KR970002165B1 - Preparation and uses of ñò-interferon - Google Patents

Abstract

내용없음.None.

Description

γ-인터페론의 제조방법과 그 용도Method for preparing γ-interferon and its use

제1도는 HBL-38 세포의 위상차 현미경 사진.1 is a phase contrast micrograph of HBL-38 cells.

제2도는 HBL-38 세포의 핵형(核型)분석 결과를 나타낸 사진.Figure 2 is a photograph showing the karyotype analysis of HBL-38 cells.

본 발명은 γ-인터페론의 제조방법과 그 용도에 관한 것이며, 더욱 상세히 발하면 인체로 부터 연유하는 배양주화(培養株化)된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계(骨髓單球系) 세포(myelomonocyte-cell)를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜 이것을 채취함을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법, 이 γ-인터페론을 항원으로 한 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법, 이 모노클로날 항체에 의한 γ-인터페론의 정제방법, 및 이 γ-인터페론을 유효 성분으로 함유한 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제에 관한 것이다.The present invention relates to a method for preparing γ-interferon and its use, and more specifically, to a bone marrow monocyte cell having a cultured γ-interferon-producing ability derived from the human body. A method for producing γ-interferon, characterized in that the production and accumulation of γ-interferon using a myelomonocyte-cell), a method for producing an anti-γ-interferon monoclonal antibody using the γ-interferon as an antigen, A method for purifying γ-interferon by a monoclonal antibody, and a prophylactic and therapeutic agent for γ-interferon sensitive disease containing the γ-interferon as an active ingredient.

인터페론은 일본국의 고바야시 시게야스(小林茂保)저 「인터페론」(1975년, 일본국 株式會社 講談社 발행), D. A. J. Tyrrel 저「Interferon and Its Clinical Potential」(1976년, William Heinemann Medical Books Ltd.(London)발행), 및 「단백질, 핵산, 및 효소, Vol.21, No. 4」(1976년)등에 기재되어 있는 바와 같이, 예컨대 비루스, 세균, 원충, 리켓치아, 핵산, 엔도톡신, 다당류 등의 인터페론 유발물질(inducer)을 생세포에 작용시킴에 따라서, 그 세포내외에서 유발생성되는 당단백질로서, 그 세포내에서의 각종 비루스의 증식을 일반적으로 억제하는 기능을 가진 물질에 부여된 명칭이다.Interferon was published by Kobayashi Shigeyasu of Japan, Interferon (1975), published by Nippon Seiki Co., Ltd., and Interferon and Its Clinical Potential by DAJ Tyrrel (1976, William Heinemann Medical Books Ltd. (London). ), And "proteins, nucleic acids, and enzymes, Vol. 21, No. As described in 4 " (1976) and the like, interferon inducers such as viruses, bacteria, protozoa, rickettsia, nucleic acids, endotoxins, and polysaccharides act on living cells, thereby causing induction in and out of the cells. The glycoprotein is a name given to a substance having a function of generally inhibiting the proliferation of various viruses in the cell.

인터페론이 가진 이와 같은 기능으로 부터 인터페론은 그 발견 당초부터 부루스성 질환의 예방제와 치료제로서 기대되어 왔다. 또, 근년에 와서 인터페론은 비루성 종양 뿐만 아니라 비루스성 종야에 대하여도 항종양성이 있음이 밝혀져 의약품으로서의 인터페론은 큰 기대를 하기에 이르렀다.Due to the function of interferon, interferon has been expected to be a prophylactic and therapeutic agent for the disease caused from the beginning of its discovery. In recent years, interferon has been shown to be anti-tumor not only for non-irractive tumors but also for virulent nights. Thus, interferon as a medicine has come to have great expectations.

인터페론에는 α-인터페론(별명, 백혈구 인터페론), β-인터페론(별명, 섬유 아세포 인터페론) 및 γ-인터페론(별명, 면역 인터페론, 타입II 인터페론)이 있으며, 이중에서 α-인터페론에 대하여는 백혈구 등으로 부터, 그리고 β-인터페론에 대하여는 섬유 아세포 등으로 부터 제조방법이 각각 확립되어, 최근 이것들을 이용한 의약품이 시판되기에 이르렀다.Interferons include α-interferon (alias, leukocyte interferon), β-interferon (alias, fibroblast interferon) and γ-interferon (alias, immune interferon, type II interferon), among which the α-interferon from leukocytes, etc. For β-interferon, a manufacturing method was established from fibroblasts and the like, and recently, a drug product using these drugs was commercially available.

위에 나온 각각의 인터페론에 대하여는 이후부터 α-IFN, β-IFN 및 γ-IFN의 약자로 표기하기로 하고, Hu가 붙은 것은 인간 유래의 것을 뜻한다.Each of the above-mentioned interferons is to be abbreviated as α-IFN, β-IFN and γ-IFN in the following, and the Hu attached means that the human origin.

한편, γ-인터페론에 대하여는 다수의 제조방법이 제안되어 있으나, 어느 것이나 아직 공업적으로 실시하기에는 이르지 못하였다. 예컨대, 일본국 특허 공개 소 57-58891호 공보, 특허 공개 소 59-82092호 공보, 특허 공개 소 60-70099호 공보, 특허 공개 소 60-87300호 공보, 특허 공개 소 60-139700호 공보, 특허 공개 소 60-149600호 공보, 국제 특허 공고 소 57-500961호 및 소 58-502032호 공보 등에서 제안하고 있는 인체 말초 혈로부터 얻은 백혈구 또는 T-임파수를 사용하는 방법은 원료인 세포를 안정적으로 대량으로 공급하는 것이 곤란하고, 또 이들 세포의 HuIFN 생성량도 불충분하다.On the other hand, a number of production methods have been proposed for γ-interferon, but none have yet been industrially implemented. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-58891, Patent Publication No. 59-82092, Patent Publication No. 60-70099, Patent Publication No. 60-87300, Patent Publication No. 60-139700, Patent The method of using leukocytes or T-lymphocytes obtained from human peripheral blood proposed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-149600, International Patent Publication No. 57-500961, and Japanese Patent No. 58-502032, etc. reliably provides a large amount of cells as a raw material. It is difficult to supply the phosphate, and the amount of HuIFN produced by these cells is also insufficient.

또한, 일본국 특허 공개 소 55-98119호 공보에서 제안되어 있는 방법은 배양주화된 인체 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나 인간 이외의 온혈동물의 체내 또는 체외에 부착한 확산 챔버내에서 세포를 이식하여 그 온혈동물의 영양체액을 공급하면서 세포를 증식시켜 수득한 인체 세포를 사용하여 γ-인터페론을 제조하는 방법인데, 원료인 인체 세포를 대량으로 안정하게 공급할 수 있다는 점에 특징이 있다.In addition, the method proposed in Japanese Patent Laid-Open No. 55-98119 discloses that a cultured human cell is transplanted into a body of a warm blooded animal other than human, or in a diffusion chamber attached to a body of a warm blooded animal other than human or in vitro. A method of producing γ-interferon using human cells obtained by proliferating cells while supplying nutrient fluid of the warm-blooded animal by transplanting the cells, which is characterized in that it can stably supply a large amount of human cells as raw materials. .

그러나, 이 방법에 있어서는 배양주화된 인체 세포의 종류에 따라 γ-HuIFN 생성능(生成能)에 변동이 있음을 판명하였고, 따라서 안정하게 고활성 γ-HuIFN을 제조하려면 더욱 개량할 필요가 있으므로 아직 공업적으로 실시에 이르지 못하였다.However, in this method, it has been found that there is a variation in γ-HuIFN production ability depending on the type of cultured human cells, and thus it is still necessary to further improve the production of highly active γ-HuIFN. As a result, the implementation did not reach.

γ-HuIFN은 세포 증식 억제 작용과 항종양 작용이 α-HuIFN 및 β-HuIFN보다도 현저히 강하고, 또 α-HuIFN 및/ 또는 β-HuIFN등과 병용함에 따라 α-HuIFN의 항비루스 작용, 세포 증식 억제 작용, 항종양 작용등을 강화하는 것이 알려져 있다. 이러한 이유로 해서 그 공업적 제조 방법의 확립이 강하게 기대되고 있다.γ-HuIFN is significantly stronger than α-HuIFN and β-HuIFN in anti-tumor activity and anti-tumor activity, and in combination with α-HuIFN and / or β-HuIFN, anti-virus action and anti-cell activity of α-HuIFN It is known to enhance antitumor activity. For this reason, the establishment of the industrial production method is strongly expected.

본 발명자등은 공업적 규모로 용이하게 실시할 수 있는 γ-인터페론의 제조방법을 확립하는 것을 목적으로 배양주화된 각종 인체 연유의 세포, 특히 배양주화된 각종의 인체 연유의 임파구성(Iymphoblastoid)세포의 γ-인터페론 생성능에 대하여 비교 연구를 계속하고, 나아가서 이 γ-인터페론이 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제로서 유용한지 아닌지를 예의 연구하였다.The inventors of the present invention have established a method for producing γ-interferon that can be easily carried out on an industrial scale. Cells of cultured human condensed milk, in particular, lymphocytes of various cultured human condensed milk Comparative studies were conducted on the ability of γ-interferon to be generated, and further studies were conducted on whether or not this γ-interferon was useful as a prophylactic and therapeutic agent for γ-interferon-sensitive diseases.

그 결과, 이외에도 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포가 기타 임파구성 세포와는 달리 높은 γ-인터페론 생성능을 가지며, γ-인터페론 제조용 세포로서 가장 적합하다는 것을 발견하였으며, 나아가서 그 골수 단구계 세포로 부터 수득한 γ-인터페론이 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제, 치료제로서 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.As a result, it was found that cultured bone marrow monocyte cells derived from the human body have high γ-interferon production ability and are most suitable as cells for producing γ-interferon, unlike other lymphocytic cells. It was confirmed that γ-interferon obtained from cells is excellent as a prophylactic and therapeutic agent for γ-interferon-sensitive diseases, and completed the present invention.

본 발명에서 말하는 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포라 함은, 일본국의 이와나미서점 발생, 기시모도 다다미쓰, 와다나베 다께시편, 「이와나미 고오쟈 면역 과학 3, 면역 반응 세포」제181-204 페이지(일본국 소와 61년) 및 Mikio Shikita 및 Isao Yamane 저「Mammalian Cell Culture Technology」제 141-162 페이지, 1985년, Soft Science Publications, Tokyo, Japan등에 기재되어 있는 바와 같이 T-세포와 B-세포에 속하지 않는 세포로서 항원 항체 반응에 따라 골수 단구계 항원(Myelomonocyteantigen)의 존재를 체크함으로써 확인되는(identifiable) 세포를 뜻한다.Cultured bone marrow monocyte cells derived from the human body referred to in the present invention include the development of Iwanami Bookstore, Tadashi Kishimado, and Tadashi Wadabe specimens, `` Iwanami Koja Immune Science 3, Immune Response Cells ''. As described in pages 181-204 (Japanese cattle year 61) and Mikio Shikita and Isao Yamane, pages 141-162, Mammalian Cell Culture Technology, 1985, Soft Science Publications, Tokyo, Japan, etc. Cells which do not belong to cells and B-cells are cells identified by checking the presence of Myelomonocyte Antigen according to the antigen antibody response.

이러한 골수 단구계 세포의 예로서 본 발명자들이 확립한 HBL-38 세포, 전술한 인용문헌에 기재되어 있는 HL-60, KG-1, ML-1, ML-2, MML-3, THP-1, U-937등의 세포 및 Japanese Journal of Cancer Research(Gann) Vol. 75, 제 660-664 페이지(1984년)에서 보고되어 있는 CTV-1 등을 적당히 이용할 수 있다. 특히, HBL-38[본 출원인인 주식회사 林原生物化學硏究所의 藤崎細胞[일본국 岡山市藤崎 675-1 소재)에서 1985년 6월 18일 이래 현재까지 상기 세포의 보관, 관리 및 분양을 하고 있음]의 γ-인터페론 생성능은 높아서, 본 발명의 실시예 가장 유리하게 이용할 수 있었다.Examples of such bone marrow monocyte cells include HBL-38 cells established by the present inventors, HL-60, KG-1, ML-1, ML-2, MML-3, THP-1, U-937 et al. And Japanese Journal of Cancer Research (Gann) Vol. CTV-1 and the like reported in 75, pages 660-664 (1984) can be used as appropriate. In particular, HBL-38 (Shizo, Inc., 675-1, Okayama City, Japan) has stored, managed and distributed the cells since June 18, 1985. [Gamma] -interferon generating ability is high, and the embodiment of the present invention was most advantageously used.

또한, 이들 세포의 γ-인터페론 생성능을 가진 유전자를 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 센다이 비루스등을 이용하는 세포 융합의 수단이나 DNA 리가아제(ligase), 제한효소(누클레아제), DNA 폴리머라아제 등의 효소를 이용하는 공지의 유전자 재조합 수단등에 의하여, 더욱 용이하게 대를 이어 배양할 수 있는 배양 주화된 세포에 도입하여 그 증식속도와 γ-인터페론 생성능을 더욱 높이는 것도 유리하게 실시할 수 있다.In addition, genes having γ-interferon-generating ability of these cells, such as polyethylene glycol or Sendai virus, can be used for cell fusion, enzymes such as DNA ligase, restriction enzyme (nuclease), DNA polymerase, and the like. By using known gene recombination means or the like, it is also advantageous to introduce into cultured cultured cells that can be cultured more easily and easily to increase its proliferation rate and γ-interferon production ability.

본 발명에서 사용하는 인체로 부터 연유하는 배양주화된 공수 단구계 세포를 증식시키는 방법은 적당히 선택할 수 있다. 예컨대, γ-인터페론 생성능을 가진 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 영양배지에 접종하여 생체밖에서 증식시키는 조직 배양법이나, γ-인터페론 생성능을 가진 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나 인간 이외의 온혈동물의 체내 또는 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 인간 이외의 온혈동물의 영양체액의 공급을 받으면서 생체내에서 증식시키는 방법등이 있다.The method for proliferating cultured cultured airborne monocyte cells derived from the human body used in the present invention can be appropriately selected. For example, a tissue culture method of inoculating bone marrow monocyte cells derived from a human body having γ-interferon production ability into a nutrient medium to proliferate in vitro, or bone marrow monocyte cells derived from a human body having γ-interferon production ability other than humans. There is a method of implanting in a body of a warm-blooded animal or in a diffusion chamber attached to or in a body of a non-human warm-blooded animal and growing in vivo while receiving a nutrient solution of a warm-blooded animal other than a human.

먼저, 생체 밖에서 증식시키는 경우에 대하여 설명한다.First, the case of proliferation outside the living body will be described.

이때 사용하는 영양배지는 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 접종하여 증식할 수 있는 것이면 좋으며, 예컨대 RPMI 1640 배지, 이이글 최소 기본 배지(Eagle's minimal essential medium)등이 있는데, 필요에 따라서 다시 비타민, 미네랄, 탄소화물, 아미노산 및/또는 포유류의 혈청등을 보충하여 개량할 수도 있다.At this time, the nutrient medium to be used should be capable of proliferating by inoculating bone marrow monocyte cells derived from the human body, for example, RPMI 1640 medium, Eagle's minimal essential medium, etc. And minerals, carbohydrates, amino acids and / or mammalian serum.

배양 방법은 단층 배양법 또는 부유 배양법을 적당히 선택할 수 있다.The culture method can be suitably selected from a single layer culture method or a floating culture method.

배양 온도는 약 20~40℃, 바람직하게는 약 35~38℃이고, 접종량은 접종후 약 1주간에서 최대 세포 발육을 나타낼 수 있는 배지 1ml당의 세포수이어야 하는데, 바람직하게는 배지 1ml당 약 10⁴~10⁷개이다.The incubation temperature is about 20-40 ° C., preferably about 35-38 ° C., and the inoculation amount should be the number of cells per ml of medium capable of exhibiting maximum cell growth for about one week after inoculation, preferably about 10 per ml of medium. ^{4-10 7} atoms.

인체의 골수 단구계 세포를 접종한 배지를 상기한 조건에서 약 4~10일간 배양하고, 배양동안에는 배지를 정기적으로 신선한 것과 교환하여 영양물을 충분히 보급함과 동시에, 배지속에 방출된 대사산물을 세척 및/또는 희석하여 증식시키는 것이 바람직하다.The medium inoculated with human bone marrow monocyte cells is incubated for about 4 to 10 days under the above conditions, and during the incubation, the medium is regularly exchanged with fresh water to sufficiently supply nutrients, and to wash and release metabolites released into the medium. Or by diluting and propagating.

다음에, 생체내에서 세포를 증식시키는 방법에 대하여 설명한다.Next, a method of proliferating cells in vivo is described.

이 방법에서는 γ-인터페론 생성능을 가진 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 그 온혈동물의 영양체액의 공급을 받을 수 있는 챔버내에 수용하여 동물을 통상의 방법으로 사육을 한다면, 온혈동물의 체내로 부터 공급되는 영양물을 함유하는 체액을 이용하여 그 세포가 용이하게 증식할 수 있기 때문에, 시험관내에 있어서의 조직 배양과 같이 값비싼 혈청등을 함유한 영양배지를 사용하지 않더라도, 또는 대폭 절약하여도 대량의 γ-인터페론을 생성시킬 수 있다.In this method, a bone marrow monocyte cell derived from a human body having γ-interferon production ability is transplanted into a body of a warm-blooded animal other than a human, or the animal is housed in a chamber capable of receiving a supply of nutrient fluid of the warm-blooded animal. In the case of breeding by the method, since the cells can be easily proliferated by using the bodily fluid containing the nutrient supplied from the body of a warm-blooded animal, the nutrient containing expensive serum such as tissue culture in vitro A large amount of γ-interferon can be generated even if the medium is not used or a significant saving.

즉, 인간 이외의 온혈동물을 이용하는 방법은 세포 증식중의 유지관리가 용이하다는 것은 물론이고, 시험관내에서 배양하는 경우와 비교하여 세포의 증식이 안정하다는 사실, 또 세포당 γ-인터페론 생성량이 증대한다는 사실, 특히 2~10배 또는 그 이상까지도 증식하므로 극히 유리하다.That is, the method using a warm-blooded animal other than human is not only easy to maintain during cell proliferation, but also more stable in cell proliferation than in culture in vitro, and the amount of γ-interferon produced per cell is increased. In fact, it is extremely advantageous because it multiplies even 2 to 10 times or more.

생체내 증식방법에서 사용하는 인간 이외의 온혈동물은 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포가 증식할 수 있는 것이면 좋은데, 예컨대 닭, 비둘기 등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 모르토르, 쥐, 햄스터(hamster), 보통 마우스, 누드 마우스 등의 포유류 등을 사용할 수 있다.The warm-blooded animals other than humans used in the in vivo proliferation method may be ones that proliferate bone marrow monocyte cells derived from the human body. For example, birds such as chickens and pigeons, dogs, cats, monkeys, goats, pigs, cows, Mammals such as horses, mortors, mice, hamsters, ordinary mice and nude mice can be used.

이들 동물에 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 이식하면 바람직하지 못한 면역 반응을 일으킬염려가 있으므로, 그 반응을 가급적 최소한으로 억제하기 위하여 사용하는 동물은 가급적 어린상태, 즉, 알, 배(胚), 태아 또는 신생기, 유소기의 동물일수록 바람직하다.Implantation of bone marrow monocytes derived from the human body into these animals may cause an undesirable immune response. Therefore, animals used to suppress the reaction to the least possible extent are as young as possible, ie eggs, embryos. ), Fetuses or newborns and cows are preferred.

또, 이들 동물에 예컨대 약 200~600rem 정도의 X 선 혹은 γ선을 조사하던가 또는 항혈청 혹은 면역 억제제 등을 주사하는 등의 사전 처치를 하여 면역 반응을 약하게 하여 이식하여도 좋다.These animals may be transplanted by weakening the immune response, for example, by irradiating X-rays or gamma rays of about 200 to 600rem, or by injecting antisera or immunosuppressants.

사용하는 동물이 누드 마우스인 경우에는 성장한 것이라도 불필요한 면역 반응을 일으킬 우려가 거의 없으므로 이러한 사전 처치를 할 필요도 없이 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 이식하여 급속히 쉽사리 증식할 수 있으므로 특히 매우 편리하다.In the case of a nude mouse, even if it is grown, there is almost no risk of causing an unnecessary immune response. Therefore, it is possible to rapidly grow by transplanting cultured bone marrow monocyte cells derived from the human body without the need for such precautions. Especially very convenient.

또, 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 예컨대 먼저, 햄스터에 이식하여 증식시킨 다음, 이 세포를 다시 누드 마우스에 이식하는 등과 같이 하여 인간 이외의 동종 또는 상이한 온혈동물들 사이에서 연속적으로 이식함으로써 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포의 증식을 보다 안정화하기도 하고, 나아가서 그로 부터 유발되는 γ-인터페론 양을 증가시킬 수도 있다. 이 경우, 동종(同種)간, 동속(同屬)간은 물론이고, 동강(同綱)간, 동목(同目)간의 이식이라도 좋다.In addition, cultured bone marrow monocyte cells derived from the human body are continuously grown among allogeneic or different warm-blooded animals other than humans, such as by first transplanting them into hamsters to proliferate the cells and then transplanting them into nude mice. Transplantation may further stabilize the proliferation of myeloid monocyte cells derived from the human body, and further increase the amount of γ-interferon induced therefrom. In this case, transplantation may be performed between the same species and the same velocity, as well as between the same cavity and the same species.

인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포가 증식할 수 있는 부위라면 좋고, 예컨대 뇨액강, 정맥, 복강, 피하 등을 자유로히 선택할 수 있다.The site in the animal body to which the bone marrow monocyte cells derived from the human body are transplanted may be a site where the transplanted cells can proliferate, and for example, urine fluid cavity, vein, abdominal cavity, subcutaneous and the like can be freely selected.

또한, 인체로부터 연유하는 골수 단구계 세포를 직접 동물체내에 이식하는 일이 없이 동물 세포의 통과를 저지할 수 있으나, 인간 이외의 온혈동물로 부터 영양체액을 HBL-38에 공급할 수 있는 적절한 수단, 즉 다공성의 여과막, 예컨대 구멍의 지름이 약 10^-7~10^-5m인 박막 필터, 한외 여과막 또는 유공섬유(hollow fiber)등을 설치한 공지의 각종 형상과 크기의 확산 챔버를 동물체내, 예를 들면 복강내에 매설하여 동물로 부터 영양물을 함유한 체액의 공급을 받으면서, 그 챔버내에서 전술한 인체로 부터 연유하는 배양 주화된 골수 단구계 세포를 어느것이나 증식시킬 수 있다.In addition, it is possible to prevent the passage of animal cells without directly implanting bone marrow monocyte cells derived from the human body, but suitable means for supplying nutrient fluid to HBL-38 from warm-blooded animals other than humans, That is, a porous filtration membrane, such as a thin-film filter having a diameter of about 10 ^-7 to 10 ^-5 m, an ultrafiltration membrane, or a hollow fiber, is provided with a known diffusion chamber having various shapes and sizes in an animal body, for example. For example, the cultured myeloid monocyte cells derived from the human body described above can be expanded in the chamber while being buried in the abdominal cavity and receiving a nutrient-containing body fluid from the animal.

또한, 필요에 따라서 이 챔버내의 영양물을 함유하는 용액을 동물체내의 체액과 접촉하여 흘러들어가도록 한 챔버를, 예컨대 동물 몸체에 부착하고, 인체로부터 연유하는 골수 단구계 세포의 챔버내의 증식상태를 투시할 수 있도록 하는 것도, 또, 이 챔버 부분만을 간헐적으로 착탈 교환할 수 있도록 하여 동물을 도살하지 않고 수명이 다할 때까지 세포를 증식시켜 동물개체당의 세포 생산량을 더욱 높일 수도 있다.Further, if necessary, a chamber is attached to the animal body, for example, to allow the solution containing the nutrients contained in the chamber to flow in contact with the body fluid in the animal body, and to see the proliferation state in the chamber of the bone marrow monocyte cells derived from the human body. In addition, it is also possible to intermittently remove or replace only the chamber portion, thereby proliferating the cells until the end of life without killing the animals, thereby further increasing the cell production per animal individual.

이러한 확산 챔버를 이용하는 방법은 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포가 동물 세포와 직접 접촉하지 않고 또한 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 우려도 극히 적으므로 면역 반응을 억제하는 사전 조치를 할 필요도 없이 각종 온혈동물을 자유로이 이용할 수 있고, 증식 세포를 쉽사리 회수할 수 있는 특징을 가지고 있다.The method of using such a diffusion chamber does not need to take any precautions to suppress the immune response because the bone marrow monocyte cells derived from the human body do not come into direct contact with the animal cells and there is little possibility of causing an undesirable immune response. The warm-blooded animal can be used freely and has the characteristics of easily recovering proliferating cells.

이식한 동물의 유지관리는 그 동물을 통상의 방법으로 사육을 계속하면 되는 것이므로, 이식후라 하더라도 특별한 취급을 전혀 필요로 하지 않으므로 매우 편리하다.The maintenance of the transplanted animal is very convenient because it is necessary to continue breeding the animal in the usual way, and since it does not require any special handling even after the transplantation.

인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 최대한으로 증식시키기 위한 기간은 통상 1~10주의 기간이면 목적을 달성할 수 있다. 이와 같이 수득할 수 있는 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포수는 동물개체당 약 10⁷~10¹²또는 그 이상에 이른다. 바꾸어 말하면, 본 발명에서는 인간 이외의 온혈동물을 이용하는 방법에 따라 인체로 부터 연유하는 이식, 증식된 골수 단구계 세포는 동물개체당 이식한 세포수의 약 10²~10⁷배 또는 그 이상까지도 이르며, 생체밖의 영양배지에 접종하여 증식시켰을 경우의 약10¹~10⁶배 또는 그 이상까지도 도달하므로 γ-인터페론의 제조를 위하여 매우 편리하다.The period for maximizing the proliferation of bone marrow monocyte cells derived from the human body is usually 1 to 10 weeks can achieve the purpose. The bone marrow monocyte cell number derived from the human body thus obtained is about 10 ⁷ to 10 ¹² or more per animal. In other words, in the present invention, according to the method of using a warm-blooded animal other than human, transplanted and proliferated bone marrow monocyte cells derived from the human body may reach about 10 ² to 10 ⁷ times or more than the number of cells transplanted per animal. , It is very convenient for the production of γ-interferon because it reaches up to about 10 ¹ ~ 10 ⁶ times or more when inoculated and propagated in nutrient medium outside the body.

이와 같이 하여 증식시킨 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 생세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성시키는 한에 있어서 어떠한 생성 방법도 본 발명에서 마음대로 이용할 수 있다. 그것을 증식에 사용된 동물체내의 그대로의 상태에서 γ-인터페론 유도체를 작용시킬 수도 있다. 예를 들면, 복강내의 복수의 부유상태로 증식한 인체로부터 연유하는 골수 단구계 세포에 또는 피하에 발생한 종양 세포에 γ-인터페론 유발물질(inducer)을 직접 작용시켜 γ-인터페론의 생성을 유발시키고, 이어서 그 복수 또는 종양으로부터 γ-인터페론을 회수한 다음 정제하면 된다.Any production method can be used freely in the present invention as long as γ-interferon is produced using the bone marrow monocyte living cells derived from the human body thus expanded. The γ-interferon derivative can be acted on as it is in the animal body used for propagation. For example, the production of γ-interferon is induced by directly acting γ-interferon inducer on bone marrow monocyte cells derived from the human body proliferated in a plurality of suspended state in the abdominal cavity or on tumor cells occurring subcutaneously, Then, the γ-interferon may be recovered from the ascites or the tumor, and then purified.

또, 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 동물 체내로 부터 들어내고, 생체밖에서 γ-인터페론 유발물질을 작용시켜서 γ-인터페론을 유발 생성시킬 수도 있다. 예컨대, 복수속에서 증식한 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 수득하고, 또는 피하에 발생한 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 함유하는 종양을 적출(extraction), 분산하여 수득한 세포를 약 20~40℃로 유지한 영양배지에 세포 농도가 약 10⁵~10⁸개 세포/ml가 되도록 부유시키고, 여기에 γ-인터페론 유발물질을 작용시킴에 따라서 γ-인터페론을 유발 생성시켜 이것을 회수하고 정제하면 된다.In addition, bone marrow monocyte cells derived from the human body can be removed from the body of the animal, and γ-interferon-induced production can be induced by acting on the γ-interferon inducer outside of the body. For example, a bone marrow monocytic cell derived from the human body proliferated in the ascites may be obtained, or a cell obtained by extracting and dispersing a tumor containing the bone marrow monocytic cell derived from the human body occurring subcutaneously may be extracted. Suspended in a nutrient medium maintained at 20 ~ 40 ℃ to a cell concentration of about 10 ⁵ ~ 10 ⁸ cells / ml, and by acting on the γ-interferon-producing substance induced by the generation of γ-interferon to recover it You can refine it.

더욱이, 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 확산챔버내에서 증식시켰을 경우에는 증식시킨 세포를 챔버내의 있는 그대로, 또는 챔버로 부터 들어내어 γ-인터페론 유발물질에 작용시켜 γ-인터페론을 유발 생성시킬 수도 있다.In addition, when the bone marrow monocyte cells derived from the human body are grown in the diffusion chamber, the proliferated cells can be lifted as-is or from the chamber and act on the γ-interferon-inducing substance to induce γ-interferon. It may be.

γ-인터페론의 유발생성에 있어서, 필요하다면 예컨대, 인체에 종의 특이성이 높은 인터페론을 이용하여 프라이밍(priming) 처리를 한다던가 대사 저해제(antimetabolite)를 사용하는 과도 유발법(super-induction)등의 공지의 방법을 채용함에 따라서, 생성하는 γ-인터페론 양을 더욱 증가시켜도 좋다.In the generation of γ-interferon, if necessary, for example, priming using an interferon having high species specificity to the human body or super-induction using an antimetabolite. By employing a known method, the amount of γ-interferon to be produced may be further increased.

아래에 나오는 방법들중 한가지 이상을 사용하여 동물개체당 γ-인터페론의 생성량을 증가시킬 수 있다.One or more of the methods listed below can be used to increase the production of γ-interferon per animal.

(1) 인체로 부터 연유하는 증식시킨 골수 단구계 세포를 먼저 동물체내에 있는 그대로의 상태에서 γ-인터페론 유발물질에 작용시킨 다음, 이어서 동일 동물개체의 특정한 부위 또는 전체로 부터 채취한 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 동물체 밖에서 γ-인터페론 유발물질에 작용시켜 γ-인터페론을 유발 생성시키는 방법.(1) The proliferated bone marrow monocyte cells derived from the human body are first acted on the γ-interferon-inducing substance as it is in the animal body, and then from the human body collected from a specific part or whole of the same animal individual. A method of causing the induced myeloid monocyte cells to induce γ-interferon by acting on a γ-interferon inducer outside of the animal.

(2) 한번 γ-인터페론의 유발 생성에 작용시킨 세포를 다시 2번 이상 반복하여 γ-인터페론의 유발물질에 작용시켜 γ-인터페론을 유발 생성시키는 방법.(2) A method of inducing and producing γ-interferon by repeating two or more times the cells once acted on the induced production of γ-interferon by acting on the γ-interferon inducer.

(3) 동물체내에 매설 혹은 접속되는 챔버를 간헐적으로 새 챔버와 교환하여 수득하는 세포수를 증가시키는 방법등의 방법.(3) A method of increasing the number of cells obtained by intermittently replacing a chamber embedded or connected in an animal body with a new chamber.

본 발명에 사용되는 γ-인터페론 유발물질로서 통상 예컨대, 피토헤마 글루티닌, 콘카나발린 A, 아메리카 자리공 유사분열 물질(pokeweed mitogen), 리포폴리삭카라이드, 리피드 A, 엔도톡신, 다당류, 세포 등의 유사분열 물질이 가장 적합하다.As the γ-interferon inducer used in the present invention, for example, phytohema glutinin, concanavalin A, pokeweed mitogen, lipopolysaccharide, lipid A, endotoxin, polysaccharide, cells, etc. Mitotic material is most suitable.

또한, 감작화(感作化)된 세포에 대해서는 항원도 γ-인터페론 유발물질로 작용한다. 이것을 γ-인터페론 유발물질로 사용할 경우에는 통상 약 0.001㎍/ml~10mg/ml의 농도에서 사용된다. 필요하다면, 예컨대 비루스, 핵산, 폴리뉴클레오티드 등의 α-인터페론 유발물질 병용하여 γ-인터페론 양을 더욱 증가시키는 것도 α-인터페론과 γ-인터페론양을 동시에 생성시키는 것도 모두 가능하다.In addition, the antigen also acts as a γ-interferon inducer for sensitized cells. When it is used as a γ-interferon inducer, it is usually used at a concentration of about 0.001 µg / ml to 10 mg / ml. If necessary, it is possible to further increase the amount of γ-interferon by using an α-interferon inducer such as viruses, nucleic acids, polynucleotides, and the like, and simultaneously generate both the amount of α-interferon and γ-interferon.

이와 같이 하여 유발 생성시킨 γ-인터페론은 공지의 정제, 분리법, 예컨대 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축 동결건조 등을 함에 따라서 용이하게 정제 분리하여 채취할 수 있다. 나아가서 고도의 정제를 필요로 하는 경우에는 예컨대 이온 교환체에 의한 흡착 및 탈착, 용출, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 등전점 분획(isoelectric point fractionation), 고속 액체 크로마토그래피, 전기영동 등의 공지의 방법을 다시 조합하는 것이 좋으며, 특히 모노클로날 항체를 이용한 크로마토그래피 등에 따라 최고 순도의 γ-인터페론을 채취하는 것도 가능하다. 이와 같이 하여 수득한 γ-인터페론은 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제, 치료제등으로서 유리하게 이용할 수 있다.Thus induced γ-interferon can be easily purified and collected by known purification, separation methods such as salting out, dialysis, filtration, centrifugation, concentrated lyophilization and the like. Furthermore, when a high degree of purification is required, known methods such as adsorption and desorption by ion exchangers, elution, gel filtration, affinity chromatography, isoelectric point fractionation, high performance liquid chromatography, electrophoresis, etc. It is better to recombine with each other, and it is also possible to collect the highest purity (gamma) -interferon especially by chromatography using a monoclonal antibody. The γ-interferon thus obtained can be advantageously used as a prophylactic or therapeutic agent for γ-interferon-sensitive diseases.

γ-인터페론 감수성 질환이라 함은 γ-인터페론에 의하여 예방되거나 치료되는 질환인데, 그것이 비루스성 질환, 예컨대 유행성 결막염, 헤르페스성 각막염, 인플루엔자, 풍진, 혈청 간염, 에이즈(AIDS)등과, 비비루스성 질환, 예컨대 대장암, 폐암, 간암, 골육종 등의 악성 종양을 비롯하여 과민성 알레르기, 중증 근무력증, 교원병(膠原病), 악성 빈혈, 관절 류머티스, 전신성 홍반(erythematisus)등의 면역질환 등이라도 좋다.γ-interferon-sensitive diseases are diseases that are prevented or treated by γ-interferon, which are non-viral diseases such as epidemic conjunctivitis, herpetic keratitis, influenza, rubella, serum hepatitis, AIDS, and the like, and non-viral diseases. For example, malignant tumors such as colorectal cancer, lung cancer, liver cancer, osteosarcoma, and immune diseases such as irritable allergy, myasthenia gravis, collagen disease, pernicious anemia, rheumatoid arthritis, and systemic erythematisus may be used.

γ-인터페론 감수성 질환 예방제 또는 치료제는 그 목적에 따라서 그 형상을 자유로이 선택할 수 있다. 그 한가지 예를 들면, 분무제, 점안제, 양치질제, 주사제 등의 액제, 연고와 같은 페이스트제, 분제, 과립제, 정제 등의 고형제 등이 있다.The γ-interferon sensitive disease prophylactic or therapeutic agent can freely select the shape according to the purpose. Examples thereof include sprays, eye drops, gargles, liquids such as injections, pastes such as ointments, powders, granules, and solids such as tablets.

이러한 예방제 및 치료제에는 γ-인터페론을 통상 그램당 1~10,000,000 단위 정도 함유시키는 것이 좋고, 필요에 따라서 γ-인터페론과 함께 그 밖의 림포카인, 예컨대 α-인터페론, β-인터페론, 종양괴사 인자(TNF), 림포 톡신, 인터로이킨 2(interleukin 2), B 세포 분화인자(differentiating factor)등이나, 또는 기타 천연 또는 합성 화학 치료제 등의 1종 또는 2종 이상을 유효성분으로 함유시켜, 그 예방과 치료효과를 더욱 높이는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 필요하다면 보조제, 증량제, 안정제 등의 1종 또는 2종 이상을 병용하는 것도 뜻대로 할 수 있다.Such prophylactic and therapeutic agents generally contain 1 to 10,000,000 units per gram of γ-interferon, and other lymphokines, such as α-interferon, β-interferon and tumor necrosis factor (TNF), as needed, with γ-interferon. ), Lymphotoxin, interleukin 2, B cell differentiating factor, or other natural or synthetic chemotherapeutic agents, including one or two or more active ingredients, preventing and treating Further enhancing the effect can also be advantageously carried out. In addition, if necessary, it is also possible to use one kind or two or more kinds such as an adjuvant, an extender, and a stabilizer in combination.

이와 같이 하여 제조되는 본 발명의 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제는, 예컨대 항비루스제, 항종양제로서, 또한 항종양성 화학치료제의 항종양 효과 증강제, 악성 종양의 전이 억제, 재발 방지제, 면역 조절제, 면역질환 치료제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.The prophylactic and therapeutic agent of the γ-interferon susceptible disease of the present invention thus prepared is, for example, an antiviral agent, an antitumor agent, and also an antitumor effect enhancer of an antitumor chemotherapeutic agent, an inhibitor of metastasis of a malignant tumor, an anti-relapse agent, an immunity. It can be used advantageously as a modulator, an immune disease therapeutic agent, etc.

인체에 종의 특이성이 높은 인터페론의 활성은 문헌(Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol. 20, No. 6, 제 616-643 페이지, 1975년)에 보고 되어 있는 인체 양막(amnion)으로 부터 연유하는 FL 세포를 사용하여 공지의 플래그(plaque) 반감법으로 측정하였다.The activity of interferon with high species-specificity in humans is derived from human amnion, reported in Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol. 20, No. 6, pages 616-643, 1975. FL cells were measured by known flag half-lives.

더욱이, γ-인터페론의 활성은 항 α-인터페론 항체 및 항 β-인터페론 항체를 공존시켜서 α-인터페론 및 β-인터페론을 중화한 다음 측정하였다.Moreover, the activity of γ-interferon was measured after neutralizing α-interferon and β-interferon by co-existing anti α-interferon antibody and anti β-interferon antibody.

적혈구 응집가는 문헌(J.E. Salk 저, The Journal of Immunology, Vol. 49, 제 87페이지, 1944년)에 공지된 방법에 준하여 측정하였다.Erythrocyte agglutination values were measured according to methods known in J. E. Salk, The Journal of Immunology, Vol. 49, page 87, 1944.

다음에, 본 발명에서 새로이 수립한 골수 단구계 세포 HBL-38에 대하여 설명한다.Next, the bone marrow monocyte cell HBL-38 newly established by this invention is demonstrated.

급성 골수성 백혈병 환자(남성 55세)로 부터의 백혈수 세포를 시험관내에서 영양배지로 배양한 결과, 21일 후에 세포의 증식이 확인되었다.Leukocyte cells from acute myeloid leukemia patients (male 55) were cultured in nutrient medium in vitro and found to proliferate after 21 days.

그것을 대를 이어 배양하고, 이중의 1종류를 안정하게 증식시킴에 성공하여 이것을 HBL-38이라고 명명하였다.It was incubated with a stand and succeeded in stably propagating one of these species and named this HBL-38.

(1) 증식능(1) proliferative capacity

소의 태아 혈청 10v/v%를 가한 RPMI 1640 배지에서의 증식 기능을 측정하였던 바, 배가시간(doubling time)은 약 30시간이었다.The proliferation function was measured in RPMI 1640 medium to which 10v / v% of fetal bovine serum was added. The doubling time was about 30 hours.

(2) 형태(2) form

증식시에 플라스크의 저면에 부착하는 성질을 가지고 있었으나, 부착성이 약하여 곧 떨어졌다. 또, 증식시에 세포 덩어리의 형성도 발견하였으나 강고한 것은 아니어서 가볍게 접촉하였을 때 용이하게 단일 세포로 분산되었다. 이 세포를 위상차 현미경으로 관찰한 결과를 제1도에 나타내었다. 세포의 형태는 약 15㎍의 두께를 가진 거의 원형 형상을 하고 있었다. 김자 염색(Giemsa's stain)을 한 결과, 핵은 원형의 것외에도 불규칙한 분열 형성(lobation)이라거나 분엽핵(karyolbism)의 경향을 나타내고 있음도 확인되었다.It had the property of adhering to the bottom of the flask at the time of propagation, but soon fell due to the poor adhesion. In addition, the formation of cell masses was also found at the time of proliferation, but it was not strong and easily dispersed into single cells when lightly contacted. The results of observing these cells with a phase contrast microscope are shown in FIG. The cell morphology was almost circular in shape with a thickness of about 15 µg. As a result of Giemsa's staining, it was confirmed that the nucleus exhibited a tendency of irregular lobation or karyolbism in addition to the circular one.

(3) 염색체수(3) chromosome number

염색체의 분석에서는 대수 증식기(exponential growth)의 세포를 사용하였다. 염색체수의 빈도 분포를 제1표로 나타내었다.In the analysis of chromosomes, cells of exponential growth were used. The frequency distribution of the number of chromosomes is shown in the first table.

150개의 세포에 대하여 관찰한 결과, 염색체수는 낮은 2배체 영역에서 있었고, 그 최빈도 분포는 염색체수 45본이 가장 많아서 세포는 53개나 되었다. 또 염색체수 44본의 세포도 42개나 확인되었다.As a result of observing 150 cells, the number of chromosomes was in the low diploid region, and the frequency distribution was the highest with 45 chromosomes, with 53 cells. In addition, 42 cells with 44 chromosomes were identified.

(4) 핵형(核形)분석(4) karyotype analysis

핵형 분성의 결과를 제2도에 나타내었다. 세포의 성염색체는 XY이었고 세포 유래원(source)과 일치하였다. 염색체 No. 17의 대응부(counterpart) 및 염색체 No. 18의 전부가 결핍되어 있었다.The results of karyotypic differentiation are shown in FIG. The sex chromosome of the cell was XY and matched the cell source. Chromosome No. 17 counterpart and chromosome no. All 18 were deficient.

염색체 No. 5의 짧은 팔(short arm)(p)과 염색체 No. 12의 팔(q)에 염색체 하나가 각각 삽입되어 있음을 관찰하였다. 또, 동일시할 수 없는 마아커어(marker) 염색체와 염색분체(chromatid)가 각기 1본이 확인되었다.Chromosome No. 5, short arm (p) and chromosome no. It was observed that one chromosome was inserted into arm q of 12. In addition, one unidentifiable marker chromosome and one chromatid were identified.

(5) 세포 표면 형징(5) cell surface molding

각종 세포 표면 항체를 사용하여 HBL-38 세포의 동정(identification)을 한 결과를 제2표에 나타내었다. 염소 적혈구(E), 항체 감작 소적혈구(EA:erythrocyte amboceptor), 인간보체(amboceptor) 감작 소적혈구(EAC)를 사용한 분석에서는, EA에서 10%의 로제테(rosette)형성을 발견하였으나 그 밖의 것은 확인되지 않았다.Table 2 shows the results of the identification of HBL-38 cells using various cell surface antibodies. Analysis using goat erythrocytes (E), antibody sensitized erythrocytes (EA), and human complement amboceptor sensitized erythrocytes (EAC) found 10% rosette formation in EA but nothing else. Not confirmed.

6개의 염소 항인체 항체(anti-human goat antibody)를 사용하여 세포 표면 면역 글로불린을 검출한 결과, HBL-38 세포는 모든 항체에 대하여 음성이었다. 모노클로날 항체를 사용하여 표면 마아커어를 스크리닝 한 결과, 3Al, MCS-2, B3/25, MY-9는 높은 양성율을 나타내었으며, NU-T2, Leu-5, Leu-4, AA-50, BA-2, OKT-1, NU-N1, B2, MO-1, MO-2는 모두 음성이었다.Cell surface immunoglobulins were detected using six anti-human goat antibodies, indicating that HBL-38 cells were negative for all antibodies. Screening of surface markers using monoclonal antibodies showed high positive rates for 3Al, MCS-2, B3 / 25, MY-9, NU-T2, Leu-5, Leu-4, AA- 50, BA-2, OKT-1, NU-N1, B2, MO-1, and MO-2 were all negative.

비루스 마이커어Virus Myker

(주) 수치는 양성 %를 뜻한다.(Note) number means positive%.

(6) EB 비루스 특이 행항원(EBNA)의 검색(6) Search for EB Virus Specific Antigens (EBNA)

EBNA에 대하여는 세포주를 수립한 다음 조기(早期)부처 여러번에 걸쳐 HBL-38 세포를 검색하였으나, 그 결과 HBL-38 세포는 EBNA-음성 이었다.For EBNA, HBL-38 cells were searched for several times in early departments after establishing cell lines. As a result, HBL-38 cells were EBNA-negative.

(7) 연한 한천 배지속에서의 콜로니 형성(7) colony formation in soft agar medium

콜로니 자극 인자(CSF:colony stimulating factor)를 함유한 0.3% 한천 배지속에서의 콜로니 형성에 대하여 HBL-38 세포를 시험하여 배양한지 14일째에 도립 현미경으로 관찰하였던 결과, 골수구 모양(myeloid)의 콜로니 형성 세포가 확인되었다. 그것들의 빈도는 1~2%였다. 콜로니 형성 인자를 가하지 않았을 경우에는 콜로니는 전혀 형성되지 않았다.Colony formation in 0.3% agar medium containing colony stimulating factor (CSF) was observed by inverted microscopy at 14 days after HBL-38 cells were tested and cultured. Colony forming cells were identified. Their frequency was 1-2%. When no colony forming factor was added, no colonies were formed.

이상의 결과로 부터 HBL-38세포는 골수 단구계 세포에 속한다는 것을 판명하였다.From the above results, it was confirmed that HBL-38 cells belong to myeloid monocyte cells.

다음에 γ-인터페론의 제조에 관한 실험 1에 대하여 설명한다.Next, Experiment 1 regarding the production of γ-interferon will be described.

[실험 1][Experiment 1]

인체로 부터 연유하는 배양주화된 각종 임파구성 세포의 γ-인터페론Γ-interferon of various lymphocytic cells cultured from the human body

생성능의 비교Comparison of generation capacity

[실험 1-1][Experiment 1-1]

생체밖에서 증식시킨 세포에 의한 인간 인터페론의 제조Preparation of Human Interferon by Cells Proliferated in Vitro

소 태아 혈청 20v/v%를 보충한 RPMI1640배지(pH7.2)에 인체로 부터 연유하는 배양주화된 각종 세포를 각기 접종하여 37℃에서 통상적인 방법을 따라서 배양하고, 이어서 혈청 첨가하지 않은 RPMI 1640배지(pH7.2)에서 세척한 다음 이 배지로 농도 1×10⁶개 세포/ml가 되도록 현탁하였다.RPMI1640 medium supplemented with fetal bovine serum 20v / v% (pH7.2) was inoculated with various cultured cells derived from the human body and cultured according to a conventional method at 37 ° C, followed by RPMI 1640 without serum addition. After washing in medium (pH 7.2), the medium was suspended to a concentration of 1 × 10 ⁶ cells / ml.

이와 같이 하여 수득한 인체로 부터 연유하는 각종 세포 현탁액 각각에 리포폴리삭카라이드를 1ml당 약 10㎍을 첨가하고 37℃에서 2일간 유지하여 인터페론 생성을 유발시켜 원심분리한 다음, 혈청액 상부를 사용하여 1ml당의 전체 인터페론의 활성 γ-인터페론의 활성을 측정하였다.To each of the various cell suspensions derived from the human body thus obtained, about 10 μg of lipopolysaccharide was added per 1 ml and maintained at 37 ° C. for 2 days to induce the production of interferon, followed by centrifugation. The activity of the total interferon per 1 ml γ-interferon activity was measured.

그 결과는 표 3과 같다.The results are shown in Table 3.

(주) 수치는 인터페론 활성을 뜻하며, ()안의 수치는 γ-인터페론 활성을 뜻한다.Note: Figures indicate interferon activity. Figures in parentheses indicate γ-interferon activity.

표 3의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 인체 연유의 배양주화된 각종 임파구성 세포의 γ-인터페론 생성능을 비교하였던 바, 종래 생산성이 전혀 알려져 있지 않은 골수 단구계 세포로 부터의 생성을 발견하였으며, 또한 그 생성량이 많다는 것을 판명하였다. 특히 HBL-38 세포는 γ-인터페론 생성능이 현저히 높아서 유리하게 이용할 수 있다.As is apparent from the results of Table 3, γ-interferon production ability of various lymphocytes cultured in human condensed milk was compared. As a result, production from myeloid monocyte cells with no known productivity was found. It was found that the amount of production was large. In particular, HBL-38 cells can be advantageously used because of their markedly high ability to produce γ-interferon.

[실험 1-2][Experiment 1-2]

생체내에서 증식시킨 세포에 의한 인터페론의 제조Preparation of Interferon by Cells Proliferated in Vivo

갖태어난 햄스터에 토끼로 부터 공지의 방법에 따라 제조한 항혈청을 미리 주사하여 햄스터의 면역을 약하게 한 다음, 그 피하에 배양주화된 인체 연유의 골수 단구계 세포를 각기 이식한 후, 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다. 피하에 발생한 종양을 적출하여 세절한 다음 트립신 함유의 생리 식염수에 현탁하여 세포를 분산시켰다.Inject the anti-serum prepared in accordance with a known method from rabbits to the hamster in advance to weaken the hamster's immunity, and then implant the bone marrow monocytes of human condensed milk cultured subcutaneously under the subcutaneous cells, and then, in a conventional manner. Breeding for three weeks. Subcutaneous tumors were isolated, cut, and suspended in physiological saline containing trypsin to disperse the cells.

수득한 각각의 세포를 실험1-1과 마찬가지로 현탁액으로 하여 마찬가지로 전체 인터페론의 활성과 γ-인터페론의 활성을 측정하였다.Each obtained cell was used as suspension in the same manner as in Experiment 1-1, and the activities of total interferon and γ-interferon were measured.

그 결과는 표 4에 나와 있다.The results are shown in Table 4.

(주) 수치는 인터페론 활성을 뜻하며, ()안의 수치는 γ-인터페론 활성을 뜻한다.Note: Figures indicate interferon activity. Figures in parentheses indicate γ-interferon activity.

제3표 및 제4표의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 배양주화된 인체 연유의 골수 단구계 세포, 특히 HBL-38 세포는 생체밖에서 증식시킨 세포 보다도 생체내에서 증식시킨 세포의 쪽이 현저하게 높은 γ-인터페론 생성량을 나타낸다는 것을 판명하였다.As is clear from the results of Tables 3 and 4, the cultured human condensed bone marrow monocytes, especially HBL-38 cells, have a significantly higher γ than the cells grown in vitro. It was found to indicate the amount of interferon production.

다음에는 γ-인터페론의 제조예를 실시예A에 따라 설명한다.Next, the example of preparation of (gamma) -interferon is demonstrated according to Example A.

[실시예 A-1]Example A-1

HBL-38 세포를 태아 소 혈청 10v/v%를 보충한 RPMI 1640 배지(pH7.2)에 세포 농도 5×10 /ml가 되도록 접종하였다.Cell concentration 5 × 10 Inoculated to / ml.

그런 다음, 통상의 방법에 따라서 정기적으로 신선한 배지와 교환하면서 37℃에서 배양하고, 이어서 신선한 동일 배지로 세포를 세척하여 이 배지에 농도 2×10 /ml가 되도록 현탁하였다. 여기에 리포폴리삭카라이드를 1ml당 약 10㎍를 첨가하고 37℃에서 2일간 유지하여 인터페론 생성을 유발시켰다. 이것을 원심분리하여 1ml당 약 5,100단위의 γ-인터페론을 함유하는 상청액을 수득하였다.Then, the cells were incubated at 37 ° C. in a regular exchange with fresh medium according to a conventional method, followed by washing the cells with fresh same medium to give a concentration of 2 × 10 in this medium. Suspended to / ml. About 10 μg per ml of lipopolysaccharide was added thereto and maintained at 37 ° C. for 2 days to induce interferon production. This was centrifuged to obtain a supernatant containing about 5,100 units of γ-interferon per ml.

[실시예 A-2]Example A-2

갖태어난 햄스터에 토끼로 부터 공지의 방법에 따라 제조한 항혈청을 미리 주사하고, 햄스터의 면역 반응을 약하게 한 다음, 그 피하에 HBL-38 세포를 이식한 후, 통상의 방법으로 4주간 사육하였다. 피하에 발생한 약 20g의 종양을 적출한 다음 콜라가나아제를 함유하는 생리 식염수에 현탁하여 세포를 분리하였다.The prepared hamster was previously injected with antiserum prepared from a rabbit according to a known method, the immune response of the hamster was weakened, and HBL-38 cells were implanted subcutaneously, and then bred for 4 weeks by a conventional method. About 20 g of tumors generated subcutaneously were extracted and then suspended in physiological saline containing collagenase to separate cells.

이 세포를 이이글의 최소 기본 배지에서 세척한 다음, 같은 조성의 새로운 배지로 세포 농도가 약 2×10 /ml가 되도록 희석하고, 여기에 1ml당 피토헤마글루티닌 200㎍ 및 리피드A 5㎍을 가하고, 37℃에서 2일간 유지하여 인터페론 생성을 유발시켰다.The cells are washed in Eagle's minimal basal medium and then the cell concentration is approximately 2 × 10 with fresh medium of the same composition. Diluted to / ml, 200μg of phytohemagglutinin and 5μg of LipidA per 1ml were added thereto, and maintained at 37 ° C for 2 days to induce interferon production.

이것을 원심분리하여 상청액 1ml당 약 93,000 단위의 γ-인터페론을 수득하였다.This was centrifuged to yield about 93,000 units of γ-interferon per ml of supernatant.

따라서, 햄스터 1마리당 약 183,000,000 단위의 γ-인터페론을 수득할 수 있었다.Thus, about 183,000,000 units of gamma -interferon could be obtained per hamster.

[실시예 A-3]Example A-3

갖태어난 쥐의 정맥에 KG-1 세포를 이식한 다음 통상의 방법으로 4주간 사육하였다.KG-1 cells were transplanted into the veins of the mice, and then bred for 4 weeks in a conventional manner.

피하에 발생한 약 20g의 종양을 적출한 다음 실시예A-2와 마찬가지로 하여 분산시켜 세포 현탄액을 수득하였다. 이 세포 현탁액에 1ml 당 센다이 비루스 약 100적혈구 응집가 및 리포폴리삭카라이드 약 5㎍을 가하고 37℃에서 2일간 유지하여 인터페론 생성을 유발시켰다.About 20 g of the tumor generated subcutaneously was extracted and dispersed in the same manner as in Example A-2 to obtain a cell suspension. To this cell suspension, about 100 erythrocyte aggregates and about 5 µg of lipopolysaccharide were added to 1 ml of the cell suspension and maintained at 37 ° C for 2 days to induce interferon production.

이것을 원심분리하여 상청액 1ml당 약 49,000 단위 γ-인터페론을 수득하였다. 따라서, 쥐 1마리당 약 97,000,000 단위의 γ-인터페론을 수득할 수 있었다.This was centrifuged to yield about 49,000 units of gamma -interferon per ml of supernatant. Thus, about 97,000,000 units of γ-interferon per mouse could be obtained.

[실시예 A-4]Example A-4

구멍의 지름이 약 0.5미크론인 박막 필터를 설치한 내용량 약 10ml의 플라스틱제 원통형 확산 챔버내에 CTV-1 세포를 생리 식염수로 부유시키고, 이 확산 챔버를 성장한 쥐의 복강내에 매설하였다.CTV-1 cells were suspended in physiological saline in a plastic cylindrical diffusion chamber having a volume of about 10 ml with a thin film filter having a diameter of about 0.5 micron, and embedded in the peritoneal cavity of the grown rat.

이 쥐를 통상의 방법으로 4주간 사육한 다음 이 챔버를 들어내었다.The mice were housed for 4 weeks in the usual manner before the chambers were lifted.

이 증식된 세포를 실시예A-1과 마찬가지로 처리하여 인터페론 생성을 유발시켰다. 이것을 원심분리하여 상청액 1ml당 약 41,000 단위의 γ-인터페론을 수득하였다. 따라서 쥐 1마리당 약 78,000,000단위의 γ-인터페론을 수득할 수 있었다.The proliferated cells were treated in the same manner as in Example A-1 to induce interferon production. This was centrifuged to yield γ-interferon of about 41,000 units per ml of supernatant. Thus, about 78,000,000 units of gamma -interferon per mouse could be obtained.

[실시예 A-5]Example A-5

37℃에서 5일간 보존한 닭의 수정란에 HBL-38 세포를 이식한 다음 37℃에서 1주간 관리하였다. 이 수정란을 깨어 증식된 세포를 채취하고, 이 세포를 실시예A-2와 마찬가지로 처리하여 인터페론 생성을 유발시켰다. 이것을 원심분리하여 상청액 1ml당 약 36,000 단위 γ-인터페론을 수득하였다. 따라서, 수정란 10개당 약 60,000,000 단위의 γ-인터페론을 수득할 수 있었다.HBL-38 cells were transplanted into fertilized eggs of chickens stored at 37 ° C. for 5 days and then maintained at 37 ° C. for 1 week. The fertilized egg was harvested to harvest proliferated cells, and the cells were treated in the same manner as in Example A-2 to cause interferon production. This was centrifuged to yield about 36,000 units of gamma -interferon per ml of supernatant. Thus, about 60,000,000 units of γ-interferon per ten fertilized eggs could be obtained.

다음에는 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법과 그것을 이용한 고순도의 γ-인터페론의 정제예를 실시예B에 따라 설명한다.Next, a method for producing an anti- [gamma] -interferon monoclonal antibody and a purification example of high-purity [gamma] -interferon using the same will be described according to Example B.

[실시예 B-1]Example B-1

(1) 부분 정제한 γ-인터페론의 제조(1) Preparation of partially purified γ-interferon

실시예A-2의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 함유하는 용액을 pH 8.5의 0.01M 트리스(Tris) 인산염완충액으로 20시간 투석한 다음, 다시 막여과하여 수득한 여과액을 항 α-인터페론 항체 및 항 β-인터페론 항체를 고정화하고 잇는 항체 칼럼에 가하여 그 비흡착 확분을 채취하였다. 획분을 크로마토포커싱법(chromatofocusing)에 따라 항비루스 활성 획분을 채취하여 농축, 동결 건조함으로써 γ-인터페론을 함유하는 분말을 활성 수율 약 30%로 수득하였다.The solution containing γ-interferon prepared by the method of Example A-2 was dialyzed for 20 hours with 0.01M Tris phosphate buffer solution at pH 8.5, and the filtrate obtained by membrane filtration was again treated with anti α-interferon antibody. And the non-adsorption proliferation was collected by adding to the antibody column to which the anti β-interferon antibody was immobilized. The fractions were subjected to chromatofocusing to obtain antiviral active fractions, concentrated and freeze-dried to obtain a powder containing γ-interferon in an active yield of about 30%.

이 제품의 비활성(specific activity)은 약 10 단위/mg 단백질이었다.The specific activity of this product is about 10 Unit / mg protein.

(2) 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조(2) Preparation of anti γ-interferon monoclonal antibody

위의 실시예B-1(1)의 방법에서 수득한 부분정제 γ-인터페론을 생리 식염수 0.05w/w%의 농도가 되도록 용해하고, 이 용액에 프로인드 완전 보조액(Freund's complete adjuvant)을 같은 양 혼합하여, 이 혼합액 0.2ml를 마우스의 피하에 주사한 다음, 7일후 다시 마찬가지로 주사하여 마우스를 면역하였다. 항체 생성능을 가진 세포를 γ-인터페론 항체를 유발 생성시켜 이 마우스로 부터 비장을 적출하고 세절 분산하여 수득한 비장 세포와 마우스 골수종 세포 P-X63-Ag8(미합중국 Flow Laboratories사 제조)를 혈청을 함유하지 않은 이이글 최소 기본 배지에서 제조한 50w/v%폴리에틸렌 글리콜-1000 함유 용액(pH7.2, 온도 37℃)에 각기 10 /ml의 세포 밀도가 되도록 부유시켰다. 이것을 5분간 유지한 다음 갖 제조한 동일의 기본 배지에서 20배로 희석하고, 이어서 공지의 방법[R. L. Davidson and P. S. Gerald, Somatic Cell Genetics, Vol. 2, No. 2, pp. 175-176(1976년)]에 준하여 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 함유 배양액에서 증식할 수 있는 잡종 세포를 채취하여 클로닝함으로써 이 잡종 세포로 부터 항 γ-인터페론 항체 생성능을 가진 세포를 선택하였다. 수득한 잡종 세포를 마우스 복강내에 1마리당 약 10 개를 이식하여 2주간 사육한 다음 이것을 도살하여 복수, 혈액등의 체액을 모아서 원심분리하고, 그 상청액에 황산 암모늄을 가하여 포화도 30~50%의 침전 획분을 얻었다.The partially purified γ-interferon obtained in the method of Example B-1 (1) above was dissolved to a concentration of 0.05 w / w% of physiological saline, and the Freund's complete adjuvant was added to the solution in the same amount. After mixing, 0.2 ml of the mixed solution was injected subcutaneously, and again after 7 days, the mice were immunized. The spleen cells and mouse myeloma cells P-X63-Ag8 (manufactured by Flow Laboratories of the United States) obtained by inducing and generating the γ-interferon antibody to the antibody having the ability to generate the antibody by extracting and sprinkling the spleen from the mouse do not contain serum. In 50 w / v% polyethylene glycol-1000 containing solution (pH7.2, temperature 37 ° C.) Suspended to a cell density of / ml. This was held for 5 minutes and then diluted 20-fold in the same basal medium prepared with a known method [R. L. Davidson and P. S. Gerald, Somatic Cell Genetics, Vol. 2, No. 2, pp. 175-176 (1976)] to select and clone a hybrid cell that can proliferate in a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine to select a cell having anti-γ-interferon antibody-producing ability from the hybrid cell. It was. The resulting hybrid cells were about 10 per mouse intraperitoneally The dogs were transplanted and reared for two weeks, and then slaughtered, and the bodily fluids such as ascites and blood were collected and centrifuged. Ammonium sulfate was added to the supernatant to obtain a sedimentation fraction having a saturation of 30 to 50%.

이것을 투석하고 다시 이 액을 위의 (1) 방법으로 수득한 γ-인터페론과 시안화 브롬(BrCN)활성화 세파로오스(Sepharose)와 실온하에서 반응시켜서 수득한 고정화 γ-인터페론 겔로 친화성 크로마토그래피를 실행하고, 항 γ-인터페론 항체 획분을 수드하여 투석한 다음 농축하고 동결 건조하여 γ-인터페론의 모노클로날 항체의 분말을 채취하였다.This solution was dialyzed and subjected to affinity chromatography using immobilized γ-interferon gel obtained by reacting the solution with γ-interferon obtained by the above method (1) and bromine cyanide (BrCN) -activated Sepharose at room temperature. Anti-γ-interferon antibody fractions were sown, dialyzed, concentrated, and lyophilized to obtain a powder of monoclonal antibody of γ-interferon.

이 제품은 골수 단구계 세포로 부터 연유하는 인체 인터페론 활성에 대하여 면역학적으로 특이적인 중화 활성을 나타내었다.It has immunologically specific neutralizing activity against human interferon activity derived from myeloid monocytes.

이 모노클로날 항체의 수용액에서의 안정성을 pH7.2에서 30분간 유지하는 조건에서의 잔존 중화 활성의 측정으로 조사한 결과, 60℃에서 80% 이상의 활성이 잔존하였으나, 70℃에서 90% 이상의 활성을 상실하였다. 또한, 4℃에서 16시간 유지하는조건에서는 pH4.0~11.0의 범위에서 안정하였고, ph 2.0에서는 90% 이상의 활성을 상실하였다.The stability of the monoclonal antibody in the aqueous solution was measured by the measurement of the residual neutralization activity at the condition of maintaining pH 7.2 for 30 minutes. As a result, at least 80% of the activity remained at 60 ° C, but at least 90% of the activity was observed at 70 ° C. Lost. In addition, it was stable in the range of pH 4.0 ~ 11.0 in the conditions maintained for 16 hours at 4 ℃, loss of more than 90% in ph 2.0.

더욱이, 이 모노클로날 항체의 성질을 조사한 결과, 2-메르캅토에탄올 존재하에서는 불안정하였으며, 항마우스 면역글로블린 M항체와 특이적인 항원 항체 반응을 나타냄을 판명하였다.Furthermore, the examination of the properties of this monoclonal antibody revealed that it was unstable in the presence of 2-mercaptoethanol and exhibited a specific antigen antibody reaction with anti-mouse immunoglobulin M antibody.

따라서, 이 모노크롤날 항체는 면역글로블린 M급으로 분류되는 항체이다.Therefore, this monoclonal antibody is an antibody classified as an immunoglobulin M class.

(3) 고순도로 정제한 γ-인터페론의 제조(3) Preparation of γ-interferon purified to high purity

위의 실시예B-1 (1)의 방법으로 제조한 부분정제 γ-인터페론을 위의 실시예B-1 (2)의 방법으로 제조한 모노클로날 항체를 고정화한 겔을 사용한 칼럼에서 크로마토그래피를 실시하여 γ-인터페론의 활성 획분을 채취하여 투석하고 농축하여 동결 건조함으로써 약 80%의 수율로 γ-인터페론 함유 고체를 수득하였다. 이 제품은 고순도로 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성 약 1.5×10 단위/mg 단백질이었다.Chromatography of a partially purified γ-interferon prepared by the method of Example B-1 (1) above using a gel immobilized with a monoclonal antibody prepared by the method of Example B-1 (2) above An active fraction of γ-interferon was collected, dialyzed, concentrated and freeze-dried to obtain a γ-interferon-containing solid in a yield of about 80%. This product is highly purified γ-interferon and its inertness is about 1.5 × 10 Unit / mg protein.

[실시예 B-2]Example B-2

(1) 부분 정제한 γ-인터페론의 제조(1) Preparation of partially purified γ-interferon

실시예A-3의 방법으로 제조한 γ-인터페론 함유 용액을 실시예B-1 (1)의 방법에 준하여 부분정제 하여 비활성이 약 10 단위/mg 단백질인 γ-인터페론을 수율 약 20%로 수득하였다.The γ-interferon-containing solution prepared by the method of Example A-3 was partially purified according to the method of Example B-1 (1) to inactivate about 10 Γ-interferon, a unit / mg protein, was obtained with a yield of about 20%.

(2) 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조(2) Preparation of anti γ-interferon monoclonal antibody

실시예B-2 (1)의 방법으로 수득한 부분정제 γ-인터페론을 항원으로 사용한 이외는 실시예B-1 (2)와 마찬가지로 마우스를 면역하여 비장 세포를 수득하였다.Example B-2 A spleen cell was obtained by immunizing mice similarly to Example B-1 (2) except that the partially purified γ-interferon obtained by the method of Example 1 was used as an antigen.

이 비장 세포와 마우스 골수종 세포 P3-NS-1/1-Ag4-1(일본국의 다이닛뽕 세이야꾸 가부시기가이샤 제조)를 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaHPO, 2mM CaCl를 함유하는 염용액에 각기 세포 밀도 10 /ml가 되도록 부유시켜, 여기에 미리 자외선 조사(照射)로 비활성화한 센다이 비루스를 함유하는 전술한 것과 동일한 염용액을 가하여 빙냉하에서 혼합하고, 이 혼합액을 5분후에 37℃의 RPMI 1640배지에서 약 20배로 희석한 다음, 이어서 실시예B-1 (2)와 마찬가지로 처리하여 항 γ-인터페론 항체 생성능을 가진 잡종 세포를 클로닝하였다.The spleen cells and mouse myeloma cells P3-NS-1 / 1-Ag4-1 (manufactured by Dainippon Seiyaku Co., Ltd., Japan) were each added to a salt solution containing 140 mM NaCl, 54 mM KCl, 1 mM NaHPO, and 2 mM CaCl. Cell density 10 / ml was added to the same salt solution as described above containing Sendai virus, which had been previously inactivated by ultraviolet irradiation, and mixed under ice-cooling. The mixed solution was mixed in an RPMI 1640 medium at 37 ° C. after 5 minutes. Diluted 20-fold and then treated in the same manner as in Example B-1 (2) to clone hybrid cells with anti- [gamma] -interferon antibody generating ability.

수득한 잡종 세포를 공지의 방법으로 면역 반응을 약하게 한 생후 7일되는 햄스터의 복강내에 1마리당 약 10 개를 이식하고, 실시예B-1 (2)와 마찬가지로 햄스터를 처리하여 모노클로날 항체를 제조하였다.About 10 per animal intraperitoneally of a 7-day-old hamster, in which the obtained hybrid cell was weakened by a well-known method. Dogs were transplanted and monoclonal antibodies were prepared by treating hamsters in the same manner as in Example B-1 (2).

이 제품은 실시예B-1 (2)에서 제조한 모노클로날 항체와 마찬가지로 γ-인터페론 활성에 대하여 면역학적으로 특이적인 중화 활성을 나타낸다.This product, like the monoclonal antibody prepared in Example B-1 (2), exhibits immunologically specific neutralizing activity for γ-interferon activity.

이 모노클로날 항체의 수용액에서의 안정성을 그 중화 활성의 측정으로 조사한 결과, pH7.2에서 30분간 유지하는 조건에서 60℃에서 80%이상의 활성이 잔존하였으나, 70℃에서는 90% 이상의 활성을 상실하였다. 또, 4℃에서 16시간 유지하는 조건에서 pH2.0~11.0의 범위에서 안정하였다.The stability of the monoclonal antibody in the aqueous solution was examined by the measurement of its neutralizing activity. As a result, at least 80% of the activity remained at 60 ° C under conditions maintained at pH7.2 for 30 minutes, but at least 70% of the activity was lost at 70 ° C. It was. Moreover, it was stable in the range of pH2.0-11.0 on the conditions hold | maintained at 4 degreeC for 16 hours.

더욱이, 이 모노클로날 항체의 성질을 조사한 결과, 2-메르캅토에탄올 존재하에서는 안정하였으며, 항마우스 면역글로블린 G항체와 특이적 항원 항체 반응을 나타내었음을 판명하였다.In addition, examination of the properties of the monoclonal antibody revealed that it was stable in the presence of 2-mercaptoethanol and exhibited a specific antigen antibody reaction with an anti-mouse immunoglobulin G antibody.

따라서, 이 모노클로날 항체는 면역글로블린 G 급으로 분류되는 항체이다.Therefore, this monoclonal antibody is an antibody classified as immunoglobulin G class.

(3) 고순도로 정제한 γ-인터페론의 제조(3) Preparation of γ-interferon purified to high purity

실시예B-2 (1)의 방법으로 제조한 부분 정제 γ-인터페론을 실시예B-2 (2)의 방법으로 제조한 모노클로날 항체를 고정화한 겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 γ-인터페론의 활성 획분을 채취하고, 투석, 농축하여 활성 수율 약 85%의 γ-인터페론 용액을 수득하였다. 이 제품은 고순도로 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성은 약 1.5×10 단위/mg단백질이었다.Example B-2 The column-purified γ-interferon prepared by the method of Example 1 was subjected to column chromatography using a gel to which the monoclonal antibody prepared by the method of Example B-2 (2) was immobilized. An active fraction of interferon was collected, dialyzed, and concentrated to give a γ-interferon solution having an active yield of about 85%. This product is highly purified γ-interferon and its specific activity is about 1.5 × 10 Unit / mg protein.

[실시예 B-3]Example B-3

실시예A-1의 방법으로 수득한 γ-인터페론을 함유하는 상청액을 pH7.2의 0.01M 인산염 완충액을 함유하는 생리식염수도 15시간 투석하고, 다시 막여과하여 수득한 여과액을 실시예B-1 (3)의 방법에 준하여 항체 컬럼에서 정제하고, 농축, 동결, 건조하여 활성 수율 약 75%의 γ-인터페론 함유 고체를 수득하였다. 이 제품은 고순도 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성은 약 1.5×10 단위/mg 단백질이었다.The filtrate obtained by dialysis of the supernatant containing γ-interferon obtained by the method of Example A-1 also with physiological saline containing 0.01 M phosphate buffer at pH 7.2 for 15 hours, and membrane filtration again, Example B- Purification was carried out in an antibody column according to the method of 1 (3), and concentrated, frozen and dried to obtain a γ-interferon-containing solid having an active yield of about 75%. This product is high purity purified γ-interferon, its specific activity is about 1.5 × 10 Unit / mg protein.

[실시예 B-4]Example B-4

실시예A-4의 방법으로 수득한 γ-인터페론을 함유하는 상청액을 실시예B-3의 방법에 준하여 투석, 막여과하여 수득한 여과액을 실시예B-2 (3)의 방법에 준하여 항체 컬럼을 사용하여 정제하고 농축함으로써 활성 수율 약 70%의 γ-인터페론 용액를 수득하였다. 이 제품은 고순도로 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성은 약 1.5×10 단위/mg 단백질이었다.The filtrate obtained by dialysis and membrane filtration of the supernatant containing γ-interferon obtained by the method of Example A-4 was prepared according to the method of Example B-2 (3). Purification and concentration using a column yielded a γ-interferon solution with an active yield of about 70%. This product is highly purified γ-interferon and its specific activity is about 1.5 × 10 Unit / mg protein.

[실시예 B-5]Example B-5

실시예A-5의 방법으로 수득한 γ-인터페론을 함유하는 상청액을 실시예B-3의 방법에 따라서 투석, 막여과하여 수득한 여과액을 실시예B-1 (3)의 방법에 따라서 항체 칼럼을 사용하여 정제하고, 농축, 동결건조하여 활성 수율 약 70%의 γ-인터페론 고체를 수득하였다. 이 제품은 고순도로 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성은 약 1.5×10 단위/mg 단백질이었다.The filtrate obtained by dialysis and membrane filtration of the supernatant containing γ-interferon obtained by the method of Example A-5 according to the method of Example B-3 was subjected to the antibody according to the method of Example B-1 (3). Purification using a column, concentration and lyophilization gave γ-interferon solids with an active yield of about 70%. This product is highly purified γ-interferon and its specific activity is about 1.5 × 10 Unit / mg protein.

다음에는 γ-인터페론을 사용하여 γ-인터페론 감수성 질환의 예방, 치료에 관한 실험2를 설명한다.Next, Experiment 2 regarding the prevention and treatment of γ-interferon-sensitive diseases using γ-interferon will be described.

[실험 2][Experiment 2]

γ-인터페론에 의한 γ-인터페론 감수성 질환의 예방, 치료 시험Prevention and treatment test of γ-interferon sensitive disease by γ-interferon

[실험 2-1][Experiment 2-1]

시험관내에서의 비루스 증식 억제 작용Inhibitory Activity of Virus Proliferation in Vitro

직격 6cm의 접시에서 단층 배양한 인간 태아의 폐의 초대(初代) 배양 세포에 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 0.1, 1.0 또는 10.0 단위를 첨가하여 37℃에서 5% CO가스 세균보육기속에서 20시간 관리한 다음, 여기에 γ-인터페론을 첨가하지 않았을 경우 약 100개의 플래크 형성능을 가진 투여량의 바리셀라 조스터 비루스(수두대상포진(水痘帶狀疱疹)비루스), 또는 인간 사이토메갈로 비루스(사산(死産), 조산원인 비루스)를 첨가함에 따라 새성하는 플래크수를 산출하였다.Γ-interferon prepared by the method of Example B-1 (3) was added to the primary cultured cells of the human fetal lung monolayer cultured in a dish of 6 cm in diameter by adding 0.1, 1.0, or 10.0 units at 5 ° C. After 20 hours in a% CO gas bacterial incubator, a dose of varicella zoster virus (chicken zoster virus) with a dose of about 100 plaques without γ-interferon ), Or human cytomegalovirus (birth birth, a premature birth virus) was added to calculate the number of plaques to form.

비루스 증식 억제 작용은 γ-인터페론에 의한 플래크수 감소율의 크기로 판정하였다.The virus proliferation inhibitory activity was determined by the magnitude of the decrease in the number of plaques caused by γ-interferon.

A:γ-인터페론을 첨가하지 않은 것에서의 플래크수Number of plaques without adding A: γ-interferon

B:γ-인터페론을 첨가한 것에서의 플래크수Number of plaques when B: γ-interferon is added

표 5의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 본 발명에서 사용하는 γ-인터페론은 비루스성 질환을 야기하는 비루스의 증식을 잘 억제하고 있음을 알 수 있다.As apparent from the results of Table 5, it can be seen that the γ-interferon used in the present invention inhibits the proliferation of viruses causing the virus.

[실험 2-2][Experiment 2-2]

γ-인터페론에 의한 악성 종양의 치료Treatment of malignant tumors with γ-interferon

(1) 시험관내에서의 γ-인터페론에 의한 악성 종양 세포 증식 억제 작용(1) Inhibition of malignant tumor cell proliferation by γ-interferon in vitro

소 태아 혈청 15v/v%를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 최종 농도가 5, 50, 500 단위/ml 되도록 첨가하고, 다시 여기에 인체 연유의 악성 종양 세포를 5×10 /ml의 농도가 되도록 접종한 다음 37℃로 보존한 5% CO가스 세균 보육기 속에서 3일간 배양하였다. 대조하기 위하여 100℃에서 30분간 보존하여 미리 비활성화한 같은 양의 γ-인터페론을 동일한 배지에 각기 같은 양이 되도록 첨가하여 마찬가지로 배양하였다. 배양 종료후 공지의 방법[Applied Microbiobogy, Vol. 22, No. 4, pp. 671-677(1971년)]에 따라서 염색제인 중성 적(neutral red)으로 생세포를 염색한 후, 이 염색제를 산성화 에탄올로 용출하였다. 용출액의 540ml에서의 흡광도로 부터 생세포 양을 측정하였다.Γ-interferon prepared by the method of Example B-1 (3) in RPMI 1640 medium containing fetal bovine serum 15v / v% was added so that the final concentration was 5, 50, 500 units / ml 5 × 10 malignant tumor cells of condensed milk Inoculated to a concentration of / ml and then incubated for 3 days in a 5% CO gas bacterial incubator stored at 37 ℃. For comparison, the same amount of γ-interferon, which was previously inactivated by preservation at 100 ° C. for 30 minutes, was added to the same medium so as to be incubated in the same amount. Known methods after incubation [Applied Microbiobogy, Vol. 22, no. 4, pp. 671-677 (1971)], after dyeing the living cells with a neutral red (staining agent), the dye was eluted with acidified ethanol. The viable cell amount was measured from the absorbance at 540 ml of the eluate.

세포 증식 억제율(%)은 다음 식으로 부터 산출하였다.The percentage of cell proliferation inhibition was calculated from the following equation.

A:시험구역의 생세포 양A: Viable cell volume in test area

B:대조구역의 생세포 양B: Viable cell volume in the control zone

측정 결과를 표6에 나타내었다.The measurement results are shown in Table 6.

표 6의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 본 발명에서 사용하는 γ-인터페론은 KB 세포, HEP-2 세포, KATO-II 세포, P-4788 세포 등의 악성 종양 세포의 증식을 현저히 억제하고 있으며, 그 활성 농도도 5~500단위/ml에서 유효하다는 것을 알 수 있다.As apparent from the results of Table 6, the γ-interferon used in the present invention significantly inhibits the proliferation of malignant tumor cells such as KB cells, HEP-2 cells, KATO-II cells, P-4788 cells, and the like. It can be seen that the active concentration is also effective at 5 to 500 units / ml.

(2) 시험관내에서 γ-인터페론에 의한 다른 림포카인 악성 종양(2) other lymphokine malignant tumors by γ-interferon in vitro

증식억제 작용의 증강 효과Enhancing Effect of Growth Inhibition

사용한 림포카인(lymphokine)으로서 γ-인터페론을 5단위/ml,γ-인터페론을 50단위/ml 및 종양 괴사인자(TNF)를 10단위/ml를 사용하였다. 이러한 림포카인은 어느 것이나 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형의 것을 사용하였다.As the used lymphokine, 5 units / ml of γ-interferon, 50 units / ml of γ-interferon and 10 units / ml of tumor necrosis factor (TNF) were used. All of these lymphokines used a natural type derived from lymphocytic cells.

실험 방법은 실험2-2 (1)의 방법에 준하여 실시하여 세포 증식 억제율(%)을 구하였다. 그 결과는 표 7에 나와 있다.Experimental method was carried out according to the method of Experiment 2-2 (1) to determine the cell growth inhibition rate (%). The results are shown in Table 7.

(주) γ-IFN은 천연형 γ-인터페론을, α-IFN은 천연형 α-인터페론을, 그리고, TNF은 천연형 종양 괴사 인자를 뜻한다.(Note) γ-IFN means natural type γ-interferon, α-IFN means natural type α-interferon, and TNF means natural type tumor necrosis factor.

표7의 결과로 부터 명백한 바와같이, γ-인터페론을 병용하면 다른 림포카인이 가진 악성 종양 증식 억제 작용을 현저히 증강하였으며, 그 작용은 γ-인터페론이 가진 그 억제 작용과 상승 효과를 나타내었다.As is apparent from the results of Table 7, the combination of γ-interferon significantly enhanced the inhibitory effect on the growth of malignant tumors of other lymphokines, and its action showed synergistic and inhibitory effects of γ-interferon.

(3) 시험관내에서 γ-인터페론에 의한 화학 요법제의 악성 종양 증식(3) malignant tumor proliferation of chemotherapy with γ-interferon in vitro

억제 작용의 증강 효과Enhancer effect of inhibitory action

실험2-2 (1)의 방법에 준하여 제조한 영양 배지 1ml에 인체로부터 연유하여 악성 종양 세포를 10 개씩 접종하여 1일 배양한 다음, 여기에 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 최종 농도 50 단위 및/또는 화학 요법제를 함유하는 생리 식염수 0.1ml을 첨가하여 37℃에서 2일간 배양하였다. 대조로서 γ-인터페론 및 화학 요법제를 함유하지 않는 생리 식염수를 사용하였다. 배양이 종료한 다음 실험2-2 (1)의 방법에 따라서 세포 증식 억제율(%)을 구하였다.Malignant tumor cells were derived from human body in 1 ml of nutrient medium prepared according to the method of Experiment 2-2 (1). After inoculating the dogs and incubating for 1 day, 37 ° C. was added to the γ-interferon prepared by the method of Example B-1 (3) by adding 0.1 ml of physiological saline containing 50 units of final concentration and / or chemotherapy agent. Incubated for 2 days. As a control, physiological saline without γ-interferon and chemotherapy was used. After the incubation was completed, cell growth inhibition rate (%) was determined according to the method of Experiment 2-2 (1).

더욱이, 화학 요법제의 농도는 배양액 1ml당 염산 니무스틴(ACNU) 1.0×10 g, 플루오로우라실 (5-FU) 1.5×10 g, 독소루비신(ADM) 1.0×10 g, 미토마이신 C(MMC) 2.5×10 g 및 황산 빈크리스틴(VCR) 1.5×10 g으로 하였다. 그 결과 표 8에 나와 있다.Furthermore, the concentration of chemotherapeutic agents was 1.0 × 10 nimustine hydrochloride (ACNU) per 1 ml of culture. g, Fluorouracil (5-FU) 1.5 × 10 g, doxorubicin (ADM) 1.0 × 10 g, mitomycin C (MMC) 2.5 x 10 g and vincristine sulfate (VCR) 1.5 × 10 g was used. The results are shown in Table 8.

(주) -는 첨가하지 않은 것을, +는 첨가한 것을 뜻한다.(Note)-means not added, + means added.

제8표의 결과로 부터 명백한 바와 같이, γ-인터페론은 각종 화학요법제가 가진 악성 종양 증식 억제 작용을 현저히 증강하고, 그 작용은 γ-인터페론이 가진 억제 작용과 상가 효과 또는 상승 효과를 뜻한다.As apparent from the results of Table 8, γ-interferon significantly enhances the malignant tumor proliferation inhibitory effect of various chemotherapeutic agents, and the action indicates an inhibitory effect, an additive effect, or a synergistic effect of γ-interferon.

(4) 생체내에서의 악성 종양 증식 억제 작용(4) inhibiting malignant tumor growth in vivo

BALB/c 연유의 누드 마우스에 인체 유암 조직편을 등부분 피하에 이식하고, 그 종양 체적이 약 200m 가 된 시기로 부터 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 단독으로 또는 이 인터페론과 인체 임파구성 세포로 부터 연유하는 다른 림포카인 및/또는 화학 요법제를 병용하여 생리 식염수에 용해한 상태에서 매일 1회씩 20일간 정맥 주사를 하였다.Human carcinoid tissue was implanted subcutaneously in the back of a nude mouse of BALB / c condensed milk and its tumor volume was about 200m. From the time when the γ-interferon prepared by the method of Example B-1 (3) alone or in combination with this interferon and other lymphokines and / or chemotherapy agents derived from human lymphocytic cells Intravenous injection was performed once daily for 20 days while dissolved in saline.

그런 다음, 누드 마우스를 도살하여 종양의 중량을 측정하였다.Nude mice were then slaughtered to weigh tumors.

더욱이, 대조로서 위와 마찬가지로 생리 식염수를 사용하였다. 그 결과는 표 9에 나타내었다.Furthermore, physiological saline was used as a control as above. The results are shown in Table 9.

※ 위험율 5% 이하에서 대조한 값에 비교하여 추계학적(推計學的)으로 실험치와 이론치와의 차가 있었다.※ There was a difference between the experimental value and the theoretical value in a stochastic comparison with the control value below the 5% risk.

표 9의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 생체내(in vivo)의 시험에 있어서도 γ-인터페론은 악성 종양의 증식을 현저히 억제한다. 또, 그 증식 억제 작용은 다른 림포카인이나 화학 요법제와의 병용에 따라 현저히 증강되어 높은 항종양 효과를 발휘하였다.As is apparent from the results in Table 9, even in the in vivo test, γ-interferon significantly inhibits the proliferation of malignant tumors. In addition, the proliferation inhibitory effect was remarkably enhanced in combination with other lymphokines and chemotherapeutic agents, and exhibited a high antitumor effect.

(5) 급성 독성 시험(5) acute toxicity test

생후 20일 되는 마우스를 사용하여 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론의 급성 독성 시험을 하였다.A 20-day-old mouse was used for acute toxicity testing of γ-interferon prepared by the method of Example B-1 (3).

그 결과, γ-인터페론의 독성은 극히 낮아서 복강내에 주사하였을 때의 LD₅₀는 10⁹단위 이상임을 판명하였다.As a result, the toxicity of γ-interferon was extremely low and the LD ₅₀ at the time of intraperitoneal injection was found to be 10 ⁹ units or more.

다음에는 본 발명의 γ-인터페론을 유효 성분으로 하여 함유시킨 약제의 제조예를 실시예 C에 따라 설명한다.Next, the example of manufacture of the medicine containing γ-interferon of this invention as an active ingredient is demonstrated according to Example C.

[실시예 C-1]Example C-1

액제Liquid

생리 식염수에 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 1ml당 500단위의 비율로 함유시켜서 액제를 제조하였다.A liquid formulation was prepared by containing γ-interferon prepared by the method of Example B-1 (3) in physiological saline at a rate of 500 units per ml.

이 제품은 유행성 결막염이나 인플루엔자 등의 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 분무용, 점안용, 점비용, 양치질용으로 가장 적합하다.This product is most suitable for spraying, eye drop, point cost, and gargle as a prophylactic and therapeutic agent for viral diseases such as epidemic conjunctivitis and influenza.

[실시예 C-2]Example C-2

주사제Injection

생리 식염수에 실시예B-2 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 1ml당 100,000 단위의 비율로 함유시키고, 이것을 무균적으로 여과한 다음, 수득한 여과액을 멸균한 유리 용기에 2ml 씩 취하여 동결 건조하여 뚜껑을 닫은 후 건조 주사제를 수득하였다.Physiological saline contains γ-interferon prepared by the method of Example B-2 (3) at a rate of 100,000 units per ml, and it is filtered aseptically, and the resulting filtrate is 2 ml each in a sterile glass container. Was taken, lyophilized to close the lid and a dry injection was obtained.

이 제품은 실시예C-1의 경우와 마찬가지로 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다. 그리고, 위암, 폐암, 간암, 백혈병 등의 악성 종양의 예방제, 치료제로서, 또한 과민성 알레르기, 악성 빈혈, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 등의 면역 질환의 예방제, 치료제로서도 가장 적합하다.This product can be advantageously used as a prophylactic or therapeutic agent for viral diseases as in the case of Example C-1. It is also most suitable as a prophylactic and therapeutic agent for malignant tumors such as gastric cancer, lung cancer, liver cancer and leukemia, and also as a prophylactic and therapeutic agent for immune diseases such as irritable allergy, pernicious anemia, rheumatoid arthritis and systemic erythema.

더욱이, 멜팔란(melphalan), 메토트렉세이트(methotrexate), 독소루비신 등의 화학 요법제의 항종양 효과 증강제로서 이용하는 것도 매우 적합하다.Moreover, it is also very suitable to be used as an antitumor effect enhancer of chemotherapy agents such as melphalan, methotrexate, doxorubicin and the like.

[실시예 C-3]Example C-3

주사제Injection

생리 식염수 실시예B-3의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 1ml당 10,000단위와 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형 α-인터페론 및 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형 종양 괴사 인자를 1ml당 각각 100,000 단위씩의 비율로 함유시켜, 이것을 무균적으로 여과하고 실시예C-2와 마찬가지로 동결 건조하여 건조 주사제를 수득하였다.Physiological saline The 10,000-per-ml γ-interferon prepared by the method of Example B-3 and the native type α-interferon derived from lymphoid cells and the native type tumor necrosis factor derived from lymphoid cells per ml It was contained at a rate of 100,000 units, which was aseptically filtered and lyophilized as in Example C-2 to obtain a dry injection.

이 제품은 각종 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 가장 적합하다.This product is most suitable as a prophylactic and therapeutic agent for various kinds of viral diseases.

또한, 유방암, 폐암, 간암, 위암, 백혈병 등의 각종 악성 종양의 예방제, 치료제로서, 그리고 과민성 알레르기, 교원병 등의 각종 악성 종양의 예방제, 치료제로서, 그리고 과민성 알레르기, 교원병, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 등의 면역 질환의 예방제, 치료제로서도 가장 적합하다.In addition, as a prophylactic and therapeutic agent for various malignant tumors such as breast cancer, lung cancer, liver cancer, gastric cancer, leukemia, and as a prophylactic and therapeutic agent for various malignant tumors such as irritable allergy and collagen disease, and as a hypersensitivity allergy, collagen disease, rheumatoid arthritis, systemic erythema, etc. It is also most suitable as a prophylactic and therapeutic agent for immune diseases.

더욱이, 테가푸르(tegafur), 미토마이신 C, 황산 빈크리스틴 등의 화학 요법제의 항종양 효과 증강제로서 이용하는 것도 매우 적합하다.Moreover, it is also very suitable to use as an antitumor effect enhancer of chemotherapeutic agents, such as tegafur, mitomycin C, vincristine sulfate.

[실시예 C-4]Example C-4

[연고제][Ointment]

실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론 및 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형 α-인터페론을 통상의 방법에 따라 소량의 유동 파라핀과 함께 혼화한 다음 제품 그램당 γ-인터페론 및 α-인터페론이 각기 50,000단위 및 500,000 단위가 되도록 와셀린을 가하고 혼합하여 연고제를 수득하였다.Example B-1 The γ-interferon prepared by the method of (3) and the native α-interferon derived from lymphocytic cells were mixed with a small amount of floating paraffin according to a conventional method, and then γ-interferon per gram of product. And waselin added and mixed so that α-interferon was 50,000 units and 500,000 units, respectively, to obtain an ointment.

이 제품은 헤르페스, 피부암, 과민성 피부암 등의 각종 피부질환의 예방제, 치료제로서 가장 적합하다.This product is most suitable for the prevention and treatment of various skin diseases such as herpes, skin cancer and irritable skin cancer.

[실시예 C-5]Example C-5

[장용성 정제]Enteric Tablets

통상의 방법에 따라서 전분과 말토오스를 기재로 하여 정제를 제조함에 있어, 실시예B-5의 방법으로 제조한 γ-인터페론 및 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형 종양 괴사 인자를 1정(200mg)당 10,000 단위씩 함유시켜서 정제를 제조하고, 여기에 미틸셀룰로오스 프탈레이트를 피복하여 장용성 정제를 수득하였다.In preparing tablets based on starch and maltose according to a conventional method, one tablet (200 mg) of native tumor necrosis factor derived from γ-interferon and lymphocytic cells prepared by the method of Example B-5 was used. Tablets were prepared by containing 10,000 units per sugar, followed by coating of mytylcellulose phthalate to obtain an enteric tablet.

이 제품은 소장, 대장등에 있어서 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다.This product can be advantageously used as an agent for preventing and treating viral diseases in the small intestine and large intestine.

또한, 대장암, 결장암, 간암 등의 예방제, 치료제로서, 그리고 과민성 알레르기, 중증 근무력증, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 등의 면역 질환의 치료제, 예방제로서도 유리하게 이용할 수 있다.It can also be advantageously used as a prophylactic and therapeutic agent for colorectal cancer, colon cancer, liver cancer and the like, as well as for the treatment and prevention of immune diseases such as irritable allergy, myasthenia gravis, joint rheumatism and systemic erythema.

더욱이, 독소루비신(ADM), 플루오로우라실, 미토마이신 C등의 화학 요법제의 항종양 효과 증강제로서 이용하는 것도 가장 적합하다.Moreover, it is also most suitable to use it as an antitumor effect enhancer of chemotherapeutic agents, such as doxorubicin (ADM), fluorouracil, and mitomycin C.

본문에서 상세히 설명한 바와 같이, 종래의 γ-인터페론은 그 생산량이 불충분하여 공업적으로 제조하는 것은 매우 곤란하였다. 이에 대하여, 본 발명은 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포가 γ-인터페론 생성능이 현저히 크다는 것을 발견하고, 이 세포를 사용하는 γ-인터페론의 대량 제조방법을 확립하였다.As described in detail in the present text, conventional production of gamma -interferon was insufficient and it was very difficult to manufacture industrially. In contrast, the present invention has found that cultured bone marrow monocyte cells derived from the human body have a remarkably large ability of generating γ-interferon and established a method for mass production of γ-interferon using the cells.

또, 이 γ-인터페론을 항원으로 한 모노클로날 항체의 제조방법과 그 항체에 의한 정제방법을 확립하여 수득한 γ-인터페론을 유효 성분으로 함유시켜 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제, 치료제를 완성하였다.In addition, a method for producing a monoclonal antibody using γ-interferon as an antigen and a method for purification by the antibody were established to contain γ-interferon as an active ingredient, thus completing a prophylactic and therapeutic agent for γ-interferon-sensitive diseases. .

이 예방제 및 치료제는 종래 치료가 곤라하였던 비루스성 질환, 악성 종양, 면역 질환 등의 예방제, 치료제로서 현저한 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 산업적 의의는 매우 큰 것이다.This prophylactic and therapeutic agent showed a remarkable effect as a prophylactic and therapeutic agent for non-viral diseases, malignant tumors, immune diseases, etc., which conventional treatments have been used for. Therefore, the industrial significance of the present invention is very large.

Claims (18)

인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜, 이것을 회수함을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법.A method for producing γ-interferon, characterized by producing and accumulating γ-interferon by using bone marrow monocyte cells having cultured γ-interferon producing ability derived from the human body. 제1항에 있어서, 골수 단구계 세포가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내에 혹은 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 그 온혈동물의 체액을 받으면서 증식시켜 수득되는 세포임을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법.The method according to claim 1, wherein the cultured bone marrow monocyte cells from which the bone marrow monocyte cells are derived from the human body are transplanted into a body of a warm blood animal other than human, or are attached to or in a body of a warm blood animal other than human. A method for producing γ-interferon, characterized in that the cell is obtained by transplanting into a chamber and proliferating while receiving the body fluid of the warm-blooded animal. 제1항에 있어서, 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론을 생성 시키는 단계에 있어서 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포에 유발물질을 작용시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법.The method of claim 1, wherein the step of generating a cultured γ-interferon derived from the human body comprises acting a trigger on the bone marrow monocyte cells having the ability to produce cultured γ-interferon derived from the human body. Method for producing γ-interferon characterized in that. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 골수 단구계 세포가 HL-60세포, KG-1 세포, ML-1 세포, ML-2 세포, LM-3 세포, THP-1 세포, U-937 세포 및 CTV-1 세포로 된 군으로 부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법.The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the myeloid monocytic cells are HL-60 cells, KG-1 cells, ML-1 cells, ML-2 cells, LM-3 cells, THP-1 cells, U- A method for producing γ-interferon, characterized in that one kind selected from the group consisting of 937 cells and CTV-1 cells. 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜 이것을 회수하고, 수득한 γ-인터페론을 항원으로 하여 인간 이외의 온혈동물을 면역시켜, 이 동물로 부터 항체 생성 세포를 채취한 다음, 이 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합시키고, 수득한 융합 세포로 부터 항 γ-인터페론 항체 생성능을 가진 잡종 세포를 선택한 후, 이 잡종 세포를 증식시켜서 γ-인터페론에 특이성을 나타내는 모노클로날 항체를 생성시킴을 특징으로 하는 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법.Γ-interferon is produced and accumulated using bone marrow monocyte cells having a cultured γ-interferon-producing ability derived from the human body, and recovered. The obtained γ-interferon is used as an antigen to immunize warm-blooded animals other than humans. The antibody-producing cells were collected from the animals, the antibody-producing cells and myeloma cells were fused, and hybrid cells having anti-γ-interferon antibody-producing ability were selected from the obtained fusion cells, and then the hybrid cells were expanded. A method for producing an anti-γ-interferon monoclonal antibody, characterized in that it produces a monoclonal antibody that exhibits specificity for γ-interferon. 제5항에 있어서, 골수 단구계 세포가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구게 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내에 혹은 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 그 온혈동물의 체액을 받으면서 증식시켜 수득되는 세포임을 특징으로 하는 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법.The method according to claim 5, wherein the cultured bone marrow monocytes from which the bone marrow monocyte cells are derived from the human body are transplanted into a body of a warm-blooded animal other than human, or attached to or in vitro of a warm-blooded animal other than human. A method for producing an anti- [gamma] -interferon monoclonal antibody, which is a cell obtained by transplanting into a chamber and proliferating while receiving the body fluid of the warm-blooded animal. 제5항 또는 제6항에 있어서, 모노클로날 항체가 면역글로불린 G급 또는 면역글로불린 M급임을 특징으로 하는 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법.The method for producing an anti-γ-interferon monoclonal antibody according to claim 5 or 6, wherein the monoclonal antibody is immunoglobulin class G or immunoglobulin class M. 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜, 이것을 γ-인터페론 모노클로날 항체를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 정제함을 특징으로 하는 γ-인터페론의 정제방법.Γ-interferon is produced and accumulated using bone marrow monocyte cells having cultured γ-interferon generating ability derived from the human body, and purified by column chromatography using γ-interferon monoclonal antibody. Method for Purifying γ-Interferon. 제8항에 있어서, 골수 단구계 세포가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내에 혹은 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 그 온혈동물의 체액을 받으면서 증식시켜 수득되는 세포임을 특징으로 하는 γ-인터페론의 정제방법.The method according to claim 8, wherein the cultured bone marrow monocyte cells from which the bone marrow monocyte cells are derived from the human body are transplanted into the body of a warm blood animal other than human, or attached to the body of or in a body of a warm blood animal other than human. A method for purifying γ-interferon, which is a cell obtained by transplanting into a chamber and proliferating while receiving the body fluid of the warm-blooded animal. 제8항 또는 제9항에 있어서, 항 γ-인터페론 모노클로날 항체가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜 이것을 회수하고, 수득한 γ-인터페론을 항원으로 하여 인간 이외의 온혈동물을 면역시켜, 이 동물로 부터 항체 생성 세포를 채취한 다음, 이 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합시키고, 수득한 융합 세포로 부터 항 γ-인터페론 항체 생성능을 가진 잡종 세포를 선택한 후, 이 잡종 세포를 증식시켜서 γ-인터페론에 특이성을 나타내는 모노크롤날 항체를 생성시켜 수득되는 것임을 특징으로 하는 γ-인터페론의 정제방법.The method according to claim 8 or 9, wherein the anti-γ-interferon monoclonal antibody produced and accumulated γ-interferon by using bone marrow monocyte cells having a cultured γ-interferon generating ability derived from the human body The resulting γ-interferon was used as an antigen to immunize warm-blooded animals other than humans, and antibody-producing cells were collected from the animals, and then the antibody-producing cells and myeloma cells were fused, A method for purifying γ-interferon, characterized in that it is obtained by selecting a hybrid cell having a γ-interferon antibody generating ability and then proliferating the hybrid cell to generate a monoclonal antibody exhibiting specificity for γ-interferon. 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성시키고, 생성된 γ-인터페론을 회수하고 정제하여 수득한 γ-인터페론 1~10,000,000단위/g과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유함을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.Γ-interferon 1 ~ 10,000,000 units / g obtained by producing γ-interferon by using bone marrow monocyte cells having cultured γ-interferon producing ability derived from the human body, and recovering and purifying the generated γ-interferon; A prophylactic and therapeutic agent for γ-interferon sensitive disease, characterized by containing a pharmaceutically acceptable carrier. 제11항에 있어서, 골수 단구계 세포가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내에 혹은 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 그 온혈동물의 체액을 받으면서 증식시켜 수득되는 세포임을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.The method according to claim 11, wherein the cultured bone marrow monocyte cells from which the bone marrow monocyte cells are derived from the human body are transplanted into a body of a warm blood animal other than human, or are attached to or in a body of a warm blood animal other than human. A prophylactic and therapeutic agent for γ-interferon sensitive disease, characterized in that the cell is obtained by transplanting into a chamber and proliferating while receiving the body fluid of the warm-blooded animal. 제11항 또는 제12항에 있어서, 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론을 생성시키는 단계에 있어서 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포에 유발물질을 작용시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.The method according to claim 11 or 12, wherein in the step of producing a cultured γ-interferon derived from the human body, the inducing agent acts on the bone marrow monocyte cells having the ability to produce a cultured γ-interferon derived from the human body. Preventing and treating γ-interferon-sensitive disease, characterized in that it comprises a step of. 제11항 또는 제12항에 있어서, 골수 단구계 세포가 HL-60세포, KG-1 세포, ML-1 세포, ML-2 세포, LM-3 세포, THP-1 세포, U-937 세포 및 CTV-1 세포로 된 군으로 부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.The method according to claim 11 or 12, wherein the myeloid monocytic cells are HL-60 cells, KG-1 cells, ML-1 cells, ML-2 cells, LM-3 cells, THP-1 cells, U-937 cells and A prophylactic and therapeutic agent for γ-interferon sensitive disease, characterized in that it is one selected from the group consisting of CTV-1 cells. 제11항 또는 제12항에 있어서, 유효 성분으로 함유되는 γ-인터페론이 항 γ-인터페론 모노클로날항체를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 채취되는 것임을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.The agent for preventing and treating γ-interferon sensitive disease according to claim 11 or 12, wherein the γ-interferon contained as an active ingredient is obtained by purification by column chromatography using an anti-γ-interferon monoclonal antibody. . 제11항 또는 제12항에 있어서, γ-인터페론과 함께 다른 림포카인을 유효 성분으로 함유시킴을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.The agent for preventing and treating γ-interferon sensitive disease according to claim 11 or 12, which contains other lymphokine as an active ingredient together with γ-interferon. 제11항 또는 제12항에 있어서, 림포카인이 γ-인터페론, β-인터페론, 종양 괴사 인자, 림포톡신, 인터로이킨 2, B세포 분화 인자 및 이들의 혼합물로 부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 림포카인임을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.The method according to claim 11 or 12, wherein lymphokine is one or two or more selected from γ-interferon, β-interferon, tumor necrosis factor, lymphotoxin, interleukin 2, B cell differentiation factor and mixtures thereof. A prophylactic and therapeutic agent for gamma -interferon sensitive disease characterized by being lymphokine. 제11항 또는 제12항에 있어서, γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제가 항비루스제, 항종양제, 항종양 효과 증강제 또는 면역 질환 치료제임을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.The agent for preventing and treating γ-interferon sensitive disease according to claim 11 or 12, wherein the prophylactic and therapeutic agent for γ-interferon sensitive disease is an antiviral agent, an antitumor agent, an antitumor effect enhancer or an immune disease therapeutic agent.

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