JPH07170988A - 核酸分子及び核酸分子を含有するように改質された微生物又は細胞培養物 - Google Patents
核酸分子及び核酸分子を含有するように改質された微生物又は細胞培養物Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 利尿剤、ナトリウム尿***亢進剤および血管
拡張剤として有用なポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む核酸分子及び、その核酸分子を含有する
ように改質された微生物又は細胞培養物に関する。 【構成】 式:Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile/
Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-As
n-Ser-Phe-Arg-Tyr(式中、Ile/MetはIle又はMetを表わ
す)で表わされ、その環状ジスルフィド形を包含し、N
末端アセチル化形及び/又はC末端アミド化形を包含す
るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、
単離され精製された核酸分子及びそれを含有するように
改質された微生物又は細胞培養物である。
拡張剤として有用なポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む核酸分子及び、その核酸分子を含有する
ように改質された微生物又は細胞培養物に関する。 【構成】 式:Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile/
Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-As
n-Ser-Phe-Arg-Tyr(式中、Ile/MetはIle又はMetを表わ
す)で表わされ、その環状ジスルフィド形を包含し、N
末端アセチル化形及び/又はC末端アミド化形を包含す
るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、
単離され精製された核酸分子及びそれを含有するように
改質された微生物又は細胞培養物である。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、利尿剤、ナトリウム尿
***亢進剤および血管拡張剤として有用なポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子及び、そ
の核酸分子を含有するように改質された微生物又は細胞
培養物に関する。
***亢進剤および血管拡張剤として有用なポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子及び、そ
の核酸分子を含有するように改質された微生物又は細胞
培養物に関する。
【0002】
【従来の技術】ほとんどの多細胞有機体は、特殊化され
た役目を果たす組織および器官に組織化されている。か
くして、それらの組織および器官の間で物質を輸送する
ための一連の系統が発達する。哺乳類を含む更に高度の
動物においては、当該輸送の効率を改善するために、こ
の循環系統は閉じられている。この閉じられた心臓と血
管の系を通る血液流体の流れは、当該流体が常に加圧さ
れていることを必要とし、そして当該系の動脈血圧の調
整は、例えば、流体容積や、血管の弾性や、血管の口径
などを含む無数の因子の複雑な相互作用を必要とする。
た役目を果たす組織および器官に組織化されている。か
くして、それらの組織および器官の間で物質を輸送する
ための一連の系統が発達する。哺乳類を含む更に高度の
動物においては、当該輸送の効率を改善するために、こ
の循環系統は閉じられている。この閉じられた心臓と血
管の系を通る血液流体の流れは、当該流体が常に加圧さ
れていることを必要とし、そして当該系の動脈血圧の調
整は、例えば、流体容積や、血管の弾性や、血管の口径
などを含む無数の因子の複雑な相互作用を必要とする。
【0003】通常の細胞外の流体容積の維持は、主に、
腎臓によるナトリウムの***(ナトリウム***増加)お
よび水の***(利尿)に依存する。これは、(1):血漿
が糸球体において濾過される場合(糸球体濾過率すなわ
ちGFR)と; (2):腎臓の細管に沿って積極的に再吸収
される(受動的に従う水を伴う)ナトリウムの再吸収の
程度とによって決定される。後者のプロセスは、部分的
に、副腎のステロイドホルモン、アルドステロンによっ
て調整される。GFRおよびアルドステロンに加えて、同
様にナトリウムの再吸収を調整する「第三番目の因子」
が存在せねばならないと、長い間、信じられてきた。今
日では、「第三番目の因子」の仮説を必要とした多くの
現象が、ナトリウムの再吸収に関連する物理力(例え
ば、血圧や、赤血球細胞濃度や、血漿粘度など)の作用
によって説明できることが明らかになっている。それに
もかかわらず、細管の再吸収を調整することができる
「ナトリウム***増加ホルモン」を求める研究が続いて
いる。
腎臓によるナトリウムの***(ナトリウム***増加)お
よび水の***(利尿)に依存する。これは、(1):血漿
が糸球体において濾過される場合(糸球体濾過率すなわ
ちGFR)と; (2):腎臓の細管に沿って積極的に再吸収
される(受動的に従う水を伴う)ナトリウムの再吸収の
程度とによって決定される。後者のプロセスは、部分的
に、副腎のステロイドホルモン、アルドステロンによっ
て調整される。GFRおよびアルドステロンに加えて、同
様にナトリウムの再吸収を調整する「第三番目の因子」
が存在せねばならないと、長い間、信じられてきた。今
日では、「第三番目の因子」の仮説を必要とした多くの
現象が、ナトリウムの再吸収に関連する物理力(例え
ば、血圧や、赤血球細胞濃度や、血漿粘度など)の作用
によって説明できることが明らかになっている。それに
もかかわらず、細管の再吸収を調整することができる
「ナトリウム***増加ホルモン」を求める研究が続いて
いる。
【0004】このようなホルモンの候補物質が幾つか存
在しており、この中に、最近、心房の筋細胞から分離さ
れたナトリウム***増加因子が含まれる。
在しており、この中に、最近、心房の筋細胞から分離さ
れたナトリウム***増加因子が含まれる。
【0005】ナトリウム***増加効果は、ラットの心室
組織ではなく、ラットの心房組織の抽出原液によって証
明されている:ドゥ・ボルド(De Bold),A.J.ほか、Life
Sciences、28:89-94(1981);ガルシア(Garcia),R.、Ex
perientia、38:1071-73(1982);キューリー(Currie),
M.G.ほか、Science、221:71-73(1983)。利尿およびナト
リウム***増加の特性を有する種々のペプチドが心房組
織から分離され、そして生成されている:フリン(Flyn
n),T.G.ほか、Biochem. Biophys. Res. Commum.、118:1
13-139(1984)。これらの心房性ナトリウム***増加因子
の存在によって、心臓は、腎臓の潅流に及ぼす自己の明
白な影響のほかにも、腎臓のナトリウムおよび水分の排
出を調整する上で大きな役割を果たしているのではない
かという長い間の疑念が強められた。心房の拡張が、利
尿およびナトリウム***増加を引き起こすことは知られ
ており、そして、これは多分、これらの因子の増大した
放出によって媒介され実現化されているのかも知れな
い。
組織ではなく、ラットの心房組織の抽出原液によって証
明されている:ドゥ・ボルド(De Bold),A.J.ほか、Life
Sciences、28:89-94(1981);ガルシア(Garcia),R.、Ex
perientia、38:1071-73(1982);キューリー(Currie),
M.G.ほか、Science、221:71-73(1983)。利尿およびナト
リウム***増加の特性を有する種々のペプチドが心房組
織から分離され、そして生成されている:フリン(Flyn
n),T.G.ほか、Biochem. Biophys. Res. Commum.、118:1
13-139(1984)。これらの心房性ナトリウム***増加因子
の存在によって、心臓は、腎臓の潅流に及ぼす自己の明
白な影響のほかにも、腎臓のナトリウムおよび水分の排
出を調整する上で大きな役割を果たしているのではない
かという長い間の疑念が強められた。心房の拡張が、利
尿およびナトリウム***増加を引き起こすことは知られ
ており、そして、これは多分、これらの因子の増大した
放出によって媒介され実現化されているのかも知れな
い。
【0006】臨床的に重要な疾患症状の多くは、異常流
体容液の維持によって特徴付けられる。うつ血性心不
全、肝硬変およびネフローゼ症候群の各々は、血行の静
脈側における過度の流体蓄積に続いており、推定される
共通の機構としては、腎臓の潅流における糸球体濾過率
(GFR)の低下がある。更に、腎臓の潅流が減少すること
によって、アンギオテンシンを血行中に形成させる動き
を有するタンパク質分解酵素の一種であるレニンの過度
の分泌が促される。アンギオテンシンは、細動脈の強力
な狭窄物質であり(動脈の血圧を維持する助けをす
る)、そして又、副腎によるナトリウム保持ホルモン、
アルドステロンの放出を促す(それが流体保持を更に悪
化させる)。しかしながら、これらの機構は、いわゆる
「浮腫状の症状」の流体保持の全てを説明するわけでは
ないので、多分、付加的因子が更に存在するのだろう。
1つの重要な可能性として、心房の慢性的な過度の拡張
(すなわち、心不全)によって、あるいは心房の不適当
な刺激(すなわち、肝硬変およびネフローゼ症候群)に
よって引き起こされる心房のナトリウム***増加因子の
相対的な欠乏または絶対的な欠乏が、流体保持にかかわ
りあっていることが上げられる。
体容液の維持によって特徴付けられる。うつ血性心不
全、肝硬変およびネフローゼ症候群の各々は、血行の静
脈側における過度の流体蓄積に続いており、推定される
共通の機構としては、腎臓の潅流における糸球体濾過率
(GFR)の低下がある。更に、腎臓の潅流が減少すること
によって、アンギオテンシンを血行中に形成させる動き
を有するタンパク質分解酵素の一種であるレニンの過度
の分泌が促される。アンギオテンシンは、細動脈の強力
な狭窄物質であり(動脈の血圧を維持する助けをす
る)、そして又、副腎によるナトリウム保持ホルモン、
アルドステロンの放出を促す(それが流体保持を更に悪
化させる)。しかしながら、これらの機構は、いわゆる
「浮腫状の症状」の流体保持の全てを説明するわけでは
ないので、多分、付加的因子が更に存在するのだろう。
1つの重要な可能性として、心房の慢性的な過度の拡張
(すなわち、心不全)によって、あるいは心房の不適当
な刺激(すなわち、肝硬変およびネフローゼ症候群)に
よって引き起こされる心房のナトリウム***増加因子の
相対的な欠乏または絶対的な欠乏が、流体保持にかかわ
りあっていることが上げられる。
【0007】多くの病例において、細胞外の流体容積の
増加も又、高血圧の亢進にかかわっているものと考えら
れる。高血圧、即ち、慢性的に高い血圧は、世界的に疾
病および死亡の主要な原因の1つとなっている。2000万
人以上のアメリカ人が、この病気に苦しんでおり、彼等
の合併症には、心不全、心臓発作、心臓麻痺および腎不
全が含まれる。慢性的高血圧において主に観察される血
行力学上の異常は、細動脈を通る血液流の大きな抵抗で
ある。しかしながら、この大きな「末梢抵抗」につなが
る機構は、完全には理解されていない。幾つかのケース
においては、レニン−アンギオテンシン系または交感神
経系の不適当な活性によって、細動脈の過度の狭窄が引
き起こされ得る。「不適当」という意味は、当該活性に
つながる未知の信号が、生命体の生理的必要に基づいて
おらず、そして高血圧を引き起こすことを意味する(と
ころが一方、先に引用された症例においては、浮腫症状
における増加したレニンの分泌は、低下した動脈血圧に
応答しており、従って正常血圧を取り戻したり、又は維
持する助けとなっている。しかしながら、高血圧疾患者
の大部分において、腎臓による不適当なナトリウムおよ
び流体容積の保持が高血圧の引き金となっていたり、又
は高血圧の亢進にかかわっているものと考えられる。大
きな末梢抵抗につながる流体保持を引き起こすところ
の、腎機能における問題となる欠陥およびその機構は、
双方共に知られていない。ナトリウム***増加ホルモン
の欠乏が、特に同物質が通常においては細動脈について
の弛緩作用を仮に発揮する場合には、上記所見の原因と
なることも、確かに可能である。
増加も又、高血圧の亢進にかかわっているものと考えら
れる。高血圧、即ち、慢性的に高い血圧は、世界的に疾
病および死亡の主要な原因の1つとなっている。2000万
人以上のアメリカ人が、この病気に苦しんでおり、彼等
の合併症には、心不全、心臓発作、心臓麻痺および腎不
全が含まれる。慢性的高血圧において主に観察される血
行力学上の異常は、細動脈を通る血液流の大きな抵抗で
ある。しかしながら、この大きな「末梢抵抗」につなが
る機構は、完全には理解されていない。幾つかのケース
においては、レニン−アンギオテンシン系または交感神
経系の不適当な活性によって、細動脈の過度の狭窄が引
き起こされ得る。「不適当」という意味は、当該活性に
つながる未知の信号が、生命体の生理的必要に基づいて
おらず、そして高血圧を引き起こすことを意味する(と
ころが一方、先に引用された症例においては、浮腫症状
における増加したレニンの分泌は、低下した動脈血圧に
応答しており、従って正常血圧を取り戻したり、又は維
持する助けとなっている。しかしながら、高血圧疾患者
の大部分において、腎臓による不適当なナトリウムおよ
び流体容積の保持が高血圧の引き金となっていたり、又
は高血圧の亢進にかかわっているものと考えられる。大
きな末梢抵抗につながる流体保持を引き起こすところ
の、腎機能における問題となる欠陥およびその機構は、
双方共に知られていない。ナトリウム***増加ホルモン
の欠乏が、特に同物質が通常においては細動脈について
の弛緩作用を仮に発揮する場合には、上記所見の原因と
なることも、確かに可能である。
【0008】利尿療法は、現在、高血圧や、腎不全およ
び種々の浮腫病状の治療における大黒柱となっている。
しかしながら、現在入手可能な薬理学的薬は、幾つかの
重大な制限事項や、望ましくない効果を有する。それら
の使用は、特定の異常(すなわち、流体容積の増大)に
向けられてはいるが、それらの多数の作用は、疑いな
く、生理学的でなく、例えば、カリウムの喪失や、尿酸
の大量保持や、ブドウ糖および脂質の異常な代謝などを
引き起こす。更に、既知の全ての利尿剤は、レニン−ア
ンギオテンシン−アルドステロン系を強く刺激して、そ
れらの流体容積減少作用や血圧低下作用に反作用するの
で、その他の望ましくない効果を生ずる。完全な、しか
しながら、調整された範囲内で生理的に局所化された反
応を与えることによって血圧を調整することができる薬
理学的に効果的な化合物が提供されることが望ましい。
び種々の浮腫病状の治療における大黒柱となっている。
しかしながら、現在入手可能な薬理学的薬は、幾つかの
重大な制限事項や、望ましくない効果を有する。それら
の使用は、特定の異常(すなわち、流体容積の増大)に
向けられてはいるが、それらの多数の作用は、疑いな
く、生理学的でなく、例えば、カリウムの喪失や、尿酸
の大量保持や、ブドウ糖および脂質の異常な代謝などを
引き起こす。更に、既知の全ての利尿剤は、レニン−ア
ンギオテンシン−アルドステロン系を強く刺激して、そ
れらの流体容積減少作用や血圧低下作用に反作用するの
で、その他の望ましくない効果を生ずる。完全な、しか
しながら、調整された範囲内で生理的に局所化された反
応を与えることによって血圧を調整することができる薬
理学的に効果的な化合物が提供されることが望ましい。
【0009】しかしながら、このような化合物を心房組
織から分離することは、典型的に煩雑なプロセスであっ
て、ごく少量の当該化合物を得る場合でも、相当量の基
質組織が必要とされる。これ等の化合物のあるものは、
化学合成によって作ることができるけれども、臨床的に
および治療的に当該化合物を適用するために、大量に当
該化合物を生産するための技術として、デオキシリボ核
酸(DNA)の組み換え技術およびその関連技術を用いるこ
とが望ましいと考えられた。
織から分離することは、典型的に煩雑なプロセスであっ
て、ごく少量の当該化合物を得る場合でも、相当量の基
質組織が必要とされる。これ等の化合物のあるものは、
化学合成によって作ることができるけれども、臨床的に
および治療的に当該化合物を適用するために、大量に当
該化合物を生産するための技術として、デオキシリボ核
酸(DNA)の組み換え技術およびその関連技術を用いるこ
とが望ましいと考えられた。
【0010】コーエン(Cohen)とボイヤー(Boyer):米
国特許第4,237,224号の将来性を有する業績から出発し
て、DNA組み換え技術は、新規なDNAの配列を提供する上
で、そして転換された細胞の培養で多量の異種のタンパ
ク質を作る上で有用になってきた。一般に、種々の生体
からのDNAの接合は、制限酵素であるエンドヌクレアー
ゼを用いたDNA鎖の切断に依存する。これらの酵素は、
供与体のDNAを、極めて特異的な個所で切断するために
用いられ、その結果、供与体のDNAは、所望のDNA鎖を含
む遺伝子断片となる。これらのDNA断片は、一般に、
「付着端」と称される短い一本鎖の尾を各端に有する。
これらの付着端を有する断片は、次いで例えば、同じ制
限酵素であるエンドヌクレアーゼにより消化されること
により作られた発現媒体の相補的断片につなぎ合わされ
る。制御要素によって適当に配列された所望の構造遺伝
子を含む発現ベクター(expression vector)を作るこ
とにより、当該ベクターを用いて、宿主細胞を転換さ
せ、そして所望の遺伝子産物を入手可能な細胞機関(ce
llular machinery)を用いて発現させることができる。
一旦、発現させられると、一般に、当該遺伝子産物が細
胞内に発現している場合には、培養細胞を溶解させるこ
とによって当該産物が取り出され、あるいは、当該遺伝
子産物が宿主細胞中に隠れている場合には、培養液から
当該産物が取り出される。
国特許第4,237,224号の将来性を有する業績から出発し
て、DNA組み換え技術は、新規なDNAの配列を提供する上
で、そして転換された細胞の培養で多量の異種のタンパ
ク質を作る上で有用になってきた。一般に、種々の生体
からのDNAの接合は、制限酵素であるエンドヌクレアー
ゼを用いたDNA鎖の切断に依存する。これらの酵素は、
供与体のDNAを、極めて特異的な個所で切断するために
用いられ、その結果、供与体のDNAは、所望のDNA鎖を含
む遺伝子断片となる。これらのDNA断片は、一般に、
「付着端」と称される短い一本鎖の尾を各端に有する。
これらの付着端を有する断片は、次いで例えば、同じ制
限酵素であるエンドヌクレアーゼにより消化されること
により作られた発現媒体の相補的断片につなぎ合わされ
る。制御要素によって適当に配列された所望の構造遺伝
子を含む発現ベクター(expression vector)を作るこ
とにより、当該ベクターを用いて、宿主細胞を転換さ
せ、そして所望の遺伝子産物を入手可能な細胞機関(ce
llular machinery)を用いて発現させることができる。
一旦、発現させられると、一般に、当該遺伝子産物が細
胞内に発現している場合には、培養細胞を溶解させるこ
とによって当該産物が取り出され、あるいは、当該遺伝
子産物が宿主細胞中に隠れている場合には、培養液から
当該産物が取り出される。
【0011】DNA組み換え技術は、直接発現と称される
方法で、全く異種の遺伝子産物を発現させるために用い
られてきている、あるいは、所望の遺伝子産物を、同種
タンパク質のアミノ酸配列のある部分を含む融合タンパ
ク質として発現させることができる。一般に、この融合
タンパク質は、後翻訳的に(post-translationally)処
理され、それによって天然の遺伝子産物が取り出され
る。当該技術において有用な手法の多くは、下記文献中
に見出される:マニアティス、T., ほか、Molecular Cl
oning、A Laboratory Manual、コールドスプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laborator
y)、ニューヨーク(1982)。
方法で、全く異種の遺伝子産物を発現させるために用い
られてきている、あるいは、所望の遺伝子産物を、同種
タンパク質のアミノ酸配列のある部分を含む融合タンパ
ク質として発現させることができる。一般に、この融合
タンパク質は、後翻訳的に(post-translationally)処
理され、それによって天然の遺伝子産物が取り出され
る。当該技術において有用な手法の多くは、下記文献中
に見出される:マニアティス、T., ほか、Molecular Cl
oning、A Laboratory Manual、コールドスプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laborator
y)、ニューヨーク(1982)。
【0012】しかしながら、一般的な方法を要約するこ
とは容易だが、所望の構造遺伝子を含む発現媒介ベクタ
ーの構築は困難なプロセスであり、そして、所望の遺伝
子産物を、その生物学的活性を保持させながら充分な量
だけ成功裏に発現させることは、容易に予想することが
困難なことである。しばしば、遺伝子産物は、酸母やバ
クテリアあるいは、哺乳動物の細胞系の中で当該産物が
発現された場合に、生物学的に活性でない場合がある。
これらの場合において、生物的活性を生じさせるため
に、後翻訳的処理が必要とされる。
とは容易だが、所望の構造遺伝子を含む発現媒介ベクタ
ーの構築は困難なプロセスであり、そして、所望の遺伝
子産物を、その生物学的活性を保持させながら充分な量
だけ成功裏に発現させることは、容易に予想することが
困難なことである。しばしば、遺伝子産物は、酸母やバ
クテリアあるいは、哺乳動物の細胞系の中で当該産物が
発現された場合に、生物学的に活性でない場合がある。
これらの場合において、生物的活性を生じさせるため
に、後翻訳的処理が必要とされる。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】ナトリウム尿亢進増加
剤、利尿剤、血管拡張剤およびレニン−アンギオテンシ
ン−アルドステロン系(system)の調節物質として有用
な化合物は、実質的に、無関係の心房組織あるいはその
生成物を含有しない心房性ナトリウム尿***亢進性/血
管拡張性ポリペプチド(ANVPs)を含む。
剤、利尿剤、血管拡張剤およびレニン−アンギオテンシ
ン−アルドステロン系(system)の調節物質として有用
な化合物は、実質的に、無関係の心房組織あるいはその
生成物を含有しない心房性ナトリウム尿***亢進性/血
管拡張性ポリペプチド(ANVPs)を含む。
【0014】本発明は、式:Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-
Gly-Arg-Ile/Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Le
u-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(式中、Ile/MetはIle
又はMetを表わす)で表わされ、その環状ジスルフィド
形を包含し、N末端アセチル化形及び/又はC末端アミ
ド化形を包含する、哺乳動物におけるナトリウム尿***
亢進剤、利尿剤及び/又は血管拡張剤として有用なポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
及び核酸分子を含有するように改質された微生物又は細
胞培養物に関する。
Gly-Arg-Ile/Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Le
u-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(式中、Ile/MetはIle
又はMetを表わす)で表わされ、その環状ジスルフィド
形を包含し、N末端アセチル化形及び/又はC末端アミ
ド化形を包含する、哺乳動物におけるナトリウム尿***
亢進剤、利尿剤及び/又は血管拡張剤として有用なポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
及び核酸分子を含有するように改質された微生物又は細
胞培養物に関する。
【0015】更に又、DNAをコードするANVPs、proANVPs
あるいはpre-proANVPsを発現するためのDNA組み換え技
術を用いた、前記化合物を生産するための方法は、下記
工程を含む: a) 宿主細胞中にDNA配列を発現させる能力のある発現ベ
クターを作り; b) 当該発現ベクターでもって、宿主細胞培養物(a hos
t cell culture)を転換させ; c) 当該転換させられた宿主細胞培養物を、DNA配列の発
現が許される条件下で培養して、ANVPs、proANVPsまた
はpre-proANVPを含むポリペプチドを生産し;そして d) 当該ポリペプチドを回収する。
あるいはpre-proANVPsを発現するためのDNA組み換え技
術を用いた、前記化合物を生産するための方法は、下記
工程を含む: a) 宿主細胞中にDNA配列を発現させる能力のある発現ベ
クターを作り; b) 当該発現ベクターでもって、宿主細胞培養物(a hos
t cell culture)を転換させ; c) 当該転換させられた宿主細胞培養物を、DNA配列の発
現が許される条件下で培養して、ANVPs、proANVPsまた
はpre-proANVPを含むポリペプチドを生産し;そして d) 当該ポリペプチドを回収する。
【0016】これらの化合物を、診断薬および治療薬と
して用いる。
して用いる。
【0017】宿主(host)生体において流体容積および血
圧を調整するために、新規な、心房性ナトリウム尿***
亢進性/血管拡張性ポリペプチド化合物が本発明の核酸
分子から提供される。ここで、本発明は一面において、
無関係の心房組織あるいはその生成物を実質的に含まな
いANVPsを提供する。
圧を調整するために、新規な、心房性ナトリウム尿***
亢進性/血管拡張性ポリペプチド化合物が本発明の核酸
分子から提供される。ここで、本発明は一面において、
無関係の心房組織あるいはその生成物を実質的に含まな
いANVPsを提供する。
【0018】本発明は、ANVPs、proANVPs(成熟ANVP発
現産物化合物の前駆物質形態)およびpre-preANVPs(完
全な信号ペプチドを有するproANVPs)、およびそれ等か
ら誘導される断片の合成を指示することができる核酸配
列を提供し、当該核酸配列は、図1乃至3及び図4及び
図5のDNA配列を有し、その中に含まれてオリゴヌクレ
オチド配列を有し、コドン(codons)を、同じアミノ酸
配列の合成または機能的に等価なアミノ酸配列の合成を
指揮することができる他のコドンで置き換えることを可
能にし、当該等価なアミノ酸配列は、提供された例で開
示された代替的残基を含む。
現産物化合物の前駆物質形態)およびpre-preANVPs(完
全な信号ペプチドを有するproANVPs)、およびそれ等か
ら誘導される断片の合成を指示することができる核酸配
列を提供し、当該核酸配列は、図1乃至3及び図4及び
図5のDNA配列を有し、その中に含まれてオリゴヌクレ
オチド配列を有し、コドン(codons)を、同じアミノ酸
配列の合成または機能的に等価なアミノ酸配列の合成を
指揮することができる他のコドンで置き換えることを可
能にし、当該等価なアミノ酸配列は、提供された例で開
示された代替的残基を含む。
【0019】本発明のANVP化合物を説明するために用い
る用語は、アミノ酸の種名の最初の3文字を用いる従来
の慣習に従い、そしてここで、光学異性体を有するL型
の全てのアミノ酸が、もし別に明白に表示されていない
限り、意図されている。
る用語は、アミノ酸の種名の最初の3文字を用いる従来
の慣習に従い、そしてここで、光学異性体を有するL型
の全てのアミノ酸が、もし別に明白に表示されていない
限り、意図されている。
【0020】
【課題を解決するための手段】前記化合物は、また、か
くして得られるANVP化合物の活性を維持しながら、種々
の方法で、上に列挙した式を変形させることによっても
得ることができる。例えば、これらの化合物のアミノ酸
は、通常、天然のL型であるが、1つ以上、通常は、2
つ以下、そして望ましくは、1つのアミノ酸を、この出
願に含まれる例示的な例のあるものにおいて示されてい
る通り、光学異性体D型、またはDL−ラセミ混合物で置
換することができる。当該化合物に含まれるアミノ酸残
基は、また、アミド化したり、アセチル化したり、また
は他の化学基でもって置換したりすることによっても変
形させることができる。但し、上記他の化学基は、例え
ば、当該化合物の活性に影響を及ぼすことなく、当該化
合物の溶解性を変化させることができるような化学基で
ある。
くして得られるANVP化合物の活性を維持しながら、種々
の方法で、上に列挙した式を変形させることによっても
得ることができる。例えば、これらの化合物のアミノ酸
は、通常、天然のL型であるが、1つ以上、通常は、2
つ以下、そして望ましくは、1つのアミノ酸を、この出
願に含まれる例示的な例のあるものにおいて示されてい
る通り、光学異性体D型、またはDL−ラセミ混合物で置
換することができる。当該化合物に含まれるアミノ酸残
基は、また、アミド化したり、アセチル化したり、また
は他の化学基でもって置換したりすることによっても変
形させることができる。但し、上記他の化学基は、例え
ば、当該化合物の活性に影響を及ぼすことなく、当該化
合物の溶解性を変化させることができるような化学基で
ある。
【0021】更にその上、当該化合物は、生物学的活性
の点で同じか、又は相補的範囲を有する化合物と混合さ
せたり、結合させたり、又は複合化(conjugate)させ
たりして、利益を得ることができる。
の点で同じか、又は相補的範囲を有する化合物と混合さ
せたり、結合させたり、又は複合化(conjugate)させ
たりして、利益を得ることができる。
【0022】現在望ましい幾つかのANVP化合物は、無関
係の心房組織またはその生成物を実質に含まない心房組
織から分離される。一般に、心房組織の酢酸抽出液は、
ゲル濾過処理および逆転相高性能液体クロマトグラフィ
ー(C18およびCNカラムを用いた)処理を受け、当該分
画の、ナトリウム***増加性および血管施緩性の作用に
ついての効力検定が行われる。
係の心房組織またはその生成物を実質に含まない心房組
織から分離される。一般に、心房組織の酢酸抽出液は、
ゲル濾過処理および逆転相高性能液体クロマトグラフィ
ー(C18およびCNカラムを用いた)処理を受け、当該分
画の、ナトリウム***増加性および血管施緩性の作用に
ついての効力検定が行われる。
【0023】当該化合物は、生物学的組織源、顕著には
哺乳動物の心房組織源から分離し、そして精製すること
ができ、例えば、固相合成法(solid phase synthe-sis)
などのような、当業界で良く知られた手段を用いて、化
学的に合成することができる。当該合成は、アルファー
アミノで保護されたアミノ酸を用いて、ペプチドのC末
端から開始される。t−ブチルオキジカルボニル(Bo
c)保護基は、全てのアミノ基に対して、他の保護基が
適しているときでさえ、用いることができる。例えば、
Boc-Arg-OHまたはBoc-Tyr-OH(即ち、C末端のアミノ酸
から選択された)は、クロルメチル化されたポリスチレ
ン樹脂支持体(supports)にエステル化することができ
る。当該ポリスチレン樹脂支持体は、望ましくは、スチ
レンと、架橋剤としての約0.5から2%のジビニルベンゼ
ンとのコポリマーであり、当該架橋剤が、ポリスチレン
ポリマーを、ある種の有機溶媒に対して完全に不溶性に
する[スチュワート(Stewart)ほか、固相ペプチド合
成(Solid-phase peptide Synthesis)、W.H.フリーマ
ン社(W.H. Freeman Co.)、サンフランシスコ(1969)お
よびメリフィールド(Merrifield)、J. Am. Chem. So
c. 85:2149-2154(1963)を参照。]。
哺乳動物の心房組織源から分離し、そして精製すること
ができ、例えば、固相合成法(solid phase synthe-sis)
などのような、当業界で良く知られた手段を用いて、化
学的に合成することができる。当該合成は、アルファー
アミノで保護されたアミノ酸を用いて、ペプチドのC末
端から開始される。t−ブチルオキジカルボニル(Bo
c)保護基は、全てのアミノ基に対して、他の保護基が
適しているときでさえ、用いることができる。例えば、
Boc-Arg-OHまたはBoc-Tyr-OH(即ち、C末端のアミノ酸
から選択された)は、クロルメチル化されたポリスチレ
ン樹脂支持体(supports)にエステル化することができ
る。当該ポリスチレン樹脂支持体は、望ましくは、スチ
レンと、架橋剤としての約0.5から2%のジビニルベンゼ
ンとのコポリマーであり、当該架橋剤が、ポリスチレン
ポリマーを、ある種の有機溶媒に対して完全に不溶性に
する[スチュワート(Stewart)ほか、固相ペプチド合
成(Solid-phase peptide Synthesis)、W.H.フリーマ
ン社(W.H. Freeman Co.)、サンフランシスコ(1969)お
よびメリフィールド(Merrifield)、J. Am. Chem. So
c. 85:2149-2154(1963)を参照。]。
【0024】都合の良いことに、ANVP化合物は、徒手技
術を用いて、又は、例えば、バイオサーチ(Biosearc
h)SAMII自動的(automatic)ペプチドシンセサイザー
(バイオサ−チ社、サンラファエル、カリフォルニア)
を、指令マニュアルに説明されている通りに、自動的に
用いて、合成することができる。
術を用いて、又は、例えば、バイオサーチ(Biosearc
h)SAMII自動的(automatic)ペプチドシンセサイザー
(バイオサ−チ社、サンラファエル、カリフォルニア)
を、指令マニュアルに説明されている通りに、自動的に
用いて、合成することができる。
【0025】あるいは、当該化合物は、組み換えDNA構
造の発現によって生産することができる。この生産は、
当該化合物を多量に提供する上で、又は、当該化合物の
代替的態様を提供する上で望ましい。
造の発現によって生産することができる。この生産は、
当該化合物を多量に提供する上で、又は、当該化合物の
代替的態様を提供する上で望ましい。
【0026】更に詳しく説明すると、種々の形のpre-pr
oANVP、proANVPおよびANVP化合物のアミノ酸配列におけ
る変形は、当該化合物の合成を指示するために用いられ
るクローン化された構造遺伝子のヌクレオチド配列をい
ろいろに変えることによって実施することができる。DN
A配列のこの変形に含まれるものとして、種々のコドン
の、他のコドンによる置換がある。但し、この場合、当
該他のコドンは、遺伝暗号の変性に起因して、同アミノ
酸の合成を指示する。
oANVP、proANVPおよびANVP化合物のアミノ酸配列におけ
る変形は、当該化合物の合成を指示するために用いられ
るクローン化された構造遺伝子のヌクレオチド配列をい
ろいろに変えることによって実施することができる。DN
A配列のこの変形に含まれるものとして、種々のコドン
の、他のコドンによる置換がある。但し、この場合、当
該他のコドンは、遺伝暗号の変性に起因して、同アミノ
酸の合成を指示する。
【0027】更に、コドンの置換によって、1つ又はそ
れ以上のアミノ酸残基を、機能的に等価な残基で、上記
の通り置換することができる。
れ以上のアミノ酸残基を、機能的に等価な残基で、上記
の通り置換することができる。
【0028】当該化合物は、完全な哺乳動物において、
および哺乳動物から分離された腎臓において、ナトリウ
ム尿***亢進性および利尿性の活性を有するように示さ
れる。更にその上、合成化合物を含む本発明の化合物
は、血管施緩活性を有し、そしてアルドステロンの放出
を抑制する。当該アルドステロンの放出は、酸化によっ
て促進させられ、そして還元によって減少されられるよ
うに示され、そのことによって、ここで開示された上記
一般式に含まれるシステイン残基間の二硫酸化物橋状結
合の存在は、上記の生物学的活性にとって必要であるこ
とが示される。
および哺乳動物から分離された腎臓において、ナトリウ
ム尿***亢進性および利尿性の活性を有するように示さ
れる。更にその上、合成化合物を含む本発明の化合物
は、血管施緩活性を有し、そしてアルドステロンの放出
を抑制する。当該アルドステロンの放出は、酸化によっ
て促進させられ、そして還元によって減少されられるよ
うに示され、そのことによって、ここで開示された上記
一般式に含まれるシステイン残基間の二硫酸化物橋状結
合の存在は、上記の生物学的活性にとって必要であるこ
とが示される。
【0029】上に列挙した生理学的効果を有するように
示される本発明の化合物は、例えば、ナトリウム尿***
亢進や、利尿や、血管拡張を含む多くの治療的応用分野
で用いることができる。このようにこれらの化合物は、
腎臓の非効率な灌流や、糸球体の低い濾過率に起因する
高血圧や腎不全に加えて、例えば、うっ血性心不全や、
ネフローゼ症候群および肝硬変等の種々の浮種症状の治
療における、治療薬として用いることができる。
示される本発明の化合物は、例えば、ナトリウム尿***
亢進や、利尿や、血管拡張を含む多くの治療的応用分野
で用いることができる。このようにこれらの化合物は、
腎臓の非効率な灌流や、糸球体の低い濾過率に起因する
高血圧や腎不全に加えて、例えば、うっ血性心不全や、
ネフローゼ症候群および肝硬変等の種々の浮種症状の治
療における、治療薬として用いることができる。
【0030】これ等の化合物は、家畜などに対する獣医
学上の使用のために哺乳動物に投与することができ、そ
して他の治療薬と同じ方法で、生理学的に受容可能なキ
ャリヤー(carrier)を用いて、臨床的に用いることが
できる。一般に、投与量は、約0.01から100μg/kg、よ
り一般的には、0.1から10μg/kgが、被投与者の体重に
関する割合の範囲である。あるいは、この範囲内の投与
は、所望の治療効果が得られるまで、通常、24時間を越
える長い時間にわたる一定の注入によって実施すること
ができる。
学上の使用のために哺乳動物に投与することができ、そ
して他の治療薬と同じ方法で、生理学的に受容可能なキ
ャリヤー(carrier)を用いて、臨床的に用いることが
できる。一般に、投与量は、約0.01から100μg/kg、よ
り一般的には、0.1から10μg/kgが、被投与者の体重に
関する割合の範囲である。あるいは、この範囲内の投与
は、所望の治療効果が得られるまで、通常、24時間を越
える長い時間にわたる一定の注入によって実施すること
ができる。
【0031】これらの化合物は、生理的に受容可能は活
性または非活性な他の物質、または、例えば、水または
生理食塩水のような生理的に妥当なキャリヤーと共に混
合されて、適切に投与され得る。当該化合物は、経口的
に、又は、例えば注射を用いる場合のように、非経口的
に投与され得る。注射は、皮下、静脈内または筋肉注射
のいずれでもよい。
性または非活性な他の物質、または、例えば、水または
生理食塩水のような生理的に妥当なキャリヤーと共に混
合されて、適切に投与され得る。当該化合物は、経口的
に、又は、例えば注射を用いる場合のように、非経口的
に投与され得る。注射は、皮下、静脈内または筋肉注射
のいずれでもよい。
【0032】これらの化合物は、薬理的に有効は量だけ
好ましい態様で投与され、そしてしばしば、酸付加塩の
ような薬理的に受容可能な塩として施される。当該塩
は、とりわけ、例えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、
リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、リンゴ酸塩な
どを含むことができる。
好ましい態様で投与され、そしてしばしば、酸付加塩の
ような薬理的に受容可能な塩として施される。当該塩
は、とりわけ、例えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、
リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、リンゴ酸塩な
どを含むことができる。
【0033】本発明の核酸分子の配列により指示される
化合物は、また、標識された試薬、通常は抗体を用いる
免疫学的検定において用いるための抗血清を作るために
用いることができる。好都合にも、ポリペプチドは、ジ
アルデヒド、特に、4から6個の炭素原子である脂肪
族、またはカルボジイミドによって、抗原に結合され得
る。これらの化合物と免疫学的試薬とは、当業界におい
て良く知られた技術により、種々のラベルでラベルされ
る。当該ラベルとして、例えば、発色団、例えばフルオ
レセインまたはローダミンなどの蛍光団、または、
125I、35S、14Cまたは3Hなどのラジオアイソトープ、あ
るいは磁化粒子などがある。
化合物は、また、標識された試薬、通常は抗体を用いる
免疫学的検定において用いるための抗血清を作るために
用いることができる。好都合にも、ポリペプチドは、ジ
アルデヒド、特に、4から6個の炭素原子である脂肪
族、またはカルボジイミドによって、抗原に結合され得
る。これらの化合物と免疫学的試薬とは、当業界におい
て良く知られた技術により、種々のラベルでラベルされ
る。当該ラベルとして、例えば、発色団、例えばフルオ
レセインまたはローダミンなどの蛍光団、または、
125I、35S、14Cまたは3Hなどのラジオアイソトープ、あ
るいは磁化粒子などがある。
【0034】これらの標識された化合物と試薬、また
は、認識することができ且つそれ等に特異的に結合する
ことができる標識された試料は、例えば、診断上の試薬
として用いることができる。生物学的標本から取られた
サンプルは、本発明の化合物と共通する抗原決定基を有
する物質の存在またはその量について、分析することが
できる。更に、モノクローナル抗体は、当業界で既知の
方法によって作ることができ、当該抗体は、例えば、生
体内において、免疫学的に関連した化合物の過剰生産を
制するための治療において用いることができる。
は、認識することができ且つそれ等に特異的に結合する
ことができる標識された試料は、例えば、診断上の試薬
として用いることができる。生物学的標本から取られた
サンプルは、本発明の化合物と共通する抗原決定基を有
する物質の存在またはその量について、分析することが
できる。更に、モノクローナル抗体は、当業界で既知の
方法によって作ることができ、当該抗体は、例えば、生
体内において、免疫学的に関連した化合物の過剰生産を
制するための治療において用いることができる。
【0035】図1乃至図3は本発明の一実施態様のデオ
キシリボ核酸(DNA)配列、即ちヒトpre-proANVPをコー
ドする遺伝子を、当該DNAによって指示されるポリペプ
チド合成におけるアミノ酸配列と共に提供する。
キシリボ核酸(DNA)配列、即ちヒトpre-proANVPをコー
ドする遺伝子を、当該DNAによって指示されるポリペプ
チド合成におけるアミノ酸配列と共に提供する。
【0036】図4は、本発明における一実施態様の相補
的デオキシリボ核酸(cDNA)配列、即ちヒトpre-proANV
PをコードするcDNAを、このDNAで指示されるポリペプチ
ド合成におけるアミノ酸配列と共に提供する。
的デオキシリボ核酸(cDNA)配列、即ちヒトpre-proANV
PをコードするcDNAを、このDNAで指示されるポリペプチ
ド合成におけるアミノ酸配列と共に提供する。
【0037】図5は、本発明における一実施態様のデオ
キシリボ核酸(DNA)配列、即ちラットpre-proANVPをコ
ードするDNAを、このDNAによって指示されるポリペプチ
ド合成におけるアミノ酸配列と共に、提供する。
キシリボ核酸(DNA)配列、即ちラットpre-proANVPをコ
ードするDNAを、このDNAによって指示されるポリペプチ
ド合成におけるアミノ酸配列と共に、提供する。
【0038】図6乃至図9は、心房組織からの、本発明
における心房のナトリウム***増加性/血管拡張性(AN
VP)化合物の精製における図示的提示であり、図6は、
抽出原液のG-50ゲル濾過の結果を示し、図7は、精製さ
れた抽出液のHPLC(C18カラム)精製の結果を示し、図
8は、図4の産物の再クロマトグラフィー(re-chromat
ography)を示し、図9は、図4の精製された活性フラ
クション即ち活性分画(active fractions)のHPLC(CN
カラム)精製の結果を示す。
における心房のナトリウム***増加性/血管拡張性(AN
VP)化合物の精製における図示的提示であり、図6は、
抽出原液のG-50ゲル濾過の結果を示し、図7は、精製さ
れた抽出液のHPLC(C18カラム)精製の結果を示し、図
8は、図4の産物の再クロマトグラフィー(re-chromat
ography)を示し、図9は、図4の精製された活性フラ
クション即ち活性分画(active fractions)のHPLC(CN
カラム)精製の結果を示す。
【0039】図10は、本発明の核酸組成物を含む相補
的DNA(cDNA)クローン(clones)を同定するために用
いられるオリゴヌクレオチドプローブ(probes)の配列
を示す。
的DNA(cDNA)クローン(clones)を同定するために用
いられるオリゴヌクレオチドプローブ(probes)の配列
を示す。
【0040】図11は、ジデオキシヌクレオチド(dideo
xynucleotide)の配列を分析するためのDNA断片を提供す
るために、ラットpre-proANVPを暗号化するデオキシリ
ボ核酸を,特異的な制限酵素であるエンドヌクレアーゼ
で切断した部位、すなわちサイト(sites)を示す。
xynucleotide)の配列を分析するためのDNA断片を提供す
るために、ラットpre-proANVPを暗号化するデオキシリ
ボ核酸を,特異的な制限酵素であるエンドヌクレアーゼ
で切断した部位、すなわちサイト(sites)を示す。
【0041】図12は、心房および心室のmRNAのノザン
法(Northern blot)分析の結果を示し、ここで、レーン
(lane)1は、ラット心房組織から分離されたRNAを示
し、そしてレーン2は、ラット心室組織から分離された
RNAを示す。
法(Northern blot)分析の結果を示し、ここで、レーン
(lane)1は、ラット心房組織から分離されたRNAを示
し、そしてレーン2は、ラット心室組織から分離された
RNAを示す。
【0042】図13乃至図16は、ポリ(poly)A+RNAに
よってコードされた無細胞翻訳産物(cellfree translat
ion products)の2元的ゲル分割法(two dimensional ge
l fractionation)の結果を示し、図13は、心房のポリ
A+RNAによってコードされた35Sタンパク質を示し、図
14は、心室のポリA+RNAによってコードされた35Sタ
ンパク質を示す。試験管内における、ラットpre-proANV
PをコードするDNAと特異的に雑種形成、すなわちハイブ
リッド形成させられ、そして当該DNAから溶出するポリ
A+RNAの翻訳が示され、図15は、心房組織から誘導さ
れたポリA+RNAを示し、そして図16は、心室組織から
誘導されたポリA+RNAを示す。
よってコードされた無細胞翻訳産物(cellfree translat
ion products)の2元的ゲル分割法(two dimensional ge
l fractionation)の結果を示し、図13は、心房のポリ
A+RNAによってコードされた35Sタンパク質を示し、図
14は、心室のポリA+RNAによってコードされた35Sタ
ンパク質を示す。試験管内における、ラットpre-proANV
PをコードするDNAと特異的に雑種形成、すなわちハイブ
リッド形成させられ、そして当該DNAから溶出するポリ
A+RNAの翻訳が示され、図15は、心房組織から誘導さ
れたポリA+RNAを示し、そして図16は、心室組織から
誘導されたポリA+RNAを示す。
【0043】図17は、ジデオキシヌクレオチドの配列
を分析するためのDNA断片を提供するために、ヒトpre-p
roANVPをコードするヒトゲノム(genomic)デオキシリボ
核酸を、特異的な制限酵素であるエンドヌクレアーゼで
もって切断した部位を示す。
を分析するためのDNA断片を提供するために、ヒトpre-p
roANVPをコードするヒトゲノム(genomic)デオキシリボ
核酸を、特異的な制限酵素であるエンドヌクレアーゼで
もって切断した部位を示す。
【0044】図18は、精製され、そして合成された本
発明核酸分子から得られる化合物の血管弛緩活性の比較
である。
発明核酸分子から得られる化合物の血管弛緩活性の比較
である。
【0045】図19および図20は、培養されたウシの
大動脈の平滑筋細胞(パネルA)と大動脈内皮細胞(パ
ネルB)とに対する125I-rANVP(126-150)の結合を示
す。実線は、特異的結合を示し、そして破線(−−−)
は、非特異的結合を示す。スキャッチャード・プロット
によるデータの分析が、差込み図に示されている。
大動脈の平滑筋細胞(パネルA)と大動脈内皮細胞(パ
ネルB)とに対する125I-rANVP(126-150)の結合を示
す。実線は、特異的結合を示し、そして破線(−−−)
は、非特異的結合を示す。スキャッチャード・プロット
によるデータの分析が、差込み図に示されている。
【0046】図21は、rANVP(126-150)およびhANVP(12
7-151)の種々の投与量に応答する、培養されたウシの血
管平滑筋における環状GMPレベルを示し、図22は、rAN
VP(126-150)およびhANVP(127-151)の種々の投与量に応
答する、培養されたウシの血管内皮細胞における環状GM
Pレベルを示す。
7-151)の種々の投与量に応答する、培養されたウシの血
管平滑筋における環状GMPレベルを示し、図22は、rAN
VP(126-150)およびhANVP(127-151)の種々の投与量に応
答する、培養されたウシの血管内皮細胞における環状GM
Pレベルを示す。
【0047】図23は、培養されたウシの大動脈平滑筋
細胞において、図24培養されたウシの大動脈内皮細胞
においてcGMPを増大させるための種々のANVPsの能力を
示す投与量−反応曲線である。データは、投与量の関数
として最大限の反応の百分率で示される。
細胞において、図24培養されたウシの大動脈内皮細胞
においてcGMPを増大させるための種々のANVPsの能力を
示す投与量−反応曲線である。データは、投与量の関数
として最大限の反応の百分率で示される。
【0048】図25乃至図28は、ラットおよびヒトの
proANVPおよびその誘導断片の発現において用いられた
バクテリア性の発現プラスミド(plasmids)の図式的な提
示であり、ここで、図25は、プラスミド発現ベクター
pKT-52を示し、図26は、第図27に示されるラットpr
e-proANVP cDNAから誘導されたDNAのセグメントを示
し、それはプラスミドpRNF-6852においてクローン化(cl
oned)されたアミノ酸87-152をコードし、図28は、図
27のラットpre-proANVP cDNAから誘導されたDNAのセ
グメントを示し、それはプラスミドpRNF-12852において
クローン化されたアミノ酸25-152をコードし、第29
は、トリプトファンオペロンプロモーター/オペレータ
ーおよびシャイン−ダルガルノの配列(SD)を含む合成DN
A配列を示し、これは図30に示されるpTRP-233を構成
するために用いられ、図31は、プラスミドphNF-233に
おいてクローン化されたアミノ酸26-151をコードするヒ
トpre-proANVP cDNAから誘導されたDNAのセグメントを
示す。
proANVPおよびその誘導断片の発現において用いられた
バクテリア性の発現プラスミド(plasmids)の図式的な提
示であり、ここで、図25は、プラスミド発現ベクター
pKT-52を示し、図26は、第図27に示されるラットpr
e-proANVP cDNAから誘導されたDNAのセグメントを示
し、それはプラスミドpRNF-6852においてクローン化(cl
oned)されたアミノ酸87-152をコードし、図28は、図
27のラットpre-proANVP cDNAから誘導されたDNAのセ
グメントを示し、それはプラスミドpRNF-12852において
クローン化されたアミノ酸25-152をコードし、第29
は、トリプトファンオペロンプロモーター/オペレータ
ーおよびシャイン−ダルガルノの配列(SD)を含む合成DN
A配列を示し、これは図30に示されるpTRP-233を構成
するために用いられ、図31は、プラスミドphNF-233に
おいてクローン化されたアミノ酸26-151をコードするヒ
トpre-proANVP cDNAから誘導されたDNAのセグメントを
示す。
【0049】図32は、L−[35S]−システインで標識さ
れたタンパク質を示す、SDS-ポリアクリルアミドゲルの
写真的提示であり、ここで、大腸菌はレーンAにおいて
pKT52発現ベクターを含み、レーンCはpRNF-6852(pre-p
roANVPのアミノ酸87-152を暗号化するDNAを含むように
変性されたpKT52)を含み、レーンEはpRNF-12852(pre-p
roANVPのアミノ酸25-152をコードするDNAを含むように
変性されたpKT52)を含み、レーンB、DおよびFは、各
々、レーンA,C,およびEからの産物を含み、当該産
物は、特異的な抗ANVP(antiANVP)抗血清でもって免疫沈
殿させられ、レーンGは、それらの対応する分子サイズ
についてのタンパク質の分子量基準を含み、矢印は、pR
NF-6852およびpRNF-12852から誘導された独特のポリペ
プチドを示す。
れたタンパク質を示す、SDS-ポリアクリルアミドゲルの
写真的提示であり、ここで、大腸菌はレーンAにおいて
pKT52発現ベクターを含み、レーンCはpRNF-6852(pre-p
roANVPのアミノ酸87-152を暗号化するDNAを含むように
変性されたpKT52)を含み、レーンEはpRNF-12852(pre-p
roANVPのアミノ酸25-152をコードするDNAを含むように
変性されたpKT52)を含み、レーンB、DおよびFは、各
々、レーンA,C,およびEからの産物を含み、当該産
物は、特異的な抗ANVP(antiANVP)抗血清でもって免疫沈
殿させられ、レーンGは、それらの対応する分子サイズ
についてのタンパク質の分子量基準を含み、矢印は、pR
NF-6852およびpRNF-12852から誘導された独特のポリペ
プチドを示す。
【0050】図33は、[35S]−システインで標識され
たタンパク質を示すSDSポリアクリルアミドゲルの写真
的提示であり、ここで、大腸菌はレーンAにおいて、pT
RP-233発現ベクターを含み、レーンBは、phNF-233[ヒ
トpre-pro ANVP(26-151)を暗号化するDNAを含むように
変性されたpTRP-233]発現産物を含み;レーンCおよび
Dは、各々、レーンAおよびBからの産物を含み、当該
産物は、特異的な抗ANVP抗血清で免疫沈殿させられる。
レーンAに隣接して、分子量基準によるサイズが示され
る。
たタンパク質を示すSDSポリアクリルアミドゲルの写真
的提示であり、ここで、大腸菌はレーンAにおいて、pT
RP-233発現ベクターを含み、レーンBは、phNF-233[ヒ
トpre-pro ANVP(26-151)を暗号化するDNAを含むように
変性されたpTRP-233]発現産物を含み;レーンCおよび
Dは、各々、レーンAおよびBからの産物を含み、当該
産物は、特異的な抗ANVP抗血清で免疫沈殿させられる。
レーンAに隣接して、分子量基準によるサイズが示され
る。
【0051】図34は、特異的ベクターとイーストα−
因子分泌信号とを用いてサツカロミセス・セレビシアエ
(Saccharomyces cerevisiae)において、ラットpre-proA
NVPおよびその関連ポリペプチド断片を発現させるため
の構築を示す。
因子分泌信号とを用いてサツカロミセス・セレビシアエ
(Saccharomyces cerevisiae)において、ラットpre-proA
NVPおよびその関連ポリペプチド断片を発現させるため
の構築を示す。
【0052】図35は、S.セレビシアエから分泌され、
そして35S−メチオニン(A)あるいは35S−システインお
よび35S−メチオニン(B)によって標識されたタンパク質
を示すSDSポリアクリルアミドゲルの写真的提示であ
る。Aにおいて、S.セレビシアエはレーン1および2に
おいて、YEp−α−8シャトル(Shuttle)ベクターを含
み、レーン3および4において、YEp−α−NF−9を含
み、レーン5および6はYEp−α−NF−12を含んだ。B
において、当該分泌されたタンパク質は、アセトンとメ
タノールで抽出され、ここでレーン1および2は、YEp
−α−NF−7とYEp−α−NF−5を含むS.セレビシアエを
表し、レーン3および4は、特異的な抗ANVP IgGで免疫
沈殿した後の、これらの試料からのタンパク質を表し、
レーン5および6は、各々、YEp−α−NF−12およびYEp
−α−NF−9を含み、そして抗ANVP Ig Gによって特異的
に免疫沈殿されたタンパク質を示す。
そして35S−メチオニン(A)あるいは35S−システインお
よび35S−メチオニン(B)によって標識されたタンパク質
を示すSDSポリアクリルアミドゲルの写真的提示であ
る。Aにおいて、S.セレビシアエはレーン1および2に
おいて、YEp−α−8シャトル(Shuttle)ベクターを含
み、レーン3および4において、YEp−α−NF−9を含
み、レーン5および6はYEp−α−NF−12を含んだ。B
において、当該分泌されたタンパク質は、アセトンとメ
タノールで抽出され、ここでレーン1および2は、YEp
−α−NF−7とYEp−α−NF−5を含むS.セレビシアエを
表し、レーン3および4は、特異的な抗ANVP IgGで免疫
沈殿した後の、これらの試料からのタンパク質を表し、
レーン5および6は、各々、YEp−α−NF−12およびYEp
−α−NF−9を含み、そして抗ANVP Ig Gによって特異的
に免疫沈殿されたタンパク質を示す。
【0053】図36は、酵母菌発現プラスミドと、ヒト
pro心房性(proatrial)ナトリウム***増加性/血管拡張
性断片128-151をコードする合成遺伝子配列との図表的
線図を示す。詳細はセクションIVに記載されている。プ
ラスミドJJ-1およびJC1-5内の関連部位のA)配列におい
て、
pro心房性(proatrial)ナトリウム***増加性/血管拡張
性断片128-151をコードする合成遺伝子配列との図表的
線図を示す。詳細はセクションIVに記載されている。プ
ラスミドJJ-1およびJC1-5内の関連部位のA)配列におい
て、
【0054】
【外1】 は、pBR322配列を示し、
【0055】
【外2】 は、2μのBフォーム(form)を含むDNA断片を示し、
【0056】
【外3】 は、α−因子前駆物質/ペプチドを暗号化するDNA断片
を示し、
を示し、
【0057】
【外4】 は、LEU2遺伝子を含むDNA断片を示す。B)はヒトのプロ
心房性(proatrial)ナトリウム尿***亢進性、血管拡張
性断片128-151を暗号化する合成DNA遺伝子配列を示す。
要素オリゴデオキシヌクレオチドは、1〜8で番号付けら
れる。α−因子に対し、上記の通りヌクレオチド配列を
番号付けしたアミノ酸は、上記のクルジアンJ(Kurjan
J)およびヘルスコヴィッツ(Herskowitz)によって記述さ
れた遺伝子配列に対応する。
心房性(proatrial)ナトリウム尿***亢進性、血管拡張
性断片128-151を暗号化する合成DNA遺伝子配列を示す。
要素オリゴデオキシヌクレオチドは、1〜8で番号付けら
れる。α−因子に対し、上記の通りヌクレオチド配列を
番号付けしたアミノ酸は、上記のクルジアンJ(Kurjan
J)およびヘルスコヴィッツ(Herskowitz)によって記述さ
れた遺伝子配列に対応する。
【0058】図37は、中国産ハムスター(Chinese ham
ster)の卵巣細胞内で、ラットおよびヒトのpre-proANVP
を発現させるための、発現ベクターの構築を示す。
ster)の卵巣細胞内で、ラットおよびヒトのpre-proANVP
を発現させるための、発現ベクターの構築を示す。
【0059】図38は、中国産ハムスターの卵巣細胞培
地からのタンパク質であって、35S-メチオニンで標識さ
れたタンパク質のSDS-ポリアクリルアミドゲルの写真的
提示であり、ここで、レーン1は、prohANVP(26-151)の
合成を指示する配列を含むCHO細胞プールからのタンパ
ク質であって、35S-メチオニンで標識されたタンパク質
を示し、レーン2は、制御CHO細胞からのタンパク質で
あって、35S-メチオニンでラベルされたタンパク質を示
し、レーン3−6は、prohANVP(26-151)の合成を指示する
配列を含むCHO細胞からのタンパク質であって、35S-メ
チオニンで標識されたタンパク質を示す:ここでレーン
3−6は、各々、CHO-8/2-93, CHO-8/2-81, CHO-8/2-55お
よびCHO-8/2-6を表示する。
地からのタンパク質であって、35S-メチオニンで標識さ
れたタンパク質のSDS-ポリアクリルアミドゲルの写真的
提示であり、ここで、レーン1は、prohANVP(26-151)の
合成を指示する配列を含むCHO細胞プールからのタンパ
ク質であって、35S-メチオニンで標識されたタンパク質
を示し、レーン2は、制御CHO細胞からのタンパク質で
あって、35S-メチオニンでラベルされたタンパク質を示
し、レーン3−6は、prohANVP(26-151)の合成を指示する
配列を含むCHO細胞からのタンパク質であって、35S-メ
チオニンで標識されたタンパク質を示す:ここでレーン
3−6は、各々、CHO-8/2-93, CHO-8/2-81, CHO-8/2-55お
よびCHO-8/2-6を表示する。
【0060】下記の実施例は、例示的目的で提供される
ものであって、本発明を限定する目的で提供されるもの
ではない。
ものであって、本発明を限定する目的で提供されるもの
ではない。
【0061】
【実施例】下記に開示される実施例において、ラットお
よびヒトのDNA配列から誘導されたpre-proANVPs、proAN
VPs、ANVPsは各々1-152および1-151と番号を付されたア
ミノ酸残基を有し、開示されたアミノ酸配列において相
違を示す。化学的に合成されたANVPsのアミノ酸配列
は、ラットから誘導された(rat-derived)配列の位置1
26およびヒトから誘導された(human-derived)配列の
位置127において、見出されるアルギン残基から番号付
けられる(図1乃至図3、図4、図5を参照)。
よびヒトのDNA配列から誘導されたpre-proANVPs、proAN
VPs、ANVPsは各々1-152および1-151と番号を付されたア
ミノ酸残基を有し、開示されたアミノ酸配列において相
違を示す。化学的に合成されたANVPsのアミノ酸配列
は、ラットから誘導された(rat-derived)配列の位置1
26およびヒトから誘導された(human-derived)配列の
位置127において、見出されるアルギン残基から番号付
けられる(図1乃至図3、図4、図5を参照)。
【0062】I.心房性ナトリウム尿***亢進性/血管
拡張性ポリペプチド化合物の単離と精製 本発明の核酸分子の配列から指示される化合物を、下記
の実験計画書(protocol)に従って、心房組織から単離
した。これらの化合物とそれらの合成ポリペプチド類似
化合物は、集合用語のANVPsに含まれる。
拡張性ポリペプチド化合物の単離と精製 本発明の核酸分子の配列から指示される化合物を、下記
の実験計画書(protocol)に従って、心房組織から単離
した。これらの化合物とそれらの合成ポリペプチド類似
化合物は、集合用語のANVPsに含まれる。
【0063】ポリペプチド化合物は、心房の酢酸抽出液
から単離され、当該抽出液は、無関係の組織およびその
生成物を実質的に含んでいなかった。1400匹の雄ウイス
ターラット(wistar rats)からの心房は、INの酢酸の
8体積(volumes)中に均質化され、当該酢酸は下記を
含有していた:1mMのフェニルメチルスルフォニル弗化
物(PMSFシグマケミカル社(PMSF Sigma Chemical C
o.)、ミズリー州、セントルイス);3mMのエチレンジア
ミン4酢酸(EDTA);および5μMのペプスタチンA
(ペプシンおよびレニン抑制物質、シグマケミカル
社)。この均質物質は、10,800×gで30分間、遠心分離
機にかけられ、そしてペレットが、初めの緩衝液の4体
積中に再均質化された。当該抽出液からの上澄み液はプ
−ルされ、そして水酸化アンモニウムで中性化された。
かくして中性化された上澄み液は、次いで10,000×gで
20分間、遠心分離機にかけられ、そして凍結乾燥され
た。
から単離され、当該抽出液は、無関係の組織およびその
生成物を実質的に含んでいなかった。1400匹の雄ウイス
ターラット(wistar rats)からの心房は、INの酢酸の
8体積(volumes)中に均質化され、当該酢酸は下記を
含有していた:1mMのフェニルメチルスルフォニル弗化
物(PMSFシグマケミカル社(PMSF Sigma Chemical C
o.)、ミズリー州、セントルイス);3mMのエチレンジア
ミン4酢酸(EDTA);および5μMのペプスタチンA
(ペプシンおよびレニン抑制物質、シグマケミカル
社)。この均質物質は、10,800×gで30分間、遠心分離
機にかけられ、そしてペレットが、初めの緩衝液の4体
積中に再均質化された。当該抽出液からの上澄み液はプ
−ルされ、そして水酸化アンモニウムで中性化された。
かくして中性化された上澄み液は、次いで10,000×gで
20分間、遠心分離機にかけられ、そして凍結乾燥され
た。
【0064】当該凍結乾燥された心房抽出物は、6mlの
緩衝液中で再構成され、遠心分離機にかけられ、そして
セファデックス(登録商標名)G50の2.5×45cmゲル濾過
カラム(細かい、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
(Pharmacia Fine Chemicals)、ニュージャージー州、ピ
スカタウェイ(Piscataway))に入れた:当該カラム
は、予めINの酢酸で平衝化されていた。分画(fractio
n)の各々からの部分標本(aliquots)が乾燥され(サ
バントスピード・バック濃縮器(Savant Speed-Vacconce
ntrator))、リン酸エステル塩で緩衝された生理食塩水
(PBS)中で再構築され、そしてナトリウム***増加性
活性について完全なラットで効力検定され、そして血管
施緩性活性についてウサギの大動脈輪を用いて効力検定
された。
緩衝液中で再構成され、遠心分離機にかけられ、そして
セファデックス(登録商標名)G50の2.5×45cmゲル濾過
カラム(細かい、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
(Pharmacia Fine Chemicals)、ニュージャージー州、ピ
スカタウェイ(Piscataway))に入れた:当該カラム
は、予めINの酢酸で平衝化されていた。分画(fractio
n)の各々からの部分標本(aliquots)が乾燥され(サ
バントスピード・バック濃縮器(Savant Speed-Vacconce
ntrator))、リン酸エステル塩で緩衝された生理食塩水
(PBS)中で再構築され、そしてナトリウム***増加性
活性について完全なラットで効力検定され、そして血管
施緩性活性についてウサギの大動脈輪を用いて効力検定
された。
【0065】このクロマトグラフィー処理の結果は、図
6に示されている通りであり、そして水平のブラケット
内に含まれた領域が凍結乾燥され、0.1%の水溶性トリ
フルオロ酢酸(TFA)で再構築され、プール(pool)され、
そして遠心分離機にかけられた。
6に示されている通りであり、そして水平のブラケット
内に含まれた領域が凍結乾燥され、0.1%の水溶性トリ
フルオロ酢酸(TFA)で再構築され、プール(pool)され、
そして遠心分離機にかけられた。
【0066】プールされた物質は、15%のアセトニトリ
ル(CH3CN)に調整され、そして0.39×30.0センチメート
ルμ−ボンダパック(μ-Bondapak)C18カラム[ウォー
ター社(Water, Inc)、マサチュセッツ州、ミルフォー
ド]にウォーターU6Kインジェクターおよび溶媒送出シ
ステム(ウォーター社、マサチュセッツ州、ミルフォー
ド)を用いて、入れられた。結合物質は、85:15から45:
55の、A(0.1%TFA):B(CH3CN)の溶媒の直線的匂配
で、40分間、溶出された。
ル(CH3CN)に調整され、そして0.39×30.0センチメート
ルμ−ボンダパック(μ-Bondapak)C18カラム[ウォー
ター社(Water, Inc)、マサチュセッツ州、ミルフォー
ド]にウォーターU6Kインジェクターおよび溶媒送出シ
ステム(ウォーター社、マサチュセッツ州、ミルフォー
ド)を用いて、入れられた。結合物質は、85:15から45:
55の、A(0.1%TFA):B(CH3CN)の溶媒の直線的匂配
で、40分間、溶出された。
【0067】当該分画試料は、ナトリウム***増加性に
ついて、分離された腎臓を用いて効力検定され、そして
既述の通り、続いて血管施緩性活性についての効力検定
が行なわれた。ナトリウム尿***亢進性活性と血管施緩
性活性とが一致する広範な領域の分画が溶出され、そし
てこれらの分画はプールされ、乾燥された。
ついて、分離された腎臓を用いて効力検定され、そして
既述の通り、続いて血管施緩性活性についての効力検定
が行なわれた。ナトリウム尿***亢進性活性と血管施緩
性活性とが一致する広範な領域の分画が溶出され、そし
てこれらの分画はプールされ、乾燥された。
【0068】かくして得られ乾燥された物質は、A:Bが7
8:22である溶媒中で再構成され、そして22から38%Bの
匂配を用いて、1.0ml/分の割合で、48分間にわたっ
て、再びクロマトグラフィーにかけられた(12の別個の
適用例において)。当該分画の部分標本は、既述の通
り、ナトリウム***増加性活性および血管施緩性活性の
双方について、テストされた。その結果を図7に示す。
3つの活性ピークからの分画は、プールされ、そして夜
通し乾燥された。
8:22である溶媒中で再構成され、そして22から38%Bの
匂配を用いて、1.0ml/分の割合で、48分間にわたっ
て、再びクロマトグラフィーにかけられた(12の別個の
適用例において)。当該分画の部分標本は、既述の通
り、ナトリウム***増加性活性および血管施緩性活性の
双方について、テストされた。その結果を図7に示す。
3つの活性ピークからの分画は、プールされ、そして夜
通し乾燥された。
【0069】第2ピーク(図7において[で表示された
領域で表示される)からの組み合わさった分画は、A:B
が77:23の溶媒中で再構成され、C18カラムに入れら
れ、23から29%B匂配を用いて、90分間にわたって、溶
出された。この再クロマトグラフィーの結果は、図8に
示される通りであった:ここで[で表示された領域は血
管施緩性活性を有する分画を示す。6件の適用例からの
活性分画がプールされた。
領域で表示される)からの組み合わさった分画は、A:B
が77:23の溶媒中で再構成され、C18カラムに入れら
れ、23から29%B匂配を用いて、90分間にわたって、溶
出された。この再クロマトグラフィーの結果は、図8に
示される通りであった:ここで[で表示された領域は血
管施緩性活性を有する分画を示す。6件の適用例からの
活性分画がプールされた。
【0070】かくして得られた物質は、0.39×30cmμ−
ボンダパックCNカラム(ウォータース社)に入れられ
た。使用された溶媒系は、A(水中で0.1%のTFA)とB
(CH3CN中で0.055%のTFA)であった。当該サンプル
は、A:Bが90:10である溶媒中で再構成され、3件の別個
の適用例において、10から30%Bの匂配を用いて、60分
間にわたり、0.6ml/分の割合で、クロマトグラフィー
にかけられた。以下に説明される通り、血管施緩性活性
は、ヒスタミンで収縮された大動脈輪に生じた緊張の低
下によって決定された。
ボンダパックCNカラム(ウォータース社)に入れられ
た。使用された溶媒系は、A(水中で0.1%のTFA)とB
(CH3CN中で0.055%のTFA)であった。当該サンプル
は、A:Bが90:10である溶媒中で再構成され、3件の別個
の適用例において、10から30%Bの匂配を用いて、60分
間にわたり、0.6ml/分の割合で、クロマトグラフィー
にかけられた。以下に説明される通り、血管施緩性活性
は、ヒスタミンで収縮された大動脈輪に生じた緊張の低
下によって決定された。
【0071】図9において[で表示された最大活性ピー
クの分画は、乾燥され、そして配列sequence決定され
た。当該配列は、アプライド・バイオシステムズ470A気
相シーケンサー(Applied Biosystems 470A gas-phase s
equencer)(アプライド・バイオシステムズ社、カリフ
ォルニア州、フォスターシティー)を、製造者の指示書
に従って用いる事により、1ナノモル(nanomole)のタン
パク質から決定された。PTHアミノ酸は、0.46×25cmIBM
CNカラムを用いて、ベックマン(Beckman)334T HPLCで
同定された。適用された匂配は、下記の変更以外は、ハ
ンカピラー、(Hunkapiller)、N.WおよびL.F.フード(Hoo
d)、Methods in Enzymology、91:486-492[アカデミッ
クプレス(Academic Press)、ニューヨーク](1983)に示
されている通りのものであった:上記で言及した変更:
2元(binary)勾配システムが、3元(ternary)匂配シス
テムで置き換えられ、当該3元勾配システムにおいて、
アセトニトリルとメタノールが、別個のポンプで入れら
れ、そしてそれら2者の比が、匂配プログラムの適当な
変更によって勾配の推移にわたって、時間と共に変化さ
せられた;パーマフェース(Permaphase)ETH(登録商標
名)ガード・カラム(guard column)は、5×0.46センチ
メートルIBM CNアナリティカル“ミニーカラム”(analy
tical "mini-column")で置き換えられ、そして当該アナ
リティカル“ミニカラム”は、28℃まで加熱された。
クの分画は、乾燥され、そして配列sequence決定され
た。当該配列は、アプライド・バイオシステムズ470A気
相シーケンサー(Applied Biosystems 470A gas-phase s
equencer)(アプライド・バイオシステムズ社、カリフ
ォルニア州、フォスターシティー)を、製造者の指示書
に従って用いる事により、1ナノモル(nanomole)のタン
パク質から決定された。PTHアミノ酸は、0.46×25cmIBM
CNカラムを用いて、ベックマン(Beckman)334T HPLCで
同定された。適用された匂配は、下記の変更以外は、ハ
ンカピラー、(Hunkapiller)、N.WおよびL.F.フード(Hoo
d)、Methods in Enzymology、91:486-492[アカデミッ
クプレス(Academic Press)、ニューヨーク](1983)に示
されている通りのものであった:上記で言及した変更:
2元(binary)勾配システムが、3元(ternary)匂配シス
テムで置き換えられ、当該3元勾配システムにおいて、
アセトニトリルとメタノールが、別個のポンプで入れら
れ、そしてそれら2者の比が、匂配プログラムの適当な
変更によって勾配の推移にわたって、時間と共に変化さ
せられた;パーマフェース(Permaphase)ETH(登録商標
名)ガード・カラム(guard column)は、5×0.46センチ
メートルIBM CNアナリティカル“ミニーカラム”(analy
tical "mini-column")で置き換えられ、そして当該アナ
リティカル“ミニカラム”は、28℃まで加熱された。
【0072】分離され、無関係のラット心房組織とその
生成物を実質的に含まない下記化合物は、
生成物を実質的に含まない下記化合物は、
【0073】
【化1】 (式中、Xは、OHまたはTry-OHである。)を有する。
【0074】以下に説明されるヌクレオチド配列から誘
導されるラットとヒトのpre-proANVPsとproANVPsのアミ
ノ酸配列を比較するために、当該化合物は、rANVP(126-
149)(Xは、OHである)およびrANVP(126-150)(Xは、
Tyr-OHである)として引用される。
導されるラットとヒトのpre-proANVPsとproANVPsのアミ
ノ酸配列を比較するために、当該化合物は、rANVP(126-
149)(Xは、OHである)およびrANVP(126-150)(Xは、
Tyr-OHである)として引用される。
【0075】以下に説明される対応するヒトDNA配列か
ら誘導されたこれらのANVPsのヒト等価物質は、各々、h
ANVP(127-150)およびhANVP(127-151)として引用され
る。本発明のANVP化合物は、既述の通り番号付けされた
(126-ラットおよび127-ヒト)NH2末端のアルギニン残
基によって番号付けされる。
ら誘導されたこれらのANVPsのヒト等価物質は、各々、h
ANVP(127-150)およびhANVP(127-151)として引用され
る。本発明のANVP化合物は、既述の通り番号付けされた
(126-ラットおよび127-ヒト)NH2末端のアルギニン残
基によって番号付けされる。
【0076】精製工程の産物を効力検定するために用い
られた方法を根拠とすると、ナトリウム尿***亢進性お
よび血管施緩性活性の双方の活性は、分離され精製され
たANVP物質に固有な特性である。
られた方法を根拠とすると、ナトリウム尿***亢進性お
よび血管施緩性活性の双方の活性は、分離され精製され
たANVP物質に固有な特性である。
【0077】II.心房性ナトリウム尿***亢進性/血管
拡張性ポリペプチドの、組み換えDNAクローニング(Coni
ng) 以下の実施例において、ラットおよびヒトから取出され
たpre-proANVPsおよびproANVPsを暗号化したデオキシリ
ボ核酸(DNA)配列を説明する。本発明のポリペプチドの
発現を指示する無数の代替配列を構築できるようにする
必要がある。
拡張性ポリペプチドの、組み換えDNAクローニング(Coni
ng) 以下の実施例において、ラットおよびヒトから取出され
たpre-proANVPsおよびproANVPsを暗号化したデオキシリ
ボ核酸(DNA)配列を説明する。本発明のポリペプチドの
発現を指示する無数の代替配列を構築できるようにする
必要がある。
【0078】A.ラットのPre-Pro心房性ナトリウム尿
***亢進性/血管拡張性ポリペプチドcDNAのクローニン
グ 1.ラットの心房のmRNAの分離 RNA全体が、ラットの心房から、チャーグウィン(Chirgw
in)、J.M.ほかBiochemistry、18、5294-5299(1979)の方
法によって単離された。当該組織は、下記溶液中で均質
化された:当該溶液は、6Mのグアニジンチオシアン酸
塩;0.005Mのクエン酸ナトリウム;pH7.0;0.1Mの2-メル
カプトエタノール;0.5%のサルクロシル(Sarcrosyl)を
含んでいた。当該均質化物質は、塩化セシウム中で2.0M
作られ、そして0.1MのEDTA中で、5.7Mの塩化セシウムの
緩衝物(cushion)上で層状にされた。当該RNAは、この緩
衝物を介して、115,000×gで16時間の間、遠心分離機
にかけられることにより、ペレット化された。次いで、
当該RNAは、0.01Mのトリス(Tris);pH7.4;0.005MのEDTA;
1.0%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(sodium dodecyls
ulfate)を含む溶液中に溶解され、そして4:1の割合のク
ロロホルムを1-ブタノールとの混合液で抽出され、その
後、70%のエタノールで沈殿させられた。
***亢進性/血管拡張性ポリペプチドcDNAのクローニン
グ 1.ラットの心房のmRNAの分離 RNA全体が、ラットの心房から、チャーグウィン(Chirgw
in)、J.M.ほかBiochemistry、18、5294-5299(1979)の方
法によって単離された。当該組織は、下記溶液中で均質
化された:当該溶液は、6Mのグアニジンチオシアン酸
塩;0.005Mのクエン酸ナトリウム;pH7.0;0.1Mの2-メル
カプトエタノール;0.5%のサルクロシル(Sarcrosyl)を
含んでいた。当該均質化物質は、塩化セシウム中で2.0M
作られ、そして0.1MのEDTA中で、5.7Mの塩化セシウムの
緩衝物(cushion)上で層状にされた。当該RNAは、この緩
衝物を介して、115,000×gで16時間の間、遠心分離機
にかけられることにより、ペレット化された。次いで、
当該RNAは、0.01Mのトリス(Tris);pH7.4;0.005MのEDTA;
1.0%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(sodium dodecyls
ulfate)を含む溶液中に溶解され、そして4:1の割合のク
ロロホルムを1-ブタノールとの混合液で抽出され、その
後、70%のエタノールで沈殿させられた。
【0079】ポリアデニル酸化(polyadenylated)RNA(po
ly A+ RNA)分画は、アビブ(Aviv)、H.およびP.レダー(L
eder)、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 69:1408-1412(19
72)によって説明されている通り、オリゴ(dT)セルロー
スを用いて。アフィニィティクロマトグラフィーによっ
て得られた。当該poly A+RNAは、下記を含む溶液中で、
セルロースマトリックスに結合させられた:0.02Mのト
リス;pH7.6;0.001MのEDTA;0.1%のSDS;0.5Mの塩化ナト
リウム。非ポリアデニル酸化(non-polyadenylated)RNA
は、カラムを当該溶液で洗浄することによって除去され
た。次いで、polyA+RNAは、塩化ナトリウムを除去した
当該溶液中に溶出させられ、そして70%のエタノールで
沈殿させられた。これらの技術を用いて、100μgのポ
リアデニル酸化RNAが、10gmの心房性組織から分離され
た。
ly A+ RNA)分画は、アビブ(Aviv)、H.およびP.レダー(L
eder)、Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 69:1408-1412(19
72)によって説明されている通り、オリゴ(dT)セルロー
スを用いて。アフィニィティクロマトグラフィーによっ
て得られた。当該poly A+RNAは、下記を含む溶液中で、
セルロースマトリックスに結合させられた:0.02Mのト
リス;pH7.6;0.001MのEDTA;0.1%のSDS;0.5Mの塩化ナト
リウム。非ポリアデニル酸化(non-polyadenylated)RNA
は、カラムを当該溶液で洗浄することによって除去され
た。次いで、polyA+RNAは、塩化ナトリウムを除去した
当該溶液中に溶出させられ、そして70%のエタノールで
沈殿させられた。これらの技術を用いて、100μgのポ
リアデニル酸化RNAが、10gmの心房性組織から分離され
た。
【0080】2.ラット心房性のcDNAライブラリー(lib
rary)の生成 ヘルフマン(Helfman)、D.M.ほか、proc. Natl. Acad. S
ci.、USA 80:31-35(1983)によって記述されている通
り、2重鎖cDNAは、逐次的に添加されるEcoRIおよびSa
lIオリゴヌクレオチド・リンカー(linkers)を用いて、
プラスミド・ベクターpUC8(ビエイラ(Vieira)、J.およ
びJ.メッシング(Messing)、Gene、19:259-268, 1982)の
中に当該2重鎖cDNAを挿入するために、合成され、生産
される。
rary)の生成 ヘルフマン(Helfman)、D.M.ほか、proc. Natl. Acad. S
ci.、USA 80:31-35(1983)によって記述されている通
り、2重鎖cDNAは、逐次的に添加されるEcoRIおよびSa
lIオリゴヌクレオチド・リンカー(linkers)を用いて、
プラスミド・ベクターpUC8(ビエイラ(Vieira)、J.およ
びJ.メッシング(Messing)、Gene、19:259-268, 1982)の
中に当該2重鎖cDNAを挿入するために、合成され、生産
される。
【0081】第1鎖cDNAは、オリゴ(dT)12-18で感作さ
れた鳥(Avian)の骨髄芽球病ウィルスからのRNA依存型DN
Aポリメラーゼによって合成された。次いで、RNA鋳型
は、塩基加水分解によって除去された。第2鎖DNAは、
第1鎖分子の3'末端での自己感作(self-priming)に依存
して、RNA依存型DNAポリメラーゼによって合成され、そ
れによって、2重鎖ヘアピン(hairpin)DNAが形成され
た。これらの分子は、一本鎖領域を満たす大腸菌のDNA
ポリメラーゼIの大断片を用いて、開放末端をブラント
末端にした(blunt-ended)。EcoRIオリゴヌクレオチ
ドリンカーは、T4-DNAリガーゼを用いて、開放末端に加
えられた。ヘアピンループは、アスペルギルス・オリザ
エ(Aspergillus oryzae)からのS1ヌクレアーゼで切
り開かれ、そして当該分子の末端は、再び前と同じよう
にブラント末端にされた。SalIオリゴヌクレオチドリ
ンカーは、次いでT4-DNAリガーゼを用いて加えられた。
SalIおよびEcoRI“接着性末端”は、これらの制限酵
素であるエンドヌクレアーゼによる切断によって開放さ
れた。これらの2重鎖、2重リンカー(doubled-linker
ed)cDNA分子は、次いで、EcoRIとSal Iで消化されたp
UC8中に連結され、そして、カサバデン(Casabaden)、M.
およびS.コーエン(Cohen)、J. Mol. Biol. 138: 179-20
7(1980)に記述された塩化カリシウム処理によって、大
腸菌MC1061の中に挿入された。
れた鳥(Avian)の骨髄芽球病ウィルスからのRNA依存型DN
Aポリメラーゼによって合成された。次いで、RNA鋳型
は、塩基加水分解によって除去された。第2鎖DNAは、
第1鎖分子の3'末端での自己感作(self-priming)に依存
して、RNA依存型DNAポリメラーゼによって合成され、そ
れによって、2重鎖ヘアピン(hairpin)DNAが形成され
た。これらの分子は、一本鎖領域を満たす大腸菌のDNA
ポリメラーゼIの大断片を用いて、開放末端をブラント
末端にした(blunt-ended)。EcoRIオリゴヌクレオチ
ドリンカーは、T4-DNAリガーゼを用いて、開放末端に加
えられた。ヘアピンループは、アスペルギルス・オリザ
エ(Aspergillus oryzae)からのS1ヌクレアーゼで切
り開かれ、そして当該分子の末端は、再び前と同じよう
にブラント末端にされた。SalIオリゴヌクレオチドリ
ンカーは、次いでT4-DNAリガーゼを用いて加えられた。
SalIおよびEcoRI“接着性末端”は、これらの制限酵
素であるエンドヌクレアーゼによる切断によって開放さ
れた。これらの2重鎖、2重リンカー(doubled-linker
ed)cDNA分子は、次いで、EcoRIとSal Iで消化されたp
UC8中に連結され、そして、カサバデン(Casabaden)、M.
およびS.コーエン(Cohen)、J. Mol. Biol. 138: 179-20
7(1980)に記述された塩化カリシウム処理によって、大
腸菌MC1061の中に挿入された。
【0082】5μgのラット心房のpoly A+RNAは、約25
ngのcDNAを産出し、サイズは300塩基対よりも大きく
選択され、そして約200,000の独立型組み換え体のライ
ブラリーが与えられた。これらの組み換え体は、ニトロ
セルロースフィルター上に培養(plated)された。培養
されたレプリカ(replica)とライブラリーは、ハナハ
ン(Hanahan)、D.とM.メセルソン(Meselson)、遺伝子(Ge
ne)10:63-67(1980)、およびハナハン、D.とM.メセル
ソンによるMethods in Enzymology、アカデミックプレ
ス、ニューヨーク、pp333-342の実験計画書(protocol)
に従って、グリセロールを含侵したフィルター上に-70
℃で凍結され貯蔵された。
ngのcDNAを産出し、サイズは300塩基対よりも大きく
選択され、そして約200,000の独立型組み換え体のライ
ブラリーが与えられた。これらの組み換え体は、ニトロ
セルロースフィルター上に培養(plated)された。培養
されたレプリカ(replica)とライブラリーは、ハナハ
ン(Hanahan)、D.とM.メセルソン(Meselson)、遺伝子(Ge
ne)10:63-67(1980)、およびハナハン、D.とM.メセル
ソンによるMethods in Enzymology、アカデミックプレ
ス、ニューヨーク、pp333-342の実験計画書(protocol)
に従って、グリセロールを含侵したフィルター上に-70
℃で凍結され貯蔵された。
【0083】3.ラット心房性cDNAライブラリーのスク
リーニング セクションIで決定された、天然のラットのANVPsのア
ミノ酸配列はワレイス(Wallace)R.B.ほか、Nucleic A
cids Res.、9:879-894(1981)に記述されている通り、ラ
ット心房性cDNAライブラリーをスクリーニングするため
のオリゴヌクレオチドプローブ(probes)を設計するため
に用いられた。遺伝暗号の変性を考慮して、各領域に対
して、2つのオリゴヌクレオチドのプールが合成され
た。領域1は、2つのテトラデカマー(tetradecamer)オ
リゴヌクレオチドのプールでカバーされ、プローブaと
プローブbは各々、64個の塩基配列からなる。領域2
は、他の2つのテトラデカマープールでカバーされ、プ
ローブcとプローブdは各々、72個の配列からなる。こ
れらのオリゴヌクレオチドの配列と位置は、図10に示
される。4つのオリゴヌクレオチド混合物の配列と一緒
に、天然のラットのANVPのアミノ酸4-13の配列が示さ
れ、ここで、領域1のプローブaとb、そして領域2の
プローブcとdにおいて、RはA又はGであり、YはT
又はCであり、NはA、G、T又はCである。各オリゴ
ヌクレオチド混合物は、エフィモフ(Efimov).V.A.他、N
uc.Acids Res. 10:6875〜6894(1982)で記述されている
通り、疑縮試薬としてのN-メチルイミダゾールの存在下
で、メシチレンスルホニル塩化物を用いて、スタンダー
ド・ホスホトリエステル法(standard phosphotriester
method)を改変することによって、バイオサーチ SAM I
オリゴヌクレオチドシンセサイザー(バイオサーチ
社、カリフォルニア州、サンラファエル)で合成され、
そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製
された。
リーニング セクションIで決定された、天然のラットのANVPsのア
ミノ酸配列はワレイス(Wallace)R.B.ほか、Nucleic A
cids Res.、9:879-894(1981)に記述されている通り、ラ
ット心房性cDNAライブラリーをスクリーニングするため
のオリゴヌクレオチドプローブ(probes)を設計するため
に用いられた。遺伝暗号の変性を考慮して、各領域に対
して、2つのオリゴヌクレオチドのプールが合成され
た。領域1は、2つのテトラデカマー(tetradecamer)オ
リゴヌクレオチドのプールでカバーされ、プローブaと
プローブbは各々、64個の塩基配列からなる。領域2
は、他の2つのテトラデカマープールでカバーされ、プ
ローブcとプローブdは各々、72個の配列からなる。こ
れらのオリゴヌクレオチドの配列と位置は、図10に示
される。4つのオリゴヌクレオチド混合物の配列と一緒
に、天然のラットのANVPのアミノ酸4-13の配列が示さ
れ、ここで、領域1のプローブaとb、そして領域2の
プローブcとdにおいて、RはA又はGであり、YはT
又はCであり、NはA、G、T又はCである。各オリゴ
ヌクレオチド混合物は、エフィモフ(Efimov).V.A.他、N
uc.Acids Res. 10:6875〜6894(1982)で記述されている
通り、疑縮試薬としてのN-メチルイミダゾールの存在下
で、メシチレンスルホニル塩化物を用いて、スタンダー
ド・ホスホトリエステル法(standard phosphotriester
method)を改変することによって、バイオサーチ SAM I
オリゴヌクレオチドシンセサイザー(バイオサーチ
社、カリフォルニア州、サンラファエル)で合成され、
そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって精製
された。
【0084】cDNAライブラリーは、次いで、これらのプ
ローブを用いてコロニー(colony)を雑種形成させること
によって、ふるい分けられた。4つのレプリカフィルタ
は、各フィルターから作られ、それによって、各コロニ
ーは各オリゴヌクレオチドプローブのプールでふるい分
けられた。 フィルターは、真空下で、80℃で、2時間
の間、焼成され、次いで大量の溶液3×SSC(ここで、
1×SSCは0.15Mの塩化ナトリウムと0.15Mのクエン酸ナ
トリウムとを含み、pH値は7.5である)0.1%SDSの中で
振盪されることにより、68℃で夜通し洗浄された。フィ
ルターは、50℃で、最小限度2時間の間、下記組成の溶
液6×SSC中で、予備的雑種形成を施された:溶液組成
は0.1%SDS;1mM EDTA;5×デンハルツ溶液(Denhardt's
solution);(0.1%Ficoll;0.1%ポリビニルピロリド
ン;0.1%ウシ血清アルブミン); 0.05%ピロ燐酸ナト
リウムであった。
ローブを用いてコロニー(colony)を雑種形成させること
によって、ふるい分けられた。4つのレプリカフィルタ
は、各フィルターから作られ、それによって、各コロニ
ーは各オリゴヌクレオチドプローブのプールでふるい分
けられた。 フィルターは、真空下で、80℃で、2時間
の間、焼成され、次いで大量の溶液3×SSC(ここで、
1×SSCは0.15Mの塩化ナトリウムと0.15Mのクエン酸ナ
トリウムとを含み、pH値は7.5である)0.1%SDSの中で
振盪されることにより、68℃で夜通し洗浄された。フィ
ルターは、50℃で、最小限度2時間の間、下記組成の溶
液6×SSC中で、予備的雑種形成を施された:溶液組成
は0.1%SDS;1mM EDTA;5×デンハルツ溶液(Denhardt's
solution);(0.1%Ficoll;0.1%ポリビニルピロリド
ン;0.1%ウシ血清アルブミン); 0.05%ピロ燐酸ナト
リウムであった。
【0085】次いでフィルターは、45℃で、振盪水浴中
で、100μg/mlのtRNAを含む雑種形成溶液10ml中で、
フィルター毎に、32pでラベルされた2.5×106cpmのオ
リゴヌクレオチド・プローブ混合物(マニアチス(Mania
tis)、T.他、Molecular Cloning、コールド・スプリン
グ・ハーバーラボラトリーズ、1982、pp.122-123に従っ
て、リン酸化されている)を用いて雑種形成された。1
時間後、恒温装置は、25℃まで冷却され、そして当該浴
は、12時間の間、平衡状態におかれた。フィルターは、
6×SSC、0.1%SDS溶液中で、室温で、15分間にわたっ
て、2度、洗浄され、次いで、6×SSC、0.1%SDS溶液
中で、(プローブcとdについては)35℃で、また(プ
ローブaとbについては)39℃で、1−2分間にわたっ
て洗浄された。最後の洗浄温度は、下記の経験式から得
られた:スグッス(Suggs)、S.V.他、精製遺伝子を用い
たDevelopmental Biology Using Purified Genes、D.D.
ブラウン(Brown)及びC.F.フォックス(Fox)編アカデミッ
クプレス、ニューヨークpp.683-693の経験式、即ち、T
d=4(G+C)+2(A+T)。かくして雑種形成されたフィルター
は、次いで乾燥されて、デュポン(登録商標)のクロネ
ックス増強スクリーン(Dupont Cronex intensifying sc
reens)を用いて、コダック(登録商標)XARフィルム上
で、完全に曝露が完了するまで、オートラジオグラフィ
ーにかけられた。
で、100μg/mlのtRNAを含む雑種形成溶液10ml中で、
フィルター毎に、32pでラベルされた2.5×106cpmのオ
リゴヌクレオチド・プローブ混合物(マニアチス(Mania
tis)、T.他、Molecular Cloning、コールド・スプリン
グ・ハーバーラボラトリーズ、1982、pp.122-123に従っ
て、リン酸化されている)を用いて雑種形成された。1
時間後、恒温装置は、25℃まで冷却され、そして当該浴
は、12時間の間、平衡状態におかれた。フィルターは、
6×SSC、0.1%SDS溶液中で、室温で、15分間にわたっ
て、2度、洗浄され、次いで、6×SSC、0.1%SDS溶液
中で、(プローブcとdについては)35℃で、また(プ
ローブaとbについては)39℃で、1−2分間にわたっ
て洗浄された。最後の洗浄温度は、下記の経験式から得
られた:スグッス(Suggs)、S.V.他、精製遺伝子を用い
たDevelopmental Biology Using Purified Genes、D.D.
ブラウン(Brown)及びC.F.フォックス(Fox)編アカデミッ
クプレス、ニューヨークpp.683-693の経験式、即ち、T
d=4(G+C)+2(A+T)。かくして雑種形成されたフィルター
は、次いで乾燥されて、デュポン(登録商標)のクロネ
ックス増強スクリーン(Dupont Cronex intensifying sc
reens)を用いて、コダック(登録商標)XARフィルム上
で、完全に曝露が完了するまで、オートラジオグラフィ
ーにかけられた。
【0086】コロニーは、それが領域番号1からの1つ
のプローブと、領域番号2からの1つのプローブとで雑
種形成された場合、陽性と考えられた。オリゴヌクレオ
チド・フローブ(プローブaとc)と強く雑種形成さ
れ、そして心室性cDNAプローブではなくて、ランダムに
感作された心房性cDNAと雑種形成された1つのコロニー
が選択された。このクローンの配列は、それがラットの
pre-pro ANVPsをコードしていることを示した。このク
ローンを、pNF1という。
のプローブと、領域番号2からの1つのプローブとで雑
種形成された場合、陽性と考えられた。オリゴヌクレオ
チド・フローブ(プローブaとc)と強く雑種形成さ
れ、そして心室性cDNAプローブではなくて、ランダムに
感作された心房性cDNAと雑種形成された1つのコロニー
が選択された。このクローンの配列は、それがラットの
pre-pro ANVPsをコードしていることを示した。このク
ローンを、pNF1という。
【0087】4.ラットのpre-pro心房性ナトリウム排
泄増加性/血管拡張性ポリペプチドcDNAの完全なスクリ
ーニング pNF1から得られた、精製されたDNA挿入物は、スモール
・ミニプレプ法(smallminiprep methods)(上記のマニ
アチス他、P.366の)を用いて作られ、そしてアクリル
アミドゲルにおいて単離された。次いで、完全なDNA挿
入物は、メッシング(Messing)J.とJ.ビーイラ(Vieir
a)、Gene、19:259-268(1982)で記述されている通りのジ
デオキシヌクレオチド法(dideoxynucleotide method)を
用いてDNA配列に対して特異的に設計された一本鎖バク
テリアファージM13の中に、各々、図11に示される通
り、5'末端と3'末端のEcoRIとSalIサイト(Sites)を介
して、サブクローン化された。全配列の初めの読取り
は、次いで、サンガー(Sanger)ジデオキシヌクレオチド
配列技術(サンガー、F.他、proc. Nat. Acad. Sci. US
A74: 5463-5469(1977)を用いてこれらのクローン(Clone
s)から得られた。この初めの配列を確認するために、他
のDNA配列の別個の読取りが必要だった。このために、
塩基340におけるHincIIサイトが用いられた。かくして
作られた当該挿入物は、エンドヌクレアーゼHincIIで消
化され、その結果生じた消化片は、SmaIとEcoRI(矢
印5)とで切開されたM13mp9の中と、SmaI及びEcoRI
(矢印6)とで消化されたM13mp8の中とに、各々、組み
込まれた。追加的確認を取るために、同様のアプローチ
が、塩基647においてPstIサイトを用いて行なわれた
(矢印3と4)。配列(pNF1)のために用いられた初めの
クローンは、図5に示される通り、その配列の塩基784
において終結したが、他のクローン(pNF4)は、更に3′
まで伸び、3′のpoly A尾部を有する最終の22塩基を含
んだ。このクローンの3′末端の配列は、当該挿入体
(矢印7)のSalI部位に対して、PstIを含むM13クロ
ーンを用いて得られ、そして、塩基785-806として図5
に示される。最後にDNAのまさに5′末端のヌクレオチド
は、32pでラベルされた一本鎖DNAのマクサムアンドギ
ルバート配列(Maxam and Gibert Sequencing)(マクサ
ム、A.アンドW.ギルバート、Proc. Nat. Acad.Sci.USA
74:560-564(1977)を用いて決定された:但し、上記一本
鎖DNAは、塩基1-186に及ぶBglII断片を用いて、5′領域
に対して相補的にされている。かくして決定された配列
は、塩基1−22として、図5に含まれた。このようにし
てヌクレオチド配列の分析によって、図5の塩基23-784
を含むクローンpNF1がANVP前駆体であるpre-pro ANVPを
コードすることが確認された。心房性cDNAライブラリー
が、cDNA挿入物で再びふるい分けされたときに、約0.5
%のコロニーが雑種形成された。このことにより、pre-
pro ANVPmRNAは、ラット心房性のmRNA集団(population)
の主要な種であることが示される。
泄増加性/血管拡張性ポリペプチドcDNAの完全なスクリ
ーニング pNF1から得られた、精製されたDNA挿入物は、スモール
・ミニプレプ法(smallminiprep methods)(上記のマニ
アチス他、P.366の)を用いて作られ、そしてアクリル
アミドゲルにおいて単離された。次いで、完全なDNA挿
入物は、メッシング(Messing)J.とJ.ビーイラ(Vieir
a)、Gene、19:259-268(1982)で記述されている通りのジ
デオキシヌクレオチド法(dideoxynucleotide method)を
用いてDNA配列に対して特異的に設計された一本鎖バク
テリアファージM13の中に、各々、図11に示される通
り、5'末端と3'末端のEcoRIとSalIサイト(Sites)を介
して、サブクローン化された。全配列の初めの読取り
は、次いで、サンガー(Sanger)ジデオキシヌクレオチド
配列技術(サンガー、F.他、proc. Nat. Acad. Sci. US
A74: 5463-5469(1977)を用いてこれらのクローン(Clone
s)から得られた。この初めの配列を確認するために、他
のDNA配列の別個の読取りが必要だった。このために、
塩基340におけるHincIIサイトが用いられた。かくして
作られた当該挿入物は、エンドヌクレアーゼHincIIで消
化され、その結果生じた消化片は、SmaIとEcoRI(矢
印5)とで切開されたM13mp9の中と、SmaI及びEcoRI
(矢印6)とで消化されたM13mp8の中とに、各々、組み
込まれた。追加的確認を取るために、同様のアプローチ
が、塩基647においてPstIサイトを用いて行なわれた
(矢印3と4)。配列(pNF1)のために用いられた初めの
クローンは、図5に示される通り、その配列の塩基784
において終結したが、他のクローン(pNF4)は、更に3′
まで伸び、3′のpoly A尾部を有する最終の22塩基を含
んだ。このクローンの3′末端の配列は、当該挿入体
(矢印7)のSalI部位に対して、PstIを含むM13クロ
ーンを用いて得られ、そして、塩基785-806として図5
に示される。最後にDNAのまさに5′末端のヌクレオチド
は、32pでラベルされた一本鎖DNAのマクサムアンドギ
ルバート配列(Maxam and Gibert Sequencing)(マクサ
ム、A.アンドW.ギルバート、Proc. Nat. Acad.Sci.USA
74:560-564(1977)を用いて決定された:但し、上記一本
鎖DNAは、塩基1-186に及ぶBglII断片を用いて、5′領域
に対して相補的にされている。かくして決定された配列
は、塩基1−22として、図5に含まれた。このようにし
てヌクレオチド配列の分析によって、図5の塩基23-784
を含むクローンpNF1がANVP前駆体であるpre-pro ANVPを
コードすることが確認された。心房性cDNAライブラリー
が、cDNA挿入物で再びふるい分けされたときに、約0.5
%のコロニーが雑種形成された。このことにより、pre-
pro ANVPmRNAは、ラット心房性のmRNA集団(population)
の主要な種であることが示される。
【0088】天然のラットのpre-proANVPのアミノ酸配
列は、cDNA ヌクレオチド配列から決定された。152アミ
ノ酸配列をコードした単一読取り枠は、当該枠が、塩基
85における初めのコドンATGから、位置541における終結
コドンまで伸びるように開示された。ヒトとラットのpr
e-pro ANVPsのアミノ酸配列(各々、図1乃至3、図4
及び図5を参照)において、生物学的に活性なANVPs
(図11を参照)を同定することができる。
列は、cDNA ヌクレオチド配列から決定された。152アミ
ノ酸配列をコードした単一読取り枠は、当該枠が、塩基
85における初めのコドンATGから、位置541における終結
コドンまで伸びるように開示された。ヒトとラットのpr
e-pro ANVPsのアミノ酸配列(各々、図1乃至3、図4
及び図5を参照)において、生物学的に活性なANVPs
(図11を参照)を同定することができる。
【0089】5.心房性の特異性の決定 心房性と心室性のpoly A+RNAは、メチル水銀水酸化物
(methyl-mercuric hydroxide)を含む1.4%のアガロー
ス(agarose)ゲルにおける電気泳動法による分画化の
後で、バイレイ(Bailey)、J.M.とN.ダビットソン(Da
vidson)による、Anal. Biochem.、70:75-85(1976)の方
法によるノザン法分析を受けた。ニックトランスレーシ
ョンされたpNF1 DNAを用いての、ノザン法分析の結果が
図12に示される:ここで、レーン1は、心房性poly A
+RNAを含み、そしてレーン2は、心室性poly A+RNA を
含む。図12に示されている通り、pNF1は、長さ方向
に、約800-900のヌクレオチドの心房性mRNAと、雑種形
成を行うが、心室性のmRNAとは雑種形成を行わない。
(methyl-mercuric hydroxide)を含む1.4%のアガロー
ス(agarose)ゲルにおける電気泳動法による分画化の
後で、バイレイ(Bailey)、J.M.とN.ダビットソン(Da
vidson)による、Anal. Biochem.、70:75-85(1976)の方
法によるノザン法分析を受けた。ニックトランスレーシ
ョンされたpNF1 DNAを用いての、ノザン法分析の結果が
図12に示される:ここで、レーン1は、心房性poly A
+RNAを含み、そしてレーン2は、心室性poly A+RNA を
含む。図12に示されている通り、pNF1は、長さ方向
に、約800-900のヌクレオチドの心房性mRNAと、雑種形
成を行うが、心室性のmRNAとは雑種形成を行わない。
【0090】上で決定されたpre-pro ANVPに対するcDNA
配列は、pre-pro ANVPが約16,500ドルトンの分子量を有
することを示す。実際の前駆物質のサイズを決定するた
めに、pre-pro ANVPをコードする心房性のmRNAは、下記
処理を受けて精製された:処理:雑種選択処理(ゴルド
ベルグ(Goldberg)、M.L.ほか、Methods in Enzymolog
y、68:206-220、アカデミックプレス、ニューヨー
ク);1cm2のニトロセルロースディスクにおける5μ
gのpNF1 DNAの固定化処理;および溶液(20mMのPIPES;
(pH6.4);1mMのEDTA;65%のホルムアミド;5×SSC;0.1
%のSDSを含む)中における、50℃での、3時間にわた
る5μgのpoly A+RNAとの雑種形成処理。フィルター
は、70℃で、広範にわたって、溶液(10mMのトリス−塩
化ナトリウム;(pH7.5);0.15Mの塩化ナトリウム;1mM
のEDTA;0.1%のSDSを含む)で洗浄された。その後、フ
ィルターは、SDSを除去した当該溶液、すなわち緩衝液
の中で洗浄された。雑種形成されたRNAは、1分間にわ
たって、50μgのイーストtRNAの存在下で、100℃で、
水中に溶出され、そして-70℃で直ちに凍結された。融
解後、RNAは、2容積の無水エタノールを用いて、エタ
ノールで沈殿させた。
配列は、pre-pro ANVPが約16,500ドルトンの分子量を有
することを示す。実際の前駆物質のサイズを決定するた
めに、pre-pro ANVPをコードする心房性のmRNAは、下記
処理を受けて精製された:処理:雑種選択処理(ゴルド
ベルグ(Goldberg)、M.L.ほか、Methods in Enzymolog
y、68:206-220、アカデミックプレス、ニューヨー
ク);1cm2のニトロセルロースディスクにおける5μ
gのpNF1 DNAの固定化処理;および溶液(20mMのPIPES;
(pH6.4);1mMのEDTA;65%のホルムアミド;5×SSC;0.1
%のSDSを含む)中における、50℃での、3時間にわた
る5μgのpoly A+RNAとの雑種形成処理。フィルター
は、70℃で、広範にわたって、溶液(10mMのトリス−塩
化ナトリウム;(pH7.5);0.15Mの塩化ナトリウム;1mM
のEDTA;0.1%のSDSを含む)で洗浄された。その後、フ
ィルターは、SDSを除去した当該溶液、すなわち緩衝液
の中で洗浄された。雑種形成されたRNAは、1分間にわ
たって、50μgのイーストtRNAの存在下で、100℃で、
水中に溶出され、そして-70℃で直ちに凍結された。融
解後、RNAは、2容積の無水エタノールを用いて、エタ
ノールで沈殿させた。
【0091】雑種選択されたRNAと全部のpoly A+RNAと
は、ウサギの綱状赤血球溶解物系(ベセスダ(Bethesda)
リサーチ・ラボ、メリーランド州、ガイセルベルク)を
用いて、250μCi/mlの[35S]−メチオニンの存在下
で、翻訳された。かくして得られた翻訳産物は、サンプ
ル毎に、1×106cpmの酸沈澱性放射能を負荷させること
によって、2元的(2-dimensional)ゲル電気泳動法によ
り、分画化された。第1次元(the first dimention)
は、匂配pH3.5-10(オファレル(O′Farrell),P.Z.ほ
か、Cell、12:113-1142(1977)を用いた等電位焦点ゲル
だった。当該当電位焦点の産物は、15%のゲルを用いた
SDS-PAGEにおいて電気泳動法にかけられた。サリチル酸
ナトリウム平衝に続いて、当該ゲルは乾燥され、次い
で、24時間にわったって、-70℃で蛍光間接撮影され
た。
は、ウサギの綱状赤血球溶解物系(ベセスダ(Bethesda)
リサーチ・ラボ、メリーランド州、ガイセルベルク)を
用いて、250μCi/mlの[35S]−メチオニンの存在下
で、翻訳された。かくして得られた翻訳産物は、サンプ
ル毎に、1×106cpmの酸沈澱性放射能を負荷させること
によって、2元的(2-dimensional)ゲル電気泳動法によ
り、分画化された。第1次元(the first dimention)
は、匂配pH3.5-10(オファレル(O′Farrell),P.Z.ほ
か、Cell、12:113-1142(1977)を用いた等電位焦点ゲル
だった。当該当電位焦点の産物は、15%のゲルを用いた
SDS-PAGEにおいて電気泳動法にかけられた。サリチル酸
ナトリウム平衝に続いて、当該ゲルは乾燥され、次い
で、24時間にわったって、-70℃で蛍光間接撮影され
た。
【0092】その産物は、図13と図14(ここで、1
2,000から30,000ドルトンの間の分子量を有する幾つか
の心房の特異的な翻訳産物が、矢印で示される)に示さ
れた。pNF1雑種で選択された心房性のRNAによってコー
ドされた翻訳産物は、図15に示される。図15におい
て、主要な心房性の特異的な種である分子量が18,00か
ら20,000ドルトンの間にある少なくとも3つの関連タン
パク質の種が示される。図16は、雑種選択によって、
いかなる心室性の特異的なタンパク質も認められなかっ
たことを示す。図15のタンパク質は雑種選択されたの
で、心房特異性であり、そして正しい分子量範囲に入っ
ており、それらは、pre-pro ANVPsを代表する。
2,000から30,000ドルトンの間の分子量を有する幾つか
の心房の特異的な翻訳産物が、矢印で示される)に示さ
れた。pNF1雑種で選択された心房性のRNAによってコー
ドされた翻訳産物は、図15に示される。図15におい
て、主要な心房性の特異的な種である分子量が18,00か
ら20,000ドルトンの間にある少なくとも3つの関連タン
パク質の種が示される。図16は、雑種選択によって、
いかなる心室性の特異的なタンパク質も認められなかっ
たことを示す。図15のタンパク質は雑種選択されたの
で、心房特異性であり、そして正しい分子量範囲に入っ
ており、それらは、pre-pro ANVPsを代表する。
【0093】B.pre-pro心房性ナトリウム尿***亢進
性/血管拡張性ポリペプチドをコードするヒト遺伝子の
クローニング 1.ヒトの天然pre-pro心房性ナトリウム尿***亢進性
/血管拡張性ポリペプチド遺伝子の単離 ラットのpre-pro ANVPを暗号化したcDNA(pNF1から単離
されたもの)は、ヒト遺伝子を同定するためのプローブ
を提供した。バクテリオファージCharon 4A(ローン(La
wn)、R.M.ほか、Cell、15:1157-1174(1978))における
ヒト・ゲノム・クローン・ライブラリーは、T.マニアチ
ス博士(ハーバード大学)から得られた。約106ファー
ジが、大腸菌K803で増殖され、そして溶菌斑が、ベン
トン(Benton)、W.DとR.W. デービス(Davis)(サイエン
ス、196:180-182(1977))とによって記述されている通
り、ニトロセルロースのフィルターに移された。これら
のフィルターは、ニックトランスレーション(リグビー
(Rigby)、P.W.J.ほか、J. Mol.Biol.、113:237-251(197
7))によって32Pで放射能的にラベルされたラットのcDN
Aに対して、雑種形成された。フィルターは、42℃で、
1時間にわたって、雑種形成緩衝液(0.75Mの塩化ナト
リウム;0.75Mの硝酸ナトリウム;40%のホルムアミ
ド;0.05%のSDS;0.02%のウシの血清アルブミン;0.0
2%のFicoll-400,000と;0.02%のポリビニルピロリド
ン;0.1%のピロ燐酸ナトリウム、20μg/mlの変性
し、せん断したサケの***DNAとを含む)中で、予備洗
浄された。新鮮な雑種形成緩衝液の1ml毎に、32Pでラ
ベルされ、煮沸されたラットのpre-pro ANVPs cDNAが加
えられ、そしてフィルターは、この緩衝液の中で、16時
間にわたって、42℃でインキュベーションされた。次い
で、フィルターは、50℃で、0.3Mの塩化ナトリウムと、
0.3Mの硝酸ナトリウムと、0.5%のSDSとを含む溶液中
で、3回洗浄され、そして夜通しオートラジオグラフィ
ーに暴露された。天然のラットのpre-pro ANVP cDNAと
雑種形成された配列を含む6つのクローンが精製され
た。
性/血管拡張性ポリペプチドをコードするヒト遺伝子の
クローニング 1.ヒトの天然pre-pro心房性ナトリウム尿***亢進性
/血管拡張性ポリペプチド遺伝子の単離 ラットのpre-pro ANVPを暗号化したcDNA(pNF1から単離
されたもの)は、ヒト遺伝子を同定するためのプローブ
を提供した。バクテリオファージCharon 4A(ローン(La
wn)、R.M.ほか、Cell、15:1157-1174(1978))における
ヒト・ゲノム・クローン・ライブラリーは、T.マニアチ
ス博士(ハーバード大学)から得られた。約106ファー
ジが、大腸菌K803で増殖され、そして溶菌斑が、ベン
トン(Benton)、W.DとR.W. デービス(Davis)(サイエン
ス、196:180-182(1977))とによって記述されている通
り、ニトロセルロースのフィルターに移された。これら
のフィルターは、ニックトランスレーション(リグビー
(Rigby)、P.W.J.ほか、J. Mol.Biol.、113:237-251(197
7))によって32Pで放射能的にラベルされたラットのcDN
Aに対して、雑種形成された。フィルターは、42℃で、
1時間にわたって、雑種形成緩衝液(0.75Mの塩化ナト
リウム;0.75Mの硝酸ナトリウム;40%のホルムアミ
ド;0.05%のSDS;0.02%のウシの血清アルブミン;0.0
2%のFicoll-400,000と;0.02%のポリビニルピロリド
ン;0.1%のピロ燐酸ナトリウム、20μg/mlの変性
し、せん断したサケの***DNAとを含む)中で、予備洗
浄された。新鮮な雑種形成緩衝液の1ml毎に、32Pでラ
ベルされ、煮沸されたラットのpre-pro ANVPs cDNAが加
えられ、そしてフィルターは、この緩衝液の中で、16時
間にわたって、42℃でインキュベーションされた。次い
で、フィルターは、50℃で、0.3Mの塩化ナトリウムと、
0.3Mの硝酸ナトリウムと、0.5%のSDSとを含む溶液中
で、3回洗浄され、そして夜通しオートラジオグラフィ
ーに暴露された。天然のラットのpre-pro ANVP cDNAと
雑種形成された配列を含む6つのクローンが精製され
た。
【0094】天然のヒトのpre-pro ANVP遺伝子のサイズ
は、クローンの全長の同定が可能なように決定された。
ブリン(Blin)N.とD.スタフォート(Stafford)の方法
(Nuc.Acid Res.3:2303-2308(1976))によって、20gの
ラットの肝臓から、2mgの高分子量のDNAが作られた。
このDNAは、制限酵素であるエンドヌクレアーゼBamH
I、BglI、KpnIおよびSacIの各々で単独的に消化さ
れ、そしてEcoRIと組み合わされて消化され、そして1
%のアガロースゲルにおける電気泳動法にかけられ、次
いでサザン、E.M.の方法(J. Mol. Biol.、 98:503-517
(1975))によって、ニトロセルロースのフィルターに移
された。これらのフィルターは、クローンを同定するた
めに用いられたのと同じ条件で、天然のラットのpre-pr
o ANVPsと相同の配列を求めてプローブされた。この方
法で、独特の2,600塩基対のEcoRI−BamHIDNA断片が同
定され、それは全遺伝子にまたがっている(span)よう
に見える。
は、クローンの全長の同定が可能なように決定された。
ブリン(Blin)N.とD.スタフォート(Stafford)の方法
(Nuc.Acid Res.3:2303-2308(1976))によって、20gの
ラットの肝臓から、2mgの高分子量のDNAが作られた。
このDNAは、制限酵素であるエンドヌクレアーゼBamH
I、BglI、KpnIおよびSacIの各々で単独的に消化さ
れ、そしてEcoRIと組み合わされて消化され、そして1
%のアガロースゲルにおける電気泳動法にかけられ、次
いでサザン、E.M.の方法(J. Mol. Biol.、 98:503-517
(1975))によって、ニトロセルロースのフィルターに移
された。これらのフィルターは、クローンを同定するた
めに用いられたのと同じ条件で、天然のラットのpre-pr
o ANVPsと相同の配列を求めてプローブされた。この方
法で、独特の2,600塩基対のEcoRI−BamHIDNA断片が同
定され、それは全遺伝子にまたがっている(span)よう
に見える。
【0095】次いで、ラットのpre-pro ANVPsとcDNAと
雑種形成された6つのヒトゲノムクローンは、同サイズ
の断片の存在を求めて分析され、そしてTHG6で表示され
るそのうちの1つは、当該断片を含んだ。
雑種形成された6つのヒトゲノムクローンは、同サイズ
の断片の存在を求めて分析され、そしてTHG6で表示され
るそのうちの1つは、当該断片を含んだ。
【0096】ついで、λHG6 DNAは、EcoRIとBamHIと
で消化され、そしてDNA断片が、同じエンドヌクレアー
ゼで予め消化されていたpBR 322に連結された。連結産
物は、既述の通り、大腸菌MC1061細胞内に移された。か
くして、プラスミドpHGRBIは、他の断片に対して、ク
ローン間に発生させられ、そして、グルンスタイン(Gru
nstein)、M.とD.ホグネス(Hogness)のコロニー雑種形
成法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961-3965(1975)に
よって同定された。雑種形成は、上記で説明した通りに
実施された。次いで、pHGRB1が配列され、そして天然の
ヒトのpre-pro ANVPの全遺伝子配列が負、含まれている
ことが示された。
で消化され、そしてDNA断片が、同じエンドヌクレアー
ゼで予め消化されていたpBR 322に連結された。連結産
物は、既述の通り、大腸菌MC1061細胞内に移された。か
くして、プラスミドpHGRBIは、他の断片に対して、ク
ローン間に発生させられ、そして、グルンスタイン(Gru
nstein)、M.とD.ホグネス(Hogness)のコロニー雑種形
成法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961-3965(1975)に
よって同定された。雑種形成は、上記で説明した通りに
実施された。次いで、pHGRB1が配列され、そして天然の
ヒトのpre-pro ANVPの全遺伝子配列が負、含まれている
ことが示された。
【0097】2.ヒトの天然のpre-pro心房性ナトリウ
ム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド遺伝子の配列
決定 ヒト遺伝子に対して、ラットのcDNAと雑種形成するよう
に示された2589塩基対の断片が、大形プラスミドプレプ
から、4%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって
作られた。配列決定を行う前に、大形のDNA断片は、幾
つかの有用な制限酵素であるエンドヌクレアーゼが切断
するサイトが決定されることを指示した:当該エンドヌ
クレアーゼは、配列を小断片に細分する。特に有用なサ
イトが、位置586(SstI)、984と1839(AvaI)、および15
81と2374(PstI)で見出された。これらのサイトは、図
17に示される。図17は、セクションII.A.4.でラッ
トのcDNAについて説明された方法一致するヒトの遺伝子
配列戦略を示す。両DNA鎖におけるこれらの領域をカバ
ーするために、これらのサイト間で、DNA断片をまたぐ
ことにより、幾つかのM13サブ・クローンが作られた。
制限酵素のエンドヌクレアーゼによる切断と、M13サブ
・クローニングとにより生成されたDNA断片は、図17
において、矢印1-10で示される。その結果生じた配列が
図1乃至3に示される。かくして得られた配列の情報
は、種々のインテリジェネティクス(Intelligenetics)
[パロ・アルト(Palo Alto)、カリフォルニア)コンピュ
ータ・プログラムを、製造者の指示書に従って用いるこ
とにより、分析された。信号(Signal)ペプチドと、前駆
物質配列と成熟ペプチドとを含む領域は、ラットの天然
のpre-pro ANVP cDNAとの比較によって同定された。全
暗号領域は、BamHIからEcoRIまでの断片に含まれ、そ
して遺伝子の暗号領域は、122と1095の塩基の2つのイ
ントロンとほぼ塩基の577-696と819-1145と2241-2536と
にまたがる3つのエキソンを含む。転写についての、仮
想上の制御信号の開始点(塩基347-354と、446-452)
と、終了点(塩基2515-2520)の双共に、当該断片に位
置する。セクションIで分離されたヒトのrANVPsの等価
物質は、ヒト遺伝子の第2と第3のエキソンにあること
が推定される。
ム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド遺伝子の配列
決定 ヒト遺伝子に対して、ラットのcDNAと雑種形成するよう
に示された2589塩基対の断片が、大形プラスミドプレプ
から、4%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって
作られた。配列決定を行う前に、大形のDNA断片は、幾
つかの有用な制限酵素であるエンドヌクレアーゼが切断
するサイトが決定されることを指示した:当該エンドヌ
クレアーゼは、配列を小断片に細分する。特に有用なサ
イトが、位置586(SstI)、984と1839(AvaI)、および15
81と2374(PstI)で見出された。これらのサイトは、図
17に示される。図17は、セクションII.A.4.でラッ
トのcDNAについて説明された方法一致するヒトの遺伝子
配列戦略を示す。両DNA鎖におけるこれらの領域をカバ
ーするために、これらのサイト間で、DNA断片をまたぐ
ことにより、幾つかのM13サブ・クローンが作られた。
制限酵素のエンドヌクレアーゼによる切断と、M13サブ
・クローニングとにより生成されたDNA断片は、図17
において、矢印1-10で示される。その結果生じた配列が
図1乃至3に示される。かくして得られた配列の情報
は、種々のインテリジェネティクス(Intelligenetics)
[パロ・アルト(Palo Alto)、カリフォルニア)コンピュ
ータ・プログラムを、製造者の指示書に従って用いるこ
とにより、分析された。信号(Signal)ペプチドと、前駆
物質配列と成熟ペプチドとを含む領域は、ラットの天然
のpre-pro ANVP cDNAとの比較によって同定された。全
暗号領域は、BamHIからEcoRIまでの断片に含まれ、そ
して遺伝子の暗号領域は、122と1095の塩基の2つのイ
ントロンとほぼ塩基の577-696と819-1145と2241-2536と
にまたがる3つのエキソンを含む。転写についての、仮
想上の制御信号の開始点(塩基347-354と、446-452)
と、終了点(塩基2515-2520)の双共に、当該断片に位
置する。セクションIで分離されたヒトのrANVPsの等価
物質は、ヒト遺伝子の第2と第3のエキソンにあること
が推定される。
【0098】C.ヒトのpre-pro心房のナトリウム尿排
泄亢進性/血管拡張性ポリペプチドcDNAのクローニング 1.ヒトの胎児の心臓のRNAの分離 妊娠の26週間目で得られたヒトの胎児の心臓が、セクシ
ョンIIで述べられた通り、poly A+mRNAを作るのに用い
られた。全部で1.7gの心臓組織から60μgのpoly A+mR
NAが分離された。
泄亢進性/血管拡張性ポリペプチドcDNAのクローニング 1.ヒトの胎児の心臓のRNAの分離 妊娠の26週間目で得られたヒトの胎児の心臓が、セクシ
ョンIIで述べられた通り、poly A+mRNAを作るのに用い
られた。全部で1.7gの心臓組織から60μgのpoly A+mR
NAが分離された。
【0099】2.ヒトの胎児の心臓のcDNAライブラリー
の生成 二重鎖cDNAは、マニアチス(Manniatis)、T.ほか、(分
子クローニング、コールドスプリングハーバーラボラト
リーズ、1982、pp. 212-246)が述べているように調製
された。10μgの鋳型RNAは,オリゴdT12-18で感作され
たAMV逆転写酵素を用いて、第一鎖cDNAに転写された。
次いで、RNA鋳型は、塩基の加水分解によって除去さ
れ、そして二重鎖にされた。DNAは、第一鎖cDNAの3´
末端に当然見出されるヘアピン・ループによる自己感作
に依存するAMV逆転写酵素によって合成された。この結
果生じた二重鎖ヘアピンDNAは、ついで、アスペルギル
ス・オリザエからのS1−ヌクレアーゼで処理させてヘア
ピンループが除去され、そしてその結果生じた分子は、
大腸菌DNAポリメラーゼIの大断片で処理されてそれら
を丸め端にした。EcoRIオリゴヌクレオチド・リンカー
は、T4-DNAリガーゼを用いて、cDNAに付加され、そし
て凝集したEcoRIの末端は、制限酵素のEcoRIによる切
断により解放された。かくして生じた二重鎖の、EcoRI
で切断されたcDNAは、次いでサイズが、バイオゲル(Bio
gel)A-50mカラム[バイオラド(BioRad)、リッチモン
ド]で分画化され、そして長さで500bpよりも大きい10ng
のcDNAが回収された。
の生成 二重鎖cDNAは、マニアチス(Manniatis)、T.ほか、(分
子クローニング、コールドスプリングハーバーラボラト
リーズ、1982、pp. 212-246)が述べているように調製
された。10μgの鋳型RNAは,オリゴdT12-18で感作され
たAMV逆転写酵素を用いて、第一鎖cDNAに転写された。
次いで、RNA鋳型は、塩基の加水分解によって除去さ
れ、そして二重鎖にされた。DNAは、第一鎖cDNAの3´
末端に当然見出されるヘアピン・ループによる自己感作
に依存するAMV逆転写酵素によって合成された。この結
果生じた二重鎖ヘアピンDNAは、ついで、アスペルギル
ス・オリザエからのS1−ヌクレアーゼで処理させてヘア
ピンループが除去され、そしてその結果生じた分子は、
大腸菌DNAポリメラーゼIの大断片で処理されてそれら
を丸め端にした。EcoRIオリゴヌクレオチド・リンカー
は、T4-DNAリガーゼを用いて、cDNAに付加され、そし
て凝集したEcoRIの末端は、制限酵素のEcoRIによる切
断により解放された。かくして生じた二重鎖の、EcoRI
で切断されたcDNAは、次いでサイズが、バイオゲル(Bio
gel)A-50mカラム[バイオラド(BioRad)、リッチモン
ド]で分画化され、そして長さで500bpよりも大きい10ng
のcDNAが回収された。
【0100】サイズ的に分画化されたcDNAは、次いでフ
ィン(Huynh)、T.V.ほか(cDNAクローニング技術:実務
的アプローチ、ed.D.グロバー(Glover)、(IRL、オック
スフォード)1984年発行)により説明されている通り、
バクテリオファージλ−ベクターであるλgt10に挿入さ
れた。DNAは、λgt10から作られ、そしてEcoRIで消化
された。このDNAはEcoRIで切断されたヒトの胎児心臓
のcDNAに結合され、そしてアメルシァム(Amersham)から
得られるパッケージング・キットを用いて試験内にパッ
ケージされる。かくして得られたファージは、次いで上
記のフィン(Huynh)、T.V.ほかによって記述された大腸
菌株BNN102に入れられた。このようにして、ヒトの胎児
心臓の、個々の約200,000のメンバーのライブラリーが
得られ、そして貯蔵するために増殖され、次いでふるい
分けられた。
ィン(Huynh)、T.V.ほか(cDNAクローニング技術:実務
的アプローチ、ed.D.グロバー(Glover)、(IRL、オック
スフォード)1984年発行)により説明されている通り、
バクテリオファージλ−ベクターであるλgt10に挿入さ
れた。DNAは、λgt10から作られ、そしてEcoRIで消化
された。このDNAはEcoRIで切断されたヒトの胎児心臓
のcDNAに結合され、そしてアメルシァム(Amersham)から
得られるパッケージング・キットを用いて試験内にパッ
ケージされる。かくして得られたファージは、次いで上
記のフィン(Huynh)、T.V.ほかによって記述された大腸
菌株BNN102に入れられた。このようにして、ヒトの胎児
心臓の、個々の約200,000のメンバーのライブラリーが
得られ、そして貯蔵するために増殖され、次いでふるい
分けられた。
【0101】3.ヒトの胎児心臓のcDNAライブラリーの
ふるい分け cDNAライブラリーは、マニアチス(Maniatis)、T.ほか(p
p.320-321)によって述べられている通り、溶菌斑雑種形
成によってふるい分けられた。雑種形成プローブは、ラ
ットのpre-pro ANVP、cDNAクローンpNF1(本願のセクシ
ョンII.A.3を見よ)からのEcoRI-SalI挿入物だった。
この精製されたDNA断片は、ベセスダ(Bethesda)リサー
チ・ラボラトリーズから入手することができるキットを
用いて、ニック(nick)翻訳により、32Pでラベルされ
た。
ふるい分け cDNAライブラリーは、マニアチス(Maniatis)、T.ほか(p
p.320-321)によって述べられている通り、溶菌斑雑種形
成によってふるい分けられた。雑種形成プローブは、ラ
ットのpre-pro ANVP、cDNAクローンpNF1(本願のセクシ
ョンII.A.3を見よ)からのEcoRI-SalI挿入物だった。
この精製されたDNA断片は、ベセスダ(Bethesda)リサー
チ・ラボラトリーズから入手することができるキットを
用いて、ニック(nick)翻訳により、32Pでラベルされ
た。
【0102】ヒトの胎児心臓の増殖させられたcDNAライ
ブラリーを用いて、ファ−ジが、宿主菌BNN102を用い
て、平板上で平板培養された。ニトロセルロースフィル
ターは、これらの平板から持ち上げられ、真空下で80℃
で2時間にわたって焼成され、そして[32P]でラベル
されたラットのpre-pro ANVP cDNA、pNFI挿入物の5×1
05cpmと雑種形成された。雑種形成は、42℃で16時間に
わたって、溶液(40%ホルムアミド;50mMリン酸ナトリ
ウム:pH6.5;5×デンハルツ(Denhardts)溶液(0.1%F
icoll;0.14Mポリビニルピリジン:0.1%ウシ血清アル
ブミン);5×SSC;50μg/mlサケ***DNA;および50
μg/mlイースト(yeast)RNA)中で行われた。フィルタ
ーは、1×SSC 0.1%SDS溶液中で、50℃で、30分間にわ
たって、2回洗浄され、そしてオートラジオグラフィー
にかけられた。ヒトのpre-pro ANVPcDNAクローンに対応
する全部で20の雑種形成ファージが、次いで同定され
た。
ブラリーを用いて、ファ−ジが、宿主菌BNN102を用い
て、平板上で平板培養された。ニトロセルロースフィル
ターは、これらの平板から持ち上げられ、真空下で80℃
で2時間にわたって焼成され、そして[32P]でラベル
されたラットのpre-pro ANVP cDNA、pNFI挿入物の5×1
05cpmと雑種形成された。雑種形成は、42℃で16時間に
わたって、溶液(40%ホルムアミド;50mMリン酸ナトリ
ウム:pH6.5;5×デンハルツ(Denhardts)溶液(0.1%F
icoll;0.14Mポリビニルピリジン:0.1%ウシ血清アル
ブミン);5×SSC;50μg/mlサケ***DNA;および50
μg/mlイースト(yeast)RNA)中で行われた。フィルタ
ーは、1×SSC 0.1%SDS溶液中で、50℃で、30分間にわ
たって、2回洗浄され、そしてオートラジオグラフィー
にかけられた。ヒトのpre-pro ANVPcDNAクローンに対応
する全部で20の雑種形成ファージが、次いで同定され
た。
【0103】4.ヒトのpre-pro ANVP cDNAクローンの
配列分析 12の、確実に雑種形成するファージが選択され、そして
精製されて再平板培養によって均質化された。ファージ
DNAプレプは、これらのヒトpre-pro ANVP cDNAクローン
から作られ、そして当該DNAは、EcoRIで消化されてcDN
A挿入物のサイズが決定された。ナンバー6のクローン
は、かくして約700の塩基対の挿入物を有するように示
され、そしてDNA配列分析のために選び出された。クロ
ーン・ナンバー6のEcoRI挿入物は、M13ベクター(メ
シング(Messing)J.及びビエイラ(Vieira)、J.、Gene、1
9:259-268(1982))内に挿入され、次いで上記のサンガ
ー(Sangar)、F.ほか、によって説明される通りのジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法によって配列された。
配列分析 12の、確実に雑種形成するファージが選択され、そして
精製されて再平板培養によって均質化された。ファージ
DNAプレプは、これらのヒトpre-pro ANVP cDNAクローン
から作られ、そして当該DNAは、EcoRIで消化されてcDN
A挿入物のサイズが決定された。ナンバー6のクローン
は、かくして約700の塩基対の挿入物を有するように示
され、そしてDNA配列分析のために選び出された。クロ
ーン・ナンバー6のEcoRI挿入物は、M13ベクター(メ
シング(Messing)J.及びビエイラ(Vieira)、J.、Gene、1
9:259-268(1982))内に挿入され、次いで上記のサンガ
ー(Sangar)、F.ほか、によって説明される通りのジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法によって配列された。
【0104】ヒトのpre-pro ANVP cDNAクローンナンバ
ー6のヌクレオチド配列を、図4に示す。当該クローン
は、ラットのpre-pro ANVP cDNAと比較されて、それが
ヒトのANF pre-pro ANVPに対応していることが確認され
た。このcDNAクローンは、アミノ酸15に対応する領域か
らヒトpre-pro ANVPコード領域まで伸び、そして3´−
未翻訳領域の全てを含む。従って、それは、ヒトpre-pr
o ANVPの生物学的に活性な要素の配列暗号の全てを含
み、そして異質系における発現に適している。
ー6のヌクレオチド配列を、図4に示す。当該クローン
は、ラットのpre-pro ANVP cDNAと比較されて、それが
ヒトのANF pre-pro ANVPに対応していることが確認され
た。このcDNAクローンは、アミノ酸15に対応する領域か
らヒトpre-pro ANVPコード領域まで伸び、そして3´−
未翻訳領域の全てを含む。従って、それは、ヒトpre-pr
o ANVPの生物学的に活性な要素の配列暗号の全てを含
み、そして異質系における発現に適している。
【0105】III.心房のナトリウム尿***亢進性/血管
拡張性ポリペプチドの化学的合成 A.合成手順 本発明における化合物は、一般式、
拡張性ポリペプチドの化学的合成 A.合成手順 本発明における化合物は、一般式、
【0106】
【化2】 [式中、、n=19、ここでaanは、D-異性体、L-異性体
およびDL異性体(ラセミ混合体残基を含む、一般式、
およびDL異性体(ラセミ混合体残基を含む、一般式、
【0107】
【化3】 (式中、Rnは、水素または1から10個の、一般には1
から6個の炭素原子を有する、脂肪族、芳香族またはア
ルカリール基であり、アミド、チオまたはオキシとして
の、2個以下の数の、窒素、酸素または硫黄の置換を有
する基を含み、ハイドロオキシ、チオールおよびエーテ
ルを含む、ここで、エーテルは、一般にアルキルエーテ
ルであり、例えばメチルのように、一般に1個の炭素原
子を有する)であり、Xは、水素、アミド、アセチルで
あるか、又は、追加的に、125以下のアミノ酸残基のオ
リゴペプチドを含み、そのN-アセチル誘導体を含み、Y
は、水素基、アミドまたは20以下のアミノ酸残基のオリ
ゴペプチドであり、そのC末端アミド誘導体を含む]を
有する。
から6個の炭素原子を有する、脂肪族、芳香族またはア
ルカリール基であり、アミド、チオまたはオキシとして
の、2個以下の数の、窒素、酸素または硫黄の置換を有
する基を含み、ハイドロオキシ、チオールおよびエーテ
ルを含む、ここで、エーテルは、一般にアルキルエーテ
ルであり、例えばメチルのように、一般に1個の炭素原
子を有する)であり、Xは、水素、アミド、アセチルで
あるか、又は、追加的に、125以下のアミノ酸残基のオ
リゴペプチドを含み、そのN-アセチル誘導体を含み、Y
は、水素基、アミドまたは20以下のアミノ酸残基のオリ
ゴペプチドであり、そのC末端アミド誘導体を含む]を
有する。
【0108】そして本発明の核酸分子の配列から指示さ
れる化合物は、下記一般式、
れる化合物は、下記一般式、
【化4】 (式中、AA1、AA8およびAA11は、同一の、又は相違した
塩基性の極性(polar)アミノ酸残基であり、望ましくは
アルギニンであり、AA2、AA3、AA6、AA7、AA13、AA15、
AA16、AA17およびAA19は、同一の、又は相違した中性の
極性アミノ酸残基であり、好ましくは、AA2とAA3はセリ
ンであり、AA6はグリシンまたはアラニンであり、AA7は
グリシンであり、AA13はグリシンまたはアラニンであ
り、AA15はグルタミン酸であり、AA16は、セリンであ
り、AA17はグリシンまたはアラニンであり、そしてAA19
はグリシンであり、AA5、AA9、AA12、AA14およびAA
18は、同一の、又は相違した中性の非極性アミノ酸残基
であり、好ましくは、AA5はフェニルアラニンであり、A
A9はイソロイシン、メチオニン又はバリンであり、AA12
はイソロイシンであり、AA14はアラニンであり、そして
AA18はロイシンである;AA10は、いかなる酸性の極性ア
ミノ酸残基であってもよく、好ましくはアスパラギン酸
である;そしてXおよびYは、先に定義した通りであ
る)を有し、固相技術によって合成された。合成は、徒
手で、あるいは、t-Bocアミノ酸を用いてバイオサーチS
AMII自動ペプチド・シンセサイザー(バイオサーチ、カ
リフォルニア州、サンラファエル)において、製造者の
指示書に従って実施された。
塩基性の極性(polar)アミノ酸残基であり、望ましくは
アルギニンであり、AA2、AA3、AA6、AA7、AA13、AA15、
AA16、AA17およびAA19は、同一の、又は相違した中性の
極性アミノ酸残基であり、好ましくは、AA2とAA3はセリ
ンであり、AA6はグリシンまたはアラニンであり、AA7は
グリシンであり、AA13はグリシンまたはアラニンであ
り、AA15はグルタミン酸であり、AA16は、セリンであ
り、AA17はグリシンまたはアラニンであり、そしてAA19
はグリシンであり、AA5、AA9、AA12、AA14およびAA
18は、同一の、又は相違した中性の非極性アミノ酸残基
であり、好ましくは、AA5はフェニルアラニンであり、A
A9はイソロイシン、メチオニン又はバリンであり、AA12
はイソロイシンであり、AA14はアラニンであり、そして
AA18はロイシンである;AA10は、いかなる酸性の極性ア
ミノ酸残基であってもよく、好ましくはアスパラギン酸
である;そしてXおよびYは、先に定義した通りであ
る)を有し、固相技術によって合成された。合成は、徒
手で、あるいは、t-Bocアミノ酸を用いてバイオサーチS
AMII自動ペプチド・シンセサイザー(バイオサーチ、カ
リフォルニア州、サンラファエル)において、製造者の
指示書に従って実施された。
【0109】上記説明に従って、下記手順が、新規なAN
VPsの化学的合成を行うために用いられた。
VPsの化学的合成を行うために用いられた。
【0110】手 順 A Boc−AAn−AAn-1…………AA1 ハイドロオキシメチルポ
リスチレンエステルの製造 1gのBoc−AAn−O−ポリスチレン−樹脂(0.2−0.6ミリ
モル/g subs)(ペニンスラ・ラブ社(peninsula Labs,
Inc.)が、スケジュールAに従って、Boc−AA1−OH…Boc
−AAn-1−OHを取り込むために処理された。スケジュールA 1) ジクロロメタン(CH2Cl2)で3回洗浄; 2) 1分間にわたって、TFA:CH2Cl2 :EDT(45:50:5、但
し、容積化)で処理; 3) 20分間にわたって、TFA:CH2Cl2 :EDT(45:50:5、但
し、容積化)で処理; 4) CH2Cl2で3回洗浄; 5) 1分間にわたって、CH2Cl2における10%(容積比v/
v)のジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)による2回の
処理; 6) CH2Cl2で2回洗浄; 7) MeOHで2回洗浄; 8) 工程(5-7)のもう一度の繰り返し; 9) CH2Cl2で3回洗浄; 10) CH2Cl2またはDMF/CH2Cl2(容積化で50:50)中に溶
解される適当に保護されたBoc-アミノ酸の予め形成され
た対称性無水物の1-6等価物の添加:Boc-Asn-OHとBoc-A
la-OHは、N-ヒドロオキシベンゾトリアゾールの活性エ
ステルと組み合わされた; 11) CH2Cl2で2回洗浄; 12) 10%のDIPEAで2回洗浄; 13) CH2Cl2で2回洗浄; 14) MeOHで2回洗浄; 15) CH2Cl2で2回洗浄; 16) 工程(11-15)のもう一度の繰り返し; 17) カイザー(kaiser)ほか、(Annal. Biochem.、34:59
5(1970))に従ったニンヒドリン反応によるテスト:当
該反応が完全でない場合には、工程(10-16)を繰り返す
か、またはその代わりに、N-アセチルイミダゾール(0.
30M、但し、DMFにおいて)又はCH2Cl2中の過剰の無水酢
酸を用いることによっての、キャップ合成。
リスチレンエステルの製造 1gのBoc−AAn−O−ポリスチレン−樹脂(0.2−0.6ミリ
モル/g subs)(ペニンスラ・ラブ社(peninsula Labs,
Inc.)が、スケジュールAに従って、Boc−AA1−OH…Boc
−AAn-1−OHを取り込むために処理された。スケジュールA 1) ジクロロメタン(CH2Cl2)で3回洗浄; 2) 1分間にわたって、TFA:CH2Cl2 :EDT(45:50:5、但
し、容積化)で処理; 3) 20分間にわたって、TFA:CH2Cl2 :EDT(45:50:5、但
し、容積化)で処理; 4) CH2Cl2で3回洗浄; 5) 1分間にわたって、CH2Cl2における10%(容積比v/
v)のジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)による2回の
処理; 6) CH2Cl2で2回洗浄; 7) MeOHで2回洗浄; 8) 工程(5-7)のもう一度の繰り返し; 9) CH2Cl2で3回洗浄; 10) CH2Cl2またはDMF/CH2Cl2(容積化で50:50)中に溶
解される適当に保護されたBoc-アミノ酸の予め形成され
た対称性無水物の1-6等価物の添加:Boc-Asn-OHとBoc-A
la-OHは、N-ヒドロオキシベンゾトリアゾールの活性エ
ステルと組み合わされた; 11) CH2Cl2で2回洗浄; 12) 10%のDIPEAで2回洗浄; 13) CH2Cl2で2回洗浄; 14) MeOHで2回洗浄; 15) CH2Cl2で2回洗浄; 16) 工程(11-15)のもう一度の繰り返し; 17) カイザー(kaiser)ほか、(Annal. Biochem.、34:59
5(1970))に従ったニンヒドリン反応によるテスト:当
該反応が完全でない場合には、工程(10-16)を繰り返す
か、またはその代わりに、N-アセチルイミダゾール(0.
30M、但し、DMFにおいて)又はCH2Cl2中の過剰の無水酢
酸を用いることによっての、キャップ合成。
【0111】手 順 B Boc−AAn−p−メチルベンズヒドリルアミン樹脂の調製 以下に説明される通り、Boc−AAn−OHは、ジシクロヘキ
シルカルボジイミドを介して、p-メチルベンズヒドリル
アミン(pMBHA)樹脂に付加される。スケジュールB 1) P-MBHA・HCl樹脂を洗浄; 2) 同樹脂を、CH2Cl2中で10%(容積比v/v)のDIPEA
で、2回洗浄; 3) CH2Cl2で2回洗浄; 4) MeOHで2回洗浄; 5) CH2Cl2で2回洗浄; 6) CH2Cl2中に溶解される適当に保護されたBoc-アミノ
酸の予め形成された対称性の無水物の、1-6等価物の添
加:ここで、反応時間は、0.5-24時間である。
シルカルボジイミドを介して、p-メチルベンズヒドリル
アミン(pMBHA)樹脂に付加される。スケジュールB 1) P-MBHA・HCl樹脂を洗浄; 2) 同樹脂を、CH2Cl2中で10%(容積比v/v)のDIPEA
で、2回洗浄; 3) CH2Cl2で2回洗浄; 4) MeOHで2回洗浄; 5) CH2Cl2で2回洗浄; 6) CH2Cl2中に溶解される適当に保護されたBoc-アミノ
酸の予め形成された対称性の無水物の、1-6等価物の添
加:ここで、反応時間は、0.5-24時間である。
【0112】未反応のアミノ基は、0.30MのN-アセチル
イミタゾール:-DMFか、または無水酢酸:CH2Cl2でもっ
て、アセチル化される。
イミタゾール:-DMFか、または無水酢酸:CH2Cl2でもっ
て、アセチル化される。
【0113】最初の2つの実施例は、ラットの心房から
分離された天然のペプチドの化学的合成を証明する(セ
クションIを見よ)。
分離された天然のペプチドの化学的合成を証明する(セ
クションIを見よ)。
【0114】実施例III.A.1:rANVP(126-150)
【化5】
【0115】1gのBoc L-Tyr(Brz)O-樹脂(ペニンスラ
・ラボラトリーズ社、0.54meg/g、カリフォルニア
州、ベルモント)は、要求されるアミノ酸の配列に関し
て、手順Aの処理を受けた(その際に、アミノ酸は下記
順序:Boc-Arg(Tos)OH、Boc-PheOH、Boc-Ser(Bzl)OH、B
oc-AsnOH、Boc-Cys(4-CH3Bzl)OH、Boc-GlyOH、Boc-LeuO
H・H2O、Boc-GlyOH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-GlnOH、BocAl
aOH、Boc-GlyOH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、
Boc-Asp(OBzl)OH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-Arg(Tos)O
H、Boc-GlyOH、Boc-GlyOH、Boc-PheOH、Boc-Cys(4CH3Bz
l)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Arg(Tos)
OBHで導入された)。
・ラボラトリーズ社、0.54meg/g、カリフォルニア
州、ベルモント)は、要求されるアミノ酸の配列に関し
て、手順Aの処理を受けた(その際に、アミノ酸は下記
順序:Boc-Arg(Tos)OH、Boc-PheOH、Boc-Ser(Bzl)OH、B
oc-AsnOH、Boc-Cys(4-CH3Bzl)OH、Boc-GlyOH、Boc-LeuO
H・H2O、Boc-GlyOH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-GlnOH、BocAl
aOH、Boc-GlyOH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、
Boc-Asp(OBzl)OH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-Arg(Tos)O
H、Boc-GlyOH、Boc-GlyOH、Boc-PheOH、Boc-Cys(4CH3Bz
l)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Arg(Tos)
OBHで導入された)。
【0116】保護されたペプチジル(protected peptidy
l)樹脂は、1分間にわたって、TFA:CH2Cl2:EDT(45:50:
5v/v/v)で処理され、次いで20分間処理され、そしてCH
2C12で3回洗浄され、MeOHで2回洗浄されて、ペプチジ
ル樹脂のTFA塩を生じ、そして真空中で乾燥された。
l)樹脂は、1分間にわたって、TFA:CH2Cl2:EDT(45:50:
5v/v/v)で処理され、次いで20分間処理され、そしてCH
2C12で3回洗浄され、MeOHで2回洗浄されて、ペプチジ
ル樹脂のTFA塩を生じ、そして真空中で乾燥された。
【0117】当該ペプチジル樹脂は、次いで10%のアニ
ソールと2%のエチルメチル硫化物とを含む無水フッ化
水素(HF)中に懸濁され、−10℃で30分間、そして0℃で
30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸発によ
り除去され、そしてペプチド/樹脂混合物は、ジエチル
エーテル中に懸濁された。当該ペプチド/樹脂混合物
は、ジエチルエーテルで2回、クロロホルムで1回、ジ
エチルエーテルで1回、クロロホルムで1回、そしてジ
エチルエ−テルで1回、各々、洗浄された。ペプチド
は、当該混合物から2.0Mの酢酸で抽出され、水で希釈さ
れ、そして凍結乾燥されて未酸化のジヒドロペプチドが
生じた。
ソールと2%のエチルメチル硫化物とを含む無水フッ化
水素(HF)中に懸濁され、−10℃で30分間、そして0℃で
30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸発によ
り除去され、そしてペプチド/樹脂混合物は、ジエチル
エーテル中に懸濁された。当該ペプチド/樹脂混合物
は、ジエチルエーテルで2回、クロロホルムで1回、ジ
エチルエーテルで1回、クロロホルムで1回、そしてジ
エチルエ−テルで1回、各々、洗浄された。ペプチド
は、当該混合物から2.0Mの酢酸で抽出され、水で希釈さ
れ、そして凍結乾燥されて未酸化のジヒドロペプチドが
生じた。
【0118】この粗ペプチドは、脱酸素化の0.01Mの酢
酸アンモニウム(NH4OAc):pH8中に0.5mg/mlまで溶解さ
れ、そして20分間攪拌されるところの、滴下式によるわ
ずかに0.01Mを超える量のフェリシアン化カリウム(KCN)
溶液の添加により酸化され、そして酢酸でpH値を5に調
整された。ペプチド溶液は、ダウエクス(DOWEX)AG3×4
陰イオン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希釈さ
れ、そして凍結乾燥されて粗環化ペプチドを生じた。
酸アンモニウム(NH4OAc):pH8中に0.5mg/mlまで溶解さ
れ、そして20分間攪拌されるところの、滴下式によるわ
ずかに0.01Mを超える量のフェリシアン化カリウム(KCN)
溶液の添加により酸化され、そして酢酸でpH値を5に調
整された。ペプチド溶液は、ダウエクス(DOWEX)AG3×4
陰イオン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希釈さ
れ、そして凍結乾燥されて粗環化ペプチドを生じた。
【0119】ペプチドの精製は、0.5MのAcOHを溶離液と
して用いることによりセファデックスG-25Fで脱塩を実
施し、次いでセファロース(ファルマシア ファイン
ケミカルズ社)またはCM-セルロース [ホワットマン(W
hatman)]における、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウム
の溶液への300mMの酢酸アンモニウムの添加によって生
じる匂配溶離を用いたイオン交換クロトグラフィーの実
施によって、達成された。かくして収集された分画は、
逆相(reversed phase)HPLCによって最低限でも97%の純
度を有することが認められ、そしてプールされ、次いで
水分を除去するために数回にわたって凍結乾燥されて精
製済のrANVP(126-150)酢酸塩が生じた。
して用いることによりセファデックスG-25Fで脱塩を実
施し、次いでセファロース(ファルマシア ファイン
ケミカルズ社)またはCM-セルロース [ホワットマン(W
hatman)]における、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウム
の溶液への300mMの酢酸アンモニウムの添加によって生
じる匂配溶離を用いたイオン交換クロトグラフィーの実
施によって、達成された。かくして収集された分画は、
逆相(reversed phase)HPLCによって最低限でも97%の純
度を有することが認められ、そしてプールされ、次いで
水分を除去するために数回にわたって凍結乾燥されて精
製済のrANVP(126-150)酢酸塩が生じた。
【0120】実施例III.A.2:rANVP(126-149)
【化6】
【0121】1.2gのBoc-Arg(Tos)O…樹脂(バイオサー
チ社、カリフォルニア州、サンラファエル)は、要求さ
れるアミノ酸の配列に関して、手順Aの処理を受けた
(その際に、アミノ酸は下記順序:Boc-PheOH、Boc-Ser
(Bzl)OH、Boc-AsnOH、Boc-Cys(4-CH3Bzl)OH、Boc-GlyO
H、Boc-LeuOH・H2O、Boc-GlyOH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-G
lnOH、BocAlaOH、Boc-GlyOH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-A
rg(Tos)OH、Boc-Asp(OBzl)OH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-
Arg(Tos)OH、Boc-GlyOH、Boc-GlyOH、Boc-PheOH、Boc-C
ys(4CH3Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc
-Arg(Tos)OHで導入された)。
チ社、カリフォルニア州、サンラファエル)は、要求さ
れるアミノ酸の配列に関して、手順Aの処理を受けた
(その際に、アミノ酸は下記順序:Boc-PheOH、Boc-Ser
(Bzl)OH、Boc-AsnOH、Boc-Cys(4-CH3Bzl)OH、Boc-GlyO
H、Boc-LeuOH・H2O、Boc-GlyOH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-G
lnOH、BocAlaOH、Boc-GlyOH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-A
rg(Tos)OH、Boc-Asp(OBzl)OH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-
Arg(Tos)OH、Boc-GlyOH、Boc-GlyOH、Boc-PheOH、Boc-C
ys(4CH3Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc
-Arg(Tos)OHで導入された)。
【0122】保護されたペプチジル樹脂は、1分間にわ
たって、TFA:CH2Cl2:EDT(45:50:5v/v/v)で処理され、次
いで20分間処理され、そしてCH2Cl2で3回洗浄され、Me
OHで2回洗浄され、そして真空中で乾燥されてペプチジ
ル樹脂のTFA塩を生じた。
たって、TFA:CH2Cl2:EDT(45:50:5v/v/v)で処理され、次
いで20分間処理され、そしてCH2Cl2で3回洗浄され、Me
OHで2回洗浄され、そして真空中で乾燥されてペプチジ
ル樹脂のTFA塩を生じた。
【0123】当該ペプチジル樹脂は、次いで10%のアニ
ソールを2%のエチルメチル硫化物とを含む無水フッ化
水素(HF)中に懸濁され、−10℃で30分間、そして0℃で
30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸発によ
り除去され、そしてペプチド/樹脂混合物は、ジエチル
エーテル中に懸濁された。当該ペプチド/樹脂混合物
は、ジエチルエーテルで2回、クロロホルムで2回、そ
してジエチルエーテルで2回、各々、洗浄された。ペプ
チドは、2.0Mも酢酸で抽出され、そして凍結乾燥されて
未酸化のジヒドロペプチドを生じた。
ソールを2%のエチルメチル硫化物とを含む無水フッ化
水素(HF)中に懸濁され、−10℃で30分間、そして0℃で
30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸発によ
り除去され、そしてペプチド/樹脂混合物は、ジエチル
エーテル中に懸濁された。当該ペプチド/樹脂混合物
は、ジエチルエーテルで2回、クロロホルムで2回、そ
してジエチルエーテルで2回、各々、洗浄された。ペプ
チドは、2.0Mも酢酸で抽出され、そして凍結乾燥されて
未酸化のジヒドロペプチドを生じた。
【0124】粗ペプチドは、2.0Mの酢酸と10mMの2-メル
カプトエタノールを含む溶液中に溶解され、そして同溶
液中でセファデックスG-25SFカラムによってクロマトグ
ラフィーにかけられた。次いで、当該ペプチドは凍結乾
燥され、そして100μg/mlのペプチドの濃度で、pH8.0
の、0.1MのNH4HCO3の溶液中に再懸濁させられた。かく
して懸濁されたペプチドは、48時間にわたって空気に曝
露されて、ゆっくりと再酸化された。次いで、当該ペプ
チドは、凍結乾燥された。
カプトエタノールを含む溶液中に溶解され、そして同溶
液中でセファデックスG-25SFカラムによってクロマトグ
ラフィーにかけられた。次いで、当該ペプチドは凍結乾
燥され、そして100μg/mlのペプチドの濃度で、pH8.0
の、0.1MのNH4HCO3の溶液中に再懸濁させられた。かく
して懸濁されたペプチドは、48時間にわたって空気に曝
露されて、ゆっくりと再酸化された。次いで、当該ペプ
チドは、凍結乾燥された。
【0125】以下の実施例は、ヒトの心房のナトリウム
***増加性/血管拡張性ポリペプチドの化学的合成を証
明する。
***増加性/血管拡張性ポリペプチドの化学的合成を証
明する。
【0126】実施例III.A.3:hANVP(127-151)
【化7】
【0127】1gのBoc-Tyr(BrZ)O-樹脂(ペニンスラ・
ラボラトリ−ズ社、0.54meg/g、カリフォルニア州、
ベルモント)は、要求されるアミノ酸の配列に関して、
手順Aの処理を受けた(その際に、アミノ酸は、下記順
序:Boc-Arg(Tos)OH、Boc-PheOH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc
-AsnOH、Boc-Cys(4-CH3Bzl)OH、Boc-GlyOH、Boc-LeuOH・
H2O、Boc-GlyOH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-GlnOH、BocAlaO
H、Boc-GlyOH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、Bo
c-Asp(OBzl)OH、Boc-MetOH・1/2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、B
oc-GlyOH、Boc-GlyOH、Boc-PheOH、Boc-Cys(4CH3Bzl)O
H、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Arg(Tos)OH
で導入された)。
ラボラトリ−ズ社、0.54meg/g、カリフォルニア州、
ベルモント)は、要求されるアミノ酸の配列に関して、
手順Aの処理を受けた(その際に、アミノ酸は、下記順
序:Boc-Arg(Tos)OH、Boc-PheOH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc
-AsnOH、Boc-Cys(4-CH3Bzl)OH、Boc-GlyOH、Boc-LeuOH・
H2O、Boc-GlyOH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-GlnOH、BocAlaO
H、Boc-GlyOH、Boc-IleOH・1/2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、Bo
c-Asp(OBzl)OH、Boc-MetOH・1/2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、B
oc-GlyOH、Boc-GlyOH、Boc-PheOH、Boc-Cys(4CH3Bzl)O
H、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Arg(Tos)OH
で導入された)。
【0128】保護されたペプチジル樹脂は、1分間にわ
たって、TFA:CH2Cl2:EDT(45:50:5v/v/v/)で処理され、
次いで20分間処理され、そしてCH2Cl2で3回洗浄され、
MeOHで2回洗浄されてペプチジル樹脂のTFA塩を生じ、
そして真空中で乾燥された。
たって、TFA:CH2Cl2:EDT(45:50:5v/v/v/)で処理され、
次いで20分間処理され、そしてCH2Cl2で3回洗浄され、
MeOHで2回洗浄されてペプチジル樹脂のTFA塩を生じ、
そして真空中で乾燥された。
【0129】当該ペプチジル樹脂は、次いで10%のアニ
ソールと2%のエチルメチル硫化物とを含む無水フッ化
水素(HF)中に懸濁され、−10℃で30分間、そして0℃で
30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸発によ
り除去され、そしてペプチド/樹脂混合物は、ジエチル
エーテル中に懸濁された。当該ペプチド/樹脂混合物B
は、ジエチルエーテルで2回、クロロホルムで1回、ジ
エチルエーテルで1回、クロロホルムで1回、そしてジ
エチルエーテルで1回、各々、洗浄された。ペプチド
は、当該混合物から2.0Mの酢酸で抽出され、水で希釈
され、そして凍結されて未酸化のジヒドロペプチドが生
じた。
ソールと2%のエチルメチル硫化物とを含む無水フッ化
水素(HF)中に懸濁され、−10℃で30分間、そして0℃で
30分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸発によ
り除去され、そしてペプチド/樹脂混合物は、ジエチル
エーテル中に懸濁された。当該ペプチド/樹脂混合物B
は、ジエチルエーテルで2回、クロロホルムで1回、ジ
エチルエーテルで1回、クロロホルムで1回、そしてジ
エチルエーテルで1回、各々、洗浄された。ペプチド
は、当該混合物から2.0Mの酢酸で抽出され、水で希釈
され、そして凍結されて未酸化のジヒドロペプチドが生
じた。
【0130】この粗ペプチドは、脱酸素化の0.01M酢酸
アンモニウム(NH4OAc):pH8中に0.5mg/mlまで溶解さ
れ、そして20分間攪拌されるところの、滴下式によるわ
ずかに0.01Mを超える量のフェリシアン化カリウム(KC
N)溶液の添加により酸化され、そして酢酸でpH値を5に
調整された。ペプチド溶液は、ダウエックス(DOWEX)AG
3×4陰イオン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希
釈され、そして凍結乾燥されて粗環化ペプチドを生じ
た。。
アンモニウム(NH4OAc):pH8中に0.5mg/mlまで溶解さ
れ、そして20分間攪拌されるところの、滴下式によるわ
ずかに0.01Mを超える量のフェリシアン化カリウム(KC
N)溶液の添加により酸化され、そして酢酸でpH値を5に
調整された。ペプチド溶液は、ダウエックス(DOWEX)AG
3×4陰イオン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希
釈され、そして凍結乾燥されて粗環化ペプチドを生じ
た。。
【0131】ペプチドの精製は、0.5MのAcOHを溶離液と
して用いることによりセファデックスG-25Fで脱塩を実
施し、次いでセファロース(ファルマシアファインケミ
カルズ社)またはCM−セルロース(ホワットマン)にお
ける、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウムの溶液への300
mMの酢酸アンモニウムの添加によって生じる勾配溶離を
用いたイオン交換クロマトグラフィーの実施によって、
達成された。かくして収集された分画は、逆相(reverse
d phase)HPLCによって最低限でも97%の純度を有するこ
とが認められ、そしてプールされ、次いで水分を除去す
るために数回にわたって凍結乾燥されて精製済みのhANV
P(127-151)酢酸塩が生じた。
して用いることによりセファデックスG-25Fで脱塩を実
施し、次いでセファロース(ファルマシアファインケミ
カルズ社)またはCM−セルロース(ホワットマン)にお
ける、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウムの溶液への300
mMの酢酸アンモニウムの添加によって生じる勾配溶離を
用いたイオン交換クロマトグラフィーの実施によって、
達成された。かくして収集された分画は、逆相(reverse
d phase)HPLCによって最低限でも97%の純度を有するこ
とが認められ、そしてプールされ、次いで水分を除去す
るために数回にわたって凍結乾燥されて精製済みのhANV
P(127-151)酢酸塩が生じた。
【0132】実施例III. A.4: rANVP(126-148)NH2
【化8】
【0133】1gのBoc-Phe-pMBHA-樹脂は、要求される
アミノ酸の配列に関して、手順Bを用いることにより得
られた(この手順Bを用いる際に、アミノ酸は、下記順
序:Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-AsnOH、Boc-Cys(4-CH3Bzl)O
H、Boc-GlyOH、Boc-LeuOH・H2O、Boc-GlyOH、Boc-Ser(Bz
l)OH、Boc-GlnOH、BocAlaOH、Boc-GlyOH、Boc-IleOH・1/
2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、Boc-Asp(OBzl)OH、Boc-IleOH・1
/2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、Boc-GlyOH、Boc-GlyOH、Boc-P
heOH、Boc-Cys(4CH3Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Ser
(Bzl)OH、Boc-Arg(Tos)OBHで導入された)。
アミノ酸の配列に関して、手順Bを用いることにより得
られた(この手順Bを用いる際に、アミノ酸は、下記順
序:Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-AsnOH、Boc-Cys(4-CH3Bzl)O
H、Boc-GlyOH、Boc-LeuOH・H2O、Boc-GlyOH、Boc-Ser(Bz
l)OH、Boc-GlnOH、BocAlaOH、Boc-GlyOH、Boc-IleOH・1/
2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、Boc-Asp(OBzl)OH、Boc-IleOH・1
/2H2O、Boc-Arg(Tos)OH、Boc-GlyOH、Boc-GlyOH、Boc-P
heOH、Boc-Cys(4CH3Bzl)OH、Boc-Ser(Bzl)OH、Boc-Ser
(Bzl)OH、Boc-Arg(Tos)OBHで導入された)。
【0134】当該ペプチジル樹脂は、次いで10%のアニ
ソール2%のエチルメチル硫化物とを含む無水フッ化水
素(HF)中に懸濁され、−10℃で30分間、そして0℃で30
分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸発により
除去され、そしてペプチド/樹脂混合物は、ジェチルエ
ーテル中に懸濁された。当該ペプチド/樹脂混合物は、
ジエチルエーテルで2回、クロロホルムで1回、ジエチ
ルエーテルで1回、クロロホルムで1回、そしてジエチ
ルエーテルで1回、各々洗浄された。ペプチドは、当該
混合物から2.0Mの酢酸で抽出され、水で希釈され、そ
して凍結乾燥されて、未酸化のジヒドロペプチドが生じ
た。この粗ペプチドは、脱酸素化の0.01Mの酢酸アンモ
ニウム(NH4OAc):pH8中に0.5mg/mlまで溶解され、そ
して20分間攪拌されるところの、滴下式によるわずかに
0.01Mを超える量のフェリシアン化カリウム(KCN)溶液
の添加により酸化され、そして酢酸でpH値を5に調整さ
れた。ペプチド溶液は、ダウエックス(DOWEX)AG3×4
陰イオン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希釈さ
れ、そして凍結乾燥されて粗環化ペプチドを生じた。
ソール2%のエチルメチル硫化物とを含む無水フッ化水
素(HF)中に懸濁され、−10℃で30分間、そして0℃で30
分間、各々保持された。当該HFは、真空下の蒸発により
除去され、そしてペプチド/樹脂混合物は、ジェチルエ
ーテル中に懸濁された。当該ペプチド/樹脂混合物は、
ジエチルエーテルで2回、クロロホルムで1回、ジエチ
ルエーテルで1回、クロロホルムで1回、そしてジエチ
ルエーテルで1回、各々洗浄された。ペプチドは、当該
混合物から2.0Mの酢酸で抽出され、水で希釈され、そ
して凍結乾燥されて、未酸化のジヒドロペプチドが生じ
た。この粗ペプチドは、脱酸素化の0.01Mの酢酸アンモ
ニウム(NH4OAc):pH8中に0.5mg/mlまで溶解され、そ
して20分間攪拌されるところの、滴下式によるわずかに
0.01Mを超える量のフェリシアン化カリウム(KCN)溶液
の添加により酸化され、そして酢酸でpH値を5に調整さ
れた。ペプチド溶液は、ダウエックス(DOWEX)AG3×4
陰イオン交換樹脂で処理され、濾過され、水で希釈さ
れ、そして凍結乾燥されて粗環化ペプチドを生じた。
【0135】ペプチドの精製は、0.5MのAcOHを溶離液
として用いることによりセファデックスG−25Fで脱塩
を実施し、次いでセファロース(ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社)またはCM-セルロース(ホワットマ
ン)における、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウム溶液
への300mMの酢酸アンモニウムの添加によって生じる勾
配溶離を用いたイオン交換クロトグラフィーの実施によ
って、達成された。かくして収集された分画は、逆相(r
eversed phase)HPLCによって最低限でも97%の純度を有
することが認められ、そしてプールされ、次いで水分を
除去するために数回にわたって凍結乾燥されて精製済み
のrANVP(12-148)酢酸塩が生じた。
として用いることによりセファデックスG−25Fで脱塩
を実施し、次いでセファロース(ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社)またはCM-セルロース(ホワットマ
ン)における、pH4.5の0.01Mの酢酸アンモニウム溶液
への300mMの酢酸アンモニウムの添加によって生じる勾
配溶離を用いたイオン交換クロトグラフィーの実施によ
って、達成された。かくして収集された分画は、逆相(r
eversed phase)HPLCによって最低限でも97%の純度を有
することが認められ、そしてプールされ、次いで水分を
除去するために数回にわたって凍結乾燥されて精製済み
のrANVP(12-148)酢酸塩が生じた。
【0136】適当な変更を行ないつつ、上記実施例III.
A.1-4において概述された手順に従って、下記のANVPsが
構成された:
A.1-4において概述された手順に従って、下記のANVPsが
構成された:
【0137】実施例III.A.5:hANVP(127-146)
【化9】
【0138】実施例III.A.6:[D-Cys129]rANVP(126-150)
【化10】
【0139】実施例III.A.7:[D-Phe130]rANVP(126-150)
【化11】
【0140】実施例III.A.8:[D-Ala131]rANVP(126-150)
【化12】
【0141】実施例III.A.9:[D-Ala132]rANVP(126-150)
【化13】
【0142】実施例III.A.10:[D-Arg133]rANVP(126-15
0)
0)
【化14】
【0143】実施例III.A.11:[D-Met135]hANVP(127-15
1)
1)
【化15】
【0144】実施例III.A.12:[D-Val134]rANVP(126-15
0)
0)
【化16】
【0145】実施例III.A.13:[D-Arg136]rANVP(126-15
0)
0)
【化17】
【0146】実施例III.A.14:[D-Val137]rANVP(126-15
0)
0)
【化18】
【0147】実施例III.A.15:[D-Ala138]rANVP(126-15
0)
0)
【化19】
【0148】実施例III.A.16:[D-Ala139]rANVP(126-15
0)
0)
【化20】
【0149】実施例III.A.17:[D-Gln140]rANVP(126-15
0)
0)
【化21】
【0150】実施施例III.A.18:[D-Ser141]rANVP(126-1
50)
50)
【化22】
【0151】実施例III.A.19:[D-Ala142]rANVP(126-15
0)
0)
【化23】
【0152】実施例III.A.20:[D-Leu143]rANVP(126-15
0)
0)
【化24】
【0153】B. 天然の、および化学的に生成された
心房のナトリウム、尿***亢進性/血管拡張性ポリペプ
チドの生物学的活性 天然の、および化学的に合成されたANVP化合物とその類
似化合物の生物学的活性は、分離されたラットの腎臓と
分離されたウサギの胸の大動脈輪と、そして分離された
血管壁の細胞とを含む試験管内系を用いることによって
決定された。当該活性、また健全なラットおよびイヌに
おいても測定された。
心房のナトリウム、尿***亢進性/血管拡張性ポリペプ
チドの生物学的活性 天然の、および化学的に合成されたANVP化合物とその類
似化合物の生物学的活性は、分離されたラットの腎臓と
分離されたウサギの胸の大動脈輪と、そして分離された
血管壁の細胞とを含む試験管内系を用いることによって
決定された。当該活性、また健全なラットおよびイヌに
おいても測定された。
【0154】1.試験管内における生物学的効力検定 rANVP(126-149)の活性は、分離されたラットの腎臓にお
いて測定された。カマルゴ(Camargo)、M.J.F.ほか、Am.
J. Physiol.、246:F447-F456(1984)において記述され
ている通りに、閉回路系において、機能的に分離された
ラットの腎臓灌流が行われた。コントロール・クリアラ
ンス期間(control clearance periods)後、0.1から1.0
μgの当該化合物が灌流液に添加された。多くのパラメ
ータに関する効果が観察された。これらのピーク値を表
1に、実験データとして示した。表1は分離され灌流さ
れるラットの腎臓における腎機能に関する合成された心
房のナトリウム***増加性/血管拡張性ポリペプチドの
効果を示す。rANVP(126-149)が、尿流量と、尿中へのナ
トリウム排出と、濾過分画と、そして糸球体の濾過率と
を増大させたことは明らかである。
いて測定された。カマルゴ(Camargo)、M.J.F.ほか、Am.
J. Physiol.、246:F447-F456(1984)において記述され
ている通りに、閉回路系において、機能的に分離された
ラットの腎臓灌流が行われた。コントロール・クリアラ
ンス期間(control clearance periods)後、0.1から1.0
μgの当該化合物が灌流液に添加された。多くのパラメ
ータに関する効果が観察された。これらのピーク値を表
1に、実験データとして示した。表1は分離され灌流さ
れるラットの腎臓における腎機能に関する合成された心
房のナトリウム***増加性/血管拡張性ポリペプチドの
効果を示す。rANVP(126-149)が、尿流量と、尿中へのナ
トリウム排出と、濾過分画と、そして糸球体の濾過率と
を増大させたことは明らかである。
【0155】
【表1】 表中の値は、4つの腎臓の平均値±SEであり;ピーク値
(P)マイナス0.05がコントロール欄の値と比較された(st
udent′stテスト)。これらの結果は、血管収縮神経がな
い状態で灌流を受けた腎臓において、本発明の当該化合
物が腎臓の血管抵抗と、濾過分画と、そして糸球体濾過
率とを増大させたことも、また示している。これと対照
的に、内因的に生成されたアンギオテンシンによって予
め収縮した分離腎臓においては、本発明の当該化合物
は、血管抵抗を減少させた。当該合成化合物についての
これらの効果は、内因的な血管収縮神経の有無により、
ANVPsが、腎臓の血管収縮作用と血管緊張低下作用の双
方の作用を持ち得ることを示す。分離腎臓において観察
されたナトリウム***増加性は、選択的に、遠心性細動
脈において発現する腎臓の血管収縮効果に起因すると考
えることができる。
(P)マイナス0.05がコントロール欄の値と比較された(st
udent′stテスト)。これらの結果は、血管収縮神経がな
い状態で灌流を受けた腎臓において、本発明の当該化合
物が腎臓の血管抵抗と、濾過分画と、そして糸球体濾過
率とを増大させたことも、また示している。これと対照
的に、内因的に生成されたアンギオテンシンによって予
め収縮した分離腎臓においては、本発明の当該化合物
は、血管抵抗を減少させた。当該合成化合物についての
これらの効果は、内因的な血管収縮神経の有無により、
ANVPsが、腎臓の血管収縮作用と血管緊張低下作用の双
方の作用を持ち得ることを示す。分離腎臓において観察
されたナトリウム***増加性は、選択的に、遠心性細動
脈において発現する腎臓の血管収縮効果に起因すると考
えることができる。
【0156】同じ方法で、他のAVNPsが、ラットの分離
腎臓で試験された。表2には、尿流量と、尿のナトリウ
ム排出度と、そして糸球体濾過率とに関するこれらのペ
プチドの効果が各々、まとめられており、ラットの分離
腎臓における心房のナトリウム***増加性/血管拡張性
ポリペプチドの効果が示されている。当該系(system)に
おいて試験されたANVPの全てが、尿流量と尿のナトリウ
ム排出度の双方を増大させたことに留意されたい。当該
ラットの分離腎臓において、これと同じ方法で、比較的
に少数の、無関係のペプチドが尿流量と、尿のナトリウ
ム排出度とに作用した。このように、観察された効果
は、ANVPsと、関連するその類似化合物に対して特異的
である。多分、これらの効果は、ANVPsと腎臓内の特異
的な受容用体部位との間の相互作用によってもたらされ
ているのであろう。
腎臓で試験された。表2には、尿流量と、尿のナトリウ
ム排出度と、そして糸球体濾過率とに関するこれらのペ
プチドの効果が各々、まとめられており、ラットの分離
腎臓における心房のナトリウム***増加性/血管拡張性
ポリペプチドの効果が示されている。当該系(system)に
おいて試験されたANVPの全てが、尿流量と尿のナトリウ
ム排出度の双方を増大させたことに留意されたい。当該
ラットの分離腎臓において、これと同じ方法で、比較的
に少数の、無関係のペプチドが尿流量と、尿のナトリウ
ム排出度とに作用した。このように、観察された効果
は、ANVPsと、関連するその類似化合物に対して特異的
である。多分、これらの効果は、ANVPsと腎臓内の特異
的な受容用体部位との間の相互作用によってもたらされ
ているのであろう。
【0157】
【表2】 ラットの分離腎臓は、表1で説明された通りに試験され
た。各化合物のコントロール期間は、Cで表示され、そ
して当該化合物の投与に続く実験期間は、Eで表示され
る。
た。各化合物のコントロール期間は、Cで表示され、そ
して当該化合物の投与に続く実験期間は、Eで表示され
る。
【0158】データは、3-8の実験の平均値を示す。
【0159】天然のANVPsは、予め収縮させられた血管
を弛緩させるので、これらのペプチドの効果は、ウサギ
から分離された胸郭の大動脈輪と、ウシから分離された
血管壁の細胞とについて研究された。
を弛緩させるので、これらのペプチドの効果は、ウサギ
から分離された胸郭の大動脈輪と、ウシから分離された
血管壁の細胞とについて研究された。
【0160】合成ANVPsは、部分的に精製された(ゲル濾
過段階の)天然のANVPsと、精製された(HPLC)天然のANV
Psの双方と、ヒスタミンで収縮させられた大動脈輪を弛
緩させる能力について、比較された。大動脈輪は1.5g
引張り力により生じた受動的な緊張状態で、10mlの通気
されたクレブス緩衝液(krab's buffer)中に懸濁され
た。当該大動脈輪は、5×10-6Mのヒスタミンで予め収
縮され洗浄され、そして上記のクライネルト(Kleiner
t), H.D.(1984)によって記述される通りに、元に緊張状
態に戻れるように保持された。精製済みのANVPs、また
は合成化合物の投与量は、累積的な方法で増やされてい
った。図18に示される通り、緊張状態の変化は、投与
された当該化合物すなわちタンパク質の累積量に関連し
ていることが示された。
過段階の)天然のANVPsと、精製された(HPLC)天然のANV
Psの双方と、ヒスタミンで収縮させられた大動脈輪を弛
緩させる能力について、比較された。大動脈輪は1.5g
引張り力により生じた受動的な緊張状態で、10mlの通気
されたクレブス緩衝液(krab's buffer)中に懸濁され
た。当該大動脈輪は、5×10-6Mのヒスタミンで予め収
縮され洗浄され、そして上記のクライネルト(Kleiner
t), H.D.(1984)によって記述される通りに、元に緊張状
態に戻れるように保持された。精製済みのANVPs、また
は合成化合物の投与量は、累積的な方法で増やされてい
った。図18に示される通り、緊張状態の変化は、投与
された当該化合物すなわちタンパク質の累積量に関連し
ていることが示された。
【0161】図示の通り、精製済みの天然rANVP(126-15
0)と合成rANVP(126-150)は、双方共に、同量で組織を弛
緩させた。更に、hANVP(127-151)は、この組織のrANVP
(126-150)と等価である。ゲラー(Geller他、Biochem.
Biophys. Res. Comm.、 120(2):333-338(1984))によっ
て記述されたアトリオペプチンIIIの等価物であるrANVP
(127-150)は、しかしながら、予め収縮させられたウサ
ギの大動脈を弛緩させる上ではほとんど効果がない。こ
の知見は、最近、ガルシア(Garcia他、Biochem.Biophy
s.Res. Comm.、126(1):178-184(1985))によって確認さ
れた。
0)と合成rANVP(126-150)は、双方共に、同量で組織を弛
緩させた。更に、hANVP(127-151)は、この組織のrANVP
(126-150)と等価である。ゲラー(Geller他、Biochem.
Biophys. Res. Comm.、 120(2):333-338(1984))によっ
て記述されたアトリオペプチンIIIの等価物であるrANVP
(127-150)は、しかしながら、予め収縮させられたウサ
ギの大動脈を弛緩させる上ではほとんど効果がない。こ
の知見は、最近、ガルシア(Garcia他、Biochem.Biophy
s.Res. Comm.、126(1):178-184(1985))によって確認さ
れた。
【0162】予め収縮させられた大動脈の血管を弛緩さ
せるためには、先ず初めに、ANVP化合物が、特異的な膜
レセプターと結合しなければならない。この配位子(lig
and)−リセプターとの相互作用と組み合わさって、細胞
内の環化GMPが増加する(ウインクイスト(Winquiest)、
他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7661-7664(198
4))。環化GMPは、ANVPや他の化合物に反応するところ
の、血管緊張低下性の細胞内仲介体として同定されてい
るので、当該環化GMPのレベルを検定することによっ
て、ANVP化合物の生物学的作用を知ることができる。従
って血管壁、例えば、ウシの大動脈平滑筋や内皮細胞か
ら取られた細胞が用いられて特異的レセプターに対する
ANVP化合物の結合度が求められ、そして、かくして組み
合わさった環化GMPの増加が測定された。これらの試験
によって、ウシの血管平滑筋を弛緩させる上でのANVPs
の相対的な有効性が示される。
せるためには、先ず初めに、ANVP化合物が、特異的な膜
レセプターと結合しなければならない。この配位子(lig
and)−リセプターとの相互作用と組み合わさって、細胞
内の環化GMPが増加する(ウインクイスト(Winquiest)、
他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:7661-7664(198
4))。環化GMPは、ANVPや他の化合物に反応するところ
の、血管緊張低下性の細胞内仲介体として同定されてい
るので、当該環化GMPのレベルを検定することによっ
て、ANVP化合物の生物学的作用を知ることができる。従
って血管壁、例えば、ウシの大動脈平滑筋や内皮細胞か
ら取られた細胞が用いられて特異的レセプターに対する
ANVP化合物の結合度が求められ、そして、かくして組み
合わさった環化GMPの増加が測定された。これらの試験
によって、ウシの血管平滑筋を弛緩させる上でのANVPs
の相対的な有効性が示される。
【0163】結合度の検定は、下記の通りに遂行され
た:ANVPsは、シェンク(Schenk他、J.Biol. Chem.、25
9:14941-1451(1984))の方法に従って、125Iでラベル
された。当該方法は、125IをANVP分子のチロキシに転
移させるために、グルコース酸化酵素とラクトパーオキ
シダーゼによって媒介される酸化作用を利用する。次い
で、125I−ANVPは、血管壁細胞の10mmの融合性培養細
胞に添加され、そして37℃で培養された。
た:ANVPsは、シェンク(Schenk他、J.Biol. Chem.、25
9:14941-1451(1984))の方法に従って、125Iでラベル
された。当該方法は、125IをANVP分子のチロキシに転
移させるために、グルコース酸化酵素とラクトパーオキ
シダーゼによって媒介される酸化作用を利用する。次い
で、125I−ANVPは、血管壁細胞の10mmの融合性培養細
胞に添加され、そして37℃で培養された。
【0164】図19乃至20に示される通り、125I−A
NVPは、特異的に、そして飽和的に細胞と結合する特異
的そして飽和的結合は、ホルモン/レセプター相互作用
の必要条件である。更にその上、 25I−ANVPの結付き
は、他の受容体部位で作用するような種々のホルモン
(アンギオテンシン、エピネフリン、バソプレシン、グ
ルカゴンではなくて、末ラベルのANVP化合物で置換する
ことができる。このように、ANVPsとその類似化合物に
よって、125I−ANVPの結合が置換されることにより、A
NVPが濃縮されて効果的に血管壁と結合して当該血管の
緊張を低下させる。血管の平滑筋の細胞の結合部位にお
いて、125I−ANVPをANVPsとその類似化合物で置き換え
ることによって達成されるANVPの濃縮について、培養さ
れたウシの血管平滑筋細胞に対する、心房のナトリウム
***増加性/血管拡張性ポリペプチドの結合を表3で略
述する。
NVPは、特異的に、そして飽和的に細胞と結合する特異
的そして飽和的結合は、ホルモン/レセプター相互作用
の必要条件である。更にその上、 25I−ANVPの結付き
は、他の受容体部位で作用するような種々のホルモン
(アンギオテンシン、エピネフリン、バソプレシン、グ
ルカゴンではなくて、末ラベルのANVP化合物で置換する
ことができる。このように、ANVPsとその類似化合物に
よって、125I−ANVPの結合が置換されることにより、A
NVPが濃縮されて効果的に血管壁と結合して当該血管の
緊張を低下させる。血管の平滑筋の細胞の結合部位にお
いて、125I−ANVPをANVPsとその類似化合物で置き換え
ることによって達成されるANVPの濃縮について、培養さ
れたウシの血管平滑筋細胞に対する、心房のナトリウム
***増加性/血管拡張性ポリペプチドの結合を表3で略
述する。
【0165】
【表3】
【0166】既述の通り、rANVP(126-150)は、ヨウ素化
され、そして上に列挙した代表的なペプチドの存在下で
培養平滑筋細胞で培養された。特異的な125I−ANVP(12
6-150)の結合を置換する能力を知るために、既述のペプ
シドのいろいろな濃度が試験された。最大限度の半分の
置換が観察された濃度を報告する。
され、そして上に列挙した代表的なペプチドの存在下で
培養平滑筋細胞で培養された。特異的な125I−ANVP(12
6-150)の結合を置換する能力を知るために、既述のペプ
シドのいろいろな濃度が試験された。最大限度の半分の
置換が観察された濃度を報告する。
【0167】これらのデータは、開示された実施例のう
ち[D-A1a142]rANVP(126-150)と、rANVP(126-150)と、そ
してhANVP(127-151)とが、血管壁細胞に対して最も良く
反応したことを証明する。
ち[D-A1a142]rANVP(126-150)と、rANVP(126-150)と、そ
してhANVP(127-151)とが、血管壁細胞に対して最も良く
反応したことを証明する。
【0168】血管平滑筋におけるANVPの作動薬的作用
は、特異レセプターとの結合に由来するだけでなく、環
化GMPの増加ともかかわっているので、同じ培養細胞を
用いて、環化GMPの蓄積に関して、ANVPsとその類似化合
物の効果が試験された。図21乃至22は、ANVPで媒介
された環化GMPの大きさが、培養された大動脈平滑筋と
内皮細胞において増大することを示す。図23及び図2
4において、大動脈平滑筋と内皮細胞における環化GMP
についてのANVPとその類似化合物の相対的な活性が示さ
れる。データは、投与量−反応の関係でプロットされて
いる(投与量の対数値vs環化GMPの増大増加量の%
値)。
は、特異レセプターとの結合に由来するだけでなく、環
化GMPの増加ともかかわっているので、同じ培養細胞を
用いて、環化GMPの蓄積に関して、ANVPsとその類似化合
物の効果が試験された。図21乃至22は、ANVPで媒介
された環化GMPの大きさが、培養された大動脈平滑筋と
内皮細胞において増大することを示す。図23及び図2
4において、大動脈平滑筋と内皮細胞における環化GMP
についてのANVPとその類似化合物の相対的な活性が示さ
れる。データは、投与量−反応の関係でプロットされて
いる(投与量の対数値vs環化GMPの増大増加量の%
値)。
【0169】更に3つのオーダーの大きさにわたる有効
性の分布が示される。両タイプの細胞における有効性の
等級順序は:[D-Ala142]rANVP(126-150)=[D-Ala131]rAN
VP(126-150)=rANVP(126-150)=rANVP(126-149)=hANVP(12
7-151)>rANVP(127-150)=その他のD-アミノ酸代替物
質。これらのデータによって、ウシの大動脈における、
これらのペプチドの血管拡張性効力が示される。このよ
うに、当該データは、あるD-アミノ酸の置換は効力を
増加させるが、他のものは効力を低下させることを示
す。更に、当該データは、カルボキシ末端のチロシン残
基を除去しても、血管の反応性にはほとんど影響がない
ことを示す。更に、当該データは、アミノ末端のアルギ
ニン残基が、反応性に対して最も大きな影響力を有する
旨の観察を裏付ける。
性の分布が示される。両タイプの細胞における有効性の
等級順序は:[D-Ala142]rANVP(126-150)=[D-Ala131]rAN
VP(126-150)=rANVP(126-150)=rANVP(126-149)=hANVP(12
7-151)>rANVP(127-150)=その他のD-アミノ酸代替物
質。これらのデータによって、ウシの大動脈における、
これらのペプチドの血管拡張性効力が示される。このよ
うに、当該データは、あるD-アミノ酸の置換は効力を
増加させるが、他のものは効力を低下させることを示
す。更に、当該データは、カルボキシ末端のチロシン残
基を除去しても、血管の反応性にはほとんど影響がない
ことを示す。更に、当該データは、アミノ末端のアルギ
ニン残基が、反応性に対して最も大きな影響力を有する
旨の観察を裏付ける。
【0170】2.生体内での効力検定 合成ANVP化合物のrANVP(126-149)と、rANVP(126-150)及
びhANVP(127-151)もまた同様に、健全なラットにおい
て、ナトリウム***増加性であることが見出だされた。
これらの化合物は、インアクチン(Inactin)で麻酔をか
けられたラットに対して、濃縮塊注射の方法(100mg/k
g、ラットの平均体重:399g)で投与され、当該ラットに
対して通常の生理食塩水が一定の割合:2.2ml/毎時で注
入された。その結果により健全なラットにおける、合成
の心房のナトリウム***増加性/血管拡張性ポリペプチ
ドのナトリウム***増加効果が表4に示された。ここで
各パラメーターの変化は、3つのコントロール期間(各
10分間)の平均値と最初の実験期間(最大反応値)との
間の差によって検定された。当該データは、平均値±SE
として示される。
びhANVP(127-151)もまた同様に、健全なラットにおい
て、ナトリウム***増加性であることが見出だされた。
これらの化合物は、インアクチン(Inactin)で麻酔をか
けられたラットに対して、濃縮塊注射の方法(100mg/k
g、ラットの平均体重:399g)で投与され、当該ラットに
対して通常の生理食塩水が一定の割合:2.2ml/毎時で注
入された。その結果により健全なラットにおける、合成
の心房のナトリウム***増加性/血管拡張性ポリペプチ
ドのナトリウム***増加効果が表4に示された。ここで
各パラメーターの変化は、3つのコントロール期間(各
10分間)の平均値と最初の実験期間(最大反応値)との
間の差によって検定された。当該データは、平均値±SE
として示される。
【0171】
【表4】
【0172】腎臓と血行に対する効果も又、測定され
た。当該測定は、化合物rANVP(126-149)の一定の割合の
注入(1μg/kg濃縮塊;その後、0.1μg/kg/分:継続時
間:1時間)を受けている麻酔をかけられたイヌにおい
て実施された。即時的効果が血圧と、GFRと、尿流量
と、電解質排率とにおいて認められ、当該効果は、注入
が継続している間、継続した。表4でこれらのパラメー
タに対して提示された“実験”データは、当該注入の期
間に得られた平均値である。麻酔をかけたイヌに置け
る、合成の心房のナトリウム***増加性/血管拡張性ポ
リペプチドの、血行と、腎臓と、代謝についての効果を
表5に示す。確証された利尿性およびナトリウム***増
加性(表5)に関連して、動脈の平均血圧(MAP)は、協
調的に、10-15%だけ低下し、一方、GFRは、25-35%だ
け上昇した。これらのパラメータの全ては回復期間(即
ち、注入期間の終了に続く期間)の間に、コントロール
・レベル(即ち、注入が行われる前のレベル)に戻っ
た。
た。当該測定は、化合物rANVP(126-149)の一定の割合の
注入(1μg/kg濃縮塊;その後、0.1μg/kg/分:継続時
間:1時間)を受けている麻酔をかけられたイヌにおい
て実施された。即時的効果が血圧と、GFRと、尿流量
と、電解質排率とにおいて認められ、当該効果は、注入
が継続している間、継続した。表4でこれらのパラメー
タに対して提示された“実験”データは、当該注入の期
間に得られた平均値である。麻酔をかけたイヌに置け
る、合成の心房のナトリウム***増加性/血管拡張性ポ
リペプチドの、血行と、腎臓と、代謝についての効果を
表5に示す。確証された利尿性およびナトリウム***増
加性(表5)に関連して、動脈の平均血圧(MAP)は、協
調的に、10-15%だけ低下し、一方、GFRは、25-35%だ
け上昇した。これらのパラメータの全ては回復期間(即
ち、注入期間の終了に続く期間)の間に、コントロール
・レベル(即ち、注入が行われる前のレベル)に戻っ
た。
【0173】
【表5】 ここで、MAPは動脈の平均圧(血圧);FEH2Oは分画の
水排出率;PRAは血漿レニン活性:PAは血漿アルドステ
ロンである。その他の略字の定義については、表1の脚
注を見よ。*P<0.05はコントロール期間の値と比較さ
れ;+P<0.05は回復期間の値と比較された。
水排出率;PRAは血漿レニン活性:PAは血漿アルドステ
ロンである。その他の略字の定義については、表1の脚
注を見よ。*P<0.05はコントロール期間の値と比較さ
れ;+P<0.05は回復期間の値と比較された。
【0174】かくして生成されたペプチドは、表5に示
される通り、血漿レニン活性(PRA)と血漿アルドステ
ロンの(PA)の双方を、かなり減少させた。追加の研究
によって、当該物質は、又、分離された副腎細胞を刺激
してアルドステロンを生成させるアンギオテンシンの働
きをも、抑えることが証明された。このように、ANVPs
は、幾つかのレベルにおいて、レニン−アンギオテンシ
ン系の作用を阻止することができる:(1)それらは、タ
ーゲット器官(血管や副腎)におけるアンギオテンシン
の直接作用に対抗し;そして(2)レニンの分泌を抑制し
て、血液中のアンギオテンシンの生成率を低下させる。
される通り、血漿レニン活性(PRA)と血漿アルドステ
ロンの(PA)の双方を、かなり減少させた。追加の研究
によって、当該物質は、又、分離された副腎細胞を刺激
してアルドステロンを生成させるアンギオテンシンの働
きをも、抑えることが証明された。このように、ANVPs
は、幾つかのレベルにおいて、レニン−アンギオテンシ
ン系の作用を阻止することができる:(1)それらは、タ
ーゲット器官(血管や副腎)におけるアンギオテンシン
の直接作用に対抗し;そして(2)レニンの分泌を抑制し
て、血液中のアンギオテンシンの生成率を低下させる。
【0175】上記データに基づけば、以下のことが明ら
かである:即ち、合成ANVPと組織から採取されたANVPの
両化合物は、同じ活性を有する(望ましくは、合成ANVP
化合物が酸化を可能にして二硫化物架橋の形成が促進さ
れた後に)。
かである:即ち、合成ANVPと組織から採取されたANVPの
両化合物は、同じ活性を有する(望ましくは、合成ANVP
化合物が酸化を可能にして二硫化物架橋の形成が促進さ
れた後に)。
【0176】上記の結果から、下記のことも明らかであ
る。即ち、主題の化合物を哺乳動物宿主において、有効
な血管緊張低下剤や、利尿剤や、ナトリウム***増加剤
として用いることができる。
る。即ち、主題の化合物を哺乳動物宿主において、有効
な血管緊張低下剤や、利尿剤や、ナトリウム***増加剤
として用いることができる。
【0177】IV. 心房のナトリウム尿***亢進性/血
管拡張性ポリペプチドに由来した組み換えDNAの発現 A.pro心房(proatrial)のナトリウム尿***亢進性/
血管拡張性ポリペプチドとその関連断片の、大腸菌にお
ける発現 以下の実施例において、大腸菌における、prorANVP(87-
152)と、prorANVP(25-152)と、prohANVP(26-151)および
prohANVP(102-151)の生成が説明される。更に、発現ベ
クターも説明される。これらは単なる例示に過ぎず、本
生成をそれのみに制限することを意図しているものでは
ないので、他のpre-proANVPsや、pre-proANVPや、又
は、ANVPの類似化合物も、同様の方法で発現させること
ができる。
管拡張性ポリペプチドに由来した組み換えDNAの発現 A.pro心房(proatrial)のナトリウム尿***亢進性/
血管拡張性ポリペプチドとその関連断片の、大腸菌にお
ける発現 以下の実施例において、大腸菌における、prorANVP(87-
152)と、prorANVP(25-152)と、prohANVP(26-151)および
prohANVP(102-151)の生成が説明される。更に、発現ベ
クターも説明される。これらは単なる例示に過ぎず、本
生成をそれのみに制限することを意図しているものでは
ないので、他のpre-proANVPsや、pre-proANVPや、又
は、ANVPの類似化合物も、同様の方法で発現させること
ができる。
【0178】1. 大腸菌発現ベクターの構成 a.PKT 52バクテリアの発現プラスミド i) trc プロモータ(promotr)の生成 プラスミドpEA300(アマン(Amman),E.ほか、Gene、25:1
67-178,1983)は、PvuIIとClaI(ニューイングランド、
バイオラボス社)で消化された。当該消化物は、上記マ
ニアチス((Maniatis),T.ほか、p.157-160)によって
記述された通り、0.8%のアガロースゲルにおいて電気
泳動にかけられた。ClaI部位近くのtrpプロモータの-3
5ヌクレオチド領域を含む大断片は、上記マニアチスほ
か(P167)によって記述された通り、UV-シャドウイング
(UV-shadowing)によって検出され、そしてマクサム((M
axam),A.とW.ギルバート(Gilbert)、Methods in Enzymo
logy、65:449-560(1980))によって記述された通り、37
℃でゲルから溶出された。当該大断片のClalサイトは、
上記マニアチスほか、p394)によって記述された通り、5
0MのdCTPで満たされ、そして残りの一本鎖5′のオーバ
ーハング(overhang)は、クローカー((Kroeker),W.ほ
か、Biochemistry、17:3236-3239(1978))によって記述
された通り、ヤエナリ(緑豆)のヌクレアーゼ(ファル
マシア(Pharmacia)P-Lバイオケミカル社)でもって消化
されることによって除去された。プラスミドpGL101(ラ
ウアー(Lauer),G.ほか、J. Mol. Appl. Genet.1:139-14
9(1981))は、既述の通り、PvuIIとHpaII(ニューイン
グランド、バイオラボズ社)で消化された。消化された
断片は、上記マニアチス,ほか、p.394)の方法で、5ユ
ニットのクレノウ断片(ベーリンガーマンハイム(Boeh
ringer-Mannheim)社、マンハイム、FRG)と、追加的な1C
i[32P]-dCTP(アメルシァム(Amersham)、イリノイ州、
シカゴ、800Ci/mM)とによって、37℃で、15分間にわた
って満たされた。その後、37℃で、30分間にわたってdC
TPとdGTPが、50Mまで添加された。かくして、ラベルさ
れ、ブラント末端断片は、12%のポリアクリル・アミド
ゲルにおいて、電気泳動法にかけられ、その後、ウエッ
ト(wet)ゲル・オートラジオグラフィーにかけられ、そ
して55の塩基対の、ブラント末端のPvuII−HpaII断片が
切断されて、既述の通り、ゲルから溶出された。2つの
分離された断片は、上記マニアチスほか(P.392)によ
って記述された通りに結合され、そして上記マニアチス
(p.250-251)によって記述された通り、大腸菌鎖RB791
(R.ブレント(Brent)とM.プタシン(Ptashne)、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 78:4204-4208,1981)を転換するために
用いられた。かくして生成されたプラスミドのpKK10-0
は、trcプロモータと称される変異したプロモーターを
含み、そして上記マニアチス(pp.366-367)によって記述
された通り、急速煮沸法によって分離された。pKK10-0
はEcoRI(ベセスダ(Bethesda)リサーチラボズ社)で消
化され、そして既述の通り大腸菌RB791を転換するため
に用いられた。このプラスミドであるPKK10-1は、既述
の通り分離され、そしてPvuIIでもって消化された。か
くしてPvuIIで消化されたプラスミドは、NcoIリンカー
(linker)(dACCATGGT、クリエイティブ・バイオモルキュ
ラーズ社、フォスターシティ、カリフォルニア)に結合
され、NcoIでもって消化され、そしてdATP、dCTP、dGT
PおよびdTTPで満たされ、そして既述の通り、リンカー
が有するPstIとHindIIIの部位に結合された[但し、当
該部位は、2つの相補的オリゴヌクレオチド(5′-dGCTG
CAGCCAAGCTTGG-3′及び5′-dCCAAGCTTGGCTGCAGC-3′)と
して、バイオサーチSAMI DNAシンセサイザー(バイオ
サーチ社)で合成された]。かくして結合された混合物
は、BamHIとHindIII(ニューイングランド、バイオラ
ボズ社)で消化され、5%ポリアクリル・アミド・ゲル
において、電気泳動にかけられ、そして既述の通り、Ba
mHI−HindIII小断片が溶出された。当該小断片は、trc
プロモータを含有する。
67-178,1983)は、PvuIIとClaI(ニューイングランド、
バイオラボス社)で消化された。当該消化物は、上記マ
ニアチス((Maniatis),T.ほか、p.157-160)によって
記述された通り、0.8%のアガロースゲルにおいて電気
泳動にかけられた。ClaI部位近くのtrpプロモータの-3
5ヌクレオチド領域を含む大断片は、上記マニアチスほ
か(P167)によって記述された通り、UV-シャドウイング
(UV-shadowing)によって検出され、そしてマクサム((M
axam),A.とW.ギルバート(Gilbert)、Methods in Enzymo
logy、65:449-560(1980))によって記述された通り、37
℃でゲルから溶出された。当該大断片のClalサイトは、
上記マニアチスほか、p394)によって記述された通り、5
0MのdCTPで満たされ、そして残りの一本鎖5′のオーバ
ーハング(overhang)は、クローカー((Kroeker),W.ほ
か、Biochemistry、17:3236-3239(1978))によって記述
された通り、ヤエナリ(緑豆)のヌクレアーゼ(ファル
マシア(Pharmacia)P-Lバイオケミカル社)でもって消化
されることによって除去された。プラスミドpGL101(ラ
ウアー(Lauer),G.ほか、J. Mol. Appl. Genet.1:139-14
9(1981))は、既述の通り、PvuIIとHpaII(ニューイン
グランド、バイオラボズ社)で消化された。消化された
断片は、上記マニアチス,ほか、p.394)の方法で、5ユ
ニットのクレノウ断片(ベーリンガーマンハイム(Boeh
ringer-Mannheim)社、マンハイム、FRG)と、追加的な1C
i[32P]-dCTP(アメルシァム(Amersham)、イリノイ州、
シカゴ、800Ci/mM)とによって、37℃で、15分間にわた
って満たされた。その後、37℃で、30分間にわたってdC
TPとdGTPが、50Mまで添加された。かくして、ラベルさ
れ、ブラント末端断片は、12%のポリアクリル・アミド
ゲルにおいて、電気泳動法にかけられ、その後、ウエッ
ト(wet)ゲル・オートラジオグラフィーにかけられ、そ
して55の塩基対の、ブラント末端のPvuII−HpaII断片が
切断されて、既述の通り、ゲルから溶出された。2つの
分離された断片は、上記マニアチスほか(P.392)によ
って記述された通りに結合され、そして上記マニアチス
(p.250-251)によって記述された通り、大腸菌鎖RB791
(R.ブレント(Brent)とM.プタシン(Ptashne)、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 78:4204-4208,1981)を転換するために
用いられた。かくして生成されたプラスミドのpKK10-0
は、trcプロモータと称される変異したプロモーターを
含み、そして上記マニアチス(pp.366-367)によって記述
された通り、急速煮沸法によって分離された。pKK10-0
はEcoRI(ベセスダ(Bethesda)リサーチラボズ社)で消
化され、そして既述の通り大腸菌RB791を転換するため
に用いられた。このプラスミドであるPKK10-1は、既述
の通り分離され、そしてPvuIIでもって消化された。か
くしてPvuIIで消化されたプラスミドは、NcoIリンカー
(linker)(dACCATGGT、クリエイティブ・バイオモルキュ
ラーズ社、フォスターシティ、カリフォルニア)に結合
され、NcoIでもって消化され、そしてdATP、dCTP、dGT
PおよびdTTPで満たされ、そして既述の通り、リンカー
が有するPstIとHindIIIの部位に結合された[但し、当
該部位は、2つの相補的オリゴヌクレオチド(5′-dGCTG
CAGCCAAGCTTGG-3′及び5′-dCCAAGCTTGGCTGCAGC-3′)と
して、バイオサーチSAMI DNAシンセサイザー(バイオ
サーチ社)で合成された]。かくして結合された混合物
は、BamHIとHindIII(ニューイングランド、バイオラ
ボズ社)で消化され、5%ポリアクリル・アミド・ゲル
において、電気泳動にかけられ、そして既述の通り、Ba
mHI−HindIII小断片が溶出された。当該小断片は、trc
プロモータを含有する。
【0179】ii) trcプロモーター・プラスミドである
PKT 52の構築 PKK10-2(ブロシウス(Brosius), J.、Gene、27:161-17
2,1984)は、BamHIとHindIIIとで消化された。当該大断
片は、0.8%アガロースゲルから分離されて既述の通りt
rcプロモーターに結合された。当該結合物は、大腸菌RB
791を転換するために用いられ、そして新たなプラスミ
ドであるPKK233-1が既述の通り溶出された。PKK233-1
は、上記マニアチス(p.381)に従って、PvuIでもって完
全に消化され、BglIでもって部分的に消化された。こ
の時、pUC8(ビエイラ(Vieira)、J.とJ.メッシング(Mes
sing)、Gene、19、既述)は、PvuIとBglIとでもって
消化され、そしてアンピシリン抵抗遺伝子(もはやPst
I部位を含んでいない)からの360塩基対のPvuI−Bgl
I断片が、5%ポリアクリル・アミドゲルから溶出され
た。この断片は、PvuI−Bg1Iで部分的に消化されたpK
K233-1の混合液と混合され、結合され、そして大腸菌RB
791を転換するために用いられた。かくして得られた転
換物は、PstI部位のみを出現させるために用いるため
にふるい分けられ(screened)、そしてEcoRI−PstI消
化作用によってチェックされ、それによって、残りのPs
tI部位がtrcプロモーターに隣接させられることにより
プラスミドpKK233-2が生成された。このプラスミドpKK2
33-2はEcoRIとPvuIIとで消化され、dATPとTTPで満たさ
れ、結合され、そして大腸菌RB791に転換された。かく
して生成されたベクターがpKT52である(図25)。
PKT 52の構築 PKK10-2(ブロシウス(Brosius), J.、Gene、27:161-17
2,1984)は、BamHIとHindIIIとで消化された。当該大断
片は、0.8%アガロースゲルから分離されて既述の通りt
rcプロモーターに結合された。当該結合物は、大腸菌RB
791を転換するために用いられ、そして新たなプラスミ
ドであるPKK233-1が既述の通り溶出された。PKK233-1
は、上記マニアチス(p.381)に従って、PvuIでもって完
全に消化され、BglIでもって部分的に消化された。こ
の時、pUC8(ビエイラ(Vieira)、J.とJ.メッシング(Mes
sing)、Gene、19、既述)は、PvuIとBglIとでもって
消化され、そしてアンピシリン抵抗遺伝子(もはやPst
I部位を含んでいない)からの360塩基対のPvuI−Bgl
I断片が、5%ポリアクリル・アミドゲルから溶出され
た。この断片は、PvuI−Bg1Iで部分的に消化されたpK
K233-1の混合液と混合され、結合され、そして大腸菌RB
791を転換するために用いられた。かくして得られた転
換物は、PstI部位のみを出現させるために用いるため
にふるい分けられ(screened)、そしてEcoRI−PstI消
化作用によってチェックされ、それによって、残りのPs
tI部位がtrcプロモーターに隣接させられることにより
プラスミドpKK233-2が生成された。このプラスミドpKK2
33-2はEcoRIとPvuIIとで消化され、dATPとTTPで満たさ
れ、結合され、そして大腸菌RB791に転換された。かく
して生成されたベクターがpKT52である(図25)。
【0180】b.pTrp-233バクテリアの発現プラスミド
の構築 i) 合成トリプトファンオペロンプロモーターおよびオ
ペレーター調節配列の構築 図29に示される10個のオリゴデオキシヌクレオチド
は、既述の通り合成され、そして精製された。1番目と1
0番目を除く500ピコモル(pmole)の各オリゴデオキシヌ
クレオチドは、個々に、20μlの溶液(60mMのTris-C
1;pH 8;15mMのDTT;10mMのMgC12:20μciの[32P]γ-A
TP;および20ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ(P/L
バイオケミカルズ)中で、37℃で30分間にわたって酸化
された。次いで、10μlの溶液(60mMのTris-HC1;pH
8;15mMのDTT;10mMのMgCl2;1.5mMのATPおよび追加的
な20ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ)が加えら
れ、その後、更に30分間にわたって、37℃で培養が行わ
れた。この培養に続いて、サンプルは、100℃で5分間、
培養された。500ピコモルの1番と10番のオリゴヌクレオ
チドは、ATPなしで、上記緩衝液中で、30μlまで希釈
された。
の構築 i) 合成トリプトファンオペロンプロモーターおよびオ
ペレーター調節配列の構築 図29に示される10個のオリゴデオキシヌクレオチド
は、既述の通り合成され、そして精製された。1番目と1
0番目を除く500ピコモル(pmole)の各オリゴデオキシヌ
クレオチドは、個々に、20μlの溶液(60mMのTris-C
1;pH 8;15mMのDTT;10mMのMgC12:20μciの[32P]γ-A
TP;および20ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ(P/L
バイオケミカルズ)中で、37℃で30分間にわたって酸化
された。次いで、10μlの溶液(60mMのTris-HC1;pH
8;15mMのDTT;10mMのMgCl2;1.5mMのATPおよび追加的
な20ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ)が加えら
れ、その後、更に30分間にわたって、37℃で培養が行わ
れた。この培養に続いて、サンプルは、100℃で5分間、
培養された。500ピコモルの1番と10番のオリゴヌクレオ
チドは、ATPなしで、上記緩衝液中で、30μlまで希釈
された。
【0181】二重基準対(double standard pair:即
ち、図29における、オリゴデオキシヌクレオチドの1
と2;3と4等の対)を構成する各々の16.7ピコモルのオ
リゴデオキシヌクレオチドは、混合され、そして90℃で
2分間、培養され、その後、室温までゆっくりと冷却さ
れた。各対は、次いで、構成的に他者と組み合わされ、
そしてフェノール/クロロホルムで抽出され、次いでエ
タノールで沈殿された。当該オリゴデオキシヌクレオチ
ド対は、30μlの溶液(5mMのTris-HCl;pH 8;10mMのMgC
l2;20mMのDTT)中で再構築され、10分間にわたって50℃
に加熱され、次いで室温まで冷却され、その後、0.5mM
の最終濃度に対してATPが添加され、次いで800ユニット
のT4 DNAリガーゼが添加され、そして12-16時間にわた
って12.5℃で培養された。
ち、図29における、オリゴデオキシヌクレオチドの1
と2;3と4等の対)を構成する各々の16.7ピコモルのオ
リゴデオキシヌクレオチドは、混合され、そして90℃で
2分間、培養され、その後、室温までゆっくりと冷却さ
れた。各対は、次いで、構成的に他者と組み合わされ、
そしてフェノール/クロロホルムで抽出され、次いでエ
タノールで沈殿された。当該オリゴデオキシヌクレオチ
ド対は、30μlの溶液(5mMのTris-HCl;pH 8;10mMのMgC
l2;20mMのDTT)中で再構築され、10分間にわたって50℃
に加熱され、次いで室温まで冷却され、その後、0.5mM
の最終濃度に対してATPが添加され、次いで800ユニット
のT4 DNAリガーゼが添加され、そして12-16時間にわた
って12.5℃で培養された。
【0182】かくして結合された混合物は、フェノール
/クロロホルムで抽出され、そしてDNAがフェノールで
沈殿された。かくして乾燥されたDNAは、30μlの当該溶
液中で再構築され、そしてEcoRIとPstIとにより35℃
で1時間の間、消化された。当該混合物は、フェノール
/クロロホルムで抽出され、そしてエタノールで沈殿さ
せられ、その後、既述の通り、8%ポリアクリルアミド
ゲルにおける電気泳動法によって、種々の二重鎖DNA分
節に分離された。DNAの断片は、ウェット・ゲル・オー
トラジオグラフィーによって視覚化され、そして長さで
約100bpに対応するバンド(band)が切り出され、そして
既述の通り、一晩溶出された。切除された合成DNAの断
片は、プラスミドM13-mp8とM13-mp9(上記のメッシン
グ,J.とビエリア,J.)とに結合され、同様にEcoRIとPs
tIにより消化され、そして、ジデオキシヌクレオチド
の配列の分析(上記のサンガーほか)に回されて、図2
5に示される設計配列通りかどうかが確認される。図2
5に示される配列には、トリプトファンオペロンリーダ
ーペプチドのリボソーム結び付き領域(図25における
S.D.領域)と共に、トリプトファンオペロン(trp)(図
25における−35と−10領域)のプロモーターとオペレ
ーター領域を含む。図25に示される配列に類似する配
列は、大腸菌内における異種タンパク質の発現に有用で
あることが見出されている(ハレウェル(Hallewell,R.
A.とエムテイジ(Emtage),S.、Gene、9:27-47(1980)、
イケハラ、M.ほか、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:5
956-5960(1984))。
/クロロホルムで抽出され、そしてDNAがフェノールで
沈殿された。かくして乾燥されたDNAは、30μlの当該溶
液中で再構築され、そしてEcoRIとPstIとにより35℃
で1時間の間、消化された。当該混合物は、フェノール
/クロロホルムで抽出され、そしてエタノールで沈殿さ
せられ、その後、既述の通り、8%ポリアクリルアミド
ゲルにおける電気泳動法によって、種々の二重鎖DNA分
節に分離された。DNAの断片は、ウェット・ゲル・オー
トラジオグラフィーによって視覚化され、そして長さで
約100bpに対応するバンド(band)が切り出され、そして
既述の通り、一晩溶出された。切除された合成DNAの断
片は、プラスミドM13-mp8とM13-mp9(上記のメッシン
グ,J.とビエリア,J.)とに結合され、同様にEcoRIとPs
tIにより消化され、そして、ジデオキシヌクレオチド
の配列の分析(上記のサンガーほか)に回されて、図2
5に示される設計配列通りかどうかが確認される。図2
5に示される配列には、トリプトファンオペロンリーダ
ーペプチドのリボソーム結び付き領域(図25における
S.D.領域)と共に、トリプトファンオペロン(trp)(図
25における−35と−10領域)のプロモーターとオペレ
ーター領域を含む。図25に示される配列に類似する配
列は、大腸菌内における異種タンパク質の発現に有用で
あることが見出されている(ハレウェル(Hallewell,R.
A.とエムテイジ(Emtage),S.、Gene、9:27-47(1980)、
イケハラ、M.ほか、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:5
956-5960(1984))。
【0183】ii) プラスミドpTrp-233を含む合成trpプ
ロモーター/オペレーターの構築 プラスミドPKK233-2(セクションIV.A.1.a.ii.を見よ)
は、NdeIで完全に消化され、その後、自己の末端を、
上記マニアチス(p.394)の方法によって、5ユニットの
大腸菌ポリメラーゼIのクレナウ(Klenow)断片(ベーリ
ンガー−マンハイム社)で満たされ、そして5μMまで
dATPと、dCTPと、dGTPおよびTTPとが加えられた。そし
て、これは、25℃で、20分間、培養された。フェノール
/クロロホルムによる抽出操作とエタノールによる沈殿
操作に続いて、DNA(NdeIにより消化済み)は、結合さ
れ、そして大腸菌に転換された(上記ナカムラ、K.ほ
か)。この結果、NdeI部位を欠いたプラスミドが生成
された。当該プラスミドは、pKK-233-2-Ndeと表示され
た。
ロモーター/オペレーターの構築 プラスミドPKK233-2(セクションIV.A.1.a.ii.を見よ)
は、NdeIで完全に消化され、その後、自己の末端を、
上記マニアチス(p.394)の方法によって、5ユニットの
大腸菌ポリメラーゼIのクレナウ(Klenow)断片(ベーリ
ンガー−マンハイム社)で満たされ、そして5μMまで
dATPと、dCTPと、dGTPおよびTTPとが加えられた。そし
て、これは、25℃で、20分間、培養された。フェノール
/クロロホルムによる抽出操作とエタノールによる沈殿
操作に続いて、DNA(NdeIにより消化済み)は、結合さ
れ、そして大腸菌に転換された(上記ナカムラ、K.ほ
か)。この結果、NdeI部位を欠いたプラスミドが生成
された。当該プラスミドは、pKK-233-2-Ndeと表示され
た。
【0184】20ナノグラムのプラスミドpKK-233-2-Nde
は、EcoRIとPstIとで完全に消化され、その後、上記
のマニアチス(pp.133-134)に従って、子ウシの腸管を用
いたホスファターゼ処理(ベーリンガーマンハイム社)
を受けた。上述の合成trpプロモーター/オペレーター
配列は、自己の凝集性の5′-EcoRIと3′-PstIの末端
を有し、50ナノグラムの当該配列が、EcoRI−PstIで
消化された10ナノグラムのpKK-233-2-Ndeと混合され、
そして既述の通り、T4-DNA-リガーゼで結合され、その
後、大腸菌JA221 1PP-/I1 lac I9に転換された。かく
して得られた転換物は、プラスミドDNAを取り出すため
にふるい分けられた。当該プラスミドDNAは、100bp Eco
RI−PstI合成trpプロモーター/オペレーターを含
み、当該プロモーター/オペレーターは、分離されて図
30においてpTRP-233として表示された。
は、EcoRIとPstIとで完全に消化され、その後、上記
のマニアチス(pp.133-134)に従って、子ウシの腸管を用
いたホスファターゼ処理(ベーリンガーマンハイム社)
を受けた。上述の合成trpプロモーター/オペレーター
配列は、自己の凝集性の5′-EcoRIと3′-PstIの末端
を有し、50ナノグラムの当該配列が、EcoRI−PstIで
消化された10ナノグラムのpKK-233-2-Ndeと混合され、
そして既述の通り、T4-DNA-リガーゼで結合され、その
後、大腸菌JA221 1PP-/I1 lac I9に転換された。かく
して得られた転換物は、プラスミドDNAを取り出すため
にふるい分けられた。当該プラスミドDNAは、100bp Eco
RI−PstI合成trpプロモーター/オペレーターを含
み、当該プロモーター/オペレーターは、分離されて図
30においてpTRP-233として表示された。
【0185】2.ラットのpro心房性ナトリウム尿***
亢進性/血管拡張性ポリペプチドをコードする、クロー
ン化されたcDNAの発現 a)プラスミドpRNF-6852の構築 プラスミドpNFl(上記)は、HincIIで完全に消化され、
その後、フェノール/クロロホルムで抽出され、そして
エタノールで沈殿させられた。NcoIデカマー・リンカ
ー(decamer linker:dAGCCATGGCT)は、SAM I DNAシンセ
サイザー(バイオサーチ社)を用いて合成され、既述の
通り、予備的(preparative)ゲル電気泳動法によって精
製され、そして自己の5′末端で、上記マニアチス(p.39
6)の方法を用いて、T4-ポリヌクレオチドキナーゼ(P-L
バイオケミカルズ社)でリン酸化された。かくしてリン
酸化されたリンカーは、ブラント末端結合によって、T4
-DNAリガーゼを介して、12.5℃で、16時間にわたって、
(HincIIで消化された)pNFIに添加された。
亢進性/血管拡張性ポリペプチドをコードする、クロー
ン化されたcDNAの発現 a)プラスミドpRNF-6852の構築 プラスミドpNFl(上記)は、HincIIで完全に消化され、
その後、フェノール/クロロホルムで抽出され、そして
エタノールで沈殿させられた。NcoIデカマー・リンカ
ー(decamer linker:dAGCCATGGCT)は、SAM I DNAシンセ
サイザー(バイオサーチ社)を用いて合成され、既述の
通り、予備的(preparative)ゲル電気泳動法によって精
製され、そして自己の5′末端で、上記マニアチス(p.39
6)の方法を用いて、T4-ポリヌクレオチドキナーゼ(P-L
バイオケミカルズ社)でリン酸化された。かくしてリン
酸化されたリンカーは、ブラント末端結合によって、T4
-DNAリガーゼを介して、12.5℃で、16時間にわたって、
(HincIIで消化された)pNFIに添加された。
【0186】65℃で6分間の培養に続いて、かくして結
合された混合物は、100mMの塩化ナトリウムを含むよう
に調整され、そして、NcoIとPstIと共に、37℃で2時
間にわたって培養され、その後、既述の通り、5%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけられた。かくして分
離されたDNAは、ウェットゲルオートラジオグラフィー
によって視覚化され、その後、316bpバンド(band)の切
除が行われ、溶出が行われ、そして既述の通り(上記マ
クサム、AとW.ギルバート)、エタノールによる沈殿が
行われた。
合された混合物は、100mMの塩化ナトリウムを含むよう
に調整され、そして、NcoIとPstIと共に、37℃で2時
間にわたって培養され、その後、既述の通り、5%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけられた。かくして分
離されたDNAは、ウェットゲルオートラジオグラフィー
によって視覚化され、その後、316bpバンド(band)の切
除が行われ、溶出が行われ、そして既述の通り(上記マ
クサム、AとW.ギルバート)、エタノールによる沈殿が
行われた。
【0187】上記マニアチスほか(pp.133-134)に従っ
て、発現プラスミドpKT52は、NcoIとPstIとで完全に
消化され、その後、子ウシの腸管のフォスファターゼ処
理(ベーリンガー・マンハイム)を受けた。かくして精
製された、そしてpNFlから誘導されたところの316bpNco
I−PstI断片は、NcoI−PstIで消化されたpKT 52と
混合され、そして25℃で30分間にわたってT4-DNA-リガ
ーゼと共に培養され、そして12.5℃で4時間、保持され
た。大腸菌株JA221(1pp-, hsd M+,trpE5,leuB6,lacY,r
ecA1/F′,lacIq,lacZ+,proA+,proB+、ナカムラ、K. ほ
か、J. Mol. Appl. Genet. 1:289-299(1982))は、塩化
カルシウム法による転換が可能なように処理され、そし
て上記マニアチスほか(pp.250-251)に記述された通
り、結合混合物で転換された。かくして生成されたアン
ピシリン抵抗コロニー(colonies)は、1mlの溶液中で夜
通し、生育され、その中からプラスミドDNAが、上記マ
ニアチスほか(pp.368-369)に記述された通り、アルカ
リ性溶解菌法によって調製された。かくして調製された
プラスミドは、適当な挿入物を調製するために、最初に
HindIIIで、次いでKpnIまたはNcoIで消化されること
によりふるい分けられた。各々、約120bpおよび320bpの
HindIII-KpnIおよびHindIII-NcoIの双方の断片を有す
るプラスミドが選択され、そしてpRNF-6852として表示
された(図26)。
て、発現プラスミドpKT52は、NcoIとPstIとで完全に
消化され、その後、子ウシの腸管のフォスファターゼ処
理(ベーリンガー・マンハイム)を受けた。かくして精
製された、そしてpNFlから誘導されたところの316bpNco
I−PstI断片は、NcoI−PstIで消化されたpKT 52と
混合され、そして25℃で30分間にわたってT4-DNA-リガ
ーゼと共に培養され、そして12.5℃で4時間、保持され
た。大腸菌株JA221(1pp-, hsd M+,trpE5,leuB6,lacY,r
ecA1/F′,lacIq,lacZ+,proA+,proB+、ナカムラ、K. ほ
か、J. Mol. Appl. Genet. 1:289-299(1982))は、塩化
カルシウム法による転換が可能なように処理され、そし
て上記マニアチスほか(pp.250-251)に記述された通
り、結合混合物で転換された。かくして生成されたアン
ピシリン抵抗コロニー(colonies)は、1mlの溶液中で夜
通し、生育され、その中からプラスミドDNAが、上記マ
ニアチスほか(pp.368-369)に記述された通り、アルカ
リ性溶解菌法によって調製された。かくして調製された
プラスミドは、適当な挿入物を調製するために、最初に
HindIIIで、次いでKpnIまたはNcoIで消化されること
によりふるい分けられた。各々、約120bpおよび320bpの
HindIII-KpnIおよびHindIII-NcoIの双方の断片を有す
るプラスミドが選択され、そしてpRNF-6852として表示
された(図26)。
【0188】pKT-52におけるクローンされたproANVP配
列の読取り枠が適当であることを確認するために、pRNF
−6852がEcoRIとPstIとで消化され、その後、既述の
通り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による約509b
pのバンドの精製が行われた。当該EcoRI−PstI断片
は、プラスミドM13mp8とM13mp9(上記メッシング(Mes
sing),J.とJ.ビエリア(Vieria))とに結合され、そして
ジデオキシヌクレオチド配列分析操作(上記サンガー(S
anger)ほか)に回された。
列の読取り枠が適当であることを確認するために、pRNF
−6852がEcoRIとPstIとで消化され、その後、既述の
通り、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による約509b
pのバンドの精製が行われた。当該EcoRI−PstI断片
は、プラスミドM13mp8とM13mp9(上記メッシング(Mes
sing),J.とJ.ビエリア(Vieria))とに結合され、そして
ジデオキシヌクレオチド配列分析操作(上記サンガー(S
anger)ほか)に回された。
【0189】図26に示される通り、プラスミドpRNF-6
852が消化されて、87から152までのアミノ酸で構成され
るタンパク質をコードするラットのproANVP cDNAの断片
が発現させられた。
852が消化されて、87から152までのアミノ酸で構成され
るタンパク質をコードするラットのproANVP cDNAの断片
が発現させられた。
【0190】発現ベクターpKT52中へのproANVP cDNAの
クローニングを可能にするために合成デカマー(decame
r)NcoIリンカー(linker)が用いられたので、発現され
た断片の最初の2つのアミノ末端のアミノ酸はNH2-Met-
Alaであり、これにラットのproANVP前駆物質の87から15
2までのアミノ酸が続く(図26)。
クローニングを可能にするために合成デカマー(decame
r)NcoIリンカー(linker)が用いられたので、発現され
た断片の最初の2つのアミノ末端のアミノ酸はNH2-Met-
Alaであり、これにラットのproANVP前駆物質の87から15
2までのアミノ酸が続く(図26)。
【0191】b) プラスミドpRNF-6852の発現 pRNF-6852またはpKT52をふくむ大腸菌JA221 1pp/F′lac
Iqを、37℃で、M9の最小限の塩を含む培地(ブドウ糖
が0.4%;チアミンが2μg/ml;硫酸マグネシウム(MgSO4
・7H2O)が200μg/ml;ロイシンが20μg/ml;トリプトフ
ァンが20μg/ml;アンピシリンが100μg/ml;そしてイ
ソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシドが
2mM)において増殖された。細胞密度が約2.5×108 cell
s/mlになった時に、L−[35s]−システイン(100μCi/
ml培養(アメルシァム(Amersham)社)、イリノイ州、シ
カゴ、930ci/ミリモル(mmole))が添加された。30秒間
の培養に続いて、1mlの培養株が除去され、そして0.34m
lの、氷冷却された20%トリクロル酢酸に添加され、次
いで1.5mlのエペンドルフ(Eppendorf)遠心機管内で渦状
に撹拌され、その後、0℃で30分にわたって静置され
た。かくして得られた混合液は、次いでエペンドルフ遠
心分離機を用いて、15,000×gで15分間、4℃で遠心分離
された。かくして得られた上澄み液は捨てられ、そして
残ったペレット(pellet)が1mlの氷冷却アセトンでもっ
て洗浄され、その後、また遠心分離機にかけられた当該
ペレットは、真空中で乾燥させられた。
Iqを、37℃で、M9の最小限の塩を含む培地(ブドウ糖
が0.4%;チアミンが2μg/ml;硫酸マグネシウム(MgSO4
・7H2O)が200μg/ml;ロイシンが20μg/ml;トリプトフ
ァンが20μg/ml;アンピシリンが100μg/ml;そしてイ
ソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシドが
2mM)において増殖された。細胞密度が約2.5×108 cell
s/mlになった時に、L−[35s]−システイン(100μCi/
ml培養(アメルシァム(Amersham)社)、イリノイ州、シ
カゴ、930ci/ミリモル(mmole))が添加された。30秒間
の培養に続いて、1mlの培養株が除去され、そして0.34m
lの、氷冷却された20%トリクロル酢酸に添加され、次
いで1.5mlのエペンドルフ(Eppendorf)遠心機管内で渦状
に撹拌され、その後、0℃で30分にわたって静置され
た。かくして得られた混合液は、次いでエペンドルフ遠
心分離機を用いて、15,000×gで15分間、4℃で遠心分離
された。かくして得られた上澄み液は捨てられ、そして
残ったペレット(pellet)が1mlの氷冷却アセトンでもっ
て洗浄され、その後、また遠心分離機にかけられた当該
ペレットは、真空中で乾燥させられた。
【0192】Ig G分画は、1mlの無免疫の血清または抗
血清(化学合成されたラットのANVPペプチドに対して生
じたもの)から、プロテインA−セファロース(登録商
標)4B(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社、(pha
rmacia Fine Chemicals)、ウプスラ、スウェーデン)ク
ロマトグラフィーを、製造者の指示書に従って用いるこ
とによって調製され、そして総量で4mlだけ収集され
た。
血清(化学合成されたラットのANVPペプチドに対して生
じたもの)から、プロテインA−セファロース(登録商
標)4B(ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社、(pha
rmacia Fine Chemicals)、ウプスラ、スウェーデン)ク
ロマトグラフィーを、製造者の指示書に従って用いるこ
とによって調製され、そして総量で4mlだけ収集され
た。
【0193】乾燥された当該TCAペレットは、40μlの
溶液(50mMのTris-HCl;pH8.0;1mMのEDTA;および1%
のSDS)中に再懸濁され、そして100℃で5分間培養され
た。10μlのこの混合液(総バクテリアたんぱく質を示
す)は、溶液(諸元:20mMのTris-HCl;pH6.8;20%の
グリセリン;2%のSDS;2%の2-メルカプトエタノー
ル;および0.1%のブロムフェノールブルー(bromphenol
blue)で、20μlにまで希釈され、その後、100℃で5分
間にわたり培養された。当該混合液の残りの30μl(免
疫吸収(immunoabsorption)に用いられる)は、溶液(50
mMのTris-HCl;pH8.0;1mMのEDTA;0.15Mの塩化ナトリ
ウム;および2%のTriton-X 100)で、1mlにまで希釈さ
れ、その後、40μlの精製されたIg Gが添加された:但
し、当該Ig Gは、無免疫血清またはラットのANVPに対し
て生じた抗血清のいずれか一方から誘導された。かくし
て得られた混合液は、室温で30分間、培養され、次いで
0℃で一晩中培養された。
溶液(50mMのTris-HCl;pH8.0;1mMのEDTA;および1%
のSDS)中に再懸濁され、そして100℃で5分間培養され
た。10μlのこの混合液(総バクテリアたんぱく質を示
す)は、溶液(諸元:20mMのTris-HCl;pH6.8;20%の
グリセリン;2%のSDS;2%の2-メルカプトエタノー
ル;および0.1%のブロムフェノールブルー(bromphenol
blue)で、20μlにまで希釈され、その後、100℃で5分
間にわたり培養された。当該混合液の残りの30μl(免
疫吸収(immunoabsorption)に用いられる)は、溶液(50
mMのTris-HCl;pH8.0;1mMのEDTA;0.15Mの塩化ナトリ
ウム;および2%のTriton-X 100)で、1mlにまで希釈さ
れ、その後、40μlの精製されたIg Gが添加された:但
し、当該Ig Gは、無免疫血清またはラットのANVPに対し
て生じた抗血清のいずれか一方から誘導された。かくし
て得られた混合液は、室温で30分間、培養され、次いで
0℃で一晩中培養された。
【0194】当該一晩中の培養に引き続いて、当該混合
液に、50μlのプロテインA−セファロース(登録商
標)4Bが添加された。[但し、当該プロテインA−セフ
ァローゼ4Bは、溶液(50mMのTris-HCl;pH7.5;5mMのED
TA;0.15Mの塩化ナトリウム;0.5%のノンイデット(No
nidet)P-40(NP-40);および1mg/mlのオボアルブミン)
中の10%懸濁液である]。かくして得られた混合液は、
次いでゆっくりと撹拌されながら、4℃で1時間にわたり
培養された。次いで、4℃で遠心分離機にかけられ、そ
の結果生じた上澄み液が捨てられ、そしてプロテインA
−セファロース(登録商標)ペレットが、0.5mlの溶液
(50mMのTris-HCl;pH7.5;5mMのEDTA;0.5Mの塩化ナ
トリウム;0.5%のNP-40;および1mg/mlのオボアルブミ
ン)中に再懸濁された。当該ペレットは、強力な渦流に
よって洗浄され、その後、遠心分離機にかけられ、そし
てその結果生じた上澄み液が除去された。
液に、50μlのプロテインA−セファロース(登録商
標)4Bが添加された。[但し、当該プロテインA−セフ
ァローゼ4Bは、溶液(50mMのTris-HCl;pH7.5;5mMのED
TA;0.15Mの塩化ナトリウム;0.5%のノンイデット(No
nidet)P-40(NP-40);および1mg/mlのオボアルブミン)
中の10%懸濁液である]。かくして得られた混合液は、
次いでゆっくりと撹拌されながら、4℃で1時間にわたり
培養された。次いで、4℃で遠心分離機にかけられ、そ
の結果生じた上澄み液が捨てられ、そしてプロテインA
−セファロース(登録商標)ペレットが、0.5mlの溶液
(50mMのTris-HCl;pH7.5;5mMのEDTA;0.5Mの塩化ナ
トリウム;0.5%のNP-40;および1mg/mlのオボアルブミ
ン)中に再懸濁された。当該ペレットは、強力な渦流に
よって洗浄され、その後、遠心分離機にかけられ、そし
てその結果生じた上澄み液が除去された。
【0195】この手順は、更に4回、追加して繰返され
た。プロテインA-セファロース(登録商標)ペレット
は、更に2回、追加して洗浄され、当該洗浄は、溶液
(50mMのTris-HCl;pH7.5;5mMのEDTA;0.15Mの塩化ナトリ
ウム;及び0.5%のNP-40)を用いて行われ、その後、更
に1回、溶液(10mMのTris-HCl;pH7.5)を用いた洗浄が
行われ、そして真空乾燥が行われた。同真空乾燥に引き
続いて、当該ペレットは、60μlの溶液(10mMのTris-H
Cl;pH6.8;1%のグリセリン;1%のSDS;1%の2-メル
カプトエタノール;及び0.05%のブロムフェノールブル
ー)中に再懸濁され、その後、100℃で10分間、培養さ
れた。
た。プロテインA-セファロース(登録商標)ペレット
は、更に2回、追加して洗浄され、当該洗浄は、溶液
(50mMのTris-HCl;pH7.5;5mMのEDTA;0.15Mの塩化ナトリ
ウム;及び0.5%のNP-40)を用いて行われ、その後、更
に1回、溶液(10mMのTris-HCl;pH7.5)を用いた洗浄が
行われ、そして真空乾燥が行われた。同真空乾燥に引き
続いて、当該ペレットは、60μlの溶液(10mMのTris-H
Cl;pH6.8;1%のグリセリン;1%のSDS;1%の2-メル
カプトエタノール;及び0.05%のブロムフェノールブル
ー)中に再懸濁され、その後、100℃で10分間、培養さ
れた。
【0196】アンダーソン((Anderson), C.W.他、J. V
irol.12:241-252(1973))によって記述された通り、免
疫吸収済み(immunoabsorbed)サンプル全体が、130×200
×0.8mmポリアクリルアミドスラブ(slab)ゲル(17.5%
のアクリルアミド;0.0735%のbis-アクリルアミド;0.33
5MのTris-HCl;pH8.7;0.04Mの塩化ナトリウム;0.1%のSD
S;0.05%の過硫酸アンモニウム;及び0.05%のTEMED)に
おいて、断続的なSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法で処理された。当該処理において、ブロフェノールブ
ルー染料がゲルの底に到達するまで、30mAの一定の電流
が当該サンプルに流された。かくして分離されたタンパ
ク質は、溶液(25%のイソプロピルアルコール;10%の
酢酸;及び0.12mg/mlのクーマシーブリリアントブルー
(Coomassie Brilliant Blue)(シグマケミカルズ社、ミ
ズリー州、セントルイス)R-250)中で揺動されること
によって当該ゲル内に室温での1時間にわたる当該処理
の結果、固定され、その後、溶液(10%のイソプロピル
・アルコール;10%の酢酸;及び0.12mg/mlのクーマシ
ーブルー)中で一晩中培養された。幾つかの変化を伴っ
た3時間にわたる、10%の酢酸による脱色(destaining)
に引き続いて、当該ゲルは、En3ハンス(En3Hance(商
品名))(ニューイングランドクレア社、マサチューセ
ッツ州、ボストン、)を用いて、製造者の指示書に従っ
て処理され、その後、乾燥され、そしてコダック(登録
商標)XAR-5 X線フィルムを用いて、−70℃で蛍光間接
撮影された。
irol.12:241-252(1973))によって記述された通り、免
疫吸収済み(immunoabsorbed)サンプル全体が、130×200
×0.8mmポリアクリルアミドスラブ(slab)ゲル(17.5%
のアクリルアミド;0.0735%のbis-アクリルアミド;0.33
5MのTris-HCl;pH8.7;0.04Mの塩化ナトリウム;0.1%のSD
S;0.05%の過硫酸アンモニウム;及び0.05%のTEMED)に
おいて、断続的なSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法で処理された。当該処理において、ブロフェノールブ
ルー染料がゲルの底に到達するまで、30mAの一定の電流
が当該サンプルに流された。かくして分離されたタンパ
ク質は、溶液(25%のイソプロピルアルコール;10%の
酢酸;及び0.12mg/mlのクーマシーブリリアントブルー
(Coomassie Brilliant Blue)(シグマケミカルズ社、ミ
ズリー州、セントルイス)R-250)中で揺動されること
によって当該ゲル内に室温での1時間にわたる当該処理
の結果、固定され、その後、溶液(10%のイソプロピル
・アルコール;10%の酢酸;及び0.12mg/mlのクーマシ
ーブルー)中で一晩中培養された。幾つかの変化を伴っ
た3時間にわたる、10%の酢酸による脱色(destaining)
に引き続いて、当該ゲルは、En3ハンス(En3Hance(商
品名))(ニューイングランドクレア社、マサチューセ
ッツ州、ボストン、)を用いて、製造者の指示書に従っ
て処理され、その後、乾燥され、そしてコダック(登録
商標)XAR-5 X線フィルムを用いて、−70℃で蛍光間接
撮影された。
【0197】プラスミドpKT-52又はpRNF-6852を含み、
既述の通りL-[35S]-システインで標識された細胞に由来
するポリペプチドのパターンの比較が図32に示され
る。分子量の大きさが約6200ドルトンのポリペプチド
は、もっぱらレーンCに現われ、当該ポリペプチドは、
pRNF-6852から誘導された全ポリペプチドを代表する。
当該ポリペプチドは、杭-ANVP IgG(レーンD)に対し
てのみ、特異的な免疫反応を示す。更に、免疫性IgG
は、pKT-52(レーンB)から誘導された全てのポリペプ
チドに対して、認め得る反応を何ら示さなかった。この
結果、pro ANVPの目指す断片が、特異的プラスミドpRNF
-6852を含む細胞内に発現することが結論された。
既述の通りL-[35S]-システインで標識された細胞に由来
するポリペプチドのパターンの比較が図32に示され
る。分子量の大きさが約6200ドルトンのポリペプチド
は、もっぱらレーンCに現われ、当該ポリペプチドは、
pRNF-6852から誘導された全ポリペプチドを代表する。
当該ポリペプチドは、杭-ANVP IgG(レーンD)に対し
てのみ、特異的な免疫反応を示す。更に、免疫性IgG
は、pKT-52(レーンB)から誘導された全てのポリペプ
チドに対して、認め得る反応を何ら示さなかった。この
結果、pro ANVPの目指す断片が、特異的プラスミドpRNF
-6852を含む細胞内に発現することが結論された。
【0198】pRNF-6852を含む大腸菌株JA221 1pp-F'lac
Iqは、1984年5月31日付で、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション((American Type Culture Colle
ction)(ATCC)、12301、パークローン・ドライブ、ロッ
クビル、メリーランド(MD)20852)に寄託され、その結
果、受託番号第39720番を付与された。
Iqは、1984年5月31日付で、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション((American Type Culture Colle
ction)(ATCC)、12301、パークローン・ドライブ、ロッ
クビル、メリーランド(MD)20852)に寄託され、その結
果、受託番号第39720番を付与された。
【0199】3.ラットのpro心房(proatrial)性ナトリ
ウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド(26-152)を
コードする、クローンされたcDNAの構築 a.プラスミドpRNF 12852の構築 セクションC.2に記述される方法と同じ方法で、完全な
長さのpro心房性ペプチドが発現された。このことを達
成するために、プラスミドpNFl(上記参照)は、AccIで
もって完全に消化され、その後、エタノールでもって沈
澱させられた。かくして、AccIで消化されたDNAは、合
成二重鎖DNAリンカー: pCATGAATCCTGT TTAGGACATAP と混合された。当該リンカーは、既述の通り、SAM I DN
Aシンセサイザー(バイオサーチ社)で合成され、そし
て予備的(preparative)ゲル電気泳動法で精製されたも
のである。かくして得られた上記混合物に、T4-DNAリガ
ーゼが添加され、それによって、当該リガーゼは、上記
消化産物に結合された。
ウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド(26-152)を
コードする、クローンされたcDNAの構築 a.プラスミドpRNF 12852の構築 セクションC.2に記述される方法と同じ方法で、完全な
長さのpro心房性ペプチドが発現された。このことを達
成するために、プラスミドpNFl(上記参照)は、AccIで
もって完全に消化され、その後、エタノールでもって沈
澱させられた。かくして、AccIで消化されたDNAは、合
成二重鎖DNAリンカー: pCATGAATCCTGT TTAGGACATAP と混合された。当該リンカーは、既述の通り、SAM I DN
Aシンセサイザー(バイオサーチ社)で合成され、そし
て予備的(preparative)ゲル電気泳動法で精製されたも
のである。かくして得られた上記混合物に、T4-DNAリガ
ーゼが添加され、それによって、当該リガーゼは、上記
消化産物に結合された。
【0200】かくして結合された当該混合物をHinfIで
消化することになり、627bp DNA断片が産出された。当
該DNA断片は5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
精製され、そして溶出された。かくして精製された627b
pHinfI−断片はクレノウ断片で処理され、そしてPstI
で消化され、次いでエタノールでもって沈澱させられ
た。プラスミドpKT52は、NcoIで消化され、次いでクレ
ノウ酵素で処理され、そしてPstIで消化され、その
後、既述の通り、子ウシの腸管のアルカリ性フォスファ
ターゼ(calf intestinal alkaline phosphatase)(上記
マニアチス他、pp.133-134参照)。HinfI-PstIで消化
されたpNFI断片は、次いでNcoI-PstIで消化されたpKT
52と混合され、そしてT4-DNAリガーゼを用いて結合され
た。
消化することになり、627bp DNA断片が産出された。当
該DNA断片は5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
精製され、そして溶出された。かくして精製された627b
pHinfI−断片はクレノウ断片で処理され、そしてPstI
で消化され、次いでエタノールでもって沈澱させられ
た。プラスミドpKT52は、NcoIで消化され、次いでクレ
ノウ酵素で処理され、そしてPstIで消化され、その
後、既述の通り、子ウシの腸管のアルカリ性フォスファ
ターゼ(calf intestinal alkaline phosphatase)(上記
マニアチス他、pp.133-134参照)。HinfI-PstIで消化
されたpNFI断片は、次いでNcoI-PstIで消化されたpKT
52と混合され、そしてT4-DNAリガーゼを用いて結合され
た。
【0201】当該結合混合物を用いてJA221 1pp-/F′la
clqを転換させた後、かくして生じたアンピシリン抵抗
コロニーから誘導されたプラスミドのミニ−プレプス(m
ini-preps)は、適当な挿入物を得るために、初めにHind
IIIを用い次にKpnI又はHincIIを用いた消化によってふ
るい分けられた(screened)。
clqを転換させた後、かくして生じたアンピシリン抵抗
コロニーから誘導されたプラスミドのミニ−プレプス(m
ini-preps)は、適当な挿入物を得るために、初めにHind
IIIを用い次にKpnI又はHincIIを用いた消化によってふ
るい分けられた(screened)。
【0202】各々、約120bp及び312bpのHindIII-KpnI
及びHindIII−HincIIの双方の断片を有するプラスミド
が選択されてpRNF-12852として表示された。pKT152にお
ける、クローンされた、完全な長さの、pro心房の配列
は、ジデオキシヌクレオチド配列分析(上記サンガー
他、参照)によって確認された。
及びHindIII−HincIIの双方の断片を有するプラスミド
が選択されてpRNF-12852として表示された。pKT152にお
ける、クローンされた、完全な長さの、pro心房の配列
は、ジデオキシヌクレオチド配列分析(上記サンガー
他、参照)によって確認された。
【0203】プラスミドpRNF-12852(図25乃至31)
は、ラットのpro ANVP前駆物質の残基25から152までを
取り囲むタンパク質をコードする(但し、当該pro ANVP
前駆物質は、残基25に対応するコドンAATに先行する付
加的なメチオニンコドンATGを有する)。
は、ラットのpro ANVP前駆物質の残基25から152までを
取り囲むタンパク質をコードする(但し、当該pro ANVP
前駆物質は、残基25に対応するコドンAATに先行する付
加的なメチオニンコドンATGを有する)。
【0204】b.プラスミドpRNF-12852の発現 pRNF-12852またはpKT152を含む大腸菌JA221 1pp−/F′
lacIqは、37℃で増殖され、そしてセクションIV.A.2.b
で記述された通り、L-[35S]-システインでラベルされ
た。抗ANVPIgGによる免疫吸収に引き続いて、かくして
ラベルされそして免疫吸収されたポリペプチド全体が、
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離さ
れ、そして既述の通り、オートラジオグラフィーに送ら
れた。
lacIqは、37℃で増殖され、そしてセクションIV.A.2.b
で記述された通り、L-[35S]-システインでラベルされ
た。抗ANVPIgGによる免疫吸収に引き続いて、かくして
ラベルされそして免疫吸収されたポリペプチド全体が、
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって分離さ
れ、そして既述の通り、オートラジオグラフィーに送ら
れた。
【0205】プラスミドpKT-52またはpRNF-12852を含
み、既述の通り、L-[35S]-システインでラベルされた細
胞に由来するポリペプチドのパターンの比較が、図32
レーンA及びレーンEに、各々示される。約18,400ドル
トンの分子量を有する大部分のポリペプチドの種は、pR
NF-12852から誘導された全ポリペプチドを代表するレー
ンE(矢印で示される)に、もっぱら現われる。当該ポ
リペプチドは、抗-ANVPI gGに対してのみ、特異的な免
疫反応を示す一方、当該免疫性IgGは、pKT-52から誘導
された全てのポリペプチドに対して、何ら認められ得る
反応を示さなかった(図32のレーンBとレーンFを比
較せよ)。従って、図32において観察された18,400ド
ルトンのポリペプチドは、ラットのpro ANVPであると信
じられる(当該ラットのpro ANVPは、図28に示される
通り、イニシエーターメチオニンに続くアミノ酸25にお
いてスタート(start)する)。
み、既述の通り、L-[35S]-システインでラベルされた細
胞に由来するポリペプチドのパターンの比較が、図32
レーンA及びレーンEに、各々示される。約18,400ドル
トンの分子量を有する大部分のポリペプチドの種は、pR
NF-12852から誘導された全ポリペプチドを代表するレー
ンE(矢印で示される)に、もっぱら現われる。当該ポ
リペプチドは、抗-ANVPI gGに対してのみ、特異的な免
疫反応を示す一方、当該免疫性IgGは、pKT-52から誘導
された全てのポリペプチドに対して、何ら認められ得る
反応を示さなかった(図32のレーンBとレーンFを比
較せよ)。従って、図32において観察された18,400ド
ルトンのポリペプチドは、ラットのpro ANVPであると信
じられる(当該ラットのpro ANVPは、図28に示される
通り、イニシエーターメチオニンに続くアミノ酸25にお
いてスタート(start)する)。
【0206】4.ヒト心房性ナトリウム尿***亢進/血
管拡張性ポリペプチド(102-151)の発現 ヒトゲノム(genomic)DNAを含有するプラスミドpH GRB
1はA paIで終りまで消化(digest)され、次にT4-DNA
ポリメラーゼ処理をして、3′−伸張末端を鈍くする
[マニアチス(maniatis)他の、上記文献第395頁参
照]。合成HindIIIリンカー[pCAAGCTTG、コラボラチブ
・リサーチ社(Collaborative Reserch Ine)、マサチ
ュセッツ州、レキシントン]は上記のブラント末端連結
を通って、ブラント末端ヒトゲノムDNAに結合する。連
結混合物はそれからHindIII及びNcoIで消化され、次に
5%ポリアミドゲル電気泳動及び溶離を使用し272bp Hi
ndIII−NcoI断片を単離する。該272bp HindIII−Nco
I断片はHindIII−NcoI消化pBR329と混合され[コバル
ビアス(Covarrubias)、L.及びF.ボリバー(Boliva
r)、Gene、17巻:第79〜89頁(1982年)]、T4-DNAリガ
ーゼで処理された。得られたプラスミドpHNF-298はBam
HI及びNcoIで消化され、得られた620bp NcoI−B
am HI断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。該62
0bp NcoI−Bam HI断片はMspIで完了まで消化され
次に大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI[クレノウ(K
lenow)フラグメント]により5′伸張末端の修復がされ
る。合成HindIIIリンカーpTTACTAAGCTTAGTAAが合成さ
れ、精製されリン酸化されブラント末端連結を通してM
spI消化NcoI−Bam HI断片に結合された。
管拡張性ポリペプチド(102-151)の発現 ヒトゲノム(genomic)DNAを含有するプラスミドpH GRB
1はA paIで終りまで消化(digest)され、次にT4-DNA
ポリメラーゼ処理をして、3′−伸張末端を鈍くする
[マニアチス(maniatis)他の、上記文献第395頁参
照]。合成HindIIIリンカー[pCAAGCTTG、コラボラチブ
・リサーチ社(Collaborative Reserch Ine)、マサチ
ュセッツ州、レキシントン]は上記のブラント末端連結
を通って、ブラント末端ヒトゲノムDNAに結合する。連
結混合物はそれからHindIII及びNcoIで消化され、次に
5%ポリアミドゲル電気泳動及び溶離を使用し272bp Hi
ndIII−NcoI断片を単離する。該272bp HindIII−Nco
I断片はHindIII−NcoI消化pBR329と混合され[コバル
ビアス(Covarrubias)、L.及びF.ボリバー(Boliva
r)、Gene、17巻:第79〜89頁(1982年)]、T4-DNAリガ
ーゼで処理された。得られたプラスミドpHNF-298はBam
HI及びNcoIで消化され、得られた620bp NcoI−B
am HI断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。該62
0bp NcoI−Bam HI断片はMspIで完了まで消化され
次に大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI[クレノウ(K
lenow)フラグメント]により5′伸張末端の修復がされ
る。合成HindIIIリンカーpTTACTAAGCTTAGTAAが合成さ
れ、精製されリン酸化されブラント末端連結を通してM
spI消化NcoI−Bam HI断片に結合された。
【0207】連結混合物はHindIIIで消化され、次に5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、156bp Hind
III断片を単離した。上記のように、T4-DNAリガーゼを
使用して子牛の腸のアルカリホスファターゼで処理した
該156bp HindIII断片は、pKT52に結合させた。
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、156bp Hind
III断片を単離した。上記のように、T4-DNAリガーゼを
使用して子牛の腸のアルカリホスファターゼで処理した
該156bp HindIII断片は、pKT52に結合させた。
【0208】JA221 lPP-/F′lacIqの連結混合物での形
質転換の次に、生じるアンピシリン耐性コロニーから誘
導されたプラスミドのミニ製造(mini-preps)がNcoI
での消化により次にClaI消化により正確に挿入される
ために分離した。
質転換の次に、生じるアンピシリン耐性コロニーから誘
導されたプラスミドのミニ製造(mini-preps)がNcoI
での消化により次にClaI消化により正確に挿入される
ために分離した。
【0209】150bpのNcoI−ClaI挿入を有するプラ
スミドが選択されpHNF-5752と名づけられた。pKT52によ
るクローン化されたヒトpro ANVP配列の読取り枠は上述
したようにDNA配列分析により確認された。
スミドが選択されpHNF-5752と名づけられた。pKT52によ
るクローン化されたヒトpro ANVP配列の読取り枠は上述
したようにDNA配列分析により確認された。
【0210】合成HindIII 8-メル(mer)リンカーがpro
ANVP cDNA断片をpKT52のHindIII部位にクローン化させ
るために使用し、proANVP配列の先のアミノ酸はMet-Ala
-Ala-Ala-Lys-Leu-Alaである。加えて、合成HindIII 16
-メル(mer)リンカーが炭素末端アミノ酸残基アルギニ
ン及びチロシンを再構築するのに使用される。それで発
現ヒトproANVP断片がサンジャー(Sanger)他の上記文
献で述べられたように、ジデオキシヌクレオチド配列分
析でNH2Met Ala Ala Ala Lys Leu Ala Trp AspSer Ser
Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Le
u Leu Thr AlaPro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys P
he Gly Gly Arg Met Asp Arg Lle GlyAla Gln Ser Gly
Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr COOHあることが決定
される。
ANVP cDNA断片をpKT52のHindIII部位にクローン化させ
るために使用し、proANVP配列の先のアミノ酸はMet-Ala
-Ala-Ala-Lys-Leu-Alaである。加えて、合成HindIII 16
-メル(mer)リンカーが炭素末端アミノ酸残基アルギニ
ン及びチロシンを再構築するのに使用される。それで発
現ヒトproANVP断片がサンジャー(Sanger)他の上記文
献で述べられたように、ジデオキシヌクレオチド配列分
析でNH2Met Ala Ala Ala Lys Leu Ala Trp AspSer Ser
Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Le
u Leu Thr AlaPro Arg Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys P
he Gly Gly Arg Met Asp Arg Lle GlyAla Gln Ser Gly
Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr COOHあることが決定
される。
【0211】5.ヒトpro心房性ナトリウム尿***亢進
/血管拡張性ポリペプチド(26-151)をコードするクロ
ーン化cDNA a.プラスミドphNF-233の構築 ヒトANVP cDNA(II.C)を含むクローン6からのλファ
ージDNAがEco RIで消化され、次にポリアクリルアミド
ゲル電気泳動及び溶離により713bp断片が単離された。
精製されたEco RI断片は、同様に消化されたプラスミ
ドpUC-9と連結され[上述のビエイラ(Vieira)、J.及
びメッシング(Messing, J.、Gene、19巻]、次に前述
したように大腸菌に形質転換される。適当な713bp Eco
RI断片と一緒のプラスミドは単離されphNF-pUC-1と名
づけられた。プラスミドphNF-pUC-lはRsaIで完了まで
消化された後フェノール/クロロホルム抽出及びエタノ
ール沈澱を行う。前述のように合成された精製された合
成二重鎖DNAリンカー 5′TATGAATCCCATGT3′ 3′ ACTTAGGGTACA5′ と混合し、次にT4-DNAリガーゼを加えて前記リンカー
をRsaI消化生成物に連結する。NdeIとの連結混合物の
消化によりポリアクリルアミドゲル電気泳動及び溶離に
より精製された370bp DNA断片を生じる。プラスミドpUC
-19(Vieria,J及びメシング、Jの上記文献)がNdeIで
消化され子牛の腸のホスファターゼで処理し次にフェノ
ール/クロロホルム抽出及びエタノール沈澱処理を行っ
た。上記370bp DNA断片はNdeI消化pUC-19に連結され次
に大腸菌の形質転換を行った。選択された370bp NdeI
ヒトプロANVP cDNA配列を含むプラスミドにおいて形質
転換物質の分離が起こり、phNF-pUC-2と名づけられた。
phNF-pUC-2はApaI及びEcoRIで消化され次に上述のア
ガロースゲル電気泳動により、より大きな配列の単離が
行われた。プラスミドphNF-pUC-1は又、ApaI及びEco R
Iで消化し次にポリアクリルアミドゲル電気泳動及び溶
離により442bp断片を単離する。phNF-pUC-1から誘導さ
れた442bp ApaI−EcoRI断片をApaI−EcoRI消化phNF
-pUC-2に連結し次に大腸菌の形質転換を行う。生じた形
質転換物質を、NdeI及びPstIでの消化により分離し、
517bp NdeI−PstI断片を含むプラスミドが生じ単離さ
れphNF-pUC-3と名づけた。
/血管拡張性ポリペプチド(26-151)をコードするクロ
ーン化cDNA a.プラスミドphNF-233の構築 ヒトANVP cDNA(II.C)を含むクローン6からのλファ
ージDNAがEco RIで消化され、次にポリアクリルアミド
ゲル電気泳動及び溶離により713bp断片が単離された。
精製されたEco RI断片は、同様に消化されたプラスミ
ドpUC-9と連結され[上述のビエイラ(Vieira)、J.及
びメッシング(Messing, J.、Gene、19巻]、次に前述
したように大腸菌に形質転換される。適当な713bp Eco
RI断片と一緒のプラスミドは単離されphNF-pUC-1と名
づけられた。プラスミドphNF-pUC-lはRsaIで完了まで
消化された後フェノール/クロロホルム抽出及びエタノ
ール沈澱を行う。前述のように合成された精製された合
成二重鎖DNAリンカー 5′TATGAATCCCATGT3′ 3′ ACTTAGGGTACA5′ と混合し、次にT4-DNAリガーゼを加えて前記リンカー
をRsaI消化生成物に連結する。NdeIとの連結混合物の
消化によりポリアクリルアミドゲル電気泳動及び溶離に
より精製された370bp DNA断片を生じる。プラスミドpUC
-19(Vieria,J及びメシング、Jの上記文献)がNdeIで
消化され子牛の腸のホスファターゼで処理し次にフェノ
ール/クロロホルム抽出及びエタノール沈澱処理を行っ
た。上記370bp DNA断片はNdeI消化pUC-19に連結され次
に大腸菌の形質転換を行った。選択された370bp NdeI
ヒトプロANVP cDNA配列を含むプラスミドにおいて形質
転換物質の分離が起こり、phNF-pUC-2と名づけられた。
phNF-pUC-2はApaI及びEcoRIで消化され次に上述のア
ガロースゲル電気泳動により、より大きな配列の単離が
行われた。プラスミドphNF-pUC-1は又、ApaI及びEco R
Iで消化し次にポリアクリルアミドゲル電気泳動及び溶
離により442bp断片を単離する。phNF-pUC-1から誘導さ
れた442bp ApaI−EcoRI断片をApaI−EcoRI消化phNF
-pUC-2に連結し次に大腸菌の形質転換を行う。生じた形
質転換物質を、NdeI及びPstIでの消化により分離し、
517bp NdeI−PstI断片を含むプラスミドが生じ単離さ
れphNF-pUC-3と名づけた。
【0212】発現プラスミドpTRP-233(図30)をNde
I及びPstIで完了まで消化し次にポリアクリルアミド
ゲル電気泳動及び溶離により517bp DNA断片を単離し
た。phNF-pUC-3から誘導されるNdeI−PstI断片はNdeI-
PstI消化pTRP-233に連結し、次に大腸菌の形質転換を
する。pTRP233において517bp NdeI−PstIを含む、生
じたプラスミドを単離し、phNF-233(図31)と名づけ
た。pTRP-233中のプロモーター/オペレーター配列の複
製及びクローン化ヒトプロANVP配列の読取り枠を確認す
るために、phNF-233をEco RI及びPstIで消化し次にポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及び溶離によりDNA配列
の単離を行う。この断片はプラスミドM13-mp18(メン
グ、J及びビエリア、Jの上記文献参照)に連結し、ジデ
オキシヌクレオチド配列分析(サンジャー等の上記文献
参照)を行う。
I及びPstIで完了まで消化し次にポリアクリルアミド
ゲル電気泳動及び溶離により517bp DNA断片を単離し
た。phNF-pUC-3から誘導されるNdeI−PstI断片はNdeI-
PstI消化pTRP-233に連結し、次に大腸菌の形質転換を
する。pTRP233において517bp NdeI−PstIを含む、生
じたプラスミドを単離し、phNF-233(図31)と名づけ
た。pTRP-233中のプロモーター/オペレーター配列の複
製及びクローン化ヒトプロANVP配列の読取り枠を確認す
るために、phNF-233をEco RI及びPstIで消化し次にポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及び溶離によりDNA配列
の単離を行う。この断片はプラスミドM13-mp18(メン
グ、J及びビエリア、Jの上記文献参照)に連結し、ジデ
オキシヌクレオチド配列分析(サンジャー等の上記文献
参照)を行う。
【0213】図31に示すように、ヒトpre-pro ANVP蛋
白の26-151の残基を残基26に対応するコドンAATの先の
付加的メチオニンコドンATGと一緒に取り囲む全長ヒトp
roANVPを発現するよう設計される。
白の26-151の残基を残基26に対応するコドンAATの先の
付加的メチオニンコドンATGと一緒に取り囲む全長ヒトp
roANVPを発現するよう設計される。
【0214】b.プラスミドphNF-233中のクローン化全
長ヒトpro ANVP(26-151)cDNAの発現 phNF-233又はptrp-233を含む大腸菌E103S(Hfr,Met B,l
ac Its)をアンピシリン添加のルリア−ベルタニ(Lur
ia-Bertani)培地(マニアチス等の上記文献第68頁)中
で37℃で1晩増殖させた。1晩たった培養物はグルコー
ス(0.4%)、チアミン(2μg/ml)、硫酸マグネシウ
ム・7水加物(MgSO4・7H2O)(200μg/ml)カスアミノ
酸(Casamino acids)(0.5%)及びアンピシリン(100
μg/ml)を添加したM9最小培地[ミラー,J, エクスペ
リメント・インモレキュラー・ジェネティックス(Expe
riments in Molecular Genetics)、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラポラトリー(Cold Spring Harbor L
aboratory)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold
Spring Harbor)、ニューヨーク、を参照]を含む培地
中で1:100に希釈し、細胞密度が0.1のA550になるまで37
℃で成長させ、この時に3-β-インドールアクリル酸
(シグマケミカル社)を、10mg/mlエタノール溶液から
25μg/mlの最終濃度で加えた。0.50のA550でL-[35S]
−システイン[200μCi/ml培養物、ニューイングラン
ド・ヌクレアー(New England Nuclear)]を加え1分
間培養を続けた。1ミリリットルの培養物をこの時取り
だし、340μlの氷冷20%トリクロロ酢酸を加え、IV.A.2
で述べたように処理した。
長ヒトpro ANVP(26-151)cDNAの発現 phNF-233又はptrp-233を含む大腸菌E103S(Hfr,Met B,l
ac Its)をアンピシリン添加のルリア−ベルタニ(Lur
ia-Bertani)培地(マニアチス等の上記文献第68頁)中
で37℃で1晩増殖させた。1晩たった培養物はグルコー
ス(0.4%)、チアミン(2μg/ml)、硫酸マグネシウ
ム・7水加物(MgSO4・7H2O)(200μg/ml)カスアミノ
酸(Casamino acids)(0.5%)及びアンピシリン(100
μg/ml)を添加したM9最小培地[ミラー,J, エクスペ
リメント・インモレキュラー・ジェネティックス(Expe
riments in Molecular Genetics)、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラポラトリー(Cold Spring Harbor L
aboratory)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold
Spring Harbor)、ニューヨーク、を参照]を含む培地
中で1:100に希釈し、細胞密度が0.1のA550になるまで37
℃で成長させ、この時に3-β-インドールアクリル酸
(シグマケミカル社)を、10mg/mlエタノール溶液から
25μg/mlの最終濃度で加えた。0.50のA550でL-[35S]
−システイン[200μCi/ml培養物、ニューイングラン
ド・ヌクレアー(New England Nuclear)]を加え1分
間培養を続けた。1ミリリットルの培養物をこの時取り
だし、340μlの氷冷20%トリクロロ酢酸を加え、IV.A.2
で述べたように処理した。
【0215】phNF-233又はpTRP-233を含む細胞から誘導
したL-[35S]−システイン標識ポリペプチドの免疫吸
収は合成ラットANVP(127-152)で注射したうさぎで生じ
た抗血清を使用して、IV.A.2で述べたようになされる。
したL-[35S]−システイン標識ポリペプチドの免疫吸
収は合成ラットANVP(127-152)で注射したうさぎで生じ
た抗血清を使用して、IV.A.2で述べたようになされる。
【0216】全体の及び免疫吸収L-[35S]−システイ
ン標識ポリペプチドはIV.A.2で述べたようにSDS-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動及び蛍光間接撮影法により分
析する。L-[35S]−システインで標識されたプラスミ
ドpTRP-233又はphNF-233を含む細胞からのポリペプチド
型の比較を図33に示す。分子量約18,000ドルトンのメ
ジャーポリペプチドは、pTRP-233から誘導された全ポリ
ペプチドを表わすレーンAと比べ、phNF-233から誘導さ
れる全ポリペプチドを表わすレーンBに独特に表われ
る。この18キロドルトンのポリペプチドは抗-ANVP抗血
清に特に免疫反応性があり、一方、pTRP-233から誘導さ
れたポリペプチドとの反応は検出されなかった(図33
中レーンC及びDと比較する。)。ヒトpro-ANVP(26-15
1)の予測されたポリペプチドはそれ故特異プラスミドph
NF-233を含む細胞に発現する。
ン標識ポリペプチドはIV.A.2で述べたようにSDS-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動及び蛍光間接撮影法により分
析する。L-[35S]−システインで標識されたプラスミ
ドpTRP-233又はphNF-233を含む細胞からのポリペプチド
型の比較を図33に示す。分子量約18,000ドルトンのメ
ジャーポリペプチドは、pTRP-233から誘導された全ポリ
ペプチドを表わすレーンAと比べ、phNF-233から誘導さ
れる全ポリペプチドを表わすレーンBに独特に表われ
る。この18キロドルトンのポリペプチドは抗-ANVP抗血
清に特に免疫反応性があり、一方、pTRP-233から誘導さ
れたポリペプチドとの反応は検出されなかった(図33
中レーンC及びDと比較する。)。ヒトpro-ANVP(26-15
1)の予測されたポリペプチドはそれ故特異プラスミドph
NF-233を含む細胞に発現する。
【0217】pRNF-6852を含む大腸菌種K12 E103S Hfrカ
バリ、(Cavalli)、met B、lacItsはアメリカンタイ
プカルチャーコレクション(ATCC)53085パークローン
ドライブ(Parklaun Drive)、ロックビル、メリーラン
ド(MD)20852に1985年4月9日に寄託し、受託番号530
85を得た。
バリ、(Cavalli)、met B、lacItsはアメリカンタイ
プカルチャーコレクション(ATCC)53085パークローン
ドライブ(Parklaun Drive)、ロックビル、メリーラン
ド(MD)20852に1985年4月9日に寄託し、受託番号530
85を得た。
【0218】C.大腸菌からのヒトpro-ANVP(26-151)の
精製及び特性化 phNF-233を含有する大腸菌をアンピシリン(100μg/m
l)を添加したルリア−ベルタニ培地で37℃で1晩増殖
させる。培養物の10ミリリットルをIV.5.bで述べた添加
物及び最小塩(minimal salts)を含む培地1000ml中に
希釈し、37℃で成長させ、細胞密度が0.1A550に相当す
るまで成長させる。この時、3−β−インドールアクリ
ル酸を10mg/mlエタノール溶液から最終濃度25μg/ml
まで加えた。細胞は細胞密度が1.0A550に相当するまで
成長させこの時細胞を4℃で7000回/分の遠心分離によ
り集める。細胞ペレットをpH8の氷冷トリス塩酸10mM溶
液中に再懸濁させ、前記のように遠心分離を行う。洗滌
した細胞ペレットを1モル酢酸及び20ミリモル塩酸を含
有する水溶液40ml中に再懸濁する。該細胞はヒートシス
テムズ−ウルトラソニックス社W-225-R型ソニケーター
(sonicator)を使用して粉砕する。懸濁液は次に沸騰
水浴中の密閉容器中で5分間培養し、次に4℃で12,000
回/分で20分間遠心分離を行う。上清(酸抽出と言う)
を除去しpH7.5のトリス塩酸10ミリモル及び1ミリモル
のEDTAで平衡にしたセファデックス(登録商標)G-10
[ファルマシア(Pharmacia)]を含む2.5cm×10cmカラ
ムにかけた。生じた免疫反応性画分は−特異ANVP標識免
疫検定法により検出されるが−プールし凍結乾燥により
乾燥させる。乾燥区分は0.5モルの酢酸中に再懸濁さ
せ、0.5モル酢酸で前もって平衡にしたセファデックス
(登録商標)G-10を含む2.5×50cmのカラムにかけた。
精製及び特性化 phNF-233を含有する大腸菌をアンピシリン(100μg/m
l)を添加したルリア−ベルタニ培地で37℃で1晩増殖
させる。培養物の10ミリリットルをIV.5.bで述べた添加
物及び最小塩(minimal salts)を含む培地1000ml中に
希釈し、37℃で成長させ、細胞密度が0.1A550に相当す
るまで成長させる。この時、3−β−インドールアクリ
ル酸を10mg/mlエタノール溶液から最終濃度25μg/ml
まで加えた。細胞は細胞密度が1.0A550に相当するまで
成長させこの時細胞を4℃で7000回/分の遠心分離によ
り集める。細胞ペレットをpH8の氷冷トリス塩酸10mM溶
液中に再懸濁させ、前記のように遠心分離を行う。洗滌
した細胞ペレットを1モル酢酸及び20ミリモル塩酸を含
有する水溶液40ml中に再懸濁する。該細胞はヒートシス
テムズ−ウルトラソニックス社W-225-R型ソニケーター
(sonicator)を使用して粉砕する。懸濁液は次に沸騰
水浴中の密閉容器中で5分間培養し、次に4℃で12,000
回/分で20分間遠心分離を行う。上清(酸抽出と言う)
を除去しpH7.5のトリス塩酸10ミリモル及び1ミリモル
のEDTAで平衡にしたセファデックス(登録商標)G-10
[ファルマシア(Pharmacia)]を含む2.5cm×10cmカラ
ムにかけた。生じた免疫反応性画分は−特異ANVP標識免
疫検定法により検出されるが−プールし凍結乾燥により
乾燥させる。乾燥区分は0.5モルの酢酸中に再懸濁さ
せ、0.5モル酢酸で前もって平衡にしたセファデックス
(登録商標)G-10を含む2.5×50cmのカラムにかけた。
【0219】生じた免疫反応性のカラム画分はプール
し、凍結乾燥した。乾燥物質は約4mlの蒸留水に入れ、
高性能液体クロマトグラフィーHPLC精製を行う。該物質
をパーキン−エルマーシリーズ(Perkin-Elmer Serie
s)4LCインジェクター及び溶剤デリバリーシステム(パ
ーキン−エルマー)を使用する1×25センチメートルの
ビダック(Vydac)C18カラムにかけた。結合物質を水
性15%アセトニトリル(CH3CN)及び0.1%トリフルオロ
酢酸(TFA)で2分間洗滌し、次にアセトニトリル及び
0.1%TFA15:85から60:40を45分間にわたり一次勾配展
開を行う。1分からの画分の試料を集め乾燥させ上述の
ように抗-ANVP標識免疫検定法で免疫反応性を検定し
た。免疫反応性のピークがその後に集められ減圧下で乾
燥した。減圧物質は水中に再懸濁し、凍結乾燥で再び乾
燥した。該物質の100モルを470A型蛋白質配列機[アプ
ライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystens In
c.)製]を使用して自動アミノ酸配列分析を行う。分析
した最初の18のアミノ酸は、Met-Asn-Pro-Met-Tyr-Asn-
Ala-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Met-Asp-Phe-Lys-Asn-で
あった。この分析から他の検出される不純物質は認めら
れなかった。IV.2.bで述べたSDS-ポリアクリルアミドゲ
ル分析も又18000ドルトンである明らかな分子の大きさ
で移動した精製物質の検出可能な他の不純物質がないこ
とを明らかにした。上述のこのポリペプチドの配列分析
から、このポリペプチドが付加的アミノ末端メチオニン
と一緒に全長ヒト(26-151)pro-ANVPに対応し、細菌性ポ
リペプチドからの検出可能な汚染物質は含まないという
ことを結論づけた。
し、凍結乾燥した。乾燥物質は約4mlの蒸留水に入れ、
高性能液体クロマトグラフィーHPLC精製を行う。該物質
をパーキン−エルマーシリーズ(Perkin-Elmer Serie
s)4LCインジェクター及び溶剤デリバリーシステム(パ
ーキン−エルマー)を使用する1×25センチメートルの
ビダック(Vydac)C18カラムにかけた。結合物質を水
性15%アセトニトリル(CH3CN)及び0.1%トリフルオロ
酢酸(TFA)で2分間洗滌し、次にアセトニトリル及び
0.1%TFA15:85から60:40を45分間にわたり一次勾配展
開を行う。1分からの画分の試料を集め乾燥させ上述の
ように抗-ANVP標識免疫検定法で免疫反応性を検定し
た。免疫反応性のピークがその後に集められ減圧下で乾
燥した。減圧物質は水中に再懸濁し、凍結乾燥で再び乾
燥した。該物質の100モルを470A型蛋白質配列機[アプ
ライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystens In
c.)製]を使用して自動アミノ酸配列分析を行う。分析
した最初の18のアミノ酸は、Met-Asn-Pro-Met-Tyr-Asn-
Ala-Val-Ser-Asn-Ala-Asp-Leu-Met-Asp-Phe-Lys-Asn-で
あった。この分析から他の検出される不純物質は認めら
れなかった。IV.2.bで述べたSDS-ポリアクリルアミドゲ
ル分析も又18000ドルトンである明らかな分子の大きさ
で移動した精製物質の検出可能な他の不純物質がないこ
とを明らかにした。上述のこのポリペプチドの配列分析
から、このポリペプチドが付加的アミノ末端メチオニン
と一緒に全長ヒト(26-151)pro-ANVPに対応し、細菌性ポ
リペプチドからの検出可能な汚染物質は含まないという
ことを結論づけた。
【0220】B.サッカロミセスセレビシアエ(Saccha
romyces cerevisiae)中のpro心房性ナトリウム尿***
亢進/血管拡張性及びpre-pro心房性ナトリウム性***
亢進/血管拡張性ポリペプチドの発現 続く例としてS.セレビシアエ(S.cerevisiae)中の種々
のproANVP及びANVPポリペプチドの発現を述べる。どのp
roANVP又はANVP配列も同様にS.セレビシアエ中に発現さ
れ得る。
romyces cerevisiae)中のpro心房性ナトリウム尿***
亢進/血管拡張性及びpre-pro心房性ナトリウム性***
亢進/血管拡張性ポリペプチドの発現 続く例としてS.セレビシアエ(S.cerevisiae)中の種々
のproANVP及びANVPポリペプチドの発現を述べる。どのp
roANVP又はANVP配列も同様にS.セレビシアエ中に発現さ
れ得る。
【0221】1.細胞内発現 pre-proANVPs、proANVPs及び成熟ANVPsを含むproANVPs
の断片を暗号にするcDNAの酵母菌サッカロミセス・セレ
ビシアエ(Saccharomyces cereviseae)においての細胞
内発現のためのベクターの調製を2つの方法で開示す
る。それぞれ酵母菌ホスフォグリセレートキナーゼ(PC
K)遺伝子の前に発現された強プロモーター配列を利用
する。最初の工程では、プラスミドpNFlはHincII[ニュ
ーイングランド・バイオラブス(new England Biolab
s)で消化される。BamHIリンカーオリゴヌクレオチド
[8ヌクレオチド長さ、コラボラチブ・リサーチ社(Co
llaborative Research,Inc.)]は消化生成物に連結さ
れ、生じる分子はBam HIで消化された。成熟ANVP配列
を含有するこの消化物からの454 bp断片が次に5%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製し、酵母のBam
HI部位−大腸菌ベクターpYGK2に連結した。該ベクター
は酵母−大腸菌シャトルベクターYEp13[J.ブローチ(B
roach)等、Gene、8巻、第121〜133頁(1979年)]を
制限酵母Bam HI及びHind IIIで消化し、次に最大の制
限断片に連結し、酵母PGK遺伝子からのプロモーター領
域にわたる制限断片を得る。PGK−プロモーター含有断
片は、Hind III制限部位、PGKのATG出発コドンからさか
のぼった約1500塩基対からPGK暗号付け領域内から、BAL
-31消化後ATG出発コドンの領域から下った28塩基対を挿
入したBam HIリンカーオリゴヌクレオチド(8塩基対
長さ、コラボラチブリサーチ社製)まで及ぶ。
の断片を暗号にするcDNAの酵母菌サッカロミセス・セレ
ビシアエ(Saccharomyces cereviseae)においての細胞
内発現のためのベクターの調製を2つの方法で開示す
る。それぞれ酵母菌ホスフォグリセレートキナーゼ(PC
K)遺伝子の前に発現された強プロモーター配列を利用
する。最初の工程では、プラスミドpNFlはHincII[ニュ
ーイングランド・バイオラブス(new England Biolab
s)で消化される。BamHIリンカーオリゴヌクレオチド
[8ヌクレオチド長さ、コラボラチブ・リサーチ社(Co
llaborative Research,Inc.)]は消化生成物に連結さ
れ、生じる分子はBam HIで消化された。成熟ANVP配列
を含有するこの消化物からの454 bp断片が次に5%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製し、酵母のBam
HI部位−大腸菌ベクターpYGK2に連結した。該ベクター
は酵母−大腸菌シャトルベクターYEp13[J.ブローチ(B
roach)等、Gene、8巻、第121〜133頁(1979年)]を
制限酵母Bam HI及びHind IIIで消化し、次に最大の制
限断片に連結し、酵母PGK遺伝子からのプロモーター領
域にわたる制限断片を得る。PGK−プロモーター含有断
片は、Hind III制限部位、PGKのATG出発コドンからさか
のぼった約1500塩基対からPGK暗号付け領域内から、BAL
-31消化後ATG出発コドンの領域から下った28塩基対を挿
入したBam HIリンカーオリゴヌクレオチド(8塩基対
長さ、コラボラチブリサーチ社製)まで及ぶ。
【0222】該ベクターを使用して、pre-proANVP配列
中のDNAのいずれの配列が挿入され得、所望のpre-proAN
VP断片を常に発現する。例えば、454 bpANVP含有断片を
該ベクター中のBam HIリンカー部位に正しい配向で挿
入するとPGKプロモーターからの78−アミノ酸の長さの
融合蛋白(PGK遺伝子のアミノ末端からの9アミノ酸、
リンカーオリゴヌクレオチドにより暗号づけされた3つ
のアミノ酸、proANVP領域の39アミノ酸、成熟ANVP配列
の25アミノ酸及びANVP前駆物質のカルボキシ末端の2つ
のアルギニン残基からなる)の合成を行う。
中のDNAのいずれの配列が挿入され得、所望のpre-proAN
VP断片を常に発現する。例えば、454 bpANVP含有断片を
該ベクター中のBam HIリンカー部位に正しい配向で挿
入するとPGKプロモーターからの78−アミノ酸の長さの
融合蛋白(PGK遺伝子のアミノ末端からの9アミノ酸、
リンカーオリゴヌクレオチドにより暗号づけされた3つ
のアミノ酸、proANVP領域の39アミノ酸、成熟ANVP配列
の25アミノ酸及びANVP前駆物質のカルボキシ末端の2つ
のアルギニン残基からなる)の合成を行う。
【0223】pre-proANVPの細胞内発現の第2の方法も
又、proANVP及びその断片の細胞外分泌を行わせる。第
2の方法において、全pre-proANVP前駆物質暗号づけ領
域を含む、制限断片はプラスミドを制限酵素Sal I
(ニューイングランド・バイオラブズ製)で第1消化す
ることによりプラスミドpNF4から単離する。生じる線長
プラスミド分子の末端上の単鎖領域はDNAポリメラーゼ
で(クレノウ断片)で処理され二重鎖にされ、Bam HI
リンカー類(8ヌクレオチド長さのコラボラチブ・リサ
ーチ社製)が次にこれらブラント末端に連結する。その
線長さプラスミド分子は次にBam HI及びEco RIで消
化されpre-proANVP断片を含む約900のbpBamHI(Sal
I)−Eco RI断片が単離される。該断片は2つの修
正:(1)PGKのATGコドン(に対する5′)から23 bpさか
のぼってあり、(2)クローン化cDNA断片の後は、PGK遺伝
子の転写終了領域がくる:他は上記のpYPGK2ベクターと
同一なベクターに連結する。(PGK部位の3′末端を含む
Eco RI−Hind III断片+3′−リンカーとしてpBR322
からの346 bp Hind III−Bam HI断片)。PGKプロモー
ターからの挿入pre-proANVP cDNAの発現はpre-proANVP
の合成を生ずる。発現されるpre-proANVPはもし信号及
び/又は処理部位が細胞によってそれと認知されそれに
基づいて行動されるなら酵母細胞により処理され分泌さ
れる。分泌された物質はproANVP、その断片がANVPのみ
のどちらかである。もし、信号配列の認知がおこらない
なら、全長pre-proANVPかその断片が細胞内に見出され
る。
又、proANVP及びその断片の細胞外分泌を行わせる。第
2の方法において、全pre-proANVP前駆物質暗号づけ領
域を含む、制限断片はプラスミドを制限酵素Sal I
(ニューイングランド・バイオラブズ製)で第1消化す
ることによりプラスミドpNF4から単離する。生じる線長
プラスミド分子の末端上の単鎖領域はDNAポリメラーゼ
で(クレノウ断片)で処理され二重鎖にされ、Bam HI
リンカー類(8ヌクレオチド長さのコラボラチブ・リサ
ーチ社製)が次にこれらブラント末端に連結する。その
線長さプラスミド分子は次にBam HI及びEco RIで消
化されpre-proANVP断片を含む約900のbpBamHI(Sal
I)−Eco RI断片が単離される。該断片は2つの修
正:(1)PGKのATGコドン(に対する5′)から23 bpさか
のぼってあり、(2)クローン化cDNA断片の後は、PGK遺伝
子の転写終了領域がくる:他は上記のpYPGK2ベクターと
同一なベクターに連結する。(PGK部位の3′末端を含む
Eco RI−Hind III断片+3′−リンカーとしてpBR322
からの346 bp Hind III−Bam HI断片)。PGKプロモー
ターからの挿入pre-proANVP cDNAの発現はpre-proANVP
の合成を生ずる。発現されるpre-proANVPはもし信号及
び/又は処理部位が細胞によってそれと認知されそれに
基づいて行動されるなら酵母細胞により処理され分泌さ
れる。分泌された物質はproANVP、その断片がANVPのみ
のどちらかである。もし、信号配列の認知がおこらない
なら、全長pre-proANVPかその断片が細胞内に見出され
る。
【0224】2.細胞外発現 a) YEp-α-8発現ベクターの再構築 大腸菌−酵母菌シャトルベクターYEp13[ナスミス(Nas
myth)、K.及びK.タッチェル(Tatchell)、セル第19巻
第753-764頁(1980年)]中の酵母菌ライブラリーを5′
−32P末端標識オリゴデオキシヌクレオチド(5′-CCTG
GCCAACCAATG-3′)を使用して分離する(マニアチスら
の上記文献の第324〜325頁を参照)。該オリゴヌクレオ
チドに雑種形成する酵母菌DNAの挿入を含むプラスミド
を次に単離する。これらプラスミドの1つは約15kbの酵
母菌DNAの挿入を含み、クルジャン(Kurjan)、J. 及び
I.ヘルスコヴィッツ(Herskowitz)のCell、30巻、第93
8〜943頁(1982年)に記載されたα−因子遺伝子を含む
1.7kbのEco RI断片を含有する事を示した。1.7kbのEc
oRI断片の末端はDNAポリメラーゼI[クレノウ(Kleno
w)断片]での培養により鈍化され、Bam HIリンカーは
T4-DNAリガーゼを使用して結合された(マニアチスらの
上記文献第113〜114頁、116頁、392〜394頁参照)。Ba
m HI末端はBam HIでの消化により粘着性にされ、次
に酵母菌−大腸菌シャトルプラスミドpCV7-Hin228のBam
HI部位に連結された。プラスミドCV7のHindIII部位の
周囲の欠失はHindIII消化、エクソヌクレアーゼIIIでの
処理、SIヌクレアーゼ処理によりなされ、T4-DNAリガー
ゼとの連結がプラスミドpCV7-Hin△228を生じ、すべて
ブローチ(Broach)、J.R及びJB.ヒックス(Hicks)の
細胞第21巻第501〜508頁(1980年)に述べられた方法を
使用する。酵母菌α−因子遺伝子を含む該プラスミド
は、図34に図解されYEp-α-8と名づける。
myth)、K.及びK.タッチェル(Tatchell)、セル第19巻
第753-764頁(1980年)]中の酵母菌ライブラリーを5′
−32P末端標識オリゴデオキシヌクレオチド(5′-CCTG
GCCAACCAATG-3′)を使用して分離する(マニアチスら
の上記文献の第324〜325頁を参照)。該オリゴヌクレオ
チドに雑種形成する酵母菌DNAの挿入を含むプラスミド
を次に単離する。これらプラスミドの1つは約15kbの酵
母菌DNAの挿入を含み、クルジャン(Kurjan)、J. 及び
I.ヘルスコヴィッツ(Herskowitz)のCell、30巻、第93
8〜943頁(1982年)に記載されたα−因子遺伝子を含む
1.7kbのEco RI断片を含有する事を示した。1.7kbのEc
oRI断片の末端はDNAポリメラーゼI[クレノウ(Kleno
w)断片]での培養により鈍化され、Bam HIリンカーは
T4-DNAリガーゼを使用して結合された(マニアチスらの
上記文献第113〜114頁、116頁、392〜394頁参照)。Ba
m HI末端はBam HIでの消化により粘着性にされ、次
に酵母菌−大腸菌シャトルプラスミドpCV7-Hin228のBam
HI部位に連結された。プラスミドCV7のHindIII部位の
周囲の欠失はHindIII消化、エクソヌクレアーゼIIIでの
処理、SIヌクレアーゼ処理によりなされ、T4-DNAリガー
ゼとの連結がプラスミドpCV7-Hin△228を生じ、すべて
ブローチ(Broach)、J.R及びJB.ヒックス(Hicks)の
細胞第21巻第501〜508頁(1980年)に述べられた方法を
使用する。酵母菌α−因子遺伝子を含む該プラスミド
は、図34に図解されYEp-α-8と名づける。
【0225】b)ラットの暗号づけpro心房性ナトリウ
ム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチドのYEp-α-8へ
の挿入 pre-proANVPをコードするpNF1(II.A.3.)からのDNAの
断片は制限エンドヌクレアーゼ切断によりYEp-α-8の特
異Hind部位(図34)に挿入され必須のDNAポリメラー
ゼI(クレノウ断片)でDNA末端に満たし、HindIIIリン
カーを加える(マニアチスらの上記文献第392頁参
照)。DNA断片の末端は次のHindIIIで消化され粘着性に
なり、アルカルホスファターゼで処理されたHindIII切
断YEp-α-8に連結された(マニアチスらの上記文献第13
3〜134頁参照)。再結合分子は大腸菌に形質転換され、
コロニーをプラスミドDNAに対して分析した(マニアチ
スらの上記文献第366〜369頁参照)。
ム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチドのYEp-α-8へ
の挿入 pre-proANVPをコードするpNF1(II.A.3.)からのDNAの
断片は制限エンドヌクレアーゼ切断によりYEp-α-8の特
異Hind部位(図34)に挿入され必須のDNAポリメラー
ゼI(クレノウ断片)でDNA末端に満たし、HindIIIリン
カーを加える(マニアチスらの上記文献第392頁参
照)。DNA断片の末端は次のHindIIIで消化され粘着性に
なり、アルカルホスファターゼで処理されたHindIII切
断YEp-α-8に連結された(マニアチスらの上記文献第13
3〜134頁参照)。再結合分子は大腸菌に形質転換され、
コロニーをプラスミドDNAに対して分析した(マニアチ
スらの上記文献第366〜369頁参照)。
【0226】マニアチスらの上記文献の第173〜175頁中
に示されたように、HaeIII断片が生じ、述べられている
ようにポリアクリルアミドゲルにより大きさが選択され
る。266bpの該断片は次のYEp-α-8にクローン化され上
述のように発現ベクターYEp-α-NF-5を生ずる。正しい
配向でこの挿入はproANVP配列のアミノ酸121〜152に対
応する成熟ANVP配列及びアミノ末端に付加的フェニルア
ラニンを含む33のアミノ酸ペプチドをコードする。対照
として、挿入の逆配向はYEp-α-8にクローン化されYEp-
α-NF-7を表わす。この挿入は異なるアミノ酸配列を有
する無関係な蛋白質をコードする。同時に、623bpのAc
c I断片が単離され正しい配向でYEp-α-8にクローン化
され発現ベクターYEp-α-NF-9を生ずる。この挿入は、
ほとんど全proANVP配列(アミノ酸28−152)及びNH2末
端での付加的なチロシンからなる126のアミノ酸ポリペ
プチドにコードする。この挿入は又逆配向でクローン化
し調節(control)プラスミドYEp-α-NF-12を生じる。H
indIIIリンカーの添加の後のラットproANVPのHaeIII及
びAccI断片の挿入は、キメラ(chimeric)蛋白質を暗
号づけするDNA配列を生ずる。この蛋白質は、α−因子
信号/解読ペプチドのために、スペーサー断片(spacer
fragment)及び適切なproANVP断片をコードする。
に示されたように、HaeIII断片が生じ、述べられている
ようにポリアクリルアミドゲルにより大きさが選択され
る。266bpの該断片は次のYEp-α-8にクローン化され上
述のように発現ベクターYEp-α-NF-5を生ずる。正しい
配向でこの挿入はproANVP配列のアミノ酸121〜152に対
応する成熟ANVP配列及びアミノ末端に付加的フェニルア
ラニンを含む33のアミノ酸ペプチドをコードする。対照
として、挿入の逆配向はYEp-α-8にクローン化されYEp-
α-NF-7を表わす。この挿入は異なるアミノ酸配列を有
する無関係な蛋白質をコードする。同時に、623bpのAc
c I断片が単離され正しい配向でYEp-α-8にクローン化
され発現ベクターYEp-α-NF-9を生ずる。この挿入は、
ほとんど全proANVP配列(アミノ酸28−152)及びNH2末
端での付加的なチロシンからなる126のアミノ酸ポリペ
プチドにコードする。この挿入は又逆配向でクローン化
し調節(control)プラスミドYEp-α-NF-12を生じる。H
indIIIリンカーの添加の後のラットproANVPのHaeIII及
びAccI断片の挿入は、キメラ(chimeric)蛋白質を暗
号づけするDNA配列を生ずる。この蛋白質は、α−因子
信号/解読ペプチドのために、スペーサー断片(spacer
fragment)及び適切なproANVP断片をコードする。
【0227】DNAはこれらのプラスミドを含む大腸菌の
培養から調製され(マニアチスらの上記文献の第366〜3
69頁を参照)及びS.セレビサエ菌株W301−18A[αade
(アデニン栄養要求株)2-1,trp1-1, leu 2-3,112, can
(カナバニン抵抗)1-100,ura(ウラシル栄養要求株)3
-1,his, 3-11, 15][クラマー(kramer)ほかProc. Na
tl. Acnd. Sci.(米国)81巻、367−370頁(1984年)参
照]をロイシン2原栄養株(prototrophy)に形質転換
するものである。酵母菌株は標準培地で培養する[シエ
アマン(Sherman)らのメソッド・イン・イースト・ジ
ェネティックス(Methods in Yeast Genetics)、コー
ルド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Ha
rbor Press)、コールドハーバー、ニューヨーク]。大
腸菌からのプラスミドDNAは配列を行いα−因子pro-ANV
P DNA再構築を認知するために又M13に再クローン化する
(メシングJ.及びJ.ビエイラの上記文献を参照)。
培養から調製され(マニアチスらの上記文献の第366〜3
69頁を参照)及びS.セレビサエ菌株W301−18A[αade
(アデニン栄養要求株)2-1,trp1-1, leu 2-3,112, can
(カナバニン抵抗)1-100,ura(ウラシル栄養要求株)3
-1,his, 3-11, 15][クラマー(kramer)ほかProc. Na
tl. Acnd. Sci.(米国)81巻、367−370頁(1984年)参
照]をロイシン2原栄養株(prototrophy)に形質転換
するものである。酵母菌株は標準培地で培養する[シエ
アマン(Sherman)らのメソッド・イン・イースト・ジ
ェネティックス(Methods in Yeast Genetics)、コー
ルド・スプリング・ハーバー・プレス(Cold Spring Ha
rbor Press)、コールドハーバー、ニューヨーク]。大
腸菌からのプラスミドDNAは配列を行いα−因子pro-ANV
P DNA再構築を認知するために又M13に再クローン化する
(メシングJ.及びJ.ビエイラの上記文献を参照)。
【0228】c)s.セレビシアエにおけるラットpro心
房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド
配列の発現及び分泌 α−因子proANVP断片製造(processing)技術を図34
に示す。mRNA転写がベクター中のα−因子配列から始ま
り終るこことは酵母菌分泌工程を通りキメラ蛋白質に翻
訳される。この蛋白質の蛋白質製造が分子のα−因子部
分におけるグルタミン−アラニン(Glu-Ala)(QA)残
基及びリジン−アルギニン(Lys-Arg)(KR)残基の両
方でおこる(クーリャン,J.及びI. ヘルスコビッツの上
記文献参照)。この処理を行った蛋白質の炭素末端部分
はそれ故、ラットproANVPの予測アミノ酸である。これ
らのプラスミドを含む酵母菌の培養はロイシン欠如の合
成培地で行われる(シェアマンらの上記文献を参照)。
酵母菌のプラスミドは比較的不安定で1世代当り約1.0
%失われるのでこの選択は必要である。酵母菌の培養物
はロイシンのない合成培地で4時間0.1〜0.5mCi/ml35S
−システインで標識される(約1000Ci/ミリモル)。牛
血清アルブミンが最終濃度100μg/mlまで加えられ、可
能な蛋白質分解を防ぐ。試料(1.0ml)を摂取し、細胞
を遠心ろ過で除去し、培地の蛋白質は10%TCA沈澱法に
より4℃で15分間濃縮され次いでエッペンドルフミクロ
フュージ(Eppendorf microfuge)(15,000×g)中で
遠心ろ過を行う。生じたペレットをアセトンで洗い真空
下で乾燥し、SDS試料緩衝液に再懸濁を行う。[レムリ
(Laemlli)、英国、ネーチャー227巻第680頁〜685頁
(1970年)]これらの試料は直接SDS-PAGEゲル(17.5
%)アクリルアミド)にし、乾燥ゲルのオートラジオグ
ラフィーで、全分泌35S−メチオニン(35S−met)蛋
白質の型を検査する。図35のAでわかるように、YEp-
α-NF-9を含む酵母菌培養液の培養液の上清は、約11.1
及び9.4kd(レーン3及び4)で35S−メチオニン(35
S−met)標識バンドを示し、YEp-α-NF-12の培養物か
らの培地(逆構築)は約5kd(レーン5及び6)の35S
−メチオニン標識バンドを示す。これらのバンドの両方
ともプラスミドベクターYEp-α-8(レーン1及び2)を
含む培養液からの培地に検出されない。
房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド
配列の発現及び分泌 α−因子proANVP断片製造(processing)技術を図34
に示す。mRNA転写がベクター中のα−因子配列から始ま
り終るこことは酵母菌分泌工程を通りキメラ蛋白質に翻
訳される。この蛋白質の蛋白質製造が分子のα−因子部
分におけるグルタミン−アラニン(Glu-Ala)(QA)残
基及びリジン−アルギニン(Lys-Arg)(KR)残基の両
方でおこる(クーリャン,J.及びI. ヘルスコビッツの上
記文献参照)。この処理を行った蛋白質の炭素末端部分
はそれ故、ラットproANVPの予測アミノ酸である。これ
らのプラスミドを含む酵母菌の培養はロイシン欠如の合
成培地で行われる(シェアマンらの上記文献を参照)。
酵母菌のプラスミドは比較的不安定で1世代当り約1.0
%失われるのでこの選択は必要である。酵母菌の培養物
はロイシンのない合成培地で4時間0.1〜0.5mCi/ml35S
−システインで標識される(約1000Ci/ミリモル)。牛
血清アルブミンが最終濃度100μg/mlまで加えられ、可
能な蛋白質分解を防ぐ。試料(1.0ml)を摂取し、細胞
を遠心ろ過で除去し、培地の蛋白質は10%TCA沈澱法に
より4℃で15分間濃縮され次いでエッペンドルフミクロ
フュージ(Eppendorf microfuge)(15,000×g)中で
遠心ろ過を行う。生じたペレットをアセトンで洗い真空
下で乾燥し、SDS試料緩衝液に再懸濁を行う。[レムリ
(Laemlli)、英国、ネーチャー227巻第680頁〜685頁
(1970年)]これらの試料は直接SDS-PAGEゲル(17.5
%)アクリルアミド)にし、乾燥ゲルのオートラジオグ
ラフィーで、全分泌35S−メチオニン(35S−met)蛋
白質の型を検査する。図35のAでわかるように、YEp-
α-NF-9を含む酵母菌培養液の培養液の上清は、約11.1
及び9.4kd(レーン3及び4)で35S−メチオニン(35
S−met)標識バンドを示し、YEp-α-NF-12の培養物か
らの培地(逆構築)は約5kd(レーン5及び6)の35S
−メチオニン標識バンドを示す。これらのバンドの両方
ともプラスミドベクターYEp-α-8(レーン1及び2)を
含む培養液からの培地に検出されない。
【0229】蛋白質−この合成及び分泌はYEp-α-NF-9
により指示(direct)されるが−の分子量は、エンドゲ
ナス酵母菌プロテアーゼがこのプラスミドでAcc I断片
によりコードされたproANVP前駆物質からのNNVPペプチ
ドを切断する可能性と一致しない。この可能性を確認す
るためにこのプラスミドを宿らせている(harbor)酵母
菌の培養物、それに相当する逆配向(YEp-α-NF-12)及
びYEp-α-NF-5及びYEp-α-NF-7(proANVPの小断片を暗
号づけるHaeIII断片)を宿らせている酵母菌断片を特に
免疫沈澱性になる35S−標識蛋白質を発現するか決定す
るために上記のように35S−メチオニン及び35S−シス
テインで標識した。35S−メチオニンはproANVP蛋白質
にとり込まれるがANVPにはとり込まれず、一方35S−シ
ステインは選択的にANVPにとり込まれる。対照実験が、
ある酵母菌培地成分が直接の免疫沈澱を防げることを示
唆したので新しい部分的な精製技術を次のように行っ
た。
により指示(direct)されるが−の分子量は、エンドゲ
ナス酵母菌プロテアーゼがこのプラスミドでAcc I断片
によりコードされたproANVP前駆物質からのNNVPペプチ
ドを切断する可能性と一致しない。この可能性を確認す
るためにこのプラスミドを宿らせている(harbor)酵母
菌の培養物、それに相当する逆配向(YEp-α-NF-12)及
びYEp-α-NF-5及びYEp-α-NF-7(proANVPの小断片を暗
号づけるHaeIII断片)を宿らせている酵母菌断片を特に
免疫沈澱性になる35S−標識蛋白質を発現するか決定す
るために上記のように35S−メチオニン及び35S−シス
テインで標識した。35S−メチオニンはproANVP蛋白質
にとり込まれるがANVPにはとり込まれず、一方35S−シ
ステインは選択的にANVPにとり込まれる。対照実験が、
ある酵母菌培地成分が直接の免疫沈澱を防げることを示
唆したので新しい部分的な精製技術を次のように行っ
た。
【0230】細胞を精製により除去し、細胞のない上清
を直接か又は凍結乾燥により濃縮して使用した。この水
溶液に10倍量のアセトンを加え混合物を氷上で10−15分
間沈澱させる。沈澱物はそれから遠心ろ過でペレット状
にしアセトンを除去した。水の少量[同量(1 volume)
以下]をこのペレットに加え再懸濁を容易にする。この
混合物に次に10倍量のメタノールを加え広範囲に混合し
沈澱物は遠心ろ過により集められた。この上清は次に除
去され真空下乾燥する。このペレットは1.0mlの免疫沈
澱緩衝液中に再溶解し免疫沈澱させ、IV.A.2に述べたよ
うに洗滌する。
を直接か又は凍結乾燥により濃縮して使用した。この水
溶液に10倍量のアセトンを加え混合物を氷上で10−15分
間沈澱させる。沈澱物はそれから遠心ろ過でペレット状
にしアセトンを除去した。水の少量[同量(1 volume)
以下]をこのペレットに加え再懸濁を容易にする。この
混合物に次に10倍量のメタノールを加え広範囲に混合し
沈澱物は遠心ろ過により集められた。この上清は次に除
去され真空下乾燥する。このペレットは1.0mlの免疫沈
澱緩衝液中に再溶解し免疫沈澱させ、IV.A.2に述べたよ
うに洗滌する。
【0231】図35のBに示したように上記抽出工程後
決定される蛋白質の複雑さは全分泌蛋白質の複雑さと比
較すると比較的単純である。図35のB中のレーン1及
び2は、その合成がメタノール溶解画分中のYEp-α-NF-
7及びYEp-α-NF-5によりそれぞれ指示される、分泌35S
−システイン標識蛋白質を示す。図35のBにおいてレ
ーン3及び4は抗−ANVP免疫グロブリンGでの両方の場
合に免疫沈澱をする同じ蛋白質を示す。抗血清は特にYE
p-α-NF-5からの3000ドルトンの蛋白質を特に沈殿さ
せ、一方逆方向(YEp-α-NF-7)から沈殿する蛋白質は
ない(図35のB、レーン3)それぞれプラスミドYEp-
α-NF-12及びYEp-α-NF-9をもつ酵母菌の培養により条
件づけられた培地のメタノール溶解画分に現われる35S
−システイン標識蛋白質の同様な免疫沈殿を示す。その
結果は図35のBレーン3及び4に示されるのと同じで
3000ドルトンの蛋白質はYEp-α-NF-9を含むS.セレビシ
アエにより条件づけられた培地から特に免疫沈殿した。
決定される蛋白質の複雑さは全分泌蛋白質の複雑さと比
較すると比較的単純である。図35のB中のレーン1及
び2は、その合成がメタノール溶解画分中のYEp-α-NF-
7及びYEp-α-NF-5によりそれぞれ指示される、分泌35S
−システイン標識蛋白質を示す。図35のBにおいてレ
ーン3及び4は抗−ANVP免疫グロブリンGでの両方の場
合に免疫沈澱をする同じ蛋白質を示す。抗血清は特にYE
p-α-NF-5からの3000ドルトンの蛋白質を特に沈殿さ
せ、一方逆方向(YEp-α-NF-7)から沈殿する蛋白質は
ない(図35のB、レーン3)それぞれプラスミドYEp-
α-NF-12及びYEp-α-NF-9をもつ酵母菌の培養により条
件づけられた培地のメタノール溶解画分に現われる35S
−システイン標識蛋白質の同様な免疫沈殿を示す。その
結果は図35のBレーン3及び4に示されるのと同じで
3000ドルトンの蛋白質はYEp-α-NF-9を含むS.セレビシ
アエにより条件づけられた培地から特に免疫沈殿した。
【0232】これらの結果は両酵母菌発現プラスミド、
YEp-α-NF-5及びYEp-α-NF-9が、特異の抗−ANVP免疫グ
ロブリンGにより免疫沈澱する3キロドルトンの35S−
システイン標識蛋白質(約25−30アミノ酸長さ)の合成
を指示することを示唆する。
YEp-α-NF-5及びYEp-α-NF-9が、特異の抗−ANVP免疫グ
ロブリンGにより免疫沈澱する3キロドルトンの35S−
システイン標識蛋白質(約25−30アミノ酸長さ)の合成
を指示することを示唆する。
【0233】YEp-α-NF-9を含むS.セレビシアエ菌株W30
1−18Aは1984年5月31日にATCCに寄託され受託番号2071
0を与えられる。
1−18Aは1984年5月31日にATCCに寄託され受託番号2071
0を与えられる。
【0234】d)S.セレビシアエ中のヒトpro心房性尿
***亢進性/血管拡張性ポリペプチド(128−151)の発
現及び分泌 i. PJC1-5発現ベクターの構築 プラスミドYEp-α-8(IV.B.2.b)は消化されHindIIIに
なり、次に上述のようにアガロースゲル電気泳動により
大きな制限断片を精製する。精製DNAは連結され大腸菌
に転換された。1つだけのHindIII制限部位を有するプ
ラスミドDNAは精製されpJJ-1と名づけた(図36の
A)。
***亢進性/血管拡張性ポリペプチド(128−151)の発
現及び分泌 i. PJC1-5発現ベクターの構築 プラスミドYEp-α-8(IV.B.2.b)は消化されHindIIIに
なり、次に上述のようにアガロースゲル電気泳動により
大きな制限断片を精製する。精製DNAは連結され大腸菌
に転換された。1つだけのHindIII制限部位を有するプ
ラスミドDNAは精製されpJJ-1と名づけた(図36の
A)。
【0235】プラスミドpJJ-1は、消化されPstI及びSa
lIになり、次にアガロースゲル電気泳動により317bpDN
A断片の精製を行う。PstI−SalI断片は連結され同時
にプラスミドM13mp8を消化する(メシング、J.及びビエ
リア、J.の上記文献参照)。
lIになり、次にアガロースゲル電気泳動により317bpDN
A断片の精製を行う。PstI−SalI断片は連結され同時
にプラスミドM13mp8を消化する(メシング、J.及びビエ
リア、J.の上記文献参照)。
【0236】MP-JJ1と名づけた単一鎖組換型ファージM1
3DNAを単離し、突然変異誘発性のオリゴデオキシヌクレ
オチド5′-GAAGAAGGGGTAAGCTTGGATAAAAGAG-3′を利用す
るオリゴデオキシヌクレオチド仲介(mediated)−部位
−指示突然変異誘発のための鋳型とに使用する。[ゾー
ラー(Zoller)、M.J.及びスミス、M.、メソッドインエ
ンザイモロジイ(Methods in Enzymology、第100巻、第
468頁〜500頁(1983年)参照]生じる突然変異誘発はα
−因子遺伝子領域(クルジャン、J.及びヘルスコヴィッ
ツ、I.の上記文献参照)における241〜243の部位に存在
するヌクレオチドコドン−TCT−を、この場所にHindIII
制限部位を導入し、このコドンによりコードしたアミノ
酸セリンに変えないAGGに変えた(図36のA)。突然
変異誘発した組換型MP-JJ-1をMP-JJ-5と名づけた。プラ
スミドJJ-1はエチジウムブロマイドの存在においてPst
Iで部位的に消化され、次にフェノール/クロロホルム
抽出及びエタノール沈殿を行う。DNAはHindIIIで終了ま
で消化され次に子牛の腸のホスファターゼ処理を行いア
ガロースゲル電気泳動により大きな制限断片を精製し
た。複写型MP-JJ-5-はPstI及びHindIIIで消化され次に
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による220bpDNA断片の
単離を行った。5853, 2280, 993, 780及び220bpのPstI
−HindIII制限断片を含むプラスミドは精製されpJC1-5
と名づけられた(図36A)。
3DNAを単離し、突然変異誘発性のオリゴデオキシヌクレ
オチド5′-GAAGAAGGGGTAAGCTTGGATAAAAGAG-3′を利用す
るオリゴデオキシヌクレオチド仲介(mediated)−部位
−指示突然変異誘発のための鋳型とに使用する。[ゾー
ラー(Zoller)、M.J.及びスミス、M.、メソッドインエ
ンザイモロジイ(Methods in Enzymology、第100巻、第
468頁〜500頁(1983年)参照]生じる突然変異誘発はα
−因子遺伝子領域(クルジャン、J.及びヘルスコヴィッ
ツ、I.の上記文献参照)における241〜243の部位に存在
するヌクレオチドコドン−TCT−を、この場所にHindIII
制限部位を導入し、このコドンによりコードしたアミノ
酸セリンに変えないAGGに変えた(図36のA)。突然
変異誘発した組換型MP-JJ-1をMP-JJ-5と名づけた。プラ
スミドJJ-1はエチジウムブロマイドの存在においてPst
Iで部位的に消化され、次にフェノール/クロロホルム
抽出及びエタノール沈殿を行う。DNAはHindIIIで終了ま
で消化され次に子牛の腸のホスファターゼ処理を行いア
ガロースゲル電気泳動により大きな制限断片を精製し
た。複写型MP-JJ-5-はPstI及びHindIIIで消化され次に
ポリアクリルアミドゲル電気泳動による220bpDNA断片の
単離を行った。5853, 2280, 993, 780及び220bpのPstI
−HindIII制限断片を含むプラスミドは精製されpJC1-5
と名づけられた(図36A)。
【0237】ii. ヒトANVP(128-151)をコードする合
成DNA配列を含むプラスミドpJC-2の構築 図36Bに示した合成DNA配列は糖分解酵素を暗号化す
る高度に発現された酵母菌遺伝子におけるコドン使用か
ら誘導された好ましい酵母菌コドンの対で設計された。
成DNA配列を含むプラスミドpJC-2の構築 図36Bに示した合成DNA配列は糖分解酵素を暗号化す
る高度に発現された酵母菌遺伝子におけるコドン使用か
ら誘導された好ましい酵母菌コドンの対で設計された。
【0238】図36Bで示された8つのオリゴデオキシ
ヌクレオチドはIV.A.1.b.で述べられたように集められ
た。次に連結しDNAの混合物はHindIIIで消化され次にポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により103bp断片の精製
を行った。HindIIIに結合した精製DNA断片は、M13-mP18
及びM13-mP19を消化したHindIIIに連結させ(ビエ
ラ,、J.及びメシング、J.の上記文献参照)及び図36
B中示した配列に生じた上記の(サンジァーラの上記文
献参照)ジデオキシヌクレオチド配列分析を行う。
ヌクレオチドはIV.A.1.b.で述べられたように集められ
た。次に連結しDNAの混合物はHindIIIで消化され次にポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により103bp断片の精製
を行った。HindIIIに結合した精製DNA断片は、M13-mP18
及びM13-mP19を消化したHindIIIに連結させ(ビエ
ラ,、J.及びメシング、J.の上記文献参照)及び図36
B中示した配列に生じた上記の(サンジァーラの上記文
献参照)ジデオキシヌクレオチド配列分析を行う。
【0239】プラスミドpJC-2はα−因子信号/解読ペ
プチドをα−因子前駆物質のアミノ酸85の後に始まるヒ
トAVNPペプチド配列(128〜151)のフレーム融合でコー
ドした。α−因子調節の存在及びANPVペプチドの上の分
泌配列が84及び85のそれぞれの場所(図36B)におけ
るリジン−アルギニン残渣に続くKEX2位によりコードさ
れたプロテアーゼにより蛋白質分解をさせ[ジュリウス
(Julius)、D.らのCell、37巻:第1075頁〜1089頁(19
84年)]、ラットproANVP配列のIV.b.1.cに述べたのと
同様なヒトAVNP(128-151)の細胞外分泌をさせる。プ
ラスミドJC-2は選択的媒体上で保持されたS.セレビシア
エに形質転換するのに使用された。
プチドをα−因子前駆物質のアミノ酸85の後に始まるヒ
トAVNPペプチド配列(128〜151)のフレーム融合でコー
ドした。α−因子調節の存在及びANPVペプチドの上の分
泌配列が84及び85のそれぞれの場所(図36B)におけ
るリジン−アルギニン残渣に続くKEX2位によりコードさ
れたプロテアーゼにより蛋白質分解をさせ[ジュリウス
(Julius)、D.らのCell、37巻:第1075頁〜1089頁(19
84年)]、ラットproANVP配列のIV.b.1.cに述べたのと
同様なヒトAVNP(128-151)の細胞外分泌をさせる。プ
ラスミドJC-2は選択的媒体上で保持されたS.セレビシア
エに形質転換するのに使用された。
【0240】iii. S.セレビシアエからのヒトANVP(128
〜151)配列の発現及び精製 プラスミドJC1-5又はJC-2を含むS.セレビシアエW301〜1
84を上記選択的合成培地(IV.B.1.c.)で培養の安定す
る(stationary phase of growth)まで培養し、その時
細胞を除去し、4℃で遠心ろ過した。表6に示した結果
はプラスミドJC-2を含むS.セレビシアエが免疫反応性ペ
プチドを分泌することを示す。
〜151)配列の発現及び精製 プラスミドJC1-5又はJC-2を含むS.セレビシアエW301〜1
84を上記選択的合成培地(IV.B.1.c.)で培養の安定す
る(stationary phase of growth)まで培養し、その時
細胞を除去し、4℃で遠心ろ過した。表6に示した結果
はプラスミドJC-2を含むS.セレビシアエが免疫反応性ペ
プチドを分泌することを示す。
【0241】
【0242】免疫反応性ペプチドを明確に同定するため
にプラスミドJC-2を含むS.セレビシアエを30℃で安定相
になるまで選択的な合成培地の1 l中に培養した。遠心
ろ過により細胞を除去した。生じる上清を水酸化アンモ
ニウムでpH8.0に調整し、次に遠心ろ過を行なった。生
じた澄んだ上清を予め0.01モルの酢酸アンモニウムで平
衡にしたDEAE(登録商標)セファセル(登録商標)(フ
ォルマシア)を含む2.5cm×10cmカラムに入れ、次に溶
出液を集め(約1.1 l)、凍結乾燥した。乾燥混合物は
約12mlの0.5モルの酢酸中に再懸濁し、再懸濁用液で平
衡にしたセファデックス(登録商標)G-11を含む2.5cm
×50cmカラムに通した。放射性免疫検定(Vを参照)に
より検定された免疫反応性を含む画分を集めプールし凍
結乾燥した。
にプラスミドJC-2を含むS.セレビシアエを30℃で安定相
になるまで選択的な合成培地の1 l中に培養した。遠心
ろ過により細胞を除去した。生じる上清を水酸化アンモ
ニウムでpH8.0に調整し、次に遠心ろ過を行なった。生
じた澄んだ上清を予め0.01モルの酢酸アンモニウムで平
衡にしたDEAE(登録商標)セファセル(登録商標)(フ
ォルマシア)を含む2.5cm×10cmカラムに入れ、次に溶
出液を集め(約1.1 l)、凍結乾燥した。乾燥混合物は
約12mlの0.5モルの酢酸中に再懸濁し、再懸濁用液で平
衡にしたセファデックス(登録商標)G-11を含む2.5cm
×50cmカラムに通した。放射性免疫検定(Vを参照)に
より検定された免疫反応性を含む画分を集めプールし凍
結乾燥した。
【0243】乾燥物質を5mlの酢酸中に再懸濁し、IV.
A.5.に述べられた高性能液体クロマトグラフィーを行な
う。
A.5.に述べられた高性能液体クロマトグラフィーを行な
う。
【0244】免疫反応性ピーク画分を単離し200pmoles
が上記IV.A.5.のように自動アミノ酸配列分析にかけら
れた。生じたアミノ酸配列は
が上記IV.A.5.のように自動アミノ酸配列分析にかけら
れた。生じたアミノ酸配列は
【0245】H-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-
Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Ph
e-Arg-Tyr-OHであった。
Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Ph
e-Arg-Tyr-OHであった。
【0246】加えて、酵母菌ポリペプチドによる汚染物
はこの分析法により探知されなかった。
はこの分析法により探知されなかった。
【0247】PJC2を含むS.セレビシアエ株・W301-18Aは
1985年4月9日にATCCに寄託され受託番号は20754だっ
た。
1985年4月9日にATCCに寄託され受託番号は20754だっ
た。
【0248】C.培養されたチャイニーズハムスター卵
巣細胞におけるpre心房性のナトリウム尿***亢進性/
血管拡張性ポリペプチドの発現 チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるprorANVP(25
-152)及びprohANVP(26-151)の発現を次の例で述べ
る。これらの例は実施例で示され哺乳動物の細胞におい
て同じようにpre-proANVP、proANVP又はANVPのいずれも
発現しうることが容易に理解されるであろう。
巣細胞におけるpre心房性のナトリウム尿***亢進性/
血管拡張性ポリペプチドの発現 チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるprorANVP(25
-152)及びprohANVP(26-151)の発現を次の例で述べ
る。これらの例は実施例で示され哺乳動物の細胞におい
て同じようにpre-proANVP、proANVP又はANVPのいずれも
発現しうることが容易に理解されるであろう。
【0249】1) ラットpre-pro心房性ナトリウム尿排
泄亢進性/血管拡張性ポリペプチドの発現 哺乳動物の細胞においてラットのpre-pro ANVPの発現を
容易にする為に、ヒトメタロチオネンII(hMTII)遺伝
子から誘導された強力な調節プロモーターに融合した、
ラットpre-pro ANVPのための暗号づけ染色体中に、雑種
遺伝子が構築された。これは2つの工程により行う。第
一には、発現ベクターを調整した。発現ベクター、pHS
I、は暗号領域の隣りの5′非翻訳領域にある塩基+70へ
の転写の初めに塩基-765で自然に生じるHindIII制限部
位からhMTII配列の840ヌクレオチド塩基対を運ぶ[カリ
ン(Kalin)、Mらのネーチャー、第299巻、第797頁〜80
2頁(1982)]。pHSIは又、その中に暗号配列が挿入さ
れうる領域を運ぶ。pHSIを構築するために、hMTII遺伝
子を運ぶプラスミドp84Hは制限エンドヌクレアーゼBamH
Iで終りまで消化され次にエクソヌクレアーゼBal-31で
処理して末端ヌクレオチドを除去する。HindIIIでの消
化の次にこの反応生成物は、HindIII及びHincIIの消化
で切断されたプラスミドにpUC8に連結された。生じるプ
ラスミドの組換え型の1つはヌクレオチド配列としてpH
SIの組成物を有した。
泄亢進性/血管拡張性ポリペプチドの発現 哺乳動物の細胞においてラットのpre-pro ANVPの発現を
容易にする為に、ヒトメタロチオネンII(hMTII)遺伝
子から誘導された強力な調節プロモーターに融合した、
ラットpre-pro ANVPのための暗号づけ染色体中に、雑種
遺伝子が構築された。これは2つの工程により行う。第
一には、発現ベクターを調整した。発現ベクター、pHS
I、は暗号領域の隣りの5′非翻訳領域にある塩基+70へ
の転写の初めに塩基-765で自然に生じるHindIII制限部
位からhMTII配列の840ヌクレオチド塩基対を運ぶ[カリ
ン(Kalin)、Mらのネーチャー、第299巻、第797頁〜80
2頁(1982)]。pHSIは又、その中に暗号配列が挿入さ
れうる領域を運ぶ。pHSIを構築するために、hMTII遺伝
子を運ぶプラスミドp84Hは制限エンドヌクレアーゼBamH
Iで終りまで消化され次にエクソヌクレアーゼBal-31で
処理して末端ヌクレオチドを除去する。HindIIIでの消
化の次にこの反応生成物は、HindIII及びHincIIの消化
で切断されたプラスミドにpUC8に連結された。生じるプ
ラスミドの組換え型の1つはヌクレオチド配列としてpH
SIの組成物を有した。
【0250】雑種遺伝子の構築を完了するために、EcoR
I−SalIラットpre-proANVP cDNAをプラスミドpNF l
(II.A.)からEcoRI及びSalIでの消化により単離し、
次にポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。pHSlは
EcoRIで切断し、T4-DNAリガーゼでcDNA断片に連結し
た。反応生成物は、再循環させるために、次に第2の連
結をされるブラント末端分子を生じるために、4つのヌ
クレオチドトリホスフェイト及びDNAポリメラーゼI
[クレノウ断片]で次に培養する。組換え型プラスミド
分子は大腸菌MC1061に導入され制限エンドヌクレアーゼ
分析により分離した(マニチアスら上記文献第104頁参
照)。2つの組換え型、(図37)pMT-NF l−10及びpM
T-NF l−20がpSV2:NEO[サザン(Southern)、P及びP.
ベルグ(Berg)、J. Mol. Appl. Jenet.第1巻、第327
頁〜第341頁(1982年)]、ネオマイシン類似物G418抵
抗性を与える機能的遺伝子を運ぶプラスミドでの同時形
質転換による培養細胞のチャイニーズハムスター卵巣
(CHO)系統に導入した。pSV:NEOの500ナノグラム及び
pMT-NF l−10の5μg又はpMT-NF l−20はDNAに4時間さ
らした後15%のグリセロールで2分“ショック(shoc
k)”を含有の標識試料[ウィグラー(Wigler)、M.らC
ell、第16巻、第777頁〜785頁(1985年)]によるリン
酸カルシウム-DNA同時沈殿物中に細胞の60mmディッシュ
(dish)に適用させる。1日後その細胞は1mg/mlでG4
18にさらす。この工程はpMT-NF l−10はpMT-NF l−20の
安定な遺伝も認めたほとんどのG418抵抗コロニーの1つ
の(pool)を生じた。CHO細胞及び他の培養細胞の先の
経験[マコーミック、Fらのモレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー(Molecular and Cellular Biolo
gy)4−1第166頁(1984年)]は、それらが哺乳動物
のプリホルモンから信号ペプチドを切断でき、ポリペプ
チドの残りを栄養培地に分泌することができる。それに
よって、pre-proANVP及び関連ペプチドの生産は次に35
S−メチオニンで細胞を培養することにより又、標準蛋
白質ゲル分析により放射性標識分泌生産物を検査するこ
とにより検査される。
I−SalIラットpre-proANVP cDNAをプラスミドpNF l
(II.A.)からEcoRI及びSalIでの消化により単離し、
次にポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。pHSlは
EcoRIで切断し、T4-DNAリガーゼでcDNA断片に連結し
た。反応生成物は、再循環させるために、次に第2の連
結をされるブラント末端分子を生じるために、4つのヌ
クレオチドトリホスフェイト及びDNAポリメラーゼI
[クレノウ断片]で次に培養する。組換え型プラスミド
分子は大腸菌MC1061に導入され制限エンドヌクレアーゼ
分析により分離した(マニチアスら上記文献第104頁参
照)。2つの組換え型、(図37)pMT-NF l−10及びpM
T-NF l−20がpSV2:NEO[サザン(Southern)、P及びP.
ベルグ(Berg)、J. Mol. Appl. Jenet.第1巻、第327
頁〜第341頁(1982年)]、ネオマイシン類似物G418抵
抗性を与える機能的遺伝子を運ぶプラスミドでの同時形
質転換による培養細胞のチャイニーズハムスター卵巣
(CHO)系統に導入した。pSV:NEOの500ナノグラム及び
pMT-NF l−10の5μg又はpMT-NF l−20はDNAに4時間さ
らした後15%のグリセロールで2分“ショック(shoc
k)”を含有の標識試料[ウィグラー(Wigler)、M.らC
ell、第16巻、第777頁〜785頁(1985年)]によるリン
酸カルシウム-DNA同時沈殿物中に細胞の60mmディッシュ
(dish)に適用させる。1日後その細胞は1mg/mlでG4
18にさらす。この工程はpMT-NF l−10はpMT-NF l−20の
安定な遺伝も認めたほとんどのG418抵抗コロニーの1つ
の(pool)を生じた。CHO細胞及び他の培養細胞の先の
経験[マコーミック、Fらのモレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー(Molecular and Cellular Biolo
gy)4−1第166頁(1984年)]は、それらが哺乳動物
のプリホルモンから信号ペプチドを切断でき、ポリペプ
チドの残りを栄養培地に分泌することができる。それに
よって、pre-proANVP及び関連ペプチドの生産は次に35
S−メチオニンで細胞を培養することにより又、標準蛋
白質ゲル分析により放射性標識分泌生産物を検査するこ
とにより検査される。
【0251】培地へ分泌された35S−メチオニン標識蛋
白質のオートラジオグラムは抗−ANVP免疫グロブリンに
より特に免疫沈殿される18,000ドルトンの蛋白質の外観
を明かにする。この蛋白質は対照プラスミドを含む細胞
の35S−メチオニン照射蛋白質においてはみられない。
このようにpMT-NF-1-10を含むCHO細胞はこれらの細胞の
培地proANVPsを分泌する。
白質のオートラジオグラムは抗−ANVP免疫グロブリンに
より特に免疫沈殿される18,000ドルトンの蛋白質の外観
を明かにする。この蛋白質は対照プラスミドを含む細胞
の35S−メチオニン照射蛋白質においてはみられない。
このようにpMT-NF-1-10を含むCHO細胞はこれらの細胞の
培地proANVPsを分泌する。
【0252】pMT-NF-1-10を含むチャイニーズハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞は、1984年5月31日ATCCに寄託され
受託番号はCRL8569である。
ー卵巣(CHO)細胞は、1984年5月31日ATCCに寄託され
受託番号はCRL8569である。
【0253】2) 培養した哺乳動物細胞におけるヒトpr
e-心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプ
チドの発現 ヒトpre-proANVPsはヒトゲノムクローンの特徴を説明す
るための適切な変更がある同様な方法で発現された。簡
単にはBamHIを、pre-proANVP遺伝子を結びつけるEcoR
Iヒトゲノム部分に運ぶプラスミド、HGRB1が構築され部
分的に制限エンドヌクレアーゼAccIで部分消化され、E
coRIで完全に消化された。生じたAccI−EcoRI断片
をポリアクリルアミドゲル精製により分離する。この断
片は、5′非翻訳領域から遺伝子の3′末端を過ぎる点ま
でのびているものであるが、この断片はAccI及びEcoR
Iで切断した発現プラスミドpMT401に結合した。プラス
ミドpMT401はM13mp7から、(ビエイラ及びメシングらの
上記文献参照)pHSIのBamHI部位へのBamHI結合ポリリ
ンカー領域の挿入により誘導される。この生じた組換型
はヒトメタロチオネインプロモーターから3′位ヒトpre
-proANVP遺伝子を含みpHNF-8と名づけられた。この雑種
構築は次に、ラットpre-proANVPsについて上述したのと
同様な方法で発現のために培養CHO細胞に誘導される。
e-心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプ
チドの発現 ヒトpre-proANVPsはヒトゲノムクローンの特徴を説明す
るための適切な変更がある同様な方法で発現された。簡
単にはBamHIを、pre-proANVP遺伝子を結びつけるEcoR
Iヒトゲノム部分に運ぶプラスミド、HGRB1が構築され部
分的に制限エンドヌクレアーゼAccIで部分消化され、E
coRIで完全に消化された。生じたAccI−EcoRI断片
をポリアクリルアミドゲル精製により分離する。この断
片は、5′非翻訳領域から遺伝子の3′末端を過ぎる点ま
でのびているものであるが、この断片はAccI及びEcoR
Iで切断した発現プラスミドpMT401に結合した。プラス
ミドpMT401はM13mp7から、(ビエイラ及びメシングらの
上記文献参照)pHSIのBamHI部位へのBamHI結合ポリリ
ンカー領域の挿入により誘導される。この生じた組換型
はヒトメタロチオネインプロモーターから3′位ヒトpre
-proANVP遺伝子を含みpHNF-8と名づけられた。この雑種
構築は次に、ラットpre-proANVPsについて上述したのと
同様な方法で発現のために培養CHO細胞に誘導される。
【0254】pHNF-8で形質転換された培養CHO細胞は、1
0%子牛の胎児血清を補ったハリスF-12培地を含む皿に
低希釈で細胞を置くことによりサブクローン化(subclo
ned)した。個々のサブクローンは続いて除去し、それ
ぞれpro-ANVP生産物について放射免疫検定(V)及び35S
−メチオニンでの放射性標識の両方により検査を行っ
た。35S−メチオニン標識蛋白質はSDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分離した。図38中にこれらの
実験の結果が示されている。レーン2は対照CHO細胞か
らの35S−メチオニン標識蛋白質を示している。レーン
1はサブクローン化する前のpHNF-8での形質転換された
CHOプールからの35S−メチオニン標識蛋白質を示す。
レーン3-6はpHNF-8を含む4つのサブクローン(subclon
es)から35S−メチオニン標識蛋白質を示し、CHO-8/2
-6、CHO-8/2-55、CHO-8/2-81、CHO-8/2-93と名づけ
られた。サブクローンのそれぞれにおいて、明らかな35
S−メチオニン標識バンドは18,000及び10,000ドルトン
に表れる。そのバンドはproANVP(18,000K)及び特異抗
体での免疫沈澱により、この蛋白質のアミノ酸末端から
なるproANVP断片として同定される。サブクローンがpro
ANVPを生産するという事実はV.で述べられた放射免疫検
定によって確認された。
0%子牛の胎児血清を補ったハリスF-12培地を含む皿に
低希釈で細胞を置くことによりサブクローン化(subclo
ned)した。個々のサブクローンは続いて除去し、それ
ぞれpro-ANVP生産物について放射免疫検定(V)及び35S
−メチオニンでの放射性標識の両方により検査を行っ
た。35S−メチオニン標識蛋白質はSDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分離した。図38中にこれらの
実験の結果が示されている。レーン2は対照CHO細胞か
らの35S−メチオニン標識蛋白質を示している。レーン
1はサブクローン化する前のpHNF-8での形質転換された
CHOプールからの35S−メチオニン標識蛋白質を示す。
レーン3-6はpHNF-8を含む4つのサブクローン(subclon
es)から35S−メチオニン標識蛋白質を示し、CHO-8/2
-6、CHO-8/2-55、CHO-8/2-81、CHO-8/2-93と名づけ
られた。サブクローンのそれぞれにおいて、明らかな35
S−メチオニン標識バンドは18,000及び10,000ドルトン
に表れる。そのバンドはproANVP(18,000K)及び特異抗
体での免疫沈澱により、この蛋白質のアミノ酸末端から
なるproANVP断片として同定される。サブクローンがpro
ANVPを生産するという事実はV.で述べられた放射免疫検
定によって確認された。
【0255】この系において蛋白質分解によりproANVP
の実質的部分が切断されているということを10,000ドル
トン型が含むことを注意すべきである。そのような蛋白
質分解結果はアミノ酸末端断片(10,000K)及びより短
いANVPのものを含むより小さいカルボキシ末端断片を生
じる。このようにクローンは、生物学的活性のANVPセグ
メントがあるか又はないより小さな断片を生じるために
重要と考えられている。
の実質的部分が切断されているということを10,000ドル
トン型が含むことを注意すべきである。そのような蛋白
質分解結果はアミノ酸末端断片(10,000K)及びより短
いANVPのものを含むより小さいカルボキシ末端断片を生
じる。このようにクローンは、生物学的活性のANVPセグ
メントがあるか又はないより小さな断片を生じるために
重要と考えられている。
【0256】pHNF-8を含むチャイニーズハムスター卵巣
(CHO)細胞及びCHO-8/2-81という名のものを1985年4
月9日に寄託し、受託番号CRL-8782であった。
(CHO)細胞及びCHO-8/2-81という名のものを1985年4
月9日に寄託し、受託番号CRL-8782であった。
【0257】D.pre心房性ナトリウム尿***亢進性/
血管拡張性ポリペプチド及び心房ナトリウム尿***亢進
性/血管拡張性ポリペプチドから誘導された発現生産物
の生物学的活性 その発現及び分泌がD.2で述べられた酵母菌α−因子系
及びC.2で述べられた大腸菌系により指示された、種々
のラット及びヒトproANVPs及びANVPsが試験され生物学
的活性を有することが示された。酵母菌の培地(100m
l)は100μg/mlのHSAを含む合成培地を30℃で16時間増
殖させる。細胞は遠心分離により除去され培地は凍結乾
燥する。凍結乾燥した粉末は2mlの蒸留水で再構成し10
倍量のアセトンを加える。その溶液を完全に混合し、次
にソルボール(Sorvall)RT6000遠心機中で10分間10,00
0×g遠心分離した[ソルボール・インストルメント(Sor
vallInstruments)、デラウエア州、ウィルミントン(W
ilmington)]。上清を除去後、そのペレットを1mlの
蒸留水中に再懸濁させ、10倍量のメタノールを加えた。
この溶液を完全に混合し、ソルボールRC5B遠心機で10分
間20,000×g遠心分離する。1/2の溶液をサバント(Sava
nt)型蒸発器での回転排気により乾燥した(表1“メタ
ノール溶解性”画分を参照)。残る溶液を0.5モルの酢
酸で1:1に希釈し、0.5モル酢酸で平衡にしたSP−セ
ファデックス(登録商標)(シグマケミカル社製)の3
mlカラムにかける。そのカラムを0.5モル酢酸15mlで洗
い次に1.0モルの酢酸アンモニウム6mlで溶離した。そ
の溶離物質を次に凍結乾燥により乾燥した(第VIIの
“ポースト(post)SP-セファデックス”画分)。その
乾燥メタノール溶解性及び酢酸アンモニウム溶離物質を
0.5mlの蒸留水で再溶解し、クライネルト(Kleinert)
らのハイパーテンション6巻増刊1第143頁〜146頁(19
84年)中に述べてある予約ラビット胸大動脈環(precon
tracted rabbit thoracie aortic ring)モデルを使用
して生物学的活性を試験した。粗凍結乾燥培地から再構
成された等量の物質、メタノール溶解性蛋白質又は1.0
モル酢酸アンモニウムでのSP-セファデックス(登録商
標)から溶離した蛋白質が5μモルヒスタミンで予備収
縮した(precontracted)大動脈環(aortic rings)を
使用して比較する。そのプラスミドproANVP(アミノ酸2
6-152)(YEp-α-NF-9)及びproANVP(アミノ酸121-15
2)(YEp-α-NF-5)をコードしたものである酵母菌培養
物により合成された物質及び同様に対応する逆配向性物
質(それぞれYEp-α-NF-12及びYEp-α-NF-7)を比較す
る。その結果を表7に表わした。表7は、pro心房性ナ
トリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド及びS.
セレビシアエにより発現されたプム心房ナトリウム***
亢進性/血管拡張性ポリペプチド断片の血管弛緩特性を
示す。重要な血管拡張活性がメタノール溶解物質及びYE
p-α-NF-5及びYEp-α-NF-9を含む細胞からの抽出物中の
ポースト(post)SP-セファデックスに検知できた。逆
配向DNAプラスミドを含む細胞からの抽出物は活性でな
い。この発見は図35で示した免疫沈殿反応データと同
様に、酵母菌か成熟ANVPを含む全長及びより小さいproA
NVP断片を生物学的活性能力を示す型に処理することを
表わす。
血管拡張性ポリペプチド及び心房ナトリウム尿***亢進
性/血管拡張性ポリペプチドから誘導された発現生産物
の生物学的活性 その発現及び分泌がD.2で述べられた酵母菌α−因子系
及びC.2で述べられた大腸菌系により指示された、種々
のラット及びヒトproANVPs及びANVPsが試験され生物学
的活性を有することが示された。酵母菌の培地(100m
l)は100μg/mlのHSAを含む合成培地を30℃で16時間増
殖させる。細胞は遠心分離により除去され培地は凍結乾
燥する。凍結乾燥した粉末は2mlの蒸留水で再構成し10
倍量のアセトンを加える。その溶液を完全に混合し、次
にソルボール(Sorvall)RT6000遠心機中で10分間10,00
0×g遠心分離した[ソルボール・インストルメント(Sor
vallInstruments)、デラウエア州、ウィルミントン(W
ilmington)]。上清を除去後、そのペレットを1mlの
蒸留水中に再懸濁させ、10倍量のメタノールを加えた。
この溶液を完全に混合し、ソルボールRC5B遠心機で10分
間20,000×g遠心分離する。1/2の溶液をサバント(Sava
nt)型蒸発器での回転排気により乾燥した(表1“メタ
ノール溶解性”画分を参照)。残る溶液を0.5モルの酢
酸で1:1に希釈し、0.5モル酢酸で平衡にしたSP−セ
ファデックス(登録商標)(シグマケミカル社製)の3
mlカラムにかける。そのカラムを0.5モル酢酸15mlで洗
い次に1.0モルの酢酸アンモニウム6mlで溶離した。そ
の溶離物質を次に凍結乾燥により乾燥した(第VIIの
“ポースト(post)SP-セファデックス”画分)。その
乾燥メタノール溶解性及び酢酸アンモニウム溶離物質を
0.5mlの蒸留水で再溶解し、クライネルト(Kleinert)
らのハイパーテンション6巻増刊1第143頁〜146頁(19
84年)中に述べてある予約ラビット胸大動脈環(precon
tracted rabbit thoracie aortic ring)モデルを使用
して生物学的活性を試験した。粗凍結乾燥培地から再構
成された等量の物質、メタノール溶解性蛋白質又は1.0
モル酢酸アンモニウムでのSP-セファデックス(登録商
標)から溶離した蛋白質が5μモルヒスタミンで予備収
縮した(precontracted)大動脈環(aortic rings)を
使用して比較する。そのプラスミドproANVP(アミノ酸2
6-152)(YEp-α-NF-9)及びproANVP(アミノ酸121-15
2)(YEp-α-NF-5)をコードしたものである酵母菌培養
物により合成された物質及び同様に対応する逆配向性物
質(それぞれYEp-α-NF-12及びYEp-α-NF-7)を比較す
る。その結果を表7に表わした。表7は、pro心房性ナ
トリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド及びS.
セレビシアエにより発現されたプム心房ナトリウム***
亢進性/血管拡張性ポリペプチド断片の血管弛緩特性を
示す。重要な血管拡張活性がメタノール溶解物質及びYE
p-α-NF-5及びYEp-α-NF-9を含む細胞からの抽出物中の
ポースト(post)SP-セファデックスに検知できた。逆
配向DNAプラスミドを含む細胞からの抽出物は活性でな
い。この発見は図35で示した免疫沈殿反応データと同
様に、酵母菌か成熟ANVPを含む全長及びより小さいproA
NVP断片を生物学的活性能力を示す型に処理することを
表わす。
【0258】
【表7】
【0259】大動脈環を5μモルのヒスタミンで予備収
縮(precontracted)した。大動脈環は次にS.セレビシ
アエ培養で得られた蛋白質で次に処理された。その蛋白
質は培養培地のアセトン/メタノール処理により精製
し、指示画分はSP-セファデックスを通過させた。YEp-
α-NF-5及びYEp-α-NF-9は正配向でのproANVP cDNAを含
有し、YEp-α-NF-7及びYEp-α-NF-12は逆配向でのDNAを
含有した。データーはクレイナート(Kleinert)の上記
文献に述べた予備収縮環(precontracted rings)の弛
緩%として表わした。
縮(precontracted)した。大動脈環は次にS.セレビシ
アエ培養で得られた蛋白質で次に処理された。その蛋白
質は培養培地のアセトン/メタノール処理により精製
し、指示画分はSP-セファデックスを通過させた。YEp-
α-NF-5及びYEp-α-NF-9は正配向でのproANVP cDNAを含
有し、YEp-α-NF-7及びYEp-α-NF-12は逆配向でのDNAを
含有した。データーはクレイナート(Kleinert)の上記
文献に述べた予備収縮環(precontracted rings)の弛
緩%として表わした。
【0260】上記発現物質試料は又、ナトリウム尿***
亢進性及び利尿性活性をカマルゴ(Camargo)、M.らのA
m. J. Physiol.、246巻F447〜F456(1984年)に記載さ
れているように単離された灌流(perfused)ラット腎臓
モデルを使用して検査した。表8に示されたようにYEp-
α-NF-5を含む酵母菌培養により合成され分泌され及びS
P-セファディクス工程を通って上記のように精製された
物質は10分間ごとにくり返し試験する間に検査されたよ
うに、尿Na+***を約3倍、尿量を2倍に増加させる。
腎糸球体のろ過作用も又、この実験において利尿作用と
一致して増加する。逆配向性対照プラスミドYEp-α-NF-
7を含有する酵母菌培養により合成され分泌され、SP-セ
ファデックス(登録商標)で精製された物質において、
同じ試験を行う時尿Na+***、尿量、腎糸球体ろ過作
用、腎抵抗性において重大な増加はない。
亢進性及び利尿性活性をカマルゴ(Camargo)、M.らのA
m. J. Physiol.、246巻F447〜F456(1984年)に記載さ
れているように単離された灌流(perfused)ラット腎臓
モデルを使用して検査した。表8に示されたようにYEp-
α-NF-5を含む酵母菌培養により合成され分泌され及びS
P-セファディクス工程を通って上記のように精製された
物質は10分間ごとにくり返し試験する間に検査されたよ
うに、尿Na+***を約3倍、尿量を2倍に増加させる。
腎糸球体のろ過作用も又、この実験において利尿作用と
一致して増加する。逆配向性対照プラスミドYEp-α-NF-
7を含有する酵母菌培養により合成され分泌され、SP-セ
ファデックス(登録商標)で精製された物質において、
同じ試験を行う時尿Na+***、尿量、腎糸球体ろ過作
用、腎抵抗性において重大な増加はない。
【0261】 表 8 単離した灌流ラット腎臓中の腎機能における、S.セレビシアエにより発現され 分泌された心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチドの効果 対 照 YEp-α-NF-5 YEp-α-NF-7 尿ナトリウム(μEg/分) 3.56 11.05 3.78 尿量(μl/分) 6.15 14.0 7.24 結果は2回の10分対照(control)時間の平均を表わ
し、次に50μlのSP-セファデックス精製蛋白質を加え
た。実験の測定は3回連続10分間の間に得られた平均値
を表わす。
し、次に50μlのSP-セファデックス精製蛋白質を加え
た。実験の測定は3回連続10分間の間に得られた平均値
を表わす。
【0262】上記VI.B.2.d.に記載されたように精製し
たヒトproANVP(128-151)を上記のように検定し生物学
的活性の全範囲を表わした。
たヒトproANVP(128-151)を上記のように検定し生物学
的活性の全範囲を表わした。
【0263】酵母菌発現活性物質に同様な方法で、IV.A
及びIV.Cにそれぞれ記載されている細菌及び哺乳動物の
細胞により発現されたラット、ヒトpre-proANVPs、proA
NVPs及びANVPsは、生物学的活性を有することが示され
てきた。
及びIV.Cにそれぞれ記載されている細菌及び哺乳動物の
細胞により発現されたラット、ヒトpre-proANVPs、proA
NVPs及びANVPsは、生物学的活性を有することが示され
てきた。
【0264】その合成が大腸菌中のプラスミドpRNF-685
2及びpRNF-12852のそれぞれにより指示されたラットpro
ANVP断片87-152及び26-152を次のように1 lの細菌細胞
から抽出した。その細胞を5000×gで60分間遠心分離を
行って回収し、pH7.5の50ミリモルトリス10ml中に再懸
濁した。この懸濁液を加熱システム超音波処理機[ヒー
トシステムズ(Heat Systems)、ファーミングドル(Fa
rmingdale)、ニューヨーク]調節(setting)4を使用
して1分間超音波で処理した。超音波処理物質は次に10
5,000×gで遠心分離し、粒状物質を除去し、生じた上清
みを取っておき粗細胞抽出物と粗細菌抽出物の1画分を
次に5分間煮沸させ、1時間pHを2.5に低下させる。次
にpHを中性にし、煮沸した酸抽出物及び粗細菌抽出物を
上記のようにウサギ胸大動脈環に、適用した。表9で示
すように、pRNF-6852及びpRNF12852を含有する抽出物か
らの粗細菌抽出物及び煮沸酸抽出物の両方は予備収縮組
織を弛緩した。pKT52ベクターを含みANVP DNAがない細
菌からの対照試料は非活性であった。このように酵母菌
発現生成物と同じ方法で細菌性ラットproANVP断片は血
管拡張性がある。さらに、これらの試料の1画分は煮沸
してあり酸抽出され、粗細菌抽出物に関する生物学的活
性の損失なく、次の工程を防ぐので全68アミノ酸断片は
生物学的に活性と考えられた。
2及びpRNF-12852のそれぞれにより指示されたラットpro
ANVP断片87-152及び26-152を次のように1 lの細菌細胞
から抽出した。その細胞を5000×gで60分間遠心分離を
行って回収し、pH7.5の50ミリモルトリス10ml中に再懸
濁した。この懸濁液を加熱システム超音波処理機[ヒー
トシステムズ(Heat Systems)、ファーミングドル(Fa
rmingdale)、ニューヨーク]調節(setting)4を使用
して1分間超音波で処理した。超音波処理物質は次に10
5,000×gで遠心分離し、粒状物質を除去し、生じた上清
みを取っておき粗細胞抽出物と粗細菌抽出物の1画分を
次に5分間煮沸させ、1時間pHを2.5に低下させる。次
にpHを中性にし、煮沸した酸抽出物及び粗細菌抽出物を
上記のようにウサギ胸大動脈環に、適用した。表9で示
すように、pRNF-6852及びpRNF12852を含有する抽出物か
らの粗細菌抽出物及び煮沸酸抽出物の両方は予備収縮組
織を弛緩した。pKT52ベクターを含みANVP DNAがない細
菌からの対照試料は非活性であった。このように酵母菌
発現生成物と同じ方法で細菌性ラットproANVP断片は血
管拡張性がある。さらに、これらの試料の1画分は煮沸
してあり酸抽出され、粗細菌抽出物に関する生物学的活
性の損失なく、次の工程を防ぐので全68アミノ酸断片は
生物学的に活性と考えられた。
【0265】IV.A.5.で記載されたように大腸菌から調
製された精製ヒトproANVP(26-151)は血管組織におい
て十分な効果を有する事が示された。
製された精製ヒトproANVP(26-151)は血管組織におい
て十分な効果を有する事が示された。
【0266】 表 9 大腸菌に発現されたpro心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプ チド断片の血管弛緩作用 試 料 弛緩% 対照 8±2 proANVP(87-152) 74±8 proANVP(25-152) 65±9 ウサギ胸大動脈管が5μMヒスタミンで予備収縮され
た。データーは予備収縮管の弛緩%として表わした。
た。データーは予備収縮管の弛緩%として表わした。
【0267】哺乳動物細胞発現の場合、proANVP(25-15
2)及びprohANVP(126-151)の両方が上述のと同様に生
物学的活性を示したCHO細胞において生成された。
2)及びprohANVP(126-151)の両方が上述のと同様に生
物学的活性を示したCHO細胞において生成された。
【0268】酵母菌、細菌及び哺乳動物細胞におけるDN
A組換え技術を述べたことを使って発現されたproANVP蛋
白質はすべて普通のANVP配列:
A組換え技術を述べたことを使って発現されたproANVP蛋
白質はすべて普通のANVP配列:
【0269】
【化25】 (式中角型括弧をつけたアミノ酸残渣はヒトANVPsにお
いてはメチオニンでラットANVPsにおいてはイソロイシ
ンである)を含有する。上記工程で発現されたproANVP
断片は血管弛緩、ナトリウム***及び利尿作用能力を示
す(表7、表8及び表9)。これらの同様なそして関連
のある作用は、又、rANVP(126-150)及びhANVP(127-1
51)でも明らかになった。このようにこれらの発現断片
は合成ANVPで試験管内調製及びヒト又は動物への生体に
注射した時の両方にすべての特性を共有する。表5に示
されたように合成ANVPsは普通の心房性血圧、血漿レニ
ン活性及び血漿アルドステロンを低下させ、尿量及び尿
ナトリウム***を低下させた。これらは利尿及び抗高血
圧性物質の望ましい特性である。さらに、proANVPs及び
ANVPsは量及び血圧調節の主な中心で作用する。このよ
うにpre-proANVPs、proANVPs及びANVPsは組換えDNA方法
により生成され、上記に匹敵する方法で酵母菌、細菌又
は哺乳動物の細胞に発現された時、浮腫状態(即ち、う
っ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変及び無効腎灌
流)の急性及び慢性治療及び腎不全及び高血圧の慢性治
療に有用性を見出すという事が結論づけられた。
いてはメチオニンでラットANVPsにおいてはイソロイシ
ンである)を含有する。上記工程で発現されたproANVP
断片は血管弛緩、ナトリウム***及び利尿作用能力を示
す(表7、表8及び表9)。これらの同様なそして関連
のある作用は、又、rANVP(126-150)及びhANVP(127-1
51)でも明らかになった。このようにこれらの発現断片
は合成ANVPで試験管内調製及びヒト又は動物への生体に
注射した時の両方にすべての特性を共有する。表5に示
されたように合成ANVPsは普通の心房性血圧、血漿レニ
ン活性及び血漿アルドステロンを低下させ、尿量及び尿
ナトリウム***を低下させた。これらは利尿及び抗高血
圧性物質の望ましい特性である。さらに、proANVPs及び
ANVPsは量及び血圧調節の主な中心で作用する。このよ
うにpre-proANVPs、proANVPs及びANVPsは組換えDNA方法
により生成され、上記に匹敵する方法で酵母菌、細菌又
は哺乳動物の細胞に発現された時、浮腫状態(即ち、う
っ血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変及び無効腎灌
流)の急性及び慢性治療及び腎不全及び高血圧の慢性治
療に有用性を見出すという事が結論づけられた。
【0270】上記実施例で示されたように、開示された
方法及び組成物はpre-proANVPs、proANVPs及びそれらの
断片及びANVPsを発現することにおいて使用を見出し得
る。当業者にとってここに示されたポリペプチドの配列
又は断片は、本発明の範囲内にとどまるがこの開示に重
要でない変更により、発現される。
方法及び組成物はpre-proANVPs、proANVPs及びそれらの
断片及びANVPsを発現することにおいて使用を見出し得
る。当業者にとってここに示されたポリペプチドの配列
又は断片は、本発明の範囲内にとどまるがこの開示に重
要でない変更により、発現される。
【0271】特に開示されたpre-proANVPsアミノ酸配列
のいずれかが発現されうる。これらの断片はANVPの完全
な配列を含まずしかしANVPsの部分を含むかもしれな
い。これらの断片はそれ自身、該化合物に示された作用
に匹敵するか又は補足的な生物学的作用を示す。
のいずれかが発現されうる。これらの断片はANVPの完全
な配列を含まずしかしANVPsの部分を含むかもしれな
い。これらの断片はそれ自身、該化合物に示された作用
に匹敵するか又は補足的な生物学的作用を示す。
【0272】加えて、ヒト誘導proANVPs、その断片及び
ANVPsは、生物学的活性のラット−誘導ポリペプチドと
比べ1つのアミノ酸置換を含む。それ故、ヒト誘導化合
物を発現し、前述の方法で調製した酵母菌、細菌及び哺
乳動物の細胞は同様な生物学的作用を示す。
ANVPsは、生物学的活性のラット−誘導ポリペプチドと
比べ1つのアミノ酸置換を含む。それ故、ヒト誘導化合
物を発現し、前述の方法で調製した酵母菌、細菌及び哺
乳動物の細胞は同様な生物学的作用を示す。
【0273】V.心房性ナトリウム尿***亢進性/血管
拡張性ポリペプチド化合物 本発明の化合物は、免疫検定、特に放射免疫検定を、試
料中のANVPsの存在又は量を決定するために使う。
拡張性ポリペプチド化合物 本発明の化合物は、免疫検定、特に放射免疫検定を、試
料中のANVPsの存在又は量を決定するために使う。
【0274】完全なフロイントアジュバント中の子牛血
清アルブミンに接合した。250μg ANVPでニュージーラ
ンド白ウサギを皮下及び筋肉内注射で免疫することによ
りANVPsに対する抗体が生成された。ブースト(boost)
の後、7−10日して耳動脈からウサギの血を採取し、そ
の血清をANVP結合能力を検査した。平行して対照の非免
疫血清試料も又試験された。表5はその中の抗血清の、
特にANVPsとの特に相互に作用する抗血清の能力が試験
される代表的なデーターを表わす。ANVP(500ナノグラ
ム)はポリスチレンプレートの特有のくぼみに固定され
た。抗血清の希釈をいろいろ変えてこれらのくぼみに加
え、特異的に結合した抗体の量を125I−標識羊抗ウサ
ギ免疫グロブリンG抗血清を加えて定量した。これは特
異抗体定量を決定する標準的な方法である。表10で示
されるように、血清の1:400の希釈で抗体の意味ある
量がANVPsにまだ結合していた。特異的に結合は非免疫
血清とともに認められなかった。
清アルブミンに接合した。250μg ANVPでニュージーラ
ンド白ウサギを皮下及び筋肉内注射で免疫することによ
りANVPsに対する抗体が生成された。ブースト(boost)
の後、7−10日して耳動脈からウサギの血を採取し、そ
の血清をANVP結合能力を検査した。平行して対照の非免
疫血清試料も又試験された。表5はその中の抗血清の、
特にANVPsとの特に相互に作用する抗血清の能力が試験
される代表的なデーターを表わす。ANVP(500ナノグラ
ム)はポリスチレンプレートの特有のくぼみに固定され
た。抗血清の希釈をいろいろ変えてこれらのくぼみに加
え、特異的に結合した抗体の量を125I−標識羊抗ウサ
ギ免疫グロブリンG抗血清を加えて定量した。これは特
異抗体定量を決定する標準的な方法である。表10で示
されるように、血清の1:400の希釈で抗体の意味ある
量がANVPsにまだ結合していた。特異的に結合は非免疫
血清とともに認められなかった。
【0275】 表 10 抗心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチドの特異結合固定化 した心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド化合物 抗血清の希釈 抗体バウンド 免疫性 非免疫性 1:10 7481 734 1:50 6977 681 1:100 6135 685 1:200 5096 634 1:400 3898 525。
【0276】表11で表わされた実験は、表10の実験
と同じであるが、非固定化ANVPsの種々の濃度のものが
抗-ANVP抗血清の1:100希釈と同時に加えられた。示さ
れたように非固定化ANVPsが固定化ANVPsから抗体結合
を、競合的に置きかえた。このように、これは競合置換
検定の例である。この検定と同様な放射免疫検定は種々
の生理学的又は病理生理学的な状態で組織または血清に
おいてANVPのような免疫反応性を定量するのに使用され
うる。これまでは検定は心房性の抽出物中にANVPを検知
するのに使用されてきた。ANVPは心室の抽出物には検知
されなかった。
と同じであるが、非固定化ANVPsの種々の濃度のものが
抗-ANVP抗血清の1:100希釈と同時に加えられた。示さ
れたように非固定化ANVPsが固定化ANVPsから抗体結合
を、競合的に置きかえた。このように、これは競合置換
検定の例である。この検定と同様な放射免疫検定は種々
の生理学的又は病理生理学的な状態で組織または血清に
おいてANVPのような免疫反応性を定量するのに使用され
うる。これまでは検定は心房性の抽出物中にANVPを検知
するのに使用されてきた。ANVPは心室の抽出物には検知
されなかった。
【0277】 表 11 遊離心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチドを加えることに より固定化心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチドと結合する 競合的置換の抗心房性ナトリウム尿***亢進性/血管拡張性ポリペプチド 遊離ANVPの濃度 抗体バウンド (nモル) (CPM) 0 6777 0.002 6343 0.02 5603 0.2 2893 2.0 1223
【図1】図2及び図3と1続きの、本発明の一実施態様
のデオキシリボ核酸(DNA)配列、即ちヒト(human)pr
e-proANVPをコードした遺伝子を、当該DNAによって指示
されるポリペプチド合成におけるアミノ酸配列と共に示
した図である。
のデオキシリボ核酸(DNA)配列、即ちヒト(human)pr
e-proANVPをコードした遺伝子を、当該DNAによって指示
されるポリペプチド合成におけるアミノ酸配列と共に示
した図である。
【図2】図1の続きの図である。
【図3】図2の続きの図である。
【図4】本発明における一実施態様の相補的デオキシリ
ボ核酸(cDNA)配列、即ちヒトpre-proANVPをコードす
るcDNAを、このDNAで指示されるポリペプチド合成にお
けるアミノ酸配列と共に示した図である。
ボ核酸(cDNA)配列、即ちヒトpre-proANVPをコードす
るcDNAを、このDNAで指示されるポリペプチド合成にお
けるアミノ酸配列と共に示した図である。
【図5】本発明における一実施態様のデオキシリボ核酸
(DNA)配列、即ちラットpre-proANVPをコードするDNA
を、このDNAによって指示されるポリペプチド合成にお
けるアミノ酸配列と共に、提供する。
(DNA)配列、即ちラットpre-proANVPをコードするDNA
を、このDNAによって指示されるポリペプチド合成にお
けるアミノ酸配列と共に、提供する。
【図6】心房組織からの、本発明における心房のナトリ
ウム***増加性/血管拡張性(ANVP)化合物の精製にお
ける抽出原液のG-50ゲル濾過の結果を図に示したもので
ある。
ウム***増加性/血管拡張性(ANVP)化合物の精製にお
ける抽出原液のG-50ゲル濾過の結果を図に示したもので
ある。
【図7】心房組織からの、本発明における心房のナトリ
ウム***増加性/血管拡張性(ANVP)化合物の精製され
た抽出液のHPLC(C18カラム)精製の結果を図に示した
ものである。
ウム***増加性/血管拡張性(ANVP)化合物の精製され
た抽出液のHPLC(C18カラム)精製の結果を図に示した
ものである。
【図8】図7の産物の再クロマトグラフィーを示す。
【図9】図7の精製された活性フラクション即ち活性分
画のHPLC(CNカラム)精製の結果を示す。
画のHPLC(CNカラム)精製の結果を示す。
【図10】本発明の核酸組成物を含む相補的DNA(cDN
A)クローンを同定するために用いられるオリゴヌクレ
オチドプローブの配列を示す。
A)クローンを同定するために用いられるオリゴヌクレ
オチドプローブの配列を示す。
【図11】ジデオキシヌクレオチドの配列を分析するた
めのDNA断片を提供するために、ラットpre-proANVPを暗
号化するデオキシリボ核酸を,特異的な制限酵素である
エンドヌクレアーゼで切断した部位を示す。
めのDNA断片を提供するために、ラットpre-proANVPを暗
号化するデオキシリボ核酸を,特異的な制限酵素である
エンドヌクレアーゼで切断した部位を示す。
【図12】心房および心室のmRNAのノザン法分析の結果
を示し、ここで、レーン1は、ラット心房組織から分離
されたRNAを示し、そしてレーン2は、ラット心室組織
から分離されたRNAを示す。
を示し、ここで、レーン1は、ラット心房組織から分離
されたRNAを示し、そしてレーン2は、ラット心室組織
から分離されたRNAを示す。
【図13】心房のポリA+RNAによってコードされた35S
タンパク質を示す。
タンパク質を示す。
【図14】心室のポリA+RNAによってコードされた35S
タンパク質を示す。
タンパク質を示す。
【図15】心房組織から誘導されたポリA+RNAを示す。
【図16】心室組織から誘導されたポリA+RNAを示す。
【図17】ジデオキシヌクレオチドの配列を分析するた
めのDNA断片を提供するために、ヒトpre-proANVPを暗号
化するヒトゲノム(genomic)デオキシリボ核酸を、特異
的な制限酵素であるエンドヌクレアーゼでもって切断し
た部位示す図である。
めのDNA断片を提供するために、ヒトpre-proANVPを暗号
化するヒトゲノム(genomic)デオキシリボ核酸を、特異
的な制限酵素であるエンドヌクレアーゼでもって切断し
た部位示す図である。
【図18】精製され、そして合成された本発明核酸分子
から得られる化合物の血管弛緩活性の比較である。
から得られる化合物の血管弛緩活性の比較である。
【図19】培養されたウシの大動脈の平滑筋細胞に対す
る125I-rANVP(126-150)の結合を示す。実線は、特異的
結合を示し、そして破線(−−−)は、非特異的結合を
示す。スキャッチャード・プロットによるデータの分析
が、差込み図に示されている。
る125I-rANVP(126-150)の結合を示す。実線は、特異的
結合を示し、そして破線(−−−)は、非特異的結合を
示す。スキャッチャード・プロットによるデータの分析
が、差込み図に示されている。
【図20】培養されたウシの大動脈内皮細胞に対する
125I-rANVP(126-150)の結合を示す。実線は、特異的結
合を示し、そして破線(−−−)は、非特異的結合を示
す。スキャッチャード・プロットによるデータの分析
が、差込み図に示されている。
125I-rANVP(126-150)の結合を示す。実線は、特異的結
合を示し、そして破線(−−−)は、非特異的結合を示
す。スキャッチャード・プロットによるデータの分析
が、差込み図に示されている。
【図21】rANVP(126-150)およびhANVP(127-151)の種々
の投与量に応答する、培養されたウシの血管平滑筋にお
ける環状GMPレベルを示す。
の投与量に応答する、培養されたウシの血管平滑筋にお
ける環状GMPレベルを示す。
【図22】rANVP(126-150)およびhANVP(127-151)の種々
の投与量に応答する、培養されたウシの血管内皮細胞に
おける環状GMPレベルを示す。
の投与量に応答する、培養されたウシの血管内皮細胞に
おける環状GMPレベルを示す。
【図23】培養されたウシの大動脈平滑筋細胞において
cGMPを増大させるための種々のANVPsの能力を示す投与
量−反応曲線である。
cGMPを増大させるための種々のANVPsの能力を示す投与
量−反応曲線である。
【図24】培養されたウシの大動脈内皮細胞においてcG
MPを増大させるための種々のANVPsの能力を示す投与量
−反応曲線である。
MPを増大させるための種々のANVPsの能力を示す投与量
−反応曲線である。
【図25】ラットおよびヒトのproANVPおよびその誘導
断片の発現において用いられたバクテリア性の発現プラ
スミドの発現ベクターpKT-52を示す。
断片の発現において用いられたバクテリア性の発現プラ
スミドの発現ベクターpKT-52を示す。
【図26】図27に示されるラットpre-proANVP cDNAか
ら誘導されたDNAのセグメントを示し、図27との対応
関係を斜め線で示している。
ら誘導されたDNAのセグメントを示し、図27との対応
関係を斜め線で示している。
【図27】プラスミドpRNF-6852においてクローン化さ
れたアミノ酸25-152をコードするラットpre-proANVP cD
NAを示し、図28との対応関係を斜め線で示している。
れたアミノ酸25-152をコードするラットpre-proANVP cD
NAを示し、図28との対応関係を斜め線で示している。
【図28】図27のラットpre-proANVP cDNAから誘導さ
れたDNAのセグメントを示す。
れたDNAのセグメントを示す。
【図29】トリプトファンオペロンプロモーター/オペ
レーターおよびシャイン−ダルガルノの配列(SD)を含む
合成DNA配列を示す。
レーターおよびシャイン−ダルガルノの配列(SD)を含む
合成DNA配列を示す。
【図30】pTRP-233を示す。
【図31】プラスミドphNF-233においてクローン化され
たアミノ酸26-151をコードするヒトpre-proANVP cDNAか
ら誘導されたDNAのセグメントを示す。
たアミノ酸26-151をコードするヒトpre-proANVP cDNAか
ら誘導されたDNAのセグメントを示す。
【図32】L−[35S]−システインで標識されたタンパク
質を示す、SDS-ポリアクリルアミドゲルの写真的提示で
あり、ここで、大腸菌はレーンAにおいてpKT52発現ベ
クターを含み、レーンCはpRNF-6852(pre-proANVPのア
ミノ酸87-152を暗号化するDNAを含むように変性されたp
KT52)を含み、レーンEはpRNF-12852(pre-proANVPのア
ミノ酸25-152を暗号化するDNAを含むように変性されたp
KT52)を含み、レーンB、DおよびFは、各々、レーン
A,C,およびEからの産物を含み、当該産物は、特異
的な抗ANVP(antiANVP)抗血清でもって免疫沈殿させら
れ、レーンGは、それらの対応する分子サイズについて
のタンパク質の分子量基準を含み、矢印は、pRNF-6852
およびpRNF-12852から誘導された独特のポリペプチドを
示す。
質を示す、SDS-ポリアクリルアミドゲルの写真的提示で
あり、ここで、大腸菌はレーンAにおいてpKT52発現ベ
クターを含み、レーンCはpRNF-6852(pre-proANVPのア
ミノ酸87-152を暗号化するDNAを含むように変性されたp
KT52)を含み、レーンEはpRNF-12852(pre-proANVPのア
ミノ酸25-152を暗号化するDNAを含むように変性されたp
KT52)を含み、レーンB、DおよびFは、各々、レーン
A,C,およびEからの産物を含み、当該産物は、特異
的な抗ANVP(antiANVP)抗血清でもって免疫沈殿させら
れ、レーンGは、それらの対応する分子サイズについて
のタンパク質の分子量基準を含み、矢印は、pRNF-6852
およびpRNF-12852から誘導された独特のポリペプチドを
示す。
【図33】[35S]−システインで標識されたタンパク質
を示すSDSポリアクリルアミドゲルの写真的提示であ
り、ここで、大腸菌はレーンAにおいて、pTRP-233発現
ベクターを含み、レーンBは、phNF-233[ヒトpre-pro A
NVP(26-151)を暗号化するDNAを含むように変性されたpT
RP-233]発現産物を含み;レーンCおよびDは、各々、
レーンAおよびBからの産物を含み、当該産物は、特異
的な抗ANVP抗血清で免疫沈殿させられる。レーンAに隣
接して、分子量基準によるサイズが示される。
を示すSDSポリアクリルアミドゲルの写真的提示であ
り、ここで、大腸菌はレーンAにおいて、pTRP-233発現
ベクターを含み、レーンBは、phNF-233[ヒトpre-pro A
NVP(26-151)を暗号化するDNAを含むように変性されたpT
RP-233]発現産物を含み;レーンCおよびDは、各々、
レーンAおよびBからの産物を含み、当該産物は、特異
的な抗ANVP抗血清で免疫沈殿させられる。レーンAに隣
接して、分子量基準によるサイズが示される。
【図34】特異的ベクターとイーストα−因子分泌信号
とを用いてサツカロミセス・セレビシアエにおいて、ラ
ットpre-proANVPおよびその関連ポリペプチド断片を発
現させるための構築を示す。
とを用いてサツカロミセス・セレビシアエにおいて、ラ
ットpre-proANVPおよびその関連ポリペプチド断片を発
現させるための構築を示す。
【図35】S.セレビシアエから分泌され、そして35S−
メチオニン(A)あるいは35S−システインおよび35S−メ
チオニン(B)によって標識されたタンパク質を示すSDSポ
リアクリルアミドゲルの写真的提示である。
メチオニン(A)あるいは35S−システインおよび35S−メ
チオニン(B)によって標識されたタンパク質を示すSDSポ
リアクリルアミドゲルの写真的提示である。
【図36】酵母菌発現プラスミドと、ヒトpro心房性(pr
oatrial)ナトリウム***増加性/血管拡張性断片128-15
1をコードする合成遺伝子配列との図表的線図を示す。
oatrial)ナトリウム***増加性/血管拡張性断片128-15
1をコードする合成遺伝子配列との図表的線図を示す。
【図37】中国産ハムスター(Chinese hamster)の卵巣
細胞内で、ラットおよびヒトのpre-proANVPを発現させ
るための、発現ベクターの構築を示す。
細胞内で、ラットおよびヒトのpre-proANVPを発現させ
るための、発現ベクターの構築を示す。
【図38】中国産ハムスターの卵巣細胞培地からのタン
パク質であって、35S-メチオニンで標識されたタンパク
質のSDS-ポリアクリルアミドゲルの写真的提示である。
パク質であって、35S-メチオニンで標識されたタンパク
質のSDS-ポリアクリルアミドゲルの写真的提示である。
【表6】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 1/21 8828−4B 5/10 // A61K 35/72 ACX 7431−4C 35/74 ABR G 7431−4C 38/00 C07K 7/08 8318−4H C12P 21/02 C 9282−4B (C12P 21/02 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:865) (C12P 21/02 C12R 1:91) A61K 37/02 (72)発明者 マッカーシー、ブライアン・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94022ロ ス・アルトス・ヒルズ、アマスト・コート 14244 (72)発明者 ラーラグ、ジョン・エイチ アメリカ合衆国ニュー・ヨーク州10021ニ ュー・ヨーク、イースト・セブンティー ス・ストリート 435、アパートメント 22ジェイ (72)発明者 ルウィッキ、ジョン・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94087サ ニーベール、ミケランジェロ・ドライブ 954
Claims (3)
- 【請求項1】 式:Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-
Ile/Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cy
s-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(式中、Ile/MetはIle又はMetを
表わす)で表わされ、その環状ジスルフィド形を包含
し、N末端アセチル化形及び/又はC末端アミド化形を
包含するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含む、単離され精製された核酸分子。 - 【請求項2】 前記コード配列の発現をもたらすことが
できる制御配列に作用的に結合された式:Arg-Ser-Ser-
Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile/Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gl
n-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(式中、I
le/MetはIle又はMetを表わす)で表わされ、その環状ジ
スルフィド形を包含し、N末端アセチル化形及び/又は
C末端アミド化形を包含するポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含む核酸分子。 - 【請求項3】 前記コード配列の発現をもたらすことが
できる制御配列に作用的に結合された式:Arg-Ser-Ser-
Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile/Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gl
n-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(式中、I
le/MetはIle又はMetを表わす)で表わされ、その環状ジ
スルフィド形を包含し、N末端アセチル化形及び/又は
C末端アミド化形を包含するポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように改質
された微生物又は細胞培養物。
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