KR20100095571A

KR20100095571A - 암 환자에서의 진단 목적용 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20100095571A
Application number: KR1020107012551A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 에스. 첸; 제니퍼 르 쿠터; 토마스 디. 유
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2007-11-09
Filing date: 2008-11-05
Publication date: 2010-08-31
Also published as: US20090123930A1; BRPI0817158A2; ZA201002808B; MX2010005057A; CA2703258A1; US20110151468A1; RU2010123381A; EP2222874A2; IL205246A0; AU2008324782A1; JP2011502513A; WO2009061800A3; CN101910416A; WO2009061800A2

Abstract

암 환자에 최적의 임상적 이로움을 부여할 가능성이 있는 요법을 확인하는데 유용한 방법 및 조성물을 본원에서 개시한다.

Description

암 환자에서의 진단 목적용 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSTIC USE IN CANCER PATIENTS}

관련 출원

본 출원은 2007년 11월 9일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 제60/986,884호 (그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)의 우선권을 주장한다.

기술분야

본 발명은 임상적 결과를 예측하는데 있어 유용하고, 항혈관형성 요법으로 치료받는 암 환자를 모니터링하는데 있어 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 배경

암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서만 매년 약 130만명 정도의 새로운 암 환자가 발생하고, 이는 심혈관계 질환 다음으로 두 번째로 높은 사망 원인이며, 사망자 4명 중 대략 1명이 암 환자인 것으로 추정된다. 이러한 사망의 대부분은 고형 암으로 인한 것이다. 특정 암의 의학적 치료에는 상당한 진보가 있어 왔지만, 모든 암에 대한 전반적인 5년 생존율은 과거 20년간 약 10％ 정도만 개선되었다. 암, 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이 및 성장하기 때문에, 제시간에 이를 검출하고 치료하는 것이 극도로 어렵다.

암 유형에 따라서, 환자는 전형적으로 화학요법, 방사선 및 항체 기반 약물을 비롯한 수개의 치료 옵션을 이용할 수 있다. 상이한 치료 요법으로부터 얻게 될 임상적 결과를 예측하는데 유용한 진단 방법은 이러한 환자들을 임상적으로 관리하는데 많이 이로울 것이다. 여러 연구에서 예로서, 돌연변이-특이적 분석법, 마이크로어레이 분석법, qPCR 등에 의해 유전자 발현과 특정 암 유형의 확인과의 관련성에 대하여 조사된 바 있다. 그러한 방법은 환자가 나타내는 암을 확인하고 분류하는데 유용할 수 있다. 그러나, 임상적 결과에 따른 유전자 발현의 예측 또는 예후에 대해 알려져 있는 것은 훨씬 더 적다.

따라서, 예를 들면, 암 환자의 무진행 생존과 같은 치료 결과를 예측하거나, 또는 상기 치료의 진행을 모니터링함으로써 각 환자에 대한 최적의 치료 요법을 선택해 낼 수 있는, 객관적이고 재현가능한 방법이 요구되고 있다.

본 발명의 요약

본 발명의 방법은 예를 들면, 암 환자 치료 방법을 지원할 때, 약 개발 과정 동안 환자를 선택할 때, 특정 치료 요법을 사용한 개개의 환자를 치료할 경우 그 성공 가능성을 예측할 때, 질환 진행 상태를 평가할 때, 치료 효능을 모니터링할 때, 개개의 환자에 대한 예후를 결정할 때, 및 특정 항암 요법이 이로울 수 있는 개체의 소질을 평가할 때를 비롯한 다양한 환경하에서 사용될 수 있다.

본 발명은 부분적으로, 암 환자의 특정 바이오마커의 발현 수준이 단독의 항혈관형성 요법으로부터만 얻어지는 감소된 임상적 이로움과 서로 관련성이 있다는 발견을 토대로 이루어진 것이다. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 환자로부터 유래된 샘플은 항혈관형성 요법 개시 이전 또는 개시점에서 수득한 것이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 환자가 단독의 항혈관형성 요법에 반응성일 가능성이 적음을 나타내는 것인, 암 환자의 항혈관형성 요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 환자로부터 유래된 샘플은 항혈관형성 요법 개시 이전 또는 개시점에서 수득한 것이다.

본 발명은 또한 암 환자에게 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자로부터 수득한 샘플은 기준 샘플에 비해 증가된 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 나타내는 것인, 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 환자로부터 유래된 샘플은 항혈관형성 요법 개시 이전 또는 개시점에서 수득한 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계, 상기 발현 수준을 기준 샘플에서의 각 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준과 비교하는 단계, 및 상기 분석으로부터 얻은 데이타를 요약한 보고서를 작성하고, 여기서 보고서는 환자가 단독의 항혈관형성 요법으로도 임상적으로 이로울 수 있는지 여부의 가능성에 관한 예측을 포함하는 단계를 포함하고, 여기서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 기준 샘플에서의 발현 수준에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법으로도 임상적으로 이로울 수 있는 가능성이 증가함을 나타내는 것인, 암 환자의 개별 게놈 프로파일을 작성하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 환자로부터 유래된 샘플은 항혈관형성 요법 개시 이전 또는 개시점에서 수득한 것이다.

임상적 이로움은 예로서, 질환 진행 상태를 어느 정도까지 억제 (속도를 느리게 하고, 완전히 정지시키는 것 포함); 질환 에피소드 및/또는 증상을 보이는 횟수의 감소; 병변 크기 축소; 인접한 말초 기관 및/또는 조직 내로의 질환 세포 침윤 억제 (즉, 감소, 속도를 느리게 하거나 완전히 정지시키는 것); 질환 확산 억제 (즉, 감소, 속도를 느리게 하거나 완전히 정지시키는 것); (질환 병변을 퇴행 또는 제거시킬 수는 있지만, 그러할 필요까지는 없는) 자가-면역 반응 감소; 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 완화; 치료 후 무병인 상태를 보이는 기간 증가, 예로서, 무진행 생존 기간 증가; 전반적인 생존율 증가; 반응율 증가; 및/또는 치료 후 소정 시점에서의 사망율 감소와 같은 다양한 종점을 평가함으로써 측정할 수 있다.

표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이를 포함하고, 단독의 항혈관형성 요법에 대한 반응을 예측하기 위해 상기 어레이를 사용하는 것에 관한 사용 설명서를 더 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자의 발현이 기준 샘플에서의 각 유전자의 발현 수준에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 키트가 또한 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 열거되어 있는 2개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 검출할 수 있는 화합물 세트이며, 여기서 암 환자로부터 수득한 샘플에서 상기 화합물 세트를 사용하여 결정된 2개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인 화합물 세트를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 화합물 세트는 표 1에 열거되어 있는 유전자 또는 유전자 생성물 모두의 발현 수준을 검출할 수 있다. 화합물 세트는 예로서, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 환자로부터 유래된 샘플은 항혈관형성 요법 개시 이전 또는 개시점에서 수득한 것이다.

본 발명은 또한 부분적으로는 항혈관형성 요법을 사용한 치료의 진행 상태를 모니터링하는데 있어 유용한 바이오마커를 확인하는 것을 토대로 한다. 따라서, 본 발명은 1차 종양 평가 시점에 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 1차 종양 평가 시점에 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준에 비해 증가하는 것은 환자가 단독의 항혈관형성 요법으로는 임상적 이로움이 감소되기 쉬움을 나타내는 것인, 항혈관형성 요법으로 치료받고 있는 암 환자에서 치료의 진행 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 1차 종양 평가 시점에 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 1차 종양 평가시의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암 환자를 확인하는 방법을 제공한다.

추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명은 암 환자에게 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자로부터 수득한 샘플은 1차 종양 평가시에 표 2에 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 항혈관형성 요법을 사용한 치료 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에 비해 증가한 것으로 나타나는 것인, 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

또한 표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이를 포함하고, 단독의 항혈관형성 요법에 대한 반응을 예측하기 위해 상기 어레이를 사용하는 것에 관한 사용 설명서를 더 포함하며, 여기서 1차 종양 평가 시점에서의 하나 이상의 유전자의 발현이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서의 하나 이상의 유전자의 발현 수준에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 표 2에 열거되어 있는 2개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 검출할 수 있는 화합물 세트이며, 여기서 1차 종양 평가시에 암 환자로부터 수득한 샘플에서 상기 화합물 세트를 사용하여 결정된 2개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인 화합물 세트를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 화합물 세트는 표 2에 열거되어 있는 유전자 또는 유전자 생성물 모두의 발현 수준을 검출할 수 있다. 화합물 세트는 예로서, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질일 수 있다.

임의의 본 발명의 방법에서, 샘플은 조직 또는 세포 샘플일 수 있거나, 혈장 및/또는 혈청으로부터 수득된 것일 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법은 표 1 또는 2에 열거되어 있는 유전자들 중 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 모두 이하의 임의 갯수의 유전자의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준은 핵산 수준, 단백질 수준 또는 분비 또는 단백질의 표면 발현 수준으로 측정될 수 있다.

본 발명의 방법의 몇몇 실시태양에서, 암은 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포 암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막의 암, 간 세포 암, 위암(gastric or stomach cancer)(위장관암 포함), 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 간암(hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암(kidney or renal cancer), 간암(liver cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (저급/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/소포 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고급 면역모세포성 NHL; 고급 림프아구성 NHL; 고급 비-절단 소세포 NHL; 거대 종양질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬(Waldenstrom) 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라, 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적인 혈관 증식을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 암은 신세포 암종이다.

본 발명의 방법은 예를 들면, VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체 또는 그의 길항제, 항-PDGFR 억제제, 예로서, 글리벡(Gleevec)™ (이마티닙 메실레이트(Imatinib Mesylate))을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항혈관형성제를 투여하는 것을 포함하는 항혈관형성 요법으로 수행될 수 있다. 항혈관형성제는 또한 본래의 혈관형성 억제제, 예로서, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예로서, 문헌 ([Klagsbrun and D'Amore, Annu . Rev. Physiol, 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (예로서, 악성 흑색종에서의 항혈관형성 요법이 열거되어 있는 표 3)]; [Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예로서, 공지된 항혈관형성 인자가 열거되어 있는 표 2); 및 [Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (예로서, 임상 시험에 사용되는 항혈관형성제가 열거되어 있는 표 1)])을 참조한다.

몇몇 실시태양에서, 항혈관형성 요법은 항-VEGF 항체를 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다.

상세한 설명

본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한, 본 분야의 기술에 포함되어 있는 것인 분자 생물학 (재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기법을 이용하게 될 것이다. 그러한 기법은 예를 들면, 문헌 (["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, (및 주기적 개정판)]; ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]에 충분히 설명되어 있다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 숙련인이 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌 ([Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N. Y. 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N. Y. 1992)])은 당업자에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 관한 일반적인 가이드를 제공한다.

특허 출원 및 공개 문헌을 비롯한, 본원에서 인용되는 모든 참고 문헌은 그의 전문이 참고로서 인용된다.

I. 정의

본원에서 사용되는 바, "어레이" 또는 "마이크로어레이"라는 용어는 기판 상에 혼성화될 수 있는 어레이 요소, 바람직하게, 폴리뉴클레오티드 프로브 (예로서, 올리고뉴클레오티드)가 정렬된 배열을 갖는 장치를 의미한다. 기판은 고체 기판, 예를 들면, 유리 슬라이드, 또는 반고체 기판, 예를 들면, 니트로셀룰로스 막일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA, 또는 그의 임의의 순열 구조일 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "표적 서열," "표적 핵산" 또는 "표적 단백질"은 검출하고자 하는 것인, 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 의미한다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 바, "주형"은 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 몇몇 경우에서, "표적 서열," "주형 DNA," "주형 폴리뉴클레오티드," "표적 핵산," "표적 폴리뉴클레오티드," 및 그의 변이체는 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바, "증폭"이란 일반적으로 원하는 서열의 다중 카피를 생산하는 과정을 의미한다. "다중 카피"란 적어도 2개의 카피를 의미하는 것이다. "카피"가 반드시 주형 서열과 완벽하게 서열 상보성을 갖거나 동일성을 갖는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들면, 카피는 예를 들면, 데옥시이노신과 같은 뉴클레오티드 유사체, 의도적인 서열 변경 (예를 들면, 주형에 혼성화될 수는 있지만, 그에 상보적이지는 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입된 서열 변경), 및/또는 증폭되는 동안 일어날 수 있는 서열 오류를 포함할 수 있다.

제1 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예로서, 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양이 제2 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예로서, 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양보다 더 크다면, 제1 샘플 중 유전자, 단백질 또는 바이오마커의 발현/양은 제2 샘플 중의 발현/양과 비교하여 증가된 것이다. 발현 수준/양은 mRNA, cDNA, 단백질, 단백질 단편 및/또는 유전자 카피를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 기준에 기초하여 측정될 수 있다. 발현 수준/양은 정성적으로 및/또는 정량적으로 측정될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 제1 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예로서, 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 증가란 제2 샘플 중의 각 유전자, 유전자 생성물, 예로서, 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, 또는 100X인 것이다. 하나의 실시태양에서, 샘플은 RNA 또는 단백질의 분석량의 차이 및 사용된 RNA 또는 단백질 샘플의 질적 가변성 둘 모두에 대하여 정규화된다. 주지되어 있는 하우스키핑 유전자, 예를 들면, GAPDH를 비롯한, 특정의 정규화 유전자의 발현을 측정하고 그를 도입함으로써 상기와 같은 정규화를 달성할 수 있다. 별법으로, 정규화는 분석된 유전자 또는 그의 큰 서브세트 모두의 신호의 평균값 또는 중앙값에 기초할 수 있다 (전역 정규화 접근법). 유전자마다 실시하는 것을 기초로, 정규화된 환자 종양 mRNA 또는 단백질 측정량을 기준 세트에서 발견된 양과 비교한다. 매 환자마다 시험된 종양 1개당 각 mRNA 또는 단백질에 대해 정규화된 발현 수준은 기준 세트에서 측정된 발현 수준에 대한 비율(％)로서 표현될 수 있다. 분석하고자 하는 특정 환자 샘플 중에서 측정된 발현 수준은 상기 범위내 일부 백분위수에 포함될 것이며, 이는 당업계에 주지되어 있는 방법에 의해 측정될 수 있다.

"검출"은 직접 및 간접적 검출을 비롯한, 임의의 검출 수단을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "샘플"이란 용어는 예를 들면, 물리적, 생화학적, 화학적, 및/또는 생리학적 특징들을 토대로 하여 특징 규명이 이루어지고/거나 확인되는 세포 및/또는 기타 다른 분자 엔티티를 함유하는, 관심의 대상이 되는 피험체로부터 수득되거나 그로부터 유래된 조성물을 의미한다. 그러한 샘플로는 환자로부터 수득한 조직, 또는 세포 샘플을 포함한다. 샘플은 또한 혈장으로부터 수득될 수 있다.

본원에서 상호 교환적으로 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 모든 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, 이에는 DNA 및 RNA가 포함된다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들면, 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합화 후에, 예를 들면, 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 기타 다른 유형의 변형으로는 예를 들어 "캡(cap)", 하나 이상의 천연적으로 발생된 뉴클레오티드에서 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들면, 비하전된 연결을 갖는 것 (예로서, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예로서, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 부분, 예를 들면, 단백질 (예로서, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예로서, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트제 (예로서, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결을 갖는 것 (예로서, 알파 아노머성 핵산 등) 뿐만 아니라, 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 모든 하이드록실기는, 예를 들면, 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 만들기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나, 또는 1 내지 20개의 탄소 원자로 이루어진 유기 캡핑기 또는 아민으로 치환될 수 있다. 기타 다른 하이드록실은 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들면, 예를 들면, 2'-O-메틸-2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머성 당, 에피머성 당, 예를 들면, 아라비노스, 크실로스 또는 리속스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비시클릭 유사체 및 비염기성 뉴클레오시드 유사체, 예를 들면, 메틸 리보시드를 비롯한, 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 포함할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결은 대체 연결기로 대체될 수 있다. 이들 대체 연결기로는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (--O--) 연결기를 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다)로 대체되는 실시태양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 비롯한, 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

본원에서 사용되는 바, "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 반드시는 아니지만, 일반적으로 길이가 약 200개 뉴클레오티드 미만인 짧은, 일반적으로 싱글 스트랜드의, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배제하는 의미가 아니다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오티드에 대해서 동등하게 충분히 적용될 수 있다.

"프라이머"는 일반적으로, 표적 서열과 혼성화함으로써 관심의 대상이 되는 샘플 중에 잠재적으로 존재하는 표적에 결합한 후, 표적에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 중합화를 촉진시키는 것으로서, 일반적으로는 유리 3'-OH 기를 갖는 짧은 싱글 스트랜드의 폴리뉴클레오티드이다.

본원에서 사용되는 바, "바이오마커"라는 용어는 일반적으로, 포유동물 조직 또는 세포 중에서 또는 그 위에서의 발현이 표준 방법 (또는 본원에 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있고, 혈관형성 억제에 기초한 치료 요법, 예로서, 항혈관형성제, 예를 들면, VEGF-특이적 억제제에 대한 포유동물 세포 또는 조직의 감수성에 대해 예측, 진단 및/또는 예후하는 것인, 유전자, 단백질, 당질 구조체, 또는 당지질을 비롯한 분자를 의미한다. 임의로, 그러한 바이오마커의 발현은 대조군/기준 조직 또는 세포 샘플에 대해서 관찰되는 것보다 더 높게 측정된다. 그러한 바이오마커의 발현은 고효율의 멀티플렉스화된 면역분석법, 예를 들면, 룰즈 베이스드 메디슨, 인크.(Rules Based Medicine, Inc.) 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)로부터 상업적으로 이용가능한 것을 사용함으로써 측정할 수 있다. 바이오마커의 발현은 또한 예로서, PCR 또는 FACS 분석법, 면역조직화학적 분석법 또는 유전자 칩-기반 분석법을 사용함으로써 측정될 수 있다.

"조직 또는 세포 샘플"은 피험체 또는 환자의 조직으로부터 수득한 세포 수집물을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선하고/거나 동결되고/거나 보존된 기관 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인액으로부터 얻은 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분; 예를 들면, 뇌 척수액, 양수, 복수액 또는 간질액과 같은 체액; 임신 또는 개체의 발생 중 임의의 시점으로부터의 세포 또는 혈장일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 세포 또는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 암성 조직/기관으로부터 수득한다. 조직 샘플은 자연계에서는 조직과 천연적으로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들면, 방부제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양분, 항생제 등을 함유할 수 있다. 본원에서의 목적상, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예로서, 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다.

"~을 서로 관련시키다" 또는 "~을 서로 관련시키는"이라는 것은 어느 방식으로든 제1 분석법 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2 분석법 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 비교하는 것을 의미한다. 예를 들면, 제2 프로토콜을 수행할 때에 제1 분석법의 결과를 사용할 수 있고/거나, 제2 분석법 또는 프로토콜을 수행해야 하는지 여부를 결정하기 위해 제1 분석법 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다. 유전자 발현 분석법 또는 프로토콜의 실시태양과 관련하여, 특정 치료학적 요법을 수행해야 하는지 여부를 결정하기 위해 유전자 발현 분석법 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "표지"라는 단어는 시약, 예를 들면, 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되고, 그가 접합되거나 융합된 시약의 검출을 촉진시키는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지 그 자체가 검출가능한 것일 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉진시킬 수 있다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 천연의 것으로부터 유래된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 포유동물로부터의 천연적으로 발생된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러한 천연 서열 폴리펩티드는 천연의 것으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조될 수 있다. "천연 서열" 폴리펩티드라는 용어는 구체적으로 상기 폴리펩티드의 천연적으로 발생된, 말단절단된 형태 또는 분비된 형태 (예로서, 세포외 도메인 서열), 상기 폴리펩티드의 천연적으로 발생된 변이체 형태 (예로서, 선택적으로 스플라이싱된 형태) 및 천연적으로 발생된 대립유전자 변이체를 포함한다.

폴리펩티드 "변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 의미한다. 그러한 변이체로는 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서 부가되거나, 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 보통, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게, 적어도 약 90％의 아미노산 서열 동일성, 및 더욱더 바람직하게, 적어도 약 95％의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.

"항혈관형성제" 또는 "혈관형성 억제제"는 바람직하지 못한 혈관 투과성을 직접 또는 간접적으로 억제시키는 소 분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 의미한다. 항혈관형성제는 혈관형성 인자 또는 그의 수용체와 결합하여 이들의 혈관형성 활성을 차단시키는 제제를 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들면, 항혈관형성제는 상기 정의된 바와 같은 혈관형성제에 대한 항체 또는 기타 길항제, 예로서, VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 억제제, 예를 들면, 글리벡™ (이마티닙 메실레이트)이다. 항혈관형성제는 또한, 본래의 혈관형성 억제제, 예를 들어, 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예로서, 문헌 ([Klagsbrun and D'Amore, Annu . Rev . Physiol., 53:217-39 (1991)]; [Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (예로서, 악성 흑색종에서의 항혈관형성 요법이 열거되어 있는 표 3)]; [Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999)]; [Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예로서, 공지된 항혈관형성 인자가 열거되어 있는 표 2); 및 [Sato. Int . J. Clin . Oncol., 8:200-206 (2003) (예로서, 임상 시험에 사용되는 항혈관형성제가 열거되어 있는 표 1)])을 참조한다.

"VEGF" 또는 "VEGF-A"라는 용어는 문헌 ([Leung et al. Science, 246: 1306 (1989)] 및 [Houck et al. Mol . Endocrin., 5:1806 (1991)])에 기재된 바와 같은, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 189- 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자, 및 그의 천연적으로 발생된 대립유전자 및 프로세싱된 형태를 지칭하는데 사용된다. VEGF-A는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, 및 PlGF를 포함하는 유전자 패밀리의 일부이다. VEGF-A는 주로 2개의 고 친화성 수용체 티로신 키나제, 즉, VEGFR-1 (Flt-1) 및 VEGFR-2 (Flk-1/KDR)에 결합하며, 후자가 VEGF-A의 혈관 내피 세포 분열촉진 신호의 주된 전달물질이다. 추가로, 뉴로필린-1은 헤파린-결합 VEGF-A 이소형에 대한 수용체로서 확인되었고, 혈관 발생에서 중요한 역할을 할 수도 있다. "VEGF" 또는 "VEGF-A"라는 용어는 또한 예를 들면, 마우스, 래트 또는 영장류와 같은 비-인간 종으로부터 유래된 VEGF를 지칭한다. 종종, 특정한 종으로부터 유래된 VEGF는 예를 들면, 인간 VEGF의 경우 hVEGF 또는 뮤린 VEGF의 경우 mVEGF와 같은 용어로 표시된다. 또한, "VEGF"라는 용어는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 중 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 말단절단된 형태 또는 단편을 지칭하는데 사용된다. 이러한 VEGF의 형태에 관한 언급은 예로서, "VEGF(8-109)", "VEGF(1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"로 본 출원에서 확인될 수 있다. "말단절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 나타낸 것과 같이 번호매김된다. 예를 들면, 말단절단된 천연 VEGF에서 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단된 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대하여 천연 VEGF에 필적하는 결합 친화성을 갖는다.

"VEGF 생물학적 활성"은 임의의 VEGF 수용체에 결합하는 활성 또는 임의의 VEGF 신호전달 활성, 예를 들면, 정상 및 비정상적 혈관형성 및 혈관생성의 조절 (문헌 ([Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25]; [Ferrara (1999) J. Mol . Med . 77:527-543])); 배아 혈관생성 및 혈관형성을 촉진하는 활성 (문헌 ([Carmeliet et al. (1996) Nature 380: 435-439]; [Ferrara et al. (1996) Nature 380: 439-442])); 및 여성 생식관에서 고리모양 혈관 증식을 조절하는 활성 및 뼈 성장 및 연골 형성을 위한 활성 (문헌 ([Ferrara et al. (1998) Nature Med . 4:336-340]; [Gerber et al., (1999) Nature Med. 5: 623-628]))을 포함한다. 혈관형성 및 혈관생성에서 혈관형성 인자인 것 이외에도, 다면발현성 성장 인자로서의 VEGF는 다른 생리학적 과정에 있어서, 예를 들면, 내피 세포 생존, 혈관 투과성 및 혈관 확장, 단핵구 화학주성 및 칼슘 유입과 같은 다수의 생물학적 효과를 나타낸다 (문헌 ([Ferrara and Davis-Smyth (1997), 상기 문헌] 및 [Cebe-Suarez et al. Cell . Mol . Life Sci. 63:601-615 (2006)])). 또한, 최근의 연구는 몇몇 비-내피 세포 유형, 예를 들면, 망막 색소 상피 세포, 췌장관 세포 및 슈반 세포에 미치는 VEGF의 분열촉진 효과를 보고하였다 (문헌 ([Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394]; [Oberg-Welsh et al. (1997) Mol . Cell . Endocrinol. 126:125-132]; [Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740])).

"VEGF-특이적 길항제"란 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 결합을 비롯한, VEGF 활성을 중화시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 폐지하거나, 감소시키거나 또는 방해할 수 있는 분자 (펩티딜 또는 비-펩티딜)를 지칭한다. 바람직하게, VEGF-특이적 길항제는 VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 이상 만큼 감소시키거나 억제한다. 바람직하게, VEGF-특이적 길항제에 의해 억제된 VEGF는 VEGF(8-109), VEGF(1-109) 또는 VEGF₁₆₅이다. 본 발명의 방법에서 유용한 VEGF-특이적 길항제는 VEGF에 특이적으로 결합하는 펩티딜 또는 비-펩티딜 화합물, 예를 들면, 항-VEGF 항체 및 그의 항원 결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 그의 단편, 및 VEGF에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체에 대한 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체 (예를 들어, 가용성 VEGF 수용체 단백질, 또는 그의 VEGF 결합 단편, 또는 키메라 VEGF 수용체 단백질); VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 적어도 단편에 상보적인 안티센스 뉴클레오염기 올리고머; VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 적어도 단편에 상보적인 작은 RNA; VEGF를 표적으로 하는 리보자임; VEGF에 대한 펩티바디; 및 VEGF 압타머를 포함한다.

"항-VEGF 항체"는 충분한 친화성 및 특이성으로 VEGF에 결합하는 항체이다. 선택된 항체는 보통 VEGF에 대해 충분히 강한 결합 친화성을 가질 것이고, 예를 들면, 항체는 100 nM-1 pM의 K_d 값으로 hVEGF에 결합할 수도 있다. 항체 친화성은 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 기반 분석법 (예를 들면, PCT 출원 공개번호 WO 2005/012359에 기재된 것과 같은 BIAcore 분석); 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA); 및 경쟁 분석법 (예를 들어, RIA)에 의해 측정될 수도 있다. 바람직하게, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 병태를 표적하고 방해하는 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 예로서, 치료제로서 그가 갖는 효과를 평가하기 위하여 항체를 기타 다른 생물학적 활성 분석법으로 처리할 수도 있다. 이러한 분석은 당업계에 공지되어 있고, 표적 항원 및 항체의 의도된 용도에 따라 달라진다. 그의 예는 HUVEC 억제 분석법 (하기 실시예에 기술되어 있음); 종양 세포 성장 억제 분석법 (예를 들면, WO 89/06692에 기재되어 있음); 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개 세포독성 (CDC) 분석법 (미국 특허 5,500,362); 및 작용 활성 또는 조혈 분석법 (WO 95/27062 참조)을 포함한다. 항-VEGF 항체는 보통 다른 VEGF 동족체, 예를 들면, VEGF-B 또는 VEGF-C에 결합하지도 않고, PlGF, PDGF 또는 bFGF와 같은 다른 성장 인자에도 결합하지 않는다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A.4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체; 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성된 재조합 인간화된 항-VEGF 모노클로날 항체를 포함하며, 베바시주맙 (BV; 아바스틴(Avastin)®)으로서 알려져 있는 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 베바시주맙은 인간 VEGF가 그의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A4.6.1로부터, 돌연변이화된 인간 IgG1 프레임워크 영역 및 항원 결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 대부분의 프레임워크 영역을 포함하는 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93％가 인간 IgG1으로부터 유래되고, 서열의 약 7％가 뮤린 항체 A.4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맙은 약 149,000 달톤의 분자량을 갖고 당화되어 있다. 베바시주맙 및 기타 다른 인간화된 항-VEGF 항체는 추가로 2005년 2월 26일 발행된 미국 특허 번호 제6,884,879호에 기재되어 있다. 추가의 바람직한 항체로는 PCT 출원 공개 번호 WO 2005/012359에 기재되어 있는 G6 또는 B20 계열 항체 (예로서, G6-31, B20-4.1)를 포함한다. 추가의 바람직한 항체에 대해서는 미국 특허 번호 제7,060,269호, 제6,582,959호, 제6,703,020호; 제6,054,297호; WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 공개 번호 제2006009360호, 제20050186208호, 제20030206899호, 제20030190317호, 제20030203409호, 및 제20050112126호; 및 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004)]를 참조한다. 기타 다른 바람직한 항체로는 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 및 C104를 포함하거나, 별법으로 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 및 Q89를 포함하는 인간 VEGF 상의 기능적 에피토프에 결합하는 것을 포함한다.

"항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체 (예로서, 이중특이성 항체) 및 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포함한다.

"차단" 항체 또는 항체 "길항제"는 항체가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 예를 들면, VEGF-특이적 길항제 항체는 VEGF에 결합하고, 혈관 내피 세포 증식을 유도할 수 있는 VEGF의 능력을 억제한다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 완전히 억제한다.

달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 전체에 걸쳐서 "다가 항체"라는 표현은 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내기 위하여 사용된다. 다가 항체를 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작하는 것이 바람직하며, 다가 항체는 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.

"Fv" 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단하게 회합된 (이는 scFv에서는 자연적으로 공유 결합일 수 있다) 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 CDR 또는 그의 하위세트는 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일의 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 오직 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)이라도, 비록 전체 결합 부위에 비해 대개 낮은 친화성을 나타내기는 하지만, 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는 능력을 갖는다.

본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 군집으로부터 수득한 항체, 즉, 군집을 구성하는 개개의 항체들이 소량으로 존재할 수 있는지 여부의 가능한 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하고는 동일한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고 특이성이고, 이것은 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 추가로, 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 군집으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내고, 이것은 특정한 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 최초로 문헌 [Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예로서, 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 예를 들면, 문헌 ([Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991)])에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유래된 항체에 있는 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동성이거나, 또는 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 반면, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래된 항체에 있는 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이거나, 또는 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 것인, "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 번호 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 81 :6851-6855 (1984)]).

비-인간 (예로서, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분 인간화된 항체는 수용체의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어, 마우스, 래트, 래빗 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 추가로, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 또한 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다. 보다 상세한 설명에 대해서는 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr . Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992)])을 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 서열에 상응하고/하거나, 본원에 개시된 인간 항체 제조 기법 중 임의의 것을 사용하여 제조된 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체에 관한 상기와 같은 정의는 구체적으로 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다. 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 인간 항체를 생산할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 인간 항체는 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 (문헌 ([Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)]; [Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)]; [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581 (1991)])). 인간 항체는 또한 인간 면역글로불린 좌위를 트랜스제닉 동물, 예로서, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내에 도입함으로써 제조될 수 있다. 시험감염시에, 인간 항체가 생산되는 것이 관찰되고, 이것은 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 비롯한, 모든 사항에서 인간에서 발견되는 것과 매우 유사하다. 이러한 접근법은 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 하기의 과학 공개 문헌: ([Marks et al., Bio / Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368:812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)]; [Lonberg and Huszar, Intern. Rev . Immunol . 13:65-93 (1995)])에 기재되어 있다. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 유도되는 항체를 생산하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통해 제조될 수 있다 (이러한 B 림프구는 개인으로부터 회수될 수 있거나, 또는 시험관내에서 면역화될 수도 있다). 예로서, 문헌 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol ., 147 (1):86-95 (1991)]; 및 미국 특허 번호 제5,750,373호)를 참조한다.

"단리된" 폴리펩티드 또는 "단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염물 성분은 폴리펩티드 또는 항체를 위한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 폴리펩티드 또는 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의한 측정시, 폴리펩티드 또는 항체의 95중량％ 초과, 가장 바람직하게는, 99중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질해질 때까지 정제될 것이다. 폴리펩티드의 자연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드 또는 항체는 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다. 그러나, 보통은 단리된 폴리펩티드 또는 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본원에서 사용되는 바, "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 시도로 수행되는 임상적 개입을 나타내고, 임상적 병상의 예방을 위해 또는 임상적 병상의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 질환 또는 질병의 발생을 지연시키고자 하는데 유용하다.

"유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 의미한다. 치료제의 "치료학적 유효량"은 예를 들어, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 항체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 치료제의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 치료학적으로 유익한 효과가 있는 양이다. "예방학적 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 원하는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 나타낸다. 반드시 그러한 것은 아니지만, 전형적으로 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계 이전에, 또는 보다 초기 단계에서 피험체에게 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다. 전암성, 양성, 조기 또는 말기 종양의 경우, 혈관형성 억제제의 치료학적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수도 있고/거나; 원발성 종양의 크기를 축소시킬 수도 있고/거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제 (즉, 어느 정도 속도를 느리게 하고, 바람직하게는 정지)시킬 수 있고/거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지)시킬 수 있고/거나; 종양 성장을 어느 정도까지 억제할 수도 있고/거나; 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 완화시킬 수도 있다. 약물이 암세포의 성장을 방지하고/거나 존재하는 암 세포를 사멸시킬 수 있을 정도까지, 이는 세포증식억제 및/또는 세포독성일 수도 있다. 암 요법을 위하여, 생체내에서의 효능은 예를 들면, 생존 기간, 질병 진행시까지의 시간 (TTP), 반응율 (RR), 반응 지속기간 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정될 수 있다.

"단기간 무진행 생존"은 1차 종양 평가 시점에서의 진행 상태를 의미한다. 암 또는 종양의 유형에 따라서, 1차 종양 평가 시점은 치료 개시 이후 약 4개월, 3개월, 2개월, 또는 1개월이 경과하였을 때이다. 1차 종양 평가 시간은 특정 질환의 진행 속도에 따라 달라진다. 하나의 실시태양에서, 신장암에 대한 1차 종양 평가 시간은 항암 요법의 개시 이후 56일이 경과한 때이다.

"암" 및 "암성"이라는 용어는 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식을 특징으로 하는, 포유동물의 생리학적 병태를 의미하거나 설명한다. 양성 및 악성 암도 상기 정의에 포함된다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포 암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막의 암, 간 세포 암, 위암 (위장관암 포함), 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (저급/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/소포 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고급 면역모세포성 NHL; 고급 림프아구성 NHL; 고급 비-절단 소세포 NHL; 거대 종양질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라, 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적인 혈관 증식을 포함한다.

"피험체" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들면, 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하나, 이에 한정되지 않는 포유동물을 의미한다. 바람직하게는, 피험체 또는 환자는 인간이다.

"항암 요법"이라는 용어는 암을 치료하는데 유용한 요법을 의미한다. 항암 치료제의 예로는 예로서, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에서 사용되는 제제, 항혈관형성제, 아포프토시스 제제, 항튜불린제, 및 암 치료용의 기타 다른 제제, 예를 들면, 항HER-2, 항CD20, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 (예로서, 엘로티닙 (타르세바(Tarceva)™)), 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예로서, 글리벡™ (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예로서, 셀레콕시브), 인터페론, 사이토카인, 하나 이상의 하기 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들)에 결합하는 길항제 (예로서, 중화 항체), TRAIL/Apo2 및 기타 생체활성의 유기 화학 약제 등을 포함한다. 이들의 조합 또한 본 발명에 포함된다.

"항혈관형성 요법"이라는 용어는 항혈관형성제를 투여하는 것을 포함하는, 혈관 형성을 억제시키는데 유용한 요법을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 억제시키거나 막고, 그리고/또는 세포의 파괴를 일으키는 물질을 의미한다. 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, 및 Re¹⁸⁶), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 한다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이톡산(CYTOXAN)® 시클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜파란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네디와인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히, 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl . Ed . Engl ., 33: 183-186 (1994)] 참조); 다이네미신 (다이네미신 A 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디와인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)® 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프로리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토크산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (오레곤주 유진 소재의 JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products)); 로족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 탁솔(TAXOL)® 파클리탁셀 (뉴저지주 프린스톤 소재의 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)), 아브락산(ABRAXANE)™ 크레모포-무함유(Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-공학처리된 나노입자 제제 (일리노이주 샤윰버그 소재의 아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners)), 및 탁소티어(TAXOTERE)® 독세탁셀 (프랑스 안토니 소재의 롱-프랑 로라(Rhone-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 젬자(GEMZAR)® 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토크산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르, CPT-11) (5-FU 및 류코보린과 이리노테칸의 치료 요법 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예로서, 레티논산; 카페기타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 치료 요법(폴폭스(FOLFOX))을 포함한 옥살리플라틴; 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR (예로서, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)™) 및 VEGF-A의 억제제 및 상기 중 임의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.

또한, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤로시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤(FARESTON)· 토레미펜; 효소 아로마타제를 억제하고 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가제(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스테인, 포르메스테인, 파드로졸, 리비조르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸; 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; 및 항안드로겐, 예로서, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 뿐만 아니라, 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 부착 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예로서, PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임, 예로서, VEGF 발현 억제제 (예로서, 안기오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예로서, 유전자 요법 백신, 예를 들면, 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 백시드(VAXID)® 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루토텍칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 (미국 특허 번호 제4,675,187호 참조) 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 비롯한, 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM)와 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬 약제 또한 본 정의에 포함된다.

"방사선 요법"이란 일반적으로 작용하는 세포의 능력을 제한하거나 세포를 전부 파괴시키고자 세포에 대해 충분한 손상을 유도하기 위하여 직접적인 감마선 또는 베타 선을 사용하는 것을 의미한다. 선량 및 치료 지속기간을 결정하는 방법이 당업계에 다수 공지되어 있음을 이해할 것이다. 전형적인 치료법은 1회 투여로서 제공하는 것이고, 전형적인 선량은 1일당 10 내지 200 유니트 (그레이(Gray)) 범위이다.

"감소시키거나 억제시킨다"라는 것은 기준과 비교하여 활성, 작용, 및/또는 양을 저하시키거나 축소시키는 것이다. "감소시키거나 억제시킨다"라는 것은 총 바람직하게, 20％ 이상, 더욱 바람직하게, 50％ 이상, 및 가장 바람직하게, 75％, 85％, 90％, 95％ 이상을 저하시킬 수 있는 능력을 의미한다. 감소시키거나 억제시킨다라는 것은 치료되어지는 질병의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기, 또는 혈관형성 질병에서 혈관의 크기 또는 수에 관한 것을 언급하는 것일 수 있다.

"진단"이라는 용어는 예를 들면, 암을 확인하는 것과 같이, 분자 또는 병적 상태, 질환 또는 병태를 확인하는 것을 의미하거나, 특정 치료 요법이 이로울 수 있는 암 환자를 확인하는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. "예후"라는 용어는 항암 요법이 임상적으로 이로울 수 있을 가능성을 예측하는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. "예측"이라는 용어는 환자가 특정 항암 요법에 대하여 유리하게 또는 불리하게 반응할 것인가에 관한 가능성을 나타내기 위한 것으로 본원에서 사용된다. 하나의 실시태양에서, 예측은 그러한 반응 정도에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 예측은 환자가 치료, 예를 들면, 특정 치료제를 사용한 치료 후에 질환의 재발을 보이지 않으면서 일정 기간 동안 생존하거나 개선되는지의 여부 및/또는 그러할 확률에 관한 것이다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대하여 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 제시된 치료제 또는 조합제의 투여, 수술적 개입, 스테로이드 치료 등을 비롯한, 치료 요법, 예를 들면, 제시된 치료 요법에 유리하게 반응할 것인지, 또는 치료 요법 후에 환자가 장기간 생존할 것인지를 예측할 때 가치있는 도구가 된다.

"환자 반응"은 제한하는 것을 아니지만, (1) 질환 진행을 어느 정도 억제시키는 것 (속도를 느리게 하고 완전히 정지시키는 것); (2) 병변의 크기를 축소시키는 것; (3) 인접한 말초 기관 및/또는 조직 내로의 질환을 보이는 세포 침윤을 억제시키는 것 (즉, 감소시키거나, 속도를 느리게 하거나, 완전히 정지시키는 것); (4) 질환이 확산되는 것을 억제시키는 것 (즉, 감소시키거나, 속도를 느리게 하거나, 완전히 정지시키는 것); (5) 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 완화시키는 것; (6) 치료 후 무병인 상태를 보이는 기간 증가 및/또는 (8) 치료 후 소정 시점에서의 사망율 감소를 비롯한, 환자에게 이로움을 나타내는 임의의 종점을 사용하여 평가할 수 있다.

"장기간 생존"이라는 용어는 치료제를 사용한 치료 이후 적어도 1년, 5년, 8년, 또는 10년 동안 생존해 있는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다.

II . 혈관형성 억제제

항혈관형성제는 하기 제제들: VEGF 억제제, 예를 들면, VEGF-특이적 길항제, EGF 억제제, EGFR 억제제, TIE2 억제제, IGF1R 억제제, COX-II (시클로옥시게나제 II) 억제제, MMP-2 (매트릭스 메탈로프로테이나제 2) 억제제, 및 MMP-9 (매트릭스 메탈로프로테이나제 9) 억제제, CP-547,632 (미국 뉴욕주 화이자 인크.(Pfizer Inc.)), 액시티닙(Axitinib) (화이자 인크.; AG-013736), ZD-6474 (아스트라제네카(AstraZeneca)), AEE788 (노파르티스(Novartis)), AZD-2171), VEGF 트랩 (리제네론(Regeneron)/아벤티스(Aventis)), 바타라닙(Vatalanib) (또한, PTK-787, ZK-222584로도 알려져 있음: 노파르티스 & 셰링 A G(Schering A G)), 마큐젠(Macugen) (페갑타닙 옥타소듐, NX-1838, EYE-001, 화이자 인크./길레드(Gilead)/아이테크(Eyetech)), IM862 (미국 워싱턴주 커클랜드 소재의 사이트란 인크.(Cytran Inc.)); 및 리조자임(Ribozyme: 콜로라도주 볼더 소재) 및 키론(Chiron: 캘리포니아주 에머리빌 소재)으로부터 입수한 합성 리보자임인 안지오자임, 및 그의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. VEGF 억제제는 미국 특허 번호 제6,534,524호 및 제6,235,764호 (둘 모두의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 인용된다).

VEGF-특이적 길항제는 VEGF에 결합할 수 있거나, VEGF 발현 수준을 감소시킬 수 있거나, VEGF의 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 결합 및 VEGF 매개 혈관형성 및 내피 세포 생존 또는 증식을 비롯한, VEGF의 생물학적 활성을 중화시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 폐지하거나, 감소시키거나 또는 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. VEGF에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 항-VEGF 항체 및 그의 항원 결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체, 융합 단백질 (예로서, VEGF-트랩 (리제네론)), 및 VEGF₁₂₁-겔로닌 (페레그린(Peregrine))이 본 발명의 방법에 유용한 VEGF-특이적 길항제로서 포함된다. VEGF-특이적 길항제로는 또한 VEGF 폴리펩티드의 길항제 변이체, VEGF에 대한 안티센스 뉴클레오염기 올리고머, VEGF에 대한 작은 RNA 분자, RNA 압타머, 펩티바디, 및 VEGF에 대한 리보자임을 포함한다. 이들 각각에 대한 예는 하기에 기술한다.

VEGF 억제제, 예를 들면, 항-VEGF 항체는 충분한 친화성 및 특이성으로 VEGF에 결합하고, VEGF의 생물학적 활성을 감소시키거나 억제시킬 수 있는 임의의 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 항-VEGF 항체는 보통 다른 VEGF 동족체, 예를 들면, VEGF-B 또는 VEGF-C에 결합하지도 않고, PlGF, PDGF 또는 bFGF와 같은 다른 성장 인자에 결합하지도 않는다. 바람직한 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A.4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체; 문헌 [Presta et al. (1997) 상기 문헌 동일]에 따라 생성된 재조합 인간화된 항-VEGF 모노클로날 항체를 포함하며, 베바시주맙 (BV; 아바스틴®)로서 알려져 있는 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 베바시주맙은 인간 VEGF가 그의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A4.6.1로부터, 돌연변이화된 인간 IgG1 프레임워크 영역 및 항원 결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 베바시주맙 및 기타 다른 인간화된 항-VEGF 항체는 추가로 2005년 2월 26일 발행된 미국 특허 번호 제6,884,879호에 기재되어 있다. 추가의 바람직한 항체로는 PCT 출원 공개 번호 WO 2005/012359에 기재되어 있는 G6 또는 B20 계열 항체 (예로서, G6-31, B20-4.1)를 포함한다. 추가의 바람직한 항체에 대해서는 미국 특허 번호 제7,060,269호, 제6,582,959호, 제6,703,020호; 제6,054,297호; WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; EP 0666868B1; 미국 특허 출원 공개 번호 제2006009360호, 제20050186208호, 제20030206899호, 제20030190317호, 제20030203409호, 및 제20050112126호; 및 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004)]를 참조한다. 기타 다른 바람직한 항체로는 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 및 C104를 포함하거나, 별법으로 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 및 Q89를 포함하는 인간 VEGF 상의 기능적 에피토프에 결합하는 것을 포함한다.

특징 규명이 가장 잘 되어 있는 VEGF 수용체 둘은 VEGFR1 (Flt-1로도 공지되어 있음) 및 VEGFR2 (뮤린 동족체의 경우, KDR 및 FLK-1로 공지되어 있음)이다. VEGF 계열의 각 구성원에 대한 각 수용체의 특이성은 다르지만, VEGF-A는 F1t-1 및 KDR, 두가지 모두에 결합한다. 전장의 Flt-1 수용체는 7개의 Ig 도메인을 갖는 세포외 도메인, 막통과 도메인, 및 티로신 키나제 활성을 갖는 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 VEGF 결합에 관여하고, 세포내 도메인은 신호 전달에 관여한다.

VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF 수용체 분자 또는 그의 단편이, VEGF 단백질에 결합하여 그를 격리시킴으로써 VEGF 단백질이 신호전달을 하지 못하도록 하는 VEGF 억제제로서 사용될 수 있다. 바람직하게, VEGF 수용체 분자, 또는 그의 VEGF 결합 단편은 가용성 형태, 예를 들면, sFlt-1이다. 가용성 형태의 수용체는 VEGF에 결합하여, 표적 세포의 표면 상에 존재하는 VEGF의 천연 수용체에 결합하지 못하도록 함으로써 VEGF 단백질의 생물학적 활성에 대해 억제 효과를 발휘한다. VEGF 수용체 융합 단백질 또한 포함되며, 그에 대한 예는 하기에서 기술한다.

키메라 VEGF 수용체 단백질은 VEGF에 결합하여 그의 생물학적 활성을 억제시킬 수 있으며, 이중 적어도 하나는 VEGF 수용체 단백질 (예로서, flt-1 또는 KDR 수용체)인 적어도 2개의 상이한 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 수용체 분자이다. 바람직하게, 본 발명의 키메라 VEGF 수용체 단백질은 오직 2개의 상이한 VEGF 수용체 분자로부터만 유래된 아미노산으로 구성되지만; flt-1 및/또는 KDR 수용체의 세포외 리간드 결합 영역으로부터의 Ig 유사 도메인 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 7개 모두를 포함하는 아미노산 서열은 기타 다른 비관련 단백질, 예를 들면, 면역글로불린 서열로부터의 아미노산 서열에 연결될 수 있다. Ig 유사 도메인이 결합하게 되는 기타 다른 아미노산 서열은 당업계의 숙련인에게는 쉽게 자명해질 것이다. 바람직한 키메라 VEGF 수용체 단백질의 예로는 가용성 Flt-1/Fc, KDR/Fc, 또는 FLt-1/KDR/Fc (VEGF 트랩으로도 알려져 있음)를 포함한다 (예를 들면, PCT 출원 공개 번호 WO 97/44453 참조).

본 발명의 가용성 VEGF 수용체 단백질 또는 키메라 VEGF 수용체 단백질은 막통과 도메인을 통해 세포 표면 상에 고정되지 않는 VEGF 수용체 단백질을 포함한다. 따라서, VEGF에 결합하여 그를 불활성화시킬 수 있는, 키메라 수용체 단백질을 비롯한 가용성 형태의 VEGF 수용체는 막통과 도메인을 포함하지 않고, 이로써, 일반적으로는 상기 분자가 발현되는 세포의 세포막과 결합하지 않는다.

추가의 VEGF 억제제는 예를 들면, WO 99/24440, PCT 국제 출원 PCT/IB99/00797, WO 95/21613, WO 99/61422, 미국 특허 번호 제6,534,524호, 미국 특허 번호 제5,834,504호, WO 98/50356, 미국 특허 번호 제5,883,113호, 미국 특허 번호 제5,886,020호, 미국 특허 번호 제5,792,783호, 미국 특허 번호 제6,653,308호, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755, 및 WO 98/02437 (이들 모두의 전문이 본원에서 참고로 인용된다).

III . 본 발명의 방법

본 발명은 부분적으로, 암 치료를 위한 항혈관형성 요법이 보이는 감소된 이로움과 서로 관련성이 있는 특이 바이오마커를 확인하는 것을 토대로 이루어진 것이다. 따라서, 본 개시된 방법 및 분석법은 암 환자를 치료하는데 있어 적절하거나 효과적인 요법을 평가하는데 유용한 데이타 및 정보를 수득하기 위한, 편리하고, 효율적이며, 잠재적으로는 비용면에서도 효과적인 수단을 제공한다. 예를 들면, 조직 또는 세포 샘플을 수득하기 위해 암 환자에서 생검을 수행할 수 있고, 상기 샘플을 각종 시험관내 분석법으로 검사하여 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자의 발현이 기준 샘플에 비해 증가하였는지 여부를 측정할 수 있다. 발현이 증가한 것으로 검출되었다면, 환자는 아마도 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법으로도 이로울 수 있게 될 것이다. 따라서, 본 발명은 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법을 사용하는 치료법에 대한 적합성을 측정하기 위하여 암 환자를 스크리닝하는 방법도 제공한다. 본 발명은 추가로 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 이는 환자가 단독의 항혈관형성 요법에 반응성일 가능성이 적음을 나타내는 것인, 암 환자의 항혈관형성 요법에 대한 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 또한, 암 환자에게 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자로부터 수득한 샘플은 기준 샘플에 비해 증가한 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 나타내는 것인, 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

항혈관형성 요법의 진행을 모니터링하는데 유용한 바이오마커 또한 확인되었다. 따라서, 본 발명은 1차 종양 평가 시점에 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 1차 종양 평가 시점에 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준에 비해 증가하는 것은 환자가 단독의 항혈관형성 요법으로는 임상적 이로움이 감소되기 쉬움을 나타내는 것인, 항혈관형성 요법으로 치료받고 있는 암 환자에서 치료의 진행 상태를 모니터링하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 1차 종양 평가 시점에 암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 1차 종양 평가 시점에 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암 환자를 확인하는 방법도 제공한다. 본 발명은 추가로 암 환자에게 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 1차 종양 평가 시점에 환자로부터 수득한 샘플은 표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 항혈관형성 요법을 사용한 치료 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에 비해 증가한 것으로 나타나는 것인, 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 암 환자를 포함한다. 암은 예로서, 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병일 수 있다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포 암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막의 암, 간 세포 암, 위암 (위장관암 포함), 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (저급/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/소포 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고급 면역모세포성 NHL; 고급 림프아구성 NHL; 고급 비-절단 소세포 NHL; 거대 종양질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라, 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적인 혈관 증식을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 암은 신세포 암종이다.

표적 바이오마커를 포함하는 샘플은 당업계에 주지되어 있고, 관심의 대상이 되는 암의 특정 유형 및 위치에 대해 적절한 방법에 의해 수득할 수 있다. 조직 생검은 대개 대표적인 암성 조직 조각을 수득하는데 사용된다. 별법으로, 세포는 관심의 대상이 암 세포를 함유하는 것으로 알려져 있거나, 함유할 것으로 판단되는 조직/체액 형태로 간접적으로 수득할 수 있다. 예를 들면, 암성 병변의 샘플은 절제술, 기관지경술, 미세침 흡인, 기관지 도말에 의해서, 또는 객담, 흉막액 또는 혈액으로부터 수득할 수 있다. 유전자 또는 유전자 생성물은 암 또는 종양 조직으로부터, 또는, 예를 들면, 뇨, 객담, 혈청 또는 혈장과 같은 기타 다른 신체 샘플로부터 검출될 수 있다. 암성 샘플 중 표적 유전자 또는 유전자 생성물의 검출을 위한 방법으로서, 상기 논의된 것과 동일한 기법이 기타 다른 신체 샘플에도 적용될 수 있다. 암 세포는 암 병변으로부터 벗겨질 수 있고, 상기 신체 샘플 중에 나타날 수 있다. 상기 신체 샘플을 스크리닝함으로써 이들 암에 관한 간단한 조기 진단을 달성할 수 있다. 추가로, 표적 유전자 또는 유전자 생성물에 대하여 상기 신체 샘플을 시험으로써 요법의 진행 상태를 보다 용이하게 모니터링할 수 있다.

암 세포에 대하여 조직 제제를 강화시키는 수단은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 조직을 파라핀 또는 크라이오스태트 절편으로부터 단리시킬 수 있다. 암 세포를 또한 유식세포 분석법 또는 레이저 포착 미세절개법에 의해 정상 세포로부터 분리해 낼 수 있다. 정상 세포로부터 암성 세포를 분리해 내는 상기와 같은 기법 뿐만 아니라, 기타 다른 기법도 당업계에 주시되어 있다. 암 조직이 정상 세포로 고도로 오염되어 있다면, 비록 오염 및/또는 위 양성/음성 결과를 최소화하는 기법 (이중 일부는 본원 하기에 기술되어 있다)이 알려져 있기 하지만, 표지(signature) 유전자 또는 단백질 발현 프로파일을 검출하는 것은 더욱 어려워질 수 있다. 예를 들면, 샘플은 또한 관심의 대상이 되는 암 세포와는 관련이 있지만, 상응하는 정상 세포와는 관련이 없는 것으로 알려져 있는 바이오마커, 또는 그와 반대되는 바이오마커의 존재에 대하여 평가될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하고, 하나 이상의 바이오마커의 발현에 대하여 조사한다. 샘플 중 다양한 바이오마커의 발현을 다수의 방법론에 의해 분석할 수 있는데, 상기 방법론들 다수는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 당업자가 이해하고 있는 것이고, 면역조직화학법 및/또는 웨스턴 블롯 분석법, 면역침전법, 분자 결합 분석법, ELISA, ELIFA, 형광 활성 세포 분류법 (FACS) 등, (예를 들면, 단백질 발현 수준을 조사하기 위한) 정량적 혈액 기반 분석법 (예를 들면, 혈청 ELISA), 생화학적 효소 활성 분석법, 계내 혼성화, 노던 분석법 및/또는 mRNA의 PCR 분석법 뿐만 아니라, 유전자 및/또는 조직 어레이 분석법에 의해 실시될 수 있는 매우 다양한 분석법들 중 임의의 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유전자 및 유전자 생성물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들면, 문헌 [Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]에서 살펴볼 수 있다. 멀티플렉스화된 면역분석법, 예를 들면, 예를 들면, 룰즈 베이스드 메디슨, 인크. 또는 메조 스케일 디스커버리 (MSD)로부터 이용가능한 것 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시태양에서, 샘플 중 표적 단백질의 발현은 면역조직화학법 및 염색 프로토콜을 사용함으로써 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학적 염색은 샘플 중 담백질을 존재를 평가하거나 검출하는데 있어 신뢰할 수 있는 방법인 것으로 제시되었다. 면역조직화학 ("IHC") 기법은 일반적으로 발색성 또는 형광성 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 프로빙하고 시각화하기 위해 항체를 사용한다.

샘플 제제의 경우, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터 유래된 조직 또는 세포 샘플이 사용될 수 있다. 샘플의 예로는 조직 생검, 혈액, 폐 흡인물, 객담, 림프액, 혈장 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 샘플은 수술적 절제술, 흡인 또는 생검을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수득할 수 있다. 조직은 새로운 것이거나, 냉동된 것일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 샘플은 파라핀 등에 고정되고 포매될 수 있다.

조직 샘플을 통상의 방법에 의해 고정 (즉, 보존)시킬 수 있다 (예로서, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3^rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York]; [The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D. C]) 참조). 당업자는 또한 샘플을 조직학적으로 염색하거나 아니면 분석하고자 하는 목적에 의해 고정제의 선택이 결정된다는 것을 알 것이다. 당업자는 또한 고정 시간이 조직 샘플의 크기 및 사용되는 고정제에 따라 달라진다는 것도 알 것이다. 일례로, 중성 완충처리된 포르말린, 보우인스(Bouin's) 또는 파라포름알데히드를 샘플을 고정시키는 데 사용할 수 있다.

일반적으로, 샘플을 먼저 고정시킨 후, 순도가 점차적으로 증가되는 일련의 알코올을 통해 탈수시키고, 침투시키고, 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 포매시켜, 조직 샘플이 절편화되도록 할 수 있다. 별법으로, 당업자는 조직 절편을 만들어 수득된 절편을 고정시킬 수 있다. 일례로, 조직 샘플을 통상적인 방법으로 파라핀에 포매시키고 처리할 수 있다 (예로서, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예로는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일단 조직 샘플을 포매시키고 나면, 샘플을 마이크로톰 등에 의해 절편화시킬 수 있다 (예로서, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 일례로, 이러한 방법에서 절편의 두께는 약 3 ㎛ 내지 약 5 ㎛일 수 있다. 일단 절편화되면, 절편을 여러 표준 방법에 의해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 부착제의 예로는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 파라핀에 포매된 절편은 양으로 하전된 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착시킬 수 있다.

파라핀을 포매 물질로 사용하는 경우, 일반적으로 조직 절편으로부터 파라핀을 제거하고, 조직 절편을 물로 다시 수화시킨다. 파라핀은 여러 통상적인 표준 방법에 의해 조직 절편으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 크실렌 및 점차적으로 순도가 감소하는 일련의 알코올을 사용할 수 있다 (예로서, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 별법으로, 상업적으로 이용가능한 파라핀 제거 비유기 제제, 예를 들면, Hemo-De7 (텍사스 휴스톤 소재의 CMS)을 사용할 수 있다.

임의로, 샘플을 제조한 후, IHC를 사용하여 조직 절편을 분석할 수 있다. IHC는 추가 기법, 예를 들면, 형태학적 염색법 및/또는 형광 동소 혼성화와 함께 조합하여 수행될 수 있다. IHC의 두가지 일반 방법; 직접적인 분석법과 간접적인 분석법, 이 두가지가 이용될 수 있다. 첫번째 분석법에 따르면, 표적 항원에의 항체의 결합을 직접적으로 측정한다. 이러한 직접적인 분석법은 표지화된 시약, 예를 들면, 형광성 태그 또는 효소로 표지화된 1차 항체를 사용하며, 이는 추가의 항체 상호작용없이도 시각화될 수 있다. 전형적인 간접적인 분석법에서는 비접합된 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지화된 2차 항체가 1차 항체에 결합하게 된다. 2차 항체가 효소 표지에 접합되면, 발색성 또는 형광발생성 기질을 첨가하여 항원을 시각화시킨다. 수개의 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호가 증폭된다.

면역조직화학법에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 부분으로 표지화될 것이다. 많은 표지가 이용될 수 있으며, 이는 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:

(a) 방사성 동위원소, 예를 들면, ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I. 예를 들면, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재되어 있는 기법을 사용하여 항체를 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사능은 섬광 계수법을 사용하여 측정할 수 있다.

(b) 콜로이드성 금 입자.

(c) 형광성 표지 (희토류 킬레이트 (유로피움 킬레이트), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민(Lissamine), 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 이용가능한 형광단, 예로서, 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7) 및 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 중 어느 하나 또는 그 이상의 것이 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 형광성 표지는 예를 들면, 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌 참조]에 개시되어 있는 기법을 사용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광측정기를 사용하여 정량할 수 있다.

(d) 다양한 효소-기질 표지를 이용할 수 있으며, 미국 특허 번호 제4,275,149호는 이들 중 몇몇에 대한 고찰을 제공한다. 이러한 효소는 일반적으로 각종 기법을 이용하여 측정할 수 있는 발색성 기질의 화학적 변화에 촉매 작용을 한다. 예를 들어, 상기 효소는 기질에서 색상 변화에 촉매 작용을 할 수 있으며, 이는 분광광도계로 측정할 수 있다. 별법으로, 이 효소는 기질의 형광성 또는 화학발광성을 변화시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기법은 상기 기술되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, (예를 들어, 화학발광측정기를 사용하여) 측정가능한 빛을 방출시키거나, 에너지를 형광 수용체에 제공한다. 효소 표지의 예는 루시퍼라제 (예로서, 반딧불이 및 세균 루시퍼라제; 미국 특허 번호 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예로서, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들면, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제 및 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기법은 문헌 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.

효소-기질 조합의 예는 예를 들면 다음과 같은 것들을 포함한다:

(i) 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서 수소 퍼옥시다제, 여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예로서, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴;

(ii) 알칼리 포스파타제 (AP)와 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트; 및

(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색성 기질 (예로서, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생성 기질 (예로서, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제).

당업자라면 많은 기타 다른 효소-기질 조합을 이용할 수 있다. 이러한 사항에 대한 전체적인 고찰을 위해서는 미국 특허 번호 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참조한다. 때로는, 표지를 항체와 간접적으로 접합시킨다. 당업자라면 이를 달성하기 위한 다양한 기법들을 알 것이다. 예를 들어, 항체를 비오틴과 접합시킬 수 있고, 상기 언급한 표지들의 4가지 넓은 카테고리들 중 어느 것을 아비딘과 접합시킬 수 있으며, 또는 그 반대로도 할 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 따라서 이와 같은 간접적인 방식으로 표지를 항체와 접합시킬 수 있다. 별법으로, 표지를 항체와 간접적으로 접합시키기 위해, 항체를 작은 합텐과 접합시키고, 상기 언급한 여러 다른 유형의 표지들 중 하나를 항합텐 항체와 접합시킨다. 따라서, 표지를 항체와 간접적으로 접합시킬 수 있다.

앞서 논의한 샘플 제조 방법 외에, IHC 이전, 동안 또는 그 이후에 조직 절편을 추가로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 시트레이트 완충액 중에서 조직 샘플을 가열하는 것과 같은 에피토프 회복 방법을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).

임의적 차단 단계 후, 1차 항체가 조직 샘플 중 표적 단백질 항원에 결합하기에 충분한 기간 및 적합한 조건하에, 조직 절편을 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적절한 조건은 일반적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 샘플에 대한 항체의 결합 정도는 앞서 논의된 검출가능한 표지 중 어느 하나를 사용하여 측정된다. 바람직하게는, 표지는 예를 들면, 3,3'-디아미노벤지딘 색원체와 같은 발색성 기질의 화학적 변화에 촉매 작용을 하는 효소 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 바람직하게, 효소 표지를 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합시킨다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항토끼 항체이다). 이로써 제조된 표본을 슬라이드에 올리고 커버슬립으로 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들면 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에서 일반적으로 사용되는 염색 강도 기준을 이용할 수 있다.

대체 방법으로, 항체-바이오마커 복합체가 형성되는데 충분한 조건하에서 샘플을 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후, 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 여러 많은 방법, 예를 들면, 혈장 또는 혈청을 비롯한 매우 다양한 조직 및 샘플을 분석하는 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 방법에 의해 검출될 수 있다. 상기와 같은 분석 포맷을 사용하는 광범위한 면역분석 기법이 이용될 수 있으며, 예로서, 미국 특허 번호 제4,016,043호, 제4,424,279호 및 제4,018,653호를 참조한다. 이는 비-경쟁 유형인 1-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 분석법 뿐만 아니라, 전통적인 경쟁 결합 분석법을 포함한다. 이러한 분석법은 또한 표지된 항체의 표적 바이오마커에의 직접적인 결합을 포함한다.

샌드위치 분석법은 가장 유용하고 보편적으로 사용되는 분석법들 중 하나이다. 샌드위치 분석 기법의 변형된 형태가 다수 존재하는데, 이들 모두 본 발명에 포함시키고자 한다. 간략하면, 전형적인 정방향 분석법에서, 표지되지 않은 항체를 고체 기판 상에 고정화시키고, 시험하고자 하는 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 항체-항원 복합체가 형성되기에 충분한 시간 기간인 적합한 기간 동안 인큐베이션시킨 후에 이어서, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지되어 있고 항원에 대해 특이적인 2차 항체를 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체로 이루어진 또다른 복합체가 형성되기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시킨다. 임의의 비반응 물질을 세척하여 제거하고, 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰함으로써 항원의 존재를 측정한다. 결과는 간단한 가시 신호 관찰에 의해 얻어진 질적 결과일 수 있거나, 공지된 양의 바이오마커를 함유하는 대조군과의 비교에 의해 정량화될 수 있다.

정방향 분석에 대한 변형으로는, 샘플 및 표지된 항체 둘 모두를 동시에 결합된 항체에 첨가하는 동시 분석법을 포함한다. 이러한 기법은 당업자에게 주지되어 있으며, 쉽게 자명해질 수 있는 것으로 임의로 최소로 변형된 변형법도 포함한다. 전형적인 정방향 샌드위치 분석법에서, 바이오마커에 대하여 특이성을 갖는 제1 항체를 고체 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합시킨다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 보편적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 염화폴리비닐 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 관, 비드 마이크로플레이트 디스크, 또는 면역분석법을 수행하는데 적합한 임의의 기타 다른 표면 형태일 수 있다. 결합 과정은 당업계에 주지되어 있고, 일반적으로는 공유적으로 교차결합시키거나 물리적으로 흡착시키는 것으로 구성되며, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척해 낸다. 이어서, 시험하고자 하는 샘플을 분취량으로 고체상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 하위유니트가 결합할 수 있게 하는 적합한 조건 (예로서, 실온 내지 40℃, 예를 들면 25℃ 내지 32℃ (25℃ 및 32℃ 포함))하에 충분한 시간 기간 (예로서, 2-40분 또는 보다 더 편리하다면 밤새도록) 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 시간이 경과한 후, 항체 하위유니트 고체상을 세척하고, 건조시키고, 바이오마커의 일부분에 대해 특이적인 2차 항체와 인큐베이션시킨다. 2차 항체는, 2차 항체가 분자 마커에 결합되어 있음을 나타내는데 사용되는 리포터 분자에 연결시킨다.

대체 방법은 샘플 중의 표적 바이오마커를 고정화시킨 후, 리포터 분자로 표지되어 있거나 그렇지 않을 수 있는 특이성 항체에 고정화된 표적을 노출시킨다. 표적량 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 항체로 직접 표지화함으로써 결합된 표적을 검출할 수 있다. 별법으로, 제1 항체에 특이적인 제2 표지된 항체를 표적-제1 항체 복합체에 노출시켜 삼중 복합체를 형성한다. 복합체는 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "리포터 분자"란, 그의 화학적 성질에 의해서 항원-결합 항체를 검출할 수 있게 하는, 분석적으로 확인이 가능한 신호를 제공하는 분자를 의미한다. 이러한 유형의 분석법에서 가장 보편적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사성핵종 함유 분자 (즉, 방사성 동위원소) 및 화학발광성 분자이다.

효소 면역분석법의 경우, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 페리오데이에 의해 2차 항체에 접합된다. 그러한, 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 상이한 접합 기법이 매우 다양하게 존재하며, 이들은 당업자이 쉽게 이용할 수 있다. 보편적으로 사용되는 효소로는 특히 호스래디쉬 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, -갈락토시다제 및 알칼리 포스파타제를 포함한다. 특이적인 효소와 함께 사용되는 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의해 가수분해될 때 일어나는 검출가능한 색상 변화에 대해서 선택된다. 적합한 효소의 예로는 알칼리 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 또한 형광발생성 기질을 사용할 도 있으며, 이는 상기 언급한 발색성 기질보다도 형광성 생성물을 생산한다. 모든 경우에서 있어서, 효소-표지된 항체를 제1 항체-분자 마커 복합체에 첨가하고, 결합할 수 있게 한 후, 과량의 시약은 세척하여 제거한다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 항체-항원-항체 복합체에 첨가한다. 기질은, 2차 항체에 연결되어 있는 효소와 반응하여 질적인 가시 신호를 제공하게 될 것이며, 이는 추가적으로는 보통 분광광도계로 측정하여 정량화됨으로써 샘플 중에 존재하는 바이오마커의 양을 나타낼 수 있다. 별법으로, 형광성 화합물, 예를 들면, 플루오레세인 및 로다민은 항체의 결합능은 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 빛을 조명받아 활성화되면, 형광 색소-표지된 항체는 빛 에너지를 흡수하게 되고, 이는 분자를 흥분 상태로 유도하고, 이어서, 광학 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색상으로 빛을 방출하게 된다. EIA에서와 같이, 형광 표지된 항체는 제1 항체-분자 마커 복합체에 결합될 수 있다. 비결합 시약을 세척하여 제거한 후, 남아있는 삼중 복합체를 적절한 파장의 빛에 노출시키고, 관찰된 형광은 관심의 대상이 되는 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기법 두가지 모두 당업계에 매우 잘 확립되어 있다. 그러나, 기타 다른 리포터 분자, 예를 들면, 방사성 동위원소, 화학발광성 또는 생체발광성 분자 또한 사용될 수 있다.

상기 기술된 기법은 또한 표 1 또는 2에 열거된 표적 유전자들 중 하나 이상의 발현을 검출하는데에도 사용될 수 있다는 것도 주시한다.

본 발명의 방법은 추가로 조직 또는 세포 샘플 중 표 1 또는 2에 열거되어 있는 하나 이상의 표적 유전자의 존재 여부 및/또는 그의 mRNA 발현을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 세포 중 mRNA를 평가하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들면, 상보성 DNA 프로브를 이용하는 이용하는 혼성화 분석법 (예를 들면, 표 1 또는 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자에 대하여 특이적인 표지된 리보프로브를 사용한 계내 혼성화 분석법, 노던 블롯 및 관련 기법) 및 다양한 핵산 증폭 분석법 (예를 들면, 표 1 또는 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자에 대하여 특이적인 상보성 프라이머를 이용하는 RT-PCR, 및 기타 증폭 유형 검출 방법, 예를 들면, 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.

포유동물로부터 얻은 조직 또는 세포 샘플을 노던 블롯, 도트 블롯 또는 PCR 분석법을 사용하여 mRNA에 대해 편리하게 분석할 수 있다. 예를 들면, RT-PCR 분석법, 예로서, 정량적 PCR 분석은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시태양에서, 생물학적 샘플 중의 표적 mRNA를 검출하는 방법은 적어도 하나의 프라이머를 사용하는 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생산하고; 표적 폴리뉴클레오티드를 센스 및 안티센스 프라이머로서 사용하여 상기와 같이 생성된 cDNA를 증폭시킴으로써 거기서 표적 cDNA를 증폭시키고; 증폭된 표적 cDNA의 존재 여부를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 (예를 들어, "하우스키핑" 유전자, 예를 들면, 액틴 계열 구성원의 비교 대조군 mRNA 서열 수준을 동시에 조사함으로써) 생물학적 샘플 중 표적 mRNA의 수준을 측정하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의로는, 증폭된 표적 cDNA의 서열을 측정할 수 있다.

본 발명의 임의의 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플 중의 mRNA, 예를 들면, 표적 mRNA를 검사 또는 검출하는 것을 포함하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용하여 시험군 및 대조군 조직 샘플로부터 얻은 시험군 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 제조한다. 이어서, 프로브를 고체 지지체 상에 고정화된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 이 어레이를 어레이의 각 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있도록 배열한다. 예를 들면, 그의 발현이 항혈관형성 요법이 보이는 증가된 또는 감소된 임상적 이로움과 서로 관련성이 있는 것인 유전자의 선택물을 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 표지된 프로브와 특정 어레이 구성원의 혼성화는, 프로브가 유래된 샘플이 상기 유전자를 발현한다는 것을 시사한다. 질환 조직의 차별적인 유전자 발현 분석은 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기법은 핵산 혼성화 기법 및 연산 기술을 사용하여 단일 실험내에서 수천개의 유전자의 mRNA 발현 프로필을 평가한다 (예로서, WO 01/75166 (2001년 10월 11일 공개) 참조); (예를 들면, 어레이 제작에 관한 논의에 대해서는 (U.S. 5,700,637, U.S. 특허 5,445,934, 및 U.S. 특허 5,807,522, 문헌 [Lockart, Nature Biotechnology. 14:1675-1680 (1996)]; [Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)])을 참조한다). DNA 마이크로어레이는, 유리 또는 다른 기판 상에서 직접 합성되거나 스폿팅되는 유전자 단편을 함유하는 소형 어레이이다. 수천개의 유전자는 통상 단일 어레이에 제시된다. 전형적인 마이크로어레이 실험은 하기 단계를 포함한다: (1) 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지된 표적을 제조하는 단계, (2) 표지된 표적을 마이크로어레이에 혼성화시키는 단계, (3) 어레이를 세척, 염색 및 스캐닝하는 단계, (4) 스캐닝한 영상을 분석하는 단계, 및 (5) 유전자 발현 프로필을 작성하는 단계. 최근에는, 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용된다: 올리고뉴클레오티드 (통상, 25 내지 70 mer) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 사전제작되어 표면에 스폿팅되거나, 또는 표면 상에서 직접 합성될 수 있다 (계내).

애피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)® 시스템은 유리 표면 상에 올리고뉴클레오티드를 직접 합성함으로써 제작된 어레이를 포함하는 상업적으로 이용가능한 마이크로어레이 시스템이다. 프로브/유전자 어레이:올리고뉴클레오티드 ("올리고스") (통상, 25 mer)를 반도체-기재 광식각법 및 고체상 화학 합성 기술을 조합하여 유리 웨이퍼 상에서 직접 합성한다. 각 어레이는 400,000개 이하의 서로 다른 올리고를 함유하며, 각 올리고는 수백만개의 카피로 존재한다. 올리고뉴클레오티드 프로브가 어레이 상의 공지된 위치에서 합성되기 때문에, 혼성화 패턴 및 신호 강도는 애피메트릭스 마이크로어레이 스위트(Affymetrix Microarray Suite) 소프트웨어에 의해 유전자 확인 및 상대적 발현 수준 면에서 해석될 수 있다. 각 유전자는 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 어레이 상에서 제시된다. 각 프로브 쌍은 완전 매치 올리고뉴클레오티드 및 미스매치 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 완전 매치 프로브는 특정 유전자에 대해 정확하게 상보적인 서열을 가지므로, 유전자 발현을 측정한다. 미스매치 프로브는 중심 염기 위치에서의 단일 염기 치환에 의해 완전 매치 프로브과 상이하여 표전 유전자 전사체의 결합을 방해한다. 이는 완전 매치 올리고에 대해 측정된 신호에 기여하는 배경 및 비특이 혼성화를 측정하는데 도움이 된다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 완전 매치 프로브의 혼성화 강도로부터 미스매치 프로브의 혼성화 강도를 감산하여 각 프로브 세트에 대한 절대 강도값 또는 특이적 강도값을 측정한다. 프로브는 진뱅크(Genbank) 및 기타 뉴클레오티드 정보보관소의 최근 정보에 기초하여 선택한다. 서열은 유전자의 3' 말단의 특수한 영역을 인식하는 것으로 여겨진다. 진칩 혼성화 오븐 ("회전식(rotisserie)" 오븐)을 사용하여 한번에 64개까지의 어레이의 혼성화를 수행한다. 플루이딕스 스테이션(fluidics station)은 프로브 어레이의 세척과 염색을 수행한다. 이는 완벽하게 자동화되어 있고, 4가지 모듈을 포함하며, 각 모듈에는 하나의 프로브 어레이가 들어간다. 각 모듈은 미리 프로그래밍된 플루이딕스 프로토콜을 사용하여 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 통해 독립적으로 제어된다. 스캐너는 공초점 레이저 형광 스캐너이며, 이는 프로브 어레이에 결합된 표지 cRNA에 의해 방출되는 형광 강도를 측정한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어에 의한 컴퓨터 워크스테이션은 플루이딕스 스테이션 및 스캐너를 제어한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 프로브 어레이에 대해 미리 프로그래밍된 혼성화, 세척 및 염색 프로토콜을 사용하여 8개까지의 플루이딕스 스테이션을 제어할 수 있다. 또한, 소프트웨어는 혼성화 강도 데이터를 획득하고 적합한 알고리즘을 사용하여 각 유전자에 대한 존재/부재 신호로 전환한다. 마지막으로, 소프트웨어는 유전자 발현 실험들 간의 비교 분석에 의해 유전자 발현의 변화를 검출하고, 결과물을 텍스트 파일 형식으로 구성하며, 이를 추가 데이터 분석을 위해 다른 소프트웨어 프로그램과 함께 이용할 수 있다.

조직 또는 세포 샘플 중 선택된 바이오마커의 발현은 또한 기능 또는 활성 기반 분석에 의해 조사될 수 있다. 예를 들면, 바이오마커가 효소일 경우, 조직 또는 세포 샘플 중 주어진 효소 활성의 존재 여부를 측정 또는 검출하는 당업계에 공지된 분석법을 수행할 수 있다.

본 발명의 키트는 다수의 실시태양을 갖는다. 전형적인 실시태양은 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기내 함유되어 있는 조성물을 포함하되; 여기서, 조성물은 표 1 또는 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자에 상응하는 표적 폴리펩티드 서열에 결합하는 1차 항체, 조성물이 적어도 한가지 유형의 포유동물 세포 중 표적 단백질의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내는 용기 상의 표지, 및 적어도 한가지 유형의 포유동물 세포 중 표적 단백질의 존재를 평가하는데 사용되는 항체 사용에 관한 설명서를 포함하는 것인 키트이다. 키트는 추가로 조직 샘플을 제조하고, 항체 및 프로브를 조직 샘플의 동일 절편에 적용시키기 위한 설명서 및 물질 세트를 포함한다. 키트는 1차 및 2차 항체 두가지 모두 포함할 수 있으며, 여기서, 2차 항체는 예로서, 효소 표지와 같은 표지에 접합된다.

또다른 실시태양은 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기내 함유되어 있는 조성물을 포함하되; 여기서, 조성물은 엄격한 조건하에서 표 1 또는 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 조성물이 적어도 한가지 유형의 포유동물 세포 중 표 1 또는 2에 열거되어 있는 하나 이상의 표적 유전자의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타내는 용기 상의 표지, 및 적어도 한가지 유형의 포유동물 세포 중 표적 RNA 또는 DNA의 존재를 평가하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드 사용에 관한 설명서를 포함하는 것인 키트이다.

키트 중 기타 다른 임의 구성 성분으로는 하나 이상의 완충액 (예로서, 차단 완충액, 세척 완충액, 기질 완충액 등), 기타 다른 시약, 예를 들면, 효소 표지에 의해 화학적으로 변경된 기질 (예로서, 색원체), 에피토프 회복 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다.

투여량 및 투여

본 발명의 방법의 경우, 항암 치료제, 항혈관형성제 및/또는 화학요법제는 예를 들면, 일정 기간 동안에 걸쳐 볼루스로서 정맥 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 동맥내, 활액막내, 경막내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로와 같은 공지된 방법에 따라 인간 환자에게 투여된다. 항체의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.

본 발명의 치료는 항-VEGF 항체와 하나 이상의 화학요법제의 조합 투여를 포함할 수 있다. 본 발명은 상이한 화학요법제의 칵테일 투여를 주시한다. 병용 투여는 별도의 제제 또는 단일의 약제학적 제제를 사용한 공투여, 및 어느 순서로든 이루어지는 연속 투여를 포함하며, 여기서, 두가지 모두 (또는 모든)의 활성제가 동시에 그들의 생물학적 활성을 발휘하는데에는 일정 기간이 존재하는 것이 바람직하다. 상기 화학요법제의 제조 및 투약 스케줄은 제조사의 설명서에 따라 또는 당업자의 실험을 통해 결정될 수 있다. 화학요법에 대한 제조 및 투약 스케줄은 또한 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기재되어 있다. 화학요법제는 항체 투여 이전 또는 이후에 이루어질 수 있거나, 그와 동시에 제공될 수 있다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 항암 치료제 또는 항혈관형성제의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이, 치료하고자 하는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과 상태, 예방 또는 치료 목적으로 제제를 투여받고 있는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 병력 및 제제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라진다. 제제는 한번에 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 적합하게 투여된다. 병용 치료 요법에서, 본 발명의 조성물은 치료학적 유효량 또는 시너지량으로 투여된다. 몇몇 실시태양에서, 항혈관형성제는 항-VEGF 항체이다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예로서 0.1-20 mg/kg)은 예를 들면, 1회 이상의 개별 투여에 의해 이루어지든, 또는 연속 주입에 의해 이루어진든 간에, 환자에게 투여하는데 있어 초기의 후보 투여량이 된다. 상기 언급한 인자들에 따라서, 전형적인 1일 투여량은 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상의 기간 동안에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 병태에 따라서 치료는 질환 증상이 원하는 정도고 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 기타 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 항체는 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 투약 범위로 매 2주 내지 매 3주마다 투여된다. 더욱 바람직하게, 그러한 투약 요법은 전이성 결장직장암을 치료하기 위한 일선의 요법으로서 화학요법과 병용하여 사용된다. 몇몇 측면에서, 화학요법은 전통적으로 고투여량으로 간헐적으로 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 다른 측면에서, 화학요법제는 스케줄로 짜여진 중단 기간없이 소량으로 보다 빈번하게 투약하는 방식을 사용하여 투여된다 ("메트로놈 화학요법"). 본 발명의 요법의 진행 상태는 통상의 기법 및 분석법에 의해 쉽게 모니터링된다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다. 특정 실시태양에서, 예로서, 조합되어 사용될 경우, 베바시주맙은 약 0.05 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 범위로 투여된다. 하나의 실시태양에서, 약 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 6.0 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 9.0 mg/kg, 10 mg/kg 또는 15 mg/kg (또는 그의 임의 조합) 중 하나 이상의 투여량이 피험체에게 투여될 수 있다. 상기 투여량은 간헐적으로, 예로서, 매일, 매 3일마다, 매주 또는 매 2주 내지 매 3주마다 투여될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 예로서, 조합되어 사용될 경우, 베바시주맙은 매 2주마다 10 mg/kg 또는 매 3주마다 15 mg/kg씩 피험체에게 정맥내로 투여될 수 있다.

하기 실시예는 단지 설명하기 위한 목적으로 제공되는 것이지, 본원에서 교시할 때 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1: 신세포 암종 환자의 샘플로부터 바이오마커 데이타 수집

기준선 및 치료 56일째 (1차 종양 평가)에 전이성 신세포 암종 환자로부터 혈장 샘플을 수집하였다. 모든 샘플은 24개월 동안 10 mg/kg 베바시주맙 IV q2wk로 치료받은 환자로부터 수득하였다. 샘플을 완충액 중에 희석시키고, 샘플 중 특정 유전자의 단백질 수준을 측정하기 위하여 분석하였다. 예비 분석에 의해 각 분석에 대하여 표준 범위내 포함되는 있는 것으로 측정된 4개의 희석 지점을 각 환자 샘플에 대하여 일중 또는 이중으로 생성하였다. 개별 단백질의 발현 수준을 위해 ELISA 분석법을 이용하거나, 멀티플렉스화된 면역분석 방법을 사용하여 샘플을 분석하였다.

일반적인 ELISA 분석 방법

ELISA 웰을 2-8℃에서 밤새도록 인산염 완충처리된 염수 (PBS (pH 7.4)) 중 1 ㎍/ml 포획 항체로 코팅하였다. 코팅 용액을 제거한 후, 차단 용액 (PBS/0.5％ BSA, 150 ㎕/웰)과 함께 1-2시간 동안 인큐베이션시켜 비특이 결합 부위를 차단시켰다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS/0.05％ 트윈)로 세척한 후, 분석 완충액 (PBS/0.5％ BSA/0.05％ 트윈-20/10 ppm 프로클린(Proclin) 300/0.25％ CHAPS/0.35 M NaCl/5 mM EDTA (pH 7.4)) 중에 희석된 표준 또는 샘플을 첨가하였다 (100 ㎕/웰). 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 플레이트를 세척하고, HRP 접합된 항체를 첨가하고 (100 ㎕/웰), 추가로 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 또한번 세척한 후, 100 ul의 테트라메틸 벤지딘 기질 (TMB)을 첨가한 후, 15-30분 동안 색상이 현상될 수 있도록 하고, 1 M 인산 (100 ㎕/웰)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 마이크로플레이트 판독기 (핀란드 소재의 써모 랩시스템즈(Thermo Labsystems))를 사용하여 450-630 nm 파장에서 플레이트를 판독하였다. 표준 곡선의 4-파라미터 피트로부터 샘플 중 단백질 농도를 외삽하였다.

멀티플렉스화된 면역분석 데이타

일반 메조 스케일 디스커버리 MSD 멀티플렉스 방법 (혈관 손상 패널 I, II 및 성장 인자 패널)을 사용하여 면역분석 데이타 또한 수집하였다. 간략하면, 진탕시키면서 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 동안 150 ul/웰 블로커(Blocker) A (패널 I, II) 또는 카제인 완충액 (성장 인자 패널) 중에서 차단시켰다. 플레이트를 PBS/0.05％ 트윈-20 (패널 I, II) 또는 PBS (성장 인자 패널)로 3회에 걸쳐 세척하였다. 40 ㎕/웰 (패널 I, II) 분석 희석액 및 10 ㎕/웰 보정액(calibrator) 또는 샘플 (블로커 A (패널 I, II) 중 1:5로 미리 희석된 것) 또는 25 ㎕/웰 분석 희석액 및 25 ㎕/웰 보정액 또는 샘플 (분석 희석액 (성장 인자 패널) 중 1:5로 미리 희석된 것)을 플레이트를에 첨가하고, 진탕시키면서 이를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 전과 같이 3회에 걸쳐 세척하고, 25 ul/웰 검출 항체 시약을 첨가하고, 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 계면활성제를 포함하는 150 ul/웰 1X 리드 버퍼 T(Read Buffer T)를 첨가하고, MSD 6000 영상기 상에서 판독하였다.

멀티플렉스화된 면역분석 데이타는 또한 룰즈-베이스드 메디슨(Rules-Based Medicine) (텍사스 오스틴)에서 휴먼맵(HumanMAP) 버전 1.6 비드 기반 분석법을 사용하여 수집하였다. 그러한 분석은 삼중으로 수행하였다.

실시예 2: 바이오마커 데이타의 통계학적 분석

다변량 데이타, 예를 들면, DNA 마이크로어레이로부터 작성된 데이타를 연구하는데 통상적으로 수행되는 클러스터 분석법 중 한 유형인, 열지도를 사용하는 바이오마커 데이타 분석법을 수행하였다 (문헌 [Eisen, M.B., Spellman, P. T., Brown, P.O., and Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. PNAS 95(25), 14863-14868, 1998]). 기준선에서 측정된 바이오마커 데이타, 1차 종양 평가 시점 (56일째)에 측정된 데이타, 및 이 두 평가 (기준선 시점 및 56일째 시점) 사이의 차이에 대하여 따로따로 열지도를 작성하였다. 광범위하게 이용할 수 있는 통계학적 분석 프로그램 R을 사용하여 분석을 수행하였다. 분석에 대하여 데이타를 작성하기 위해, 먼저 하기와 같이 Z-점수로 정규화하였다. 각 데이타 세트 내에서 바이오마커의 평균값을 감산하여 각 바이오마커에 대한 값을 중심화시킨 후, 중심화된 값을 그의 제곱근 평균 제곱값 (이는 중심화된 값의 제곱의 합을 (n-1)로 나눈 값의 제곱근을 계산하여 얻은 것이다)으로 나누어 크기를 조정하였다. 차이를 나타내는 열지도의 경우, Z-점수는 조합된 데이타 세트에 대해 계산한 것과 같이, 기준선과 56일째의 Z-점수 사이의 차이로서 계산하였다.

관찰된 바이오마커 값에 대한 Z-점수는, 상기 값이 관찰된 평균 또는 확립된 평균보다 더 높거나 낮은 표준 편차 수치를 나타낸다. 가능한 Z-점수 범위는 -∞ 내지 +∞ 사이이다. 클러스터 분석에 대한 데이타를 작성하기 위하여 본 발명자들은 이들 Z-점수를, 가능 범위가 0 내지 1인 Z-점수 분위수로 전환시켰다. Z-점수 분위수는 표준 정규 확률 변수가 소정 갯수의, 평균값으로부터 표준 편차값을 갖게 될 확률이다.

이어서, R에서 디폴트 값과의 열지도 함수를 사용하여 Z-점수 분위수로부터 열지도를 작성하였다. 이는 바이오마커의 고발현은 자주색으로 나타나고, 저발현은 청록색으로 나타나는 (여기서, 발현은 데이타 세트 중 나머지 다른 샘플에 대하여 상대적인 것이다) 색상 영상 데이타를 생성한다. 열지도는 또한, 다변량 데이타 분석에서 잘 확립된 방법인 계층적 클러스터링 알고리즘을 사용하여 바이오마커 및 샘플을 재정렬한다. 계층적 클러스터링 알고리즘은 먼저 각 바이오마커에 그 자체의 클러스터로 배정한 후, 단 하나의 클러스터가 남을 때까지 가장 유사한 2개의 클러스터를 반복하여 결합시킨다. 각 단계에서는 그의 유클리드 거리를 사용하여 클러스터 사이의 거리를 전산처리하였다. R에서 디폴트 세팅, 즉, 완전 연관 방법을 사용하여 가장 유사한 2개의 클러스터를 전산처리하였다.

이러한 분석에 의해 작성된 클러스터는 바이오마커의 생물학적 특성들 및 임상적 공변량, 즉, 무진행 생존, 요법에 대한 반응, 및 병변 크기 변화를 조사함으로써 해석하였다. 기준선 데이타에서, 열지도 검사를 통해서는 베바시주맙을 사용하는 치료에 대하여 잘 반응하는 환자의 높은 빈도에 상응하는, 고도로 발현된 유전자 클러스터가 밝혀졌다(염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF), 란테스, P-셀렉틴, PDGF, VEGF-C, CD40 리간드, 뇌 유래의 신경 친화성 인자 (BDNF) 및 플라스미노겐 활성 인자 억제제-1 (PAI1)). 그러나, 상기 치료에 대하여 반응을 보인 모든 반응자가 상기 유전자의 고도의 발현을 보인 것은 아니었다. 기준선 데이타에서, 열지도 검사를 통해서 단기간 (예로서, 4개월 미만) 무진행 생존이 상대적으로 높은 비율로 발생하는 것에 상응하는, 고도로 발현된 유전자 클러스터가 밝혀졌다. 이들 유전자를 하기 표 1에 열거한다.

혈청 아밀로이드 P
보체 C3
ICAM 1
합토글로빈
C 반응성 단백질
피브리노겐
sNRP1
알파-1 항트립신
VCAM-1
인터루킨 6
혈청 아밀로이드 A

열지도 차이를 통해 단기간 (예로서, 4개월 미만) 무진행 생존과 관련이 있는, 고도로 발현된 유전자 클러스터가 밝혀졌다. 이들 유전자를 하기 표 2에 열거한다.

CD40 리간드
표피 성장 인자 (EGF)
1형 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP-1)
뇌 유래의 신경 친화성 인자
1형 플라스미노겐 활성 인자 억제제 (PAI-1)
VEGF C
줄기 세포 인자
상피 유래의 중성구 활성화 단백질 78 (ENA-78, CXCL5로도 알려져 있음)
염기성 섬유모세포 성장 인자
PDGF BB
란테스
P-셀렉틴
인터루킨 18
인터루킨 1ra
인터루킨 8
대식세포 염증성 단백질 1-알파 (MIP 1-알파, CCL3으로도 알려져 있음)
ICAM-1
CD40
ICAM-1
알파-1 항트립신
종양 괴사 인자 수용체 II
베타-2 마이크로글로불린
면역글로불린 IgM
면역글로불린 IgA
인터루킨 6
칼시토닌
매트릭스 메탈로프로테이나제 9 (MMP-9)

Claims

신장암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
여기서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인,
항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 신장암 환자를 확인하는 방법.
신장암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
여기서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 환자가 단독의 항혈관형성 요법에 반응성일 가능성이 적음을 나타내는 것인,
신장암 환자의 항혈관형성 요법에 대한 반응을 예측하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항혈관형성 요법이 VEGF-특이적 길항제를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, VEGF-특이적 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
제4항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 환자로부터 수득한 샘플이 조직 샘플이거나, 혈장으로부터 수득된 것인 방법.
신장암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계;
상기 발현 수준을 기준 샘플과 비교하는 단계; 및
상기 측정 및/또는 비교 단계로부터 얻은 데이타를 요약한 보고서를 작성하고, 여기서 보고서는 상기 환자가 단독의 항혈관형성 요법으로도 임상적으로 이로울 수 있는지 여부의 가능성에 관한 예측을 포함하는 것인 단계
를 포함하고, 여기서 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 상기 항혈관형성 요법이 아닌 또는 상기 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법으로도 임상적으로 이로울 수 있는 가능성이 증가함을 나타내는 것인, 신장암 환자의 개별 게놈 프로파일을 작성하는 방법.
표 1에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이를 포함하고, 단독의 항혈관형성 요법에 대한 신장암 환자의 반응을 예측하기 위해 상기 어레이를 사용하는 것에 관한 사용 설명서를 더 포함하며, 여기서 하나 이상의 유전자의 발현이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 키트.
표 1에 열거되어 있는 2개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 검출할 수 있으며,
여기서 신장암 환자로부터 수득한 샘플에서 화합물 세트를 사용하여 결정된 2개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 기준 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 화합물 세트.
제9항에 있어서, 화합물이 폴리뉴클레오티드인 화합물 세트.
제9항에 있어서, 화합물이 단백질인 화합물 세트.
제9항에 있어서, 표 1에 열거되어 있는 유전자 또는 유전자 생성물 모두를 검출할 수 있는 화합물 세트.
1차 종양 평가시에 신장암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
여기서 1차 종양 평가시의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에 비해 증가하는 것은 환자가 단독의 항혈관형성 요법으로는 임상적 이로움이 감소되기 쉬움을 나타내는 것인,
항혈관형성 요법으로 치료받고 있는 신장암 환자에서 치료의 진행 상태를 모니터링하는 방법.
1차 종양 평가시에 신장암 환자로부터 수득한 샘플에서 표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하고,
여기서 1차 종양 평가시의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인,
항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 신장암 환자를 확인하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 항혈관형성 요법이 VEGF-특이적 길항제를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서, VEGF-특이적 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
제16항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 환자로부터 수득한 샘플이 조직 샘플이거나, 혈장으로부터 수득된 것인 방법.
제13항에 있어서, 감소된 임상적 이로움이 단기간 무진행 생존, 낮은 반응율 또는 낮은 전반적인 생존율인 방법.
표 2에 열거되어 있는 하나 이상의 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이를 포함하고, 단독의 항혈관형성 요법에 대한 신장암 환자의 반응을 검출하기 위해 상기 어레이를 사용하는 것에 관한 사용 설명서를 더 포함하며, 여기서 1차 종양 평가시에 환자로부터 수득한 샘플에서의 하나 이상의 유전자의 발현이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 키트.
표 2에 열거되어 있는 2개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준을 검출할 수 있으며,
여기서 1차 종양 평가시에 신장암 환자로부터 수득한 샘플에서 화합물 세트를 사용하여 결정된 2개 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현이 항혈관형성 요법의 개시 이전 또는 개시점에서 환자로부터 수득한 샘플에 비해 증가하는 것은 항혈관형성 요법이 아닌 또는 항혈관형성 요법에 추가한 항암 요법이 환자에게 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 화합물 세트.
제21항에 있어서, 화합물이 폴리뉴클레오티드인 화합물 세트.
제21항에 있어서, 화합물이 단백질인 화합물 세트.
제21항에 있어서, 표 2에 열거되어 있는 유전자 또는 유전자 생성물 모두를 검출할 수 있는 화합물 세트.