KR950012761B1 - 심방의 나트륨 이뇨성/혈관 확장성 폴리펩티드의 제조방법 - Google Patents

심방의 나트륨 이뇨성/혈관 확장성 폴리펩티드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

심방의 나트륨 이뇨성/혈관 확장성 폴리펩티드의 제조방법
제 1a 도는 인체 pre-pro ANVP를 코드화하는 유전자의 DNA서열이다.
제 1b 도는 인체 pre-pro ANVP를 코드화하는 cDNA서열이다.
제 2 도는 래트 pre-pro ANVP를 코드화하는 DNA의 서열이다.
제 3a 내지 3p 도는 심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성(ANVP)화합물의 정제그래프로서 ;
제 3 도는 조 추출들의 G-50겔 여과 그래프이고,
제 3b 도는 정제한 추출물의 HPLC이며,
제 3c 도는 제 1b 도의 생성물의 재-크로마토그래피이고,
제 3d 도는 제 1 도의 정제된 활성 분획의 HPLC이다.
제 4 도는 본 발명의 핵산 조성물을 함유하는 cDNA클론을 확인하기 위해 사용한 올리고 누클레티드 프로브(probe)의 서열이다.
제 5 도는 래트 pre-pro ANVP를 코드화하는 DNA의 제한엔도누클레아제에 의한 절단부위이다.
제 6a 도는 심방 및 심실 mRNA의 노던 반점 분석의 결과이다.
제 6b 내지 6e 도는 폴리 A+RNA에 의해 코드화된 세포를 함유하지 않는 번역 생성들의 이차원적 겔 분획화 결과로서, 제 6b 도는 심방의 폴리 A+RNA에 의해 코드화된35S단백질을 나타내며, 제 6c 도는 심실의 폴리 A+RNA에 의해 코드화된35S단백질을 나타내고, 제 6d 도는 심방조직에서 유도된 폴리 A-1RNA를 나타내며,제 6e 도는 심실조직에서 유도된 폴리 A-1RNA를 나타낸다.
제 7 도는 인체 pre-pro ANVP를 코드화하는 인체 제놈성 DNA의 특정 제한엔도누클레아제에 의한 절단부위를 나타낸 것이다.
제 8 도는 본 발명의 정제된 합성 화합물의 혈관이완 작용의 비교그래프이다.
제 9a 도는 배양된 소의 대동맥 평활근세포에 대한125I-rANVP(126 내지 150)의 결합을 나타낸 그래프이다.
제 9b 도는 배양된 소의 대동맥 내피세포에 대한125I-rANVP(126 내지 150)의 결합을 나타낸 그래프이다
제 10a 도는 rANVP 및 hANVP용량 대 배양된 소의 혈관 평활근의 시클릭 GMP수준의 그래프이다.
제 10b 도는 rANVP 및 hANVP 용량 대 배양된 소의 혈관 내피세포의 시클릭 GMP수준의 그래프이다.
제 11a 도는 배양된 소의 대동맥 평활근 세포의 cGMP증가에 대한 여러 ANVP의 능력의 용량-감응 그래프이다.
제 11b 도는 배양된 소의 대동맥 내피세포의 cGMP증가에 대한 ANVP능력의 용량-감응 그래프이다.
제 12 도는 래트 및 인체 pro-ANVP 및 유도단편의 발현에 사용되는 박테리아성 발현 플라스미드의 설명으로서,
제 12a 도는 플라스미드 발현 벡터 pKT-52이며
제 12b 도는 제 12c 도의 래트 pre-pro ANVP cDNA유래 DNA단편이고,
제 12c 도는 래트 pre-pro ANVP cDNA이며,
제 12d 도는 제 12c 도의 래트 pre-pro ANVP cDNA유레 플라스미드 pRNF-12852중에 클론화된 아미노산25-152를 코드화하는 DNA단편이고,
제 12e 도는 트립토판 오페론 프로모터 오퍼레이터 및 샤인 델가노서열을 함유하는 합성 DNA서열이며,
제 12f 도는 플라스미드 pTRP-233플라스미드이고,
제 12g 도는 플라스미드 phNF-233중에 클론화된 아미노산 26-151을 코드화하는 인체 pre-pro cDNA유래 DNA의 단편이다.
제 13 도는 L-[35S]-시스테인으로 표지된 단백질을 나타내는 SDS-폴리아크릴아미드겔의 사진이다.
제 14 도는 L-[35S]-시스테인으로 표지한 단백질을 나타내는 SDS-폴리아크릴아미드겔의 사진이다.
제 15 도는 특정 벡터 및 효모 α-인자 분비 시그널을 사용하여 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 래트 pre-pro ANVP 및 관련된 폴리펩티드 단편을 발현하기 위한 구조를 나타낸 것이다.
제 16 도는35S-메티오닌(A) 또는35S-시스테인 및35S-메티오닌(B)로 표지된 단백질을 분비한 S. 세리비시아에가 나타내는 SDS폴리아크릴아미드겔의 사진이다.
제 17 도는 효모 발현 폴리스미드 및 인체 pro심방의(proatrial) 나트륨 이뇨/혈관확장 단편 128-151을 코드화하는 합성 유전자 서열을 도식화한 것이다.
제 18a 도는 중국계 햄스터 난소(CHO)세포에서 래트 및 인체 pro-pro ANVP를 발현시키기 위한 발현벡터의 구조이다.
제 18b 도는 중국계 햄스터 난소세포 배지로부터 얻은35S-메티오닌 표지된 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드겔의 사진이다.
본 발명은 이뇨제, 나트륨 이뇨제 및 혈관확장제로서 유용한 폴리펩티드외 제조방법에 관한 것이다.
대부분의 다세포 유기체는 특정 기능을 수행하는 조직 및 기관으로 이루어져 있다. 즉, 어떤 시스템은 그들사이에 물질을 수송하도록 진화하였다. 포유류를 포함하는 고등동물에서, 이러한 순환계는 수숭효율을 향상시키기 위해 폐쇄되어 있다. 이러한 폐쇄된 심장혈관계를 통해 혈액이 흐르기 위해서는 혈액이 압력하에 유지되어야 하며, 진신적 동맥 혈압의 조절은 혈액용적 및 혈관 탄성도 및 구경등을 포함하는 다수의 인자의 복잡한 상호작용을 필요로 한다.
정상의 세포의 액 용적의 유지는 일차적으로 신장에 의한 나트륨(나트롬 이뇨작용) 및 물(이뇨작용)의 분비에 좌우된다. 이것은 (1) 혈장이 사구체에서 여과되는 비율(사구체 여과율 또는 GFR) 및 (2) 나트륨이신관을 따라 능동적으로 재흡수되는 정도(들과 함께는 수동적임)에 의해 측정된다.(2)의 과정은 부신의 스테로이드 호르몬 알도스테론에 의해 일부 조절된다. GFR 및 알도스테론 이외에, 나트륨 재흡수를 또한 조절하는 "제 3의 인자"가 존재함이 틀림없을 것으로 오랫동안 생각해왔다. 오늘날, "제 3의 인자"의 가정을 필요로 하는 다수의 현상이 나트륨 재흡수에 대한 물리적인 힘(예를들어, 혈압, 적혈구 세포농도 및 혈장점도)의 효과에 의해 설명될 수 있음이 명백해졌다. 그럼에도 불구하고, 관의 재흡수를 조절할 가능성 있는"나트륨 이뇨호르몬"에 대한 연구는 계속되고 있다.
심방근 세포로부터 최근에 단리된 나트륨 이뇨성 인자를 포함하는 것중 여러가지가 그러한 호르몬으로 후보에 올라 있다. 나트륨 이뇨 효과가 래트의 심실조직이 아닌 심방조직의 조 추출물에서 발휘되었다.[참조,드 볼드, 에이.제이.(De Bold, A.J.)등, Life Science, 28 : 89-94(1981), 가르시아, 알., 익스페러엔티아(Garcia, R., Eyperientia), 38 : 1071-73(1982), 퀴리, 엠.지.(Currie, M.G.)등, Science 221 : 71-73(1983)]. 이뇨 및 나트롬 이뇨작용을 갖는 여러가지 펩티드가 심방조직에서 단리되어 서열화 되였다.[참조, 플린, 티. 지.(Flynn, T. G.)등, Biochem.Biophys.Res.Commun.177;859-865(1983), 쿠리, 엠. 지.(Currie, M.G.)등, Science 223 : 67-69(1984), 강가와, K. (Kangawa, K.)등, Biochem.Biophys.Res. Commun.,118 : 13l-139(l984)]. 상기의 심방 나트륨 이뇨인자의 존재는, 신장의 관류에 대한 그의 명백한 효과 이외에도 심장이 신장의 나트륨 및 물 배설을 조절하는 중요한 역할을 할 수 있다는 오랫동안 지니고 있던 의심을 확고하게 하였다. 심방의 긴장은 이뇨 및 나트륨 이뇨를 유발한다고 알려져 있으며, 이것은 상기 인자들의 유리가 증가됨으로서 매개될 수 있다.
다수의 임상적으로 중요한 질병상태는 비정상적인 체액의 저류에 의해 나타난다. 울혈성 심장 질환, 간경변 및 네프로제증후근은 각각 정맥순한부에 과량의 혈액의 축적을 야기하는데, 가정한 통상의 메카니즘은 신장의 관류의 부족으로 GFR이 떨어지는 것이다. 감소된 신장관류가 레닌의 과잉분비를 자극하는 이외에, 순환에 관여하는 단백질 분해 효소가 앙기오텐신(angiotensin)의 형성을 유발한다.
앙기오텐신은 세동맥의 강력한 수축제(동맥압의 유지를 돕는다)이며 또한 부신에 의해 나트륨 보유 호르몬 알도스테론의 유리도 유발한다(체액 정체를 더욱 악화시킴). 그러나, 이들 메카니즘으로 소위 "부종상태(edematous state)"로 지칭되는 체액 정체가 완전히 설명되지 않으며, 추가의 인자들이 관련되는것 같다. 한가지 중요한 가능성은 심방의 만성 과긴장(예를들어, 심장 질환)에 의하거나 심방의 불충분한 자극(예를들어, 경변 및 네프로제 증후근)에 의해 야기되는 심방의 나트롬 이뇨인자의 상대적 또는 절대적 결핍이 체액 정체에 영향을 미친다는 것이다.
세포외액 양의 증가는 또한 여러가지 예에서 고혈압의 진행에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 고혈압, 또는 만성적인 혈압상승은 세계적으로 질병 및 사망의 주요원인중 하나이다. 2천만 이상의 미국인이 상기의 질병과 심장질환, 심장 발작, 발작 및 신장질환을 포함하는 합병증으로 고생하고 있다. 만성 고혈압에서 주로 관찰되는 혈동력학적 이상은 세동맥을 통과하는 혈액외 흐름에 대한 저항력이 증가되는 것이다. 그러나,이러한 증가된 "말초 저항"을 유발하는 메카니즘은 완전히 밝혀져 있지 않다. 몇몇 경우에, 레닌-앙기오텐신 시스템 또는 교감신경계의 부적절한 활성이 세동맥의 과도한 수축을 야기할 수 있다 : "부적절한"이란 용어는 상기 활성을 유도하는 미지의 시그널이 기관의 생리학적 필요에 의거하지 않아 혈압의 상승을 야기하는 것을 의미한다.(이에 반하여, 전자의 예에서는, 부종 상태에서 증가된 레닌 분비는 동맥압의 감소에 반응하는 것으로서, 따라서 정상압력으로 복원시키거나 정상압력을 유지시킨다) 그러나, 상당한 고혈압 환자에서, 신장에 부적절한 나트륨 및 체액 저류를 느끼며 혈압의 상승을 유발하거나 혈압상승에 기여하게 된다. 신장 기능에 있어서 감지할 수 있는 결함 및 말초 저항을 증가시키는 체액 저류 메카니즘은 모두 미지이다. 이러한 상기 관찰되는 증상에, 특히 동일한 물질이 세동맥에 이완효과를 정상적으로 발휘하는 경우나트륨 이뇨호르몬의 결핍에 기인한 것일 수 있음이 확실하다.
이뇨 요법은 현재 고혈압, 신장 질환 및 여러가지 부종상태(심장 질환등)의 치료에 중요하다. 그러나, 현재 사용하고 있는 약리학적제제는 여러가지 중요한 제한사항 및 부작용을 갖는다. 상기 약제를 특이한 이상(즉, 부피팽창)에 사용할 수 있는 반면 그의 다작용이 확실히 비생리학적이어서 칼륨 고갈, 요산의 저류증가 및 비정상적인 글루코스 및 지방대사를 야기한다. 또한, 모든 기지의 이뇨제들은 용적-고갈 및 혈압 강하 효과를 방해하고 기타의 부작용을 일으키는 레닌-앙기오텐신-알도스테론 시스템을 심하게 자극한다. 따라서, 완전한 그러나 조절된 범위의 생리학적 감응을 제공하여 혈압을 조절할 수 있는 약리학적으로 유효한 화합물을 제공하는 것이 바람직할 것이다.
그러나 심방조직으로부터 상기 화합물의 단리는 통상 간편한 공정이 아니고, 소량의 화합물을 얻기 위해많은 기질조직이 필요하다. 이들 화합물중 특정한 것은 화학적으로 합성될 수 있기는 하나, 임상 및 치료용으로 제공하기 위하여는 재조합 데옥시리보핵산(DNA) 및 관련기법을 사용하여 다량의 상기 화합물을 생성시키는 것이 바람직하다.
코헨 및 보이에르(Cohen ＆ Boyer)의 미합중국 특허 제 4,237,224호의 초기연구로부터 발전하여, 재조합DNA기술로 신규의 DNA서열을 제공하기에 유용하게 되었고 형질 전환된 세포 배양액중에 다량의 이형 단백질을 생성시키게 되었다. 일반적으로 서로 다른 유기체로부터 얻은 DNA의 결합은 제한 엔도누클레아제를 사용하는 DNA서열의 절단에 의한다. 이들 효소는 매우 특정부위에서 공여 DNA를 절단하는데 사용되며 그 결과 목적하는 DNA서열을 함유하는 유전자 단편을 수득한다. 이러한 DNA단편은 통상 각 말단에 짧은 일본쇄 말단부, 즉 "점성-말단(sticky-end)"을 함유한다. 이 점성 말단 단편은 예를들어 동일한 제한 엔도누클레아제로 분해시켜 제조한 발현 비히클내의 상보적인 단편에 연결될 수 있다.
조절성분과 적절한 배향으로 목적하는 구조 유전자를 함유하는 발현벡터를 제조하면, 이 벡터를 사용하여 숙주세포를 형질 전환시키고 유용한 세포 기전을 이용하여 목적하는 유진자 생성들을 발현시킨다. 발현시킨후, 생성물이 세포내에서 발현된 경우에는 일반적으로 세포 배양액을 용해시켜 유전자 생성물을 회수하고,생성물이 숙주세포에 의해 분비되는 경우에는 매질로부터 생성물을 회수한다.
재조합 DNA기술은 직접적인 발현으로 완전한 이종 유전자 생성물을 발현시키는데 사용되거나, 목적하는 유전자 생성물은 동종 단백질의 아미노산 서열의 일부를 함유하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 일반적으로 후 번역(post transation)과정을 수행하여 고유의 유전자 생성물을 회수한다. 상기 방법에 유용한 다수의 기술은 마니아 티스, 티(Maniatis, T) 등에 의해 밝혀져 있다[참조,Molecular Cloning : A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) ].
그러나, 일반적인 방법을 쉽게 요약하자면, 원하는 구조유전자를 함유하는 발현벡터의 구성과정이 난해하며, 유의적 양의 원하는 유전자 생성물은 그의 생리학적 활성을 보유시키면서 성공적으로 발현시키는 것은 쉽게 예측할 수 없다. 종종 유전자 생성물은 효모, 박테리아 또는 포유동물 세포시스템에서 발현시키는 경우 생물학적으로 활성이 없다. 이러한 경우, 생물학적 활성을 수득하기 위해서는 후번역 공정이 필요하다.
나트륨 이뇨제, 이뇨제, 혈관확장제 및 레닌-앙기오텐신 알도스테론계의 조절제로서 유용한 본 발명의 화합물에는 무관한 심방 조직 또는 생성물을 거의 함유하지 않는 심방 나트륨 이뇨/혈관 폴리펩티드(ANVPs)가 포함된다. 또한 하기 일반식의 폴리펩티드 화합물도 포함된다.
Figure kpo00002
상기식에서, n은 19이고, aan은 일반식
Figure kpo00003
[여기에서, Rn은 수소이거나, 세개 이하의 질소, 산소 또는 황원자의 치환체를 갖는(예를들어, 아미도, 티오 또는 옥시이거나, 히드록시, 티올 및 일반적으로 1개의 탄소원자의 알킬에테르(예를들어, 메틸에테르)인 에테르를 함유함) 탄소수 1 내지 10, 보통 1 내지 6의 지방족, 방향족 또는 알크아릴기이다]으로서 D-이성체, L-이성체 및 DL-이성체(라세미 혼합물)을 포함하며, X는 수소, 아미도 또는 아세틸이거나, 추가로, 125개 까지의 아미노산 잔기의 올리고펩티드(그의 N-아세틸 유도체 포함)를 포함하며, Y는 히드록실, 아미도 또는 20개 까지의 아미노산 잔기의 을러고필티드(그의 C-말단의 아미드 유도체 포함)이다.
또한 본 발명은 다음과 같은 방법으토 DNA코드화 ANVPs, pro ANVPs 또는 pre-pro ANVPs를 발현시키기 위한 재조합 DNA기법을 사용하여 본 발명 화합물을 제조하는 방법을 제공한다
(a) 숙주 세포중에서 DNA서열을 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제조하고 ; (b) 숙주세포 배양물을 상기의 발현 벡터로 형질전환시키고 ; (c) DNA서열을 발현시킬 수 있는 조건하에서 상기의 형질전환된 숙주세포를 배양하여 ANVPs, pro ANVPs 또는 pre-pro ANVPs로 구성되는 폴리펩티드를 제조하고 ; (d) 생성된 폴리펩티드를 회수한다.
본 발명은 또한 진단 및 치료제로서 이들 화합물을 사용하는 방법을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
제 1a 도는 본 발명의 한가지 태양, 즉 인체 pre-pro ANVP를 코드화하는 유전자의 데옥시리보핵산(DNA)서열을 이 DNA에 의해 지시된 폴리펩티드 합성 아미노산 서열과 함께 나타낸 것이다.
제 1b 도는 본 발명의 한가지 태양, 즉 인체 pre-pro ANVP를 코드화하는 상보적 데옥시리보핵산(cDNA)의 cDNA서열을 이 DNA에 의해 지시된 폴리펩티드합성 아미노산 서열과 함께 나타낸 것이다.
제 2 도는 본 발명의 한가지 태양, 즉 래트 pre-pro ANVP를 코드화하는 데옥시리보핵산(DNA)의 서열을 이 DNA에 의해 지시된 폴리펩티드합성 아미노산 서열과 함께 나타낸 것이다.
제 3a 내지 3d 도는 심방조직으로부터 본 발명의 심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성(ANVP)화합물의 정제를 그래프로 나타낸 것으로, 제 3a 도는 조 추출물의 G-50겔 여과의 결과이며, 제 3b 도는 정제한 추출물의HPLC(C18컬럼)정제의 결과이고, 제 3c 도는 제 1b 도의 생성물의 재 -크로마토그래피결과이며, 제 3d 도는 제 1c 도의 정제된 활성분획의 HPLC(CN컬럼)정제의 결과이다.
제 4 도는 본 발명의 핵산 조성물을 함유하는 상보적 DNA(CDNA)클론을 확인하기 위해 사용한 올리고누클레오티드 프로브(probes) 의 서열이다.
제 5 도는 디데옥시 누클레오티드 서열분석용 DNA단편을 제공하기 위하여 특정 제한 엔도누클레아제로 래트 pre-pro ANVP를 코드화하는 데옥시리보핵산(DNA)을 절단한 부위를 나타낸 것이다.
제 6a 도는 심방 및 심실 mRNA의 노던 반점분석(Northern blot analysis)의 결과로서, 레인 1은 래트심방 조직으로부터 단리한 RNA이며 레인 2는 래트 심실 조직으로부터 단리한 RNA이다.
제6b도, 제6c도, 제6d도 및 제6e도는 폴리 A+RAN에 의해 코드화된 세포-유리 번역(transldtion) 생성물의 이차원적 겔 분획화 결과로서, B는 심방의 폴리 A+RNA에 의해 코드화된35S단백질을 나타내며, C는 심실의 폴리A+RNA에 의해 코드화된35S단백질을 나타낸다
래트 pre-pro ANVP를 코드화하는 DNA에 특이적으로 혼성화시키고 이 DNA로부터 용출시킨 폴리 A+RNA의 시험관내 번역도 나타내였는데, 제6d도는 심방 조직으로부터 유도된 풀리 A+RNA를 나타내며, 제6e도는 심실조직으로부터 유도된 풀리 A+RNA를 나타낸다.
제 7 도는 디데옥시 누클레오티드 서열분석용 DNA단편을 제공하기 위해 특정 제한 엔도투클레아제로 인체 pre-pro ANVP를 코드화하는 인체 게놈성 데옥시리보핵산(DNA)을 절단한 부위를 나타낸 것이다.
제 8 도는 본 발명의 정제된 합성 화합들의 혈관이완작용의 비교이다.
제 9a 도 및 제 9b 도는 배양된 소의 대동맥 평활근 세포(A그래프) 및 대동맥 내피세포(B그래프)에 대한125I-rANVP(126 내지 150)의 결합을 나타낸다. 실선(-)은 특이적 결합을 나타내며, 점선(…)은 비특이적 결합을 나타낸다.
제 10a 도 및 제 10b 도는 여러가지 용량의 rANVP(126-150) 및 hANVP(127-251) 각각에 대하여 배양된 소의 혈관 평활근(A그래프) 및 혈관 내피세포(B그래프)에서 시클릭 GMP 수준을 나타낸 것이다.
제 11a 도 및 제 11b 도는 배양된 소위 대동맥 평활근 세포(A그래프) 및 배양된 소의 대동맥 내피세포(B그래프)에서 cGMP를 증가시킬 수 있는 여러가지 ANVP의 능력을 나타내는 용량-감응 곡선이다.
제 12 도는 래트 및 인체 pro-ANVP 및 유도단편의 발현에 사용되는 박테리아성 발현 플라스미드의 도시적 설명으로서, 제 12a 도는 플라스미드 발현벡터 pKT-52를 나타내며, 제 12b 도는 제 12c 도에 나타낸 래트pre-pro ANVP cDNA유래 DNA의 단편을 나타낸 것이고, 제 12d 도는 제 12c 도의 래트 pre-pro ANVP cDNA로부터 유래되며 플라스미드 pRNF-12852중에 클론화된 아미노산 25-152를 코드화하는 DNA의 단편을 나타낸 것이며, 제 12e 도는 트립토판 오페론 프로모터/오퍼레이터 및 제 12f 도에 나타낸 pTRP-233의제조에 사용된 샤인-델가노 서열(Shine-Delgarno Sequence. SD서열)을 함유하는 합성 DNA서열이며,제 12g 도는 플라스미드 phNF-233중에 클론화된 아미노산 26-15l를 코드화하는 인체 pre-pro ANVP cDNA로부터 유래된 DNA의 단편을 나타낸 것이다.
제 13 도는 L-[35S]-시스테인으로 표지된 단백질을 나타내는 SDS-폴리아크릴아미드겔의 사진으로서, 레인 A중 이.콜라이 pKT 52 발현벡터를 함유하며, 레인 C는 pRNF-6852(pre-pro ANVP의 아미노산87-152를 코드화하는 DNA를 함유하도록 변형시킨 pKT 52)를 함유하며 레인 E는 pRNF-12852(pre-pro ANVP의 아미노산 25-152를 코드화하는 DNA를 함유하도록 변형시킨 pKT 152)를 함유하며, 레인B, D 및 F는 각각 레인 A, C 및 E으로부터 특이적 항 ANVP항혈청으로 면역 첨전시킨 생성물이며, 레인 G는 상응하는 분자크기로 나타낸 단백질 분자량 표준이다. 화살표는 pRNF-6852 및 pRNF-12852로부터 유래한 독특한 폴리펩티드를 나타낸다.
제 14 도는 [35S]-시스테인으로 표지한 단백질을 나타내는 SDS폴리아크릴아미드겔의 사진으로 레인 A중의 이.콜라이 pTRP-233 발현벡터를 함유하며, 레인 B는 phNF-233(인체 pre-pro ANVP(26-151)을 코드화하는 DNA를 함유하도록 변형시킨 pTRP-233) 발현 생성물을 함유하며, 레인 C 및 D는 각각 레인A 및 B로부터 특이적 항-ANVP항혈청으로 면역 침전시킨 생성물이다.
제 15 도는 특정 벡터 및 효모 α-인자 분비 시그널을 사용하여 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 래트 pre-pro ANVP 및 관련된 폴리펩티드 단편을 발현하기 위한 구조를 나타낸 것이다.
제 16 도는35S-메티오닌(A) 또는35S-시스테인 및35S-메티오닌(B)로 표지된 단백질을 분비한 S. 세레비시아에가 나타내는 SDS폴리아크릴아미드겔의 사진이다. 제16a도에서, 레인 1 및 2의 S.세레비시아에는 YEp-α-8서틀 벡터를 함유하며, 레인 3 및 4는 YEp-α-NF-9를 함유하고, 레인 5 및 6은 YEp-α-NF-12를 함유한다. 제16b도에서는, 분비된 단백질을 아세톤 및 메탄올을 추출하였고, 레인 1 및 2는 YEp-α-NF-7 및 YEp-α-NF-5를 함유하는 에스.세레비시아에를 나타내며, 레인 3 및 4는 특이적 항ANVP IgG로 면역침전시킨 후 이 제제로부터 얻은 단백질을 나타내고, 레인 5 및 6은 각각 YEp-α-NF-12 및 YEp-α-NF-9를 함유하며, 항 ANVP IgG에 의해 특이적으로 면역침전된 단백질을 나타낸다.
제 17 도는 효모발현 플라스미드 및 인체 pro심방의 (proatrial)나트륨 이뇨/혈관확장 단편 128-151을 코드화하는 합성 유전자서열을 도식화한 것이다. 자세한 것은 (IV)단락에 설명되어 있다. (A) 플라스미드 JJ-1 및 JC1-5내의 관련 영역의 서열.
Figure kpo00004
는 pBR 322서열이고,
Figure kpo00005
는 2μ의 B형을 함유하는 DNA단편이며,
Figure kpo00006
는 α-인자 전구체/펩티드를 코드화하는 DNA단편이고,
Figure kpo00007
는 LEU2 유진자를함유하는 DNA단편이다. (B) 인체 전심방 나트륨 이뇨/혈관확장 단편 128-151을 코드화하는 합성 DNA유전자 서열. 성분 올리고데옥시 누클레오티드를 1 내지 8로 번호를 붙였다. α-인자에 대한 상기 누클레오티드서열상의 아미노산 번호는 쿠르얀 제이.(Kurjan J.) 및 헤르스코비쯔(Herskowitz)에 의해 기술된 유전자 서열에 상응한다.
제 18a 도는 중국계 햄스터 난소(CHO) 세포에서 래트 및 인체 pre-pro ANVP를 발현시키기 위한 발현벡터의 구조이다.
제 18b 도는 중국계 햄스터 난소세포 배지로부터 얻은35S-메티오닌 단백질의 SDS-폴리아크릴아미드겔의 사진으로서, 레인 1은 prohANVP(26-151)의 합성 서열을 함유하는 CHO세포 푸울로부터 얻은35S-메티오닌 표지된 단백질을 나타내며, 레인 2는 대조 CHO세포로부터 얻은35S-메티오닌 표지된 단백질을 나타내고, 레인 3 내지 6은 pro ANVP(26-151)의 합성 서열을 함유하는 CHO세포(각각 CHO-8/2-93,CHO-8/2-81, CHO-8/2-55 및 CHO-8/2-6)로부터 얻은35S-메티오닌 표지된 단백질을 나타낸다.
본 발명에 따라, 신규의 대동맥 나트륨 이뇨/혈관확장성 폴리펩티드 화합물(ANVPs)는 숙주 유기체내에서 체액 양 및 혈압을 조절하기 위해 제공되며 본 발명의 한가지 태양은 관련이 없는 심방조직 또는 생성물을 거의 함유하지 않는 ANVPs를 제공한다.
본 발명의 다른 태양은 하기 일발식의 ANVP화합물 및 생리학적으로 허용가능한 그의 염, 아이드 및 에스테르를 제공한다.
Figure kpo00008
상기식에서, n은 19이고, aan은 일반식
Figure kpo00009
[여기에서, Rn은 수소이거나, 세개이하의 질소, 산소 또는 황원자의 치환체를 갖는(예를들어, 아미도, 티오 또는 옥시이거나 히드록시, 티올 및 일반적으로 1개의 탄소원자의 발킬에테르(예를들어, 메틸에테르)인 에테르를 함유함) 탄소수 1 내지 10, 보통 1 내지 6의 지방족, 방향족 또는 알크아릴기이다]으로서 D-이성체, L-이성체 및 DL-이성체(라제미 혼합물)을 포함하며, X는 수소, 아미도 또는 아세틸이거나, 추가로, 125개까지의 아미노산 잔기의 올리고펩티드(그의 N-아세틸 유도체 포함)를 포함하며, Y는 히드록실, 아미도 또는 20개까지의 아미노산 잔기의 올리고펩티드(그의 C-말단의 아미드 유도체 포함)이고, 표시된 바와 같이 상기 화합물은 시스테인 잔기사이에 디술파이드 결합을 갖는 화합물이 포함된다.
또한 본 발명에는 하기 일반식의 ANVP 화합들이 포함된다.
Figure kpo00010
상기식에서, 시스테인 잔기는 디술파이드 결합에 의해 임의로 결합되며, AA1, AA6및 AA11은 동일하거나 상이한 염기성 극성 아미노산 잔기, 바람직하게는 Arg이고, AA2, AA3, AA6, AA7, AA13, AA15,AA16, AA17및 AA19는 동일하거나 상이한 중성의 극성 아미노산 잔기로서, 바람직하게는, AA2및 AA3는 Ser이며, AA6는 Gly 또는 Ala이고, AA7는 Gly이며, AA13은 Gly 또는 AIa이고, AA15는 Gln이며,AA16은 Ser이고, AA17은 Gly 또는 Ala이며, AA19는 Gly이고, AA5, AA9, AA12, AA14및 AA18은 동일하거나 상이한 중성의 비극성 아미노산 잔기일 수 있는데, 바람직하게는 AA5는 phe이고, AAg는 Ile, Met 또는 Val이며, AA12는 Ile이고, AA14는 Ala이며, AA18은 Leu이고, AA10은 산성 극성 아미노산 잔기, 바람직하게는 Asp이며 , X 및 Y는 전술한 바와 같다.
중성의 비극성 아미노산 잔기는 생러적 pH에서 소수성 R기, 일반석으로 두개 이하의 질소, 산소 또는 황원자로 치환될 수 있는 탄소수 0 내지 10, 보통 1 내지 6의 지방족 또는 방향족 탄화수소를 갖는 아미노산 잔기로서, 이의 예는 알라닌(Ala), 발린(Val), 로이신(Leu), 이소로이신(Ile), 프롤린(Pro), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe) 및 트립트관(Trp) 이다.
중성의 극성 아미노산 잔기는 생리적 pH에서 친수성 비전하 R기를 갖는 아미노산 잔기로서, 이의 예에는 글리신(Gly), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn) 및 글루타민(Gln) 이다.
산성의 극성 아미노산 잔기는 생리적 pH에서 친수성, 음전하를 띤 R기를 함유하는 아미노산 잔기로서, 이의 예에는 아스파르트산(Asp) 및 글루탐산(Glu)이다. 염기성의 극성 아미노산 잔기는 생리적 pH에서 친수성, 양전하를 띤 R기를 함유하는 아미노산 잔기로서, 이의 예에는 리신(Lys), 아르기닌(Arg) 및 히스티딘(His) 이다.
일반적으로, 본 발명의 바람직한 태양은 하기 일반식의 화합물이다.
Figure kpo00011
상기식에서, X 및 Y는 전술한 바와 같으며, 시스테인 잔기는 바람직하게 디술파이드 결합에 의해 결합되어 있고, 괄호안의 아미노산 잔기는 바로 전 아미노산과 교체할 수 있다.
특정의 바람직한 태양은 하기 일반식의 화합물이다.
Figure kpo00012
상기식에서, 괄호안의 아미노산 잔기는 바로 전의 잔기와 교체할 수 있으며, 시스테인 잔기는 디술파이드 결합에 의해 결합되어 있고, X'는 COOH, H 및 OH로 구성되는 군에서 선택되며, Y는 Asn_Y', Asn_Ser-Y', ASn-Ser-Phe-Y', Asn-Ser-Phe-Arg-Y' 및 Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr_Y'로 구성되는 군에서 선택되며, 여기서 Y'는 OH, NH2또는 올리고펩티드이다.
디술파이드 결합이 없는 상기 화합물의 예는 다음과 같다;
Figure kpo00013
본 발명의 그밖의 양상은 ANVPs, pro ANVPs(완성된 ANVP발현 생성 화합물의 전구체) 및 pre-pro ANVPs(온전한 신호펩티드를 갖는 pro ANVPs)의 합성을 지시할 수 있는 헥산 서열, 및 이로부터 유래된 단편을 제공하는 것인데, 상기의 핵산서열은 제 1 도 및 2 도의 DNA서열로 구성되고, 이에 함유된 올리고누클레오티드서열을 포함하며, 코돈을 동일한 아미노산 또는 작용적으로 동등한 아미노산 서열(동등한 아미노산 서열이란, 실시예에 기재된 교체가능한 서열을 포함한다)의 합성을 지시할 수 있는 다른 코돈으로 대치할 수 있다.
본 발명의 ANVP화합물의 설명에 사용된 명명법은 아미노산의 관용명의 처음 세문자를 사용하는 통상의 실시에 따랐으며, 특별한 언급이 없는한 광학 이성체를 갖는 모든 아미노산의 L형이다.
본 발명이 범위에 속하는 화합물은 수득된 ANVP화합물의 활성을 유지하는 한 다수의 방법으로 상기에 나타낸 일반식을 변형시켜 수득할 수도 있다. 예를들어, 상기 화합물의 아미노산의 통상 천연의 L형이기는하나, 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이 하나이상, 보통 둘이하, 바람직하게는 하나의 아미노산이 D형 광학이성체 또는 DL라세미 혼합물로 대치될 수 있다. 본 발명 화합물에 함유된 아미노산 잔기는 아미드화 또는 아세틸화되거나 예를들어 그의 활성에 영향을 미치지 않으며 화합물의 용해도를 변화시킬 수 있는다른 화학적인 기로 치환될 수도 있다.
또한, 하나이상의 아미노산 잔기가 작용상 동등한 잔기로 대치될 수 있는데, 예를들어 염기성의 극성 아미노산은 다른 염기성의 극성 아미노산으로 대치될 수 있으며, 산성의 극성 아미노산은 다른 산성의 극성 아미노산으로 대치될 수 있다. 그러나, 특정의 비극성 소수성 아미노산, 특히 시스테인의 치환은 시스틴 디술파이드 가교를 방해할 가능성이 있으므로 바람직하지 못하다.
본 발명의 ANVP화합물은 이 화합물의 아미노산 서열내에서 신장, 단축 또는 치환시켜, 예를들어 상기기재된 서열의 N-말단 또는 C-말단 또는 양쪽 말단에 아미노산 또는 올리고펩티드를 가하거나 제거하여 변형시킬 수도 있다. 특히, Y1는 아미드 또는 아미노산이거나 20이하, 통상 8이상, 바람직하게는 5이하의 아미노산의 올리고펩티드일 수 있고, X1및 N-아세틸 또는 아미노산이거나 약 125이하, 바람직하게는 약101이하의 아미노산의 올리고펩티드일 수 있으며 단, 이러한 변형으로 상기 화합물의 나트륨 이뇨, 이뇨 및 혈관확장활성 모두에 역효과를 미치지 않는다.
더우기, 본 발명의 화합물은 동일하거나 상보적 생물학적 활성을 갖는 화합물과 혼합, 결합 또는 접합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 ANVP화합물은 관련이 없는 심방조직 또는 기타 생성물을 함유함이 없이 심방조직으로부터 단리된다. 일반적으로, 심방조직의 아세트산 추출물을 겔 여과하고 역전상 고속 액체 크로마토그래피(C18및 CN컬럼을 사용)시킨 다음, 각 분획의 나트륨 이뇨 및 혈관확장 활성을 분석한다.
본 발명의 범위에 속하는 화합물은 생물학적 조직원, 특히 포유류의 심방조직원으로부터 단리 및 정제할 수 있거나, 예를들어, 고상합성 등 본 분야에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 합성은 α-아미노 보호된 아미노산을 사용하여 펩티드의 C-말단으로부터 개시된다. t-부틸옥시카보닐(Boc)보호기이외의 보호기가 적절하기는 하나 t-Boc보호기가 모든 아미노기에 사용될 수 있다. 예를들어, Boc-Arg-OH 또는 Boc-Tyr-OH(즉, 선택된 C-말단의 아미노산)는 클로로메틸화 폴리스티렌 수지 지지체로 에스테르화될 수 있다. 폴리스티렌 수지 지지체는 이 폴리스티렌 중합체가 어떠한 유기용매에도 완전히 불용성이 되도록 하는 가교결합제로서 약 0.5 내지 2% 디비닐벤젠을 함유하는 스티렌의 공중합체가 바람직하다.[참조, 스테와르트(Stewart)등, Solid-Phase Pepticle Synthesis, W.H.Freeman Co., SanFrancisco (1969 및 메리필드(Merrifield), I.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963)].
통상적으로, ANVP화합물은 수동으로 조작하거나, 예를들어 기기 편람에 기재된 Biosearch SAM II자동펩티드 합성기(Biosearch,Inc.San Rafael, California)를 사용하여 합성할 수 있다.
다른 방법으로, 본 발명의 화합물은 재조합 DNA구조체를 발현시켜 제조할 수 있다. 이러한 제법은 상기화합물을 다량으로 또는 다른 태양으로 제조하기에 바람직할 수 있다.
더욱 특히, 여러가지 형태의 pre-pro ANVP, pro-ANVP 및 ANVP화합물의 아미노산 서열내의 변형은 화합물의 합성을 지시하는 클론화된 구조유전자의 누클레오티드서열내에 다양한 변화를 일으킴으로서 이루어질 수 있다. 이러한 DNA서열의 변형에는 여러가지 코돈을 동일한 아미노산의 합성을 지시하는 다른 코돈(유전적 코드의 축퇴에 기인함)으로 치환시키는 것이 포함된다.
또한, 코돈치환에 의하여, 하나이상의 아미노산 잔기가 전술한 바와 같은 작용상 동등한 잔기로 치환될 수 있다.
본 발명의 화합물은 온전한 포유류 및 포유류에서 적출한 신장에서 나트륨 이뇨 및 이뇨작용을 갖는 사실이 밝혀졌다. 더우기, 합성 화합물을 포함하여 본 발명의 화합물은 혈관확장 작용을 가지며, 산화에 의해 증가되고 환원에 의해 감소되는 것으로 보이는 알도스테론의 방출을 억제하는데, 이러한 사실은 상기 선명한 생물학적 활성을 위해서, 본 명세서에 기재된 일반식에 함유된 시스테인 잔기사이의 디술파이드 결합이 필요함을 나타낸다.
상기 지적한 생리학적 효과를 갖는 것으로 알려진 본 발명의 화합물은 나트륨 이뇨제, 이뇨제 및 혈관확장제등의 다수의 치료목적에 사용될 수 있다. 즉, 상기 화합물은 고혈압증 및 효과가 없는 신장관류 또는 감소된 사구체 여과율에 기인한 신장질환 이외에, 예를들어, 울혈성 심장질환, 네프로제 증후근 및 간 경변등의 여러가지 부종형태를 치료하는 치료제로서의 용도를 발견할 수 있다.
상기 화합물은 다른 치료제와 유사한 방법으로 즉, 생리학적으로 허용가능한 담체에 함유시켜 사육동물등의 수의학용 및 인체 임상용으로 포유류에 투여할 수 있다. 일반적으로, 용량은 피투여체 체중 1kg당 약0.01 내지 100μg, 보다 통상적으로 0.1 내지 10μg의 범위이다. 이와 달리, 상기 범위내의 용량이 희망하는 치료효과가 얻어질 때까지 장기간, 보통 24시간 경과후 일정주입에 의해 투여할 수 있다.
상기 화합들은 다른 생리학적으로 허용가능한 활성 또는 비활성 물질과의 혼합물 또는 예를들어, 물 또는 생리식염수 등이 생리학적으로 적절한 담체와의 혼합물로서 투여할 수 있다. 상기 화합물은 경구 또는 비경구적으로(예를들어, 주사) 투여할 수 있다. 주사는 피하, 정맥 또는 근육내 주사에 의할 수 있다.
상기 화합물은 산부가염 등의 약리학적으로 허용가능한 염으로서 약제학적 유효량으로 투여함이 바람직하다. 이러한 염에는 예를들어, 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염, 아세트산염, 벤조산염, 말산염, 그밖의 다른 염들이 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 표지된 시약을 사용하는 면역 분석용 항혈청, 보통 항체를 제조하는 데에 사용될수도 있다. 편리하게, 폴리펩티드는 특히 탄소수 4 내지 6이며 지방족인 디알데히드 또는 카보디이미드를 사용하여 항원에 결합시킬 수 있다. 상기의 화합들 및 면역학적 시약은 당기술 분야에 공지된 기수에 의해 발색단, 형광단(예를들어, 플루오레세인 또는 로오다민) 방사성동위원소(예를들어,125I,35S,14C 또는3H) 또는 자화입자등의 여러가지 표지로 표지될 수 있다.
상기의 표지된 화합물 및 시약, 또는 이를 인식할 수 있고 특히 이에 결합할 수 있는 표지된 시약은 예를들어 진단시약으로 사용될 수 있다. 생리학적 피검물에서 추출한 시료는 본 발명의 화합물을 함유하는 통상의 항원 결점인자를 갖는 물질의 존재여부 또는 양에 대해 분석할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체가 본 분야의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며 이 항체는 생체내에서 면역학적으로 관련된 화합물의 과잉생성을 중화시키는 치로제로서 사용될 수 있다.
하기의 실시예로 본 발명이 제한되지 않으며, 이것으로 본 발명을 설명하고자 한다.
실험
하기의 실험적 성명에 있어서, 래트 및 인체 DNA서열에서 유래된 pre-pro ANVPs, pro ANVPS은 기재된 아미노산 서열에 차이를 나타내는 각각 1-152번 및 1-151번의 아미노산 잔기를 갖는다. 화학적으로 합성된 ANVPs는 아미노산 서열은 래트-유래 서열의 126위치 및 인쩨-유래서열의 127위치에서 발견된 아르기닌 잔기로부터 번호를 적는다(참조, 제 1 도 및 제2도).
I. 심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 화합물의 단리 및 정제
본 발명의 범위에 속하는 화합물은 하기의 실험조서에 따라 심방조직으로부터 단리한다. 상기의 화합물및 그의 합성 폴리펩티드 동족체가 집단적인 용어 ANVPs에 포함된다.
폴리펩티드 화합물은 무관한 조직 및 기타 생성들이 거의 함유되지 않도록 심방의 아세트산 추출물에서 단리한다. 1400마리의 숫컷 위스타 래트의 심방을 1mM페닐메틸술포닐 클로라이드(PMSF Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.),3mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 5μM 펩스타틴 A(펩신및 레닌억제제, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)를 함유하는 1N 아세트산 8용적중에 균질화시킨다. 이 균질물을 10,800×g에서 30분간 원심분리시키고 펠렛을 원완충액 4용적중에 다시 균질화시킨다. 추출물로부터의 상청액을 모으고 수산화암모늄으로 중화시킨다. 중화시킨 상청액을 10,000×g에서 20분간 원심분리시키고 동결건조시킨다.
동결건조된 심방 추출물을 6ml완충액에 환원시키고(reconstituted) 원심분리시킨후, 1N 아세트산으로 미리 평형화시킨 세파덱스
Figure kpo00014
G-50의 2.5×45cm겔 여과 컬럼(미세, Pharnmacla Fine Chemicals, Piscataway, NJ)에 적용시킨다. 각 분획물로부터 일정량을 취하여 건조시키고(Savant Speed-Vac concentrator), 인산염 완충액 식염수(PBS)에 환원시킨 다음, 온전한 래트에서 나트륨 이뇨 활성을 분석하고, 토끼의 대동맥 링(ring)을 사용하여 혈관 확장을 분석한다.
상기의 크로마토그래피 결과는 제 3 도에 나타내었으며, 도면에 표시된 영역을 동결건조시킨 다음 0.1%수성 트리들루오로아세트산(TFA)으로 환원시키고 수집, 원심분리한다.
수집한 물질을 15% 아세토니트릴(CH3CN)이 되도록 하고 Waters U 6K주입기 및 용매 전달시스템(Waters, Inc., milford, MA)를 사용하여 0.39×30.0cmμ-Bondapak C18컬럼(Waters, Inc., milford, MA)에 적용한다. 결합 물질을 용매 A(0.1% TFA) : B(CH3CN) 85:15 내지 45:55를 선형 구배로 40분간 용출시킨다.
분획물을 일정량 취하여 적출한 신장에서 나트륨 이뇨 작용 및 후술하는 바와 같이 혈관확장 활성을 분석한다. 나트륨 이뇨작용 및 혈관확장작용이 동시에 일어나는 광범위한 영역이 용출되는데 이 분획을 수집 건조시킨다.
수득하여 건조시킨 물질을 A : B, 78 : 22중에 환원시키고 C18컬럼에 적용시킨 다음 48시간동안 22 내지34% 구배로 용출시킨다. 분획물을 일정량을 추하여 전술한 바와 같이 나트륨 이뇨작용 및 혈관확장 작용에 대해 시험한다. 이 결과는 제 3b 도에 나타내었다. 도면에 나타난 세개의 활성피크의 분획물을 수집하고 밤새 건조시킨다.
두번째 피크의 수집분획물(제 3b 도의 표시부분)을 A:B,72:23중에 환원시키고, C18컬럼에 적용하여 23내지 29% B의 구배로 90분간 용출시킨다. 이러한 재크로마트그래피의 결과는 제 3c 도에 나타내었다. 표시부분은 혈관확장 활성을 갖는 분획이다. 6회 적용하여 활성분획을 수집한다.
상기에서 수득된 물질을 0.39×30cmμ -Bondapak CN킬럼(Water,Inc., milford, MA)에 적용한다. 사용된 용매는 A(물중의 0.1% TFA) 및 B(CH3CN중 0.055% TFA)이다. 시료를 A:B, 90:10중에 환원시키고, 10 내지 30% B의 구배를 사용하여 60분 이상 3회 분리 적용하여 크로마토그래피한다. 혈관확장 활성은 후술할 히스타민-수둑 대동맥 링에 생성된 장력을 완화시킴에 의해 측정된다.
가장 활성적인 피크(제 d 도의 표시부분)를 건조시키고 서열을 분석한다. 이 서열은 Applied Boosystem 470A 기상 서열 분석기(Applied Biosystem Inc., Foster City, CA)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라1mmole의 단백질에 대해 측정한다. PTH아미노산은 Beckman 334 THPLC로 0.46×25cm IBM CN-컬럼을 사용하여 확인한다. 사용된 구배는 문헌의 지시에 따른 것으로 다음과 같이 변형시켰다[참조, 훈카필러, 엔.더블유.(Hunkapiller, N.W.] 및 엘.이.후드(L.E.Hood), Methods in Exzymology,91:486-492(Academic Press, New York)(1983)] : 2변수 구배 시스템을 3변수 구배시스템으로 교체함에 있어, 아세토니트릴 및 메탄올을 분리 펌프로 펌프시키고 이들의 비를 구배 전과정을 통해 시간따라, 구배 프로그램의 변형에 따라 변화시킨다. Permaphase ETH
Figure kpo00015
guard컬럼은 5×0.46cm IBM CN분석용 "미니-컬럼"이며, 분석용 컬럼은 28℃로 가온시킨다.
상기와 같이 무관한 래트 심방조직 및 생성물이 거의 함유되지 않도록 단리된 화합물은 다음의 서열을 갖는다.
Figure kpo00016
상기에서, X는 OH 또는 Tyr-OH이다.
후술하는 뉴클레오티드 서열에서 유래한 래트 및 인체 pre-pro ANVPs 및 pro ANVPs의 아미노산 서열을 비교하여 상기 서열의 화합물을 다음과 같이 칭한다.
rANVP(l26-149)(여기에서 X=OH) 및 rANVP(126-150)(여기에서 X=Tyr-OH)
후술하는 상응하는 인체 DNA서열에서 유래한 상기 ANVPs의 인체 등가물은 hANVP(127-150) 및 hANVP(127-151)로 각각 칭한다. 본 발명의 ANVP 화합물은 기술된 바와 같이 번호를 매긴 NH2말단의 아르기닌 잔기를 포함하여 번호를 매긴다(126-래트 및 127-인체).
정제과정의 생성물을 분석하기 위해 사용된 방법 때문에, 나트륨 이뇨 및 혈관확장 작용은 단리 및 정제된 ANVP물질의 고유성질이다.
II. 심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드의 재조합 DNA클로닝
하기의 실시예에 래트 및 인체 유래 pre-pro ANVPs 및 pro ANVPs를 코드화하는 데옥시리보핵산(DNA)서열이 기재되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드 태양의 발현을 지시할 다수의 다른 서열이 구성될 수 있어야 한다.
A. 래트 pre-pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 cDNA의 클로닝
1. 래트 심방의 mRNA의 단리
총 RNA는 문헌의 방법에 의해 래트 심방으로부터 단리한다[참조, 크리그윈, 제이.엠.(Chirgwin, J. M.) 등, Biochemistry 18 ; 5294-5299(1979)] : 조직을 6M 구아니딘 티오시아네이트, 0.005M 나트륨 시트레이트, pH 7.0, 0.1M 2-머캅토에탄올, 0.5% 사크로실의 용액중에 균질화시킨다. 이 균질물을 CsCl중 2M로 만들고 0.1M EDTA중에서 5.7M CsCl쿠션상에 층을 형성시킨다. 115,000×g에서 16시간동안 원심분리시켜 상기 쿠선을 통고하여 RNA가 펠렛화 되도록 한다. 그 다음 이 RNA를 0.01M 트리스, pH 7.4, 0.005M EDTA 및 1.0% 도데실 황산나트륨(SDS)중에 용해시키고 클로로포름과 1-부탄올의 4:1혼합물을 사용하여 추출한 다음 70% 에탄올로 침전시킨다.
폴리아데닐화 RNA(폴리 A+RNA) 분획은 문헌의 기재와 같이 올리고(dT)셀룰로오스를 사용하여 친화크로마토그래피에 의해 수득된다[참조, 아비브, 에이취.(Aviv, H.) 및 피.레더(P.Leder), Proc. Natl. Acad. Sci.USA 69:1408-1412(1972)]. 폴리 A+RNA는 0.5M NaCl을 함유하는 0.02M 트리스, pH 7.6, 0.001M EDTA, 0.1% SDS 용액에서 셀룰로오스 매트릭스에 결합된다.
비-폴리아데닐화 RNA는 상기 용액으로 컬럼을 세척하여 제거한다. 그다음 폴리 A+RNA를 NaCl이 없는 동일한 용액에서 용출시키고, 70% 에탄올로 침전시킨다. 이러한 방법으로 10gm의 심방조직에서 100μg의 폴리아데닐화 RNA를 단리한다.
2. 래트 심방의 cDNA 라이브러리(1lbrary)의 생성
이본쇄 cDNA는 문헌에 기재된 대로 EcoR I 및 Sal Ⅰ 올리고 누클레오티드 링커를 연속적으로 첨가시켜 플라스미드 벡터 pUC8[참조, 비에이라, 제이.(Vieird,J.) 및 제이.메싱(J.Messing),Gene 17:259-268,1982]내로 삽입시키기 위해 합성, 제조한다[참조, 헬프만, 디.엠(Helfman, D.M.)등, Proc. Natl.Acad.Sci. USA 80:31-35(1983)].
올리고(dT)12-18로 개시되는 아비안 미엘로블라스토시스 비루스(Avian Myeloblastosis Virus)로부터의 RNA-종속 DNA 폴리머라제에 의해 제 1스트랜드 cDNA를 합성한다. 그다음 염기성 가수분해에 의해 RNA주형을 제거한다. 제 1스트랜드 분자의 3'-말단에 자체적으로 개시되어 이본쇄 헤어핀(hair pin) DNA를 형성시키는 RNA-종속 DNA 폴리머라제에 의해 제 2스트랜드 DNA가 합성된다. 이러한 분자는 이. 콜라이(E.Coli)의 DNA폴리머라제 1의 큰 단편을 사용하여 개방된 말단부에서 평활 말단(blunt end)을 만들어 1본쇄 영역을 채운다. T4-DNA리가제를 사용하여 EcoR I올리고 누클레오티드 링커를 개방-말단에 첨가시킨다. 헤어핀 루프(loop)는 종종 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터의 S1누클레아제에 의해 절단 개방되어 분자의 말단은 전과 같이 다시 평활 말단이 된다.
그다음 T4-DNA리가제를 사용하여, Sal I올리고 누클레오티드 링커를 첨가한다. Sal I 및 EcoR I "점성 말단(Sticky end)"은 상기의 제한 엔도 누클레아제로 절단하여 제거한다. 이러한 2본쇄 이중-연결된 cDNA분자는 EcoR I 및 Sal I-분해 pUC 8에 연결하고, 문헌에 기재된 CaCl2-처리에 의해 이.콜라이MC1061로 감염시킨다[참조, 카사바덴, 엠.(Casabaden,M.) 및 에스.코헨(S.Cohen), J.Mol Biol.138 : 179-207(1980)].
5μg의 래트 심방의 폴리 A+RNA로 300염기쌍 이상으로 선택된 크기의 약 25mg의 cDNA가 수득되는데 약 200,000종의 독립적인 재조합체의 라이브러리를 수득한다. 이러한 재조합체를 니트로셀룰로오스 필터상에 얇게 펴놓고 복사체를 놓은 다음, 이 라이브러리를 문헌의 지시에 따라 -70℃에서 글리세롤 항침 필터상에서 동결 저장한다[참조, 하나한, 디.(Hanahan, D) 및 엠.메셀손(M.Meselsan), Gene 10:63-67(1980) 및 하나안, 디. 및 엠.메셀손, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, pp 333-342].
3. 래트 심방의 cDNA라이브러리의 스크리닝
단락 I에서 결정한 고유의 래트 ANVPs의 아미노산 서열은 문헌의 기재대로 래트 심방의 cDNA라이브러리를 스크린하기 위한 올리고누클레오티드 프로브를 설계하는데 사용된다[참조, 왈레이스, 알.비.(Wallace, R.B.)등, Nucleic Acids Res.9 : 879-894(1981)]. 유전자 코드의 축퇴에 기인하여 두가지 올리고누클레오티드 푸울이 각 영역에서 합성된다. 영역 1은 두가지 테트라디세이며 올리고누클레오티드 푸울, 각 64염기서열로 구성되는 프로브, a 및 프로브 b를 포함한다. 이 올리고누클레오티드 프로브의 서열및 위치를 제 4 도에 나타내었다. 천연의 래트 ANVP의 4 내지 13번 아미노산의 서열이 4가지 올리고누클레오티드 혼합물, 영역 1에 대한 프로브 a 및 b, 영역 2에 대한 c 및 d(여기서, R=A 또는 G, Y=T 또는 C, N=A, G,T 또는 C이다)을 함께 나타나 있다. 각각의 올리고누클레오티드 혼합물은 문헌의 기재와 같이 축합제로서 N-메틸이미다졸의 존재하에 메시틸렌술포닐 클로라이드를 사용하는 표준 포스포트리에스테르법의 변형법에 의해 Biosearch SAM I 올리고누클레오티드 합성기(Biosearch, Inc., San Rofael,Cal.)상에서 합성하고 [참조, 에피모브, 브이.에이.(Efimov, V.A.)등, Nuc. Acids Res.10;6875-6894(1982)], 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 정제한다.
그다음 cDNA 라이브러리를 상기의 프로브를 사용하는 콜로니 혼성화에 의해 스크린한다. 각 여과지(filter)로부터 4가지의 복사체 여과지를 제조함으로써 각 콜로니를 각각의 올리고누클레오티드 프로브 푸울로 스크린할 수 있다.
여과지를 2시간 동안 80℃ 진공하에서 구운후 다량의 3×SSC(1×SSC는 0.15M NaCl, 0.15M 시트르산나트륨, pH 7.5이다) 0.1% SDS중에 진탕시키며 68℃에서 밤새 세척한다. 이 여과지를 6×SSC, 0.1%SDS,1mM EDTA 5X 덴하르트용액(Denhardts solution)(0.1% 피콜, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 소혈청 알부민) 0.05% 피로인산나트륨 중에서 최소 2시간동안 50℃에서 예비혼성화시킨다.
그다음 이 여과지를 45℃의 진탕수조에서 100μg/ml tRNA를 함유하는 10ml 혼성화 용액중에서 여과지당 2.5×106cpm32p-표지된 올리고누클레오티드 프로브 혼합물 [마니아티스, 티.(MaMatis,T.)등, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982, pp.122-123에 의해 포스포릴화]로 혼성화시킨다. 1시간후, 온도조절 장치를 25℃까지 낮추고 이 용기를 12시간동안 평형화시킨다. 여과지를 6×SSC, 0.1% SDS중, 실온에서 15분간 2회 세척한 다음 35℃(프로브 c 및 d의 경우) 또는 39℃(프로브 a및 b의 경우)에서 1 내지2분간 6×SSC, 0.1% SDS로 세척한다. 최종 세척온도는 실험식 Td=4(G+C)+2(A+T)으로부터 계산하여 수득한다[참조, 서그스, 에스.브이(Suggs, S.V.)등 Developmental Biology Using Purified Genes(ed. D. D. Brown and C. F. Fox)Academic Press, New York pp.683-693]. 혼성화 여과지를 건조시키고 완전히 노출시킨 Dupont
Figure kpo00017
cronex강화 스크린을 사용하여 Kodak
Figure kpo00018
XAR 필름상에서 오노라디오그래프한다.
1번 영역중 하나의 프로브 및 2번 영역중 하나의 프로브를 사용하여 혼성화하는 경우 콜로니는 양성일 것으로 추측된다. 올리고누클레오티드 프로브(푸울 a 및 c)에 강력히 혼성화된 콜로니 및 심실 cDNA 르로브가 아닌 랜덤재시 심방 cDNA에 혼성화된 콜로니중 하나를 선택한다. 상기 클론의 서열은 래트 pre-pro ANVPs를 코드화한 서열임이 증명되였다. 이 클론은 pNF1로 칭한다.
4. 래트 pre-pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 cDNA의 완전한 서열화
pNF1에서 수득한 정제 DNA삽입물은 소미니프렙 법(small miniprep method)으로 제조하고[참조, 마니아티스 등, Supra p 366)아크릴아미드겔상에서 단리한다. 온전한 DNA삽입물을 5' 및 3'말단에 각각 EcoR I 및 Sal Ⅰ위치를 통하여 박테리오파지 M13[메싱, 제이(Messing., J.) 및 제이.비에리아(J.Vieria),Gene 19 : 259-268(1982)에 기재된 디데옥시누클레오티드법을 사용하여 DNA서열을 특별히 배열한 이론쇄파지)내로 서브클론화한다(제 5 도). 완전한 서열의 초기 판독은 생거(Sanger) 디데옥시누클레오티드 서열분석법을 사용하여 상기 클론으로부터 수득한다[생거, 에프. (Sanger, F.)등, Proc Nat. Acad. Sci. USA 74:5463-5469(1977)] 상기 초기서열을 확인하기 위하여, 별도로 다른 DNA쇄의 판독이 필요하다. 이러한 경우, 염기 340의 HincII부위가 사용된다. 제조된 삽입물을 엔도누클레아제 HincII로 절단하고 생성되는 분해물을 Sma I과 EcoR I(화살표 5)로 절단한 N13 mp9와 Sal Ⅰ 및 Sma I(화살표 6)으로 분해한M13 mp8내로 클론화한다. 상기와 유사하게 염기 647에서 Pst I부위를 사용하여 추가로 확인한다(화살표 3및 4) 서열분석에 사용된 초기 클론(pNE1)이 서열의 784염기에서 말단화되지만(제 2 도 참조), 또다른 클론(pNF4)는 3'이후에 최종 22염기와 3'폴리 A말단 서열이 함유되도록 연장된다. 상기 클론의 3'발단의 서열은 삽입물(화살표 7)의 Pst I에서 Sal I까지 부위를 함유하는 M13클론을 사용하여 수득하는데 2도에 염기 785-806으로 나타내었다.
최종적으로, DNA의 5'-말단의 누클레오티드는 염기 1-186에 걸친 Bgl II 단편을 사용하여 5'영역에 상보적이 되도록 한32P-표지 일본쇄 DNA의 맥삼-길버트 서열분석에 의해 측정한다[참조, 맥삼, 에이.(Maxam, A.) 및 더블유. 길버트(W.Gilbert), Proc, Nat.Acad. Sci. USA 74 : 560-564(1977)] 이렇게 측정한 서열은 염기 1-22로 제 2 도에 포함되어 있다. 즉 누클레오티드 서열 분석으로 제 2 도의 염기 23-784를 함유하는 클론 pNF1이 ANVP전구체, pre-pro ANVP을 코드화함을 확인하였다. 심방 cDNA라이브러리를 cDNA삽입물, 약 0.5%의 혼성 콜로니로 다시 스크린한다. 이것으로 pre-pro ANVP mRNA가 래트 심방의 mRNA개체군내의 주종임이 나타난다.
천연의 래트 pre-pro ANVP의 아미노산 서열은 cDNA누클레오티드 서열로부터 측정한다. 염기 85에서 541위치의 말단 코돈까지 개시코돈 ATG로부터 연장되는 152아미노산 서열을 코드화하는 단일 개방 판독프레임이 밝혀졌다. 생물학적 활성 ANVPs(제 5 도 참조)는 인체 및 래트 pre-pro ANVP의 아미노산 서열(각각 제 1 도 및 제 2 도 참조)에서 확인될 수 있다
5. 심방특이성의 측정
심방 및 심실의 폴리 A+RNA를 문헌의 방법에 의해 수산화메틸 수은을 함유하는 1.4% 아가로스겔상에서의 전기영동에 의해 분별 분류한 후 노던 반점분석을 적용한다[바일레이, 제이.엠.(Balley, J.M.) 및 엔.데이비슨(N.Davison), Anal.Blochem.70 : 75-85(1976)] 니크(nick) 해석 pNF1 DNA를 사용하는 노던 반점분석의 결과는 제 6a 도에 나타나 있으며, 레인 1은 심방의 폴리 A+RNA를, 레인 2는 심실의 폴리A+RNA를 함유한다. 제 6a 도에 나타낸 바와 같이 pNF1은 길이 약 800 내지 900누클레오디드의 심방mRNA에 혼성화된다. 심실의 mRNA에 혼성화되지는 않는다 .
상기에서 결정한 pre-pro ANVP에 대한 cDNA서열은 약 16,500달톤의 분자량을 갖는다. 실제적인 전구체 크기를 측정하기 위하여, pre-pro ANVP를 코드화하는 심방의 mRNA를 1㎠의 니트로셀룰로오스디스크당 5μg pNF1 DNA를 고정시키고 5μg의 폴리 A+RNA로 3시간 동안 50℃의 20mM PIPEs, pH 6.4, 1mM EDTA, 65% 포름아미드,5×SSC, 0.1% SDS중에서 혼성화시켜 혼성 선택법에 의해 정제한다[참조, 골드버그, 엠.엘.(Goldberg, M.L.)등, Methods in Enzymology 68 : 206-220, Academic Press, New York]. 여과지를 10mM 트리스-HCl pH 7.5, 0.15M NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS로 70℃에서 잘 세척한다. 그다음, 필터를 SDS가 함유되지 않은 동일한 완충액으로 세척한다. 혼성화된 RNA를 1분간 50μg의 효모 tRNA존재하에 100℃의 H2O중에서 용출시키고 -70℃에서 빠르게 냉동시킨다. 해동시킨 후,이 RNA를 2용적의 무수 에탄올을 사용하여 에탄올 침전시킨다.
하이브리드 선택 RNA 및 총 폴리 A+RNA는 250μ Ci/ml[35S]-메티오닌의 존재하에 토끼의 망상 적혈구 용해질 시스템(Bethesda Research Labs, Gaithersburg, Maryland)을 사용하여 변역된다. 번역 생성물은 시료당 1×106cpm의 산 침전가능 방사활성을 가한 2-차원 겔 전기영동에 의해 분별한다. 첫번째 차원은 PH 3.5 내지 10의 구배를 사용하는 동전 집속겔이다[참조, 오파렐, 피 제트.(Ofarrell, P.Z.)등, Cell 12:113-1142(1977)]. 등전집속의 생성물을 15% 겔을 사용하는 SDS-PAGE에서 전기영동시킨다. 살리실산 나트륨으로 평형화시킨 후 겔을 건조시키고 -70℃에서 24시간동안 형광사진을 촬영한다.
이 결과는 제 6b 도 및 제 6c 도에 나타내었으며, 여기에, 12,000 내지 30,000달톤의 분자량을 갖는 여러가지 심방의 특정 번역 생성물의 위치를 화살표로 나타내었다. pNF1 하이브리드 선택 심방의 RNA에 의해 코드화되는 번역 생성물은 제 6d 도에 나타내었는데, 주요 심방의 특정종류인 18,000 내지 2,000달톤을 갖는 적어도 3가지의 관련된 단백질 종류를 나타내었다. 제 6e 도는 하이브리드 선택이 어떠한 심실 특이성 단백질도 인식하지 않음을 나타낸다. 선택된 하이브리드인 제 6d 도의 단백질은 심방특이성을 가지며, 보정한 분자량범위이므로, 이 단백질은 pre-pro ANVPs이다.
B. pre-pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드를 코드화하는 인체 유전자의 클로닝
1. 인체 고유 pre-pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 유전자의 단리
래트의 pre-pro ANVP를 코드화하는 cDNA(pNF1에서 단리)는 인체 유전자를 확인하는 프로브로서 제공된다. 박테리오파지 샤론 4A중의 인체게놈성 클론 라이브러리[로운, 알.엠.(Lawn,R M )등, Cell 15:1157-1174(1978)]는 하버드 대학의 티.마니아티스(T.Maniatis) 박사로부터 제공받았다.
약 106파지는 이.콜라이 K803에서 성장시키고, 반점 용해질을 문헌의 기재대로 니트로셀룰로오스 여과지로 옮긴다[참조, 벤톤, 더블유.디.(Benton, W.P.) 및 알.더블유.데이비스(R.W.Davis), Science 196:180-182(1977)]. 이 여과지를 니크 번역법(리그비, 피.더블유.제이.(Rigby, P.W.J.)등 J.Mol.Biol.113:237-251(1977)]에 의해32P로 방사표지한 래트 cDNA와 혼성화시킨다. 이 여과지를 42℃에서 1시간동안 혼성화 완충액(0.75M NaCl, 0.75M 질산나트륨,40% 폴리아미드, 0.05% SDS,0.02% 소의 혈청알부민, 0.02% 피콜-400,000, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피로인산나트륨, 20μg/ml 변성 전단 연어정자 DNA)중에서 예비세척한다. 새로운 혼성화 완충액 1ml당 5×105cpm의32P-표지된 끓인 래트 pre-pro ANVP cDNA를 가하고, 이 여과지를 42℃의 상기 완충액중에서 16시간동안 인큐베이트시킨다. 그다음 여과지를 0.3M NaCl 및 0.3M 질산나트륨 및 0.05% SDS중에서 50℃로하여 3회 세척하고 오토라디오그래피에 밤새노출시킨다. 래트고유의 pre-pro ANVP cDNA에 혼성화시킨 서열을 함유하는 여섯개의 클론이 정제된다.
전 길이의 클론을 확인하기 위해 고유한 인체 pre-pro ANVP 유전자의 크기를 측정한다. 블린, 엔.(Blin, N.) 및 디.스타포드(D.Stafford)의 방법에 의하여 [참조, Nuc Acid Res. 3:2303-2308(1976)] 20g의 래트의 간으로부터 2mg의 고분자량 DNA를 제조한다. 이 DNA를 제한 엔도 누클레아제 BamHⅠ,Bgl II, kpn I 및 Sac I 단독으로 및 EcoR I와 함께 사용하여 분해하고, 1% 아가로스겔상에서 전기영동시킨뒤 서던의 방법에 의해 니트로셀룰로스 여과지에 옮긴다[서던, 이.임., J.Mol.Biol.98:503-517(1975)]. 이 여과지는 클론의 동정에 사용되는 동일한 조건에 의해 고유의 래트 Pre-Pro ANVPs에 상동인 서열에 대해 프로브로 사용된다. 이러한 방법으로 독특한 2,600염기쌍 EcoR I-BamH I DNA단편을 동정하여 완전한 유전자를 밝힌다.
다음에 래트의 pre-pro ANVPs cDNA에 하이브리드화된 여섯개의 인체 게놈의 클론을 유사한 크기의 단편의 존재에 대해 분석하였는데,λHG 6로 표시된 단편들중의 하나는 상기의 단편을 함유하였다.
λHG 6 DNA를 EcoR I 및 BamH I으로 분해시킨다음 DNA단편을 동일한 엔도뉴클레아제로 먼저 분해시킨 pBR 322에 연결한다. 연결 생성물을 상기에서 기술한 바대로 이.콜라이 MC 1061세포에 옮긴다. 이렇게 하여 플라스미드 pHGRB1를 다른 단편들에 대한 클론들로부터 생성시키고, 문헌[Grunstein, M. and D. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 : 3961-3965(1975)]에 기술된 콜로니 하이브리드화 절차로 동정한다. 하이브리드화는 상기에서 기술한 바대로 수행한다. pHGRB1을 서열화한 다음 고유의 인체 pre-pro ANVP에 대해 전체 유전자 서열을 함유함을 알 수 있었다.
2. 인체의 천연 pre-pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 유전자의 서열화
인체 유전자로서, 래트 cDNA와 하이브리드시킬 2589염기쌍 단편을 대규모 플라스미드 프레프(prep)로부터 4% 폴리아크릴아미드겔 전기영도에 의해 제조한다. 서열화를 진행시키기 전에, 커다란 크기의 DNA단편은 서열을 보다. 조그만 단편들로 분해시키는 몇개의 유용한 제한 엔도뉴클레아제 절단부위를 결정한다.
특히 유용한 부위는 586(Sst I),984 및 1839(Ava I), 및 1581 및 2374(Pst I) 위치에서 발견된다. 이들부위는 제II.A.4장에서 래트의 cDNA에 대해 기술된 방법과 일치하는 인체 유전자 서열화 전법을 묘사한 제 7 도에 나타나 있다. 양 DNA가닥상에서 이들 영역을 포함시키기 위하여 이들 부위사이에서 DNA단편들을 연결시켜 몇개의 m13 서브클론을 제조한다. 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 m13 서브클로닝에 의해 생성된 DNA단편은 제 7 도에서 화살표 1 내지 10에 의해 지적된다. 생성된 서열은 제 1a 도에 나타나 있다. 수득한 서열정보는 제조자의 지시에 따라 다양한 지능유전학(팔로 알토, 캘리포니아) 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석한다. 시그널 펩티드, 전구체 서열 및 성숙한 펩티드를 함유하는 영역은 래트의 천연 pre-proANVP cDNA와 비교함으로써 동정한다. 완전한 코딩 영역은 BamH I 내지 EcoR I 단편내에 포함되며,유전자코딩 영역은 122 및 1095 염기증 2개의 인트론, 및 약 577-696,819-1145 및 2241-2536염기를 연결시킨 3개의 엑손을 함유한다. 전사의 개시(염기 347-354 및 446-452) 및 종결(염기 2515-2520) 둘 다를 위해 추정의 조절신호도 또한 이 단편내에 위치한다. 제I장에서 단리된 rANVPs의 인체 등가물은 인체 유전자의 두번째 및 세번째 엑손내에 위치하는 것으로 추론될 수 있다
C. 인간의 pre-pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 cDNA의 클로닝
1. 인간 태아의 심장 RNA의 단리
임신 26주에 수득한 인간 태아의 심장을 사용하여 제II장에서 기술한 바대로, 폴리 A+mRNA를 제조한다. 총 1.7gm의 심장조직으로부터 60μg의 폴리 A+mRNA가 단리된다.
2. 인간 태아의 심장 cDNA라이브러리의 생성
2본쇄 cDNA를 문헌[Manniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982, pp.212-246]에 기술된 바대로 제조한다. 10μg의 주형 RNA를 1본쇄 cDNA내로 올리고 dT 12-18를 사용하여 개시되는 AMV역 전사효소를 사용하여 복제한다. 이어서 RNA주형을 염기 가수분해 반응으로 제거하여 2본쇄화 한다. DNA는 첫번째 본쇄 cDNA의 3'-말단에서 자연적으로 발견되는 헤어핀 루프에 의한 자가 개시에 따른 AMV역전사효소에 의해 합성된다. 생성된 2본쇄 헤어핀 DNA는 아스퍼질러스 오라이재(Aspergillus Oryzal)로부터 S1-뉴클레아제로 처리하여 헤어핀 루프를 제거한 다음, 생성된 분자를 커다란 단편의 이.콜라이 DNA폴리머라제(I)으로 처리하여 그들을 평활 말단화한다. EcoR I올리고뉴클레오타이드 링커를 T4-DNA리가제를 사용하여 CDNA분자에 가하고 점성 EcoR I 말단을 제한 효소EcoR I으로 절단하여 방출한다. 생성된 2본쇄의 EcoR I로 연결된 cDNA는 바이오겔 A-50m 칼럼(리치몬드 소재의 바이오레드사)상에서 크기를 분류하여 길이가 500bp보다 긴 cDNA 10mg를 회수한다.
크기 분류된 cDNA를 문헌[Huynh, T.V. et al., cDNA Cloning Techniques A Pratical Approach,ed. D. Glover(IRL,oxford) 1984 in Press]에 기술된 바대로 박테리오파지 λ-벡터,λgt 10에 클론화시킨다. DNA를 λgt 10으로부터 제조하여 EcoR I로 분해한다. 이 DNA를 EcoR I로 결합된 인간 태아 심장의 cDNA에 연결시키고 아메르샴(Amersham)사로부터 입수한 포장용통을 사용하여 시험관내에서 포장한다. 생성된 파지를[문헌 Huynh, T.V.et al., Supra]에 기술된 이.콜리 균주 BUN 102상에 도말한다. 이러한 방식으로, 약 200,000 각 원의 인간 태아 심장의 라이브러리를 수득하여 저장 및 선별을 위해 확대한다.
3. 인간 태아 심장의 cDNA라이브러리의 선별
도서관은 문헌[Maniatis, T. et al., pp.302-321]에 기술된 바대로 역병 하이브리화 반응에 의해 선별한다. 하이브리드화 반응 프로브는 래트의 pre-pro ANVP, cDNA클론 pNF1[참조 : 본 명세서의 제II. A.3장]로부터의 EcoR I-Sal I 삽입물이다. 이 정제된 DNA 단편은 베데스다. 리서치 래보러토리스 사로부터 입수가능한 키트를 사용하여 니크 번역에 의하여32P표지한다.
증대된 인간 태아 심장의 cDNA 도서관을 사용하여, 파지는 숙주균주 BNN 102를 사용하여 플레이트상에 도달한다. 이 플레이트로부터 니트로셀룰로오스 필터를 들어 올리고, 진공하 80℃에서 2시간동안 구워, [32P]로 표지된 래트의 pre-pro ANVP cDNA, pNF삽입물 5×105cpm에 하이브리드화시킨다. 하이드러드화는 40% 포름아미드, 50mM 나트륨 포스페이트 pH 6.5, 5×덴하르츠 용액(0.1% 피콜, 0.14M 폴리비닐피리딘, 0.1% 소의 혈청 알부민), 5×SSC, 50μg/ml 연어의 정액 DNA 및 50μg/ml효모 RNA중의 42℃에서 16시간동안 수행한다. 필터는 1×SSC 0.1% SDS중의 50℃에서 30분동안 2회 세척하여 방사선 사진을 찍는다. 이어서 인간의 pre-pro ANVP cDNA클론에 상응하는 총 20개의 하이브러드화 파지를 동정한다.
4. 인간의 pre-pro ANVP cDNA클론의 서열분석
양성적으로 하이브리드화된 파지 12개를 선택하고 재도말하여 균질하게 정제한다. 파지 DNA프레프는 이 인간의 pre-pro ANVP cDNA클론으로부터 만들고 DNA는 EcoR I로 분해하여 cDNA삽입물의 크기를 측정한다. 이렇게 하여 제 6 번 클론은 약 700염기쌍의 삽입물을 갖는다고 나타났으며 DNA서열 분석용으로 선택한다.
제 6 번 클론의 EcoR I삽입들은 파지 M13벡터내로 서브클론화되어(Messing J. ＆ Vieira, J., Gene 19 259-268(1982)) 문헌 Sanger, F.et al., Supra]에 기술된 바대로 디데옥시뉴클레오타이드 체인 종졀 방법으로 서열화한다.
인간의 pre-pro ANVP cDNA의 제 6 번 클론의 뉴클레오티드 서열은 제 1b 도에 나타나 있다. 이 클론을 래트의 pre-pro ANVP cDNA와 비교하여 인간의 ANF pre-pro ANVP에 상응하는가를 확인한다. 이cDNA클론은 아미노산 15에 상응하는 부위로부터 인간의 pre-pro ANVP 코딩영역을 통하여 확장되여 모든 3'-미번역 영역을 함유한다. 그러므로 이것은 인간의 pro ANVP의 생물학적 활성 성분의 모든 코딩서열을 함유하며 외래 시스템에서 발현시키기에도 적절하다.
Ⅲ. 심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드의 화학적 합성
A. 합성 과정
하기 일반식(III-A)을 갖는 본 발명의 화합물 및 하기 일반식(III-B)을 갖는 본 발명의 화합물은 고체-상 기술에 의해 합성한다.
Figure kpo00019
상기식에서, n은 19이고, aan은 일반식
Figure kpo00020
[여기에서, Rn은 수소이거나, 2개 이하의 질소, 산소 또는 황원자의 치환체(예를들어, 아미도, 티오 또는 옥시이거나, 하이드록시, 티올 및 에테르(예를들어 에테르는 통상적으로 탄소수 1의 알킬 에테르, 예를들어 메틸 에테르이다)를 함유)를 갖는 탄소수 1 내지 10, 통상적으로 1 내지 6의 지방족, 방향족 또는 알크아릴 그룹이다]의 D-이성체, L-이성체 및 DL-이성체(라세미체 혼합물)중의 하나이며, X는 수소, 아미도, 아세틸이거나 부가적으로 125아미노산 잔류물까지의 올리고펩티드(그의 N-아세틸 유도체 포함)를 포함하며, Y는 히드록실, 아미도 또는 20개 까지의 아미노산 잔기의 올리고펩티드(그의 C-말단 아미드 유도체도 포함)이며, AA1, AA8및 AA11는 동일하거나 상이한 염기성 극성 아미노산 잔기, 바람직하게는 Arg일 수 있으며, AA2, AA3, AA6, AA7,AA13, AA15, AA16, AA17및 AA19는 동일하거나 상이한 중성, 극성, 아미노산 잔기일 수 있는데, 바람직하게는, AA2및 AA3는 Ser이고, AA6는 GIy 또는 Ala이며, AA7은 GIy이고, AA13은 Gly 또는 Ala이며, AA15는 Gln이고, AA16은 Ser이며, AA17은 Gly 또는 AIa이고, AA19는 Gly이며; AA5, AA9, AA12, AA14및 AA18은 동일하거나 상이한 중성, 비극성, 아미노산 잔기일 수 있는데, 바람직하게는 AA5는 Phe이고, AA9은 Ile, Met 또는 Va1이며, AA12은 Ile이고, AA14는 Ala이며 AA18은 Leu이고; AA10은 산성극성 아미노산 잔기, 바람직하게는 Asp일 수 있다.
합성은 제조자의 지시에 따라 t-Boc아미노산을 사용하여, 수동적으로 또는 , 바이오서치 SAMⅡ 자동조작된 페티드 합성기 (Biosearch, San Rafael, California) 상에서 수행 한다.
상기 기술된 내용에 따라, 하기 절차는 신규 ANVPs의 화학적 합성을 위해 사용한다.
과정A
Boc-AAn-AAn-1·‥‥AA1하이드록시메틸 폴리스티렌 에스테르의 제조
Boc-AAn-o-폴리스티렌-수지(0.2-0.6밀리몰/아클론 g)(Peninsula Labs, Inc.) 1g을 계획표 A에 따라 처리하여 Boc-AA1-OH…Boc-AAn-1-OH를 혼입시킨다.
계획표 A
1) 디클로로메탄(CH2Cl2)으로 3회 세척.
2) TFA : CH2Cl2: EDT(45 : 50 5용적비)로 1분동안 처리
3) TFA : CH2Cl2: EDT(40 : 50 5용적비)로 20분동안 처리
4) CH2Cl23회 세척
5) CH2Cl2중의 10%(v/v) 디이소프로필에딜아민(DIPEA)으로 1분동안 2회 처리.
6) CH2Cl2으로 2회 세척
7) MeOH로 2회 세척.
8) (5 내지 7)을 1회 반복
9) CH2Cl2로 3회 세척
10) CH2Cl2또는 DMF/CH2Cl2(50:50용적)중에 용해된 적절히 보호된 Boc-아미노산의 먼저 형성된 대칭 무수물 1 내지 6등가물을 첨가.
Boc-Asn-OH 및 Boc-Ala-OH는 N-하이드록시벤조트리아졸의 활성 에스테르와 커플된다.
11) CH2Cl2로 2회 세척.
12) 10% DIPEA로 2회 세척.
13) CH2Cl2로 2회 세척.
14) MeOH로 2회 세척.
15) CH2Cl2로 2회 세척
16) 단계(11 내지 15)를 1회 반복
17) 문헌[Kaiser et al., Annal. Biochem. 34 : 595(1970)]에 따른 닌히드린 반응으로 시험.
반응이 완결되지 않는 경우, 단계(10 내지 16), 또는 , N-아세틸 이미다졸(DMF중의 0.30M) 또는 CH3Cl2중의 과량의 무수 아세트산을 사용하여 캡 합성을 반복한다.
과정 B
Boc-AAn-P-메틸벤즈하이드릴아민 수지의 제조
Boc-AAn-OH를, 하기에 기술한 바대로, 디사이클로헥실카보디이미드를 거쳐 p-메틸벤즈하이드릴아민(pMBHA)에 결합시킨다.
계획표 B
1) p-MBHA, HCl수지를 세척.
2) CH2Cl2중의 10%(v/v) DIPEA으로 수지를 2회 세척.
3) CH2Cl2로 2회 세척.
4) MeOH로 2회 세척.
5) CH2Cl2로 2회 세척.
6) CH2Cl2중에 용해된 적절히 보호된 Boc-아미노산의 먼저 형성된 대칭 무수물 1 내지 6등가물을 0.5내지 24시간의 반응시간으로 첨가.
미반응 아미노그룹은 0.30M N-아세틸이미다졸: -DMF, 또는 아세트산 무수물:CH2Cl2으로 아세틸화시킨다.
하기 실시예중 처음 2개는 래트의 심방으로부터 분리시킨 천연 펩티드의 화학적 합성을 설명한다(참조 : 제 I 장)
실시예 III.A. 1 : rANVP(126-150)
Figure kpo00021
Boc L-Tyr(BrZ) O-수지(Peninsula Labs Inc., 0.54meq/g, Belmont, A) 1g을 필요한 아미노산 서열 [Loc -Arg(Tos) OH, Boc -PheOH, Boc -Ser(Bzl) OH, Boc -AsnOH, Boc -Cys(4 -CH3bzl)OH, Boc-GlyOH, Boc-LeuOH·H2O, Boc-GlyOH, Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-GlnOH, BocAlaOH, Boc-GlyOH, Boc -IleOH·1/2H2O, Boc -Arg(Tos) OH, Boc -Asp (OBzl) OH, Boc -IleOH·1/2H2O, Boc -Arg (Tos) OH, Boc -GlyOH, Boc -GlyOH, Boc -PheOH, Boc -Cys(4CH3Bzl) OH, Boc -Ser(bzl) OH,Boc-Ser(bzl)OH, Boc-Arg(Tos)OH)의 순서로 도입]을 사용하여 과정 A에 따라 수행한다. 보호된 펩티딜 수지를 TFA : CH2Cl2: EDT(45 : 50 : 5v/v/v)로 1분동안, 이어서 20분동안 처리한 다음, CH2Cl2로 3회, MeOH로 2회 세척하여 탭티딜 수지의 TFA염을 수득하고 진공중에서 건조시킨다.
이어서 탭티딜 수지를 10% 아니솔 및 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 불화수소(HF)중에 -10℃에서 30분동안 및 0℃에서 30분동안 현탁시킨다. HF를 진공하에서 증발시켜 제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 디에틸 에테르로 1회, 클로로포름으로 1회 및 디에틸 에테르로 1회 세척한다. 펩티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 혼합물로부터 추출하고, H2O로 희석시키고 동결건조시켜 산화되지 않은 디하이드로 펩티드를 수득한다.
조 펩티드를 탈산소 0.01M 암모늄 아세테이트(NH4OAc)(pH 8)에 0.5mg/ml까지 용해시킨 다음, 20분동안 교반하고 아세트산을 사용하여 pH 5로 조정한 약 과량의 0.01M 칼륨 페리시아나이드(KCN) 용액을 적가하여 산화시킨다. 펩티드 용액을 DOWEX AG 3×4음이온 교환수지로 처리하여, 여과하고, H2O로 희석시키고 동결전조시켜 환상화된 조 펩티드를 수득한다.
펩티드의 정제는 용출제로 0.5M AcOH를 사용하여 세파덱스 G-25F상에서 탈염시키고, 300mM NH4OAc를 가하여 생성된 용출성분을 사용하여 CM-세파로오스(Pharmacia Fine Chemicals) 또는 CM-셀룰로오스(Whatman)상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행하여 pH 4.5의 0.01M NH4OAc 용액을 수득한다. 역상 HPLC에 의한 평가로 최소 97% 순도를 갖는 회수된 분획을 합하여 H2O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 rANVP(126-150) 아세테이트염을 수득한다.
실시예 Ⅲ.A.2 : rANVP(126-149)
Figure kpo00022
Boc-Arg(Tos) O-수지 1.2g(Biosearch, Inc , San Rafael, CA)을 필요한 아미노산 서열[Boc-PheOH, Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-AsnOH, Boc-Cys(4-CH3bzl)OH, Boc-GlyOH, Boc-LeuOH·H2O, Boc-GlyOH, Boc-Ser(bzl)OH, Boc-GlnOH, BocAlaOH, Boc-GlyOH, Boc-IleOH·1/2H2O,Boc-Arg(Tos)OH, Boc-Asp(OBzl)OH, Boc-IleOH·1/2H2O, Boc-Arg(Tos)OH, Boc-GlyOH, Boc -GlyOH, Boc -PheOH, Boc -Cys(4CH3bzl) OH, Boc -Ser(Bzl) OH, Boc -Ser(Bzl) OH, Boc -Arg(Tos)OH)의 순서로 도입]을 사용하여 과정 A에 따라 수행한다. 보호된 펩티딜 수지를 TFA CH2Cl2EDT(45 50 5v/v/v)로 1분, 및 이어서 20분동안 처리한 다음, CH2Cl2로 3회 및 MeOH로 2회 세척하고 진공중에서 건조시켜 펩티딜 수지의 TFA염을 수득한다.
이어서 펩티딜 수지를 10% 아니솔 및 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 HF중에 -10℃에서 30분동안 및 0℃에서 30분동안 현탁시킨다. HF를 진공하에서 증발제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틴 에테르에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 2회, 및 디에틸 에테르로 2회 세척한다. 펩티드를 2.0M 아세트산으로 추출하고 동결건조시켜 산화되지 않은 디하이드로 펜티드를 수득한다
조 팹티드를 2.0M 아세트산 및 10mM 2-머캅토에탄올중에 용해시키고 동일 용액중에서 세파덱스 G-25SF칼럼상에서 크로마토그래피한다. 펩티드를 동결 건조시킨 다음 100μg/ml의 펩티드 농도에서 0.1M NH4HCO3(pH 8.0)의 용액에 재현탁시킨다. 현탁된 펩티드를 48시간동안 공기에 노출시켜 천전히 일어나는 재산화반응을 촉진시킨다. 이어서 펩티드를 동결 건조시킨다.
하기 실시예는 인간 심방의 나트륨 이뇨제/혈관확장제 폴리펩티드의 화학적 합성을 설명한다.
실시예 Ⅲ.A.3 : rANVP(127-151)
Figure kpo00023
Boc L-Tyr(BrZ) O-수지 1g(Peninsula Labs Inc., 0.54meq/g, Belmont, CA)을 필요한 아al노산서열 [Boc -Arg(Tos) OH, Boc - PheOH, Boc - Ser(Bzl) OH, Boc -AsnOH, Boc -Cys(4 -CH3Bzl) OH,Boc -GlyOH, Boc - LeuOH·H2O, Boc -GIyOH, Boc -Ser(bzl) OH, Boc -GlnOH, BocAlaOH, Boc -GIyOH, Boc -IleOH·1/2H2O, Boc-Arg(Tos) OH, Boc -Asp (OBzl) OH, Boc -MetOH·1/2H2O, Boc -Arg(Tos)OH, Boc-GIyOH, Boc-GlyOH, Boc-PheOH, Boc-Cys(4CH3bzl)OH, Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-Arg(Tos)OH)의 순서로 도입]로 과정 A에 따라 수행한다. 보호된 펩티딜 수지를 TFA CH2C12EDT(45 : 50 : v/v/v)로 1분, 및 이어서 20분동안 처리하고 CH2Cl2로 3희, 및 MeOH로 2회 세척하여 펩티드 수지의 TFA염을 수득하여 진공중에서 건조시킨다.
이어서 펩티딜 수지를 10% 아니솔 및 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 불화수소(HF)중에 -10℃에서 30분동안 및 0℃에서 30분동안 현탁시킨다. HF를 진공하에서 증발제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 디에틸에테르로 1회, 클로로포름으로 1회 및 디에틸 에테르로 1회 세척한다. 펩티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 혼합물로부터 추출하고, H2O로 희석시키고 동결건조시켜 산화되지 않은 디하이드로 펩티드를 수득한다.
조 펩티드를 탈산소 0.01M 암모늄 아세테이트(NH4OAc)(pH 8)중에 0.5mg/ml까지 용해시킨 다음, 20분 동안 교반하여 아세트산으로 pH 5로 조정한 약 과량의 0.01M 칼륨 페리시아나이드(KCN) 용액을 적가하여 산화시킨다. 펩티드 용액을 DOWEX AG 3×4음이온 교한수지로 처리하며, 여과하고, H2O로 희석시키고 동결건조시켜 환상화된 조 펩티드를 수득한다.
펩티드의 정제는 용출제로 0.5M AcOH를 사용하여 세파덱스 G-25F상에서 탈염시키고,300mM NH4OAc를 가하여 생성된 용출성분을 사용하여 CM-세파로오스(Pharnacia Fine Chemicals) 또는 CM-셀룰로오스(Whaman)상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행하여, 0.01M NH4OAc(pH 4.5) 용액을 수득한다. 역상 HPLC에 의한 평가로 최소 97% 순도를 갖는 회수된 분획을 합하여 H2O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 hANVP(127-151) 아세테이트염을 수득한다
실시예 Ⅲ.A.4 : rANVP(126-148)NH2
Figure kpo00024
Boc-Phe-pMBHA-수지 1g을 필요한 아미노산 서열[Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-AsnOH, Boc-Cys(4 -CH3Bzl) OH, Boc -GlyOH, Boc -LeuOH·H2O, Boc -GlyOH, Boc -Ser(Bzl) OH, Boc -GlnOH, BocAlaOH, Boc-GlyOH, Boc-IleOH·1/2H2O, Boc-Arg(Tos)OH, Boc-Asp(OBzl)OH, Boc-IleOH·1/2H2O, Boc -Arg(Tos) OH, Boc -GlyOH, Boc -GlyOH, Boc -PheOH, Boc -Cys(4CH3Bzl)OH, Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-Ser(Bzl)OH, Boc-Arg(Tos)OH)의 순서로 도입]로 계획표 B를 사용하여 수득한다.
이어서 펩티딜 수지를 10% 아니솔 및 2% 에틸 메틸 설파이드를 함유하는 무수 불화수소(HF)중에 -10℃에서 30분동안 및 0℃에서 30분동안 현탁시킨다. HF를 진공하에서 증발 제거하고 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르에 현탁시킨다. 펩티드/수지 혼합물을 디에틸 에테르로 2회, 클로로포름으로 1회, 디에틸에데르로 1회, 클로로포름으로 1회 및 디에틸 에테르로 1회 세척한다. 팹티드를 2.0M 아세트산을 사용하여 혼합물로부터 추출하고, H2O로 희석시키고 동결건조시켜 산화되지 않은 디하이드로 펩티드를 수득한다.
조 펩티드를 탈산소 0.01M 암모늄 아세테이트(NH4OAc)(pH 8)에 0.5mg/ml까지 용해시킨 다음, 20분동안 교반하여 아세트산으로 pH 5로 조정한 약 과량의 0.01M 칼륨 페리시아나이드(KCN) 용액을 적가하여 산화시킨다. 펩티드 용액을 DOWEX AG 3×4음이온 교환수지로 처리하여, 여과하고, H2O로 희석시키고 동결건조시켜 환상화된 조 펩티드를 수득한다.
펩티드의 정제는 용출제로 0.5M AcOH를 사용하여 세파덱스 G-25F상에서 달염시키고, 300mM NH4OAc를 가하여 생성된 용출성분을 사용하여 CM-세파로오스(Pharrmacia Fine Chemicals) 또는 CM-셀룰로오스(Whatman)상에서 이온 교환 크로마토그레피에 의해 수행하여 0.01M NH4OAc(pH 4.5)의 용액을 수득한다. 역상 HPLC에 의한 평가로 최소 97% 순도를 갖는 회수된 분획을 합하여 H2O로부터 수회 동결건조시켜 정제된 rANVP(126-148) 아세테이트염을 수득한다.
실시예 III.A.1-4에 개괄된 과정에 따라, 적절한 수정을 가하여, 하기의 ANVPs를 합성한다 :
실시예 Ⅲ.A.5 rANVP(127-146)
Figure kpo00025
실시예 Ⅲ.A.6 [D-Cys129]rANVP(126-150)
Figure kpo00026
Figure kpo00027
실시예 Ⅲ.A.20 [D-Leu143]rANVP(126-150)
Figure kpo00028
B. 천연 및 화학적으로 생성된 심방의 나트륨 이뇨제/혈관확장제 폴리펩티드의 생물학적 활성
천연 및 화학적으로 합성된 ANVP 화합물 및 유사한 것들의 생물학적 활성은 분리된 래트의 신장, 분리된 집토끼의 흉부의 대동맥환 및 분리된 혈관계 벽 세포를 포함하여, 시험관내 시스템을 사용하여 측정한다. 활성은 또한 손대지 않은 래트 및 개에서도 측정한다.
1. 시험관내 생물학적 측정
rANVP(126-149)의 활성은 분리된 래트의 신장에서 측정한다. 작용성인 분리된 래트의 신장을, 하기문헌[Camargo, M.J.F. et al. Am. J. Physiol., 246 : F447-F456(1984)]에 기술된 바대로, 페쇄 회로시스템내에 살포한다. 정리기간을 조절한 후, 0.1 내지 1.0μg의 화합물을 살포액에 가한다. 다중 변수상에서의 효과가 주시된다. 이들 피크 수치는 표 1에 실험적 데이타로 나타나 있다. rANVP(126-149)가 오줌의 유속, 오줌의 나트륨 배설, 여과 분획 및 신사구체의 여과 속도를 증가시킨다는 것이 명백하다.
[표 I]
분리되어 살포된 래트의 신장에서 신장작용상의 합성 심방의 나트륨 이뇨제/혈관확장제 폴리펩티드rANVP(126-149) 의 효과
Figure kpo00029
GFR, 신사구체 여과속도 ; FF, 여과분획 ; RVR, 신장의 혈관계 저항성 ; V, 오줌의 유속 ; FLNa, 여과된 나트륨의 부하량 ; TNa, 관조직의 나트륨 재흡수 ; UNaV, 오줌의 나트륨 배설 속도 ; FENa분획나트륨 배설 ; UR
Figure kpo00030
, 오줌의 칼륨 배설속도 ; FER, 분획 칼륨 배설.
결과는 평균 ±4신장의 SE이다.
*대조용과 비교하여 P-0.05(학생의 t실험)
이들 결과는 또한 혈관 수축제 부재하에서 살포된 분리된 신장에서, 본 발명의 화합들이 신장의 혈관 저항성, 여과 분획 및 신사구체의 여과속도를 증가시킨다는 것을 보여준다. 대조적으로, 내생적으로 생성된 엔지오텐신으로 예비 수축시킨 분리된 신장에서, 화합물은 혈관 저항성을 감소시킨다. 합성 화합들과의 이들 효과는 ANVPs가 내생의 혈관 수축제에 따라 신장의 혈관 수축 및 혈관 이완 활성 둘다를 가질 수 있다는 것을 보여준다. 분리된 신장에서 관찰된 나트륨 이뇨작용은 도출성 소동맥에서 바람직하게 표현된 혈관 수축 효과에서 생길 수 있다.
유사한 방식으로, 다른 ANVPs 효과는 분리된 래트의 신장에서 검사한다. 표 II는 오줌의 유속, 오줌의 나트륨 이뇨 및 신사구체의 여과속도상에서 이들 펩티드의 효과를 요약한 것이다. 이 시스템에서 시험된 모든 ANVP's는 오줌의 유속 및 오줌의 나트륨 배설을 증가시킨다고 인지할 수 있다. 이러한 방식으로 분리된 래트의 신장에서 유속 및 나트륨 이뇨에 관련되지 않은 펩티드 효과는 상대적으로 적다. 이렇게 하여 관찰된 효과는 ANVPs 및 관련된 유사물에서는 특이하다. 이들 효과는 아마 신장내에서 특정 수용체 부위와ANVPs의 상호작용에 의해 조정된다.
[표 II]
분리된 래트의 신장에서 심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드의 효과
Figure kpo00031
분리된 래트의 신장은 표 1에 기술된 바대로 처리한다. 각 화합물의 조절기간은 C로 표시되고 화합물을가한 후의 실험기간은 F로 표시된다.
Figure kpo00032
-오줌의 유속, UNa
Figure kpo00033
-오줌의 나트륨 이뇨속도, GFR-신사구체의 여과속도, 데이타는 실험 3 내지 8의 중간치를 나타낸다.
천연 ANVPs가 예비 수축된 혈관을 이완시키므로, 이들 펩티드의 효과는 집토끼로부터 분리된 흉부의 대동맥 환상에서, 그리고 소의 분리된 혈관 벽 세포상에서 연구한다.
히스타민-수축된 대동맥 환을 이완시키는 능력에 대해 합성 ANVPs와 부분적으로 정제된(겔 여과 단계) 그리고 여과된(HPLC) 천연 ANVPs를 비교한다. 환을 1.5g 수동적 장력하에서 10ml 통기된 크렙스완충액(krebs buffer)에 현탁시킨다. 환을 5×10-6M 히스타민으로 예비 수축시켜 세척하고 기술된 바와 같이 기준 장력으로 되돌린다[Kleinert, H.D.(1984), Supra]. 이어서 정제된 ANVPs 또는 합성 화합들의 증가된 양을 누적 방식으로 가한다. 장력에서의 변화는, 제 8 도에서 볼 수 있는 바와 같이, 가한 단백질의 누적된 양에 관련되어 나타난다.
보는 바와 같이, 정제된 천연 rANVP(126-150) 및 합성 rANVP(126-150) 둘다는 동 용량에서 조직을 이완시킨다. 부가하여, hANVP(127-151)은 이 조직에서 rANVP(126-150)과 동일하다. 그러나, 하기 문헌[Geller, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.120(2) : 333-338(1984)]에 기술된 아트리오펩틴III(artriopeptionⅢ)와 동일한 rANVP(127-150)은 예비 수축된 집토끼의 대동맥을 이완시키는 효능이 매우 적다. 이 관찰은 하기 문헌[Garcia, et al., Biochem Biophys.Res.Comm : 126(1) 170-184(1985)]에 의해 최근에 확인되었다.
예비 수축된 대동맥 관을 이완시키기 위하여, ANVP화합들은 먼저 특정 막 수용체에 결합시켜야 한다. 이 리간드-수용체와 연관된 상호작용은 세포내 환상 GMP에서 증가한다[Winguist et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 : 7661-7664(1984)]. 환상 GMP가 ANVP 및 다른 화합물에 상응하여 혈관 이완작용의 세포내 중재자로 확인되었음으로, 환상 GMP 농도의 부과는 ANVP화합물의 생물학적 작용을 측정하기 위한 부가의 표지물로 제공된다. 그러므로, 혈관 벽원의 세포, 즉 소의 대동맥의 평활근 및 내생조직의 세포의 특정 수용체에 대한 ANVP화합들의 결합을 측정하기 위해 사용되며 관련된 환상 GMP증가가 측정된다. 이들 시험은 소의 혈관의 평활근을 이완시킴에 있어 ANVPs의 상대적 효능을 반영할 것이다.
결합 검정은 하기와 같이 수행한다. ANVPs를 하기 문헌[Schenk, et al., J. Biol. Chem., 259 : 14941-14951(1984)]에 기술된 과정에 따라125I로 분류한다. 이 과정에서는 ANVP분자상에서125I를 티로신으로 전달시키는 산화를 조정하는 산화제 및 락토과산화제가 유용하게 이용된다. 이어서125I-ANVP를 혈관벽세포의 10mm 합류조직에 가한 다음 37℃에서 배양한다.
제 9 도에서 보는 바와 같이,125I-ANVP를 특수하고 안정한 방식으로 세포에 결합시킨다. 특수하고 안정한 결합은 호르몬/수용체 상호작용의 필수 성분이다. 더우기,125I -ANVP결합은 분류되지 안은 ANVP화합물에 의해 대치될 수 있지만, 다른 수용체 부위에서 작용하는 여러가지의 호르몬(엔지오텐신, 에핀에프린, 배소프렌신, 글루카곤)에 의해서는 대치될 수 없다. 즉, 수축작용으로 ANVPs 및 유사물에 의한125I-ANVP결합의 대치는 혈관벽에 결합시키고 관의 수축상태를 변화시키는 그들의 능력을 반영한다. ANVPs 및 연관된 유사물이 혈관의 평활근 세포상에서 결합부위로부터125I-ANVP를 대치시키는 수축작용은 표Ⅲ에 개괄되어 있다.
[표 III]
심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드의 배양된 소 혈관의 평활근 세포에로의 결합
Figure kpo00034
rANVP(126-150)는 기술된 바대로 요오드화되어 상기 기술된 대표적인 펩티드 존재하에 배양된 평활근세포와 함께 배양한다. 기술된 펩티드의 여러가지 농도는 특정125I -rANVP(l26-150)결함을 대치시키는그들의 능력을 위해 검사한다. 반-최대의 대치가 관찰된 농도를 수록한다.
이들 데이타는 발표된 태양[D-Ala142]rANVP(126-150), rANVP(126-150) 및 hANVP(127-151)이 혈관 벽 세포와 가장 반응성이 있다는 것을 증명한다.
혈관의 평활근에서 ANVP의 경쟁적 작용이 특정 수용체의 결합에 기인할 뿐만 아니라, 환상 GMP에서의 증가와 연관되므로, 환상 GMP 축적상의 ANVPs 및 유사물의 효과는 동일 배양된 세포를 사용하여 측정한다.
제 10 도는 배양된 대동맥 평활근 및 내피조직세포에서 ANVP-조정된 환상 GMP 증가의 크기를 설명한다.
제 11a 도 및 제 11b 도에서는, 대동맥 평활근에서 환상 GMP축적물상의 ANVP 및 유사물의 상대적 활성이 나타나 있다. 데이타는 용량-상응 관계(대수용량 대 최대 환상 GMP 증가%)로 플로트되어 있다.
다시 한번, 크기의 세 순서 이상의 효능에 있어서의 분배를 볼 수 있다. 양 세포 형태에 있어 효능의 등급순서는 [D-Ala142]rANVP(126-150)=[D-Ala131]rANVP(126-150)=rANVP(l26-150)=rANVP(126-149)=hANVP(127-151)〉rANVP(127-150) : 다른 D아미노산 치환이다. 이들 데이타는 소의 대동에서 이들 펩티드의 혈관 이완효능을 반영할 것이다. 즉, 데이타는 특정 D아미노산 치환이 효능을 증가시키는 반면, 다른 것은 효능을 감소시킨다는 것을 설명한다. 또한, 데이타는 카복시 말단 티로신 잔류물의 제거가 혈관 재활성화상에 효과가 적다는 것을 내포한다. 또한, 데이타는 아미노말단 아르기긴 잔류물이 최대의 재활성화에 중요하다는 관찰을 확인한다.
2. 생체 내 검정
합성 ANVP화합물 rANVP(126-149), rANVP(126-150) 및 hANVP(127-151) 또한 손상되지 않은 래트에서 나트륨 배설제로 발견되었다. 이들 화합물을 통상적인 살린을 2.2ml/hr으로 항상 주입해온 이낙틴으로 마취된 래트(100mg/kg, 평균 체중 399g)에 환제 주사제로 투여한다. 결과는 표(Ⅳ)에 나타나 있는데, 각 변수에서의 변화는 세 조절기간의 평균(각 10분) 및 첫번째 실험기간(최대 반응) 사이에서의 변화로 평가된다. 데이타는 평균 ±SE로 기재되어 있다.
[표 lV]
손상되지 않은 래트에서 합성 심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 화합물의 나트륨 이뇨효과
Figure kpo00035
Figure kpo00036
, 오줌의 유속, UNa
Figure kpo00037
, 오줌의 나트륨 이뇨속도 ; UK
Figure kpo00038
, 오줌의 칼륨 이뇨속도. 15마리의 동물에 대한 대조수치 :
Figure kpo00039
, 103±2.9μl/min ; UNa
Figure kpo00040
, 0.93±0.5μEq/min, 및,UK
Figure kpo00041
, 1.6±0.4μEq/min.
신장 및 혈액동력 효과는 화합물 rANVP(126-149)을 항상 주입(1μg/kg환제, 이어서 1시간동안 0.1μg/kg/min) 받아온 마취된 개에서 또한 측정하여 왔다. 즉석 효과는 주사를 통해 유지해온 혈압, GFR 및 오줌의 유속 및 전해질 배출상에서 나타난다. 표(IV)에 이들 변수에 대해 기술한 "실험적" 데이타는 주사기간동안 수득한 평균 수치이다. 지속적인 이뇨작용 및 나트륨 이뇨작용(표 V)과 관련하여, 평균 동맥혈압(MAP)은 10-15%까지 일정하게 떨어지는 반면, GFR은 25-35%까지 증가한다. 모든 이들 변수는 회복기간(즉 이어서 주사의 종결)동안 대조(즉 주사전) 수준으로 되돌아온다.
[표 V]
마취된 개에서 합성 심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 화합물의 혈액 동력, 신장 및 물질대사효과
Figure kpo00042
MAP, 평균 동맥 혈압(혈압) ; FEH2O, 분획 수 배출 ; PRA, 플라스마 레닌 활성 ; PA, 플라스마 알도스테론.
다른 약자의 정의는 표 I 의 각주 참조.
*P〈0 05대조용과 비교 ;+P〈0.05회복과 비교.
펩티드는, 표 V에서 보는 바와 같이, 플라스마 레닌 활성(PRA) 및 플라스마 알도스테론(PA)에 있어 중대한 감소를 가져온다. 추가의 연구로 이들 물질이 분리된 부신 세포에 의해 알도스테론 생산을 자극시키는 앤지오텐신의 능력을 저해한다는 것을 알 수 있다. 즉, ANVPs는 여러 수준에서 레닌-앤지오텐신 시스템의 효과를 차탄할 수 있다 : (1) 그들은 그의 목표기관(혈관 및 부신)상에 앤지오텐신의 직접적인 작용에 반대하고, 및 (2) 그들은 레닌 분비를 저해하여, 혈액에서 앤지오텐신 형성의 속도를 줄인다.
상기 데이타를 근거로 하여, 합성 및 조직 유도된 ANVP화합물은 유사한 활성을 갖는데, 바람직하게는 합성 ANVP화합들이 산화되어 디설파이드 다리의 형성을 촉진시킨 후인 것이 명백하다.
또한 상기 결과로부더, 목적 화합물이 포유동물 숙주에서 효능있는 혈관 확장제, 이뇨제 및 나트륨 이뇨제로 사용될 수 있다는 것이 명백하다.
IV. 재조합 DNA유도된 싱방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드의 발현
A 이.콜라이에서 pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 및 관련된 단편의 발현
하기 실시예에서는 이.콜리에서 pro rANVP(87-152) pro rANVP(25-151), pro ANVP(26-151) 및 pro hANVP(102-151)의 발현이 기술되어 있다. 추가로, 발현 벡터 또한 기술되어 있다. 이들은 설명을 위한 실시예이지, 어떠한 제한을 내포하는 것이 아니라는 것을 이해해야 하며 다른 pre-pro ANVPs, pro ANVPs 또는 ANVP's는 유사한 방식으로 발현될 수 있다.
1. 이.콜라이 발현 벡터의 구성
a. pKT52세균성 발현 플라스미드의 구성
i) trc프로모터의 생성
플라스미드 pEA 300(Amman, E. et al., Gene 25 : 167-178,1983)을 PvuII 및 Cla I (New England Biolabs, Inc.)으로 분해한다. 분해는 하기 문헌[Maniatis, T.et al.Supra at p. 157-160]에 기술된 바대로 0.8% 아가로우즈 겔에서 전기영동시킨다. Cla I 부위 근처의 trp프로모터의 -35뉴클레오티드 부위를 함유하는 큰 단편이 문헌[Maniatis et al., Supra at p.167]에 기술된 바대로 UV-Shadowing에 의해 감지되며,문헌[Maxam,A.andW.Gllbert, Methods in Enzymology, 65 : 449-560(1980)]에 기술된 바대로 37。에서 겔로부터 용출된다. 큰 단편의 Cla I 부위를 문헌[Maniatis et al., Supra at p. 394]에 기술된 바대로 50M dCTP 채우고, 잔존하는 1본쇄 5'상부를 하기 문헌[Kroeker, W.et al., Biochemistry 17 : 3236-3239(1978)]에 기술된 바대로 녹두 뉴클레아제(Pharmacia P-I Biochemicals, Inc.)로 분해하여 제거한다. 플라스미드 pGL 101(Lauer, G. et al., J.Mol.Appl.Genet.1 : 139-147,1981)은 기술된 바대로 PvuII 및 HpaII(New England Biolabs)로 분해한다. 분해된 단편은 하기 문헌[Maniatis et al.,Supra at p.394]의 방법에 의해 클레노우 단편 5단위(Boehringer-Mannheim, Inc., Mannheirm, FRG)로채우고, 37℃에서 15분동안 1 Ci[-32P]-dCTP(Amersham,Chicago,Illinois,800Ci/mM)를 가한다.
이어서 37℃에서 30분동안 dCTP 및 dGTP를 50M까지 가한다. 표지된 평활 말단 단편을 12% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기영동시키고 습윤성 및 오토래디오그래피하여, 55염기쌍 평활 HpaII-PvuⅡ 단편을 절단하여 기술된 바대로 겔로부터 용출시킨다. 두개의 단리된 단편을 문헌[Maniatis et al., Supra at p. 392]에 기술된 바대로 연결시키고, 문헌[Maniatis, et al., Supra at p.250-251]에 기술된 바대로 이.콜라이균주 RB 791(R.Brent and M.Ptashne, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 4204-4208,1981)를 형질 전환시키기 위해 사용한다. 생성된 플라스미드인 pKK 10-0은 trc 촉진자로 불리는 수정 프로모터를 함유하며, 문헌[Maniatis, et al., Supra at pp.366-367]에 기술된 바대로 급속 비등 방법으로 분리시킨다. pKK 10-0을 EcoR I(Bethesda Research Labs,Inc.)로 분해시키고, 상기 기술된 바대로 이.콜라이 RB791을 형질 전환시키기 의해 사용한다. 이 플라스미드인 pKK 10-1을 기술된 바대로 단리시키고 PvuII로 분해한다. PvuII 분해된 플라스미드를 Nco I 링커(dACCATGGT, Creative Biomolecules, Inc. Foster City, California)에 연결시켜, Nco I로 분해하고, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP로 채우고, 기술된 바대로 Pst I 및 HindⅢ을 함유하는 링커에 연결시켜 바이오서치 SAM I DNA 합성기(Biosearch, Inc.)상에서 두개의 상보적 올리고뉴클레오타이드(5'-dGCTGCAGCCAAGCTTGG-3' 및 5'-dCCAAGCTTGG-CT-GCAGC-3')로 합성한다. 연결 혼합물을 BomHI 및 HindⅢ(New England Biolabs)로 분해하고, 5% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기영동시키고, 작은 BamHI-HindⅢ 단편을 상기 기술된 바대로 용출시킨다. 이 단편은 trc프로모터를 함유한다.
ⅱ) tec프로모터 플라스미드, pKT 52의 구성
pKK 10-2(Brosius, J., Gene 27 : 161-172,1984)를 BamHI 및 HindIII로 절단한다. 큰 단편을 0 8%아가로우즈 겔로부터 단리시키고 상기 기술된 바대로 trc프로모터 단편에 연결시킨다. 연결은 이.콜라이RB 791을 형질 전환시키기 위해 사용하며 신규 플라스미드인 pKK 233-1을 기술된 바대로 단리한다. PKK 233-1을 Pvu I 으로 절단하여 종결하고, 부분적으로는 하기 문헌[Maniatis et al., Supra at p.381]에 따라 Bgl I으로 절단한다. 동시에, pUC 8(Vleira, J. and J. Messing, Gene 19, Supra)을 Pvu I 및Bgl I으로 절단하고 앰피실린 내성 유전자(Pst I 부위를 전혀 함유하지 않음)로부터 360염기쌍 PvuI-Bgl I 단편을 5% 폴리아크릴아미드겔로부터 단리시킨다.
이 단편을 pKK 233-1의 PvuI-Bgl I 부분 절단 혼합물과 혼합하여, 연결시키고 이.콜라이 RB 791을 형질전환시키기 위해 사용한다. 형질전환체를 단지 하나의 Pst I 부위의 존재하는가 스크린하고 EcoR I-Pst I 절단으로 체크하여 잔존하는 Pst I 부위가 trc프로모터 다음에 존재하도록 플라스미드 pKK 233-2를 생성시킨다. 플라스미드 pKK 233-2를 EcoR I 및 PvuII로 절단시키고, dATP 및 TTP로 채운후, 연결시키고, 이.콜라이 RB 791내에 형질전환시킨다. 생성된 벡터는 pKT 52이다(제 12a 도)
b. pTrp-233 세균성 발현 플라스미드의 구성
ⅰ) 합성 트립토판 오페론 프로모터 및 오퍼레이터 조절서열의 구성
제 12e 도에 나타낸 열개의 올리고데옥시뉴클레오타이드를 합성하여 상기 기술된 바대로 정제한다. 1 및 10을 제외한 각 올리고데옥시뉴클레오타이드 500피코 몰을 각각 60mM 트리스-CI, pH 8, 15mM DTT, 10mM MgCl2, 20μCi [32P]r-ATP 및 폴리뉴클레오타이드 키나제 20단위(P/C Biochemicals)를 함유하는 20μl중 37℃에서 30분동안 인산화시킨다. 이어서 60mM 트리스-HCl, pH 8, 15mM DTT, 10mM MgCl2, 1.5mM ATP 및 폴리뉴클레오타이드 키나제 추가의 20단위를 함유하는 용액 10μl를 가하여 37℃에서 30분동안 배양한다. 배양에 이어 샘플을 100℃에서 5분 동안 배양하고, 올리고데옥시뉴클레오타이드 1및 10의 500피코 몰을 ATP를 함유하지 않는 상기 버퍼에 30μl까지 희석시킨다.
이중 표준쌍(예, 올리고데옥시뉴클레오타이드 1 및 2,3 및 4등. 제 12e 도)으로 이루어진 각 올리고데옥시뉴클레오타이드 16.7피코몰을 혼합하여 90℃에서 2분동안 배양한 다음, 천전히 실온으로 냉각시킨다. 이어서 각 쌍을 구성체내의 다른 것과 합하여 페놀/클로로프름으로 추출하고 에탄올 침전을 수행한다. 올리고데옥시뉴클레오타이드 쌍을 50mM 트리스-HCl, pH 8, 10mM MgCl2, 20mM DTT를 함유하는 30μl에서 재구성하여 10분 동안 50℃까지 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음, ATP를 가하여 0.5mM의 최종 농도가되도록 하고, T4DNA리가제 800단위를 가하여 12.5℃에서 12 내지 16시간 동안 배양한다.
연결 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 DNA 에탄올 침전을 수행한다. 건조된 DNA를 30μl에서재구성하여 EcoR Ⅰ 및 Pst I으로 37℃에서 1시간동안 분해시킨다. 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전을 수행한 다음, 여러가지 2본쇄 DNA 단편을 상기 기술된 바대로 8% 폴리아크릴아미드겔상에서 전기영동으로 분리시킨다. DNA 단편을 습윤성 겔 오토래디오그래피로 가시화하고 길이에서 약 100bp에 상응하는 밴드를 절단하여 상기 기술된 바대로 밤새 용출시킨다. 절단한 합성 DNA 단편을 플라스미드M13-mp 8 및 m13-mp 9(Messing, J.and Vieria, J.Supra)에 연결시키고 유사한 방식으로 EcoR I 및Pst I으로 분해시키고 디데옥시뉴클레오타이드 서열분석을 행하여 제 12e 도에 나타낸 계획된 서열을 확인한다. 제 12e 도에 나타낸 이 서열은 트립토판 오페론(trp)의 프로모터 및 오퍼레이터 영역(제 12a 도에서,-35및 -10부위)뿐만 아니라 트립토판 오페론 리더 펩티드의 리보소옴 결합 영역(제 12e 도에서 S.D.부위)도함유한다. 제 12e 도에 나타낸 것과 유사한 서열은 이.콜라이에서 이종 단백질의 발현에 유용하다고 증명되어 왔다(Hallewellt R.A.and Embage, S Gene 9 : 27-47(1980), Ikehara, M.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 5956-5960(1984)).
ⅱ) 플라스미드 pTrp-233을 함유한 합성 trp프로모터/오퍼레이터의 구성
플라스미드 pKK 233-2(참조 : 제IV.A.l.a.ⅱ장)를 Nde I으로 절단 종결시킨 다음 문헌[Maniatis etal., Supra at p. 394]의 방법으로 이.콜라이 폴리머라제I, 클레노우 단편의 5단위(Boehringer-Mannheim, Inc.)로 말단을 채우고 dATP, dCTP, dGTP 및 TTP를 50μM까지 가한다. 이것을 25℃에서 20분동안 배양한다. 이어서 페놀/클로로포름 추출공정 및 에탄올 침전공정을 수행한 다음, Nde I으로 절단된 DNA를 연결시키고 이.콜라이내로 형질전환시킨다(Nakamura, K. et al. Supra). Nde Ⅰ부위가 결손된 생성된 플라스미드를 pKK-233-2-Nde로 표시한다.
플라스미드 pKK-233-2-Nde 20나노그램을 EcoR I 및 Pst I으로 절단 종결한 다음, 문헌[Maniatiset al., Supra at pp.133-134]에 따라 송아지 장내 포스파타제로 처리(Boehringer Mannheim)한다. 점성5'一EcoR I 및 3'-Pst I 말단을 갖는 상기 기술된 합성 trp프로모터/오퍼레이터 서열 50나노그램을 EcoR I -으로 절단한 Pst I-233-2-pKK l-나노그램과 혼합하여 기술된 바대로 T4-DNA-리가제로 연결시킨 다음, 이.콜라이 JA 221 lpp-/I'lacIq내로 형질전환시킨다. 형질전환체를 100bp EcoR I-Pst I 합성trp프로모터/오퍼레이터를 함유하는 플라스미드 DNA가 존재하는지 스크리닝하고 단리하여 pTRP-233으로 표시하고, 이것을 제 12 도에 나타내었다.
2. 래트의 pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드를 코드화하는 클론된 cDNA의 발현
a) 플라스미드 pRNF-6852의 구성
플라스미드 pNF 1(상기 참조)을 HincII로 절단 종결시킨 다음, 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시킨다. Nco I 데카머 링커(dAGCCATGGCT)를 SAM Ⅰ DNA합성기(Biosearch Inc.)상에서 합성하고, 기술된 바대로 예비 겔 전기영동에 의해 정제하고 그의 5' 말단에서 문헌[Maniatis et al., Supra at p.396]의 과정을 사용하여 T4-폴리뉴클레오타이드 키나제(P-L Biochemlcals)로 인산화시킨다. 인산화된 링커를 HincII로 절단시킨 pNF1에 12.5℃에서 16시간 동안 T4-DNA리가제로 평활 말단 연결에 의해 부착시킨다.
65℃에서 5분동안 배양한 다음, 연결 혼합물을 100mM NaCl로 조절하고 37℃에서 2시간동안 Nco I 및Pst I으로 배양한 후, 기술된 바대로 5% 폴리아크릴아미드겔 전기영동시킨다. 단리된 DNA를 습윤성 오토래디오그래피에 의해 가시화한 다음, 316bp 밴드를 절단하여, 용출시키고 기술된 바대로 에탄올 침전시킨다(Maxam, A and W.Gilbert, Supra).
발현 플라스미드인 pKT 52를 Nco I 및 Pst I으로 절단 종결시킨 다음, 문헌[Maniatis, et al., Supra at pp.133-134]에 따라, 송아지 장내 포스파타제(Boehringer Mannheim)로 처리한다.
pNF1으로부터 유도된 정세된 316bp Nco I -Pst I 단편을 Nco I -Pst I 으로 절단시킨 pKT 52와 혼합하고 25℃에서 30분동안 및 12.5℃에서 4시간동안 T4-DNA-리가제와 함께 배양한다. 이.콜라이균주 JA221(lpp-, hSd M+, trp E 5, leu B 6, lac Y, rec A 1/F',lac Iq, IacZ+, ProA+, proB+, Nakamura,K. et al., J. Mol. Appl. Genet. 1 : 289-299(1982))을 CaCI2방법에 의해 형질전환시키기에 적합하게 만들어 문헌[Mniatis et a1., Supra at pp. 250-251]에 기술된 바대로 연결 혼합물로 형질전환시킨다. 결과로 생성된 앰피실린 내성 콜로니를 알칼리분해 방법(MaMatis, et al., Supra at pp. 368-369)에 의해 제조한 플라스미드 DNA로부터의 1ml에서 밤새 성장시킨다. 플라스미드를 첫째로 HindIII 및 이어서 Kpn I 또는 Nco I으로 절단하여 정확히 삽입되었는가 스크리닝한다. 각각 약 120bp 및 320bp의 HindIII-KpnI 및 HindIII-Nco I 단편 둘다를 갖는 플라스미드를 선택하여 pRNF-6852로 표시한다(제 12b 도).
pKT-52에서 클론된 pro ANVP서열의 리딩 프레임(reading frame)이 정확한가를 확인하기 위하여, pRNF-6852를 EcoR I 및 Pst I으로 분해시킨 다음, 상기 기술된 바대로 폴리아크릴아미드겔 전기영동에의해 약 509pb의 밴드를 정제한다. EcoR I-Pst I 단편을 플라스미드 N13mpq및 M13mp 9에 연결(Messing, J. and J. Vieria, Supra)시키고 디데옥시뉴클레오타이드 서열분석을 수행한다(Sanger et al. ,Supra).
제 12b 도에서 보는 바대로, pRNF-6852를 절단하여 아미노산 87 내지 152로부터 단백질을 코드화하는 래트의 pro ANVP cDNA의 단편을 발현시킨다.
합성 데카머 Nco I 링커를 사용하여 발현 벡터 pKT 52내로 pro ANVP cDNA을 클로닝하였으므로 발현된 단편의 첫번째 2개의 아미노 말단의 아미노산은 NH2-Mel-Ala이고 다음의 래트의 pro ANVP 전구체의 아미노산 87 내지 152이다(제 12bb 도).
b) 플라스미드 pRNA-6852의 발현
pRNF-6852 또는 pKT 52를 함유하는 이.콜라이 JA 221 App-/F'lac Iq를 글루코오스(0.4%). 티아민(2μg/ml), MgSO4·MH2O(200μg/ml), 로이신(20μg/ml), 트립토판(20μg/ml), 앰피실린(100μg/ml), 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드(2mH)로 보충된 M 9최소 염을 함유하는 배치(MIller, J., Experiments in Molecular Genetics, cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring, cold Spring Spring Harbor, New York)중의 37℃에서 성장시킨다. 약 2.5×108세포수/ml의 세포 밀도에서, L-[35S]-시스테인(100μ Ci/ml 배양(Amersham corp., chicago, IH inois 930 Ci/mmole))을 가한다. 30초 동안 배양한 다음, 배양액 1ml를 제거하고 1.5ml 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리관에서 빙-냉 20% 트리-클로로아세트산에 가하고, 회전시켜 0℃에서 30분동안 정치시킨다. 이어서 혼합물을 15,000×g의 에펜도르프 원심분리기에서 4℃에서 15분동안 원심분리시킨다. 상등액을 버리고 펠릿을 빙-냉 아세톤 1ml로 세척한 다음, 원심분리하고 생성된 펠릿을 진공중에서 건조시킨다.
IgG분획을 제조자의 명세서에 기술된 바대로 단백질 A-Sepharose
Figure kpo00043
4B(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 크로마토그래피를 사용하여 비-면역 혈청 또는 항-혈청 1ml(화학적으로 합성된 래트의 ANVP펩티드에 대해 상승한다)로부터 제조하여 총 용적 4ml에서 회수한다.
건조된 TCA팰릿을 50mM 트리스-Cl, pH 8.0, 1mM EDTA, 및 1% SDS의 40μl에 재현탁시키고 100℃에서 5분동안 배양한다. 이 혼합물 10μl(전체 세균의 단백질을 나타낸다)를 20mM 트리스-HCl, pH6.8, 22% 글리세롤, 2% SDS, 2% 2-머캅토에탄올, 및 0.1% 브롬페놀 블루로 20μl까지 희석시킨 다음, 100℃에서 5분동안 배양한다. 잔존하는 혼합물 30μl(면역흡수를 위해 사용된다)를 50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, 0.15M NaCl, 및 2% 트리톤×100으로 1ml까지 희석시킨 다음, 래트의 ANVP에 대하여 상승된 비-면역 혈청 또는 항혈청으로부터 유도된 정제된 IgG 40μl를 가한다. 혼합물을 실온에서 30분동안 및 4℃에서 밤새 배양한다.
밤새 배양한 다음, 단백질 A-Sepharose
Figure kpo00044
4B(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 5mM EDTA, 0.15M NaCl, 0.5% Nonidet p-40(Np-40) 및 1mg/ml 오브알부민에서의 10% 현탁액)를 혼합물에 가하고 4℃에서 1시간 동안 부드럽게 교반하면서 배양한다. 4℃에서 원심분리시킨 다음, 상등액을 버리고 단백질 A-Sepharose
Figure kpo00045
펠릿을 50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 5mM EDTA, 0.5M NaCl, 0.5% NP-40, 및 1mg/ml 오브알부민의 0.5ml에 재현탁시킨다. 펠릿을 격렬히 회전시켜 세척한 다음, 원심분리시키고 상등액을 제거한다.
이 과정을 4회 더 반복한다. 단백질 A-Sepharose
Figure kpo00046
펠릿을 50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 5mM EDTA, 0.15M NaCl 및 0.5% NP-40으로 2회 더 세척한 다음, 10mM 트리스-HCl, pH 7.5로 1회 세척한다. 진공중에서 건조시킨 다음, 펠럿을 10mM 트리스-HCl, pH 6.8, 1% 글리세롤, 1% SDS, 1% 2-머캅토에탄올, 및 0.05% 브롬페놀 블루의 60μl에 재현탁시킨 후,100℃에서 10분동안 배양한다.
전체 및 면역흡수된 샘플을 17.5% 아크릴아미드, 0.0735% 비스-아클리아미드, 0 335M 트리스-HCl, pH 8.7, 0.04M NaCl, 0.1% SDS,0.05% 암모늄 과설페이트, 및 0.05% TEMED를 함유하는 130×200×0.8mm 폴리아크릴아미드 슬라브 겔상에서 문헌[Anderson, C.W.et al., J.Virol.12:241-252(1973)]에 기술된 바대로 불연속 SDS-올리아크릴아미드겔 전기영동시킨다. 샘플을 브롬페놀 블루 염료가 겔의 바닥에 도달할 때까지 30mA 항류에서 수행한다. 분리된 단백질을 25% 이소프로필 알콜,10%아세트산, 및 0.12mg/ml 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue ; Sigma Chemicals, st. Louis, Missouri) R-250의 용액중에서 실온에서 l시간 동안 혼들어 겔에 고정시킨 다음, 10% 이소프로필알콜, 10% 아세트산, 및 0.12mg/ml 쿠마시 블루의 용액중에서 밤새 배양한다. 10% 아세트산으로 3시간에 걸쳐 몇번 변화시키면서 탈색시킨 다음, 겔을 제조자의 지시에 따라 En Hance(상품명)(New England Nuclear, Boston, Massachusetts)으로 처리한 후, 건조시키고 -70℃에서 Kodak
Figure kpo00047
XAR -5 x-레이 필름을 사용하여 플루오로그래피시킨다.
상기 기술된 바대로 L-35S-시스테인으로 분류된, 플라스미드 pKT-052 또는 pRNF-6852를 함유하는 세포와 폴리펩티드 패턴의 비교는 제 13 도에 나타나 있다. 약 6200달톤의 분자크기를 갖는 폴리펩티드가 레인 C에 유일하게 나타나 있는데, 이것은 pRNF-6852로부터 유도된 전체 폴리펩티드를 나타낸다. 이 폴리펩티드는 항-ANVP IgG(레인 D)에만 특이하게 면역반응성이 있다. 부가하여, pKT-52(레인 B)로부터 유도된 어떠한 폴리펩티드와도 면역 IgG의 반응성은 감지되지 않는다 즉, 예언한 pro ANVP단편이 특정플라스미드 pRNF-6852를 함유하는 세포에서 발현된다는 것으로 결론을 내릴 수 있다.
pRNF-6852을 함유하는 이.콜라이균주 JA 221 1pp-F'aclq를 1984년 5읠 31일에 하기 기관[American Type Culture Collection(ATCC) 12301 Parklaum Drive, Rockville, MD20852]에 기탁하였으며 기탁번호는 39720[재기탁기관 : 한국종균협회 ; 기탁일 : 1986년 10월 21일 ; 수탁번호 : KFCC-10294]이다.
3. 래트의 pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드(26-152)를 코드화하는 클론된 cDNA의 발현
a. 플라스미드 pRNF 12852의 제조
제c,x 장에 기술된 것과 유사한 방식으로, pro심방 전체 길이가 발현된다. 이것을 달성하기 위하여, 플라스미드 pNF1(상기 참조)을 Acc I으로 분해 종결시킨 다음, 에탄올 침전시킨다. Acc I-온침된 DNA를 SAM Ⅰ DNA합성기(Biosearch Inc.)상에서 합성한 합성 이중가닥의 DNA 연결자
PCATGAATCCTGT
TTAGGACATAp
와 혼합하고 기술된 바대로 에비 겔 전기영동에 의해 정제한다. T4-DNA리가제를 이 혼합물에 가하여 링커를 분해 생성물에 연결시킨다.
연결 혼합들을 Hinf I으로 분해시켜 627bp DNA 단편을 수득하고, 5% 폴리아크릴아미드겔 전기영동에의해 정제하고 용출시킨다. 정제된 627bp Hinf I-단편을 klenow단편으로 처리하고 Pst I으로 분해시킨 다음, 에탄올 침전시킨다. 플라스미드 pKT 52을 Nco I로 분해시킨 다음, 기술(Maniatis, et al., Supra at pp 133-134)된 바대로 klenow 효소로 처리하고, Pst I으로 분해시키고 송아지 장내 알칼리성 포스파타제로 처리한다. Hinf I-Pst I로 절단한 pNF1 단편을 Nco I-Pst I으로 절단한 pKT 52와 혼합한 다음, T4-DNA리가제를 사용하여 연결시킨다.
JA 221 lpp-/F'1ac Iq를 상기 연결 혼합들로 형질전환시킨 다음, 생성된 앰피실린 내성 콜로니로부터 유도된 플라스미드의 미니-프레프를 HindⅢ로 절단한 다음 kpn I 또는 HincII 절단한 정확한 삽입을 위해 스크리닝한다.
각각 약 120bp 및 312bp의 HindⅢ-kpn I 및 HindIII-HincII 단편 둘다를 함유하는 플라스미드를 선택하여 pRNF-12852로 표시한다. pKT 52에서 클론된 전체길이의 pro심방 서열의 리딩 프레임은 디데옥시뉴클레오타이드 서열분석(Sanger, et al., Supra)에 의해 확인한다.
플라스미드 pRNF-12582(제 12d 도)는 잔기 25에 상응하는 코돈 AAT에 선행하는 추가의 메티오닌 코돈ATG와 함께 래트의 pro ANVP 전구체의 잔류물 25 내지 152로 둘러싸인 단백질을 코드화한다.
b. 플라스미드 pRNF-12852의 발현
pRNF-12852 또는 pKT 52는 함유하는 이.콜라이 JA 221 lpp-/F'lacIq를 37℃에서 성장시키고 제TV.A.2.b장에 기술된 바대로 L-[35S]시스테인으로 표지한다. 항-ANVP IgG로 면역 흡수시킨 다음, 표지된전체 및 면역 흡수된 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 분리시키고 상기 기술된 바대로 오토래디오그래피시킨다.
상기의 폴리펩티드형과, 전술한 L-[35S]시스테인으로 표지, 플라스미드 pKT-52 또는 pRNF-12852를 함유하는 세포의 비교는 제 13 도에서 각각 레인 A 및 E로 나타나 있다. 약 18400달톤의 분자크기를 갖는 주폴리펩티드 종은 레인에 유일하게 나타나는데(화살표로 표시), 이것은 pRNF-12852로부터 유도된 전체 폴리펩티드를 나타낸다. 이 폴리펩티드가 항-ANVP IgG에만 특이하게 면역반응성인 반면, pKT-52로부터 유도된 어떠한 폴리펩티드와도 면역 IgG의 반응이 감지되지 않는다(제 13 도에서 레인 B 및 F비교).
제 13f 도에서 관찰된 18,400달톤의 폴리펩티드는 래트의 pro ANVP가 제 12d 도에서 보는 바대로 개시자메티오닌 전의 아이노산 25에서 출발한다고 믿어진다.
4. 인간의 pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드(102-151)의 발현
인간 게놈의 DNA를 함유하는 플라스미드 pHGRB1을 Apa I으로 분해 종결시킨 다음, T4-DNA 폴리머라제로 처리하여 3'-확대된 말단을 평활시킨다(Maniatis et al., Supra at p. 395). 합성 HindIII 링커(pCAAGCTTG, Collaborative Rearch lnc., Lexington. MA)를 상기 기술된 바대로 평활말단 연결을 통하여 인간의 평활 말단화된 게놈의 DNA에 부착시킨다. 이어서 이 연결 혼합물을 HindIII 및 Nco I으로 분해한 다음, 5% 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 사용하여 272bp HindIII-Nco I단편을 단리시키고 용출시킨다. 272bp HindIII-Nco I단편을 HindIII-Nco I으로 절단한 pBR 329(Covarrubias L. and F.Bolivar, Gene 17 : 79-89(1982))와 혼합하여 T4-DNA리가제로 처리한다. 생성된 플라스미드 pHNF-298을 BamH I 및 Nco I로 분해시키고 생성된 620bp Nco I-BamH I단편을 아가로우즈겔 전기영동에 의해 정제한다. 620bp Ncol-BamH I단편을 MspI으로 분해종결시킨 다음, 5'연장된 말단을 이.콜라이 DNA폴리머라제 I (klenow단편)에 의해 회복시킨다. 합성 HindIII 연결자 pTTACTAAGCTTAGTAA를합성하고, 정제하여 인산화시키고 Msp I으로 분해된 Nco I-BamH I단편에 평활만한 연결로서 부착시킨다.
연결 혼합물을 HindⅢ로 분해시킨 다음, 5% 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 156bp HindⅢ단편을 단리시킨다. 156bp HindIII 단편을 HindIII로 분해시킨 pKT 52에 부착하고, 기술된 바대로 T4-DNA리가제를 사용하여 송아지 장내 알칼리성 포스파타제로 처리한다. JA 221 lpp-/F'lacIq를 상기 연결 혼합물로 형질전환시킨 다음, 생성된 앰피실린 내성 콜로니로부터 유도된 플라스미드의 미니-프레프를 Nco I으로 분해하고 이어서 Cla I분해하여 정확한 삽입에 대해 스크리닝한다.
150bp의 Nco I-Cla I 삽입물을 갖는 플라스미드를 선택하여 pHNF-5752로 표시한다. pKT 52에서 인간의 클론된 pro ANVP서열의 리딩 프레임은 기술된 바대로 DNA서열 분석에 의해 확인한다.
합성 HindⅢ 8-mer링커를 사용하여 pro ANVP cDNA단편을 pKT 52의 HindⅢ 부위내로 클로닝시키므로, pro ANVP 서열에 선행하는 아미노산은 Met-Ala-Ala-Ala-Lys-Leu-Ala이다. 또한 합성 HindⅢ 16-mer링커는 카복시 말단 아미노산 잔류물 Arg 및 Tyr를 재구성하기 위해 사용한다. 그러므로, 발현된 인간의 pro ANVP단편의 서열은 기술된 바대로 디데옥뉴클레오타이드 서열 분석을 사용하여 하기로 표시한다(Sanger, et al. Supra) :
NH2Met Ala Ala Ala Lys Leu Ala Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile GIy Ala Gln Ser Gly Leu GIy Cys Asn Ser Phe Arg Tyr COOH
5. 인간의 pro심방의 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드(26-151)을 코드화하는 클론된 cDNA의 발현
a. 플라스미드 phNF-233의 구성
인간의 ANVP cDNA(제II. C장)를 함유하는 클론 6으로부터의 λ-파지 DNA를 EcoR I으로 분해시킨다음, 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 사용하여 713bp 단편을 단리시키고 용출시킨다. 정제된 EcoR Ⅰ단편을 유사한 방식으로 분해된 플라스미드 pUC-9(Vieira, J.and Messing, J., Gene 19, Supra)에 연결시킨 다음, 기술된 바대로 이.콜라이내로 형질전환시킨다. 적절한 713bp EcoR I단편을 갖는 플라스미드를 단리시키고 phNF-pUC-1로 표시한다. 플라스미드 phNF-pUC-1을 Rsa I으로 분해 종결시킨 다음, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전시킨다. Rsa I분해 DNA를, 기술한 바와 같이 합성하고 정의한 합성 2본쇄 DNA링커
5'TATGAATCCCATGT 3'
3' ACTTAGGGTACA 5'
와 혼합하고, 이어서 T4-DNA리가제를 가하여 링커를 Rsa I 분해 생성물에 연결시킨다. 연결 혼합물을 Nde I로 분해하여 370bp DNA단편을 생성하고 폴리아크릴아마이드겔 전기영동으로 정제하며 용출시킨다. 플라스미드 pUC-19(Vieria, J. ＆ Messnig, J. Supra)를 Nde I로 분해하고 소의 장 포스파타제로 처리하며, 이어서 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전처리한다.
상술한 370bp DNA단편을 Nde I 분해 pUC-19에 연결하고 이.콜라이를 형질전환시킨다. 형질전환체를 스크리닝하여 생성된 370bp Nde I인체 pro ANVP cDNA서열을 함유하는 플라스미드를 선택하고 phNF-pUC-2로 phNF-pUC-2를 Apa I 및 EcoR I로 분해하고 기술한 바와 같이 아가로오스 겔 전기영동으로 대형 서열을 단리한다. 플라스미드 phNF-pUC-1을 또한 Apa 및 EcoR I로 분해하고 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 442bp 서열을 분리하며 용출시킨다. phNF-pUC-1으로부터 유레된 442bp Apa I-EcoR I단편을 Apa I-EcoR I분해 phNF-pUC-2에 연결한 후 이.콜라이를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 Nde I 및 Pst I로 분리함으로써 스크린하여 517bp Nde I-Pst I 단편을 함유하는 플라스미드를 생성시키고, 이를 분리하여 ph NF-pUC-3로 명명한다.
발현 플라스미드 pTRP-233(제 12f 도)을 Nde I 및 Pst I로 완전히 분해하고 기술한 바와 같이 소의 장포스파타제 처리를 한다. 플라스미드 phNF-pUC-3를 Nde I 및 Pst I로 완전히 분해하고 폴리아크릴 아마이드겔 진기영동으로 517bp DNA서열을 분리하며 용출시킨다. phNF-pUC-3으로부터 유래된 Nde I -Pst I 단편을 Nde I-Pst I분해 pTRP-233에 연결하고 이.콜라이를 형질전환시킨다. pTrp 233중의 517bp Nde I -Pst I를 함유하는 생성된 플라스미드를 분리하여 phNF-233(제 12g 도)으로 명명한다.
pTRP-233중의 클론화된 인체 pro ANVP서열의 리이딩 프레임(reading frame)뿐만 아니라 trp프로모터/오퍼레이터 서열을 확인하기 위해 phNF-233을 EcoR I 및 Pst I로 분해하고 폴리아크릴아마이드겔 전기영동으로 DNA서열을 분리하여 용출시킨다. 이 단편을 플라스미드 M13-mp 18(Messing, J.and Vieria, J., Supra)에 연결시키고 디데옥시누클레오티드서열분석(Sanger et al. Supra)을 한다.
제 12g 도에 나타난 바와 같이, 플라스미드 phNF-233을, 부가적인 메티오닌 코돈 ATG로 인체 pre-proANVP 단백질의 잔기 26에서 151을 둘러싸고, 잔기 26에 상응하는 코돈 AAT에 선행하여 전장(filllength)의 인체 pro ANVP가 발현되도록 고안한다.
b. 플라스미드 phNF-233중의 클론화된 전장 인체 pro ANVP(26-151) cDNA의 발현
phNF-233 또는 ptrp-233을 함유하는 이.콜라이 E103s(Hfr-Met B, lacIts)를 임피실릴(100μg/ml)이 추가된 루리라-베르타니(Luria-Bertani)배지(Maniatis et al., Supra at p.68)에서 37℃로 밤새 성장시킨다. 밤새의 배양액을 글루코스(0.4%), 티아민(2μg/ml), MgSO4, 7H2O(200μg/ml), 카사미노산(Casamino acids)(0.5%) 및 임피실릴(100μg/ml)을 추가한 M9 최소염(M9 minimal Salts ; Miller, J., Experiments in Molecular Genetics Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)을 함유하는 배지에서 1 : 100로 희석하고 세포 밀도가 0.1의 A550에 달할때까지 37℃에서 증식시키며, 이때 3-β-인돌아크릴산(Sigrma Chemical. Co.)을 10mg/ml 에탄올 용액으로 가하여 최종 농도를 25μg/ml로 한다. 0.50의 A550에서 L-[35S] -시스테인(200μ Ci/ml 배양액(New England Nuclear)]을 가하고 계속해서 1분동안 배양한다. 이때 배양액 1ml로 취하며 빙-냉각 20% 트리클로로 아세트산 340μl에 가하고 단락 IV.A.2.에 기술한 바와 같이 처리한다.
phNF-233 또는 pTRP-233을 함유하는 세포로부터 유래된 L-[35S]-시스테인 표지 폴리펩티드의 면역흡수를, 합성 래트 ANVP(127-152)를 주입한 토끼에서 수득한 항혈청을 사용하여 상기 단락 IV.A.2. 에 기술한 바와 같이 수행한다.
총 면역흡수된 L-[35S]-시스테인 표지 폴리펩티드를 단락 IV.A.2.에 기술한 바와 같이 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 형광사진법으로 분석한다. L-[39S]-시스테인으로 표지된 플라스미드 pTRp-233 또는 phNF-233을 함유하는 세포로부터의 폴리펩티드 형태의 비교가 제 14 도에 나타나 있다. 분자량 약18,000달톤의 주요 폴리펩티드가 pTRP-233으로부터 유래한 총 폴리펩티드를 나타내는 레인 A와 비교해서 phNF-233으로부터 유래한 총 폴리펩티드를 나타내는 레인 B에 독특하게 나타난다. 이 18k달톤 폴리펩티드는 특히 항-ANVP 항혈청에 면역반응적인 반면에 pTRP-233으로부터 유래한 폴리펩티드와의 반응은 검출되지 않았다(제 14 도의 레인 C 및 D참조) 그러므로 예상된 인체 pro_ANVP(26-151)의 폴리펩티드가 특이 플라스미드 phNF-233을 함유하는 세포에서 발현된다.
pRNF-6852를 함유하는 이.콜라이 균주 K 12 E 103 S Hfy Cavalli, met B,lac Its는 미합중국, 매릴랜드 20852, 록빌, 파크로운 드라이브(Parklawn Drive, Rackville, MD 20852, U.S.A.)소재의 ATCC(American Type Culture Collection)에 1985년 4월 9일 기탁되었으며 수탁번호 53085[재기탁기관 : 한국종균협회 ; 1986년 10월 21일 ; 수탁번호 : KFCC-10295]를 지정받았다.
c. 이.콜라이로부터 인체 pro-ANVP(26-151)의 정제 및 특성화
phNF-233을 함유하는 이.콜라이 E 103S를 암피실린(100μg/ml]을 추가한 루리아-베르타니 베지에서 37℃로 밤새 증식시킨다. 배양액 10ml를 단락 IV. 5.b에 기술한 바와 같이 최소염 및 추가물을 함유하는 배지 1000ml에 희석하고, 37℃에서 0.1A550상응하는 세포 밀도까지 증식시킨다. 이때 3-β-인돌 아크릴산을 10mg/ml에탄올 용액으로 가하여 최종 농도 25μg/ml로 한다. 세포를 1.0A550에 상응하는 세포 밀도에 달할때까지 증식시키고, 세포를 4℃에서 7,000rpm으로 원심분리하여 수거한다. 세포 펠릿(pellet)을 10mM트리스-HCl, pH 8의 빙-냉각 용액에 재현탁하고 전과 같이 원심분리한다. 세척한 세포 펠릿을 1M 아세트산 및 2mM HCl을 함유하는 수용액 40ml에 재현탁시킨다. 세포를 0℃에서 음파파쇄기(Heat Systems-Ultrasonics Inc. Model W-225-R)를 사용하여 파괴한다. 이어서 현탁액을 비등 수욕상의 밀봉 용기에서 5분동안 항온처리하고 4℃에서 12,000rpm으로 20분동안 원심분리한다. 상등액(산추출물로 기술)을 취하여 10mM 트리스-HCl, pH 7.5 및 1mM EDTA로 평형화한 세파덱스R
Figure kpo00048
G-10(Pharmacia)을 함유하는 2.5cm×100cm 컬럼에 적용한다. 특수 ANVP방사성 면역측정법(단락 V참조)으로 검출한 바와 같이 생성된 면역반응성 분획을 모아서 동결 건조시킨다. 건조된 분획을 0.5M 아세트산에 재현탁시키고 이미 0.5M 아세트산으로 평형화한 세파덱스
Figure kpo00049
G-10을 함유하는 2.5×50cm컬럼에 적용한다.
생성된 면역반응성 컬럼 분획을 모아서 동결 건조시킨다. 건조 물질을 약 4ml의 증류수에 넣고 고속 액체 크로마토그라피 HPLC정제를 수행한다. 퍼킨-엘머시리즈(Perkln-Elmer Series) 4LC 주입기 및 용매공급시스템(Perkin-Elmer)을 사용해서 그 물질을 1×25cm 비닥(Vydac) C18컬럼에 적용한다. 경계물질을 수성 15% 아세토니트릴(CH3CN) 및 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 2분동안 세척하고,15:85 내지 60:40의 CH3CN 및 0.1% TFA의 선형 구배를 45분에 걸쳐 전개시킨다. 1분 분획으로부터의 분취량을 수거하여 건조하고 기술한 바와 같이 항-ANVP 방사성 면역 측정법을 이용하여 면역방응성을 측정한다. 면역 반응성의 피크를 수거하여 진공중에 건조한다. 건조물질을 물에 재현탁하고 다시 동결건조시킨다.
물질 100p몰을 모델 470A 단백질 서열기(sequenator)(Applied Biosystems Inc.)를 사용하여 자동 아미노산 서열 분석을 수행한다. 분석된 첫번째 18아미노산은 Met-Asn-Pro-Met-Tyr-Asn-Ala-Val- Ser - Asn - Ala - Asp - Leu - Met - Asp - Phe - Lys -Asn - 이다.
기타 검출성 불순물은 이 분석에서 관찰할 수 없었다. 단락 IV.2.b에 기술한 바와 같이 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 분석도 확실한 분자 크기 18,000달톤과 함께 이동하는 정제 물질에서 볼순물을 감지하지 못하였다. 상술한 이 폴리펩티드의 서열 분석으로부터 이 폴리펩티드는 부가적인 아미노-말단 메티오닌을 함유하는 전장 사람(26-151) pro-ANVP에 상응하며 세균성 폴리펩티드로부터의 오염물질을 함유하지 않음이 확인되었다.
B. 사카로마이세스 세리비지애(Saccharo-myces cerevisiae)에서의 pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 및 pro-pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드의 발현
에스.세리비지애에서의 여러가지 pro ANVP 및 ANVP 폴리펩티드의 발현이 하기 실시예에 기술되어 있다. 유사한 방법으로 다른 프로 ANVP 또는 ANVP서열이 에스. 세리비지애에서 발현될 수 있다.
1. 세포내 발현
2가지 방법이 효모 사카로마이세스 세리비지애에서 pre-pro ANVPs pro ANVPs 및 성숙 ANVPs를 함유하는 프로 ANVPs단편을 코드화하는 cDNA의 세포간 발현용 벡터의 제조시에 포함된다. 각각의 방법은 효모 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 유전자의 앞에서 발견되는 강력한 프로모터 서열을 사용한다. 첫번째 방법에서 플라스미드 pNF1을 HincII(New England Biolabs)로 분해한다. BamH I링커 올리고누클레오티드(길이 8 누클레오티드, Collaborative Research, Inc.)를 분해 생성물에 연결시키고, 생성된 분자를 BamH I으로 분해한다. 성숙 ANVP서열을 함유하는 이 분해로부터의 454bp 단편을 5% 폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 정제하고 효모-이 콜라이 벡터 pYPGK 2의 BamH I위치에 연결한다. 효모-이콜라이 셔틀(Shuttle) 벡터 YEp 13[J. Broach et al., Gene 8 : 121-133(1979)]를 제한 효소 BamH I 및 Hind Ⅲ로 분해하고, 수득한 가장 큰 제한단편을 효모 PGK 유전자로부터의 프로모터 부위를 갖는 제한 단편에 연결시켜 이 벡터를 구성한다. PGK-프로모터-함유 단편을 HindIII 제한 위치로부터 PGK의 ATG개시 코돈의 상부로 약 1500염기쌍을 연장하고, PGK코드화 부위내로부터 BAL-31분해후 ATG개시 코돈의 하부 28염기쌍에 삽입된 BamH I 링커 올리고누클레오티드(길이 8 염기쌍, Collaborative Research,Inc.)에 연결시킨다.
이 벡터를 사용해서, pre-pro ANVP 서열중의 기타 DNA서열을 삽입 사용하여 pre-pro ANVP의 목적하는 단편을 발현시킨다. 예를들면 454bp ANVP-함유 단편을 이 벡터중의 BamH I 링커 위치에 옳은 배향으로 삽입하는 것은 PGK프로모터로부터 78-아미노산-장(long)융합 단백질의 합성을 허용한다(PKG유전자의 아미노 말단으로부터 9 아미노산, 링커 누클레오티드에 의해 코드화된 3 아미노산, pro-ANVP부위의 39아미노산, 성숙 ANVP서열의 25아미노산, 및 ANVP전구물질의 카복시 말단의 2 아르기닌 잔기로 구성).
pre-pro ANVPs의 세포간 발현을 위한 2번째 방법은 또한 pro ANVPs 및 그의 단편의 세포의 분비를 허용한다. 2번째 방법에서 전체 pre-pro ANVP 전구물질 코드화 영역을 함유하는 제한 단편은 우선 제한효소 Sal I (New England Biolabs)으로 플라스미드 pNF4를 분해하여 이 플라스미드로부터 단리한다. 생성된 선형 플라스미드 분자의 말단에 있는 1본쇄 부위를 DNA 폴리머라제 I (Klenow fragment)로 처리하여 2본쇄로 하고, BamH I 링커(길이 8 누클레오티드, Collaborative Research, Inc.)를 이들 평활 말단상에 연결시킨다. 선형 플라스미드 분자를 BamH I 및 EcoR I로 분해하고, pre-pro ANVP를 함유하는 약 900bp의 BamH I(Sal I)-EcoR I단편을 단리한다. 이 단편을 다음 2가지 변형 이외에, 상술한 pYPGK 2벡터와 동일한 벡터에 연결시킨다 :
(1) BamH I 링커 올리고누클레오티드는 PGK의 ATG코돈 상부(5') 23bp에 위치하고,(2) 클론화된 cDNA단편뒤에 PGK 유전자의 전사 종결부위(3'링커로서 pBR322로부터의 346bp HindIII-BamH I 단편과 PGK위치의 3'발단을 함유하는 EcoR I-HindⅢ단편)가 온다. PGK프로모터로부터 삽입된 pre-proANVP cDNA의 발현은 pre-pro ANVP의 합성을 일으킨다. 발현된 pre-pro ANVP는 신호 및/ 또는 진행 위치가 효모 세포에 의해 인식되고 작용될 경우 그와 같은 세포에 의해 진행 및 분리될 것이다. 그렇게 분비된 물질은 pro ANVPs이거나, 그의 단편 또는 ANVPs일 것이다. 신호 서열의 인식이 발생하지 않을 경우, 전장 pre-pro ANVPs 또는 그의 단편은 세포에서 내부적으로 발견될 것이다.
2. 세포의 발현
a) YEp-α-8 발현벡터의 구성
이.콜라이-효모 셔틀 벡터 YEp13[Nasmyth, k.and k.Tatchell, Cell 19 : 753-764(1980)]중의 효모라이브러리를 5'-32P말단 표지 올리고데옥시누클레오티드(5'-CCTGGCCAACCAATG-3')(참조 : Maniatis et al., Supra at pp.324-325)를 사용하여 스크린하였다. 이 올리고누클레오티드에 혼성화하는 효모 DNA삽입부위를 함유하는 플라스미드를 연속 단리한다. 이들 플라스미드중의 하나는 DNA의 약 15kb 삽입부위를 함유하며, 문헌[Kurjan, J. and I. Herskowitz, Cell 30 : 933-943(1982)]에 기술된 바와 같이 α-인자 유전자를 소유하는 1.7kb EcoR I단편을 함유하는 것으로 나타났다. 17kb EcoR I단편의 말단은 DNA 폴리머라제I(Klenow fragment)으로 항온 처리하여 평활하게 하고, T4-DNA리가제(Maniatis et al., Supra at pp. 113-114,116,392-394)를 사용하여 BamH I 링커를 부착시켰다. BamH I말단은 BamH I의 분해에 의해 점성 말단화하고, 이어서 효모-이.콜라이 셔틀 플라스미드 pCV7-Hin228의 BamH I위치에 연결시킨다. 플라스미드 CV 7의 HindIII 위치주변의 결실은 문헌(Broach, J.R. and J.B.Hicks, Cell 21 : 501-508,1980)에 기술된 방법을 사용하여 HindIII 분해, 엑소누클레아제III 처리, S1누클레아제 처리, 및 T4-DNA리가제로 연결시켜 플라스미드 pCV 7-Hin△ 228을 생성시킴으로서 완성한다. 효모 α-인자 유전자를 함유하는 이 플라스미드가 제 15 도에 도해되어 있으며, 이하 YEp-α-8로 명명한다.
b) 래트 pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA를 YEp-α-8으로 삽입
pre-pro ANVP를 코드화하는 pNF1으로부터의 DNA의 2단편(단락 II.A.3.)을 제한 효소로 절단하고, 필요에 따라 DNA 폴리머라제I(Klenow fragment)을 DNA말단에 채우며, HindIII 링커(Moniatis et al., Supra at p. 392)를 가함으로써 YEp-α-8(제 15 도)의 독특한 HindⅢ 위치에 삽입한다. 후속적으로 DNA 단편의 말단을 HindⅢ로 분해하여 점성화하고, 알칼리 포스파타제(참조 Maniatis et al., Supra at pp. 133-134)로 처리완료한 HindIII 분해 Yep-α-8에 연결시킨다. 재조합 분자로 이.콜라이를 형질전환하고 콜로니에 대해 플라스미드 DNA분석을 한다(Maniatis et al., Supra at pp. 366-369).
HaeⅢ단편을 설명한 바와 같이 생성시키고 하기 문헌(Maniatis et al., Supra at pp. 173-175)에 기술된바와 같이 폴리아크릴아마이드겔로부터 크기를 선택한다. 266bp의 이 단편을 YEp-α-8로 클론화하고, 상술한 바와 같이 발현 벡터 YEp-α-NF-5를 생성한다. 이 삽입부위는 아미노 말단에 부가적인 페닐알라닌을 갖고 pro ANVP서열의 아미노산 121-152에 상응하는, 성숙 ANVP서열을 함유하는 33 아미노산 펩티드를 정배향으로 코드화한다. 대조용으로 삽입부위의 역배향을 YEp-α-8에 클론화하고 YEp-α-NF-7을 분해한다. 이 삽입부위는 다른 아미노산 서열을 함유하는 무관한 단백질을 암호화한다. 유사하게 623bp의 Acc I단편을 분리하고 YEp-α-8에 정배향으로 클론화하여 발현 벡터 YEp-α-NF-9을 산출한다. 이 삽입부위는 NH2말단에 부가적인 티로신을 갖고 pro ANVP서열(아미노산 28-152) 거의 전부로 구성되는 126아미노산 폴리펩티드를 코드화한다. 이 삽입부위를 또한 그의 역배향으로 클론화하여 대조용 플라스미드 YEp-α-NF 12를 생성시킨다. HindIII 링커의 첨가후, 래트 pro ANVP의 이들 HaeⅢ 및Acc I의 삽입은 키메라(chimeric) 단백질을 코드화하는 DNA서열을 산출한다. 이 단백질은 α-인자 신호/리더(leader) 펩티드, 스페이서(spacer) 단편 및 적절한 pro ANVP단편을 코드화하고 있다.
DNA를 이 플라스미드 함유 이.콜라이 균주로부터 제조하고(Maniatis et al., Supra at pp. 366-369)에 세리비지애 균주 W301-18A(αade 2-1, trp 1-1,leu 2-3, 112, can 1-100, ora 3-1, his 3-11, 5)를 Leu 2프로토트로피(prottrophy)로 형질전환시키는데 사용한다. 효모 균주를 표준배지[Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor, New York)]에서 증식시킨다. 이.콜라이로부터의 플라스미드 DNA를 α-인자 pro ANVP DNA구성의 서열 및 형성용 M13에 또한 재클론화한다(Messing J. and J. Vieira, Supra).
c) 에스. 세리비지애에서의 래트 pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 서열의 발현 및 분리
α-인자 pro ANVP단편 진행도를 제 15 도에 나타내었다. mRNA전사는 벡터의 α-인자 서열부터 개시되고 종결된다. 이것은 키메라 단백질로 번역되고 효모 분비 과정을 통하여 개시된다. 이 단백질의 단백질 분해 공정이 분자의 α-인자 부위의 Glu-Ala(QA) 잔기 및 Lys-Arg(KR) 잔기에서 발생한다(Kurjan, J. and I. Herskowitz, Supra). 그렇게 제조된 단백질의 C-말단 부위는 래트 pro ANVP의 예상된 아미노산이다. 이들 플라스미드를 함유하는 효모를 루신이 결핍된 합성 배지에서 배양한다(참조 Sherann et al., Supra). 효모 플라스미드는 비교적 불안정하고 세대당 약 1.0%가 소실되기 때문에 상기의 선택 작업이 필요하다. 효모 균주를 루신부재의 합성 배지에서 4시간동안 0.1 내지 0.5m Ci/ml35S-시스테인(약1000Ci/mmole)으로 표지한다. 소의 혈청 알부민을 최종 농도 100μg/ml로 가하여 단백질의 가능성을 방지한다. 샘플(1.0ml)을 취하여 원심분리로 세포를 제거하고, 배지 단백질을 4℃에서 15분 동안 10% TCA침전으로 농축하며, 후속적으로 에펜도르프 마이크로퓨지(Eppendorf mlcrofuge ; 15,000×g)에서 원심분리한다. 생성된 팰럿을 아세톤으로 세척하고, 진공하에 건조하며, SDS샘플 완충액에 재현탁시킨다[Laemlli,U.k., Nature 227:680-685(1970)]. 이 샘플을 SDS-PAGE겔(17 5% 아크릴아마이드)에 직접 적용하여 건조겔의 방사선 자기법에 의해 총 분비된35S-met 단백질의 형태를 조사한다. 제 16a 도에 나다난 바와 같이 YEp-α-NF-9을 함유하는 효모 배양액으로부터의 배양 상등액은 약 11.1 및 9.4kd에서35S-met-표지밴드를 나타내고(레인 3 및 4), 반면에 YEp-α-NF-12(역구성)의 배양액으로부터의 배지는 약 5kd에서35S-met 표지밴드를 나타낸다(레인 5 및 6). 이들 밴드의 어느 것도 플라스미드 벡터 YEp-α'-8을 함유하는 균주로부터의 배지에서 검출되지 않았다(레인 1 및 2).
YEp-α-NF-9에 의해 합성 및 분비된 단백질의 분자량은 내인성 효모 프로테아제가 이 플라스미드에서 Acc I 단편에 의해 코드화된 pro ANVP 전구물질로부터의 ANVP펩티드를 분해한다는 가능성에 상반되지 않는다. 이 가능성을 확인하기 위해서, 이 플라스미드를 함유하는 효모 균주, 그의 상응하는 역배향(YEp-α-NF-12), 및 YEp-α-NF-5와 YEp-α-NF-7(pro ANVP의 소단편을 코드화하는 HaeⅢ단편)을 함유하는 효모 균주를 그들이 특이적으로 면역 침전할 수 있는35S-표지 단백질을 발현시키는 경우 상기와 같이35S-Met 및35S-Cys로 표지하여 검출한다.35S-Met는 pro ANVP 단백질에 혼입되나 ANVP에는 안되며, 반면에35S-Cys는 ANVP에 선택적으로 혼입된다. 대조 실험으로 약간의 효모 배지성분이 직접적인 면역침전을 억제함이 밝혀졌기 때문에 신규의 부분적인 정제 방법이 하기와 같이 수행된다.
세포를 원심분리하여 제거하고 세포 유리 상등액을 직접 사용하거나 또는 동결 건조에 의해 농축한다. 아세톤 10용적을 수성 용액에 가하고 혼합물을 빙상에서 10-15분간 침전시킨다. 침전물을 원심분리시켜 펠릿으로 하고 아세톤을 제거한다. 소량의 물(1용적이하)을 이 팰릿에 가하여 재현탁을 용이하게 한다. 메탄올 10용적을 이 혼합물에 가하고, 완전히 혼합하여, 침전물을 원심분리하여 수거한다. 상등액을 채취하여 진공하에 건조시킨다. 이 겔릿을 면역침전 완충액 1.0ml에 재용해하고 면역침전시키며 단락 IV A2에 기술한 바와 같이 세척한다.
제 16b 도에 나타낸 바와 같이 상기 추출공정후 판명된 단백질의 복잡성은 총 분비 단백질의 복잡성과 비교하여 비교적 단순하다. 제 16b 도의 레인 1 및 2는 분비된35S-Cys 표지 단백질의 합성이 메탄올 용해성 단편중에서 각각 YEp-α-NF-7 및 YEp-α,-NF-5에 의해 지시됨을 보여준다. 제 16b 도의 레인 3 및 4는 양쪽의 경우 항-ANVP IgG과의 면역침전이 따르는 동일 단백질을 나타낸다. 항혈청은 YEp-α-NF-5(레인 4, 제 16b 도)로부터 3,000달톤 단백질을 특이하게 침전시키는 반면 상응하는 역배향(YEp-α,-NF-7)(레인 3, 제 16b 도)으로부터는 아무 단백질도 침전되지 않았다. 레인 5 및 6는 각각 플라스미드YEp-α-NF-12 및 YEp-α-NF-9을 함유하는 효모 균주가 배양된 배지의 메탄올 용해성 분회에서35S-시스테인 표지 단백질의 유사한 면역첨전이 일어남을 보여준다. 결과는 제 16b 도, 레인 3 및 4에 나타난바와 동일하고, 3,000달톤 단백질이 YEp-α-9 함유 에스.세리비지애가 증식한 배지로부터 특이하게 면역침전되었다.
이 결과는 효모 발현 플라스미드, YEp-α,-NF-5 및 YEp-α-NF-9가 모두 특이 항-ANVP IgG에 의해 면역침전되는 3kd35S-Cys 표지단백질(길이 약 25-30아미노산)의 합성을 지시함을 가리킨다.
YEp-α-NF-9을 함유하는 에스.세리비지애 균주 W301-18A는 1984년 5윌 31일, ATCC에 기탁되어 수탁번호 20710으로 지정되었다.
d) 에스.세리비지애에서의 인체 pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드(128-151)의 발현 및 분비
ⅰ. PJC1-5 발현 벡터의 구성
플라스미드 YEp-α-8(단락 IV.B.2.)를 HindIII로 완전히 분해하고 기술한 바와 같이 아가로오스 겔 전기영동으로 가장 큰 제한 단편을 정제한다. 정제한 DNA를 연결시키고 이.콜라이에 형질전환시킨다. 단지 하나의 HindⅢ 제한부위를 함유하는 플라스미드 DNA가 정제되며 pJJ-1(제 17a 도)로 표기한다.
플라스미드 pJJ-1을 Pst I 및 Sal I으로 완전히 분해하고 아가로오스겔 전기영동으로 317bp DNA단편을 정제한다. Pst I-Sal I단편을 유사하게 분해한 플라스미드 M13mp8(Messing, J. and Vieria, J., Supra)에 연결한다. MP-JJ1으로 표기되는 1본쇄 재조합 파지 M13 DNA를 분리하고 돌연변이 유발성 올리고데옥시누클레오티드 5'-GAAGAAGGGGTAAGCTTGGATAAAAGAG-3'를 사용하는 올리고누클레오티드성-위치-유도 돌연변이-유발 (oligodeoxy nucleotide mediated-site-directed mutagenesis )[Zoller, M.J. and Smith, M., Methods in Enzymology 100 : 468-500(1983)]용 주형으로 사용한다. 생성된 돌연변이 유발은 α-인자 유전자(Kurjan, J.and Herskowitz, I., Supra)의 코드화 부위에서 위치241-243에 존재하는 뉴클레오티드 코돈-TCT-를 AGC로 변형시켜 이 위치에서 HindIII 제한위치를 유도하도록 하나, 이 코돈(제 17a 도)에 의해 코드화된 아미노산 Ser은 변형시키지 않는다. 돌연변이 유발된 재조합 MP-JJ-1은 NP-JJ-5로 표기한다. 플라스미드 JJ-1을 에티둠 브로마이드의 존재하에 Pst I로 분해하고 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 시킨다.
DNA를 HindⅢ로 완전히 분해하고 소의 장 포스파다제 처리를 하며 아가로오스셀 전기영동으로 가장 큰 제한 단편을 정제한다. MP-JJ-5의 복제형을 Pst I 및 HindⅢ로 분해하고 폴리아크릴아마이드겔 전기영동으로 220bp DNA단편을 분리한다. 220bp Pst I -HindIII DNA단편을 유사하게 분해한 pJJ-1에 연결시키고 이.콜라이에 형질전환한다. 5853, 2280, 993, 780 및 220bp의 Pst I-HindIII제한 단편을 함유하는 생성 플라스미드를 정제하고 pJCi-5(제 17a 도)로 표기한다.
ⅱ.인체 ANVP(128-151)을 코드화한 합성 DNA서열을 함유하는 플라스미드 pJC-2의 구성
제 17b 도에 나타나 있는 합성 DNA서열을 당분해 효소를 코드화하는 고도의 발현 효모 유전자에서의 코돈 용법으로부터 지시되는 바람직한 효모 코돈의 세포로 표기한다.
제 1 도에 나타낸 8을 올리고누클레오티드를 단락 IV.A.1.b.에 기술한 바와 같이 조립한다. 연결시킨 다음에 DNA 혼합물을 HindIII로 분해하고 폴리아크릴아마이드겔 전기영동에 의해 103bp 단편을 정제한다. 정제된 DNA단편을 HindIII 분해 M13-Mp18 및 M13-mp19(Vierra, J.and Messing, J., Supra)속에 연결시키고 상술한 바와 같이(Sanger et al., Supra) 디데옥시누클레오티드 서열 분석을 수행하여 제 17b 도에 나타낸 서열을 생성시킨다.
플라스미드 JC 1-5를 HindIII로 완전히 분해하고 소의 장 포스파타제 처리, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 수행한다. 상술한 정제 합성 DNA서열을 HindⅢ 분해 JC 1-5에 연결시켜 이.콜라이에 형질전환한다. 생성된 플라스미드를 103bp 합성 HindIII서열에 대해 스크린하고 그중 하나를 정제하여 pJC-2로 표기한다.
플라스미드 pJC-2는 α-인자 전구물질의 아미노산 85이후에 개시하는 사람 ANVP펩티드 서열(128-151)의 인프레임(Inframe) 융합과 함께 α-인자 신호/리더펩티드(Kurjam, J. and Herskowitz, I., Supra)를 코드화한다. ANVP펩티드 상부에 α-인자 조절 및 분비 서열의 존재는 각각 위치 84 및 85에 -Lys-Arg-잔기(제 17b 도)를 갖는 KEX 2위치[Julius, D.et al., Cell 37 : 1075-1089(1984)]에 의해 코드화된 프로데아제에 의해 단백질 분해 공정 및 래트 pro-ANVP서열에 대해 단락 IV.B.1.c.에서 기술한 것과 유사한 인체 ANVP(128-151)의 세포의 분비를 허용한다. 플라스미드 JC-2를 사용하여 선택 배지상의 에스.세리비지애 W301-18A(절 IV.B.1.b.)를 형질전환시킨다.
ⅲ. 에스.세리비지애로부터의 인체 ANVP(128-151)의 발현 및 정제
플라스미드 JC 1-5 또는 JC-2를 함유하는 에스.세러비지애 W301-184를 상술한 선택 합성 배지(section IV.B.1.c.)에서 30℃로 성장의 정지기까지 증식시키고, 세포를 4℃에서 원심분리하여 채취한다. 생성된 상등액을 채취하여 특히 방사성 면역 측정법(단락 V)으로 ANVP 펩티드의 손재를 측정한다. 표 VI에 있는 결과는 플라스미드 JC-2 함유 에스 세리비지애가 면역반응성 펩티드를 분비하고 있다는 것을 나타낸다.
[표 Ⅵ]
Figure kpo00050
면역반응성 펩티드를 명확하게 동정하기 위해서, 플라스미드 JC-2를 함유하는 에스. 세리비지애를 선택합성 배지 1ℓ에서 30℃ 정지기까지 증식시킨다. 세프를 원심분리로 제거한다. 생성된 상등액을 수산화 암모늄으로 pH 8.0에 조정한 다음 원심분리시킨다. 생성된 맑은 상등액을 이미 0.01M 암모늄 아세테이트로 평형화한 DEAE
Figure kpo00051
세파셀
Figure kpo00052
(Pharmaia)을 함유하는 2.5cm×10cm 컬럼에 적용하고, 용출액(약 1.1ℓ)을 수거하여 동결건조시킨다. 건조 혼합물을 0.5M 아세트산 약 12ml에 재현탁시킨 다음 재현탁 용액으로 평형화한 세파덱스
Figure kpo00053
G-10함유 2.5cm×50cm컬럼에 적용한다. 방사성면역측정법(단락 V)으로 측정하여 면역활성을 함유하는 분획을 수거하고, 모아서 동결건조시킨다.
건조 물질을 아세트산 5ml에 재현탁하고 단락 IV.A.5.에 기술한 바와 같이 고속 액체 크로마토그라피를 수행한다.
면역반응성 피크 분획을 분리하고,200p몰을 기술한 바와 같이(단락 IV.A.5.) 자동 아미노산 서열 분석시킨다. 생성 아미노산 서열은 다음과 같다.
H - Ser - Ser -Cys - Phe -Gly -Gly - Arg - Met - Asp - Arg - Ile -Gly - Ala -Gln - Ser - Gly - Leu -Gly - Cys - Asn - Ser - Phe - Arg - Tyr - OH
게다가 효모 폴리펩티드에 의한 오염물질은 이 분석방법에 의해 검출할 수 없다.
pJC 2를 함유하는 에스.세리비지애 균주 W 301-18A는 1985년 4읠 9일 ATCC에 기탁되었으며 수탁번호 20754[재기탁기관 : 한국종균협회 ; 기탁일 1986년 10월 21일 ; 수탁번호 KFCC-10293]를 지정받았다.
c. 배향된 차이니스(chinese)
햄스터 난소 세포에서의 pre-pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드의 발현
하기 실시예에 CHO(차이니스 햄스터 난소)세포중외 pro rANVP(25-152) 및 pro hANVP(26-151)의 발현이 기술되어 있다. 이들 실시예는 설명하기 위해 제공되며 어떤 pre-pro ANVP, pro ANVP 또는 ANVP도 포유류 세포에서 동일 방법으로 발현할 수 있다는 점을 쉽게 이해하게 될 것이다.
1) 래트-pro-pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드의 발현
포유류 세포에서 래트 pre-pro ANVPs의 발현을 용이하게 하기 위해 래트 pre-pro ANVP용 코드화분절을 사람 메탈로티오네인II(hMTII) 유전자로부터 유래한 강력히 조절된 프로모터에 융합시켜서 혼성화유전자를 구성한다. 이것은 2단계로 수행한다. 제 1단계에서는 발현 벡터를 제조한다. 발현 벡터, pHS I는 전사 출발 위치, 765번 염기에 자면적으로 발생한 HindⅢ 제한 위치로부터 코드화 영역에 인접한 5' 비번역 영역에 위치한+70번 염기까지, hMTII서열의 840누클레오티드 염기쌍[Karin, M. et al., Nature 299 : 797-802(1982)]을 갖는다. pHS I는 또한 코드화 서열이 삽입될 수 있는 부위를 갖고 있다. pHS I를 구성하기 위해, hMTII 유전자를 갖는 플라스미드 p84H를 제한 엔도누클레아제 BamH I으로 완전히 분해하고 엑소누클레아제 Bal-31로 처리하여 말단 누클레오티드를 제거한다. HindIII로 분해하고, 이 반응의 생성물을 HindⅢ 및 Hincll 분해에 의해 개환된 플라스미드 pUC 8[Vieira, J. and J. Messing, Gene 19 : 259-268(1982)]에 연결시킨다. 생성된 플라스미드 제조합체중 하나는 누클레오티드 서열에 의해 판명된 pHS I의 조성을 갖고 있다.
혼성화 유전자의 구성을 완성하기 위해 EcoR I-Sal I 래트 pre-pro ANVP cDNA를 EcoR I 및 SaII으로 분해하여 플라스미드 pNF1(단락 II.A.)로부터 단리하고, 폴리아크릴아마이드겔 정제를 수행한다. pHS I를 EcoR I로 개환하고 T4-DNA리가제로 cDNA단편에 완결시킨다. 반응 생성물을 평활-말단 분자로 하기 위해 4누클레오티드 삼인산 및 DNA폴리머라제 I (Klenow fragment)과 배양하고, 후속적으로 2차 연결을 통해 재환상화한다. 재조합 플라스미드 분자를 이.콜라이 MC 1061속에 도입하고 제한 엔도누클레아제분석 [Maniatis et al., Supra at p.104)으로 스크린한다. 2개의 제조합체(제 18a 도), pMT-NF1-10 및 pMT-NF1-20을 네오마이신 유사체 G4l8에 대한 내성을 부여하는 기능 유전자를 갖는 플라스미드, pSV2 : NEO[Southern, p. and p.Berg, J.Mol.Appl.Genet.1 : 327-341(1982)]로 공동-형질전환시킴으로써 배양된 세포의 차이니스 햄스터 난소(CHO)주에 도입시킨다. pSV2 : NEO 500ng 및 pMT-NF1-10 또는 pMT-NF1-20 5μg을 DNA에 4시간 노출시킨후 15% 글리세롤로 2분 동안의 "쇼크(shock)"를 포함해서, 표준 프로트콜[Wigler, M., et al., Cell 16 : 777-785(1979)]에 따라 인산칼슘-DNA 공동 침전물 중의 세포 60mm 접시에 적용한다. 1일후 세포를 G418 1mg/ml에 노출시킨다. 이 방법은 대부분 pMT-NF1-10 또는 pMT-NF1-20의 안정적인 유전을 또한 수득한 G418 내성 콜로니를 생성한다. CHO세포 및 기타 배양 세포에 대한 이전의 경험은 그들이 포유류 프리호르몬(prehormones)으로부터의 신호 펩티드를 절단할 수 있고, 폴리펩티드의 잔여물을 영양 배지로 분비할 수 있음을 시사한다. 따라서 pre-pro ANVPs 및 관련 펩티드의 생성은35S-met로 세포를 배양하고 표준 단백질 겔 분석에 의해 방사능-표지된 분비 생성물을 시험함으로써 측정한다.
배지에 분비된35S-Met-표지 단백질의 방사선자기법은 항-ANVP IgG에 의해 특이하게 면역침전하는 18,000달톤의 단백질의 출현을 밝혀냈다. 이 단백질은 대조 플라스미드를 함유하는 세포의35S-메티오닌표지 단백질에서는 발견되지 않는다. 따라서 pMT-NF1-10을 함유하는 CHO세포는 이들 세포의 배지로pro ANVPs를 분비한다.
pMT-NF1-10을 함유하는 차이니스 햄스터 난소[CHO) 세포는 1984년 5월 31일, ATCC에 기탁되었으며 수탁번호 CRL-8569[재기탁기관 : 한국종균협회 ; 기탁일 : 1986년 10월 21일 ; 기탁기관 : KFCC-10291]를 지정받았다.
2) 배양된 포유류 세포에서의 인체 pre-pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성
폴리펩티드의 발현
사람 pre-pro ANVPs는 사람 게놈의 클론의 특성을 감안한 적당한 변형의 유사 방법으로 발현된다. 요약해서, pre-pro ANVP 유전자를 함유하는 BamH I 에서 EcoR I 까지의 인체 게놈의 단편을 갖는 플라스미드 HGRB1을 구성하여, 제한 엔도누클레아제 ACC I으로 부분 분해하고, EcoR I로 완전히 분해한다. 생성된 Acc I-EcoR I 단편을 폴리아크릴아마이드겔 정제법으로 단리한다. 유전자의 5' 비전사 부위에서 3'말단을 지난 지점까지 연장된 이 단편을 Acc I 및 EcoR I로 개환된 발현 플라스미드 pMT401에 연결시킨다. 플라스미드 pMT401을 m13 mp7 (Vieira and Messing, Supra)로부터의 BamH I-결합 폴리링커부위를 pHSI의 BamH I위치에 삽입시킴으로써 유도한다. 인체 pre-pro ANVP 유진자를 함유하는 생성재조합체를 사람 메탈로티오네인 프로모터의 3'에 위치시키고 pNHF-8로 표기한다. 잡종 구성체를 래트pre-pro ANVPs에 대해 상기 기술한 바와 유사한 방법으로 배양된 발현용 CHO세포에 유도한다.
pNHF-8로 형질전환된 배양 CHO세포를 10% 태아 소혈청을 추가한 해리스(Harris) F-12배지를 함유하는 접시에서 낮은 희석으로 세포를 평판시켜 아클론화한다. 개개의 아클론을 후속적으로 채취하고 방사성면역측정법(단락 V) 및35S-메티오닌의 방사능표지로 각각 pro-ANVP생성에 대해 시험한다.35S-메티오닌-표지된 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동으로 분해한다. 제 18b 도는 이들 실험의 결과이다. 레인 2는 대조용 CHO세포로부터의35S-메티오닌-표지된 단백질을 나타낸다. 레인 1은 아클론화전에 pNHF-8로 형질전환된 CHO 풀(pool)로부터의35S-메디오닌 표지된 단백질을 나타낸다. 레인 3-6은 pHNF-8을 함유하는 4개의 아클론으로부터의35S-메티오닌-표지된 단백질을 나타내며 CHO-8/2-6,CHO-8/2-55, CHO-8/2-81, CHO-8/2-93으로 표기된다. 각각의 아클론에서 명백한35S-메티오닌-표지된 밴드는 18,000 및 10,000달톤에서 나타난다. 벤드는 pro ANVP(18,000k)로 분류되며 특수한 항체로의 면역침전에 의해 이 단백질의 아미노 말단을 함유하는 pro ANVP단편이다. 아클론이 pro ANVP를 생성시킨다는 사실은 단락 V에 기술한 방사성 면역 측정법에 의해 확인되였다.
10,000달톤의 형태는 pro ANVP의 치환 부위가 이 시스템에서 단백질 분해에 의해 분해되어 있음을 가리킨다는 것을 주목해야 한다. 그와 같은 단백질 분해는 짧은 ANVP's를 함유하는 소형 카복시 말단 단편및 아미노 말단 단편을 산출한다. 따라서 클론은 생물학적으로 활성 ANVP 분절이 있거나 또는 없이 pro ANVP 및 소형 단편을 생성하는메 중요한 것으로 고려된다.
pHNF-8을 함유하고 CHO-8/2-81로 표기된 차이니스 햄스터 난소(CHO)세포는 1985년 4월 9일,ATCC에 기탁되었으며 수탁번호 CRL-8782[재기탁기관 : 한국종균협회 ; 기탁일 : 1986년 10될 21일 ; 수탁번호 : KFCC-10292]로 지정받았다.
D. pre-pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 및 pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드로부터 유래한 발현 생성물의 생물학적 활성
단락 D.2에 기술한 효모 α-인자 시스템 및 단락 C.2에 기술한 이.콜라이 시스템에 의해 발현 및 분비가 유도된 여러가지 래트 및 인체 pro ANVPs를 시험하여 생물학적 활성을 함유함을 밝혔다. 효모 배양액(100ml)를 100μg/ml HSA를 함유하는 합성 배지에서 30℃로 16시간 동안 증식시켰다. 세포를 원심 분리하여 채취하고 배지를 동결건조시킨다. 동결건조 분발을 증류수 2ml에 환원시키고 아세톤 10용적을 가한다. 용액을 완전히 혼합하고 이어서 소르발(Sorvall) RT 6000원심분리기(Sorvall Instruments, Wilmington, DE)에서 10,000×g로 10분동안 원심분리시킨다. 상등액을 제거한 후 펠릿을 증류수 1ml에 재현탁시키고 메탄올 10용적을 가한다. 이 용액을 완진히 혼합하고 다시 소르발 RC58 원심분리기에서 20,000×g로 10분동안 원심분리시킨다.
용액의 반을 사반트(Savant)-타이프 증발기("메탄올 용성" 분획, 표 I참조)상에서 회진 증발에 의해 건조한다. 잔여 용액을 0.5M 아세트산으로 1:1희석시키고 0.5M 아세트산에서 평형화한 SP-세파덱스
Figure kpo00054
(sigma chemical Co.) 3ml컬럼에 적용한다. 컬럼을 0.5M 아세트산 15ml로 세척하고 이어서 1.0M 암모늄 아세테이트 6ml로 용출시킨다. 용출된 물질을 동결건조시킨다[표 VII "post SP-Sephadex"분획) 건조된 메탄올 용해성 및 암모늄 아세테이트 용출 물질을 증류수 0.5ml에 재용해하고 하기 참조 문헌[Kleinert, et al., Hypertension 6 : Suppl.1 : 143-146(1984)]에 기술된 예비 수축된 토끼의 가슴 대동맥환 모델을 사용하여 생물학적 활성을 시험한다. 조동결 배지, 메탄올 용해성 단백질 또는 1.0M 암모늄 아세데이트의 SP-세파덱스
Figure kpo00055
로부터 용출된 단백질로부터 재구성된 물질의 등용적을 5μM 히스타민으로 예비수축된 대동맥 환을 사용하여 비교한다. 그의 플라스미드가 pro ANVP(아미노산 26-152)(YEp-α-NF-9) 및 pro ANVP(아미노산 121-152)(YEp-α-NF-5), 뿐만 아니라 상응하는 역배향(각각 YEp-α-NF-12 및 YEp-αr-NF-7)을 코드화하는 효모 균주에 의해 합성된 물질을 비교한다. 이 결과를 표Ⅶ에 나타내였다. 탁월한 혈관확장 활성이 메탄올 용해성 물질 뿐만 아니라 YEp-α-NF-5 및 YEp-α-NF-9을 함유하는 세포 추출물에서의 후(post) SP-세파덱스 물질에서 검출된다. 역배향 DNA플라스미드를 함유하는 세포로부터의 추출물은 비활성적이였다. 이러한 발견, 뿐만 아니라 제 16 도에 나타난 면역침전 자료는 효모가, 성숙 ANVP를 함유하는 전장 및 소형 pro ANVP 단편을 잠재적인 생물학적 활성을 나타내는 형태로 진행시킴을 입증한다.
[표 Ⅶ]
pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 및 에스.세리비지애에 의해 발현된 pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 단편의 혈관 이완 특성
Figure kpo00056
대동맥 환을 5μM 히스타민으로 에비 수축시킨다. 이어서 대동맥 환을 에스.세리비지애 배양액으로부터 수득한 단백질로 처리한다. 단백질을 배양 배지의 아세톤/메탄올 처리에 의해 정제하고 지시 분획을 SP-세파덱스를 통해 통과시킨다. YEp-α-NF-5 및 YEp-α-NF-9은 pro ANVP cDNA를 정배향으로 함유하고 YEp-α-NF-7 및 YEp-α-NF-12는 DNA를 역배향으로 함유한다. 자료가 상기(kleinert,supra)에서 기술한 바와 같이 예비수축된 환의 %이완으로 표현되어 있다.
상기 발현된 물질의 샘플을 또한 하기 문헌[Cannrgo, M.et al., Am.J : Physiol.246 : F447-F456(1984)]에 기술된 바와 같이 분리된 관류 래트 신장 모델을 사용하여 나트륨 이뇨성 및 이뇨성 활성에 대해 시험한다. 표 Ⅷ에 나타난 바와 같이 YEp-α-NF-5 함유 효모 배양물로부터 합성 및 분비되고 SP-세파덱스를 통해 상술한 바와 같이 정제된 물질은 각각 10분의 반복 시험 기간동안 시험된 바와 같이 뇨의 Na+ 배설 약 3배 및 뇨의 용적 2배를 증가시켰다. 사구체 여과 또한 이뇨 활성과 부합하는 이 실험에서 증가시켰다. 동일 실험을 역배향 대조 플라스미드 YEp-α-NF-7을 함유하는 효모 배양물에 의해 합성 및 분비되고 SP-세파덱스
Figure kpo00057
를 통해 정제된 물질에 대해 수행한 경우, 뇨의 Na+ 배설, 뇨의 용적, 사구체 여과 또는 신장 내성에서 탁월한 증가는 발생하지 않았다
[표 Ⅷ]
단리된 관류 래트 신장에서 신장 기능성 에스.세리비지애에 의한 발현 및 분비된 심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리팹티드의 효과
Figure kpo00058
결과는 후속적으로 SP-세파덱스 정제된 단백질 50μl를 가한 2개의 10분 대조 기간의 평균을 나타낸다. 실험적 측정은 3회의 연속적 10분 기간동안 수득된 값의 평균을 나타낸다.
단락 IV.B.2.d.에 기술된 바와 같이 정제된 인체 pro ANVP(128-151)을 상술한 바와 같이 측정하여 생물학적 활성의 전범위를 밝혀낸다.
효모-발현된 활성물질과 유사한 방법으로, 단락 IV.A 및 IV.C에서 기술한 세균 및 포유류 세포 발현 시스템에 의해 발현된 래트 및 인체 pre-pro ANVPs, pro ANVPs 및 ANVPs가 생물학적 활성을 소유하는 것으로 밝혀냈다.
이.콜라이에서 각각 플라스미드 pRNF-6852 및 pRNF-12852에 의해 합성이 유도된 래트 pro ANVP단편 87-152 및 26-152를 하기와 같이 세균 세포 1ℓ로부터 추출한다. 세포를 5,000×g에서 60분동안 원심분리시켜 수거하고 50mM 트리스, pH 7.5의 10ml에 재현탁시킨다. 이 현탁액을 열 시스템 초음파 파쇄기(Heat Systems, Farmingdale, NY)를 사용하여 세팅(Setting) 4에서 1시간동안 초음파 파쇄시킨다. 초음파 파쇄물을 105,000×g에서 원심분리하여 임자 물질을 제거하고, 생성된 상등액을 모아서 조세균 추출물로 칭한다. 조세균 추출물의 분획을 후속적으로 5분동안 가열하고 1시간동안 pH 2.5로 낮춘다. pH를 중화하고 생성된 가열-산 추출물 및 조세균 추출물을 기술한 바와 같이 토끼 가슴 대동맥 환에 적용한다. 표 IX에 나타난 바와 같이, pRNF-6852 및, pRNF-12852를 함유하는 추출물로부터의 조세균 추출물 및 가열-산 추출물은 예비수축된 조직을 이완시킨다. pro ANVP DNA가 포함되지 않은 pKT 52벡터를 함유하는 세균으로부터의 대조용 샘플은 볼활성적이다. 따라서 효모 발현 생성물과 유사한 방법으로 세균성 래트 pro ANVP단편은 혈관확장성을 나타내었다. 게다가 조세균 추출물에 비해 생물학적 활성의 소실없이, 후속적인 진행을 방지하기 위해 이들 샘플의 분획은 가열되고 산은 추출되기 때문에 전체 68아미노산 단편이 생물학적으로 활성인 것으로 믿어진다. 단락 IV.A.5.에 기술한 이.콜라이로부터 제조된 정제 인체 pro ANVP(26-151)가 혈관 조직에 큰 효과를 가지고 있음이 밝혀졌다.
[표 IX]
이.콜라이에서 발현된 pro심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 단편의 혈관이완 활성
Figure kpo00059
토끼 가슴 대동맥 환을 5μM 히스타민으로 예비수축시킨다. 자료는 예비수축된 환의 %이완으로서 표현되었다.
포유류·세포 발현의 경우, CHO세포에서 생성된 pro rANVP(25-152) 및 pro hANVP(126-151)는 상기 관찰된 것과 유사한 생물학적 활성을 나타내었다.
상술한 재조합 DNA기술을 사용하여 효모, 세균 및 포유류 세포에서 발현된 pro ANVP단백질 모두는 하기의 공통적인 ANVP서열을 하유한다 :
Figure kpo00060
여기에서 가로안의 아미노산 잔기는 인체 ANVPs에서 Met이고 래트 ANVPs에서 Ile이다. 상술한 시스템에서 발현된 pro ANVP단편은 잠재적인 혈관확장성, 나트륨 이뇨성 및 이뇨성활성(표 Ⅶ,Ⅷ 및 Ⅸ)을 보인다. 이들 동일 및 관련 활성은 또한 rANVP(126-150) 및 hANVP(127-15l)로 설명된 바 있다. 따라서 이들 발현된 단편들은 생체의 제세 및 인체 또는 동물에게 주입된 경우 생체내에서 합성 ANVP와 모든 특성을 공유해야 한다. 표 V에 나타난 바와 같이 합성 ANVPs는 평균 동맥 혈압, 플라스마 레닌(renin)활성 및 플라스마 알도스테론을 낮추고, 뇨의 용적 및 뇨의 나트륨 배설을 증가시킨다. 이들은 이뇨제 및 항고혈압제를 위해 바람직한 특성이다. 게다가 pro ANVPs 및 ANVPs는 용적 및 혈압조절의 모든 주요중심에서 작용한다. 따라서 재조합 DNA방법으로 생성되고 상술한 것과 필적하는 방법으로 효모, 세균 또는 포유류 세포에서 발현된 경우, pre-pro ANVPs, pro ANVPs, 및 ANVPs는 부종(浮腫) 상태(즉 울혈성 심마비, 신장 증후군, 간경변 및 비효율성 신장 관류)의 급성 및 만성 치료와 신장 부전증 및 고혈압의 만성 치료시 활용성을 발견할 것이다.
상기 실시예에서 설명한 바와 같이 기술된 방법 및 조성물은 pre-pro ANVPs, pro ANVPs 및 그의 단편, 및 ANVPs를 발현시키는 데에서 용도를 찾을 수 있다. 여기에서 기술한 폴리펩티드의 어떤 서열 또는 단편은 본 내용에 약간의 변형을 가하고, 한편 본 발명의 영역내에 위치함으로써 발현될 수 있다는 것이 당분야의 통상적인 기술을 소유한 사람은 명백히 알고 있다.
특히 기술된 pre-pro ANVPs 아미노산 서열의 어느 단편이건 발현될 수 있다. 이들 중 특정 단편은ANVP의 완전한 서열을 함유하지 않을 것이나 ANVPs의 일부는 포함할 수도 있다. 이들 단편 자체는 인스턴트(instant) 화합물에 대해 기술한 활성과 부합 또는 상보적인 생물학적 활성을 보인다.
더불어 인체-유래 pro ANVPs 그의 단편 및 ANVPs는 생물학적으로 활성적인 래트-유래 폴리펩티드에 부합하는 단일 아미노산 위치를 함유한다. 그러므로 상술한 방법으로 제조한 효모, 세균 및 포유류 세포발현된 사람-유래 화합물을 유사한 생물학적 활성을 나타낼 것이다.
V. 심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 화합물에 대한 항체의 생성
본 발명의 화합물은 샘플에서 ANVPs의 존재여부 또는 존재량을 측정하기 위해 면역측정법, 특히 방사성면역 측정법을 제공하기 위해 사용된다.
ANVPs에 대한 항체는 완전 프로운트 보조제(Complete Freund's adjuvant)중에 소의 혈청 알부민에 접합된 250μg ANVP으로 뉴우질랜드 호이트 토끼(White rabbits)를 피하 및 근육내 면역시켜 생성한다. 토끼를 불판전 프로운트 보조약 중에 접합 동일양으로 3주 간격마다 추가 투여한다. 토끼를 추가 투여한 7-10일 후 귀의 동맥으로부터 채혈하고 생성된 혈청을 ANVP와 결합하는 그의 능력에 대해 시험한다. 동일조건의 대조용 비-면역 혈청 샘들을 또한 시험한다. 표 V는 ANVPs와 특이하게 상호작용하는 항혈청의 능력을 시험한 대표적인 실험으로부터의 자료를 나타낸다. ANVP(500ng)이 폴리스티렌 플레이트 개개의 웰(well)에서 고정화되었다. 항혈청의 다양한 희석액을 이들 웰에 가하고 특이하게 결합된 항체의 양을125I-표지된 양의 항-토끼 IgG 항혈청을 가함으로써 측정한다. 이것은 특이한 항체 종말점을 측정하기 위한 표준 방법이다. 표 X에 나타난 바와 같이, 상당한 양의 항체에 대해 1:400의 혈청 희석에서 아직 ANVPs에 대한 결합이 있었다. 특히 결합이 비-면역혈청에서는 관찰되지 않았다.
[표 X]
고정화된 심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 화합물에 대한 항-심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 항혈청의 특이 결합
Figure kpo00061
표 ⅩⅠ에서 언급된 실험이 표 X의 것과 동일하나, 비-고정화된 ANVPs의 다양한 농도를 항-ANVP 항혈청의 1:100희석과 함께 동시에 가했다. 나타난 바와 같이 비-고정화된 ANVPs는 고정화된 ANVPs로부터 항체결합을 경쟁적으로 제거한다. 따라서 이것은 경생적 제거 측정법의 실시예로서 기여한다. 이 측정법 및 유사한 방사성면역 측정법을 다양한 생리학적 또는 병리생리학적 상태하에 조직 또는 혈청중의ANVP-유사(like)면역 반응성을 정량하는데 사용할 수 있다. 따라서 이 측정법이 심방 추출물중의 ANVP을 검출하기 위해 사용되어 왔다. 심실 추출물에서는 ANVP가 검출되지 않았다.
[표 ⅩI]
유리 심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드를 가함으로써 고정화된 심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드에 대한 항-심방 나트륨 이뇨성/혈관확장성 폴리펩티드 결합의 경쟁적 제거
Figure kpo00062
비록 상기의 발명이 어느정도 명확하게 이해의 목적으로 기술되었다 하더라도, 당분야 숙련가들은 본 발명의 변형이 첨부된 특허 청구의 정신 및 범위내에서 실행될 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다.

Claims (1)

  1. C-발단 티로신 잔기가 커플된 고형 지지체에 아미노산을 연속적으로 부가한 다음, 하기 일반식(1)의 펩티드를 지지체로부터 분리하여 펩티드를 아세테이트 염으로 전환시킴으로 특징으로 하는, 일반식(1)의 펩티드를 제조하는 방법.
    Figure kpo00063
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