KR960014622B1 - 폐렴균 배양용 배지 및 폐렴균 협막 다당류 성분의 개선된 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

폐렴균 배양용 배지 및 폐렴균 협막 다당류 성분의 개선된 제조방법

제1도는 탄수화물 첨가에 따른 타입 1의 폐렴균의 본 발명에 따른 변형된 CAT배지에서의 생장곡선을 나타낸 것이다.

제2도는 탄수화물 첨가에 따른 타입 23의 폐렴균의 본 발명에 따른 변형된 CAT 배지에서의 생장곡선을 나타낸 것이다.

제3도는 탄수화물로 첨가에 글루코즈의 양에 따른 타입 1,4 및 23의 폐렴균의 본 발명에 따른 변형된 CAT 배지에서의 다당류생성(P.S)과 생장율(흡광도: O.D.)을 비교하여 나타낸 것이다.

제4도는 금속이온 첨가에 따른 타입 1의 폐렴균의 본 발명에 따르는 변형된 CAT 배지에서의 생장곡선을 나타낸 것이다.

제5도는 아미노산 첨가에 따른 타입 1의 폐렴균의 본 발명에 따르는 변형된 CAT 배지에서의 생장곡선을 나타낸 것이다.

제6도는 통기량의 변화에 따른 타입 1,4 및 23의 폐렴균의 발명에 따르는 변형된 CAT 배지에서의 다당류 생성(P.S.)과 생장율(흡광도: O.D)을 비교하여 나타낸 그래프이다.

제7도는 폐렴균을 BHI 배지 및 본 발명에 따르는 변형된 CAT 배지에서 배양하여 분리한 협막 다당류와 표준혈청의 침강반응을 이중-면역 전기영동 방법에 의해 나타낸 것이다.

본 발명은 폐렴균(Streptococcus pneumoniae)의 배양을 위해 최적화된 배지, 특히 카제인 가수분해물을 함유하는 폐렴균 배양용 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폐렴균을 상기의 최적화된 배지에서 최적화된 조건하에 배양하여 폐렴균 다당류 백신을 다량으로 생성시키는, 폐렴균의 개선된 배양방법에 관한 것이다.

폐렴균(Streptococcus pneumoniae)은 그의 세포벽 외측에 다당류로 구성되어 있는 점액성 협막 구조물을 가지고 있다. 폐렴균의 협막 다당류는 약 80여종의 혈청형을 나타내며, 이 형청형에 따라 폐렴균의 종류가 구분된다. 이러한 협막 다당류를 마우스에게 소량 투여하면 형 특이적으로 항체 면역글로부린을 생성한다. 따라서, 폐렴균의 협막 다당류는 폐렴균의 감염에 대한 면역성을 제공하는 항원으로 작용할 수 있다.

이와 같이 유용한 항원성을 갖는 협막 다당류 성분을 생산하기 위해 선행기술에서는 일반적으로 폐렴균을 혈액배지, 뇌 심장 침출물(Brain Heart Infusion : BHI)배지, 트립신 대두 육즙(trypsin soy broth)배지, 토드 휴이트 육즙(Todd Hewitt Broth) 배지 및 한정배지(defined media)등에서 배양하는 방법을 이용하여 왔다.

그러나 이러한 배지들은 제조방법이 복합하거나 너무 고가일 뿐 아니라, 폐렴균을 이들 배지에서 배양하는 경우에 협막 다당류의 생성 수율도 매우 낮아서 대량 생산에는 바람직하지 못하였다. 예를 들어, BHI 배지를 사용하는 경우에는 폐렴균의 배양은 잘 되지만, 배지의 구성성분으로 고가의 송아지 뇌 침출물 및 소심장 침출물 등을 사용하기 때문에 배지의 제조 원가가 너무 비싸 대량 생산에는 적합하지 못하다. 또한 혈액 배지에는 양이나 말의 혈액을 첨가하여야 하므로 배지의 제조가 매우 까다롭고 원가 역시 비쌀 뿐 아니라 협막 다당류의 생산 수율도 BHI 배지를 사용한 경우에 비해서 현저히 낮으며, 한정배지를 사용한 경우에도 극히 제한된 특정 형태의 폐렴균은 우수한 배양결과를 제공하지만 대부분의 경우에는 BHI 배지에서 배양한 경우에 비해 열등한 결과를 제공하였다.

이에 따라 본 발명자는 상기한 바와 같은 종래의 배지를 사용한 폐렴균 배양시의 단점들을 나타내지 않으면서, 저렴한 배지를 사용하여 폐렴균을 효율적으로 배양함으로써 유용한 항원성 협막 다당류를 대량으로 생산할 수 잇는 방법을 집중적으로 연구하였으며, 그 결과 선행기술에서는 혐기적 조건하에서 협막을 생성하지 않는 폐렴균을 유전자 조작이 용이하도록 배양하는데만 사용되어 왔던 CAT 배지의 구성성분을 일부 변형시켜 수득한 배지가 통기하에서 폐렴균의 생장 및 협막 다당류 생성에 놀라운 효과를 나타냄을 확인하게 되었다. 즉 카제인 가수분해물(casein hydrolysate)을 주성분으로 함유하며 기존의 CAT 배지(탄수화물 함량 : 글루코즈 0.2w/v%)에 비해 탄수화물 함량이 증가된, 변형된 CAT 배지를 폐렴균 배양용 배지로 사용하여 통기하에서 폐렴균을 배양함으로써 상기한 바와 같은 목적을 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 폐렴균의 항원성 협막 다당류를 생산하기 위한 폐렴균의 배양에 최적화된 배지에 관한 것이다. 특히 본 발명은 카제인 가수분해물 내지 0.5 내지 1.5w/v%, 트립톤 0.1 내지 1w/v%, NaCl 0.1 내지 1.5w/v%, 효모추출물 0.1 내지 0.5w/v%, 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.017N 및 탄소공급원 0.8 내지 2.0w/v%를 함유하는 폐렴균 배양용 배지에 관한 것이다.

본 발명의 배지에 첨가할 수 있는 탄소공급원으로는 예를들면 글루코즈, 슈크로즈 및 말토즈와 같은 단당류 또는 이당류의 탄수화물이 있으며, 가장 바람직하게는 글루코즈가 사용된다. 탄소공급원의 첨가량은 배지 조성물의 0.8 내지 2.0w/v%이며, 최적 첨가량은 0.8w/v%이다. 이와 같은 탄소공급원을 첨가한 배지를 사용하여 폐렴균을 배양하면 탄소공급원을 0.8w/v% 미만의 미량으로 첨가하거나, 또는 탄소공급원을 첨가하지 않은 배지를 사용한 경우에 비해 폐렴균의 최대 생장점이 1.5배 이상 증가하며, 최대 생장점에 도달하는 시간도 2배 이상 단축된다.

본 발명의 배지에는 또한 필요에 따라 금속이온 및 아미노산 성분을 포함시킬 수 있다.

본 발명에 따르는 배지에 첨가할 수 있는 적합한 금속이온은 칼슘, 마그네슘 및 구리이다. 이들 금속이온은 바람직하게는 가각 CaCl₂, MgSO₄및 CuSO₄의 형태로 첨가되며, 그의 첨가 농도는 1mM 내지 10mM, 특히 1mM인 것이 바람직하다. 이러한 금속이온을 첨가한 본 발명에 따른 배지에서 폐렴균을 배양하면 금속이온을 함유하지 않는 배지에서 배양한 경우에 비해 폐렴균의 최대 생장점에 도달하는 시간을 2배 이상 단축시킨다.

또한, 본 발명의 배지에는 아미노산 성분을 첨가함으로써 목적하는 협막 다당류의 수율을 2배 이상 증가시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 아미노산에는 아스파라긴, 페닐알라닌, 트레오닌, 시스테인, 이소로이신 또는 메티오닌과 같이 폐렴균의 배양에 악영향을 미치지 않는 아미노산이면 어느 것이나를 첨가할 수 있으나, 협막 다당류 성분의 수율을 고려할때 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 트레오닌을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 이미노산의 첨가시에, 그 사용량은 0.1 내지 1000ppm 농도롤 하는 것이 바람직하다.

폐렴균의 최대 생장점 및 협막 다당류 성분의 수율등과 관련하여 볼때, 본 발명에 따르는 가장 바람직한 폐렴균 배양 배지는 카제인 가수분해물 1w/v%, 트립톤 0.5w/v%, 염화나트륨 0.5w/v%, 효모추출물 0.1w/v%, 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.017N, 글루코즈 0.8w/v%, 황산마그네슘(MgSO₄) 황산구리(CuSO)또는 염화칼슘(CaCl₂) 1mM, 및 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 트레오닌 3mg/L를 함유하는 배지이다.

폐렴균을 본 발명에 따르는 배지에서 배양할 때, 목적하는 효과를 극대화시키기 위해서 배양은 pH 5내지 8에서 진탕하여 통기시키면소 수행할 수 있다.

이러한 조건하에서 수행함으로써 통기를 하지 않고 배양한 경우에 비해 폐렴균의 최대 생장점에는 큰 변화가 없었으나 목적하는 협막 다당류 성분의 생성 수율을 2배 이상 증가시키면서 생산비는 약 35% 이하로 감소시키는 잇점을 얻을 수 있다. 이러한 목적을 위한 통기는 배양물을 일반적으로 대기중에서 바람직하게는 50rpm 이하로 온화하게 진탕함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에 따르는 배지는 다음과 같은 간단한 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 배지는 카제인 가수분해물, 트립톤, 염화나트륨 및 효모추출물을 증류수에 용해시키고 고압멸균시킨 후, 각각 별도로 멸균시킨 인산칼륨(K₂HPO₄)과 탄소공급원 및, 임의로 금속이온 공급원 또는 아미노산 성분을 첨가함으로서 제조할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면 선행기술에서 사용되어 오던 BHI 배지나 혈액배지, 한정배지 등과는 달리 제조가 간단하며 저렴한 배지를 사용하기 때문에 목적하는 폐렴균의 항원성 협막 다당류의 생산원가가 감소될 뿐 아니라, 혐기성 조건이 아닌 통기하에서 배양을 수행하므로 배양조작이 간편하다는 잇점이 제공된다. 또한, 본 발명에 따르는 배양조건 하에서 폐렴균을 배양하면 선행기술에서 가장 우수한 수율을 제공하는 것으로 인정되고 있는 BHI 배지에서 배양한 경우에 비해 더 우수하거나 적어도 동등한 협막 다당류 성분의 수율을 제공한다. 이러한 우수한 수율은 저렴한 배지를 사용하여 간편한 조작에 의해 얻어지는 효과라는 점에서 당해 기술분야에서의 명백한 진보성을 입증하는 것이다.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명된다.

실시예 1

증류수 중에 카제인 가수분해물 1w/v%, 트립톤 0.5w/v%, 염화나트륨 0.5w/v%, 효모추출물 0.1w/v% 및 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.017N을 용해시켜 제조한 배지 100ml를 500ml 삼각플라스크에 넣고 121℃에서 30분간 멸균시킨다. 별도로 탄소공급원으로 글루코즈, 슈크로즈 및 말토즈 각각을 멸균시켜 글루코즈는 0.8w/v%의 농도로(배지 1), 슈크로즈는 2.0w/v%의 농도로(배지 2), 또한 말토즈는 2.0w/v%의 농도로(배지 3)각각의 플라스크에 도입시켜 3종의 폐렴균 배양용 배지를 수득한다. 이 배양배지를 이용하여 첨가된 탄소공급원의 종류가 폐렴균의 성장에 미치는 영향을 시험하였다. 대조용으로는 탄소공급원을 함유하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 조성을 갖는 배지 및 BHI 배지를 사용한다. 각각의 배지에 타입 1, 타입 4 및 타입 23의 3종의 폐렴균을 10⁵CFU/ml(CFU : Cell Forming Unit)의 양으로 접종하고 37℃에서 배양한다. 시간의 경과에 따라 각 플라스크의 배양물의 흡광도를 550nm에서 측정하여 폐렴균의 생장율을 측정하였다. (제1도 및 제2도 참조).

그 결과, 타입 1의 폐렴균은 글루코즈를 첨가한 배지인 배지 1에서 배양 5시간 후에 최대 흡광도 0.831을 나타내었으며, 타입 3의 폐렴균은 탄소공급원으로 슈크로즈를 첨가한 배지 2에서 배양 11시간 후에 최대 흡광도 0.959를 나타내었다. 이에 반해 BHI 배지에서 배양한 경우에 타입 1의 폐렴균의 5시간 후에 측정된 흡광도는 0.595이고 타입 23의 폐렴균은 배양 7시간 후에 최대 흡광도 0.735를 나타내었다. 또한, 탄소공급원을 첨가하지 않은 배지에서의 폐렴균의 생장은 극히 미미하였다. 즉, 타입 1의 폐렴균의 경우에는 배양 9시간 후에는 흡광도가 0.1미만인 것으로 측정되었으며, 타입 23의 폐렴균의 경우에도 불과 0.1 정도의 흡광도를 나타내었다. 상기에서 보는 바와 같이, 탄소공급원으로 글루코즈, 슈크로즈 또는 말토즈를 첨가한 배지에서의 폐렴균의 생장은 탄소공급원을 첨가하지 않은 배지 또는 통상 이용되는 BHI 배지에서의 생장에 비해 최고 생장점에 도달하는 시간면에서 약 1/3정도의 시간을 단축시키는 효과를 제공하였다.

배양이 끝나면 각각의 배지에 페놀 1w/v%를 가하여 페렴균을 분해시키고, 여기에 나트륨 아세테이트 5w/v%를 가하여 생성된 협막 다당류 성분을 분리시킨다. 각 배지에서 분리된 다당류 성분의 수율을 측정하여 비교한 결과, 타입 1,4 및 23의 폐렴균의 생성수율은 배지 1 내지 3에서 모두 BHI 배지나 탄소공급원을 함유하지 않은 배지에서의 수율에 비해 약 1.2배 이상 증가하였음을 알 수 있었다.

또한, 별도로 상기 배지 2와 동일한 조성을 가지나, 단 글루코즈의 농도를 0.2w/v%, 2w/v% 및 5w/v%로 변화시켜 첨가한 배지를 사용하여 상기와 동일한 방식으로 배양하여, 첨가된 글루코즈 농도에 따른 폐렴균의 최대 생장율과 협막 다당류 성분의 수율을 측정하여 보았다(참조 제3도). 그 결과 제3도에서 보는 바와 같이 배지에 첨가된 글루코즈 농도가 0.8 내지 2.0w/v%인 경우에 최대 생장율과 협막 다당류 성분의 수율의 두가지면에서 모두 만족스러운 결과를 얻을 수 있었다. 그러나, 글루코즈 농도가 0.2w/v%인 경우에는 폐렴균의 생장이 전반적으로 바람직하지 못하고, 타입 23의 폐렴균의 경우에는 5w/v% 글루코즈 첨가시 다당류 생성 수율이 현저히 저하되는 단점을 나타냈다. 따라서, 본 발명에서 탄소공급원의 첨가량은 0.8w/v% 내지 2.0w/v%로 조종하였다.

실시예 2

증류수 중에 카제인 가수분해물 1w/v%, 트립톤 0.5w/v%, 염화나트륨 0.5w/v%, 효모추출물 0.1w/v% 및 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.017N 글루코즈 0.8w/v%를 용해시켜 제조한 배지 100ml를 500ml 삼각플라스크에 넣고 121℃에서 30분간 멸균시킨다.

별도로 금속이온 공급원인 황산마그네슘, 황산구리, 염화칼슘, 염화코발트, 황산철 및 염화망간을 각각 멸균시킨 후, 상기 수득한 배지 100ml씩을 함유하는 플라스크 각각에 1mM의 농도가 각각 도입시켜 6종의 시험용 배양배지를 수득한다. 이 배지를 이용하여 첨가된 금속이온의 종류가 폐렴균의 생장속도 및 협막 다당류 성분의 수율에 미치는 영향을 시험하였다. 대조용으로는 금속이온을 함유하지 않은 통상의 CAT 배지, BHI 배지 및 금속이온 대신에 EDTA 1mM을 함유하는 상기 배지를 사용하였다. 각각의 배지에 타입 1, 타입 4 및 타입 23의 3종의 폐렴균을 10⁵CFU/ml의 양으로 접종하고 37℃에서 배양한다. 시간의 경과에 따라 각 플라스크의 배양물의 흡광도를 550nm에서 측정하여 폐렴균의 생장율을 측정하였다.(제4도 참조).

그 결과, 금속이온으로 Ca 및 Mg를 함유하는 배지에서 타입 1의 폐렴균은 배양 약 5 내지 6시간 후에 0.721의 흡광도를 나타내었으며, 타입 4의 폐렴균은 0.573, 타입 23의 폐렴균은 0.728의 흡광도를 나타내었다. 이러한 결과를 대조용 배지에서의 폐렴균 생장과 비교하여 보면, 금속이온의 첨가가 폐럼균의 생장율에는 크게 영향을 미치지 않는 것으로 판단될 수 있다.

배양이 끝나면 각각의 배지에 페놀 1w/v%를 가하여 폐렴균을 분해시키고, 여기에 나트륨 아세테이트 5w/v%를 가하여 생성된 협막 다당류 성분을 분리시킨다. 각 배지에서 분리된 다당류 성분의 수율을 측정하여 비교한 결과, 타입 1,4 및 23의 폐렴균의 생성수율은 금속이온-함유 배지, 특히 CuSO₄, MgSO₄또는 CaCl₂를 함유하는 배지에서 모두 BHI 배지나 금속이온을 함유하지 않은 배지에서의 수율에 비해 약 1.4배 이상 증가하였음을 알 수 있었다.

실시예 3

증류수 중에 카제인 가수분해물 1w/v%, 트립톤 0.5w/v%, 염화나트륨 0.5w/v%, 효모추출물 0.1w/v% 및 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.017N 및 글루코즈 0.8w/v%를 용해시켜 제조한 배지 100ml를 500ml 삼각플라스크에 넣고 121℃에서 30분간 멸균시킨다.

별도로 아미노산 공급원으로 시스테인, 아스파라긴, 페닐알라닌, 이소로이신, 트레오닌 및 메티오닌 각각을 멸균시킨 후, 상기 수득한 배지 100ml씩을 함유하는 플라스크 각각에 3mg/L씩의 농도로 각각 도입시켜 6종의 시험용 배양배지를 수득한다. 이 배양배지를 이용하여 아미노산의 첨가가 폐렴균의 생장속 및 협막 다당류 성분의 생성수율에 미치는 영향을 시험하였다. 대조용으로는 아미노산을 함유하지 않은 통상의 CAT 배지 및 BHI 배지를 사용하였다. 각각의 배지에 타입 1, 타입 4 및 타입 23의 3종의 폐렴균을 10⁵CFU/ml의 양으로 접종하고 37℃에서 배양한다. 시간의 경과에 따라 각 플라스크에 배양물의 흡광도를 550nm에서 측정하여 폐렴균의 생장율을 측정하였다.(제 5도 참조).

그 결과, 특히 아미노산으로 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 트레오닌을 첨가한 배지에서 타입 1의 폐렴균은 0.763, 타입 4의 폐렴균은 0.587 및 타입 23의 폐렴균은 0.716의 최대 흡광도를 나타내었다. 이러한 결과를 대조용 배지에서의 폐렴균의 생장과 비교하여 보면, 아미노산의 첨가가 폐렴균의 생장율에는 크게 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

배양이 끝나면 각각의 배지에 페놀 1w/v%를 가하여 폐렴균을 분해시키고, 여기에 나트륨 아세테이트 5w/v%를 가하여 생성된 협막 다당류 성분을 분리시킨다. 각 배지에서 분리된 다당류 성분의 수율을 측정하여 비교한 결과, 타입 1,4 및 23의 폐렴균의 생성수율은 아미노산, 특히 아스파라긴 ,페닐알라닌 또는 트레오닌을 함유하는 배지에서 모두 BHI 배지나 아미노산을 함유하지 않은 배지에서의 수율에 비해 약 2배 이상 증가하였음을 알 수 있었다.

실시예 4

증류수 중에 카제인 가수분해물 1w/v%, 트립톤 0.5w/v%, 염화나트륨 0.5w/v% 효모추출물 0.1w/v% 및 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.017N 및 글루코즈 0.8w/v%의 농도로 용해시켜 제조한 배지 100ml를 500ml 삼각플라스크에 넣고 121℃에서 30분간 멸균시킨다. 멸균된 배양배지에 각각 타입 1,4 및 23의 폐렴균을 10⁵CFU/ml의 양으로 접종하여 37℃에서 0, 50, 100 또는 150rpm으로 진탕하여 통기하면서 배양하여 통기가 폐렴균의 생장율 및 협막 다당류 성분의 생성 수율에 미치는 영향을 시험하였다.(제 6도).

시간의 경과에 따라 각 플라스크의 배양물의 흡광도를 550nm에서 측정하여 폐렴균의 생장율을 측정하였다. 그 결과, 제6도에서 보는 바와 같이 통기 여부가 폐렴균의 생장율에 미치는 영향은 거의 없으며, 50rpm 정도의 온화한 교반 통기 하에서는 생장율이 다소 증가하였으나 100rpm 이상의 교반에 의한 통기시에는 생장율이 다소 저하하는 것을 알 수 있었다.

배양이 끝나면 각각의 배지에 페놀 1w/v%를 가하여 폐렴균을 분해시키고, 여기에 나트륨 아세테이트 5w/v%를 가하여 생성된 협막 다당류 성분을 분리시킨다. 각 배지에서 분리된 다당류 성분의 수율을 측정하여 비교한 결과, 제6도에서 보는 바와 같이 50rpm 정도로 온화하게 통기하여 배양한 경우에 타입 1,4 및 23의 폐렴균의 다당류 생성수율은 통기를 하지 않거나 100rpm 이상으로 과도하게 통기하면서 배양한 경우에 비해 약 1.2 내지 2.0배 이상 증가하였음을 알 수 있다.

실시예 5

BHI 배지 및 증류수 중에 카제인 가수분해물 1w/v%, 트립톤 0.5w/v%, 염화나트륨 0.5w/v%, 효모추출물 0.1w/v% 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.017N 및 글루코즈 0.8w/v%를 함유하는 본 발명에 따르는 변형된 CAT 배지에서 배양하여 분리한 폐렴균의 협막 다당류 성분을 증류수로 1 : 1, 1 : 2, 1 : 4 및 1 : 10으로 희석한 검체와 증류수를 1.25% 아가로즈겔(아가로즈 1.25g을 베로날 1.842g/L, 베로날 나트륨 10.309g/L 및 나트륨 아세테이트 6.8g/L로 이루어진 용액 25ml 및 증류수 75ml에 용해시켜 두께 0.2mm의 전기 영동 필름에 분주하여 제조)에 부하시킨 다음, 40시간 동안 습기로 포화된 상자내에 두어 확산시킨다. 겔을 안산염 완충 식염수(NaH₂PO₄·2H₂) 1.9mM, Na₂HPO₄8.1mM, NaCl 154mM에 H₂O 9000ml를 가하고 pH를 7.2 내지 7.4로 조절하여 제조)로 15분 및 증류수로 15분씩 3회 세척하고 겔면을 위로 하여 여과지를 얹어 습기를 제거한 다음 건조시킨다. 0.5% 쿠마시 브릴리안트 블루(Coomassie brilliant blue)로 5분간 염색한 후, 메틸알콜 : 아세트산 : 증류수(4.5 : 1: 4.5)에 넣고 침전띠가 보일때까지 신선한 액으로 갈아주면서 색소를 제거한 다음 겔을 건조시키고 관찰한다. BHI 배지로부터 얻은 다당류 및 본 발명의 변형된 CAT 배지로부터 얻은 다당류는 표준 혈청과 반응하여 동일한 침강선이 얻어진다. 그 결과는 제7도에서 보는 바와 같다. 제7도에서 중심의 웰은 각각의 폐염균 타입에서 분리해낸 표준 항혈청을 함유하며, 주변 웰 1은 증류수, 주변 웰 2는 정제된 다당류 1mg/ml, 주변 웰 3은 정제된 다당류 0.5mg/ml, 주변 웰 4는 정제된 다당류 0.25mg/ml, 그리고 주변 웰 5는 정제된 다당류 1mg/ml를 포함하고 있다. 또한, [A]는 BHI 배지에서 배양한 타입 1의 폐렴균으로부터 분리된 다당류의 반응을 나타낸 것이며, [B]는 역시 BHI 배지에서 배양한 타입 4의 폐렴균으로부터 분리된 다당류의 침강 반응을 나타낸 것이고, [C]는 상기의 변형된 BHI배지에서 배양한 타입 1의 폐렴균으로부터 분리된 다당류의 침강 반응을 나타낸 것이고, [D]는 역시 변형된 BHI 배지에서 배양한 타입 4의 폐렴균으로부터 분리된 다당류의 반응을 나타낸 것이다.

제7도의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따르는 변형된 BHI 배지로부터 얻은 다당류는 BHI 배지에서 얻은 다당류와 비교하여 항원특이성의 변화가 없음을 알 수 있다.

Claims (10)

1. 증류수 중에 카제인 가수분해물 0.5 내지 1.5w/v%, 트립톤 0.1 내지 1.0w/v%, 염화나트륨 0.1 내지 1.5w/v%, 효모추출물 0.1 내지 0.5w/v% 인산카륨(K₂HPO₄) 0.017N 및 탄소공급원 0.8 내지 2.0w/v%를 함유함을 특징으로 하는 폐렴균 배양용 배지.
2. 제1항에 있어서, 추가로 금속이온 공급원 1mM 내지 10mM 및 아미노산 0.1 내지 1000ppm을 함유함을 특징으로 하는 배지.
3. 제1항에 있어서, 탄소공급원이 글루코즈, 슈크로즈 및 말토즈 중에서 선택됨을 특징으로 하는 배지.
4. 제3항에 있어서, 탄소공급원이 글루코즈임을 특징으로 하는 배지.
5. 제2항에 있어서, 금속이온 공급원이 염화칼륨, 황산마그네슘 및 황산구리 중에서 선택됨을 특징으로 하는 배지
6. 제2항에 있어서, 아미노산이 아스파라긴, 페닐알라닌 및 트레오닌 중에서 선택됨을 특징으로 하는 배지.
7. 제2항에 있어서, 증류수 가수분해물 1w/v%, 트립톤 0.5w/v%, 염화나트륨 0.5w/v%, 효모추출물 0.1w/v% 인산칼륨(K₂HPO₄) 0.017N, 글루코즈 0.8w/v%, 황산마그네슘 1mM 및 아스파라긴 3mg/L를 함유함을 특징으로 하는 배지.
8. 폐렴균을 제1항 내지 7항중의 어느 한 항에 따르는 배지중에서 통기하에 배양함을 특징으로 하여, 폐렴균의 협막 다당류 성분을 생성시키는 방법.
9. 제8항에 있어서, 통기를 50rpm 이하로 진탕하여 수행함을 특징으로 하는 방법.
10. 제8항에 있어서, 배양을 pH 5 내지 8에서 수행함을 특징으로 하는 방법.