KR20240099470A - 항-cldn18.2 단일클론 항체 및 이의 응용 - Google Patents

항-cldn18.2 단일클론 항체 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-CLDN18.2 단일클론 항체 및 이의 제제를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 신규한 항-CLDN18.2 인간화 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 항원에 고도로 특이적으로 결합할 수 있고, 높은 친화도 및 높은 생물학적 활성을 가지며, 인간 CLDN18.2 항원 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 시험관 내 및 생체 내 모두에서 종양을 효율적으로 억제할 수 있다.

Description

항-CLDN18.2 단일클론 항체 및 이의 응용
본 발명은 의약 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 항-CLDN18.2 인간화 단일클론 항체 및 이의 제제에 관한 것이다.
밀착 연접(Tight Junctions, TJs)은 상피 조직에서 세포 간 침투성을 조절하는 다분자 복합체이다. 밀착 연접 복합체에서, 밀착 연접 단백질(claudins)은 인접한 세포 사이에 밀착 채널을 형성하여 이온, 용질 등 물질의 흐름을 조절한다.
CLDN18은 폐 및 위 상피 세포에서 밀착 연접의 주요 구성 부분으로, CLDN18.1 및 CLDN18.2라는 두 가지 아형을 갖고 있는데, CLDN18.1은 주로 폐에서 발현되고, CLDN18.2는 주로 위에서 발현된다.
연구를 통해 CLDN18.2는 원발성 위암 및 전이성 위암, 췌장암, 식도암, 폐암, 담관암, 난소암 등 다양한 종양에서 고도로 발현됨을 발견하였다(Sahin U, 등. Clin Cancer Res, 2008;14(23):7624-34). 종양 세포는 증식이 빠르고 침입 및 전이가 쉬운 등의 특성을 갖고 있어 밀착 연접 구조를 상실하므로, 표면의 CLDN18.2 분자가 더 쉽게 노출되어 CLDN18.2는 이상적인 종양 치료 표적으로 된다(Hewitt KJ, 등. BMC Cancer, 2006; 6:186).
Ganymed Pharmaceuticals AG사에서 개발한 CLDN18.2에 대한 키메라 항체 IMAB362는 임상 III상 연구에 돌입하였다. 말기 또는 재발성 위 식도암에 대한 임상 II상 연구에서 IMAB362는 1차 화학요법 약물 EOX(에피루비신, 옥살리플라틴, 카페시타빈)와 결합하여 화학요법 단독에 비해 환자의 PFS 및 OS를 현저히 연장시켜 위암, 식도암 등 질병의 치료를 위한 잠재적인 약물로 되었다(Lordick F, 등. Gastric Cancer, 2021; 24(3): 721-730.).
종양 치료에서 CLDN18.2의 잠재력으로 인해 활성이 높은 항체 약물의 개발은 임상적 필요성이 크다.
인간 CLDN18.1과 CLDN18.2 사이의 높은 유사성은 CLDN18.2 특이적 항체의 개발에 어려움을 초래한다. 이 밖에, 마우스 CLDN18.2는 인간 CLDN18.2 세포외 루프 1 서열과 완전히 일치하며, 마우스 체내에서 특이적 항-인간 CLDN18.2의 항체를 스크리닝하려면 마우스의 면역 내수성을 파괴해야 한다. 따라서, 인간 CLDN18.2 항체를 특이적으로 인식하는 고활성 항체 약물의 개발은 많은 기술적 어려움을 극복해야 한다.
따라서, 당업계에서는 여전히 높은 친화도 및 높은 생물학적 활성을 갖는 CLDN18.2 항체 및 이의 응용 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 높은 친화도 및 높은 생물학적 활성을 갖는 CLDN18.2 항체 및 이의 응용을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에서는 항체의 중쇄 가변 영역을 제공하며, 상기 중쇄 가변 영역은,
(1) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR1;
(2) 서열번호 4 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR2; 및
(3) 서열번호 5 또는 17로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR3을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 중쇄 가변 영역의 3개 상보성 결정 영역 CDR의 서열은 서열번호 3, 4 및 5; 또는 3, 16 및 5; 또는 3, 4 및 17이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 11, 12 및 13에 상응하는 4개의 프레임워크 영역 FR로부터 유래된 4개의 프레임워크 영역 FR을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 11, 12 또는 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제2 양태에서는 항체 중쇄를 제공하며, 상기 항체 중쇄는 본 발명의 제1 양태에 따른 항체의 중쇄 가변 영역을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 중쇄의 불변 영역은 인간으로부터 유래된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 중쇄의 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2 등의 중쇄 불변 영역이다.
본 발명의 제3 양태에서는 항체의 경쇄 가변 영역을 제공하며, 상기 경쇄 가변 영역은,
(1) 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR1';
(2) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR2'; 및
(3) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR3'을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 6, 14, 및 15에 상응하는 4개의 프레임워크 영역 FR로부터 유래된 4개의 프레임워크 영역 FR을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 6, 14 또는 15로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 제4 양태에서는 항체 경쇄를 제공하며, 상기 항체 경쇄는 본 발명의 제3 양태에 따른 항체의 경쇄 가변 영역을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 경쇄의 불변 영역은 인간으로부터 유래된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 경쇄의 불변 영역은 인간 Kappa, Lambda 등의 경쇄 불변 영역이다.
본 발명의 제5 양태에서는 항체를 제공하며, 상기 항체는,
(1) 본 발명의 제1 양태에 따른 중쇄 가변 영역; 및/또는
(2) 본 발명의 제3 양태에 따른 경쇄 가변 영역을 갖는다.
또는, 상기 항체는 본 발명의 제2 양태에 따른 중쇄; 및/또는 본 발명의 제4 양태에 따른 경쇄를 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 더 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 서열번호 1, 11, 12 또는 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 6, 14, 및 15로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 서열번호 1, 11, 12 또는 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 15로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는,
(Z1) 서열번호 1로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 6으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체:
(Z2) 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체;
(Z3) 서열번호 11로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체;
(Z4) 서열번호 12로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체;
(Z5) 서열번호 12로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체;
(Z6) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체; 및
(Z7) 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 18, 20, 21 또는 22로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 인간화 항체이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 CLDN18.2에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 이중사슬 항체 또는 단일사슬 항체이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 이중 특이적 항체이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 약물 접합체 형태이다.
본 발명은 또한 624에 대응되는 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 23으로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 24로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
본 발명의 제6 양태에서는 재조합 단백질을 제공하며, 상기 재조합 단백질은,
(i) 본 발명의 제1 양태에 따른 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 양태에 따른 중쇄, 본 발명의 제3 양태에 따른 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 양태에 따른 경쇄 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 항체; 및
(ii) 발현 및/또는 정제를 돕기 위한 선택적인 태그 서열을 갖는다.
다른 바람직한 예에서, 상기 태그 서열은 6His 태그를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 재조합 단백질(또는 폴리펩티드)은 융합 단백질을 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 재조합 단백질은 단량체, 이량체 또는 다량체이다.
본 발명의 제7 양태에서는 항체 제제를 제공하며, 상기 항체 제제는,
(a) 본 발명의 제5 양태에 따른 항체; 및
(b) 완충액, 멸균수, 선택적인 계면활성제를 포함하는 담체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제제에서 상기 항체의 농도는 5~100mg/mL; 바람직하게는 10~70mg/mL, 보다 바람직하게는 20~60mg/mL이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 완충액은 시트르산 완충 시스템, 히스티딘 완충 시스템 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제제의 pH 범위는 5.0~7.5, 바람직하게는 5.5~7이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제제는 주사 제제이다.
본 발명의 제8 양태에서는 키트를 제공하며, 상기 키트는 본 발명의 제7 양태에 따른 항체 제제, 및 상기 항체 제제를 담는 용기를 포함한다.
본 발명의 제9 양태에서는 CAR 컨스트럭트를 제공하며, 상기 CAR 컨스트럭트의 항원 결합 영역의 scFv 단편은 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 결합 영역이고, 상기 scFv는 본 발명의 제1 양태에 따른 중쇄 가변 영역 및 본 발명의 제3 양태에 따른 경쇄 가변 영역을 갖는다.
본 발명의 제10 양태에서는 재조합 면역 세포를 제공하며, 상기 면역 세포는 본 발명의 제9 양태에 따른 외인성 CAR 컨스트럭트를 발현한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역 세포는 NK 세포, T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 면역 세포는 인간 또는 인간이 아닌 포유동물(예: 마우스)로부터 유래된다.
본 발명의 제11 양태에서는 항체 약물 접합체를 제공하며, 상기 항체 약물 접합체는,
(a) 본 발명의 제1 양태에 따른 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 양태에 따른 중쇄, 본 발명의 제3 양태에 따른 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 양태에 따른 경쇄 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 항체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 부분; 및
(b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고 상기 항체 부분과 접합된 접합 부분을 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체 부분과 상기 접합 부분은 화학 결합 또는 링커를 통해 접합된다.
본 발명의 제12 양태에서는 활성 성분의 용도를 제공하며, 상기 활성 성분은 본 발명의 제1 양태에 따른 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 양태에 따른 중쇄, 본 발명의 제3 양태에 따른 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 양태에 따른 경쇄 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 항체, 본 발명의 제6 양태에 따른 재조합 단백질, 본 발명의 제10 양태에 따른 면역 세포, 본 발명의 제11 양태에 따른 항체 약물 접합체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 활성 성분은,
(a) 검출 시약 또는 키트의 제조;
(b) CLDN18.2 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약물 또는 제제의 제조; 및/또는
(c) 암 또는 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 약물 또는 제제의 제조에 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 혈액 종양, 고형 종양 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 혈액 종양은 급성 골수성 백혈병(AML), 다발성 골수종(MM), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 호지킨 림프종 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 고형 종양은 위암, 위암 복막전이, 간암, 백혈병, 신장 종양, 폐암, 소장암, 골암, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 대장암, 자궁경부암, 난소암, 림프종, 비인두암, 부신 종양, 방광 종양, 비소세포 폐암(NSCLC), 신경교종, 자궁내막암 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 CLDN18.2를 고도로 발현하는 종양이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약물 또는 제제는 CLDN18.2(양성 발현) 관련 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물 또는 제제를 제조하는 데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 항체는 약물 접합체(ADC) 형태이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약 또는 키트는 CLDN18.2 관련 질병을 진단하는 데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약 또는 키트는 샘플에서 CLDN18.2 단백질을 검출하는 데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 검출 시약은 검출편이다.
본 발명의 제13 양태에서는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은,
(i) 본 발명의 제1 양태에 따른 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 양태에 따른 중쇄, 본 발명의 제3 양태에 따른 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 양태에 따른 경쇄 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 항체, 본 발명의 제6 양태에 따른 재조합 단백질, 본 발명의 제10 양태에 따른 면역 세포, 본 발명의 제11 양태에 따른 항체 약물 접합체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 활성 성분; 및
(ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 항종양인 제2 활성 성분을 더 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제2 활성 성분은 세포 독성 약물, 독소, 사이토카인, 효소, 항체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 제2 활성 성분은 EGFR을 표적으로 하는 항체, HER2를 표적으로 하는 항체를 포함한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 액체 제제이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 주사제이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 종양을 치료하는 데 사용된다.
다른 바람직한 예에서, 상기 종양은 CLDN18.2를 고도로 발현하는 종양이다.
본 발명의 제14 양태에서는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드는,
(1) 본 발명의 제1 양태에 따른 중쇄 가변 영역, 본 발명의 제2 양태에 따른 중쇄, 본 발명의 제3 양태에 따른 경쇄 가변 영역, 본 발명의 제4 양태에 따른 경쇄 또는 본 발명의 제5 양태에 따른 항체; 또는
(2) 본 발명의 제6 양태에 따른 재조합 단백질; 및/또는
(3) 본 발명의 제9 양태에 따른 CAR 컨스트럭트로부터 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩한다.
본 발명의 제15 양태에서는 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 본 발명의 제14 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유한다.
다른 바람직한 예에서, 상기 벡터는 박테리아 플라스미드, 파지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스와 같은 포유동물 세포 바이러스, 또는 기타 벡터를 포함한다.
본 발명의 제16 양태에서는 유전자 조작된 숙주 세포를 제공하며, 상기 숙주 세포는 본 발명의 제15 양태에 따른 벡터를 함유하거나 게놈에 본 발명의 제14 양태에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합된다.
본 발명의 제17 양태에서는 샘플 내 CLDN18.2 단백질의 시험관 내 검출(진단적 검출 또는 비진단적 검출 포함) 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(1) 시험관 내에서, 상기 샘플을 본 발명의 제5 양태에 따른 항체와 접촉시키는 단계; 및
(2) 항원-항체 복합체가 형성되는지 여부를 검출하되, 복합체가 형성되면 샘플에 CLDN18.2 단백질이 존재함을 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명의 제18 양태에서는 검출판을 제공하며, 상기 검출판은 서브스트레이트(지지판) 및 테스트 스트립을 포함하고, 상기 테스트 스트립은 본 발명의 제5 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제11 양태에 따른 항체 약물 접합체를 함유한다.
본 발명의 제19 양태에서는 키트를 제공하며, 상기 키트는,
(1) 본 발명의 제5 양태에 따른 항체를 함유하는 제1 용기; 및/또는
(2) 본 발명의 제5 양태에 따른 항체에 대한 2차 항체를 함유하는 제2 용기를 포함하거나,
상기 키트는 본 발명의 제18 양태에 따른 검출판을 함유한다.
본 발명의 제20 양태에서는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 발현에 적합한 조건에서, 본 발명의 제14 양태에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양물로부터 재조합 폴리펩티드를 분리하되, 상기 재조합 폴리펩티드는 본 발명의 제5 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제6 양태에 따른 재조합 단백질인 단계를 포함한다.
본 발명의 제21 양태에서는 CLDN18.2 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 제5 양태에 따른 항체, 상기 항체의 항체-약물 접합체 또는 상기 항체를 발현하는 CAR-T 세포 또는 이들의 조합을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 범위 내에서, 본 발명의 상기 각 기술적 특징과 아래(예: 실시예)에서 구체적으로 설명되는 각 기술적 특징은 모두 서로 조합되어 새롭거나 바람직한 기술적 해결수단을 구성할 수 있다는 점을 이해해야 한다. 편폭의 제한으로 여기서는 더 이상 설명하지 않는다.
도 1은 하이브리도마 상청액 세포에 특이적으로 결합하는 Elisa 결합 검출 결과를 보여준다.
도 2는 유세포 분석 검출 결과를 보여준다. 도 2a는 키메라 항체 ch429 검출 결과이고, 도 2b는 키메라 항체 ch623 검출 결과이며, 도 2c는 키메라 항체 ch624 검출 결과이고, 도 2d는 키메라 항체 ch782 검출 결과이며, 도 2e는 참조 항체 Ref.ch175 검출 결과이다.
도 3은 재조합 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 결합 활성 검출 결과를 보여준다. 도 3a는 HEK293-hCLDN18.1 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 결합 활성 결과이고; 도 3b는 HEK293-hCLDN18.2 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 결합 활성 결과이다.
도 4는 NUGC4 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 결합 활성 검출 결과를 보여준다.
도 5는 재조합 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 세포 결합 활성의 유세포 분석 검출 결과를 보여준다.
도 6은 HEK293-hCLDN18.2 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 ADCC 활성 결과를 보여준다.
도 7은 인간 CLDN18.1&CLDN18.2, 마우스 CLDN18.1&CLDN18.2 및 NUGC4 세포에 대한 인간화 항체의 결합 활성을 보여준다.
도 8은 인간화 항체의 ADCC 활성을 보여준다.
도 9는 인간화 항체의 CDC 활성 검출 결과를 보여준다.
도 10은 HEK293-hCLDN18.2 증식에 대한 인간화 항체의 억제 활성 결과를 보여준다.
도 11은 본 발명의 항체 hu782와 참조 항체의 핵심 결합 부위의 비교를 보여준다. 여기서, 도 11a는 Ref.ch175의 핵심 결합 부위를 보여주고, 도 11b는 본 발명의 항체 hu782의 핵심 결합 부위를 보여준다.
도 12는 본 발명의 항체의 생체 내 항종양 활성을 보여준다.
광범위하고 심층적인 연구를 거쳐 본 발명자들은 예기치 않게 우수한 고친화도 및 높은 항종양 활성을 갖는 항-인간 CLDN18.2 항체를 최초로 획득하였다. 구체적으로, 대량의 스크리닝을 거쳐 본 발명자들은 인간 CLDN18.2에 대해 높은 친화도를 갖는 여러 계통의 마우스 유래 항체를 최초로 획득하였다. 마우스 유래 항체를 기반으로, 본 발명은 키메라 항체 및 인간화 항체를 추가로 제조하고, 획득된 인간화 항체에 대해 돌연변이 스크리닝을 수행하였다. 본 발명의 항체, 특히 돌연변이된 인간화 항체는 키메라 항체와 유사한 친화도를 가져 향후 표적 치료를 위한 인간화 단일클론 항체 약물로 추가로 개발될 수 있다. 본 발명의 항체는 인간 CLDN18.2에 효과적으로 결합하고, 다양한 종양 세포의 증식을 억제하며, 누드 마우스 엔도솜에서 종양의 성장을 억제할 수 있어, 우수한 항종양 활성을 갖는다. 이를 기반으로 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 다양한 형태의 hCLDN18.2 DNA를 항원으로 구축하여 마우스를 교대로 면역시키고, hCLDN18.2를 재조합적으로 발현하는 세포주를 사용하여 면역을 보강하였으며, 하이브리도마 융합 기술을 통해 hCLDN18.2를 특이적으로 인식하는 마우스 단일클론 항체 mab429, mab623, mab624, mab782를 얻었다.
키메라 항체 ch782는 hCLDN18.2에 특이적으로 결합하고, 종양 세포인 NUGC4 세포 표면의 CLDN18.2 분자를 인식할 수 있으며, CLDN18.2와의 친화도는 참조 항체 Ref.ch175보다 현저히 높다. ch782는 hCLDN18.2 세포에 대해 ADCC, CDC 및 증식 억제 활성을 갖는다.
키메라 항체 ch782를 인간화하여 4 가지 IgG1형 인간화 항체 조합인 hu782H1.1L1, hu782H1.2L1, hu782H1.1L2, hu782H1.2L2를 얻는다. 4 가지 인간화 항체는 hCLDN18.2를 특이적으로 인식하고, ch782와 상당한 친화도를 갖는다.
인간화 항체 중쇄 hu782H1.1에 대해 S60A 부위 돌연변이를 수행하여 잠재적인 글리코실화 부위를 제거하는 동시에 V101A 돌연변이를 수행하여 발현량을 강화시켜 인간화 항체 중쇄 hu782 H1.2-V101A를 얻는다. 상기 S60A, V101A 부위는 Kabat 넘버링 규칙에 따라 정의된다.
종양 세포에 대한 인간화 항체 hu782(H1.2L2 조합), hu782-HV(H1.2-V101A L2 조합)의 ADCC 활성은 참조 항체 Ref.ch175보다 현저히 우수하다.
인간화 항체 hu782 중쇄 불변 영역의 239번 위치, 332번 위치의 아미노산에 대해 S239D/I332E 돌연변이를 수행하여 인간화 항체 hu782-DE를 얻는다. 상기 S239D, I332E는 EU 넘버링 시스템에 따라 정의된다.
종양 세포 NUGC4에 대한 인간화 항체 hu782-DE의 ADCC 활성은 참조 항체 Ref.ch175보다 현저히 우수하고, EC50값은 Ref.ch175보다 24배 낮다.
인간화 항체 hu782, hu782-HV는 hCLDN18.2 표적 세포에 대해 CDC 사멸 활성을 갖는다.
인간화 항체 hu782, hu782-HV는 hCLDN18.2 표적 세포에 대해 증식 억제 활성을 갖고, 증식 억제 활성은 용량 의존적이며, 참조 항체 Ref.ch175보다 현저히 우수하다.
에피토프 분석 결과, 인간화 항체 hu782가 인식하는 핵심 부위는 hCLDN18.2 분자의 E56, G48 부위를 포함하는 반면, 참조 항체 Ref.ch175가 인식하는 핵심 부위는 A42S, N45A, E56A, G48 부위를 포함함을 발견하였는데, 이는 두 항체의 결합 에피토프에 일정한 차이가 있음을 입증한다.
누드 마우스 종양 이식 모델에서, hu782, hu782-HV, hu782-DE이 세 항체는 모두 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있고, 참조 항체 Ref.ch175보다 우수하며, 특히hu782, hu782-DE 이 두 항체의 종양 성장 억제 효과는 참조 항체 Ref.ch175보다 현저히 우수하다. hu782, hu782-DE 이 두 항체 치료군 모두 마우스 종양이 완전히 퇴행하고, hu782-HV, hu782, hu782-DE의 종양 억제율은 34.68%, 62.88% 및 65.05%이며, 참조 항체 Ref.ch175는 15.5%이다.
용어
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어를 정의한다. 본 명세서에서 달리 명확히 규정하지 않는 한 본 발명에서 사용되는 아래 각 용어는 아하에서 주어진 의미를 가져야 한다. 다른 정의는 명세서 전반에 걸쳐 명시되어 있다.
용어 "약"은 당업자에 의해 결정된 특정 값 또는 조성에 대해 허용 가능한 오차 범위 내의 값 또는 조성을 의미할 수 있으며, 이는 부분적으로 값 또는 조성의 측정 방법에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 "약 100"이라는 표현은 99와 101 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "함유" 또는 "포함(포괄)"은 개방형, 반폐쇄형 및 폐쇄형일 수 있다. 다시 말하면, 상기 용어는 "본질적으로??로 구성" 또는 "??로 구성"을 포함한다.
서열 동일성은 기설정된 비교 창(참조 뉴클레오티드 서열 또는 단백질 길이의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있음)을 따라 2개의 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정함으로써 결정된다. 일반적으로, 이는 백분율로 표시된다. 뉴클레오티드 서열의 서열 동일성을 측정하는 방법은 당업자에게 잘 알려진 방법이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "중쇄 가변 영역"과"VH"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "경쇄 가변 영역"과 "VL"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "가변 영역"과 "상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)"은 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "본 발명의 항체", "본 발명 단백질" 또는 "본 발명의 폴리펩티드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 모두 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 중쇄 가변 영역(서열번호 1, 11, 12 또는 13의 아미노산 서열) 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 6, 14 또는 15의 아미노산 서열)을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 이들은 시작 메티오닌을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 항체는 624에 대응되는 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 중쇄 가변 영역(서열번호 23의 아미노산 서열) 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 24의 아미노산 서열)을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다.
CLDN18.2
인간 CLDN18의 전장은 261개의 아미노산을 함유하고, 이는 4개의 막관통 소수성 영역과 2개의 세포외 고리 구조를 갖는 4-패스 막관통 단백질이며, 고리 1은 막관통 영역 1 및 막관통 영역 2로 둘러싸여 이루어지고; 고리 2는 막관통 영역 3 및 막관통 영역 4로 둘러싸여 이루어진다. 인간 CLDN18.1과 CLDN18.2의 N-말단, 막관통 영역 1 및 세포외 루프 1의 아미노산 조성에는 차이가 있지만 나머지 부분은 완전히 일치하며, 그 서열 유사도는 92%에 도달한다.
항체
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 사슬 간 이황화 결합으로 연결된 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄로 구성된 테트라펩티드 사슬 구조인 면역글로불린을 의미한다.
기존 항체 번호 체계에는 다음과 같은 체계가 포함된다.
1. Kabat 체계(Kabat 등, 1991)는 동일한 도메인 유형의 서열 사이의 높은 서열 변이 영역의 위치를 기반으로 하며, 항체 중쇄(VH) 및 경쇄(Vλ 및 Vκ) 가변 도메인에 대한 넘버링은 상이하다.
2. Chothia 체계(Al-Lazikani, 1997)는 Kabat 체계와 동일하지만 첫 번째 VH 상보성 결정 영역(CDR) 주위에 주석 삽입 위치를 수정하여 구조적 루프에 대응되도록 한다. 마찬가지로, 강화형 Chothia 프로젝트(Abhinandan 및 Martin, 2008)에서는 삽입 위치에 추가 구조적 수정을 가하였다.
3. 이러한 Kabat 유사 체계와는 반대로 IMGT(Lefranc, 2003) 및 AHo(Honegger 및 Plueckthun, 2001)는 모두 항체 및 T 세포 수용체(TCR)(Vα 및 Vβ) 가변 도메인에 대한 고유한 체계를 정의한다. 따라서, 도메인 유형 간에 동등한 잔기 위치를 비교할 수 있다. IMGT 및 AHo는 주석 위치 수(각각 128 및 149)와 indel이 발생한다고 간주하는 위치가 상이하다.
면역글로불린 중쇄 불변 영역의 아미노산 조성과 배열 순서가 상이하므로 항원성도 상이하다. 따라서, 면역글로불린은 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 이 5 가지 유형으로 구분되거나 면역글로불린 아형으로 지칭될 수 있으며, 이에 상응하는 중쇄는 각각 μ 사슬, δ 사슬, γ 사슬, α 사슬, 및 ε 사슬이다. 동일한 유형의 Ig는 힌지 영역의 아미노산 조성 및 중쇄 이황화 결합의 수 및 위치의 차이에 따라 상이한 하위 유형으로 구분될 수도 있는 바, 예를 들어 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 구분될 수 있다. 경쇄는 불변 영역에 따라 κ 사슬 또는 λ 사슬로 구분된다. 5 가지 유형의 Ig 중 각 유형의 Ig는 모두 κ 사슬 또는 λ 사슬을 가질 수 있다. 상이한 유형의 면역글로불린의 하위 단위 위치 구조 및 3차원 구성은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 항체 경쇄는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 유래 또는 마우스 유래의 κ, λ 사슬 또는 이들의 변이체를 포함한다.
본 발명에서, 본 발명에 따른 항체 중쇄는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 유래 또는 마우스 유래의 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이들의 변이체를 포함한다. 항체 중쇄 및 경쇄에서 N-말단에 가까운 약 110개의 아미노산 서열은 변화가 매우 크며 가변 영역(Fv 영역)이고; C-말단에 가까운 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정적이며 불변 영역이다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR) 및 상대적으로 보존된 서열을 갖는 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하므로, 상보성 결정 영역(CDR)으로도 지칭된다. 각 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 중쇄 가변 영역(HCVR)은 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 구성되고, 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 순차적으로 배열된 순서는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4이다. 경쇄의 3개 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 의미하고; 중쇄의 3개 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 의미한다. 본 발명의 실시예 13에서, kabat와 Chothia 방법을 결합하여 ch782 항체의 6개 CDR을 구획한다.
본 발명에서 용어 "마우스 유래 항체"는 당업계의 지식과 기술에 따라 제조된 항-CLDN18.2 단일클론 항체를 의미한다. 제조 시 피험자에게 CLDN18.2 항원을 주사한 후, 원하는 서열 또는 기능적 특성을 가진 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리한다. 본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 상기 마우스 유래 CLDN18.2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 마우스 유래 κ, λ 사슬 또는 이들의 변이체의 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하거나 마우스 유래 IgG1, IgG2, IgG3 또는 이들의 변이체의 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 마우스 유래 항체의 가변 영역과 인간 항체의 불변 영역을 융합하여 형성된 항체를 의미하며, 이는 마우스 유래 항체에 의해 유도되는 면역 반응을 감소시킬 수 있다.
CDR 이식 항체(CDR-grafted antibody)로도 지칭되는 용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 항체 가변 영역 프레임워크, 즉 상이한 유형의 인간 생식계열 항체 프레임워크 서열에 마우스의 CDR 서열을 이식하여 생성된 항체를 의미한다. 인간화 항체는 다량의 마우스 단백질 성분을 보유하는 키메라 항체에 의해 유도되는 이종 반응을 극복할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조문헌으로부터 얻을 수 있다. 면역원성 감소와 동시에 초래되는 활성 감소를 방지하기 위해, 상기 인간 항체 가변 영역 프레임워크 서열에 대해 최소 역 돌연변이 또는 복귀 돌연변이를 수행하여 활성을 유지할 수 있다.
용어 "항체의 항원 결합 단편"(또는 "항체 단편"으로 약칭됨)은 항원(예를 들어, CLDN18.2)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 전장 항체의 단편을 이용하여 항체의 항원 결합 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 용어 "항체의 항원 결합 단편"에 포함되는 결합 단편의 구현예는,
(i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편;
(ii) 힌지 영역의 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편의 2가 단편을 포함하는 F(ab')2 단편;
(iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 및
(iv) 항체의 단일 팔의 VH 및 VL 도메인으로 구성된 Fv 단편을 포함한다.
Fv항체는 항체 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 포함하지 않고, 모든 항원 결합 부위의 최소 항체 단편을 갖는다. 일반적으로, Fv항체는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함하고, 항원 결합에 필요한 구조를 형성할 수 있다.
용어 "CDR"은 주로 항원 결합에 기여하는 항체의 가변 도메인 내의 6개 초가변 영역 중 하나를 의미한다. 상기 6개의 CDR에 대해 가장 일반적으로 사용되는 정의 중 하나는 Kabat E.A 등,(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)에 의해 제공된다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위(예를 들어, CLDN18.2 분자 상의 특정 부위)를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 독특한 공간 형태로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속 또는 비연속 아미노산을 포함한다.
용어 "특이적 결합", "선택적 결합", "선택적으로 결합" 및 "특이적으로 결합"은 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체의 결합을 의미한다. 일반적으로, 항체는 약 10-7M 미만, 예를 들어 약 1O-8M, 1O-9M 또는 lO-10M 또는 그 이하의 친화도(KD)로 결합한다.
용어 "경쟁적 결합"은 CLDN18.2의 세포외 영역 상의 동일한 에피토프(항원 결정기로도 지칭됨) 또는 동일한 에피토프의 일부를 본 발명의 단일클론 항체와 인식하여 상기 항원과 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 단일클론 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 본 발명의 단일클론 항체가 인식하는 CLDN18.2의 아미노산 서열을 인식하여 결합하는 항체를 의미한다.
용어 "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 평형 상수를 의미한다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 약 10-7M 미만, 예를 들어 약 1O-8M, 1O-9M 또는 lO-10M 또는 그 이하의 해리 평형 상수(KD)로 CLDN18.2에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원 결정기"는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되고 항원적으로 연속되지 않는 3차원 공간 부위를 의미한다.
본 발명은 완전한 항체뿐만 아니라 면역학적 활성을 갖는 항체의 단편 또는 항체와 다른 서열에 의해 형성된 융합 단백질도 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 항체의 단편, 유도체 및 유사체를 더 포함한다.
본 발명에서, 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 제조된 마우스 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 포함한다. 재조합 항체, 예를 들어 인간 및 비인간 부분을 포함하는 키메라 및 인간화 단일클론 항체는 당업계에 공지된 DNA 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 단일 세포 유래 클론에서 분비되는 항체를 의미한다. 단일클론 항체는 매우 특이적이고 단일 항원 에피토프를 표적으로 한다. 상기 세포는 진핵, 원핵 또는 파지 클론 세포주일 수 있다.
본 발명에서, 항체는 단일 특이적, 이중 특이적, 삼중 특이적 또는 그 이상의 다중 특이적일 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 항체는 이의 보존적 변이체를 더 포함하고, 이는 본 발명의 항체의 아미노산 서열과 비교하여 최대 10개, 바람직하게는 최대 8개, 보다 바람직하게는 최대 5개, 가장 바람직하게는 최대 3개의 아미노산이 유사한 특성을 갖거나 유사한 아미노산으로 대체되어 폴리펩티드를 형성함을 의미한다. 이러한 보존적 변이체 폴리펩티드는 바람직하게는 하기 표에 따른 아미노산 대체에 의해 생성된다.
초기 잔기 대표적인 치환 바람직한 치환
Ala(A) Val; Leu; Ile Val
Arg(R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn(N) Gln; His; Lys; Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro; Ala Ala
His(H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile(I) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu
Leu(L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys(K) Arg; Gln; Asn Arg
Met(M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe(F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr; Phe Tyr
Tyr(Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val(V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Leu
항-CLDN18.2 인간화 항체본 발명은 항-CLDN18.2 인간화 항체(이하, CLDN18.2 항체로 약칭됨)를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 CLDN18.2에 대한 높은 특이성 및 높은 친화도를 갖는 인간화 항체를 제공하며, 이는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열을 포함한다.
1986년 Jones 등은 최초로 마우스 단일클론 항체 중쇄 CDR을 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역에 이식한 후, 마우스 단일클론 항체 경쇄와 완전한 항체로 조립하여 원래 마우스 단일클론 항체와 유사한 친화도를 유지함으로써 항체 인간화 기술 발전에 아이디어를 제공하였다. 1989년 Queen 등은 CDR 이식 방법을 통해 항-CD25 인간화 항체를 성공적으로 구축하였는데, 이 방법은 인간 항체 프레임워크 영역을 사용하여 인간화를 수행하고, 프레임워크 영역의 일부 부위에 마우스 유래 항체 아미노산을 보류하여 친화도를 유지하였다. 1992년 Presta 등은 인간 항체 하위 그룹의 공통 서열(consensus sequence)을 주형으로 사용하여 CDR 이식을 수행함으로써 인간화를 성공적으로 구축하는 방법을 보고하였다. 1994년 Pedersen 등은 표면 재포장(resurfacing) 방법으로 항체를 인간화하는 방법을 보고하였다. 1994년 Hsiao 등은 인간 항체 생식계열(Germline) 서열의 프레임워크 영역을 이용하여 CDR 이식을 수행하는 인간화 방법을 보고하였다. 1994년 Jespers 등은 파지 라이브러리(shuffling library) 방법을 사용하여 인간화 방법을 성공적으로 구축하였다.
항체 인간화에는 일반적으로 인간 프레임워크 영역에 대한 두 가지 선택이 있는데, 그 중 하나는 알려진 성숙한 항체이고, 다른 하나는 인간 생식계열 서열이다. 알려진 성숙한 항체 프레임워크 영역은 일반적으로 잠재적인 면역원성을 가져올 수 있는 체세포 돌연변이 부위를 포함한다. 이미 성숙한 항체와 비교하여, 인간 생식계열 서열의 프레임워크 영역은 이론적으로 면역원성이 더 낮고 구조가 더 유연하며 가소성이 강하고 다양한 CDR 영역을 쉽게 수용할 수 있다. 인체에서 인간 항체 생식계열 유전자의 사용 빈도는 일정한 편향성을 갖고 있는데, 사용 빈도가 높은 생식계열의 프레임워크 영역에서 선택된 인간화 항체는 면역원성이 낮고, 발현량이 높으며, 구조적 안정성 등의 장점을 갖는다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 인간화 시 마우스 유래 항체와 유사도가 가장 높은 생식계열 서열을 선택하지 않고, 대신 유사성과 인체 사용 빈도를 함께 고려하여 다량의 실험적 스크리닝을 거쳐, 바람직한 서열의 프레임워크 영역을 선택하여 인간화를 수행한다. 인간 항체 생식계열 프레임워크 영역을 선택하여 CDR 이식을 수행함으로써, 이렇게 구축된 인간화 항체는 구조가 더욱 안정적이고, 발현량이 높으며, 면역원성이 낮고, 약물 기량성이 더 높다.
다른 바람직한 예에서, 상기 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역은 인간화 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 인간화 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2 등의 중쇄 불변 영역 또는 인간 Kappa, Lambda 경쇄 불변 영역이다.
다른 바람직한 예에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 서열을 첨가, 결실, 변형 및/또는 치환하여 형성된 서열은 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
본 발명의 항체는 이중사슬 또는 단일사슬 항체일 수 있으며, 바람직하게는 완전 인간화 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 유도체는 단일사슬 항체, 및/또는 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab',(Fab')2 또는 당업계에 공지된 다른 알려진 항체 유도체 등, 및 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM항체 또는 다른 아형 항체 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 항체는 CLDN18.2를 표적으로 하는 인간화 항체, CDR 이식 및/또는 변형 항체일 수 있다.
본 발명의 상기 내용에서, 상기 첨가, 결실, 변형 및/또는 치환된 아미노산의 수는 바람직하게는 초기 아미노산 서열의 전체 아미노산 수의 40% 이하, 보다 바람직하게는 35% 이하, 보다 바람직하게는 1~33%, 보다 바람직하게는 5~30%, 보다 바람직하게는 10~25%, 보다 바람직하게는 15~20%이다.
항체의 제조
단일클론 항체를 생성하는 데 적합한 임의의 방법 모두 본 발명의 CLDN18.2 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 연결되거나 자연적으로 존재하는 CLDN18.2 단백질 또는 이의 단편을 사용하여 동물을 면역화할 수 있다. 보조제, 면역 자극제, 반복 강화 면역 접종을 포함하는 적합한 면역 접종 방법을 사용할 수 있으며, 하나 이상의 경로를 사용할 수 있다.
임의의 적합한 형태의 CLDN18.2는 모두 CLDN18.2에 특이적인 비인간 항체를 생성하고, 상기 항체의 생물학적 활성을 스크리닝하기 위한 면역원(항원)으로 사용될 수 있다. 면역원은 단독으로 사용되거나 당업계에 알려진 하나 이상의 면역원성 강화제와 조합하여 사용될 수 있다. 면역원은 천연 유래로부터 정제되거나 유전자 변형 세포에서 생성될 수 있다. 면역원을 코딩하는 DNA는 그 유래가 게놈 또는 비게놈(예를 들어, cDNA)일 수 있다. 면역원을 코딩하는 DNA는 적합한 유전 벡터를 사용하여 발현될 수 있으며, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 플라스미드 및 비-바이러스 벡터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
인간화 항체는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE를 포함한 모든 유형의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 임의의 유형의 경쇄는 모두 본 명세서의 화합물 및 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, κ, λ 사슬 또는 이들의 변이체가 본 발명의 화합물 및 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편의 DNA 분자 서열은 PCR 증폭 또는 게놈 라이브러리 스크리닝 방법 등과 같은 통상적인 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 이 밖에, 경쇄 및 중쇄의 코딩 서열은 함께 융합되어 단일사슬 항체를 형성할 수도 있다.
일단 관련 서열이 얻어지면, 재조합 방법을 이용하여 관련 서열을 대량으로 얻을 수 있다. 이는 일반적으로 이를 벡터로 클로닝한 후 세포로 전이시키고, 그런 다음 통상적인 방법을 통해 증식된 숙주 세포로부터 관련 서열을 분리함으로써 수행된다.
이 밖에, 특히 단편 길이가 짧은 경우 인공 합성 방법을 사용하여 관련 서열을 합성할 수도 있다. 일반적으로, 먼저 복수의 작은 단편을 합성한 후 이를 연결하여 긴 서열의 단편을 얻을 수 있다. 그런 다음 이러한 DNA 서열을 당업계에 알려진 다양한 기존 DNA 분자(또는 벡터) 및 세포에 도입할 수 있다.
용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 의미한다. 핵산 분자는 단일사슬 또는 이중사슬일 수 있지만, 바람직하게는 이중사슬 DNA이다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 "효과적으로 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 프로모터 또는 인핸서는 상기 코딩 서열에 효과적으로 연결된다.
용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 일 실시형태에서, 벡터는"플라스미드"이고, 이는 다른 DNA 세그먼트가 연결될 수 있는 고리형 이중사슬 DNA 고리를 의미한다.
본 발명은 또한 상기 적절한 DNA 서열 및 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 적절한 숙주 세포를 형질전환시켜 단백질 발현을 가능하게 할 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 식물 또는 동물 세포(예: 포유동물 세포)와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 DNA로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 얻어진 형질전환체는 통상적인 방법으로 배양될 수 있으며, 형질전환체는 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 사용된 숙주 세포에 따라 통상적인 배지를 사용하여 적합한 조건에서 배양한다.
일반적으로, 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 항체 발현에 적합한 조건에서 배양된다. 그런 다음 통상적인 면역글로불린 정제 단계, 예를 들어 단백질 A-Sepharose, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 등 통상적인 분리 정제 수단을 통해 본 발명의 항체를 정제할 수 있다.
얻어진 단일클론 항체는 통상적인 수단으로 동정할 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역 침전 또는 시험관 내 결합 시험(예: 방사 면역 측정(RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 측정(ELISA))을 통해 측정할 수 있다.
항체 제제
항체는 다양한 제제 완충액에서 다양한 안정성을 가지며, 이는 전하 이질성 변화, 항체 분자의 분해 및 응집 등으로 나타나는데, 이러한 질량 특성의 변화는 항체 자체의 물리 화학적 특성과 관련되므로, 항체 약물 개발 과정에서는 다양한 항체의 물리 화학적 특성에 따라 항체 자체에 적합한 제제 완충액을 스크리닝해야 한다. 현재 일반적으로 사용되는 항체 제제 완충 시스템으로는 임산염 완충액, 시트르산 완충액, 히스티딘 완충액 등이 있으며, 동시에 항체의 특성에 따라 다양한 농도의 염이온이나 소르비톨, 트레할로스, 수크로스 등의 부형제를 첨가하고, 항체의 안정성을 유지하기 위해 트윈과 같은 계면활성제도 적당량 첨가한다.
약학적 조성물
본 발명은 또한 조성물을 제공한다. 바람직한 예에서, 상기 조성물은 전술한 항체 또는 이의 활성 단편 또는 이의 융합 단백질 또는 이의 ADC 또는 상응하는 CAR-T 세포, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학적 조성물이다. 일반적으로, 이러한 물질은 비독성, 불활성 및 약학적으로 허용 가능한 수성 담체 매질에 제제화될 수 있으며, 여기서 pH는 일반적으로 약 5~8이고, 바람직하게는 pH는 약 6~8이며, pH값은 제제화되는 물질의 특성과 치료할 병증에 따라 변할 수 있다. 제제화된 약학적 조성물은 종양내, 복강내, 정맥내 또는 국소 투여를 포함하지만 이에 한정되지 않는 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 뉴클레오티드 서열로부터 세포 내에서 발현되어 세포 치료에 사용될 수 있는 바, 예를 들어, 상기 항체는 키메라 항원 수용체 T 세포 면역 치료(CAR-T) 등에 사용된다.
본 발명의 약학적 조성물은 CLDN18.2 단백질 분자에 직접 결합할 수 있어, CLDN18.2 관련 질병의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 이 밖에, 다른 치료제를 동시에 사용할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따른 단일클론 항체(또는 이의 접합체) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 안전하고 유효한 양(예: 0.001~99wt%, 바람직하게는 0.01~90wt%, 보다 바람직하게는 0.1~80wt%)으로 함유한다. 이러한 담체에는 식염수, 완충액, 포도당, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합이 포함되지만 이에 포함되지는 않는다. 약물 제제는 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제 형태로 제조될 수 있는 바, 예를 들어 생리식염수나 포도당 및 기타 보조제를 함유한 수용액을 사용하여 통상적인 방법으로 제조한다. 주사제, 용액과 같은 약학적 조성물은 멸균 조건에서 제조되는 것이 바람직하다. 활성 성분은 치료 유효량, 예를 들어 1일당 약 1마이크로그램/kg 체중~약 5mg/kg 체중으로 투여된다. 이 밖에, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 치료제와 함께 사용될 수도 있다.
약학적 조성물 사용 시, 안전하고 유효한 양의 약학적 조성물을 포유동물에게 투여하는데, 여기서 상기 안전하고 유효한 양은 일반적으로 적어도 약 10마이크로그램/kg 체중, 대부분의 경우 약 50mg/kg 체중 이하이며, 바람직하게는 상기 용량은 약 10마이크로그램/kg 체중~약 20mg/kg 체중이다. 물론, 구체적인 용량은 투여 경로, 환자의 건강 상태와 같은 요인도 고려해야 하며, 이러한 요인들은 모두 숙련된 의사의 기술 범위 내에 있다.
검출 용도 및 키트
본 발명의 항체는 샘플을 검출하여 진단 정보를 제공하는 것과 같은 검출 적용에 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 샘플(시료)에는 세포, 조직 샘플 및 생검 시료가 포함된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "생검"은 당업자에게 알려진 모든 유형의 생검을 포함해야 한다. 따라서 본 발명에서 사용되는 생검은 예를 들어 내시경 방법 또는 기관의 천자 또는 바늘 생검에 의해 제조된 조직 샘플을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 샘플은 고정되거나 보존된 조직 샘플을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체(또는 이의 단편)를 포함하는 키트를 제공하며, 본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 키트는 용기, 사용 설명서, 완충액 등을 더 포함한다. 바람직한 예에서, 본 발명의 항체는 검출판에 고정될 수 있다.
본 발명의 주요 이점은 다음과 같다.
1. 본 발명의 항체는 대표적인 트립토판, 티로신 포매가 우수한 구조를 가지며, 스크리닝된 인간 VH, VL 프레임워크 영역 주형 구조는 안정하고, 마우스 단일클론 항체-CDR 영역과의 적응성이 우수하며, 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 잘 페어링될 수 있고, 친화도가 높으며, 구조가 안정적이다.
2. 키메라 항체와 비교하여, 본 발명의 인간화 항체는 우수한 생물학적 활성 및 특이성을 가지며, CLDN18.2와 동등한 친화도를 유지하면서 더 낮은 면역원성 및 더 높은 발현량을 갖는다.
3. 본 발명의 인간화 항체는 유의미한 시험관 내 생물학적 활성을 가져 시험관 내에서 배양된 종양 세포의 증식 활성을 효과적으로 억제할 수 있으며, 활성은 대조 항체보다 우수하다.
4. 본 발명의 인간화 항체는 유의미한 생체 내 생물학적 활성을 가져 인간 위암 세포 등 종양 세포에 대해 우수한 억제 활성을 가지며, 활성은 대조 항체보다 우수하다.
이하, 구체적인 실시예와 결합하여 본 발명을 추가로 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니라는 점을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체적인 조건이 명시되지 않은 실험 방법은 일반적으로 Sambrook 등, 분자 클론: 실험실 메뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기술된 조건과 같은 일반적인 조건을 따르거나 제조업체가 권장하는 조건을 따른다. 달리 명시하지 않는 한, 백분율과 부는 중량% 및 중량부이다.
특별한 설명이 없는 한, 본 발명의 실시예에서 사용되는 재료 및 시약은 모두 시판되는 제품이다.
재료 및 방법
1. 참조 항체
본 발명의 실험에 사용된 참조 항체의 서열은 특허 US8168427의 175D10 클론의 항체 서열로부터 유래된다. 175D10 항체는 IMAB362로도 불리운다. 175D10 항체의 가변 영역 서열에 대해 전체 유전자 합성을 수행하여 IgG1 키메라 항체 불변 영역을 포함하는 진핵 발현 벡터에 구축하고, 발현 및 정제를 수행하였다. 제조된 해당 참조 항체는 본 발명에서 Ref.ch175로 약칭된다.
참조 항체 Ref.ch175(또는 IMAB362)는 CLDN18.2의 세포외 루프 1 부분을 특이적으로 인식하고, CLDN18.1에 결합하지 않으며, 주로 항체 의존성 세포에 의해 매개되는 세포 독성 작용(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 및 보체 의존성 세포 독성 작용(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 통해 종양 세포를 사멸한다.
실시예 1: CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 세포주의 구축
본 실시예에서는 인간 CLDN18.1, 인간 CLDN18.2, 마우스 CLDN18.1, 마우스 CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 세포주를 구축하였다. 그 방법은 다음과 같다.
전체 유전자 합성법으로 인간 CLDN18.1(NP_057453.1), 인간 CLDN18.2(NP_001002026.1)의 전장 유전자 단편을 코딩하고, 전장 단편을 Xhol+BamHI로 분해하여 각각 pEGFP-N2 진핵 발현 벡터(Clontech사에서 구입)에 클로닝하였으며, 각각 pEGFP-N2-hCLDN18.1 및 pEGFP-N2-hCLDN18.2로 명명하였다.
HEK293 세포(중국과학원 세포 은행, GNHu43에서 구입)를 4Х105개/웰로 6웰 플레이트에 접종하고, 다음날, 리포펙타민 형질감염 시약 LipoMax를 사용하여 pEGFP-N2-hCLDN18.1, pEGFP-N2-hCLDN18.2를 각각 HEK293 세포에 형질감염시키고, 형질감염 24h 후, 1:10의 비율로 세포를 계대배양하였으며, 세포가 벽에 부착된 후 G418(Gibco에서 구입)을 최종 농도 300μg/ml로 첨가하여 압력 스크리닝을 수행하고, 서브 클로닝을 거쳐 인간 CLDN18.1, 인간 CLDN18.2 막 단백질을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 얻었으며, 각각 HEK293-hCLDN18.1 및 HEK293-hCLDN18.2로 명명하였다.
전체 유전자 합성법으로 마우스 CLDN18.1(NP_062789.1), 마우스 CLDN18.2(NP_001181850.1)의 전장 유전자 단편을 코딩하고, KpnI+XbaI로 분해하여 pcDNA3.1-P2A-EGFP 진핵 발현 벡터(Nanjing GenScript Company에서 구입)에 클로닝하였으며, 각각 pcDNA3.1-mCLDN18.1 및 pcDNA3.1-mCLDN18.1로 명명하였다. 상기와 동일한 방법으로 HEK293 세포를 형질감염시켜 마우스 CLDN18.1 및 CLDN18.2 막 단백질을 안정적으로 발현하는 세포를 얻었으며, 각각 HEK293-mCLDN18.1 및 HEK293-mCLDN18.2로 명명하였다.
>NP_057453.1 claudin-18 isoform 1 precursor [Homo sapiens]SEQ ID No: 25
MSTTTCQVVAFLLSILGLAGCIAATGMDMWSTQDLYDNPVTSVFQYEGLWRSCVRQSSGFTECRPYFTILGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV
>NP_001002026.1 claudin-18 isoform 2 [Homo sapiens]SEQ ID No: 26
MAVTACQGLGFVVSLIGIAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFANMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV
>NP_062789.1 claudin-18 isoform A1.1 precursor [Mus musculus]SEQ ID No: 27
MATTTCQVVGLLLSLLGLAGCIAATGMDMWSTQDLYDNPVTAVFQYEGLWRSCVQQSSGFTECRPYFTILGLPAMLQAVRALMIVGIVLGVIGILVSIFALKCIRIGSMDDSAKAKMTLTSGILFIISGICAIIGVSVFANMLVTNFWMSTANMYSGMGGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLTPDDSNFKAVSYHASGQNVAYRPGGFKASTGFGSNTRNKKIYDGGARTEDDEQSHPTKYDYV
>NP_001181850.1 claudin-18 isoform A2.1 [Mus musculus]SEQ ID No: 28
MSVTACQGLGFVVSLIGFAGIIAATCMDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAVRALMIVGIVLGVIGILVSIFALKCIRIGSMDDSAKAKMTLTSGILFIISGICAIIGVSVFANMLVTNFWMSTANMYSGMGGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLTPDDSNFKAVSYHASGQNVAYRPGGFKASTGFGSNTRNKKIYDGGARTEDDEQSHPTKYDYV
실시예 2: 면역원의 제조
인간 CLDN18.2 세포외 루프 1(CLDN18.2 ECL1)의 아미노산 서열은 마우스 CLDN18.2 ECL1의 아미노산 서열과 완전히 일치하므로, CLDN18.2 ECL1에 결합하는 항체는 얻기가 어렵다. 동시에 종양 세포 표면의 CLDN18.2 분자 형태가 정상 조직 세포 표면의 분자 형태와 다를 수 있다는 점을 고려하여, 본 실시예에서는 높은 친화도로 종양 세포를 인식하는 항체를 얻기 위해 다양한 형태의 DNA 플라스미드를 면역 내수성을 타파하는 항원으로 설계하였다.
인간 CLDN18.2 ECL1 및 CLDN18.2의 전장 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 각각 파상풍 톡소이드의 P2 에피토프 TT830-844, P30 에피토프 TT947-967과 직렬 연결시켜 진핵 발현 벡터 PTT5(Invitrogen사에서 구입)에 클로닝하고, 각각 PTT5-TT-hCLDN18.2, PTT5-TT-hCLDN18.2-ECL1로 명명하였다.
본 발명은 CLDN18.2 ECL1을 인간 IgG1 Fc-C-말단에 융합시키고, 이를 hFc-CLDN18.2-ECL1로 명명하였다.
TT-hCLDN18.2 뉴클레오티드 서열: 서열번호 29
CAGTACATCAAGGCCAACAGCAAGTTCATCGGCATCACCGAGCTGAAGAAGCTGGGTGGTTCCAACGACATATTCAACAACTTCACCGTGAGCTTCTGGCTGCGCGTGCCGAAGGTGAGCGCCAGCCACCTGGAGCAGTACGGTGGCGGTAGCGGAatggccgtgactgcctgtcagggcttggggttcgtggtttcactgattgggattgcgggcatcattgctgccacctgcatggaccagtggagcacccaagacttgtacaacaaccccgtaacagctgttttcaactaccaggggctgtggcgctcctgtgtccgagagagctctggcttcaccgagtgccggggctacttcaccctgctggggctgccagccatgctgcaggcagtgcgagccctgatgatcgtaggcatcgtcctgggtgccattggcctcctggtatccatctttgccctgaaatgcatccgcattggcagcatggaggactctgccaaagccaacatgacactgacctccgggatcatgttcattgtctcaggtctttgtgcaattgctggagtgtctgtgtttgccaacatgctggtgactaacttctggatgtccacagctaacatgtacaccggcatgggtgggatggtgcagactgttcagaccaggtacacatttggtgcggctctgttcgtgggctgggtcgctggaggcctcacactaattgggggtgtgatgatgtgcatcgcctgccggggcctggcaccagaagaaaccaactacaaagccgtttcttatcatgcctcaggccacagtgttgcctacaagcctggaggcttcaaggccagcactggctttgggtccaacaccaaaaacaagaagatatacgatggaggtgcccgcacagaggacgaggtacaatcttatccttccaagcacgactatgtgtaa
TT-hCLDN18.2-ECL1뉴클레오티드 서열: 서열번호 30
CAGTACATCAAGGCCAACAGCAAGTTCATCGGCATCACCGAGCTGAAGAAGCTGGGTGGTTCCAACGACATATTCAACAACTTCACCGTGAGCTTCTGGCTGCGCGTGCCGAAGGTGAGCGCCAGCCACCTGGAGCAGTACGGTGGCGGTAGCGGACgcatggaccagtggagcacccaagacttgtacaacaaccccgtaacagctgttttcaactaccaggggctgtggcgctcctgtgtccgagagagctctggcttcaccgagtgccggggctacttcaccctgctggggctgccagccatgctgcaggcagtgcgagccTAA
hFc-CLDN18.2-ECL1 뉴클레오티드 서열: 서열번호 31
GACAAGACCCACACATGCCCACCTTGTCCAGCTCCAGAGCTGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATCTCTAGGACCCCCGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTATCGGGTGGTGTCTGTGCTGACAGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGCCCTGCCTGCTCCAATCGAGAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCTCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCTTCTGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCAGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCTCTTTCTTTCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTTTCCTGTAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCATTACACACAGAAGTCTCTGTCCCTGAGCCCTGGCAAGGGATCCGGAGGAGGCTCTGGAGGCTCCGACCAGTGGAGCACCCAGGATCTGTACAACAATCCCGTGACAGCCGTGTTCAACTATCAGGGCCTGTGGAGGTCTTGCGTGCGGGAGTCCAGCGGCTTCACCGAGTGTAGAGGCTACTTTACACTGCTGGGACTGCCTGCTATGCTGCAGGCTGTGCGCTGA
실시예 3: 항-인간 CLDN18.2 하이브리도마 세포주의 제조
실험용 Balb/c 마우스는 Shanghai Sipur-Bikke Laboratory에서 구입하고, 면역용 마우스는 모두 4~6주령의 암컷이며, 표준화되고 질병이 없으며, 건강한 순종 마우스이다.
CLDN18.2는 4-패스 막관통 단백질이므로, 높은 친화도로 종양 세포를 인식하는 특이적 항체를 얻기 위해, 마우스 면역화는 다양한 플라스미드 교대 면역화를 통해 이루어지고, 인간 CLDN18.2 막 단백질을 발현하도록 안정적으로 형질감염된 세포를 사용하여 충격 면역화를 수행하였다. 그 방법은 다음과 같다.
1일째 및 14일째: 인간 CLDN18.2의 전장 유전자를 코딩하는 50μg의 진핵 발현 벡터 플라스미드 pEGFP-N2-hCLDN18.2를 마우스 대퇴사두근(i.m)에 주사하고, 보조제는 In vivo-Jet PEI-Man 생체 내 형질감염 시약(Polyplus에서 구입, 203-10G)이다. 28일째에 50μg의 진핵 발현플라스미드 hFc-CLDN18.2-ECL1 DNA를 마우스 대퇴사두근(i.m)에 주사하고; 42일째에 50μg의 진핵 발현 벡터 플라스미드 PTT5-TT-hCLDN18.2를 마우스 대퇴사두근(i.m)에 주사하였으며; 56일째에 50μg의 진핵 발현 벡터 플라스미드 PTT5-TT-CLDN18.2 ECL1을 마우스 대퇴사두근(i.m)에 주사하고; 70일째에 50μg의 진핵 발현 벡터 플라스미드 PTT5-TT-hCLDN18.2 및 50μg의 진핵 발현 벡터 플라스미드 PTT5-TT-CLDN18.2 ECL1을 마우스 대퇴사두근(i.m)에 주사하였다.
14일 후, 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하고, cell based-elisa 방법을 사용하여 혈청 항체 역가를 측정하였으며, 융합 3일 전에 2Х107개의 HEK293-hCLDN18.2 세포/마우스를 사용하여 항체 역가가 가장 높은 2마리 마우스의 복강내에 주사하여 면역을 강화하였다. 융합 당일, 마우스 안구에서 혈액을 채취하고 비장을 적출하여 단일 세포 현탁액을 제조한 후, SP20 세포와 전기 융합하여 하이브리도마 플레이팅을 얻었다.
면역화 시간 면역원 및 용량 면역화 방식
1 pEGFP-N2-hCLDN18.2, 50μg/마리 i.m, In vivo-Jet PEI-Man 생체 내 형질감염 시약
14 pEGFP-N2-hCLDN18.2, 50μg/마리 i.m, In vivo-Jet PEI-Man 생체 내 형질감염 시약
28 hFc-CLDN18.2-ECL1, 50μg/마리 i.m, In vivo-Jet PEI-Man 생체 내 형질감염 시약
42 PTT5-TT-hCLDN18.2, 50μg/마리 i.m, In vivo-Jet PEI-Man 생체 내 형질감염 시약
56 PTT5-TT-CLDN18.2 ECL1, 50μg/마리 i.m, In vivo-Jet PEI-Man 생체 내 형질감염 시약
70 PTT5-TT-hCLDN18.2, 50μg/마리PTT5-TT-CLDN18.2 ECL1, 50μg/마리 i.m, In vivo-Jet PEI-Man 생체 내 형질감염 시약
84 HEK293-hCLDN18.2, 2Х107개/마리 복강내 주사
실시예 4: 인간 CLDN18.2에는 특이적으로 결합하지만 인간 CLDN18.1에는 결합하지 않는 하이브리도마 세포의 스크리닝
본 실시예에서는 cell based-ELISA 방법을 사용하여 인간 CLDN18.2에는 특이적으로 결합하지만 인간 CLDN18.1에는 결합하지 않는 하이브리도마 세포에 대해 하이브리드도마 스크리닝을 수행하였다. 그 방법은 다음과 같다.
HEK293-hCLDN18.1 세포 및 HEK293-hCLDN18.2 세포를 트립신으로 소화 후, 3Х105개/mL의 세포 밀도로 폴리라이신(P4707, Sigma) 코팅된 96웰 플레이트에 200μL/웰로 각각 접종하여 밤새 배양하고; 세포의 컨플루언시가 90% 이상에 도달하면, 상청액을 제거하고, 10% 중성 포르말린 용액을 사용하여 실온에서 15min 동안 고정하였으며; PBS로 3회 세척한 후, 5% 탈지유로 4℃에서 밤새 차단하였다. 하이브리도마 검출 시 동일한 웰의 상청액을 HEK293-hCLDN18.1 세포 및 HEK293-hCLDN18.2 세포 코팅 플레이트에 각각 첨가하고, 상청액 80μl/웰을 첨가한 후, 37℃에서 1h 동안 인큐베이션하고, PBST로 3회 세척한 후, 1:5000으로 희석된 염소 항-마우스 IgG(H+L)-HRP 100μl/웰을 첨가하고, 37℃에서 45min 동안 인큐베이션하고, 30min 동안 발색한 후, 2M H2SO4 50μl/웰을 첨가하여 발색을 멈추고, 마이크로플레이트 리더로 OD450을 판독하였다.
수만 개의 클론을 스크리닝한 후, 최종적으로 여러 균주의 hCLDN18.2 특이적 항체를 얻었으며, 가장 우수한 4개 균주를 하기 표에 나타내었다.
클론 번호 HEK293-hCLDN18.2에 대한 OD450의 비율 HEK293-hCLDN 18.1에 대한 OD450의 비율 특이성
(OD450의 비율)
mab429 2.8678 0.3777 7.59
mab623 1.4839 0.2647 5.61
mab624 2.3512 0.1538 15.29
mab782 2.7024 0.1692 15.97
실시예 5: 마우스 단일클론 항체 아형의 검출
아형 검출 키트(SBA Clonotyping System-HRP kit, southernbiotech에서 구입, 5300-05)를 사용하여 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 클론 균주의 아형을 검출하였다.
검출 결과는 다음과 같다.
클론 번호 중쇄 아형 경쇄 아형
mab429 IgM Kappa
mab623 IgM Kappa
mab624 IgG2b Kappa
mab782 IgG2a Kappa
실시예 6: 항-인간 CLDN18.2마우스 유래 단일클론 항체의 가변 영역 코딩 서열의 클로닝 및 동정
스크리닝된 마우스 단일클론 항체에는 IgM 아형 항체가 존재하므로, 그 활성을 추가로 평가하기 위해 RACE-PCR 방법을 사용하여 마우스 단일클론 항체 가변 영역 서열을 얻고, 키메라 항체를 구축하였다.
RNA 추출 키트인 TakaRa MiniBEST Universal RNA Extration Kit(Takara, 9767)를 사용하여 실시예 4에서 얻은 전체 하이브리도마 mRNA를 추출하고, SMARTer RACE 5'/3' Kit(Clontech, 634858)를 사용하여 PCR을 통해 마우스 유래 항체 가변 영역 서열을 얻었으며, 결과는 다음과 같다.
624 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열(서열번호 23):
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARTSYGNSFAYWGQGTLVTVSA
624 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열(서열번호 24):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK
782 항체 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열(서열번호 2):
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGACCTGGTGAAACCTTCTCAGTCACTTTCACTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATAGCTGGCACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATACACTACAGTGATAACACGAACTACAGCCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGGATCTACTATGGTAACTCGTTTGTTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
782 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열(서열번호 1):
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSDNTNYSPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARIYYGNSFVYWGQGTLVTVSA
782 항체 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열(서열번호 7):
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATTTTTATCCGTACACGTTCGGGGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
782 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열(서열번호 6):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYFYPYTFGGGTKLEIK
실시예 7: 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 구축 및 발현
상동 재조합 방법 프라이머 설계 원칙에 따라 프라이머를 설계하고, 실시예 6에서 얻은 마우스 유래 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편을 증폭시켜 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열에 각각 연결하고, 발현 벡터 PTT5(Invitrogen사에서 구입)에 구축하였다.
상용 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드를 추출하고, PEI 형질감염 방법을 사용하여 293FV 현탁 세포를 형질감염시켰으며, 형질감염 7일 후, 상청액을 수집하고, ProteinA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 키메라 항체를 얻었다.
실시예 8: 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 특이성 분석
인간 CLDN18.2로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포 및 인간 CLDN18.1로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포를 각각 트립신으로 소화 후, 5Х105개의 세포/100μl에 하이브리도마 상청액 100μl를 첨가하여 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하고, FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 1:400으로 희석된 염소 항-마우스 IgG-PE 2차 항체를 첨가하여 얼음 위에서 45min 동안 인큐베이션하고, FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 300μl의 로딩 완충액을 첨가하고, BD 유동 튜브로 옮긴 후, BD FACS calibur로 분석하였다. Flowjo 소프트웨어를 사용하여 평균 형광 강도 MFI(MedianFluorescence Intensity)를 분석하였다.
결과를 도 2 및 하기 표에 나타내었다.
항체 번호 HEK293-hCLDN18.2 HEK293-hCLDN 18.1 P/N
ch429 1219 2.26 539.4
ch623 235 2.05 114.6
ch624 1420 2.27 625.6
ch782 4179 2.86 1461.2
Ref.ch175 2618 2.48 1055.6
참고: P/N은 HEK293-hCLDN18.2 세포에 결합하는 항체의 MFI를 HEK293-hCLDN18.1 세포에 결합하는 항체의 MFI로 나눈 값으로, 특이성을 표현하는 데 사용된다.
결과는 ch429, ch623, ch624, ch782가 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하지만, 인간 CLDN18.1에는 결합하지 않음을 보여준다. 그 중 키메라 항체 ch782의 MFI는 참조 항체 Ref.ch175의 MFI보다 높다.
실시예 9: 재조합 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 결합 활성 검출
HEK293-hCLDN18.1 및 HEK293-hCLDN18.2 세포를 트립신 소화 후 일정한 세포 밀도로 폴리라이신(P4707, Sigma) 코팅된 96웰 플레이트에 접종하여 밤새 배양하고; 세포의 컨플루언시가 90% 이상에 도달하면, 상청액을 제거하고, 10% 포르말린 용액을 사용하여 실온에서 15min 동안 고정하였으며; PBS로 1회 세척한 후, 5% 탈지유로 4℃에서 밤새 차단하여 준비해 두었다. 후보 키메라 항체 및 참조 항체 Ref.ch175를 1μg/ml부터 시작하여 10 구배로 3배 희석하고, 100μl/웰을 세포 코팅된 96웰 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBST로 플레이트를 3회 세척하고, 1:2000으로 희석된 마우스 항-인간 IgG Fc-HRP를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBST로 플레이트를 3회 세척하고, TMB 발색 용액으로 15분 동안 발색한 후, 2M H2SO4로 종료하였다. OD450-OD630값을 판독하고, GraphPad Prism 8 소프트웨어로 피팅하고 그래프를 작성하여 EC50을 계산하였다. 결과를 도 3에 나타내었는데, 이는 ch429, ch623, ch624, ch782 및 참조 항체 Ref.ch175는 모두 HEK293-hCLDN18.1 세포에는 결합하지 않지만 HEK293-HCLDN18.2 세포에는 특이적으로 결합하는 것을 보여주며, 또한 발명자들은 참조 항체 Ref.ch175에 대한 ch429 및 ch782의 상대적 활성은 각각 257.5% 및 179.9%임을 발견하였다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
항체 번호 EC50(ng/ml) 상대적 결합 활성
ch429 12.06 257.5%
ch623 91.81 33.8%
ch624 39.17 79.3%
ch782 17.26 179.9%
Ref.ch175 31.05 100.0%
실시예 10: NUGC4 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 결합 활성 검출
실시예 9와 동일한 방법으로 NUGC4 세포(Nanjing Kebai Biotechnology Co., Ltd.에서 구입)를 96웰 플레이트에 도말하고, 후보 키메라 항체 및 참조 항체 Ref.ch175를 100μg/ml부터 시작하여 10 구배로 3배 희석하고, 100μl/웰을 세포 코팅된 96웰 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBST로 플레이트를 3회 세척하고, 1:2000으로 희석된 마우스 항-인간 IgG Fc-HRP를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBST로 플레이트를 3회 세척하고, TMB 발색 용액으로 15분 동안 발색한 후, 2M H2SO4로 종료하였다. OD450-OD630값을 판독하고, GraphPad Prism 8 소프트웨어로 피팅하고 그래프를 작성하여 EC50을 계산하였다.
결과를 도 4 및 하기 표에 나타내었다.
항체 번호 EC50(μg/ml)
ch429 5.25
ch623 -
ch624 -
ch782 0.57
Ref.ch175 -
키메라 항체 ch782 및 ch429의 EC50은 각각 0.57μg/ml 및 5.25μg/ml이고, 고농도에서 ch782의 판독값(OD450=2.3)은 발견된 ch429의 판독값(OD450=1.2)보다 높았지만, ch623, ch624 및 참조 항체 Ref.ch175는 모두 EC50을 계산할 수 없었다.
이는 ch782 항체가 인간 CLDN18.2 단백질을 내인성으로 발현하는 NUGC4 세포에 대한 결합 활성이 가장 우수함을 보여주며, 이는 참조 항체 Ref.ch175보다 훨씬 강하다.
실시예 11: HEK293-hCLDN18.2 세포에 대한 항-CLDN18.2 인간-마우스 키메라 항체의 결합 활성 검출
실시예 8의 방법에 따라 키메라 항체 ch429, ch624, ch782, Ref.ch175를 10μg/ml 농도부터 시작하여 3배 구배 희석을 수행하고, 유세포 분석 실험을 수행하였다. MFI를 종좌표로 하고 GraphPad Prism 8 소프트웨어로 피팅하고 그래프를 작성하여 EC50을 계산하였다.
결과를 도 5 및 하기 표에 나타내었다.
항체 번호 EC50(μg/ml)
ch429 0.52
ch624 -
ch782 0.81
Ref.ch175 0.85
본 발명의 키메라 항체 ch429, ch782 및 참조 항체 Ref.ch175는 모두 HEK293-hCLDN18.2 세포에 결합할 수 있으며, EC50은 각각 0.52μg/ml, 0.81μg/ml, 0.85μg/ml이지만, ch624의 결합 활성이 분명히 약하였다.
이 밖에, 고농도에서 HEK293-hCLDN18.2 세포에 결합하는 ch782의 MFI는 Ref.ch175의 MFI보다 높았다.
실시예 12: 리포터 유전자 방법을 통한 HEK293-hCLDN18.2 세포에 대한 항-CLDN18.2 항체 인간-마우스 키메라 항체의 ADCC 활성 검출
항체의 FC-말단에 의해 매개되는 ADCC 효과는 항체의 항종양 활성을 평가하는 중요한 지표이다. ADCC는 항체 의존성 세포에 의해 매개되는 세포 독성 작용으로, 그 작용 메커니즘은 항체가 종양 표면 항원에 결합한 후, 항체의 Fc 영역은 면역 이펙터 세포 수용체에 결합하며, 주로 NK 세포의 Fc 수용체에 의한 표적 인식을 통해 종양 세포를 직접 용해하고 사멸시킨다.
본 실시예에서는 리포터 유전자 방법을 사용하여 항체 ADCC의 생물학적 활성을 검출하고, FcγRIIIa 수용체를 안정적으로 발현하는 조작된 Jurkat 세포를 이펙터 세포로 선택하였으며, Bio-GloTM Luciferase Assay System 키트를 사용하여 루시퍼라제 화학 발광 신호를 검출하고, NFAT 신호 전달 경로의 활성화를 측정하여 항체 Fc 이펙터 기능을 정량적으로 검출하였다.
실시예 1에서 구축한 HEK293-hCLDN18.2 세포를 소화 후 2.5Х105/ml로 희석하고, 그런 다음 100μl/웰을 흰색 불투명 세포 배양 플레이트에 도말하고, 37℃에서 24h 동안 정치 배양한 후, 상청액을 버리고, 0.1% BSA를 함유한 분석 배지 25μl/웰을 첨가한 후; Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa 세포를 6Х106 개/mL로 희석하고, 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰에 25 μl의 Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa 세포 현탁액을 첨가한 후, 각 웰에 25μL의 항체 희석액을 첨가하여 최종 농도가 6μg/mL에 도달하면 총 10 희석 구배로 3배 연속 희석을 수행하고; 세포 플레이트를 항온 인큐베이터에 넣어 6 h 동안 유도 배양한 후, 96웰 플레이트를 실온 조건에 놓고 적어도 15 min 동안 평형화하였으며, 연속 샘플 건을 사용하여 모든 반응 웰의 각 웰에 75 μL의 Bio-GloTM Luciferase Assay Reagent(염색액은 빛으로부터 보호되어야 함)를 첨가하고, 실온 조건에서 5 min 동안 반응한 후, 다기능 마이크로플레이트 리더에 놓고 Luminescence 광 신호 값을 검출하였다. 형광 값은 항체 농도와 함께 GraphPad Prism 8 소프트웨어로 피팅하고 그래프를 작성하여 EC50을 계산하였다.
결과를 도 6 및 하기 표에 나타내었다.
항체 번호 EC50(ng/ml)
ch782 47.64
Ref.ch175 36.46
결과는 ch782와 참조 항체 Ref.ch175를 구배 희석 후, 효과 대 표적 비율 E:T=6:1에 따라 37℃에서 6h 동안 인큐베이션한 후 ch782 및 Ref.ch175 모두 강한 ADCC 활성을 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 13: 항-CLDN18.2 항체ch782의 인간화
항체 면역원성을 감소시키고 항체가 체내에 투여된 후 생성되는 인간 항-마우스 항체(HAMA) 효과를 줄이기 위해, 본 실시예에서는 바람직한 항체ch782를 인간화시켰다. 구체적으로, 실시예 6의 mab782 항체 가변 영역 서열을 인간화 서열로 설계하였다. kabat 코딩 시스템에 따라 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 코딩하고, NCBIIgblast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통해 서열 상동성을 비교하여 상동성이 높은 인간 유래 항체 서열을 프레임워크로 선택한 후, 마우스 유래 항체 CDR을 이식하고, 프레임워크 영역의 일부 핵심 아미노산을 복귀 돌연변이시켰다.
Blast로 782 항체 중쇄와 인간 생식계열의 상동 서열을 검색한 결과는 다음과 같다.
IGHV4-38-2*02 71.1%(69/97)
IGHV4-61*01 71.4%(70/98)
IGHV4-61*08 71.4%(70/98)
Blast로 782 항체 경쇄와 인간 생식계열의 상동 서열을 검색한 결과는 다음과 같다.
IGKV4-1*01 79.2%(80/101)
IGKV3-7*02 65.3%(66/101)
IGKV3-7*04 65.3%(66/101)
782 항체의 중쇄 가변 영역에서 kabat에 의해 정의된 FR 및 CDR 서열은 다음과 같다.
서열번호 1에서의 위치 번호 서열
FR1 1~30 DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT
CDR1 31~36 SGYSWH
FR2 37~50 WIRQFPGNKLEWMG
CDR2 51~66 YIHYSDNTNYSPSLKS
FR3 67~98 RISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR
CDR3 99~107 IYYGNSFVY
782 항체의 경쇄 가변 영역에서 kabat에 의해 정의된 FR 및 CDR 서열은 다음과 같다.
서열번호 6에서의 위치 번호 서열
FR1 1~23 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSC
CDR1 24~40 KSSQSLLNSGNQKNYLT
FR2 41~55 WYQQKPGQPPKLLIY
CDR2 56~62 WASTRES
FR3 63~94 GVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYC
CDR3 95~103 QNDYFYPYT
본 발명에서 항체 중쇄 인간화는 상동성이 높은 IGHV4-61 을 주형으로 선택하여 CDR 영역을 대체하고, 중쇄 CDR1 이식에는 Chothia에 의해 정의된 CDR1 부위도 포함되며, I48M/V67I/V71R 이 3개 부위를 복귀 돌연변이시켜 hu782H1.1을 얻었다.
번역 후 변형 분석을 통해 S60 부위에 잠재적인 글리코실화 부위가 존재함을 발견하였는데, 이는 점 돌연변이 방식을 통해 S60A로 돌연변이되고, hu782H1.2로 명명되었으며, 이의 101번째 아미노산 V를 A로 돌연변이시켜 발현량을 최적화하고, hu782 H1.2-V101A로 명명하였다.
본 발명에서 항체 경쇄의 인간화는 각각 VκI consensus sequence를 주형으로 사용하여 CDR 영역을 대체시켜 hu782L1을 얻고; IGKV4-1을 주형으로 사용하여 CDR 영역을 대체시켜 hu782L2를 얻었다.
코돈 최적화 후 이상 서열에 대해 전체 유전자 합성을 수행하고, 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 발현 벡터에 클로닝하여 발현 및 정제를 수행하였다.
hu782H1.1(서열번호 11)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSDNTNYSPSLKSRITISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARIYYGNSFVYWGQGTLVTVSS
hu782H1.2(서열번호 12)
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hu782H1.2-V101A(서열번호 13)
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hu782L1(서열번호 14)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNDYFYPYTFGQGTKVEIK
hu782L2(서열번호 15)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPLLIYWASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYFYPYTFGGGTKLEIK
실시예 14: CLDN18.2에 대한 인간화 항체의 특이적 결합 활성 검출
상기 실시예의 키메라 항체 결합 활성 평가 방법을 사용하여 인간 CLDN18.1 및 CLDN18.2, 마우스 CLDN18.1 및 CLDN18.2 및 NUGC4 세포에 대한 인간화 항체의 결합 활성을 검출하였다.
결과를 도 7 및 하기 표에 나타내었다.
HEK293-hCLDN18.2
EC50(ng/ml)		 HEK293-mCLDN18.2 EC50(ng/ml) NUGC4
EC50(μg/ml)
ch782 17.26 18.69 0.57
hu782H1.1L1 27.64 18.94 0.14
hu782H1.2L1 19.42 15.75 0.17
hu782H1.1L2 29.67 20.65 0.16
hu782H1.2L2 18.84 16.02 0.23
결과는 인간화 항체 모두 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 활성이 키메라 항체 ch782의 결합 활성보다 크게 낮지 않음을 보여준다.
이 밖에, 예상외로 종양 세포 NUGC4 세포에 결합하는 4 가지 인간화 항체의 EC50값이 키메라 항체 ch782의 EC50값보다 현저히 우수하였다.
실시예 15: 인간화 항체의 ADCC 활성 검출
본 발명에서 항체의 생체 내 활성의 주요 메커니즘 중 하나는 ADCC 기능적 활성으로, 인간 IgG1항체(hIgG1)는 주로 항체 힌지 영역 및 CH2 영역을 통해 FcγR에 결합하여 ADCC 효과를 발휘한다.인간화 항체의 ADCC 활성을 강화하기 위해, 본 실시예에서는 인간화 항체 중쇄 hu782H1.2의 Fc에 S239D/I332E(DE) 돌연변이를 도입하여 FcγR에 대한 친화도를 강화함으로써, ADCC강화 목적을 달성한다. 발현 및 정제 후, 리포터 유전자 방법을 사용하여 야생형 및 DE 돌연변이형 인간 유래 항체의 ADCC를 평가한다.
중쇄 경쇄
hu782 hu782H1.2(서열번호 18) hu782L2(서열번호 19)
hu782-HV hu782H1.2-V101A(서열번호 21) hu782L2(서열번호 19)
hu782-DE hu782H1.2-S239D/I332E(서열번호 20) hu782L2(서열번호 19)
hu782-HV-DE hu782H1.2-V101A/ S239D/I332E(서열번호 22) hu782L2(서열번호 19)
그 방법은 다음과 같다. 실시예 12의 구체적인 조작 단계에 따라 표적 세포 HEK293-hCLDN18.2 및 NUGC4 세포를 각각 2.5Х105/ml로 희석한 후, 100μl/웰을 흰색 불투명 세포 배양 플레이트에 도말하고, 37℃에서 24h 동안 정치 배양한 후, 상청액을 버리고, 0.1% BSA를 함유한 분석 배지 25μl/웰을 첨가한 후; Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa 세포를 6Х106 개/mL로 희석하고, 96웰 플레이트를 꺼내 각 웰에 25 μl의 Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa 세포 현탁액을 첨가한 후, 각 웰에 25μL의 항체 희석액을 첨가하여 최종 농도가 6μg/mL에 도달하면 총 10 희석 구배로 3배 연속 희석을 수행하고; 세포 플레이트를 항온 인큐베이터에 넣어 6 h 동안 유도 배양한 후, 96웰 플레이트를 실온 조건에 놓고 적어도 15 min 동안 평형화하였으며, 연속 샘플 건을 사용하여 모든 반응 웰의 각 웰에 75 μL의 Bio-GloTM Luciferase Assay Reagent(염색액은 빛으로부터 보호되어야 함)를 첨가하고, 실온 조건에서 5 min 동안 반응한 후, 다기능 마이크로플레이트 리더에 놓고 Luminescence 광 신호 값을 검출하였다. 형광 값은 항체 농도와 함께 GraphPad Prism 8 소프트웨어로 피팅하고 그래프를 작성하여 EC50을 계산하였다.
HEK293-hCLDN18.2 EC50(ng/ml) NUGC4
EC50(μg/ml)		 NUGC4-hCLDN18.2 EC50(ng/ml)
ch782 47.64 0.2387 nd.*
hu782 64.03 0.379 67.61
hu782-HV 70.94 1.151 73.10
hu782-DE 2.58 0.09408 6.87
hu782-HV-DE nd. nd. 11.48
Ref.ch175 36.46 NA* 166.7
*nd: 미검출; *NA: 약한 신호로 인해 계산되지 않음.
결과는 인간 CLDN18.2를 고도로 발현하는 재조합 세포의 경우, 키메라 항체 ch782 및 인간화 항체 hu782, hu782-HV 모두 참조 항체와 동등한 ADCC 활성을 효과적으로 생성할 수 있으며(EC50은 각각 47.64ng/ml, 64.03 ng/ml, 70.94 ng/ml임), Fc 프라이머 S239D/I332E에서 돌연변이된 hu782-DE의 ADCC 활성이 현저히 향상됨을 보여준다(도 8).
인간 CLDN18.2를 내재적으로 발현하는 NUGC4 세포에서도 동일한 결과가 관찰되었으며, NUGC4 세포에 대한 본 발명에서 얻은 후보 항체 ch782 및 hu782의 ADCC 활성은 참조 항체 Ref.ch175보다 우수하였다.
이어서, hCLDN18.2를 안정적으로 형질감염시키는 NUGC4 세포를 표적 세포로 사용하여 ADCC 활성 검출을 수행한 결과는 hu782-DE, hu782-HV-DE의 ADCC 활성이 대조 항체 Ref.ch175보다 현저히 우수함을 보여주며, EC50값은 각각 6.87ng/ml 및 11.48ng/ml(도 8C)이다.
실시예 16: 인간화 항체 CDC 활성 검출
CDC는 보체 의존성 세포에 의해 매개되는 세포 독성 작용으로, 그 작용 메커니즘은 보체에 결합한 항원-항체 혼합물이 최종적으로 세포막을 뚫고 세포 삼투압을 변화시켜 결국 세포 용해를 일으키는 것이다. 본 실시예에서는 HEK293-hCLDN18.2 세포를 표적 세포로 사용하고, 어린 토끼 보체 혈청을 사용하여 보충 추출물을 제공하였으며, CCK-8 세포 증식-독성 검출 키트를 사용하여 항체 CDC 효과를 검출하였다.
실시예 1의 HEK293-hCLDN18.2 세포를 표적 세포로 사용하여 소화 후 2.0Х105개/mL로 희석하고, 웰당 100μL의 부피로 96웰 광투과성 흑체 배양 플레이트에 도말한 후, 세포가 벽에 완전히 부착될 때까지 약 4h 동안 정치 배양하였다. 성장 배지를 건조하게 흡인하고, 각 웰에 50μL의 분석 배지를 첨가하였다. 반응 웰의 각 웰에 50μL의 희석된 항체를 첨가한 후, 1:15으로 희석된 어린 토끼 보체 50μL를 첨가하여 각 웰의 최종 부피가 150μL이고, 각 웰의 샘플 부피가 총 부피의 1/3이며, 초기 농도가 목표 농도의 3배이고, 목표 농도가 6μg/mL일 때 시작한다. 세포 플레이트를 항온 인큐베이터에 넣어 12h 동안 유도 배양한 후 배지를 흡인하여 버리고, 각 웰에 100μL의 신선한 분석 배지를 첨가한 후, 실온 조건에서 각 웰에 CCK-8 용액 10μL를 첨가하여 5% CO2 인큐베이터에 넣고, 37℃ 어둠 속에서 4 h 동안 반응시켰다. 다기능 마이크로플레이트 리더의 450 nm 파장에 놓고 OD값을 검출하였다. GraphPad Prism 8 소프트웨어로 피팅하고 그래프를 작성하여 EC50을 계산하였다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
HEK293-hCLDN18.2
EC50(ng/ml)
ch782 30.9
hu782 49.46
hu782-HV 47.58
Ref.ch175 40.89
결과는 본 발명의 ch782, hu782, hu782HV 모두 HEK293-hCLDN18.2 세포에 대해 참조 항체 Ref.ch175와 동등한 CDC 효과를 유도할 수 있음을 보여준다(EC50은 각각 30.9 ng/ml, 49.46 ng/ml, 47.58 ng/ml, 40.89 ng/ml임).
실시예 17: HEK293-hCLDN18.2 세포 증식에 대한 인간화 항체의 억제 작용 검출
대수 성장 단계의 HEK293-hCLDN18.2 세포를 취하였다. 표적 세포를 소화하고, 계수 후 세포를 1.0Х105개/mL로 희석하고, 웰당 100μL의 부피로 96웰 광투과성 흑체 배양 플레이트에 도말한 후, 세포가 벽에 완전히 부착될 때까지 약 4h 동안 정치 배양하였다. 반응 웰의 각 웰에 50μL의 희석된 항체를 첨가하되, 각 웰의 최종 부피는 200μL이며, 96웰 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에 넣고, 37℃에서 96h 동안 유도 배양한 후 배지를 흡인하여 버리고, 각 웰에 100μL의 신선한 분석 배지를 첨가한 후, 실온 조건에서 각 웰에 CCK-8 용액 10μL를 첨가하여 5% CO2 인큐베이터에 넣고, 37℃어둠 속에서 4 h 동안 반응시켰다. 다기능 마이크로플레이트 리더의 450 nm 파장에 놓고 OD값을 검출하였다. 결과는 세포 증식 억제율=1-(OD450항체/OD450블랭크)로 계산되었다.
결과는 저농도(1μg/ml)에서 표적 세포에 대한 본 발명의 항체 hu782의 증식 억제 효과가 고농도(30μg/ml)의 참조 항체 Ref.ch175(18.3 %vs.7.3%)보다 우수하고, 항체 농도가 증가할수록 증식 억제 효과가 강화되어 용량 의존적 효과를 나타냈으며, 30μg/ml 농도에서, ch782, hu782, hu782-HV의 세포 증식 억제율이 각각 67.8%, 76%, 63.2%에 도달하여 참조 항체 Ref.ch175보다 현저히 우수함을 보여준다.
실시예 18: 인간화 항체와 hCLDN18.2 단백질 사이의 결합 부위 분석
본 발명의 항체가 hCLDN18.2 단백질에는 결합하고 hCLDN18.1 단백질에는 결합하지 않는 핵심 아미노산 부위를 탐색하기 위해, 본 실시예에서는 점 돌연변이 방식을 사용하여 실시예 1에서 구축된 pEFGP-N2-hCLDN18.2 플라스미드에서 hCLDN18.2 ECL1과 hCLDN18.1 ECL1의 아미노산 차이 부위 및 그 부근 아미노산에 대해 알라닌 돌연변이를 수행하되, 그 중 A42 돌연변이는 hCLDN18.1 ECL1의 중간 부위에서 아미노산 S로 돌연변이된다(Q29A, S31A, N37A, A42S, N45A , Q47A , G48A, S52A, E56A, G65A, L69A , G71A). 성공적으로 돌연변이된 플라스미드 및 야생형 플라스미드를 실시예 1의 방법에 따라 293Fv 세포에 각각 형질감염시키고, 48시간 후 세포를 취하여 유세포 분석을 수행하였다.
hu782, Ref.ch175 및 동형 대조군(IsotypecontrolhIgG1)을 10μg/ml로 희석하고, 각각 상기 형질감염 세포와 함께 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하고, FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 1:400으로 희석된 염소 항-마우스 IgG-PE 2차 항체를 첨가하여 얼음 위에서 45min 동안 인큐베이션하고, FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 300μl의 로딩 완충액을 첨가하고, BD 유동 튜브로 옮긴 후, BD FACS calibur로 분석하였다. Flowjo 소프트웨어를 사용하여 평균 형광 강도 MFI(Median Fluorescence Intensity)를 분석한 결과, 돌연변이 후 형질감염 세포의 MFI가 야생형에 비해 50% 이상 감소한 경우, 이 부위가 항체의 결합에 영향을 미치는 핵심 아미노산 부위인 것으로 판단되었다.
결과는 도 11에 도시한 바와 같이, 본 발명의 A42S, N45A, E56A 돌연변이 후 참조 항체 Ref.ch175의 결합에 큰 영향을 미치는 반면, A42S 돌연변이는 hu782의 결합에 영향을 미치지 않고, N45A 돌연변이는 hu782의 결합에 작은 영향을 미치며, E56A 돌연변이는 hu782의 결합에 큰 영향을 미침을 보여준다. 동시에 본 발명은 예상외로 hCLDN18.2 ECL1과 hCLDN18.1 ECL1의 동일한 아미노산 부위에서의 G48A 돌연변이로 인해 참조 항체 Ref.ch175 및 hu782 모두 결합할 수 없음을 발견하였다.
실시예 19: 인간화 항체의 생체 내 활성 평가
본 실시예에서는 BALB/c 누드 마우스를 사용하여 종양 세포를 피하 이식하여 CDX 동물 모델을 구축하고, 인간화 항체의 생체 내 약리 효과를 평가하였다.
실시예 1의 방법에 따라 NUGC4-hCLDN18.2가 안정적으로 형질감염된 세포주를 구축하고, 증식 배양을 수행하였다. 4~6주령의 암컷 SPF 등급 BALB/c 누드 마우스를 사용하여 3~4일 동안 적응성 사육 후, 종양 접종을 준비하였다. 대수 성장 단계의 재조합 NUGC4-hCLDN18.2 세포를 소화 후 무혈청 1640 배지로 2회 세척한 후 2.5Х107/ml로 희석하고, 총 5Х106개의 세포/마리를 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 0.2ml씩 피하 접종하였다. 접종 1주일 후 종양이 70~100 mm3으로 성장하면 무작위 블록 설계로 군당 6마리씩 그룹화하였다. 블랭크 모델군은 IgG1 동형 대조군이다. 실험군에는 매주 2회의 투여 빈도로 10mg/kg 용량을 복강내 주사와 정맥내 주사를 번갈아 투여하고, 매회 투여 전 종양 부피 및 마우스 체중 데이터를 기록하였다.
종양 부피 계산: V(mm3)=(W2xL)/2, W는 정중선 근처 종양의 짧은 직경이고, L은 정중선 근처 종양의 긴 직경이다.
종양 부피가 2000 mm3보다 크고 체중 감소가 20%보다 크거나, 중요한 생리학적 기능에 대한 간섭 또는 종양 궤양 및 괴사가 관찰될 때 마우스를 경추 탈구로 희생시켰다.
종양 억제율(TGI)의 계산 공식은 다음과 같다.
TGI(%)=() X 100
Vt-V0=(t일째 투여군의 평균 종양 부피)-(그룹화 당일 투여군의 평균 종양 부피)
Vct-Vc0=(t일째 투여군의 평균 종양 부피)-(그룹화 당일 투여군의 평균 종양 부피)
NUGC4-hCLDN18.2 마우스 피하 이식 종양 모델에서, 본 발명의 인간화 항체 및 이의 돌연변이체의 항종양 성장 활성이 관찰되었으며, 이들 모두 일정한 약리 효과를 나타내었다. 종말점에서 각 군의 종양 부피를 하기 표에 나타내었다.
투여 및 용량 동물 수
 종양 부피(mm3)
(평균 값±표준 오차)		 TGI(%) CR*
그룹화 당일(D0) 종료 시간(D28)
대조군 6 88.80±6.98 873.83±128.20 NA 0/6
Ref.ch175, 10mg/kg 6 88.21±4.57 751.39±115.87 15.55 0/6
hu782, 10mg/kg 6 88.26±5.47 379.77±151.50 62.88 1/6
hu782-HV, 10mg/kg 6 87.97±5.47 600.96±87.0 34.68 0/6
hu782-DE, 10mg/kg 6 86.22±6.72 360.69±131.35 65.05 2/6
*:CR, 종양이 완전히 퇴행된 동물 수/해당 군의 총 동물 수
인간화 항체 hu782 및 이의 돌연변이체 hu782-HV, hu782-DE군의 종양 억제율은 모두 Ref.ch175군보다 현저히 높았고, 특히hu782 및 이의 ADCC 강화 돌연변이 항체 hu782-DE군의 종양 억제율은 각각 62.88% 및 65.05%에 도달하였다. 이 밖에, hu782군의 6마리 마우스 중 1마리 마우스의 종양이 완전히 퇴행된 것으로 관찰되고, hu782-DE군의 6마리 마우스 중 2마리 마우스의 종양이 완전히 퇴행된 것으로 관찰되었으며, Ref.ch175 조합hu782-HV군에서는 이러한 현상이 모두 관찰되지 않았다.
상기 결과는 본 발명의 항체(특히 인간화 항체)의 생체 내 약리 효과가 참조 항체 Ref.ch175보다 현저히 우수함을 보여준다.
본 발명에 언급된 모든 문헌은 각 개별 문헌이 개별적으로 참조로서 인용된 것과 마찬가지로 본 발명에 참조로서 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 교시 내용을 읽은 후, 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명에 대해 다양한 변경이나 수정을 가할 수 있으며, 이러한 등가 형태 역시 본 발명에 첨부된 청구범위에 의해 한정된 범위 내에 속한다는 것을 이해해야 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (20)

  1. 항-인간 CLDN18.2 항체의 중쇄 가변 영역으로서,
    상기 중쇄 가변 영역은,
    (1) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR1;
    (2) 서열번호 4 또는 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR2; 및
    (3) 서열번호 5 또는 17로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-인간 CLDN18.2 항체의 중쇄 가변 영역.
  2. 항-인간 CLDN18.2 항체 중쇄로서,
    상기 항체 중쇄는 제1항에 따른 항체의 중쇄 가변 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 항-인간 CLDN18.2 항체 중쇄.
  3. 항-인간 CLDN18.2 항체의 경쇄 가변 영역으로서,
    상기 경쇄 가변 영역은,
    (1) 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR1';
    (2) 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR2'; 및
    (3) 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 CDR3'을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-인간 CLDN18.2 항체의 경쇄 가변 영역.
  4. 항-인간 CLDN18.2 항체 경쇄로서,
    상기 항체 경쇄는 제3항에 따른 항체의 경쇄 가변 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 항-인간 CLDN18.2 항체 경쇄.
  5. 항-인간 CLDN18.2 항체로서,
    상기 항체는,
    (1) 제1항에 따른 중쇄 가변 영역; 및/또는
    (2) 제3항에 따른 경쇄 가변 영역을 갖거나,
    상기 항체는 제2항에 따른 중쇄; 및/또는 제4항에 따른 경쇄를 갖는 것을 특징으로 하는 항-인간 CLDN18.2 항체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 1, 11, 12 또는 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열번호 6, 14 또는 15로 표시되는 경쇄 가변 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 항-인간 CLDN18.2 항체.
  7. 재조합 단백질로서,
    상기 재조합 단백질은,
    (i) 제1항에 따른 중쇄 가변 영역, 제2항에 따른 중쇄, 제3항에 따른 경쇄 가변 영역, 제4항에 따른 경쇄 또는 제5항에 따른 항체; 및
    (ii) 발현 및/또는 정제를 돕기 위한 선택적인 태그 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
  8. 항체 제제로서,
    상기 항체 제제는,
    (a) 제5항에 따른 항-인간 CLDN18.2 항체; 및
    (b) 완충액, 멸균수, 및 선택적인 계면활성제를 포함하는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 제제.
  9. CAR 컨스트럭트로서,
    상기 CAR 컨스트럭트의 항원 결합 영역의 scFv 단편은 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 결합 영역이고, 상기 scFv는 제1항에 따른 중쇄 가변 영역 및 제3항에 따른 경쇄 가변 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 CAR 컨스트럭트.
  10. 재조합 면역 세포로서,
    상기 면역 세포는 제9항에 따른 외인성 CAR 컨스트럭트를 발현하는 것을 특징으로 하는 재조합 면역 세포.
  11. 항체 약물 접합체로서,
    상기 항체 약물 접합체는,
    (a) 제1항에 따른 중쇄 가변 영역, 제2항에 따른 중쇄, 제3항에 따른 경쇄 가변 영역, 제4항에 따른 경쇄 또는 제5항에 따른 항체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 부분; 및
    (b) 검출 가능한 마커, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고 상기 항체 부분과 접합된 접합 부분을 함유하는 것을 특징으로 하는 항체 약물 접합체.
  12. 활성 성분의 용도로서,
    상기 활성 성분은 제1항에 따른 중쇄 가변 영역, 제2항에 따른 중쇄, 제3항에 따른 경쇄 가변 영역, 제4항에 따른 경쇄 또는 제5항에 따른 항체, 제7항에 따른 재조합 단백질, 제10항에 따른 면역 세포, 제11항에 따른 항체 약물 접합체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 활성 성분은,
    (a) 검출 시약 또는 키트의 제조;
    (b) CLDN18.2 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약물 또는 제제의 제조; 및/또는
    (c) 암 또는 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 약물 또는 제제의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 활성 성분의 용도.
  13. 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은,
    (i) 제1항에 따른 중쇄 가변 영역, 제2항에 따른 중쇄, 제3항에 따른 경쇄 가변 영역, 제4항에 따른 경쇄 또는 제5항에 따른 항체, 제7항에 따른 재조합 단백질, 제10항에 따른 면역 세포, 제11항에 따른 항체 약물 접합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 활성 성분; 및
    (ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 폴리뉴클레오티드는,
    (1) 제1항에 따른 중쇄 가변 영역, 제2항에 따른 중쇄, 제3항에 따른 경쇄 가변 영역, 제4항에 따른 경쇄 또는 제5항에 따른 항체; 또는
    (2) 제7항에 따른 재조합 단백질; 및/또는
    (3) 제9항에 따른 CAR 컨스트럭트로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  15. 벡터로서,
    상기 벡터는 제14항에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  16. 유전자 조작된 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제15항에 따른 벡터를 함유하거나 게놈에 제14항에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합된 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 숙주 세포.
  17. 샘플 내 CLDN18.2 단백질의 시험관 내 검출(진단적 검출 또는 비진단적 검출 포함) 방법으로서,
    상기 방법은,
    (1) 시험관 내에서, 상기 샘플을 제5항에 따른 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (2) 항원-항체 복합체가 형성되는지 여부를 검출하되, 복합체가 형성되면 샘플에 CLDN18.2 단백질이 존재함을 나타내는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 검출판으로서,
    상기 검출판은 서브스트레이트(지지판) 및 테스트 스트립을 포함하고, 상기 테스트 스트립은 제5항에 따른 항체 또는 제11항에 따른 항체 약물 접합체를 함유하는 것을 특징으로 하는 검출판.
  19. 키트로서,
    상기 키트는,
    (1) 제5항에 따른 항체를 함유하는 제1 용기; 및/또는
    (2) 제5항에 따른 항체에 대한 2차 항체를 함유하는 제2 용기를 포함하거나,
    상기 키트는 제18항에 따른 검출판을 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
  20. CLDN18.2 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법으로서,
    상기 방법은 제5항에 따른 항체, 상기 항체의 항체-약물 접합체 또는 상기 항체를 발현하는 CAR-T 세포 또는 이들의 조합을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020247019362A 2021-11-11 2022-11-11 항-cldn18.2 단일클론 항체 및 이의 응용 KR20240099470A (ko)

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