KR20230173044A - 넉줄고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공한다.

Description

넉줄고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising extract Davallia mariesii root extract for preventing or treating neurodegenerative diseases}
본 발명은 넉줄고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방, 개선, 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 신경질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중 뇌를 비롯한 신경계에서 발생하는 질환으로서 인간의 평균수명이 길어짐에 따라 그 발병률이 현저히 증가하고 있다. 예를 들어 퇴행성 신경질환은 주요 증상과 침범되는 뇌부위를 고려하여 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 다발성경화증, 근위축성 측삭경화증 등과 같이 구분할 수 있다. 알츠하이머병(Alzheimer’s disease: AD) 가장 흔한 퇴행성 신경질환 중 하나로서 점진적으로 기억력이 감퇴되고 인지력이 상실되는 증상을 나타내는 병이며, 인간의 평균수명이 길어짐에 따라 그 발병률도 현저히 증가하고 있다.
알츠하이머 병의 병리학적 특징 중 하나는 신경세포의 외부에 축적되어지는 노인성 반점(senile plaques)을 들 수 있는데 이 원인물질로는 베타아밀로이드(beta-amyloid 또는 amyloid-β, β-amyloid, Aβ)를 들 수 있다. 베타아밀로이드(Aβ)는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precusor protein, APP)라는 단백질에서 잘려져 나온 단백질 파편이다. 베타아밀로이드 생성에 관여하는 효소 중 가장 중요한 것은 베타 위치 APP 절단 효소(β-site APP-cleaving enzyme, BACE1)라고 명명된 베타시크리타제(β-secretase)이다. 베타시크리타제(BACE1)에 의해 잘려진 APP는 90 kDa 내외의 베타시크리타제 유래 APP 분비형(β-secretase derived secreted form of APP, sAPPβ)이라 불리는 N-말단 도메인(N-terminal domain)과 베타시크리타제 유래 분비된 APP의 C-말단 단편(β-secretase derived secreted C-terminal fragment of APP, CTFβ) (C99)이라 불리는 세포질 도메인(cytoplasmic domain)으로 나눠진다. 이렇게 생성된 sAPPβ는 세포 밖으로 분비되고, C99가 다시 감마시크리타제(γ-secretase)에 의해 잘려 4 kDa의 베타아밀로이드가 생성된다. 따라서 베타시크리타제(BACE1)의 활성을 억제하는 물질은 베타아밀로이드의 생성을 저해하여 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 신경질환에 대한 치료 또는 예방 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
그러나 현재 시판 중이거나 개발 중인 약물의 대부분은 알츠하이머 환자의 증상을 개선시켜 삶의 질을 높이는 약물이며, 이러한 약물의 예로는 콜린성 신경계 가설에 근거하여 개발된 아세틸콜린분해억제제인 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine) 등과 같은 아세틸콜린가수분해효소(acetylcholinesterase) 억제제와 NMDA 수용체의 길항제인 메만틴(memantine) 등을 들 수 있다. 하지만 이러한 치료제들은 발병 초기에 일시적인 임상증상개선 효과에 그치는 것들이 대부분이고 부작용까지 나타나고 있어 실제 이용에 문제점이 많으며, 퇴행성 신경질환에 대한 보다 근원적인 치료가 가능한 의약품 개발이 필요하다.
본 발명자들은 퇴행성 신경질환의 발병 원인에 근거한 근본적인 치료에 목표를 두어 치료제를 개발하고자 하였고, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 비정상적인 대사로 인하여 베타아밀로이드가 다량 생성되어 뇌세포에 독성을 일으킴에 따라 발병하는 퇴행성 신경질환을 치료하기 위해 베타아밀로이드 단백질의 생성을 억제할 수 있는 약물을 개발하기 위해 노력한 끝에 본 발명을 완성하였다.
Selkoe DJ. 1991. The molecular pathology of Alzheimer’s disease. Neuron 6:487-498
본 발명은 베타아밀로이드 생성 억제 효과가 뛰어난 넉줄고사리 추출물을 이용하여 알츠하이머병, 치매를 비롯한 퇴행성 신경질환을 예방, 개선, 또는 치료하는 조성물을 제공하는 것을 해결 과제로 한다.
일 양상은 넉줄고사리(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 일 양상은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 일 양상은 넉줄고사리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 학습 또는 기억력 개선, 또는 인지기능 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
다른 일 양상은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 사료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술분야 또는 유사한 기술분야 내에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다. 본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
일 양상은 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드((-)-epiafzelechin-3-O-β-D-allopyranoside), (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드((2S)-5,7,3',5'-tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D-glucopyranoside), (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드((2S)-5,7,3',5'-tetrahydroxy-flavanone 7-O-hesperidoside), 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드(7-O-methyl-epiafzelechin-(4α→8)-epiafzelechin-3-O-β-glucopyranoside), 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 넉줄고사리(Davallia mariesii)(또는 Davallia mariesii T. Moore ex Baker로 기재함)는 넉줄고사리과(Davalliaceae) 넉줄고사리속(Davallia)에 속하는 양치식물이다. 바위의 겉이나 나무의 줄기에 붙어 자란다. 뿌리줄기는 지름 3~5mm, 굵고 옆으로 길게 뻗는데 갈색 또는 회갈색이고 겉에 선형의 비늘조각이 밀생한다. 잎은 드문드문 난다. 땅속줄기는 바위 위에 노출되어 옆으로 길게 기고, 빽빽이 붙는 비늘조각은 선상 피침형, 방패 모양으로 붙는 점에서 다른 고사리류와 구별된다. 한반도 전역에 나며 일본, 타이완, 중국 등에 분포한다.
상기 넉줄고사리는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.
상기 넉줄고사리 추출물은 넉줄고사리의 뿌리 및 뿌리줄기로부터 얻어질 수 있다. 바람직하기로는 일 구체 예에서, 상기 넉줄고사리 추출물은 넉줄고사리 뿌리, 넉줄고사리 뿌리 줄기, 또는 이들의 조합의 추출물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “추출물”은 넉줄고사리를 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 넉줄고사리를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비 제한적인 예로는, 냉침추출법, 온침추출법, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
상기 넉줄고사리를 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 넉줄고사리 추출물의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 넉줄고사리 추출물의 추출용매는 에탄올일 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 알코올은 100% 알코올이거나 알코올의 희석수 예컨대 알코올을 1 내지 99%(v/v)로 물에 희석하여 제공될 수 있다.
상기 에탄올은 10 %(v/v) 내지 100 %(v/v), 20 %(v/v) 내지 100%(v/v), 30 %(v/v) 내지 99 %(v/v), 50 %(v/v) 내지 95 %(v/v), 또는 70 %(v/v) 내지 90 %(v/v)의 농도일 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 에탄올은 20 %(v/v) 내지 100 %(v/v)의 농도일 수 있다.
상기 추출물의 추출온도는, 4℃내지 120℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 추출시간은 12시간 내지 120시간일 수 있다. 상기 추출온도가 4℃보다 낮은 경우 추출이 잘 안 될 수 있으며, 120℃를 넘는 경우 추출물이 변성될 수 있다. 상기 추출시간이 12시간보다 낮은 경우 유효성분이 일부 추출되지 않을 수 있으며, 120시간을 넘길 경우 유효성분 이외의 불순물 성분이 함께 추출될 수 있으므로 바람직하지 않다. 또는 상기 추출온도는 상온일 수 있다.
필요에 따라 추출과정은 1 내지 10회, 예를 들어 2 내지 5회 반복할 수 있다.
또한, 상기 추출물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있고, 필요에 따라 농축하여 사용될 수 있지만, 이제 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다. 일 구체 예에서, 넉줄고사리를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다. 일 구체 예에서, 넉줄고사리 추출물은 용매의 극성에 따라 분획할 수 있다.
상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, C1 내지 C4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(n-hexane, Hx), 디클로로메탄(dichloromethane, DCM), 에틸아세테이트(EA) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체 예에서, 상기 넉줄고사리 추출물을 얻은 후 용매 극성에 따라 분획하여 분획물을 얻을 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 분획물은 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 또는 물로 분획된 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 분획물은 에틸아세테이트로 분획된 것일 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 분획물은 넉줄고사리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.
상기 분획 용매에 사용되는 유기용매는 예를 들어, 0 %(v/v) 내지 99 %(v/v) 수용액이거나 또는 농도 100%(v/v)의 용매일 수 있다. 상기 분획온도는 4℃ 내지 120℃에서 수행될 수 있다. 또는, 상기 분획온도는 상온일 수 있다. 필요에 따라 분획과정은 1 내지 10회, 예를 들어 2 내지 5회 반복할 수 있다. 필요에 따라 분획과정 전에 추출물의 현탁 과정을 거칠 수 있다. 상기 분획과정을 수행하여 수득한 분획추출물은 진공회전농축기 또는 진공건조기를 사용하여 농축한 후, 실온에서 보관할 수 있다.
또한, 상기 추출물 또는 분획물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있고, 필요에 따라 농축하여 사용될 수 있지만, 이제 제한되는 것은 아니다.
아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precusor protein, APP)은 α,β,γ-시크리타제(α,β,γ-secretase)에 의해 나뉘어지고 N-말단 단백질들은 상등액으로 유리되며 C-말단 단백질들은 세포 내에 존재하게 된다. 베타아밀로이드(Aβ)는 APP 단백질에서 잘려져 나온 파편이고, 이것의 생성에 관여하는 효소 중 가장 중요한 것이 베타시크리타제 (BACE1)이다.
일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 넉줄고사리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리되는 화합물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 일 구체 예에서, 베타아밀로이드 생성 억제 능력을 측정한 결과, 넉줄고사리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 가장 우수한 베타아밀로이드 생성 억제 활성을 보였다.
일 구체 예에서, 넉줄고사리 뿌리 및 뿌리줄기를 80% 에탄올로 추출한 후 용매 극성에 따라 분획하고 각 분획물의 베타아밀로이드 생성 억제 여부를 측정한 결과 에틸아세테이트층(에탈아세테이트 분획물)이 가장 효과적으로 베타아밀로이드의 생성을 억제하였다. 넉줄고사리 에틸아세테이트층(에탈아세테이트 분획물)의 베타아밀로이드 생성 억제효과는 베타아밀로이드 생성에 가장 중요한 효소인 베타시크리타제(β-secretase)의 활성을 감소시킴에 기인한 것이었다.
또한, 일 구체 예에 따른 넉줄고사리 추출물, 분획물, 및 이로부터 분리된 화합물들은 베타아밀로이드 응집을 억제하고, 베타아밀로이드 응집체를 해체시키는 효과를 나타내어 퇴행성 신경질환의 예방, 개선, 치료 등에 효과적으로 사용될 수 있다.
일 구체 예에서, 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 베타아밀로이드 생성 억제 효과가 있는 화합물을 활성추적단리(activity-guided isolation) 방법으로 분리할 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화합물은 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드 (1), (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드 (2), (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드 (4), 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드(5), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 화합물은 하기 화학식 1 내지 2, 4, 및 5와 같이 나타낼 수 있다.
[화학식]
상기 화합물들은 넉줄고사리로부터 유래되어 현저하게, 농도의존적으로 밀로이드 생성을 억제하고, 이는 베타시크리타제(β-secretase) 활성을 감소시킴에 기인한다.
또한, 상기 화합물들은 넉줄고사리로부터 유래되어 베타아밀로이드 응집을 억제할 뿐만 아니라, 응집된 베타아밀로이드를 해체하여 응집체의 양을 감소시키며, 베타아밀로이드 응집체에 의해 유발되는 신경독성을 감소시킬 수 있다.
이에 따라, 베타아밀로이드 생성이 감소되어 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 신경질환의 예방, 개선, 치료, 또는 학습 또는 기억력 개선 또는 인지기능 개선 효과를 나타낼 수 있고, 치매에 대한 보다 근본적인 치료법이 될 수 있다.
상기 화합물들은 다른 식물체에서 유래된 것도 포함될 수 있고, 구체적으로는 넉줄고사리에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체 예에서, 상기 유효성분은 넉줄고사리 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 얻어진 것일 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 분획물은 넉줄고사리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)"은 노화와 깊은 관련을 가지면서, 정상적인 노화의 과정과는 달리 급속하게 신경계의 일부 또는 뇌 전체에 비정상적인 신경세포의 죽음이 일어나 뇌와 척수의 기능이 상실되어 인지 능력, 보행-운동 능력 등이 감소하는 질환을 의미한다. 예컨대 중추신경계의 뇌와 척수 세포가 퇴화 또는 소실 등의 이유로 인해 표현적인 기능장애로 나타나는 질환을 의미한다. 일 구체 예에서, 퇴행성 신경질환은 퇴행성 뇌질환일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)"은 퇴행성 신경질환의 하나로서, 나이가 들어감에 따라 뇌에서 발생하는 질환을 말한다. 현재까지 잘 알려지지 않은 원인으로 뇌에서 특정 뇌세포군이 서서히 그 기능을 잃고 뇌신경계의 정보전달에 가장 중요한 뇌신경세포의 사멸, 뇌신경세포와 뇌신경세포 사이의 정보를 전달하는 시냅스의 형상이나 기능상의 문제 또는 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증가나 감소로 인하여 야기되는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아밀로이드(Amyloid)"는 수용성 단백질이 다양한 생화학적 조선에서 비수용성 특성을 나타냄으로써 단백질간 특이적 상호작용에 의해 형성된 섬유상 구조물을 지칭하며, 본 명세서에서 언급된 퇴행성 신경질환에서 관찰되는 공통된 단백질 응집물에 해당한다.
일 구체 예에서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Cerebral amyloid angiopathy), 전신성 아밀로이드증(systematic amyloidosis), 베타아밀로이드 관련 치매(Dementia associated with beta-amyloid), 파킨슨병(Parkinson's disease), 경도인지장애(Mild cognitive impairment), 노인성 치매, 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis 또는 Lou Gehrig disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-픽병(Niemann-Pick Disease), 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 아밀로이드성 뇌졸중(stroke), 다운 증후군(Down's syndrome), 노쇠(Senility), 다발성경화증, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 척수소뇌성 운동실조증, 및 치매(dementia)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 일 구체 예에서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 전신성 아밀로이드증, 베타아밀로이드 관련 치매, 파킨슨병, 경도인지장애, 및 노인성 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “알츠하이머병 (Alzheimer's disease)”은 뇌세포가 점진적으로 파괴되어 기억과 인지능이 점차로 상실되고 결국은 사망으로 이어지는 퇴행성 신경질환이다. 알츠하이머병에 걸린 환자의 뇌조직에는 베타아밀로이드(Aβ)라는 플라크(senile plaques)가 축적되고 뇌세포에는 신경섬유성 엉킴(neurofibrillary tangle, NFT)이 나타나며, 이로 인해 뇌조직 전반에 걸쳐 광범위한 퇴행성 위축이 일어난다. 본 명세서에서 “알츠하이머병”은 알츠하이머형 치매(Alzheimer type dementia)와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “대뇌 아밀로이드 맥관병증(Cerebral amyloid angiopathy)”은 피질과 연수막의 뇌혈관 벽에 아밀로이드가 침착되는 질환이다. 대뇌 아밀로이드 맥관병증은 뇌엽성 뇌출혈, 치매, 일과성 허혈발작, 간질발작 등을 일으킨다. 알츠하이머병에서 뇌 아밀로이드 혈관병증의 빈도가 80-90%에 달한다는 연구결과들도 있으며, 알츠하이머병과 깊이 연관되는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “전신성 아밀로이드증 (systematic amyloidosis)”은 몸 전체에 걸쳐 아밀로이드 (amyloid) 단백질이 조직이나 장기에 지나치게 쌓여서 조직이나 장기의 기능 장애를 일으키는 질환을 총칭한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “베타아밀로이드 관련 치매(Dementia associated with beta-amyloid)”는 알츠하이머병으로 야기되는 치매, 즉, 베타아밀로이드가 뇌조직에 침착되어 발병하는 치매를 말하며, 베타아밀로이드의 침착으로 야기된 치매를 포함한다. 이 병이 있는 환자는 기억력이 서서히 감퇴될 뿐만 아니라, 현재 자기가 처한 상황을 정확히 이해하는 능력을 상실하게 되며, 학습능력, 언어능력 및 판단능력이 감퇴하고 나아가 자기 자신을 보살피는 능력까지 상실하는 치매 (dementia)에 이르게 된다. 알츠하이머병에 걸린 환자의 뇌는 점차로 그 손상이 심해지면서 중추신경계는 물론 자율신경계의 기능까지 침해되어 전반적인 건강상태가 악화된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "파킨슨병(Parkinson's disease)"은 뇌의 흑질(substantia nigra)에 분포하는 도파민의 신경세포가 점차 소실되어 발생하며 안정떨림, 경직, 운동완만(운동느림) 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “경도인지장애”는 기억력이나 기타 인지기능의 저하가 객관적인 검사에서 확인될 정도로 뚜렷하게 감퇴된 상태이나, 일상생활을 수행하는 능력은 보존되어 있어 아직은 치매가 아닌 상태를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “노인성 치매(senile dementia)”는 정상적으로 생활해오던 사람이 65세 이후 다양한 원인에 의해 뇌기능이 손상되면서 이전에 비해 인지 기능이 지속적이고 전반적으로 저하되어 일상생활에 상당한 지장을 주게 되는 질환이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치매(dementia)"는 정상적으로 생활해오던 사람이 다양한 원인에 인해 뇌기능이 손상되면서 이전에 비해 인지 기능이 지속적이고 전반적으로 저하되어 일상생활에 상당한 지장이 나타나는 질환이며, 알츠하이머성 치매, 베타아밀로이드 관련 치매(Dementia associated with beta-amyloid), 노인성 치매(Senile dementia), 루이 소체 치매(Lewy Body Dementia), 다경색 치매(Multi-infarct dementia), 뇌졸중 관련 치매(Dementia associated with stroke), 파킨슨 질환 관련 치매(Dementia associated with Parkinson's disease), 혈관성 치매, 및 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia)를 포함할 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 퇴행성 신경질환은 베타아밀로이드(β-amyloid) 응집에 의해 유발되는 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 퇴행성 신경질환은 뇌내 베타아밀로이드 축적을 주된 원인으로 하는 질환일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 베타아밀로이드(β-amyloid) 생성을 억제할 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 베타-시크리테이즈(β-secretase) 활성을 감소시킬 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 베타아밀로이드 응집을 억제하고/하거나 응집된 베타아밀로이드를 해체할 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 아세틸콜린 함량을 증가시킬 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 아세틸콜린에스터라제 활성도를 감소시킬 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 베타아밀로이드 침착을 감소시킬 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 기억과 인지기능에 중요한 시냅스 가소성에 관여하는 BDNF 및 p-CREB의 발현을 증가시킬 수 있다.
신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)는 인지 및 기억력 향상효과를 갖는 작용 기전으로 장기기억 형성과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다.
사이클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질(cyclic AMP-response element binding protein, CREB)은 뇌의 신경 가소성(neuronal plasticity) 및 장기 기억 형성에 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
또한, 일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 이를 투여한 개체의 기억력을 현저하게 개선할 수 있다.
일 구체 예에 따른 넉줄고사리 뿌리 또는 뿌리줄기의 에탄올 추출물, 분획물, 또는 이로부터 분리된 화학식 1 내지 4의 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 베타아밀로이드 생성을 억제하거나, 베타아밀로이드 생성에 가장 중요한 효소인 베타-시크리테이즈 활성을 감소시킴으로써 퇴행성 신경질환을 치료, 개선, 예방할 수 있다.
또한, 일 구체 예에 따른 넉줄고사리 뿌리 또는 뿌리줄기의 에탄올 추출물, 분획물, 또한 이로부터 분리된 화합물은 스코폴라민을 투여한 생쥐의 기억력을 현저하게 개선한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유효성분으로 포함"은 목적하는 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양으로 포함되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 조성물 내 넉줄고사리 추출물, 분획물 또는 이로부터 유래된 화합물의 함량은 적용 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 1 내지 99 중량%, 바람직하게는 10 내지 90 중량%, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 중량%로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체 예에 따른 조성물에서 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화학식 1 내지 5의 화합물은 0.1 ㎍/mL 내지 1000 ㎍/mL, 예를 들어 0.1, 0.5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12.5, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 500, 700, 900, 1000 ㎍/mL 또는 앞의 값 중 어느 하나를 상한 또는 하한으로 하는 범위 예컨대 1 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL, 5 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL, 10 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL, 1 내지 90 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 내지 80 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 내지 70 ㎍/mL, 1 ㎍/mL 내지 60 ㎍/mL, 또는 1 ㎍/mL 내지 50 ㎍/mL 일 수 있다.
일 구체 예에 따른 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화학식 1 내지 5의 화합물을 포함하는 조성물의 투여량은 0.1 mg/kg 내지 1000 mg/kg, 예를 들어 0.1, 0.5, 0,75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12.5, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 500, 700, 900, 1000 mg/kg 또는 앞의 값 중 어느 하나를 상한 또는 하한으로 하는 범위 예컨대 1 mg/kg 내지 500 mg/kg, 5 mg/kg 내지 400 mg/kg, 5 mg/kg 내지 200 mg/kg, 10 mg/kg 내지 200 mg/kg, 10 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 내지 400 mg/kg, 10 mg/kg 내지 300 mg/kg, 10 mg/kg 내지 200 mg/kg, 20 mg/kg 내지 200 mg/kg, 또는 50 mg/kg 내지 200 mg/kg 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 신경질환이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 신경질환의 진행을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 “약학적으로 허용 가능한”은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 일 구체 예에서, 상기 유효성분은 약학적으로 허용 가능한 염 형태로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이의 약학적으로 허용가능한 염" 또는 "이의 식품학적으로 허용가능한 염"은 일반적으로 안전하며, 무독성이고, 생물학적으로도 다른 측면으로도 부적합하지 않아 약학적 및 식품학적 조성물의 제조에 사용가능함을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "약학적 조성물"은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여를 위한 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 약학적 조성물은 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 환제, 산제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 및 과립제로 이루어지는 군중에서 선택된 제제로 제형화된 것일 수 있다.
다른 일 양상은 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드, 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
다른 일 양상은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이때, 상기 퇴행성 신경질환, 추출물, 분획물, 이로부터 분리된 화합물, 예방 및 치료의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 명세서에서 사용된 용어 "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개체"는 퇴행성 신경질환이 발병하였거나, 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 개, 고양이, 햄스터, 기니피그 등의 포유류, 앵무새, 카나리아 등의 조류, 다른 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있고, 또는 인간과 함께 더불어 사는 반려동물일 수 있다.
일 구체 예에서, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법은 개체에 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 고형분을 기준으로 1일 0.0001 내지 500 mg/체중 kg으로, 더욱 구체적으로 0.01 내지 500 mg/체중 kg으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 구체 예에 따른 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료방법에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
다른 일 양상은 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드, 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
다른 일 양상은 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드, 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 학습 또는 기억력 개선, 또는 인지기능 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또 다른 일 양상은 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드, 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 학습 또는 기억력 개선, 또는 인지기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “학습 또는 기억력 개선"이란 학습 기능 저하 또는 기억력 감퇴 증세가 본 발명에 따른 넉줄고사리 추출물, 분획물 또는 이로부터 유래된 화합물에 의해서 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명의 용어, "인지기능 개선"이란 인지능력의 감퇴 증세가 본 발명에 따른 추출물, 분획물 또는 넉줄고사리로부터 유래된 화합물에 의해서 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
이때, 상기 퇴행성 신경질환, 추출물, 분획물, 이로부터 분리된 화합물, 및 예방의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개선"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
일 구체 예에 다른 식품용 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 파킨슨병 개선 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “건강기능식품(functional food)”은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 '기능(성)'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 퇴행성 신경질환 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
상기 건강기능식품은 본 발명의 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
상기 식품용 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품용 조성물은 필요에 따라 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산나트륨, 아초산나트륨 등), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 유화제, 증점제, 피막제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
다른 일 양상은 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드, 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 사료용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 퇴행성 신경질환, 추출물, 분획물, 이로부터 분리된 화합물, 및 예방 또는 개선의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 사료용 조성물은 가축, 또는 반려동물과 같이 인간 이외의 개체의 퇴행성 신경질환 발병 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있으며, 기능성 사료첨가제, 또는 사료용 조성물로 활용할 수 있다.
상기 사료용 조성물은 투여를 위해서 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 사료용 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료용 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다.
상기 사료용 조성물은 가축사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏ 당 약 10 내지 500 g, 구체적으로는 10 내지 100 g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거치는 것이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "가진다", "가질 수 있다", "포함한다", 또는 "포함할 수 있다" 등의 표현은 해당 특징(예: 수치, 또는 성분 등의 구성요소)의 존재를 가리키며, 추가적인 특징의 존재를 배제하지 않는다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것 본 명세서에서 사용된 성분의 양, 분자량과 같은 특성들, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자들은 달리 명시되지 않는 한, 모든 경우에 용어 "약(about)"에 의해 수식되는 것으로 이해된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 숫자들은 본 발명에 의하여 얻고자 하는 바람직한 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 소정의 값 또는 범위의 5% 이내, 바람직하게는 1% 내지 2% 이내를 의미한다.
일 구체 예에 따른 넉줄고사리 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 유효성분인을 포함하는 약학적 조성물은 알츠하이머병으로 비롯한 퇴행성 신경질환의 원인 물질인 베타아밀로이드의 생성을 감소시키고, 베타아밀로이드 생성에 가장 중요한 효소인 베타시크리타제의 활성을 감소시킬 수 있다. 또한, 일 구체 예에 따른 넉줄고사리 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리한 유효성분을 포함하는 약학적 조성물은 아세틸콜린 함량을 증가시키고, 아세틸콜린에스터라제 활성도를 감소시키며, 베타아밀로이드 침착을 감소시키고, 기억과 인지기능에 중요한 시냅스 가소성에 관여하는 BDNF 및 p-CREB의 발현을 증가시킨다. 이에 따라, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 비정상적인 대사로 인하여 베타아밀로이드가 다량 생성되어 뇌세포에 독성을 일으킴에 따라 발병하는 퇴행성 신경질환을 치료하기 위한 보다 근본적인 치료제를 제공한다.
이에 따라, 일 구체 예에 따른 조성물은 알츠하이머병을 비롯한 퇴행성 신경질환의 예방, 개선, 치료, 또는 인기기능 개선을 위한 의약품, 식품, 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 알츠하이머병을 비롯한 뇌내 베타아밀로이드 축적과 관련한 질환을 앓고 있거나, 앓을 수 있는 환자에 대한 의약품, 보조제, 건강 식품 또는 기능성 식품으로 이용될 수 있고, 알츠하이머성 치매 치료를 위한 뇌조직 재생 용도로도 사용될 수 있다.
도 1은 넉줄고사리 추출물의 헥산(Hx), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EA), 및 물(DW) 분획물의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(Y축: 대조군에 대한 세포 생존율(%)).
도 2는 넉줄고사리 에탄올 추출물의 베타아밀로이드 생성에 미치는 효과를 나타낸 도이다. 도 2A는 전기영동을 통해 sAPPβ, 베타시크리타제 단백질을 분리한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸다. 도 2B 및 도 2C는 각각 항체 결합 방법으로 측정한 sAPPβ와 베타시크리타제의 함량(Y축: 대조군에 대한 %로 표시)을 나타낸다.
도 3은 넉줄고사리 추출물의 헥산(Hx), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EA), 및 물(DW) 분획물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 3A는 전기영동을 통해 sAPPβ, 베타시크리타제 단백질을 분리한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸다. 도 3B 및 도 3C는 각각 항체 결합 방법으로 측정한 sAPPβ와 베타시크리타제의 함량(Y축: 대조군에 대한 %로 표시)을 나타낸다.
도 4는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 1 및 2의 화합물의 분리 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 4의 화합물의 분리 과정을 나타낸 모식도이다.
도 6은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 5의 화합물의 분리 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7a는 화학식 1의 화합물에 대해 측정한 1H-NMR 자료이다. 도 7b는 화학식 1의 화합물에 대해 측정한 13C-NMR 자료이다.
도 8a는 화학식 2의 화합물의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸다. 도 8b는 화학식 2의 화합물의 13C-NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 9a는 화학식 4의 화합물의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸다. 도 9b는 화학식 4의 화합물의 13C-NMR 분석 결과를 나타낸다. 도 9c 및 도 9d는 각각 화학식 4의 화합물의 1H-NMR, 13C-NMR 분석에 대한 2D NMR 데이터 결과를 나타낸다.
도 10a는 화학식 5의 화합물의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸다. 도 10b는 화학식 5의 화합물의 13C-NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물의 구조식을 나타낸다.
도 12는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(Y축: 대조군에 대한 세포 생존율(%)).
도 13은 화학식 1 및 2 화합물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 화학식 4 화합물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 화학식 5 화합물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 스코폴라민 유발 마우스의 암실에서의 체류 시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(Y축: 체류 시간(초)).
도 17은 스코폴라민 유발 마우스의 탈출 대기 시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(Y축: 탈출 지연 시간(초)).
도 18은 넉줄고사리 추출물에 의한 아세틸콜린 함량의 변화를 나타낸 것이다(X축: 정상군(N), 스코폴라민처리군(C), 도네페질 0.75mg/kg+스코폴라민 처리군, 양성대조군(P), 넉줄고사리 200 mg/kg+스코폴라민 처리군(AL), 넉줄고사리 500 mg/kg+스코폴라민 처리군(AH), Y축: 농도(pg/mL)).
도 19는 넉줄고사리 추출물에 의한 아세틸콜린에스터라제 활성도의 변화를 나타낸 것이다(X축: 정상군(N), 스코폴라민처리군(C), 도네페질 0.75mg/kg+스코폴라민 처리군, 양성대조군(P), 넉줄고사리 200 mg/kg+스코폴라민 처리군(AL), 넉줄고사리 500 mg/kg+스코폴라민 처리군(AH), Y축: 활성도(mU/mL))
도 20은 넉줄고사리 추출물에 의한 베타아밀로이드 감소 효과를 나타낸 것이다 (정상군(N), 스코폴라민처리군(C), 도네페질 0.75mg/kg+스코폴라민 처리군, 양성대조군(P), 넉줄고사리 200 mg/kg+스코폴라민 처리군(AL), 넉줄고사리 500 mg/kg+스코폴라민 처리군(AH)).
도 21은 넉줄고사리 추출물에 의한 대뇌 BDNF, CREB, 및 p-CREB의 발현 변화를 나타낸 것이다(정상군(N), 스코폴라민처리군(C), 도네페질 0.75mg/kg+스코폴라민 처리군, 양성대조군(P), 넉줄고사리 200 mg/kg+스코폴라민 처리군(AL), 넉줄고사리 500 mg/kg+스코폴라민 처리군(AH)).
도 22는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물의 Thioflavin T 형광 분석 결과(%)를 나타낸 그래프이다. 이로부터 베타아밀로이드 응집 억제 효과가 확인된다.
도 23은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물의 Thioflavin T 형광 분석 결과(%)를 나타낸 그래프이다. 이로부터 베타아밀로이드 응집체 해체 효과가 확인된다.
도 24는 넉줄고사리 추출물에서 분리된 유효성분들의 Thioflavin T 형광 분석 결과(%)를 나타낸 그래프이다. 이로부터 베타아밀로이드 응집 억제 효과가 확인된다.
도 25는 넉줄고사리 추출물에서 분리된 유효성분들의 Thioflavin T 형광 분석 결과(%)를 나타낸 그래프이다. 이로부터 베타아밀로이드 응집체 해체 효과가 확인된다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)를 과발현하는 형질주입 세포주 (APP-CHO 세포 사용)의 세포배양
실험에 사용한 APP-CHO 세포주는 10% FBS가 함유된 RPMI 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 배지는 3일마다 교환해 주었다.
실시예 1. 넉줄고사리 추출물 및 분획물의 제조
넉줄고사리(Davallia mariesii) 뿌리 및 뿌리줄기 3 kg을 구입하여 분쇄기로 곱게 간 후 80 % 에탄올로 3회 추출하여(EtOH 20L, 3회)한 후 여과한 여액을 감압 농축하여 235.5 g의 넉줄고사리 에탄올 추출물을 확보하였다.
상기 확보한 넉줄고사리 에탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 분획하여 얻은 각 분획층으로부터 분획물을 얻었다. 구체적으로는 상기 확보한 추출물에 소량의 메탄올(10-20 mL)을 가해 녹인 후 물(4-5 L)에 현탁하고 n-헥산(n-hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 및 에틸아세테이트(ethylacetate)로 연속적으로 분획(각4-5 L씩 3회)하여 헥산 분획물(26.3 g), 디클로로메탄 분획물(1.6 g), 에틸아세테이트 분획물(29.1 g), 및 물 분획물(170.3 g)을 얻었다.
실험예 1. 넉줄고사리 추출물 및 분획물의 세포독성 평가 (MTT assay)
APP-CHO 세포에 대한 넉줄고사리 뿌리 및 뿌리줄기 추출물의 세포독성을 검사하기 위하여 MTT 기반 세포 독성 분석 (MTT-based cytotoxicity assay)을 실시하였다. 약물이 처리된 세포를 24시간 배양한 후, 5 mg/ml 농도의 MTT 용액을 넣고 3시간 배양하였다. 처리 약물로는 실시예 1에서 얻은 넉줄고사리 추출물과 미의 헥산(Hx), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EA), 및 물(DW) 각각의 분획물을 사용하였다. 각 분획물은 12.5, 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였다.
배지를 제거하고 DMSO를 넣어 30분간 용해시킨 후 Emax precision microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 동일한 방법으로 실시하되 넉줄고사리 뿌리 추출물을 처리하지 않은 군(DMSO 처리)을 대조군으로 하였다.
넉줄고사리 에탄올 추출물을 APP-CHO 세포에 처리한 결과 독성이 나타나지 않았다. 넉줄고사리 추출물은 실험에서 처리한 최고 농도인 100 ㎍/mL까지 세포 독성이 나타나지 않았다.
도 1는 넉줄고사리 추출물의 헥산(Hx), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EA), 및 물(DW) 분획물의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(Y축: 대조군에 대한 세포 생존율(%)).
상기 도 1와 같이, 물층을 제외한 분획물은 50 ㎍/mL까지 세포 독성이 나타나지 않았다.
실험예 2. 넉줄고사리 추출물 및 분획물의 베타아밀로이드 생성억제 효과 평가 : 웨스턴 블랏 분석을 이용한 sAPPβ, 베타시크리타제 수준 변화 측정
넉줄고사리 추출물 및 분획물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정하고, 이러한 효과가 베타시크리타제를 억제에 기인하는 지를 평가하였다. 이를 위해 웨스턴 블랏 분석(western blot analysis)을 이용하여 베타시크리타제(β-secretase), 및 그로 인해 생성되는 단편인 sAPPβ의 수준 변화를 측정하였다. 처리 약물로는 실시예 1 및 2에서 얻은 넉줄고사리 추출물, 이의 헥산(Hx), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EA), 및 물(DW) 각각의 분획물을 처리하였다. 양성대조군(PC)으로는 관중추출물(50 ㎍/mL)을 사용하였다.
처리 약물로는 실시예 1에서 얻은 넉줄고사리 추출물과 이의 헥산(Hx), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EA), 및 물(DW) 각각의 분획물을 사용하였다. 넉줄고사리 추출물은 12.5, 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도로 처리하였다. 각 분획물은 세포 독성이 나타나지 않는 최고 농도로 설정한 50 ㎍/mL의 농도로 처리하였다.
α,β,γ-시크리타제에 의해 나눠진 APP의 N-말단 단백질들은 상등액으로 유리되며 C-말단 단백질들은 세포 내에 존재하게 된다. 60 mm dish에 배양한 제조예 1에서 제조한 APP-CHO 세포들에 넉줄고사리 추출물 또는 분획물을 다양한 농도로 24시간 처리한 후 상등액은 원심분리 (1000 x g, 10분)하여 따로 보관하고, 남아 있는 세포는 PBS로 세척하고 트립신(trypsin)을 넣어 3분간 배양한 다음 떼어내어 EP튜브로 옮겼다. 1000 x g에서 원심분리를 통해 세포 펠릿(cell pellet)을 만든 후 상등액을 제거하고 Lysis buffer 50μl를 넣었다. 30분 동안 -20℃에서 용해시켜 단백질을 추출한 후 SMART™ BCA kit(Intron, Korea)를 이용하여 정량하였다. 추출한 단백질과 상등액에 sample loading buffer를 넣고 100℃ 끓는 물에 10분 동안 끓인 후 사용할 때까지 -20℃에 보관했다. 7.5% gel 또는 15% Acrylamide gel로 전기영동을 통해 단백질을 분리한 후 PVDF membrane으로 옮겼다. PVDF membrane의 항체에 대한 비특이적 결합을 차단하기 위하여 blocking buffer (5% skin milk in PBS) 용액에서 1시간 동안 반응시킨 후 Tween 20을 함유한 PBS 용액 (0.1% PBST)으로 15분간 3번 세척 후 각 검증 단백질에 대한 1차 항체를 첨가하여 4℃에서 12시간 반응시켰다.
사용한 1차 항체는 β-secretase antibody (1:1000, Abcam), APP c-terminal antibody (1:1000, Sigma A8717), sAPPβ antibody (1:1000, IBL 18957), beta-actin antibody (1:1000, BD biosciences, CA, USA)이다.
PBST 용액으로 15분간 3번 세척한 다음 2차 항체 (5% skin milk in PBS)로 1시간 반응시켰다. 이어서 ECL-spray (Advanta, CA, USA)로 반응시킨 후 G:Box iChemiXT Imager (Syngene, Cambridge, UK) 상에서 단백질을 확인하였다. 동일한 방법으로 실시하되 넉줄고사리 뿌리 추출물 또는 분획물을 처리하지 않은 군(DMSO 처리)을 음성대조군으로 하고, 양성대조군을 관중추출물 처리군으로 하였다.
도 2는 넉줄고사리 에탄올 추출물의 베타아밀로이드 생성에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 2A는 전기영동을 통해 sAPPβ, 베타시크리타제 단백질을 분리한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸다. 도 2B 및 도 2C는 각각 항체 결합 방법으로 측정한 sAPPβ와 베타시크리타제의 함량(Y축: 대조군에 대한 %로 표시)을 나타낸다.
도 2에서와 같이, 넉줄고사리 추출물은 12.5 ㎍/mL 부터 100 ㎍/mL까지의 농도에서 농도 의존적으로 sAPPβ의 생성을 억제하고, 베타시크리타제 발현양도 유의미하게 감소시켰다.
넉줄고사리 추출물 처리 시, 상등액으로 유리된 sAPPβ가 음성대조군에 비해 농도 의존적으로 감소되었다(도 2B).
또한 β-시크리타제의 단백질량을 측정한 결과도 역시 농도 의존적으로 양성 대조군에 비해 현저히 감소하는 결과를 나타내었다(도 2C).
도 3은 넉줄고사리 추출물의 헥산(Hx), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EA), 및 물(DW) 분획물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 각 분획물은 세포 독성이 나타나지 않는 최고 농도로 설정한 50 ㎍/mL의 농도로 처리하였다.
도 3A는 전기영동을 통해 sAPPβ, 베타시크리타제 단백질을 분리한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸다. 도 3B 및 도 3C는 각각 항체 결합 방법으로 측정한 sAPPβ와 베타시크리타제의 함량(Y축: 대조군에 대한 %로 표시)을 나타낸다.
도 3에서와 같이, 넉줄고사리 추출물의 분획물 중 에틸아세테이트(EA) 분획물이 가장 현저하게 sAPPβ의 생성을 억제하고, 베타시크리타제 발현양도 유의미하게 감소시켰다.
실시예 2. 넉줄고사리 추출물로부터 화학식 1, 2, 4 및 5의 화합물 분리 및 동정
넉줄고사리 추출물에 함유된 유효성분을 activity-guided isolation 법으로 분리하였으며 그 결과 4개 활성 물질을 분리, 구조 동정하였다.
실시예 1에서 얻은 에틸아세테이트 층(에틸아세테이트 분획물)에 대해 컬럼크로마토그라피를 실시하였다. 실리카겔을 고정상으로 사용하고 이동상으로 chloroform : MeOH = 100 : 1을 사용한 컬럼크로마토그라피를 시행하였고, 13개의 소분획물(subfraction) (DME1~DME13)를 얻었다. 이로부터 아래와 같은 방법으로 화학식 1, 2, 4 및 5의 화합물을 분리하였다.
(1) 화학식 1 및 2의 화합물
위에서 얻은 소분획물 중 DME8을 실리카겔을 고정상으로 사용하고 이동상으로 chloroform : MeOH = 100 : 5을 사용한 컬럼크로마토그라피를 시행하였고 7개의 subfractions (DME8-1~DME8-7)를 얻었다. 이 중 DME8-5-3을 Sephadex LH-20 (10% MeOH)를 사용한 컬럼크로마토그라피로 분리한 결과 DME8-5-3-1 (compound 1, 32.0 mg)와 DME8-5-3-3 (compound 2, 11.2 mg)을 순물질로 확보하였다.
도 4는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 1 및 2의 화합물의 분리 과정을 나타낸 모식도이다.
(2) 화학식 4의 화합물
위에서 얻은 소분획물 중 DME11를 실리카겔 컬럼크로마토그라피로 분리한 결과 (이동상 chloroform : MeOH = 100 : 1) 9개의 subfractions (DME11-1~DME11-9)이 확보되었으며, 이 중 DME11-4을 Sephadex LH-20 (10% MeOH)를 사용한 컬럼크로마토그라피로 분리한 결과 DME11-4-5 (compound 4, 107.34 mg)을 순물질로 확보하였다.
도 5는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 4의 화합물의 분리 과정을 나타낸 모식도이다.
(3) 화학식 5의 화합물
위에서 얻은 소분획물 중 DME11-6을 Sephadex LH-20 (10% MeOH)을 이용한 컬럼크로마토그라피법로 분리한 결과 DME11-6-6 (compound 5, 15.36 mg)을 순물질로 확보하였따.
도 6은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 5의 화합물의 분리 과정을 나타낸 모식도이다.
(4) 화학식 1, 2, 4 및 5의 화합물의 동정
넉줄고사리에 함유된 베타아밀로이드 생성을 억제하는 활성 성분을 분리하기 위해 activity-guided isolation을 시행하였고 그 결과 5개의 물질이 분리되었다. 이 중에 활성이 있는 4개의 화합물 (compounds 1, 2, 4, 5)에 대해 구조 분석을 완료하였다. 상기 화합물에 대한 구조는 NMR 결과와 참고문헌과의 자료를 함께 비교하여 분석하였다. 분석 결과는 다음과 같다.
화학식 1의 화합물(compound 1): (-)-Epiafzelechin-3-O-β-D-allopyranoside
화학식 2의 화합물(compound 2): (2S)-5,7,3’,5’-tetradroxy-flavanone 7-O-β-D-glucopyranoside
화학식 4의 화합물(compound 4): (2S)-5,7,3’,5’-tetradroxy-flavanone 7-O-hesperidoside
화학식 5의 화합물(compound 5): 7-O-methyl-epiafzelechin-(4α→8)-epiafzelechin-3-O-β-glucopyranoside
도 7a는 화학식 1의 화합물에 대해 측정한 1H-NMR 자료이다. 도 7b는 화학식 1의 화합물에 대해 측정한 13C-NMR 자료이다.
도 8a는 화학식 2의 화합물의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸다. 도 8b는 화학식 2의 화합물의 13C-NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 9a는 화학식 4의 화합물의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸다. 도 9b는 화학식 4의 화합물의 13C-NMR 분석 결과를 나타낸다. 도 9c 및 도 9d는 각각 화학식 4의 화합물의 1H-NMR, 13C-NMR 분석에 대한 2D NMR 데이터 결과를 나타낸다.
도 10a는 화학식 5의 화합물의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸다. 도 10b는 화학식 5의 화합물의 13C-NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 4개의 활성 성분인 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물의 구조식을 나타낸다.
실험예 3. 넉줄고사리 추출물로부터 분리한 화합물의 세포독성 평가
실시예 2에서 얻은 넉줄고사리 추출물로부터 분리한 화학식 1, 2, 4 및 5의 화합물에 대한 세포독성을 평가하였다. 처리 약물로 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물의 화합물 10, 50㎍/mL을 사용한 것을 제외하고는 실험예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.
도 12는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(Y축: 대조군에 대한 세포 생존율(%)).
도 12에서와 같이, 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물은 모두 10, 50㎍/mL의 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았다.
실험예 4. 넉줄고사리 추출물로부터 분리한 화합물의 베타아밀로이드 생성억제 효과 평가 : 웨스턴 블랏 분석을 이용한 sAPPβ, 베타시크리타제 수준 변화 측정
실시예 2에서 얻은 넉줄고사리 추출물로부터 분리한 화학식 1, 2, 4 및 5의 화합물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정하고, 이러한 효과가 베타시크리타제를 억제에 기인하는 지를 평가하였다. 처리 약물로 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물 10, 50㎍/mL을 사용한 것을 제외하고는 실험예 2와 동일한 방법으로 실시하였다.
도 13은 화학식 1 및 2 화합물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 화학식 4 화합물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 화학식 5 화합물의 베타아밀로이드 생성 억제 효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13 내지 15에서와 같이, 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물은 10, 50㎍/mL의 농도에서 농도의존적으로 베타아밀로이드 생성을 현저하게 억제하였으며, 이러한 효과는 베타시크리타제 발현량 감소와 일치하였다.
넉줄고사리 추출물에 4개의 활성 물질인, 화학식 1, 2, 4, 및 5 화합물이 농도의존적으로 베타아밀로이드의 생성을 억제하고, 그와 동시에 β-시크리타제의 단백질량 또한 현저히 감소함을 확인하였다.
실험예 5. 넉줄고사리 추출물 및 분획물의 인지기능 개선 효과 평가
넉줄고사리 추출물의 인지기능 개선 효과를 스코폴라민으로 기억력 손실을 유발한 생쥐모델(ICR마우스 6주령, male)를 이용하여 실험하였다.
각 실험군은 정상군(N)(비히클만 투여), 음성대조군(C)(비히클 투여 후 스코폴라민 처리), 양성대조군(P)(도네페질 0.75mg/kg 투여 후 스코폴라민 처리), 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL)(넉줄고사리 추출물 200 mg/kg 투여 후 스코폴라민 처리), 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH)(넉줄고사리 추출물 500 mg/kg 투여 후 스코폴라민 처리)으로 나누었으며, 각군은 9 마리였다.
시험물질로 비히클, 도네페질, 또는 넉줄고사리 추출물을 28일간 투여하였다. 투여 종료 후 정상군을 제외한 각 군은 스코폴라민 5 mg/kg를 복강 투여(i.p.)로 처리하였다.
(1) 행동 테스트
(1.1) 수동회피실험 (Passive avoidance test)
기억력 손상이 유도된 실험동물을 평가하기 위해 avoidance system (GEMINI, USA) 장비를 이용하여 수동회피실험을 진행하였다. 25 cm × 15 cm 크기의 2개 방 (dark, bright)이 있고, 방 사이는 칸막이 문 (connecting guillotine door : 10 × 10 cm)이 위치한다. 전구가 설치된 밝은 방에 실험동물을 넣고 칸막이를 열어주어 조명이 없는 어두운 방으로 들어가게 될 때, 0.5 Ma의 전기 자극이 3초간 grid 바닥을 통해 흘러 실험동물이 60초 중 어두운 상자에 머무는 시간을 측정하였다.
도 16은 스코폴라민 유발 마우스의 암실에서의 체류 시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(X축: 정상군(N), 음성대조군(C), 양성대조군(P), 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL), 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH), Y축: 체류 시간(초)).
도 16에서와 같이, 수동회피실험 결과, 스코폴라민 투여로 인해 수동 회피반응을 하는데 걸리는 시간이 증가하는 경향을 보였으며, 음성대조군(스코폴라민처리군)(C) 대비 정상군(N)에서는 유의적인 수준으로 감소하였다 (p<0.005).
또한, 넉줄고사리뿌리 추출물(AL: 200 mg/kg 투여군, AH: 500 mg/kg 투여군)을 투여한 생쥐군의 경우 스코폴라민만을 처리한 음성대조군(C)보다 수동회피반응 시간이 감소하는 경향을 나타내었다.
(1.2) 수중미로실험 (Water maze test)
실험동물의 공간지각능력 및 단기, 장기 기억력의 회복에 도움을 주는지 측정할 수 있는 실험이다. Morris 방법을 응용하여 100 cm (W) × 30 cm (H)의 원형 수조 속에 물 (온도 20 ± 2 ℃)을 채우고, 도피대는 수면의 높이에 맞춰 설치하였고, 물에 검은색 물감을 풀어 불투명하게 하여 도피대가 잘 보이지 않게 하였다. 실험동물이 도피대를 찾아 올라갈 때까지 걸리는 시간을 탈출 지연(escape latency) 시간으로 하였으며, 개체당 최대 수영 시간을 120초로 하였다.
도 17은 스코폴라민 유발 마우스의 탈출 대기 시간을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(X축: 정상군(N), 음성대조군(C), 양성대조군(P), 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL), 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH), Y축: 탈출 지연 시간(초)).
도 17에서와 같이, 수중미로실험 결과에서도 스코폴라민처리군(C)군은 정상군(N)에 비해 현저히 증가하였으며, 넉줄고사리 추출물(AL: 200 mg/kg 투여군, AH: 500 mg/kg 투여군) 투여군의 경우 스코폴라민만을 처리한 음성대조군(C)군에 비해 감소하는 경향을 나타내었다.
도 16 및 도 17에서, 1) 값은 7회 실험 그룹에 대한 평균 ± SE로 표시된다.
2) *p<0.05 vs. C, #p<0.005 vs. C
이와 같은 스코폴라민 투여로 인지 손상을 유도한 생쥐 모델에서 행동실험 결과 넉줄고사리추물물 투여군에서 농도의존적으로 기억력저하를 개선하는 효과를 나타냄과 인지기능 개선 경향성을 확인하였다.
(2) ELISA
(2.1) 아세틸콜린(ACh) 함량 변화 측정
생쥐 모델 부검 시 적출된 뇌 조직을 차가운 0.1M PBS에 균질화하였다. 5,000 rpm에서 10분간 원심분리 (4℃)하여 상층액을 분리하였고, Mouse Acetylcholine, Ach ELISA Kit(Cat.no#MBS160373, Mybiosource, USA)를 이용하여 아세틸콜린 함량을 측정하였다. 아세틸콜린 함량 측정을 위해 96-wellplate에 뇌 조직 효소원 40μL 분주 후 anti-Ach antibody 10μL을 추가하였다. 또한, streptavidin-HRP시약을 50μL씩 분주 후 잘 혼합하여 밀봉 후 37℃에서 배양하였다. Plate세척 후 substrate solution A와 B를 50μL씩 넣고 차광하여 37℃에서 약 10분 배양 후 stop solution을 50μL 분주 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 18은 넉줄고사리 추출물에 의한 아세틸콜린 함량의 변화를 나타낸 것이다(X축: 정상군(N), 음성대조군(C), 양성대조군(P), 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL), 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH), Y축: 농도(pg/mL)).
도 18에서와 같이, 음성대조군(C)에 비해 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL) 및 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH)에서 아세틸콜린의 함량이 증가하였다.
(2.2) 아세틸콜린에스터라제(AChE) 활성도 변화 측정
부검 시 적출된 뇌 조직을 차가운 0.1M PBS에 균질화하였다. 5,000 rpm에서 10분간 원심분리 (4℃)하여 상층액을 분리하였고, Mouse Acetylcholinesterase ELISA Kit(Cat.no#MBS721845, Mybiosource,USA)를 이용하여 아세틸콜린에스터라제 활성을 측정하였다. 아세틸콜린에스터라제 활성 측정을 위해서는 96-wellplate에 뇌 조직 효소원 100 μL분주 후 balance solution 10μL을 추가하였다. 그리고 conjugate 시약을 50 μL씩 추가 후 잘 혼합하여 밀봉 후 37 ℃에서 배양하였다. Plate 세척 후 substrate A와 B시약을 각 50μL씩 넣고 차광하여 37℃에서 약 15-20분 배양 후 stop solution을 50μL분주 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 19는 넉줄고사리 추출물에 의한 아세틸콜린에스터라제 활성도의 변화를 나타낸 것이다(X축: 정상군(N), 음성대조군(C), 양성대조군(P), 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL), 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH), Y축: 활성도(mU/mL))
도 19에서와 같이, 음성대조군(C)에 비해 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL) 및 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH)에서 아세틸콜린에스터라제 활성도가 감소하였다.
도 18 및 도 19에서, 1) 값은 7회 실험 그룹에 대한 평균 ± SE로 표시된다.
2) *p<0.05 vs. C, #p<0.005 vs. C
도 18 및 도 19의 결과는 넉줄고사리 추출물을 투여하는 경우 스코폴라민에 의해 증가된 아세틸콜린에스터라제(AChE)의 활성을 감소시켜 시냅스에 신경전달물질인 ACh의 양이 늘어나게 함으로 인지기능 개선에 도움이 되었다는 것을 시사한다.
(3) 면역조직화학(Immunohistochemistry)
p-CREB, CREB, BDNF와 β-amyloid의 발현 양상을 측정하기 위해 면역조직화학염색을 시행하였다. 부검 시 적출한 뇌 조직을 10% 포르말린에 24시간 동안 고정 후 10%, 20% sucrose용액에 12시간씩 순차적으로 교환해준 다음 30% sucrose용액에서 3일간 보관하였다. 절편을 제작하여 슬라이드에 부착 후 1% bovine serum albumin이 포함된 1차 항체와 biotinylation된 2차 항체를 각각 반응시켰다. 사용한 1차 항체는 다음과 같다: -amyloid antibody (MOAB-2, 1 : 100, Novus Biologicals, Centennial, CO, USA), BDNF antibody (1 : 200, Novus Biologicals), CREB antibody (1 : 500) 및 p-CREB antibody (p-Ser133, 1 : 100, Novus Biologicals).
세척 후 avidin-biotin-peroxidase complex와 반응하고 발색 시약 (0.05% 3,3-diaminobenzide and 0.02% H2O2)을 이용하여 발색시킨 다음 일반 광학현미경 (Nikon, E600, Japan)을 이용하여 100배율로 촬영하였다.
p-CREB: 활성화된 CREB(인산화된 상위 전사인자).
CREB(cAMP response element-binding protein): 전사조절인자로서 미토겐(Mitogen), 뉴로트로핀(Neurotrophin)을 비롯한 다른 여러 신경성장요소들에 의해 활성화된다(CREB는 활성화되기 전 형태).
BDNF(Brain-derived neurotrophic factor): 뇌유래신경영양인자(뉴런(신경세포)의 생존과 성장을 촉진하는 단백질로서, 기억력과 사고능력 등 인지기능을 보호하는 기능도 수행).
BDNF 및 p-CREB의 발현이 증가해야 인지기능 개선효과를 유발할 수 있다.
(3.1) 베타아밀로이드 침착 (Aβ deposition) 측정
도 20은 넉줄고사리 추출물에 의한 베타아밀로이드 침착 감소 효과를 나타낸 것이다 (정상군(N), 음성대조군(C), 양성대조군(P), 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL), 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH)).
도 20에서 붉은색 화살표시는 베타아밀로이드 침착된 부분을 표시한 것이다.
도 20에서와 같이, 음성대조군(C)에 비해 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL) 및 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH)에서 베타아밀로이드 침착이 감소하였다.
(3.2) BDNF, CREB, 및 p-CREB의 발현 변화 측정
도 21은 넉줄고사리 추출물에 의한 대뇌 BDNF, CREB, 및 p-CREB의 발현 변화를 나타낸 것이다(정상군(N), 음성대조군(C), 양성대조군(P), 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL), 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH)).
도 21에서와 같이, 음성대조군(C)에 비해 넉줄고사리 추출물 저용량 처리군(AL) 및 넉줄고사리 추출물 고용량 처리군(AH)에서 BDNF 및 p-CREB의 발현이 증가하였다.
기억과 인지기능에 중요한 시냅스 가소성에 관여하는 BDNF/CREB 시그널링(signaling)을 통해 넉줄고사리 추출물이 인지 기능 개선에 도움을 주는 점을 알 수 있다.
실험예 6. 넉줄고사리 추출물 및 분획물의 베타아밀로이드 응집 억제 평가 : Thioflavin T assay (티오풀라빈 T 형광 분석)
넉줄고사리 추출물 및 분획물의 베타아밀로이드 응집 억제 효과를 티오플라빈 T (Thioflavin T) 형광 분석법(ThT assay)으로 측정하였다.
단량체에서 올리고머 및 피브릴(fibril)로의 베타아밀로이드 (Aβ)의 응집은 신경 독성을 유도하고 신경세포 사멸을 유발하는 것으로 알려져 있다. 티오플라빈 T 형광 분석법으로 베타아밀로이드 응집체(Aβ aggregate)의 양을 측정하여, 넉줄고사리 에탄올 추출물, 이로부터 얻은 각 분획물에 의해 피브릴로의 자기 응집(self-aggregation)이 억제되는 정도를 평가하였다.
베타-아밀로이드를 96 well plate에 최종농도가 20 μM 되도록 분주한 후 실시예 1에서 제조된 100, 20, 4 ㎍/mL 농도(최종농도)의 넉줄고사리 에탄올 추출물, 그리고 헥산 분획물(Hx), 디클로로메탄 분획물(DCM), 에틸아세테이트 분획물(EA), 및 물 분획물(DW)을 가하고 각각 37 ℃에서 24시간 반응시켰다. 그 후 티오플라빈 T 시험 용액 (ThT solution) (thioflavin with 100 mM glycine, pH 8.5)을 넣어 최종농도가 3 μM이 되도록 추가하고 20분 반응시킨 후 형광양을 442 excitation, 485 emission를 측정하는 형광측정기로 형광 값을 측정하였다. 동일한 방법으로 실시하되 넉줄고사리 에탄올 추출물 또는 분획물을 처리하지 않은 군(DMSO 처리)을 대조군으로 하였다.
Y축을 베타아밀로이드만을 처리한 군에 대한 형광 강도 %로 하여, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 22는 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물의 Thioflavin T 형광 분석 결과(%)를 나타낸 그래프이다. 이로부터 베타아밀로이드 응집 억제 효과가 확인된다.
도 22에서와 같이, 넉줄고사리 추출물은 농도 의존적으로 베타아밀로이드의 응집을 억제하였다.
또한, 넉줄고사리 추출물로부터 얻은 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물, 및 에틸아세테이트 분획물에서도 베타아밀로이드 응집 억제 효과를 보였고, 디클로로메탄과 에틸아세테이트 분획물이 가장 좋은 활성을 보였다.
실험예 7. 넉줄고사리 추출물 및 분획물의 베타아밀로이드 응집체 해체 활성 평가 : Thioflavin T assay (티오풀라빈 T 형광 분석)
넉줄고사리 추출물 및 분획물의 이미 응집된 베타아밀로이드 응집체를 해체하는 활성이 있는지 티오플라빈 T (Thioflavin T) 형광 분석법(ThT assay)으로 측정하였다.
베타-아밀로이드를 96 well plate에 최종농도가 20 μM 되도록 분주한 후 37 ℃에서 24시간 동안 미리 반응시켜 베타아밀로이드 응집체를 형성시켰다. 그 후 100, 20, 4 ㎍/mL 농도(최종농도)의 넉줄고사리 에탄올 추출물, 그리고 헥산 분획물(Hx), 디클로로메탄 분획물(DCM), 에틸아세테이트 분획물(EA), 및 물 분획물(DW)을 가하고 각각 37 ℃에서 24시간 더 반응시켰다. 그 후 티오플라빈 T 시험 용액 (ThT solution) (thioflavin with 100 mM glycine, pH 8.5)을 넣어 최종농도가 3 μM이 되도록 추가하고 20분 반응시킨 후 형광양을 442 excitation, 485 emission를 측정하는 형광측정기로 형광 값을 측정하였다. 동일한 방법으로 실시하되 넉줄고사리 에탄올 추출물 또는 분획물을 처리하지 않은 군(DMSO 처리)을 대조군으로 하였다.
Y축을 베타아밀로이드만을 처리한 군에 대한 형광 강도 %로 하여, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 23은 넉줄고사리 추출물 또는 이의 분획물의 Thioflavin T 형광 분석 결과(%)를 나타낸 그래프이다. 이로부터 베타아밀로이드 응집체 해체 효과가 확인된다.
도 23에서와 같이, 넉줄고사리 추출물은 농도 의존적으로 이미 응집된 베타아밀로이드의 응집체를 해체하는 활성을 나타냈다.
또한, 넉줄고사리 추출물로부터 얻은 헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물, 및 에틸아세테이트 분획물에서도 베타아밀로이드 응집체를 해체하는 활성을 보였고, 에틸아세테이트 분획물이 가장 좋은 활성을 보였다.
실험예 8. 넉줄고사리 추출물에서 분리된 유효성분들의 베타아밀로이드의 응집 억제 및 응집체 해체 활성 평가 : Thioflavin T assay (티오풀라빈 T 형광 분석)
실험예 6 및 7에서와 같이 넉줄고사리 추출물에서 분리한 5개의 유효성분에 대한 베타아밀로이드 응집 억제 효과와 이미 응집된 베타아밀로이드 응집체를 해체하는 활성을 티오플라빈 T (Thioflavin T) 형광 분석법(ThT assay)으로 측정하였다.
도 24는 넉줄고사리 추출물에서 분리된 유효성분들의 Thioflavin T 형광 분석 결과(%)를 나타낸 그래프이다.
도 24에서와 같이, 넉줄고사리 추출물에서 분리된 유효성분들은 농도 의존적으로 베타아밀로이드의 응집을 억제하였다. 이로부터 베타아밀로이드 응집 억제 효과가 확인된다.
도 25는 넉줄고사리 추출물에서 분리된 유효성분들의 Thioflavin T 형광 분석 결과(%)를 나타낸 그래프이다. 이로부터 베타아밀로이드 응집체 해체 효과가 확인된다.
도 25에서와 같이, 넉줄고사리 추출물에서 분리된 유효성분들은 농도 의존적으로 이미 응집된 베타아밀로이드의 응집체를 해체하는 활성을 나타냈다.
상기 결과와 같이, 화학식 1 내지 5의 유효성분 모두 베타아밀로이드의 응집을 억제할 뿐 아니라 이미 응집된 베타아밀로이드 응집체를 해체하는 효과를 보였다.
이 성분들 중 화학식 2의 화합물이 두가지 효과 모두에서 가장 뛰어났다.
위의 실험 결과로 미루어 볼 때, 넉줄고사리추출물, 에틸아세테이트 분획층과 유효성분들은 베타-아밀로이드의 생성을 억제하는 효과를 가지고 있으며, 그 기전은 β-시크리타제의 발현 억제와 관계가 있음을 알 수 있었다. 따라서 넉줄고사리추출물, 에틸아세테이트 분획층과 이로부터 분리된 화학식 1, 2, 4, 및 5의 화합물의 유효성분들은 알츠하이머성 치매와 같은 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료제, 건강기능식품으로 개발될 수 있다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
본 연구과제는 한국연구재단 중견연구자 지원사업 (2019R1A2C100621412)으로 수행되었다.

Claims (16)

  1. 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드((-)-epiafzelechin-3-O-β-D-allopyranoside), (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드((2S)-5,7,3',5'-tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D-glucopyranoside), (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드((2S)-5,7,3',5'-tetrahydroxy-flavanone 7-O-hesperidoside), 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드(7-O-methyl-epiafzelechin-(4α→8)-epiafzelechin-3-O-β-glucopyranoside), 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 넉줄고사리 추출물은 넉줄고사리 뿌리, 넉줄고사리 뿌리 줄기, 또는 이들의 조합의 추출물인 것인, 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 넉줄고사리 추출물의 추출용매는 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합물인 것인 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 넉줄고사리 추출물의 추출용매는 에탄올인 것인 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 에탄올은 20 %(v/v) 내지 100 %(v/v)의 농도인 것인 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 분획물은 넉줄고사리 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것인 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 대뇌 아밀로이드 맥관병증(Cerebral amyloid angiopathy), 전신성 아밀로이드증(systematic amyloidosis), 베타아밀로이드 관련 치매(Dementia associated with beta-amyloid), 파킨슨병(Parkinson's disease), 경도인지장애(Mild cognitive impairment), 및 노인성 치매로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병인 것인 약학적 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 뇌내 베타아밀로이드 축적을 주된 원인으로 하는 질환인 것인 약학적 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 베타아밀로이드(β-amyloid) 생성을 억제하는 것인 약학적 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 베타-시크리테이즈(β-secretase) 활성을 감소시키는 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여를 위한 것인 약학적 조성물.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 환제, 산제, 현탁화제, 시럽제, 주사제 및 과립제로 이루어지는 군중에서 선택된 제제로 제형화된 것인 약학적 조성물.
  14. 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드, 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품용 조성물.
  15. 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 또는 상기 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드, 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 학습 또는 기억력 개선, 또는 인지기능 개선용 건강기능식품.
  16. 넉줄고사리 추출물(Davallia mariesii) 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 (-)-에피아프젤레친-3-O-β-D-알로피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-β-D-글루코피라노시드, (2S)-5,7,3',5'-테트라히드록시-플라바논 7-O-헤스페리도시드, 7-O-메틸-에피아프젤레친-(4α→8)-에피아프젤레친-3-O-β-글루코피라노사이드, 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 사료용 조성물.
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