TW202413430A - 抗cd37和cd3的雙特異性抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明的課題是提供可以用於人類治療的抗CD37和CD3的雙特異性抗體。
本發明者等製作複數個對CD3具有多種親和性且提升穩定性的抗CD3scFv,並使用該些製作複數個抗CD37和CD3的雙特異性抗體。多個該雙特異性抗體顯示不期望的性質,即在高濃度時,具有體外(in vitro)細胞毒性和細胞激素產生活性的減弱。藉由一系列的研究發現,在高濃度時活性也不會減弱的抗體,在體內(in vivo)中顯示抗腫瘤作用。因此,該些抗體可以用於治療表現CD37的人類癌症。
Description
本發明是有關於一種用作人類治療的醫藥組成物的有效成分之有用的抗CD37和CD3的雙特異性抗體。
CD37是屬於四跨膜蛋白質(Tetraspanin)家族的貫通膜4次的蛋白質,具有小細胞外環狀域(small extracellular loop;SEL)與大細胞外環狀域(large extracellular loop;LEL)之2個細胞外區域及3個細胞質區域。已有報告指出,四跨膜蛋白質家族的分子參與接著、運動、分化、增殖等之多種細胞功能。其一為CD37,從使用基因剔除小鼠的解析,顯示其參與抗體產生、T細胞的功能的控制等之免疫功能(非專利文獻1)。CD37在正常組織中的表現限定於血液細胞,其中在成熟B細胞具有高度表現。相對於此,未成熟的B細胞、分化程度較高的漿細胞具有較低表現、或完全不表現。T細胞、單核球、顆粒球等之血液細胞中,雖然程度較低,但仍表現CD37。進一步地,已知CD37在源自成熟B細胞的非何傑金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病等之血癌中也高頻率地高度表現。如上所述,認為表現CD37的細胞是有限定的,且CD37在癌細胞中高度表現,因此,其作為癌症治療的目標是較佳的,且正在進行以CD37作為目標之癌症治療藥的開發。但是,迄今為止尚未存在實際應用的治療藥(專利文獻1、非專利文獻1)。
分化簇3(Cluster of Differentiation 3;CD3)是一種蛋白質,藉由與T細胞表面的T細胞受體形成複合體,以向T細胞傳達活化訊號。CD3是由gamma(γ)、delta(δ)、epsilon(ε)、zeta(ζ)和eta(η)鏈之5種的次單元所構成的複合體,各次單元形成εγ、εδ、ζζ之3種的二聚物。CD3的表現具有T細胞特異性,且在T細胞的分化的所有階段表現。進一步地,由於其在正常T細胞和腫瘤性T細胞中均表現,因此被廣泛用作T細胞的標記。
作為利用生物體內免疫系統的新癌症治療法,正在進行雙特異性T細胞召集抗體(bispecific T-cell-recruiting antibodies)的開發(專利文獻2~6)。雙特異性T細胞召集抗體的最一般的形態,是藉由同時結合癌細胞上表現的腫瘤相關抗原(Tumor Associated Antigen;TAA)和T細胞上表現的CD3,使T細胞和癌細胞的距離在物理上靠近,同時經由CD3將活化訊號輸入到T細胞,藉此誘導T細胞對癌細胞產生細胞毒性。將CD3和CD19(Cluster of Differentiation 19)作為目標抗原之布林莫單抗(blinatumomab),已經使用於臨床之復發或難治性的急性淋巴細胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia;ALL)的治療,被認為具有優異的治療效果。進一步地,已知各種TAA作為雙特異性T細胞召集抗體的目標,例如,正在研究開發以TSPAN8、CD33、BCMA、PSMA、EGFRvIII等TAA作為目標的雙特異性T細胞召集抗體作為各種癌症的治療藥(專利文獻2、非專利文獻2)。但是,迄今為止,尚無已知的抗CD37和CD3的雙特異性抗體。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1] WO2015/017552號
[專利文獻2] WO2022/102768號
[專利文獻3] 日本特許第5686953號
[專利文獻4] 美國特許第9587021號
[專利文獻5] 美國特許第9701759號
[專利文獻6] 美國特許第10259887號
[非專利文獻]
[非專利文獻1] International Journal of Molecular Sciences、2020;21(24):p.9531
[非專利文獻2] Biomarker Research、2021;9(1):p.38
[發明所欲解決之課題]
本發明的課題是提供可以用於人類治療的抗CD37和CD3的雙特異性抗體。
[用以解決課題之手段]
本發明者等在研究以各種的TAA作為目標之抗TAA-抗CD3的雙特異性抗體的製作之過程中,認為抗CD3scFv的最適親和性取決於TAA的表現量之組合、抗TAA抗體的對於TAA的親和性而不同。因此,活用已知資訊和本公司的蛋白質結構資訊解析的技術,取得複數個具有多樣親和性的抗CD3scFv(實施例1)。進一步地,為了提升所取得之抗CD3scFv的穩定性而引入複數個突變,成功取得複數個兼具多樣的親和性和穩定性兩者之抗CD3scFv (實施例2)。進一步地,本發明者等取得複數個抗CD37抗體和抗CD3scFv之組合的抗CD37和CD3的雙特異性抗體(實施例3),並對該雙特異性抗體的體外(in vitro)之細胞毒性和細胞激素產生進行評價(實施例4)。其結果,多個雙特異性抗體明顯在高濃度中表現出活性減弱之不期望的性質。進一步地,在本發明中發現即使在高濃度中,活性也不易減弱的抗體,明顯在體內(in vivo)中表現出抗腫瘤作用(實施例5)。基於該些研究的結果,本發明者等成功取得在體外(in vitro)和體內(in vivo)中都表現出良好的特性之3種類的雙特異性抗體(實施例5)。
亦即,本發明是有關於以下的[1]~[29]。
[1] 一種雙特異性抗體,其是抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含:
(a)抗CD37抗體的Fab區域,其是由包含抗CD37抗體的重鏈可變區域的重鏈片段和包含抗CD37抗體的輕鏈可變區域的輕鏈所構成;
(b)抗CD3scFv區域,其包含抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域;以及
(c)Fc區域,其是由與(a)的Fab區域的重鏈片段連結之第一Fc多肽和與(b)的抗CD3scFv區域連結之第二Fc多肽所構成;
抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域為以下(1)~(3)中的任一者:
(1)由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(2)由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;或
(3)由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域。
[2] 如[1]所述之雙特異性抗體,其中抗CD3scFv區域是以下(1)~(3)中的任一者:
(1)由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域;
(2)由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域;或
(3)由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域。
[3] 如[1]或[2]所述之雙特異性抗體,其中抗CD37抗體的重鏈可變區域包含由序列編號10的胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號10的胺基酸編號50至65的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號10的胺基酸編號98至104的胺基酸序列所構成之CDR3,且抗CD37抗體的輕鏈可變區域包含由序列編號12的胺基酸編號24至34的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號12的胺基酸編號50至56的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號12的胺基酸編號89至95的胺基酸序列所構成之CDR3。
[4] 如[3]所述之雙特異性抗體,其中抗CD37抗體的重鏈可變區域為由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成,且抗CD37抗體的輕鏈可變區域為由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成。
[5] 如[4]所述之雙特異性抗體,其中抗CD37抗體的Fab區域是由下述所構成:由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成之重鏈片段和由序列編號12的胺基酸序列所構成之輕鏈。
[6] 一種雙特異性抗體,其是如以下(a)~(c)中的任一者之抗CD37和CD3的雙特異性抗體:
(a)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;
(b)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或
(c)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
[7] 一種雙特異性抗體,其是如以下(a)~(c)中的任一者之抗CD37和CD3的雙特異性抗體:
(a)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;
(b)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;或
(c)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域。
[8] 如[1]~[7]中任一所述之雙特異性抗體,其中Fc區域包含杵臼(knobs into holes)突變,杵臼突變是在形成Fc區域的1個Fc多肽中的T366W的突變,以及形成Fc區域的另一個Fc多肽中的T366S、L368A和Y407V的突變(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引(EU index)的胺基酸位置)。
[9] 如[1]~[8]中任一所述之雙特異性抗體,其中Fc區域包含LALA突變(L234A和L235A)(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引(EU index)的胺基酸位置)。
[10] 如[1]~[9]中任一所述之雙特異性抗體,其中Fc區域包含P329A突變(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引(EU index)的胺基酸位置)。
[11] 如[1]~[10]中任一所述之雙特異性抗體,其中抗CD37抗體的Fab區域的重鏈片段與第一Fc多肽是透過鉸鏈區域而連結,抗CD3scFv區域與第二Fc多肽是透過鉸鏈區域而連結。
[12] 如[11]所述之雙特異性抗體,其中連結抗CD3scFv區域和第二Fc多肽的鉸鏈區域包含C220S突變(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引(EU index)的胺基酸位置)。
[13] 如[11]或[12]所述之雙特異性抗體,其中Fc區域包含杵臼(knobs into holes)突變、LALA突變和P329A突變,連結抗CD3scFv區域和第二Fc多肽的鉸鏈區域包含C220S突變(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引(EU index)的胺基酸位置)。
[14] 一種雙特異性抗體,其是如以下(a)~(c)中的任一者:
(a)由下述所構成的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域;
(b)由下述所構成的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域;或
(c)由下述所構成的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域。
[15] 如[1]~[14]中任一所述之雙特異性抗體,其為經轉譯後修飾者。
[16] 如[15]所述之雙特異性抗體,其中轉譯後修飾是重鏈可變區域的N末端焦麩醯胺化和/或重鏈的C末端離胺酸缺失。
[17] 一種用於生產抗CD37和CD3的雙特異性抗體之多核苷酸,其選自由下述(a)~(p)所組成的群組中:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域;
(c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈的鹼基序列的多核苷酸;
(d)包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸;
(e)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(f)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(g)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(h)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(i)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(j)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(k)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(l)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(m)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(n)包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;
(o)包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;或
(p)包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸。
[18] 一種用於生產抗CD37和CD3的雙特異性抗體之多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
[19] 一種用於生產抗CD37和CD3的雙特異性抗體之多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域。
[20] 一種用於生產抗CD37和CD3的雙特異性抗體之多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中:
(a)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;
(b)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;或
(c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸。
[21] 一種表現載體,其包含如[17]~[20]中任一者所述之多核苷酸。
[22] 一種宿主細胞,其轉形有如[21]所述之表現載體。
[23] 一種宿主細胞,其包含如[17]~[20]中任一者所述之多核苷酸。
[24] 一種抗CD37和CD3的雙特異性抗體之生產方法,其包含培養如[22]或[23]所述之宿主細胞的步驟。
[25] 一種醫藥組成物,其包含如[1]~[16]中任一者所述之雙特異性抗體和藥學上可接受的賦形劑。
[26] 一種如[1]~[16]中任一者所述之雙特異性抗體,其用於治療癌症。
[27] 一種如[25]所述之醫藥組成物,其用於治療癌症。
[28] 一種治療癌症的方法,其包含向對象投予治療有效量之如[1]~[16]中任一者所述之雙特異性抗體的步驟。
[29] 一種如[1]~[16]中任一者所述之雙特異性抗體作為製備用於治療癌症之醫藥組成物的用途。
[發明的效果]
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,可與作為TAA之CD37和作為T細胞表面分子之CD3兩者結合,藉由使T細胞和癌細胞的距離在物理上靠近,增強T細胞對癌細胞的殺傷作用。因此,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體和包含該雙特異性抗體的醫藥組成物,可以用於治療癌症。
以下,對本發明進行詳細說明。
<定義>
本說明書的用語,除非在以下有特別定義,將按照該技術領域中具有通常知識者之一般使用的意義來使用。
抗體(或免疫球蛋白質)是一種糖蛋白質,其基本結構是由2條具有單一排列的重鏈和2條具有單一排列的輕鏈所構成之具有左右對稱Y字型的結構之4條鏈結構。抗體存在有IgG、IgM、IgA、IgD和IgE之5個類型。抗體分子的基本結構在各類型是共通的,形成由將2條分子量為5萬~7萬的重鏈和2條分子量為2萬~3萬的輕鏈以雙硫鍵和非共價鍵進行結合之分子量為15萬~19萬的Y字型之4條鏈結構所構成之抗體分子。重鏈通常由包含約440個胺基酸的多肽鏈所構成,每個類型具有特徵性結構,對應於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE之分別稱為Igγ、Igμ、Igα、Igδ、Igε。進一步地,IgG存在有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的次類型,與每個對應的重鏈被稱為Igγ1、Igγ2、Igγ3、Igγ4。輕鏈通常由包含約220個胺基酸的多肽鏈所構成,已知有λ型和κ型2種,分別稱為Igλ、Igκ。前述兩種的輕鏈可以與任一種類的重鏈進行配對。
抗體分子的鏈內雙硫鍵在重鏈存在有4個(Igμ、Igε中有5個),在輕鏈存在有2個,每100~110個胺基酸殘基形成一個環。該些立體結構在各環之間的是類似的,被稱為結構單元或結構域。位於重鏈、輕鏈之N末端的結構域稱為可變區域,即使是從同種動物的同一類型(或次類型)所產生的抗體也具有多樣的胺基酸序列,已知其與抗體及抗原的結合特異性有關。可變區域下游的C末端側的結構域的胺基酸序列,在各類型或次類型幾乎是恆定的,被稱為恆定區域。重鏈從N末端到C末端具有重鏈可變區域(VH)和重鏈恆定區域(CH)。CH進一步地從N末端側分為CH1結構域、CH2結構域和CH3結構域之3個結構域。輕鏈從N末端至C末端具有輕鏈可變區域(VL)和輕鏈恆定區域(CL)。
VH和VL中存在的3個互補性決定區域(CDR)的胺基酸序列變化非常大,有助於可變區域的可變異性。CDR是由依CDR1、CDR2、CDR3的順序存在於每個重鏈和輕鏈的N末端之大約5~10個胺基酸殘基所構成的區域,並形成抗原結合部位。另一方面,可變區域的CDR以外的部分稱為架構區域(FR),由FR1~4所構成,其胺基酸序列的變化相對較少。
當抗體以蛋白質分解酶的木瓜蛋白酶處理時,獲得3個抗體片段。N末端側的2個片段被稱為Fab(抗原結合片段,Fragment,antigen binding)區域。在本說明書中,所謂的「Fab區域」是指,由重鏈的VH和CHl結構域及輕鏈(VL和CL)所構成之區域,且在構成該Fab區域的前端部分之抗原結合部位與抗原進行結合。在本說明書中,所謂的「重鏈片段」是指由構成Fab區域的重鏈的VH和CH1結構域所構成之片段。此外,C末端側的片段被稱為Fc(可結晶片段,Fragment,crystallizable)區域。在本說明書中,「Fc多肽」是指,由重鏈的CH2結構域及CH3結構域所構成之多肽,且「Fc區域」是指,由2個Fc多肽所構成之複合體。
在本說明書中,所謂的「鉸鏈區域」是指,存在於重鏈的CH1結構域和CH2結構域之間的高可動性的胜肽區域,且重鏈片段和Fc多肽是以鉸鏈區域而連接。此外,抗體的2條的重鏈在鉸鏈區域以雙硫鍵連結。
在本說明書中,所謂的「抗原」是使用一般的含義,特別是,用作表示能被如抗體、抗原結合片段等之抗原結合蛋白質特異性地結合之分子或分子的一部分的用語。抗原能是如蛋白質、核酸等之分子。1個抗原也可以具有可以與不同的抗體等進行相互作用之1個或多個抗原決定位。
在本說明書中,所謂的「抗體」是指,與抗原進行特異性結合的多肽,只要其能夠與抗原進行特異性結合,即可具有任何結構。例如,抗體包含IgG等之以4條鏈結構作為基本結構的多肽之外,包含後述的抗原結合片段、雙特異性抗體、三特異性抗體等之各種形狀的多肽。
在本說明書中,所謂的「抗原結合片段」是指,包含至少一個源自抗體之具有抗原結合活性的多肽鏈的分子。作為代表性的抗原結合片段,可列舉:單股可變區域片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')
2片段。scFv是由以連接子連結之VH和VL所構成之一價的抗原結合片段。Fab片段是由包含輕鏈和重鏈的VH、CH1結構域的片段所構成之一價的抗原結合片段。Fab'片段是由包含輕鏈、重鏈的VH、CH1結構域和鉸鏈區域的一部分的片段所構成之一價的抗原結合片段,在該鉸鏈區域的部分包含於重鏈之間構成S-S鍵之半胱胺酸殘基。F(ab')
2片段是Fab'片段以雙硫鍵而連結之二價的分子。所謂的一價是指包含1個抗原結合部位,所謂的二價是指包含2個抗原結合部位。在本說明書中,所謂的「scFv區域」是指包含scFv的區域。
在本說明書中,所謂的「多肽」是指,藉由肽鍵連結之複數個胺基酸。多肽中所使用之胺基酸可以是天然的胺基酸或人工胺基酸的任一者。多肽中所包含的胺基酸殘基的個數只要為2以上即可,較佳為10以上。
在本說明書中,所謂的「雙特異性抗體」是指,可以與2個不同的抗原進行特異性結合的抗體。
在本說明書中,所謂的「人抗體」是指,具有人類免疫球蛋白胺基酸序列的抗體。在本說明書中,「人源化抗體」是指,除了CDR以外的胺基酸殘基的一部份、大部分或全部已被源自人類免疫球蛋白分子的胺基酸殘基取代的抗體。作為人源化的方法沒有特別限制,例如,可以參照美國專利第5225539號、美國專利第6180370號等來製作人源化抗體。
在本說明書中,所謂的「轉譯後修飾」是指,當抗體在細胞內表現的情況下,抗體在轉譯後受到修飾。作為轉譯後修飾的實例,可列舉:重鏈的N末端的麩醯胺酸或麩胺酸的焦麩醯胺化、糖基化、氧化、脫醯胺化、糖化等之修飾;藉由羧肽酶對重鏈的C末端的離胺酸進行切割使其離胺酸缺失。已知在各種抗體中,發生此類轉譯後修飾(J. Pharm. Sci.、2008; Vol.97:p.2426-2447)。
在本說明書中,所謂的「多核苷酸」是指核苷酸的聚合物,包含RNA或DNA。所使用的RNA或DNA可以是天然的,也可以是人工合成的。
本說明書中所使用的抗體的胺基酸殘基編號,是藉由指定Kabat編號或歐洲索引(EU INDEX)(Kabat等人、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed、1991、NIH Publication No.91-3242),可以按照該些的編號系統來進行定義。
在本說明書中,當部分的各種類存在2個以上的情況下,為了方便區別而使用「第一」或「第二」用語。除非明確說明,此般用語的使用並不預期賦予特定的順序或含義。
在本說明書中,所謂的「連結」或「連結有」是指,複數個成分(例如,Fab區域和Fc多肽)直接連結或透過一個或複數個仲介物(例如可列舉:胜肽連接子、鉸鏈區域,但不限於此)來連結。在本說明書中,所謂的「胜肽連接子」是指,為了可變區域之間的連結,可以藉由基因工程引入1以上的任意的胺基酸殘基。本發明所使用的胜肽連接子的長度沒有特別限制,可以由發明所屬技術領域中具有通常知識者根據目的而適當選擇。
在本說明書中,所謂的「對象」是指,需要預防或治療的人類或其他動物。在一態樣中,其是需要治療或預防的人類。
<本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體>
本發明提供一種具有以下的(a)~(c)結構之結合CD37和CD3的雙特異性抗體(也稱為「抗CD37和CD3的雙特異性抗體」):
一種雙特異性抗體,其是抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含:
(a)抗CD37抗體的Fab區域,其是由包含抗CD37抗體的重鏈可變區域的重鏈片段和包含抗CD37抗體的輕鏈可變區域的輕鏈所構成;
(b)抗CD3scFv區域,其包含抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域;以及
(c)Fc區域,其是由與(a)的Fab區域的重鏈片段連結之第一Fc多肽和與(b)的抗CD3scFv區域連結之第二Fc多肽所構成。
在本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中,抗CD37抗體和抗CD3scFv的重鏈可變區域和輕鏈可變區域可以是源自人類抗體、源自人源化抗體或其組合。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體是由源自人類抗體的抗CD37抗體和包含人源化抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域之抗CD3scFv所構成的抗體。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含含有抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域為以下(1)~(3)中的任一者:
(1)由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(2)由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;或
(3)由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,其包含:
(a)抗CD37抗體的Fab區域,其是由包含抗CD37抗體的重鏈可變區域的重鏈片段和包含抗CD37抗體的輕鏈可變區域的輕鏈所構成;
(b)抗CD3scFv區域,其包含抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域;以及
(c)Fc區域,其是由與(a)的Fab區域的重鏈片段連結之第一Fc多肽和與(b)的抗CD3scFv區域連結之第二Fc多肽所構成;
雙特異性抗體之抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域為以下(1)~(3)中的任一者:
(1)由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(2)由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;或
(3)由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域。
在抗CD3scFv區域中,連結抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域的胜肽連接子的種類和長度沒有特別限制,可以由發明所屬技術領域中具有通常知識者適當選擇,長度較佳為5個胺基酸以上(上限沒有特別限制,但通常為30個胺基酸以下,較佳為20個胺基酸以下),特別較佳為15個胺基酸。作為胜肽連接子,例如可以使用甘胺酸-絲胺酸連接子(GS連接子)、甘胺酸-離胺酸-脯胺酸-甘胺酸-絲胺酸連接子(GKPGS連接子)。作為胜肽連接子,例如可列舉以下:。
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號19)
Ser-Gly-Gly-Gly (序列編號20)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號21)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號22)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號23)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號24)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列編號25)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (序列編號26)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)
n(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)
nGly-Lys-Pro-Gly-Ser (序列編號27)
(Gly-Lys-Pro-Gly-Ser)
n上述n表示1以上的整數。發明所屬技術領域中具有通常知識者可以根據目的適當選擇胜肽連接子的長度、序列。
在1個實施方式中,抗CD3scFv區域中所使用的連接子是包含(Gly-Lys-Pro-Gly-Ser)
n的序列的連接子。在1個實施方式中,用於抗CD3scFv區域的連接子較佳為包含(Gly-Lys-Pro-Gly-Ser)
4的序列的連接子。
在1個實施方式中,抗CD3scFv區域是以下(1)~(3)中的任一者:
(1)由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域;
(2)由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域;或
(3)由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含抗CD37抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域。本發明中所使用的抗CD37抗體,可以基於本技術領域已知的抗CD37抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域的序列資訊來製作。例如,已知的抗CD37抗體記載於專利文獻1中。
在1個實施方式中,抗CD37抗體的重鏈可變區域包含由序列編號10的胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號10的胺基酸編號50至65的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號10的胺基酸編號98至104的胺基酸序列所構成之CDR3,且抗CD37抗體的輕鏈可變區域包含由序列編號12的胺基酸編號24至34的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號12的胺基酸編號50至56的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號12的胺基酸編號89至95的胺基酸序列所構成之CDR3。
在1個實施方式中,抗CD37抗體的重鏈可變區域為由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成,且抗CD37抗體的輕鏈可變區域為由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成。
作為抗CD37抗體的Fab區域的重鏈片段之源自CH1結構域的重鏈恆定區域,可以選擇Igγ、Igμ、Igα、Igδ或Igε中的任一恆定區域。作為Igγ,例如可以選擇Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4。在1個實施方式中,抗CD37抗體的Fab區域的重鏈片段包含源自人類Igγ1恆定區域的CH1結構域。
作為抗CD37抗體的Fab區域的輕鏈的輕鏈恆定區域(CL),可以選擇Igλ或Igκ的任一恆定區域。在1個實施方式中,抗CD37抗體的Fab區域包含Igκ恆定區域之CL。在1個實施方式中,抗CD37抗體的Fab區域的輕鏈包含人類Igκ恆定區域之CL。
在1個實施方式中,抗CD37抗體的Fab區域是由下述所構成:由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成之重鏈片段和由序列編號12的胺基酸序列所構成之輕鏈。
在本說明書中,將包含抗CD37抗體的重鏈可變區域的重鏈片段與連結有第一Fc多肽之多肽稱為「抗CD37抗體的重鏈」。在本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中,包含抗CD37抗體的重鏈可變區域的重鏈片段和Fc多肽(第一Fc多肽)可以直接連結,或也可以透過胜肽連接子、鉸鏈區域來連結。此外,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中,抗CD3scFv區域和Fc多肽(第二Fc多肽)可以直接連結,或也可以透過胜肽連接子、鉸鏈區域來連結。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體是如以下(a)~(c)中的任一的抗CD37和CD3的雙特異性抗體:
(a)包含下述的雙特異性抗體:連結有第一Fc多肽之抗CD37抗體重鏈片段的抗CD37抗體的重鏈、抗CD37抗體的輕鏈及連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽;該抗CD37抗體的重鏈片段包含含有由序列編號10的胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號10的胺基酸編號50至65的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號10的胺基酸編號98至104的胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域;該抗CD37抗體的輕鏈包含含有由序列編號12的胺基酸編號24至34的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號12的胺基酸編號50至56的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號12的胺基酸編號89至95的胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域;該抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(b)包含下述的雙特異性抗體:連結有第一Fc多肽之抗CD37抗體重鏈片段的抗CD37抗體的重鏈、抗CD37抗體的輕鏈及連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽;該抗CD37抗體的重鏈片段包含含有由序列編號10的胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號10的胺基酸編號50至65的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號10的胺基酸編號98至104的胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域;該抗CD37抗體的輕鏈包含含有由序列編號12的胺基酸編號24至34的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號12的胺基酸編號50至56的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號12的胺基酸編號89至95的胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域;該抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;或者,
(c)包含下述的雙特異性抗體:連結有第一Fc多肽之抗CD37抗體重鏈片段的抗CD37抗體的重鏈、抗CD37抗體的輕鏈及連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽;該抗CD37抗體的重鏈片段包含含有由序列編號10的胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號10的胺基酸編號50至65的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號10的胺基酸編號98至104的胺基酸序列所構成之CDR3的重鏈可變區域;該抗CD37抗體的輕鏈包含含有由序列編號12的胺基酸編號24至34的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號12的胺基酸編號50至56的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號12的胺基酸編號89至95的胺基酸序列所構成之CDR3的輕鏈可變區域;該抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體是如以下(a)~(c)中的任一的抗CD37和CD3的雙特異性抗體:
(a)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;
(b)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或
(c)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體是如以下(a)~(c)中的任一的抗CD37和CD3的雙特異性抗體:
(a)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;
(b)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;或
(c)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域。
在本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中,作為構成Fc區域的第一Fc多肽和第二Fc多肽所源自的重鏈恆定區域,可以選擇Igγ、Igμ、Igα、Igδ或Igε中的任一恆定區域。作為Igγ,例如可以選擇Igγ1、Igγ2、Igγ3或Igγ4。在1個實施方式中,第一Fc多肽和第二Fc多肽是源自人類Igγ1恆定區域的Fc多肽。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中的Fc區域,可以包含降低抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性作用(ADCC)、補體依賴性細胞毒性作用(CDC)的突變。所謂的L234A,是指按照人類Igγ1恆定區域中的歐洲索引,在胺基酸位置234位的白胺酸取代成丙胺酸。所謂的L235A,是指按照人類Igγ1恆定區域中的歐洲索引,在胺基酸位置235位的白胺酸取代成丙胺酸。人類Igγ1恆定區域L234A和L235A的胺基酸突變被稱為「LALA突變」。已知該突變會降低抗體的抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性作用、補體依賴性細胞毒性作用(Mol.Immunol.、1992; Vol. 29: p.633-639; J. Immunol.、2000; Vol. 164:p.4178-4184)。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中的Fc區域,進一步可以包含基於其他已知技術的突變。例如,Fc區域可以包含P329A突變(J Biol Chem.、2001; Volume 276: Issue 9: p.6591-6604; J Immunol、2000; Vol 164: Issue 8: p.4178-4184)或基於杵臼(knobs into holes)技術的突變(以下,也稱為「杵臼突變」)。P329A突變是藉由減弱與 FcγR和C1q的結合而具有降低ADCC活性和CDC活性的效果。杵臼技術是將一重鏈的CH3區域中存在的胺基酸側鏈取代為較大側鏈(knobs;突起),將另一重鏈的CH3區域中存在的胺基酸側鏈取代為較小側鏈(hole;空隙),藉此使突起配置於空隙內,以促進重鏈的異二聚化,並可以有效率地取得目標之異二聚化抗體分子的技術。(Nature、1994; Vol. 372: p.379-383; Nature Biotech.、1998; Vol.16: p.677-681; J. Mol. Biol.、1997; Vol.270: p.26-35; Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2013; Vol.110: p.E2987-E2996)。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含含有L234A和L235A的胺基酸突變(LALA突變)的Fc區域。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含含有P329A突變的Fc區域。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含含有杵臼突變的Fc區域。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含含有在L234A和L235A的胺基酸突變(LALA突變)、P329A突變和杵臼突變中的一種以上的突變的Fc區域。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含含有L234A和L235A的胺基酸突變(LALA突變)、P329A突變和杵臼突變的Fc區域。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體所包含的杵臼突變,是形成該Fc區域的一Fc多肽中的T366W突變,以及形成該Fc區域的另一Fc多肽中的T366S、L368A和Y407V突變(參照
WO1998/050431)。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含由序列編號10的胺基酸序列229至445的胺基酸序列所構成之第一Fc多肽。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含由序列編號14的胺基酸編號270至486的胺基酸序列、由序列編號16的胺基酸編號270至486的胺基酸序列或由序列編號18的胺基酸編號270至486的胺基酸序列所構成之第二Fc多肽。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含以下(a)~(c)中任一多肽:
(a)由第一Fc多肽和第二Fc多肽所構成之Fc區域,該第一Fc多肽由序列編號10的胺基酸序列229至445的胺基酸序列所構成,該第二Fc多肽由序列編號14的胺基酸編號270至486的胺基酸序列所構成;
(b)由第一Fc多肽和第二Fc多肽所構成之Fc區域,該第一Fc多肽由序列編號10的胺基酸序列229至445的胺基酸序列所構成,該第二Fc多肽由序列編號16的胺基酸編號270至486的胺基酸序列所構成;或
(c)由第一Fc多肽和第二Fc多肽所構成之Fc區域,該第一Fc多肽由序列編號10的胺基酸序列229至445的胺基酸序列所構成,該第二Fc多肽由序列編號18的胺基酸編號270至486的胺基酸序列所構成。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中,包含抗CD37抗體的重鏈可變區域之重鏈片段與第一Fc多肽,可以是透過鉸鏈區域而連結,並構成抗CD37抗體的重鏈。
此外,在本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中,抗CD3scFv區域與第二Fc多肽,可以是透過鉸鏈區域而連結。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含抗CD37抗體的Fab區域之重鏈片段透過鉸鏈區域而與第一Fc多肽連結之抗CD37抗體的重鏈。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含抗CD3scFv區域透過鉸鏈區域而與第二Fc多肽連結之多肽。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含抗CD37抗體的Fab區域之重鏈片段透過鉸鏈區域而與第一Fc多肽連結之抗CD37抗體的重鏈,以及抗CD3scFv區域透過鉸鏈區域而與第二Fc多肽連結之多肽。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含CD37抗體的Fab區域之重鏈片段透過鉸鏈區域而與第一Fc多肽連結之抗CD37抗體的重鏈,抗CD37抗體的輕鏈以及抗CD3scFv區域透過鉸鏈區域而與第二Fc多肽連結之多肽。
當本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體包含鉸鏈區域的情況下,基於已知技術,可以在鉸鏈區域中包含突變。例如,鉸鏈區域可以包含C220S突變(Methods、2019; Volume 154: p.38-50)。C220S突變是以除去成為自由形式之220位的半胱胺酸為目的的突變,藉由使存在於輕鏈恆定區域的半胱胺酸的欠缺,使其失去配對的半胱胺酸,其結果成為自由形式的半胱胺酸。當本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體包含鉸鏈區域的情況下,在1個實施方式中,連結抗CD3scFv區域和第二Fc多肽的鉸鏈區域包含C220S突變。
在本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的1個實施方式中,Fc區域包含L234A和L235A的胺基酸突變(LALA突變)、P329A突變和杵臼突變,且連結抗CD3scFv區域和第二Fc多肽的鉸鏈區域包含C220S突變。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含含有由序列編號10的胺基酸號214至445的胺基酸序列所構成之鉸鏈區域及第一Fc多肽的多肽。在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含含有由序列編號14的胺基酸編號255至486的胺基酸序列、由序列編號16的胺基酸編號255至486的胺基酸序列,或由序列編號18的胺基酸編號255至486的胺基酸序列所構成之鉸鏈區域和第二Fc多肽的多肽。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含以下(a)~(c)中任一多肽:
(a)包含由序列編號10的胺基酸序列214至445的胺基酸序列所構成之鉸鏈區域和第一Fc多肽之多肽;以及包含由序列編號14的胺基酸編號255至486的胺基酸序列所構成之鉸鏈區域和第二Fc多肽之多肽;
(b)包含由序列編號10的胺基酸序列214至445的胺基酸序列所構成之鉸鏈區域和第一Fc多肽之多肽;以及包含由序列編號16的胺基酸編號255至486的胺基酸序列所構成之鉸鏈區域和第二Fc多肽之多肽;或
(c)包含由序列編號10的胺基酸序列214至445的胺基酸序列所構成之鉸鏈區域和第一Fc多肽之多肽;以及包含由序列編號18的胺基酸編號255至486的胺基酸序列所構成之鉸鏈區域和第二Fc多肽之多肽。
注意的是,在本說明書中,LALA突變、P329A突變及C220S突變、杵臼突變等之胺基酸突變的記載,是基於按照人類Igγ1恆定區域中的歐洲索引的胺基酸位置。例如,如前所述,所謂的L234A,是指按照人類Igγ1恆定區域中的歐洲索引,在胺基酸位置234位的白胺酸取代成丙胺酸。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,其是如以下(a)~(c)中的任一者:
(a)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域;
(b)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域;或
(c)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,是包含由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈、由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈和由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的雙特異性抗體。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,是包含由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈、由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈和由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的雙特異性抗體。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,是包含由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈、由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈和由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的雙特異性抗體。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,可以進行轉譯後修飾。在1個實施方式中,轉譯後修飾是在重鏈可變區域N末端的焦麩醯胺化和/或重鏈C末端離胺酸缺失。本技術領域已知藉由N末端焦麩醯胺化或C末端離胺酸缺失之轉譯後修飾不影響抗體的活性(Analytical Biochemistry、2006; Vol.348: p.24-39)。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體可以與人類CD37(基因號:NM_001774.3)和人類CD3εδ複合蛋白質(CD3ε基因號:NM_000733.3、CD3δ基因號:NM_000732.4或NM_001040651.1)進行結合。可以使用已知的結合活性測定方法來確認是否與人類CD37及人類CD3εδ複合體蛋白質進行結合。作為測定結合活性的方法,例如可列舉:酶標免疫測量(Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay, ELISA)法、流式細胞術等的方法。當使用ELISA法時,例如可以使用實施例1~3中記載的方法。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,可以由發明所屬技術領域中具有通常知識者基於本說明書所公開的抗CD37抗體和抗CD3scFv區域的重鏈可變區域和輕鏈可變區域的序列資訊,使用本技術領域已知的方法製作。此外,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的抗CD3scFv區域,可以由發明所屬技術領域中具有通常知識者基於抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域的序列資訊,使用本技術領域已知的方法製作。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含人源化抗體或人類抗體的序列。當製作人源化抗體時,可以使用發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法,適當地引入回復突變(Bioinformatics、2015; Vol.31: p.434-435)。本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體雖然沒有特別限制,但例如可以按照後述的<本發明的雙特異性抗體的生產方法及該方法所生產之本發明的雙特異性抗體>所記載的方法來製造。
<本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸>
此外,本發明還提供一種用於生產本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸(也稱為「本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸」)。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸,其選自由下述(a)~(p)所組成的群組中:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域;
(c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈的鹼基序列的多核苷酸;
(d)包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸;
(e)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(f)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(g)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(h)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(i)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(j)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(k)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(l)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(m)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(n)包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;
(o)包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;或
(p)包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中:
(a)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;
(b)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;或
(c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸,可以由發明所屬技術領域中具有通常知識者基於其鹼基序列使用本技術領域已知的方法來製作。例如,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸,可以利用本技術領域已知的基因合成方法來合成。作為這樣的基因合成方法,能使用國際公開第90/07861號中記載的抗體基因的合成方法等之發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的各種方法。
<本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體>
此外,本發明還提供一種表現載體(也稱為「本發明的抗CD37和CD3雙特異性抗體的表現載體」),包含以下(a)~(p)所記載之本發明的抗CD37和CD3雙特異性抗體的多核苷酸。該些多核苷酸,每一個可以分別包含在單獨的載體中,或也可以複數個多核苷酸包含在1個載體中:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸序列1至115的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域;
(c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈的鹼基序列的多核苷酸;
(d)包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸;
(e)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(f)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(g)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(h)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(i)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(j)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(k)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(l)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(m)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(n)包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;
(o)包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;或
(p)包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體,包含以下(a)~(c)中任一多核苷酸:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體,包含以下(a)~(c)中任一多核苷酸:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體,包含以下(a)~(c)中任一多核苷酸:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體,包含以下(a)~(c)中任一多核苷酸:
(a)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;
(b)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;或
(c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體,只要是在真核細胞(例如,動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母)和/或原核細胞(例如,大腸桿菌)等之各種宿主細胞中可以產生多核甘酸,即沒有特別限制,作為此類表現載體,例如可列舉:質體載體、病毒載體等。作為質體載體,例如可以使用pcDNA系列(Thermo Fisher Scientific公司)、pALTER(註冊商標)-MAX(Promega)、pHEK293 Ultra Expression Vector(Takara Bio公司)、pEE6.4或pEE12.4(Lonza Biologies公司)等。作為病毒載體,例如可以使用慢病毒、腺病毒、反轉錄病毒、腺相關病毒。例如,當為了將前述多核苷酸引入細胞而使用慢病毒時,該慢病毒可以使用pLVSIN-CMV/EF1α載體(Takara Bio公司)、pLenti載體(Thermo Fisher Scientific公司)等。在1個實施方式中,本發明的雙特異性抗體的表現載體所使用載體是pcDNA3.4-TOPO(註冊商標)(Thermo Fisher
Scientific公司)和pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific公司)。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體,包含能與多核苷酸可操作地連結的啟動子。作為在動物細胞中用於表現多核苷酸的啟動子,例如可列舉:如CMV、RSV、SV40等之源自病毒的啟動子、肌動蛋白啟動子、延伸因子(elongation factor;EF)1α啟動子、熱休克啟動子等。作為在細菌(例如,埃希氏菌屬)中用於表現該多核苷酸的啟動子,例如可列舉:trp啟動子、lac啟動子、λPL啟動子、tac啟動子等。作為在酵母中用於表現該多核苷酸的啟動子,例如可列舉:GAL1啟動子、GAL10啟動子、PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。
作為用於製作表現載體的宿主細胞,當使用動物細胞、昆蟲細胞或酵母的情況下,本發明的雙特異性抗體的表現載體,能包含起始密碼子和終止密碼子。在此情況下,也可以包含增強子序列、編碼本發明的抗體或其重鏈或輕鏈的基因的5'側和3'側之非轉譯區域、分泌訊號序列、剪接接合部、多聚腺苷酸化點或可複製單元。當使用大腸桿菌作為宿主細胞時,本發明的表現載體可以包含起始密碼子、終止密碼子、終止子區域和可複製單元。本發明的表現載體根據目的可以包含通常使用的藥劑選擇標記基因(例如,四環黴素耐性基因、安比西林耐性基因、康黴素耐性基因、新黴素耐性基因、二氫葉酸還原酶基因)。
<包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸的宿主細胞>
此外,本發明還提供一種宿主細胞(統稱為「包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸的宿主細胞」),其是藉由本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體而轉形,或在細胞內包含抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸的宿主細胞。宿主細胞不僅包含體外(in vitro)培養的細胞,也包含體內(in vivo)構成組織的細胞。
在1個實施方式中,包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞,包含以下(a)~(p)所記載之本發明的抗CD37和CD3雙特異性抗體的多核苷酸,或包含含有該多核苷酸之本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸序列1至115的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域;
(c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈的鹼基序列的多核苷酸;
(d)包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸;
(e)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(f)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(g)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(h)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(i)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(j)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成;
(k)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(l)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(m)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽;
(n)包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;
(o)包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;或
(p)包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸。
在1個實施方式中,包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞,包含以下(a)~(c)中任一多核苷酸:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼抗CD3scFv區域之鹼基序列的多核苷酸,抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域。
在1個實施方式中,包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞,包含以下(a)~(c)中任一多核苷酸:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞,包含以下(a)~(c)中任一多核苷酸:
(a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;
(b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;或
(c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞,包含以下(a)~(c)中任一多核苷酸:
(a)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;
(b)包含編碼下述之鹼基序列的多核苷酸:包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;或
(c)包含編碼下述之鹼基序列的多核苷酸:包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸。
作為包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞,只要可以適合引入所使用的表現載體或基因的方法,並表現該多核苷酸所編碼之多肽即可,沒有特別限制。作為前述的宿主細胞,例如可列舉:本發明的技術領域中通常使用之已知細胞或人工樹立的細胞等之各種細胞(例如,動物細胞(例如,CHO-K1細胞、ExpiCHO-S(註冊商標)細胞、CHOK1SV細胞、CHO-DG44細胞、HEK293細胞、NS0細胞)、昆蟲細胞(例如,Sf9)、細菌(埃希氏屬菌等)、酵母(酵母屬、畢赤酵母菌屬等)等)。在1個實施方式中,本發明的宿主細胞是CHO-K1細胞或ExpiCHO-S細胞。此外,宿主細胞不僅包含體外(in vitro)培養的細胞,也包含體內(in vivo)構成組織的細胞。
將本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸或本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的表現載體引入宿主細胞的方法沒有特別限制,例如可以使用磷酸鈣法、電穿孔法或脂轉染法等之發明所屬技術領域中具有通常知識者一般使用的方法。作為脂轉染法,可以使用微脂體、脂質奈米粒子、外泌體等之一般已知的多核苷酸的輸送系統。此外,作為將表現載體引入體內(in vivo)之構成組織的細胞的方法,沒有特別限制,例如包含使用腺相關病毒、微脂體、脂質奈米粒子、外泌體等的方法。
包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞的篩選,可以發明所屬技術領域中具有通常知識者一般使用的方法來進行。篩選方法例如可以使用:使用藥劑選擇標記基因和如四環黴素、安比西林、新黴素或潮黴素等的藥劑之藥劑選擇方法、如極限稀釋法、單細胞分選法或菌落拾取法等之細胞分離法。
<本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的生產方法>
此外,本發明還提供一種生產本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的方法(也稱為「本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的生產方法」)。本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的生產方法,包含將<包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞>中所記載的包含抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞進行培養,在該細胞或該培養上清液中表現該抗體的步驟,回收、分離、純化該抗體的方法等,但只要能生產本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,並不受限於該些方法。
包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞可以藉由已知的方法進行培養。關於培養條件,例如,發明所屬技術領域中具有通常知識者可以適當選擇溫度、培養基的pH及培養時間等。當宿主細胞是動物細胞時,作為培養基,例如可以使用包含約5~20%的胎牛血清的MEM培養基(Science、1959; Vol.130: p.432-437)、DMEM培養基(Virol.、1959; Vol.8: p.396)、RPMI -1640 培養基(J.Am.Med.Assoc.、1967; Vol.199: p.519)、199 培養基(Exp.Biol.Med.、1950; Vol.73: p.1-8)等。關於培養基的pH,例如為約6~8,關於培養,視需求在通氣、攪拌的同時,在通常約30~40℃培養約15~336小時。當宿主細胞是昆蟲細胞時,作為培養基,例如可以使用包含胎牛血清的Grace's培養基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1985;Vol.82:p.8404)等。關於培養基的pH,例如為約5~8,關於培養,視需求在通氣、攪拌的同時,在通常約20~40℃培養約15~100小時。當宿主細胞是大腸桿菌或酵母時,作為培養基,例如,含有營養源的液體培養基較為適當。營養培養基例如包含:經轉形之宿主細胞的生長所必需的碳源、無機氮源或有機氮源。作為碳源,例如為:葡萄糖、葡聚醣、可溶性澱粉、蔗糖等,作為無機氮源或有機氮源,例如可列舉:銨鹽、硝酸鹽、胺基酸、玉米浸液、蛋白腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯提取液等。如果需要,可以包含其他營養素(例如,無機鹽(例如,氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂)、維他命類)、抗生素(例如,四環黴素、新黴素、安比西林、康黴素)等。培養基的pH例如為約5~8。當宿主細胞為大腸桿菌時,作為培養基,例如可以使用LB培養基、M9培養基(Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory; Vol.3: A2.2)等。關於培養,視需求在通氣、攪拌的同時,在通常約14~43℃培養約3~24小時。當宿主細胞是酵母時,作為培養基,例如可以使用Burkholder最小培養基(Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、1980; Vol.77: p.4505)等。關於培養,視需求在通氣、攪拌的同時,在通常約20~35℃培養約14~144小時。藉由如上所述的培養,可以表現本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的生產方法,除了培養包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的多核苷酸之宿主細胞,使其表現抗CD37和CD3的雙特異性抗體的步驟之外,進一步可以包含從該經轉形的宿主細胞回收、分離或純化抗CD37和CD3的雙特異性抗體的步驟。作為分離或純化方法,例如可列舉:如鹽析、溶劑沉澱法等之利用溶解度的方法;如透析、超過濾、凝膠過濾等之利用分子量差異的方法;如離子交換層析法、羥基磷灰石層析法等之利用帶電的方法;如親和層析法等之利用特異性親和性的方法;如逆相高效液相層析法等之利用疏水性差異的方法;如等電點電泳等之利用等電點的差異的方法等。在1個實施方式中,分泌到培養上清液中的抗體,可以藉由各種層析,例如,藉由使用蛋白質A管柱或蛋白質G管柱之管柱層析來進行純化。
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,也包含藉由本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的生產方法所生產之抗CD37和CD3的雙特異性抗體。
<本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物>
此外,本發明還提供一種抗CD37和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物(也稱為「本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物」)。本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物,包含含有本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體和藥學上可接受的賦形劑的醫藥組成物。本發明的醫藥組成物,可以使用本技術領域通常使用的賦形劑,即藥劑用賦形劑、藥劑用擔體等,藉由通常使用的方法來調製。作為該些醫藥組成物的劑型的實例,例如可列舉:注射劑、點滴用劑等之非經口試劑,且可以藉由靜脈內投予、皮下投予、腹腔內投予等來進行投予。關於製劑化,可以在藥學可接受的範圍內,使用對應該些劑型之賦形劑、擔體、添加劑等。
本發明的醫藥組成物能包含本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的轉譯後修飾體。例如,本發明還包含含有已接受C末端離胺酸缺失、N末端焦麩醯胺化的兩者或其一者之抗體等的醫藥組成物。
在1個實施方式中,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的醫藥組成物,其為含有選自以下(a)~(c)中任一者之本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體及/或該抗體的轉譯後修飾體的醫藥組成物:
(a)包含下述的雙特異性抗體及/或該抗體的轉譯後修飾體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;
(b)包含下述的雙特異性抗體及/或該抗體的轉譯後修飾體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或
(c)包含下述的雙特異性抗體及/或該抗體的轉譯後修飾體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的醫藥組成物,其為含有選自以下(a)~(c)中任一者之本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體及/或該抗體的轉譯後修飾體的醫藥組成物:
(a)包含下述的雙特異性抗體及/或該抗體的轉譯後修飾體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域;
(b)包含下述的雙特異性抗體及/或該抗體的轉譯後修飾體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域;或
(c)包含下述的雙特異性抗體及/或該抗體的轉譯後修飾體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域。
在1個實施方式中,本發明的醫藥組成物是包含含有由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈、由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈及由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域的雙特異性抗體和/或該抗體的轉譯後修飾體之醫藥組成物。
在1個實施方式中,本發明的醫藥組成物是包含含有由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈、由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈及由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域的雙特異性抗體和/或該抗體的轉譯後修飾體之醫藥組成物。
在1個實施方式中,本發明的醫藥組成物是包含含有由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈、由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈及由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域的雙特異性抗體和/或該抗體的轉譯後修飾體之醫藥組成物。
製劑化之本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的添加量,根據患者的症狀的程度、年齡、使用製劑的劑型,或者抗體的結合力價等而不同,但例如可以使用約0.001mg/kg~100mg/kg。
<本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的醫藥用途>
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,和包含該些的醫藥組成物可以用於治療癌症。此外,本發明還包含一種治療癌症的方法,其包含向對象投予治療有效量的本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的步驟。此外,本發明還包含一種用於治療癌症之本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體。此外,本發明還包含一種將本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體作為製造用於治療癌症之醫藥組成物的用途。作為本發明治療的對象之癌症沒有特別限制,例如可列舉:各種癌細胞的腹膜轉移、胃癌、肺癌、如急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、骨髓增生不良症候群等之血癌;如腺癌、鱗狀細胞癌、腺鱗狀細胞癌、未分化癌、大細胞癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、皮膚癌、皮膚T細胞淋巴瘤、乳癌、***癌、膀胱癌、***癌、頸部癌、頭頸部癌、子宮癌、子宮頸癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、腎臟癌、胰臟癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、睪丸癌、卵巢癌、腦腫瘤等之實質癌;以及如骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織和造血組織的癌症之外,如軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性血管內皮瘤、惡性許旺細胞瘤、骨肉瘤、軟部組織肉瘤等之肉瘤;如膠質母細胞瘤、多形性膠質母細胞瘤、肝母細胞瘤、髓母細胞瘤、腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、胰母細胞瘤、胸膜肺母細胞瘤、視網膜母細胞瘤等之母細胞瘤等。
在1個實施方式中,作為本發明治療的對象之癌症是非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、CLL、AML、T細胞淋巴瘤。在1個實施方式中,作為本發明治療的對象之癌症較佳為非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、CLL。
此外,本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,和包含該抗體的醫藥組成物可以與用於癌症治療的其他藥物和包含該些的醫藥組成物組合使用。作為組合使用的藥劑,例如可列舉:利妥昔單抗、奧比妥珠單抗、奧法木單抗、環磷醯胺、艾黴素、長春新鹼、潑尼松龍、苯達莫司汀、異環磷醯胺、雷利度胺、卡鉑、依托泊苷、依魯替尼、Venetoclax、納武單抗、帕博利珠單抗、匹吉利珠單抗、斯帕他珠單抗、西米普利單抗、阿替利珠單抗、度瓦魯單抗、阿維魯單抗等。
為了能進一步理解本發明,本說明書中提供特定的實施例僅供參考,但該些僅用於例示目的,並不限定本發明。
[實施例]
一般來說,已知雙特異性T細胞召集抗體的生理活性,受到如抗體形式、目標TAA的表現量、抗體識別之TAA上的抗原決定位、TAA和CD3的親和性、體內動態等之各種因素的影響。本發明者等製作複數個具有多樣親和性之抗CD3scFv,並認為藉由探索抗CD37抗體和抗CD3scFv的最適組合,可以取得親和性的最適平衡之雙特異性T細胞召集抗體,實施以下的研究。
[實施例1:取得具有多樣的CD3結合親和性的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體]
首先,本發明者等以取得具有多樣親和性之抗CD3scFv群為目的,使用由序列編號2、4和6所記載的胺基酸序列所構成之多肽,使用藉由該多肽所構成之抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體(專利文獻2)的序列,嘗試對於抗CD3scFv(序列編號6)進行突變。按照常規方法合成編碼連結有第二Fc多肽與經突變的抗CD3scFv的多肽的DNA,並將其***到pcDNA3.4TOPO載體(Thermo Fisher Scientific,A14697)。在本說明書中,將連結有第二Fc多肽與抗CD3scFv區域的多肽也稱為「抗CD3scFv-Fc」。
[實施例1-1:具有多樣的CD3結合親和性之抗CD3scFv的製作]
為了推定序列編號6的抗CD3scFv中能夠影響CD3結合親和性的胺基酸殘基,使用下述進行分析:(1)已知資訊(專利文獻3~6),(2)抗體的結構資訊,(3)抗體的各胺基酸殘基位置中胺基酸出現頻率的資訊,以及(4)人類Germline序列資訊。參考分析結果,設計66種的突變體。使用編碼該些突變體的胺基酸序列的DNA,按照常規方法取得抗體。將所得之抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體稱為BTE-0002~BTE-0067。此外,作為突變前的抗體,使用編碼序列編號2、4和6所記載的胺基酸序列的DNA,按照常規方法取得抗體。將所得之突變前的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體稱為BTE-0001。
[實施例1-2:CD3εδ複合蛋白質的調製]
為了評價抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體對CD3的結合活性,進行取得CD3εδ複合蛋白質。CD3εδ複合蛋白質是將各別搭載有編碼CD3ε或CD3δ的DNA之2個表現載體引入細胞而取得。使用pcDNA3.4TOPO載體作為表現載體。在第1個表現載體中,***編碼有下述胺基酸序列的DNA:依序連結CD3ε的訊息序列及胞外結構域(相當於UNIPROT登錄號:P07766之胺基酸編號1~126)、羊駝Fc(相當於Genbank登錄號:CAO79574.1之胺基酸編號102~ 328)。在第2個載體中,***編碼有下述胺基酸序列的DNA:依序連結CD3δ的訊息序列及胞外結構域(相當於UNIPROT登錄號:P04234之胺基酸編號1~105)、羊駝Fc(相當於Genbank登錄號:CAO79574.1之胺基酸編號102~ 327)。DNA按照常規方法進行合成。將製作的2個載體轉染至ExpiCHO-S(註冊商標)細胞(Thermo Fisher Scientific公司,A29127)中。將培養上清液使用HiTrap MabSelect SuRe pcc(Cytiva公司,17-5491-12)親和性純化法,以及使用陰離子交換管柱(Cytiva公司,17-1154-01)進行純化而獲得CD3εδ複合蛋白質。
[實施例1-3:具有多樣的CD3結合親和性之抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體群的CD3結合活性評價]
藉由ELISA評價抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體之BTE-0001~BTE-0067之對於CD3的結合活性。ELISA法按照常規方法進行。將實施例1-2中取得的CD3εδ複合蛋白質固相化於平板。將BTE-0001~BTE-0067用作被驗抗體。使用Goat anti-Human IgG Fc, Multi-Species SP ads-HRP (SouthernBiotech公司、2014-05)作為二抗。使用TMB+ Substrate-Chromogen (Dako公司, S1599)作為檢測試劑。使用Infinite M200pro(Tecan公司)測定吸光度。將同一平板內的最大值固定在頂部,同一平板內空白中的最小值固定在底部,使用GraphPad Prism的variable slope model(four parameters)來算出EC50值。其結果,BTE-0002~BTE-0067的66種抗體的EC50值中,最小值為BTE-0067的3.34 ng/mL,中位數為93.2 ng/mL,最大值為BTE-0030的>7500 ng/mL,可以確認表現出多樣的結合活性。
[實施例1-4:具有多樣的CD3結合親和性的抗TSPAN8和CD3scFv的雙特異性抗體群的穩定性評價]
此外,為了評價BTE-0001~BTE-0067的穩定性,實施熱漂移分析(以下稱為「TSA」)。用TSA測定50%分子的折疊崩壞時的變性中點溫度(以下稱為「Tm」)。一般認為,Tm越高,蛋白質的熱穩定性越高。TSA使用Protein Thermal Shift Dye Kit(Thermo Fisher Scientific公司、4461146、以下稱為「Kit」)。按照Kit的步驟準則,將各抗體和Kit附帶的螢光色素混合,分注到MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate(Thermo Fisher Scientific公司、4346907),並使用StepOnePlus即時PCR系統(Thermo Fisher Scientific公司)進行測定。TSA的測定是藉由將溫度從25℃昇溫到99℃來實施。使用Protein Thermal Shift Software(Thermo Fisher Scientific公司、4466038)進行解析。按照常規方法將測定所獲得的光譜算出最低Tm。其結果,藉由突變而得到之BTE-0002~BTE-0067中,大多的Tm值相較於突變前的BTE-0001的Tm值為相同或較低的值。只有BTE-0006~BTE-0008、BTE-0010、BTE-0034、BTE-0048的Tm高於BTE-0001。以Tm為約63℃以上為目標,但獲得的大多抗體的Tm約為60℃左右,教示其熱穩定性並不充分。
[實施例2:取得具有多樣的CD3結合親和性,且改善穩定性之抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體]
在實施例1中,發明者等成功獲得具有多樣的CD3結合親和性之抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體群。但是,同時也教示該些抗體的熱穩定性並不充分。因此,從實施例1中獲得的抗體中選擇11種具有CD3結合親和性的多樣性的抗體,並以改善穩定性為目標進行研究。選擇的抗體為BTE-0015、BTE-0025、BTE-0031、BTE-0034(高結合活性抗體)、BTE-0006、BTE-0009、BTE-0048(中等結合活性抗體)、BTE-0008、BTE -0011、BTE-0012、BTE-0019 (低結合活性抗體),該些抗體也被統稱為「11種的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體」。
[實施例2-1:引入用於改善穩定性的突變之抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體的製作]
為了改善11種的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體的穩定性,設計突變體。突變體是參考專利文獻3及專利文獻5而設計。具體而言,對11種的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體引入L75突變為Ile、H100突變為Asp、L58突變為Val、L85突變為Asp和L95突變為His之突變而設計55種的抗體(BTE0070~BTE0124)。其中,上述L75、H100、L58、L85、L95中的任一者都是Kabat numbering中的編號。此外,前述55種的抗體中並未引入N297G突變,而是引入歐洲索引中的第329位的脯胺酸(Pro)取代為Ala的P329A突變。為了確認從N297G變更為P329A對穩定性的影響,作為比較抗體,設計11種的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體之從N297G變更為P329A的雙特異性抗體(BTE-0125~BTE-0135)。用於該些抗體製作之將序列編號2的抗TSPAN8抗體的重鏈的N297G變更為P329A的序列,記載於序列編號8。設計的抗體也稱為「66種的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體」。按照常規方法製作編碼該些抗體的DNA,並按照常規方法獲得抗體。將獲得的66種抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體分別稱為BTE-0070~BTE-0135。
[實施例2-2:引入用於改善穩定性的突變之抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體群的CD3結合活性評價]
藉由實施例1-3中記載的ELISA法來評價66種的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體對CD3的結合活性。其結果,用於改善穩定性的突變並沒有顯著影響對CD3的結合活性,且基本上維持突變前的多樣的結合活性。
[實施例2-3:引入用於改善穩定性的突變之66種抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體群的穩定性評價]
藉由實施例1-4所述的TSA來評價66種的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體的穩定性。將ELISA EC50為1250 ng/mL以下,TSA中Tm為63℃以上的抗體作為改善穩定性的抗體。進一步地,相對於蛋白質調製時的培養基量,選擇具有1mg/mL以上的抗體產量(Yield)的抗體。進一步地,將選擇的34種的抗TSPAN8和CD3scFv的雙特異性抗體在40℃下靜置1週以評價其穩定性。使用表面電漿共振(SPR)法測定靜置前後的抗體的CD3結合活性來評價抗體的穩定性。SPR法的測定使用BiacoreT-200(Cytiva公司)。用於Biacore測定的晶片是Series S Sensor Chip CM5(Cytiva公司, 29104988),使用His Capture Kit(Cytiva公司、
28995056)和Amine Coupling Kit(Cytiva公司、BR100050)將抗體固定化,接著與Human CD3 epsilon&CD3 delta Heterodimer Protein, His Tag&Tag Free(MALS verifies) (AcroBiosystems公司、CDD-H52W1)結合來製作。在以靜置前的CD3結合活性作為100%的情況下,算出靜置後的CD3結合活性(Biacore40C1W)。Biacore40C1W中的相對值越低,表示靜置時的保存穩定性越差。其結果,作為Tm為63℃以上,且保持殘留活性為78%以上的抗體,發現16種的抗TSPAN8和CD3的雙特異性抗體(BTE-0079、0080、0090、0091、0092、0097~0102、0111~0113、0134、0135)。藉由ELISA法對該些抗體之對CD3的結合活性和藉由TSA及SPR之穩定性的結果如表1所示。dTm表示各抗體的Tm與BTE-0001的Tm之間的差。Biacore值表示藉由SPR法將靜置前的CD3結合活性作為100%時之靜置後的CD3結合活性(Biacore40C1W)。此外,該16種所使用的抗CD3scFv在以下稱為「16種類的抗CD3scFv」。
[實施例3:抗CD37和CD3的雙特異性抗體的取得]
使用實施例2-3中取得的16種的抗CD3scFv,取得作為與CD37結合的雙特異性抗體之抗CD37和CD3的雙特異性抗體。
作為抗CD37抗體,基於專利文獻1的記載,基於編碼抗CD37抗體的序列編號9和序列編號11之鹼基序列來合成DNA,並將其***到pcDNA3.4TOPO載體。製作的載體稱為ApiD00158和ApiD00159。然後,將搭載有編碼抗CD3scFv-Fc的DNA之pcDNA3.4TOPO載體之下述任一載體與ApiD00158和ApiD00159轉染至ExpiCHO-S(註冊商標)細胞:ApiD00087、ApiD00088、ApiD00145、ApiD00146、
ApiD00100、ApiD00105~ApiD00110、ApiD00119~
ApiD00121、ApiD00156、ApiD00157。按照常規方法,使用MabSelect SuRe純化培養上清液。所得的16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體被稱為BTE-0136~0149、0151、0152,或統稱為「16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體」。用於製作抗CD37和CD3的雙特異性抗體的載體名稱及抗CD3scFv的突變胺基酸編號及突變的資訊如表2所示。
[實施例4:抗CD37和CD3的雙特異性抗體的體外(in vitro)活性評價]
從實施例3製作的16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體中,篩選出穩定性和活性優異的抗體,將對人類CD3的結合親和性、穩定性、CD37表現細胞與人類T細胞共同培養系統中的細胞毒性(Redirected T Cell Cytotoxicity:RTCC)及細胞激素的產生,如以下所述進行評價。
[實施例4-1:16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的結合活性評價]
藉由實施例1-3中記載的ELISA法來評價16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的CD3結合活性。其結果,在與抗CD37抗體的雙特異性抗體中,可以確認16種的抗CD3雙特異性抗體總體上維持對CD3的多樣的結合活性。16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的EC50值如表3所示。
[實施例4-2:16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的穩定性評價]
藉由實施例1-4中所述之TSA來評價16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的穩定性。Tm如表3所示。進一步地,測定在40℃下靜置1週後的抗CD3結合活性的殘留率(表3)。16種的抗CD37和CD3雙特異性抗體均在Biacore40C1W中均顯示出約70%以上的穩定性。特別是BTE-0136、0138、0141、0142、0144、0145、0148、0151顯示出80%以上的殘留率,教示該些是高穩定性的抗體。
[實施例4-3:16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體的RTCC活性評價]
在表現人類CD37和GFPSpark(註冊商標)的CHO-K1細胞(CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞)和從人類PBMC分離的T細胞的共同培養系統中,藉由使抗CD37和CD3雙特異性抗體作用而誘導的體外(in vitro) RTCC活性進行評價。
1:CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞的製作
藉由以下方法製作CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞。按照常規方法,將編碼人類CD37(NCBI登錄號:NP_001765.1)的DNA***到pcDNA3.4TOPO載體以構築人類CD37表現載體。按照常規方法從PD-L1-GFPSpark表現載體(SinoBiological公司,HG10084-ACG)中除去PD-L1序列以構築GFPSpark表現載體。使用Lipofectamine3000 Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific公司、L3000015)將該些2種質體載體轉染至CHO-K1細胞(American Type Culture Collection、CCL-61),並以包含Geneticin(Thermo Fisher Scientific公司、10131-027)和Hygromycin B Gold(InvivoGen公司、ant-hg-5)的培養基進行培養以選擇引入基因的細胞。分離單一殖株細胞後,將藉由流式細胞儀確認之人類CD37和GFPSpark兩者均有表現的細胞,在以下的實驗用作CHO-K1_人類CD37/
GFPSpark細胞。
2:Expanded panT細胞的製作
使用PanT Cell Isolation Kit、human(Miltenyi Biotec公司、130-096-535),基於添附的步驟準則,從人類PBMC (ALLCELLS公司,PB003F)中分離出panT細胞(包含CD4T細胞和CD8T細胞兩者)。將分離的panT細胞稀釋至1×10
6個/ml,添加與panT細胞相同數量的Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation (Thermo Fisher Scientific公司、11131D)和終濃度為30U/ml的人類IL-2(PeproTech公司、200-02),在37℃、5% CO
2的恆溫箱中培養。培養開始4天後、6天後、8天後,以5×10
5個/mL的濃度進行傳代培養。在培養開始4天後和6天後之傳代培養時,添加終濃度為30U/ml的人類IL-2。培養開始11天後回收細胞,藉由磁鐵除去Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation後,以CELLBANKER1(Takara公司,CB011)進行懸浮並冷凍保存。將調製的細胞稱為Expanded panT細胞。
3:RTCC分析
將培養基調製為5×10
4個/mL的CHO-K1_人類CD37
/GFPSpark 細胞的懸浮液接種於平底384孔微量盤(Greiner公司,781182)各孔20μL(1×10
3個),並在37℃,5% CO
2恆溫箱中培養3小時。隨後,將BTE-0136、0138、0141~0145、0147、0148、0151以最高濃度作為3.0×10
3ng/mL,以4倍公比稀釋至2.9×10
-3ng/mL(換算之終濃度為1.0×10
3ng/mL~9.5×10
-4ng/mL),將BTE-0137、0139、0140、0146、0149、0152以最高濃度作為3.0×10
4ng/mL,以4倍公比稀釋至2.9×10
-2ng/mL(換算之終濃度為1.0×10
4ng/mL~9.5×10
-3ng/mL),將稀釋後的抗體以各孔20μL添加至培養中的384孔板。將在培養基中調製成5×10
5個/mL的Expanded panT細胞以各孔20μL添加,在37℃、5% CO
2的恆溫箱中培養3天後,以IncuCyte(註冊商標)ZOOM(Sartorius公司)來測定各孔的GFPSpark螢光面積作為活細胞數的指標。各種抗CD37和CD3的雙特異性抗體的濃度與GFPSpark螢光面積的關係如圖1-1、1-2所示。其結果,除了BTE-0137之外的15種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體,降低CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞的活細胞數。
[實施例4-4:16種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體之細胞激素產生評價]
藉由以ELISA測定實施例4-3-3的RTCC分析的培養上清液中所包含的IFN-γ和TNF-α,評價抗CD37和CD3的雙特異性抗體的T細胞活化作用。測定中使用BD OptEIA Human IFN-γ ELISA(BD Biosciences公司、555142)、以及Human TNF-alpha DuoSet ELISA(R&D Systems公司、DY210-5)。相對於抗CD37和CD3的雙特異性抗體的添加濃度,將檢測到的IFN-γ和TNF-α的量作圖之圖表顯示於圖2-1~2-4。其結果,除了BTE-0137外,15種的抗CD37和CD3的雙特異性抗體均誘導IFN-γ和TNF-α的產生,但大多的抗體在一定濃度以上之抗體存在下,反而降低IFN-γ和TNF-α的產量。一般來說,已知設計為辨識2個抗原分子而在細胞間形成交聯之抗體,在高濃度條件下則經由僅與其中一個抗原分子結合的抗體佔據抗原,而抑制細胞間的交聯形成(AAPS J.2019、Vol.21(4)、p.66)。高抗體濃度區域中 IFN-γ和TNF-α產量的減少是此種細胞間交聯形成抑制的結果,具有該特徵的抗體被認為是會容易發生由T細胞引起的細胞毒性減弱的抗體,因此不適合用作治療人類癌症的抗體。考慮到此點,綜合具有多樣的CD3結合親和性、穩定、且即使在RTCC分析中在高濃度也不容易降低IFN-γ和TNF-α的產量之抗體的篩選結果,將BTE-0136、0142、0148選定為用於治療人類的候選抗體。
[實施例5:抗CD37和CD3的雙特異性抗體的體內(in vivo)抗腫瘤評價]
將以PBS懸浮之2.5×10
6個/100μL的人類PBMC (Precision for Medicine公司,33000-10M)移入6週齡NOD/Shi-scid、IL-2RγKO(NOG)雌性小鼠(In-Vivo Science股份有限公司)的尾靜脈。隨後,在移植人類PBMC的13天後,將以Corning Matrigel Basement Membrane Matrix、Phenol Red-Free(Corning公司、356237)懸浮之2×10
6個/100μL的SU-DHL-6細胞(American Type Culture Collection、CRL-2959)移植至小鼠皮下。SU-DHL-6細胞移植後8天後,測定腫瘤體積和體重,並將小鼠分群以使各群之間的腫瘤體積均等。在分群當天和7天後,從尾靜脈投予以PBS稀釋之BTE-0136、0142、0148的劑量5、1、0.1、0.01、0.001mg/kg。向對照群投予PBS。在分群當天、4天後、7天後和11天後測定腫瘤體積。試驗以各群8例實施。然而,從解析中排除在開始抗體投予後11天之前即死亡之BTE-0136的0.001mg/kg投予群和BTE-0148的0.001mg/kg投予群中的各1例。其結果如圖3-1~3-3所示。藉由下式計算腫瘤體積[mm
3]。
(腫瘤長軸的長度[mm])×(腫瘤短軸的長度[mm])
2×0.5
開始給予抗體11天後,比較對照群和各抗體給予群的腫瘤體積,藉由Dunnett多重比較檢定,*表示p<0.05的群,**表示p<0.01的群。其結果,BTE-0136和BTE-0142在0.001mg/kg以上的劑量,BTE-0148在0.01mg/kg以上的劑量,顯示顯著的抗腫瘤作用。
[產業上的利用性]
本發明的抗CD37和CD3的雙特異性抗體可以期待用於治療癌症。此外,本發明的多核苷酸、表現載體、包含表現載體的宿主細胞和生產抗體的方法對生產前述抗CD37和CD3的雙特異性抗體而言是有用的。
[序列表非關鍵詞文字]
序列編號2和8顯示抗TSPAN8抗體的重鏈胺基酸序列,序列編號1和7所示的鹼基序列是編碼序列編號2和8所示的抗TSPAN8抗體的重鏈胺基酸序列之鹼基序列。序列編號4顯示抗TSPAN8抗體的輕鏈胺基酸序列,序列編號3所示的鹼基序列是編碼序列編號4所示的抗TSPAN8抗體的輕鏈胺基酸序列之鹼基序列。序列編號10顯示抗CD37抗體的重鏈胺基酸序列,序列編號9所示的鹼基序列是編碼序列編號10所示的抗CD37抗體的重鏈胺基酸序列之鹼基序列。序列編號12顯示抗CD37抗體的輕鏈胺基酸序列,序列編號11所示的鹼基序列是編碼序列編號12所示的抗CD37抗體的輕鏈胺基酸序列之鹼基序列。序列編號6、14、16、18是連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的胺基酸序列,序列編號5、13、15、17所示的鹼基序列是編碼序列編號6、14、16、18所示的連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的胺基酸序列之鹼基序列。序列編號19~27是發明的詳細說明中所記載之各種連接子的胺基酸序列。
[圖1-1]顯示在CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞和Expanded panT細胞的共同培養系統中,抗CD37和CD3的雙特異性抗體的細胞毒性的評價結果。橫軸表示抗體濃度,縱軸表示各孔(well)的GFPSpark螢光面積。實驗以三重複實施,各條件的平均值以符號表示,並以折線連接。
[圖1-2]顯示在CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞和Expanded panT細胞的共同培養系統中,抗CD37和CD3的雙特異性抗體的細胞毒性的評價結果。橫軸表示抗體濃度,縱軸表示各孔(well)的GFPSpark螢光面積。實驗以三重複實施,各條件的平均值以符號表示,並以折線連接。
[圖2-1]顯示在CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞和Expanded panT細胞的共同培養系統中,抗CD37和CD3的雙特異性抗體的IFN-γ分泌誘導活性的評價結果。橫軸表示抗體濃度,縱軸表示培養上清液中的IFN-γ濃度。實驗以三重複實施,各條件的平均值以符號表示,並以折線連接。
[圖2-2]顯示在CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞和Expanded panT細胞的共同培養系統中,抗CD37和CD3的雙特異性抗體的IFN-γ分泌誘導活性的評價結果。橫軸表示抗體濃度,縱軸表示培養上清液中的IFN-γ濃度。實驗以三重複實施,各條件的平均值以符號表示,並以折線連接。
[圖2-3]顯示在CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞和Expanded panT細胞的共同培養系統中,抗CD37和CD3的雙特異性抗體的TNF-α分泌誘導活性的評價結果。橫軸表示抗體濃度,縱軸表示培養上清液中的TNF-α濃度。實驗以三重複實施,各條件的平均值以符號表示,並以折線連接。
[圖2-4]顯示在CHO-K1_人類CD37/GFPSpark細胞和Expanded panT細胞的共同培養系統中,抗CD37和CD3的雙特異性抗體的TNF-α分泌誘導活性的評價結果。橫軸表示抗體濃度,縱軸表示培養上清液中的TNF-α濃度。實驗以三重複實施,各條件的平均值以符號表示,並以折線連接。
[圖3-1]顯示在人類PBMC移入SU-DHL-6細胞皮下荷癌模型之BTE-0136的抗腫瘤效果。左圖的橫軸表示抗體投予開始後的日數,縱軸表示腫瘤體積,誤差條表示標準誤差。右圖顯示投予開始11日後之各個體的腫瘤體積的值。橫軸表示BTE-0136的劑量,縱軸表示腫瘤體積。橫線表示平均值,誤差條表示標準誤差。藉由Dunnett多重比較檢定來比較PBS投予群的腫瘤體積和各劑量之BTE-0136的投予群的腫瘤體積來求出顯著性概率P值。圖中的**表示P值顯著水準小於0.01的群,*表示P值顯著水準小於0.05的群。
[圖3-2]顯示在人類PBMC移入SU-DHL-6細胞皮下荷癌模型之BTE-0142的抗腫瘤效果。左圖的橫軸表示抗體投予開始後的日數,縱軸表示腫瘤體積,誤差條表示標準誤差。右圖顯示投予開始11日後之各個體的腫瘤體積的值。橫軸表示BTE-0142的劑量,縱軸表示腫瘤體積。橫線表示平均值,誤差條表示標準誤差。藉由Dunnett多重比較檢定來比較PBS投予群的腫瘤體積和各劑量之BTE-0142的投予群的腫瘤體積來求出顯著性概率P值。圖中的**表示P值顯著水準小於0.01的群,*表示P值顯著水準小於0.05的群。
[圖3-3]顯示在人類PBMC移入SU-DHL-6細胞皮下荷癌模型之BTE-0148的抗腫瘤效果。左圖的橫軸表示抗體投予開始後的日數,縱軸表示腫瘤體積,誤差條表示標準誤差。右圖顯示投予開始11日後之各個體的腫瘤體積的值。橫軸表示BTE-0148的劑量,縱軸表示腫瘤體積。橫線表示平均值,誤差條表示標準誤差。藉由Dunnett多重比較檢定來比較PBS投予群的腫瘤體積和各劑量之BTE-0148的投予群的腫瘤體積來求出顯著性概率P值。圖中的**表示P值顯著水準小於0.01的群。
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Claims (29)
- 一種雙特異性抗體,其是抗CD37和CD3的雙特異性抗體,包含: (a)抗CD37抗體的Fab區域,其是由包含抗CD37抗體的重鏈可變區域的重鏈片段和包含抗CD37抗體的輕鏈可變區域的輕鏈所構成; (b)抗CD3scFv區域,其包含抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域;以及 (c)Fc區域,其是由與(a)的Fab區域的重鏈片段連結之第一Fc多肽和與(b)的抗CD3scFv區域連結之第二Fc多肽所構成; 抗CD3抗體的重鏈可變區域和輕鏈可變區域為以下(1)~(3)中的任一者: (1)由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域; (2)由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域;或 (3)由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域。
- 如請求項1之雙特異性抗體,其中抗CD3scFv區域是以下(1)~(3)中的任一者: (1)由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域; (2)由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域;或 (3)由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成之抗CD3scFv區域。
- 如請求項1或2之雙特異性抗體,其中抗CD37抗體的重鏈可變區域包含由序列編號10的胺基酸編號31至35的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號10的胺基酸編號50至65的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號10的胺基酸編號98至104的胺基酸序列所構成之CDR3,且抗CD37抗體的輕鏈可變區域包含由序列編號12的胺基酸編號24至34的胺基酸序列所構成之CDR1、由序列編號12的胺基酸編號50至56的胺基酸序列所構成之CDR2及由序列編號12的胺基酸編號89至95的胺基酸序列所構成之CDR3。
- 如請求項3之雙特異性抗體,其中抗CD37抗體的重鏈可變區域為由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成,且抗CD37抗體的輕鏈可變區域為由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成。
- 如請求項4之雙特異性抗體,其中抗CD37抗體的Fab區域是由下述所構成:由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成之重鏈片段和由序列編號12的胺基酸序列所構成之輕鏈。
- 一種雙特異性抗體,其是如以下(a)~(c)中的任一者之抗CD37和CD3的雙特異性抗體: (a)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域; (b)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或 (c)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
- 一種雙特異性抗體,其是如以下(a)~(c)中的任一者之抗CD37和CD3的雙特異性抗體: (a)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域; (b)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;或 (c)包含下述的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是連結有第二Fc多肽之由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域。
- 如請求項1~7中任一項之雙特異性抗體,其中Fc區域包含杵臼(knobs into holes)突變,杵臼突變是在形成Fc區域的1個Fc多肽中的T366W的突變,以及形成Fc區域的另一個Fc多肽中的T366S、L368A和Y407V的突變(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引的胺基酸位置)。
- 如請求項1~8中任一項之雙特異性抗體,其中Fc區域包含LALA突變(L234A和L235A)(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引的胺基酸位置)。
- 如請求項1~9中任一項之雙特異性抗體,其中Fc區域包含P329A突變(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引的胺基酸位置)。
- 如請求項1~10中任一項之雙特異性抗體,其中抗CD37抗體的Fab區域的重鏈片段與第一Fc多肽是透過鉸鏈區域而連結,抗CD3scFv區域與第二Fc多肽是透過鉸鏈區域而連結。
- 如請求項11之雙特異性抗體,其中連結抗CD3scFv區域和第二Fc多肽的鉸鏈區域包含C220S突變(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引的胺基酸位置)。
- 如請求項11或12之雙特異性抗體,其中Fc區域包含杵臼(knobs into holes)突變、LALA突變和P329A突變,連結抗CD3scFv區域和第二Fc多肽的鉸鏈區域包含C220S突變(其中,前述突變位置是在人類Igγ1恆定區域中按照歐洲索引的胺基酸位置)。
- 一種雙特異性抗體,其是如以下(a)~(c)中的任一者之雙特異性抗體: (a)由下述所構成的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域; (b)由下述所構成的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域;或 (c)由下述所構成的雙特異性抗體:抗CD37抗體的重鏈,其是由序列編號10的胺基酸序列所構成;抗CD37抗體的輕鏈,其是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及多肽,其是由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域。
- 如請求項1~14中任一項之雙特異性抗體,其為經轉譯後修飾者。
- 如請求項15之雙特異性抗體,其中轉譯後修飾是重鏈可變區域的N末端焦麩醯胺化和/或重鏈的C末端離胺酸缺失。
- 一種用於生產抗CD37和CD3的雙特異性抗體之多核苷酸,其選自由下述(a)~(p)所組成的群組中: (a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈片段的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈片段包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成之重鏈可變區域; (b)包含編碼抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成之輕鏈可變區域; (c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈的鹼基序列的多核苷酸; (d)包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈的鹼基序列的多核苷酸; (e)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域; (f)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域; (g)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域; (h)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成; (i)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成; (j)包含編碼抗CD3scFv區域的鹼基序列的多核苷酸,該抗CD3scFv區域由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成; (k)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽; (l)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽; (m)包含編碼下述多肽之鹼基序列的多核苷酸:連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的重鏈可變區域和由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成之抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域的多肽; (n)包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸; (o)包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸;或 (p)包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽之抗CD3scFv區域的多肽的鹼基序列的多核苷酸。
- 一種用於生產抗CD37和CD3的雙特異性抗體之多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中: (a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,該多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號14的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號14的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域; (b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,該多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號16的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號16的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域;或 (c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之包含由序列編號10的胺基酸編號1至115的胺基酸序列所構成的重鏈可變區域之抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈包含由序列編號12的胺基酸編號1至105的胺基酸序列所構成的輕鏈可變區域;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,該多肽是連結有第二Fc多肽之包含由序列編號18的胺基酸編號1至125的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的重鏈可變區域及由序列編號18的胺基酸編號146至254的胺基酸序列所構成的抗CD3抗體的輕鏈可變區域之抗CD3scFv區域。
- 一種用於生產抗CD37和CD3的雙特異性抗體之多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中: (a)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,該多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號14的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域; (b)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,該多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號16的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域;或 (c)包含編碼抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的重鏈是連結有第一Fc多肽之由序列編號10的胺基酸編號1至213的胺基酸序列所構成的抗CD37抗體的重鏈片段;包含編碼抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸,該抗CD37抗體的輕鏈是由序列編號12的胺基酸序列所構成;以及包含編碼多肽之鹼基序列的多核苷酸,該多肽是連結有第二Fc多肽之由序列編號18的胺基酸編號1至254的胺基酸序列所構成的抗CD3scFv區域。
- 一種用於生產抗CD37和CD3的雙特異性抗體之多核苷酸,其選自由下述(a)~(c)所組成的群組中: (a)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號14的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸; (b)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號16的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸;或 (c)包含編碼由序列編號10的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的重鏈之鹼基序列的多核苷酸;包含編碼由序列編號12的胺基酸序列所構成之抗CD37抗體的輕鏈之鹼基序列的多核苷酸;以及包含編碼由序列編號18的胺基酸序列所構成之連結有第二Fc多肽的抗CD3scFv區域之多肽之鹼基序列的多核苷酸。
- 一種表現載體,其包含如請求項17~20中任一項之多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其轉形有如請求項21之表現載體。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項17~20中任一項之多核苷酸。
- 一種抗CD37和CD3的雙特異性抗體之生產方法,其包含培養如請求項22或23之宿主細胞的步驟。
- 一種醫藥組成物,其包含如請求項1~16中任一項之雙特異性抗體和藥學上可接受的賦形劑。
- 一種如請求項1~16中任一項之雙特異性抗體,其用於治療癌症。
- 一種如請求項25之醫藥組成物,其用於治療癌症。
- 一種治療癌症的方法,其包含向對象投予治療有效量之如請求項1~16中任一項之雙特異性抗體的步驟。
- 一種如請求項1~16中任一項之雙特異性抗體作為製備用於治療癌症之醫藥組成物的用途。
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