KR20240079551A - 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법 - Google Patents

광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플영역의 이동에 의하여 대물렌즈와의 거리가 변경되더라도 형광분자를 여기시키는 여기광의 조사위치를 유지시킬 수 있는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법에 관한 것이다. 본 발명은 광학현미경의 광원부에 설치되며, 샘플의 형광체를 여기시키기 위한 여기광을 발생시키는 제1 광원; 상기 샘플면에 초점을 형성하기 위한 가이드 빔을 발생시키는 제2 광원; 상기 여기광과 상기 가이드 빔의 조사방향을 일치시키는 빔 결합부; 및 상기 샘플면에 형성되는 상기 가이드 빔의 초점위치 변화에 따라 상기 여기광의 조사범위 및 조사위치를 조절하는 제3 빔 제어부를 포함하는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치를 제공한다.

Description

광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법{Automatic excitation light control device for optical microscope and automatic excitation light control method}
본 발명은 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 샘플영역의 이동에 의하여 대물렌즈와의 거리가 변경되더라도 형광분자를 여기시키는 여기광의 조사위치를 유지시킬 수 있는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법에 관한 것이다.
광학현미경은 맨눈으로 볼 수 없거나 잘 보이지 않는 아주 작은 물체나 구조의 확대상을 만들어 보여주는 광학기기이다. 광학현미경은 그 원리에 따라 형광현미경, 금속현미경, 편광현미경, 간섭현미경, 위상차현미경, 암시야현미경, 명시야현미경 등으로 구분된다. 이중 형광 현미경은 형광(fluorescence)을 이용하여 이미징하는 광학현미경으로, 시료에 존재하는 형광물질이 흡수하는 특정 파장을 비추었을 때, 형광물질이 흡수한 빛이 형광 형태로 나오는 긴 파장의 빛을 감지하여 이미징을 할 수 있다.
형광현미경은 파장 특이적 필터를 이용해 비추어 주는 빛보다 훨씬 약한 방출하는 빛을 감지하게 된다. 형광 현미경은 제논, 수은, LED, 레이저를 이용하는 광원과 여기광 필터(excitation filter), 다이크로익 미러(dichroic mirror) 그리고 방출광 필터(emission filter)로 이루어진다. 광원으로부터 나온 빛이 여기광 필터를 통해 형광물질이 흡수할 수 있는 파장만이 지나가게 되고, 다이크로익 미러를 통해 시료를 비추게 된다. 시료에 있던 형광물질이 이 특정 파장의 빛을 흡수하고, 형광의 형태로 긴 파장의 빛을 방출하는데, 이렇게 방출된 빛은 다이크로익 미러에 반사되지 않고 검출기로 검출되게 된다. 다색상 형광 현미경의 경우 각색에 해당하는 여기광 필터와 다이크로익 미러를 장착하여 시료에 존재하는 다양한 색의 형광물질을 이미징 할 수 있다(도 2 참조).
이러한 형광 현미경은 세포내 소기관 및 단백질 등을 이미징 할 때 사용되며 공초점 현미경(confocal microscope)과, 전반사형광 현미경(total internal reflection fluorescence microscope) 등이 있다.
이러한 형광현미경은 바이오마커에 형광체를 부착한 다음, 상기 형광제를 여기하여 관찰하는 것으로 바이오마커의 종류 및 양을 측정하고 있다. 하지만 기존에 사용되는 현미경의 경우 대물렌즈 방향에서 여기광을 공급하며, 이에 따라 대물렌즈에서 여기광에 의한 자가 형광이 발생되어 신호대잡음비가 낮아져 정확한 관찰이 어렵다는 단점을 가지고 있다. 아울러 이렇게 공급되는 여기광의 경우 샘플의 광표백을 심화시킬 수 있다는 단점을 가지고 있다(도 3 참조).
이를 개선하기 위하여 샘플을 기준으로 대물렌즈와는 반대방향에서 여기광을 공급하는 현미경이 사용되고 있다. 이러한 현미경의 경우 샘플의 상부에서 여기광을 공급함과 동시에 일정한 각도를 가지고 여기광을 공급함에 따라 대물렌즈로 입사되는 여기광을 최소화 할 수 있다는 장점을 가진다(도 4 참조). 또한 샘플의 상부에 프리즘 등을 추가로 배치하여 여기광을 전반사시킴으로써 대물렌즈로 입사되는 여기광을 0에 가깝게 줄일 수 있다.
다만 이러한 대물렌즈 반대편에서 여기광을 공급하는 경우 샘플면의 이동에 따른 여기광 조사위치가 변경될 수 있어 정확한 관찰이 어렵다는 단점을 가지고 있다(도 5 참조).
따라서 이러한 현미경들의 단점을 개선하기 위한 새로운 방법의 여기광 공급 장치를 필요로 하는 실정이다.
(0001) 대한민국 등록특허 제10-0942195호 (0002) 대한민국 등록특허 제10-2290325호
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 샘플영역의 이동에 의하여 대물렌즈와의 거리가 변경되더라도 형광분자를 여기시키는 여기광의 조사위치를 유지시킬 수 있는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법을 제공하고자 한다.
상술한 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 광학현미경의 광원부에 설치되며, 샘플의 형광체를 여기시키기 위한 여기광을 발생시키는 제1 광원; 상기 샘플면에 초점을 형성하기 위한 가이드 빔을 발생시키는 제2 광원; 상기 여기광과 상기 가이드 빔의 조사방향을 일치시키는 빔 결합부; 및 상기 샘플면에 형성되는 상기 가이드 빔의 초점위치 변화에 따라 상기 여기광의 조사범위 및 조사위치를 조절하는 제3 빔 제어부를 포함하는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치를 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 여기광 및 상기 가이드 빔은 상기 샘플면을 기준으로 상기 대물렌즈의 반대편에서 조사될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 여기광 및 상기 가이드 빔은 상기 샘플면과 5~85°의 각도를 가지고 조사될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 제3 빔 제어부는 상기 빔 결합부를 통과한 상기 여기광 및 상기 가이드 빔을 동시에 조절하며, 상기 가이드 빔의 초점을 일정한 위치에 유지하여 상기 여기광의 조사위치와 조사범위를 조절할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 여기광의 조사위치 및 조사범위를 조절하는 제1 빔 제어부를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 가이드 빔의 초점 및 조사위치를 조절하는 제2 빔 제어부를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 가이드 빔은 상기 샘플면에서 초점을 형성하며, 상기 여기광은 상기 샘플면 전체영역에 조사될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 가이드 빔은 상기 여기광 조사영역의 중앙부에 초점을 형성할 수 있다.
본 발명은 또한 자동 여기광 조절장치를 사용한 자동 여기광 조절방법을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 상기 자동 여기광 조절방법은, (a) 임의의 샘플 또는 초점조절용 이미지를 관찰하여 대물렌즈의 초점을 조절하는 단계; (b) 상기 여기광을 상기 대물렌즈의 관측영역에 균일하게 조사하는 단계; (c) 상기 가이드 빔을 상기 여기광의 공급영역 중앙에 초점을 형성하도록 조사하는 단계; (d) 상기 가이드 빔의 초점 위치를 측정하는 단계; (e) 샘플을 상기 대물렌즈의 관찰영역에 공급한 다음, 상기 대물렌즈의 초점을 조절하는 단계; 및 (f) 상기 가이드 빔의 초점이 일정한 위치에 유지되도록 상기 제3 빔 제어부를 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 가이드 빔은 제1 카메라를 통하여 관찰되며, 상기 샘플에서 발생되는 형광은 제2 카메라를 통하여 관찰될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 여기광은 상기 (d)단계 이후 차단되며, 상기 (f)단계 이후 재조사되어 상기 샘플을 여기시키는 것일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 가이드 빔은 상기 (f)단계이후 상기 여기광의 재조사시 차단되는 것일 수 있다.
본 발명에 의한 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법은 기존의 광학 현미경을 이용한 형광관찰에서 대물렌즈와 샘플면 사이의 거리변화로 인한 여기광의 불균일 공급을 개선하여 샘플의 형광관찰을 더욱 용이하게 할 수 있다.
또한 본 발명의 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치 및 자동 여기광 조절방법은 여기광의 조사위치와 범위를 자동으로 조절하므로, 샘플의 변경 또는 대물렌즈의 초점 변경 등으로 인하여 대물렌즈와 샘플면 사이의 거리가 달라지더라도 별다른 조작 없이 샘플을 정확하게 관찰할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 자동 여기광 조절정치를 포함하는 광학현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 기존에 사용되는 형광현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 기존에 사용되는 대물렌즈 방향에서 여기광을 공급하는 형광현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 샘플의 상부에서 여기광을 공급하는 형광현미경의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 샘플면의 위치변화에 따른 여기광 공급위치의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 대물렌즈 방향에서 관찰할 때 샘플면의 위치변화에 따른 여기광의 위치변화를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 가이드 빔의 초점위치가 결정된 모습을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 샘플면과 대물렌즈 사이의 거리 변화에 따른 가이드 빔의 이동 및 형상변화를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 가이드 빔의 소수점 이하의 픽셀이동을 검출할 수 있는 것을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 여기광의 위치변화와 자동 정렬되는 것을 나타낸 사진이다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
본 명세서에서, '및/또는' 이라는 용어는 복수의 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다. 본 명세서에서, 'A 또는 B'는, 'A', 'B', 또는 'A와 B 모두'를 포함할 수 있다.
본 발명은 광학현미경의 광원부에 설치되며, 샘플의 형광체를 여기시키기 위한 여기광을 발생시키는 제1 광원; 상기 샘플면에 초점을 형성하기 위한 가이드 빔을 발생시키는 제2 광원; 상기 여기광과 상기 가이드 빔의 조사방향을 일치시키는 빔 결합부; 및 상기 샘플면에 형성되는 상기 가이드 빔의 초점위치 변화에 따라 상기 여기광의 조사범위 및 조사위치를 조절하는 제3 빔 제어부를 포함하는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 자동 여기광 조절장치를 포함하는 광학현미경을 나타낸 것이다. 본 발명의 자동 여기광 조절 장치 및 조절방법은 여기광을 사용하는 형광현미경에 주로 사용될 수 있으므로 이를 기준으로 설명한다.
상기 제1 광원(110)은 여기광(111)을 발생시키기 위한 광원으로 샘플에 포함되어 있는 형광을 여기시킬 수 있는 파장을 포함하는 빛을 발생시킬 수 있다. 일반적으로 형광체의 여기를 위하여 단파장의 레이저를 사용하며, 이와는 별도로 높은 연색성을 가지는 백색광을 사용할 수도 있다. 이러한 높은 연색성의 백색광은 고연색 발광소자를 통하여 생성이 가능하다.
상기 고연색 백색 발광소자는 가시광 전역에 걸쳐 매끄러운 발광 스펙트럼이 분포되어 있으며, 또한 여기광으로 많이 사용되는 자외선 영역까지 이러한 스펙트럼이 이어지도록 발광되고 있어 태양광과 유사한 발광 패턴을 가지고 있다. 이 고연색 발광소자의 경우 다양한 발광체와 형광체를 혼합하여 발광을 수행하고 있으므로 여기광 필터를 이용하여 원하는 스펙트럼의 여기광을 형성할 수 있다. 특히 기존에 사용되는 광원의 경우 좁은 영역의 스펙트럼을 가지는 빛만을 공급하고 있어 광원에서 공급되는 스펙트럼 외의 여기광이 필요한 경우 광원 자체를 교환하여야 하지만, 상기와 같이 고연색성 백색 발광소자를 사용하는 경우 광원의 교체 없이 상기 여기광 필터를 교환하는 것만으로도 원하는 여기광을 형성할 수 있다.
또한 상기 백색발광소자 이외에도 단색광을 발산하는 레이저를 광원으로 사용될 수 있으며, 이 경우 상기 레이저가 발산하는 단색광은 상기 샘플에 포함되는 형광체를 동시에 여기시킬 수 있는 것이 바람직하다. 상기 레이저의 경우 상기 발광소자를 사용한 광원에 비하여 높은 광도를 가질 수 있으며, 스펙트럼 대역이 좁은 단색광을 발산할 수 있다. 따라서 상기 형광체를 더욱 밝게 여기시킬 수 있으므로, 상기 샘플에 포함되어 있는 다종의 형광체들이 동일한 여기광을 사용할 수 있는 경우라면 이러한 레이저 광원을 사용할 수 있다. 다만 상기 형광체를 여기시키기 위하여 넓은 스펙트럼이 필요한 경우에는 상기 고연색의 백색 발광소자를 사용하는 것이 바람직하므로 각 실험의 조건에 따라 적절한 광원을 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제1 광원(110)에는 제1 빔 제어부(112)가 설치될 수 있다. 상기 제1 빔 제어부(112)는 다수 개의 렌즈를 조합하여 상기 제1 광원(110)에서 발생되는 여기광(111)의 조사위치 및 조사 범위를 조절할 수 있다. 이때 상기 제1 빔 제어부(112)의 경우 후술할 자동 여기광 조절이 아닌 수동으로 위치를 조절하는 부분이며, 상기 가이드 빔(121)을 사용한 자동위치 조절 단계 이전 대물렌즈(310)의 관찰범위에 맞도록 상기 여기광의 조사범위와 조사위치를 정렬하는 부분이다.
즉 상기 제1 빔 제어부(112)의 경우 샘플의 관찰이전 여기광(111)의 초기 조사위치를 정하며, 대물렌즈(310)의 관찰범위에 맞게 여기광(111)의 조사범위를 제한하는 것으로 원하지 않는 위지에 여기광(111)이 조사되어 광표백이 일어나는 것을 막을 수 있다.
또한 상기 제1 빔 제어부(112)의 경우 상기 여기광(111)의 밝기 조절 및 차단을 수행할 수도 있다. 상기 여기광(111)의 경우 원하는 광량으로 조절되어 조사되는 것이 바람직하며, 이러한 밝기조절은 샘플(200)의 관찰 이전에 수행하는 것이 바람직하다. 따라서 상기 제1 빔 제어부(112)에는 이러한 여기광(111)의 밝기 조절부를 포함할 수 있다. 또한 상기 여기광(111)의 경우 광표백을 최소화하기 위하여 원하는 시간에만 조사되어야 하므로 상기 제1 빔 제어부(112)에 여기광 차단부를 설치하는 것으로 샘플의 광표백을 최소화 할 수 있다. 즉 상기 여기광 차단부의 경우 상기 여기광을 정렬하는 동안에는 상기 여기광을 차단하지 않으며, 샘플의 공급 및 자동 여기광 조절단계에서는 상기 여기광을 차단하는 것으로 상기 샘플에 여기광이 조사되는 시간을 최소화 할 수 있다.
상기 가이드 빔(121)은 상기 여기광(111)의 중심에 공급되는 빛으로 넓은 범위에 조사되는 여기광(111)과는 달리 샘플면에 초점을 형성하도록 공급될 수 있다.(도 1 참조) 즉 상기 가이드 빔(121)의 경우 상기 샘플면(210)에 매우 좁은 범위를 가지도록 조사되는 것이 바람직하다. 이는 상기 가이드 빔(121)의 초점의 형상을 가우시안(Gaussian) 함수 또는 푸아송(Poisson) 함수를 이용하여 피팅하여 정확한 위치를 찾기 위함이다.
또한 상기 가이드 빔(121)은 상기 여기광(111)과 동일하거나 짧은 파장을 가질 수 있다. 일반적으로 상기 가이드 빔(121)과 상기 여기광(111)이 동일하거나 유사한 파장을 가지는 경우 상기 가이드 빔(121)에 의해서도 상기 샘플의 형광이 여기될 수 있으며, 또한 상기 가이드 빔(121)을 이용하여 여기광의 위치를 조절하는 동안 광표백이 나타날 수 있다. 하지만 본 발명의 경우 상기 가이드 빔(121)은 위에 나타난 바와 같이 상기 여기광의 중앙부에 매우 좁은 영역(초점, 220)에만 조사되므로, 관찰결과에 영향을 최소화 할 수 있다. 특히 상기 여기광(111) 보다 짧은 파장을 사용하며 상기 샘플의 형광체를 여기시키지 않는 파장을 가지는 경우에는 이러한 광표백효과를 최소화 하는 것도 가능하다.
아울러 상기 가이드 빔(111)과 상기 샘플(200)에서 발생되는 형광을 구분하기 위하여 상기 가이드 빔(121)은 상기 샘플(200)에서 발생되는 형광에 비하여 긴 파장을 가지는 것을 사용할 수도 있다. 일반적으로 상기 여기광(111)의 경우 형광체가 여기되어 발생되는 형광에 비하여 짧은 파장을 가지고 있으므로, 상기 형광보다 긴 파장을 가지는 가이드 빔(121)을 사용하는 경우 상기 형광체의 광표백을 피할 수 있다.
상기 제2 광원(120)은 상기 가이드 빔(121)을 발생시키기 위한 것으로 일반적으로 사용되는 광원이 사용될 수 있다. 상기 가이드 빔(121) 역시 상기 여기광(111)과 동일하게 높은 연색성을 가지는 광원을 사용하거나 단파장의 레이저를 광원으로 사용할 수 있으며, 이에 관한 설명은 동일하므로 생략하기로 한다.
상기 제2 광원(120)에는 제2 빔 제어부(122)가 설치될 수 있다. 상기 제2 빔 제어부(122)는 상기 가이드 빔(121)의 초점 및 위치를 조절하기 위하여 사용되는 것으로 상기 제1 빔 제어부(112)와 동일하게 상기 가이드 빔(121)을 독립적으로 조절할 수 있다. 즉 상기 제2 빔 제어부(122) 역시 후술할 자동 여기광 제어와는 관계없이 상기 가이드 빔(121)의 초기 정렬을 수행하는 부분이다.
이때 상기 제2 빔 제어부(122)는 상기 샘플(200)의 관찰이전 상기 가이드 빔(121)이 상기 여기광(111)의 중앙부분에 초점을 형성하도록 조절하는 것이 바람직하며, 또한 샘플의 광표백 영역을 최소화하기 위하여 조사범위가 최소화 되도록 할 수 있다. 이를 위하여 상기 제2 빔 제어부(122)는 초점 조절부, 가이드 빔 밝기 조절부, 가이드 빔 위치 조절부 및 가이드 빔 차단부를 포함할 수 있다.
상기 초점 조절부는 상기 가이드 빔(121)의 초점을 형성하기 위한 것으로 상기 샘플면(210)에 상기 가이드 빔이 초점을 형성할 수 있도록 한다. 이때 상기 가이드 빔의 초점은 샘플을 관찰하기 이전에 정렬되는 것으로 초기 초점 정렬을 상기 초점 조절부를 통하여 수행할 수 있다.
상기 가이드 빔 밝기 조절부는 상기 가이드 빔(121)의 밝기를 조절하기 위한 것으로 광표백 영역을 최소화하기 위하여 상기 가이드 빔의 밝기를 최소화 할 수 있다. 즉 상기 가이드 빔의 밝기는 자동 여기광 조절에서 위치를 확인할 수 있을 정도로만 조절될 수 있으며, 이에 따라 상기 가이드 빔에 의한 광표백을 최소화 할 수 있다.
상기 가이드 빔 위치 조절부는 상기 가이드 빔(121)의 초기 위치를 조절하는 부분으로, 일반적으로 상기 가이드 빔(121)의 초점 위치가 상기 여기광(111) 조사범위의 중앙에 위치하도록 할 수 있다. 다만 중앙부에 상기 샘플에서 발생되는 형광이 몰려 있는 경우에는 상기 가이드 빔의 위치를 상기 여기광의 조사범위 일측으로 이동시켜 사용하는 것도 가능하다.
상기 가이드 빔 차단부는 상기 가이드 빔을 원하는 시점에 차단 및 공급하기 위하여 사용되는 것으로 일반적으로 상기 가이드빔 밝기 조절부와 일체화되어 설치될 수도 있지만, 독립적으로 설치되는 것도 가능하다. 상기 가이드 빔 차단부의 경우 상기 가이드 빔을 상시 샘플의 형광관측시 차단할 수 있으며, 이를 통하여 상기 샘플의 형광 관측시 상기 가이드 빔에 의한 노이즈 형성을 최소화 할 수 있다.
상기 빔 결합부(130)는 상기 여기광(111) 및 상기 가이드 빔(111)의 조사방향을 일치시키기 위하여 사용되는 것이다. 본 발명의 경우 위에서 살펴본 바와 같이 상기 여기광(111)의 중앙부에 상기 가이드 빔(121)의 초점을 형성하고 있다. 이때 상기 가이드 빔(121)과 상기 여기광(111의 조사방향이 일치하지 않는 경우, 후술할 샘플면(210)과 대물렌즈(310) 사이의 거리가 변화할 때 상기 가이드 빔(121)과 상기 여기광(111)의 이동량이 달라질 수 있다. 따라서 상기 조사방향을 일치 시키는 것으로 상기 여기광(111)과 상기 가이드 빔(121)이 일체화 되어 움직이도록 하는 것이 바람직하다. 이를 위하여 상기 빔 결합부(130)에는 상기 제1 광원(110)과 상기 제2 광원(120)이 90°각을 이루며 상기 여기광(111) 및 상기 가이드 빔(121)을 공급할 수 있다(도 1 참조). 또한 상기 여기광(111)과 상기 가이드 빔(121)의 조사방향을 일치시키기 위하여 상기 여기광과 상기 가이드 빔의 파장이 상이한 경우 다이크로익 미러를 사용할 수 있으며, 상기 여기광과 상기 가이드 빔의 파장이 유사하거나 일치하는 경우 중성농도 필터를 사용할 수 있다.
상기 다이크로익(Dichroic mirror) 미러는 특정 파장대역의 빛을 반사하고 나머지 파장대역의 빛은 투과시키는 거울의 일종으로 본 발명의 경우 상기 여기광과 상기 가이드 빔 중 하나의 파장을 반사시키는 다이크로익 미러를 사용하여 선택적인 반사와 투과를 수행할 수 있다.
또한 상기 중성 농도 필터(neutral density filter)의 경우 입사되는 빛의 일부를 반사하며 일부를 투과시키는 거울의 일종으로 이를 사용하는 경우 상기 여기광과 상기 가이드 빔의 일부를 반사 및 투과하여 조사방향을 일치시킬 수 있다.
상기 제3 빔 제어부(140)는 상기 빔 결합부(130)를 통과한 상기 여기광(111)과 상기 가이드 빔(121)을 동시에 제어하는 부분으로, 구체적으로는 상기 샘플면(210)에 형성되는 상기 가이드 빔(121)의 초점(220)위치 변화에 따라 상기 여기광의 조사범위 및 조사위치를 조절할 수 있다.
이를 상세히 살펴보면, 상기 샘플면(210)의 경우 상기 대물렌즈(310)와의 간격이 일정하게 유지되어야 하지만, 샘플의 이동, 샘플의 변화 및 커버 글라스와 슬라이드 글라스의 곡률 등의 변화로 인하여 간격 및 위치가 변화될 수 있다. 이때 일반적으로 사용되는 형광 현미경의 경우 상기 여기광(111)이 일정한 위치에서 공급되므로 상기와 같은 이동으로 인하여 상기 여기광의 조사위치 및 조사범위가 변화될 수 있다(도 5 참조).
이 경우 상기 대물렌즈(310)의 초점도 변화하는 것이 일반적이지만, 대물렌즈(310)의 경우 초점 조절장치를 가지고 있으므로, 초점의 조절이 가능하며, 다만 샘플(200)이 중앙에 위치하도록 여기광의 조사위치가 달라진다는 문제점이 발생할 수 있다. 본 발명의 경우 위에서 살펴본 바와 같이 상기 여기광(111)의 중앙부에는 상기 가이드 빔(121)의 초점(220)이 위치하고 있으므로, 상기 가이드 빔(220)이 중앙에 위치하도록 조절하는 것만으로도 상기 여기광(111)이 정확한 위치에 조사될 수 있다.
따라서 상기 제3 빔 조절부(140)의 경우 상기 빔 결합부(130)를 통과한 상기 가이드 빔(121)과 상기 여기광(111)을 동시에 조절하여 상기 여기광(111)이 정확한 위치에 조사될 수 있도록 할 수 있으며, 이때 상기 가이드 빔(121)을 기준으로 하여 상기 가이드 빔(121)이 일정한 위치를 유지하도록 하는 것으로 상기 여기광이 원하는 위치에 정확하게 조사될 수 있다.
또한 위와 같은 샘플면(210)과 대물렌즈(310) 사이의 거리 변화는 상기 여기광의 조사범위에도 영향을 줄 수 있으므로, 본 발명의 경우 상기 여기광의 조사범위 역시 일정하게 유지하는 것이 가능하며, 이에 따라 원하지 않은 범위에 상기 여기광이 공급되어 광표백이 나타나는 것을 방지할 수 있다.
또한 가이드 빔의 위치를 정확하게 측정하기 위하여 상기 가이드 빔 초점의 형상을 가우시안(Gaussian) 함수 또는 푸아송(Poisson) 함수를 이용하여 피팅할 수 있다. 이처럼 가이드 빔의 초점을 가우시안 함수 또는 푸아송 함수를 이용하여 피팅함으로써 가이드 빔 초점의 중심점을 소수점 아래 픽셀 단위까지 찾아낼 수 있으며, 이러한 중심점이 일정한 위치를 유지하도록 상기 제3 빔 제어부를 이용하여 상기 가이드 빔의 조사위치를 조절하는 것으로 상기 여기광을 정확하게 제어할 수 있다.
도 9의 아래 그림과 같이 측정된 이미지의 각 픽셀의 밝기를 2차원 가우시안 함수 에 입력하고 최소제곱법(least square method)에 의한 오차가 최소가 되도록 하는 x0, yo를 구함으로써 소수점 아래 픽셀 단위로 가이드 빔 초점의 중심점을 찾아낼 수 있다. 또한 여기광의 위치를 매우 정밀하게 제어하지 않아도 되는 경우에는 이러한 피팅을 생략하고, 가이드 빔의 가장 밝은 픽셀의 위치를 기준으로 할 수 있다.
상기 여기광(111) 및 상기 가이드 빔(121)은 상기 샘플면(210)을 기준으로 상기 대물렌즈(310)의 반대편에서 조사될 수 있다(도 1 및 도 4 참조). 일반적으로 사용하는 형광현미경의 경우 상기 대물렌즈와 동일한 방향에서 상기 여기광을 샘플면으로 조사한다(도 2 및 도 3 참조). 이 경우 상기 여기광에 의해 대물렌즈에서 자가형광, 즉 노이즈가 발생되며, 이러한 노이즈는 신호대비잡음비를 낮춰 정확한 형광관찰이 어려울 수 있다. 본 발명의 경우 이러한 노이즈의 발생을 최소화하기 위하여 상기 여기광(111)을 상기 샘플면의 상부에서 조사하는 것으로 여기광에 의한 노이즈를 최소화 할 수 있다.
아울러 형광관찰시 상기 여기광이 직접 상기 대물렌즈로 입사하게 되면 동일한 이유로 형광의 관찰이 어려울 수 있다. 즉 상기 여기광이 상기 대물렌즈 방향으로 조사되면 여기광에 의해 대물렌즈에서 자가형광이 발생되어 신호대잡음비가 낮아져 정확한 관찰이 어려울 수 있다. 따라서 본 발명에 사용되는 여기광(111) 및 가이드 빔(121)은 상기 샘플면(210)과 5~85°의 각도를 가지고 조사되는 것이 바람직하다(도 4 참조). 이를 통하여 상기 여기광(111)이 상기 샘플의 형광체를 여기시킬수 있지만, 대부분의 여기광(111)은 상기 대물렌즈의 외측으로 조사되며, 이에 따라 신호대잡음비를 크게 높일 수 있다.
다만 이 경우 상기 가이드 빔(121) 역시 대물렌즈(310) 방향에서 관찰하기 어려울 수 있지만, 상기 가이드 빔(121)은 상기 여기광(111)과는 달리 좁은 영역에 집중되어 초점을 형성하게 되므로, 샘플면(210)에서의 산란에 의하여 일부가 상기 대물렌즈 방향으로 입사될 수 있으므로, 상기 가이드 빔은 상이 대물렌즈(310)를 통하여 관찰되는 것이 가능하다.
이때 상기 각도가 5°미만인 경우 샘플 거치를 위한 부품과의 간섭이 피하기 어렵고, 85°를 초과하는 각도를 형성하는 경우 상기 여기광이 상기 대물렌즈로 입사되어 신호대잡음비가 낮아질 수 있다. 아울러 상기 각도가 작아질수록 여기광은 장축대 단축의 비가 큰 길쭉한 타원의 형태가 되는데, 제1 빔 제어부(112) 또는 제2 빔 제어부(140)에 한 쌍의 원통형 렌즈(cylindrical lens)를 추가로 배치해 입사광의 장축을 줄이거나 단축을 늘림으로써 여기광을 원의 형태로 만들 수 있다.
본 발명은 또한 자동 여기광 조절장치를 사용한 자동 여기광 조절방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 자동 여기광 조절방법을 통하여 상세히 설명한다.
상기 자동 여기광 조절방법은, (a) 임의의 샘플 또는 초점조절용 이미지를 관찰하여 대물렌즈의 초점을 조절하는 단계; (b) 상기 여기광을 상기 대물렌즈의 관측영역에 균일하게 조사하는 단계; (c) 상기 가이드 빔을 상기 여기광의 공급영역 중앙에 초점을 형성하도록 조사하는 단계; (d) 상기 가이드 빔의 초점 위치를 측정하는 단계; (e) 샘플을 상기 대물렌즈의 관찰영역에 공급한 다음, 상기 대물렌즈의 초점을 조절하는 단계; 및 (f) 상기 가이드 빔의 초점이 일정한 위치에 유지되도록 상기 제3 빔 제어부를 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (a)단계는 임의의 샘플 또는 초점조절용 이미지를 관찰하여 대물렌즈(310)의 초점을 조절하는 단계이다. 이때 상기 임의의 샘플은 관찰이 필요한 샘플과 동일 또는 유사한 샘플을 사용하는 것이 바람직하며, 이러한 대물렌즈(310)의 조절을 통하여 대물렌즈(310)와 샘플면(210) 사이의 초기 거리를 정렬하고 초점을 조절하여 명확한 화상을 얻도록 할 수 있다. 또한 상기 임의의 샘플 외에도 초점 조절용 이미지를 사용할 수 있으며, 이러한 초점 조절용 이미지의 경우 용이하게 초점을 조절하기 위하여 격자형 무늬, 숫자, 또는 문자를 이용할 수 있다. 이러한 이미지의 경우 직관적으로 초점의 변화를 감지할 수 있으며, 이에 따라 사용자가 용이하게 초점을 조절하고 대물렌즈를 초기 정렬할 수 있다.
상기 (b) 단계는 상기 여기광(111)을 상기 대물렌즈(310)의 관측영역에 균일하게 조사하는 단계이다. 이 단계에서 상기 여기광(111)의 조사각도, 밝기, 조사범위 등을 조절할 수 있으며, 이러한 조절은 상기 제1 빔 조절부(112)를 통하여 수행될 수 있다. 또한 이 단계에서 상기 여기광(111)의 조사각도를 조절하는 것으로 상기 여기광(111)이 최대한 원형에 가까우면서도 상기 대물렌즈(310)로 직접 조사되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 아울러 후술할 가이드 빔의 조사각도는 상기 여기광과 일체화되어 움식일 수 있으므로 상기 여기광의 조사각도가 조절되며 동시에 조절되도록 하는 것이 바람직하다.
상기 (c) 단계는 상기 가이드 빔(121)을 상기 여기광의 공급영역 중앙에 초점(220)을 형성하도록 조사하는 단계이다. 이 단계에서는 상기 여기광(111)이 조사되고 있는 상태로 상기 가이드 빔(121)의 초점(220)이 상기 여기광(111)의 중심에 위치하도록 조절할 수 있으며, 또한 상기 가이드 빔(121)의 밝기가 조절되어 적절한 밝기를 가질 수 있다.
상기와 같이 (a) 단계, (b)단계 및 (c)단계를 통하여 상기 여기광 및 상기 가이드 빔의 초기 정렬이 완료될 수 있다. 이 단계가 완료되면 샘플을 관찰한 초기정렬이 완료된 것이며, 이렇게 완료된 초기정렬을 기준으로 하여 후술할 자동 조절 및 관찰이 이루어질 수 있다.
상기 (d)단계는 상기 가이드 빔의 초점 위치를 측정하는 단계이다(도 7 참조). 상기 가이드 빔(121)의 경우 상기 여기광(111)의 중앙에 위치하면서 일정한 크기를 가지도록 샘플면(210)에 초점(220)을 형성할 수 있다. 따라서 상기 가이드 빔(121) 초점(220)의 위치를 측정하는 것으로 상기 샘플면(210)의 이동을 감지할 수 있으며, 이러한 이동을 감지하기 위하여 최초의 초점을 측정하고 이를 기준점으로 삼을 수 있다.
아울러 상기 (d)단계가 완료된 이후 상기 여기광(111)은 차단되는 것이 바람직하다. 이후의 단계에서는 형광체와 결합된 샘플이 공급되며, 상기 여기광이 지속적으로 조사되는 경우에는 장기간 형광체가 노출되어 광표백이 나타날 수 있다. 따라서 상기와 같이 초기 정렬 및 최초 초점의 측정이 이루어진 이후에는 상기 여기광을 차단하여 광표백을 막는 것이 바람직하다.
상기 (e)단계는 샘플(200)을 상기 대물렌즈(310)의 관찰영역에 공급한 다음, 상기 대물렌즈(310)의 초점을 조절하는 단계이다. 이 단계에서 관찰을 위한 샘플이 공급될 수 있으며, 샘플의 관찰이 용이하도록 대물렌즈의 초점을 미세 조절할 수 있다. 다만 이 단계에서는 위에서 살펴본 바와 같이 샘플면의 변화로 인한 높이차이가 발생할 수 있으며, 이에 따라 상기 여기광의 조사위치가 변화될 수 있으므로 후술할 자동 여기광 조절단계를 필요로 한다.
상기 (f)단계는 상기 가이드 빔의 초점이 일정한 위치에 유지되도록 상기 제3 빔 제어부(140)를 조절하는 단계이다. 상기 (f)단계에서 샘플(200)이 공급되면 샘플면(210)의 차이로 인하여 높이 차이가 발생될 수 있다. 이때 상기와 같은 샘플면의 변화는 상기 여기광(111)의 조사위치를 변화시킬 수 있으며(도 6 참조), 상기 가이드 빔의 초점위치 또한 변화시킬 수 있다(도 8 참조). 따라서 상기 가이드 빔(121)을 상기 (d)단계에서 측정된 초점위치로 이동시키면(도 7 참조) 상기 여기광 역시 정확한 위치에 조사되도록 할 수 있다.
이러한 가이드 빔의 위치 조절은 상기 제3 빔 조절부(140)를 통하여 수행할 수 있으며, 상기 제3 빔 조절부(140)의 경우 빔 결합부(130)를 통과한 상기 가이드 빔 및 상기 여기광을 동시에 조절할 수 있으므로, 상기와 같은 가이드 빔의 위치를 조절하는 것만으로도 상기 여기광을 정확한 위치에 정렬할 수 있다.
상기와 같이 (f)단계가 완료된 이후 샘플의 형광을 관찰할 수 있다. 이를 위하여 상기 (d)단계 이후 차단된 여기광을 재조사할 수 있으며 상기 가이드 빔을 차단하는 것도 가능하다.
아울러 상기 가이드 빔과 상기 형광은 하나의 카메라를 통하여 촬영 및 관찰될 수도 있지만, 바람직하게는 2개의 카메라(330, 340)를 통하여 각각 관찰될 수 있다(도 1참조). 이를 위하여 상기 대물렌즈(310)의 후단 즉 상기 대물렌즈를 기준으로 상기 샘플의 반대편에는 다이크로익 미러(320)를 설치하여 상기 샘플에서 발생되는 형광과 상기 가이드빔을 분리할 수 있다. 또한 상기 가이드 빔은 좁은 범위에 초점을 가지는 강력한 빛을 형성하게 되므로 상기 다이크로익 미러를 통하여 상기 가이드 빔을 완전히 분리하지 못하는 경우 상기 형광 관찰용 카메라(330)의 전면에 다이크로익 필터를 추가적으로 설치할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1
도 1에 나타난 바와 같이 광원에 자동 여기광 조절 장치를 설치하였다. 이후 샘플이 놓여지는 부분에 정렬용 샘플을 삽입한 다음, 대물렌즈의 초점을 정렬하여 상기 정렬용 샘플이 또렷하게 관찰되도록 하였다. 상기 대물렌즈의 정렬이 완료된 이후 제1 광원 및 제1 빔 제어부를 사용하여 여기광을 상기 대물렌즈의 관찰영역에 조사되면서 상기 여기광이 상기 대물렌즈에는 직접 조사되지 않도록 조절하였다. 이때 상기 여기광이 상기 샘플면에 입사되는 각도는 43도로 측정되었다.
상기 샘플면에 형성되는 여기광 조사영역의 중앙에 가이드 빔이 초첨을 형성할 수 있도록 제2 빔 제어부를 조절하였다. 이때 상기 가이드 빔은 450 nm의 피크파장을 가지는 레이저를 사용하였다
가이드 빔의 위치좌표를 확인하기 위하여 가이드 빔을 가우시안 함수로 피팅하였으며, 이를 지속적으로 수행하여 가이드 빔의 중심점을 좌표(Y)를 표시하였다.
샘플에 여기광을 조사하고 샘플 관찰용 카메라로 샘플을 관찰하며 샘플이 가장 선명하게 보이도록 대물렌즈의 위치를 미세 조절하였고 이때 가이드 빔의 위치(최초 Y좌표)는 200으로 결정(노란선)되었다.
상기 제2 빔 제어부를 사용한 정렬이 완료된 이후 상기 샘플면을 상하로 이동하여 상기 대물렌즈와의 거리가 달라졌을 때 상기 가이드 빔의 변화를 확인하였다.
도 8에 나타난 바와 같이 거리가 1 ㎛ 이동할 때마다 가이드 빔의 중심이 약 10픽셀정도가 이동하는 것을 확인할 수 있었으며(도 8에서 Y는 샘플면과 대물렌즈 사이의 거리 변화량), 이를 통하여 상기 가이드 빔의 좌표를 200에 유지하는 경우 상기 샘플면과 대물렌즈 사이의 거리도 유지할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 9에 나타난 바와 같이 본 발명의 경우 가우시안 함수를 이용한 피팅을 수행하고 있으므로 픽셀의 정수배가 아닌 소수점아래 픽셀범위까지 확인할 수 있었으며, 이는 본 발명의 가이드 빔을 사용하는 경우 더욱 정밀한 제어가 가능한 것을 의미한다. 거리가 1 ㎛ 이동할 때마다 가이드 빔의 중심이 약 10픽셀정도가 이동하므로, 가이드 빔의 중심이 1 픽셀 이동할 경우 샘플면과 대물렌즈 사이의 거리는 100 nm 이동했음을 알 수 있고, 0.1 픽셀은 10 nm, 0.01 픽셀은 1 nm 이동했음을 알 수 있다. 이와 같이 가우시안 함수로 피팅함으로써 매우 정밀한 제어가 가능하였다.
실시예 2
상기 실시예 1의 결과를 사용하여 여기광의 이동을 정렬할 수 있는지 확인하였다. 도 10에 나타난 바와 같이 샘플면을 상하로 이동시킨 경우(즉 샘플면과 대물렌즈 사이의 거리변화를 수행한 경우) 상기 여기광이 상측 또는 하측으로 이동되는 것을 확인하였지만, 상기 가이드 빔의 위치를 초기위치로 이동시키는 경우 상기 여기광 역시 중앙에 정렬되는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
110 : 제1 광원
111 : 여기광
112 : 제1 빔 제어부
120 : 제2 광원
121 : 가이드 빔
122 : 제2 빔 제어부
130 : 빔 결합부
140 : 제3 빔 제어부
200 : 샘플
210 : 샘플면
220 : 초점
310 : 대물렌즈
320 : 다이크로익 미러
330 : 형광 관찰 카메라
340 : 가이드 빔 관찰 카메라

Claims (13)

  1. 광학현미경의 광원부에 설치되며,
    샘플의 형광체를 여기시키기 위한 여기광을 발생시키는 제1 광원;
    상기 샘플면에 초점을 형성하기 위한 가이드 빔을 발생시키는 제2 광원;
    상기 여기광과 상기 가이드 빔의 조사방향을 일치시키는 빔 결합부; 및
    상기 샘플면에 형성되는 상기 가이드 빔의 초점위치 변화에 따라 상기 여기광의 조사범위 및 조사위치를 조절하는 제3 빔 제어부;
    를 포함하는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 여기광 및 상기 가이드 빔은 상기 샘플면을 기준으로 상기 대물렌즈의 반대편에서 조사되는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 여기광 및 상기 가이드 빔은 상기 샘플면과 5~85°의 각도를 가지고 조사되는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제3 빔 제어부는 상기 빔 결합부를 통과한 상기 여기광 및 상기 가이드 빔을 동시에 조절하며,
    상기 가이드 빔의 초점을 일정한 위치에 유지하여 상기 여기광의 조사위치와 조사범위를 조절하는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 여기광의 조사위치 및 조사범위를 조절하는 제1 빔 제어부를 포함하는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 가이드 빔의 초점 및 조사위치를 조절하는 제2 빔 제어부를 포함하는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 가이드 빔은 상기 샘플면에서 초점을 형성하며,
    상기 여기광은 상기 샘플면 전체영역에 조사되는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 가이드 빔은 상기 여기광 조사영역의 중앙부에 초점을 형성하는 광학 현미경을 위한 자동 여기광 조절장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 자동 여기광 조절장치를 사용한 자동 여기광 조절방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 자동 여기광 조절방법은,
    (a) 임의의 샘플 또는 초점조절용 이미지를 관찰하여 대물렌즈의 초점을 조절하는 단계;
    (b) 상기 여기광을 상기 대물렌즈의 관측영역에 균일하게 조사하는 단계;
    (c) 상기 가이드 빔을 상기 여기광의 공급영역 중앙에 초점을 형성하도록 조사하는 단계;
    (d) 상기 가이드 빔의 초점 위치를 측정하는 단계;
    (e) 샘플을 상기 대물렌즈의 관찰영역에 공급한 다음, 상기 대물렌즈의 초점을 조절하는 단계; 및
    (f) 상기 가이드 빔의 초점이 일정한 위치에 유지되도록 상기 제3 빔 제어부를 조절하는 단계;
    를 포함하는 자동 여기광 조절방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 가이드 빔은 제1 카메라를 통하여 관찰되며,
    상기 샘플에서 발생되는 형광은 제2 카메라를 통하여 관찰되는 자동 여기광 조절방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 여기광은 상기 (d)단계 이후 차단되며, 상기 (f)단계 이후 재조사되어 상기 샘플을 여기시키는 것인 자동 여기광 조절방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 가이드 빔은 상기 (f)단계이후 상기 여기광의 재조사시 차단되는 것인 자동 여기광 조절방법.
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