KR20240046057A - 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법 - Google Patents

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Abstract

투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법으로서, 그 방법은, 제1 배율로 샘플의 기준 이미지를 획득하는 단계; 기준 이미지에서 식별된 제1 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해, 투과 전자 현미경의 전자 빔을 타깃 위치로 조향하는 단계, 제1 배율보다 큰 제2 배율로 샘플의 교정 이미지를 획득하는 단계, 및 교정 이미지 내의 타깃 위치의 예상된 포지션과 교정 이미지 내의 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 단계, 제1 복수의 타깃 위치들 및 대응하는 겉보기 시프트들을 사용하여 비선형 모델을 훈련시키는 단계; 비선형 모델에 기초하여, 다음 타깃 위치에 대한 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계; 전자 빔을 교정된 타깃 위치로 조향하고, 제1 배율보다 큰 제3 배율로 이미지를 획득하는 단계를 포함한다.

Description

투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법 {A Method of Automated Data Acquisition for a Transmission Electron Microscope}
본 발명은 극저온 전자 현미경(cryo-EM) 상에서 단일 입자 분석(SPA)을 위한 자동화된 데이터 획득을 수행하기 위해 투과 전자 현미경을 제어하기 위한 타깃팅 방법들에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 이미지 시프트 프로세스들을 통해 고배율 이미지들을 수집하기 위한 개선된 기법들을 제공한다.
본 발명은 SPA 데이터 획득에서 타깃 영역들을 이미징하는 동안 빔 제어 정확도를 개선시키는 것에 관한 것이다.
SPA 샘플의 설명:
전형적인 SPA 샘플은 그리드 상에 냉동(freeze)된 동일한 유형의 많은 생체-거대분자들(대부분 구리 또는 금으로 제조되고, 직경이 ~3 밀리미터임)을 포함한다. 그러한 그리드는 통상적으로, ~500개의 메시들("그리드 정사각형들", ~75 마이크로미터 측부 길이를 갖는 정사각형들)을 포함한다. 각각의 그러한 정사각형은 대략 1 마이크로미터 직경(일반적으로 0.2 내지 2 마이크로미터의 범위에 있음)의 수백 개의 규칙적으로 분포된 홀들을 갖는 얇은 탄소 포일(foil)을 포함한다. 하나의 적합한 냉동 방법은 플런지-냉동(plunge-freezing)이며, 이는 각각의 그러한 홀이 다수의 생체-거대분자들을 포함하는 비정질 얼음의 얇은 층에 의해 커버되는 것을 보장한다. 제트-냉동 및 인쇄-기반 냉동과 같은 다른 냉동 방법들이 또한 가능하다.
SPA 데이터 획득 및 빔 제어 방식:
SPA 데이터 획득은 전형적으로,
(1) 현미경을 저배율(LM) 모드(전형적으로 200 내지 500x)로 설정하고;
(2) (1)의 조건들 하에서 내비게이션 이미지("그리드 정사각형 이미지")를 획득하고 - 전형적으로 그러한 내비게이션 이미지는 약 10 내지 100 마이크로미터에 걸쳐 있음 -;
(3) 데이터 획득을 위한 타깃 영역들로서 포일 홀들의 서브세트를 식별하고 선택하기 위해 내비게이션 이미지를 사용하고;
(4) 고배율(HM) 모드(전형적으로 20,000 내지 100,000x)로 스위칭하고;
(5) 포일 홀들의 위치들에 있는 얼음 시트들에서 생체분자들의 HM 이미지들을 순차적으로 획득함으로써 - 전형적으로, 그러한 HM 이미지들은 약 100 내지 1000 나노미터에 걸쳐 있음 - 수행된다. 포일이 HM 이미지의 범위보다 크다면, 그리고 HM 이미지들을 기록하는 데 사용되는 조명이 다음 HM 이미지와 중첩되지 않으면(그렇지 않으면, 조명을 중첩하는 것은 다음 HM 이미지에서 방사선 손상을 야기할 것임), 다수의 HM 이미지들이 단일 포일 홀에 기록될 수 있다.
본 명세서에서, "타깃 영역"은 HM으로 카메라 상에 캡처될 영역(전형적으로 선택된 얼음 포일 또는 포일 홀의 일부)을 의미하고; "타깃 포지션" 또는 "타깃 위치"는 타깃 영역 내의 중심 포지션을 의미한다.
이러한 위치들은 적절한 스테이지 이동들에 의해 또는 전자 현미경의 빔 편향 유닛들을 사용하여 전자 빔을 적절히 편향시킴으로써 방문될 수 있다. 내비게이션 이미지는 포일 홀들의 선택된 서브세트에 HM 이미지들을 중심설정시키는 데 필요한 스테이지 이동들 및/또는 전자 빔 편향들의 크기들 및 방향들을 결정하는 데 사용된다.
일반적으로, 그러한 전자 빔 편향은 2개의 동시 및 동기식 액션들: 샘플 위의 편향 및 샘플 아래의 편향으로 이루어진다. 이러한 2개의 편향들의 조합 효과는 카메라 상에 이미징되는 샘플의 일부가 광학 축으로부터 멀리 시프트되는 것(따라서, 샘플의 기계적 이동을 효과적으로 모방함)이며, 따라서, 그러한 전자 빔 편향은 일반적으로 "이미지 시프트"로 불린다. 그러나, 전자 빔 편향의 범위가 현재 현미경들에서의 광학 축으로부터 수십 마이크로미터("축외(off-axis)")로 제한되므로, 샘플 스테이지 이동이 더 큰 이동들을 수행하는 데 요구된다.
빔 편향은 일반적으로 가능할 때마다 선호되는데, 이는 샘플 스테이지를 기계적으로 이동시키는 것이 훨씬 더 느리고, 기록된 이미지들에서 해상도의 손실을 유발할 수 있는 바람직하지 않은 기계적 드리프트를 도입하기 때문이다.
SPA 이미지들의 큰 세트들을 수집하기 위한 기존의 방법들의 일 예는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터의 EPU('E Pluribus Unum') 소프트웨어이며, 이는 이미지 시프트 기법들을 포함한다. 이러한 이미지 시프트 기법들은 스테이지를 이동시키지 않으면서 축외 포일 홀들로부터의 이미지 데이터의 수집을 허용하여, 이러한 포일 홀들을 대물 렌즈의 광학 축에 더 가깝게 가져간다. 그 결과, 그리드 정사각형 상의 미리 정의된 위치들을 이미징하는 데 요구되는 스테이지 이동들의 수가 감소될 수 있다. 이러한 이미지 시프트 기법들로부터 기인되는 광학 수차들은 대물 렌즈의 동시 재포커싱, 이미지를 동시에 리-스티지메이팅(re-stigmating)하는 것, 및 조명 빔의 적절한 틸트를 동시에 적용하는 것에 의해 최소화될 수 있다.
전술된 이미지 시프트는 현미경 컬럼(column)에서 편향기들(빔 편향을 달성하는 광학 모듈들)의 전류를 조정함으로써 달성된다. 시료에서의 관찰된 이미지 시프트와 설정된 전류 사이의 관계는 이론적으로 선형이고, 이미지 시프트 제어 로직에서 모델링된다.
그러나, 이러한 제어 로직에 의해 적용되는 이미지 시프트들은 때때로 빔을 사전-선택된 얼음 홀들로 정확하게 시프트시키지 않는다. 다시 말하면, 내비게이션 이미지로부터 측정된 바와 같은 얼음 홀들의 포지션들과 편향기 코일들에 인가된 전류들로 표현된 바와 같은 얼음 홀들의 포지션들 사이에 미스매치가 존재할 수 있다. 이러한 미스매치들은 일반적으로 "타깃팅 에러들"로 지칭된다. 특히 요구되는 이미지 시프트들이 비교적 클 때(예를 들어, 12 마이크로미터 초과), 타깃팅 에러들이 발생할 수 있다. 발명자들은 그러한 에러들이 내비게이션 이미지 및/또는 샘플에서 관찰된 시프트들에 대한 다음의 선형 및/또는 비선형 기여도들로부터 비롯될 수 있다고 가정했고 식별했다:
(1) 내비게이션 이미지 또는 HM 이미지들에서의 왜곡들; 이러한 왜곡들은 3차 이미지 왜곡들과 같은 전자 현미경의 렌즈들에 고유한 광학 수차들로 인한 것일 수 있지만, 이러한 왜곡들은 또한 전자 현미경의 렌즈들의 약간의 비-진원도(non-roundness) 또는 약간의 시프트들와 같은 기계적 결함들의 결과인 광학 수차들로 인한 것일 수 있다.
(2) 현미경이 이미지 검출기 상에 이미징하는 광학 평면으로부터의 샘플 높이의 국소 편차들; 특히 조명 빔의 틸트와 조합된 그러한 편차는 카메라 상에 이미징되도록 의도되었던 샘플의 포지션과 카메라 상에 실제로 이미징되는 샘플의 포지션 사이의 차이를 유발할 수 있다.
그러한 타깃팅 에러들이 HM 이미지의 범위과 비교하여 실질적이게 될 때(예를 들어, HM 이미지가 200 nm에 걸쳐 있고, 타깃팅 에러가 50 nm을 초과할 때), 이어서, HM 이미지는 더 이상 타깃팅된 얼음 포일을 적절하게 캡처하지 않으며, SPA 데이터 획득은 비효율적이게 된다. 따라서, SPA 이미지들의 큰 세트들을 수집하기 위한 기존의 방법들은 SPA 데이터 획득에서 타깃팅 에러들을 감소시키기 위해 이미지 시프트의 교정(calibration)을 위한 프로세스를 이용할 수 있다. 최신 이미지 시프트 교정 프로세스들은 전형적으로,
(1) 중간 배율(MM, ~5000x)에서, 높은 배율로 기록될 얼음 포일들 또는 포일 홀들의 타깃팅된 포지션들의 미리 정의된 서브세트 주위에 중심설정되는 미리 정의된 수의 보조 또는 "교정 이미지들" 또는 "포일 홀 이미지들"을 취하는 단계(여기서, 는 적용된 이미지 시프트를 나타내는 2차원 벡터들임),
(2) (1)에서 획득된 교정 이미지들에 홀들의 중심들을 정밀하게 위치시키고, 그로부터, 카메라 상에 이미징되었던 시료 상의 실제 포지션들의 세트 를 도출하기 위해 이미지 프로세싱 알고리즘들을 사용하는 단계(여기서, 는 실제 관찰된 이미지 시프트를 나타내는 2차원 벡터들임) - 타깃팅 에러들 는 타깃팅된 포지션들과 실제 이미징된 포지션들 사이의 차이들 에 의해 주어짐 -;
(3) 선형 모델 를 데이터세트 에 피팅(fit)하는 단계 - 2x2 행렬 M은 가능한 스케일링, 회전, 및 전단(shear)을 고려하고, 벡터 S는 가능한 시프트를 고려하고, 대안적으로 그리고 동등하게, 선형 모델은 또한, 모델 를 사용하여 데이터 세트 에 피팅될 수 있고, 1은 2x2 항등 행렬(identity matrix)을 나타냄 -;
(4) 교정된 포지션들에서 HM 이미지들을 획득하기 위해 (3)에서 피팅된 모델
을 적용하는 단계를 포함한다.
그러나, 다음과 같은 위에서 설명된 최신 교정 프로세스에 여러가지 함정들이 존재한다:
(1) 타깃팅 에러는 모델링되지 않는 비선형 컴포넌트들을 갖는다.
(2) 타깃 영역들의 미리 정의된 서브세트 및 획득 순서는 교정 동안 조정될 수 없다. 이는 포일 홀 패턴의 주기성으로 인해 포일 홀들의 중심들을 위치시키는 동안 측정 에러들을 유발할 수 있다.
(3) 샘플 높이 변동성에 대한 지식이 사용되지 않는다.
(4) 포일 홀 중심 발견 알고리즘이 단지 소정의 미리 정의된 기하학적 형상들만을 인식하므로, 그것은 불규칙한 홀들을 포함하는 샘플로 작동할 수 없다.
(5) 교정 타깃들이 적절하게 선택되지 않으면, 지향성 바이어스가 피팅에 도입될 수 있다.
이러한 이유 때문에, SPA 획득 프로토콜의 현재 구현예들은, SPA 획득 프로세스의 유효성을 달리 손상시킬 과도한 타깃팅 에러들을 방지하기 위해 이미지 시프트들을 전형적으로 약 12 마이크로미터 미만으로 제한한다. 따라서, SPA 획득의 현재 구현예들은 이미지 시프트들을 샘플의 기계적 이동들과 조합하며, 여기서 후자는 전형적으로 12 마이크로미터보다 큰 시프트들을 만드는 데 사용된다.
더 긴 범위 이미지 시프트들을 가능하게 하기 위해 타깃팅 에러들을 감소시키고, 그에 의해, 요구되는 스테이지 이동들의 수를 감소시키고, 그에 의해, SPA 획득의 완전한 실행에 대해 필요한 시간을 감소시키는 것이 본 발명의 의도이다.
위에서 설명된 SPA 데이터 획득에서의 최신 이미지 시프트 교정 프로세스는 선형 모델에 의해서만 설명될 수 없는 타깃팅 에러들을 겪을 수 있다. 더욱이, 프로세스는 전체 교정 절차를 재실행하지 않으면서 미리 정의된 위치들의 즉시(on-the-fly) 조정을 허용하지 않는다. 그것은 또한 샘플 높이를 고려하지 않는다. 따라서, 본 발명은 개선된 교정 프로세스를 제공하고자 한다.
제안된 방법은 샘플의 비평탄도 및 틸트(이는 샘플 높이 변동을 유발함) 및 LM 및 HM 모드들 사이의 더 높은 차수의 불일치들을 고려함으로써 기존의 방법들을 개선시킨다. 그것은 또한, 미리 정의된 보조 이미지들의 즉시 조정(아래에서 설명되는 세부사항들)을 허용한다. 이러한 인자들은 (수차들을 교정하기 위해 기존의 기법들과 조합하여 적용되는 바와 같이) LM 및 HM 모드들 사이의 선형 시프트, 스케일링, 회전, 및 전단 불일치들에 부가하여 고려될 수 있다.
개선된 이미지 시프트 교정을 위한 다음의 방법이 제안된다("교정 방법 1"):
(1) 저배율로 그리드 정사각형 이미지를 획득하는 것;
(2) 그리드 정사각형 이미지에서 데이터 획득을 위해 타깃 위치들의 세트를 식별하는 것;
(3) 이미지 시프트 교정을 위해 타깃 위치들의 세트로부터 타깃 위치들의 서브세트 를 선택하는 것;
(4) 타깃 위치들의 이러한 서브세트 내의 각각의 타깃 위치 에 대해:
a. 이미지 시프트를 사용하여 전자 빔을 타깃 위치로 조향하는 것;
b. 중간 배율로 교정 이미지를 획득하는 것;
c. 그리드 정사각형 이미지 내의 타깃 위치와 교정 이미지 내의 실제 이미징된 위치 사이의 시프트 를 발견하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 것;
(5) 비선형 모델 를 데이터 쌍들 에 피팅하는 것
(6) 예측된 타깃팅 에러를 고려하는 보정된 타깃 위치들 을 생성하기 위해 타깃 위치들의 완전한 세트에 모델을 적용하는 것.
(7) 이러한 보정된 타깃 위치들을 사용하여 고배율의 데이터 획득으로 진행하는 것.
(5)의 모델은 평활하게 변하는 전역 타깃팅 에러 거동을 캡처하기 위해 평활화 함수들, 예를 들어 제르니케(Zernike) 다항식들에 기초할 수 있다. 그러한 다항식 기반 모델은 일반적인 형태 를 가질 수 있으며, 여기서 K는 다항식의 차수이고,는 타깃 위치이고, 는 계수 벡터들이다.
모델은 부가적으로, 예를 들어 가우시안 프로세스 회귀("kriging"), 또는 스플라인 보간과 같은 파라메트릭 접근법들을 포함함으로써 타깃팅 에러의 국부 변동들을 고려할 수 있다.
역 (6)을 수행하는 것은, 예를 들어 폐쇄형 역 이 존재하면 실현가능하지 않을 수 있다. 이러한 경우에, 위의 (2)에서 정의된 바와 같은 실제 이미징된 위치들 를 이용하여 역 모델 를 데이터 쌍들 에 직접 피팅할 수 있다. 이어서, 그에 따라 피팅된 역 모델은 이미징을 위한 교정된 포지션들을 계산하기 위해 에 따라 사용될 수 있다.
대안적으로, 관계 를 사용하고, 교정된 위치들 를 계산하며, 즉 를 역 의 1차 근사로서 사용할 수 있다.
(4)c에서 언급된 이미지 프로세싱 기법들은 특징 인식 및 매칭, 예를 들어 원 검출에 기초할 수 있다. 대안적으로, 이미지 등록, 예를 들어 상호 정보 이미지 등록을 위한 픽셀 기반 방법들이 이미지들 사이의 시프트들을 발견하는 데 사용될 수 있다. 후자의 클래스의 방법들은 그들이 이미지들에 존재할 특정 유형의 특징부를 취하지 않는다는 장점을 가지며, 이는 이들을 특정 이미지 특징부들을 인식하는 것을 목표로 하는 방법들(이전 섹션에서 최신 접근법으로 함정들의 목록에서 항목 (4)로서 언급된 특징 기반 방법들의 단점)보다 더 일반적으로 만든다.
포일 홀 패턴들이 전형적으로 주기적이고, 다른 큰 그리고/또는 높은 콘트라스트 특징부들이 일반적으로 시야에 있지 않기 때문에, 이미지 등록 또는 다른 시프트 측정 기법들은 타깃팅 에러가 너무 크면 실패하기 쉽다. 예를 들어, 타깃팅 에러가 포일 홀들 사이의 거리와 비슷하면, 이미지 등록 또는 특징 매칭 기법들은 전형적으로, 하나의 포일 홀 거리만큼 오프셋된 특징부들을 정렬시킬 것이며, 이는 부정확한 타깃팅 에러 측정을 산출한다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 연속적인 모델 피트들 및 위치 보정들이 나머지 타깃팅 에러를 제한하는 제2 방법("교정 방법 2")이 제안된다:
(1) 저배율로 이미지의 그리드 정사각형 이미지를 획득하는 것;
(2) 그리드 정사각형 이미지에서 데이터 획득을 위해 타깃 위치들의 세트를 식별하는 것;
(3) 이미지 시프트 교정을 위해 타깃 위치들의 세트로부터 타깃 위치들의 서브세트 를 선택하는 것;
(4) 타깃팅 에러가 서브세트의 시작부터 끝까지 성장할 것으로 예상되도록 타깃 위치들의 서브세트를 순서화하는 것;
(5) 교정된 타깃 위치들의 세트 를 초기화하는 것 - 각각의 교정된 타깃 위치의 초기 값은 원래의 타깃 위치와 동일하고, 즉 초기에 모든 포지션들 i에 대해 임 -;
(6) 타깃 위치들의 서브세트 내의 각각의 타깃 위치 에 대해:
a. 이미지 시프트를 사용하여 전자 빔을 보정된 타깃 위치 로 조향하는 것;
b. 중간 배율로 교정 이미지를 획득하는 것;
c. 그리드 정사각형 이미지 내의 타깃 위치와 교정 이미지 내의 실제 이미징된 위치 사이의 시프트 를 발견하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 것;
d. 지금까지 이용가능한 데이터 쌍들 에 비선형 모델을 피팅하는 것;
e. 교정된 타깃 위치들의 세트 를 업데이트하기 위해 타깃 위치들의 서브세트에 d의 모델을 적용하는 것;
(7) 예측된 타깃팅 에러를 고려하는 보정된 타깃 위치들 을 (이전에 설명된 방법들 중 하나를 사용하여) 생성하기 위해 타깃 위치들의 완전한 세트에 모델을 적용하는 것;
(8) 이러한 보정된 타깃 위치들을 사용하여 고배율의 데이터 획득으로 진행하는 것.
(3)에서의 선택은, 포일 홀들(예를 들어, 모든 타깃 위치들의 볼록한 껍질(hull))의 영역이 선택된 포인트들로 커버되어, 작은 모델링 에러(예를 들어, 임의의 포일 홀 위치에서 30 nm 미만)를 갖는 모델이 가능한 가장 적은 선택된 포인트들로 피팅될 수 있도록 행해진다. 전형적으로, 평활화 타깃팅 에러 필드들의 경우, 이는 50 um 측부 길이를 갖는 그리드 정사각형 내의 12개의 위치들을 사용하여 공간적으로 균일한 커버리지에 의해 달성될 수 있다. 타깃팅 에러 가 일반적으로 광학 축으로부터의 거리를 증가시킴에 따라 성장하므로, (4)에서의 순서화를 수행할 하나의 가능성은 광학 축으로부터의 최소 거리로부터 최대 거리까지 순서화된다.
방법들 1 및 2 둘 모두에 대해, 타깃팅의 교정을 위해 선택된 타깃 포지션들의 서브세트는 데이터 획득을 위해 궁극적으로 사용되는 타깃 위치들과 일치할 필요가 없다는 것을 유의해야 한다. 타깃팅 에러 교정을 위해 선택된 타깃 포지션들은 다음과 같기만 한다면, 그리드 정사각형 이미지의 시야 내에 임의적으로 배치될 수 있다:
이러한 타깃 포지션들은 타깃 포지션에서의 시야 내의 이미지 등록에 적합한 특징부들을 포함하고(예를 들어, 타깃 포지션은 전자 빔에 투명하지 않은 구역에 있지 않아야 함),
타깃 포지션들의 이러한 서브세트는 모든 데이터 획득 위치들에 대해 정확할 타깃팅 에러 모델을 피팅하게 허용하고(그러나 데이터 획득을 위해 사용되지 않는 영역들에서 부정확할 수 있음),
이러한 타깃 포지션들은 이미지 시프트에 의해 도달가능하다.
타깃팅 에러 교정을 수행하기 위한 타깃 포지션들의 이러한 세트에 대한 자연적인 선택은 (병리학적 상황들, 예를 들어 모든 위치들이 직선 상에 놓여 있는 것을 제외하고) 데이터 획득을 위한 타깃 위치들의 세트(또는 그의 서브세트)이다. 그러나, 다른 선택들, 예를 들어 이미지 시프트 범위 내에 선택된 카디널리티(cardinality)를 갖는 위치들의 균일하게 이격된 세트가 가능하다. 위치당 전자 선량(dose)을 최소화하여, 따라서 위치당 방사선 손상을 최소화하기 위해, 이들 2개의 세트들 사이의 중첩을 의도적으로 최소화하는 것이 유리할 수 있다는 것을 유의한다. 부가적으로, 2개의 세트들을 독립적으로 선택하는 것은 (이전 섹션에서 현재 최신 방법의 함정들의 리스트 내의 항목 (5)로서 언급된) 이미징을 위한 타깃 위치들의 지향성으로 바이어싱된 세트에 의해 도입될 수 있는 모델 피트의 지향성 바이어스를 피하는 데 도움을 줄 수 있다.
교정 이후의 데이터 획득은 이미지 시프트가 배타적으로 사용되는 때에도 그리드 정사각형당 상당한 양의 시간을 취한다. 이는 샘플 드리프트가 존재하면 교정에 문제가 될 수 있다. 예를 들어, 그리드 정사각형 내의 500개의 포일 홀들 및 포일 홀당 2초의 획득 시간의 경우, 그리드 정사각형에 대한 프로세싱 시간은 약 16분이다. 분당 2 나노미터의 선형 드리프트를 이용하면, 이러한 드리프트는 마지막으로 획득된 포일 홀들에서 30 나노미터 초과의 부가적인 타깃팅 에러를 도입하며, 이는 데이터 획득에 대해 허용가능하지 않을 수 있다. 더욱이, 데이터 획득 동안, 샘플 높이에 관한 더 많은 정보가, 예를 들어 콘트라스트 전달 함수(CTF) 측정을 통해 이용가능하게 되며, 이는 샘플 높이 변동으로 인해 타깃팅 에러 컴포넌트를 명시적으로 모델링하게 허용한다.
따라서, 획득 동안 타깃팅 모델을 업데이트하기 위한 동적 절차("교정 방법 3")가 제안된다:
(1) 타깃팅 모델 Δ를 피팅하고, 보정된 타깃 위치들 의 세트를 생성하기 위해 교정 방법 1 또는 2를 수행하는 것;
(2) 타깃팅 모델이 재교정될 필요가 있는지 여부를 획득 동안 결정하기 위해 재교정 기준을 선택하는 것;
(3) 타깃 위치들의 세트 내의 각각의 타깃 위치에 대해:
a. (2)의 재교정 기준을 사용하여, 타깃팅 모델을 재교정할지 여부를 결정하는 것 - 재교정하지 않는다면, g로 진행함 -;
b. 이미지 시프트를 사용하여 전자 빔을 보정된 타깃 위치들 중 하나 이상으로 조향하는 것;
c. 중간 배율로 교정 이미지를 획득하는 것;
d. 그리드 정사각형 이미지 내의 타깃 위치 와 교정 이미지 내의 실제 이미징된 위치 사이의 겉보기(apparent) 시프트 를 발견하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 것;
e. 지금까지 이용가능한 데이터 쌍들 에 비선형 모델을 피팅하는 것;
f. 교정 모델을 업데이트하고, 예측된 타깃팅 에러를 고려하는 개선된 보정된 타깃 위치들 을 생성하기 위해 타깃 위치들의 서브세트에 e의 모델을 적용하는 것;
g. 개선된 보정된 타깃 위치들을 사용하여 이미지 시프트를 이용하여 고배율로 데이터 획득을 수행하는 것.
재교정을 트리거하는 데 사용되는 (2)에서의 재교정 기준은 다음에 기초할 수 있다:
i. 이전의 교정이 소정의 미리 정의된 수의 획득들을 초과한 이후의 획득들의 수; 또는
ii. 이전의 교정이 소정의 미리 정의된 시간 간격을 초과한 이후 경과된 시간; 또는
iii. 측정된 타깃팅 에러들 가 소정의 미리 정의된 최대 타깃팅 에러 를 초과하는 것;
또는 이들의 조합. 재교정 기준은 부가적으로, 마지막 교정 이후로 광학 설정들이 변경되었는지 여부를 고려할 수 있다.
e의 모델은 방법 1 또는 방법 2에서와 동일한 형태를 사용할 수 있다. 그것은 이상적인 샘플 평면으로부터 타깃팅 에러 기여도까지의 (부호있는) 거리에 관한 명시적 모델을 사용하여 샘플 높이 변동을 부가적으로 고려할 수 있다. 이러한 관계는 아래에서 더 상세히 설명된다.
방법들 1 및 방법 2에서와 같이, (3)의 b 내지 f에서 모델을 교정하는 데 사용되는 타깃 포지션들은 데이터 획득을 위해 의도된 위치들의 세트로부터 취해질 필요가 없다. 예를 들어, 재교정이 단지 드리프트에 대해 보정하도록 의도되면, 동일한 영역이 루프 (3)의 각각의 반복에서 교정을 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, (3)e에서의 모델 피트는 (1)에서 획득된 원래의 모델일 수 있으며, 여기서 모든 파라미터들은 새롭게 획득된 측정에 피팅되는 시프트 파라미터를 제외하고 고정된다.
(3)c에서 중간 배율로 스위칭하는 오버헤드를 피하기 위해, 시프트 측정은 (3)g에서 획득된 고배율 이미지를 사용하여 수행되어, 다음의 절차("교정 방법 4")를 산출할 수 있다:
(1) 타깃팅 모델 Δ를 피팅하고, 보정된 타깃 위치들 의 세트를 생성하기 위해 교정 방법 1 또는 2를 수행하는 것;
(2) 타깃팅 모델이 재교정될 필요가 있는지 여부를 획득 동안 결정하기 위해 재교정 기준을 선택하는 것;
(3) 타깃 위치들의 세트 내의 각각의 타깃 위치에 대해:
a. (2)의 재교정 기준을 사용하여, 타깃팅 모델을 재교정할지 여부를 결정하는 것 - 재교정하지 않는다면, c로 진행함 -;
b. 지금까지 이용가능한 데이터 쌍들 에 비선형 모델을 피팅하는 것;
c. 예측된 타깃팅 에러를 고려하는 보정된 타깃 위치들의 세트 를 업데이트하기 위해 타깃 위치들의 서브세트에 b의 모델을 적용하는 것;
d. 보정된 타깃 위치들을 사용하여 이미지 시프트를 이용하여 고배율로 데이터 획득을 수행하는 것;
e. 그리드 정사각형 이미지 내의 타깃 위치 와 (3)d에서 획득된 이미지 내의 이미징된 위치 사이의 시프트 를 발견하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 것.
일반적으로, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법이 제공된다. 방법은,
제1 배율로 샘플의 기준 이미지를 획득하는 단계;
기준 이미지에서 식별된 제1 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
투과 전자 현미경의 전자 빔을 타깃 위치로 조향하는 단계,
제1 배율보다 큰 제2 배율로 샘플의 교정 이미지를 획득하는 단계, 및
교정 이미지 내의 타깃 위치의 예상된 포지션과 교정 이미지 내의 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 단계,
제1 복수의 타깃 위치들 및 대응하는 겉보기 시프트들을 사용하여 비선형 모델을 훈련시키는 단계;
비선형 모델에 기초하여, 다음 타깃 위치에 대한 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계;
전자 빔을 교정된 타깃 위치로 조향하고, 제1 배율보다 큰 제3 배율로 (샘플의) 이미지를 획득하는 단계를 포함한다.
제안된 방법이 알려진 방법들과 상이한 하나의 방식은 특징부들의 겉보기 시프트들을 고려하기 위해 비선형 모델을 훈련시킴으로써 이루어진다. 본 명세서에서, 용어 "비선형"은 "반드시 선형이 아니라는" 의미로 이해되어야 한다. 다시 말하면, 비선형 모델들은 선형 컴포넌트들 및 비선형 컴포넌트들을 포함한다. 기존의 방법들은 선형 효과들(예를 들어, 렌즈들의 1차 광학 특성들에 의해 야기되는 것들)을 고려할 수 있다. 그러나, 이들은 더 높은 차수의 불일치들을 고려하지 않는다.
다음 타깃 위치에 대한 교정된 타깃 위치를 계산하는 것은 교정된 빔 시프트를 계산하는 것으로 동등하게 생각될 수 있다. 교정된 "타깃 위치"를 계산하는 것은 빔 조향 동안 샘플의 이동을 예상하고 이에 대해 보정하는 것(그러므로, 빔이 상이한 위치로 조향됨)으로 개념적으로 생각될 수 있다. 교정된 "빔 시프트"는, 샘플이 여전히 남아있지만 빔 시프트 동작이 정확하지 않다는 것(그러므로, 빔 조향 동작 자체는 교정을 요구함)으로 개념적으로 생각될 수 있다. 어느 방식으로든, 모델의 구성은 동일하지만, 에러의 부호들은 반전될 것이다. 다시 말하면, 샘플이 시프트 동작 동안 이동하는 것으로 보이면, 샘플을 추적하기 위해 추가적인 빔 시프트가 사용될 수 있다. (부정확한 위치가 이미징되기 때문에) 빔 시프트를 조향하기 위한 타깃팅 모델이 부정확하게 나타나면, 이것은 검출되며, 보정이 "에임 오프(aim off)"에 적용되어, 타깃팅 에러를 수정한다. 이러한 2개의 효과들 및 프로세스들은 역전된 부호들을 갖는다. 그러나, 각각은 수학적으로 유사하다. 따라서, 에러의 실제 소스는 무시될 수 있고, 위에서 설명된 접근법은 둘 모두를 해결하기 위해 이용될 수 있다. 샘플 드리프트는 타깃팅 에러로 잘못 해석될 수 있고, 보정은 드리프트를 추적하는 것과 동일할 것이다.
제1 배율로 샘플의 기준 이미지를 획득하는 것은 더 높은 배율 이미지들의 몽타주(montage)를 획득하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 기준 이미지는 단일의 더 높은 배율의 이미지보다 더 큰 범위 또는 시야(FOV)를 갖는다.
이미지를 획득하는 것은 (예를 들어, 제3 배율로) 하나 이상의 이미지들을 획득하는 것을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 타깃 위치마다 다수의 이미지들이 획득될 수 있다.
일부 종래 기술의 방법들은 물리적 효과들의 미리 설정된 선택으로부터 기인되는 불일치들을 예측하기 위해 타깃팅 모델들을 제약한다. 다시 말하면, 이들은, 불일치들의 일부 물리적 원인들을 고려하고, 이어서 일부 측정들을 취함으로써 모델의 파라미터들을 교정하는 제약된 파라미터화된 모델을 생성한다. 이러한 방법들은 (예를 들어, 일부 더 높은 차수의 광학 왜곡들을 포함하는) 모델을 전개할 때 고려되지 않는 물리적 원인들을 갖는 불일치들을 무시할 수 있다. 그러한 종래 기술의 방법들과 대조적으로, 본 출원에서 제안된 방법의 예들은 이러한 방식으로 모델을 제약하지 않는다. 대신에, 제안된 방법들은, 모델에 구체적으로 추가될 이러한 불연속들의 수학적 컴포넌트들을 요구하지 않으면서 불일치들(예컨대, 불명확한 원인을 갖는 더 높은 차수의 불일치들)을 고려하기 위해 더 많은 자유를 비선형 모델에 제공한다. 이러한 방식으로, 제안된 방법들은, 이미지 프로세싱을 사용하여 캡처되고 분석된 실제 이미지들로부터 획득된 데이터가 모델을 정의하게 허용함으로써 더 신뢰할 수 있는 모델을 제공할 수 있다. 유리하게, 모델은 캡처된 실제 이미지들의 분석으로부터 더 많은 측정들이 획득됨에 따라 계속 개량(refine)될 수 있다.
제2 배율로 교정 이미지를 획득하거나 제3 배율로 이미지를 획득하는 것은 빔이 조향된 직후 이미지를 획득하는 것을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 빔은 타깃 위치로 조향되고, 이어서 이미지가 타깃 위치에서 캡처된다.
교정 이미지 내의 타깃 위치의 예상된 포지션과 교정 이미지 내의 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하는 것은 기준 이미지 내의 타깃 위치에서 또는 그 주위에서 샘플의 하나 이상의 특징부들을 식별하는 것 및 교정 이미지 내의 위치들에서 이러한 동일한 특징부들을 식별하는 것을 포함할 수 있다. "예상된" 포지션을 지칭할 때, 이는 빔 조향 프로세스가 완벽하게 작동되면 초래될 교정 이미지 내의 타깃 위치의 포지션일 수 있다. 따라서, 빔을 타깃 위치로 조향한 이후, 교정 이미지 내의 타깃 위치의 예상 포지션은 교정 이미지의 중심에 있을 수 있다. 타깃 위치와 상이한 교정된 타깃 위치로 조향될 때, 예상된 포지션은 예측된 겉보기 시프트에 의해 교정 이미지의 중심으로부터 오프셋될 수 있다.
타깃 위치에 대한 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계는 타깃 위치에서의 예측된 겉보기 시프트를 타깃 위치에 추가하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 예측된 타깃팅 에러를 예측하고 보상할 수 있다.
도 2a 내지 도 2d에 예시된 바와 같이, 오프셋 d를 타깃 위치에 추가하는 것은 특징부로 하여금 교정 이미지에서 만큼 이동되게 해야 한다. 이미지 2B는 교정 없이 타깃 위치에서 획득되고, 그의 예상된 위치로부터의 특징부의 오프셋 d는 교정 이미지에서 관찰된다(도 2b에서 화살표에 의해 예시됨). 타깃팅 에러는 인 반면, 겉보기 시프트는 이다. 이러한 에러를 (대략적으로) 보상하기 위해, (도 2c에서 화살표에 의해 예시된) 교정된 타깃 위치는 타깃 위치로부터 Δ를 감산함으로써(또는 예측된 겉보기 시프트를 타깃 위치에 추가함으로써) 획득된다. 예측된 타깃팅 에러 및 측정된 타깃팅 에러는 동일한 부호 관례를 따른다.
대안적으로, 주어진 타깃 위치에 대한 교정된 타깃 위치를 계산하는 것은, 타깃 위치가 교정된 타깃 위치에서 캡처된 이미지의 중심에 있는 것을 예측된 겉보기 시프트가 초래할 교정된 타깃 위치를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 교정된 타깃 위치에서의 예측된 겉보기 시프트를 타깃 위치에 추가한다. 이는 이미지의 중심에 타깃 위치를 더 정확하게 배치하는 교정된 타깃 위치를 제공할 수 있다.
따라서, 이러한 방법에 따라 교정된 타깃 위치를 컴퓨팅하는 것은 타깃팅 에러를 예측하는 모델을 반전시키는 것, 즉, 예측된 타깃팅 에러를 고려하여, 원하는 타깃 위치가 그에 따라 획득된 이미지의 중심에 배치되도록 빔을 조향할("에이밍 오프(aiming off)") 곳을 예측하는 모델을 생성하는 것과 마찬가지이다.
위치들 및 시프트들은 기준 이미지에 의해 정의된 좌표계의 관점들에서 표현될 수 있거나, 또는 다른 좌표계에서 결정될 수 있다. 추가 및 감산할 때, 위치들 및 시프트들은 동일한 좌표계에 있어야 한다.
특히, 타깃 위치들은 저배율(LM) 이미지 내의 중심 포지션으로부터의 변위로서 LM 이미지의 좌표계에서 표현될 수 있다. 그에 따라 선택된 좌표계의 원점이 전형적으로, 어떠한 추가적인 이미지 시프트도 (LM 이미지를 획득할 때 적용되었던 것을 넘어) 적용되지 않으면 이미징된 포지션과 일치하므로, 이러한 표현은 수학적으로 편리하다.
제3 배율은 얼음에 매립된 생체분자들의 이미지들을 획득하는 데 유용한 레벨일 수 있다. 샘플 분석의 목적을 위해 제3 배율로 획득된 이미지들은 "데이터 획득" 이미지들로 지칭될 수 있다.
제3 배율은 제2 배율보다 클 수 있다. 따라서, ("고배율(HM)"로 또한 불릴 수 있는) 제3 배율로의 데이터 획득 이미지들은 ("중간 배율(MM)"로 또한 불릴 수 있는) 제2 배율의 교정 이미지들보다 더 상세히 보여질 수 있다. 이는 데이터 획득 이미지들에 대해, 샘플을 더 상세히 이미징하기 위해 고배율 설정들이 요구될 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 교정을 위해, 시야(FOV)가 더 크도록 더 낮은 배율을 갖는 것이 유리할 수 있다. 이는 이미지에서 가시적인 특징부들의 수를 증가시키고, 따라서 이미지 시프트는 더 정확하게 또는 더 명확하게 결정될 수 있다. 게다가, (예를 들어, 이미지의 겉보기 시프트가 이미지 FOV보다 크기 때문에) 포일 홀 에지들과 같은 소정의 특징부들이 교정 이미지에서 가시적이지 않으면, 이미지는 교정에 유용하지 않을 수 있다. 이는, (FOV가 더 크지만, 타깃팅 에러가 변경되지 않은 상태로 유지되기 때문에) 교정 이미지가 더 낮은 배율로 캡처되면 발생할 가능성이 더 적다.
일부 예들에서, 제3 배율 및 제2 배율은 동일할 수 있다. 교정 이미지들은 데이터 획득 이미지들로서 사용될 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다.
샘플은 복수의 홀들을 포함하는 천공된 포일을 포함할 수 있으며, 여기서 타깃 위치는 복수의 홀들 중 제1 홀 내의 위치이고, 다음 타깃 위치는 복수의 홀들 중 제2 홀에 위치된다. 선택적으로, 제2 홀은 제1 홀에 바로 인접할 수 있다. 다시 말하면, 교정은 다음 타깃 위치에 인접한 홀을 사용하여 수행될 수 있다. 타깃팅 에러들은 교정 데이터가 다음 타깃 위치 부근의 홀들에 대해 획득되면 더 정확하게 예측될 수 있다.
제1 예에서, 모든 홀에 대해 재교정이 수행될 수 있다. 따라서, 모델 정확도는 높게 유지될 수 있다. 다른 예에서, 재교정은 단지 N개의 홀들마다(예를 들어, 10개의 홀들마다) 수행할 수 있다. 이는 효율을 개선시키면서 모델 정확도를 보존할 수 있다. 다른 예에서, 교정은 데이터 획득 동안 캡처된 이미지들을 사용하여 배경에서 비동기식으로 수행될 수 있다. 다른 예에서, 모델 예측 에러가 임계 레벨을 초과할 때 재교정이 트리거될 수 있다. 이는, 프로세싱 효율을 추가로 개선시키면서, 요구되는 레벨로 모델 정확도를 보존할 수 있다. 다른 예에서, 방법은 모델이 유효한 위치들의 맵을 유지할 수 있다. 재교정은 획득 순서에서 다음 타깃 위치(또는 나중의 타깃 위치)가 유효 위치들의 맵 외부에 있다는 결정에 기초하여 수행될 수 있다.
포일 홀당 다수의 타깃 위치들이 존재할 수 있다. 타깃 위치들은, 얼음 내에 현탁(suspend)된 생체분자들을 이미징하고, 포일 홀 외부에 있는 FOV의 비율을 감소시키기 위해 포일 홀의 중심에서 선택될 수 있다.
일부 경우들에서, 샘플은 사실상 주기적일 수 있다(예를 들어, 여기서 샘플은 홀들의 그리드를 포함한다). 그러한 경우들에서, 포일 홀들 사이의 거리의 절반보다 큰 겉보기 시프트들을 보정하는 것이 가능하지 않을 수 있다. 이는 이미지 프로세싱 기법들이 이미징되도록 의도된 홀에 대한 이웃 홀의 특징부들을 오인(mistake)할 수 있기 때문이다. 타깃팅 에러들은 빔이 조향되는 광학 축으로부터의 거리가 증가함에 따라 증가하는 경향이 있다. 따라서, 모델이 이미지 시프트의 더 큰 값들에서 작동하는 것을 보장하기 위해, 광학 축에 가까운 홀들을 사용하여 모델을 교정하고, 이어서 더 멀리 있는 홀들을 이미징하고, 이러한 홀들을 사용하여 모델을 재교정하는 것이 유리하다. 이어서, 훨씬 더 멀리 있는 이미지 홀들에 대해 이루어지는 등이다. 이러한 방식으로, 모델은 빔 이미지 시프트의 큰 값들을 갖는 영역들을 정확하게 타깃팅하기 위해 반복적으로 개량될 수 있다.
전자 빔을 타깃 위치로 조향하는 단계는 타깃 위치를 빔 조향 프로세스(이는 선형 빔 조향 모델에 의해 결정된 양들만큼 전자 빔을 조정하도록 구성됨)에 입력하는 단계를 포함할 수 있다.
비선형 모델은 주어진 타깃 위치가 빔 조향 프로세스에 입력될 때 겉보기 시프트를 예측하도록 구성될 수 있다.
비선형 모델은 타깃 위치에 기초하여 겉보기 시프트(다시 말하면, 선형 조향 모델을 사용하여 전자 빔을 타깃 위치로 조향할 때 캡처된 이미지의 겉보기 시프트)를 추정하도록 구성될 수 있다. 비선형 모델은 추정된 겉보기 시프트("예측된 타깃팅 에러"의 음수임)를 고려하기 위해 타깃 위치에 기초하여, 교정된 타깃 위치를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 전자 빔은 타깃 위치보다는 (선형 조향 모델을 사용하여) 교정된 타깃 위치로 조향될 수 있다. 이러한 방식으로, 겉보기 시프트가 고려되며, 타깃 위치는 그것이 빔을 타깃 위치로 조향한 이후 캡처된 이미지에 있을 것보다 빔을 교정된 타깃 위치로 조향한 이후 캡처된 이미지의 중심에 더 가깝게 보인다.
방법은, (예를 들어, 광학 축으로부터 거리가 증가하는 순서로 또는 광학 축으로부터 바깥쪽으로 나선형으로 움직이는 나선형 형상으로 타깃 위치들을 순서화함으로써) 각각의 타깃 위치에 대한 대응하는 겉보기 시프트의 크기가 시작으로부터 끝까지 증가할 것으로 예상되도록 제1 복수의 타깃 위치들을 순서화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법은,
(예를 들어, 광학 축으로부터 거리가 증가하는 순서로 타깃 위치들을 순서화함으로써) 각각의 타깃 위치의 크기가 (바람직하게는, 기준 이미지 중심으로부터의 벡터로서) 시작으로부터 끝까지 증가하도록 제1 복수의 타깃 위치들을 순서화하는 단계; 및/또는
(예를 들어, 타깃 위치들이 광학 축으로부터 바깥쪽으로 나선형으로 움직이는 나선형 형상을 형성하도록 타깃 위치들을 순서화함으로써) 타깃 위치의 각도가 시작으로부터 끝까지 평활하게 변경되도록 제1 복수의 타깃 위치들을 순서화하는 단계를 더 포함할 수 있으며,
기준 이미지에서 식별된 제1 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해, 방법은 (이전 교정 이미지를 프로세싱한 이후 업데이트된) 비선형 모델에 기초하여 (다음 타깃 위치에 대한) 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계를 더 포함하고,
전자 빔을 타깃 위치로 조향하는 단계는 교정된 타깃 위치를 빔 조향 프로세스에 입력하는 단계를 포함하고,
방법은 교정된 타깃 위치 및 대응하는 겉보기 시프트에 기초하여, 각각의 겉보기 시프트를 식별한 이후 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함한다.
2π 라디안의 각도가 0 라디안의 각도와 동등하므로, 당업자는 (기준 이미지의 중심에 대한 벡터들로서 표현되는) 타깃 위치들의 각도들이 전체 원(full circle) 주위로 루프될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 각도의 절대값은, 순서화된 목록을 통해 이동될 때, 각도들이 측정되는 축을 통과할 때 점프하는 것으로 보일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 각도들은, 타깃 위치들의 순서화된 목록 내의 인접한 위치들 사이에 비교적 작은 각도를 갖는 관점들에서, 순서화된 목록을 통해 이동될 때 평활하게 변경될 수 있다.
위의 예시적인 방법들 중 일부에서, 교정 이미지는 타깃 위치보다는 전자 빔을 교정된 타깃 위치로 조향한 이후 획득된다. 이러한 경우, 타깃 위치의 예상된 포지션은 (예측된 겉보기 시프트가 교정된 타깃 위치를 사용함으로써 고려되었기 때문에) 교정된 타깃 위치에서 획득된 교정 이미지의 중심에 있을 수 있다. 따라서, 원래의 타깃 위치의 특징부는 이미지 중심에 있는 것으로 예상된다. 특징부가 이미지의 중심에 있지 않으면, 잔차 에러(residual error)를 획득하기 위해, 관찰된 특징부들 사이의 시프트 측정이 수행될 수 있다. 잔차 에러는 총 타깃팅 에러를 획득하기 위해 타깃 위치에 대한 예측된 에러에 추가될 수 있다. 유리하게, 이미징을 위해 교정된 타깃팅 위치를 사용하는 것은, 이미지 시프트들이 더 작을 것으로 예상되기 때문에 측정 프로세스를 더 용이하게 만든다.
다른 예에서, 겉보기 시프트는 (원래의 타깃 위치보다는) 교정된 타깃 위치의 예상된 포지션과 교정 이미지 내의 교정된 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트로서 계산될 수 있다. 이러한 경우, ("예상된" 포지션이 조향 모델에 기초하고, 예측된 겉보기 시프트를 고려하지 않기 때문에) 교정된 타깃 위치는 교정 이미지의 중심에서 예상될 수 있다.
방법은 원래의 타깃 위치들을 사용하여, 교정된 타깃 위치들의 세트를 초기화하는 단계, 및 비선형 모델에 기초하여 다음 타깃 위치에 대해 계산되는, 교정된 타깃 위치로 개개의 타깃 위치를 대체함으로써, 교정된 타깃 위치들의 세트를 업데이트하는 단계를 더 포함할 수 있다.
비선형 모델을 훈련시키는 단계는 비선형 모델을 데이터 쌍들 에 피팅하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 복수의 타깃 위치들 내의 i번째 타깃 위치에 대해, 는 기준 이미지에서 식별된 바와 같은 타깃 위치이고, 는 이미지 프로세싱 기법들을 사용하여 식별된 바와 같은 시료 상의 실제 포지션이고, 는 이미지 프로세싱 기법들을 사용하여 식별된 바와 같은 대응하는 겉보기 시프트(또는 "타깃팅 에러")이다.
다음 타깃 위치는 제2 복수의 타깃 위치들 중 하나의 타깃 위치일 수 있고, 방법은 제2 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
비선형 모델에 기초하여, 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계,
전자 빔을 교정된 타깃 위치로 조향하는 단계, 및
제3 배율로 샘플의 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
제2 복수의 타깃 위치들은 기준 이미지에서 또는 제2 기준 이미지에서 식별될 수 있다. 제2 기준 이미지는 샘플 또는 제2 샘플의 이미지일 수 있다.
방법은,
제2 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
하나 이상의 미리 결정된 기준들에 기초하여, 비선형 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정하는 단계(모델이 유효한지 여부의 결정은 교정된 타깃 위치를 계산하기 위해 비선형 모델을 사용하기 전에 수행됨);
재교정이 요구되면, (제2 복수의 타깃 위치들 중 현재의 타깃 위치에서) 제2 배율로 샘플의 이미지를 획득하고, 이미지 내의 타깃 위치의 예상된 포지션과 이미지 내의 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하고, 겉보기 시프트에 기초하여 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함할 수 있다.
재교정이 요구되면, 방법은,
비선형 모델(재교정을 요구하는 오래된 비선형 모델)에 기초하여, 예비로 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계, 및
전자 빔을 예비로 교정된 타깃 위치로 조향하는 단계를 더 포함할 수 있다.
겉보기 시프트에 기초하여 비선형 모델을 업데이트하는 단계는 예비로 교정된 타깃 위치 및 대응하는 겉보기 시프트를 사용하여 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 포함할 수 있다.
제3 배율로 샘플의 이미지를 획득하는 단계는 교정된 타깃 위치를 사용하여 이미지 시프트를 이용하여 고배율로 데이터 획득을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은,
제2 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
(비선형 모델에 기초하여, 교정된 타깃 위치를 계산하기 전에) 하나 이상의 미리 결정된 기준들에 기초하여 비선형 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정하는 단계;
재교정이 요구되면, 제3 배율로 획득된(이전 사이클 동안 획득된) 대응하는 이미지 내의 제2 복수의 타깃 위치들로부터의 바로 선행하는 타깃 위치의 예상된 포지션과 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하고, 교정된 타깃 위치 및 대응하는 겉보기 시프트에 기초하여 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다시 말하면, 재교정이 요구되면, 방법은,
제3 배율로 획득된 제2 복수의 타깃 위치들로부터의 바로 선행하는 타깃 위치의 이미지에서, 바로 선행하는 타깃 위치의 예상된 포지션과 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 단계, 및
바로 선행하는 타깃 위치에 대한 교정된 타깃 위치 및 대응하는 겉보기 시프트에 기초하여 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바로 선행하는 타깃 위치에서 획득된 이전 이미지는 제3 배율로 획득된 샘플의 이미지일 수 있다. 유리하게, 중간 배율의 별개의 교정 이미지가 요구되지 않을 수 있다.
제2 복수의 타깃 위치들 중 제1 타깃 위치에 대해, 바로 선행하는 타깃 위치가 존재하지 않는다. 그러나, 모델은 단지 방금 훈련되었고, 따라서 유효한 것으로 가정될 수 있다.
업데이트된 모델은 모델 품질 체크들을 겪을 수 있다. 예를 들어, 파라미터들이 유효 파라미터들의 선택된 범위 밖에 있으면, 새로운 모델이 거부될 수 있다. 새로운 모델은 또한, 품질 메트릭들(예컨대, 선택된 에러 메트릭에 대한 측정된 타깃팅 에러들에 관한 피트의 품질)에 기초하여 거부될 수 있다.
업데이트된 모델은 또한, 지금까지 수집된 모든 이전 데이터 쌍들을 고려할 수 있다.
비선형 모델을 업데이트하는 단계는 비선형 모델을 데이터 쌍들 에 피팅하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제2 복수의 타깃 위치들 내의 j번째 타깃 위치에 대해, 는 교정된 타깃 위치이고, 는 이미지 프로세싱 기법들을 사용하여 식별된 바와 같은 시료 상의 실제 포지션이고, 는 겉보기 타깃팅 에러이다.
비선형 모델에 기초하여, 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계는 교정된 타깃 위치들을 제공하기 위해, (타깃팅 에러들을 더 정확하게 예측하는) 업데이트된 모델을 타깃 위치들에 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 타깃팅 모델이 재교정될 필요가 있는지 여부를 데이터 획득 동안 결정하기 위해 재교정 기준을 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 재교정 기준은 비선형 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정할 때 사용될 수 있다.
비선형 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정하는 것은, 재교정 기준을 사용하여, 타깃팅 모델을 재교정할지 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
방법은, 제2 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해, 제3 배율로 획득된 샘플의 이미지 내의 예상된 포지션과 이미징된 위치 사이의 타깃 위치의 겉보기 시프트를 (그리드 정사각형 이미지로부터) 발견하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
비선형 모델은 복수의 모델 컴포넌트들을 포함할 수 있고, 각각의 컴포넌트는 하나 이상의 별개의 유효성 기준들을 가질 수 있다. 예를 들어, 스테이지를 새로운 그리드 정사각형으로 이동시키는 것은 모델의 소정의 컴포넌트들을 무효화할 수 있지만, 다른 컴포넌트들은 무효화되지 않을 수 있다. 새로운 기준 이미지를 취하는 것은 모델의 소정의 컴포넌트들을 무효화할 수 있지만, 다른 컴포넌트들은 무효화되지 않을 수 있다. 이전보다 더 멀리 빔을 시프트시키는 것은 모델의 소정의 부분들을 무효화할 수 있지만, 다른 부분들은 무효화되지 않을 수 있다. 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정하는 것은 각각의 모델 컴포넌트가 여전히 유효한지 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 비선형 모델을 업데이트하는 단계는 여전히 유효하지 않은 것으로 결정되는 모델 컴포넌트들을 업데이트하고, 임의의 업데이트 없이, 여전히 유효한 것으로 결정되는 모델 컴포넌트들을 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 유리하게, 이러한 방식으로 선택적으로 모델을 업데이트하는 것은 더 효율적일 수 있고, 더 신뢰할 수 있는 모델을 초래할 수 있다.
하나 이상의 미리 결정된 기준들에 기초하여 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정하는 것은, 현재 모델을 피팅하는 데 사용되는 이미지들의 획득 동안 광학 설정들과 비교하여 광학 설정들이 변경되었는지 여부를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 평가는 현재 모델이 피팅되었던 그리드 정사각형과 비교하여 현재 그리드 정사각형에 대한 이전 지식에 추가로 기초할 수 있다. 예를 들어, 이러한 이전 지식은 높이 편차, 오염 레벨, 균열들 등의 추정을 포함할 수 있다. 평가는 마지막 교정 이후의 시간, 총 드리프트 추정, 또는 이들의 조합에 추가로 기초할 수 있다.
일반적으로, 모델(제1 복수의 타깃 위치들)을 교정하는 데 사용되는 위치들은 데이터 획득을 위해 의도된 위치들의 세트(타깃 위치들의 제2 세트)와 중첩될 필요가 없다. 그러나, 일부 상황에서, 이들은 아래에서 설명되는 바와 같을 수 있다.
제1 복수의 타깃 위치들은 타깃 위치들 및 식별된 겉보기 시프트들이 비선형 모델을 훈련시키기에 충분하도록 선택될 수 있어서, 비선형 모델이 제2 복수의 타깃 위치들에서 정확하다.
방법은,
기준 이미지에서 관심있는 제3 복수의 위치들을 식별(수신/결정)하는 단계;
제3 복수의 타깃 위치들의 서브세트로서 제1 복수의 타깃 위치들을 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다시 말하면, 타깃 위치들의 선택은 모델을 교정하는 데 사용될 수 있다.
제2 복수의 타깃 위치들은 제3 복수의 타깃 위치들과 동일할 수 있다. 다시 말하면, 제3 배율의 "데이터 획득" 이미지는 관심있는 각각의 타깃 위치에 대해 캡처될 수 있다. 대안적으로, 제2 배율의 교정 이미지들이 허용가능하면, 제3 배율의 데이터 획득 이미지들은 교정 이미지가 획득되었던 타깃 위치들에 대해 필요하지 않을 수 있다. 따라서, 제2 복수의 타깃 위치들은 제3 복수의 타깃 위치들의 서브세트일 수 있다.
제1 복수의 타깃 위치들, 다음 타깃 위치, 제2 복수의 타깃 위치들 및/또는 제3 복수의 타깃 위치들 각각은,
샘플이 각각의 타깃 위치에 근접한 이미지 등록에 적합한 하나 이상의 특징부들을 포함하여, 특징부들 중 하나 이상이 타깃 위치에서 획득된 이미지에서 보이게 하고, 그리고/또는
각각의 타깃 위치가 현미경의 광학 축으로부터 임계 거리 내에 위치되어, 타깃 위치가 이미지 시프트에 의해 도달가능하도록 선택될 수 있다.
방법은 (예를 들어, 임의의 위치에서 겉보기 시프트를 예측하지 않는 "항등" 모델로) 모델을 초기화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 모델을 훈련시키는 단계는 데이터 쌍들을 사용하여 모델을 업데이트하는 단계를 포함할 수 있다.
투과 전자 현미경의 전자 빔을 타깃 위치로 조향하는 단계는 기준 이미지 내의 타깃 위치의 포지션에 기초하여, 전자 빔을 이동시키기 위해 선형 조향 모델을 사용하는 단계를 포함할 수 있다.
"타깃 위치"는 샘플(관심있는 특징부) 상의 위치이고, 또한 기준 이미지 내의 포인트이다(여기서, 관심있는 특징부가 기준 이미지에서 나타남). 기준 이미지에서 식별된 타깃 위치로 빔을 조향하는 것은,
기준 이미지 내의 타깃 위치의 포지션에 기초하여 현미경에서 샘플의 타깃 위치의 물리적 포지션을 추정하는 단계, 및
선형 조향 모델을 사용하여 전자 빔을 물리적 포지션으로 조향하는 단계를 포함할 수 있다.
교정된 타깃 위치를 계산하는 단계는, 타깃팅 에러가 교정된 타깃 위치에 추가될 때, 원하는 타깃 위치가 이미지의 중심에 가깝게 나타나도록, 선형 조향 모델을 사용하여 빔이 조향되어야 하는 위치를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
제3 배율은 제2 배율과 동일할 수 있거나, 또는 제2 배율보다 클 수 있다.
동일한 선형 조향 모델(우리는 타깃팅 에러들이 초래되는 것으로 알고 있음)을 사용하고, 예상되는 에러를 설명하기 위해 이미지를 보정된 위치로 조정하기보다는, 조향 모델은 비선형 거동을 고려하도록 업데이트될 수 있고, 빔은 보정된 모델을 사용하여 타깃 위치들로 조정될 수 있다. 다시 말하면, 비선형 타깃팅 모델은 조향 모델로 통합될 수 있다. 비선형 모델이 위에서 설명된 바와 같이 재교정되지만, 선형 조향 모델은 동일하게 유지될 수 있다. 이는 선형 조향 모델이 변경되지 않는 현미경의 물리적 속성들에 기초하기 때문일 수 있다.
방법은 제1 배율로 샘플(또는 상이한 샘플)의 제2 기준 이미지를 획득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 기준 이미지는 상이한 그리드 정사각형과 같은 동일한 샘플의 상이한 위치를 보여줄 수 있다. 대안적으로, 제2 기준 이미지는 상이한 샘플을 완전히 보여줄 수 있다.
방법은 제2 기준 이미지 내의 제2 복수의 타깃 위치들을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
비선형 모델은, (선형 조향 모델을 사용하여) 전자 빔을 타깃 위치로 조향함으로써 획득된 이미지에서 샘플의 특징부(기준 이미지에서 식별된 타깃 위치에 위치된 특징부)의 겉보기 시프트를 추정하도록 구성될 수 있다. 다시 말하면, 비선형 모델은 주어진 타깃 위치에 대한 겉보기 시프트를 예측하도록 구성되고, 겉보기 시프트는 선형 조향 모델이 완벽했다면 예상될 포지션 - 이미지의 중심 - 과 조향 모델이 불완전하다면, 우리가 실제로 특징부를 관찰할 것으로 예상한 이미지 내의 포지션 사이의 차이이다.
비선형 모델은 이상적인 평탄한 샘플 평면으로부터의 실제 샘플의 편차들을 고려할 수 있다. 일부 예들에서, 비선형 모델은 실제 샘플이 평활하다고 가정한다.
비선형 모델을 사용하여 겉보기 시프트를 추정하는 것은 특징부의 물리적 위치와 현미경의 이미징 평면 상으로의 특징부의 투영 사이의 차이를 추정하는 것을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 모델은 타깃 위치에서의 샘플의 z-오프셋을 고려할 수 있다. 타깃 위치에서의 z-오프셋은 샘플이 평활하다고 가정하여(샘플 높이가 샘플의 특징부들 사이에서 평활하게 변한다고 가정하여), (다른 근처의 위치들에서의) 샘플의 다른 특징부들에 대한 하나 이상의 추정되거나 결정된 z-오프셋들에 기초하여 추정될 수 있다. z-축의 원점은 ("이미지 평면"으로 종종 지칭되는 간결함을 위해) 현미경이 이미지 검출기 상에 이미징하는 (샘플에서의 또는 그 부근의) 광학 평면과 일치할 수 있고, z-축의 방향은 빔 전파의 주요 방향("광학 축")과 일치할 수 있다.
z-오프셋을 추정할 때, 스테이지 높이 및 틸트가 고려될 수 있다. 따라서, z-오프셋은 다음의 2개의 컴포넌트들로 분할될 수 있다:
샘플의 틸트에 의해 그리고 선택적으로는, 이미지 평면 위의 스테이지의 높이의 시프트에 대해 야기될 수 있는 바와 같은 이상화된 평탄한 샘플 평면과 이미지 평면 사이의 차이; 및
이상화된 평탄한 샘플 평면으로부터 샘플의 특징부의 오프셋.
그러한 z-오프셋은 다수의 방식들로 추정될 수 있다. z-오프셋이 측정될 수 있는 하나의 방식은 이미징된 데이터 획득 위치에서 디포커스(defocus)를 결정하는 것에 기초한다. 이러한 측정은 전형적으로, 획득된 이미지의 전력 스펙트럼을 분석하고 이미징 시스템의 콘트라스트 전달 함수(CTF)의 모델을 피팅함으로써 수행되며, 여기서 디포커스는 핵심 파라미터이다. 디포커스가 이미징된 평면으로부터의 이미징된 위치의 z-오프셋에 정비례하므로, 측정된 디포커스는 이러한 z-오프셋을 결정하는 데 사용될 수 있다.
z-오프셋이 추정될 수 있는 하나의 다른 방식은, 임의의 잔차 차이가 특징부의 포지션과 이상적인 평탄한 샘플 평면 사이의 높이 불일치들로 인한 것이라고 가정하고, 잔류 겉보기 시프트를 사용하여 z-오프셋을 추정하여, 이미 취해진 측정들 및 광학 수차들 및/또는 스테이지 틸트를 고려하는 모델을 사용하여 특징부의 예상된 포지션을 결정함으로써 이루어진다.
전자 빔을 조향하는 단계는 전자 빔의 틸트 및/또는 시프트를 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 전자 빔의 틸트 및/또는 시프트를 조정하는 단계는,
입사 전자 빔을 조정하는 단계(조명 빔을 이동시키는 단계), 및/또는
투과된 전자 빔을 조정하는 단계(카메라 FOV를 이동시키는 단계)를 포함할 수 있다.
방법은, 기준 이미지에서 식별된 하나 이상의 특징부들의 위치(및/또는 배향)를 교정 이미지 내의 대응하는 위치(및/또는 배향)에 맵핑하기 위해 변환 동작을 사용하는 단계를 더 포함할 수 있다. 변환 동작은 하나 이상의 회전, 병진이동 및/또는 스케일링 동작들을 포함할 수 있다.
변환 동작은 추정된 z-오프셋을 고려할 수 있다.
교정 이미지 내의 타깃 위치의 예상된 포지션과 교정 이미지 내의 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 단계는,
(선형) 조향 모델을 사용하여 교정 이미지 내의 특징부의 예상된 포지션을 결정하는 단계;
(예를 들어, 특징 검출 및 특징 매칭 프로세스들을 사용하여) 관찰된 포지션에서 교정 이미지 내의 특징부를 식별하는 단계;
예상된 포지션과 관찰된 포지션 사이의 차이로서 겉보기 시프트를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
샘플이 복수의 홀들을 포함하는 천공된 포일을 포함하는 경우, 타깃 위치는 홀들 중 하나의 홀 내의 위치일 수 있다. 제1 이미지 내의 특징부/타깃 위치를 식별하는 단계는 제1 이미지 내의 홀의 에지를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 교정 이미지 내의 특징부를 식별하는 단계는 교정 이미지 내의 동일한 홀의 에지를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은,
하나 이상의 교정 이미지들에 대한 디포커스 측정을 획득하는 단계;
디포커스 측정에 기초하여 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법은,
특징부의 z-오프셋(특징부의 물리적 위치와 현미경의 이미징 평면 상으로의 특징부의 투영 사이의 차이)을 추론하기 위해 디포커스 측정을 사용하는 단계를 더 포함할 수 있다.
비선형 모델을 훈련/업데이트하는 단계는 타깃 위치들, 대응하는 겉보기 시프트들, 및 대응하는 디포커스 측정들을 사용하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 제2 배율로 이미지들을 반복적으로 획득하는 단계 및 하나 이상의 사이클들을 수행함으로써 비선형 모델을 개량하는 단계를 포함할 수 있다. 각각의 사이클은,
기준 이미지 내의 타깃 위치를 식별하는 단계;
전자 빔을 타깃 위치로 조향하는 단계;
타깃 위치에서 제2 배율로 교정 이미지를 획득하는 단계; 및
교정 이미지 내의 관찰된 포지션에서 기준 특징부를 식별하고, 관찰된 포지션과 (선형 조향 모델을 사용하여 획득된) 예상된 포지션 사이의 차이로서 겉보기 시프트를 결정하고, 겉보기 시프트에 기초하여 비선형 모델을 업데이트하는 단계; 및/또는
교정 이미지에 대한 디포커스 측정을 획득하고, 특징부에 대한 z-오프셋을 추론하기 위해 디포커스 측정을 사용하고, z-오프셋에 기반하여 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 포함할 수 있다.
모델을 업데이트하기 위한 반복 사이클들은, 잔차 타깃팅 에러가 타깃팅 모델을 업데이트하는 데 사용되는 이미지들의 제1 수가 제1 임계치에 도달하고 그리고/또는 디포커스 측정이 타깃팅 모델을 업데이트하는 데 사용되는 이미지들의 제2 수가 제2 임계치에 도달할 때까지 반복될 수 있다.
다른 예에서, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법이 제공되며, 그 방법은,
제1 배율로 샘플의 기준 이미지를 획득하는 단계;
기준 이미지에서 식별된 제1 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
(바람직하게는, 타깃 위치를 현미경의 광학 축과 정렬시키기 위해) 투과 전자 현미경의 스테이지를 타깃 위치로 시프트시키는 단계;
제1 배율보다 큰 제2 배율로 샘플의 교정 이미지를 획득하는 단계, 및
교정 이미지 내의 타깃 위치의 예상된 포지션과 교정 이미지 내의 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 단계,
제1 복수의 타깃 위치들 및 대응하는 겉보기 시프트들을 사용하여 비선형 모델을 훈련시키는 단계;
비선형 모델에 기초하여, 다음 타깃 위치에 대한 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계;
스테이지를 교정된 타깃 위치로 시프트시키고, 제1 배율보다 큰 제3 배율로 이미지를 획득하는 단계를 포함한다.
이러한 방식으로, 제안된 방법들은 또한, 스테이지 시프트 프로세스에서 타깃팅 에러들을 교정 및 보정하는 데 사용될 수 있다. 위에서 언급된 선택적인 특징들은 이러한 방법에 동일하게 적용될 수 있다.
위에서 설명된 방법들 중 하나 이상을 수행하도록 구성된 투과 전자 현미경 장치가 또한 제공된다. 장치는 투과 전자 현미경, 명령어들을 실행하기 위한 프로세서, 및 명령어들을 저장하기 위한 메모리를 포함할 수 있다.
컴퓨터의 프로세서 상에서 실행될 때, 컴퓨터로 하여금 위에서 설명된 방법들 중 하나 이상을 수행하게 하는 명령어들을 포함하는 컴퓨터 소프트웨어가 또한 제공된다. 소프트웨어는 전자 현미경에 통신가능하게 커플링된 일반적인 컴퓨터 시스템 상에서 실행될 수 있다. 대안적으로, 소프트웨어는 현미경에 커플링된 전용 하드웨어 상에서 실행될 수 있다.
본 발명의 특정 비제한적 예들은 이제 다수의 비제한적 예들을 참조하여 설명될 것이다.
도 1a는 하전 입자 현미경의 개략도를 예시한다.
도 1b는 타깃팅 부정확성을 겪는 실제 SPA 이미지들을 예시한다.
도 2a 내지 도 2d는 하나의 일반적인 예시적인 구현예 동안 획득된 개략적인 이미지들을 예시한다. 도 2a는 기준 이미지 내의 타깃 위치를 보여주는 기준 이미지를 예시한다. 도 2b는 전자 빔을 타깃 위치로 조향함으로써 획득된 교정 이미지 및 타깃팅 에러들에 의해 야기되는 타깃 위치의 겉보기 시프트를 예시한다. 도 2c는 기준 이미지 내의 교정된 타깃 위치를 예시한다. 도 2d는 전자 빔을 교정된 타깃 위치로 조향함으로써 획득된 교정 이미지를 예시한다.
도 3a는 교정 방법들 1 및 2를 예시한다.
도 3b는 교정 방법 3을 예시한다.
도 3c는 교정 방법 4를 예시한다.
도 4는 샘플 높이 변화에 의해 도입된 타깃팅 부정확성들의 기하학적 계산을 예시한다.
도 5는 제안된 방법의 특정 예시적 구현예에 대한 흐름도를 예시한다.
도 6은 생명 과학 샘플에 대한 타깃팅 에러들을 예시한다.
도 7은 30°만큼 틸팅된 골드(gold) 그리드 샘플에 대한 타깃팅 에러들을 예시한다.
도 1a(축적대로 예시되지 않음)는 본 발명이 구현될 수 있는 하전 입자 현미경(M)의 일 예의 매우 개략적인 도면이다. 일 예에서, 하전 입자 현미경(M)은 투과 전자 현미경(TEM)과 같은 투과형 현미경일 수 있다. 도 1a에 예시된 바와 같이, 진공 인클로저(2) 내에서, 전자 소스(4)는, 전자-광학 축(B')을 따라 전파되고 전자-광학 조명기(6)를 횡단하는 전자들의 빔(B)을 생성하며, 그 전자-광학 조명기(6)는 전자들을 시료(S)의 선택된 부분 상으로 지향시키고/포커싱하는 역할을 하고, 그 선택된 부분은 (국부적으로) 박화/평탄화될 수 있다. (특히) 빔(B)의 스캐닝 모션을 달성하는 데 사용될 수 있는 편향기(8)가 또한 도시되어 있다.
시료(S)는, 홀더(H)가 (제거가능하게) 부착되는 크래들(A')을 이동시키는 포지셔닝 디바이스/스테이지(A)에 의해 다수의 자유도들로 포지셔닝될 수 있는 시료 홀더(H) 상에 홀딩된다. 예를 들어, 시료 홀더(H)는 (특히) XY 평면에서 이동될 수 있는 손가락을 포함할 수 있다. 직교 좌표계(Cartesian coordinate system)가 또한 도 1a에 도시되어 있다. 전형적으로, Z 축에 평행한 모션 및 X/Y 축들에 대한 틸트가 또한 가능할 것이다. 그러한 이동은 빔 스캐닝에 대한 대안으로서, 시료(S)의 상이한 부분들이 (Z 방향으로) 축(B')을 따라 이동하는 전자 빔(B)에 의해 조명/이미징/검사되게 허용하고 그리고/또는 스캐닝 모션이 수행되게 허용한다. 원하는 경우, 선택적인 냉각 디바이스(도시되지 않음)는, 예를 들어 극저온 온도들에서 시료 홀더(H)(및 그 상의 시료(S))를 유지하기 위해 시료 홀더(H)와의 밀접한 열 접촉을 하게 될 수 있다.
전자 빔(B)은 (예를 들어) 2차 전자들, 후방산란된 전자들, X-선들 및 광학 방사선(음극선발광(cathodoluminescence))을 포함하는 다양한 유형들의 "자극된" 방사선이 시료(S)로부터 나오게 하는 그러한 방식으로 시료(S)와 상호작용할 것이다. 원하는 경우, 이러한 방사선 유형들 중 하나 이상은, 예를 들어 결합된 신틸레이터/광전자증배기 또는 EDX(에너지 분산성 X-선 분광법) 모듈일 수 있는 분석 디바이스(22)의 보조로 검출될 수 있다. 그러한 경우, 이미지는 SEM에서와 기본적으로 동일한 원리를 사용하여 구성될 수 있다. 그러나, 대안적으로 또는 보충적으로, 본 발명은, 시료(S)를 횡단하고(통과하고), 그로부터 빠져나가고/나오고, 축(B')을 따라 (실질적으로는, 일반적으로 일부 편향/산란으로) 계속 전파되는 전자들을 연구할 수 있다. 그러한 투과된 전자 플럭스는 이미징 시스템(투영 렌즈)(24)에 진입하며, 이는 일반적으로, 다양한 정전식/자기 렌즈들, 편향기들, 보정기들(예컨대, 스티그메이터(stigmator)들) 등을 포함할 것이다. 정상(비-스캐닝) TEM 모드에서, 이러한 이미징 시스템(24)은 투과된 전자 플럭스를 형광 스크린(26) 상으로 포커싱할 수 있으며, 이는 원하는 경우, 그것이 축(B')을 벗어나게 하기 위해 (화살표(26')에 의해 개략적으로 표시된 바와 같이) 철수/후퇴될 수 있다. 시료(S)(그의 일부)의 이미지(또는 회절도(diffractogram))는 이미징 시스템(24)에 의해 스크린(26) 상에 형성될 것이고, 이는 인클로저(2)의 벽의 적합한 부분에 위치된 뷰잉 포트(28)를 통해 뷰잉될 것이다. 스크린(26)에 대한 후퇴 메커니즘은, 예를 들어 사실상 기계적 및/또는 전기적일 수 있고, 본 명세서에 도시되지 않는다.
스크린(26) 상에서 이미지를 뷰잉하는 것에 대한 대안으로서, 본 발명은 대신에, 이미징 시스템(24)을 떠나는 전자 플럭스의 포커스 심도가 일반적으로 매우 크다(예를 들어, 대략 1 미터)는 사실을 이용할 수 있다. 결과적으로, 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 다양한 다른 유형들의 분석 장치가 스크린(26)의 하류에서 사용될 수 있다.
스크린(26)의 하류에서 사용될 수 있는 하나의 다른 유형의 분석 장치는 TEM 카메라(30)이다. 카메라(30)에서, 전자 플럭스는, 예를 들어 제어기/프로세서(20)에 의해 프로세싱되고, 평판 디스플레이와 같은 디스플레이 디바이스(도시되지 않음) 상에 디스플레이될 수 있는 정적 이미지(또는 회절도)를 형성할 수 있다. 요구되지 않을 때, 카메라(30)는 그것이 축(B')을 벗어나게 하기 위해 (화살표(30')에 의해 개략적으로 표시된 바와 같이) 철수/후퇴될 수 있다.
스크린(26)의 하류에서 사용될 수 있는 다른 유형의 분석 장치는 STEM 카메라(32)이다. 카메라(32)로부터의 출력은 시료(S) 상의 빔(B)의 (X, Y) 스캐닝 포지션의 함수로서 기록될 수 있고, (X, Y)의 함수로서 카메라(32)로부터의 출력의 "맵"인 이미지가 구성될 수 있다. 카메라(32)는, 예를 들어 카메라(30)에 특징적으로 존재하는 픽셀들의 행렬과 대조적으로, 20 mm의 직경을 갖는 단일 픽셀을 포함할 수 있다. 게다가, 카메라(32)는 카메라(30)(예를 들어, 초당 102개의 이미지들) 보다 일반적으로 훨씬 더 높은 획득 레이트(예를 들어, 초당 106개의 포인트들)를 가질 것이다. 다시 한번, 요구되지 않을 때, 카메라(32)는 그것이 축(B')을 벗어나게 하기 위해 (화살표(32')에 의해 개략적으로 표시된 바와 같이) 철수/후퇴될 수 있다(예를 들어, 도넛 형상의 환형 암시야 카메라(32)의 경우에는 그러한 후퇴가 필요하지 않을 것이지만, 그러한 카메라에서, 중심 홀은 카메라가 사용 중이지 않을 때 플럭스 통과를 허용할 것이다).
카메라들(30 또는 32)을 사용하여 이미징하는 것에 대한 대안으로서, 본 발명은 또한, 예를 들어 EELS 모듈일 수 있는 분광 장치(34)를 호출할 수 있다.
항목들(30, 32, 34)의 순서/위치는 엄격하지 않고, 많은 가능한 변형들이 고려될 수 있다는 것을 유의해야 한다. 예를 들어, 분광 장치(34)는 또한 이미징 시스템(24)으로 통합될 수 있다.
제어기(컴퓨터 프로세서)(20)는 제어 라인들(버스들)(20')을 통해 다양한 예시된 컴포넌트들에 연결된다는 것을 유의한다. 이러한 제어기(20)는, 액션들을 동기화하는 것, 세트포인트들을 제공하는 것, 신호들을 프로세싱하는 것, 계산들을 수행하는 것, 및 디스플레이 디바이스(도시되지 않음) 상에 메시지들/정보를 디스플레이하는 것과 같은 다양한 기능들을 제공할 수 있다. 말할 필요도 없이, (개략적으로 도시된) 제어기(20)는 원하는 대로, 인클로저(2) 내부 또는 외부에 (부분적으로) 있을 수 있고, 일체형 또는 복합 구조를 가질 수 있다.
당업자는 인클로저(2)의 내부가 엄격한 진공으로 유지되어야 할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 소위 "환경 TEM/STEM"에서, 주어진 가스의 배경 분위기는 인클로저(2) 내에 의도적으로 도입/유지된다. 당업자는 또한, 실제로, 가능한 경우, 이용된 전자 빔이 통과하는 작은 튜브(예를 들어, 직경이 대략 1 cm)의 형태를 취하지만, 소스(4), 시료 홀더(H), 스크린(26), 카메라(30), 카메라(32), 분광 장치(34) 등과 같은 구조들을 수용하기 위해 넓어져서, 인클로저(2)의 볼륨이 본질적으로 축(B')을 끌어안도록 인클로저(2)의 볼륨을 한정하는 것이 유리할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
전자 현미경의 전자 빔 편향기들을 사용하여, 샘플의 특정 부분들을 광학 축으로 기계적으로 시프트시킴으로써, 또는 전자 빔을 이러한 특정 부분들을 향해 시프트시킴으로써, 샘플의 상이한 부분이 카메라(30)의 시야로 들어가게 될 수 있다. 그러나, 그러한 편향들은 수차들을 유도할 수 있고, 그에 의해, 이러한 유도된 수차들이 적절히 보상되지 않으면 해상도의 손실을 유도할 수 있다. 이는 다음의 단락들에서 설명된다.
주사형 전자 현미경들, 전자 빔 마이크로프로브들 및 전자 빔 리소그래피 기계들과 같은 전자 빔 기구들에서 획득가능한 해상도 및 시야는 광학 시스템의 수차들에 의해 제한된다. 이러한 수차들은 기생 및 고유로 분류될 수 있다. 기생 수차들은 렌즈의 자기장을 생성하는 재료의 자기 속성들의 불완전한 진원도 또는 불균질성들과 같은 렌즈의 결함들에 의해 야기된다. 렌즈의 가장 잘 알려진 기생 수차는 (이중(two-fold)) 비점수차(astigmatism)이다. 고유 수차들은 렌즈에 고유하며, 따라서 이들은 신중한 기계가공에 의해 회피될 수 없다. 고유 수차들은 전통적으로 순수 기하학적(그의 가장 잘 알려진 수차는 구면 수차임) 또는 에너지-의존적(그의 가장 잘 알려진 수차는 (1차) 색수차임)으로 분류된다. 렌즈의 3차의 고유 기하학적 수차들은 8개의 유형들: 등방성 및 이방성 왜곡, 필드의 곡률, 등방성 및 이방성 축외(off-axial) 비점수차, 등방성 및 이방성 축외 코마(coma), 및 구면 수차이다. 단어들 "축외"는 축상(on-axial) 비점수차 및 축상 코마(이들은 각각 기생 수차들 및 1차 및 2차임)로부터 축외 비점수차 및 축외 코마(이들은 고유 수차들이고, 3차임)를 구별하는 데 사용된다. 단어들 "축외" 및 "축상"은 종종, 비점수차 또는 코마의 어느 형태가 의미되는지가 맥락으로부터 명확할 때 드롭된다는 것을 유의해야 한다.
시스템의 광학 축 상의 이미지 포인트에 대해, 구면 수차만이 발생한다. 전자 빔이 축외로 더 멀리 이미지 포인트들 상에 포커싱됨에 따라, 나머지 7개의 수차들은 달성가능한 포커싱된 스폿 크기 및 이미지에 존재하는 왜곡의 정도를 결정하는 데 중요하게 된다.
이러한 광학 수차들 중 몇몇은 일반적으로 알려진 기법들로 보정될 수 있다. 일부 종류의 동시 보정이 제공되지 않는 시야를 제한하는 유일한 수차들은 등방성 및 이방성 코마이다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 빔 정의 애퍼처의 적절한 배치는 종래의 전자 현미경과 같은 비주사형 전자 빔 기구들에서도 등방성 코마가 소거될 수 있게 한다. 그러나, 이방성 코마 수차를 완전히 보정하는 수단은 존재하지 않는다. 추가로, 필드의 곡률을 최소화하면서 이방성 및 등방성 코마를 동시에 보정하는 것이 문제이다.
예시적인 예에서, 300 ㎸ STEM 현미경(내장된 구면 수차 보정기가 없음)이 제공할 수 있는 최상의 해상도는 약 0.10 nm이다. 전형적으로, 이는 약 0.04×0.04 nm2의 픽셀들에서 시료를 스캐닝함으로써 획득된다. 현대의 STEM 제어부들은 8000×8000 픽셀들만큼 큰 이미지들을 수집할 수 있다. 이는 320×320 nm2의 시야 및 u=320 nm/√2=226 nm의 최대 축외 거리에 대응한다. 축외 코마로 인한 블러(blur)는 다음과 같이 계산될 수 있으며:
여기서, K는 축외 코마의 계수를 나타내고, v는 샘플에서의 STEM 빔의 반-수렴(half-convergence) 각도를 나타낸다. 여기서, 거리 및 각도 및 코마는 복소 수들 u=x+iy and v=αx+iαy이고, 그들의 복소 켤레들은 추가된 상단 바에 의해 나타낸다. K가 전형적으로 약 1(무차원)이고 v가 전형적으로 0.012 rad이므로, 이미지의 코너들에서의 축외 블러는 이러한 예에서 약 0.098 nm에 달하며, 이는 해상도를 저하시킨다.
축외 수차들의 속성을 이해하기 위해, 대물 렌즈를 무한히 얇은 렌즈인 것으로 단순화하는 것은 도움이 될 수 있다. 이상적으로, 렌즈의 굴절 강도는 렌즈의 중심까지 빔의 거리에 따라 선형으로 증가하고; 비례의 연관된 상수는 대물 렌즈의 역 초점 거리와 동일하다. 그러나, 실제로, 더 높은 차수의 수차들은 굴절 강도가 선형 의존성으로부터 벗어나게 한다. 그러나, 무한히 얇은 렌즈의 경우, 렌즈의 중심을 통해 지향되는 임의의 빔은, 렌즈의 굴절력이 그의 중심에서 0이므로 이러한 더 높은 차수의 수차들을 겪지 않을 것이다. 따라서, 스캐닝 빔이 대물 렌즈의 중심을 통해 이동하도록 스캐닝 빔이 틸팅(또는 지향)된다고 가정하면, 더 높은 차수의 수차들을 빔에 가하지 않으면서 축외로 멀리있는 샘플을 무한히 스캐닝하는 것이 가능하다. 이러한 방식은 '코마가 없는 평면에 피봇(pivot) 포인트를 두는 것'으로 당업자에게 알려져 있다. 유사하게, 무한히 얇지 않은 실제 렌즈의 경우, 스캐닝 빔이 이러한 평면에서 광학 축을 가로지르도록 지향될 때 어떠한 등방성 축외 코마도 도입되지 않은 속성으로 렌즈의 중심에 일반적으로 상당히 가까운 평면이 존재한다.
복소 피봇 포인트를 사용함으로써, 즉 시프트-의존적 틸트 보정을 시프트에 추가함으로써, 등방성 뿐만 아니라 이방성 코마도 회피되거나 보정될 수 있다.
종래의 SPA에서, 최대 이미지 시프트는 대물 렌즈의 고유 3차 수차들에 의해 도입되는 수차들에 의해 설정된다. 1차 수차들이 스티그메이터 또는 스티그메이팅 렌즈에 의해 보정될 수 있는 (축상) 비점수차에 대응하므로, 3차 수차들은 관련있는 수량들이고, 시스템이 회전 대칭이므로, 2차 수차들은 사라진다. 다음의 수학식들은 이를 정량적으로 예시한다. 복소 수들 u=x+iy and v=ax+iay에 의해 시료에서의 포지션 및 각도를 나타내고, 추가된 상단 바에 의해 그들의 복소 켤레들을 나타낸다. 모든 3차 수차들에 의해 유도된 시프트에 대한 일반적인 표현은 다음과 같으며:
여기서, Cs=구면 수차이고, K=축외 코마이고, F=필드 곡률이고, Λ=축외 비점수차(복소 수)이고, D=왜곡이다.
시료에서 시프트 u→u+s 및 틸트 v→v+t를 도입한다. 이는 다음과 같은 부가적인 수차들을 유도하며:
,
이때, 유효 코마는 이고,
유효 디포커스는 이고,
유효 비점수차는 이다.
종래의 단일 입자 분석에서, 틸트는 적용되지 않고, 시프트 s만이 적용된다. 이러한 경우, 유효 코마는 최대 이미지 시프트를 제한하고 있다.
이러한 경우, 코마 B가 약 2 μm에 도달할 때, 그것은 약 1 Å의 해상도 손실을 초래하고, 이는 실제로 허용가능한 최대 해상도 손실이다. 본 출원인의 Krios™ 투과 전자 현미경은 K=0.15+1.42i를 포함하므로, 최대 허용된 이미지 시프트는 약 2μm/(0.15-1.42i) ~1.5μm가 된다. 유효 코마는 비율 t=-Ks/Cs로 이미지 시프트 s 및 빔 틸트 t를 동시에 적용함으로써 제거될 수 있다. 이러한 스큐(skew) 조명은 미국 특허 제4,101,813호로부터 알려져 있다.
이미지 시프트 프로세스들 동안 발생하는 수차들을 보정하기 위한 위에서 설명된 기법들은 "수차가 없는 이미지 시프트" 또는 "AFIS" 기법들로 지칭될 수 있고, 제US 2021/0272767호에 설명되어 있다.
수차가 없는 이미지 시프트(AFIS) 및 샘플 높이의 영향:
전자 빔이 축외 포지션에서 하부 대물 렌즈를 통과할 때, 결과적인 이미지는 코마와 같은 바람직하지 않은 위상 수차들을 경험하며, 이는 최종 SPA 이미지 품질에 해로울 수 있다. 이러한 축외 코마는 결과적인 코마가 최소이도록 빔을 틸팅하고 빔이 하부 대물 렌즈 내의 고정된 포인트를 통과하게 함으로써 소거될 수 있다(종종 "회전 중심" 또는 "코마가 없는 중심"으로 불림). 코마가 없는 포인트 주위에서 빔을 피봇하는 것은 코마가 없는 중심 위의 광학 축에 수직인 각각의 평면에 대해 상이한 시프트를 초래한다. 따라서, 샘플에서 소정의 빔 시프트를 달성하기 위해, 코마가 없는 중심 위의 샘플의 높이(광학 축에 수직인 2개의 평면들 사이의 거리, 하나의 평면은 관심있는 샘플 포인트(타깃 영역)를 포함하고, 다른 평면은 코마가 없는 중심을 포함함)가 알려져야 한다. 단순화의 이유들을 위해, 샘플이 평탄하고 광학 축에 수직으로 배향되고, 현미경이 검출기에서 이미징하는 광학 평면에 샘플이 위치되며, 따라서 코마가 없는 중심 위의 샘플의 높이는 고정되고 알려져 있다고 가정하는 것이 일반적인 실시이다. 이러한 샘플 평면은 "이미지 평면" 또는 "타깃 평면"으로 지칭된다. 이어서, 코마가 없는 중심 위의 샘플의 실제 국부 높이는 코마가 없는 중심 위의 타깃 평면의 높이와 타깃 평면 위의 관심있는 샘플 포인트의 높이(이는 타깃 평면으로부터의 높이 편차의 방향에 의존하여 양이거나 음일 수 있음)의 합이다. 우리는 타깃 평면 위의 샘플의 높이의 이러한 국부 편차를 "샘플 높이" 또는 "샘플 z 오프셋"으로 지칭한다.
현재 현미경 시스템들에서, 선택된 타깃 평면에서의 원하는 빔 시프트들 및 틸트들과 요구되는 렌즈 전류들 사이의 변환은 전문가들에 의해 수행될 필요가 있는 교정 절차에 의해 확립된다. 이러한 변환이 각각의 가속 전압에 대해 시간에 걸쳐 안정적이고, 재교정을 위해 전문가 지식을 요구하므로, 그것은 (예를 들어, 샘플 스테이지 z 좌표로부터 도출된 바와 같은) 샘플의 높이가 타깃 평면으로부터 벗어나는 것으로 알려져 있을 때에도 거의 조정되지 않는다. 특히, 그것이 예측가능할 때, 예를 들어 시료 스테이지가 알려진 각도만큼 틸팅될 때에도, (이미징 시스템에서 렌즈들의 강도를 조정함으로써) 국부 샘플 높이 변동으로 인해 타깃 평면을 동적으로 조절하는 것은 일반적이지 않다.
이미지 시프트 기법들은 스테이지 A를 이동시키지 않으면서 시료(S)의 축외 포일 홀들로부터의 이미지 데이터의 수집을 허용하여, 이러한 포일 홀들을 광학 축(B')에 더 가깝게 가져간다.
일 예에서, 시료는 이미징될 분자의 거의 동일한 복사본(copy)들을 갖는 얼음의 비정질 층을 각각 포함하는 많은 원형 포일 홀들을 갖는 그리드를 포함한다. 각각의 얼음 포일 홀은 약 2 μm 직경이며, 평균 거리는 약 5 μm이다. 스테이지는 홀의 중심으로 이동되고, 2개 내지 6개의 상이한 이미지 시프트들은 2개 내지 6개의 이미지들을 획득하는 데 사용되며, 각각의 이미지는 약 0.5×0.5 μm2의 영역을 커버한다. 이어서, 스테이지는 다음 홀으로 이동되고, 절차가 반복된다. 이러한 프로세스는 수천 회 반복될 수 있으며, 따라서 많은 수천 개의 이미지들을 생성할 수 있다. 이러한 이미지들로부터, 입자들은 재구성된 입자에서 특정 해상도가 되도록 픽킹(pick), 분류, 정렬, 및 평균된다. 획득 세션은 전형적으로 몇 일이 걸릴 수 있다.
스테이지 시프트의 완화 시간은 최대 대략 1분일 수 있고, 이러한 대기 시간은 SPA 세션의 총 시간에 대한 지배적인 기여일 수 있다. 이러한 총 시간은 스테이지 시프트들 대신에 이미지 시프트들이 사용될 수 있다면 상당히 감소될 수 있다.
타깃팅 소프트웨어는 편향기들을 조정함으로써 원하는 위치들의 이미지들을 자동으로 캡처하도록 구성될 수 있다. 기존의 기법들은 또한, 개선된 빔 제어를 용이하게 하기 위해 타깃팅 에러들을 예측하는 것을 목표로 한다. 이는 저배율(LM)을 사용하여 관찰된 포일 홀들의 겉보기 포지션들을 고배율(HM)을 사용하여 관찰될 때의 그러한 동일한 포일 홀들의 겉보기 포지션들과 비교하는 교정 프로세스를 수반할 수 있다. 겉보기 포지션들 사이의 불일치들은 모델을 이용하여 피팅되고, 이어서 모델은 LM 및 HM 모드 사이의 선형 회전 및 스케일링 불일치들을 결정하는 데 사용된다. 이어서, 현미경의 자동화된 동작 동안 더 높은 배율로 특정 구역들을 이미징하기 위해 타깃팅을 수행할 때 이러한 불일치들이 고려될 수 있다.
LM 및 HM 모드들을 사용하여 수집된 이미지들 사이에(예를 들어, 스케일, 회전, 왜곡에) 비교적 큰 미스매치가 존재할 수 있다. 이에 대한 하나의 이유는 현미경(M)의 투영 시스템(24) 내의 제1 이미징(또는 "중간") 렌즈가 HM 모드에서 스위칭 온되고 LM 모드에서 스위칭 오프된다는 것이다.
단일 입자 분석(SPA) 기법의 일 예는, 극저온 온도들로 냉각되고 유리질 물(vitreous water)에 현탁된 샘플 입자들을 시료(S)가 포함하는 극저온 전자 현미경(cryoEM)이다. 수성 샘플 용액이 포일 메시 그리드에 적용되고 냉동된다. 포일 메시 그리드는 다수의 포일 홀들을 포함하며, 여기서 냉동된 용액이 현탁된다. 이어서, 메시 그리드 내의 포일 홀들은 현미경(M)에 의해 분석된다.
포일 홀들의 분석은 데이터가 수집되는 속도를 개선시키기 위해 자동으로 수행될 수 있다. 자동화된 데이터 수집의 처리량을 제한하는 하나의 중요한 병목은 스테이지 A의 스테이지 이동에서 소비되는 시간이다. 각각의 스테이지 이동은 드리프트를 감소시키기 위해 정착 기간(settlement period)이 뒤따라야 한다. 부가적으로, 스테이지 이동의 부정확성을 보상하기 위해 여분의 추적 단계들이 요구될 수 있다. 위에서 설명된 이미지 시프트 기법들은 요구되는 스테이지 이동들의 수를 감소시키고 그에 의해 자동화 데이터 수집 동안 처리량을 증가시키도록 설계되었다.
그러나, SPA에서의 이미지 시프트의 실험적인 타깃팅 정확도는 때때로 샘플 평면 상의 시프트 거리가 10 μm 초과일 때 100 nm보다 악화되는 것으로 밝혀진다. 전형적인 불량 이미지 예들이 도 1b에 도시되어 있으며, 여기서 시야(FOV)의 50% 초과가 사용가능하지 않다(이는 이들이 시료(S)의 포일 홀에 현탁된 얼음보다는 포일 자체를 이미징하기 때문임).
도 1b는 타깃팅 부정확성을 겪는 실제 SPA 이미지들을 예시한다. 이러한 이미지들에 대한 FOV는 대략 300 nm이다.
빔이 전도성 지지 필름의 일부를 여전히 터치하는 것을 확인하기 위해(샘플 상의 하전 효과들을 감소시키는 데 도움을 주기 위해), 카메라 FOV 내부에 나타나는 필름의 이러한 조명된 부분 없이(또는 적어도, 필름이 대부분의 FOV를 지배하지 않으면서), 타깃팅 정확도는 50 nm보다 양호할 필요가 있다. 따라서, 현재 타깃팅 정확도는 단일 이미징 중심으로부터 도달가능한 포일 홀들의 유효 수를 제한한다(다시 말하면, 타깃팅 정확도는 스테이지 A를 이동시키지 않으면서 이미징될 수 있는 홀들의 수를 제한함).
(현재 이미지 편향기들의 범위 제한인) 25 μm만큼 큰 시프트 거리들에서 50 nm보다 양호한 값으로 타깃팅 정확도를 개선시키는 것이 본 발명의 의도이다. 그러한 개선으로, 이미지 시프트 기법들은 더 많은 영역을 커버하고, 그에 의해 정사각형 획득당 스테이지 이동의 수를 감소시킬 수 있다. 그것은 또한, 틸팅된 SPA 획득의 처리량을 상당히 개선시킬 것이며(적어도 2x), 이는 COVID-19 스파이크 단백질과 같은 공기-물 계면들에 의해 유도된 배향 선호도를 갖는 단백질들에 매우 중요한 것으로 입증되어 있다.
타깃팅에 대한 유의한 유형들의 에러 소스들은,
1. 샘플의 비평탄도;
2. HM 모드에 대해 선형 회전 및 스케일링을 야기하여, LM 및 HM 맵들 사이의 미스매치를 암시하는 LM 모드에서의 디포커스; 및
3. 다른 에러 소스들, 예컨대 더 높은 차수의 왜곡들 및 편향기들의 기계적 결함들.
기존의 기법들은 에러 소스 2: LM 및 HM 모드 사이의 선형 회전 및 스케일링을 야기하는 디포커스만을 해결한다. 일련의 이미지들의 수집의 시작 시에, 알려진 기법들은 몇몇 이미지들을 수집하고, 관찰된 타깃팅 에러들에 선형 (스케일링 및 회전) 보정을 피팅한다. 이러한 방식으로, 타깃팅 에러에 대한 샘플의 비평탄도의 가능한 효과들은 가능한 더 높은 차수의 왜곡들과 함께 무시된다.
에러 소스 1을 해결하기 위해, 이러한 예의 제안된 방법들은, 샘플 높이의 변동들이 (빔 틸트가 조명 방식에 고유하므로) 획득을 위해 선택된 빔 틸트와 조합하여 조명의 시프트를 생성할 수 있다는 것을 고려한다. 이러한 시프트는 알려진 이미지 시프트 기법들에 현재 영향을 주는 부정확성의 상당한 부분을 고려할 수 있다.
에러 소스 1을 보상하는 것 외에 에러 소스들 2 및 3을 해결하기 위해, 특정 예에서, 제안된 방법은 근처의 획득 영역들에 대한 정확한 에러 예측을 허용하고 그에 의해 타깃팅을 추가로 개선시키기 위해 평활한 2차원 함수를 나머지 에러들에 즉시 피팅한다. 더 높은 차수의 에러 기여도들의 물리적인 근원 원인은 알려지지 않을 수 있다. 그러나, 물리적인 근원 원인을 에러 기여도들에 부여하는 것은 필요하지 않을 수 있다. 본 발명은 이러한 에러들을 더 높은 차수의 항들로서 모델링함으로써 매우 양호하게 작동할 수 있다.
하나의 일반적인 예시적인 구현예가 도 2a 내지 도 2d를 참조하여 예시되고, 다음과 같이 요약될 수 있다:
1) 도 2a에 예시된 바와 같이, 저배율(LM)로 샘플의 개요 이미지 를 획득함(여기서, 는 시료 상의 포지션을 나타내는 2차원 벡터임);
2) 이러한 개요 이미지로부터, 고배율로 기록될 개요 이미지의 서브-영역들의 이미지 좌표들 를 결정함(제1 관심 서브영역 은 도 2a에서 "X"로 도시됨);
3) HM 이미지의 중심이 제1 관심 서브영역 의 결정된 좌표에 있도록 편향기들을 사용하여 빔을 시프트시킴(의도된 시프트는 도 2a의 화살표에 의해 예시됨);
4) 도 2b에 예시된 고배율(HM)로 타깃 영역의 이미지를 기록함.
(전통적인 기술이 가정하는) 이상적인 시나리오에서, 이러한 HM 이미지의 중심은 관심있는 영역 의 중심에 대응한다. 그러나, 다양한 이유들 때문에, 이러한 중심들 사이에는 겉보기 시프트가 존재할 수 있다. 이는 다음에 의해 야기될 수 있다:
i. LM 및/또는 HM 이미지의 배율의 부정확한 교정;
ii. LM 및/또는 HM 이미지의 부정확한 배향;
iii. LM 이미지의 왜곡들, 이는 다음 때문일 수 있다:
a. 광학 수차들로 인해, 그리고/또는
b. 카메라 결함들로 인해;
iv. 아래에서 설명되는 바와 같은 샘플의 비평탄도로 인한 부정확한 타깃팅;
v. 스테이지의 드리프트; 및
vi. 다른 명시되지 않은 인자들.
그러한 타깃팅 에러들을 고려하기 위해, 다음의 단계들이 방법에 추가될 수 있다:
5) 도 2b의 화살표에 의해 예시된 바와 같이, HM 이미지의 중심과 제1 타깃 영역 의 중심 사이의 겉보기 시프트 또는 "타깃팅 에러" 을 결정하기 위해 교차-상관, 뉴럴 네트워크 또는 AI를 사용하는 것.
모든 타깃 영역들 이 방문되고 기록되었을 때, 에러 맵 Δ가 개요 이미지에 대해 제공된다. 기본 원인들 i, ii, iii, iv, v 모두가 평활하게 변하는 에러 맵들을 생성하기 때문에, 이러한 에러 맵은 평활해야 한다(다시 말하면, 어떠한 급작스러운 변화들도 존재하지 않는다). 이러한 평활도 때문에, 이미 기록된 HM 이미지들 및 그들의 에러들이 맵을 생성하는 데 사용될 수 있고, 이러한 맵은 아직 획득되지 않은 영역들에 보간 및/또는 외삽될 수 있다. 따라서, 이미지 획득이 여전히 진행 중인 동안, 이미 기록된 HM 이미지들은 다음 HM 이미지들을 기록하기 위해 어떤 보정이 빔 시프트에 적용되어야 하는지를 예측하는 데 사용될 수 있다:
6) 에러 맵을 개량하기 위해 최신 겉보기 시프트/타깃팅 에러 을 사용함;
7) (예시적인 목적들을 위해서만 동일한 타깃 위치 을 가정하여) 도 2c의 화살표에 의해 예시된 바와 같이, 예측된 타깃팅 에러를 고려하기 위해, 다음 타깃 위치 에서 타깃팅 에러 을 예측하고 교정된 타깃 위치 을 계산하도록, 개량된 에러 맵을 사용함;
8) 도 2d에 예시된 바와 같이, 빔을 다음 교정된 타깃 위치로 시프트시키고, 고배율(HM)로 다음 이미지를 캡처함;
9) 모든 타깃 서브영역들이 이미징될 때까지 단계들 4 내지 8을 반복함.
일부 예시적인 방법들은, 에러 맵이 최적의 방식으로 생성, 업데이트, 및 외삽될 수 있도록, 타깃 영역들 가 기록되는 순서를 변경한다. 예를 들어, 타깃 영역들 는 LM 개요(또는 "기준") 이미지의 중심으로부터 바깥쪽으로 나선형으로 움직이는 나선형 경로를 따라 방문된다.
에러 맵 은 기반 함수들 의 합으로서 기입될 수 있다. 다시 말하면, 이고, 계수들 는 초기에 모두 0이고(그러므로, 에러들이 없음), 측정된 에러들 를 사용하여 결정되고 미세-튜닝(fine-tune)된다.
일 예에서, 제르니케 다항식들이 기본 함수들에 대해 사용될 수 있다. 이러한 기능들은 광학 수차들을 설명하는 데 유용할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 2D 스플라인 함수들이 기본 함수들에 대해 사용될 수 있다. 이러한 함수들은 시료 비평탄도를 설명하기에 더 적합할 수 있다.
방법은 (단계 2: LM으로 개요 이미지를 획득하는 단계 이후에 그리고 단계 3: HM으로 최종 이미지들을 획득하는 단계 이전에) 여분의 단계 2a에 의해 연장될 수 있으며, 여기서 의 제1 근사를 측정하고 구축하기 위해 일부 중간 배율(MM)의 맵이 기록된다(예를 들어, LM=100x, MM=6,000x, HM=100,000x).
도 3a는 "교정 방법 1" 및 "교정 방법 2"에 대한 흐름도를 예시한다. 흐름도에 예시된 단계들은 아래에서 개별적으로 설명된다.
타깃팅 모델은 단계(S301)에서 초기화된다. 이러한 초기화는 항등 맵, 즉, 임의의 타깃 위치가 주어지면, 주어진 타깃 위치와 동일한 교정된 타깃 위치를 리턴하는 모델일 수 있다. 대안적으로, 초기화는 다른 그리드 정사각형으로부터의 타깃들에 대한 모델 피트로부터의 파라미터들을 복사함으로써 행해질 수 있다.
단계(S302)에서 그리드 정사각형 이미지가 획득된다.
단계(S302)에서 획득된 그리드 정사각형 이미지에 기초하여, 단계(S303)에서 타깃 위치들이 식별된다. 이는 전형적으로 홀 발견 알고리즘에 의해 행해지지만, 인간 조작자에 의해 전적으로 보조되거나 수행될 수 있다.
단계(S304)에서, 타깃 위치들의 서브세트는 단계(S303)에서 식별된 타깃 위치들로부터 선택된다. 이러한 선택은, 작은 모델링 에러(예를 들어, 임의의 포일 홀 위치에서 50 nm 미만)를 갖는 모델이 가능한 가장 적은 선택된 포인트들로 피팅될 수 있는 그러한 방식으로 포일 홀들(예를 들어, 모든 타깃 위치들의 볼록한 껍질)의 영역이 선택된 포인트들로 커버되도록 행해진다. 전형적으로, 평활화 타깃팅 에러 필드들의 경우, 이는 50 um 측부 길이를 갖는 그리드 정사각형 내의 적어도 10개의 위치들을 사용하여 공간적으로 균일한 커버리지에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 선택은 선택된 수의 빈들 각각으로부터 랜덤하게 행해질 수 있으며, 여기서 각각의 빈은 선택된 수의 위치들을 선택된 순서로 포함한다. 예를 들어, 위치들의 순서는 획득 소프트웨어에 의해 설정된 바와 같은 획득 순서일 수 있다.
단계(S305)에서, 교정 기준은 현재 타깃팅 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정한다. 이러한 평가는, 현재 모델을 피팅하는 데 사용되는 이미지들의 획득과 비교하여 광학 설정들이 변경되었는지 여부에 기초하여 행해질 수 있다. 평가는 현재 모델이 피팅되었던 그리드 정사각형과 비교하여 현재 그리드 정사각형에 대한 이전 지식에 추가로 기초할 수 있다. 예를 들어, 이러한 이전 지식은 높이 편차, 오염의 레벨, 균열들 등의 추정을 포함할 수 있다.
단계(S305)에서 평가된 타깃팅 모델이 유효하지 않으면, 방법은 루프에 진입한다. 루프의 시작 시에, 단계(S306)에서 정지 기준이 체크된다. 이러한 정지 기준은 "다음 타깃이 이용가능하지 않은가?"와 추가적인 기준들의 논리적 OR일 수 있다. 이러한 추가적인 기준들은 현재 타깃팅 모델이 선택된 값보다 작은 에러를 갖는 신뢰도 값에 기초할 수 있다.
단계(S307)에서, 다음 타깃 위치가 타깃 위치의 서브세트 4로부터 현재 타깃 위치로서 선택된다.
"교정 방법 2"에서, 현재 타깃팅 모델은 단계(S308)에서 교정된 타깃 위치를 생성하기 위해 현재 타깃 위치에 적용된다. "교정 방법 1"에서, 교정된 타깃 위치는 현재 타깃 위치가 되도록 선택된다.
단계(S309)에서, 교정된 타깃 위치에 중심설정되도록 빔을 편향시키기 위해 이미지 시프트를 사용하여 중간 배율(MM) 또는 고배율(HM)의 이미지가 교정된 타깃 위치에서 획득된다.
교정된 타깃 위치에서의 타깃팅 에러는 단계(S310)에서, 교정된 타깃 위치에서의 그리드 정사각형 이미지의 크롭(crop)을 단계(S309)에서 획득된 이미지와 비교함으로써 측정된다. 이러한 측정은 2개의 이미지들 사이의 시프트를 검출하기 위해 이미지 프로세싱 기법들, 예를 들어 특징 추적, 광학 흐름, 특징 인식, 또는 이미지 등록을 사용하여 수행될 수 있다. 교정된 타깃 위치에서의 측정된 타깃팅 에러가 저장된다.
새로운 타깃팅 모델이 지금까지 이용가능한 데이터 쌍들 에 피팅되며, 여기서 i번째 위치에 대해, 는 교정된 타깃 위치이고, 는 측정된 타깃팅 에러이다. 이러한 새로운 타깃팅 모델은 다음 반복을 위한 새로운 현재 타깃팅 모델인 것으로 취해질 수 있다. 이러한 모델 업데이트는 모델 품질 체크들을 겪을 수 있다. 예를 들어, 파라미터들이 유효 파라미터들의 선택된 범위 밖에 있으면, 새로운 모델이 거부될 수 있다. 새로운 모델은 또한, 품질 메트릭들, 예를 들어 선택된 에러 메트릭에 대한 측정된 타깃팅 에러들에 관한 피트의 품질에 기초하여 거부될 수 있다.
단계(S305)에서 평가된 모델이 여전히 유효한 경우 또는 단계(S306)에서 체크된 정지 기준에 도달한 경우 중 어느 하나에 도달한 단계(S312)에서, 현재 타깃팅 모델이 단계(S304)에서 선택된 모든 타깃 위치들에 적용되어, 모든 타깃 위치들에 대한 교정된 위치들을 초래한다.
종래의 데이터 획득 방법은 단계(S312)로부터의 교정된 타깃 위치들을 사용하여 단계(S313)에서 실행된다.
도 3b는 "교정 방법 3"에 대한 흐름도를 예시한다. 흐름도에 예시된 단계들은 아래에서 개별적으로 설명된다.
타깃팅 모델은 단계(S321)에서 초기화된다. 이러한 초기화는 항등 맵, 즉, 임의의 타깃 위치가 주어지면, 주어진 타깃 위치와 동일한 교정된 타깃 위치를 리턴하는 모델일 수 있다. 대안적으로, 초기화는 다른 그리드 정사각형으로부터의 타깃들에 대한 모델 피트로부터의 파라미터들을 복사함으로써 행해질 수 있다.
단계(S322)에서, 그리드 정사각형 이미지가 획득된다.
단계(S322)에서 획득된 그리드 정사각형 이미지에 기초하여, 단계(S323)에서 타깃 위치들이 식별된다. 이는 전형적으로 홀 발견 알고리즘에 의해 행해지지만, 인간 조작자에 의해 전적으로 보조되거나 수행될 수 있다.
단계(S324)에서, 추가적인 타깃들이 획득을 위해 프로세싱되도록 유지되는지 여부가 체크된다. 유지되지 않으면, 현재 그리드 정사각형에 대한 데이터 획득이 완료되고, 방법은 단계(S313)로 진행한다. 애플리케이션은 다음 그리드 정사각형에서 획득을 계속하기로 결정할 수 있다.
더 많은 타깃들이 프로세싱되도록 유지되면, 단계(S325)에서 다음 타깃이 선택된다.
단계(S326)에서, 교정 기준은 현재 타깃팅 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정한다. 이러한 평가는, 현재 모델을 피팅하는 데 사용되는 이미지들의 획득과 비교하여 광학 설정들이 변경되었는지 여부에 기초하여 행해질 수 있다. 평가는 현재 모델이 피팅되었던 그리드 정사각형과 비교하여 현재 그리드 정사각형에 대한 이전 지식에 추가로 기초할 수 있다. 예를 들어, 이러한 이전 지식은 높이 편차, 오염 레벨, 균열들 등의 추정을 포함할 수 있다. 평가는 마지막 교정 이후의 시간, 총 드리프트 추정, 또는 이들의 조합에 추가로 기초할 수 있다.
현재 모델이 유효하면, 단계(S331)에서 그 현재 모델은 현재 타깃 위치를 교정하기 위해 즉시 적용된다. 그렇지 않으면, 현재 모델이 현재 타깃에 적용되어, 단계(S327)에서, 예비로 교정된 타깃 위치를 생성한다.
단계(S328)에서, 예비로 교정된 타깃 위치에 중심설정되도록 빔을 편향시키기 위해 이미지 시프트를 사용하여 중간 배율(MM)의 이미지가 예비로 교정된 타깃 위치에서 획득된다.
예비로 교정된 타깃 위치에서의 타깃팅 에러는 단계(S329)에서, 예비로 교정된 타깃 위치에서의 그리드 정사각형 이미지의 크롭을 단계(S328)에서 획득된 이미지와 비교함으로써 측정된다. 이러한 측정은 2개의 이미지들 사이의 시프트를 검출하기 위해 이미지 프로세싱 기법들, 예를 들어 특징 추적, 광학 흐름, 특징 인식, 또는 이미지 등록을 사용하여 수행될 수 있다. 예비로 교정된 타깃 위치에서의 측정된 타깃팅 에러가 저장된다.
단계(S330)에서, 새로운 타깃팅 모델이 지금까지 이용가능한 데이터 쌍들 에 피팅되며, 여기서 i번째 위치에 대해, 는 예비로 교정된 타깃 위치이고, 는 측정된 타깃팅 에러이다. 이러한 새로운 타깃팅 모델은 다음 반복을 위한 새로운 현재 타깃팅 모델인 것으로 취해질 수 있다. 이러한 모델 업데이트는 모델 품질 체크들을 겪을 수 있다. 예를 들어, 파라미터들이 유효 파라미터들의 선택된 범위 밖에 있으면, 새로운 모델이 거부될 수 있다. 새로운 모델은 또한, 품질 메트릭들, 예를 들어 선택된 에러 메트릭에 대한 측정된 타깃팅 에러들에 관한 피트의 품질에 기초하여 거부될 수 있다. 현재 타깃팅 모델이 타깃 위치에 적용되어, 단계(S331)에서, 교정된 타깃 위치를 생성한다.
단계(S332)에서, 고배율(HM) 이미지가 교정된 타깃 위치에서 획득된다.
도 3c는 "교정 방법 4"에 대한 흐름도를 예시한다. 흐름도에 예시된 단계들은 아래에서 개별적으로 설명된다.
타깃팅 모델은 단계(S341)에서 초기화된다. 이러한 초기화는 항등 맵, 즉, 임의의 타깃 위치가 주어지면, 주어진 타깃 위치와 동일한 교정된 타깃 위치를 리턴하는 모델일 수 있다. 대안적으로, 초기화는 다른 그리드 정사각형으로부터의 타깃들에 대한 모델 피트로부터의 파라미터들을 복사함으로써 행해질 수 있다.
단계(S342)에서 그리드 정사각형 이미지가 획득된다.
단계(S342)에서 획득된 그리드 정사각형 이미지에 기초하여, 단계(S343)에서 타깃 위치들이 식별된다. 이는 전형적으로 홀 발견 알고리즘에 의해 행해지지만, 인간 조작자에 의해 전적으로 보조되거나 수행될 수 있다.
단계(S344)에서, 추가적인 타깃들이 획득을 위해 프로세싱되도록 유지되는지 여부가 체크된다. 유지되지 않으면, 현재 그리드 정사각형에 대한 데이터 획득이 단계(S351)에서 완료된다. 애플리케이션은 다음 그리드 정사각형에서 획득을 계속하기로 결정할 수 있다.
더 많은 타깃들이 프로세싱되도록 유지되면, 단계(S345)에서 다음 타깃이 선택된다.
단계(S346)에서, 교정 기준은 현재 타깃팅 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정한다. 이러한 평가는, 현재 모델을 피팅하는 데 사용되는 이미지들의 획득과 비교하여 광학 설정들이 변경되었는지 여부에 기초하여 행해질 수 있다. 평가는 현재 모델이 피팅되었던 그리드 정사각형과 비교하여 현재 그리드 정사각형에 대한 이전 지식에 추가로 기초할 수 있다. 예를 들어, 이러한 이전 지식은 높이 편차, 오염 레벨, 균열들 등의 추정을 포함할 수 있다. 평가는 마지막 교정 이후의 시간, 총 드리프트 추정, 또는 이들의 조합에 추가로 기초할 수 있다.
현재 모델이 유효하면, 단계(S348)에서 그 현재 모델은 현재 타깃 위치를 교정하기 위해 즉시 적용된다. 그렇지 않으면, 단계(S347)에서, 새로운 타깃팅 모델이 지금까지 이용가능한 데이터 쌍들 에 피팅되며, 여기서 i번째 위치에 대해, 는 교정된 타깃 위치이고, 는 측정된 타깃팅 에러이다. 이러한 새로운 타깃팅 모델은 다음 반복을 위한 새로운 현재 타깃팅 모델인 것으로 취해질 수 있다. 이러한 모델 업데이트는 모델 품질 체크들을 겪을 수 있다. 예를 들어, 파라미터들이 유효 파라미터들의 선택된 범위 밖에 있으면, 새로운 모델이 거부될 수 있다. 새로운 모델은 또한, 품질 메트릭들, 예를 들어 선택된 에러 메트릭에 대한 측정된 타깃팅 에러들에 관한 피트의 품질에 기초하여 거부될 수 있다.
현재 타깃팅 모델이 타깃 위치에 적용되어, 단계(S348)에서, 교정된 타깃 위치를 생성한다.
단계(S349)에서, 고배율(HM) 이미지가 교정된 타깃 위치에서 획득된다.
교정된 타깃 위치에서의 타깃팅 에러는 단계(S350)에서, 교정된 타깃 위치에서의 그리드 정사각형 이미지의 크롭을 단계(S349)에서 획득된 이미지와 비교함으로써 측정된다. 이러한 측정은 2개의 이미지들 사이의 시프트를 검출하기 위해 이미지 프로세싱 기법들, 예를 들어 특징 추적, 광학 흐름, 홀 인식, 또는 이미지 등록을 사용하여 수행될 수 있다. 예비로 교정된 타깃 위치에서의 측정된 타깃팅 에러가 저장된다.
추가적인 특정 예에 예시된 제안된 방법에서, 샘플 높이의 변동들이 모델에 의해 고려될 수 있다. 이것이 달성될 수 있는 하나의 방식은 차원 z를 타깃팅 알고리즘에 추가함으로써 이루어진다(아래에서 설명되는 바와 같이, "가상적인 타깃팅 평면"으로부터의 샘플 높이 편차).
타깃팅 에러를 결정하기 위한 기하학적 모델이 도 4에 예시되어 있다. 이러한 모델은 샘플 높이 변동을 고려한다. 단순화를 위해, 이러한 도면은 코마가 없는 피봇 포인트가 대물 렌즈의 중심과 일치한다고 가정한다.
겉보기 타깃팅 에러 벡터는 로서 정의된다. 이러한 벡터들의 x-컴포넌트 및 y-컴포넌트는 Δ = (ex, ey), u = (x, y), 및 u' = (x', y')로서 나타낸다. 샘플이 평탄하고, "이상적인 평탄한 샘플 평면"과 중첩될 때, 조명된 포지션은 수학식들 (1a) 및 (1b)에 의해 주어진다:
x' = x + ex (1a)
z' = h + x tan(α) + ex tan(α) (1b)
유사한 삼각형들을 비교하면, 우리는 수학식 (2)에서 다음과 같다고 결론을 내린다:
f/x = (h + x tan(α) + ex tan(α))/ex (2)
따라서, 타깃팅 에러 ex는 다음과 같은 수학식 (3)을 사용하여 계산될 수 있다:
ex = (xh + x2tan(α))/(f-x tan(α)) (3)
특정 예에서, 제안된 방법은 초기에 위의 수학식을 사용하여 샘플 높이를 근사하며, 이는 샘플이 평탄하고 "이상적인 평탄한 샘플 평면"과 중첩된다고 가정한다. 방법은, 일단 이용가능한 이웃 포지션들로부터 충분한 디포커스 값들이 존재하면, 샘플 높이 변동을 고려하는 더 정확한 높이 외삽 방식으로 스위칭할 것이다. 이러한 접근법은 SPA 샘플의 국소 평활도를 가정한다. 특정 제안된 방법은 (뉴럴 네트워크 기반 이미지 인식을 이용하여) 에러를 계속 모니터링하고, 평활화 함수를 사용하여 샘플 높이의 예측을 즉시 개량할 것이다.
종래의 기법들과 비교하여, 제안된 방법들(이들은 3D-AFIS로 지칭될 수 있음)에 의해 향상들이 제공되며, 이는 다음을 포함한다:
샘플 높이 변동을 고려하는 것,
샘플 높이 예측을 위해 외삽을 사용하는 것,
나머지 에러들의 즉시 모니터링 및 보정.
상세한 예가 도 5의 흐름도에 예시되어 있다. 방법은 단계(S501)에서 시작된다.
종래의 빔 제어 방법들은 단계(S502)에서 수행된다.
단계(S503)에서, 시스템은 (예를 들어, 위에서 설명된 EPU 소프트웨어에서 제공된 것과 같은 "데이터 획득" 사전 설정된 기능을 사용하여) 다음 HM 이미지를 획득한다.
단계(S504)에서, 시스템은 포일 홀 에지가 가시적인지 여부를 결정한다. 가시적이면, 방법은 단계(S505)로 진행한다. 가시적이지 않으면, 방법은 단계(S506)로 진행한다.
단계(S505)에서, 시스템은 먼저, 다음에 의해 u'를 결정한다:
1. 에지의 윤곽을 나타내기 위한 이미지 세그먼트화(segmentation)
2. 기하학적 분석
둘째로, 시스템은 수학식 (4)를 사용하여 에러 벡터를 계산한다:
e = (ex, ey) = u' - u - predicted_optical_error(u') (4)
여기서, 예측된 광학 에러는 디폴트로 세션의 시작 시에 (0, 0)으로 설정된다. 우리는 또한, z' 변화에 의해 도입된 광학 에러가 무시가능하다고 가정하며, 이는 작은 빔 틸트 각도를 고려하여 유효하다.
단계(S506)에서, 시스템은 다음의 2개의 기준들이 충족되는지 여부를 결정한다:
측정된 디포커스로 획득된 HM 이미지들의 임계 "M" 수를 초과하는지
분석된 포일 홀 에지를 갖는 HM 이미지들의 임계 "N" 수를 초과하는지
M&N은 견고성을 보장하기 위해 사용자에 의해 설정된 양의 정수 파라미터들이다. 이들은 실험 유형에 기초하여 결정될 수 있다.
둘 모두의 기준들이 충족되면, 방법은 단계(S509)로 진행한다. 하나 또는 둘 모두의 기준들이 충족되지 않으면, 방법은 단계(S507)로 진행한다.
단계(S507)에서, 시스템은 샘플이 평탄하다고 가정하고, α를 사용하여 z를 추정한다.
단계(S508)에서, 시스템은 개선된 빔 제어를 수행하며, 여기서 x, y, z 및 함수 predict_optical_error(., .)는 다음 HM 영역에 대한 빔/이미지 틸트/시프트를 예측하는 데 사용된다. 그것은 z = 0일 때 동일할 것이다.
단계(S509)에서, 시스템은 이전에 알려진 파라미터들로서 f 및 α를 사용하여, 이전에 획득된 HM 이미지들로부터의 모든 x, y, b, 및 z를 사용하여 z를 외삽하고 결정한다. 여기서, b는 톤 링(Thon ring) 측정된 디포커스와 대물 렌즈 디포커스 사이의 차이로서 정의된다. 그것은 이상적인 평탄한 샘플 평면으로부터의 샘플의 높이 및 샘플의 틸트의 국부 편차로부터의 기여들을 이용하여 "가상적인 타깃팅 평면"으로부터의 샘플 높이 편차를 측정한다.
빔 각도에서 홀수 차수인 수차들(예컨대, 1차인 포커스 및 비점수차, 및 3차인 구면 수차)이 관찰될 수 있는데, 그 이유는 이러한 홀수-차수 수차들이 이미지의 푸리에 변환에서 소위 "톤 링들"에 영향을 주기 때문이다(톤 링들은 푸리에 변환에서 제로 세기의 링들 또는 타원들임). 이미지의 푸리에 변환은 실시간으로 관찰될 수 있고, 포커스 및 비점수차에 대한 제어부들은 이미지 해상도를 최적화하기 위해 조정될 수 있다. 톤 링 측정된 디포커스와 대물 렌즈 디포커스 사이의 차이는 톤 링들의 포지션 및 타원율(ellipticity)을 분석함으로써 결정될 수 있다.
단계(S510)에서, 시스템은 위의 수학식 (3)을 사용하여 측정된 e와 예측된 e 사이의 차이로 predict_optical_error(.,.) 함수를 피팅&업데이트한다.
이러한 방법에서, 물리적인 근원 원인을 알 필요 없이, 광학 에러들이 모델에서 해결되고 고려된다.
실험 결과들
타깃팅 부정확도는 전형적인 SPA 샘플에 대해 그리고 틸팅된 골드 그리드 샘플에 대해 조사되었다. 먼저, 전체 그리드 정사각형(보정 없음)에 대해 '원시(raw)' 데이터가 수집되었다. 이를 행하기 위해, 다음의 단계들이 수행되었다:
전체 그리드 정사각형이 커버되도록 이미지 시프트 범위를 설정함,
소프트웨어에서 스케일링 및 회전 교정을 스위칭 오프함,
전체 그리드 정사각형에서 모든 포일 홀들의 HM 이미지들을 수집함,
'원시' 타깃팅 에러들(즉, LM으로 기록된 바와 같은 샘플 맵 내의 포지션들과 HM 이미지로부터 측정된 바와 같은 포지션 사이의 차이)을 평가함.
도 6은 생명 과학 샘플에 대해 실험적으로 측정된 타깃팅 에러들을 예시한다. 어떠한 교정도 적용하지 않으면서 이미지 시프트를 갖는 그리드 정사각형 상의 모든 도달가능 위치들을 타깃팅함으로써 에러 측정들이 획득되었다. 벡터 필드 플롯들에서의 각각의 화살표는 하나의 에러 측정을 보여주며, 여기서 벡터의 시작은 그 측정에 대한 타깃 위치에 배치되고, 벡터의 팁(tip)은 측정된 에러만큼 벡터의 시작으로부터 변위된다.
도 6a는 원시 에러 벡터 필드(적용된 보정 없음)를 예시한다. 도 6b는 알려진 기법들(영역들의 ~50%가 >= 50 nm 에러를 가짐)에서 수행된 바와 같이 스케일링 및 회전 교정을 에뮬레이팅한 이후의 잔차 에러 벡터 필드를 예시한다. 도 6c는 본 출원에서 제안된 바와 같은 특정 예시적인 기법들(영역들의 ~7%가 >= 50 nm 에러를 가짐)을 에뮬레이팅한 이후의 잔차 에러 벡터 필드를 예시한다.
도 7은 30°만큼 틸팅된 골드 그리드 샘플에 대한 타깃팅 에러들을 예시한다. 도 7a는 원시 에러 벡터 필드(보정 없음)를 예시한다. 도 7b는 알려진 기법들(영역들의 ~52%가 >= 50 nm 에러를 가짐)에서 수행된 바와 같이 스케일링 및 회전 교정을 에뮬레이팅한 이후의 잔차 에러 벡터 필드를 예시한다. 도 7c는 본 출원에서 제안된 바와 같은 특정 예시적인 기법들(영역들의 < 1%가 >= 50 nm 에러를 가짐)을 에뮬레이팅한 이후의 잔차 에러 벡터 필드를 예시한다.
'원시' 타깃팅 에러들이 도 6a 및 도 7a에 도시되어 있다.
알려진 접근법의 성능이 도 6B 및 도 7b에 예시되어 있다. 이러한 도면들은 알려진 기법들을 사용하여 회전 및 선형 스케일링을 이용한 원시 타깃팅 에러들의 보정들을 예시한다.
마지막으로, 동일한 원시 타깃팅 에러들은 본 출원에 설명된 바와 같은 특정 방법을 사용하여 보정되고: 이는 획득 순서로 포일 홀들을 루프 오버(loop over)하고 가장 가까운 이미 획득된 포일 홀으로부터의 타깃팅 에러를 예측함으로써 행해진다. 결과들은 도 6c 및 도 7c에 도시되어 있다. 모든 경우들에서, 현재 접근법은 50 nm 또는 더 양호한 전역 정확도에 도달하기에 불충분한 것으로 입증되었던 반면, 정확도는 대부분의 포일 홀들에 대한 제안된 기법들을 사용하여 50 nm보다 양호하였다.
도 6c 및 도 7c에 예시된 나머지 에러들의 일부는 제안된 방법들을 사용한 보정 이후의 실제 에러들보다는 포일 홀 중심들의 부정확한 측정으로 인한 것일 수 있다는 것을 유의할 가치가 있다.
이미지의 위상 수차 및 겉보기 비점수차는 "톤 링 피팅"으로 알려진 기법들을 사용하여 결정될 수 있으며, 이는 이미지의 푸리에 변환에서 톤 링들의 포지션 및 타원율을 측정한다. 콘트라스트 전달 함수(CTF)는 수차들이 이미지에 어떻게 영향을 주는지를 수학적으로 설명하며, (디포커스와 같은 다른 파라미터들 중에서) 위상 수차 및 겉보기 비점수차를 정량화하는 파라미터들을 결정하는 데 사용될 수 있다.
전도성 지지 필름은 카메라 FOV 내부에 나타나지 않아서, 캡처된 이미지 모두가 유용하다는 것이 바람직하다. 그러나, 소프트웨어는 포일 홀 에지의 예상된 및 관찰된 포지션들 사이의 불일치들을 관찰함으로써 결정되는 잔차 타깃팅 에러들에 기초하여 모델을 개량한다. 이러한 불일치들을 관찰/측정하기 위해, 포일 홀 에지는 FOV 내에 있을 필요가 있다. 하나의 해결책은 동일한 HM 배율로 더 많은 이미지들: 모델을 개량하기 위한 포일 홀 에지를 포함하는 초기 이미지 및 포일 홀 에지를 포함하지 않는 후속 이미지들을 취하는 것이다. 다른 해결책에서, 보조 HM 이미지들은 고배율 HM 이미지들과 동시에 약간 더 낮은 배율로 획득될 수 있다. 이러한 방식으로, 포일 홀 에지가 없는 이미지를 캡처하는 것과 동시에 포일 홀의 에지를 보기 위해 카메라의 FOV가 넓어진다. 대부분의 현미경 설정들이 동일하기 때문에, 고배율 HM 이미지(포일 홀 에지 없음) 및 저배율 HM 이미지(포일 홀 에지를 포함함)는 동일한 타깃팅 에러를 공유한다. 단지 최종 배율만이 조정되고 단지 약간만 조정된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 나타내지 않으면, 본 명세서에서 용어들의 단수 형태들은 복수형을 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 예를 들어, 문맥상 달리 나타내지 않으면, "a" 또는 "an"과 같은 청구범위를 포함하는 본 명세서의 단일 참조(예컨대, 아날로그-디지털 변환기)는 "하나 이상"(예를 들어, 하나 이상의 아날로그-디지털 변환기)을 의미한다. 본 개시내용의 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐, 단어들 "구비한다", "포함한다", "갖는다" 및 "함유한다" 및 그 단어들의 변형들, 예를 들어 "구비하는" 및 "구비하다" 또는 이와 유사한 것은 "포함하지만 제한되지 않는다"를 의미하고, 다른 컴포넌트들을 배제하도록 의도되지 않는다(그리고 배제하지 않는다).
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 개시내용에 따른 실시예들이 특정 유형들의 디바이스들 및 애플리케이션들(특히 투과 전자 현미경, 단일 입자 분석 및 극저온 전자 현미경)을 참조하여 설명되었고, 실시예들이 그러한 경우 특정 장점들을 갖지만, 본 개시내용에 따른 접근법들은 다른 유형들의 디바이스 및/또는 애플리케이션에 적용될 수 있다. 현미경의 특정 구조적 세부사항들은 (특히 알려진 전자 현미경 시스템 제약들 및 능력들을 고려하여) 잠재적으로 유리하지만, 유사하거나 동일한 동작을 갖는 디바이스들에 도달하기 위해 상당히 변경될 수 있다. 달리 언급되지 않으면, 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징들로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 언급되지 않으면, 개시된 각각의 특징은 일반적인 일련의 동등한 또는 유사한 특징들의 단지 일 예이다.
위의 기법들은 투과 전자 현미경(TEM)과 관련하여 설명된다. 본 기법들은 주사형 터널링 전자 현미경(STEM) 시스템, 주사형 전자 현미경(SEM) 시스템, 이중 빔 현미경 시스템, 및/또는 이온 기반 현미경과 같은 다른 하전 입자 빔 현미경 시스템들에서의 샘플 정렬에 적용될 때 유용할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. TEM 이미징의 본 논의는 단지 하나의 적합한 이미징 양식의 일 예로서 제공된다. 기법들은 또한 시준된 입사 빔에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 예시적인 언어 ("예를 들면", "예컨대", "예를 들어" 및 유사한 언어)의 사용은 단지 본 발명을 더 양호하게 예시하도록 의도되며, 달리 청구되지 않으면 본 발명의 범위에 대한 제한을 나타내지 않는다. 본 명세서의 어떠한 언어도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 명세서에 설명된 임의의 단계들은 달리 언급되지 않거나 문맥상 요구되지 않으면, 임의의 순서로 또는 동시에 수행될 수 있다.
본 명세서에 개시된 양태들 및/또는 특징들 모두는 그러한 특징들 및/또는 단계들 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합들을 제외하고 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 보상 파라미터들의 세트를 결정하고 보상 파라미터들의 세트를 측정들에 적용하는 양태들과 같이, 추가적인 이점을 갖는 양태들의 특정 조합들이 존재할 수 있다. 특히, 본 발명의 바람직한 특징들은 본 발명의 모든 양태들에 적용가능하며 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 마찬가지로, 필수적이지 않은 조합들로 설명된 특징들은 별개로 사용될 수 있다(조합되지 않음).
애플리케이션이 "홀수" 및 "짝수" 차수의 수차들을 참조하는 경우, 이는 이는 (위상 의존성보다는) 각도 의존성의 차수에 대한 참조이다. 다시 말하면, 홀수 차수의 수차들은 1차인 포커스 및 비점수차, 및 3차인 구면 수차를 포함한다. 짝수 차수의 수차들은 축상 및 축외 코마를 포함할 수 있다.

Claims (15)

  1. 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법으로서,
    제1 배율로 샘플의 기준 이미지를 획득하는 단계;
    상기 기준 이미지에서 식별된 제1 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
    상기 투과 전자 현미경의 전자 빔을 상기 타깃 위치로 조향하는 단계,
    상기 제1 배율보다 큰 제2 배율로 상기 샘플의 교정 이미지를 획득하는 단계, 및
    상기 교정 이미지 내의 상기 타깃 위치의 예상된 포지션과 상기 교정 이미지 내의 상기 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트(apparent shift)를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 단계,
    상기 제1 복수의 타깃 위치들 및 대응하는 겉보기 시프트들을 사용하여 비선형 모델을 훈련시키는 단계;
    상기 비선형 모델에 기초하여, 다음 타깃 위치에 대한 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계;
    상기 전자 빔을 상기 교정된 타깃 위치로 조향하고, 상기 제1 배율보다 큰 제3 배율로 이미지를 획득하는 단계를 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    각각의 타깃 위치의 크기가 시작으로부터 끝까지 증가하도록 상기 제1 복수의 타깃 위치들을 순서화하는 단계; 및/또는
    상기 타깃 위치의 각도가 시작으로부터 끝까지 평활하게 변경되도록 상기 제1 복수의 타깃 위치들을 순서화하는 단계를 더 포함하며;
    상기 기준 이미지에서 식별된 상기 제1 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해, 상기 방법은 상기 비선형 모델에 기초하여, 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계를 더 포함하고,
    상기 전자 빔을 상기 타깃 위치로 조향하는 단계는 상기 교정된 타깃 위치를 빔 조향 프로세스에 입력하는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 상기 교정된 타깃 위치 및 대응하는 겉보기 시프트에 기초하여, 각각의 겉보기 시프트를 식별한 이후 상기 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 다음 타깃 위치는 제2 복수의 타깃 위치들 중 하나의 타깃 위치이고, 상기 방법은 상기 제2 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
    상기 비선형 모델에 기초하여, 교정된 타깃 위치를 계산하는 단계,
    상기 전자 빔을 상기 교정된 타깃 위치로 조향하는 단계, 및
    상기 제3 배율로 상기 샘플의 이미지를 획득하는 단계를 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제2 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
    하나 이상의 미리 결정된 기준들에 기초하여, 상기 비선형 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정하는 단계;
    재교정이 요구되면, 상기 제2 배율로 상기 샘플의 이미지를 획득하고, 상기 이미지 내의 상기 타깃 위치의 예상된 포지션과 상기 이미지 내의 상기 타깃 위치의 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하고, 상기 겉보기 시프트에 기초하여 상기 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 제2 복수의 타깃 위치들의 각각의 타깃 위치에 대해,
    하나 이상의 미리 결정된 기준들에 기초하여, 상기 비선형 모델이 여전히 유효한지 여부를 결정하는 단계;
    재교정이 요구되면, 상기 제3 배율로 획득된 대응하는 이미지 내의 상기 제2 복수의 타깃 위치들로부터의 바로 선행하는 타깃 위치의 예상된 포지션과 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하고, 상기 교정된 타깃 위치 및 대응하는 겉보기 시프트에 기초하여 상기 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 복수의 타깃 위치들은 상기 타깃 위치들 및 식별된 겉보기 시프트들이 상기 비선형 모델을 훈련시키기에 충분하도록 선택되어, 상기 비선형 모델이 상기 제2 복수의 타깃 위치들에서 정확한, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기준 이미지에서 관심있는 제3 복수의 타깃 위치들을 식별하는 단계;
    상기 제3 복수의 타깃 위치들의 서브세트로서 상기 제1 복수의 타깃 위치들을 선택하는 단계를 더 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 복수의 타깃 위치들, 상기 다음 타깃 위치, 상기 제2 복수의 타깃 위치들 및/또는 상기 제3 복수의 타깃 위치들 각각에 대해,
    상기 샘플은 각각의 타깃 위치에 근접한 이미지 등록에 적합한 하나 이상의 특징부들을 포함하여, 상기 특징부들 중 하나 이상이 상기 타깃 위치에서 획득된 이미지에서 보이게 하고, 그리고/또는
    각각의 타깃 위치는 상기 현미경의 광학 축으로부터 임계 거리 내에 위치되어, 상기 타깃 위치가 이미지 시프트에 의해 도달가능하게 하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 배율로 상기 샘플의 제2 기준 이미지를 획득하는 단계; 및
    상기 제2 기준 이미지 내의 제2 복수의 타깃 위치들을 식별하는 단계를 더 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비선형 모델은 상기 전자 빔을 상기 타깃 위치로 조향함으로써 획득된 이미지에서 상기 샘플의 특징부의 겉보기 시프트를 추정하도록 구성되는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전자 빔을 조향하는 단계는, 바람직하게,
    입사 전자 빔을 조정하고, 그리고/또는
    투과된 전자 빔을 조정함으로써,
    상기 전자 빔의 틸트(tilt) 및/또는 시프트를 조정하는 단계를 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 교정 이미지 내의 상기 타깃 위치의 상기 예상된 포지션과 상기 교정 이미지 내의 상기 타깃 위치의 상기 관찰된 포지션 사이의 겉보기 시프트를 식별하기 위해 이미지 프로세싱 기법들을 사용하는 단계는,
    조향 모델을 사용하여 상기 교정 이미지 내의 특징부의 예상된 포지션을 결정하는 단계;
    관찰된 포지션에서 상기 교정 이미지 내의 상기 특징부를 식별하는 단계;
    상기 예상된 포지션과 상기 관찰된 포지션 사이의 차이로서 상기 겉보기 시프트를 결정하는 단계를 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 교정 이미지들에 대한 디포커스(defocus) 측정을 획득하는 단계; 및
    상기 디포커스 측정에 기초하여 상기 비선형 모델을 업데이트하는 단계를 더 포함하는, 투과 전자 현미경에 대한 자동화된 데이터 획득 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 구성된 투과 전자 현미경 장치.
  15. 컴퓨터의 프로세서 상에서 실행될 때, 상기 컴퓨터로 하여금 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법을 수행하게 하는 명령어들을 포함하는 컴퓨터 소프트웨어.
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