KR950005132B1 - 2-케토-d-글루카르산의 제조방법 - Google Patents

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KR950005132B1
KR950005132B1 KR1019860011313A KR860011313A KR950005132B1 KR 950005132 B1 KR950005132 B1 KR 950005132B1 KR 1019860011313 A KR1019860011313 A KR 1019860011313A KR 860011313 A KR860011313 A KR 860011313A KR 950005132 B1 KR950005132 B1 KR 950005132B1
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Abstract

내용 없음.

Description

2-케토-D-글루카르산의 제조방법
제1도는 실시예 1에서 수득한 결정성 물질의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
제2도는 참고예에서 수득한 결정성 물질의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명은 발효법에 의해서, 사료용의 칼슘-강화 첨가제, 청정작용 증강제, 시멘트 가소제 및 당류 대사 연구의 시약으로 작용하는 하기 일반식(Ⅰ)의 2-케토-D-글루카르산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
2-케토-D-글루카르산을 제조하는 방법으로는, 화학적 산화에 의해 글루코스로부터 합성한 D-글루카르산에 슈도모나스 아에루기노사를 작용시킴으로써 미생물적 산화를 통해 2-케토-D-글루카르산을 수득하는 한가지 방법만이 있을 뿐이다.(체코슬로바키아 특허 제222577호, 1984년 2월 1일).
특허를 받은 상기 방법에서는, 화학적 산화에 의해 출발물질인 D-글루카르산을 합성하는 공정이 요구되는데, 수율의 측면에서 볼때 만족스러운 산업적 기술이라고 생각되지 않는다.
본 발명자들은 단당류의 미생물적 산화의 기작을 연구하던 중에, 토양 시료로부터 분리한 세균종(K591s, 12-5, 12-15, 12-4 또는 22-3)을 탄소원으로서 D-글루코스, D-프룩토스 및/또는 다른 단량류를 함유하는 배지에서 배양함으로써 상당한 양의 2-케토-D-글루카르산을 생산 및 축적할 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 이들 세균을 분류학적으로 연구한 결과 이들이 새로운 속에 속하는 새로운 세균 균주임을 발견하였으며 계속 연구하여 본 발명을 개발하였다.
즉, 본 발명은 하기 일반식(Ⅱ)의 화합물을 슈도글루코노박터 속에 속하며, 상기 화합물을 산화시킬 수 있는 박테리아 또는 그의 가공물질과 접촉시키고, 2-케토-D-글루카르산을 생산 및 축적시킨 후에 회수함을 특징으로 하는 2-케토-D-글루카르산의 제조방법을 제공한다.
Figure kpo00002
균주 K591s 및 균주 12-5, 12-15, 12-4 및 22-3은 각각 일본의 와까야마현 및 시가현에서 수집한 토양 시료로부터 분리한 것이다. 이들 5 균주는 각각 다음의 분류학적 특성을 갖는다.
균주 K591s 및 12-5의 분류학적 특성
(a) 형태
(1) 막태형 : 크기 : 0.3~0.5×0.7~1.4㎛
(2) 세포 다형성은 발견되지 않음.
(3) 2~4의 극성 편모로 운동.
(4) 포자형성은 발견되지 않음.
(5) 그램-음성.
(6) 내산성이 아님.
(b) 각종 배지에서의 생장상태.
(1) 배양 한천 판 배양 : 거의 자라지 않음.
효모 추출액 배양 한천 판에서 배양하면 원형의, 완전하고 매끄럽고 광택있는 콜로니를 형성한다.
(2) 효모 추출액 배양 한천 사면 배양 : 중간 정도로 생장.
모상(毛狀)의, 매끄럽고 광택있는 콜로니 형성.
(3) 효모 추출액 배양 액체 배양 : 중간 정도로 생장.
배지 전체를 통하여 균질하게 혼탁해짐.
(4) 배양 젤라틴 천자 배양 : 상부에서만 약하게 생장.
젤라틴 액화는 발생하지 않음.
(5) 리트머스 우유 : 산성화 응고.
(c) 생리학적 특성
(1) 비록 약하긴 하지만 니트레이트 환원반응에 양성.
(2) 탈질소 작용 : 없음.
(3) 메틸 레드(MR) 시험 : 양성.
(4) 보게스-프로스카우어(VP) 시험 : 음성.
(5) 인돌 생산 : 없음.
(6) 황화수소 생산 : 없음.
(7) 전분 가수분해 : 없음.
(8) 시트레이트 이용 : 음성.
(9) 암모늄염 이용.
(10) 색소 생성 : 없음.
(11) 우레아제 생산.
(12) 옥시다제 시험 : 양성.
(13) 카탈라제 시험 : 양성.
(14) 생장온도 : 16~36℃ ; 최적온도 : 24~34℃.
생장 pH : 5.5~8.7 ; 최적 pH : 6.0~7.5.
(15) 호기성.
(16) 휴-레이프슨(Hugh-Leifson)의 OF 시험 : 산화성.
(17) L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스, D-프룩토스, D-갈락토스, D-만노스, 말토스, 수크로스, 락토스, 트레할로스, D-만니톨 및 글리세롤로부터는 산만 나오고 기체는 나오지 않음.
D-소르비톨, 이노시톨 또는 전분으로부터는 산과 기체 모두 나오지 않음.
(d) 기타 특성
(1) 에탄올로부터 미소량의 아세트산 생산.
(2) 생장하는데 있어서, 비오틴, 티아민, 리보플라빈 및 조효소 A(이후에는 CoA로 약칭)에 의존적.
(3) 글리세롤로부터 디히드록시 아세톤 생산.
(4) DNA : 67±1몰%의 구아닌+시토신 함유.
(5) 10 이소프렌 단위(CoQ10)를 갖는 우비퀴논 함유.
(6) 스트렙토마이신 내성.
균주 12-15의 분류학적 특성
(a) 형태
(1) 막태형 ; 크기 : 0.3~0.5×0.7~1.4㎛.
(2) 세포 다형성은 발견되지 않음.
(3) 2~4의 극성 편모로 운동.
(4) 포자형성은 발견되지 않음.
(5) 그램-음성.
(6) 내산성이 아님.
(b) 각종 배지에서의 생장상태
(1) 배양 한천 판 배양 : 거의 자라지 않음.
효모 추출액 배양 한천 판에서 배양하면 원형의, 완전하고 매끄럽고 광택있는 콜로니를 형성한다.
(2) 효모 추출액 배양 한천 사면 배양 : 중간 정도로 생장. 모상의 매끄럽고 광택있는 콜로니 형성.
(3) 효모 추출액 배양 액체 배양 : 중간 정도로 생장.
배지 전체를 통하여 균질하게 혼탁해짐.
(4) 배양 젤라틴 천자 배양 : 상부에서만 약하게 생장.
젤라틴 액화는 발생하지 않음.
(5) 리트머스 우유 : 산성화 응고되지 않음.
(c) 생리학적 특성
(1) 니트레이트 환원반응 : 음성.
(2) 탈질소 작용 : 없음.
(3) 메틸 레드(MR) 시험 : 양성.
(4) 보게스-프로스카우어(VP) 시험 : 음성.
(5) 인돌 생산 : 없음.
(6) 황화수소 생산 : 없음.
(7) 전분 가수분해 : 없음.
(8) 시트레이트 이용 : 음성.
(9) 암모늄염 이용.
(10) 색소생성 : 없음.
(11) 우레아제 생산.
(12) 옥시다제 시험 : 양성.
(13) 카탈라제 시험 : 양성.
(14) 생장온도 : 23~32℃ ; 최적온도 : 28~32℃.
생장 pH : 6.0~7.5 ; 최적 pH : 6.5~7.1.
(15) 호기성.
(16) 휴-레이프슨(Hugh-Leifson)의 OF 시험 : 산화성.
(17) L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스, D-프룩토스, D-갈락토스, D-만노스, 말토스, 수크로스, 락토스, 트레할로스, 및 글리세롤로부터는 산만 나오고 기체는 나오지 않음.
D-만니톨, D-소르비톨, 이노시톨 또는 전분으로부터는 산과 기체 모두 나오지 않음.
(d) 기타 특성
(1) 에탄올로부터 미소량의 아세트산 생산.
(2) 생장하는데 있어서, 비오틴, 티아민, 리보플라빈 및 CoA에 의존적.
(3) 글리세롤로부터 디히드록시 아세톤 생산.
(4) DNA : 67±1몰%의 구아닌+시토신 함유.
(5) 10 이소프렌 단위(CoQ10)를 갖는 우비퀴논 함유.
(6) 스트렙토마이신 내성.
균주 12-4의 분류학적 특성
(a) 형태
(1) 막대형 ; 크기 : 0.3~0.5×0.7~1.4㎛.
(2) 세포 다형성은 발견되지 않음.
(3) 2~4의 극성 편모로 운동.
(4) 포자형성은 발견되지 않음.
(5) 그램-음성.
(6) 내산성이 아님.
(b) 각종 배지에서의 생장상태
(1) 배양 한천 판 배양 : 매우 조그만 콜로니만 생장.
완전한 관찰 L은 불가능 효모 추출액 배양 한천 판에서 배양하면 원형의, 완전하고 매끄럽고 광택있는 콜로니를 형성한다.
(2) 효모 추출액 배양 한천 사면 배양 : 중간 정도로 생장.
모상(毛狀)의, 매끄럽고 광택있는 콜로니 형성.
(3) 효모 추출액 배양 액체 배양 : 중간 정도로 생장 배지 전체를 통하여 균질하게 혼탁해짐.
(4) 배양 젤라틴 천자 배양 : 상부에서만 약하게 생장.
젤라틴 액화는 발생하지 않음.
(5) 리트머스 우유 : 산성화 응고하지 않음.
(c) 생리학적 특성
(1) 니트레이트 환원반응 : 음성.
(2) 탈질소 작용 : 없음.
(3) 메틸 레드(MR) 시험 : 양성.
(4) 보게스-프로스카우어(VP) 시험 : 음성.
(5) 인돌 생산 : 없음.
(6) 황화수소 생산.
(7) 전분 가수분해 : 없음.
(8) 시트레이트 이용 : 음성.
(9) 암모늄염 이용.
(10) 색소 생성 : 없음.
(11) 우레아제 생산.
(12) 옥시다제 시험 : 양성.
(13) 카탈라제 시험 : 양성.
(14) 생장온도 : 16~36℃ ; 최적온도 : 24~34℃.
생장 pH : 5.5~8.2 ; 최적 pH : 6.0~7.5.
(15) 호기성.
(16) 휴-레이프슨(Hugh-Leifson)의 OF 시험 : 산화성
(17) L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스, D-프룩토스, D-갈락토스, D-만노스, 말토스, 수크로스, 락토스, 트레할로스, 및 글리세롤로부터는 산만 나오고 기체는 나오지 않음.
D-만니톨, D-소르비톨, 이노시톨 또는 전분으로부터는 산과 기체 모두 나오지 않음.
(d) 기타 특성
(1) 에탄올로부터 미소량의 아세트산 생산.
(2) 생장하는데 있어서, 비오틴, 티아민, 리보플라빈 및 CoA 또는 판토텐산에 의존적.
(3) 글리세롤로부터 디히드록시아세톤 생산.
(4) DNA : 67±1몰%의 구아닌+시토신 함유.
(5) 10 이소프렌 단위(CoQ10)를 갖는 우비퀴논 함유.
(6) 스트렙토마이신 내성.
균주 22-3의 분류학적 특성
(a) 형태
(1) 막대형 ; 세포크기 : 0.3~0.5×0.7~1.4㎛.
(2) 세포 다형성은 발견되지 않음.
(3) 2~4의 극성 편모로 운동.
(4) 포자형성은 발견되지 않음.
(5) 그램-음성.
(6) 내산성이 아님.
(b) 각종 배지에서의 생장상태
(1) 배양 한천 판 배양 : 매우 작은 콜로니만 생장 ; 완전한 관찰은 불가능.
효모 추출액 배양 한천 판에서 배양하면 원형의, 완전하고 매끄럽고 광택있는 콜로니를 형성한다.
(2) 효모 추출액 배양 한천 사면 배양 : 중간 정도로 생장.
모상의 매끄럽고 광택있는 콜로니 형성.
(3) 효모 추출액 배양 액체 배양 : 중간 정도로 생장.
배지 전체를 통하여 균질하게 혼탁해짐.
(4) 영양 젤라틴 천자 배양 : 상부에서만 약하게 생장.
젤라틴 액화는 발생하지 않음.
(5) 리트머스 우유 : 산성화 응고되지 않음
(c) 생리학적 특성
(1) 비록 약하긴 하지만 니트레이트 환원반응에 양성.
(2) 탈질소 작용 : 없음.
(3) 메틸 레드(MR) 시험 : 양성.
(4) 보게스-프로스카우어(VP) 시험 : 음성.
(5) 인돌 생산 : 없음.
(6) 황화수소 생산 : 없음.
(7) 전분 가수분해 : 업음.
(8) 시트레이트 이용 : 음성.
(9) 암모늄염 이용.
(10) 색소 생성 : 없음.
(11) 우레아제 생산.
(12) 옥시다제 시험 : 양성.
(13) 카탈라제 시험 : 양성.
(14) 생장온도 : 16~38℃ ; 최적온도 : 24~34℃.
생장 pH : 5.5~8.7 ; 최적 pH : 6.0~7.8.
(15) 호기성.
(16) 휴-레이프슨(Hugh-Leifson)의 OF 시험 : 산화성.
(17) L-아라비노스, D-크실로스, D-글루코스, D-프룩토스, D-갈락토스, D-만노스, 말토스, 수크로스, 락토스, 트레할로스, 및 글레세롤로부터는 산만 나오고 기체는 나오지 않음.
(d) 기타 특성
(1) 에탄올로부터 미소량의 아세트산 생산.
(2) 생장하는데 있어서, 비오틴, 티아민, 리보플라빈 및 CoA 또는 판토텐산에 의존적.
(3) 그릴세롤로부터 히드록시아세톤 생산.
(4) DNA : 67±1몰%의 구아닌+시토신 함유.
(5) 10 이소프렌 단위(CoQ10)를 갖는 우비퀴논 함유.
(6) 스트렙토마이신 내성.
토양으로부터 분리한 이들 다섯종의 세균 균주를 문헌[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. (1974), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1 (1984)]에 기술된 세균 종과 대조하였다; 이들 5 균주, 즉 균주 K591s, 12-5, 12-15, 12-4 및 22-3은 모두 호기성, 그램-음성, 옥시다제 시험-양성, 편모를 갖는 운동성 간상균이기 때문에 우선적으로 슈도모나스 속에 속하는 것으로 나타났다. 이들은 성장 인자에 의존하고, DNA의 구아닌+시토신 함량이 67±1몰%이고, 퀴논계로서 10이소프렌 단위를 갖는 우비퀴논을 갖는다는 점에서 슈도모나스 디미누타 및 피. 베시쿨라리스와 닮았다. 그러나, 이들 균주는 비록 미소량이지만 에탄올로부터 아세트산을 생산하고 글리세롤로부터 디히드록시아세톤을 생산한다는 점에서 슈도모나스속의 세균과는 다르다.
이러한 특성은 글루코노박터 속의 세균종이 갖는 특성이다. 그러나, 본 발명의 5 균주는 옥시다제 활성에서 양성이고, pH 4.5에서 자라지 못하고, 당(에너지원)을 함유하지 않는 효모 추출액 배양 배지 또는 펩톤-효모 추출액 배지에서 완전히 자랄 수 있고, DNA의 구아닌+시토신 함량이 67±1몰%라는 점에서 글루코노박터 속에 속하는 세균과는 다르다.
즉, 이들 5 균주인 K591s, 12-5, 12-15, 12-4 및 22-3중 어느 하나도 공지된 속에 속하지 않는다; 이들을 새로운 속의 새로운 세균종으로 인정해야만 한다. 그래서 균주 K591s, 12-5, 12-15, 12-4 및 22-3을 슈도글루코노박터 사카로케토케네스로 명명하였다.
이들 세균종은 이후에 경우에 따라서 산화균(oxidizing bacteria)으로 표시되기도 한다. 이들의 영양 요구성은 다음과 같다 : 균주 K591a, 12-5 및 12-15는 흔하지 않은 영양 요구성을 갖는다. 즉, 생장에 CoA를 필요로 한다. 이들 3 균주에서는 CoA를 판토텐산으로 대치할 수 없다. 한편, 균주 12-4 및 22-3은 CoA 및/또는 판토텐산의 존재하에 생장할 수 있다.
본 발명에서 이용된 균주는 상기한 균주 뿐만이 아니라 UV 또는 X-ray 조사에 의한 돌연변이체 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(니트로소구아니딘), 메틸 메탄-설포네이트 또는 니트로겐머스타드 같은 화학적 변이 유발소에 의한 돌연변이체도 포함한다. 돌연변이체를 얻는 방법은 통상적인 것이다.
이러한 돌연변이체의 예로서, 균주 K591s를 니트로소구아니딘으로 처리하여 유도된 균주 TH14-86을 언급할 수 있다. 이 돌연변이주 TH14-86은 상술한 원료 물질인 당류로부터 2-케토-D-글루카르산을 생산하는 능력이 증강되었다는 것을 제외하고는 모균주와 동일한 분류학적 특성을 나타낸다.
상술한 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s, 12-5 및 TH14-86은 1985년 9월 19일자로 일본국 재단법인 발효 연구소(IFO)에 기탁되었으며, 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 12-15, 12-4 및 22-3은 1985년 12월 16일자로 IFO에 기탁되었다.
덧붙여, 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s, 12-5 및 TH14-86은 일본국 통상산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술연구소(FRI)에 1985년 10월 7일자로 기탁되었으며, 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 12-15, 12-4 및 22-3은 1985년 12월 20일자로 기탁되었다. 이들 미생물은 부다페스트 협약하의 기탁으로 전화되어 1986년 8월 9일부터 FRI에 보관되어 있다.
이들 미생물은 또한 1986년 9월 22일자로 한국 종균협회(KFCC)에 기탁되었다.
IFO, FRI 및 KFCC의 기탁번호는 다음과 같다 :
Figure kpo00003
본 발명에서 화합물(Ⅱ)로 사용되는 화합물에는 D-글루코스, D-프룩토스, D-만노스, D-소르비톨, D-만니톨, D-글루콘산, 2-케토-D-글루콘산, D-글루코손 및 D-만노산이 포함된다. 이후에는 이들 화합물을 "원료 당류"로 표시한다. 전화 효소에 의해 수크로스 또는 당밀로부터 수득한 전화당도 원료 당류로 이용될 수 있다.
본 발명에서는, 원료 당류를 포함하는 배지에서 상기 균을 배양하는 것과 가공된 균 세포로 하여금 원료 당류에 작용하도록 하는 것 모두 가능하다.
본 발명에서 이용된 "가공된 균세포"는 원료 당류가 산화되어 2-케토-D-글루카르산이 형성되는 반응에 관련된 효소계를 함유하는 제제를 나타낸다. 이러한 제제로는, 세척 균 세포, 건조 균 세포, 갇힌(entrapped) 균 세포 등을 예시할 수 있는데, 이들은 상기 배양물에 원심분리, 여과, 용매(예, 염수)에 의한 세척, 아세톤 및 드라이아이스에 의한 건조, 폴리아크릴아미드겔 또는 K-카라기닌에 유입시키는 등의 적절한 처리를 실시함으로써 수득한다.
원료 당류는 배양을 시작할때 또는 배양 도중에 몇회에 나누어 또는 배양중에 연속적으로 배지에 가할 수 있다.
상기한 균을 원료 당류와 접촉시켜 반응을 실시하고자 하는 경우에, 반응액내의 당류 농도는 배지를 기초로 하여 1~30%(w/v), 바람직하게는 5~20%(w/v)이어야 한다.
다음과 같은 방법으로 원료 당류를 가공된 균 세포와 접촉시킬 수 있다 : 예를들어, 가공된 균 세포를 원료 당류, 2-(N-모르폴리노)-에탄설폰산(MES) 완충액(pH 6.5, 0.5M) 및 CaCO3에 가하고, 물로 희석하고 원추형 플라스크내에서 진탕하였다.
상기 가공된 균 세포를 원료 당류와 접촉시켜 반응을 수행하는 경우에, 반응액내의 당류 농도는 배지를 기초로 하여 0.1~10%(w/v)이어야 한다. 가공된 균 세포의 양은 가공되지 않은 건조 세포를 기초로 하여 계산했을때 1~30㎎/ml이어야 한다. 반액의 pH를 약 5.5~7.5로 조절해야 한다. 반응온도 및 반응시간은 각각 약 20~40℃ 및 약 1~100시간내에서 선택할 수 있다.
상술한 균 배양 배지는 상기 균주가 이용할 수 있는 영양원을 함유하고만 있으면 액체 또는 고체일 수 있다; 그러나, 대량 배양을 위해 액체 배지를 사용하는 것이 바람직하다.
배지에 첨가되는 첨가제에는 탄소원, 질소원, 미네랄, 유기산염 및 미생물 배양에 통용되는 미량 영양소가 포함된다.
상술한 원료 당류는 아무런 처리없이 탄소원으로 사용할 수 있다; 글리세롤, 수크로스, 락토스, 말토스, 당밀 등을 부가적 탄소원으로 사용할 수 있다.
질소원으로 이용되는 물질에는 암모늄염(암모늄 설페이트, 암모늄 니트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트 등), 옥수수 침지액(corn steep liquor, 이후에는 때때로 CSL로 약칭하기도 한다) ; 펩톤, 육즙, 효모 추출액, 건조 효모, 두육(soybean meal), 면실유분 및 우레아 등의 유기 또는 무기 질소 화합물이 포함된다. 사용가능한 미네랄에는 포태슘염, 소듐염, 칼슘염, 마그네슘염, 철염, 망간염, 코발트염, 아연염, 구리염 또는 인산염이 포함된다.
사용가능한 미량 영양소에는 상술한 균의 생장에 필수적인 영양소, 즉 CoA, 판토텐산, 비오틴, 티아민 및 리보플라빈 뿐만 아니라 플라빈 모노누클로에티드(이후에는 FMN으로 표기한다), 플라빈 아데닌 디누클레오티드(이후에는 FAD로 표기한다), 기타 비타민, L-시스테인, L-글루탐산 및 티오황산나트륨 같이 균의 생장 및 2-케토-D-글루카르산 생산을 촉진하는 화합물들도 포함된다. 후자의 화합물들은 화학 화합물 또는 이들을 포함하는 천연물질의 형태일 수 있다.
이용가능한 배양법에는 정상배양, 진탕배양 및 심부배양이 포함된다. 대량 배양을 위해서는 심부배양이 바람직하다.
배양조건은 균주, 배지 조성물 및 기타 요인에 의해 결정된다. 조건은 각각의 경우에 따라, 목적 생성물이 최고의 효율로 생산되는데 필요한 요구에 따라 선택할 수 있다. 예를들어 배양 온도는 25~35℃이고, 배지의 pH는 5~9인 것이 바람직하다. 상기 조건에서 10~120시간 동안 배양 또는 반응을 수행함으로써 2-케토-D-글루카르산을 최고 농도로 축적할 수 있다.
이 경우에, pH 값은 통상적으로 목적 생성물이 생성됨에 따라 감소한다 ; 따라서 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아 같은 적절한 염기성 물질 또는 적절한 완충액을 배지에 가하여 2-케토-D-글루카르산 생산에 최적인 pH를 유지하는 것이 바람직하다.
상술한 산화균을 제외한 세균종의 멸균배양은 배지의 성분으로도 작용할 수 있다. 이러한 목적으로 사용할 수 있는 균에는 바실루스속, 슈도모나스속, 시트로박터속, 에스케리키아속 및 에르비니아속의 것이 포함된다. 특히, 다음의 균을 사용할 수 있다.
바실루스 세레우스 IFO 3131
바실루스 섭틸리스 IFO 3023
바실루스 펄밀루스 IFO 12089
바실루스 메가테륨 IFO 12108
바실루스 아밀로리퀴파시엔스 IFO 3022
슈도모나스 트리폴리이 IFO 12056
시트로박터 프레운디이 IFO 12681
에스케리키아 콜리 IFO 3546
에르비니아 헤르비콜라 IFO 12686
다음과 같은 방법으로 산화균의 생장을 촉진시킬 수 있다 : 적절한 배지에서 이들 기타 균을 20~40℃에서 2~4일간 배양하고, 멸균하고, 생선된 배양 브로쓰를 0.5~5.0%(v/v)의 비율로 산화균의 배지에 가한다.
상술한 방법대로 배양 브로쓰 또는 반응액내에서 생산되고 축적된 2-케토-D-글루카르산은 그 특성에 따라 공지의 방법으로 분리 및 정제할 수 있다. 2-케토-D-글루카르산은 유리산 또는 소듐염, 포태슘염, 칼슘염, 암모늄염 등의 형태로 분리할 수 있다.
목적에 어긋나지 않는한, 어떠한 분리법이라도 적용할 수 있다. 예를들어, 균 세포를 먼저 여과 또는 원심분리 등의 방법으로 반응 생성물로부터 제거하고, 필요에 따라 활성탄으로 처리하여 탈색할 수 있다. 그후에 반응 생성물의 용액을 농축하여 결정을 침전시킨다. 생성된 결정을 여과하여 수집하고 재결정하여 목적 생성물을 분리한다. 용매추출, 크로마토그래피, 염석 등을 단독으로 또는 배합하여 1회 또는 반복적으로 실시할 수 있다.
2-케토-D-글루카르산이 유리산의 형태로 얻어진 경우에, 적절한 방법으로 소듐염, 포태슘염, 칼슘염, 암모늄염 등으로 전환시킬 수 있다; 또한 염의 형태로 얻어지는 경우에는 적절한 방법에 의해 유리산 또는 또 다른 염으로 전환시킬 수도 있다.
본 발명에 의해 얻어진 목적 생성물은 원소조성, 융점, 선광도 및 적외선 스팩트럼 등의 물리화학적 특성을 결정해본 결과 2-케토-D-글루카르산으로 확인되었다.
반응액 또는 배양 브로쓰내에 생산된 2-케토-D-글루카르산은 설폰화 폴리스티렌 겔(시마드즈, SCR-101H 컬럼, 7.9㎜×30㎝)을 이용한 고수율 액체 크로마토그래피(이동상 : 묽은 황산. pH 2.2; 용출속도 : 0.5분ml/분 ; 검출기 : 시차 회절기)에 의하여 정량 분석할 수 있다; 체코슬로바키아 특허 제222,577호(1984, Kulhanek Milos et al.)에 따라 슈도모나스 아에루기노사(IFO 3448)를 이용하여 D-글루카르산으로부터 제조한 2-케토-D-글루카르산을 후술한 참고예에서 표준 시료로 이용하였다.
본 발명은 D-글루코스 등을 2-케토-D-글루카르산으로 산화시킬 수 있는 슈도글루코노박터 속의 균을 이용하여 2-케토-D-글루카르산을 고수율로 수득할 수 있게 하였다.
본 발명은 하기 참고예 및 실시예에서 보다 상세히 설명된다. 다른 언급이 없는한, 배지의 %값은 중량/부피%(w/v%)이다.
[참고예]
0.5% 펩톤, 0.5% 효모 추출액, 1.0% D-글루코스 및 0.1% K2HPO4로 이루어진 배지(이후에는 PYG 배지로 표시한다) 30ml를 200ml원추형 플라스크에 넣고 120℃에서 20분간 오토클레이브하였다. 2.0%의 한천을 PYG 배지에 가하여 제조한 사면 배지위에서 28℃에서 2일간 생장시킨 슈도모나스 아에루기노사(IFO 3448)의 신선한 세포를 고리하나 가득 상기 플라스크에 접종시켰다. 균 세포를 30℃에서 24시간 동안 회전 진탕 배양(200rpm)하였다. 생성된 배양 브로쓰를 종배양 브로쓰로 이용하였다.
NaOH를 이용하여 미리 pH 7.0으로 조절한 모노포태슘 D-글루카르산(Sigma, USA)의 5%(w/v) 수용액을 0.45μ 구멍 크기의 필터로 여과하여 미생물을 제거하고, PYG 배지에 1%(w/v)의 농도로 가하였다. 20ml의 이 배지를 함유하는 200ml-원추형 플라스크에 상술한 종배양 브로쓰 1ml을 옮기고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 고수율 액체 크로마토그래피한 결과 생성된 배양 브로쓰는 9.02㎎/ml의 2-케토-D-글루카르산을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 배양 브로쓰(590ml)를 원심분리하여 균 세포를 제거하고 580ml의 상층액을 수득하였다. 생성된 상층액을 엠버라이트 양이온 교환 수지 IR 120B(H+형, Rohm ＆ Haas, USA, 200ml)로 패킹된 컬럼에 통과시키고, 컬럼을 150ml의 탈이온수로 세척하여 양이온을 제거하였다. 활성탄(70ml)으로 패킹된 컬럼에 상층액을 통과시키고, 컬럼을 50ml의 탈이온수로 세척하여 상층액을 탈색시켰다.
Ca(OH)2로 용출액(780m1)의 pH를 6.5로 조절하고, 여과하여 흰 혼탁성을 제거하고, 감압하에 약 20ml로 농축하였다.
농축물중에 형성된 흰색의 무정형 결정을 유리 필터상에 수집하고, 소량의 냉수, 메탄올 및 에틸 에테르로 차례로 세척하고 감압하에 건조함으로써 5.04g의 디칼슘 2-케토-D-글루카레이트·3.5 수화물을 수득하였다. 이 결정성 물질의 분석 데이타는 다음과 같다 :
융점 : 152~157℃(분해).
원소분석 : C6H6O8Ca·3.5H2O.
계산치(%) : C ; 23.30, H ; 4.24, Ca ; 12.96.
실측치(%) : C ; 23.15, H ; 4.18, Ca ; 14.00.
비선광도 :
Figure kpo00004
(c=1.075, 0.1N HCl)
IR 흡수 스펙트럼 : 주흡수 파수는 다음과 같다 :
파수(cm-1) : 3590, 3500, 3400~2700(br)*, 1650, 1600, 1430, 1380, 1360, 1300, 1250, 1240, 1220, 1125, 1095, 1065, 1040, 1005, 995, 955, 900, 840, 800, 765, 725.
*) br : 넓음.
[실시예 1]
2.0%의 D-클루코스, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 건조 효모 및 2.0%의 CaCO3로 이루어진 종배지 20ml를 200ml-원추형 플라스크에 옮기고 120℃에서 20분간 오토클레이브하였다. 2.5%의 D-소르비톨, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 효모 추출액, 0.2%의 CaCO3및 2.0%의 한천으로 이루어진 사면 배지상에서, 28℃에서 4일간 생장시킨 슈도클루코노박터 사카로케토게네스 K591s(FERM BP-1130, IFO 14464, KFCC 10275)의 세포를 고리하나 가득 상기 플라스크에 접종시키고, 30℃에서 2일간 진탕 배양(200rpm)함으로써 종배양 브로쓰를 수득하였다. 한편, 종배양과 조성이 같이 배지 200ml를 1ℓ-원추형 플라스크에 옮기고, 상기와 같은 방법으로 멸균한 후에, 이 플라스크에 10ml의 종배양 브로쓰를 옮기고 30℃에서 3일간 진탕 배양하였다.
생성된 배양 브로쓰는 19.4mg/ml의 2-케토-D-글루카르산을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
이 배양 브로쓰(1600ml)를 원심분리(700rpm,10분)하여 균 세포-함유 침전물을 제거함으로써 1520ml의 상층액을 수득하였다. 4℃로 냉각한 후에, 생성된 상층액을 3일간 방치하여 칼슘 2-케토-D-글루카레이트의 무정형 결정을 수득하였다. 생성된 결정을 유리 필터(No. 3) 위에 수집하고, 소량의 냉수, 메탄올 및 에틸 에테르로 차례로 세척하고, 감압하에 오산화인으로 건조함으로써 18g의 디칼슘 2-케토-D-글루카레이트·3 수화물을 수득하였다. 생성된 결정성 물질의 분석 데이타는 다음과 같다 :
융점 : 152~157℃(분해).
원소분석 : C6H6O8Ca·3H2O.
계산치(%) : C ; 24.00, H ; 4.03, Ca ; 13.35.
실측치(%) : C ; 23.96, H ; 4.16, Ca ; 13.00.
비선광도 :
Figure kpo00005
(c=1.065, 0.1N HCl)
IR 흡수 스펙트럼 : 주흡수 파수는 다음과 같다 :
파수(cm-1) : 3590, 3500, 3400~2700(br)*, 1650, 1600, 1430, 1380, 1360, 1300, 1250, 1240, 1220, 1125, 1095, 1065, 1040, 1005, 995, 955, 900, 840, 800, 765, 725.
*) Br : 넓음.
이 결정성 물질과 표준 시료는 동일한 IR 스펙트럼(각각 제1도 및 제2도), 고수율 액체 크로마토그래피에서의 동일한 머무름 시간(9.4분) 및 시차 회절지수에 대한 동일한 UV 흡수(214nm) 비(약 1.0)를 나타낸다. 이 결정성 물질과 표준 시료를 실온에서 3시간 동안 얇은 막 크로마토그래피[셀룰로스판(Merck)용매 : 페놀-포름산-물(75 : 5 : 25)]했을 때 동일한 Rf 값(0.20)을 나타내었다. 덧붙여 이들은 발색 반응에서도 동일하였다. 즉, 둘다 모두 질산은 시약에는 흑변하고, O-페닐렌디아민 시약에는 황변하고 아닐린프탈산 시약에도 황변하였다.
이러한 분석 데이타를 근거로 하여, 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s에 의해 생산된 글루코스 대사물은 2-케토-D-글루카르산인 것으로 확인되었다.
[실시예 2]
실시예 1과 동일한 방법으로 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 균주 K591s(FERM BP-1130, IFO 14464, KFCC 10275), 12-5(FERM BP-1129, IFO 14465, KFCC 10274), 12-15(FERM BP-1132, IFO 14482, KFCC 10277), 12-4(FERM BP-1131, IFO 14483, KFCC 10276) 및 22-3(FERM BP-1133, IFO 14484, KFCC 10278)의 종배양 브로쓰를 제조하였다. 3.0%의 CLS, 0.5%의 건조 효모, 0.5%의 암모늄 설페이트, 0.05%의 티오황산나트륨, 0.2%의 황산 제이철 및 3.0%의 CaCO3로 구성된 배지(pH 6.5)에 미리 멸균시킨 원료 당류를 5%(w/v)(표 1에 나타냄)의 농도로 가하여 발효 배지를 제조하였다. 이 발효 배지(25ml)를 함유하는 200ml-원추형 플라스크에 0.25ml씩의 각각의 종배양 브로쓰를 옮기고 30℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 생성된 배양 브로쓰를 0.3N 황산으로 희석하고, 원심분리한 후, 생성된 상층액을 고수율 액체 크로마토그래피하여 2-케토-D-글루카르산 함량을 결정하였다. 결정의 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1]
2-케토-D-글루카르산의 생산량(mg/ml)
Figure kpo00006
* 2.5%(w/v)의 농도로 사용함.
[실시예 3]
2.0%의 D-글루코스, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 건조 효모, 2.0%의 탄산칼슘 및 0.01%의 악트콜(Actcol, 발포방지제, Takeda Chemical Industries)로 구성된 전(전前) 배양 배지(500ml)를 2ℓ-사까구찌 플라스크에 옮기고, 120℃에서 20분간 오토클레이브하였다. 실시예 1의 사면 배지위에서, 28℃에서 4일간 생장시킨 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 균주 12-5(FERM BP-1129, IFO 14465, KFCC 10274)의 균 세포를 10ml의 멸균수에 현탁시키고, 전체 현탁액을 상술한 사까구찌 플라스크에 옮기고 28℃에서 2일간 상호 진탕 배양(85spm)함으로써 전 배양물로 사용할 배양 브로쓰를 수득하였다.
3.0%의 D-글루코스, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 건조 효모, 2.0%의 탄산칼슘 및 0.03%의 악트콜로 이루어진 종배양 배지 30ι를 50ι-발효기에 넣고 125℃에서 20분간 오토클레이브하였다. 상술한 전 배양 브로쓰 1ι를 이 발효기에 넣고, 24ι/분의 공기공급, 1.0kg/㎠G의 내부압력 및 28℃에서 200rpm으로 교반하며 2일간 배양함으로써 종배양 브로쓰를 수득하였다.
한편, 실시예 1의 사면 배지위에서, 28℃에서 2일간 배양한 바실루스 메가테륨(IFO 12108)의 균세포를 10ml의 멸균수에 현탁시키고, 동일한 전 배양 배지를 포함하는 사까구찌 플라스크에 상기 현탁액 전체를 접종시키고, 28℃에서 2일간 상호 진탕 배양(84spm)함으로써 바실루스 메가테륨의 종배양 브로쓰를 수득하였다.
4.0%의 수크로스, 4.0%의 면실분, 0.65%의 K2HPO4, 0.55%의 KH2PO4, 0.05%의 암모늄 설페이트, 0.05%의 NaCl, 0.05%의 황산마그네슘 및 0.05%의 칼슘 판토테네이트로 구성된 30ℓ의 배지(pH 7.0)를 50ℓ-발효기에 공급하고 125℃에서 20분간 오토클레이브하였다. 1ℓ의 바실루스 메가테륨 종 배양 브로쓰를 상기 발효기에 옮기고, 24ℓ/분의 공기공급, 1.0kg/㎠G의 내부압력 및 28℃에서 200rpm으로 교반하며 4일간 배양하였다. 생성된 배양 브로쓰를 120℃에서 20분간 증기 오토클레이브하고 냉소에서 보존하여 다음의 발효 배지의 성분인 바실루스 메가테륨의 멸균 배양 브로쓰로 이용하였다.
10.0%의 D-글루코스(120℃에서 15분간 별도로 멸균), 1.0%의 펩톤, 1.0%의 황산제일철, 0.01%의 L-시스테인, 6.0%의 탄산칼슘, 1㎍/ml의 FMN, 1㎍/ml의 티아민 히드로클로라이드, 0.5㎍/ml의 비오틴, 0.02%의 악트콜 및 상술한 바실루스 메가테륨의 4.0% 멸균 배양 브로쓰로 구성된 발효 배지 120ℓ를 200ℓ-발효기에 공급하고 125℃에서 20분간 오토클레이브하였다. 상술한 종 배양 브로쓰 10ℓ를 이 발효기에 옮기고, 96ℓ/분의 공기공급, 1.0kg/㎠G의 내부압력 및 28℃에서 200rpm으로 교반하며 4일간 배양하였다. 생성된 배양 브로쓰는 99.3mg/ml의 2-케토-D-글루카르산을 함유하는 것으로 밝혀졌다.
샤프레스(sharpless) 원심분리(15,000rmp)로 처리한 이 배양 브로쓰(110ℓ)로부터 약 31kg의 젖은 침전물을 수득하였다. 이 젖은 침전을 150ℓ의 물로 세척하고, 원심분리(3,000rpm)하고, 30ℓ의 아세톤에 현탁시킨 후 탈수 및 원심분리(3,000rpm)하여 흰 분말을 수득하고, 이를 감압하 50℃에서 24시간 동안 건조시켜 14.6kg의 흰색의 디칼슘 2-케토-D-글루카레이트 조 분말을 수득하였다. 이 조 분말의 순도는 유리 2-케토-D-글루카르산에 기초하여 계산했을때 58.9%이었다.
[실시예 4]
실시예 1과 동일한 방법으로 수득한 조 디칼슘 2-케토-D-글루카레이트 5g[고수율 액체 크로마토그래피*에 의해 정량 결정했을때 85.1%의 디칼슘 2-케토-D-글루카레이트·3 수화물을 함유함]을 500ml-에를렌마이어 플라스크에 넣고, 교반하며 300ml 증류수에 현탁시켰다. 이 현탁액에 60ml의 양이온 교환 수지 IR-120B(Rohm & Haas, USA)를 가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 생성물을 유리 필터에 통과시키고, 잔류 고체를 100ml 증류수로 세척하였다. 여액과 세척액을 합하고, 감압하에 약 50ml로 농축하였다. 미리 약 10g의 히플로 수퍼 셀(Johns Manville, USA, 셀라이트)을 깔아놓은 밀리포어 여과지(Millipore Co., USA, GS WPO 4700, 구멍크기 : 0.22㎛)를 이용하여 상기 농축액을 미세 여과하고, 20ml의 증류수로 세척하고 세척액과 여액을 합하였다. 고수율 액체 크로마토그래피하여 정량 결정한 결과, 여액은 2.66g의 2-케토-D-글루카르산을 함유하는 것으로 밝혀졌다(회수율 : 90.1%).
이 여액을 10g의 활성탄(Takeda Chemical Industries, 크로마토그래피용 시라사기 A)으로 패킹된 컬럼에 통과시키고 100ml의 증류수로 세척하였다. 용출액을 분할하고, 두개의 500ml 들이 가지형 플라스크에 옮기고 7시간 동안 동결 건조하여 증발시켰다. 생성된 무색의 유성 물질을 감압하에 3시간 동안 오산화인의 존재하에 건조시키고, 원소분석 및 IR 스펙트럼 분석을 하였다.
원소분석 : C6H8O8·1.4H2O.
계산치(%) : C ; 30.88, H ; 4.66.
실측치(%) : C ; 31.12, H ; 4.57.
고수율 액체 크로마토그래피*: 머무름 시간=7.30분.
IR(film) : 주 흡수 파수(cm-1) 3700~2700, 1730, 1700(sh), 1680(sh), 1640.
*) 고수율 액체 크로마토그래피의 측정 조건.
기기 : 시마드즈 LC-3A 모델.
컬럼 : 아미넥스 이온 용출 HPX-87H, 300×7.9mm(Bio-Rad).
용출속도 : 0.6ml/분.
컬럼온도 : 25℃.
이동상 : 0.008N H2SO4.
검출기 : UV(210nm) 및 RI(Showa Denko, SE-31 모델).
[실시예 5]
실시예 4의 방법에 따라 5.0g의 조 디칼슘 2-케토-D-글루카레이트·3 수화물[85.1%의 C6H6O8Ca·3H2O 함유]로부터 제조한 10ml의 2-케토-D-글루카르산 용액[고수율 액체 크로마토그래피에 의해 정량 결정했을 때 2.71g(0.013몰)의 2-케토-D-글루카르산 함유 ; 수율 : 92.0%]을 30ml의 다우엑스 50W-X8(양이온 교환 수지, Dow Chemical Co., USA, Na+형)로 패킹한 컬럼에 통과시켰다. 증류수로 용출시켜 400ml의 용출액(pH : 3.4)을 수득하고, 이를 감압하에 건조상태로 농축시켰다. 잔류물에 메탄올(400ml)을 가하고, 교반하여 분말성 물질을 수득하였다. 여과하여 분말을 수집하고, 소량의 아세톤으로 세척하고 감압하에 건조기내에서 건조시킴으로써 2.44g의 모노소듐 2-케토-D-글루카레이트(수율 : 75.6%)를 수득하였다.
융점 : 155~160℃(분해).
원소분석 : C6H7O8Na·H2O.
계산치(%) : C ; 29.04, H ; 3.66.
실측치(%) : C ; 28.72, H ; 3.80.
IR(KBr) : 주흡수 파수(cm-1) 3600~2800, 1720, 1620, 1410.
[실시예 6]
실시예 4의 방법에 따라 5.0g의 조 디칼슘 2-케토-D-글루카레이트·3 수화물[85.1%의 C6H6O8Ca·3H2O 함유]로부터 제조한 10ml의 2-케토-D-글루카르산 용액[고수율 액체 크로마토그래피로 정량 결정했을때 2.71g(0.013몰)의 2-케토-D-글루카르산 함유]을 30ml의 다우엑스 50W-X8(K+형)로 패킹한 컬럼에 통과시켰다. 증류수로 용출시켜 400ml의 용출액(3.42의 pH 값을 나타냄)을 수득하였다.분말을 여과하여 수집하고, 소량의 아세톤으로 세척하고 감압하의 건조기내에서 건조함으로써 2.12g의 모노포태슘 2-케토-D-글루카레이트를 수득하였다(수율 61.7%).
융점 : 135~150℃(분해).
원소분석 : C6H7O8K·H2O.
계산치(%) : C ; 27.27, H ; 3.43.
실측치(%) : C ; 26.83, H ; 3.66.
IR(KBr) : 주흡수 파수(cm-1) 3600~2800, 1720, 1610, 1410.
[표 2]
사면 배지(g/l)
D-소르비톨 25
펩톤 10
효모 추출액 10
CaCO32
한천 2
pH 7.0 20
[표 3]
완전 배지(g/l)
D-소르비톨 25
펩톤 10
효모 추출액 10
pH 6.5(고체 배지의 경우에는 20g의 한천을 가함)
[표 4]
최소 필수 배지(g/l)
수크로스 5
K2HPO41
KH2PO41
(NH4)2SO41
NaCl 1
MgSO4·7H2O 0.1
MnCl2·nH2O 0.002
수듐 L-글루타데이트 0.1
L-시스테인 0.1
CoA 0.002
FMN 0.002
티아민 0.002
비오틴 0.001
pH 7.0(고체 배지의 경우에는 20g의 한천을 가함)
표 3에 나타낸 5ml의 완전 배지를 함유하는 시험관(16mm×160mm)에 표 2에 나타낸 사면 배지에서 생장시킨 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s를 고리하나 가득 접종시키고 30℃에서 2일간 진탕 배양하였다. 이 배양 브로쓰(1ml)를 5ml의 동일 배지를 포함하는 시험관에 옮기고 진탕하며 4시간 동안 배양하였다. 생성된 브로쓰(5ml)를 5℃에서 15분간 무균 원심분리(12,000rpm)하여 세포를 수확하였다. 세포를 10ml의 트리스-말레산 완충액(pH 6.5 : 0.05M)에 현탁시키고, 재원심분리하였다. 상기 공정을 2회 반복하고, 세척된 세포를 1mg/ml의 니트로소구아니딘을 함유하는 상기 완충액 5ml에 현탁시키고, 30℃에서 2시간 동안 변이처리를 위하여 진탕하였다.
현탁액을 5℃에서 15분간 원심분리(12,000rpm)하여 세포를 수집하고 10ml씩의 트리스-말레산 완충액으로 2회 세척하여 니트로소구아니딘-처리 세포를 함유하는 분획을 회수하였다. 이것을 0.85% 염수로 희석하여 적절한 농도로 만들고, 15ml의 완전 배지(고체)를 함유하는 판(직경 : 9cm)에 도포하였다. 접종된 판배지를 28℃에서 5일간 배양하여 콜로니를 생장시켰다. 콜로니의 수를 세고 처리하지 않은 대조와 비교하였다. 니트로소구아니딘 처리에 의한 미생물의 치사율은 90.4% 이었다. 완전 배지판 위의 콜로니를 표 4의 최소 필수 배지 판위에 복사하고, 28℃에서 3일간 배양한 후 영양 요구성 변이체의 발생 빈도를 조사하였다. 발생 빈도는 6.6%이었다.
변이 유발소로 처리한 완전 배지판 위의 콜로니를 매 판당 12 균주의 비율로서 새로운 완전 배지에 약 2cm의 길이로 선을 그었다(streak). 28℃에서 2일간 배양한 후, 고리하나 가득한 생장 세포를 7.0%의 D-글루코스(개별적으로 멸균함), 1.0%의 건조 효모, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 염화제일철 및 3.0%의 CaCO3로 구성된 3ml의 배지(pH 6.5)를 함유하는 시험관에 옮겼다. 피시험 돌연변이체 중에서 균주 TH14-86이 상술한 조건하에서 모균주 K591s 보다 두배 많은 양의 2-케토-D-글루카르산을 생산하는 것으로 판명되었다. 이 균주 TH14-86(IFO 14466, FERM BP-1128, KFCC 10273)을 D-글루코스를 산화시키는 능력이 증강된 산화균으로 선택하였다.
[실시예 8]
실시예 7에서 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s로부터 유도된 돌연변이 균주 TH14-86을 사면 배지상에서 28℃에서 4일간 생장시켰다. 사면 배양물로부터 고리하나 가득한 세포를 취하여, 실시예 1의 종배양 배지 20ml를 함유하는 200ml-원추형 플라스크에 접종시키고, 진탕하며 30℃에서 2일간 배양하였다.
1ℓ 들이 원추형 플라스크에, 3.0%의 D-글루코스, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 건조 효모 및 2.0%의 CaCO3로 구성된 전배양 배지 200ml를 충전시키고, 120℃에서 20분간 오토클레이브하여 멸균하였다. 이 원추형 플라스크에 20ml의 상기 배양 브로쓰를 접종하고, 30℃에서 진탕하며 2일간 배양함으로써 균주 TH14-86의 전배양 브로쓰를 수득하였다.
5ℓ-자르 발효기를 오토클레이브하고, 5.0%의 D-글루코스(개별적으로 멸균함), 4.0%(v/v)의 바실루스 메가테륨의 멸균 배양 브로쓰(실시예 3에서 제조), 1.0%의 펩톤, 0.3%의 암모늄 설페이트, 0.05%의 Na2S2O3, 0.03%의 KH2PO4, 0.05%의 마그네슘 설페이트, 0.1%의 FeSO4·7H2O, 0.05%의 악트콜, 5mg/ℓ의 MnSO4·4H2O, 1mg/ℓ의 FMN, 1mg/ℓ의 티아민, 0.05mg/ℓ의 비오틴 및 9.0%의 CaCO3로 구성된 발효 배지 2.4ℓ를 충전시킨 후, 120℃에서 30분간 오토클레이브하여 멸균하였다.
이 발효 배지에 상술한 균주 TH14-86의 전배양 브로쓰 300ml를 접종하고, 2.0ℓ/분의 공기공급 및 800rpm의 교반 조건하에 32℃에서 54시간 동안 배양하면서, 처음 6시간 동안 배양한 후, 18시간에 걸쳐 600ml의 D-글루코스 용액(300g의 D-글루코스를 물에 용해시키고 120℃에서 20분간 오토클레이브하여 제조)을 자르 발효기에 연속적으로 가하였다.
생성된 배양 브로쓰(3.05ℓ)는 164.9mg/ml의 2-케토-D-글루카르산을 함유하였다.
[실시예 9]
1.0%의 L-소르보스(개별적으로 멸균), 0.5%의 펩톤 및 0.5%의 효모 추출액으로 구성된 25ml의 배지(pH 7.0)를 200ml-원추형 플라스크에 충전시키고, 120℃에서 15분간 오토클레이브하여 멸균하였다. 표2의 사면 배지에서 생장시킨 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH14-86을 고리하나 가득히 플라스크에 28℃에서 4일간 접종시키고, 30℃에서 진탕하며 2일간 배양하여 종 배양물을 수득하였다.
0.5%의 D-글루코스(개별적으로 멸균), 1.0%의 펩톤, 0.5%의 효모 추출액 및 2.0%의 CaCO3로 구성된 배지(pH 7.0) 25ml를 200ml-원추형 플라스크에 충전시키고, 120℃에서 15분간 오토클레이브하여 멸균하였다. 1.0ml의 상기 종 배양물을 플라스크에 접종시키고 30℃에서 2일간 배양하였다.
생성된 배양물(460ml)을 실온에서 20분간 방치하고, 침전을 경사 분리하여 제거하였다. 잔류 액체를 실온에서 1,000rpm의 저속으로 원심분리하여 주로 CaCO3로 이루어진 침전을 제거하였다. 이렇게하여 얻은 세포 현탁액을 5℃에서 10분간 더 원심분리(6,000rpm)하고, 수집한 세포를 약 100ml씩의 냉염수(0.85%)로 2회 세척하고, 5℃에서 재원심분리(6,000rpm)하여 세정된 세포를 수득하였다. 세포를 35ml의 냉염수(0.85%)에 현탁시켜 세척된 세포 현탁액을 수득하였다. 이 세척된 세포 현탁액 2ml에 300mg의 D-글루코스, 0.5ml의 2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산(MES) 완충액(pH 6.5 : 0.5M) 및 180mg의 CaCO3를 가하고 물로 희석하여 10ml로 만들었다. 혼합물을 100ml-원추형 플라스크내에서 30℃에서 진탕하며 24시간 반응시켰다. 이렇게하여 수득한 반응 혼합물은 25.7mg/ml의 2-케토-D-글루카르산을 포함하였다.

Claims (8)

  1. 하기의 사슬구조로 표현되는 화합물을 슈도글루코노박터 속에 속하며, 기 화합물을 산화시킬 수 있는 세균 또는 그의 가공물질과 배지내에서 접촉시키고, 2-케토-D-글루카르산을 생산 및 축적시키고, 회수함을 특징으로 하는 2-케토-D-글루카르산의 제조방법.
    Figure kpo00007
  2. 제1항에 있어서, 세균이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세균이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s(FERM BP-1130, IFO 14464, KFCC 10275), 12-5(FERM BP-1129, IFO 14465, KFCC 10274), TH14-86(FERM BP-1128, IFO 14466, KFCC 10273), 12-15(FERM BP-1132, IFO 14482, KFCC 10277), 12-4(FERM BP-1131, IFO 14483, KFCC 10276) 또는 22-3(FERM BP-1133, IFO 14484, KFCC 10278)임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 세균이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH14-86(FERM BP-1128, IFO 14466, KFCC 10273)임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 화합물이 D-글루코스임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 화합물이 D-글루콘산임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 화합물을 세균과 접촉시킬때 화합물을 배지를 기초로 하여 1~30%(w/v)의 농도로 사용함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 농도가 배지를 기초로 하여 5~20%(w/v)임을 특징으로 하는 방법.
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