KR840001921B1 - 데카펩티드의 제조방법 - Google Patents

데카펩티드의 제조방법 Download PDF

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KR840001921B1
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신텍스(미합중국) 인코포레이티드
버어튼 엘. 로저스
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Abstract

내용 없음.

Description

데카펩티드의 제조방법
본 발명은 황체(黃體) 형성 호르몬의 노나펩티드와 데카펩티드 및 그 염의 제조방법에 관한 것이다.
황체 호르몬(LH)과 난포(卵胞) 성장 촉진 호르몬(FSH)은 시상하부(視床下部)에서 생성되는 방출 호르몬 LH-RH의 제어 아래 하수체 전엽선(下垂體前葉腺)으로부터 방출된다. LH 및 FSH는 생식선(生殖腺)에 작용하여 스테로이드 호르몬의 합성을 촉진하고 또 배우자 성숙을 촉진한다. LH-RH의 맥동박출 및 그에 따른 LH와 FSH의 방출은 가축 및 인간에 있어서의 성주기를 조절한다. 또한, LH-RH는 태반, HCG방출, 그리고 직접적으로는 생식선에 유효하다. LH-RH작용 물질 유연체(類緣體)는 양면작용 기구에 의하여 생식력을 조절하는데 유용하다. LH-RH 유연체는 낮은 투여량으로도 배란을 촉진하며 시상하부성 무월경증 및 배란성 불임증 치료에 유용하다. 또한, 성기능 부전증 및 임포텐스(생식 불능증)에 사용될 수 있으며, 남성에 있어서 정자 형성 및 남성 호르몬(안드로겐)의 방출을 자극시킨다. 이와 반대로 효능이 높고 장기간 지속적인 LH-RH의 유연체를 다량 투여하면, 여성에 있어서는 정반대의 효과를 주어 배란을 방해하며, 남성에 있어서는 정자 형성이 억제된다. 이러한 효과에 관련되는 것은 남성과 여성에 있어서의 종속기관(accessory organ)의 축소를 비롯한 생식선 부위의 성스테로이드의 정상적인 순환량의 조절 작용이다. 가축에 있어서, 이러한 역효과는 사양(飼養) 조건하에서의 체중 증대를 촉진하고 임신한 동물의 유산을 촉진하며, 일반적으로 화학적 불임제로서의 작용을 한다.
천연 호르몬 방출 호르몬 LH-RH는 아미노산(비대칭 중심을 갖지 않는 아미노산 글리신을 제외한 L-체)을 자연적으로 발생시키는 데카펩티드이다. 이 데카펩티드의 서열은 다음과 같다.
(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
이러한 천연물질의 많은 유연체가 연구되어 왔는데, 그 중에 다수가 임상학적으로 사용하기에는 불충분한 생물학적 활성이 있다는 사실이 입증되었다. 일정의 선택된 변경을 가하면, 생물학적 활성에 유리한 효과를 갖는다는 사실이 증명되었다. 가장 중용한 변형은 제6위치의 Gly을 D-아미노산으로 치환시킴으로써 얻어진다. 예컨대, 제6위치의 Gly 잔기를 D-Ala, D-Leu, D-Phe 또는 D-Trp로 치환시키면, LH-RH에 비하여 증가된 활성을 가진 일련의 LH-RH 유연체로 된다. 이에 대해서는 엠. 모나한과 그의 공동 연구자들의 [D-Ala6]-LH RH에 대한 논문, Biochem., 12, 4616 (1973) ; 제이. 에이. 빌체즈-마아티네츠와 그의 공동 연구자들의 [D-Leu6] LHRH 및 desGly10[D-Leu6, Pro NHEt9] LHRH에 대한 논문, Biochem. Biophy. Res. Comm. 59, 1226 (1974) ; 디이. 에이취. 코이와 그의 공동 연구자들의 D-Phe6LHRH에 대한 논문, 의화학지, 19,423 (1976) 및 더블류. 베일과 그의 공동 연구자들의 저서인 영국 옥스포오드시 블랙웰 과학 출판사 간행(1976)의 Clinical Endocrinology, 제5증보판, 2615와 디이. 에이취. 코이와 그의 공동연구자들의 [D-Trp6] LHRH에 관한 논문, Biochem. Biophys. Res. Comm., 67, 576 (1979)를 참조하기 바란다.
제6위치에 있어서의 전술한 치환체에 의하여 얻은 활성의 실질적 증가 이 외에 제10위치의 Gly-NH2를 알킬아미드, 시클로알킬아미드 또는 플루오로알킬아미드로 치환시키거나 또는 Gly-NH2를 알파-아자글리신 아미드로 치환된 노나펩티드를 제조하여서 활성이 증대될 수도 있다. 이에 대해서는 엘. 후지노와 그의 공동 연구자들의 논문, Biochem. Biophys. Res. Comm., 49, 863 (1972), 디이. 에이취. 코이와 그의 공동 연구자들의 논문, 생화학 14, 1848(1975) 및 에이. 에스. 두타와 그의 공동 연구자들의 논문, 화학회지, Perkin I, 1979, 379를 참조하기 바란다.
제7위치에 있는 로이신기를 N-메틸-로이신으로 치환시키면, 효소 분해에 대하여 안정도가 증가하게 된다. 이에 대해서는 예컨대 엔. 링과 그의 공동 연구자들의 논문, Biochem. Biophy. Res. Comm., 63, 801(1975)를 참조하기 바람.
제3위치의 트립토판기를 3-(1-나프틸)-L-알라닌으로 치환시키면, 생물학적 효능이 증가하게 된다. 이에 관해서는 케이. 유. 프레이세드와 그의 공동 연구자들의 논문, 이화학지, 19, 492(1976) 및 와이. 에이브의 논문, Chem. Pharm. Bull, 24, (12), 3149(1976)을 참조하기 바람.
제5위치의 티로신기는 페닐 알라닌 또는 생물학적 활성의 정체력(停滯力)을 가진 3-(1-펜타플푸오로페닐)-L-알라닌으로 치환시킬 수 있다. 이에 관해서는 엔. 야나이하라와 그의 공동 연구자들의 논문, Biochem. Biophy. Res. Comm., 52, 64(1973) 및 디이. 코이와 그의 공동연구자들의 논문, 의화학지, 16, 877(1973)을 참조하기 바람.
전술한 것들보다 생물학적 활성이 더 높을 뿐만 아니라, 동물과 인간에게 임상적으로 사용할 수 있는 LH-RH 유연체를 제조할 필요성이 있게 되었다.
따라서, 본 발명은 제6위치에 특정의 친유성 D-아미노산이 있는 LH-RH의 노나펩티드 및 데카펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 설명하자면, 본 발명은 제6위치에 친유성 카르복실산기 특히 다수의 알킬기로 치환된 2개 또는 그 이상의 카르복실산 아릴환(또는 퍼히드로아릴환) 또는 페닐환(또는 시클로헥실환)이 포함된 기를 함유하는 특정의 D-아미노산을 가지는 LH-RH 유연체의 제조방밥에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 화합물은 다음 일반식(Ⅰ)의 노나펩티드 및 데카펩티드와 그의 약리학적으로 허용되는 염류이다.
(pyro) Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-z (Ⅰ)
상기 식에서, V는 트립토필, 페닐알라닐 또는 3-(1-나프틸)-L-알라닐이고, W는 티로실, 페닐알라닐 또는 3-(1-펜타플루오로-페닐)-L-알라닐이고, X는 하기 일반식의 D-아미노산 잔기이고,
Figure kpo00001
Y는 로이실, 이소로이실, 노르-로이실 또는 N-메틸-로이실이며,
Z는 글리신아미드 또는 -NH-R1[단, 여기서, R1은 저급 알킬, 시클로알킬, 플루오로저급 알킬 또는
Figure kpo00002
(단, 여기서, R2는 수소 또는 저급알킬이다.)임]이다.
전술한 바와같이, 또한 편의상 각종 아미노산의 약호는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회, 생화학지 11, 1726(1972)에 의하여 추천된 펩티드 기술 분야에서 통상 허용되는 대로 사용하였으며, 비대칭 중심을 갖지 않은 아미노산 글리신과 또 X로 표시한 제6위치의 아미노산을 제외하고 모두 L형이다.
본 발명에서 모든 펩티드 내의 아미노산의 서열은 통상적으로 허용된 공지의 방법에 따라 기재하였으므로, N-말단 아미노산은 좌측에, C-말단은 아미노산 우측에 있다.
본 발명에서 "약리학적으로 허용되는 염류"란 모체화합물의 소정의 생물학적 활성을 보유하고 여하한 불필요한 독성이 없는 염류를 지칭하는 것이다. 그러한 염류의 예로서는, (a) 무기산, 예컨대 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산부가염, 그리고 유기산, 예컨대 초산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술포닐산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산에 의해 형성된 염류, 또는 (b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등의 다가 금속 양이온 또는 N, N1-디벤질에틸렌-디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온에 의한 염류, 또는 (c) 상기 (a) 및 (b)의 혼성체, 예컨대 탄닌산아연 염류 등이 있다.
본 발명에서 "저급 알킬"은 탄소 원자수가 1내지 4개인 직쇄 또는 분지쇄 포화탄화수소, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸이고, "시클로알킬기"는 탄소 원자수가 3내지 6개인 환상 포화탄화수소, 예컨대 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이고, "플루오로저급 알킬"은 1개 이상의 수소원자가 불소에 의하여 치환된 저급 알킬기, 예컨대 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 2, 2, 2-트리플루오로 에틸 등이다.
또한 "나프틸"이란 1-나프틸 및 2-나프틸을 포함하는 것이며, "안트릴"이란 1-안트릴, 2-안트릴 및 9-안트릴을 포함하며, "플루오로에닐"이란 2-플루오로에닐, 3-플루오르에닐 4-플루오르에닐 및 9-플루오르에닐을 포함하고, "페난트릴"이란 2-페난트릴, 3-페난트릴 및 9-페날트릴을 포함하며, 또 "아다만틸"이란 1-아다만틸 및 2-아다만틸을 포함하는 용어이다.
본 발명의 바람직한 화합물은 X가 3-(2-나프틸)-D-알라닐 또는 3-(2,4, 6-트리메틸페닐)-D-알라닌, Z가 글리신아미드 또는 -NHEt, W가 티로실, Y가 로이실 또는 N-메틸-로이실인 화합물이다. 특히 바람직한 것은 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닐-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닐-N-메틸-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) Glu-His-Phe-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닐-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-트리메틸페닐)-D-알라닐-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닐-Leu-Arg-Pro-NHEt, (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닐-N-페닐-Leu-Arg-Pro-NHEt, 및 이들의 약리학적으로 허용되는 염류이다.
특히 바람직한 것은 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닐-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2및 그의 염류이다.
본 발명의 화합물, 특히 그의 염류는 종전의 가장 유효한 LH-RH 작용물질, 즉 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Arg-Pro-Gly-NH2와 대응하는 프롤릴에틸아미드에 비하여 놀라운 효과와 장기간 지속되는 LH-RH작용 물질 활성을 나타낸다. 매일 2회씩 피하주사로 정상 성주기를 갖는 암쥐에 투약시켜 발정을 부분적으로 또는 완전히 억제하는 것을 측정하는 것이 첫번째 효과측정이다(2주의 기간에 걸쳐 측정).
LH-RH 유연체 및 본 발명의 화합물에 대하여 사용하여 온 다수의 생물학적 검정법에는 다음과 같은 것들이 포함된다.
(a) 피하주사에 의한 발정간기(發精間期) 또는 발정전기(發精前期)의 암쥐에 있어서의 배란억제법(리펠과 그의 공동 연구자의 논문, Proc. Soc. Exd. Biol. Med., 148, 1193 (1974)).
(b) 방사선 동위원소 면역 검정법으로 측정되는 분산된 하수체 전엽의 배양에 의한 LH 및 FSH의 방출법(뻬일과 그의 공동 연구자들의 논문, Endocrinology, 91, 562(1972)).
(c) 방사선 동위원소 면역 검정법으로 측정되는 정맥 주사에 응하여 난소를 절제하여 스테로이드를 처리한 쥐의 말초순환기 내로의 LH 및 FSH 방출법(아리무라와 그의 공동 연구자들의 논문, Endocrinology, 90, 163 (1972)),
보다 더 진보된 수준에서는, 이들 화합물의 활성을 정자형성의 억제, 그리고 남성 호르몬의 순환과 고환(睾丸) 크기 뿐만 아리라, 양성(良性) 전립선 비대증에 걸린 개에 있어서의 전립선 크기를 극적으로 감소시키는 등의 생체내에서 나타날 수 있다.
그 결과로, 이들 화합물은 LH 및 FSH의 억제 또는 직접 성기에 작용할 필요가 있는 여러 가지 상황에 다음 용도와 더불어 여러 가지 용도로 사용될 수 있음이 발견되었다.
생리학적 용도(소량 투여 효과)
-비배란성 붙임증에 있어서의 배란 유도 및 자성(雌性) 포유 동물에 있어서의 적기 배란을 위한 배란억제.
-여성에 있어서 황체 형성 기능 부족으로 인한 불임증 치료.
-남성 및 여성의 일방에 있어서 성기능 저하 및 성기능 부전증 치료.
-가축에 있어서의 낭포성 난소/색정 증후군 치료.
-성행위 유도 또는 촉진, 또는 임포텐스/불감증 치료.
역설적 용도(다량 투여 효과)
-여성 피임. -포유동물의 종양 및 낭포 치료.
-배란 억제 또는 지연. -다낭포성 난소증후군(Stein-Leventhal) 치료.
-분만 유도. -자궁 악성 종창 치료.
-배란 병발(倂發). -양성 전립선 비대증 및 전립선 종창 치료.
-발정 억제. -남성 피임.
-자성 동물의 생육 촉진 -남성 또는 여성 중 일방에 있어서 과다한 성기 발
육호르몬에 기인하는 질병 치료.
-황체 분해, 월경 유도. -식육용 웅성(雄性) 동물에 있어서의 기능 거세.
-최초 3개월 유산 촉진. -발정 전기의 배란 억제.
-자궁 내막염 치료.
더욱이, 이들 화합물은 물론이고 공지의 LH-RH 화합물은 HCG의 순환량을 억제하고 또 태반에 직접적인 효력이 있기 때문에, 분명히 유산 촉진제로서의 놀라운 새로운 용도를 나타낸다. 태반에 대한 효과로 융모 종창에 대한 용도를 제안할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 관점은 전술한 화합물들의 특별한 용도(LH-RH 호르몬의 유연체 관하여 앞에서 언급하지 않은 용도를 포함하여), 즉 여성에 있어서 배란 억제(즉, 피임), 자궁 내막염 치료, 양성전립선 비대증 치료 및 남성의 정자 형성의 억제(즉, 피임)에 대한 용도이다. 따라서, 이 관점에 의하면, 본 발명은 배란억제, 자궁 내막염 치료, 전립선 비대의 감소, 또는 필요한 경우에 포유동물의 정자형성의 억제 등에 유효한 것으로 관찰되는 바, 이러한 치료법은 전술한 본 발명의 화합물 또는 이 화합물을 함유하는 제약 조성물의 유효량을 포유 동물의 대상 객체에 투여하는 것이다.
본 발명의 화합물은 실제 사용시, 본 발명 화합물 또는 이 화합물을 함유하는 제약 조성물의 유효량을 치료를 요하는 포유 동물의 대상 객체에 투여하여야 하는데, 이들 화합물 또는 조성물은 경구 투여, 비경구투여(피하, 근육, 정맥투여 포함), 질내 투여(특히, 피임용일 때), 직장투여, 구강투여(혀밑 투여 포함) 또는 비강투여를 비롯한 특정의 목적용도에 따라 여러가지 경로를 통하여 투여된다. 가장 적당한 경로는 어느 경우에든지, 용도 특히 유효성분, 투여할 객체 및 의사에 좌우될 것이다. 본 발명 화합물 또는 이 화합물을 함유하는 조성물은 또한 더욱 상세히 후술하게 될 서방제(徐放劑), 저장제 또는 삽입제의 형태로 투여하여도 좋다.
일반적으로, 전술한 용도들, 소위 "역설적" 또는 다량투여 용도의 경우에, 체중 1㎏당 1일 약 0.01 내지 100㎍의 양으로, 바람직하게는 체중 1㎏ 당 1일 0.1 내지 5.0㎍의 양으로 투여하는 것이 편리하다. 이러한 투여시에 1일 1회 투여, 다수회의 투여 또는 방출을 늦추므로서 가장 유효한 결과를 얻을 수도 있다.
이들 화합물 및 조성물을 투여하기 위한 정확한 투여량 및 투여법은 반드시 치료 대상의 요구도, 치료 형태, 질환의 정도 또는 요구량에 의하여 물론 의사의 판단에 따라야 한다. 일반적으로, 비경구 투여가 흡수면에서 기타 투여법보다 소량투여를 요한다.
본 발명 화합물은 내용성(耐容性)이 있고 비교적 무독성이다. 대표적인 화합물은 40㎎/㎏의 과량을 생쥐에 충분히 피하투여할 때 LD50을 나타내는데, 이것은 전술한 치료적 투여량에 비하여 대단히 큰 안정한 인자이다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 화합물을 유효 성분으로 하여 약리학적으로 허용되는 무독성 담체와 혼합물 형태로 된 조성물에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 이러한 조성물은 특히 액제 또는 현탁제로 한 비경구 투여용(피하, 근육 또는 정맥 투여용), 특히 반고형제, 예컨대 크리임제 및 좌약 등으로 한 질내 또는 직장 투여용, 특히 정제 또는 캡슐제로한 경구 또는 구강 투여용, 또는 산제, 비강 점적제 또는 에어로졸제로 한 비강 투여용으로 제조될 수 있다.
이 조성물은 단위 투여제형으로 하여 간편하게 투여할 수 있으며, 또 제약업계에 잘 알려진 여하한 방법, 예컨데 펜실바니아주 이스턴시에 소재하는 맥 퍼블리싱 컴페니(Mack Publishing Company)의 1970년판 레밍턴 약물 과학(Remington's Pharmaceutical Science)에 기재된 바와같은 방법에 의하여 제조될 수 있다. 비경구 투여제형은 일반 불활성 담체로서 살균수 또는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리올레핀글리콜, 식물유, 수소화 나프탈렌 등을 함유하여도 좋다. 질내 또는 직장 투여제형, 예를 들면 좌약은 불활성 담체로서 폴리알킬렌글리콜, 와셀린, 코코아 버터 등을 포함하여도 좋다. 흡입 투여제형은 고체로 하여도 되며, 불활성 담체로서 예컨대 락토오스를 함유하거나, 또는 비강 점적제형으로 투여하기 위한 수성 또는 유성 용액제이어도 좋다. 구강 투여용의 대표적인 불활성 담체에는 설탕, 스테아린산칼슘, 스테아린산 마그네슘, 미리 젤라틴화시킨 녹말 등이 포함된다.
본 발명의 화합물은 장기간에 걸쳐, 예컨대 1회 투여로부터 1주일 내지 1년에 걸쳐 대상 객체에 투여하는 것이 특히 바람직하다. 각종 서방제, 저장제 또는 삽입제를 이용할 수 있다. 예컨대, 투여제형은 체액 중에서의 용해도가 낮은 화합물의 약리학상 허용되는 무독성염, 예컨대, (a) 인산, 황산, 시트르산, 타르타르산, 탄닌산, 파모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌모노술폰산 또는 나프탈렌 디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 같은 다염기성, 산과의 산부가염, (b) 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등의 다가금속 양이온 또는 N, N'-디벤질에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민 등의 유기 양이온과의 염, 또는 (c) 상기 (a) 및 (b)의 혼성체, 예컨대 탄닌산아연염을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명의 화합물 또는 바람직하게는 전술한 바와 같은 비교적 불용성염은 겔화될 수 있다. 예컨대 모노스테아르산 알루미늄은 예를들면 참깨기름으로 겔화시키면 주사용으로 적합하다. 특히 바람직한 염은 아연염, 탄닌산아연염, 파모산염 등이다. 다른 종류의 주사용 서방제는 예컨대 미합중국 특허 제3,773,919호에 기재한 폴리락트산/폴리글리콜산과 같은 분해지연성의 무독성, 비항원성 중합체 내에 분산되거나 또는 캡슐화된 화합물 또는 염을 함유한다. 본 발명 화합물, 또는 전술한 바와 같은 비교적 불용성인 염류는 특히 동물용 콜레스테롤 기질의 실라스틱(silastic) 과립으로 제제하여도 무방하다. 그밖의 서방제, 예컨대 리포솜 등은 예를들면 뉴욕시에 소재하는 마아셀 데커, 인코포레이티드(Marcel Dekker, Inc.) 발행의 1978년판 제이. 아르. 로빈슨 편집의 "Sustained and Controlled Release Drug Delivery System" 과 같은 문헌에서 잘 알려져 있다. LH-RH형 화합물에 관한 특별한 참고사항은 미합중국 특허 제4,010,125호에서 발견할 수 있다.
본 발명 방법에 의한 폴리펩티드는 펩티드 기술 분야에서 숙련된 자들에게 공지된 어떠한 기술로도 합성할 수 있다. 그와 같이 이용할 수 있는 여러 가지 기술은 제이. 엠. 스튜워어트와 제이. 디이. 영의 공저인 샌프란시스코시 소재의 더불유, 에이치. 프리맨 컴페니(W.H. Freeman Co.) 발행의 "고상 펩티드 합성", 1969년판과 고상 펩티드 합성에 관한 아카데믹 프레스(Academic Press) (뉴욕) 발행의 제이. 마이넨호피의 저서 "호르몬 단백질과 펩티드" 1973년판, 제2권, 제46면 및 표준 액제 합성에 관한 아카데믹 프레스(Academic Press) (뉴욕) 발행의 이이. 시뢰더와쳐이. 루브케의 공저 "펩티드" 1965년판 제1권에 가장 잘 기술되어 있다.
일반적으로, 이들 방법은 1종 이상의 아미노산 또는 적절히 보호시킨 아미노산을 순서대로 성장하는 펩티드 연쇄에 축합시켜서 행하는 방법들이다. 통상적으로, 제1 아미노산의 아미노기 또는 카트복실기의 어느 일방을 적당한 보호기로 보호시킨다. 이어서, 보호시킨 아미노산 또는 유도된 아미노산은 불활성 고체 담체에 결합시키거나, 또는 아미드 결합을 형성하기에 적당한 조건하에, 적절히 보호시킨 보결기(아미노기 또는 카트복실기)를 갖는 그 다음 서열의 아미노산을 순서대로 부가시킴으로써 결합될 수 있다. 그리하여, 이 새로이 부가된 아미노기로부터 보호기를 제거한 다음, 다시 다음 서열의 아미노산(적절히 보호된 것임)을 부가시키고, 이와 같은 방법을 계속해 나간다. 모든 소정의 아미노산을 적절한 서열로 결합시킨 후에는, 남아있는 보호기(및 고체 담체)를 순차적으로 또는 동시에 제거하여 최종의 폴리펩티드를 얻는다. 이 일반적 방법을 약간 수정함으로써 일시에 1종이상의 아미노산을 부가하여 펩티드쇄를 성장시켜 나갈 수 있다. 예컨대, 보호된 트리펩티드를 적절히 보호한 디펩티드와 커플링(비대칭 중심을 라세미화하지 않는 조건)시킴으로써, 보호기 제거후에 펜타펩티드를 형성할 수 있다.
본 발명의 화합물을 제조하는 특히 바람직한 방법은 고상 펩티드 합성이다.
이 방법에 있어서, 아미노산의 α-아미노기는 산 또는 염기에 민감한 기로 보호된다. 그러한 보호기들은 펩티드 결합형성 조건에는 적당하지만, 성장하는 펩티드쇄를 파괴시키거나 그 펩티드쇄중에 함유된 여하한 비대칭 중심도 파괴하는 일이 없이 용이하게 제거할 수 있는 성질이 있는 것이라야 한다. 적당한 보호기로서는 t-부틸옥시카트보닐(Boc), 벤질옥시카트보닐(Cbz), 비페닐이소프로필옥시카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, α,α-디메틸-3,5-디메틸옥시벤질옥시카르보닐, o-니트로페닐, 2-술페닐, 2-시아노-t-부틸옥시카르보닐, 9-플루오르에닐 메틸 옥시카르보닐 등이 있는데, 특히 t-부틸옥시카르보닐(Boc)이 좋다.
특히 바람직한 측쇄보호기는, 아르기닌에 대한 것으로서는 니트로, P-톨루엔술포닐, 4-메록시벤젤술포닐, Cbz, Boc 및 아다만틸옥시카르보닐이고, 티로신에 대한 것으로서는 벤질, o-브로모벤질옥시카르보닐, 2,6-디클로로벤질, 이소프로필, 시클로헥실, 시클로펜틸 및 아세틸이며, 세린에 대한 것으로는 벤질 및 테트라히드로피라닐이고, 또 히스티딘에 대한 것으로서는 벤질, P-톨루엔술포닐 및 2,4-디니트로페닐이다.
C-말단 아미노산은 적당한 고체 담체에 결합된다. 상기 합성에 유용한 적당한 고체담체는 시약과 각 단계 마다의 축합-탈보호 반응의 반응 조건에 대하여 불활성이고 또한 사용된 매질내에서 불용성인 물질이다. 적당한 고체 담체로서는 클로로메틸-폴리스티렌-디비닐벤젠 중합체, 히드록시메틸-폴리스티렌-디비닐벤젠 중합체 등인데, 특히 클로로메틸-폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 중합체가 바람직하다. 본 발명 화합물의 C-말단이 글리신아미드인 특별한 경우에, 특히 유용한 담체는 피이. 리뻬릴과 그의 공동 연구자들의 논문, Helv. Chim. Acta., 54, 2772(1971)에 기재된 벤즈히드릴 아미노-폴리스티렌-디비닐벤젠 중합체이다. 클로로메틸 폴리스티렌-디비닐벤젠형의 수지에의 결합은 Nα-보호 아미노산, 특히 에탄올, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드(DMF) 중의 Boc-아미노산의 세슘염, 테트라메틸암모늄염, 트리에틸암모늄염, 4, 5-디아자비시클로[5, 4, 0] 운데크-5-엔염 또는 이와 유사한 염, 특히 DMF 중의 세슘염을 클로로메틸 수지와 가온된 온도, 예컨대 40℃ 내지 60℃, 바람직하게는 약 50℃에서 약 12시간 내지 48시간, 바람직하게는 약 24시간 동안 반응시킴으로써 제조된다. Nα-Boc-아미노산은 디클로로메탄 또는 DMF, 바람직하게는 디클로로메탄과 같은 용매 중에서 약 10°내지 50℃, 바람직하게는 25℃의 온도에서 약 2시간 내지 약 24시간, 바람직하게는 12시간 동안 커플링 반응을 전개시킨 N,N'-디시클로헥실 카르보이미드(DCC) 1-히드록시벤조트리아졸(HBT)에 의하여 벤즈히드릴아민 수지에 결합시킨다. 연속적으로 보호된 아미노산의 커플링은 이 기술 분야에 공지된 자동 폴리펩티드 합성기 내에서 수행할 수 있다.
N-보호기의 제거는 예컨대 염화메틸렌 중의 트리플루오로용액, 디옥산중의 염화수소 용액, 초산 중의 염화수소 용액 또는 기타 강산 용액, 바람직하게는 거의 상온에서 디클로로메탄 중의 50% 트리플루오로 초산 용액 존재하에 수행할 수 있다. 각 보호된 아미노산은 약 2.5몰 과량으로 도입하는 것이 바람직하며, 커플링 반응은 거의 상온에서 디클로로메탄, 디클로로메탄/DMF 혼합물, DMF, 특히 염화메틸렌 중에서 수행하는 것이 좋다. 커플링제는 통상 디클로로메탄 중의 DCC이지만, N,N'-디-이소-프로필카르보디이미드 또는 기타 카르보디이미드를 단독 또는 HBT, T-히드록시숙신이미드, 기타 N-히드록시이미드류 또는 옥심류의 존재하에 수행할 수도 있다. 그렇지 않으면, 보호 아미노산 활성 에스테르(예컨대, P-니트로페닐, 펜타플루오로페닐 등) 또는 대칭, 무수물을 사용할 수 있다.
고상체의 합성 말기에, 완전히 보호된 폴리펩티드가 수지에서 분리된다. 수지 담체에 대한 결합이 벤질에스테르인 경우, 개열반응은 프롤린 C-말단을 갖는 펩티드에 대해서는 알칼리아민 또는 플루오로아민에 의한 아미노 분해에 의하며, 글리신 C-말단을 갖는 펩티드에 대해서는 예컨대 약 10°내지 50℃, 바람직하게는 약 25℃에서 12시간 내지 24시간, 바람직하게는 약 18시간 동안 암모니아/메탄올 또는 암모니아/에탄올에 의한 아미노 분해에 의하여 행한다. 다른 방법으로는, 펩티드는 예컨대 메탄올에 의한 트란스에스테르화와 여기에 후속하는 아미노 분해에 의하여 제거될 수 있다. 보호 펩티드는 이 시점에서 실리카겔 크로마로그라피에 의하여 정제될 수 있다. 폴리펩티드로부터 보호기(측쇄)를 제거하는 반응은, 예컨대 아니졸 또는 다른 카르보늄 스카벤저(scavenger)의 존재하에 무수 액체 불화수소에 의한 아미노 분해 생성물 처리, 불화수소/피리딘 착화합물에 의한 처리, 트리스(트리플루오로아세틸) 붕소 및 트리플루오로초산에 의한 처리, 수소와 탄소에 담지시킨 팔라듐 또는 폴리비닐피롤리돈에 의한 환원, 또는 액체 암모니아 중의 나트륨, 바람직하게는 액체 불화수소 및 아니졸에 의하여 약 -10°내지 ±10℃, 바람직하게는 약 0℃에서 15분 내지 1시간, 바람직하게는 약 30분간의 환원에 의하여 수행된다. 벤질히드릴아민 수지상의 글리신 말단 펩티드의 경우에, 수지개열 및 탈보호는 전술한 액체 불화수소 및 아니졸을 이용하는 단일한 단계로 행하여도 좋다. 이어서, 완전히 보호된 탈보호 폴리펩티드는 다음에 열거하는 방법 중 일부 또는 전체방법을 이용하는 크로마토그라피 단계의 순서에 의하여 정제한다.
-초산염 형태의 약염기성 수지상에서의 이온 교환.
-비유도성 폴리스티렌-디비닐벤젠(예컨대, 앰버라이트 XAD) 상에서의 소수성 흡착 크로마토그라피.
-카르복시메틸롤로오스 상에서의 이온 교환 크로마토그라피.
-예컨대, 세파덱스 G-25 상에서의 격막 크로마토그라피, 또는 향류 분배.
-고속 액체 크로마토그라피(HPLC), 특히 옥틸- 또는 옥타데실실릴-실리카 결합상(結合相) 컬럼 충전물 상에서의 가역상(可逆相) HPLC.
만약 라세미 아미노산이 제6위치에 사용되는 경우에는, 디아스테로머 이성체인 노나펩티드 또는 데카펩티드의 최종 제품이 분리되며, 제6위치에 D-아미노산을 함유하는 목적펩티드는 바람직하게는 전술한 크로마토그라피 공정 중에 탈리 및 정제된다.
C-말단 아자글리신 아미드를 갖는 펩티드는 공지된 펩티드 중간체들을 이용하는 표준펩티드를 용액을 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 이에 대한 것은 실시예 3에 더욱 상세히 기재되어 있다.
따라서 본 발명은 공지의 폴리펩티드 합성법에 따라 다음 아미노산 서열을 갖는 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 약리학상 허용되는 염을 제조함에 있어서,
i) 보호기, 또는 보호된 폴리펩티드로부터 공유 결합된 고체 담치를 제거하여 하기 일반식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 염을 얻고, 경우에 따라서는
ii) 하기 일반식(Ⅰ)의 화합물을 약리학상 허용되는 염으로 전환시키거나, 또는
iii) 하기 일반식(Ⅰ)의 화합물의 염을 그의 약리학상 허용되는 염으로 전환시키거나, 또는
ⅳ) 하기 일반식(Ⅰ)의 화합물의 염을 분해시켜 하기 일반식(Ⅰ)의 유리폴리펩티드로 변화시키는 것을 특징으로 하는 황체 형성 호르몬 방출 호르몬의 노나펩티드 및 데카펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
(pyro) Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (Ⅰ)
상기 식에서, V는 트립토필, 페닐알라닐 또는 3-(1-나프틸)-L-알라닐이고, W는 티로실, 페닐알라닐 또는 3-(1-펜타플루오로-L-페닐)-L-알라닐이고, X는 하기 구조식의 D-아미노산 잔기이고,
Figure kpo00003
Y는 로이실, 이소로이실, 노르-로이실 또는 N-메틸-로이실이며, Z는 글리신아미드 또는 -NH-R1[단, 여기서, R1은 저급알킬, 시클로알킬, 플루오로 저급 알킬 또는
Figure kpo00004
(단, 여기서, R2는 수소 또는 저급 알킬이다.)임]이다.
다음의 실시예들은 이 분야와 숙련자들이 본 발명을 더욱 충분히 이해하고 실시할 수 있도록 제공된 것이다. 이들은 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니며, 다만 본 발명의 예시 내지는 예증에 불과하다.
[제조예 A]
무수 알코올(마그네슘에톡시드로부터 증류한 것) 0.1ℓ를 나트륨 금속 1.52g이 들어 있는 오븐 건조플라스크에 첨가하였다. 수소 방출이 종료되었을 때, 이 용액에 2-아세트아미드-2-시아노 초산 에틸 10.21g과 2-브로모메틸나프탈렌 13,26g을 첨가하였다. 이 용액을 1시간 동안 환류 가열한 다음 냉각시켰다. 에탄올을 감압 증류시키고 잔사를 초산 에틸에 용해시켰다. 유기층을 물 50㎖로 2회, 포화염수 용액 50㎖로 1회 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용액을 여별하고 용제를 감압하에 제거하여 잔사를 2시간 동안 환류하에 진한 염산 100㎖내에서 가수분해시켰다.
가수 분해 혼합물을 냉각시키고 조생성물의 침전을 활성탄으로 처리한 진한 염산 5㎖를 함유하는 고온수 0.5ℓ에 재용해시키고 진한 수산화암모늄을 사용하여 용액의 pH를 6으로 조정하였다. 침전을 여취하고 진공 건조시켜서 3-(3-나프틸)-D, L-알라닌 순품 11.3g을 얻었다. 융점 230-232℃.
2-브로모메틸나프탈렌 대신에 화학량론적으로 등가α-클로로이소두렌,
량의 4-브로모메틸비페닐,
1-브로모메틸나프탈렌, 1-브로모메틸아다만탄,
9-브로모메틸플루오렌, 3-브로모메틸페난트렌,
9-브로모메틸안트라센, 1-클로로메틸-2,3,6-
2-브로모메틸플루오렌, 트리-(n-부틸) 벤젠, 그리고
2-브로모메틸안트라센, 1-클로로메틸-2,3-4-5-6-펜타메틸벤젠을 사용하고 상기 공정을 반복하여 다음의 아미노산을 각각 얻었다.
3-(1-나프틸)-D, L-알라닌, 융점 : 185-187℃,
3-(9-안트릴)-D, L-알라닌, 융점 : 290℃(염산염),
3-(9-플루오르에닐)-D, L-알라닌,
3-(2-플루오르에닐)-D, L-알라닌, 융점 : 264-269℃,
3-(2-안트릴)-D, L-알라닌,
3-(1-안트릴)-D, L-알라닌,
3-(2,4,6-트리메틸페닐)-D, L-알라닌, 융점 : 235-237℃,
3-(4-비페니릴)-D, L-알라닌, 융점 : 290℃,
3-(3-페난트릴)-D, L-알라닌,
3-(2,4,6-트리(n-부틸) 페닐)-D, L-알라닌, 그리고
3-(2,3,4,5,6-펜타메틸페닐)-D, L-알라닌.
[제조예 B]
무수 벤젠 300㎖ 중에 1,1-디페닐에틸렌 18.2g, α-메톡시-N-벤질옥시카르보닐글리신산메틸 25.3g 및 2-나프탈렌술폰산 1.5g을 용해시킨 용액을 2일간 환류시켰다. 여기서 얻은 조생성물을 CH2Cl2대 CH2Cl2/EtOAc 그레디엔트를 사용하여 규산 컬럼에서 정제시켰다. 정제된 2-[1-(2,2-디페닐에틸에닐)]-N-벤질옥시카르보닐 글리실산메틸을, 10% 메탄올 수용액 350㎖ 중에 KOH 10.9g을 용해시킨 용액을 사용하여, 대응하는 산이 되도록 가수분해시켰다. 그 결과 생성된 산(조품)을 진한 염산 3㎖를 함유하는 95% 에탄올 100㎖에 용해시켜서 탄소에 담지시킨 10% Pd 2g의 존재하에 2시간동안 수소화반응시켜 3-(2,2-디페닐메틸)-D, L-알라닌 2.4g을 얻었다. 융점 : 235-237℃.
[제조예 C]
1M NaOH 120㎖ 중에 3-(2-나프틸)-D, L-알라닐 12.9g을 용해시킨 용액에 초산 무수물 6.23㎖와 1M NaOH 60㎖를 0℃에서 1/2시간 첨가하였다. 진한 염산을 사용하여 pH를 2로 조정하고, 그 결과 생성된 침전을 여과시켰다. 고체를 60% 에탄올 수용액에서 재결정화시켜, N-아세틸-3-(2-나프틸)-D, L-알라닌 12.2g을 얻었다.
무수 메탄올 240㎖의 N-아세틸 아미노산 15g 용액에 삼불화붕사 에테르산염 15.8㎖를 가하고 그 혼합물을 1시간 동안 환류시켰다. 알코올을 증발시키고 물 200㎖을 첨가하여 초산에틸로 그 용액을 추출시켰다. 유기층을 염기성 수용액 및 산성 수용액으로 세척하여 MgSO4위에서 건조시키고 여과하여 유상물질을 얻었다. 이 유상 물질을 초산에틸/헥산으로부터 결정화시켜서, N-아세틸-3-(2-나프틸)-D, L-알라닌산메틸 14.2g을 얻었다. 융점 : 79-80℃.
3-(2-나프틸)-D, L-알라닌 대신에 화학량론적으로 등가량의
3-(1-나프틸)-D, L-알라닌,
3-(2-플루오르에닐)-D, L-알라닌,
3-(2-안트릴)-D, L-알라닌,
3-(1-안트릴)-D, L-알라닌, 그리고
3-(2,2-디페닐메틸)-D, L-알라닌
을 사용하고, 상기 공정을 반복하여 다음의 화합물을 각각 얻었다.
N-아세틸-3-(1-나프틸)-D, L-알라닌산 메틸, 융점 : 97.5-98℃,
N-아세틸-3-(2-플루오르에닐)-D, L-알라닌산 메틸, 융점 : 170-171℃,
N-아세틸-3-(2-안트릴)-D, L-알라닌산 메틸, 그리고
N-아세틸-3-(2,2-디페닐메틸)-D, L-알라닌산 메틸, 융점 : 113-114℃.
[제조예 D]
디메틸술폭시드 300㎖, 1M KCl 120㎖ 및 물 780㎖의 혼합물 중에 N-아세틸-3-(2-나프틸)-D, L-알라닌산 메틸 6.6g을 용해시킨 용액을 0.4M KCl 3㎖ 중의 효소 서브틸리신(subtilysin) 33.6g으로 처리하였다. 라디오미터 pH 스타트(Readiometer pH stat)를 사용하여 0.2M NaOH로 자동적정시킴으로써 pH를 7로 유지시켰다. 30분후에 NaOH 용액 70㎖를 용해시켜서 가수 분해를 종료시켰다. 이 용액은 NaHCO312g을 사용하여 염기성으로 하고 초산에틸로 추출시켰다. 유기층에는 N-아세틸-3-(2-나프틸)-D-알라닌산메틸이 함유되어 있었다. 초산에틸/헥산에서 결정화시켜서 황색 고체를 얻었다. 융점 : 80-81℃.
이것을 유리 아미노산으로, 이어서 다음과 같은 방법으로 N-Boc 아미노산으로 전화시켰다.
6N HCl 60㎖에 N-아세틸-3-(2-나프틸)-D-알라닌산메틸 2.5g을 용해시킨 용액을 120-130℃에서 3시간 가열시키고 실온으로 냉각시켰다. 생성된 백색 침전을 수집하여 NH4OH로 pH6이 되게 중화시킴으로써, 12N HCl 1㎖를 함유하는 H2O 50㎖에서 재결정화시키고, 진공 건조하여, 3-(2-나프틸)-D-알라닌 1.2g을 얻었다. 융점 : 242-244℃, [α]D2526.6° (c=0.5, CH3CO2H).
1N NaOH 55㎖, H2O 10㎖ 및 디옥산 20㎖의 혼합물중의 3-(2-나프틸)-D-알라닌 교반용액을 0℃에서 디-tert-부틸디카르보네이트 1.48g 및 산화마그네슘 0.22g으로 처리하였다. 1.5시간 후에 디-tert-부틸디카르보네이트 0.3g을 추가하고, 그 혼합물을 실온으로 되게 방치하였다. 고체를 여거하고, 여액을 농축시켜서 용량이 50㎖로 되게 하였다. 이 수용액을 NaHSO4로 pH2.5가 되게 맞추고 초산에틸로 추출시켰다. 유기층을 5% NaHSO4, 물 및 포화염수로 세척하였다. 초산에틸 용액을 황산마그네슘 위에서 건조시키고 여과 및 농축하여 유상물질을 얻고, 에테르/헥산으로부터 결정화시켜서, N-Boc-3-(2-나프틸)-D-알라닌 1.3g을 얻었다. 융점 : 90-91℃, [α]D25-32.6 (c=0.8, MeOH).
N-아세틸-3-(2-나프틸)-D, L-알라닌산메틸 대신에 화학양론적으로 등가량의
N-아세틸-3-(1-나프틸)-D, L-알라닌산메틸,
N-아세틸-3-(2-플루오르에닐)-D, L-알라닌산메틸,
N-아세틸-3-(2-안트릴)-D, L-알라닌산메틸, 그리고
N-아세틸-3-(2,2-디페닐메틸)-D, L-알라닌산메틸
을 사용하고, 상기 공정을 반복함으로써 대응하는 유리 아미노산을 경유하여 다음의 N-Boc 아미노산을 각각 얻었다.
N-Boc-3-(1-나프틸)-D-알라닌, 융점 : 92-93℃, [α]D 2554.8°(c=0.5 MeOH).
N-Boc-3-(2-플루오르에닐)-D-알라닌, 융점 : 161-163℃(분해),
N-Boc-3-(2-안트릴)-D-알라닌, 그리고
N-Boc-3-(2,2-디페닐메틸)-D-알라닌, 융점 : 153-154℃.
[제조예 E]
파르(Parr) 수소화반응기내에, 3-(2-나프틸)-D-알라닌 0.85g 2M 염산 100㎖ 및 아담(Adam) 촉매(PtO2) 0.85g을 넣었다. 이 용액을 20분간 H2가스압 60lb/in2의 파르 수소화 반응기내에 충전시켰다. 이 혼합물을 가열하여 백색 침전을 용해시키고 규조토를 사용하여 여과시켰다. 그 용액을 감압 농축시킨 다음 물로부터 동결건조시켜, 백색 고체인 3-(2-퍼히드로나프틸)-D-알라닌 0.8g을 얻었다. 융점 : 230-232℃.
이 물질을 1N NaOH 3.2㎖, 물 5㎖ 및 디옥산 15㎖의 혼합물에 용해시키고, MgO 0.14g 및 디-tert-부틸디카르보네이트 0.85g으로 처리하였다. 0℃에서 1시간 그리고 25℃에서 2시간 후에, 현탁액을 여과하여 감압건고시키고, 디에틸에테르로 세척한 다음, NaHSO4로 산성화시켜 pH2로 되도록 하였다. 산성화시킨 수성층을 초산에틸로 3회 추출하고 추출액을 합쳐서 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과농축하여 백색 유상의 N-Boc-3-(2-퍼히드로나프틸)-D-알라닌 0.75g을 얻었다.
이 물질 중 0.1g을 취하여 테트라히드로푸란 5㎖에 용해시키고 담황색이 지속될 때까지 새로 제조한 디아조메탄을 사용하여 0℃에서 적정하였다. 초산 1㎖를 사용하여 반응을 정지시키고, 용제를 증발시킨 다음 잔사를 초산에틸 75㎖와 물 75㎖ 사이에서 분할시켰다. 유기층을 5% NaHCO3, 물 5% NaHSO4, 물, 포화 NaCl 용액의 순으로 세척하고 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 이 용액을 여과 및 감암농축시켜서, 준비해둔 박층 크로마트그라피 판(두께 750μ , 실리카겔, 20㎝×20㎝)에 올려놓았다. 이 판을 디클로로메탄/초산에틸(18/1)로 전개시키고 제품 밴드를 제거하였다. 그 제품 밴드로부터의 실리카 겔을 프리트 처리한 유리 깔때기 상에서 디클로로메탄/초산에틸(9/1)로 세척하고, 여액을 농축하여 담황색 유상 물질인 N-Boc-3-(2-퍼히드로나프틸)-D-알라닌메틸 0.1g을 얻었다.
이 물질은 퍼히드로나프탈렌 핵의 제2위치에 2개의 이성체가 있는 혼합물로서 얻는다. 이들 부분 입체 이성체는 용출제로서 초산에틸/헥산(1 : 9)를 사용하여 고속 액체 크로마토그라피 컬럼 상에서 분리하고 가수분해시켜서 유리산인 N-Boc-3-(2-퍼히드로나프틸)-D-알라닌으로 전화시킬 수 있다.
3-(2-나프틸)-D-알라닌 대신에 화학양론적으로 등가량의
3-(1-나프틸)-D-알라닌,
3-(2,2-디페닐메틸)-D-알라닌,
3-(2,4,6-트리메틸페닐)-D, L-알라닌,
3-(4-비페니릴)-D, L-알라닌,
3-(2,4,6-트리(n-부틸) 페닐)-D, L-알라닌, 그리고
3-(2,3,4,5,6-펜타메틸페닐)-D, L-알라닌
을 사용하여 다음의 N-Boc 아미노산을 각각 얻었다.
N-Boc-3-(1-퍼히드로나프틸)-D-알라닌,
N-Boc-3-(퍼히드로-2,2-디페닐메틸)-D-알라닌,
N-Boc-3-(2,4,6-트리메틸시클로헥실)-D, L-알라닌,
N-Boc-3-(퍼히드로-4-비페니릴)-D, L-알라닌,
N-Boc-3-(2,4,6-트리(n-부틸) 시클로헥실)-D, L-알라닌, 그리고
N-Boc-3-(2,3,4,5,6-펜타메틸시클로헥실)-D, L-알라닌.
[실시예 1]
벡크만 990형 폴리펩티드 합성기 내에, 리베일, Supra에 설명된 바와 같이 벤즈히드릴아미노-폴리스티렌-디비닐벤젠 수지(Lab Systems Inc.) 0.8g(0.8밀리몰)을 가하였다. 이어서 다음의 합성 계획에 의하여 이 수지에 아미노산을 가하였다.
단계 1 CH2Cl2세척 1회 1.5분 4 CH2Cl2세척 3회 1.5분
2 50% CF3CO2H/CH2Cl25 10% 트리에틸아민/CH2Cl22회 1.5분
…탈보호 1회 1.5분 6 CH2Cl2세척 3회 1.5분
3 50% CF3CO2H/CH2Cl27 N-Boc-아미노산 용액 1회 첨가
…탈보호 1회 30분 8 N,N'-디시클로헥실카르보
디이미드 용액 1회 커플링 반응 2시간
9 CH2Cl2헹굼 및 보존 11 CH2Cl2세척 3회 1.5분
…커플링 1회 카플링반응 2시간12 에탄올 세척 3회 1.5분
10 CH2Cl2…헹굼액첨가 1회 1.5분13 CH2Cl2세척 3회 1.5분
단계 1-13은 아미노산 하나의 커플링 주기를 완성하는 것인데, 이 반응의 완성은 이. 카이저(E. Kaizer)와 그의 공동연구자의 닌히드린 법 [Anal. Biochem. 34, 595 (1970) 참조]에 의하여 확인한다.
이어서 상기 수지를 보호된 아미노산 및 BCC의 2.5각몰 과량으로 연속적으로 커플링시켰다. 수지를 연속 커플링 주기중에 다음 화합물로 처리하였다.
Boc-Gly-OH 0.433g, Boc-leu-OH 0.462g,
Boc-Pro-OH 0.432g, Boc-3-(2-나프틸)-D-알라닌 0.504g 및
Boc-Arg(Tosyl)-OH 0.857g, 1-히드록시벤조트리아졸 0.272g,
N-Boc, 0-2-브로모벤조일 옥시카르보닐-L-티로신 0.724g,
Boc-Ser(벤질)-OH 0.59g,
Boc-Trp-OH 0.654g, 그리고
피로글루탐산 0.524g.
수지를 반응기에서 꺼내어 CH2Cl2로 세척하고 진공 건조시켜서 보호된 폴리펩티드 수지 2.0g을 얻었다.
동시에, 상기 수지로부터 폴리펩티드 제품을 여취하고 무수 액체 HF로 처리하여 완전히 보호기를 제거하였다. 보호된 폴리펩티드 수지 2.0g과 아니졸(스카벤저) 2㎖를 Kel-F 반응기내에서 재증류시킨(CoF3로부터) 무수 액체 HF로 30분간 0℃에서 처리하였다. HF를 진공증발시키고, 그의 염으로서 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)--D-알라닐-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2의 잔사를 에테르로 세척하였다. 초산 추출물을 동결건조시켜서 조물질 0.8g을 얻었다.
이 폴리펩티드 조품을 앰버라이드(Amberlite) XAD-4 컬럼(폴리스티렌-4% 디비닐벤젠 중합체)상에 올려놓고 물(0.5ℓ)로부터 에탄올(1ℓ)로 전개액을 유하시키는 방법에 의해 용출시켰다. 용출 용량 690㎖ 내지 1.470㎖의 유분(留分)을 함유하는 튜우브를 수집하여 증류건고시켜, 일부가 정제된 폴리펩티드 490㎎을 얻었다.
일부 정제된 제품 시료 150㎎을 1.5%의 피리딘을 함유하는 1-부탄올/톨루엔/초산/물(10/15/12/18)의 혼합용제를 사용하는 세파덱스 G-25의 컬럼(3㎝×50㎝)에서 격막 크로마로그라피를 행하였다. 순품유분을 박층 크로마토그라피(실리카 겔, BuOH/H2O/HOAc/EtOAc ; 1 : 1 : 1 : 1)및 HPLC(5미크론, 역상옥타데실실릴 충전, 40% 0.03M NH4OAc/60% 아세토니트릴)에 의하여 수집하였다. 목적 생성물은 용출용량 1,000㎖ 내지 1,400㎖의 유분 중의 컬럼으로부터 생성되었다. 순품 유분을 수집하고 증류 건고시켜서 물에 용해시킨 후 동결시키면, 순수한 피로-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티토실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프로필-글리신아미드 57㎎을 초산 부가염 형태로 얻을 수 있었다. [α]D 25-27.4°(c=0.9, HoAc), 융점 : 185-193℃(분해).
[실시예 2]
C-말단 Pro-NH-CH2CH3의 유연체를 합성하기 위하여, 실시예 1에 기재한 것과 동일한 합성을 행하였다. 백크만 990형 합성기에는 Boc-Pro-OH의 건조 세슘염을 클로로메틸-폴리스티렌 1% 디비닐 벤젠(Lab Systems, Inc.)와 동몰량 반응시켜 제조한 Boc-Pro-O 수지 2.13g을 채워 넣었다. 이 Boc-Pro-O 수지에는 푸롤린 1.4밀리몰이 함유되어 있다.
이어서, 그 수지를 보호된 아미노산 및 DCC의 각 2.5몰과량과 커플링시켰다. 그리하여, 그 수지를 연속커플링 주기중에
Boc-Arg (토실)-OH 1.61g,
Boc-Leu-OH H2O 0.93g,
Boc-3-(2-나프틸)-D-알라닌 0.94g 및 1-히드록시벤조트리아졸 0.49g,
N-Boc-O-2-브로모벤질옥시카르보닐-L-티로신 1.75g 및 Soc-Ser(벤질)-OH 1.11g과 순차적으로 반응시켰다.
이 합성 시점에서 보호된 폴리펩티드 수지의 양을 반분하고, 그 중의 반을 사용하여
Boc-Trp-OH 0.57g,
Boc-His (토실)-OH 0.77g,
피로글루탐산 0.21g과 순차적으로 반응시켰다.
수지를 반응기에서 꺼내어 CH2Cl2로 세척하고 진공건조시켜서 보호된 폴리펩티드 수지 2.26g을 얻었다.
보호된 폴리펩티드는 2℃에서 18시간 동안 에틸아민 25㎖로 아미노 분해시켜 수지로부터 분리시켰다. 에틸아민은 증발시키고 수지는 메탄올로 추출시켰다. 메탄올을 증발시켜서 pyro-Glu-His (토실)-Trp-Ser (벤질)-Tyr(2-브로모벤질옥시카르보닐)-3-(2-나프틸)-D-알라닐-Leu-Arg(토실)-Pro-NH-CH2CH31.39g을 얻었다.
폴리펩티드 조품을 0℃에서 30분간 Kel-F 반응기내에서 아니졸 3㎖와 재증류(CoF3로부터)하고, 무수액체 HF의 혼합물로 처리하여 보호기를 제거하였다. HF를 진공증류 시키고, 잔사를 에테르로 세척하였다. 잔사를 2M 초산에 용해시키고 동결건조하여, (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닌-Leu-Arg-Pro-NH-CH3CH3조품 0.82g을 그의 초산 부가염 형태로 얻었다. 시료 20㎎을 40-50μ 옥타데실실릴화 실리카(Merk, Lichroprep C18)의 0.9㎜×550㎜ 컬럼 상에서 고속 액체 크로마로그라피하여 최종적으로 정제하였다. 용출액은 64% 0.03M NH4OAc/36% 아세토니트릴이었다. 4회 처리로 조품 총량 61㎎을 정제하였다. 물로부터 3회 동결 건조시킨 후, 피로글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린 에틸아미드 순품 15㎎을 그의 초산 부가염 형태로 얻었다. 융점 180-190℃, [α]D25-57.2°(c=1.1, HOAc).
에틸아민 대신에 화학량론적으로 등가량의 트리플루오로메틸아민,
n-부틸아민, 펜타플루오로에틸아민, 그리고
시클로프로필아민, 2,2,2-트리플루오로에틸아민
시클로헥실아민,
을 사용하고, 상기 분리 반응을 반복 실시하여, 전술한 노나펩티드의 대응하는
n-부틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드, 그리고
시클로프로필아미드, 2,2,2-트리플루오로에틸아미드
시클로헥실아미드, 를 얻었다.
[실시예 3]
일반식(Ⅰ)에서 Z가
Figure kpo00005
인 화합물은 표준용액 합성법에 의하여 제조될 수 있다.
예컨대, "AzaGlyNH2"가
Figure kpo00006
인 다음의 방법이 사용될 수 있다.
Figure kpo00007
각개 단편의 커플링은 아지드화 아실법 [J. Honzel와 그의 공동 연구자, Coll. Czech. Chem. Comm., 26, 2333 (1971)], DCC/HBT 커플링법 또는 기타 라세미화 유리 단편 커플링기법에 의하여 진행할 수 있다. 화합물 (1) 및 (2)는 알려진 것이다[M. Fujino와 그의 공동 연구자, Biochem. Biophys, Res. Comm. 57, 1248 (1974) 및 A.S. Dutta와 공동연구자, J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379]. 화합물(3)은 수소분해로 Cbz 및 니트로기를 제거한 다음, DCC/HBT 또는 기타 이 분야에 공지된 커플링제를 사용하여 N-Boc-3-(2-나프틸)-D-알라닌과 커플링시킴으로써 화합물(2)로부터 제조된다. 유사한 LH-RH 유연체의 합성에 대해서는 듀타(Dutta)등의 논문을 참조할 수 있다.
이와 유사하게 하여, N-Boc-3-(2-나프틸)-D-알라닌 대신에 다른 아미노산을 사용하여, 일반식(Ⅰ)의 기타 화합물, 예컨대,
(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-메틸-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2와 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-트리메틸페닐)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2를 제조할 수 있다. 또한, 화합물(2)를 제조함에 있어서는, AzaGly-NH2대신에 AzaGly-NH-저급알킬을 사용하여 AzaGly-NH-저급 알킬 말단을 가진 대응하는 펩티드, 예컨대
(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et,
(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-N-메틸-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et, 그리고
(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2, 4, 6-트리메틸페닐)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et
를 얻을 수 있다.
[실시예 4]
실시예 1의 방법을 반복 실시하고, 고상 합성 순서로 적절한 아미노산을 대치하면서, 제6위치에 D-아미노산 또는 D, L-아미노산(후자의 경우는 크로마토그라피 도중에 부분 입체 이성체를 분리하여) 중의 어느 하나를 사용하여 다음의 데카펩티드를 얻을 수 있다. 이들은 초산 부가염으로서 분리되는 특징이 있다.
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알리닐-N-메틸로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드, [α]D 25-26.6°(c=1, HOAc),
pyro-글루타밀-히스티딜-페닐알라닐-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프로필-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-3-(1-나프틸)-L-알라닐-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-페닐알라닐-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-3-(1-펜타플루오로페닐)-L-알라닐-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(1-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드, 융점 : 173-5℃, [α]D 25-28.1°(c=0.8, HOAc),
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-안트릴-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-플루오로페닐)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드, [α]D 25-25.8°(c=1, HOAc),
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(3-페난트릴)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(4-비페니릴)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드, [α]D 25-35.7°(c=1, HOAc),
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2,2-디페닐메틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(1-아다만틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2,4,6-트리메틸페닐)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드, [α]D 25-42.1°(c=1, HOAc),
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-[2,4, 6-트리-(n-부틸) 페닐]-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2,3,4,5,6-펜타메틸페닐)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실--3-(2,4,6-트리메틸시클로헥실)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-[2,4,6-트리(n-부틸) 시클로헥실]-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(퍼히드로-1-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(퍼히드로-2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(4-퍼히드로비페니릴)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(퍼히드로-2, 2-디페닐메틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-이소로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-노르로이실-아르기닐-프롤릴-글리신아미드.
[실시예 5]
실시예 1의 방법을 반복실시하고, 고상 합성 순서에 적절한 아미노산을 대치하면서, 제6위치에 D-아미노산 또는 D, L-아미노산(후자의 경우는 크로마토그라피 도중에 부분 입체 이성체를 분리하여) 중의 어느 하나를 사용하여 다음의 노나펩티드를 얻을 수 있다. 이들은 초산 부가염으로서 단리되는 특징이 있다.
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(1-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤릴의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-페닐알라닐-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, 융점 180-190℃, [α]D 25-57.2°(c=1, 101 HOAc), n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-3-(1-나프틸)-L-알라닐-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, 융점 160-170℃, [α]D 25-45.3°(c=1, HOAc), n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-페닐알라닐-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-2-(1-펜타플루오로페닐)-L-알라닐-3-(2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(1-안트릴)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-플루오르에닐)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2, 2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(3-페난트릴)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(4-비페니릴)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2,2-디페닐메틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, 융점 176-206℃, [α]D 25-33.7°(c=1, 10% HOAc), n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(1-아다만틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2,4,6-트리메틸페닐)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2, 2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-[2,4,6-트리-(n-부틸) 페닐]-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2,3,4,5,6-펜타메틸페닐)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2,4,6-트리메틸시클로헥실)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(퍼히드로-1-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2, 2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(퍼히드로-2-나프틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2, 2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(4-퍼히드로비페닐)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2, 2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(퍼히드로-2,2-디페닐메틸)-D-알라닐-로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-N-메틸로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, 융점 170-185℃, [α]D 25-81.1°(c=0.7, 10% HOAc), n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-이소로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
pyro-글루타밀-히스티딜-트립토필-세릴-티로실-3-(2-나프틸)-D-알라닐-노르로이실-아르기닐-프롤린의 에틸아미드, n-부틸아미드, 시클로프로필아미드, 시클로헥실아미드, 트리플루오로메틸아미드, 펜타플루오로에틸아미드 및 2,2,2-트리플루오로에틸아미드,
[실시예 6]
가) (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(실시예 1 참조)의 불화수소염 0.1g의 용액을 물 50㎖에 용해시키고, 초산을 사용하여 미리 평형에 도달시키고 탈이온수로 세척한 Dowex 3 음이온 교환수지 50g의 컬럼을 통과시켰다. 이 컬럼을 탈이온수로 용출시키고, 용출액을 동결건조시켜서 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, [α]D 25-27.5°(c=0.9, HOAc)의 대응하는 초산염을 얻었다.
수지의 평형중에 초산 대신 다른 산을 사용하고 상기 공정을 반복실시하여, 예컨대, 염산염, 불소산염, 황산염, 인산염, 질산염, 안식향산염 등을 얻을 수 있다.
이와 유사한 방법으로, 일반식(Ⅰ)의 다른 화합물의 산부가염을 제조할 수도 있다.
나) 물에 대한 용해도가 낮은 염의 경우, 목적하는 산을 사용하여 물로부터 침전시켜 이들 염을 제조할 수 있다. 그 예를 들면 다음과 같다.
탄닌산아연염 : 물 0.1㎖ 중의 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2초산염 10㎎의 용액을 0.25M NaOH 0.08㎖ 중의 탄닌산 8㎎의 용액을 사용하여 처리하였다. 물 0.1㎖ 중의 ZnSO4.7H2O 염 5㎎의 용액을 즉시 LH-RH 유연체의 용액에 첨가하였다.
그 결과 얻은 현탄액을 물 1㎖로 희석하고 침전을 원심분리시켰다. 청징액을 경사처리하고, 침전 원심분리 및 청징액 경사법에 의하여 잔사를 물 1㎖씩 2회 세척하였다. 침전을 진공건조시켜서 위에서 표제의 LH-RH 유연체의 혼합 탄닌산 아연염 15㎎을 얻었다.
파모산염 : 에탄올 1.6㎖와 0.25M NaOH 0.1㎖의 혼합물에 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH250㎎을 용해한 용액에 0.25M NaOH 0.3㎖ 중에 파모산 11㎎을 용해한 용액을 첨가하였다. 용제를 감압유지하고 잔사를 물 2㎖에 현탁시키고, 원심분리하여 청징액을 경사하였다. 침전을 1.5㎖ 물로 세척하여 원심분리하고 청징액을 경사하였다. 침전을 진공건조시켜서 표제의 LH-RH 유연체의 파모산염 54㎎을 얻었다.
유사한 방법으로, 물에 대한 용해도가 낮은 기타 염을 제조할 수 있다.
다) 유리 펩티드로부터 산부가염의 제조
유리염기인 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH250mg의 용액에 1N 초산 30㎖를 첨가하였다. 그 결과 얻은 용액을 동결건조하여 표제의 LH-RH 유연체의 초산염 50mg을 얻었다.
이와 유사한 방법으로, 초산 대신 다른 산(펩티드에 대하여 화학량론적으로 등가량)을 사용하여 일반식(Ⅰ)의 다른 산부가염, 예컨대, 염산염, 불소산염, 황산염, 인산염, 질산염 등을 얻을 수 있었다.
라) 금속 양이온을 갖는 염, 예컨대 아연염의 제조
0.25M NaOH, 0.3㎖ 물 및 에틴올/m/로 이루어진 혼합액에 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2초산염 50㎎이 함유된 용액에 0.2㎖ 물중의 ZnSO4ㆍ7H2O 염 15㎎의 용액을 가하였다. 침전을 원심분리하고 청징액을 경사처리하였다. 침전을 원심분리법 및 청징액 경사법에 의하여 물 1㎖로 세척하였다. 침전을 진공건조하여 표제의 LH-RH 유연체의 아연염 48g을 얻었다.
이와 유사한 방법으로 기타 다가 양이온, 이를테면 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등을 사용하여 염을 제조할 수 있다.
[실시예 7]
물 25㎖ 중의 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2초산염 50㎎의 용액을 NaOH 용액으로 평형화시킨 Dowex 1(강염기성인 사급 암모늄 음이온 교환수지)의 50㎎ 컬럼에 통과시켜 짝이온(counterion) 수산화물을 얻었다. 이 컬럼을 물 150㎖로 용출시키고, 용출액을 동결 건조시켜서 대응하는 폴리펩티드 45㎎을 유리 염기로서 얻었다.
이와 유사한 방법으로, 일반식(Ⅰ)의 화합물의 다른 산부가염, 예컨대 실시예 6에 기재한 바와 같은 염을 대응하는 유리 염기로 전환시킬 수 있다.
[실시예 8]
이하에서는 유효 성분으로서 본 발명의 LH-RH유연체, 예컨대 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닐-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2또는 약리상 허용되는 염, 이를테면 초산 부가염, 아연염, 탄닌산아연염 등을 함유하는 대표적인 제약 조성물에 관하여 설명하겠다.
가) 구강(예컨대, 혀밑) 투여용 정제
1. LH-RH 유연체 50.0㎍ 3. LH-RH 유연체 25.0㎍
압축성 설탕, USP 96.0mg 만니톨, USP 88.5mg
스테아린산 칼슘 4.0mg 스테아린산마그네슘 1.5mg
2. LH-RH 유연체 30.0㎍ 미리 젤라틴화시킨 녹말, USP 10.5mg
압축성 설탕, USP 98.5mg 4. LH-RH 유연체 200.0㎍
스테아린산마그네슘 1.5mg 락토오스, USP 83.3mg
미리 젤라틴화시킨 녹말, USP 15.0mg
스테아린산마그네슘 1.5mg
제조방법 :
a. LH-RH 유연체를 충분한 양의 물에 용해시켜서 불활성 담체의 설탕 성분과 혼합시켜서 수화 과립을 형성한다. 건조기에서 완전히 건조시킨다. 건조 과립을 체질하여 대형응집체를 파쇄한 다음, 잔여 성분과 혼합시킨다. 이 과립을 표준 타정기에서 압착시켜서 특정 중량의 정제를 얻는다.
b. 이 제법에 있어서, 모든 제형에는 0.01%젤라틴, USP가 포함된다. 이 젤라틴은 우선 수성 과립화 용제, 다음에는 LH-RH 유연체에 용해시킨다. 나머지 과정은 상기 (a)항의 경우와 같다.
상기 제형 4는 경구 투여용 정제로서 사용할 수도 있다.
나) 작용시간이 긴 근육내 주사제
1. 작용시간이 긴 근육내 주사제-참기름 겔
LH-RH 유연체 1.0㎍
모노스테아린산 마그네슘, USP 20.0㎎
참기름, 충분량 1.0㎎
모노스테아린산 알루미늄을 참기름과 혼합하고 교반하면서 맑은 황색 용액이 형성될 때까지 120℃까지 가열하였다. 이어서, 그 혼합물을 고압살균 후 냉각시켰다. 다음에, LH-RH 유연체를 미세하게 분말화하면서 무균적으로 첨가한다. 특히 바람직한 LH-RH 유연체는 용해도가 낮은 염, 이를테면 아연염, 탄닌산아연염, 파모산염 등이다. 이들은 예외없이 장시간의 작용을 나타낸다.
2. 작용 시간이 긴 근육내 주사-생체 분해성
중합체 마이크로캡슐제
LH-RH 유연체
25/75 글리콜리드/락티드
공중합체(고유점도 : 0.5) 99%
상기 제형의 마이크로캡슐(0-150μ)을 다음 성분에 현탁시킨다.
덱스트로스 5.0% 트윈(Tween) 80 0.1%
CMC, 나트륨 0.5% 정제수, 충분량 100.0%
벤질알코올 0.9%
마이크로캡슐 25㎎을 담체 1.0㎖에 현탁시킨다.
다) 근육내 주사용 수용액제
LH-RH 유연체 25㎎ 주사용수, 충분량 100㎖
젤라틴, 비항원성 5㎎
젤라틴과 LH-RH 유연체를 주사용수에 용해시킨 다음, 여액을 살균한다.
라) 비강 투여용 수용액제
LH-RH 유연체 250㎎ 벤질알코올 0.9㎎
덱스트로스 5㎎ 정제수, 충분량 100㎖
LH-RH 유연체, 덱스트로스, 벤질알코올을 충분량의 정제수에 용해한다.
마) 직장 투여제
직장 투여용 담지체
LH-RH 유연체 500㎍
Witeposle H15 20.0㎎
LH-RH 유연체를 용융된 Witeposole H15에 혼합하여 충분히 혼합시킨 다음 2g 모울드에 주가한다.
[실시예 9]
쥐에 있어서 발정 억제.
공정 : 생쥐(Hilltop, Spranque Dawley, 약 200g이고 질구가 개방되어 있음)를 케이지 1개당 5마리 및 1그룹당 2개의 케이지로 구분하여 칭량한다. 14일간 매일 2회씩(아래 나타낸 바와 같은 것 제외) 피하 주사한다. 매일 질의 오물을 취하여 발정 주기의 단계를 조사하고 체중을 0, 1 및 2주에 기록한다. 4일째부터 부분 발정 억제(즉, 단지 발정이 없는 발정 동기 및 발정 전기)를 나타내는 암쥐의 비율과, 4일째부터 완전발정 억제(즉, 발정 동기)를 나타내는 암쥐의 비율을 기록한다. 이러한 발정 억제 비율에 관한 자료를 기록한 최적 직선으로부터 ED50의 양을 얻어낸다. LH-RH 유연체는 소의 0.1% 혈청 알부민을 함유하는 생리식염수중의 초산염 형태로 하여 투여하였다. 주사량은 0.2㎖이었는데, 유연체의 함량은 0.05, 0.1, 0.2 또는 0.4㎍의 비율이었다. 대조품(BSA를 함유한 생리 식염수)은 발정 억제 효과를 나타내지 않았다. 부분 및 완전 발정억제에 대한 ED50의 값은 다음과 같다.
Figure kpo00008
Figure kpo00009
주 : a-이들 화합물에 대한 투여는 매일 1회이었음.
[실시예 10]
체중이 각각 약 25g인 6마리의 스위스-웹스터종 새앙쥐(Simonsen)에 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-나프틸)-D-알라닐-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2의 초산염 0.25㎖를 피하주사하였다. 투여량은 체중 1㎏당 40㎎ 또는 쥐 1마리당 약 1㎎이었다. 사망률 조사를 위하여 매일 2회씩 21일간 상기 새앙쥐를 관찰하였다. 어떠한 치사 효과도 관찰되지 않았다. 그러므로, LD50은 40㎎/㎏ 이상이다.

Claims (1)

  1. 보호기를 갖는 N-말단 알파 아미노산 또는 펩티드를 보호기가 있거나 또는 없는 다른 알파 아미노산 또는 펩티드와 공지의 펩티드 커플링 반응에 의해서 커플링시켜서 소정의 아미노산 결합 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻고, 이어서 상기 보호된 폴리펩티드로부터 상기 보호기 또는 공유결합된 고상지지체를 제거시켜서 하기 구조식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 염을 제조하는 방법에 있어서, LH-RH의 메카펩티드 유도체의 6-위치 아미노산을 하기 구조식(Ⅱ)의 D-아미노산 잔기로 치환시킴을 특징으로 하는 하기 구조식(Ⅰ)으로 표시되는 데카펩티드의 제조 방법.
    (pyro) Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (Ⅰ)
    Figure kpo00010
    상기 식(Ⅰ)에 있어서, V는 트립토필, 페닐알라닐 또는 3-(1-나프틸)-L-알라닐이고, W는 티로실, 페닐알라닐 또는 3-(1-펜타플루오로-페닐)-L-알라닐이고,
    X는 상기 구조식 (Ⅱ)의 D-아미노산 잔기이고, Y는 로이실, 이소로이실, 노르-로이실 또는 N-메틸-로이실이고, Z는 글리신아미드 또는 -NH-R1[식중, R1은 저급알킬, 시클로알킬, 플루오로 저급알킬 또는 -NH
    Figure kpo00011
    (R2는 수소 또는 저급알킬임)]이고, 상기 식 (Ⅱ)에 있어서, R는 (a) 3개 이상의 직쇄 저급 알킬기로 치환된 나프틸, 안트릴, 플루오레닐, 페난트릴, 비페닐릴, 벤즈히드릴 및 페닐로되는 군중에서 선택된 카르보시클릭 아릴 함유기이거나, 또는 (b) 3개 이상의 직쇄 저급알킬기로 치환된 시클로헥실, 퍼히드로나프틸, 퍼히드로비페닐릴, 퍼히드로-2,2-디페닐메틸 및 아다만틸로되는 군중에서 선택된 포화 카르보시클릭기이다.
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