KR20240053519A - 장내 미생물 군집의 변화를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물 - Google Patents

장내 미생물 군집의 변화를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물 Download PDF

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김나영
남령희
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서울대학교산학협력단
서울대학교병원
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Abstract

본 명세서에서는 장내 미생물 군집의 변화를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물, 키트 및 이를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법이 기술된다. 일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 장내 미생물을 검출하여 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측하는 효과가 우수하다.

Description

장내 미생물 군집의 변화를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물{A composition for diagnosing or predicting treatment responsiveness using changes in the intestinal microbial community}
본 명세서에서는 장내 미생물 군집의 변화를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물, 키트 및 이를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법이 기술된다.
최근 장내 미생물이 다양한 인간 질병에서 중요한 역할을 한다는 점을 제시하는 많은 연구 결과들이 있다. 장내 미생물총은 숙주 면역 및 대사 기능의 항상성을 유지하기 때문에 장내 미생물총의 불균형은 위장 질환, 암, 대사 장애 및 면역 장애와 관련이 있다. 대장암(CRC) 환자를 대상으로 한 메타게놈 분석 결과, 대장암의 발생이 장내 미생물총의 불균형과 관련이 있는 것으로 나타났다. Fusobacterium nucleatum, Streptococcus bovis, S. galloliticus, Escherichia coli, Bacteroides fragilis와 같은 대장암 발병의 원인으로 추정되는 기회감염 병원체는 대장암 환자에서 증가하였다. 예를 들어, F. nucleatum 감염이 대장암 마우스 모델과 HCT116 및 SW480 결장암 세포에서 카스파제 활성화 및 모집 도메인 3(caspase activation and recruitment domain 3, CARD3) 발현의 상향 조절을 통해 자가포식 신호를 활성화함으로써 대장암 전이를 촉진한다고 보고된 바 있으며, F. nucleatum은 대장암 세포에서 baculoviral IAP repeat-keeping 3(BIRC3)의 발현을 상향 조절하여 5-플루오로우라실(5-FU)에 대한 화학 내성을 촉진한다고 보고된 바 있다. 현재 질병과 장내 미생물 군집 사이의 관계에 대한 많은 연구가 진행되고 있지만 대장암의 발병기전에서 장내 미생물군 유전체의 명확한 역할은 확립된 바가 없다.
남성의 대장암 발병률은 여성보다 높다. 대장암 예방을 위해 여성의 성호르몬(예컨대, 에스트로겐)에 대하여 조사한 결과, 내인성 양측 난소절제술(OVX)로 내인성 에스트로겐이 제거된 암컷 마우스 모델의 경우 정상 암컷과 비교하여 변경된 장내 미생물 조성을 나타냈다. 또한, 장내 미생물총에 의해 생성되는 대사 신호 분자인 단쇄 지방산의 수준은 OVX 암컷 마우스에서 현저하게 하향 조절된다는 연구결과가 존재한다.
한편, 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI)는 독성이 낮고 치료 효과가 좋아 암 환자의 생존기간 연장에 효과적이다. 가장 잘 알려진 ICI는 프로그램된 세포 사멸 수용체-1(programmed cell death receptor-1, PD-1), 프로그램된 세포 사멸 수용체-1 리간드(programmed cell death receptor-1 ligand, PD-L1) 및 세포독성 T 림프구 관련 단백질(cytotoxic T lymphocyte-associated protein, CTLA-4)을 표적으로 한다. 활성화된 T 세포의 표면에서 정상적으로 상향 조절되는 PD-1은 항원 제시 세포 및 기타 면역 세포에서 발현되는 PD-L1에 결합하고 음성 공동 자극 신호를 받아 T 세포 활성화를 제한한다. 암세포에서 PD-L1의 과발현은 면역 회피를 유도하고 궁극적으로 면역 억제 종양 미세 환경(TME)을 형성한다. 흥미롭게도, 에스트로겐은 PD-L1 발현으로 대표되는 면역 미세 환경을 개선하였다. 또한, 에스트로겐은 PD-L1 발현을 하향 조절하고 종양 관련 세포 집단을 조절함으로써 MC38 종양 성장을 억제하여 MC38 종양 모델에서 항 PD-L1 항체의 효과를 증가시켰다. 이에, 본 발명자들은 대장암 마우스 모델에서 장내 미생물군 유전체 조성이 성별, 항 PD-L1(programmed death-ligand 1) 항체 또는 E2(17β-estradiol) 치료와 같은 다양한 조건에서 조절될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 장내 미생물 군집의 변화를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 장내 미생물 군집의 변화를 이용한 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에서 미생물 검출 제제를 포함하고, 상기 미생물은 Parabacteroides goldsteinii, Lactobacillus murinus, Muribaculaceae 과(Family), Lachnospiraceae 과 및 Ruminococcaceae 과로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명은 다른 측면에서 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명은 또 다른 측면에서 다음 단계를 포함하고, 상기 미생물은 Parabacteroides goldsteinii, Lactobacillus murinus, Muribaculaceae 과(Family), Lachnospiraceae 과 및 Ruminococcaceae 과로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
(a) 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 DNA로부터 장내 미생물의 풍부도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 분석된 장내 미생물의 풍부도를 대조군과 비교하는 단계.
일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 장내 미생물을 검출하여 대장암 진단 또는 치료 반응성을 예측하는 효과가 우수하다.
다른 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 임의의 대장암 환자의 장내 미생물 군의 정보를 확인하여 면역관문 억제제 또는 에스트로겐 치료에 대한 치료 반응성을 예측할 수 있어, 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하며, 적절한 예후 예측 및 치료 방법의 결정을 보다 합리적으로 수행할 수 있다.
도 1은 MC38 대장암 마우스 모델에서 장내 미생물 군집에 대한 항 PD-L1(programmed death-ligand 1) 항체 및/또는 E2(17β-estradiol) 의 효과를 평가하기 위한 실험 설계를 나타낸다. 도 1A는 실험 설계도이며, 도 1B는 데이터 분석 방식을 나타낸다.
도 2는 장내 미생물총의 베타 다양성을 나타낸다. 도 2A 및 2B는 MC38 수컷 마우스의 종 수준에서 UniFrac 기반 PCoA 및 UPGMA 트리에 의한 시료 클러스터링에 관한 것이고, 도 2C 및 2D는 MC38 암컷 마우스의 종 수준에서 UniFrac 기반 PCoA 및 UPGMA 트리에 의한 시료 클러스터링 결과이다. MC38 수컷 및 암컷 마우스는 종 수준에서 일반화된 UniFrac 방법을 사용하여 클러스터링되었다. 박테리아 개체군 구조의 유사성에 대한 의미는 PERMANOVA에 의해 분석되었다. 각 그룹의 군집 및 계통수는 다른 색상으로 표시된다. M_CON, 파란색; M_항-PD-L1, 녹색; M_E2, 회색; M_항-PD-L1+E2, 보라색; F_CON, 빨간색; F_항-PD-L1, 주황색. M, 수컷; F, 암컷; CON, 대조군; PCoA, principal coordinates analysis; UPGMA, unweighted pair group method with arithmetic mean; PERMANOMA, permutational multivariate analysis of variance.
도 3은 MC38 대장암 모델에서 항 PD-L1 및/또는 E2에 의한 분류학적 바이오마커 확인 결과이다. 도 3A 내지 3D는 선형 판별 분석(Linear discriminant analysis, LDA) 효과 크기(Linear discriminant analysis effect size LEfSe) 분석 결과이다. 색상 막대는 표시된 조건에서 풍부한 종의 LDA 점수(log10)를 보여준다. (A-C) 파란색 막대(수컷 대조군), (A) 녹색 막대(항 PD-L1 항체 처리된 수컷), (B) 회색 막대(E2 처리된 수컷), (C) 보라색 막대(항 -PD-L1 항체 및 E2이 병용 처리된 수컷), (D) 빨간색 막대(암컷 대조군), 주황색 막대(항 PD-L1 항체 처리된 암컷). 종명의 색상은 각 종의 특성을 나타낸다. 공생 박테리아는 노란색, 기회감염 병원체는 주황색, 특징되지 않는 경우 색상 없음으로 나타낸다. 도 3E 및 3F는 LEfSe 데이터를 기반으로 하는 벤 다이어그램이며, (E) MC38 수컷 마우스에서 항 PD-L1 항체 및/또는 E2 처리에 의한 변화를 나타내는 박테리아, (F) MC38 수컷 및 암컷 마우스에서 항 PD-L1 항체 처리로 공통적인 변화를 나타내는 박테리아의 식별 결과이다.
도 4는 장내 미생물의 분류학적 구성을 나타낸다. 도 4A는 MC38 수컷 및 암컷 마우스에서 대조군(왼쪽 패널) 및 항 PD-L1 항체 처리 군(오른쪽 패널)의 문 수준에서 장내 미생물 조성을 나타내며, 도4B는 MC38 수컷 및 암컷 마우스에서 대조군(왼쪽 패널) 및 항 PD-L1 처리 군(오른쪽 패널)의 과(family) 수준에서 장내 미생물군 조성을 나타낸다. *, P<0.05, 수컷 대조군 대 암컷 대조군, 항 PD-L1 항체 처리된 수컷 대 항 PD-L1 항체 처리된 암컷. 도 4C는 MC38 수컷 및 암컷 마우스에서 대조군 및 항 PD-L1 항체 처리군의 Firmicutes/Bacteroidetes 비율을 나타낸다.
도 5는 장내 미생물총의 베타 다양성을 나타낸다. 도 5A는 MC38 수컷 및 암컷 대조군의 종 수준에서 UniFrac 기반 PCoA 및 UPGMA 트리에 의한 시료 클러스터링에 관한 것이고, 도5B는 항 PD-L1 항체 처리 MC38 수컷 및 암컷 마우스의 종 수준에서 UniFrac 기반 PCoA 및 UPGMA 트리에 의한 시료 클러스터링에 관한 것이다. M_CON, 파란색; F_CON, 빨간색; M_항-PD-L1, 녹색; F_항-PD-L1, 주황색. M, 수컷; F, 암컷; CON, 대조군.
도 6은 MC38 수컷 및 암컷 마우스에서 대조군 및 항 PD-L1 항체 처리에 따른 성 바이오 마커의 확인 결과이다. 도 6A 및 6B는 선형 판별 분석(LDA) 효과 크기(LEfSe) 분석 결과이다. 색상 막대는 표시된 조건에서 풍부한 종의 LDA 점수(log10)를 보여준다. (A) 파란색 막대(수컷 대조군) 및 빨간색 막대(암컷 대조군), (B) 녹색 막대(항 PD-L1 처리된 수컷) 및 주황색 막대(항 PD-L1 항체 처리된 암컷). 도 6C는 LEfSe 데이터를 기반으로 하는 벤 다이어그램이며, MC38 수컷 및 암컷 마우스에서 대조군 및 항 PD-L1 항체 처리에 따른 성 의존적 변화를 나타내는 박테리아의 식별 결과를 나타낸다.
도 7은 MC38 대장암 모델에서 에스트로겐이 종양 미세 환경을 조절하고 동시에 장내 미생물 군집을 변경하여 항-PD-L1의 효과를 증가시키고 종양 크기 감소에 기여하는 조절 메커니즘에 관한 것이다. CAFs, cancer-associated fibroblasts; E2, 17β-estradiol; PD-L1, programmed death-ligand 1; PD-1, programmed cell death-1; TAM, tumor-associated macrophages.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
종래 연구에서 본 발명자들은 MC38 대장암 마우스 모델에서 항 PD-L1(programmed death-ligand 1) 항체 및 E2(17β-estradiol)의 병용 요법의 효과와 대장암 성장, PD-L1 발현 및 종양 관련 세포 집단에 대한 성별 및 에스트로겐의 효과를 조사한 바 있다. MC38 세포 주입 전 E2 처리는 PD-L1 발현을 감소시키고 수컷 마우스에서 종양 관련 세포 집단을 조절함으로써 MC38 대장암 성장을 억제하였다. 또한, 항 PD-L1 항체와 E2를 함께 처리하면 항 PD-L1 항체 또는 E2 단독 처리에 비해 수컷 마우스에서 MC38 종양 성장을 유의하게 억제하고 PD-L1 발현 세포를 감소시켰다. 나아가, 항 PD-L1 항체 및 E2 병용 치료는 종양 관련 대식세포(TAM)(CD11b+F4/80+)의 감소와 종양 부담에서 M1 TMA(CD11b+F4/80+CD86+)의 증가를 나타냈다.
본 발명에서는 항 PD-L1 특이적(Parabacteroides goldsteinii) 및 E2 특이적(Lachnospiraceae 과) 분류학적 바이오마커를 확인하였다. 흥미롭게도, Parabacteroides goldsteinii는 수컷 및 암컷 마우스 모두 항 PD-L1 처리 군에서 풍부하였으며, Lactobacillus murinus 는 단독 처리군(항-PD-L1 항체 또는 E2)보다 병용 처리군(항-PD-L1 항체 + E2)에서 더욱 증가하였다. 또한, 대장암이 진행되는 동안 남성의 장내 미생물군(예컨대, Lachnospiraceae 과 및 Ruminococcaceae 과)에 변화를 일으켜 대장암 억제를 높일 수 있다는 점을 확인하였다.
이에, 본 발명은 일 관점에서 미생물 검출 제제를 포함하고, 상기 미생물은 Parabacteroides goldsteinii, Lactobacillus murinus, Muribaculaceae 과(Family), Lachnospiraceae 과 및 Ruminococcaceae 과로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 상기 미생물 분류는 종(species), 속(genus), 과(family), 목(order), 강 (class), 문(phylum) 계에 따른 계통학적 분류를 따른다.
본 명세서에서 특성화(characterized)되지 않은 박테리아는 "PAC", 혹은 "AB", "AF", "AM", "DQ", "EU", "FJ", "HM", "JK", "KE", "LN" 뒤에 고유 번호를 붙여 명명한다.
본 명세서에서 "치료 반응성"이란 대상체가 대장암의 치료요법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하는 것을 의미하고, "예측"이란 대상체가 대장암 치료 후 재발할 가능성, 생존 여부 또는 생존할 가능성을 미리 판단하는 것을 의미한다. 또한, "대장암 진단"이란 대상체에 대하여 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 일 측면에 따른 목적상, 진단은 대장암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 임의의 특정 대상체에 대한 대장암 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물, 키트 또는 방법은 대장암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 미생물 검출 제제는 시료 내에서 대장암의 예측 또는 진단을 위해 Parabacteroides goldsteinii, Lactobacillus murinus, Muribaculaceae 과(Family), Lachnospiraceae 과 및 Ruminococcaceae 과로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 미생물의 16S rRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호 화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 혼성화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 프라이머를 이용한 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서 "프라이머(primer)"란 유전자의 표적 부위에 해당하는 특정 영역을 PCR을 이용하여 증폭하기 위하여 사용하는 유전자 특정 영역의 말단에 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그 변이체를 의미한다. 상기 프라이머는 특정 영역 말단과 완전히 상보적일 것을 요구하지 않으며, 상기 말 단에 혼성화되어 이중사슬 구조를 형성할 정도로 상보적이라면 사용될 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 미생물 검출 제제는 서열번호 1로 표시되는 정방향 프라이머(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-XXXXXXXX-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')및/또는 서열번호 2로 표시되는 역방향 프라이머(5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXXXX-GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 밑줄 친 서열은 표적 영역 프라이머를 나타내며, 상기 XXXXXXXX는 인덱스 서열(index sequence)을 나타내고, 상기 인덱스 서열로 분자 고유 서열을 포함할 수 있다. 상기 분자 고유 서열은 각 핵산분자마다 고유하게 부착되는 바코드 서열로 상이한 핵산분자가 상호 구분될 수 있게 하며, 분자 바코딩 서열 또는 분자 인덱싱 바코드 등 다양한 명칭으로 불릴 수 있다. 상기 분자 고유 서열의 길이는 핵산분자의 개수를 고려하여 조절될 수 있다. 상기 분자 고유 서열은 4개 내지 20개의 뉴클레오티드, 4개 내지 16개의 뉴클레오티드, 4개 내지 12개의 뉴클레오티드, 4개 내지 10개의 뉴클레오티드, 또는 6개 내지 8개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다. 상기 분자 고유 서열은 무작위적으로 합성된 염기서열일 수 있다. 상기 무작위적 합성은 특정 위치에서 A, G, T, C 중 하나의 염기가 100%의 확률로 합성되지 아니한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "프로브(probe)"란 유전자의 표적 부위와 상보적으로 결합할 수 있는 서열의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드, 그 변이체, 또는 폴리뉴클레오티드와 이에 결합된 표지 물질을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "혼성화(hybridization)"란 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 뿐 아니라 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv를 모두 포함하는 것일 수 있다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 상기 미생물의 존재 여부를 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-글루코시다제, β-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈옥시다제, 헥소키 나제와 GDPase, RNase, 글루코즈옥시다제와루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트카복실라제, 아스파르테이트아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트데카복실라제, β라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 산화환원 분자에는 페로센, 루테늄착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+,[RU(bpy)3]2+,[MO(CN)8]4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3 H, 14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,125I,131I,186Re등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학 적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유 리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 피험자의 시료(sample)에 적용되는 것일 수 있고, 상기 시료는, 예를 들어, 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 치료는 항-PD-L1(programmed death-ligand 1) 및/또는 에스트로겐을 적용하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 "적용"은 임의의 적절한 방법으로 적용 대상에 상기 조성물을 제공하는 것을 의미하며, 투여, 도포, 흡수 및 섭취 등을 포함하는 의미이다. 이때, 적용 대상은 상기 조성물을 적용할 수 있는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 Muribaculaceae 과(Family)의 미생물은 PAC001068_g_uc 또는 PAC001070_s일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 Lachnospiraceae 과(Family)의 미생물은 PAC001294일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 Ruminococcaceae 과 (Family)의 미생물은 PAC002541일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 조성물을 포함하는, 대장암 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 미생물, 검출 제제, 피험자, 시료 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 정상 대조군과 비교하여 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 감소되어 있거나 Muribaculaceae 과(Family)의 풍부도가 증가되어 있는 경우 대장암으로 판단하거나, 치료 전 대조군과 비교하여 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 증가되어 있거나 Muribaculaceae 과(Family)의 풍부도가 감소되어 있는 경우 대장암 치료 반응성이 좋은 것으로 판단할 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 남성 대상체에서 정상 대조군과 비교하여 Lachnospiraceae 과의 박테리아의 풍부도가 증가되어 있거나 Ruminococcaceae 과의 박테리아의 풍부도가 감소되어 있는 경우 대장암으로 판단할 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 남성 대상체에서 치료 전 대조군과 비교하여 Lachnospiraceae 과의 박테리아의 풍부도가 감소되어 있거나 Ruminococcaceae 과의 박테리아의 풍부도가 증가되어 있는 경우 대장암 치료 반응성이 좋은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 다음 단계를 포함하고, 하기 미생물은 Parabacteroides goldsteinii, Lactobacillus murinus, Muribaculaceae 과(Family), Lachnospiraceae 과 및 Ruminococcaceae 과로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 대장암 예측 또는 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
(a) 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA로부터 장내 미생물의 풍부도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 분석된 장내 미생물의 풍부도를 대조군과 비교하는 단계.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 미생물의 16S rRNA에 대한 PCR 프라이머쌍을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계는 서열번호 1로 표시되는 프라이머 및/또는 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 치료는 항-PD-L1(programmed death-ligand 1) 및/또는 에스트로겐을 적용하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 Muribaculaceae 과(Family)의 미생물은 PAC001068_g_uc 또는 PAC001070_s일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 Lachnospiraceae 과(Family)의 미생물은 PAC001294일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 Ruminococcaceae 과 (Family)의 미생물은 PAC002541일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 분석된 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 정상 대조군과 비교하여 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 감소되어 있거나 Muribaculaceae 과(Family)의 풍부도가 증가되어 있는 경우 대장암으로 판단하거나, 치료 전 대조군과 비교하여 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 증가되어 있거나 Muribaculaceae 과(Family)의 풍부도가 감소되어 있는 경우 대장암 치료 반응성이 좋은 것으로 판단할 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 남성 대상체에서 정상 대조군과 비교하여 상기 (b) 단계에서 분석된 Lachnospiraceae 과의 박테리아의 풍부도가 증가되어 있거나 Ruminococcaceae 과의 박테리아의 풍부도가 감소되어 있는 경우 대장암으로 판단할 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 남성 대상체에서 치료 전 대조군과 비교하여 상기 (b) 단계에서 분석된 Lachnospiraceae 과의 박테리아의 풍부도가 감소되어 있거나 Ruminococcaceae 과의 박테리아의 풍부도가 증가되어 있는 경우 대장암 치료 반응성이 좋은 것으로 판단할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실험 재료 및 방법
(1-1) 시료 준비
E2(17β-estradiol) 및 올리브 오일은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, 미국)에서 구입하여 실온에서 보관하였다. E2 용액은 올리브 오일에 녹인 후 준비하였다. 생체 내 연구용 항 마우스 PD-L1(programmed death-ligand 1) 항체와 이의 이소타입 대조군(isotype control) 항체는 Bio X Cell(Lebanon, NH, 미국)에서 구입하여 4℃의 냉장고에 보관하였다. MC38 세포는 Kerafast Inc.(Boston, MA, 미국)에서 구입하였다. 세포 배양 배지 및 시약은 Gibco BRL(Grand Island, NY, 미국)에서 구입하였다.
(1-2) MC38 세포 배양
MC38 대장암 마우스 세포는 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서, 10% 소태아혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 10mM HEPES 및 항생제-항진균제 혼합물이 보충된 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)에서 배양하였다. 이식을 위해 MC38 세포를 Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세척하고 트립신 처리하고 DPBS에 최종 재현탁하기 전에 생존력을 확인하였다.
(1-3) 마우스 하우징 조건
C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스(7주령)는 오리엔트 바이오(서울, 한국)에서 구입하고 특정 병원체가 없는 조건에서 12/12시간 명암 주기로 23℃의 필터 탑 케이지(filter-top cage)에 수용하였다. 적응 1주일 후, 마우스는 성별(수컷과 암컷)에 따라 무작위로 나뉘고 필터 탑 케이지의 같은 방에 수용되었으며 케이지당 3-5마리의 마우스를 유지하였다. 실험 기간 동안 개별 마우스를 추적할 수 있도록 동물을 이어 펀치로 표시하였다. 모든 동물 실험은 분당서울대학교병원 동물관리위원회(IACUC)의 승인을 받았다(승인번호 BA-2013-316-023-01). 모든 실험은 분당서울대학교병원 IACUC의 관련 가이드라인 및 규정과 Animals in Research: Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) 가이드라인의 권장 사항에 따라 수행하였다.
(1-4) MC38 대장암 마우스 모델의 확립 및 대변 DNA 추출
수컷 및 암컷 마우스(8주령)의 오른쪽 옆구리에 100μL DPBS에 재현탁된 0.5 Х 106 MC38 세포를 피하 주사하였다. 각 그룹의 10마리의 마우스가 MC38 세포 이식에 사용되었다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, MC38 세포 이식 3일 전에 E2(10 mg/kg)를 수컷 마우스에게 1주일 동안 매일 복강 내 투여하였다. 종양 부피는 (최소 직경) 2 Х (최대 직경) Х 0.5 공식을 사용하여 계산하였다. MC38 주사 후, 50 내지 100 mm3 범위의 종양을 갖는 수컷 및 암컷 마우스가 항 PD-L1 항체 주사를 위해 선택되었고, 범위를 벗어난 종양이 있는 마우스는 이 절차에서 제외되었다. 따라서, 도 1A에 기재된 실험에서는 총 60마리의 마우스 중 34마리로부터 결과를 얻었다. 마우스에 항 마우스 PD-L1 항체 또는 이의 이소타입 대조군 항체를 복강 내 10mg/kg의 용량으로 3일마다 총 3회 주사하였다. MC38 세포 주사 후 26일째에 모든 처리군(34개 시료)에서 신선한 대변을 수집하였다. 모든 대변 시료는 즉시 액체 질소에서 동결시켰고 DNA 분리가 될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 게놈 DNA는 QIAamp DNA 스툴 미니 키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 분리하였다.
(1-5) 메타게놈 시퀀싱(Metagenome sequencing)
씨제이바이오사이언스㈜(서울, 한국)에서 분리된 stool DNA에 대해 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 및 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. PCR 증폭은 추출된 DNA와 함께 16S rRNA 유전자의 V3에서 V4 영역을 표적으로 하는 융합 프라이머를 사용하여 수행하였다. 증폭을 위해 하기 표 1의 프라이머를 이용하였다.
프라이머 서열
서열(5'-3') 서열번호
341F 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-XXXXXXXX-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-CCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
805R 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXXXX-GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3' 2
밑줄 친 염기서열은 표적 영역 프라이머를 나타낸다. 증폭은 95℃에서 3분 동안 초기 변성 후 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 프라이머 어닐링 및 72℃에서 30초동안 신장의 25주기를 수행하였으며, 최종적으로 72℃에서 5분 동안 신장을 수행하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 확인하고 Gel Doc 시스템(BioRad, Hercules, CA, 미국)으로 가시화하였다. PCR 산물은 CleanPCR(CleanNA, Waddinxveen, 네덜란드)로 정제하였다. 동일한 농도의 정제된 제품을 함께 모으고 CleanPCR(CleanNA, Waddinxveen, 네덜란드)을 사용하여 짧은 단편(비표적 제품)을 제거하였다. 품질과 제품 크기는 DNA 7500 칩을 사용하여 Bioanalyzer 2100(Agilent, Palo Alto, CA, 미국)에서 평가되었다. 혼합 앰플리콘을 풀링하고 시퀀싱은 Illumina MiSeq Sequencing system(Illumina, 미국)을 사용하여 씨제이바이오사이언스㈜(서울, 한국)에서 수행하였다.
(1-6) 데이터 처리 및 분석
데이터 처리 및 분석은 씨제이바이오사이언스㈜(서울, 한국)에서 수행하였다. 품질 검사로 원시 읽기가 시작됐으며, Trimmomatic 0.32 버전으로 저품질(< Q25)의 필터링을 처리하였다. QC 통과 후 paired-end 시퀀싱 데이터는 기본 매개변수가 있는 VSEARCH 2.13.4 버전의 fastq-mergepairs 명령으로 병합되었다. 그런 다음 프라이머는 0.8의 유사도 컷 오프에서 Myers & Miller의 정렬 알고리즘으로 트리밍 되었다. 16S rRNA를 인코딩하지 않는 비특이적 앰플리콘은 hmm 프로필 포함하는 3.2.1 버전의 HMMER 소프트웨어 패키지에서 nhmmer에 의해 검출되었다. 고유 읽기가 추출되고 중복 읽기가 VSEARCH의 derep_fulllength 명령에 의해 고유 읽기로 클러스터링 되었다. EzBioCloud 16S rRNA 데이터베이스는 VSEARCH의 usearch_global 명령을 사용하여 분류학적 할당에 사용된 후 보다 정확한 쌍별 정렬을 수행하였다. 키메라 읽기는 UCHIME 알고리즘과 EzBioCloud의 키메라가 아닌 16S rRNA 데이터베이스를 사용하여 참조 기반 키메라 감지에 의해 <97% 유사성을 가진 읽기에서 필터링 되었다. 키메라 필터링 후 EzBioCloud 데이터베이스에서 종 수준(<97% 유사성)으로 식별되지 않은 읽기를 컴파일하고 cluster-fast 명령을 사용하여 새로운 클러스터링을 수행하여 추가 OTU(Operational taxonomic unit)를 생성하였다. 마지막으로 단일 읽기(싱글톤)가 있는 OTU는 추가 분석에서 생략되었다.
(1-7) 장내 미생물 다양성 분석
OTU의 희박곡선은 EzBioCloud(씨제이바이오사이언스㈜)에서 생성하였다. 결과 편향을 피하기 위해 읽기를 12,919로 정규화한 다음 분석을 수행하였다. 그룹 간의 시료 차이는 주좌표 분석(principal coordinate analysis, PCoA) 및 산술 평균(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA) 트리(tree)가 있는 비가중 쌍 그룹 방법에 의해 시각화 되었다. PCoA 및 UPGMA와 같은 베타 다양성의 거리는 종 수준에서 일반화된 UniFrac 방법으로 계산하였다. 그리고 그룹간 분리의 유의성은 순열다변량분산분석(permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)을 통해 계산하였다. GraphPad Prism(버전 5.01)을 사용하여 문 및 과 수준에서 상대적 분류학적 풍부도(%)를 결정하기 위해 막대 그래프를 생성하였다. 상기 언급한 모든 분석은 씨제이바이오사이언스㈜의 생물정보학 클라우드 플랫폼인 EzBioCloud 16S 기반 MTP에서 수행하였다.
(1-8) 항 PD-L1 및/또는 E2 특이적 및 성별 특이적 장내 미생물군 결정
상대적 분류학적 풍부도(%)를 기반으로 한 분류학적 바이오마커의 식별은 종 수준에서 선형 판별 분석(linear discriminant analysis, LDA) 효과 크기(LDA effect size, LEfSe) 방법을 사용하여 평가하였다. LEfSe는 다음과 같은 일반 기준으로 EzBioCloud((씨제이바이오사이언스㈜))에서 수행되었다. 1) 클래스 간 factorial Kruskal-Wallis 테스트의 알파 값 < 0.05 2) 하위 클래스 간의 쌍별 Wilcoxon 테스트에 대한 알파 값 < 0.05; 3) 판별 기능에 대한 로그 LDA 점수의 임계값 < 2.0; 및 4) 다중 클래스 분석 세트가 만능으로 설정되었다. 박테리아 특성은 이전 보고서에 따라 "공생 박테리아", "기회감염 병원체" 및 "특징되지 않음"으로 분류되었다. 벤 다이어그램을 사용하여 항 PD-L1 항체 및/또는 E2 처리에 의해 공통적인 변화를 나타내는 박테리아 또는 LEfSe 데이터를 기반으로 성별 차이를 나타내는 박테리아를 식별하였다.
(1-9) 통계 분석
두 그룹 간 또는 두 그룹 이상 간의 차이의 통계적 유의성은 Mann-Whitney 테스트 또는 Kruskal-Wallis H 테스트에 의해 각각 계산하였다. 그래프는 GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, San Diego, 미국)을 사용하여 생성하였으며 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 PASW Statistics 버전 18.0.0(SPSS Inc., 2009, Chicago, IL, 미국)을 사용하여 수행하였다. 차이는 P<0.05에서 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다.
데이터는 다음 분석 방식에 따라 그룹 1(수컷에서 치료 별)과 그룹 2(성별)로 나누어 분석하였다(도 1B). 다음 그룹의 MC38 수컷에서 장내 미생물군 유전체를 비교하여 치료제 처리에 따른 장내 미생물군 유전체 조성의 변화를 조사하였다: 수컷 대조군, 항 PD-L1 항체 처리된 수컷, E2-처리된 수컷, 항 PD-L1 항체 및 E2를 동시 처리한 수컷. 이 분석의 결과에 기초하여, 장내 미생물군 유전체 조성에 대한 항 PD-L1 및/또는 E2의 효과를 조사하였다. 또한, 장내 미생물군 유전체 조성의 성별 차이는 수컷 대조군과 암컷 대조군/ 수컷 및 암컷 항 PD-L1 항체 처리 군의 장내 미생물군 유전체를 비교하여 분석하였다. 이 분석을 기반으로 MC38 대장암 모델에서 장내 미생물군 유전체 구성의 성별 변화를 조사하였다.
MC38 대장암 마우스의 개별 박테리아 군집에 대한 항 PD-L1 및/또는 E2의 효과 확인
개별 박테리아 군집은 PCoA 및 UPGMA 트리로 조사하였다. MC38 대장암 수컷 마우스에서 수컷 대조군 시료의 각 분포는 산발적으로 흩어져 있었다(도 2A). 대조적으로, 항 PD-L1 항체 및/또는 E2로 처리하였을 때, 각 그룹은 항 PD-L1 항체 또는 E2 단독 처리, 항 PD-L1 및 E2 병용 처리 시 강하게 군집화되고 명확하게 분리되었다(도 2A). 2D PCoA에 대한 PERMANOVA 결과는 개별 박테리아 군집을 나타내는 베타 다양성이 MC38 대장암 수컷 마우스에서 달랐지만 유의미하지 않은 것으로 나타났다(모든 그룹에 대해 P=0.060)(도 2A). MC38 대장암 수컷 그룹의 UPGMA 결과도 PCoA와 유사한 클러스터링 패턴을 나타냈다 (도 2B). 다음으로, MC38 대장암 암컷 마우스 그룹에서 MC38 대장암 암컷 대조군과 비교하여 항 PD-L1 처리에 의해 분포 및 클러스터링이 변하였다(도 2C). 2D PCoA에 대한 PERMANOVA 결과는 베타 다양성이 암컷 대조군 마우스와 비교하여 항 PD-L1 항체 처리된 마우스에서 다르지만 유의미하지 않은 것으로 나타났다(P=0.282)(도 2C). MC38 암컷 마우스 그룹의 UPGMA 결과도 PCoA와 유사한 클러스터링 패턴을 보여주었다(도 2D).
종합하면, 유의미한 통계적 차이는 없었으나, MC38 대장암 수컷 마우스의 베타 다양성은 항 PD-L1 항체 단독, E2 단독 또는 항 PD-L1 및 E2 병용 투여에 의해 영향을 받는 것을 확인하였으며, MC38 대장암 암컷 마우스도 항PD-L1 항체 처리에 영향을 받는 것을 확인하였다.
장내 미생물 군집에서 항 PD-L1 또는 E2-특이적 분류학적 바이오마커의 확인
MC38 수컷 마우스 대조군과 비교한 LEfSe 분석에서 항PD-L1 항체 처리 군에서는 15개 박테리아(공생 박테리아 1개: Parabacteroides goldsteinii, 14개 특성화되지 않은 박테리아) 존재비에 변화가 있었고, E2 처리 군에서는 17개 박테리아(모두 특성화되지 않은 박테리아)의 존재비에 변화가 있었으며, 항 PD-L1항체 및 E2 병용 처리 군에서는 17개의 박테리아(2개의 공생 박테리아: Parabacteroides goldsteinii 및 Lactobacillus murinus 그룹, 1개의 기회감염 병원체: Enterobacteriaceae 그룹, 14개의 특성이 지정되지 않은 박테리아)의 존재비에 변화가 있었다(도 3A-C). 수컷 대조군과 비교하여, Parabacteroides goldsteinii 의 존재비는 항PD-L1 항체 처리 군에서 3배 이상 유의하게 증가하였다(도 3A). 항PD-L1 항체 처리 군과 달리 E2 처리 군에서는 수컷 대조군과 비교하여 특성화되지 않은 세균만이 확인되었다(도 3B). 수컷 대조군과 비교하여 항PD-L1 항체 및 E2 병용 처리 군에서 공생 박테리아 Parabacteroides goldsteinii 및 Lactobacillus murinus 그룹의 존재 비율은 증가한 반면 기회감염 병원체 Enterobacteriaceae 그룹의 비율은 감소하였다(도 3C). LEfSe 분석 결과, MC38 암컷 대조군과 비교하여 항PD-L1 처리군에서 공생 박테리아 Parabacteroides goldsteinii 의 존재비가 증가하였다(도 3D).
다음으로, 벤다이어그램 분석을 통해 MC38 마우스 모델에서 항 PD-L1 또는 E2 특정 분류학적 바이오마커를 찾으려고 하였다. 수컷 대조군과 비교하여 항 PD-L1 항체 단독 처리군과 항 PD-L1 항체 및 E2 병용 처리군 모두에서 Parabacteroides goldsteinii 존재비의 증가와 Ruminococcaceae 과 (PAC001490) 존재비 감소를 확인하였다(도 3E). 수컷 대조군과 비교하여, Lachnospiraceae 과(PAC001117)의 존재비의 감소는 E2 단독 처리군 및 항PD-L1 항체 및 E2병용 처리군 모두에서 확인되었다(도 3E). 흥미롭게도, 모든 항PD-L1 항체 처리군, E2 처리군, 항PD-L1 및 E2 병용 처리군에서 공통적인 변화를 보이는 4개의 박테리아를 확인하였다: PAC001716_s 및 PAC001785_s(Ruminococcaceae과)의 존재비 증가 및 PAC001068_g_uc 및 PAC001070_s(Muribaculaceae과)의 존재비 감소(도 3E). 또한, Parabacteroides goldsteinii의 존재비는 성별에 관계없이 각 대조군에 비해 항PD-L1 처리에 의해 공통적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3F).
종합하면, Parabacteroides goldsteini는 수컷과 암컷 모두에서 항 PD-L1치료에 대한 잠재적인 바이오마커임을 확인하였다. 또한, 항PD-L1 항체 및 E2를 처리한 수컷에서 Lactobacillus murinus가 추가 바이오마커로 확인하였다.
성별에 따른 장내 미생물군집의 미생물 다양성 확인
MC38 마우스 모델에서 대조군과 항PD-L1 항체 처리군의 성별에 따른 베타 다양성 지수를 분석하였다. 개별 박테리아 군집은 PCoA 및 UPGMA 트리로 조사하였다. 대조군 간의 성별 비교에서 암컷 그룹은 잘 클러스터링된 반면 수컷 그룹은 산발적으로 흩어져 있어 대조군에서 성별에 따른 분리가 명확하지 않았다(도 5A). 대조군과 달리 항PD-L1 항체 처리군에서는 수컷과 암컷 클러스터링이 명확하게 분리되었다(도 5B). 2D PCoA에 대한 PERMANOVA 결과는 개별 박테리아 커뮤니티를 나타내는 베타 다양성이 성별(P=0.024)에서 유의하게 다른 것으로 나타났다(도 5B). 성별에 따른 UPGMA 결과도 PCoA와 유사한 클러스터링 패턴을 나타냈다(도 5A 및 5B).
종합하면, MC38 마우스 모델에서 베타 다양성은 항 PD-L1 처리 그룹에서 명확한 성별 차이를 나타냈다.
MC38 마우스 모델의 장내 미생물 군집에서 성별 특이적 분류학적 바이오마커의 식별
우선, 수컷과 암컷 대조군 마우스에서 미생물의 분류학적 구성을 관찰하였다. 문 수준에서 수컷 대조군(35%)과 비교하여 암컷 대조군(28%)에서 Firmicutes의 존재 비율이 유의하게 감소하였다(P=0.042, 도 4A). Verrucomicrobia의 존재 비율은 수컷 대조군에 비해 암컷 대조군에서 증가했지만 유의성은 나타내지 않았다(도 4A).
다음으로, 항PD-L1 항체가 처리된 수컷 및 암컷 마우스에서 미생물의 분류학적 조성을 관찰하였다. Bacteroidetes의 존재비는 항PD-L1 항체가 처리된 수컷(36%)에 비해 항PD-L1항체가 처리된 암컷(53%)에서 크게 증가하였다(P=0.045, 도 4A).
Firmicutes 및 Verrucomicrobia의 존재비는 항PD-L1 항체가 처리된 수컷에 비해 항PD-L1 항체가 처리된 암컷에서만 통계적 유의성이 없이 감소하는 경향이 있었다(도 4A). 과적 수준에서 Muribaculaceae(문: Bacteroidetes)의 존재비는 수컷 대조군(3%)에 비해 암컷 대조군(1%)에서 유의하게 감소하였다(P=0.041; 도 4B). Lachnospiraceae와 Ruminococcaceae(문: Firmicutes)의 존재비는 수컷 대조군에 비해 암컷 대조군에서 감소하는 경향만 보였다(도 4B).
항PD-L1항체 처리군에서 Bacteroidaceae (문: Bacteroidetes)(P=0.045, 수컷 36%, 암컷 52%) 및 Ruminococcaceae(문: Firmicutes)의 존재비(P=0.045, 수컷 25%) 및 암컷에서 16%) 항PD-L1 처리된 수컷에 비해 항PD-L1 처리된 암컷 마우스에서 각각 강하게 증가 및 감소하였다(도 4B).
도메인 박테리아의 두 가지 주요 문인 Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)의 비율을 추가로 분석하였다. 수컷 대조군이 암컷 대조군보다 더 높은 F/B 비율을 나타냈다. 항PD-L 1항체 처리군도 대조군과 유사한 패턴을 나타냈다. 그러나, 대조군과 항PD-L1 항체 처리군에서 수컷과 암컷 사이의 F/B 비율에는 유의한 차이가 없었다(도 4C).
대조군과 항 PD-L1 항체 처리군의 성별에 따른 LEfSe 분석에서, 대조군에서11개균(기회감염 병원체 1개: Enterobacteriaceae, 10개 특징되지 않은 균)의 존재비에 변화가 있었고, 항 PD-L1 그룹에서 45개 박테리아(모두 특성화되지 않은 박테리아)의 존재비에 변화가 있었다(도 6A 및 6B). 대조군의 성별 비교에서, Enterobacteriaceae의 존재비는 암컷 대조군에 비해 수컷 대조군에서 2배 이상 유의하게 증가하였다(도 6A). 대조군과 달리 항PD-L1 항체 처리군에서는 특성화되지 않은 박테리아만이 확인되었다(도 6B).
다음으로 벤다이어그램 분석을 통해 MC38 대조군과 항PD-L1 항체 처리군에서 성별에 따른 분류학적 바이오마커를 찾고자 하였다. 대조군과 항PD-L1 항체 처리군의 성별 비교에서 두 세균(PAC001294 및 PAC002514)은 공통적으로 성별 차이를 보이는 것을 확인하였다(도 6C). 흥미롭게도, 대조군과 비교할 때, 암컷에 비해 수컷에서 PAC002541(Ruminococcaceae과)의 감소와 PAC001294(Lachnospiraceae 과)의 증가가 확인하였으며, 항 PD-L1 항체 처리군에서는 수컷에서 암컷에 비해 PAC001294(Lachnospiraceae 과)의 감소 및 PAC002541(Ruminococcaceae과)의 증가를 확인하였다(도 6C).
서열목록
1. Primer F
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-XXXXXXXX-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-CCTACGGGNGGCWGCAG
2. Primer R
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXXXX-GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC

Claims (15)

  1. 미생물 검출 제제를 포함하고,
    상기 미생물은 Parabacteroides goldsteinii, Lactobacillus murinus, Muribaculaceae 과(Family), Lachnospiraceae 과 및 Ruminococcaceae 과로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미생물 검출 제제는 상기 미생물의 16S rRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, 항체, 펩타이드 및 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미생물 검출 제제는 서열번호 1로 표시되는 프라이머 및/또는 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 치료는 항-PD-L1(programmed death-ligand 1) 및/또는 에스트로겐을 적용하는 것인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측용 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 정상 대조군과 비교하여 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 감소되어 있거나 Muribaculaceae 과(Family)의 풍부도가 증가되어 있는 경우 대장암으로 판단하거나,
    치료 전 대조군과 비교하여 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 증가되어 있거나 Muribaculaceae 과(Family)의 풍부도가 감소되어 있는 경우 대장암 치료 반응성이 좋은 것으로 판단하는, 키트.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 남성 대상체에서 정상 대조군과 비교하여 Lachnospiraceae 과의 박테리아의 풍부도가 증가되어 있거나 Ruminococcaceae 과의 박테리아의 풍부도가 감소되어 있는 경우 대장암으로 판단하는, 키트.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 키트는 남성 대상체에서 치료 전 대조군과 비교하여 Lachnospiraceae 과의 박테리아의 풍부도가 감소되어 있거나 Ruminococcaceae 과의 박테리아의 풍부도가 증가되어 있는 경우 대장암 치료 반응성이 좋은 것으로 판단하는, 키트.
  9. (a) 분리된 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 추출된 DNA로부터 장내 미생물의 풍부도를 분석하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 분석된 장내 미생물의 풍부도를 대조군과 비교하는 단계;를 포함하고,
    상기 미생물은 Parabacteroides goldsteinii, Lactobacillus murinus, Muribaculaceae 과(Family), Lachnospiraceae 과 및 Ruminococcaceae 과로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인, 대장암 진단 또는 치료 반응성 예측을 위한 정보제공 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 상기 미생물의 16S rRNA에 대한 PCR 프라이머쌍을 이용하는 것인, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 서열번호 1로 표시되는 프라이머 및/또는 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 이용하는 것인, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 치료는 항-PD-L1(programmed death-ligand 1) 및/또는 에스트로겐을 적용하는 것인, 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 정상 대조군과 비교하여 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 감소되어 있거나 Muribaculaceae 과(Family)의 풍부도가 증가되어 있는 경우 대장암으로 판단하거나,
    치료 전 대조군과 비교하여 Lactobacillus murinus 및/또는 Parabacteroides goldsteinii의 풍부도가 증가되어 있거나 Muribaculaceae 과(Family)의 풍부도가 감소되어 있는 경우 대장암 치료 반응성이 좋은 것으로 판단하는, 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 남성 대상체에서 정상 대조군과 비교하여 Lachnospiraceae 과의 박테리아의 풍부도가 증가되어 있거나 Ruminococcaceae 과의 박테리아의 풍부도가 감소되어 있는 경우 대장암으로 판단하는, 방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 방법은 남성 대상체에서 치료 전 대조군과 비교하여 Lachnospiraceae 과의 박테리아의 풍부도가 감소되어 있거나 Ruminococcaceae 과의 박테리아의 풍부도가 증가되어 있는 경우 대장암 치료 반응성이 좋은 것으로 판단하는, 방법.
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