/o radiación. Los activadores de Chkl por radiación incluyen, pero no se limitan a, radiación ionizante. Radiación ionizante incluye radiación electromagnética o en partículas que puede producir pares iónicos mediante interacción con la materia. La radiación ionizante incluye rayos X y rayos gamma, partículas alfa y beta, neutrones, y núcleos cargados. Radiación incluye luz ultravioleta, luz visible, radiación infrarroja, radiación de microondas, y mezclas de las mismas. Se pueden utilizar pruebas tales como aquellas descritas en el ejemplo 9 para determinar si un agente es o no un activador de Chkl. "Inhibir la proliferación celular aberrante" significa retardar la velocidad a la cual proliferan las células que proliferan de manera aberrante o eliminar dicha proliferación completamente. Esta inhibición puede ser el resultado ya sea de una velocidad disminuida de replicación, una velocidad incrementada de muerte celular, o ambas. La muerte celular puede presentarse mediante cualquier mecanismo, incluyendo apoptosis y catástrofe mitótica. "Prevenir la proliferación celular aberrante" significa inhibir la proliferación celular aberrante antes de su aparición, o inhibir la recurrencia de la misma.
"Jn vivo" significa dentro de un individuo vivo, tal como dentro de un animal o humano. En este contexto, los agentes se pueden utilizar terapéuticamente in vivo para retardar o eliminar la proliferación de células que se replican de manera aberrante. Los agentes también se pueden utilizar in vivo como un método profiláctico para evitar la proliferación celular aberrante o la manifestación de síntomas asociados con la misma. "Ex vivo" significa fuera de un individuo vivo. Los ejemplos de poblaciones celulares ex vivo incluyen cultivos de células y muestras biológicas, tales como muestras de fluido o tejido provenientes de humanos o animales. Dichas muestras se pueden obtener utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de muestras fluidas biológicas incluyen sangre, fluido cerebro-espinal, orina, y saliva. Los ejemplos de muestras de tejido incluyen tumores y biopsias de los mismos. En este contexto, los compuestos de la presente invención pueden estar en numerosas aplicaciones, tanto terapéuticas como experimentales. "Radio-sensibilizador" significa un compuesto administrado a un humano u otro animal en una cantidad terapéuticamente efectiva para incrementar la sensibilidad de las células hacia la radiación electromagnética y/o para promover el tratamiento de enfermedades que pueden ser tratadas con radiación electromagnética. "Radiación" incluye, pero no se limita a, radiación que tiene la longitud de onda de 10~20 hasta 100 metros . El término "contenedor" significa cualquier receptáculo y envoltorio para el mismo apropiado para guardar, embarcar, dispensar, y/o manejar un producto f rmacéutico . El término "inserto de material de empaque" significa información que acompaña al producto que provee una descripción de la manera en la que se administra el producto, junto con los datos de seguridad y eficacia requeridos para permitir que el médico, farmacéutico, y paciente tomen una decisión informada con respecto al uso del producto. El inserto del material de empaque generalmente se considera como el "marbete" para un producto farmacéutico. La presente invención incluye todos los posibles estereoisómeros e isómeros geométricos de los compuestos de la fórmula estructural (I) . La presente invención incluye no solamente compuestos racémicos, sino también isómeros ópticamente activos . Cuando un compuesto de la fórmula estructural (I) se desea como un enantiómero individual, éste se puede obtener ya sea mediante resolución del producto final o mediante síntesis estereoespecífica a partir de cualquiera de un material de partida isoméricamente puro o a través del uso de un reactivo auxiliar quiral, por ejemplo, véase Ma et al . , Tetrahedron : Asymmetry, 8 (6) , páginas 883-88, 1997. La resolución del producto final, de un intermediario, o de un material de partida se puede lograr utilizando cualquier método apropiado conocido en la técnica. De manera adicional, en situaciones en las cuales son posibles tautómeros de los compuestos de la fórmula estructural (I) , la presente invención pretende incluir todas las formas tautoméricas de los compuestos. Como se demuestra posteriormente en la presente invención, e.stereoisómeros específicos pueden presentar una capacidad excepcional para inhibir Chkl en combinación con tratamientos quimioterapéuticos o radio-terapéuticos. Como el compuesto, también se pueden utilizar profármacos de compuestos de la fórmula estructural (I) en un método de la presente invención. Esta bien establecido que una estrategia con profármaco, en la cual un compuesto se convierte en derivado a una forma apropiada para formulación y/o administración, después es liberado como un fármaco in vivo, se ha utilizado exitosamente para alterar transitoriamente (por ejemplo, bio-reversibilidad) las propiedades físico-químicas del compuesto (véase, H. Bundgaard, Ed. , "Design of Prodrugs", Elsevier, Amsterdam, 1985; Silverman, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Academic Press, San Diego, capítulo 8, 1992; Hillgren et al . , Med. Res . Rev. , 15, 83, 1995). Los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales . Los grupos funcionales, si se desea o si fuera necesario, se pueden modificar para proveer un profármaco. Los profármacos apropiados incluyen, por ejemplo, derivados de ácido, tales como amidas y esteres. Los expertos en la técnica también apreciarán que se pueden utilizar N-óxidos como profármacos . Los compuestos de la invención pueden existir como sales. En los métodos de la invención por lo general se prefieren sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a formas salinas o z iteriónicas de los compuestos de la fórmula estructural (I) . Las sales de los compuestos de la fórmula (I) se pueden preparar durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos o por separado haciendo reaccionar el compuesto con un ácido que tenga un catión apropiado. Los cationes farmacéuticamente aceptables apropiados incluyen cationes de metal alcalino (por ejemplo, sodio o potasio) y de metal alcalinotérreo (por ejemplo, calcio o magnesio) . Además, las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la fórmula estructural (I) que contienen un centro básico son sales acidas de adición que se forman con ácidos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de ácidos que se pueden utilizar para formar sales farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, y fosfórico, y ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, maleico, succínico, malónico y cítrico. Los ejemplos no limitativos de sales de los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, sales clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, bisulfato, 2-hidroxietan-sulfonato, fosfato, bifosfato, acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato, alcanforato, alcanfor-sulfonato, citrato, digluconato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, formiato, succinato, malonato, fumarato, maleato, metansulfonato, mesitilensulfonato, naftilen-sulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, tricloroacetato, trifluoroacetato, glutamato, bicarbonato, undecanoato, lactato, citrato, tartrato, gluconato, bencensulfonato, y p-toluensulfonato. Además, los grupos amino disponibles presentes en los compuestos de la invención se pueden cuaternizar con cloruros, bromuros, y yoduros de metilo, etilo, propilo, y butilo; sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo, y diamilo; cloruros, bromuros, y yoduros de decilo, laurilo, miristilo, y estearilo; y bromuros de bencilo y fenetilo. En vista de lo anterior, cualquier referencia a compuestos de la presente invención que aparezcan en la presente invención pretende incluir los compuestos de la fórmula estructural (I) así como las sales, solvatos, o profármacos de los mismos farmacéuticamente aceptables. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar terapéuticamente como el compuesto químico puro, pero es más útil administrar los compuestos como una composición o formulación farmacéutica. Por lo tanto, la presente invención provee una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula (I) junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo. También se provee un procedimiento para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar un compuesto de la fórmula (I) con un diluyente o vehículo para el mismo farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, la presente invención también provee formulaciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la fórmula estructural (I) , o una sal, profármaco, o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, de manera opcional, otros ingredientes terapéuticos y/o profilácticos . Los vehículos son "aceptables" en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de los mismos. Dichos excipientes se pueden encontrar por ejemplo, en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 17a Ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA (1985). Los compuestos de la invención presentan potencia adecuada contra Chkl. La potencia típicamente se expresa como la concentración de un compuesto requerida para lograr un cierto resultado. Mientras mayor sea la potencia, menor será la cantidad de compuesto requerida para efectuar su función pretendida. La potencia in vi tro típicamente se expresa en términos de valores de CI50 y se mide utilizando una prueba de dosis-respuesta. Los valores de CI50 se pueden medir poniendo en contacto un sistema de prueba sensible con un compuesto de interés a través de un intervalo de concentraciones, incluyendo concentraciones a las cuales no se observa o se observa un efecto mínimo, a través de concentraciones más altas en las cuales se observa un efecto parcial, hasta concentraciones de saturación en las cuales se observa un efecto máximo. Teóricamente, dichas pruebas del efecto dosis-respuesta de los compuestos inhibidores se pueden describir como una curva sigmoidal que expresa un grado de inhibición como una función de la concentración cuando se gráfica en una escala logarítmica. La curva también teóricamente pasa a través de un punto en el cual la concentración es suficiente para reducir la actividad de la enzima de punto de comprobación hasta un nivel que sea 50% de aquel de la diferencia entre la actividad enzimática mínima y máxima observada en la prueba. Esta concentración se define como la concentración inhibidora al 50% de inhibición o valor Clso- Los valores de CI50 se pueden determinar utilizando técnicas de ensayo bioquímicas convencionales (sin células) o técnicas de ensayo basadas en célula bien conocidas por los expertos en el campo. Un ejemplo de dicha prueba se provee más adelante en el ejemplo 1. De preferencia, los valores de CI50 se obtienen efectuando la prueba relevante por lo menos dos veces, expresando el valor de CI50 como el promedio (media aritmética, o "media") de los valores individuales obtenidos. De manera más preferida, la prueba se repite de 3 a 10 (o más) veces, expresando el valor de CI50 como la media de los valores obtenidos. Más preferido, la prueba se efectúa un número de veces suficiente para generar un valor de CI50 de la ' media estadísticamente confiable, utilizando métodos estadísticos conocidos por los expertos en la técnica. Los compuestos de la invención, cuando se analizan como se describe en el ejemplo 1 más adelante, presentan valores de CI50 menores de aproximadamente 5 µM, y hacia abajo hasta aproximadamente 0.1 nM. En algunas modalidades, los compuestos demuestran un valor de CI50 de aproximadamente 550 nM o menor, en otras modalidades menor de aproximadamente 250 nM, en otras menor de aproximadamente 200 nM, en otras menor de 150 nM aproximadamente, en otras menor de aproximadamente 100 nM, en otras menor de aproximadamente 75 nM, en otras menor de aproximadamente 50 nM, y en otras menor de aproximadamente 25 nM. En la modalidad preferida, los compuestos de la invención presentan selectividad para inhibir Chkl con respecto a otras proteínas cinasas. La selectividad puede ser conveniente para reducir los efectos secundarios adversos y/o incrementar el índice terapéutico. "Selectividad" se expresa en la presente invención como "selectividad en número de veces". En general, la selectividad en número de veces, tal como se utiliza en la presente invención, es la CI50 de un compuesto de prueba para una enzima de comparación dividida entre la CI50 de una enzima contra la que se compara (comparadora) . En particular, la selectividad en número de veces para un inhibidor de Chkl, como se utiliza en la presente invención, es la CI50 de un inhibidor de Chkl (un compuesto de prueba) para Chkl (la enzima de comparación) dividida entre la CI50 para una enzima comparadora. Las enzimas comparadoras contra las cuales se pueden medir los compuestos de la invención incluyen por lo menos las siguientes proteína cinasas: Cdc2, Chk2, CTAK, EphAl, EphA2, Erkl, FGFRl, FGFR4, IR, JNK1, c-Kit, p38alfa, p38beta, p38delta, Ros, Rse, Rsk2, TrkA, TrkB, proteína cinasa A, proteína cinasa C, pp60v-src, proteína cinasa B/Akt-1, p38Mapk, p70S6K, cinasa II dependiente de calmodulina de calcio, y tirosina cinasa abl. Las pruebas para determinar los valores de CI50 para un compuesto de prueba contra una enzima comparadora se describen en el ejemplo 2 y son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los compuestos preferidos de la invención presentan selectividad de por lo menos 20 veces aproximadamente con respecto a las proteína cinasas evaluadas antes mencionadas. Los compuestos y composiciones farmacéuticas apropiadas para ser utilizadas en la presente invención incluyen aquellas en las cuales el ingrediente activo se administra en una cantidad efectiva para lograr su propósito pretendido. De manera más específica, una "cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad suficiente para tratar a un individuo que padece de una indicación, o para aliviar los síntomas existentes de la indicación. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad del experto en la técnica, especialmente en vista de la descripción detallada provista en la presente invención. Además del inhibidor de Chkl, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para que incluyan citocinas, linfocinas, factores de crecimiento, otros factores hematopoyéticos, o mezclas de los mismos, para reducir los efectos secundarios adversos que puedan surgir a partir de, o que estén asociados con, la administración de la composición farmacéutica sola. De manera alternativa, dichos agentes biológicamente activos se pueden incluir en una composición farmacéutica de la invención para promover un efecto terapéutico deseado. Las composiciones farmacéuticas coadyuvantes biológicamente activas útiles en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a, M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoyetina, factor de célula madre, eritropoyetina, angiopoyetinas, incluyendo Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, y/o el polipéptido tipo angiopoyetina de humano, factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) , angiogenina, proteína 1 morfogénica de tejido óseo (BMP-1) , BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, receptor IA de BMP, receptor IB de BMP, factor neurotrófico derivado de cerebro, factor neurotrófico ciliar, factor 1 quimiotáctico de neutrófilo inducido por citocina del receptor del factor neurotrófico ciliar, factor 2 quimiotáctico de neutrófilo inducido por citocina, factor de crecimiento de célula endotelial, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, atrayente de neutrófilo derivado del epitelio, factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) 4, FGF 5, FGF 6, FGF 7, FGF 8, FGF 8b, FGF 8c, FGF 9, FGF 10, FGF de carácter ácido, FGF de carácter básico, receptor 1 del factor neurotrófico derivado de línea de célula de la glía, receptor 2 de factor neurotrófico derivado de línea de célula de la glía, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento, proteína relacionada con el crecimiento, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocito, receptor del factor de crecimiento de hepatocito, factor I de crecimiento tipo insulina, receptor del factor de crecimiento tipo insulina, factor II de crecimiento tipo insulina, proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento de queratinocito, factor inhibidor de leucemia, receptor del factor inhibidor de leucemia, factor de crecimiento de nervio, receptor de factor de crecimiento de nervio, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor de crecimiento de placenta, factor 2 de crecimiento de placenta, factor de crecimiento de célula endotelial derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena del factor A del crecimiento derivado de plaquetas, factor AA de crecimiento derivado de plaquetas, factor AB de crecimiento derivado de plaquetas, cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor BB de crecimiento derivado de plaquetas, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante de crecimiento de pre-célula B, factor de célula madre, receptor del factor de célula madre, factor de crecimiento transformante (TGF), TGF, TGF 1, TGF 1.2, TGF 2, TGF 3, TGF 5, TGF 1 latente, TGF, proteína I de unión, proteína II de unión a TGF, proteína III de unión a TGF, receptor tipo 1 del factor de necrosis tumoral, receptor tipo II del factor de necrosis tumoral, receptor de activador de plasminógeno tipo urocinasa, factor de crecimiento del endotelio vascular, y proteínas quiméricas y fragmentos de las mismas biológicamente o inmunológicamente activas. Los compuestos de la fórmula estructural (I) también se pueden conjugar o ligar a porciones auxiliares que promuevan una propiedad benéfica del compuesto en un método de uso terapéutico. Dichos conjugados pueden incrementar el suministro de los compuestos a un sitio anatómico particular o región de interés (por ejemplo, un tumor) , permitir concentraciones terapéuticas sostenidas de los compuestos en las células objetivo, alterar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los compuestos, y/o mejorar el índice terapéutico o perfil de seguridad de los compuestos. Las porciones auxiliares apropiadas incluyen, por ejemplo, aminoácidos, oligopéptidos, o polipéptidos, por ejemplo, anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos manipulados genéticamente; y ligandos naturales o sintéticos para los receptores en las células o tejidos objetivo. Otros auxiliares apropiados incluyen porciones de ácido graso o lípido que promueven la biodistribución y/o absorción del compuesto por parte de las células objetivo (véase, por ejemplo, Bradley et al . , Clin . Cáncer Res . , 7:3229, 2001) . Las formulaciones de la presente invención se pueden administrar en una manera normal para el tratamiento de las enfermedades indicadas, tales como mediante administración por vía oral, parenteral, trans-mucosas (por ejemplo, sublingual o mediante administración en la cavidad oral) , tópica, transdérmica, rectal, o inhalación (por ejemplo, inhalación nasal o pulmonar profunda) . La administración por vía parenteral incluye, pero no se limita a modos de administración por vía intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal, e intra-articular. La administración por vía parenteral también puede lograrse utilizando una técnica de alta presión, tal como POWDERJECT™ (Po derject Pharmaceuticals PLC, Oxford, Inglaterra) . Para administración por vía oral y administración en la cavidad bucal, la composición puede estar en forma de tabletas o pastillas formuladas en una manera convencional. Por ejemplo, las tabletas y cápsulas para administración por vía oral pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, jarabe, goma acacia, gelatina, sorbitol, goma tragacanto, mucílago de almidón, o polivinilpirrolidona) , materiales de relleno (por ejemplo, lactosa, azúcar, celulosa micro-cristalina, almidón de maíz, fosfato de calcio, o sorbitol), lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol o sílice) , desintegrantes (por ejemplo, almidón de maíz o glicolato de almidón sódico) , o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio) . Las tabletas se pueden recubrir de conformidad con métodos bien" conocidos en la técnica. De manera alternativa, los compuestos de la presente invención se pueden incorporar en preparados líquidos orales tales como por ejemplo suspensiones acuosas U oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes, o elíxires. Asimismo, las formulaciones que contienen estos compuestos se pueden presentar como un producto seco que se reconstituye con agua u otro vehículo apropiado antes de usar. Dichos preparados líquidos pueden contener aditivos convencionales, por ejemplo agentes suspensores, tales como jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucosa/azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio, y grasas comestibles hidrogenadas; agentes emulsificantes, tales como lecitina, mono-oleato de sorbitán, o acacia; vehículos no acuosos (los cuales pueden incluir aceites comestibles) , tales como aceite de almendras dulces, aceite de coco fraccionado, esteres oleosos, propilenglicol, y alcohol etílico; y conservadores, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y ácido sórbico. Dichos preparados también se pueden formular como supositorios, por ejemplo, que contengan bases convencionales para supositorio, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Las composiciones para inhalación típicamente se pueden proveer en forma de una solución, suspensión, o emulsión que se puede administrar como un polvo seco o en forma de un aerosol utilizando un propelente convencional, tal como diclorodi-fluorometano o triclorofluorometano. Las formulaciones tópicas y transdérmicas comprenden vehículos acuosos o no acuosos convencionales, tales como gotas oftálmicas, cremas, ungüentos, lociones y pastas, o están en forma de un emplaste (plaster) , parche, o membrana medicada. De manera adicional, las composiciones de la presente invención se pueden formular para administración por vía parenteral mediante inyección o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden estar en forma de suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes suspensores, estabilizadores y/o dispersantes. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo apropiado (por ejemplo, agua libre de pirógenos, estéril) antes de usar. Una composición de la presente invención también se puede formular como un preparado para depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante implante (por ejemplo, en forma subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por consiguiente, los compuestos de la invención se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo, una emulsión en un aceite aceptable) , resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles (por ejemplo, una sal muy poco soluble) . Para uso veterinario, un compuesto de la fórmula (I) , o una . sal, profármaco, o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, se administra como una formulación apropiadamente aceptable de conformidad con la práctica veterinaria normal. El médico veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración que sea la más apropiada para un animal particular. Los animales que pueden ser tratados mediante los compuestos y métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a mascotas, ganado, animales de espectáculo, y especímenes de zoológico.
Métodos de síntesis Los compuestos de la presente invención se pueden preparar mediante los siguientes esquemas de síntesis. Los materiales de partida se pueden obtener a partir de fuentes comerciales o se pueden preparar utilizando métodos de la literatura bien establecidos conocidos por los expertos en la técnica. Los grupos X, R1, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 y R10 se definieron anteriormente a menos que se indique más adelante lo contrario.
ESQUEMA DE REACCIÓN 1 6 Como se ilustra en el esquema de reacción 1, los compuestos de la fórmula 4 se pueden preparar a partir de los compuestos de la fórmula 6 mediante tratamiento con una base, tal como DIEA, y difenil-fosforil-azida. Un solvente típico para esta reacción es THF, y la reacción se efectúa detrás de una campana de protección a temperatura ambiente a través de un período de una a doce horas.
ESQUEMA DE REACCIÓN 2 El esquema de reacción 2 muestra una síntesis alternativa de los compuestos de la fórmula 5. Los compuestos de la fórmula 3 se tratan con compuestos de la fórmula 7, los cuales se preparan de conformidad con el esquema de reacción 4. Un solvente no limitativo, útil es DMF, y la temperatura de reacción se mantiene entre temperatura ambiente y 60 °C durante una a doce horas aproximadamente .
ESQUEMA DE REACCIÓN 3 Como se demuestra en el esquema de reacción 3, los compuestos de la fórmula 7 se pueden preparar a partir de los compuestos de la fórmula 8 mediante tratamiento con un cloroformiato de arilo, tal como cloroformiato de fenilo o cloroformiato de p-nitrofenilo, en presencia de una base, tal como piridina. Los solventes no limitativos utilizados en esta reacción incluyen CH2C12 o piridina, a temperaturas de 0°C hasta temperatura ambiente.
ESQUEMA DE REACCIÓN 4 El esquema de reacción 4 muestra una estrategia para los compuestos de la fórmula 3. Los compuestos de la fórmula 1 se convierten en los compuestos de la fórmula 2 mediante tratamiento con ácidos aril-borónicos y una fuente de paladio (0) (por ejemplo, tetrakis-trifenilfosfina de paladio) en presencia de una solución acuosa básica, tal como Na2C03, K2C03, o K3P0 . Los ejemplos no limitativos de solventes utilizados en esta reacción incluyen THF, dioxano, o éter dimetílico de etilenglicol. La reacción típicamente se efectúa a temperaturas entre 0°C y 90°C durante 1 a 12 horas. Los compuestos de la fórmula 2 se convierten en los compuestos de la fórmula 3 en presencia de, por ejemplo, Pd/C, Pt/C o zinc. Los ejemplos de solventes utilizados en esta reacción incluyen, pero no se limitan a MeOH, EtOH, o HOAc. De manera alternativa, los compuestos de la fórmula 1 se pueden utilizar para introducir un arilo en los alquinos terminales, 11, utilizando un catalizador, tal como PdCl2(PPH3) o cualquier otra fuente de paladio (0). Las reacciones típicamente se efectúan a temperaturas que varían desde temperatura ambiente hasta 90°C, en presencia de una base, tal como trietilamina . Asimismo, los compuestos de la fórmula 1, en la cual X es un triflato, es decir, tf, se pueden obtener a partir de los compuestos de la fórmula 9. Los reactivos típicos incluyen anhídrido tríflico o N-feniltriflimida. La reacción típicamente se efectúa a temperaturas entre -10°C y temperatura ambiente, ün ejemplo no limitativo de un solvente es diclorometano. Los ejemplos no limitativos de base son TEA o di-isopropiletilamina.
ESQUEMA DE REACCIÓN 6 H 10 El esquema de reacción 6 ilustra una síntesis alternativa para los compuestos de la fórmula 5. Los compuestos de la fórmula 3 se pueden convertir en los compuestos de la fórmula 10 siguiendo los procedimientos descritos en el esquema de reacción 2. Los compuestos de la fórmula 10 se pueden convertir después en los compuestos de la fórmula 5 siguiendo los procedimientos descritos en el esquema de reacción 4. Los ejemplos no limitativos de compuestos de la fórmula estructural (I) se proveen más adelante, cuyas síntesis se efectúan de conformidad con los procedimientos generales indicados más adelante y en la publicación de solicitud de patente E.U.A. co-pendiente No. 2003/0069284, incorporada en la presente invención para referencia. Los compuestos adicionales de la invención se pueden preparar utilizando los esquemas de reacción generales anteriores, y las siguientes síntesis específicas, mediante una solución correcta de los materiales de partida. Las abreviaturas utilizadas en las síntesis descritas en la presente invención son: horas (h) , minutos (min) , atmósfera (atm) , desionizada (DI) , nitrógeno (N2) , agua (H20) , sulfato de magnesio (MgS04) , ácido clorhídrico (HCl) , sulfóxido de dimetilo (DMSO) , azodicarboxilato de di-isopropilo (DIAD), bis-trifenilfosfeno de dicloropaladio (PdCl2 (PPh3)2) , trietilamina (TEA), dióxido de carbono (C02) , cloruro de metileno (CH2C12) , cloroformo (CHC13) , metanol (MeOH) , hidróxido de amonio (NHOH) , cloruro de amonio (NH4C1) , cloroformo deuterado (CDCI3) , tetrahidrofurano (THF) , N-metilpirrolidona (NMP) , ácido acético (HOAc) , hidróxido de sodio (NaOH) , -acetato de etilo (EtOAc) , etanol (EtOH) , sulfóxido de dimetilo (DMSO) , éter dietílico (Et20) , ácido p-toluensulfónico (p-TsOH) , carbonato de sodio (Na2C03) , bicarbonato de sodio (NaHC03) , ácido nítrico (HN03) , cloruro de sodio (NaCl) , saturado (a) (satd) , cromatografía en capa fina (CCF) , carbonato de potasio (K2C03) , fosfato de potasio (K3P04) , paladio sobre carbón (Pd/C) , cloruro de potasio (KCl) , solución salina regulada con fosfatos (PBS), yoduro cuproso (C (1)1), sulfato de sodio (NaS04) , dimetilformamida (DMF), 1,8- diazabiciclo [5 . 4 . 0] undec-7-eno (DBU) , y N, N-diisopropiletilamina ( DIEA) .
Intermediario 1 Azida de 5-metil-pirazin- carbonilo A una suspensión agitada de ácido 5-metil-pirazin-2-carboxílico (25 g, 181 mmoles) en 540 ml de THF a temperatura ambiente bajo N2 se agrega DIEA (31.7 ml, 181 mmoles) lo que da como resultado una solución de color café. Después se agrega mediante goteo azida de difenilfosforilo (39.2 ml, 181 mmoles) como una solución en 50 ml de THF en el transcurso de 1 hora detrás de una campana de protección. La reacción se deja agitando durante la noche. Después la reacción se evapora con evaporador giratorio hasta un volumen pequeño a temperatura ambiente y se divide entre Et20 (1 litro) y H20 (1 litro) . La capa de H20 se extrae de nuevo con 2 x 250 ml de Et20, y las capas orgánicas combinadas se lavan 2 x 1 L con Na2C03 saturado. Las capas orgánicas se secan (MgS04) , se filtran, y se concentran hasta una masa sólida, la cual se tritura con Et20 para obtener el producto como un sólido de color amarillo (15 g, 50%) . Se puede aislar compuesto más puro tomando "x" g del producto crudo en 20x ml de Et20, y tratando con l-2x g de carbón para decoloración a temperatura ambiente durante unos cuantos minutos . Después de filtrar y concentrar, este material es homogéneo mediante CCF en EtOAc y de color blanco puro. La recuperación es típicamente de 65%.
Compuesto 1 l-(5-metil-pirazin-2-il)-3-(5-metil- 2-piridin-3 -iletinil-fenil)-urea Paso 1 ter-butil-dimetil- (4-metil-2-nitro-feniletinil) -silano A una solución agitada de l-bromo-4-metil-2-nitro-benceno (3.24 g, 15.0 mmoles), PdCl2(PPh3)2 (1.05 g, 1.5 mmoles), y Cu (1)1 (5.7 g, 30 mmoles) se agrega TEA (40 ml) seguido por TMS-acetileno (5.3 ml, 37.5 mmoles). Después de agitar a 60°C durante 12 horas, la reacción se filtra, se diluye con EtOAc (150 ml) y Na2C03 al 10% (150 ml) . La capa orgánica se lava con salmuera, se seca con MgS0 , se filtra, y se seca a presión reducida para obtener 4.0 g de un residuo de color negro amorfo.
Paso 2 l-etinil-4-metil-2-nitro-benceno A una solución agitada de ter-butil-dimetil- (4-metil-2-nitro-feniletinil) -silano (3.5 g, 15 mmoles) en MeOH (20 ml) se agrega NaOH (1.8 g, 45 mmoles, en 5 ml de H20) . Después de agitar durante 1 hora, la reacción se diluye con EtOAc (150 ml) y Na2C03 al 10% (150 ml) . Se separan las capas y la capa acuosa se extrae con EtOAc (1 por 75 ml) . Las capas orgánicas se combinan, se secan con MgS0 , se filtran, y se secan a presión reducida para obtener 1.40 g (58% en los dos pasos) de un sólido de color café.
Paso 3 3- (4-metil-2-nitro-feniletinil) -piridina A una solución agitada de 3-bromopiridina (608 mg, 3.85 mmoles), PdCl2(PPh3)2 (246 mg, 0.35 mmoles), y Cu (1)1 (733 mg, 3.85 mmoles) se agrega TEA (10 ml) seguido por l-etinil-4-metil-2-nitro-benceno (564 mg, 3.5 mmoles). Después de agitar a 60°C durante 4 horas, la reacción se filtra, y se diluye con EtOAc (150 ml) y Na2C03 al 10% (150 ml) . La capa orgánica se lava con salmuera, se seca con MgS04, se filtra, y se seca a presión reducida. El material se purificará utilizando un cartucho 40M de Biotage eluyendo con hexanos/EtOAc (7/3) para obtener un aceite de color café claro.
Paso 4 5-metil-2-piridin-3-iletinil-fenilamina A una solución de 3- (4-metil-2-nitro-feniletinil) -piridina (1 mmoles) en MeOH (1 ml) se agregan 0.5 ml de NHC1 saturado seguido por polvo de zinc (0.33 g, 5.0 mmoles) . La mezcla se agita durante 10 minutos, después se diluye con EtOAc (50 ml) y Na2C03 (50 ml de una solución acuosa al 10%) . La capa orgánica se seca con MgS0 , se filtra, y se concentra a presión reducida para obtener el material deseado como un aceite transparente.
Paso 5 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (5-metil-2-piridin-3-iletinil-fenil) -urea A una solución agitada de azida de 5-metil-pirazin-2-carbonilo (compuesto 7) (163 mg, 1.0 mmoles) en tolueno (4 ml) y previamente calentada a 90°C durante 15 minutos, se agrega 5-metil-2-piridin-3-iletinil-fenilamina (1 mmol) . La mezcla se enfría hasta 65°C y se agita durante 12 horas. La mezcla de reacción se enfría después hasta temperatura ambiente. Se agrega acetato de etilo a la capa orgánica, y se lava con salmuera, se seca con MgS04. Después de filtrar, y de evaporar a presión reducida, se aisla un aceite y se purifica mediante cromatografía en columna (gel de sílice) eluyendo con EtOAc/hexanos 1:4. 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 11.39 (br s, ÍH) , 8.79 (s, ÍH) , 8.61 (d, ÍH) , 8.25 (s, ÍH) , 8.19 (s, ÍH) , 8.15 (s, ÍH) , 7.79 (d, 1H) , 7.41 (m, 2H) , 7.31 (m, 1H) , 6.91 (d, ÍH) , 2.41 (s, 3H) , 2.37 (s, 3H) . LRMS (apci, positivo) m/e 344.4 (M+l).
Compuesto 2 l-(5-metil-pirazin-2-il)-3-(5-metil- 2-piridin-3-il-fenil)-urea Paso 1 3- (4-metil-2-nitro-fenil) -piridina Se diluyen 4-bromo-2-nitro-fenol (648 mg, 3.0 mmoles) y ácido 3-piridil-borónico (387 mg, 3.15 mmoles) con 5 ml de dioxano y se colocan bajo N2. Se diluye carbonato de potasio en 1 ml de H20 y se agrega a la mezcla de reacción. Se agrega tetrakis (trifenilfosfina) -paladio (173 mg, 0.15 mmoles), después la reacción se calienta hasta 70 °C y se agita durante la noche. Se deja que la reacción se enfría hasta temperatura ambiente, después se diluye con 30 ml de EtOAc y 30 ml de Na2C03 al 10%. La capa orgánica se lava con salmuera, se seca con MgS0 , se filtra, y se concentra a presión reducida. El material se purifica con un cartucho 40M de Biotage eluyendo con hexanos/EtOAc, 1/1 para obtener un sólido blanquecino.
Paso 2 5-metil-2-piridin-3-il-fenilamina Se prepara de conformidad con el compuesto 1, Paso 4 a partir de 3- (4-metil-2-nitro-fenil) -piridina.
Paso 3 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (5-metil-2-piridin-3-il-fenil) -urea Se prepara de conformidad con el compuesto 1, Paso 5 utilizando 5-metil-2-piridin-3-il-fenilamina y el compuesto 7. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 11.00 (br s, 1H) , 9.00 (s, ÍH) , 8.75 (s, ÍH) , 8.70 (d, ÍH) , 8.40 (s, 2H) , 7.75 (d, ÍH) , 7.40 (m, 2H) , 7.15 (d, ÍH) , 7.05 (d, ÍH) , 2. 45 (s, 3H) , 2.40 (s, 3H) . LRMS (apci, positivo) m/e 320.3 (M+l).
Compuesto 3 l-(5-metil-pirazin-2-il)-3-(5-metil-2- piridin-4-il-fenil)-urea Paso 1 4- (4-pvetil-2-nitro-fenil) -piridina Se prepara de conformidad con el compuesto 2, Paso 1 utilizando ácido 4-piridil-borónico y 4-bromo-2-nitro-fenol.
Paso 2 5-metil-2-piridin-4-il-fenilamina Se prepara de conformidad con el compuesto 1, Paso 4 utilizando 4- (4-metil-2-nitro-fenil) -piridina.
Paso 3 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (5-metil-2-piridin-4-il-fenil) -urea Se prepara de conformidad con el compuesto 1, Paso 5 utilizando 5-metil-2-piridin-4-il-fenilamina y el compuesto 7. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 10.90 (br s, 1H) , 8.65 (d, 2H) , 8.25 (s, 1H) , 8.20 (s, ÍH) , 8.10 (br s, ÍH) , 7.45 (d, 2H) , 7.33 (s, 1H) , 7.15 (d, 1H) , 7.05 (d, 1H) , 2.48 (s, 3H) , 2.46 (s, 3H) . LRMS (apci, positivo) m/e 320.0 (M+l).
Compuesto 4 l-(5-metil-pirazin-2-il)-3- (2-oxazol-5-il-fenil)-urea Paso 1 2-oxazol-5-il-fenilamina Se disuelve 2-oxazol-5-il-fenil-nitro (190 mgs, 1 mmol) en 3 ml de EtOH a temperatura ambiente. Se agrega una cantidad catalítica de catalizador de Pearlman y la hidrogenación se efectúa a 1 atmósfera. Después de filtrar sobre celita, la solución se evapora a presión reducida. Se aisla un sólido de color amarillo.
Paso 2 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (2-oxazol-5-il-fenil) -urea Se prepara de conformidad con el compuesto 1, Paso 5, utilizando 2-oxazol-5-il-fenilamina y el compuesto 7. LRMS (apci, positivo) m/e 296.0 (M+l).
Compuesto 5 l-(5-metil-pirazin-2-il)-3-(5-metil- 2-tiazol-2-il-fenil)-urea Paso 1 4-metil-2-nitro-benzamida Se obtiene 4-metil-2-nitrobenzamida a partir de ácido 4-metil-2-nitrobenzoico mediante el procedimiento descrito en J. Am . Chem . Soc, 75:1389 (1957).
Paso 2 4-metil-2-nitro-tiobenzamida Se disuelven 4-metil-2-nitrobenzamida (180 mgs, 1 mmol) y reactivo de Belleu (529 mgs, 1 mmol) en 3 ml de THF bajo N2. La suspensión se agita durante la noche. Se forma una solución de color amarillo. La solución se concentra, se vuelve a disolver en 20 ml de CH2C12 y se agrega gel de sílice degrado fresco. La solución se evapora a presión reducida, y el gel de sílice/compuesto absorbido se cargan en una unidad Biotage ZIF. El compuesto se somete a cromatografía en una columna 12M de Biotage con EtOAc: hexanos 3:7. Las fracciones deseadas se combinan y se concentran para obtener el material deseado como un sólido de color amarillo oscuro.
Paso 3 2- (4-metil-2-nitro-fenil-tiazol) Se disuelve 4-metil-2-nitro-tiobenzamida (37 mg, 0.18 mmoles) en HOAc (5 ml) con pTsOH (90 mg, 0.047 mmoles) y 2-bromo-l, 1-dietoxi-etano (48 mg, 0.24 mmoles). La mezcla se calienta a 100°C durante 1.5 horas. El producto deseado se aisla utilizando el procedimiento descrito en Chem. Pharm. Bull., 39 (9) : 2323-2332 (1991).
Paso 4 2- (4-metil-2-amino-fenil-tiazol) Se disuelve 2- (4-metil-2-nitro-fenil-tiazol) (30 mgs, 0.13 mmoles) en EtOH (3 ml) con una cantidad catalítica de catalizador de Pearlman. Se sigue el procedimiento descrito para el compuesto 4, Paso 1. El material deseado se obtiene con buenos rendimientos.
Paso 5 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (5-metil-2-tiazol-2-il-fenil) -urea Se prepara de conformidad con el compuesto 1, Paso 5, utilizando 2- (4-metil-2-amino-fenil-tiazol) y el compuesto 7. LRMS (apci, positivo) m/e 326.0 (M+l).
Compuesto 6 l-[2-(4-dimetüaminometil-tiazol-2-il)-5-metil- fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-urea Paso 1 Ester etílico del ácido 2- (4-metil-2-nitro-fenil-tiazol-4-carboxilico Se agita 4-metil-2-nitro-tiobenzamida (60 mgs, 0.30 mmoles, preparada como se describe en el compuesto 5, Paso 2, en 1 ml de EtOH absoluto a temperatura ambiente bajo N2. Se agrega bromopiruvato de etilo (65 mgs, 0.33 mmoles) , y la solución resultante se calienta a 70°C durante 3 horas. La reacción se diluye hasta 30 ml con EtOAc y se lava con NaHC03 saturado, y NaCl saturado. La capa orgánica se seca con MgS0 , se filtra y se concentra hasta un aceite de color amarillo, el cual se utiliza como tal en el siguiente paso.
Paso 2 2- (4-metil-2-nitro fenil) -tiazol-4-il-metanol Se disuelve el éster etílico del ácido 2-(4-metil-2-nitro-fenil-tiazol-4-carboxílico (292 mg, 1 mmol) en 5 ml de EtOH absoluto a temperatura ambiente en un matraz abierto. Se agrega en porciones borohidruro de sodio (1 mmol, 38 mg) en un lapso de varias horas y la reacción se monitorea mediante CCF (EtOAc: hexanos 2:3). Después que concluye la reacción, se agrega cuidadosamente HCl 2N con agitación. Después de 15 minutos, la solución de color amarillo claro se concentra en el evaporador giratorio, y la mezcla cruda se divide entre EtOAc ( 60 ml) y agua ( 60 ml) . Las capas orgánicas se aislan y se lavan con NaHC03 saturado y 60 ml de NaCl saturado. Las capas orgánicas se secan con MgS0 , se filtran y se concentran para proveer un sólido de color naranja como el material deseado.
Paso 3 2- (4-metil-2-nitro-fenil) tiazol-4-carbaldehído Se agita 2- ( 4-metil-2-nit o fenil) -tiazol-4-il-metanol (297 mg, 1.18 mmoles) en 5 ml de CH2C12 a temperatura ambiente bajo N2. Se agrega reactivo de Dess-Martin (500 mg, 1.18 mmoles) como un sólido. Después de 30 minutos, la reacción se completa. La reacción se diluye en 60 ml de CH2C12 y se lava con 60 ml de NaOH 1 N. Las capas orgánicas se secan con MgS04, se filtran y se concentran a presión reducida. El material crudo se purifica en una columna 12M de Biotage eluyendo con EtOAc/hexanos 1:4 para obtener el material deseado.
Paso 4 Dimetil- [2- (4-metil-2-nitro-fenil) -tiazol-4-ilmetil] -amina Se agitan dimetilamina (640 ul de una solución 2M en MeOH) , acetato de sodio, y cianoborohidruro de sodio (56 mgs, 0.89 mmoles) en 2.6 ml de MeOH a temperatura ambiente bajo N2. Se agrega HOAc glacial para ajustar el pH a 7-8. Después se agrega 2- (4-metil-2-nitro-fenil) -tiazol-4-carbaldehído (159 mgs, 0.64 mmoles) como una solución en 3.2 ml de MeOH. Después de dos horas, la formación del producto es evidente mediante espectroscopia de masas. Se deja que la reacción proceda durante la noche. En ese momento, se agrega acetona (500 ul) para extinguir cualquier borohidruro que no haya reaccionado y la reacción se acidula a pH < 3. La reacción se concentra. El residuo se divide entre Et20 (30 ml) y H20 (30 ml) . La fase acuosa se extrae con Et20, después se neutraliza con NaOH 1 N hasta pH 10. La fase acuosa se vuelve a extraer con Et20. Las capas orgánicas combinadas se secan con MgS04, se filtran y se concentran a presión reducida para proveer el material deseado.
Paso 5 Dimetil- [2- (4-metil-2-amino-fenil) -tiazol-4-ilmetil] -amina Se prepara de conformidad con el compuesto 5, Paso 4 a partir de dimetil- [2- (4-metil-2-nitro-fenil) -tiazol-4-ilmetil] -amina .
Paso 6 1- [2- (4-dimetilaminometil-tiazol-2-il) -5-metil-3-fenil] -3- (5-metil-pirazin-2-il) -urea Se prepara de conformidad con el compuesto 1, Paso 5 a partir del compuesto 7 y dimetil- [2- (4-metil-2-amino-fenil) -tiazol-4-ilmetil] -amina. LRMS (apci, positivo) m/e 383.0 (M+l).
Métodos terapéuticos Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar para tratar condiciones que implican proliferación celular aberrante. Por ejemplo, los compuestos se pueden utilizar para potenciar los efectos terapéuticos de radiación y/o un agente quimioterapéutico utilizado en el tratamiento de cánceres y otras indicaciones de proliferación celular que involucran células eucariotas, incluyendo aquellas en humanos y otros animales . En general, los compuestos de la presente invención inhiben las células que proliferan de manera aberrante, tanto cancerosas como no cancerosas. Por ejemplo, los compuestos de la invención se pueden utilizar para incrementar el tratamiento de tumores que normalmente se tratan con un anti-metabolito, por ejemplo, metotrexato o 5-fluorouracilo (5-FU) . El uso de los compuestos de la presente invención puede dar como resultado la regresión parcial o completa de células que proliferan en forma aberrante, es decir, la reducción o eliminación de dichas células de la población celular. Por lo tanto, por ejemplo, cuando la población de células que proliferan de manera aberrante son células de tumor, los compuestos de la invención se pueden utilizar para retardar la velocidad de crecimiento de tumor, reducir el número de tumores, y/o inducir la regresión parcial o completa del tumor. Los compuestos de la presente invención se pueden utilizar in vivo o ex vivo cuando no se ha identificado proliferación celular aberrante o en casos en los que no esté sucediendo la proliferación celular aberrante, pero cuando se sospecha o se espera la proliferación celular aberrante. Los compuestos de la presente invención también se pueden utilizar cuando se ha tratado previamente la proliferación celular aberrante con el fin de evitar o inhibir la recurrencia de la misma. Un método de la presente invención comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto inhibidor de Chkl de la presente invención en combinación con un agente quimioterapéutico a un individuo en necesidad de lo mismo. De manera alternativa, un método de la presente invención comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos uno de los inhibidores de Chkl de la presente invención a un individuo en necesidad de lo mismo en combinación con un anticuerpo, por ejemplo, herceptina, que tiene actividad para inhibir la proliferación de células de cáncer. Por lo tanto, los cánceres son susceptibles al tratamiento incrementado mediante administración de un inhibidor de Chkl de la presente invención en combinación con un agente quimioterapéutico o un anticuerpo. Los cánceres que pueden ser tratados mediante la presente invención incluyen carcinomas y sarcomas que se caracterizan por tumores sólidos, y cánceres de los sistemas mieloide o linfoide, incluyendo leucemias, linfomas, y otros cánceres que típicamente carecen de una masa de tumor, pero que están distribuidos en los sistemas vascular o linfo-reticular . Estos cánceres incluyen, por ejemplo cánceres colorrectales, cánceres de cabeza y cuello, cánceres de páncreas, cánceres de tejido mamario, cánceres gástricos, cánceres de vejiga, cánceres de la vulva, leucemias, linfomas, melanomas, carcinomas de célula renal, cánceres de ovario, cánceres de cerebro, osteosarcomas, y cánceres de pulmón. Los compuestos de la presente invención, por lo tanto, son útiles en cánceres mediados por actividad de Chkl. De manera más particular, la actividad de Chkl está asociada con formas de cáncer que incluyen, pero no se limitan a, oncología de adulto y pediátrica, crecimiento de tumores sólidos/tumores malignos, carcinoma de célula mixoide y redonda, tumores localmente avanzados, cáncer metastásico, sarcomas de tejido blando de humano, incluyendo sarcoma de Ewing, metástasis de cáncer, incluyendo metástasis linfáticas, carcinoma de célula escamosa, particularmente de la cabeza y cuello, carcinoma de célula escamosa del esófago, carcinoma oral, tumores malignos de célula sanguínea, incluyendo mieloma múltiple, leucemias, incluyendo leucemia linfocítica aguda, leucemia anti-linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, y leucemia de célula pilosa, linfomas de efusión (linfomas basados en cavidad corporal) , linfoma del timo, cáncer de pulmón (incluyendo carcinoma de célula pequeña, linfoma de célula T cutáneo, linfoma de Hodgkin, linfoma de tipo no Hodgkin, cáncer de la corteza adrenal, tumores productores de ACTH, cánceres de célula no pequeña, cáncer de tejido mamario, incluyendo carcinoma de célula pequeña y carcinoma de ducto) , cánceres gastrointestinales (incluyendo cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, y pólipos asociados con neoplasia colorrectal) , cáncer pancreático, cáncer hepático, cánceres urológicos (incluyendo cáncer de la vejiga, tal como tumores de vejiga superficiales primarios, carcinoma de célula transitoria invasivo de la vejiga y cáncer de la vejiga invasivo de músculo) , cáncer de próstata, tumores malignos del tracto genital femenino (incluyendo carcinoma de ovario, neoplasmas epiteliales del peritoneo primarios, carcinoma cervical, cánceres del endometrio uterino, cáncer vaginal, cáncer de la vulva, cáncer uterino y tumores sólidos en el folículo ovárico) , tumores malignos del tracto genital masculino (incluyendo cáncer de testículos y cáncer de pene) , cáncer de riñon (incluyendo carcinoma de célula renal) , cáncer de cerebro (incluyendo tumores intrínsecos del cerebro, neuroblastoma, tumores de cerebro astrocíticos, gliomas, e invasión de célula de tumor metastásico en el sistema nervioso central) , cánceres de tejido óseo (incluyendo osteomas y osteosarcomas), cánceres .de la piel (incluyendo melanoma maligno, progreso de tumor de queratinocitos de piel de humano, y cáncer de célula escamosa) , cáncer de la tiroides, retinoblastoma, neuroblastoma, efusión peritoneal, efusión pleural maligna, mesotelioma, tumores de Wilms, cáncer de vesícula biliar, neoplasmas trofoblásticos, hemangiopericitoma, y sarcoma de Kaposi. Un compuesto de la presente invención también se puede utilizar para radio-sensibilizar las células. Las enfermedades que pueden ser tratadas con radiación incluyen, pero no se limitan a enfermedades neoplásicas, tumores benignos y malignos, y células cancerosas. El tratamiento con radiación emplea radiación electromagnética tal como radiación gamma (10-20 hasta 10-13 m) , radiación con rayos X (10~12 hasta 10-9 m) , luz ultravioleta (10 nm hasta 400 nm) , luz visible (400 nm hasta 700 nm) , radiación infrarroja (700 nm hasta 1.0 mm) , y radiación con microondas (1 mm hasta 30 cm) . Algunos protocolos para tratamiento de cáncer actualmente emplean radio-sensibilizadores activados por radiación electromagnética, por ejemplo, rayos X. Los ejemplos de radio-sensibilizadores activados por rayos X incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: metronidazol, misonidazol, desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodesoxiuridina (BUdr) , 5-yododesoxiuridina (IUdR) , bromidesoxicitidina, fluorodesoxiuridina (FUdR) , hidroxiurea, cisplatina, y análogos y derivados terapéuticamente efectivos de los mismos . La terapia fotodinámica (PDT por sus siglas en inglés) de cánceres utiliza luz visible como el activador por radiación del agente sensibilizador. Los ejemplos de radio-sensibilizadores fotodinámicos incluyen los siguientes, pero no se limitan a: derivados de hematoporfirina, PHOTOFRIN®, derivados de benzoporfirina NPe6, etioporfirina de estaño (SnET2), feoborbida-a, bacterioclorofila-a, naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianina de zinc, y análogos y derivados terapéuticamente efectivos de los mismos. Los radio-sensibilizadores se pueden administrar en conjunto con una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más compuestos además del inhibidor de Chkl, dichos compuestos incluyen, pero no se limitan a, compuestos que promueven la incorporación de radio-sensibilizadores a las células objetivo, compuestos que controlan el flujo de agentes terapéuticos, nutrientes, y/u oxígeno a las células objetivo, agentes quimioterapéuticos que actúan sobre el tumor con o sin radiación adicional, u otros compuestos terapéuticamente efectivos para tratar cáncer u otra enfermedad. Los ejemplos de agentes o métodos terapéuticos adicionales que se pueden utilizar en conjunto con radio-sensibilizadores incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo (5-FU) , leucovorin, oxígeno, carbógeno, transfusiones de eritrocitos, perfluorocarbonos (por ejemplo, FLÜOSOLW®-DA) , 2,3-DPG, BW12C, bloqueadores del canal de calcio, pentoxifilina, compuestos antiangiogénesis, hidralazina, y L-BSO. Los agentes quimioterapéuticos que se pueden utilizar en combinación con un compuesto de la presente invención para tratar un cáncer incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, anti-metabolitos, hormonas y antagonistas de las mismas, radioisótopos, anticuerpos, así como productos naturales, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, se puede administrar un compuesto inhibidor de la presente invención con antibióticos, tales como doxorrubicina y otros análogos de tipo antraciclina, mostazas nitrogenadas, tales como ciclofosfamida, análogos de pirimidina tales como 5-fluorouracilo, cisplatina, hidroxiurea, taxol y sus derivados naturales y sintéticos, y similares. Como otro ejemplo, en el caso de tumores mixtos, tales como adenocarcinoma de mama, en el cual los tumores incluyen células dependientes de gonadotropina y células independientes de gonadotropina, el compuesto se puede administrar en conjunto con leuprólido o goserelina (análogos peptídicos sintéticos de LH-RH) . Otros protocolos anti-neoplásicos incluyen el uso de un compuesto inhibidor con otra modalidad de tratamiento, por ejemplo, cirugía o radiación, también conocido en la presente invención como "modalidades anti-neoplásicas adjuntas". Los agentes quimioterapéuticos adicionales útiles en la invención incluyen hormonas y antagonistas de las mismas, radioisótopos, anticuerpos, productos naturales, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos útiles en los métodos que emplean compuestos de la presente invención se listan en la siguiente tabla.
TAB1A 1 A) Agentes alquilantes G) Productos naturales i) Mostazas nitrogenadas i) Fármacos anti-mitóticos Mecloretamina Ciclofosfamida ii) Taxanos Ifosfamida Paclitaxel Melfalan alcaloides de Vinca Clorambucil Vinblastina (VLB) Vincristina ü) Nitrosoureas Vinorelbina Carmustina (BCNU) Taxotere® (docetaxel) Lomustina (CCNU) Estramustina Semustina (metil-CCNU) Fosfato de estramustina iii) Etilenimina/metil-melamina iii) Epipodofilotoxinas Trietilen melamina (TEM) Etopósido Trietilen-tiofosforamida Tenipósido (tiotepa) Hexametilmelamina iv) Antibióticos (HMM, altretamina) Actinomicina D Daunomicina (rubidomicina) iv) Alquil-sulfonatos Doxorubicina (adriamicina) Busulfan Mitoxantroneidarubicina Bleomicina v) Triazinas Esplicamicina (mitramicina) Dacarbazina (DTIC) Mitomicina C Dactinomicina Afidicolina v) Enzimas L-asparaginasa L-arginasa B) Antimetabolitos H) Radio-sensibilizadores i) Análogos de ácido fólico Mettronidazol Metotrexato Misonidazol Trimetrexato Desmetilmisonidazol Pemetrexed Pimonidazol (antifolato multi-dirigido) Etanidazol Nimorazol ü) Análogos de pirimidina RSU 1069 5-fluorouracilo E09 Fluorodesoxiuridina RB 6145 Gemcitabina SR4233 Citosina-arabinósido Nicotinamida (AraC, citarabina) 5-bromodesoxiuridina 5-azacitidina 5-yododesoxiuridina 2,2' -difluorodesoxi- Bromodesoxicitidina citidina iii) Análogos de purina 6-mercaptopurina 6-tioguanina Azatioprina TABLA 1 (cont . ) 2 ' -desoxicoformicina I) Agentes diversos (pentostatina) i) Complejos de coordinación Eritrohidroxinonil-adenina de platino (EHNA) Cisplatina Fosfato de fludarabina Carboplatina 2-clorodesoxiadenosina Oxaliplatina (cladribina, 2-CdA) Antracendiona Mitoxantrona c) Inhibidores de topoisomerasa tipo I ii) Urea sustituida Camptotecina Hidroxiurea Topotecano Irinotecano iii) Derivados de metilhidrazina N-metilhidrazina (MIH) Procarbazina iV) Supresores adrenocorticales Mitotano ( o,pr-DDD) Ainoglutetimida D) Modificadores de la J) Citocinas respuesta biológica Interferón (a, ß, ?) G-CSF Interleucina-2 GM-CSF E) Agentes de diferenciación K) Fotosensibilizadores Derivados de ácido Derivados de retinóico hematoporfirina Photofrin® Derivados de benzoporfirina Nped Etioporfirina de estaño (SnET2) Feobórido-a Bacterioclorofila-a Naftalocianinas Ftalocianinas Ftalocianinas de zinc F) Hormonas y antagonistas ) Radiación i) Adrenocorticosteroides/ Rayos X antagonistas Prednisona y equivalentes Luz ultravioleta Dexametasona Radiación gamma Ainoglutetimida Luz visible Radiación infrarroja ii) Progestinas Caproato de hidroxiprogesterona Acetato de medroxiprogesterona Acetato de megestrol TABLA 1 (cont.) Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos que son particularmente útiles en conjunto con radio-sensibilizadores incluyen, por ejemplo, camptotecina, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, interferón (alfa, beta, gamma) , irinotecano, hidroxiurea, clorambucil, 5-fluorouracilo, metotrexato, 2-cloroadenosina, fludarabina, azacitidina, gemcitabina, pemetrexed, interleucina 2, irinotecano, docetaxel, paclitaxel, topotecano, y análogos y derivados de los mismos terapéuticamente efectivos . De conformidad con la presente invención, los compuestos de la presente invención son útiles en combinación con gemcitabina, solos o también con paclitaxel. Los compuestos de la presente invención también son útiles en combinación con pemetrexed, solo o también con cisplatina, carboplatina, u otras platinas. Un inhibidor de Chkl de la presente invención también se puede administrar en combinación con gemcitabina y pemetrexed. Un inhibidor de Chkl de la presente invención administrado en combinación con gemcitabina puede ser útil en el tratamiento de, por ejemplo, carcinoma pancreático, leiomiosarcoma del útero, sarcoma de tejido óseo, cáncer de pulmón de célula no pequeña metastásico, sarcoma de tejido blando de tronco y extremidades, cáncer de célula renal, adenocarcinoma, y enfermedad de Hodgkin. Un inhibidor de Chkl de la presente invención administrado con pemetrexed puede ser útil en el tratamiento de mesotelioma. Los compuestos .de la presente invención también pueden potenciar la eficacia de fármacos utilizados en el tratamiento de enfermedades, condiciones, o trastornos inflamatorios caracterizados por proliferación celular aberrante. Los ejemplos de enfermedades inflamatorias que se pueden tratar con los compuestos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide (R?) , psoriasis, vitíligo, granulomatosis de Wegener, artritis crónica juvenil con inicio sistémico (JCA) , y lupus eritomatoso sistémico (LES) . El tratamiento de artritis, granulomatósis de Wegener, y LES con frecuencia implica el uso de terapias inmuno-supresoras, tales como radiación ionizante, metotrexato, y ciclofosfamida. Dichos tratamientos típicamente inducen, ya sea directa o indirectamente, el daño al ADN. La inhibición de la actividad de Chkl dentro de las células inmunes ofensoras hace que las células sean más sensibles al control por parte de estos tratamientos estándar. Psoriasis y vitíligo comúnmente se tratan con radiación ultravioleta (UV) en combinación con un psoraleno. Los compuestos de la presente invención incrementan el efecto aniquilador de UV y un psoraleno, e incrementan el índice terapéutico de este régimen de tratamiento. En general, los compuestos de la presente invención potencian el control de células de enfermedad inflamatoria cuando se utilizan en combinación con fármacos inmuno-supresores . El compuesto de la presente invención también se puede utilizar en métodos para tratar otras condiciones no cancerosas caracterizadas por células que proliferan de manera aberrante. Dichas condiciones incluyen, pero no se limitan a, aterosclerosis, restenosis, vasculitis, nefritis, retinopatía, enfermedad renal, trastornos proliferativos de la piel, psoriasis, cicatrización queloide, queratosis actínica, síndrome de Stevens-Johnson, osteoporosis, enfermedades hiper-proliferativas del ojo incluyendo crecimiento descendente epitelial, vitreo- retinopatía proliferativa (PVR) , retropatía diabética, enfermedades hemangio-proliferativas, ictiosis, y papilomas . Un método preferido para administrar un inhibidor de Chkl de la presente invención se describe en el documento WO 05/027907, cuya descripción se incorpora para referencia. Dichos métodos para inhibir la proliferación celular aberrante implican programar la administración de un activador de Chkl (por ejemplo, un agente quimioterapéutico) y un inhibidor de Chkl de conformidad con la presente invención. En este método, se administra por lo menos un activador de Chkl a una dosis y durante un tiempo suficiente para inducir la sincronización sustancial de la detención del ciclo celular en células en proliferación. Después de lograr la sincronización sustancial de fase, se administra por lo menos un inhibidor de Chkl para abrogar la detención del ciclo celular e inducir la muerte celular terapéutica. El método es útil con cualquier activador de Chkl, y encuentra aplicación para tratar o prevenir condiciones cancerosas y no cancerosas que implican proliferación celular aberrante. Una población de células que proliferan de manera aberrante se puede poner en contacto con un inhibidor, o más de uno, de Chkl de la invención. Si se utiliza más de un inhibidor de Chkl, los inhibidores de Chkl se pueden poner en contacto con las células utilizando métodos iguales o diferentes (por ejemplo, en forma simultánea o secuencial, durante tiempos iguales o diferentes, o utilizando modalidades iguales o diferentes) según sea determinado por el experto en la técnica, por ejemplo, un médico encargado (en el caso de pacientes humanos) o un investigador de laboratorio (en el caso de un procedimiento, in vitro o ex vivo) . También se puede poner en contacto una población de células que proliferan de manera aberrante con uno o más activadores de Chkl. Si se utiliza más de un activador de Chkl, los activadores de Chkl se pueden poner en contacto con las células utilizando los mismos métodos o métodos diferentes, generalmente como se describió anteriormente en el contexto de inhibidores de Chkl. Los compuestos de la presente invención se pueden aplicar a poblaciones de células ex vivo . Por ejemplo, los compuestos de la presente invención se pueden utilizar ex vivo para obtener información referente al programa y/o dosificación óptimas para administrar un inhibidor de Chkl para una indicación dada, tipo celular, paciente, y/u otro parámetro . de tratamiento. Esta información se puede utilizar para propósitos experimentales o en una clínica para determinar protocolos para tratamiento in vivo. Otros usos ex vivo para los compuestos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica. Como será apreciado por los expertos en la técnica, se pueden utilizar agentes activos o auxiliares adicionales en los métodos descritos en la presente invención. Como también será apreciado por los expertos en la técnica, la referencia en la presente invención a "tratamiento" se extiende a profilaxis, así como al tratamiento de enfermedades o síntomas establecidos . • La cantidad de un compuesto de la invención requerida para uso en el tratamiento varía con la naturaleza de la condición que está siendo tratada, y con la edad y la condición del paciente, y finalmente queda determinada por el- médico o veterinario encargado. En general, sin embargo, las dosis administradas para el tratamiento de humano adulto típicamente están en el intervalo de 0.001 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg por día. La dosis se puede administrar en una sola dosis, o como dosis múltiples administradas a intervalos apropiados, por ejemplo como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. En la práctica, el médico determina el régimen de dosificación apropiado para un paciente individual, y la dosis varía con la edad, peso, y respuesta del paciente particular. Las dosis anteriores son ejemplos del caso promedio, pero existen casos individuales en los cuales se ameritan dosis más altas o más bajas, y dichas dosis están dentro del campo de la presente invención. El contacto de la población de células con un inhibidor de Chkl de la presente invención, a cualquier dosis, se efectúa durante un tiempo suficiente para lograr la abrogación sustancial del punto de comprobación del ciclo celular. Típicamente, aunque no necesariamente, dichos tiempos incluyen intervalos de hasta 72 horas aproximadamente hasta 96 horas aproximadamente, dependiendo de diversos factores. En algunas modalidades, sería deseable o necesario administrar el inhibidor de Chkl a través de un periodo de hasta varias semanas o más, según sea determinado por el médico o técnico encargado. Por lo tanto, un inhibidor de Chkl de la presente invención típicamente se puede administrar durante hasta 1 hora aproximadamente, hasta 2 horas aproximadamente, hasta 3 horas aproximadamente, hasta 4 horas aproximadamente, hasta 6 horas aproximadamente, hasta 12 horas aproximadamente, hasta 18 horas aproximadamente, hasta 24 horas aproximadamente, hasta 48 horas aproximadamente, o hasta 72 horas aproximadamente. Los expertos en la técnica apreciarán que los intervalos de tiempo expresados en la presente invención son solamente ejemplos y que los intervalos y sub-intervalos dentro y fuera de aquellos expresados también están dentro del campo de la invención. Los inhibidores de Chkl de la presente invención se pueden administrar a través de una pluralidad de dosis. Por ejemplo, el inhibidor de Chkl se puede administrar a una frecuencia de: cuatro dosis suministradas como una dosis por día a intervalos de cuatro días (q4d x 4) ; cuatro dosis suministradas como una dosis por día a intervalos de tres días (q3d x 4) ; una dosis suministrada por día a intervalos de cinco días (qd x 5) ; una dosis por semana durante tres semanas (qwk3) ; cinco dosis diarias, con dos días de descanso, y otras cinco dosis diariamente (5/2/5) ; o, cualquier régimen de dosificación determinado como apropiado por la circunstancia.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Determinación de los valores de CI50 de los inhibidores de Chkl Se identifica el ADNc de Chkl de humano y se clona como se describió previamente en la publicación de solicitud internacional no. WO 99/11795, presentada el 4 de septiembre de 1998. Se inserta una marca FLAG® en marco con el extremo amino terminal de Chkl de longitud completa. El iniciador 5' contiene un sitio EcoRI, una secuencia Kozak, y también codifica para una marca FLAG® para purificación por afinidad utilizando el anticuerpo M2 (Sigma, Saint Louis, IL) . El iniciador 3 ' contiene un sitio Salí. El fragmento amplificado mediante PCR se clona en pCI-Neo como un fragmento EcoRI-SalI (Invitrogen, Carlsbad, CA) , después se sub-clona como un fragmento EcoRI-Notl en pFastBací (Gibco-BRL, Bethesda, MD) . Se prepara baculovirus recombinante como se describe en el manual Bac-to-Bac de Gibco-BRL y se utiliza para infectar células Sf-9 cultivadas en medio CCM3 (Hy-Clone Laboratories, Logan, UT) para expresión de la proteína Chkl marcada con FLAG®. Se purifica Chkl marcado con FLAG® a partir de comprimidos congelados de células SF9 infectadas con baculovirus . Los comprimidos celulares congelados se mezclan con un volumen igual de solución reguladora para lisis 2X que contiene Tris-HCl 100 mM pH 7.5, 200 mM de NaCl, 50 M de B-glicerofosfato, 25 mM de NaF, 4 mM de MgCl2, 0.5 mM de EGTA, 0.2% de TWEEN®-20, 2 mM de vanadato de sodio, 2 mM de DTT, y una mezcla de inhibidores de proteasa (Complete mini, Boehringer Mannheim catálogo 2000 #1836170) . Las células después se trituran (dounced) 20 veces con el pistilo suelto de un homogenizador Dounce y se centrifugan a 48,400 x g durante 1 hora. La columna de afinidad M2 se lava previamente con 10 volúmenes de columna de glicina 50 mM pH 3.5 seguido por Tris 20 mM pH 7.5, 150 mM de NaCl alternando tres veces y finalizando con un lavado con Tris NaCl. La columna después se lava con 25 volúmenes de columna de Tris 20 mM pH 7.5, 150 M de NaCl, 0.1% de TWEEN®-20, 1 mM de EGTA, 1 mM de EDTA y tabletas IX "complete mini" de proteasa. El lisado clarificado después se une a la resina de afinidad M2 por lotes a 4°C durante 4 horas. La mezcla de resina y lisado se vierte después en una columna y se recolecta el flujo que pasa a través de la misma. La resina se lava con 10 volúmenes de columna de Tris 20 mM pH 7.5, 150 mM de NaCl, y N-octil-glucósido 3 mM. Chkl marcado con FLAG® se eluye después de la columna con 6 volúmenes de columna de Tris 20 mM pH 7.5, 150 mM de NaCl, 3 mM de N-octil-glucósido fría que contiene 0.5 mg/ml de péptido FLAG® (Sigma, Catálogo 2000 # F-3290) . Se recolectan tres fracciones y se analizan respecto a la presencia de Chkl marcado con FLAG. La prueba para actividad de cinasa de Chkl incluye 100 ng de FLAG®-Chkl purificado (150 pmoles de ATP/min) , 20 µm de péptido de Cdc25C (H-leu-tyr-arg-ser-pro-ser-met-pro-glu-asn-leu-asn-arg-arg-arg-arg-OH) (SEQ ID NO: 1), 4 µm de ATP, 2 µCi de [32P]?-ATP, Hepes 20 mM pH 7.2, 5 mM de MgCl2, 0.1% de NP40, y 1 mM de DTT. Las reacciones se inician mediante la adición de mezcla de reacción que contiene ATP y se efectúa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las reacciones se detienen mediante adición de ácido fosfórico (concentración final 150 mM) y se transfieren a discos de fosfocelulosa. Los discos de fosfocelulosa se lavan cinco veces con ácido fosfórico 150 mM y se secan al aire. Se agrega fluido para centelleo y los discos se cuentan en un contador para centelleo Wallac. La prueba se incuba en presencia de un intervalo amplio de concentraciones del compuesto inhibidor de Chkl y se calcula un valor de CI50 para el compuesto. Como se indicó anteriormente, todos los compuestos de la invención sometidos a la prueba presentan valores de CI5o en la prueba menores de 500 nM aproximadamente.
EJEMPLO 2 Selectividad Los inhibidores de Chkl de la presente invención se analizan respecto a la selectividad, con Chkl como la enzima de comparación y las siguientes proteína cinasas como enzimas comparadoras: Cdc2, Chk2, CTAK, EphAl, EphA2, Erkl, FGFR1, FGFR4, IR, JNK1, c-Kit, p38alfa, p38beta, p38delta, Ros, Rse, Rsk2, TrkA, TrkB, proteína cinasa A, proteína cinasa C, pp60v-src, proteína cinasa B/Akt-1, p38MapK, p70S6K, cinasa II dependiente de calmodulina de calcio, y tirosina cinasa abl. Se mide el valor de CI50 de un compuesto contra Chkl como se describió anteriormente. El valor de CI50 del compuesto contra las enzimas comparadoras se mide utilizando la plataforma de tecnología registrada SelectSmart™ (MDS Pharma Servies, Bothell, Washington, EUA) con cualquiera de un procedimiento de ELISA modificado o polarización de fluorescencia. Todos los inhibidores evaluados muestran una selectividad de 20 veces para Chkl con respecto a las enzimas comparadoras analizadas. De manera alternativa, las pruebas para determinar la CI0 para cada una de estas cinasas han sido descritas previamente en la literatura, incluyendo la publicación de patente E.U.A. No. 2002-016521 Al, y el documento WO 95/19988, de las cuales ambas se incorporan en la presente invención para referencia.
EJEMPLO 3 Inhibidores de Chkl de la invención inhiben la función de Chkl en las células Para establecer que los inhibidores de Chkl de la invención inhiben la función de Chkl en las células, los inhibidores se pueden analizar en pruebas moleculares basadas en célula. Debido a que se ha demostrado que Chkl de mamífero fosforila a Cdc25C in vitro, lo que sugiere que ésta regula en forma negativa ciclina B/cdc2 en respuesta al daño al ADN, se puede analizar la capacidad de los inhibidores de Chkl para incrementar la actividad de Ciclina B/cdc2. El experimento se puede diseñar de la siguiente manera: Se irradian células HeLa con 800 rads y se incuban durante 7 horas a 37 °C. Debido a que estas células funcionalmente son p53 negativas, éstas se detienen exclusivamente en G2. Después, se agrega nocodazol a una concentración de 0.5 µg/ml y las células se incuban durante 15 horas a 37 °C. La adición de nocodazol está diseñada para atrapar cualesquiera células que pasen a través de la detención en G2 hacia M. Por último, se agrega un inhibidor de Chkl durante 8 horas, se recolectan las células, se lisan y se precipitan inmunológicamente cantidades iguales de proteína con un anticuerpo para Ciclina Bl (New England Biolabs) en la forma sugerida por el fabricante. Los inmuno-precipitados se analizan después respecto a actividad de cinasa cdc2 asociada con Ciclina B analizando la actividad de la cinasa de histona Hl (Yu et al . , J Biol Chem. , Dic. 11 de 1998; 273 (50) : 33455-64) . Además, se puede establecer la capacidad de los inhibidores de Chkl de la presente invención para abrogar el punto de comprobación de daño a ADN en G2 inducido por radiación ionizante utilizando experimentos de ' prueba de índice mitótico. Se tratan células HeLa (aproximadamente 1 x 106) como se describió anteriormente. Las células se recolectan mediante centrifugación, se lavan una vez con PBS, después se vuelven a suspender en 2.5 ml de KCl 75 mM y se vuelven a centrifugar. Las células se fijan después en 3 ml de una mezcla de HOAc:MeOH (1:3) fría recién preparada y se incuban sobre hielo durante 20 minutos. Las células se convierten en comprimidos, se aspira la solución de fijación y se vuelven a suspender en 0.5 ml de PBS. Se preparan frotis mitóticos pipeteando 100 µl de las células fijas sobre un porta-objetos para microscopio y la muestra se anega con 1 ml de solución para fijación. Los portaobjetos se secan después al aire, se tiñen con tinción de Wright (Sigma) durante 1 minuto, seguido por un lavado con H20 y un lavado con MeOH al 50%. La presencia de cromosomas condensados y la ausencia de envoltura nuclear identifican las células mitóticas .
EJEMPLO 4 Inhibidores de Chkl de la presente invención incrementan la aniquilación de células mediante tratamientos para cáncer Para demostrar que la inhibición de Chkl mediante un compuesto de la presente invención sensibiliza las células elegidas como blanco al efecto aniquilador de los agentes que dañan el ADN, se pueden incubar células en presencia de un inhibidor de Chkl de la presente invención y se exponen ya sea a irradiación o a un agente químico que daña el ADN. Las células sembradas a una densidad de 1000-2000 por cavidad en placas para microtitulación de 96 cavidades se cultivan en medio RMPI 1640 que contiene 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina durante 18 horas a 37 °C en una incubadora humedecida con 5% de C02. Las células evaluadas pueden incluir cualesquiera células o líneas celulares de interés, tales como HeLa, ACHN, 786-0, HCT116, SW620, HT29, Colo205, SK-MEL-5, SK-MEL-28, A549, H322, OVCAR-3, SK-0V-3, MDA-MB-231, MCF-7, PC-3, HL-60, K562, y MOLT4. Todas las designaciones de línea celular se refieren a las siguientes líneas de célula de humano: Las células se tratan con medio que contiene fármacos quimioterapéuticos solos o fármacos quimioterapéuticos y un inhibidor de Chkl. Las células se incuban durante 5 días aproximadamente antes de medir el crecimiento mediante determinación de los niveles de absorción de 3H-timidina. Los fármacos quimioterapéuticos incluyen etopósido, doxorrubicina, cisplatina, clorambucil, 5-fluorouracilo (5-FU) . La concentración de fármaco necesaria para inhibir el crecimiento celular para el 90% de las células de control no tratadas se define como la GI90. Los compuestos de la presente invención se pueden analizar con antimetabolitos adicionales, incluyendo metotrexato, hidroxiurea, 2-cloroadenosina, fludarabina, azacitidina, y gemcitibina para establecer en la misma la capacidad de los agentes para incrementar la aniquilación. Los compuestos de la presente invención se pueden comparar entre sí determinando la aniquilación incrementada de carcinoma colorrectal HT29 en combinación con gemcitabina.
Además, se puede analizar la capacidad de los inhibidores de Chkl de la invención para incrementar la aniquilación mediante radiación.
EJEMPLO 5 Prueba sensible para medir la actividad de inhibidor de Chkl en modelos animales Se desarrolla la siguiente prueba sensible para medir la actividad de inhibidor de Chkl en modelos de tumor de roedor. En particular, la prueba se puede utilizar, entre otras cosas, para medir la capacidad de un inhibidor de Chkl para bloquear la función de Chkl en el modelo de tumor, y para permitir la determinación de condiciones que faciliten el acceso del inhibidor de Chkl al objetivo molecular. La capacidad de los inhibidores de Chkl selectivos para abrogar un punto de comprobación inducido por quimioterapia se mide utilizando una prueba inmuno-fluorescente cuantitativa que mida el índice mitótico monitoreando la fosforilación de histona H3 sobre serina 10 (H3-P) , un evento específico de la mitosis (Ajiro et al., J Biol Chem . , 271 : 13191-201 , 1996; Goto et al., J Biol Chem . , 274:25543-9, 1999). El protocolo de prueba es el siguiente. Se extirpan tumores a partir de roedores tratados o no tratados con activador de Chkl (en el presente estudio, agente quimioterapéutico) y/o inhibidor de Chkl, y se incrustan en parafina. Los tumores se cortan en secciones de 6 mieras de espesor y se montan sobre portaobjetos. Se retira la parafina de los portaobjetos mediante tratamientos sucesivos de 3 minutos con xileno, etanol al 100%, EtOH al 95%, EtOH al 70%, y H20 desionizada. Los portaobjetos se calientan después a 95°C en citrato de sodio 10 mM durante 10 minutos seguido por un paso de enfriamiento de 20 minutos. Los portaobjetos se bloquean durante 30 minutos con solución reguladora para bloqueo (20% de suero normal de humano y 2% de Seroalbúmina de bovino en solución salina regulada con fosfatos que contiene 0.05% de Tritón X-100 (PBST)). El anticuerpo anti-fosfo-histona H3 (Upstate Biotech, Cat. #06-570) se diluye 1:200 en la solución reguladora para bloqueo y se incuba con los portaobjetos durante 1 hora. Los portaobjetos se lavan 3 veces, 5 minutos, en PBST. Se agrega el anticuerpo secundario anti-rodamina de conejo, de cabra, (Jackson, cat #711-295-152) durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavan después dos veces en PBST y se agregan 75 µM de 0.1 µM/ml de DAPI (Sigma) en PBS y se deja teñir durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavan después dos veces más en PBST y se montan con Vectashield (Vector, cat # H-1400) . Los portaobjetos se observan utilizando microscopía de fluorescencia. El porcentaje de células teñidas con anticuerpo H3-P con relación a las células totales (teñidas con DAPI) se cuantifica utilizando el software a Metamorph (Universal Imaging Corporation, Versión 4.6).
EJEMPLO 6 Inhibidores de Chkl selectivos abrogan los puntos de comprobación de fase G2 y S inducidos por daño al ADN Estudios previos demuestran que los Inhibidores de Chkl selectivos abrogan sustancialmente los puntos de comprobación en G2/M y S inducidos por daño al ADN. En los primeros, el daño al ADN es inducido por radiación ionizante (IR), cuya fase objetivo es la fase G2. En los últimos, el daño al ADN es inducido por agentes quimioterapéuticos cuya fase objetivo es la fase S. Véase la publicación de solicitud de patente E.U.A 2003/0069284 y las referencias citadas en la misma. Brevemente, se analiza la abrogación mediante inhibidor de Chkl del punto de comprobación por daño al ADN en G2 utilizando experimentos de índice mitótico. Se irradian aproximadamente 1 x 106 células HeLa con 800 rads y se incuban durante 7 horas a 37 °C. Debido a que estas células funcionalmente son p53 negativas, éstas se detienen exclusivamente en G2. Después se agrega nocodazol a una concentración de 0.5 µg/ml y se incuban durante 15 horas a 37 °C. (La adición de nocodazol está diseñada para atrapar las células que pasen a través de la detención en G2 hacia la mitosis evitando que éstas pasen también a Gl y permitiendo la cuantificación de células en fase M) . Se agrega un inhibidor selectivo de Chkl durante 8 horas, y las células se recolectan mediante centrifugación, se lavan una vez con PBS, después se vuelven a suspender en 2.5 ml de KCl 75 mM y se vuelven a centrifugar. Las células se fijan después en 3 ml de una mezcla de HOAc:MeOH (1:3) fría recién preparada y se incuban sobre hielo durante 20 minutos. Las células se convierten en comprimidos, se aspira la solución de fijación y las células se vuelven a suspender en 0.5 ml de PBS. Se preparan frotis mitóticos pipeteando 100 µl de las células fijas sobre un portaobjetos de vidrio para microscopio y la muestra se anega con 1 ml de solución para fijación. Los portaobjetos se secan después 'al aire, se tiñen con tinción de Wright (Sigma, St. Louis, MO) durante 1 minuto, seguido por un lavado en agua y un lavado en MeOH al 50%. La presencia de cromosomas condensados y la ausencia de envoltura nuclear identifican las células mitóticas. Los inhibidores de Chkl dan como resultado un incremento en el número de células mitóticas en presencia de irradiación, con lo cual se demuestra la abrogación de la detención en G2 inducida por IR. Esta abrogación del punto de comprobación da como resultado un incremento en la actividad de ciclina B/cdc2, la cual es requerida para que las células pasen a la mitosis. Las células tratadas con IR seguido por inhibidor de Chkl pasan por lo tanto a la mitosis con ADN dañado. Estos experimentos confirman la hipótesis de que Chkl está involucrada en la G2 inducida por IR.
EJEMPLO 7 El inhibidor de Chkl es absorbido por células de tumor en presencia de activador de Chkl en un modelo de xenoinjerto de tumor En un modelo de xenoinjerto de tumor, se injertan ratones desnudos con tumores de carcinoma de colon HT29 en el lado y se dejan crecer hasta 200 mm3. Los ratones se tratan después ya sea con vehículo, 300 mg/kg de inhibidor de Chkl, 20 mg/kg de gemcitabina o se les coadministran 300 mg/kg de inhibidor de Chkl y 20 mg/kg de gemcitabina dos veces, con tres días de separación en los días 1 y 4. El tratamiento de los ratones portadores de tumor mediante coadministración de inhibidor de Chkl y gemcitabina da como resultado un retraso de 4 días de crecimiento en los tumores en comparación con gemcitabina sola. Para evaluar la difusión de los inhibidores de Chkl en el tejido de tumor, se miden los niveles en plasma y tejido de inhibidor de Chkl. Utilizando una bomba Alzet, se administran 500 mg/kg de inhibidor de Chkl a los ratones portadores de tumor HT29 en un sistema de suministro continuo a través de un periodo de 24 horas. Se toman muestras de plasma, y después • se recolectan los tumores, riñones, hígado, bazo, y los pulmones. Los puntos de tiempo de recolección son 1, 2, 4, 8, y 24 horas. Se extraen los tejidos y se cuantifican los niveles de inhibidor de Chkl. Este experimento demuestra que un inhibidor de Chkl penetra en el tejido normal y de tumor, alcanza un nivel de aproximadamente 15 µM en el tejido de tumo, y llega a un máximo en el tejido del bazo a las 8 horas aproximadamente a 20 µM. Por lo tanto, los inhibidores de Chkl son absorbidos fácilmente por las células en proliferación, y son útiles, en conjunto con agentes quimioterapéuticos activadores de Chkl, como terapias para el tratamiento de enfermedades proliferativas.
EJEMPLO 8 Dosis-respuesta de tumores tratados con inhibidores de Chkl y gemcitabina Para determinar una dosis eficaz de inhibidor de Chkl después del tratamiento con gemcitabina y si la abrogación del punto de comprobación dependiente de la dosis se correlaciona o no con la actividad anti-tumor, se efectúa un experimento de dosis-respuesta. Se injertan ratones desnudos con células de tumor HT29 y se deja que los tumores se desarrollen durante 10 días. Los tumores al inicio son de aproximadamente 100 mm3.
Los animales se tratan con gemcitabina a la MTD (160 mg/kg) seguido por inhibidor de Chkl a 50 mg/kg, 200 mg/kg, o 400 mg/kg. El tiempo de pret-tratamiento con gemcitabina es 32 horas en este experimento según se determina mediante una prueba basada en célula que indica este punto de tiempo como el óptimo para este tipo de tumor. El análisis del volumen de tumor en cada régimen de tratamiento indica que el tratamiento de ratones portadores de tumor HT29 con la terapia descrita desacelera el crecimiento de tumor más que con gemcitabina sola, en el que cualquiera de 200 mg/kg o 400 mg/kg de inhibidor de Chkl más gemcitabina de nuevo muestra efectos del inhibidor de Chkl dependientes de la dosis.
EJEMPLO 9 Prueba para determinar sin un agente es o no un activador de Chkl Para determinar si un agente es un activador de Chkl, se puede medir el estado de fosforilación de Chkl utilizando anticuerpos fosfo-específicos para sitios de fosforilación específicos en Chkl. Se ha demostrado que las serinas 317 y 345 se fosforilan después del tratamiento de las células con radiación ionizante, radiación ultravioleta, hidroxiurea, N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) , temozolamida y gemcitabina. Liu et al., Genes Dev. 14:1448-59, 2000; Zhao et al., Mol. Cell Biol. 21:4129-39, 2001; Lopez-Girona et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 58:11289-94, 2001; Guo et al., Genes Dev. 14:2145-56, 2000; Gatei et al., J. Biol. Chem. 278:14806-11, 2003; Ng et al., J Biol Chem. 279 (10) : 8808-19, 2004; Wang et al., Nati Acad Sci USA 100 (26) : 15387-92, 2003; Stojic et al., Genes Dev. 18 (11) : 1331-44 , 2004. Estos sitios de serina son fosforilados por cinasas de punto de comprobación corriente arriba, Atm y Atr. Liu et al., Genes Dev. 14:1448-59, 2000; Zhao et al., Mol. Cell Biol., 21:4129-39, 2001). La fosforilación de estos sitios en respuesta a un activador de Chkl candidato se puede monitorear mediante análisis Western blot o inmunohistoquímica de células de tumor. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente procedimiento para demostrar que gemcitabina da como resultado la activación de Chkl en la serina 345 y 317. Las células HT29 se tratan con gemcitabina 20 µM durante 2 horas. La gemcitabina se lava del medio de crecimiento celular y las células se incuban durante 22 horas adicionales. Se preparan Usados de proteína y se separan mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se transfieren a membranas de PVDF y se sondean con antisuero (Cell Signalling) específico para cualquiera de las serinas 317 o 345 fosforiladas (Cell Signalling) . Los análisis de Western blots muestran que el tratamiento con gemcitabina de las células de carcinomas de colon HT29 da como resultado la fosforilación de ambas serinas 317 y 345.
EJEMPLO 10 Prueba para monitorear la actividad de Chkl en respuesta a un inhibidor de Chkl Se ha descubierto que la fosforilación de Chkl en la serina 296 es estimulada mediante tratamiento de células de tumor con gemcitabina, y que la fosforilación en este sitio es inhibida por inhibidores de Chkl. Las fosforilación en este sitio no es inhibida por wortmanina, la cual inhibe a Atm y Atr. Por lo tanto, la fosforilación de serina 296 es distinta de la fosforilación en las serinas 317 y 345. Además, se ha descubierto que este sitio está fosforilado en preparados de Chkl purificado, lo que sugiere que la enzima purificada se puede fosforilar así misma o a otras moléculas de Chkl en la serina 296. Tomados juntos, estos datos sugieren que la fosforilación en la serina 296 es efectuada por la misma Chkl. Por lo tanto, se puede utilizar esta estrategia para monitorear la actividad de Chkl en tumores en respuesta a los activadores de Chkl. Además, esta estrategia se puede utilizar para medir la activación de Chkl mediante inhibidores de Chkl. Por lo tanto, las células HT29 se tratan con gemcitabina 20 µM durante 2 horas. La gemcitabina se lava del medio de crecimiento celular y las células se incuban durante 22 horas adicionales. Se preparan usados de proteína y se separan mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Las proteínas se transfieren a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y se sondean con antisuero (Cell Signalling) específico para serina 296 fosforilada (Cell Signalling) . El análisis Western blot muestra que el tratamiento con gemcitabina de células de carcinoma de colon HT29 da como resultado la fosforilación de serina 296. Además, las células tratadas con inhibidores de Chkl selectivos durante 15 minutos no muestran fosforilación de serina 296. Estos datos sugieren que la fosforilación de serina 296 es efectuada por la cinasa Chkl.
EJEMPLO 11 Modelos animales de tumor 1 Para evaluar la capacidad de los inhibidores de Chkl de la invención para incrementar la aniquilación de tumores mediante agentes que dañan al ADN en ratones, se establecen modelos de xenoinjertos de tumor utilizando líneas de célula de tumor de colon. Se puede utilizar 5-fluorouracilo (5-FU) o gemcitabina como agentes que dañan al ADN. Se pueden utilizar células HT29 y Colo205 (carcinoma de colon de humano) y células H460 y Calu-6 (carcinoma de célula no pequeña) para propagar los tumores de xenoinjerto en ratones de 6-8 semanas de edad de género femenino tímicos Balb/c (nu/nu) . Los ratones se mantienen en una cabina con flujo de aire laminar bajo condiciones libres de patógenos y se alimentan con comida y agua estériles ad libitum. Las líneas celulares se cultivan hasta subconfluencia en medio RPMI 1640 complementado con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, y 1.5 mM de L-glutamina en un ambiente humedecido con 5% de C02. Se preparan suspensiones de célula individual en CMF-PBS, y la concentración celular se ajusta a 1 x 108 células/ml. Los ratones se inoculan por vía subcutánea (s.c.) en el flanco derecho o la pierna derecha con un total de 1 x 107 células (100 µl) .
Los ratones se aleatorizan (5-15 ratones/grupo) en cuatro grupos de tratamiento y se utilizan cuando los tumores alcanzan un volumen de 75-100 cm3 (normalmente 7-11 días después de la inoculación) . Los tumores se miden con calibradores de Vernier y los volúmenes de tumor se calculan utilizando la fórmula derivada empíricamente: Volumen de tumor (cm3) = longitud del tumor (cm) x anchura del tumor (cm) x profundidad del tumor (cm)/3.3.
El tratamiento consiste de i) inyección intraperitoneal (i.p) de 100 µl de gemcitabina a 160 mg/kg. Se observa un retraso en el crecimiento del tumor en los ratones tratados con gemcitabina. Se espera que el tratamiento de los ratones con 160 mg/kg de gemcitabina en combinación con la administración por vía oral de inhibidores de Chkl reduzca los volúmenes de tumor y prolongue la vida. El tamaño del tumor se monitorea cada tercer día durante todo el tiempo que dura el experimento. Evidentemente, se pueden hacer muchas modificaciones y variaciones de la invención como se describió anteriormente en la presente sin alejarse del alcance y campo de la misma, y, por lo tanto, únicamente se deben imponer limitaciones tales como las que se indican mediante las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES Un compuesto que tiene una fórmula en la cual X1 es nada, -O-, -S-, -CH2-, o -NÍR1)-; X2 es -O-, -S-, o -NÍR1)-; Y es O ó S; o =Y representa dos átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono común; W se selecciona a partir del grupo que consiste de heteroarilo, arilo, heterocicloalquilo, cicloalquilo, y alquilo de C?_6 sustituido con un grupo heteroarilo o arilo, en los cuales dicho grupo arilo de W está opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes representados por R2, dicho grupo heteroarilo de W está opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes representados por R5, y dichos grupos heterocicloalquilo y cicloalquilo de W están opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes alquilo de C?-e? R1 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C?-e, alquenilo de C2_6, alquinilo de C2_6, y arilo; R2 se selecciona a partir del grupo que consiste de halógeno, alquilo de C?_6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2_6, OCF3, N02, CN, NC, N(R3)2, OR3, C02R3, C(0)N(R3)2, C(0)R3, NÍR^COR3, N (R1) C (O) OR3, NÍR^CÍO)-alquilen (C?_6) -C (O) R3, N (R1) C (O) -alquilen (Ca_6) -C (O) OR3, N (R1) C (O) -alquilen (C?_6) -OR3, N (R1) C (O) -alquilen (C?-6) - NHC(0)OR3, NfR^C (O) -alquilen (C?_6) -S02NR3, alquilen (C-e) -OR3, y SR3; R3 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, halógeno, alquilo de C?_6, alquenilo . de C2-6, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, S02R4, alquilo de C?_6 sustituido con uno o más de halógeno, hidroxi, arilo, heteroarilo, heterocicloalquilo, N(R4)2, y S02R4, alquilen (C?_6) -arilo, alquilen (C?_6) -heteroarilo, alquilen (C?_6) -heterocicloalquilo de C3-8, alquilen (C?_6) -S02-arilo, alquilen (C?_6) -N (R4) 2 opcionalmente sustituido, OCF3, alquilen (C?_6) -N (R4) 3+, heterocicloalquilo de C3_8, y CH (alquilen (Ci-d) -N (R)2)2, o dos grupos R3 se toman juntos para formar un anillo alifático de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; R4 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C?_6, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquilen (C?_6) -arilo, y S02-alquilo de C?_6, o dos grupos R4 se toman juntos para formar un anillo de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido; R5 se selecciona a partir del grupo que consiste de alquilo de C?_6, alquinilo de C2_6, arilo, heterocicloalquilo, N(R3)2, OR3, halógeno, N3, CN, alquilen (Cx-s) -arilo, alquilen (C?_6) -N (R3) 2, C(0)R3, C(0)OR3, C(0)N(R3)2, N(Ra)C(0)R3, N (R1) C (O) OR3, y Alquilen R6 es -C=C-R7 o heteroarilo; R7 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidro, alquilo de C?_6, arilo, alquilen (Ci-e) -arilo, heteroarilo, alquilen (C?_6) -heteroarilo, y alcoxi; R8, R9, y R10, de manera independiente, se seleccionan a partir del grupo que consiste de halógeno, alquilo de C?_6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2_6, alquinilo de C2_6, OCF3, CF3, N02, CN, NC, N(R3)2, OR3, C02R3, C(0)N(R3)2, C(0)R3, NÍR^COR3, N (R1) C (O) OR3, N (R8) C (O) OR3, N(RX)C (O) -alquilen (C?_3)-C (O) R3, N (R1) C (O) -alquilen (C?_3) - C (O) OR3, N (R1) C (O) -alquilen (d_3) -OR3, N (R1) C (O) -alquilen (C1-3) - NHC(0)OR3, N(R1)C(0) -alquilen (C?_3)-S02NR3, alquilen (C?_3) - OR3, y SR3; y una sal, o profármaco, o solvato del mismo 5 farmacéuticamente aceptable. 2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque X1 y X2 son -N(H)-; Y es 0 ó S; y 10 W es heteroarilo que contiene por lo menos dos heteroátomos que se seleccionan a partir del grupo que consiste de N, O, y S, dicho anillo está opcionalmente sustituido con uno a cuatro sustituyentes que se seleccionan a partir del grupo que consiste de alquilo de 15. C?-6, arilo, heteroarilo, N(R3)2, OR3, C(0)N(R3)2, C02R3, CN, y halógeno. 3. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque W se selecciona a partir del grupo que consiste de piridazinilo, 20 pirimidinilo, pirazinilo, y triazinilo, opcionalmente sustituidos con uno a cuatro sustituyentes que se seleccionan a partir del grupo que consiste de alquilo de C?_6 opcionalmente sustituido, arilo, N(R3)2, OR3, C(0)0R3, C(0)N(R3)2, y halógeno. 25 4. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque W se selecciona a partir del grupo que consiste de 5. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque W se selecciona a partir del grupo que consiste de 6.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque W es pirazinilo. 1 . - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R7 es heteroarilo. 8. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque heteroarilo es piridilo. 9.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R6 es heteroarilo que se selecciona a partir del grupo que consiste de 10.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque heteroarilo está sustituido con alquilen (C?_3) -N (R4) 2. 11.- Una composición que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 12.- Un compuesto que se selecciona a partir del grupo que consiste de: 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (5-metil-2-piridin-3-iletinil-fenil) -urea; 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (5-metil~ 2-piridin-3-il-fenil) -urea; 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (5-metil-2-piridin-4-il-fenil) -urea; 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (2-oxazol-5-il-fenil) -urea; 1- (5-metil-pirazin-2-il) -3- (5-metil-2-tiazol-2-il-fenil) -urea; 1- [2- (4-dimetil-aminometil-tiazol-2-il) -5-metil-fenil] -3- (5-metil-pirazin-2-il) -urea, y mezclas de los mismos. 13.- Un método para inhibir la cinasa 1 de punto de comprobación en una célula que comprende un paso de poner en contacto una célula con una cantidad efectiva de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1. 14.- Un método para sensibilizar células en un individuo sometido a tratamiento quimioterapéutico o radio-terapéutico para una condición médica, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 en combinación con un agente quimioterapéutico, un agente radio-terapéutico, o una mezcla de los mismos. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, que comprende también administrar uno o más de citocina, linfocina, factor de crecimiento, u otro factor hematopoyético. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el agente quimioterapéutico se selecciona a partir del grupo que consiste de un agente alquilante, un antimetabolito, una hormona o antagonista de la misma, un radioisótopo, un anticuerpo, y mezclas de los mismos. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el agente radio-terapéutico se selecciona a partir del grupo que consiste de radiación gamma, radiación de rayos X, luz ultravioleta, luz visible, radiación infrarroja, y radiación de microondas . 18.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la condición es un cáncer que se selecciona a partir del grupo que consiste de un cáncer colorrectal, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer pancreático, un cáncer de tejido mamario, un cáncer gástrico, un cáncer de vejiga, un cáncer de la vulva, una leucemia, un linfoma, un melanoma, un carcinoma de célula renal, un cáncer de ovario, un tumor de cerebro, un osteosarcoma, y un carcinoma de pulmón. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la condición es un cáncer que se selecciona a partir del grupo que consiste de carcinomas de célula mixoide y redonda, un tumor localmente avanzado, cáncer metastásico, sarcoma de Ewing, una metástasis de cáncer, una metástasis linfática, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula escamosa del esófago, carcinoma oral, mieloma múltiple, leucemia linfocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia de célula pilosa, linfomas de efusión (linfomas basados en cavidad corporal) , linfoma del timo, cáncer de pulmón, carcinoma de célula pequeña, linfoma de célula T cutáneo, linfoma de Hodgkin, linfoma de tipo no Hodgkin, cáncer de la corteza adrenal, tumores productores de ACTH, cánceres de célula no pequeña, cáncer de tejido mamario, carcinoma de célula pequeña, carcinoma de ducto, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, pólipos asociados con neoplasia colorrectal, cáncer pancreático, cáncer hepático, cáncer de la vejiga, tumores de vejiga superficiales primarios, carcinoma de célula transitoria invasivo de la vejiga, cáncer de la vejiga invasivo de músculo, cáncer de próstata, carcinoma de ovario, neoplasmas epiteliales del peritoneo primarios, carcinoma cervical, cánceres del endometrio uterino, cáncer vaginal, cáncer de la vulva, cáncer uterino y tumores sólidos en el folículo ovárico, cáncer de testículos, cáncer de pene, carcinoma de célula renal, tumores intrínsecos del cerebro, neuroblastoma, tumores de cerebro astrocíticos, gliomas, invasión de célula de tumor metastásico en el sistema nervioso central, osteomas y osteosarcomas, melanoma maligno, progreso de tumor de queratinocitos de piel de humano, cáncer de célula escamosa, cáncer de la tiroides, retinoblastoma, neuroblastoma, efusión peritoneal, efusión pleural maligna, mesotelioma, tumores de Wilms, cáncer de vesícula biliar, neoplasmas trofoblásticos, hemangiopericitoma, y sarcoma de Kaposi. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el tratamiento se administra para una condición inflamatoria que se selecciona a partir del grupo que consiste de artritis reumatoide, psoriasis, vitíligo, granulomatosis de Wegener, y lupus eritematoso sistémico. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el agente quimioterapéutico comprende gemcitabina, pemetrexed, cisplatina, carboplatina, paclitaxel, o mezclas de los mismos. 22.- Un método para inhibir proliferación celular aberrante que comprende poner en contacto una población de células que comprende células que proliferan de manera aberrante con un activador de Chkl para sincronizar sustancialmente la detención del ciclo celular entre dichas células que proliferan de manera aberrante, y posteriormente poner en contacto dicha población de células con un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 para abrogar sustancialmente dicha detención del ciclo celular. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dicho activador de Chkl comprende por lo menos un agente quimioterapéutico. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dicho activador de Chkl comprende radiación ionizante o ultravioleta. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dicha radiación ionizante se administra en conjunto con un radio-sensibilizador, un foto-sensibilizador, o una mezcla de los mismos. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dichas células que proliferan de manera aberrante no son cancerosas. 27.- El uso de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 para la fabricación del medicamento para 1 1 inhibir la cinasa 1 de punto de comprobación. 28.- El uso de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para sensibilizar las células en un individuo sometido a tratamiento quimioterapéutico o radio-terapéutico para una indicación médica. 29.- El uso de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación celular aberrante en una población de células que comprende células que proliferan de manera aberrante. 30.- El uso de un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento en una célula para el tratamiento curativo o profiláctico de una condición en la cual la inhibición de la cinasa 1 de punto de comprobación es de beneficio terapéutico. 31.- Un artículo de fabricación para uso farmacéutico en humanos que comprende: (a) una composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1; (b) un inserto de material de empaque que informa que la composición es útil en el tratamiento de indicaciones que implican proliferación celular aberrante; y, (c) un contenedor opcional. 32.- Un artículo de fabricación para uso farmacéutico en humanos que comprende : (a) una composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1; (b) un inserto de material de empaque que informa que la composición es útil como un quimio-sensibilizador o radio-sensibilizador en un tratamiento de una indicación relacionada con lesiones al ADN o replicación de ADN; y, (c) un contenedor opcional.
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