KR20240038768A - 키메라 단백질 및 면역치료 방법 - Google Patents

키메라 단백질 및 면역치료 방법 Download PDF

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KR20240038768A
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니꼴라 부와제로
따씨앙 쁘띠톰므
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인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
낭트 유니베르시테
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Abstract

암 면역치료요법을 위한 키메라 단백질은 단일 분자에 효능적 특성 및 길항적 특성을 표시함으로써 다른 활성들을 조합할 수 있다. 그러나, 이들은 일반적으로 암 치료와 관련된 조직뿐만 아니라 전체 유기체에 발휘되는 이의 효능과 관련된 독성을 나타낸다. 이는 면역 세포가 면역조절 분자를 발현하는 종양 세포와 상호작용하는 종양 미세환경에 대한 키메라 단백질의 적절한 벡터화(vectorization)를 사용하여 해결할 수 있다.
본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인, (b)는 링커, (b)는 기능성 링커, 및 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인임, 또는 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단, 여기서 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인, (b)는 링커, (b)는 기능성 링커, 및 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인임.

Description

키메라 단백질 및 면역치료 방법
본 발명은 면역치료요법의 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 암을 앓고 있는 대상체(subject)에서 암 치료법을 선택하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
융합 단백질은 상이한 단백질, 또는 단백질의 부분들의 조합에 의해 수득된 인공 단백질이다. 이는 목적한 단백질 또는 단백질의 부분들에 상응하는 개방 판독 프레임(open reading frame)을 포함하는 유전자의 DNA를 재조합하여 생성한 후 수득된다. 융합 단백질은 또한 키메라 단백질(chimeric protein)로 불릴 수 있다.
암 면역치료요법을 위한 고전적인 치료학적 단백질(예컨대, 항체, 리간드)은 효능적(agonistic) 또는 길항적(antagonistic) 활성을 위해 종양 세포 및 면역 세포 둘 다의 표면에 위치한 면역조절 단백질(immunomodulatory protein)을 표적화 한다. 암 면역치료요법을 위한 키메라 단백질은 단일 분자에 효능적 특성 및 길항적 특성 둘 다를 표시함으로써 이러한 활성을 조합할 수 있다. 그러나, 이들은 일반적으로 암 치료와 관련된 조직뿐만 아니라 전체 유기체에 발휘되는 이의 효능과 관련된 독성을 나타낸다. 이는 면역 세포가 면역조절 분자를 발현하는 종양 세포와 상호작용하는 종양 미세환경에 대한 키메라 단백질의 적절한 벡터화(vectorization)를 사용하여 해결할 수 있다. 이러한 벡터화는 종양에서 특이적으로 복제하는 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus)와 같은 바이러스 벡터를 포함한 유전자 치료요법 벡터에 키메라 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입함으로써 달성될 수 있다. 종양에 대한 이러한 특정의 벡터화는 강력한 키메라 단백질의 현장 발현(onsite expression)을 보장하며, 이는 이의 독성을 제한하면서 이의 항-종양 효능을 증진시키는 것으로 예측된다. 이렇게 향상된 안전성은 추가의 기능성 도메인으로 보충될 수 있는 키메라 단백질의 추가 가공을 위한 기회를 제공하며, 이는 다른 면역 메커니즘을 활성화하여 면역자극 특성을 강화할 것이다.
본 발명은 암을 앓고 있는 대상체에서 암 치료법을 선택하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 청구범위에 의해 정의된다.
본 발명자들은 상이한 병리학적 맥락(예컨대, 암, 이식, 알레르기, 자가면역질환)에서 세포-표적화된 면역반응을 구체적으로 및 세밀하게 역전시키기 위한 신규의 면역치료학적 분자를 구축하였다.
표적 종양 세포에 대해 지시된 면역 반응을 향상시키는 것이 목표인 암 면역치료요법의 맥락에서, 이러한 분자는 표적 세포의 면역 인식과 이웃하는 면역 세포의 활성화를 증진시켜 구체적이고, 국재화되고 장기-지속적인 항-종양 면역 반응을 유발한다.
표적화된 자체 세포 또는 이식된 세포에 대한 면역 반응을 최소화하는 것이 목표인 자가면역 질환, 알레르기, 이식의 문맥에서, 이러한 분자는 표적 세포의 면역 인식을 억제하고 주변 면역 세포를 관용하여 시간에 걸쳐 세포 및 조직 파괴로부터 환자를 보호할 것이다.
키메라 단백질
제1 대상에서, 본 주사는 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다:
- N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이거나 또는
- N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서: (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체(homotrimeric) 또는 이종삼량체(heterotrimeric)) 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체(예를 들어, 동종이량체(homodimeric), 이종이량체(heterodimeric)) 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 도메인이다.
제2 대상에서, 본 주사는 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다:
- N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이거나 또는
- N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서: (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 표적화 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 표적화 도메인(a) 및/또는 표적화 도메인(c)로 구성된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질에 관한 것이다: N 말단 - (a) - (c) - (b) - C 말단, 여기서 (c)는 단량체 도메인, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 도메인 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 면역 파괴 또는 보호 또는 면역 재프로그래밍(immune reprogramming)을 위해 표적화될 세포의 표면에서 분자에 특이적으로 결합하는 표적화 도메인(a)을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 면역 파괴 또는 보호 또는 면역 재프로그래밍을 위해 표적화될 세포 표면에서 분자에 특이적으로 결합하는 표적화 도메인(c)을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 신호전달 도메인(a) 및/또는 신호전달 도메인(c)으로 구성된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 신호 형질도입 캐스케이드(signal transduction cascade)를 개시하는 신호 전달 도메인(a)을 갖는다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 신호 형질도입 캐스케이드를 개시하는 신호전달 도메인(c)을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 표적화 도메인 및/또는 신호전달 도메인인 도메인 (a)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 표적화 도메인 및/또는 신호전달 도메인인 도메인(c)를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "키메라 단백질"은 원래 별개의 단백질을 암호화한 2개 이상의 유전자의 결합(joining)을 통해 생성된 단백질을 지칭한다. 이 융합 유전자의 해독은 각각의 원래 단백질로부터 유래된 기능적 특성을 지닌 단일 또는 다중 폴리펩티드를 생성한다. 키메라 단백질은 천연에서 자연적으로 연결되지 않는 제2의 아미노산 서열에 연결된 제1의 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열은 일반적으로 융합 단백질에 함께 모이는 별개의 단백질로 존재할 수 있거나 이는 일반적으로 동일한 단백질에 존재할 수 있지만 융합 단백질에서 새로운 배열로 놓일 수 있다. 키메라 단백질은 예를 들어, 화학적 합성에 의해, 또는 펩타이드 영역이 목적한 관계로 암호화되어 있는 폴리뉴클레오티드를 생성 및 해독함에 의해 생성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "TAME-IT"는 본 발명의 키메라 단백질을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 뮤린(murine) 리간드(들)/수용체(들)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 사람 리간드(들)/수용체(들)에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 활성인자 단백질이다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 면역 자극 신호의 전달(transmission)을 향상시키고/시키거나, 증가시키고/시키거나 자극하도록 가공된다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 억제인자 단백질이다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 면역 자극 신호의 전달을 억제하고/하거나, 감소하고/하거나 차단하도록 가공된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-PD-L1를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 4-1 BBL; 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-PD-L1/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) HVEM, 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITR; 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD27; 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD28, 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137 및/또는 항-PD-L1/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 항-PD-L1-Fc-LIGHT 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 또는 항-PD-L1-Fc-OX40L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체)이며, 여기서 Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 일부를 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다. 일부 구현예에서, 항-PD-L1은 나노바디(nanobody) 또는 scFv이다. 특수한 구현예에서, 항-PD-L1 나노바디는 KN035(참조: Zhang et al. Cell Discov. 2017; 3: 17004) 또는 5DXW(참조: https://www.rcsb.org/structure/5DXW)이다. 특수한 구현예에서, 항-PD-L1 scFv는 PD-L1이다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 항-PD-L2를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극 수용체와 페어링된다: 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 4-1 BBL; 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40; 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) HVEM; 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITR; 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD27; 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD28; 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30; 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40 및 항-PD-L2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-TIM-3을 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-TIM-3/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-TIM-3/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-TIM-3/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-TIM-3/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-TIM-3/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-TIM-3/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-TIM-3/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-TIM-3/TL1 A 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 및 항-TIM-3/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 항-TIM3-Fc-OX40L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체)이며, 여기서 Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 하나의 단백질을 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-CTLA-4을 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-CTLA-4/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 4-1 BBL; 항-CTLA-4/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-CTLA-4/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-CTLA-4/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-CTLA-4/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-CTLA-4/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-CTLA-4/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-CTLA-4/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-CTLA-4 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-CTLA-4/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L. 일부 구현예에서, 항-CTLA-4는 scFv이다. 특수한 구현예에서, 항-CTLA-4 scFv는 aCTLA-4이다 (참조: Griffin et al. J Immunol 2000 May 1;164(9):4433-42).
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-TIGIT를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 4-1 BBL; 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-TIGIT/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-TIGIT/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-VISTA를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-VISTA/4-1 BBL 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-VISTA/OX-40L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-VISTA/LIGHT 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-VISTA/GITRL 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-VISTA/CD70 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-VISTA/CD30L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-VISTA/CD40L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-VISTA/CD137L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-VISTA/TL1A 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 및 항-VISTA/OX40L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체).
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-BTLA를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-BTLA/4-1 BBL 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-BTLA/OX-40L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-BTLA/LIGHT 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-BTLA/GITRL 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-BTLA/CD70 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-BTLA/CD30L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-BTLA/CD40L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-BTLA/CD137L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 항-BTLA/TL1A 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체); 및 항-BTLA/OX40L 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체).
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-CD172a(SIRP1 a)를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-CD172a(SIRP1 a)/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 4-1 BBL; 항-CD172a(SIRP1 a)/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-CD172a(SIRP1 a)/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-CD172a(SIRP1 a)/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-CD172a(SIRP1 a)/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-CD172a(SIRP1 a)/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-CD172a(SIRP1 a)/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-CD172a(SIRP1 a)/ 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-CD172a(SIRP1 a)/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 항-CD172a(SIRP1 a)-Fc-CD40L 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 또는 CD172a(SIRP1a)-Fc-LIGHT 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체)이며, 여기서 Fc는 항체의 Fc 도메인의 적어도 하나의 단백질을 포함하고 이황화 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-CD115를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-CD115/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-CD115/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-CD115/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-CD115/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-CD115/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-CD115/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-CD115/ 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-CD115/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-TMIGD2를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-TMIGD2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-TMIGD2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-TMIGD2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-TMIGD2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-TMIGD2/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-TMIGD2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-TMIGD2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-TMIGD2/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-CD200를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-CD200/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-CD200를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-CD200/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-CD200/ 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-CD200/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-CD19를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-CD19/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 4-1 BBL; 항-CD19/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-CD19/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-CD19/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-CD19/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-CD19/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-CD19/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-CD19/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-CD19/ 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-CD19/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L. 일부 구현예에서, 항-CD19는 나노바디(nanobody) 또는 scFv이다. 특수한 구현예에서, 항-CD19 scFv는 aCD19이다 (참조: Ng et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Sep 4;109(36):14526-31).
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-MSLN(즉, 항-메소텔린(mesothelin))를 포함하고, 다음과 같은 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 면역 자극제와 페어링된다: 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 4-1 BBL; 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX-40L; 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) LIGHT; 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) GITRL; 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD70; 항-MSLN/단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD30L; 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD40L; 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) CD137L; 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) TL1A; 및 항-MSLN/ 단량체 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체, 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) OX40L. 일부 구현예에서, 항-MSLN는 나노바디(nanobody)이다. 특수한 구현예에서, 항-MSLN 나노바디는 A1이다(Prantner et al, J Biomed Nanotechnol. 2015 Jul;11(7):1201-12).
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 사람 키메라 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 뮤린 키메라 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 설치류 키메라 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 고양이과(feline) 키메라 단백질, 포유동물이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 개과(canine) 키메라 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 영장류 키메라 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 비-사람(즉, 사람 이외의 다른 종) 키메라 단백질이다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-PD-L1]-[TAA]n-[이량체 4-1 BBL 및 단량체 OX-40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-PD-L1]-[TAA]n-[이량체 OX-40L 및 단량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-PD-L1]-[TAA]n-[삼량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-PD-L1]-[TAA]n-[삼량체 OX-40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-MSLN]-[TAA]n-[삼량체 OX-40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-PD-L1]-[TAA]n-[삼량체 hCD40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-MSLN]-[TAA]n-[삼량체 hCD40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-MSLN]-[TAA]n-[삼량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-CTLA-4]-[TAA]n-[삼량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-CTLA-4]-[TAA]n-[삼량체 CD40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-CD19]-[TAA]n-[삼량체 CD40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-mPD-L1]-[TAA]n-[삼량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-mPD-L1]-[TAA]n-[이량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [항-mPD1]-[TAA]n-[삼량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
특수한 구현예에서, 키메라 단백질은 [이량체 항-mPD1]-[TAA]n-[삼량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10와 동일하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 약 1 nM 내지 약 5 nM, 예를 들어, 약 1 nM, 약 1.5 nM, 약 2 nM, 약 2.5 nM, 약 3 nM, 약 3.5 nM, 약 4 nM, 약 4.5 nM, 또는 약 5 nM의 KD로 사람 PD-L1 또는 PD-L2에 결합한다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 약 5 nM 내지 약 15 nM, 예를 들어, 약 5 nM, 약 5.5 nM, 약 6 nM, 약 6.5 nM, 약 7 nM, 약 7.5 nM, 약 8 nM, 약 8.5 nM, 약 9 nM, 약 9.5 nM, 약 10 nM, 약 10.5 nM, 약 11 nM, 약 11.5 nM, 약 12 nM, 약 12.5 nM, 약 13 nM, 약 13.5 nM, 약 14 nM, 약 14.5 nM, 또는 약 15 nM의 KD로 사람 PD-L1에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 약 1 nM 내지 약 30 nM, 예를 들어, 약 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 11 nM, 12 nM, 13 nM, 14 nM, 15 nM, 16 nM, 17 nM, 18 nM, 19 nM, 20 nM, 21 nM, 22 nM, 23 nM¸24 nM, 25 nM¸26 nM, 27 nM; 28 nM, 29 nM, 30 nM의 KD로 사람 PD-L1 또는 PD-L2에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 약 1 nM 내지 약 1000 nM, 예를 들어, 약 1 nM, 100 nM, 200 nM¸300 nM¸400 nM, 500 nM¸600 nM, 700 nM, 80 nM, 900 nM, 1000 nM의 KD로 사람 PD-L1 또는 PD-L2에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 (예컨대, 종양에 대한) 면역 활성화를 촉진시킬 수 있고, 촉진시키는 단계를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 면역 억제(예컨대, 종양이 생존하도록 하는)를 억제(suppresing)할 수 있고, 억제하는 단계를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 작제물의 키메라 특성(chimeric natrue)에 의해 제공되는 신호전달의 근접성으로 인해 증진된 면역 활성화 및/또는 면역 억제의 증진된 억제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 면역 반응의 진폭을 조절(예컨대, 효과기 출력(effector output)의 수준의 조절)할 수 있거나, 또는 조절하는 단계를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 예컨대, 암의 치료를 위해 사용되는 경우, 본 키메라 단백질은 제한 없이, 증가된 수준의 사이토킨 생산, 증식 또는 표적 사멸 가능성을 자극하는 단계를 포함하여, T 세포 반응의 진폭을 증가시키기 위해 면역 억제와 비교하여 면역 자극의 정도를 변경시킨다.
일부 구현예에서, 삼량체 신호전달 분자의 사용은 단량체에 비해 치료학적 효능을 증진시킨다.
표적화 도메인 (a) 또는 (c)
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 표적화 도메인 (a) 및/또는 표적화 도메인 (c)를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, 용어, "표적화 도메인"은 관심 조직 또는 기관의 특정 세포 표면에 대한 인식 및 고정(anchoring)의 기능을 갖는 도메인을 지칭한다. 본 발명의 표적화 도메인은 특정 세포, 예를 들면, 종양 세포 또는 면역 세포의 표면 상의 마커를 인식하고; 이는 TAME-IT 분자를 세포 표면에 고정하여 표시하고 표적화된 세포의 내부에서 신호를 전달할 수 있다. 본 발명의 표적하 도메인은 또한 경쟁에 의해 신호를 차단할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 단량체성 표적화 도메인(a) 또는 이량체성(예를 들어, 동종이량체 또는 이종이량체) 표적화 도메인(a) 또는 삼량체성(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 표적화 도메인(a)으로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 단량체성 표적화 도메인(c) 또는 이량체성(예를 들어, 동종이량체 또는 이종이량체) 표적화 도메인(c) 또는 삼량체성(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 표적화 도메인(c)으로 구성된다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인(a) 또는 표적화 도메인(c)은 면역 파괴(예컨대, 종양 세포) 또는 보호(예컨대, 이식된 세포) 또는 면역 재프로그래밍(예컨대, 수지상 세포)을 위해 표적화될 세포 표면에서 분자에 특이적으로 결합한다. 표적화 도메인은 면역 조절인자(예컨대, PD-L1, CTLA-4, TIGIT, TIM-3, VISTA, BTLA, LAG3, CD28) 및 계통-특이적인 항원(예컨대, 메소텔린(mesothelin), CD19, HER2)을 포함하지만 이에 국한되지 않는 하나 이상의 분자를 표적화하도록 가공될 수 있다. 표적화 도메인은 이의 전체 또는 짧은 형태의 항체, 유도체 또는 임의의 다른 표적화 모이어티(예컨대, scFv, 나노바디(nanobody), 단일-도메인 항체, 아피틴(affitin), 아피바디(affibody), 압타머(aptamer)) 또는 표적화된 분자(예컨대, PD-1, CD80/CD86, EGF)와 상호작용하는 것으로 알려진 천연 세포 수용체의 세포외 도메인으로부터 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 예를 들어: CSF1 R, CTLA-4, PD-L1 , PD-L2, PD-1 , BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, VISTA/VSIG8, KIR, 2B4, TIGIT, CD160 (BY55로도 언급됨), CHK 1 및 CHK2 키나제, A2aR, CEACAM (예컨대, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), 및 다양한 B-7 계열 리간드(B7-1 , B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7를 포함하나, 이에 제한되지 않음)를 포함하여, 면역 억제에 관여하는 하나 이상의 분자를 표적화하도록 가공될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은, TIM-3, BTLA, PD-1, CSF1 R, CTLA-4, CD244, CD160, TIGIT, CD172a (SIRP1 a), 2B4, VISTA, VSIG8, CD200 및 TMIGD2 중 하나 이상를 제한없이 포함하는 하나 이상의 분자를 표적화하도록 가공될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은, OX40, SLAMF4, IL-2 R a, 4-1 BB/TNFRSF9, IL-2 R β, ALCAM, BTLA, B7-1, IL-4 R, B7-H3, BLAME/SLAMFS, CEACAM1, IL-6 R, IL-7 Ra, IL-10R a, IL-10R β, IL-12 R β1, IL-12 R β2, CD2, IL-13 R a 1, IL-13, CD3, CD4, ILT2/CDS5j, ILT3/CDS5k, ILT4/CDS5d, ILT5/CDS5a, 루테그린 a4/CD49d, CDS, 인테그린 E/CD103, CD6, 인테그린 a M/CD 1 1 b, CDS, 인테그린 a X/CD1 1 c, 인테그린 β 2/CDIS, KIR/CD15S, CD27/TNFRSF7, KIR2DL1, CD2S, KIR2DL3, CD30/TNFRSFS, KIR2DL4/CD15Sd, CD31/PECAM-1, KIR2DS4, CD40 리간드/TNFSF5, LAG-3, CD43, LAIR1, CD45, LAIR2, CDS3, 류코트리엔 B4-R1, CDS4/SLAMF5, NCAM-L1, CD94, NKG2A, CD97, NKG2C, CD229/SLAMF3, NKG2D, CD2F-10/SLAMF9, NT-4, CD69, NTB-A/SLAMF6, 공통의 γ 쇄/IL-2 R γ, 오스테오폰틴, CRACC/SLAMF7, PD-1, CRTAM, PSGL-1, CTLA-4, RANK/TNFRSF1 1A, CX3CR1, CX3CL1, L- Selectin, SIRP β 1, SLAM, TCCR/WSX-1, DNAM-1, 티모포이에틴, EMPRIN/CD147, TIM-1, EphB6, TIM-2, Fas/TNFRSF6, TIM-3, Fas 리간드/TNFSF6, TIM-4, Fey RII/CD16, TIM-6, TNFR1/TNFRSF1A, 그라눌리신, TNF RIII/TNFRSF1 B, TRAIL RI/TNFRSFIOA, ICAM-1/CD54, TRAIL R2/TNFRSF10B, ICAM-2/CD102, TRAILR3/TNFRSF10C, IFN-yR1, TRAILR4/TNFRSF10D, IFN-γ R2, TSLP, IL-1 R1, LIGHT, LTBR (TNFRSF3) 및 TSLP R의 세포외 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는 사람 백혈구, 골수 세포, 내피 세포 상에 존재하는 하나 이상의 분자를 표적화하도록 가공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "백혈구"는 백혈 세포(white blood cell; WBC) 또는 백혈구로도 알려져 있으며 감염성 질환 및 외부 침입자로부터 신체를 보호하는 데 관여하는 면역계의 세포이다. 모든 백혈구 세포는 조혈줄기세포로 알려진 골수내 다능성 세포에서 생산되고 유래된다. 백혈구는 혈액과 림프계를 포함하여, 몸 전체에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "골수 세포"는 다양한 기능을 지는 광범위한 세포형으로 이루어진, 체내 유핵 조혈 세포를 지칭한다. 이는 단핵구, 대식구, 수지 세포 및 과립구를 포함하고, 면역계의 중요한 부분을 구성한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "림프 세포"는 면역계에서 역할을 하는 세포를 지칭한다. 3 가지의 상이한 림프구 계통: 크기가 작은, B 림프구와 T 림프구, 크고 과립형인 NK 림프구가 존재한다. 림프구는 주로 림프절과 비장에서 발견되는 박은 적혈 혈액 세포(백혈구)이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "섬유아세포"는 세포외 매트릭스와 콜라겐을 합성하고, [1] 동물 조직을 위한 구조적 골격(간질(stroma))을 생산하며 상처 치유에 중요한 역할을 하는 생물학적 세포의 유형을 지칭한다. [2] 섬유아세포는 동물에서 연결 조직의 가장 흔한 세포이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "내피 세포"는 혈관의 투과성 장벽을 지칭하고 혈류 조절에 포함된다. 내피 세포는 상처 치유, 혈관형성, 염증 공정, 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier), 당뇨병 및 기타 심혈관 질환과 관련된 응용 분야에 중요하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프로그램화된 사멸-리간드(Programmed death-ligand) 1"(PD-L1)은 분화 클러스터 274(CD274) 또는 B7 동족체 1(B7-H1)로도 알려져 있으며 사람에서 CD274 유전자(UniProt 번호: Q9NZQ7)에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. PD-L1은 면역계의 적응 아암(adaptive arm)을 억제하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 추측된 40kDa 제1형 막관통 단백질(transmembrane protein)이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성 T-림프구 관련 단백질 4"(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4; CTLA-4)는 CD152(분화 클러스터 152)로도 알려져 있으며 면역 체크포인트로 기능하고 면역 반응을 하향 조절하는 단백질 수용체를 지칭한다. CTLA4는 조절성 T 세포에서 구성적으로 발현되지만 활성화 후 통상의 T 세포에서만 상향 조절된다(UniProt number: P16410). CTLA-4 단백질은 사람에서 CTLA4 유전자에 의해 암호화된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "Ig 및 ITIM 도메인을 지닌 T 세포 면역수용체(T cell immunoreceptor with IG and ITIM domain)"(TIGIT)은 일부 T 세포 및 천연 킬러 세포(natural killer cell; NK) 상에 존재하는 면역 수용체를 지칭한다 (UniProt number: Q495A1).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "T 세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(mucin-domain containing-3)"(TIM-3)은 사람에서 HAVCR2 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 지칭한다(UniProt number: Q8TDQ0).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "V-도메인 면역글로불린 [Ig]-함유 T-세포 활성화 억제제(V-domain immunoglobulin [Ig]-containing suppressor of T-cell activation)"(VISTA)는 면역 체크포인트로서 기능하고 C10orf54 유전자에 의해 암호화되는 제I형 막관통 단백질을 지칭한다(UniProt number: Q9H7M9).
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "B- 및 T-림프구 감쇠제(B- and T-lymphocyte attenuator)"(BTLA)는 사람에서 BTLA 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 지칭한다. BTLA는 CD272(분화 클러스터 272)로도 지정되었다(UniProt number: Q7Z6A9).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "림프구 활성화 유전자 3"(LAG3)은 사람에서 LAG3 유전자에 의해 암호화되고 CD223(분화 클러스터 223)으로도 지정되는 단백질을 지칭한다(Uniprot number: P18627).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "분화 클러스터 28(Cluster of Differentiation)"(CD28)은 T 세포 활성화 및 생존에 요구되는 공-자극성 신호를 제공하는 T 세포에서 발현되는 단백질을 지칭한다(Uniprot number: P10747).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "메조텔린"은 또한 MSLN으로 공지되어 있으며 사람에서 MSLN 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다(Uniprot number: Q13421).
메조텔린은 중피 세포에서 발현되는 40 kDa 단백질이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "B-림프구 항원 CD19" (CD19)는 CD19 분자(분화 클러스터 19), B-림프구 표면 항원 B4, T-세포 표면 항원 Leu-12 및 CVID3으로도 알려져 있으며, 사람에서 유전자 CD19에 의해 암호화된 막관통 단백질을 지칭한다. 사람에서, CD19는 모든 B 계통 세포에서 발현된다. CD19(Uniprot number: P15391).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "수용체 타이로신-단백질 키나제 erbB-2"는 CD340(분화 클러스터 340), 원-발암유전자(proto-oncogene) Neu, Erbb2(설치류) 또는 ERBB2(사람)로도 알려져 있으며, 사람에서 ERBB2 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. ERBB는 조류 게놈에서 분리된 유전자인 적아세포 종양유전자(erythroblastic oncogene) B의 약어이다. 이는 또한 HER2(사람 상피 성장 인자 수용체 2에서 유래) 또는 HER2/neu.HER2로 흔히 불린다. HER2는 사람 상피 성장 인자 수용체(HER/EGFR/ERBB) 계열의 구성원을 지칭한다. 이러한 종양유전자의 증폭 또는 과-발현은 imp Uniprot 번호: P04626)를 수행하는 것으로 나타났다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 항체이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로 목적한 생물학적 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다. 이러한 용어는 Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체(DAB), TandAbs 이량체, Fv, scFv(단일 쇄 Fv), dsFv, ds-scFv, Fd, 선형 항체, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 이중특이적 항체 단편, 비바디(bibody), 트리바디(tribody)(각각 이중특이적 또는 삼중특이적dls scFv-Fab 융합체); sc-디아바디; 카파(람다) 바디(scFv-CL 융합체); BiTE(이중특이적 T 세포 인게이저(Engager), T 세포를 유인하기 위한 scFv-scFv 탄뎀(tandem)); DVD-Ig(이중 가변 도메인 항체, 이중특이적 포맷); SIP(작은 면역단백질, 일종의 미니바디); SMIP("작은 모듈러 면역약제(small modular immunopharmaceutical)" scFv-Fc 이량체; DART(ds-안정화된 디아바디 "이중 친화성 재표적화(Dual Affinity ReTargeting)"); 상어의 IgNAR(면역글로불린 새로운 항원 수용체), 하나 이상의 CDR을 포함하는 작은 항체 모사체 등을 포함한다. 다양한 항체-기반 작제물 및 단편을 제조하고 사용하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(참조: Kabat et al., 1991, specifically incorporated herein by reference). 특히 디아바디는 EP 404,097 및 WO 93/11161에 추가로 기재되어 있지만; 선형 항체는 Zapata et al. (1995)에 기재되어 있다. 항체는 기존 기술을 사용하여 단편화될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 생성시킬 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편은 이황화물 가교를 감소시키기 위해 처리함으로써 Fab' 단편을 생산할 수 있다. 파파인 소화는 Fab 단편의 형성을 초래할 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAb, TandAb, ds-scFv, 이량체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편 및 기타 단편은 또한 재조합 기술에 의해 합성될 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있다. 항체 단편을 생산하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 설명되어 있다. 예를 들억, Beckman et al., 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall et al., 2004; Reff & Heard, 2001 ; Reiter et al., 1996; and Young et al., 1995 각각은 효과적인 항체 단편의 생산를 추가로 기술하며 이를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 제 4,816,567호에 기술된 바와 같은 "키메라" 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 미국 특허 제 6,982,321호 및 7,087,409호에 기술된 바와 같은 사람화된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 사람 항체이다. "사람 항체"는 US 6,075,181 및 6,150,584에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 항체는 EP 0 368684, WO 06/030220 및 WO 06/003388에 설명된 것과 같은 단일 도메인 항체이다.
특수한 구현예에서, 표적화 도메인은 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 배양 시 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생산하기 위해 제공하는 어떠한 기술을 사용하여서도 제조하고 분리할 수 있다. 생산 및 분리 기술은 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인트라바디(intrabody)"는 일반적으로 세포내 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 항체, 특히 단일 쇄 가변 항체 단편(scFv)은 세포내 국재화를 위해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 말토스 결합 단백질과 같은 안정한 세포내 단백질에 대한 융합, 또는 예컨대, 소포체 보유와 같은 세포내 트래피킹(trafficking)/국재화 펩타이드 서열의 첨가를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인트라바디는 단일 도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 단일 도메인 항체이다. 용어 "단일 도메인 항체"(sdAb) 또는 "VHH"는 천연적으로 경쇄가 없는 낙타과(Camelid) 포유동물에서 발견될 수 있는 유형의 항체의 단일 중쇄 가변 도메인을 지칭한다. 이러한 VHH는 또한 "nanobody®"라고 불린다. 본 발명에 따르면, sdAb는 특히 라마(llama) sdAb일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 임의의 차단 항체일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 도메인은 단일 도메인 항체이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단일 도메인 항체"는 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 천연적으로 경쇄가 없는 낙타과 포유동물에서 발견될 수 있는 유형의 항체의 단일 중쇄 가변 도메인을 지칭한다. 이러한 단일 도메인 항체는 VHH 또는 "nanobody®"으로 불린다. (단일) 도메인 항체의 일반적인 설명에 대해서는, 위에 인용된 선행 기술과 EP 0 368　684, Ward et al. (Nature 1989 Oct 12; 341 (6242): 544-6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; 및 WO 06/030220, WO 06/003388을 참고한다. 나노바디는 분자량이 사람 IgG 분자의 대략 1/10이며, 단백질은 물리적 직경이 단지 몇 나노미터이다. 작은 크기의 하나의 결과는 낙타과 나노바디가 보다 큰 항체 단백질에 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 능력인데, 즉, 낙타과 나노바디는 전통적인 면역학적 기술을 사용하여 비밀스러운(cryptic) 항원을 검출하기 위한 시약 및 사용 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서 작은 크기의 또 다른 결과는 나노바디가 표적 단백질의 홈(groove)이나 좁은 틈새(narrow cleft)의 특정 부위에 결합한 결과로 억제할 수 있고, 따라서 전통적인 항체보다 분자량이 낮은 고전적인 저분자 약물의 기능과 더 유사한 능력을 발휘할 수 있다는 것이다. 낮은 분자량과 컴팩트한 크기는 또한 나노바디는 열 안정성이 매우 뛰어나고 극한 pH와 단백질 분해에 안정적이며 항원성이 불량한 나노바디를 생성한다. 또 다른 결과는 나노바디가 순환계에서 조직으로 용이게 이동하고 심지어 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 통과하여 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 혈액 뇌 장벽을 통과하는 약물 수송을 더욱 촉진시킬 수 있다. 2004년 8월 19일 공개된 U.S. 특허 출원 No. 20040161738 참고. 사람에 대한 낮은 항원성과 결합된 이러한 특징은 큰 치료 잠재력을 나타낸다. 단일 도메인 항체의 아미노산 서열 및 구조는 당업계 및 본원에서 "골격 영역 1" 또는 "FR1"; "골격 영역 2" 또는 "FR2"로; "골격 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "골격 영역 4" 또는 "FR4"로 지칭되는 4개의 골격 영역 또는 "FR"로 구성되는 것으로 간주될 수 있으며; 이러한 골격 영역은 당업계에서 각각 "CDR1에 대한 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region for CDR1)"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2" 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로 지칭되는, 3개의 상보적 결정 영역 또는 "CDR"에 의해 차단되어 있다. 따라서, 단일 도메인 항체는 일반 구조: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 지닌 아미노산 서열로 정의될 수 있으며, 여기서 FR1 내지 FR4는 각각 골격 영역 1 내지 4를 지칭하고, 여기서 CDR1 내지 CDR3은 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 단일 도메인 항체의 아미노산 잔기는 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템 아미노산 넘버링(http://imgt.cines.fr/)에 의해 제공된 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단편은 아피바디(affibody), 아필린(affilin), 아피틴(affitin), 아드넥틴(adnectin), 아트리머(atrimer), 에바신(evasin), DARPin, 안티칼린(anticalin), 아비머(avimer), 피노머(fynomer) 및 버사바디(versabody)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체 모사체라고 또한 불리는 비-면역글로불린계 항체로 이식된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 면역 억제 특성을 갖는 제I형 막 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 면역 억제 신호의 전달을 파괴, 차단, 감소 및/또는 억제하도록 가공된다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 종양 세포 표면의 억제 리간드를 차폐하고 면역 억제 리간드를 면역 자극성 리간드로 대체하는 것을 포함하는 방법에서 사용될 수 있거나 그 용도를 찾을 수 있다. 따라서, 본 키메라 단백질은, 구현예에서, 억제성 면역 신호를 감소 또는 제거하고/하거나 면역 자극 신호를 증가 또는 활성화시킬 수 있거나, 또는 이러한 방법을 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 억제 신호를 지닌(따라서 면역 반응을 회피하는) 종양 세포는 종양 세포를 공격할 수 있는 T 세포에 결합하는 양성 신호로 치환될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 억제 면역 신호는 본 작제물에 의해 차폐되고 자극 면역 신호가 활성화된다. 이러한 유익한 특성은 본 키메라 단백질의 단일 작제물 접근법에 의해 향상된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 PD-1 및 PD-L1 또는 PD-L2 및/또는 PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2의 결합을 차단하고/하거나, 감소하고/하거나 억제한다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 CTLA-4의 활성 및/또는 CTLA-4와 AP2M 1, CD80, CD86, SHP-2 및 PPP2R5A 중 하나 이상과의 결합을 차단하고/하거나, 감소하고/하거나 억제한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 GITR 및/또는 GITR과 하나 이상의 GITR 리간드의 결합을 증가하고/하거나 자극한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 OX40 및/또는 OX40과 하나 이상의 OX40 리간드의 결합을 증가시키고/시키거나 자극한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 면역 조절을 향상시키고/시키거나, 회복시키고/시키거나, 촉진하고/하거나 자극할 수 있거나 이를 포함하는 방법에서 용도를 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명의 키메라 단백질은 T 세포, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포(helper cell), 쳔연 킬러(NK) 세포, 천연 킬러 T(NKT) 세포, 항-종양 대식세포(예컨대, M1 대식세포), B 세포, 및 수지상 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 종양 세포에 대한 하나 이상의 면역 세포의 활성 또는 활성화를 회복시키고/시키거나, 촉진하고/하거나 자극한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 비제한적인 예로서, 하나 이상의 T-세포 고유의 신호, 예를 들면, 프로-생존 신호(pro-survival signal); 오토크린(autocrine) 또는 파라크린(paracrine) 성장 신호; p38 MAPK-, ERK-, STAT-, JAK-, AKT- 또는 PI3K-매개된 신호; 및/또는 항-세포자멸사 신호(anti-apoptotic signal); 및/또는 전염증성 사이토킨 생산 또는 T 세포 이주 또는 T 세포 종양 침윤 중 하나 이상을 촉진하고/하거나 이에 필요한 신호를 활성화 및/또는 자극하는 것을 포함하는, T 세포의 활성 및/또는 활성화를 향상시키고/시키거나, 회복시키고/시키거나, 촉진하고/하거나 자극한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 하나 이상의 T 세포(예를 들면, 제한없이, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 천연 킬러 T(NKT)세포), B 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 천연 킬러 T(NKT) 세포, 수지 세포, 단핵구 및 대식세포(예컨대, M1 및 M2 중 하나 이상)의 종양 또는 종양 미세환경 내로의 증가를 유발할 수 있거나, 또는 이를 포함하는 방법에서 용도를 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 면역억제 세포(예를 들어, 골수-유래 억제 세포(MDSC), 조절 T 세포(Treg), 종양 관련 호중구(TAN), M2 대식세포 및 종양 관련 대식세포(TAM)의 종양 및/또는 종양 미세환경(TME)으로의 보충을 억제하고/하거나 유발할 수 있거나, 또는 이를 포함하는 방법에서 용도가 발견된다.
일부 구현예에서, 본 치료요법은 M1 대식세포에 유리하도록 종양 부위 및/또는 TME에서 M1 대 M2 대식세포의 비율을 변경시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 유효량의 본원에 기술된 키메라 단백질을 대상체(subject)에게 투여함을 포함하여, 본 발명의 키메라 단백질은 T 세포 불활성화 및/또는 종양에 대한 면역 관용(immune tolerance)을 억제하고/하거나 감소시킬 수 있고, 이를 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F 및 IL-22 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 다양한 사이토킨의 혈청 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 치료된 대상체의 혈청에서 IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-22, TNFα 또는 IFNγ를 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질의 투여는 TNFα 분비를 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질의 투여는 백혈구에 의한 초항원(superantigen) 매개된 TNFα 분비를 향상시킬 수 있다. 이러한 사이토킨 반응의 검출은 나타된 키메라 단백질에 대한 최적의 투여 요법을 결정하는 방법을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 항-종양 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포의 세포 사멸을 억제하고/하거나, 차단하고/하거나 감소시키거나; 또는 전-종양(pro-tomor) T 세포의 세포 사멸을 자극시키고/시키거나, 유도하고/하거나 증가시킨다. T 세포 고갈은 증식 및 효과기 기능의 점진적인 상실을 특징으로 하는 T 세포 기능 장애 상태이며, 이는 클론 결실(clonal deletion)로 정점에 이른다. 따라서, 전-종양 T 세포는 많은 만성 감염 및 암 중에 발생하는 T 세포 기능 장애 상태를 지칭한다. 이러한 기능 장애는 불량한 증식 및/또는 효과기 기능, 억제 수용체의 지속된 발현 및 기능성 효과기 또는 기억 T 세포와 구별되는 전사 상태에 의해 정의된다. 탈진은 감염과 종양의 최적 제어를 방해한다. 또한, 항-종양 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포는 종양에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 T 세포를 지칭한다. 예시적인 전-종양 T 세포는 하나 이상의 체크포인트 억제 수용체를 발현하는 Treg, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포, Th2 세포 및 Th17 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 체크포인트 억제 수용체는 제어되지 않은 면역 반응을 방지하거나 억제하는 면역 세포에서 발현된 수용체(예컨대, CTLA-4, B7-H3, B7-H4, TIM-3)를 의미한다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 효과기 T 세포 대 조절 T 세포의 비율을 증가시킬 수 있고 이를 포함하는 방법에서, 사용될 수 있다. 예시적인 효과기 T 세포는 ICOS+ 효과기 T 세포; 세포독성 T 세포 {예컨대, αβ TCR, CD3+, CD8+, CD45RO+); CD4+효과기 T 세포 {예컨대, αβ TCR, CD3+, CD4+, CCR7+, CD62Lhi, IL-7R/CD127+); CD8+ 효과기 T 세포 {예컨대, αβ TCR, CD3+, CD8+, CCR7+, CD62Lhi, IL7R/CD127+); 효과기 기억 T 세포{예컨대, CD62Llow, CD44+, TCR, CD3+, IL 7R/CD127+, IL-15R+, CCR7low); 중심 기억 T 세포{예컨대, CCR7+, CD62L+, CD27+; or CCR7hi, CD44+, CD62Lhi, TCR, CD3+, IL-7R/CD127+, IL-15R+); 초기 효과기 기억 T 세포(CD27+ CD62L-) 및 후기 효과기 기억 T 세포(CD27-CD62L-)를 포함하는 CD8+ 효과기 기억 T 세포(TEM) (각각, TemE 및 TemL); CD127(-)CD25(low/-) 효과기 T 세포; CD127( )CD25( ) 효과기 T 세포; CD8+ 줄기세포 기억 효과기 세포(TSCM) {예컨대, CD44(low)CD62L(high)CD122(high)sca(+)); TH1 효과기 T 세포 {예컨대, CXCR3+, CXCR6+ 및 CCR5+; 또는 αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-12R+, IFNyR+, CXCR3+), TH2 효과기 T 세포 {예컨대, CCR3+, CCR4+ and CCR8+; or αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-4R+, IL-33R+, CCR4+, IL-17RB+, CRTH2+); TH9 효과기 T 세포 {예컨대, αβ TCR, CD3+, CD4+); TH17 효과기 T 세포 {예컨대, αβ TCR, CD3+, CD4+, IL-23R+, CCR6+, IL-1 R+); CD4+CD45RO+CCR7+ 효과기 T 세포, CD4+ CD45RO+CCR7( ) 효과기 T 세포; 및 IL-2, IL-4 및/또는 IFN-γ를 분비하는 효과기 T 세포를 포함한다. 예시적인 조절 T 세포는 ICO+ 조절 T 세포, CD4+CD25+FOXP3+ 조절 T 세포, CD4+CD25+ 조절 T 세포, CD4+CD25- 조절 T 세포, CD4+CD25 고 조절 T 세포, TIM-3+ PD-1+ 조절 T 세포, 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3)+ 조절 T 세포, CTLA-4/CD152+ 조절 T 세포, 뉴로필린-1(Nrp-1)+ 조절 T 세포, CCR4+ CCR+ 조절 T 세포, CD62L (L-selectin) + 조절 T 세포, CD45RBIow 조절 T 세포, CD127IOW 조절 T 세포, LRRC32/GARP+ 조절 T 세포, CD39+ 조절 T 세포, GITR+ 조절 T 세포, LAP+ 조절 T 세포, 1 B1 1+ 조절 T 세포, BTLA+ 조절 T 세포, type 1 조절 T 세포 (Tr1 세포), T 헬퍼 형 3 (Th3) 세포, 천연킬러 T 세포 표현형의 조절 세포(NKTregs) CD8+ 조절 T 세포, CD8+CD28- 조절 T 세포 및/또는 IL-10, IL-35, TGF-β, TNF-α, 갈렉틴-1, IFN-Y 및/또는 MCP1을 분비하는 조절 T 세포를 포함한다.
기능성 링커
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 기능적 링커(b)는 특수한 길이 제한 없이 도메인 (a)을 도메인(c)에 연결한다.
일부 구현예에서, 기능적 링커(b)는 특수한 길이 제한 없이 표적화 도메인(a)을 신호전달 도메인(c)에 연결한다.
일부 구현예에서, 기능적 링커(b)는 특수한 길이 제한 없이 신호전달 도메인(a)을 표적화 도메인(c)에 연결한다.
일부 구현예에서, 기능적 링커(b)는 특수한 길이 제한 없이 도메인 (c)을 도메인(a)에 연결한다.
일부 구현예에서, 기능적 링커(b)는 특수한 길이 제한 없이 표적화 도메인 (c)을 신호전달 도메인(a)에 연결한다.
일부 구현예에서, 기능적 링커(b)는 특수한 길이 제한 없이 신호전달 도메인 (c)을 표적화 도메인(a)에 연결한다.
일부 구현예에서, 기능적 링커(b)는 특수한 길이 제한 없이 표적화/신호전달 도메인(a)을 신호전달 도메인/표적화 도메인(c)에 연결한다.
일부 구현예에서, 기능적 링커(b)는 특수한 길이 제한 없이 표적화/신호전달 도메인(c)을 신호전달 도메인/표적화 도메인(a)에 연결한다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 유연성(flexible), 예를 들면, 제한없이 고도의 유연성일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 강성(rigid) 알파 나선을 포함하나, 이에 국한되지 않는 강성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "링커"는 단일 단백질에서 다수의 도메인을 분리하기 위해 천연에서 생성된 짧은 아미노산 서열을 지칭한다.
일부 구현예에서, 링커는 기능성일 수 있다. 예를 들어, 링커는 제한 없이, 본 키메라 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 안정성을 증진시키고/시키거나, 발현을 증진시키고/시키거나, 약동학을 증진시키고/시키거나 생체 활성을 증진시키기 위해 기능할 수 있다. 다른 예에서, 링커는 키메라 단백질을 특정 세포 유형 또는 위치로 표적화하도록 기능할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "기능성 링커"는 자체적으로 면역 메커니즘을 활성화하는 능력을 갖는 링커를 지칭한다. 본 발명의 기능적 링커는 상이한 세포 유형, 예를 들면, TAME-IT 표적화 세포의 식세포작용 시 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)에 의해 또는 표적화된 세포에 의해 직접적으로 주요 조직적합성 복합체 분자에서 프로세싱되고 제시될 종양 항원의 펩타이드 서열을 함유한다. 본 발명의 기능성 링커는 특정 항원(예컨대, 종양-관련 항원, 신생항원, 바이러스 항원)에 대한 면역 반응을 유도한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "종양-관련된 항원"(TAA)은 종양 세포 또는 정상 세포에 존재하는 항원 분자, 예를 들면, 배아 단백질, 당단백질 항원, 편평세포 항원 등을 지칭하며,이는 다수의 종양의 치료에 널리 사용되어 왔다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항원"은 항원-특이적인 항체, B-세포 항원 수용체 또는 T-세포 항원 수용체에 의해 결합될 수 있는 병원체의 외부에 존재할 수 있는 것과 같은 분자 또는 분자 구조를 지칭한다. 신체 내 항원의 존재는 일반적으로 면역 반응을 개시(trigger)한다. 항원은 항체 및 T-세포 항원 수용체에 의해 "표적화" 된다. 각각의 항체 또는 T-세포 항원 수용체는 면역 내 세포가 항원과 접촉한 후 항원과 일치하도록 면역계에 의해 특이적으로 생산되고; 이는 항원을 정밀하게 확인 또는 일치시키고 적응 반응을 시작하도록 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뮤린 항원"은 항원-특이적인 항체, B-세포 항원 수용체 또는 T-세포 항원 수용체에 의해 결합될 수 있는 뮤린 분자 또는 뮤린 분자 구조를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "바이러스 항원"은 이의 숙주에서 면역 반응을 유발하는 바이러스에 의해 방출되는 독소 또는 기타 물질을 지칭한다. 바이러스 단백질은 특정 면역학적 반응에 의해 검출될 수 있는 바이러스 게놈에 의해 명시되는 항원이다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "신생항원(neoantigen)"은 종양 세포내 돌연변이에 의해 생성된 종양 특이적 항원을 주로 지칭하고, 이는 종양 세포에서만 발현된다(11). 신생항원은 바이러스 감염, 대체 스플라이싱(alternative splicing) 및 유전자 재배열에 의해 또한 생성될 수 있다(12-14). 이는 T 세포가 암세포를 인식하는 이상적인 표적이며 강력한 항-종양 면역 반응을 자극할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 기능성 링커는 TAA 펩타이드의 조합을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 기능성 링커는 하나 또는 다수의 TAA 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 기능성 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 TAA 펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 기능성 링커는 동일한 TAA 펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 기능성 링커는 동일한 TAA 펩타이드를 적어도 1, 2, 3, 4, 5개의 카피로 포함하고 다른 TAA 펩타이드를 적어도 1, 2, 3, 4, 5개의 카피로 포함한다.
일부 구현예에서, 종양 또는 세균 및 바이러스와 같은 병원성 미생물에 의해 발현된 항원은 본 발명의 키메라 단백질의 링커(b)에 항원성 펩타이드로서 삽입될 수 있다. 따라서 이러한 키메라 단백질은 환자의 특정 항원의 서열을 사용하여 링커(b)의 항원성 펩타이드를 변화시킴으로써 각 환자에 대해 '개별화'시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 링커는 4개의 글리신과 1개의 세린의 반복체(GGGGS라고도 알려진, G4S 서열), 일반적인 실험실 기술에 의해 특정 항체를 사용하는 단백질 검출을 위한 펩타이드 태그, 주요 조직적합성 복합체의 제I 및 제II 부류 분자 상에 제시될 수 있고 이에 대해 특이적인 면역 반응이 지시될 하나 또는 수개의 확인되고 치료학적으로 관련성이 있는 항원성 펩타이드, 예를 들면, 종양 관련 항원(TAA)(예컨대, NY-ESO-1, 멜란A 항원, MUC-1) 또는 내성 항원(예컨대, MBP, PLP, MOG) 중에서 선택된다. 특정 구현예에서, 링커는 TAA이다.
일부 구현예에서, 링커는 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 이황화물 결합을 형성할 수 있는 이러한 적어도 하나의 시스테인 잔기는 이론에 얽매이기를 바라지 않고, 키메라 단백질의 적절한 다량체 상태를 유지하고 효율적인 생산을 가능하게 하는 역할을 한다.
일부 구현예에서, 생성된 키메라 단백질이 적절하게 폴딩되고/되거나 안정한 다량체 상태로 형성되도록 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하는 링커로 제I형 및 제II형 막관통 단백질 세포외 도메인을 인접시킴(adjoining)을 포함하는, 안정한 키메라 단백질을 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 링커는 천연적으로-발생하는 다중-도메인 단백질로부터 유래될 수 있거나 또는 경험적 링커이며, 이는 예컨대 Chichili et ai, (2013), Protein Sci. 22(2): 153-167, Chen et ai, (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65( 10) : 1357-1369에 기술된 바와 같고, 이들 문헌은 전체 내용이 여기에 참조로서 통합된다. 일부 구현예에서, 링커는 링커 설계 데이터베이스 및 컴퓨터 프로그램을 사용하여 설계할 수 있으며, 이는 Chen et al /., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369 and Crasto ef. a/., (2000), Protein Eng. 13(5):309-312에 기술된 바와 같고, 이들 문헌은 전체 내용이 여기에 참조로서 통합된다.
일부 구현예에서, 링커는 (폴리에틸렌 글리콜) PEG와 같은 합성 링커이다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "PEG"는 석유로부터 유래된 폴리에테르 화합물을 지칭한다. PEG의 구조는 일반적으로 H-(O-CH2-CH2)n-OH로 나타낸다. PEG는 모노(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드와 같은, 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 PEG의 모든 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
일부 구현예에서, 링커는 폴리펩타이드이다. 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연적으로 발생하는 아미노산 뿐만 아니라 천연적으로 발생하는 아미노산 중합체 및 비-천연적으로 발생하는 아미노산 중합체의 인공 화학적 모사체이다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 폴리펩타이드 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체를 암시적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7; 8, 9, 10개의 종양-관련된 항원(TAA)(예컨대, NY-ESO-1, 멜란A 항원, MUC-1)의 연속으로 구성된다.
일부 구현예에서, 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7; 8, 9, 10개의 내성 항원(예컨대, MBP, PLP, MOG)의 연속으로 구성된다.
일부 구현예에서, 링커는 길이가 약 500개 미만의 아미노산, 길이가 약 450개 미만의 아미노산, 길이가 약 400개 미만의 아미노산, 길이가 약 350개 미만의 아미노산, 길이가 약 300개 미만의 아미노산, 길이가 약 250개 미만의 아미노산, 길이가 약 200개 미만의 아미노산, 길이가 약 150개 미만의 아미노산, 또는 길이가 약 100개 미만의 아미노산이다. 예를 들어, 링커는 길이가 약 100개 미만, 약 95개 미만, 약 90개 미만, 약 85개 미만, 약 80개 미만, 약 75개 미만, 약 70개 미만, 약 65개 미만, 약 60개 미만, 약 55개 미만, 약 50개 미만, 약 45개 미만, 약 40개 미만, 약 35개 미만, 약 30개 미만, 약 25개 미만, 약 20개 미만, 약 19개 미만, 약 18개 미만, 약 17개 미만, 약 16개 미만, 약 15개 미만, 약 14개 미만, 약 13개 미만, 약 12개 미만, 약 11개 미만, 약 10개 미만, 약 9개 미만, 약 8개 미만, 약 7개 미만, 약 6개 미만, 약 5개 미만, 약 4개 미만, 약 3개 미만, 약 2개 미만의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커는 유연하다. 다른 구현예에서, 링커는 강성이다.
일부 구현예에서, 링커는 실질적으로 글리신 및 세린 잔기로 구성된다 (예컨대, 약 30%, 또는 약 40%, 또는 약 50%, 또는 약 60%, 또는 약 70%, 또는 약 80%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 97%, 또는 약 98%, 또는 약 99%, 또는 약 100% 글리신 및 세린).
일부 구현예에서, 링커는 항체의 힌지 영역(hinge region)(예컨대, 서브클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 IgA1 및 IgA2)를 포함하는, IgG, IgA, IgD 및 IgE)이다. IgG, IgA, IgD 및 IgE 부류 항체에서 발견되는 힌지 영역은 유연한 스페이서로서 작용하여, Fab 부분이 공간에서 자유롭게 이동할 수 있도록 한다. 불변 영역과 대조적으로, 힌지 도메인은 구조적으로 다양하며, 면역글로불린 부류와 서브부류 중에서 서열과 길이 둘 다가 상이하다. 예를 들어, 힌지 영역의 길이와 유연성은 IgG 서브클래스에 따라 상이하다. IgG1의 힌지 영역은 아미노산 216-231을 포함하며 자유롭게 유연하기 때문에, Fab 단편은 이의 대칭축에 대해 회전할 수 있고 2개의 중쇄 간 이황화물 브릿지 중 첫 번째에 중심이 있는 구 내에서 이동할 수 있다. IgG2는 12개의 아미노산 잔기와 4개의 이황화물 브릿지를 지닌, IgG1보다 더 짧은 힌지를 갖는다. IgG2의 힌지 영역은 글리신 잔기가 부족하고 비교적 짧으며 추가적인 중쇄 간 이황화물 브릿지에 의해 안정화된 강성의 폴리-프롤린 이중 나선을 함유한다. 이러한 특성은 IgG2 분자의 유연성을 제한한다. IgG3은 62개의 아미노산(21개의 프롤린과 11개의 시스테인 포함)을 함유하고 유연하지 않은 폴리-프롤린 이중 나선을 형성하는, 이의 고유한 연장된 힌지 영역(IgG1 힌지의 약 4배 김)에 의해 다른 서브부류와 상이하다. IgG3에서, Fab 단편은 Fc 단편에서 비교적 멀리 떨어져 있어, 분자에 보다 큰 유연성을 제공한다. IgG3의 신장된 힌지는 또한 다른 서브부류와 비교하여 이의 보다 높은 분자량을 담당한다. IgG4의 힌지 영역은 IgG1보다 더 짧고 유연성은 IgG1과 IgG2 사이의 중간이다. 힌지 영역의 유연성은 IgG3>lgG1>lgG4>lgG2의 순서로 감소하는 것으로 알려져 있다. 일부 구현예에서, 링커는 사람 IgG4로부터 유래될 수 있고 이량체화(S228P 포함) 또는 FcRn 결합을 향상시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다.
결정학적 연구에 따르면, 면역글로불린 힌지 영역은 기능적으로 3개의 영역: 상부 힌지 영역, 코어 영역 및 하부 힌지 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. Shin et al. / 1992 Immunological Reviews 130:87 참고. 상부 힌지 영역은 Cm의 카르복실 말단부터 운동을 제한하는 힌지의 첫 번째 잔기, 일반적으로 2개의 중쇄 사이에 쇄간 이황화물 결합을 형성하는 첫 번째 시스테인 잔기까지의 아미노산을 포함한다. 상부 힌지 영역의 길이는 항체의 분절 유연성과 상관관계가 있다. 코어 힌지 영역은 중쇄 간 이황화물 브릿지를 포함하고, 하부 힌지 영역은 CH2 도메인의 아미노 말단 말단을 결합시키며 CH2. ID 내 잔기를 포함한다. 야생-형 사람 IgG1의 코어 힌지 영역에는 Cys-Pro-Pro-Cys 서열이 함유하고, 이는, 이황화물 결합 형성에 의해 이량체화된 경우, 피벗(pivot)으로서 작용하는 것으로 여겨지는 사이클릭 옥타펩타이드를 생성하고, 따라서, 유연성을 부여한다. 일부 구현예에서, 본 링커는 임의의 항체(예컨대, 서브클래스를 포함하는 IgG, IgA, IgD, 및 IgE (예컨대, lgG1 , lgG2, lgG3, and lgG4, 및 lgA1 및 lgA2))의 상부 힌지 영역, 코어 영역 및 하부 힌지 영역 중 1개, 2개 또는 3개를 포함한다. 힌지 영역은 또한 탄수화물 부착을 위한 다수의 구조적으로 구별되는 유형의 부위를 포함하는, 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 예를 들면, IgA1은 힌지 영역의 17개 아미노산 분절 내에 5개의 글리코실화 부위를 함유하며, 이는 분비성 면역글로불린에 유리한 특성으로 간주되는, 장 프로테아제에 대한 힌지 영역 폴리펩타이드의 저항성을 부여한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 항체(예컨대, 서브클래스를 포함하는 IgG, IgA, IgD, 및 IgE (예컨대, lgG1 , lgG2, lgG3, and lgG4, 및 lgA1 및 lgA2))의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 사람 IgG4 항체로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 사람 IgG1 항체로부터 유래된 힌지-CH2-CH3 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 증가된 친화성 및 향상된 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 친화성을 증가시키고 FcRn에 대한 결합을 향상시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 이론에 얽매이지 않고, FcRn에 대한 증가된 친화성 및 향상된 결합은 본 발명의 키메라 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, 링커는 항체의 Fc 도메인을 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "맞춤형 치료요법(personalized therapy)"는 질환을 방지, 진단 또는 치료하기 위한 개체 자신의 유전자 또는 단백질에 관한 정보에 관한 것이다. 암에서, 맞춤형 의학은 개인의 종양에 대한 특정 정보를 사용하여 진단을 내리고, 치료를 계획하고, 치료가 얼마나 효과적으로 작용하는지 알아내거나 예후를 결정하는 데 도움을 준다.
일부 구현예에서, 링커 (b)는 맞춤형 치료요법 관점을 위해 환자에게 적응되도록 상호교환될 수 있다. 종양 또는 세균 및 바이러스와 같은 병원성 미생물에 의해 발현된 항원은 본 발명의 키메라 단백질의 링커(b) 내 항원성 펩타이드로서 삽입될 수 있다. 따라서, 이러한 키메라 단백질은 환자의 특정 항원으로부터의 서열을 사용하여 링커(b)의 항원성 펩타이드를 변화시킴으로써 각 환자에 대해 '개별화'될 수 있다.
신호전달 도메인 (a) 또는 (c)
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 신호전달 도메인(a) 및/또는 신호전달 도메인(c)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 단량체 신호전달 도메인(a) 또는 이량체(예를 들어, 동종이량체 또는 이종이량체) 신호전달 도메인(a) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 신호전달 도메인(a)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 단량체 신호전달 도메인(c) 또는 이량체 신호전달 도메인(c) 또는 삼량체 신호전달 도메인(c)을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "신호전달 도메인"은 표면 분자에 결합하고 세포내 신호 형질도입 캐스케이드를 개시하는 도메인을 지칭한다. '신호전달 도메인'은 TNF 계열의 단량체, 이량체(예를 들어, 동종이량체 또는 이종이량체) 또는 삼량체(예를 들어, 동종삼량체 또는 이종삼량체) 단백질로 구성되며 상이한 면역 세포 유형의 활성화를 자극하는 효능적 특성을 보유한다.
일부 구현예에서, 종양 괴사 인자 상과(Tumor Necrosis Factor Superfamily; TNFSF)로부터의 분자의 경우, 신호 전달 도메인(c) 또는 신호 전달 도메인(a)은 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 리간드의 세포외 도메인의 동종삼량체인 활성형, CD40L(CD154), 4-1BBL(CD137L) 및 OX40L(CD252)을 포함한다. TNFSF는 27 부재로 이루어진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양 괴사 인자 상과"(TNFSF)는 세포외 시스테인-풍부 도메인을 통해 종양 괴사 인자(TNF)에 결합하는 능력을 특징으로 하는 사이토킨 수용체의 단백질 상과를 지칭한다. TNFSF는 리간드의 세포외 도메인의 동종삼량체인, 활성형, 이들 CD40L(CD154), 4-1BBL(CD137L) 및 OX40L(CD252) 중에서 27개 구성원으로 구성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화 클러스터 40"(CD40)은 항원 제시 세포에서 발견되고 이들의 활성화에 필요한 공자극성 단백질을 지칭한다. TH 세포에서 CD40에 대한 CD154(CD40L)의 결합은 항원 제시 세포를 활성화하고 다양한 하부 효과를 유도한다(UniProt number: P25942).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화 클러스터 137 L"(CD137L)은 4-1BBL, 괴사 인자 수용체 상과 구성원 9(TNFRSF9)로도 알려져 있으며 림프구 활성화(ILA)에 의해 유도된다. 4-1BBL은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 계열의 구성원이며 CD4+ 및 CD8+ 계통의 활성화된 T 세포에 의해 발현된다. 4-1 BB Lis는 수지상 세포, B 세포, NK 세포, 호중구 및 대식세포에서도 발현된다(UniProt number: Q07011). CD137 리간드는 수지상 세포, 단핵구/대식세포 및 B 세포와 같은 전문 항원 제시 세포(APC)에서 주로 발현되며, 이들 세포가 활성화되는 동안 그 발현이 상향 조절된다. 그러나, 이의 발현은 다양한 조혈 세포와 비-조혈 세포에서 문서화되었다. 일반적으로, 4-1 BBL/CD137L은 많은 유형의 세포에서 구성적으로 발현되지만 이의 발현 수준은 일부 유형의 세포를 제외하고는 낮다. 흥미롭게도, 4-1 BBL/CD137L은 다양한 유형의 세포에서 CD137(4-1 BB 및 TNFRSF9로도 알려짐)과 공발현되지만, CD137/4-1 BB의 발현은 두 분자 사이의 cis-상호작용에 의해 4-1 BBL/CD137L의 발현을 강력하게 하향조절하여 4-1 BBL/CD137L의 세포내이입(endocytosis)을 야기한다(참조: Byungsuk Kwon et al. Is CD137 Ligand (CD137L) "Signaling a Fine Tuner of Immune Responses?" Immune Netw. 2015 Jun;15(3):121 -124).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "종양 괴사 인자 수용체 상과, 구성원 4" (Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 4; TNFRSF4)는 CD134 및 OX40 수용체로도 알려져 있으며, CD28와 달리, 휴면 나이브(resting naive) T 세포에서 구성적으로 발현되지 않는 TNFR 상과 수용체의 구성원이다(UniProt number: P43489).
일부 구현예에서, 신호전달 도메인(c) 또는 신호전달 도메인(a)은 병리학적 맥락에 따라 관심 면역 세포(예컨대, 수지상 세포, Tregs를 포함한 T 세포, 대식세포, NK 세포, 골수-유래된 억제 세포) 상에서 발현되는 수용체에 대한 특정 효능제로서 작용한다. 신호전달 도메인(c) 또는 신호전달 도메인(a)은 면역 리간드(예컨대, TNFSF 계열, PD-L1, CTLA-4)의 세포외 도메인의 활성형(단량체 또는 다량체)로 이루어진다.
본원에 사용된 용어 "수지상 세포"(dendritic cell: DC)는 포유동물 면역계의 항원-제시 세포(보조 세포(accessory cell)로도 알려짐)를 지칭한다. 이의 주요 기능은 항원 물질을 처리하고 이를 세포 표면의 면역 체계의 T 세포에 제시하는 것이다. 이는 선천 면역계와 적응 면역계 사이의 전령인자(messenger) 역할을 한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "T 세포"는 림프구의 한 유형을 지칭한다. T 세포는 면역계의 중요한 백혈구 중 하나이며 적응 면역 반응에서 중심 역할을 한다. T 세포는 이의 세포 표면에 T-세포 수용체(TCR)가 존재함으로써 다른 림프구와 쉽게 구별될 수 있다. T 세포는 골수에서 발견된, 조혈 줄기 세포에서 발생한다. 이후에, 발달 중인 T 세포가 흉선으로 이동하여 성숙된다. T 세포는 이것이 발달(또는 성숙)하는 기관에서 이의 명칭이 유래되었다. 흉선으로 이주한 후, 전구 세포는 여러 가지 독특한 유형의 T 세포로 성숙된다. T 세포 분화는 흉선을 떠난 후에 또한 계속된다. 특정하고 분화된 T 세포 서브형의 그룹은 면역 반응을 제어하고 형성하는 데 있어 다양한 주요 기능을 갖는다. 이러한 기능 중 하나는 면역-매개된 세포 사멸이며, 이는 CD8+ "킬러" T 세포와 CD4+ "헬퍼" T 세포라는 두 가지 주요 서브형에 의해 수행된다. (이는 세포 표면 단백질 CD8 또는 CD4의 존재에 따라 명명되었다.) "킬러 T 세포"라고도 알려진 CD8+ T 세포는 세포독성이고-이는 이것이 바이러스-감염된 세포 뿐만 아니라 암 세포를 직접 죽일 수 있음을 의미한다. CD8+ T 세포는 또한 사이토킨으로 알려진 작은 신호 단백질을 사용하여 면역 반응을 시작할 때 다른 유형의 세포를 보충할 수 있다. T 세포의 상이한 집단인, CD4+ T 세포는 "헬퍼 세포"로 기능한다. CD8+ 킬러 T 세포와 달리, 이러한 CD4+ 헬퍼 T 세포는 이물질로 확인된 세포를 간접적으로 사멸시킴으로써 기능하는데: 이는 면역계의 다른 부분이 특정 인지된 위협에 반응하는지 여부와 그 방법을 결정한다. 헬퍼 T 세포는 또한 사이토킨 신호 전달을 사용하여 조절 B 세포에 직접적으로 영향을 미치고, 다른 세포 집단에 간접적으로 영향을 미친다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 T 세포" (Treg)는 이전에 억제인자 T 세포(suppressor T cell)로 공지되어 있으며, 면역계를 조절하고 자가-항원(self-antigen)에 대한 내성을 유지하며 자가면역 질환을 방지하는 T 세포의 서브집단을 지칭한다. Treg는 면역억제성이며 일반적으로 효과기 T 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 하향 조절한다. Treg는 바이오마커 CD4, FOXP3 및 CD25를 발현하며 나이브 CD4 세포와 동일한 계통에서 유래된 것으로 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "천연 킬러 세포"(NK 세포)는 거대 과립 림프구(LGL)로도 알려져 있으며 빠르게 확장하는 선천성 림프 세포(ILC) 계열에 속하고 사람에서 모든 순환하는 림프구의 5-20%를 차지하는 선천 면역계에 중요한 세포독성 림프구 유형을 지칭한다. NK 세포의 역할은 척추동물 적응 면역 반응에서 세포독성 T 세포의 역할과 유사하다. NK 세포는 바이러스에 감염된 세포에 대해 신속한 반응을 제공하며, 감염 후 약 3일 정도에 작용하고, 종양 형성에 반응한다. 전형적으로, 면역 세포는 감염된 세포 표면에 제시된 주요 조직 적합성 복합체(MHC)를 검출하여 사이토킨 방출을 개시하고, 용해 또는 세포사멸을 통해 감염된 세포의 사멸을 유발한다. NK 세포는, 그러나, 항체 및 MHC의 부재하에서 스트레스를 받는 세포를 인식하고 사멸시키는 능력을 가짐으로써, 훨씬 빠른 면역 반응이 가능하도록 한다는 점에서 독특하다. 이는 MHC 제1 부류의 "자기" 표지가 결여된 세포를 죽이기 위해 활성화가 필요하지 않다는 인식 때문에 "자연 킬러"로 명명되었다. MHC I 마커가 결여된 유해 세포는 T 림프구 세포와 같은 다른 면역 세포에 의해 감지 및 파괴될 수 없기 때문에 이 역할은 특히 중요하다. NK 세포는 CD56의 존재와 CD3의 부재(CD56+, CD3-)로 확인될 수 있다. NK 세포(선천성 림프구 세포 그룹에 속함)는 공통 림프구 전구 세포와 구별되는 3개의 종류의 세포 중 하나이며, 나머지 2개는 B 림프구와 T 림프구이다. NK세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선, 및 흉선에서 분화하고 성숙하는 것으로 알려져 있고, 흉선에서 이는 순환계로 들어간다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "골수-유래된 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell)"(MDSC)는 골수 계통(골수 줄기 세포에서 유래한 세포의 계열)의 이종 세포 그룹이다. MDSC는 변경된 조혈의 결과로서, 만성 감염 및 암과 같은 병리학적 상황에서 강력하게 확장된다. MDSC는 면역자극 특성보다는 강력한 면역억제 활성을 갖고 있는 다른 골수성 세포 유형과 구별된다. 다른 골수 세포와 유사하게, MDSC는 T 세포, 수지상 세포, 대식세포 및 천연 킬러 세포를 포함한 다른 면역 세포 유형과 상호 작용하여 이의 기능을 조절한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 4-1 BBL, OX-40 리간드(OX-40L), LIGHT(CD258), GITR 리간드(GITRL), CD70, CD30 리간드, CD40 리간드(CD40L), CD137 리간드, TRAIL 및 TL1A 중 하나 이상인 면역 자극 신호의 세포외 도메인의 삼량체를 포함한다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 3개의 동일한 면역 자극 신호의 조합을 포함하며, 여기서 면역 자극 신호는 4-1 BBL, OX-40 리간드 (OX-40L), LIGHT (CD258), GITR 리간드 (GITRL), CD70, CD30 리간드, CD40 리간드 (CD40L), CD137 리간드, TRAIL, 및 TL1A로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 3개의 다른 면역 자극 신호의 조합을 포함하며, 여기서 면역 자극 신호는 4-1 BBL, OX-40 리간드 (OX-40L), LIGHT (CD258), GITR 리간드 (GITRL), CD70, CD30 리간드, CD40 리간드 (CD40L), CD137 리간드, TRAIL, 및 TL1A로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 2개의 동일한 면역 자극 신호와 하나의 다른 면역 자극 신호의 조합을 포함하며, 여기서 면역 자극 신호는 4-1 BBL, OX-40 리간드 (OX-40L), LIGHT (CD258), GITR 리간드 (GITRL), CD70, CD30 리간드, CD40 리간드 (CD40L), CD137 리간드, TRAIL, 및 TL1A로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 이의 폴딩 또는 리간드/수용체 상호작용을 증진시키도록 변형된 면역 자극 신호의 세포외 도메인의 삼량체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "LIGHT"는 종양 괴사 인자 상과 구성원 14(TNFSF14)로도 알려져 있으며, TNF 상과의 분비된 단백질이다. 이는 헤르페스바이러스 진입 매개인자(herpesvirus entry mediator; HVEM)와 데코이 수용체(decoy receptor) 3에 의해 인식된다(UniProt number: O43557).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "종양 괴사 인자 리간드 상과 구성원 18" (TNFSF18)은 GITR 리간드(GITRL)로도 알려져 있으며 사람에서 TNFSF18 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다(UniProt number: Q9UNG2).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분화 클러스터 70"(CD70)은 사람에서 CD70 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다.[1] CD70은 CD27의 리간드이다. CD70 단백질은 고도로 활성화된 림프구(T-세포 및 B-세포 림프종 같은)에서 발현된다(UniProt number: P32970).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CD30 리간드"는 TNFRSF8로도 알려져 있으며 종양 괴사 인자 수용체 계열의 세포막 단백질 및 종양 마커이다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 종양 괴사 인자(TNF) 리간드 계열에 속하는 사이토킨이다. 이러한 사이토킨은 수용체 TNFRSF18/AITR/GITR에 대한 리간드이다. 이는 말초 조직에서 T 림프구 생존을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사이토킨은 내피세포에서도 발현되는 것으로 밝혀졌고, T 림프구와 내피세포 사이의 상호작용에 중요한 것으로 고려된다(UniProt number: P28908)
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "TNF-관련 세포사멸-유도 리간드(TRAIL)는 CD253(분화 클러스터 253)으로도 지정되었으며 TNFSF10(종양 괴사 인자(리간드) 상과, 멤버 10)은 세포사멸이라고 불리는 세포 사멸 과정을 유도하는 리간드로 기능하는 단백질을 지칭한다. TRAIL은 대부분의 정상 조직 세포에서 생산되고 분비되는 사이토킨이다. 이는 특정 사멸 수용체에 결합함으로서, 주로 종양 세포에서 세포사멸을 유발한다(UniProt number: P50591).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "종양 괴사 인자 리간드 상과 구성원 15"(TNFSF15)는 TL1A로도 알려져 있으며 종양 괴사 인자(TNF) 리간드 계열에 속하는 사이토킨을 지칭한다. 이는 내피 세포에서 특이적으로 발현된다(UniProt number: O95150).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "삼량체 단백질"은 단백질 또는 핵산과 같은 3개의, 일반적으로 비-공유 결합된 거대분자에 의해 형성된 거대분자 복합체를 지칭한다. 동종삼량체는 세 개의 동일한 분자에 의해 형성될 수 있다. 이종삼량체는 3개의 상이한 거대분자에 의해 형성될 수 있다. 특히, 용어 "삼량체"는 이들 분자 각각의 세포외 도메인 서열의 반복(x3)을 지칭하며 이의 삼량체화된 동족 수용체에 대한 효율적인 결합을 통해 관심 세포의 최적 활성화를 가능하도록 한다.
일부 구현예에서, 신호전달 도메인 (c) 또는 신호전달 도메인 (a)는 삼량체 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 신호전달 도메인 (a) 또는 (c)는 다음과 같은 삼량체 면역 자극제를 포함한다: 삼량체 4-1 BBL; 삼량체 OX-40L; 삼량체 LIGHT; 삼량체 GITRL; 삼량체 CD70; 삼량체 CD30L삼량체 CD40L; 삼량체 HVEM, 삼량체 GITR; 삼량체 CD27; 삼량체 CD28, 삼량체 CD137 및 삼량체 TL1A.
특수한 구현예에서, 본 발명의 신호 전달 도메인은 삼량체 4-1 BBL을 포함한다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 신호 전달 도메인은 링커에 의해 연결되는 3개의 단량체 4-1 BBL을 포함하며, 상기 링커는 4개의 글리신과 1개의 세린의 반복체(G4S 서열), 일반적인 실험실 기술에 의해 특정 항체로 단백질 검출을 위한 펩타이드 태그, 주요 조직적합성 복합체의 제I 및 제II 부류 분자 상에 제시될 수 있고 이에 대해 특이적인 면역 반응이 지시될 하나 또는 수개의 확인되고 치료학적으로 관련성이 있는 항원성 펩타이드 서열, 예를 들면, 종양 관련 항원(TAA)(예컨대, NY-ESO-1, 멜란A 항원, MUC-1) 또는 내성 항원(예컨대, MBP, PLP, MOG) 중에서 선택된다. 특정 구현예에서, 4-1 BBL의 단량체 사이의 링커는 TAA이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 신호 전달 도메인은 4-1 BBL의 2개 단량체 및 1개의 단량체성 OX-40L을 지닌 삼량체 면역 자극제를 포함하며, 여기서 4-1 BBL의 각각의 단량체는 링커에 의해 연결되며, 상기 링커는 4개의 글리신과 1개의 세린의 반복체(G4S 서열), 일반적인 실험실 기술에 의해 특정 항체로 단백질 검출을 위한 펩타이드 태그, 주요 조직적합성 복합체의 제I 및 제II 부류 분자 상에 제시될 수 있고 이에 대해 특이적인 면역 반응이 지시될 하나 또는 수개의 확인되고 치료학적으로 관련성이 있는 항원성 펩타이드 서열, 예를 들면, 종양 관련 항원(TAA)(예컨대, NY-ESO-1, 멜란A 항원, MUC-1) 또는 내성 항원(예컨대, MBP, PLP, MOG) 중에서 선택된다. 특정 구현예에서, 4-1L의 단량체 사이의 링커는 TAA이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 신호 전달 도메인은 삼량체 OX-40L를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 신호 전달 도메인은 링커에 의해 연결되는 3개의 단량체 OX-40L를 포함하며, 상기 링커는 4개의 글리신과 1개의 세린의 반복체(G4S 서열), 일반적인 실험실 기술에 의해 특정 항체로 단백질 검출을 위한 펩타이드 태그, 주요 조직적합성 복합체의 제I 및 제II 부류 분자 상에 제시될 수 있고 이에 대해 특이적인 면역 반응이 지시될 하나 또는 수개의 확인되고 치료학적으로 관련성이 있는 항원성 펩타이드 서열, 예를 들면, 종양 관련 항원(TAA)(예컨대, NY-ESO-1, 멜란A 항원, MUC-1) 또는 내성 항원(예컨대, MBP, PLP, MOG) 중에서 선택된다. 특정 구현예에서, OX-40L의 단량체 사이의 링커는 TAA이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 신호 전달 도메인은 삼량체 CD40L를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 신호 전달 도메인은 링커에 의해 연결되는 3개의 단량체 CD40L를 포함하며, 상기 링커는 4개의 글리신과 1개의 세린의 반복체(G4S 서열), 일반적인 실험실 기술에 의해 특정 항체로 단백질 검출을 위한 펩타이드 태그, 주요 조직적합성 복합체의 제I 및 제II 부류 분자 상에 제시될 수 있고 이에 대해 특이적인 면역 반응이 지시될 하나 또는 수개의 확인되고 치료학적으로 관련성이 있는 항원성 펩타이드 서열, 예를 들면, 종양 관련 항원(TAA)(예컨대, NY-ESO-1, 멜란A 항원, MUC-1) 또는 내성 항원(예컨대, MBP, PLP, MOG) 중에서 선택된다. 특정 구현예에서, CD40L의 단량체 사이의 링커는 TAA이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "삼량체"는 3개의 동일한 단순한 분자 또는 3개의 다른 단순한 분자, 또는 2개의 동일한 단순한 분자와 1개의 다른 단순한 분자로 이루어진 화학적 화합물 또는 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용어 "삼량체"는 동종삼량체 또는 이종삼량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 전달 도메인 (c) 또는 신호 전달 (a)는 단량체이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단량체"는 하나의 더 단순한 분자로 이루어진 화학적 화합물 또는 분자에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 신호 전달 도메인 (c) 또는 신호 전달 (a)는 이량체이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이량체"는 2개의 동일한 단순한 분자 또는 2개의 상이한 단순한 분자로 이루어진 화학적 화합물 또는 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 용어 "이량체"는 동종이량체 또는 이종이량체를 포함한다.
단백질의 벡터화(vectorization)
일부 구현예에서, 본 발명은 이종 핵산의 전달을 위한 벡터에 관한 것이며, 여기서 핵산은 본 발명의 키메라 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질의 벡터화는 임의의 발현 시스템을 사용하고, 복제 및 비-복제 바이러스(예를 들어 종양용해성 바이러스, AAV, 렌티바이러스), mRNA, 플라스미드 및 다른 유전자 치료요법 벡터에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (a) 는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (a) 는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 포함하는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에 관한 것이며, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 백시니아 바이러스(VV)에 관한 것이며, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 포유동물 발현 벡터이다.
원핵생물 및 진핵생물 벡터 둘 다는 키메라 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 원핵 생물 벡터는 이. 콜라이(E. coli) 서열을 기반으로 한 작제물을 포함한다(참고: 예컨대, Makrides, Microbiol Rev 1996, 60:512-538). 이. 콜라이에서 발현을 위해 사용될 수 있는 조절 영역의 비-제한적인 예는 lac, trp, Ipp, phoA, recA, tac, T3, T7 및 APL를 포함한다. 원핵생물 발현 벡터의 비제한적인 예는 Agt11과 같은 Agt 벡터 시리즈(Huynh et al., in "DNA Cloning Techniques, Vol. I: A Practical Approach," 1984, (D. Glover, ed.), pp. 49-78, IRL Press, Oxford) 및 pET 벡터 시리즈(Studier et al., Methods Enzymol 1990, 185:60-89)를 포함할 수 있다. 그러나 원핵생물의 숙주-벡터 시스템은 포유동물 세포의 해독-후 프로세싱의 대부분을 수행할 수 없다. 따라서, 진핵생물의 숙주-벡터 시스템이 특히 유용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 키메라 단백질의 발현을 위해 다양한 조절 영역이 사용될 수 있다. 예를 들어, SV40 초기 및 말기 프로모터, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV) 이미디어트 얼리 프로모터(immediate early promoter) 및 로우스 육종 바이러스 긴 말단 반복체(Rous sarcoma virus long terminal repeat; RSV-LTR) 프로모터가 사용될 수 있다. 포유동물 세포에 유용할 수 있는 유도성 프로모터는 메탈로티오네인 II 유전자, 마우스 유방 종양 바이러스 글루코코르티코이드 반응성 긴 말단 반복체(mouse mammary tumor virus glucocorticoid responsive long terminal repeat; MMTV-LTR), β-인터페론 유전자 및 hsp70 유전자와 관련된 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다(참고: Williams et al., Cancer Res 1989, 49:2735-42; and Taylor et al., Mol Cell Biol 1990, 10:165-75). 열 쇼크 프로모터(heat shock promoter) 또는 스트레스 프로모터(stress promoter)가 또한 재조합 숙주 세포에서 키메라 단백질의 발현을 구동시키는데 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는 발현 제어 영역에 작동가능하게 연결된, 키메라 단백질(및/또는 추가 제제) 또는 이의 상보체를 암호화하는 핵산, 또는 이의 상보체를 포함하며, 이는 포유동물 세포에서 기능성이다. 발현 제어 영역은 작동가능하게 연결된 차단제 및/또는 자극제를 암호화하는 핵산의 발현을 구동시켜 차단제 및/또는 자극제가 발현 벡터로 형질전환된 사람 세포에서 생산되도록 할 수 있다. 발현 제어 영역은 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현에 영향을 미치는 조절성 폴리뉴클레오타이드(때때로 본원에서 성분이라고 함), 예를 들어 프로모터 및 인핸서이다. 본 발명의 발현 벡터의 발현 제어 영역은 사람 세포에서 작동 가능하게 연결된 암호화 핵산을 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 종양 세포이다. 다른 구현예에서, 세포는 비-종양 세포이다. 일부 구현예에서, 발현 제어 영역은 작동 가능하게 연결된 핵산에 조절 가능한 발현을 부여한다. 신호(때때로 자극이라고도 함)는 이러한 발현 제어 영역에 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 신호에 반응하여 발현을 증가시키는 이러한 발현 제어 영역은 종종 유도성이라고 지칭된다. 신호에 반응하여 발현을 감소시키는 이러한 발현 제어 영역은 종종 억제성이라고 지칭된다. 전형적으로, 이러한 성분에 의해 제공되는 증가 또는 감소량은 존재하는 신호의 양에 비례하고; 신호의 양이 많을수록 발현의 증가 또는 감소도 커진다. 일부 구현예에서, 본 발명은 신호에 반응하여 일시적으로 높은 수준의 발현을 일으킬 수 있는 유도성 프로모터의 사용을 고려한다. 예를 들어, 종양 세포 근처에 있는 경우, 이러한 발현 제어 서열을 포함하는 키메라 단백질(및/또는 추가 제제)에 대한 발현 벡터로 형질전환된 세포는 적절한 단서에 형질전환된 세포를 노출시킴으로써 일시적으로 높은 수준의 제제를 생산하도록 유도된다. 예시적인 유도성 발현 제어 영역은 소분자 화합물과 같은 단서로 자극되는 유도성 프로모터를 포함하는 영역을 포함한다. 특정 실시예들은 예를 들어 U.S. 특허 Nos. 5,989,910, 5,935,934, 6,015,709, 및 6,004,941에서 찾을 수 있으며, 그 각각은 그 전체로서 여기에 참조로서 통합된다. 발현 제어 영역 및 유전자자리 제어 영역은 천연 프로모터 및 인핸서 성분과 같은 전-장(full-length) 프로모터 서열 뿐만 아니라 전-장 또는 비-변이체 기능의 전부 또는 일부를 유지하는 하위서열(subsequence) 또는 폴리뉴클레오티드 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "기능성" 및 이의 문법적 변형은, 핵산 서열, 하위서열 또는 단편과 관련하여 사용될 때, 서열이 천연 핵산 서열의 하나 이상의 기능(예컨대, 비-변이체 또는 비-변형된 서열)을 갖는다는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 분비되거나 분비될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "작동 가능한 연결"은 구성성분 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 설명된 구성성분의 물리적 병치를 지칭한다. 핵산과 작동가능하게 연결되는 발현 제어 성분의 예에서, 관계는 제어 성분이 핵산의 발현을 변조하도록 하는 것이다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 제어 영역은 전사된 핵산의 5' 말단 근처 (즉, "상부")에 병치되어 있다. 발현 제어 영역은 또한 전사된 서열의 3' 말단 (즉, "하부")에 위치하거나 전사체 내에(예컨대, 인트론으로) 위치할 수 있다. 발현 제어 성분은 전사된 서열로부터 멀리 떨어져 위치할 수 있다(예컨대, 핵산으로부터 100 내지 500, 500 내지 1000, 2000 내지 5000개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드). 발현 제어 성분의 구체적인 예는 일반적으로 전사된 서열의 5'에 위치하는 프로모터이다. 발현 제어 성분의 또 다른 예는 전사된 서열의 5' 또는 3'에 위치하거나 전사된 서열 내에 위치할 수 있는 인핸서이다.
사람 세포에서 기능성인 발현 시스템은 당업계에 잘 알려져 있으며, 바이러스 시스템을 포함한다. 일반적으로, 사람 세포에서 기능성인 프로모터는 포유동물 RNA 폴리머라제에 결합하고 암호화 서열의 mRNA로의 하부(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 일반적으로 암호화 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는, 전사 개시 영역, 및 전형적으로 전사 개시 부위의 상부에 25-30 염기쌍에 위치한 TATA 박스를 가질 것이다. TATA 박스는 RNA 폴리머라제 II가 올바른 위치에서 RNA 합성을 시작하도록 지시하는 것으로 생각된다. 프로모터는 또한 전형적으로 TATA 박스 상부의 100 내지 200개 염기쌍 내에 위치하는 상부 프로모터 성분(인핸서 성분)을 함유할 것이다. 상부 프로모터 성분은 전사가 시작되는 속도를 결정하고 어느 방향으로든 작용할 수 있다. 프로모터로서 특히 사용되는 것은 포유동물 바이러스 유전자로부터의 프로모터인데, 이는 바이러스 유전자가 흔히 고도로 발현되고 광범위한 숙주 범위를 갖기 때문이다. 예는 SV40 얼리 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 말기 프로모터, 헤르페스 단성 바이러스 프로모터 및 CMV 프로모터를 포함한다. 전형적으로, 포유동물 세포에 의해 인식되는 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열은 해독 정지 코돈의 3'에 위치하는 조절 영역이므로, 프로모터 성분과 함께, 암호화 서열을 플랭킹(flank)한다. 성숙한 mRNA의 3' 말단은 부위 특이적 해독-후 절단 및 폴리아데닐화에 의해 형성된다. 전사 터미네이터 및 폴리아데닐화 신호의 예는 SV40에서 유래된 신호가 포함된다. 인트론은 또한 발현 작제물 내에 포함될 수 있다. 살아있는 세포에 핵산을 도입하는 데 이용가능한 다양한 기술이 존재한다. 시험관 내(in vitro)에서 핵산을 포유동물 세포로 전달하는 데 적합한 기술은 리포솜, 전기천공(electroporation), 미세주입(microinjection), 세포 융합(cell fusion), 중합체-기반 시스템, DEAE-덱스트란, 바이러스 형질도입, 인산칼슘 침전 방법 등의 사용을 포함한다. 생체 내(in vivo) 유전자 전달을 위해, 리포솜을 포함한 다양한 기술과 시약을 사용할 수도 있고; 키토산 및 젤라틴과 같은 천연 중합체-기반 전달 비히클; 바이러스 벡터가 또한 생체내 형질도입에 적합하다. 일부 상황에서, 종양 세포 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 리간드와 같은 표적화제를 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 세포 내 이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어, 특정 세포 유형에 대해 향성(tropic)인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 주기에서 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 세포내 국재화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 표적화 및/또는 흡수를 촉진하기 위해 사용할 수 있다. 수용체-매개된 세포 내 이입 기술은 예를 들어 Wu et al, J. Biol. Chem. 262, 4429- 4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)에 의해 기술되어 있다. 적절한 경우, 유전자 전달 제, 예를 들면, 통합 서열을 또한 사용할 수 있다. 다수의 통합 서열이 당업계에 알려져 있다(참고: 예컨대, Nunes-Duby et al., Nucleic Acids Res. 26:391 -406, 1998; Sadwoski, J. Bacterid., 165:341-357, 1986; Bestor, Cell, 122(3):322-325, 2005; Plasterk et al., TIG 15:326-332, 1999; Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003). 이는 리컴비나제(recombinase) 및 트랜스포사제(transposase)를 포함한다. 예는 Cre(Sternberg and Hamilton, J. Mol. Biol., 150:467-486, 1981 ), 람다(Nash, Nature, 247, 543-545, 1974), Flp (Broach, et al., Cell, 29:227-234, 1982), R (Matsuzaki, et al., J. Bacteriology, 172:610-618, 1990), cpC31 (see, e.g., Groth et al, J. Mol. Biol. 335:667-678, 2004), 슬리핑 뷰티(sleeping beauty), 마리너 계열의 트랜스포사제(transposase of the mariner family)(Plasterk et al., supra), 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 LTR 서열 및 AAV의 ITR 서열과 같은 바이러스 통합을 제공하는 구성성분을 갖는 AAV, 레트로바이러스, 렌티바이러스와 같은 바이러스 통합용 구성성분을 포함한다(Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003). 또한, CRISPR/CAS9, 아연 핑거(zinc finger), TALEN 및 메가뉴클레아제 유전자-편집 기술을 포함하는 키메라 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 삽입하기 위해 직접적이고 표적화된 유전자 통합 전략을 사용할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 바이러스 벡터인 키메라 단백질(및/또는 추가의 제제)의 발현을 위한 발현 벡터를 제공한다. 유전자 치료에 유용한 많은 바이러스 벡터가 알려져 있다(예컨대, Lundstrom, Trends Biotechnol., 21:117, 122, 2003 참조). 예시적인 바이러스 벡터는, 다른 바이러스 벡터 또한 사용될 수 있지만, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 렌티바이러스(LV), 레트로바이러스(RV), 아데노바이러스(AV), 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 동일한 과로부터의 바이러스, 홍역 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스(VV), 점액종 바이러스, 레오바이러스, 파보바이러스, 볼거리 바이러스 및 바이러스를 포함한다. 생체내 용도의 경우, 바이러스 및 아데노바이러스와 같이 숙주 게놈에 통합되지 않는 바이러스 벡터가 사용하기에 적합하다. 바이러스의 예시적인 유형은 신드비스 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis: VEE) 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus; SFV), HSV, 엔테로바이러스, 파라믹소바이러스, 폭스바이러스, 랍도바이러스를 포함한다. 시험관 내 사용의 경우, 레트로바이러스, AAV, 렌티바이러스와 같이 숙주 게놈에 통합되는 바이러스 벡터가 적합하다. 일부 구현예에서, 본 발명은 생체 내에서 고형 종양을 본 발명의 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하여, 생체 내에서 사람 세포를 형질도입하는 방법을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV)이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 재조합 백시니아 바이러스(VV)이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 키메라 단백질을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
발현 벡터는 본 발명의 키메라 단백질을 생산하기 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 시험관 내에서 배양되거나 유전적으로 조작될 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포는 제한 없이, 사람, 원숭이 및 설치류로부터 유래된 세포를 포함한다(참고: 예를 들어, Kriegler in "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual," 1990, New York, Freeman & Co.). 이는 SV40{예컨대, COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 세포주; 사람 배아 신장 세포주{예컨대, 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293, 293-EBNA 또는 293 세포, Graham et al., J Gen Virol 1977, 36:59); 아기 햄스터 신장 세포{예컨대, BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소-세포-DHFR(예컨대, CHO, Urlaub 및 Chasin, Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77:4216); DG44 CHO 세포, CHO-K1 세포, 마우스 세르톨리 세포(mouse Sertoli cell)(Mather, Biol Reprod 1980, 23:243-251); 마우스 섬유아세포{예컨대, NIH-3T3), 원숭이 신장 세포(예컨대, CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, (예컨대, VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 자궁경부암종 세포(예컨대, HELA, ATCC CCL 2); 개과 신장 세포(예컨대, MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포(예컨대, BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포(예컨대, W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포(예컨대, Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유방 종양 세포(예컨대, MMT 060562, ATCC CCL51)를 포함한다. 본원에 기술된 키메라 단백질을 발현하기 위한 예시적인 암 세포 유형은 마우스 섬유아세포주, NIH3T3, 마우스 루이스 폐 암종 세포주, LLC, 마우스 비만세포종 세포주, P815, 마우스 림프종 세포주, EL4 및 이의 난알부민 형질감염체, E.G7, 마우스 흑색종 세포주 B16F10, 마우스 섬유육종 세포주 MC57, 사람 소세포 폐 암종 세포주 SCLC#2 및 SCLC#7을 포함한다.
본 발명의 실시에 유용한 유전자 전달 바이러스 벡터는 분자 생물학 분야에 잘 알려진 방법론을 이용하여 작제될 수 있다. 전형적으로, 전이유전자를 운반하는 바이러스 벡터는 전이유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 적합한 조절 성분 및 세포 형질도입을 매개하는 바이러스 단백질의 생산에 필요한 성분로부터 조립된다.
숙주 세포는 건강한 사람, 암 환자, 감염성 질환 환자, 개인 실험실 기탁물, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)과 같은 공공 배양 컬렉션, 또는 상업적 공급업체를 포함하여 정상 또는 영향을 받는 대상으로부터 수득할 수 있다.
시험관 내, 생체 외 및/또는 생체 내에서 본 키메라 단백질의 생산에 사용될 수 있는 세포는 제한없이, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵구, 과립구와 같은 혈액 세포; 다양한 줄기 또는 전구 세포, 특히 조혈 줄기 또는 전구 세포(예컨대, 골수에서 얻은 것), 제대혈, 말초혈, 태아 간 등을 포함한다. 세포 유형의 선택은 치료 또는 방지되는 종양 또는 감염성 질환의 유형에 따라 달라지며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
치료
일부 구현예에서, 본 발명은 암 및/또는 종양의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 암의 치료는 면역 억제보다 면역 자극을 선호하도록 현재의 키메라 단백질로 면역계를 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 암을 앓고 있는 환자의 치료 또는 방지 방법에 사용하기 위한 키메라 단백질에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 구조를 포함하는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다: N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 구조를 포함하는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다: N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단, 여기서 (a)는 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 구조를 포함하는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다: N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 구조를 포함하는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다: N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 구조를 포함하는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다: N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 구조를 포함하는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다: N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 삼량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 구조를 포함하는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다: N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단, 여기서 (a)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음의 구조를 포함하는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다: N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단, 여기서 (c)는 단량체 도메인이고, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 이량체 도메인이다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 설치류, 고양이과, 개개 및 영장류와 같은 포유동물을 나타낸다. 특히, 본 발명에 따른 대상체는 사람이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 대상체는 암을 앓고 있거나 암에 걸리기 쉽다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 "환자"를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "생물학적 샘플"은 혈청 샘플, 혈장 샘플, 뇨 샘플, 혈액 샘플, 림프 샘플, 또는 조직 생검과 같이 피험자로부터 수득된 임의의 샘플을 지칭한다. 특수한 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 생검이다.
본원에 사용된 바와 같은, "조직"은, 신체 또는 기관의 부분을 참고로 사용된 경우, 일반적으로, 형태학적으로 유사한 세포 및 관련된 부속 세포 및 지지 세포 및 함께 작용하여 체내에서 특정 기능들을 수행하는 세포간 물질, 예를 들면, 세포외 매트릭스 물질, 혈관 공급물, 및 유체의 응집체 또는 집합체를 지칭한다. 일반적으로 동물과 사람에는 4개의 기본 유형의 조직, 예를 들면, 근육, 신경, 상피 및 연결 조직을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상이 암을 앓는 경우, 조직 샘플은 종양 조직 샘플이다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "종양 조직 샘플"은 대상체로부터 유래된 임의의 조직 종양 샘플을 의미한다. 상기 조직 샘플은 시험관 내 평가를 위한 목적을 위해 수득된다. 일부 구현예에서, 종양 샘플은 대상체로부터 절제된 종양으로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 샘플은 대상체의 원발성 종양에서 수행된 생검 또는 대상체의 원발성 종양으로부터 멀리 떨어진 전이성 샘플에서 수행된 생검으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 조직 샘플은 전반적인 1차 종양(전체로서), 종양의 중심으로부터의 조직 샘플, 사전 수술(예를 들면 치료 후 대상체의 추적을 위해)에서 수집된 종양 조직 샘플, 및 원격 전이를 포함한다. 물론, 종양 조직 샘플은 다양한 잘 알려진 수집-후 제조 및 저장 기술(예컨대, 고정, 보관, 냉동 등)에 적용시킬 수 있다. 샘플은 냉장, 냉동, 고정(예컨대, 포르말린 고정) 또는 봉매(예컨대, 파라핀 봉매)시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "암"은 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 신체의 다른 부위에 침입하거나 퍼질 가능성이 있는 비정상적인 세포 성장과 관련된 질환의 그룹을 지칭한다. 용어 "암"은 원발성 암 및 전이성 암 둘 다를 추가로 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 위장, 잇몸, 두부, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁으로부터의 암 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 암은 구체적으로 다음의 조직학적 유형일 수 있지만 이에 한정되지는 않는다: 신생물, 악성; 미분화된 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두암종; 편평 세포 암종; 림프상피 암종; 기저 세포 암종; 모공축암종; 이행세포 암종; 유두상 이행세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 조합된 간세포 암종과 담관암종; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종성 폴립의 선암종; 선암종, 가족성 폴립증 대장균; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 분지 폐포 선암종; 유두상 선암종; 발색성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암종; 호염기구 암종; 투명 세포 선암종; 과립세포암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포상 선암종; 비피막성 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지선암종; 귀지의; 선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인장 고리 세포 암종; 침윤성 덕트 암종; 수질암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파제트 질환; 선상 세포 암종; 선편평암종; 편평화생을 동반한 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 간질 종양; 악성 수막종; 악성 과립막 세포 종양; 및 악성 원형모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 레이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 갈색 세포종; 사구체육종; 악성 흑색종; 무흑색성 흑색종; 표면 확산 흑색종; 거대색소모반의 악성 흑색종; 상피세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구종; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아성 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 간질성 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러리안 혼합 종양; 신모세포종; 간모세포종; 암육종; 악성 중간엽종; 악성 브레너종양; 악성 엽상종양; 윤활막육종; 악성 중피종; 이상세포종; 배아암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 피질옆 골육종; 연골육종; 악성 연골모세포종; 중간엽 연골육종; 뼈의 거대세포종; 유윙 육종; 악성 치성 종양; 법랑모세포돈토육종; 악성 법랑모세포종; 법랑모세포섬유육종; 악성 송과체종; 척색종; 악성 신경교종; 상의세포종; 상의세포종; 원형질 성상세포종; 섬유성 성상세포종; 성상모세포종; 수모세포종, 교모세포종; 핍지신경교종; 희소돌기아세포종; 원시 신경외배엽; 소뇌육종; 신경절신경모세포종; 신경 모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경섬유육종; 악성 신경초종; 악성 과립세포종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨 림프종; 부육아종; 악성 림프종, 소림프구; 악성 림프종, 대세포, 미만성; 악성 림프종, 여포성; 균상 식육종; 기타 명시된 비호지킨 림프종; 악성 조직구증가증; 다발 골수종; 비만세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구백혈병; 비만세포 백혈병; 거핵모세포백혈병; 골수성 육종; 및 털세포 백혈병.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 예방적 또는 방지적 치료 뿐만 아니라 치유적 또는 질환 변형 치료, 예를 들면, 질환에 걸릴 위험이 있거나 질병에 걸린 것으로 의심되는 대상체 뿐만 아니라 질병 또는 질병을 앓고 있는 것으로 진단된 대상체의 치료를 포함하며, 임상적 재발의 억제를 포함한다. 치료는 장애 또는 재발성 장애의 발행을 방지, 치유, 지연, 이의 중증도를 감소, 또는 이의 하나 이상의 증상을 개선시키기 위하여, 또는 이러한 치료의 부재하에서 에측된 것 이상으로 대상체의 생존을 연장시키기 위하여, 의학 장애를 갖거나 또는 궁극적으로 장애를 획득할 수 있는 대상체에게 투여될 수 있다. "치료 요법"은 질병의 치료 패턴, 예컨대, 치료요법 동안 사용된 투여 패턴을 의미한다. 치료 요법은 유도 요법 및 유지 요법을 포함할 수 있다. 어구 "유도 요법" 또는 "유도 기간"은 질환의 초기 치료에 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 지칭한다. 유도 요법의 일반적인 목표는 치료 요법의 초기 기간 동안 피험자에게 높은 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 요법은 (부분적으로 또는 전체적으로) "로딩 요법"을 사용할 수 있는데, 이는 유지 요법 동안 의사가 사용하는 것보다 더 많은 용량의 약물을 투여하는 것, 유지 요법 동안 의사가 약물을 투여하는 것보다 더 자주 약물을 투여하는 것, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 어구 "유지 요법" 또는 "유지 기간"은 질병의 치료 동안 대상체의 유지를 위해, 예컨대, 대상체의 차도를 오랜 일정 기간(수개월 또는 년) 유지하기 위해 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 지칭한다. 유지 요법은 연속 요법(예컨대, 정기적인 간격, 예컨대, 매주, 매월, 매년 등에 약물을 투여) 또는 간헐 요법(예컨대, 중단된 치료, 간헐적 치료, 재발 시 치료 또는 특수한 예정 기준[예컨대, 통증, 질환 징후 등]의 달성 시 치료)을 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 정맥내, 근육내, 장내, 피하, 비경구, 전신, 국부, 척추, 비강, 국소 또는 표피 투여(예컨대, 주사 또는 주입에 의한)와 같이, 신체 외부에 존재하는 물질(예컨대, 단독 또는 고전적 치료와 조합된 카스파제 8의 억제제)을 대상체에게 주사하거나 또는 다른 방식으로 물리적으로 전달하는 행위를 지칭한다. 질환 또는 이의 증상이 치료되는 경우, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발생 후 발생한다. 질환 또는 이의 증상이 방지되는 경우, 물질의 투여는 전형적으로 질환 또는 이의 증상의 발생이 시작되기 전에 발생한다.
"치료학적 유효량"은 목적한 치료 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 약물의 치료학적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 체중, 및 개체에서 목적한 반응을 이끌어내는 약물의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 키메라 단백질 또는 키메라 단백질 부위의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료학적으로 유리한 효과가 더 큰 것이다. 약물의 효율적인 투여량 및 투여량 요법은 치료할 질환 또는 상태에 따라 다르며 당업자에 의해 결정될 수 있다. 당업계에서 통상의 기술을 가진 의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사는 약제학적 조성물에 사용되는 약물의 용량을 목적한 치료학적 효과를 달성하기 위해 요구된 것보다 낮은 수준에서 시작하고 목적한 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 용량은 특수한 투여량 요법에 따라 치료학적 효과를 생산하는데 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 이러한 유효 용량은 일반적으로 위에서 설명한 요인에 의존할 것이다. 예를 들어, 치료학적 용도를 위한 치료학적 유효량은 질환의 진행을 안정화시키는 능력에 의해 측정될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도, 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 요인을 기반으로 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다. 치료적으로 유효한 양의 약물에 대한 예시적이고 비제한적인 범위는 약 0.1-100 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-20 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-10 mg/kg, 예를 들어 약 0.5, 예를 들면, 약 0.3, 약 1, 약 3 mg/kg, 약 5 mg/kg 또는 약 8 mg/kg이다. 본 발명의 키메라 단백질의 치료학적 유효량에 대한 예시적인 비-제한적 범위는 0.02-100 mg/kg, 예를 들면, 약 0.02-30 mg/kg, 예를 들면, 약 0.05-10 mg/kg 또는 0.1-3 mg/kg, 예를 들면, 약 0.5-2 mg/kg이다. 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하 투여일 수 있고, 예를 들면 표적 부위에 근접하게 투여될 수 있다. 상기 치료 방법 및 용도의 투여량 요법은 최적의 원하는 반응(예컨대, 치료학적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있고, 시간이 지남에 따라 수개의 분할 용량이 투여될 수 있거나, 치료학적 상황의 긴급성에 따라 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료의 효능은 치료요법 동안, 예를 들어, 미리 정의된 시점에서 모니터링된다. 비제한적인 예로서, 본 발명에 따른 치료는 24시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간 또는 2시간마다 단일 또는 분할된 용량 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여, 1일당 약 0.1-100 mg/kg, 예컨대 0.2, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/kg의 양으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40일 중 적어도 하나, 또는 대안적으로 치료 개시 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20주 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합으로 본 발명의 제제의 일일 투여량으로 제공될 수 있다.
전형적으로, 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 키메라 단백질을 암호화하는 단백질 또는 유전자는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 대상체에게 투여된다. 이러한 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들면, 사람 혈청 알부민, 완충제 물질, 예를 들면, 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화된 식물성 지방산, 물, 염 또는 전해질, 예를 들면, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방의 부분 글리세라이드 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 피험자에게 투여하는데 사용하기 위해, 조성물은 대상체에게 투여하기 위해 제형화될 것이다. 본 발명의 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로, 흉막내로, 복강내로 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 기술에는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 윤활막내, 흉골내, 척수강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술이 포함된다. 본 발명의 조성물의 멸균 주사용 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중 멸균 주사용 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중 용액일 수 있다. 사용할 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함하여 임의의 부드러운 고정 오일을 사용할 수 있다. 올레산, 및 이의 글리세리드 유도체와 같은 지방산은 특히 폴리옥시에틸화된 버젼의 올리브 오일이나 피마자유와 같은 천연 약제학적으로 허용되는 오일과 같이, 주사제 제조에 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 예를 들면, 카복시메틸 셀룰로오스 또는 유제 및 현탁제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 투여량 형태의 제형에 일반적으로 사용되는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 다른 일반적으로 사용된 표면활성제, 예를 들면, 트윈(Tween), 스판(Span) 및 기타 유화제 또는 약제학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 기타 투여량 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 생체이용성 향상제를 제형의 목적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 캡슐제, 정제, 수성 현탁제 또는 액제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 경구적으로 허용되는 투여량 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제도, 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐제 형태의 경구 투여의 경우, 유용한 희석제는 예를 들어, 락토스를 포함한다. 경구 사용을 위해 수성 현탁제가 필요한 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁화제와 결합한다. 목적한 경우, 특정 감미료, 풍미제 또는 착색제를 또한 첨가할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 직장 투여용 좌제 형태로 투여될 수 있다. 이는 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로 직장에서 녹아 약물을 방출하는 적합한 비-자극성 부형제와 제제를 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 본 발명의 조성물은 특히, 치료 표적이 눈, 피부 또는 하부 장관의 질환을 포함하여, 국소 적용에 의해 쉽게 접근할 수 있는 부위 또는 기관을 포함하는 경우, 국소적으로 투여될 수 있다. 이들 부위 또는 기관 각각에 적합한 국소 제형이 용이하게 제조된다. 국소 적용의 경우, 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 연고로 제제화될 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체는 광 오일, 액체 바셀린, 화이트 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 대안적으로, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체에 현탁되거나 용해된 활성 구성성분을 함유하는 적합한 로션제 또는 크림제로 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 광오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 하부 장관에 대한 국소 적용은 직장 좌약 제형(위 참조) 또는 적합한 관장 제형으로 이루어질 수 있다. 패치를 또한 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약제학적 제형 분야에 널리 공지된 기술에 따라 제조되며, 벤질 알코올 또는 기타 적합한 방부제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 중 액제로 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물에 존재하는 키메라 단백질은 100mg(10mL) 또는 500mg(50mL) 일회용 바이알에 10mg/mL의 농도로 공급될 수 있다. 생성물은 9.0mg/mL의 염화나트륨, 7.35mg/mL의 시트르산나트륨 이수화물, 0.7mg/mL의 폴리소르베이트 80 및 멸균 주사용수로 IV 투여용으로 제형화된다. pH를 6.5로 조정한다. 본 발명의 약제학적 조성물 중 키메라 단백질에 대한 예시적인 적합한 투여량 범위는 약 1mg/m2 내지 500mg/m2사이일 수 있다. 그러나, 이는 예시적이며, 임상 시험에서 결정되어야 하는 약제학적 조성물 중 특수한 항체의 친화성 및 내약성을 고려하여 최적의 스케쥴 및 요법이 조정될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 주사용 약제학적 조성물(예를 들어, 근육내, iv)은 멸균 완충수(예컨대, 근육내의 경우 1 ml), 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예컨대, 약 50 ng 내지 약 30 mg 이상, 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg을 함유하도록 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조합"은 추가(두 번째, 세 번째...) 약물과 함께 첫 번째 약물을 제공하는 모든 형태의 투여를 지칭하는 것으로 의도된다. 약물은 동시, 개별 또는 순차적으로 및 임의의 순서로 투여될 수 있다. 본 발명에 따르면, 약물은 약물이 폐에 도달할 수 있도록 하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 약물은 대상체에게 전신 투여된다(즉, 전신 투여를 통해). 따라서, 일부 구현예에서, 약물은 순환계에 들어가 몸 전체에 분포되도록 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 약물은 국소 투여, 예를 들어 폐에 대한 국소 투여에 의해 대상체에게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조합"은 추가(두 번째, 세 번째...) 약물과 함께 첫 번째 약물을 제공하는 모든 형태의 투여를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 키메라 단백질은 동시, 개별 또는 순차적으로 및 임의의 순서로 투여될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 키메라 단백질은 약물이 신장에 도달할 수 있도록 하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 대상체에게 전신 투여된다(즉, 전신 투여를 통해). 따라서, 일부 구현예에서, 약물은 순환계에 들어가 몸 전체에 분포되도록 대상체에게 투여된다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "조합된 치료", "조합된 치료요법" 또는 "치료요법 조합"은 하나 이상의 의약을 사용하는 치료를 지칭한다. 조합된 치료요법은 이중 치료요법 또는 중복-치료요법(bi-therapy)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 화학적 화합물은 종양 성장을 억제하는데 효과적인 화합물이다. 화학치료제의 예는 티오테파 및 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬술폰산염; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아르니드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 카른프토테신(예를 들면, 합성 유사체 토포테칸); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(예를 들면, 이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(예를 들면, 합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라누스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스 틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로수레아; 에네디인 항생제(예를 들어 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신(11 및 칼리케아미신 211, 예컨대, Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186(1994) 참조)와 같은 항생제; 디네미신 A를 포함하는 디네미신; 에스페라미신; 뿐만 아니라, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카니노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신 (예를 들면, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이단르비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙톰그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사물질, 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-부신제; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파르니드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포 파민; 데메콜신; 디아지콘; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로겐나늄; 테누아존산; 트리아지콘; 2,2',2"- 트리클로로트리에틸아르닌; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브롬톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드, 티오테파, 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스톤 소재) 및 독세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, 프랄스 안토니 소재), 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린, 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들면, 시스플라틴 및 카르보플라틴); 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론, 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 예를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 4(5)-이미다졸을 억제하는 아로마타제, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(파레스턴)을 포함하는 항-에스트로겐과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 항호르몬제 및 플루타미드, 닐루타미드, 비카루타미드, 류프롤라이드, 및 고세렐린과 같은 항0안드로겐; 및 상기 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역치료제"는 면역치료요법에 사용될 수 있는 모든 유형의 화합물을 지칭한다. 본원에 사용된 면역치료요법은 면역 반응을 유도, 향상, 또는 억제함으로써 질환을 치료하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같은, "항-암 면역치료요법"은, 면역계를 자극하여 종양을 거부하고 파괴하도록 한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항암 면역치료제"는 예컨대, 종양-특이적인 항원(TSA), 종양-관련된 항원(TAA), 면역 보조제, 면역 조절제, 항체, 변형된 면역 세포, 사이토킨, 면역 체크포인트 차단 분자, 바이러스와 같은 화합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역 조절제"는 항원에 대한 면역 반응을 원하는 면역 반응으로 조절하는 구성성분이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 면역-조절제일 수 있는 추가 제제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역치료제"는 암 세포에 대한 신체의 면역 반응을 간접적으로 또는 직접적으로 향상, 자극 또는 증가시키고/시키거나 다른 항암 치료요법의 부작용을 감소시키는 화합물, 조성물 또는 치료법을 지칭한다. 따라서 면역치료요법은 암 세포에 대한 면역계의 반응을 직접적 또는 간접적으로 자극하거나 향상시키고/시키거나 다른 항암제에 의해 유발될 수 있는 부작용을 줄이는 치료요법이다. 면역치료요법은 또한 당업계에서 면역 치료요법, 생물학적 치료요법, 생물학적 반응 조절제 치료요법 및 생물치료요법으로도 지칭된다. 당업계에 공지된 일반적인 면역치료제의 예는 면역 체크포인트 억제제, 사이토킨, 암 백신, 모노클로날 항체 및 비-사이토킨 보조제를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 대안적으로, 면역치료요법 치료는 대상체에게 일정량의 면역 세포(T 세포, NK, 세포, 수지 세포, B 세포…)를 투여하는 것으로 이루어질 수 있다. 면역치료제는 비-특이적일 수 있는데, 즉, 인체가 암세포의 성장 및/또는 확산과 싸우는 데 더 효과적이 되도록 일반적으로 면역계를 증강(boost)시킬 수 있거나, 또는 이들은 특이적, 즉 암세포 자체에 표적화될 수 있고 면역치료요법 요법은 비특이적 및 특정 면역치료제의 사용을 조합할 수 있다. 비-특이적 면역치료제는 면역계를 자극하거나 간접적으로 증진시키는 물질이다. 비-특이적인 면역치료제는 암 치료를 위한 주 치료요법으로서 단독으로 사용될 뿐만 아니라, 주요 치료요법 외에, 비-특이적 면역치료제가 다른 치료요법(예컨대: 암 백신)의 효능을 향상시키는 보조제로서 기능하는 요법으로서 사용된다. 비-특이적 면역치료제는 또한 후자의 맥락에서 다른 치료요법의 부작용, 예를 들어 특정 화학치료제에 의해 유발되는 골수 억제를 감소시키는 기능을 할 수 있다. 비-특이적 면역치료제는 주요 면역계 세포에 작용하여 사이토킨 및 면역글로불린 생산 증가와 같은 2차 반응을 유발할 수 있다. 대안적으로, 제제 자체가 사이토킨을 포함할 수 있다. 비-특이적 면역치료제는 일반적으로 사이토킨 또는 비-사이토킨 보조제로 분류된다. 많은 사이토킨이 면역계를 강화하기 위해 고안된 일반적인 비-특이적 면역치료요법, 또는 다른 치료요법과 함께 제공되는 보조제로서 암 치료에 적용되는 것으로 나타났다. 적합한 사이토킨은 인터페론, 인터류킨 및 콜로니-자극 인자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 의해 고려되는 인터페론(IFN)은 IFN의 일반적인 유형, IFN-알파(IFN-α) 및 IFN-베타(IFN-β)를 포함한다. IFN은 암세포의 성장을 늦추고/늦추거나, 보다 정상적인 거동을 하는 세포로의 발달을 촉진하고/하거나, 이의 항원 생성을 증가시킴으로써 암세포를 차폐하여 면역계가 암 세포를 더 쉽게 인식하고 파괴하도록 함으로써, 암세포에 직접적으로 작용할 수 있다. IFN은 또한 예를 들면, 혈관형성을 늦추고/늦추거나, 면역계를 증강시키고/시키거나 천연 살해(NK) 세포, T 세포 및 대식세포를 자극함으로써 암세포에 간접적으로 작용할 수 있다. 재조합 IFN-알파는 Roferon(Roche Pharmaceuticals) 및 Intron A(Schering Corporation)로서 상업적으로 이용 가능하다. 본 발명에 의해 고려되는 인터류킨은 IL-2, IL-4, IL-11 및 IL-12를 포함한다. 시판되는 재조합 인터류킨의 예는 Proleukin®(IL-2; Chiron Corporation) 및 Neumega®(IL-12; Wyeth Pharmaceuticals)를 포함한다. Zymogenetics, Inc.(시애틀, 워싱턴주)는 현재 IL-21의 재조합 형태를 시험하고 있으며, 이는 또한 본 발명의 조합물에 사용하기 위해 고려된다. 본 발명에 의해 고려되는 콜로니-자극 인자(CSF)는 사르그라모스팀(sargramostim)을 포함한다. 하나 이상의 성장 인자를 사용한 치료는 전통적인 화학 요법을 받는 대상체에서 새로운 혈액 세포의 생성을 자극하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, CSF를 사용한 치료는 화학치료요법과 관련된 부작용을 줄이는 데 도움이 될 수 있으며 더 높은 용량의 화학치료제를 사용할 수 있도록 할 수 있다. 면역치료제는, 특이적 또는 비특이적 표적을 갖는 것 외에도, 활성화될 수 있는데, 즉, 신체의 자체적인 면역 반응을 자극할 수 있거나, 또는 이는 수동적일 수 있는데, 즉, 신체의 외부에서 생성된 면역계 구성성분을 포함할 수 있다. 수동적인 특이적 면역치료요법은 전형적으로 암세포 표면에서 발견되는 특수한 항원에 대해 특이적이거나 특수한 세포 성장 인자에 대해 특이적인 하나 이상의 모노클로날 항체를 사용하는 것을 포함한다. 모노클로날 항체는 다양한 방법으로 암의 치료에 사용되어, 예를 들면, 특정 유형의 암에 대한 대상체의 면역 반응을 향상시키거나, 혈관형성에 관여하는 것과 같은 특이적인 세포 성장 인자를 표적화함에 의해, 또는 화학치료제, 방사활성 입자 또는 독소와 같은 제제에 연결되거나 접합된 경우 암 세포에 대한 다른 항암제의 전달을 향상시킴으로써 암세포의 성장을 방해할 수 있다. 본 발명의 조합물에 포함되기에 적합한 암 면역치료제로서 현재 사용되는 모노클로날 항체는 리툭시맙(Rituxan®), 트라스투주맙(Herceptin®), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin®), 토시투모맙(Bexxar®), 세툭시맙(C-225, Erbitux®), 베바시주맙(Avastin®), 젬투주맙 오조가미신(Mylotarg®), 알렘투주맙(Campath®) 및 BL22를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 다른 예는 항-CTLA4 항체(예컨대, 이필리무맙), 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-PLD2 항체(비제한적인 예로서, 니몰루맙(ONO- 4538/BMS-936558, MDX1 106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), 펨브롤리주맙(KEYTRUDA, Merck), MK-3475(MERCK), BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB), 아테졸리주맙(TECENTRIQ, GENENTECH), MPDL3280A(ROCHE) 중 하나 이상으로부터 선택됨), 항-TIMP3 항체, 항-LAG3 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체 또는 항-B7H6 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 B 세포 고갈 항체를 포함한다. 전형적인 B 세포 고갈 항체는 항-CD20 모노클로날 항체[예컨대, 리툭시맙b(Roche), 리브리투모맙 티우세탄(Bayer Schering), 토시투모맙(GlaxoSmithKline), AME-133v(Applied Molecular Evolution), 오크렐리주맙(Roche), 오파투무맙(HuMax-CD20, Gemnab), TRU-015(Trubion) 및 IMMU-106(Immunomedics)], 항-CD22 항체[예컨대, Epratuzumab, Leonard et al., Clinical Cancer Research (Z004) 10: 53Z7-5334], 항-CD79a 항체, 항-CD27 항체, 또는 항-CD19 항체(예컨대, U.S. 특허 No. 7,109,304), 항-BAFF-R 항체(예컨대, 벨리무맙, GlaxoSmithKline), 항-APRIL 항체(예컨대, 항-사람 APRIL 항체, ProSci Inc.) 및 항-IL-6 항체[예컨대 previously described by De Benedetti et al., J Immunol (2001) 166: 4334-4340 및 by Suzuki et al., Europ J of Immunol (1992) 22 (8) 1989-1993에 의해 이전에 기술됨, 여기에 참조로서 통합됨], CD137(4-1 BB) 및/또는 CD137(4-1BB)와 4-1 BB 리간드(비제한적인 예로서, 우렐루맙(BMS-663513 및 항-4-1 BB 항체) 중 하나 이상과의 결합을 증가시키고/시키거나 자극하는 제제, 및 CTLA-4의 활성 및/또는 CTLA-4와 AP2M1, CD80, CD86, SHP-2 및 PPP2R5A 중 하나 이상의 결합 및/또는 OX40과 OX40L(비제한적인 예로, GBR 830(GLENMARK), MEDIMIN6469)의 결합을 차단시키고/시키거나, 감소시키고/시키거나, 억제하는 제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
면역치료학적 치료는 동종이식, 특히 조혈 줄기 세포 HSC와의 동종이식으로 이루어질 수 있다. 면역치료학적 치료는 또한 Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley 및 Steven A. Rosenberg "Adoptive Immunotherapy for cancer: Harlinging the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012)에 설명된 입양 면역치료요법(adoptive immunotherapy)으로 이루어질 수 있다. 입양 면역치료요법에서, 대상체의 순환 림프구인, NK 세포를 단리하여 시험관 내에서 증폭시킨 후 대상체에게 재투여한다. 활성화된 림프구 또는 NK 세포는 가장 특히 혈액이나 종양 샘플에서 이전에 분리되어 시험관 내에서 활성화(또는 "확장")된 대상체 자신의 세포이다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 하나 이상의 염증성 질환 또는 상태를 치료, 제어 또는 방지하는 데 사용된다. 염증 질환의 비-제한적인 예시로는 심상성 여드름, 급성 염증, 알레르기성 비염, 천식, 죽상경화증, 아토피성 피부염, 자가면역 질환, 자가염증 질환, 상염색체 열성 경직성 운동실조증, 기관지 확장증, 복강병, 만성 담낭염, 만성 염증, 만성 전립선염, 대장염, 게실염, 가족성 호산구 증가증(fe), 사구체신염, 글리세롤 키나제 결핍증, 화농땀샘염, 과민증, 염증, 염증성 창자 질환, 염증성 골반 질환, 간질성 방광염, 후두 염증성 질환, 레이 증후군, 편평태선, 비만세포 활성화 증후군, 비만세포증, 안구 염증 질환, 중이염, 통증, 골반 염증 질환, 재관류 손상, 호흡기 질환, 재협착증, 류마티스열, 류마티스 관절염, 비염, 유육종증, 패혈성 쇼크, 규폐증 또는 기타 진폐증, 이식 거부, 결핵 및 혈관염을 포함한다.
일부 구현예에서, 염증 질환은 다발 경화증(예컨대, 자가면역 뇌척수염(EAE)), 당뇨병, 루푸스, 복강 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 길랭-바레 증후군, 경피증, 굿파스처 증후군, 베게너 육아종증, 자가면역 간질, 라스무센 뇌염, 원발성 담즙 경화증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 애디슨병, 하시모토 갑상선염, 섬유근통, 메니에 증후군; 이식 거부(예컨대, 동종이식 거부의 예방), 악성 빈혈, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 홍반 루푸스, 다발 경화증, 중증 근무력증, 라이터 증후군, 그레이브 질환과 같은 자가면역 질환 또는 상태, 또는 다른 자가면역 질환이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질이 이식 거부를 치료, 제어 또는 방지하는 데 사용되는 경우, 키메라 단백질은 다음의 일반 구조: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단 (여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 링커, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 단량체 신호전달 및/또는 표적화 도메인임)를 가지거나, 또는 다음의 일반 구조: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단 (여기서 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 링커, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 단량체 신호전달 및/또는 표적화 도메인임)를 가진다.
일부 구현예에서, 본 키메라 제제는 세포내 병원체를 제거하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 본 키메라 제제는 하나 이상의 감염을 치료하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 본 키메라 단백질은 바이러스 감염(예를 들면, HIV 및 HCV 포함), 기생충 감염(예를 들면, 말라리아 포함) 및 세균 감염을 치료하는 방법에 사용된다. 일부 구현예에서, 감염은 면역억제를 유도한다. 예를 들어, HIV 감염은 종종 감염된 대상의 면역억제를 초래한다. 따라서, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 이러한 감염의 치료는 일부 구현예에서, 면역 억제보다 면역 자극을 선호하도록 본 키메라 단백질로 면역계를 조절하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명은 면역활성화를 유도하는 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 장내 기생충 감염은 만성 면역 활성화와 관련이 있다. 이러한 구현예에서, 이러한 감염의 치료는 면역 자극보다 면역 억제를 선호하도록 본 키메라 단백질로 면역계를 조절하는 것을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동시 투여"는 2가지 활성 성분을 동일한 경로로 및 동시에 또는 실질적으로 동시에 투여하는 것을 지칭한다. 용어 "별도 투여"는 2가지 활성 성분을 동시에 또는 실질적으로 동시에 상이한 경로로 투여하는 것을 지칭한다.용어 "순차 투여"라는 용어는 2가지 활성 성분을 서로 다른 시점에 투여하는 것을 지칭하며, 투여 경로는 동일하거나 상이하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 PD-L1 및/또는 PD-L2를 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 키메라 단백질은 OX-40을 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 GITR을 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 키메라 단백질은 4-1BB를 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 CD40을 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 키메라 단백질은 VISTA를 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 키메라 단백질은 CSF1을 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 IL-34를 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 단백질은 CD47을 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 단백질은 갈렉틴-9 및/또는 포스파티디세린을 발현하는 세포(예컨대, 암 세포, 간질 세포 또는 면역 세포)를 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가의 제제에 대해 불응성인 환자에서 키메라 단백질을 사용한 치료를 제공하고, 제한없이, 본원에 기술된 다양한 화학치료제를 포함하는, 이러한 "추가의 제제"는 본원의 어딘가에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질이 암을 치료, 제어 또는 방지하는 데 사용되거나 또는 면역치료에 사용되는 경우, 키메라 단백질은 다음의 일반 구조: N 말단 - (a) - (b) - (c) - C 말단 (여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 링커, (b)는 기능성 링커이고, (c)는 이량체 또는 삼량체 신호전달 및/또는 표적화 도메인임)를 가지거나, 또는 다음의 일반 구조: N 말단 - (c) - (b) - (a) - C 말단 (여기서 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인이고, (b)는 링커, (b)는 기능성 링커이고, (a)는 이량체 또는 삼량체 신호전달 및/또는 표적화 도메인임)를 가진다.
본 발명은 다음의 도면들 및 예시들을 통하여 더 상세히 설명한다. 그러나, 이들 예시들과 도면들은 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1. TAME-IT 분자의 일반적인 제시. TAME-IT 분자는 뚜렷한 면역자극 활성을 지닌 3개의 상이한 도메인으로 구성된 키메라 단백질이다. '표적화 도메인'은 종양 세포 또는 면역 세포의 표면 상의 마커를 인식하고; 이는 TAME-IT 분자를 세포 표면에 고정하고 나타내며 표적화된 세포 내부의 신호를 신호전달하거나 차단할 수 있다. '기능적 링커'는 TAME-IT-표적화된 세포의 식세포작용 시 항원-제시 세포를 포함하여, 다양한 세포 유형에 의해 주요 조직적합성 복합체 분자에서 프로세싱되어 제시될 종양 또는 바이러스 항원의 펩타이드 서열을 함유한다. '신호전달 도메인'은 TNF 계열의 단량체, 이량체 또는 삼량체 단백질로 구성되며 다양한 면역 세포 유형의 활성화를 자극하는 효능제 특성을 보유한다.
도 2. TAME-IT 단백질은 표적화된 세포의 표면에 작용성 리간드를 나타낸다. PD-L1+ 세포를 KN035-TAA-th4-1BBL 분자(KN035는 항PD-L1 나노바디이고 th4-1BBL은 삼량체 사람 4-1BBL 도메인이다)와 함께 항온하고, 세척한 다음 형광색소-접합된 항-4-1BBL 항체로 염색하였다. TAME-IT 분자 KN035-th4-1BBL은 표면 PD-L1을 인식할 수 있으며 PD-L1+ 세포를 4-1BBL(A)에 대해 양성으로 만든다. 이러한 공정은 단량체성 사람 4-1BBL(mh4-1BBL)(D)에 연결된 사람 PD-1 모이어티로 구성된 이전 분자보다 더 효율적이다. 메조텔린+ 세포를 A1-thCD40L 분자(A1은 항-메조텔린 나노바디이고 thCD40L은 삼량체 사람 CD40L 도메인이다)와 함께 항온처하고, 세척한 후 형광색소-접합된 항-CD40L 항체(B)로 염색하였다. TAME-IT 분자 A1-thCD40L은 표면 메조텔린을 인식할 수 있고 메조텔린+ 세포를 CD40L(진한 회색)에 대해 양성으로 만드는 반면 메조텔린-세포는 CD40L-(밝은 회색)로 유지된다. 가용성 삼량체 CD40L(sthCD40L)으로만 구성된 분자를 사용하는 경우, 메조텔린+ 세포는 CD40L-로 유지되었으며, 이는 항-메조텔린 A1 나노바디가 표면 고정에 필수적임을 입증한다(C). CTLA-4+ / CD40L- 세포를 [항-CTLA-4]-[thCD40L] TAME-IT 분자와 함께 항온처리하거나(진한 회색) 항온처리하지 않고(밝은 회색), 세척한 다음 형광색소-접합된 항-CD40L 항체로 염색하였다. (E) TAME-IT 분자는 이의 표면에서 고정으로 인해 CTLA-4+ / CD40L- 세포를 CD40L에 대해 양성으로 만든다.
도 3. TAME-IT 분자는 사람 수지상 세포를 활성화한다. (A-C) 사람 단핵구-유래된 수지상 세포를 KN035-th4-1BBL-생산 세포(진한 회색) 또는 대조군 세포(밝은 회색)의 상층액과 함께 48시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 수지상 세포를 유동 세포 계측법으로 CD80, CD83 및 CD86 성숙 마커의 발현에 대해 분석하였다. 이는 TAME-IT 단백질이 항원-제시세포의 성숙을 유도함을 나타낸다. 사람 단핵구-유래된 수지상 세포(DC)를 이전에 TAME-IT 분자 A1-thCD40L(A1은 항메조텔린 나노바디이다)과 함께 항온처리되거나 항온처리되지 않은 LPS(양성 대조군) 및/또는 메조텔린+ 종양 세포(Meso13)와 함께 20시간 동안 항온처리된 후 CD83 성숙 마커의 발현에 대해 분석하였다. 종양 세포에 대한 TAME-IT 분자의 고정은 후자에 의해 유도된 DC 성숙의 억제를 되돌렸다. 항메조텔린 나노바디(sthCD40L)가 결여된 TAME-IT 분자의 절두된 버젼(truncated version)을 사용하거나 DC와 종양 세포(트랜스웰) 사이의 물리적 분리를 수행한 경우, 이러한 면역활성화 특성이 손실되었다.
도 4. 조작된 종양용해 바이러스에 감염된 세포는 TAME-IT 분자를 생산한다. HEK 세포를 A1-thCD40L 분자를 암호화하는 VSV로 감염시켰다. 배양 상층액(SN)을 수집하고 원심분리(CSN)로 농축하였다. 그런 다음 A1-thCD40L을 웨스턴 블롯으로 검출하였다. 음성 대조군으로서, 관련 없는 단백질(mRuby2)을 암호화하는 VSV를 사용하였다.
도 5. '기능성 링커'에 암호화된 항원은 CD4 T 세포에 효율적으로 제시된다. 사람 종양 세포를 항원성 펩타이드를 포함하는 '기능성 링커'를 포함하거나 포함하지 않는 상이한 TAME-IT 분자를 암호화하는 VSV로 감염시켰다. 이후에, 이러한 감염된 세포를 사람 단핵구-유래된 수지상 세포와 공-배양하거나 배양하지 않은 후 6시간 동안 펩티드 서열이 '기능적 링커'에서 발견되는 종양 항원 NY-ESO-1에 특이적인, 사람, HLA-DP4-제한된, CD4 T 세포 클론과 함께 공-배양하였다. T 세포 활성화는 감마-인터페론의 세포내 염색으로 평가되었으며 이전에 '기능적 링커'를 함유하는 TAME-IT 분자를 암호화하는 VSV로 감염된 종양 세포를 내재화한 HLA-DP4+ 수지상 세포(MHC 클래스 II 분자 발현)에 대해서만 관찰하였다. 이는 TAME-IT 분자의 항원성 펩타이드가 사람 항원-제시 세포에 의해 효율적으로 프로세싱되고 종양-관련 항원-특이적인 사람 CD4 T 세포로 제시된다는 것을 나타낸다.
도 6. '기능적 링커'에 암호화된 항원은 CD8 T 세포에 대해 효율적으로 제시된다. 사람 종양 세포를 항원성 펩타이드를 함유하는 '기능성 링커'를 포함하거나 포함하지 않는 상이한 TAME-IT 분자를 암호화하는 VSV로 감염시켰다. 그런 다음 이러한 감염된 세포를 사람 단핵구-유래된 수지상 세포와 함께 공-배양하거나 그렇지 않은 후, '기능적 링커'에서 펩티드 서열이 발견되는 종양 항원 NY-ESO-1에 대해 특이적인, 사람, HLA-A2 제한된, CD8 T 세포 클론과 함께 6시간 동안 공-배양하였다. T 세포 활성화를 감마-인터페론의 세포내 염색으로 평가하고 '기능적 링커'를 함유하는 TAME-IT 분자를 암호화하는 VSV가 사용된 조건에서 HLA-A2+ 종양 세포 및 수지상 세포에 대해서만 관찰되었다. 이는 TAME-IT 분자로부터의 항원성 펩타이드가 감염된 세포 또는 면역 세포에 의해 효율적으로 프로세싱처리되고 종양-관련된 항원-특이적인 사람 CD8 T 세포에 제시됨을 나타낸다.
도 7. TAME-IT 단백질은 상이한 유형의 사람 림프구를 활성화한다. (A) PD-L1+ 사람 흑색종 세포를 항-PD-L1 항체 니볼루맙 또는 TAME-IT 단백질 KN035-TAA-th4-1BBL의 존재 또는 부재하에 1:2, 1:1 또는 2:1의 표적:효과기 비율로 활성화 또는 비-활성화된 사람 폴리클로날 CD8 T 세포와 함께 5일 동안 공-배양하였다. CD8 T 세포에 의한 사멸을 평가하기 위해 실험 중에 표적 흑색종 세포의 합치(confluence)를 현미경으로 분석하였다. TAME-IT 단백질은 CD8 T 세포의 활성화와 흑색종 세포의 사멸을 향상시킨다. (B) MDA-MB-231 사람 유방 종양 세포를 KN035-TAA-th4-1BBL TAME-IT 분자를 암호화하거나 암호화하지 않는 VSV로 18시간 동안 감염시켰다. 이들 감염된 세포를 사람 천연 킬러(NK) 세포와 6시간 동안 공-배양하였다. NK 세포 활성화를 CD107a의 표면 염색으로 평가하였고 TAME-IT 분자를 암호화하는 VSV가 사용된 조건하에서 증가하였다.
도 8: KN41은 림프구 T의 더 큰 활성화를 유도한다. (A) 총 PBMC를 20 PBMC에 대해 1개의 볼 비율로 항-CD3/CD28 항체에 커플링된 비드의 존재 또는 부재하에 나타된 표적:효과기 비율로 M113 또는 M113-PD-L1 세포(웰 당 10,000개의 종양 세포)와 공-배양하였다. 세포를 KN41과 동시에 처리하거나 KN41(KN41 PI)과 함께 예비-배양하였다. 24시간 후, 상층액을 수거하고 ELISA로 IFNg에 대해 분석하였다. (B) 종양 세포당 5개의 PBMC 및 항-CD3/CD28 비드를 사용하는 조건 하에서, 상층액 중 IFNg를 나타낸 시간에 분석하였다. (C) 공급자 세포에서 분류되고 이전에 증폭시킨 총 CD8 LT를 항-CD3.CD28 비드(1:20)의 존재 하에 종양 세포에 대한 2개의 효과기 세포와 함께 M113 또는 M113-PD-L1 세포와 함께 공-배양하였다. 배양물을 KN41 또는 항-PD-1 항체(니볼루맙)로 처리하거나 처리하지 않았다. 나타낸 시간에 상층액 중 IFNg를 분석하였다.
실시예:
실시예 1
목표
TAME-IT 키메라 단백질(도 1)이 표적화된 수용체에 대한 이의 '표적화 도메인'의 결합을 통해 관심 세포를 구체적으로 인식할 수 있음을 입증한다.
재료 및 방법
단백질 생산
Lenti X 세포(HEK293T)를 0일에 6-웰 플레이트에서 웰당 7.105개 세포로 플레이팅하였다. 1일째에, 배지를 10% FCS가 첨가된 2mL의 신선한 DMEM으로 대체하였다. TAME-IT 단백질을 암호화하는 2μg의 pcDNA3.1 플라스미드와 함께 리포펙타민(Lipofectamine) 3000을 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 상층액을 수집하고 10,000g에서 10분 동안 원심분리하여 제거하였다.
세포 염색
2.105개의 Meso13 사람 중피종 세포 또는 HEK-293T 세포를 대조군(EFGP) 또는 TAME-IT-형질감염된 HEK 세포로부터의 상층액과 함께 30분 동안 배양하였다. PBS로 2회 세척 후, 세포를 항-h4-1BBL 또는 항-hCD40L 항체(Biolegend, cat#311504 및 310806, 각각)로 15분 동안 염색하였다. PBS로 2회 세척한 후, BD Accuri C1 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석하였다.
결과
본 실험은 PD-L1(도 2A) 또는 메소텔린(도 2B)에 대해 지시된 나노바디를 포함하는 TAME-IT 분자가 각각 PD-L1+ 및 메소텔린+ 세포 각각을 인식할 수 있음을 나타낸다. 결과적으로 표적화된 세포를 TAME-IT 분자(여기서 삼량체화된 4-1BBL 또는 CD40L)에 함유된 '신호전달 도메인'으로 새로이 코팅한다. 추가의 실험에서, 본 발명자는 '표적화 도메인'의 고정이 동일한 표면 단백질을 인식하는 다른 항체와 경쟁하므로, TAME-IT 분자가 표적에 대해 특이적임을 나타낸다(데이터는 나타내지 않음). 도 2C에 나타낸 바와 같이, 표적화 도메인의 존재는 이것을 결여하는 분자가 표적화된 세포를 인식하지 않는 못하므로 이러한 신생-코팅에 절대적으로 필수적이다. 도 2D에서, 본 발명자는 TAME-IT 구조가 항-PD-L1 나노바디 대신 사람 PD-1 세포외 도메인을 사용하는 경쟁 분자보다 우수하다는 것을 나타낸다. 또한 본 발명자는 CTLA-4에 대한 scFv를 '표적화 도메인'으로 사용하여 이러한 특이적인 표적화를 달성할 수 있음을 나타내었고(도 2E), 따라서 이러한 도메인이 다양한 유형의 표적화 분자(예컨대, 나노바디, scFv)로부터 제조될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2
목표
막-결합된 TAME-IT 단백질이 이의 '신호전달 도메인'을 통해 직면하는 면역 세포에 신호를 보내는 능력을 유지함을 입증한다.
재료 및 방법
단백질 생산
Lenti X 세포(HEK293T)를 0일째에 6-웰 플레이트에서 웰당 7.105개의 세포로 플레이팅하였다. 1일째에, 배지를 10% FCS가 보충된 2mL의 신선한 DMEM으로 대체하였다. 세포는 본 발명자의 작제물을 암호화하는 2μg의 pcDNA3.1 플라스미드와 함께 리포펙타민 3000을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 상층액을 수집하고 10,000g에서 10분 동안 원심분리하여 제거하였다.
수지상 세포(DC) 분화
건강한 공여체로부터의 사람 단핵구를 2% 사람 알부민, 과립구-대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF, 500 IU/mL) 및 인터류킨-4(IL-4, 50ng/mL)가 보충된 RPMI-1640 배지의 6웰 플레이트에 mL당 2.106개의 세포 및 cm²당 1.106개의 세포로 플레이팅하였다. 5일 동안 배양(37℃, 5% CO2)한 후, 분화된 DC를 수집하고 계수하였다.
DC 성숙 검정
100,000개의 분화된 DC를 본 발명자의 분자를 함유하는 HEK 세포로부터의 상층액과 직접적으로, 또는 이러한 상층액으로 이전에 염색하고 공-배양 전에 세척한 종양 세포와 함께, 96웰 플레이트 속에서 48시간 동안 배양하였다.
세포 염색
단핵구-유래된 DC를 배양 시간이 끝나면 플러싱(flushing)하여 수집하였다. PBS로 2회 세척 후, 이를 항-hCD80, 항-hCD83, 항-hCD86 및 항-hHLA-DR 항체로 30분 동안 염색하였다. 2회 PBS 세척 후, BD FACS Canto II 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석하였다. CD80, CD83 및 CD86 발현은 DC에 상응하는 HLA-DR+ 세포 분획에서 결정되었다.
결과
본 실험은 TAME-IT 분자가 가용성(도 3A) 또는 세포-결합된(도 3B) 형태로, 및 삼량체 h4-1BBL(도 3A) 또는 삼량체 hCD40L(도 3B-3C) 도메인을 함유하는 경우 사람 DC의 성숙을 활성화할 수 있음을 나타낸다. TAME-IT-유도된 DC 성숙은 종양 세포(Meso13)가 고도로 면역 억제성임에도 불구하고 발생한다(도 3C). 병원체-관련된 분자 패턴(PAMP)과의 상승 효과는 TAME-IT와 LPS를 둘 다를 사용하여 DC를 공-처리하는 경우 관찰된 바와 같이 입증된다(도 3C). 전반적으로, 이는 신호전달 도메인이 완전히 기능성이고 사람 골수 세포를 용이하게 활성화시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 3
목표
TAME-IT 분자가 종양용해 바이러스(OV)에서 암호화됨으로써 벡터화되고 OV-감염된 세포에 의해 효율적으로 생산될 수 있음을 입증한다.
재료 및 방법
바이러스 생성
TAME-IT 단백질을 암호화하는 유전자를 VSV-G와 VSV-L 판독 프레임 사이의 역 유전학에 의해 VSV(수포성 구내염 바이러스) 인디애나 균주 게놈에 삽입하였다. MVA-T7에 의해 감염된 BHK-21 세포에서 1시간 동안 바이러스를 구출한 후 VSV-N, VSV-P, VSV-L-암호화 벡터 및 TAME-IT 서열을 함유하는 항-게놈성 VSV 벡터로 형질감염시켰다. 재조합 VSV를 0.22μm 여과와 BHK-21 세포에 대한 구회의 추가의 계대배양에 의해 상층액으로부터 회수하였다. 유사하게, TAME-IT 단백질을 암호화하는 유전자를 상동 재조합에 의해 백시니아 바이러스의 종양용해성 균주의 게놈에 삽입하였다.
세포 감염
HEK-293T 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 7.105개의 세포로 플레이팅하고 다음날 밤새 감염시키기 위해 2mL 중 MOI=0.1로 감염시켰다.
이후에, 상층액을 수집하고 10,000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 1.5mL의 상층액을 Vivaspin 5,000Da에서 10배 더 농축하였다. 그런 다음 20 μL를 5X 램믈리/β-머캅토에탄올과 혼합하고 95℃에서 5분동안 가열하였다. 샘플을 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고 200V에서 40분 동안 이주시켰다. 그런 다음, 단백질을 100V에서 1시간 동안 PVDF 막으로 이전시켰다. 막을 TBS/BSA에서 1시간 동안 차단한 후 TBS/BSA중 Strep-Tactin XT-HRP를 사용하여 단백질을 후속적으로 검출하였다. 마지막으로, Clarity™ Western ECL 기질 및 BioRad Chemidoc Imager를 사용하여 화학발광성으로 막을 영상화하였다.
결과
본 실험은 TAME-IT 단백질의 서열이 종양용해성 VSV의 게놈에 삽입될 수 있고 VSV-감염된 종양 세포에 의해 효율적으로 생산될 수 있음을 나타낸다(도 4). 병행 실험에서, TAME-IT 단백질을 암호화하는 종양용해성 VV를 사용하는 경우 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 4
목표
이것이 함유한 암호화된 항원을 프로세싱하여 CD4 및 CD8 T 세포에 제시될 수 있는지의 여부를 측정함으로써 '기능성 링커'의 역할을 입증한다.
재료 및 방법
세포 감염
Meso34 및 Meso13 사람 중피종 세포를 0일째에 96-웰 플레이트에 웰당 104개의 세포로 플레이팅하고 1일째에 MOI=0.1에서 상이한 TAME-IT 단백질을 암호화하는 VSV로 감염시켰다. 2일째에, 시험한 조건에 따라 2.105개의 DC를 공-배양물에 가하였다. 3일째에, DC를 플러싱하고 8.105개의 T 세포 클론(NY-ESO-1 항원에 특이적인 CD4 또는 CD8)이 들어있는 V-바닥 96-웰 플레이트에 6시간 동안 프레펠딘-A의 존재하에 플레이팅하였다.
세포 염색
배양 시간이 끝나면 플러싱하여 세포를 수집하였다. 2회 PBS 세척 후, 이를 항-hCD3 항체로 30분 동안 염색하였다. 2회 PBS 세척 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, PBS + 0.1% 사포닌으로 투과화한 다음 항-hIFNγ 항체로 30분 동안 염색하였다. 2회 PBS + 0.1% 사포닌 세척 후, BD Canto II 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석하였다. T 세포를 CD3+ 세포로 게이팅하고 세포내 IFNγ 생산에 대해 분석하였다.
결과
CD4 T 세포 클론을 사용한 첫 번째 실험에서는 '기능적 링커'를 함유하는 TAME-IT 단백질이 이를 암호화하는 VSV에 감염된 종양 세포에 의해 효율적으로 생산됨을 나타낸다(도 5). 이들 분자를 이전에 식균된 VSV-TAME-IT-감염된 종양 세포를 갖는 DC에 의해 MHC 제II 부류 분자에서 추가로 프로세싱되고 제시된다. 이러한 DC는 이후 TAA-특이적인 CD4 T 세포를 활성화한다. 이는 '기능적 링커'가 이러한 링커 내에 암호화된 항원성 펩타이드를 인식하는 CD4 T 세포의 특이적인 활성화를 허용함을 나타낸다. 이러한 결과는 상이한 공여체의 DC를 사용한 2개의 추가의 실험에서 확인되었다(데이터는 나타내지 않음).
두 번째 실험은 (i) TAME-IT 단백질을 암호화하는 VSV에 감염된 종양 세포 및 (ii) 이전에 식균된 VSV-TAME-IT-감염된 종양 세포를 갖는 DC에 의해 '기능성 링커'로부터의 TAA 펩타이드가 또한 효율적으로 프로세싱되고 MHC 그룹 I 분자 상에 TAA-특이적인 CD8 T 세포로 제시된다는 것을 나타낸다(도 6). 이러한 결과는 상이한 공여체로부터의 DC를 사용한 두 가지 추가 실험에서 확인되었다(데이터는 표시되지 않음).
실시예 5
목표
TAME-IT 단백질에 의한 상이한 유형의 사람 림프구의 활성화를 입증한다.
재료 및 방법
CD8 T 세포 활성화
0일째에, PD-L1+ 사람 흑색종 세포를 웰당 10,000개 세포의 농도로 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. 1일째에 사람 폴리클로날 CD8 T 세포를 이전에 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 활성화 비드의 존재 또는 부재하에서 종양 세포에 2:1, 1:1, 1:2 비율로 첨가하였다. 일부 조건에서는, 항-PD1 항체 니볼루맙 또는 정제된 TAME-IT 단백질 KN035-TAA-th4-1BBL을 혼합물에 첨가하였다. 종양 세포의 합치를 시간-경과 현미경으로 5일 동안 분석하였다.
NK 세포 활성화
NK 활성화 분석을 위해, 104개의 MDA-MB-231 세포를 0일째에 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 1일째에, 세포를 MOI=0.1에서 18시간 동안 VSV-KN035-TAA-th4-1BBL에 의해 감염시킨 후 브레펠딘-A의 존재 하에 105개의 확장된 사람 NK 세포와 함께 6시간 동안 배양하였다. 배양 시간이 끝나면 플러싱함으로써 NK 세포를 수집하였다. 2회 PBS 세척 후, 항-hCD107a 항체로 30분 동안 염색했다. 2회 PBS 세척 후, BD Accuri C1 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석했다.
결과
PD-L1+ 사람 흑색종 세포를 TAME-IT 단백질 KN035-TAA-th4-1BBL의 존재 또는 부재하에서 활성화된 폴리클로날 CD8 T 세포와 함께 공-배양하였다(도 7A). 이 실험은 TAME-IT 단백질의 존재가 CD8 T 세포에 의한 흑색종 세포의 사멸을 증가시켰음을 나타내며, 이는 T 림프구에 대한 이이 면역활성화 특성을 입증한다. 유사한 방식으로, 이러한 TAME-IT 단백질을 암호화하는 종양용해성 VSV를 사용하여 사람 유방암 세포를 감염시켰을 때, 공-배양된 천연 킬러 세포는 대조군 조건과 비교하여 향상된 활성화를 나타내었다(도 7B).
더욱이, KN41은 림프구 T의 더 큰 활성화를 유도한다(도 8A 내지 8C). 이러한 상이한 결과는 TAME-IT 단백질이 항종양 면역성의 맥락에서 상이한 유형의 사람 T 림프구를 활성화하는 특성을 가지고 있음을 나타낸다.
참고문헌:
본 출원에서, 여러 참고문헌들이 본 발명이 속한 기술 분야를 기술한다. 이들 참고문헌들의 개시는 여기에 참조로서 통합된다.

Claims (16)

  1. 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질을 암호화하는 핵산:
    - N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인, (b)는 기능성 링커, 및 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인임, 또는
    - N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단, 여기서 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인, (b)는 기능성 링커, 및 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인임.
  2. 다음의 일반 구조를 갖는 키메라 단백질:
    - N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인, (b)는 기능성 링커, 및 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인임, 또는
    - N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단, 여기서 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인, (b)는 기능성 링커, 및 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인임.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 신호전달 및/또는 표적화 도메인 (a)는 단량체, 동종이량체, 이종이량체, 동종삼량체, 또는 이종삼량체인, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 신호전달 및/또는 표적화 도메인 (c)는 단량체, 동종이량체, 이종이량체, 동종삼량체, 또는 이종삼량체인, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 신호전달 및/또는 표적화 도메인 (a)는 항-PD-L1, 항-CTLA-4, 항-TIGIT, 항-TIM-3, 항-VISTA, 항-BTLA, 항-LAG3, 항-CD28, 항-메조텔린 (항-MSLN), 항-CD19, 항-HER2로부터 선택되는, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (b) 기능성 링커는 종양-관련된 항원(TAA) 또는 내성 항원로부터 선택되는, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  7. 제6항에 있어서,
    종양-관련된 항원(TAA)는 NY-ESO-1, 멜란A 항원, 또는 MUC-1인, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 신호전달 및/또는 표적화 도메인 (c)는 4-1 BBL, OX-40 리간드 (OX-40L), LIGHT (CD258), GITR 리간드 (GITRL), CD70, CD30 리간드, CD40 리간드 (CD40L), TRAIL, 및 TL1A로부터 선택되는 신호전달 도메인인, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    키메라 단백질은 [항-PD-L1]-[TAA]n-[삼량체 4-1 BBL]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    키메라 단백질은 [항-PD-L1]-[TAA]n-[삼량체 OX-40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    키메라 단백질은 [항-PD-L1]-[TAA]n-[이량체 4-1 BBL 및 단량체 OX-40L]이고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10인, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 또는 키메라 단백질.
  12. 다음의 일반 구조를 가지는 키메라 단백질의 치료적으로 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서의 암 또는 염증성 질환의 치료 방법:
    - N 말단-(a)-(b)-(c)-C 말단, 여기서 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인, (b)는 기능성 링커, 및 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인임, 또는
    - N 말단-(c)-(b)-(a)-C 말단, 여기서 (c)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인, (b)는 기능성 링커, 및 (a)는 신호전달 및/또는 표적화 도메인임.
  13. 제12항에 있어서,
    염증성 질환은, 심상성 여드름(acne vulgaris), 급성 염증(acute inflammation), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 천식(asthma), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 자가면역 질환(autoimmune disease), 자가염증 질환(autoinflammatory diseases), 상염색체 열성 경직성 운동실조증(autosomal recessive spastic ataxia), 기관지 확장증(bronchiectasis), 복강병(celiac disease), 만성 담낭염(chronic cholecystitis), 만성 염증(chronic inflammation), 만성 전립선염(chronic prostatitis), 대장염(colitis), 게실염(diverticulitis), 가족성 호산구 증가증(familial eosinophilia)(fe), 사구체신염(glomerulonephritis), 글리세롤 키나제 결핍증(glycerol kinase deficiency), 화농땀샘염(hidradenitis suppurativa), 과민증(hypersensitivities), 염증(inflammation), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases), 염증성 골반 질환(inflammatory pelvic disease), 간질성 방광염(interstitial cystitis), 후두 염증성 질환(laryngeal inflammatory disease), 레이 증후군(Leigh syndrome), 편평태선(lichen planus), 비만세포 활성화 증후군(mast cell activation syndrome), 비만세포증(mastocytosis), 안구 염증 질환(ocular inflammatory disease), 중이염(otitis), 통증(pain), 골반 염증 질환(pelvic inflammatory disease), 재관류 손상(reperfusion injury), 호흡기 질환(respiratory disease), 재협착증(restenosis), 류마티스열(rheumatic fever), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 비염(rhinitis), 유육종증(sarcoidosis), 패혈성 쇼크(septic shock), 규폐증 또는 기타 진폐증(silicosis or other pneumoconioses), 이식 거부(transplant rejection), 결핵(tuberculosis) 및 혈관염(vasculitis)을 포함하는, 치료 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    자가면역 질환 또는 상태는, 다발 경화증(multiple sclerosis), 당뇨병(diabetes mellitus), 루푸스(lupus,), 복강 질환(celiac disease), 크론 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 경피증(scleroderms), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 자가면역 간질(autoimmune epilepsy), 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 원발성 담즙 경화증(Primary biliary sclerosis), 경화성 담관염(Sclerosing cholangitis), 자가면역 간염(Autoimmune hepatitis), 애디슨병(Addison's disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 섬유근통(Fibromyalgia), 메니에 증후군(Menier's syndrome); 이식 거부(transplantation rejection)(예컨대, 동종이식 거부의 예방), 악성 빈혈(pernicious anemia), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 피부근염(dermatomyositis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 홍반 루푸스(lupus erythematosus), 다발 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 그레이브 질환(Grave's disease), 또는 다른 자가면역 질환인, 치료 방법.
  15. 제1항의 키메라 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), 렌티바이러스(LV), 레트로바이러스(RV), 아데노바이러스(AV), 홍역 바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스(VV), 점액종 바이러스, 레오바이러스, 파보바이러스, 볼거리 바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV), 또는 동일한 과로부터의 바이러스인, 발현 벡터.
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