KR910000454B1 - Novel microorganism streptomyces sp kccb2 - Google Patents

Abstract

A process for the production of validamycin A comprises inoculating 5 V/V% seed culture of Streptomyces hygroscopicus var limoneus KCCB2 (KFCC-10650) to the medium (pH 6.5-7.5) contg. 3 wt.% cornstarch, 3 wt.% glucose, 3wt.% sucrose, 3wt.% corn steep liquor, 3 wt.% corn gluten, 3 wt.% cottonseed powder, 1.5 wt.% NaCl, 0.5 wt.% NH4 Cl and 1.5 wt.% CaCO3, and cultivating the broth at 28-39 deg.C, 200 rpm for 7 days to produce and accumulate validamycin A, and then recovering from the broth.

Description

스트렙토마이세스의 변이주 KCCB2및 이를 이용한 항생물질의 제조방법Variants of Streptomyces KCCB2 and Preparation of Antibiotics Using the Same

본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스(streptomyces hygroscopicus varlimoneus) ATCC 21432로부터 돌연변이 유발로 개량된 변이주 KCCB₂(수탁번호: KFCC-10650) 및 이를 이용하여 아미노글루코사이드계 항생물질을 생성시킨 후, 그 배양액으로부터 주성분인 바리다마이신(validamycin) A를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention is to produce a mutant strain KCCB ₂ (Accession No .: KFCC-10650) modified by mutagenesis from Streptomyces hygroscopicus varlimoneus ATCC 21432 and aminoglucoside antibiotics using the same. And a method for producing varidamycin A as a main component from the culture solution.

스트렙토마이세스 하이그로스코피커스에 의해 생산되는 바리다마이신은 벼문고병에 유용한 주성분인 A와 그의 유도체 B.C.D.E 및 F가 있다.Varidamycin produced by Streptomyces hygroscophytes includes A, a major component useful for rice blight, and its derivatives B.C.D.E and F.

본 발명은 목적 화합물인 바리다마이신 A는 벼의 문고병예방 및 치유에 유용하며 작물과 인축에 대한 독성이 낮아 수도용 살균제로 극히 우수한 물질(미국특허 제3,754,083호, 일본특허공고 소50-28,157호)로 소개되어 있다.The present invention, baridamycin A, a target compound, is useful for the prevention and healing of rice paddy disease, and is extremely excellent as a fungicide for water supply due to its low toxicity to crops and human beings (US Pat. No. 3,754,083, Japanese Patent Publication No. 50-28,157). It is introduced.

한편 문고병은 도열병 및 백엽고병과 함께 벼의 3대병으로 우리나라 미작지대에 널리 분포해있으며, 특히 1960년대 이후 해마다 큰 피해를 주고 있다.On the other hand, the paperback disease, along with the heat and white leaf disease, is the third major disease of rice, widely distributed in Korea's rice field, especially since the 1960s, causing great damage every year.

이러한 문고병의 방제약으로서 종래에는 유기합 성살균제인 네오진 액제 및 분제를 사용하기도 했으나 이러한 종래의 방제약은 높은 어독성과 중금속성분으로 인해 환경오염 문제가 심각해 대두되어 왔다.Conventionally, as an antimicrobial agent for paperback disease, neosynthetic liquids and powders, which are organic synthetic disinfectants, have been used. However, these conventional antimicrobial agents have caused serious environmental pollution due to high fish toxicity and heavy metal components.

그러나, 바리다마이신 A는 사용후 자연환경하에서 탄산가스나 물등의 안전한 물질로 분해되기 때문에 무공해 저독성 살균제로서 각광을 받고 있다.However, varidamycin A is in the spotlight as a pollution-free, low-toxic bactericide because it decomposes into a safe substance such as carbon dioxide or water in a natural environment after use.

바리다마이신 A의 유도체인 B.C.D.E 및 F는 문고병의 원인균인 라이조토니아 솔라니에 대한 선택적 특이성이 낮아 문고병에 대한 예방 및 치유능력이 매우 떨어지며 또한 바리다마이신 A의 발효 부산물로 그 생산성이 매우 낮다.B.C.D.E and F, derivatives of varidamycin A, have low selective specificity for the causative agent of the disease, Lyzotonia solani, which is very poor in the prevention and cure of the disease, and also a very low productivity as a fermentation by-product of varidamycin A.

종래에 알려져 있는 미생물 발효에 의한 바리다마이신 A의 생산방법으로는 포도당 3중량%, 대두분 2.2중량%, 펩톤 0.3중량% 그리고 탄산칼슘 0.4중량%을 함유하는 배지에서 이를 28℃의 온도로 2일간 배양하여 종배양액을 제조하고 이와 동일성분을 함유하는 배지에다 상기 종배양액을 5% 접종한 후 교반속도 200rpm 의 조건으로 28℃에서 114시간 배양하여 200mg/l 의 목적물을 수득하는 방법(미국특허 제3,754,083호)이 소개되어 있다.Conventionally known methods for producing varidamycin A by fermentation of microorganisms include a medium containing 3% by weight of glucose, 2.2% by weight of soy flour, 0.3% by weight of peptone and 0.4% by weight of calcium carbonate, at a temperature of 28 ° C. for 2 days. Method of preparing a seed culture solution by incubating the seed culture solution 5% inoculated in a medium containing the same component and incubating for 114 hours at 28 ℃ under a stirring speed of 200rpm to obtain the target product of 200mg / l (US Patent No. 3,754,083).

그러나, 상기 방법은 배양시간이 5일정도로 짧아 균주가 이용하는 탄소원의 농도가 상대적으로 낮고, 또 배지내에 고가의 펩톤을 0.3중량% 첨가해야 하기 때문에 경제성 및 생산성이 낮은 단점이 있었다.However, the method has a disadvantage of low economical efficiency and productivity because the incubation time is about 5 days, the concentration of the carbon source used by the strain is relatively low, and 0.3 wt% of expensive peptone must be added to the medium.

한편, 발효배양액에 축척된 바리다마이신의 분리 및 정제방법으로는 먼저 규조토를 사용하여 세포배양액으로부터 균체를 제거해낸 뒤, 그 여액을 양이온 및 음이온 교환수지에 통액시켜 무기온들을 제거하고, 이를 다시 강산성 양이온 교환수지에 흡착시켜 0.5N 암모니아수로 용출시켜 얻는 방법(미국특허 제3,754,083호, 제4,011,391호, 제4,089,947호)이 소개되어 있다.Meanwhile, as a method of isolating and purifying varidamycin accumulated in a fermentation broth, first, the cells are removed from the cell culture broth using diatomaceous earth, and the filtrate is passed through a cation and an anion exchange resin to remove inorganic temperatures. Adsorption by cation exchange resins to elute with 0.5 N ammonia water (US Pat. Nos. 3,754,083, 4,011,391 and 4,089,947) is introduced.

그러나, 상기 방법은 균체표면에 묻은 생산물의 회수가 모두 이루어지지 않아 회수율이 낮았으며, 용출시 유도체별 분리가 효율적이지 못하고 정량분석에 있어서 정확한 농도의 산출이 어려운 단점이 있었다.However, the method has a low recovery rate because all of the products on the cell surface are not recovered, and the separation of derivatives during elution is not efficient and it is difficult to calculate the correct concentration in quantitative analysis.

이에 본 발명은 종래에 사용되어온 균주에 비해 탄소원 및 질소원에대한 이용도가 높고, 바리다마이신 A의 생산능력이 향상된 더욱 우수한 새로운 변이주를 제공하는데에 그 목적이 있다.Accordingly, the present invention has a high object of using a carbon source and a nitrogen source as compared to the conventionally used strains, and an object of the present invention is to provide a better new variant strain with improved production capacity of varidamycin A.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 변이주를 이용하여 바리다마이신을 제조하는데 있어서, 보다 저렴한 비용으로 높은 생산수율을 얻을 수 있는 새로운 배지조건과 배양방법을 확립하고, 보다 경제적인 정제 및 분리공정을 사용하여 바리다마이신 A를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.In addition, another object of the present invention is to prepare a varidamycin using the above mutant strain, to establish a new medium conditions and culture methods to obtain a high production yield at a lower cost, using a more economical purification and separation process To provide a method for preparing varidamycin A.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에 따른 신균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 KCCB₂(streptomyce-shygroscopicus var limoneus KCCB₂) 는 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 ATCC 21432의 변이주로서, 다음과 같은 방법으로 제조된다.Novel strain of Streptomyces high-gloss nose coarse variant of the remote Neuss _{KCCB 2 (streptomyce-shygroscopicus var limoneus} KCCB 2) according to the present invention is a mutant strain of Streptomyces high-gloss nose coarse variant of the remote Neuss ATCC 21432, in the following way: Are manufactured.

우선, 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 ATCC 21432 의 포자를 TM 완충액(Tris-Moleir Buffer pH 8.0)에 녹이고 이를 N.T.G. 1.0mg/ml 로 30분간 처리한 다음 이렇게 얻어진 균주를 전분 3-6g, 포도당 3-6g, 콘구루텐 3-6g, 콘스팁리퀴어3-6g 과 무기염류등을 증류수 100ml에 넣은 배지에서 4-6일간 진탕배양하여 생산성이 높은 우수균주를 선별분리하다.First, the spores of Streptomyces hygroscophycus strain Limoneus ATCC 21432 were dissolved in TM buffer (Tris-Moleir Buffer pH 8.0), which was then treated with N.T.G. After 30 minutes of treatment at 1.0mg / ml, the obtained strain was treated with 3-6g of starch, 3-6g of glucose, 3-6g of congurutene, 3-6g of congestiquique and inorganic salts in a medium containing 100ml of distilled water. After 6 days shaking culture, the excellent productive strains were screened and separated.

특히, 이 변이주는 30세대 이상 지나도 높은 생산성을 유지하는 것이 나타났다.In particular, this mutant strain has been shown to maintain high productivity even after more than 30 generations.

본 발명자들은 상기 변이주를 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 KCCB(streptomyces hygroscopicus var limoneus KCCB₂)로 명명하고, 1988년 11월 11일자로 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호:KFCC-10650)The present inventors named the mutant strain Streptomyces hygroscopicus var limoneus KCCB ₂ (KCCB ₂ ) and deposited it with the Korean spawn association on November 11, 1988 (Accession Number: KFCC-10650).

이하, 본 발명에 따른 스트렙토 마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 KCCB₂는 다음과 같은 특성을 갖는다.Hereinafter, the Streptococcus hygroscophycus strain Limoneus KCCB ₂ according to the present invention has the following characteristics.

(1) 당분 이용특성(1) Sugar use characteristics

본 발명에 따른 신균주인 상기 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 KCCB₂의 당 이용성은 다음 표 1에서 알수 있는 바와 같이 포도당, 자당, 전분,글리세롤, 맥아당 등에서는 친규주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 ATCC 21432와 큰 차이를 보이지는 않으나 솔비톨, 초산나트륨, 구연산 나트륨등의 이용에 있어서는 친균주보다 월등한 특징을 갖는다.The sugar availability of the strain Streptomyces hygroscopicus strain Limoneus KCCB ₂ according to the present invention, glucose, sucrose, starch, glycerol, maltose and the like, as shown in the following Table 1 Although not significantly different from Copicus ATCC 21432, the use of sorbitol, sodium acetate, sodium citrate, etc. is superior to the parent strain.

[표 1]TABLE 1

상기 표 1에서 알수 있는 바와같이 변이주는 친균주에 비해 많은 종류의 당을 이용함을 알 수있으며, 이와 같은 형질이 고농도의 당을 이용하여 바리다마이신 A의 생산성이 높아지는 것으로 생각된다.As can be seen in Table 1, it can be seen that the mutant strain uses many kinds of sugars compared to the parent strain, and such traits are thought to increase productivity of varidamycin A using high concentrations of sugars.

(2) 배양학적 특성(2) culture characteristics

본 발명의 변이주와 친균주는 포도당-아스파라신배지, N.A 배지, 벤네트아가베지, 펩톤-포도당 배지, 포도당-N.A 배지, 타이로신아가배지, 펩톤아가배지 등에서는 큰 차이점을 보이지 않았으나 YEME 아가배지, 효모추출배지, PDA 배지 등에서는 상이한 점을 나타내며, 그 결과는 다음 표 2와같다.Variants and parent strains of the present invention did not show a significant difference in glucose-asparasine medium, NA medium, bennetagavacge, peptone-glucose medium, glucose-NA medium, tyrosine agar medium, peptone agar medium, YEME agar medium, Yeast extraction medium, PDA medium and the like shows a different point, the results are shown in Table 2 below.

[표 2]TABLE 2

한편, 본 발명에 따른 변이주인 KCCB₂의 발효조건을 확립하는데 있어서, 배지조건은 탄소원으로 전분, 포도당, 설탕등을 3-6중량%, 질소원으로는 옥수수침지액, 콘글루텐밀, 면실분 등을 3-6중량% 사용하고, 소금 1.5중량%, 염화암모늄 0.5중량%, 탄산칼슘 1.5중량%를 사용한다.On the other hand, in establishing the fermentation conditions of the variant strain KCCB ₂ according to the present invention, the medium conditions are 3-6% by weight of starch, glucose, sugar, etc. as a carbon source, corn steep liquor, corn gluten wheat, cottonseed meal, etc. 3-6% by weight, salt 1.5% by weight, ammonium chloride 0.5% by weight, calcium carbonate 1.5% by weight.

또한 배양시에는 180rpm 의 교반속도, 6.5-7.5의 초기 pH로 28℃에서 7일간 배양한다.In addition, the culture was incubated for 7 days at 28 ℃ with a stirring speed of 180rpm, initial pH of 6.5-7.5.

본 발명에서는 상기와 같은 배지조성과 배양조건을 기초로 하되 배양중 일정량의 유기산을 일정시간 배양후에 첨가하게 되면 바리다마이신의 생산성이 크게 향상된다.In the present invention, on the basis of the medium composition and the culture conditions as described above, if a certain amount of organic acid is added after incubation for a certain time, the productivity of varidamycin is greatly improved.

또한, 본 발명에서는 상기와 같은 배지조성을 기초로 하고, 배양시 0.5-1.5V, V.M의 통기량과 400-800rpm 의 교반속도로 25-33℃의 온도에서 7-9일간 연속배양기를 사용하여 연속 배양하는 방법을 사용할 수도 있는바, 이렇게 하게되면 바리다마이신의 생산성이 2배이상 향상된다.In the present invention, based on the medium composition as described above, using a continuous incubator for 7-9 days at a temperature of 25-33 ℃ at 0.5-1.5V, aeration rate of VM and agitation speed of 400-800rpm It is also possible to use a culture method, which increases the productivity of varidamycin by more than two times.

이와같이 생산성이 향상된 이유는 변이주 KCCB₂의 당분 이용특성(표1 참조)에서 나타난 바와 같이 본 발명의 변이주 KCCB₂는 전분의 중간 가수분해산물을 포함한 여러종류의 당을 이용할 수 있다는 형질적 특성과, 유기산을 첨가함으로써 배지의 pH를 일정하게 유지시켜 균의 생육에 적합한 조건을 만들어줄 수 있으며, 첨가한 유기산이 바리다마이신 A생산에 필요한 탄소원으로 사용되는 것에 기인하는 것으로 판단된다.Thus reason, productivity improvements are sugars using attribute type that (see Table 1) can be used for several types of sugar, including intermediate hydrolyzate of mutant KCCB ₂ is a starch of the present invention as shown in the qualitative properties of the mutant KCCB ₂ and, By adding an organic acid, the pH of the medium can be kept constant to create conditions suitable for the growth of bacteria, and it is believed that the organic acid is used as a carbon source necessary for the production of varidamycin A.

한편, 발효배양액에 축적된 바리다마이신 A의 분리 및 정제방법에 있어서는 배양액에 옥살산을 가하여 pH 4.0으로 조정한후, 한외여과장치(분획분자량(20,000))을 사용하여 균체분리 하였으며, 농축된 균체에 일정량의 물을 가한후 재여과한다.On the other hand, in the method of separation and purification of varidamycin A accumulated in the fermentation broth, the solution was adjusted to pH 4.0 by adding oxalic acid to the culture medium, and then the cells were separated using an ultrafiltration device (fractional molecular weight (20,000)), and then a predetermined amount of the concentrated cells. Add water and refilter.

한외 여과막을 통과한 여과액을 강산성 양이온 교환수지(Diaion SKIB) 및 약염기성 음이온 교환수지(Diaion WA30)를 통과시켜 이온들을 제거하고, 이를 다시 강산성 양이온 교환수지(Diaion SK102)에 흡착시킨 뒤 증류수와 0.1N 암모니아수의 농도기울기를 만들어 바리다마이신 A 내지 F의 유도체분리를 효율적을 진행한다(표 8참조)The filtrate passed through the ultrafiltration membrane was passed through a strong acid cation exchange resin (Diaion SKIB) and a weak base anion exchange resin (Diaion WA30) to remove ions, which were then adsorbed to a strong acid cation exchange resin (Diaion SK102) and then distilled water and A concentration gradient of 0.1 N ammonia water is made to efficiently separate derivatives of varidamycin A to F (see Table 8).

이어서, 용출하여 얻은 활성분획은 흡착형수지(Amberlite XAD-4)를 통과시켜 조색소를 제거한 뒤 강염기성 음이온 교환수지에서 크로마토그라피하여 바리다마이신 A,B 및 C를 분리정제한다.Subsequently, the eluted active fraction is passed through an adsorptive resin (Amberlite XAD-4) to remove crude pigment and chromatographed on a strong basic anion exchange resin to separate and purify varidamycin A, B and C.

또한 바리다마이신 A의 생산성 및 정제단계별 농도는 고속액체 크로마토그라피법에 따라 실시한다.In addition, the productivity and concentration of each purification step of varidamycin A is carried out according to the high performance liquid chromatography method.

이하, 본 발명의 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

[실시예 1]Example 1

다음 표 3 및 표 4와 같은 조성으로 종배양 배지와 본배양 배지를 조성하고 가성소다를 사용하여 그 pH 가 6.5 내지 7.5로 되도록 조절한다.Next, culture the seed culture medium and the main culture medium with the same composition as in Table 3 and Table 4, and adjust the pH to 6.5 to 7.5 using caustic soda.

[표 3]TABLE 3

[표 4]TABLE 4

상기 표 4 종배양 배지 100ml를 500ml 플라스크에 넣고 120℃에서 15분간 가압멸균한후, 여기에다 YEME 아가사면배지에서 5-7일간 배양한 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변조 리모네우스 KCCB₂한 백금니를 접종하여 48시간 배양함으로써, 종배양액을 제조하였다.100 ml of the culture medium of the above Table 4 was put into a 500 ml flask and autoclaved at 120 ° C. for 15 minutes, and then Streptomyces hygroscopicus modulated Limoneus KCCB ₂ one platinum tooth was incubated for 5-7 days in YEME agar slope medium. The seed culture solution was prepared by inoculating and incubating for 48 hours.

본 배양은 본 배양 배지 100ml를 500ml 플라스크에 넣고 120℃에서 20분간 가압멸균후, 종배양액 5ml를 접종하여 교반속도 200rpm 의 조건으로 28℃에서 7일간 배양하였다. 배양일수에 따른 두 균주의 pH, 잔존당, 잔존 암모니아의 농도 및 바리다마이신 A의 생산량은 다음 표 5와 같다.In the main culture, 100 ml of the main culture medium was placed in a 500 ml flask and autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes, and then 5 ml of the seed culture solution was inoculated and incubated at 28 ° C. for 7 days at a stirring speed of 200 rpm. The pH, residual sugar, residual ammonia concentration and varidamycin A production of the two strains according to the culture days are shown in Table 5 below.

[표 5]TABLE 5

[실시예 2]Example 2

YEME 아가사면배지에 배양한 변이주 KCCB₂한 백금니를 가압 멸균된 종배양 배지에 접종한 후, 48시간 배양하여 종배양액을 제조하였다.One strain of KCCB ₂ mutant strain cultured in YEME agar mask medium was inoculated in autoclaved cultivation medium, and then cultured for 48 hours to prepare a culture medium.

실시예 1과 같은 조건으로 조제한 본배양 배지에 종배양을 5% 부피비율로 접종하여 교반속도 180rpm 의 조건으로 진탕 배양하면서 구연산, 유산 또는 초산등의 유기산을 배양 2일째 또는 2일과 4일째에 각각 1%부터 비율로 첨가하면서 배양하였다.Inoculated in the main culture medium prepared in the same conditions as in Example 1 at 5% by volume ratio, while shaking cultured at a stirring speed of 180 rpm with organic acids such as citric acid, lactic acid or acetic acid on the second or second and fourth days, respectively. Cultures were added at a rate of 1%.

일정한 시간 배양한후 배양액을 회수하여 첨가한 유기산의 종류와 농도에 따른 바리다마이신의 생산성을 측정한 결과는 다음 표 6과 같다.After incubating for a certain time, the culture medium was recovered and the results of measuring the productivity of varidamycin according to the type and concentration of organic acid added are shown in Table 6 below.

[표 6]TABLE 6

* 대조: 유기산을 첨가하지 않은 경우* Control: no organic acid added

* 첨가회수 1은 배양 2일째에, 첨가회수 2는 배양 2일째와 4일째에 각각 한번씩 첨가했음을 말한다.* Addition number 1 indicates that the addition number 2 was added once on the 2nd day and 4th day of the culture.

상기 표 6에서 알수 있는 바왁 KX이 본 발명에 따른 변이주를 배양함에 있어서, 배지에다 유기산을 첨가하는 경우, 초산을 배양 2일째에 1% 부피 비율로 첨가하였을때는 대조군에 비해 25%의 생산성 향상을 나타냈다.Barwak KX can be seen in Table 6 In the culturing the mutant according to the present invention, when the organic acid is added to the medium, when acetic acid is added in 1% volume ratio on the second day of culture, a 25% productivity improvement compared to the control group Indicated.

[실시예 3]Example 3

상기 실시예 1과 동일한 조성의 종배양 배지 및 본배양 배지를 조성하여 본 발명에 따른 변이주 KCCB₂를 다음 조건으로 배양한다.The seed culture medium and the main culture medium of the same composition as in Example 1 were prepared to culture the mutant strain KCCB ₂ according to the present invention under the following conditions.

본 배양은 용량 7.5l의 발효조 3대에 각각 본배양 배지 4l를 넣고 121℃에 30분간 가압멸균후, 종배양액 200ml를 접종하고 통기량 1.0V.V.M, 교반속도 400rpm 의 조건으로 28℃에서 7일간 배양하면서 배양액의 pH 가 6.5-7.5를 유지할 수있도록 황산, 유산 및 초산을 각각 자동적으로 첨가하였다.In this culture, 4 l of the main culture medium was added to three fermenters of 7.5 l each, followed by autoclaving at 121 ° C. for 30 minutes, inoculated with 200 ml of the culture medium, and incubated at 28 ° C. for 7 days under conditions of aeration rate 1.0 VVM and agitation speed of 400 rpm. Sulfuric acid, lactic acid and acetic acid were added automatically so that the pH of the culture was maintained at 6.5-7.5.

상기 발효조에서 배양액을 회수하여 바리다마이신 A의 생산성을 측정한 결과는 다음 표 7과 같다.The results of measuring the productivity of the varidamycin A by recovering the culture solution in the fermenter are shown in Table 7 below.

[표 7]TABLE 7

[실시예 4]Example 4

상기 실시예 1의 배지조성을 이용해 배양한 세포배양액(생산량:3,150mg/l) 286l중에서 그 260l를 한외여과(분획분자량 20,000)하여 170l의 여액을 얻었다. 농축된 균체 90l에 대하여는 동량의 몰을 가하여 이를 다시 90l로 농축하는 작업을 2회 반복하여 180l의 희석여과액 및 90l의 세포농축액을 얻었다.In 286 l of the cell culture medium (production amount: 3,150 mg / l) cultured using the medium composition of Example 1, 260 l of the ultrafiltration (fractional molecular weight 20,000) was obtained to obtain 170 l of the filtrate. To 90 l of concentrated cells, the same amount of molar was added and concentrated to 90 l twice to obtain 180 l of the diluted filtrate and 90 l of cell concentrate.

한편, 26l의 세포배양액에 대해서는 미국특허 제3,754,083호에 의한 방법으로 여과하였는바, 즉 전공여과장치에 여과막을 깔고 그 위에 1.06kg 의 규조토(세포배양액의 4%)를 덮은 뒤 26l의 배양액을 부어 18.7l의 여과액을 얻었다.On the other hand, the cell culture solution of 26l was filtered by the method according to U.S. Patent No. 3,754,083, that is, a filter membrane was placed on the major filtration device, and 1.06kg of diatomaceous earth (4% of the cell culture solution) was covered thereon, followed by pouring 26l of culture medium. 18.7 l of filtrate was obtained.

상기 두가지 방법으로 여과한 여액들을 분취하여 고속액체 크로마토그라피법으로 농도 및 회수율을 측정한 결과는 각각 다음 표 8과 표 9와 같았다.The filtrates were filtered by the two methods, and the concentration and the recovery rate were measured by high-performance liquid chromatography.

[표 8]TABLE 8

[표 9]TABLE 9

[실시예 5]Example 5

상기 실시예 4의 여과액 350l중 300l를 강산성 양이온교환수지 Diaion SKIB(H-형) 수지탑(수지량 50) 및 약염기성 음이온 교환수지 Diaion WA30(OH-형 수지탑(수지량 50l)에 통액시켜 양이온 및 음이온을 제거한후 이들 수지탑을 증류수로 세정한 액 100l 와 함께 강산성 양이온 교환수지 Diaion SK102(Na-형)수지탑(수지량 60l)에 흡착시켰다.300l of 350l of the filtrate of Example 4 was passed through a strong acid cation exchange resin Diaion SKIB (H-type) resin tower (resistive amount 50) and weakly basic anion exchange resin Diaion WA30 (OH-type resin column (resistance 50l)). After removing the cations and the anions, these resin towers were adsorbed with a strong acid cation exchange resin Diaion SK102 (Na-type) resin tower (60 l of resin) together with 100 l of the liquid washed with distilled water.

상기 수지탑을 증류수 120l로 세정한 후 증류수와 0.1N 암모니아 수로 농도구배를 만들어 용출시켜 24l(생산량: 24,416mg/l)의 활성분획을 얻었다.The resin tower was washed with 120 l of distilled water and eluted with a concentration gradient of distilled water and 0.1 N ammonia water to obtain an active fraction of 24 l (amount: 24,416 mg / l).

나머지 50l의 여과액에 대하여는 상기와 동일한 방법을 거쳐 미국특허 제4,011,391호에 의거 Diaion SK102 수지탑에서 용출시 0.5N 암모니아수로 시종 동일한 농도를 유지하며 용출시켰다.The remaining 50 l of the filtrate was eluted with the same concentration as 0.5 N ammonia water when eluted in the Diaion SK102 resin tower according to US Patent No. 4,011,391 through the same method as described above.

상기 두가지 용출법을 비교한 결과는 다음 표 10과 같았다.The result of comparing the two dissolution methods is shown in Table 10 below.

[표 10]TABLE 10

[실시예 6]Example 6

실시예 5에서 얻은 활성분획 24l중 12l를 색소를 제거하기 위하여 흡착수지 Amberlite XAD-4 수지탑(수지량7l)를 통과시키고 10l의 증류수로 세정한 뒤 농축하여 아세톤을 가하고 건고하여 632g의 황색조분말을 얻었다.12l of 24l of the active fraction obtained in Example 5 was passed through an adsorbent resin Amberlite XAD-4 resin column (7l of resin) to remove the pigment, washed with 10l of distilled water, concentrated to add acetone, and dried. A powder was obtained.

한편, 나머지 12l의 활성분획에 대하여는 미국특허 4,011,391에 의한 방법으로 정제를 실시하였다. 약염기성 음이온 교환수지 Amberlite IRA-900(OH-형) 수지탑(수지량7l)를 통과시켜 10l의 증류수로 세정한 뒤 농축하여 아세톤을 가하고 건고하여 707g의 황색조분말을 얻었다.On the other hand, the remaining 12 l of the active fraction was purified by the method according to US Patent 4,011,391. The weakly basic anion exchange resin was passed through Amberlite IRA-900 (OH-type) resin tower (resin 7l), washed with 10l of distilled water, concentrated to add acetone, and dried to obtain 707g of yellow crude powder.

상기 두가지 방법으로 정제한 조분말들의 순도를 비교한 결과 흡착수지법에 의한 방법이 미국특허방법에 비해 순도면에서 우수하였다. 그 결과는 다음 표 11과 같다.As a result of comparing the purity of the crude powders purified by the above two methods, the adsorption resin method was superior in purity compared to the US patent method. The results are shown in Table 11 below.

[표 11]TABLE 11

위의 흡착수지법에서 얻은 조분말 100g을 강염기성 음이온 교환수지 Diaion PA 306 S 수지탑에서 물을 전개액으로 사용하여 크로마토그라피하여 바리다마이신 A,B,C,D를 유도체별로 분리하였다.The crude powder obtained by the above adsorption resin method was chromatographed using water as a developing solution in a strong basic anion exchange resin Diaion PA 306 S resin column to separate varidamycin A, B, C, and D by derivatives.

그 결과는 다음 표 12와 같다.The results are shown in Table 12 below.

[표 12]TABLE 12

Claims (4)

스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 ATCC 21432 의 변이주로서 당분 이용도가 높은 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 KCCB₂(수탁번호: KFCC-10650).Streptomyces hygroscophys strain Limoneus KCCB ₂ (Accession No .: KFCC-10650), characterized by high sugar availability as a variant of the Streptomyces hygroscopicus strain Limoneus ATCC 21432. 옥수수 전분 3중량%, 포도당 3중량%, 설탕 3중량%, 옥수수침지액 3중량%, 콘글루텐 3중량%, 면실분 3중량%, 소금 1.5중량%, 염화암모늄 0.5중량%, 탄산칼슘 1.5중량%를 함유하고 있으면서 pH 6.5-7.5인 배지에 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스 변종 리모네우스 KCCB₂(수탁번호:KFCC-10650)의 종배양액을 5% 부피 비율로 접종한후 교반속도 200rpm 으로 28-38℃에서 7일간 배양하여 배양액내에 바리다마이신 A를 축적시킨 다음, 이를 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 바리다마이신 A의 제조방법.Corn starch 3%, glucose 3%, sugar 3%, corn steep 3%, corn gluten 3%, cottonseed flour 3%, salt 1.5%, ammonium chloride 0.5%, calcium carbonate 1.5% Inoculated with a 5% volume fraction of a seed culture solution of Streptomyces hygroscophycus mutant Limoneus KCCB ₂ (Accession No .: KFCC-10650) in a medium containing pH 6.5-7.5 at a rate of 200 rpm. The method for preparing varidamycin A, which is characterized by culturing at 38 ° C. for 7 days, accumulating varidamycin A in the culture medium, and then separating and purifying it. 제2항에 있어서, 배양시 프로피온산, 유산, 능금산과 초산 등의 유기산을 첨가하여 배양중의배지 pH 6.5-7.5로 유지하면서 배양액내에 바리다마이신 A를 축적시키는 것을 특징으로하는 바리다마이신 A의 제조방법.The method for preparing varidamycin A according to claim 2, wherein organic acids such as propionic acid, lactic acid, uric acid and acetic acid are added to the culture medium to accumulate varidamycin A in the culture medium while maintaining the pH in the culture medium at 6.5-7.5. 제2항에 있어서, 상기 배양액내의 바리다마이신 A의 분리정제는 상기 배양액을 한외여과후 양이온 교환수지에 흡착시키고, 증류수와 암모니아수의 농도기울기를 만들어 바리다마이신 A를 용출시킨 다음, 흡착수지를 사용하여 조색조를 제거하는 것을 특징으로하는 바리다마이신 A의 제조방법.The method of claim 2, wherein the separation and purification of varidamycin A in the culture medium is adsorbed to the cation exchange resin after ultrafiltration, the concentration gradient of distilled water and ammonia water to elute varidamycin A, and then using the adsorptive resin A method for producing varidamycin A, characterized by removing the color tone.