KR20230155589A - 단백질 코로나 분석을 위한 조성물, 방법 및 시스템 및 그것들의 용도 - Google Patents

단백질 코로나 분석을 위한 조성물, 방법 및 시스템 및 그것들의 용도 Download PDF

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마이클 피가
샤오얀 자오
그레고리 트로이아노
윌리엄 매닝
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마윈 코
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Abstract

단백질 코로나를 분석하기 위한 조성물, 방법, 및 시스템, 뿐만 아니라 치료 표적뿐만 아니라 진전된 진단 도구의 발견에서의 그것의 적용이 본원에서 기술된다.

Description

단백질 코로나 분석을 위한 조성물, 방법 및 시스템 및 그것들의 용도{COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS FOR PROTEIN CORONA ANALYSIS AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 11월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 62/756,960호; 2019년 3월 26일에 출원된 62/824,278HJ; 및 2019년 7월 16일에 출원된 62/874,862호에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 상기 출원들의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
과학 및 의학에서 단백질 정보의 광범위한 실행은 대부분, 그러한 분석의 확장성을 제한하는 복잡한 작업흐름을 필요로 하는, 단백질 분자 자체에 내재된 복잡성 때문에 유전체학 뒤로 뒤쳐져 있었다. 본원에는 단백질체 데이터의 신속한 처리 및 질환과 관련된 핵심 바이오마커의 확인을 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
본 발명은 대상체에서 광범위한 질환 및 장애의 검출 및 질환 상태의 측정을 위한 나노입자의 패널을 제공한다.
단백질 코로나(protein corona)를 생성하고 특성화하는 것은 또한 현장에서 수행되었다; 그러나, 대부분의 실험은 비자성(non-magnetic) 입자, 예컨대 리포좀 및 중합체 나노입자, 또는 표적화된 약물 전달에 사용될 수 있는 다른 입자 유형(particle type)에서 실시되었다.
현재 단백질 코로나 형성 및 특성화에 대한 (전형적으로 학문적인) 검정의 문제점은, 검정에 사용된 입자가 코로나 수집을 위해 분리될 필요가 있기 때문에, 그것이 고처리량 및/또는 자동화된 형식에 맞지 않다는 것이다. 단백질 코로나에 사용된 SPMNP의 장점은 외부 자기장을 적용함으로써 현탁 혼합물로부터 쉽게 분리될 수 있는 신속한 자성 반응이다. 이런 유형의 자성 입자는 입자와 혈장 단백질 사이의 상호작용을 미세하게 조정하는 것을 도울 수 있는 상이한 작용기로의 추가의 화학적 변형을 위한 양호한 플랫폼이다.
일부 측면으로, 본 개시는 샘플에서 단백질을 확인하는 방법을 제공하며, 방법은:
입자 패널을 샘플과 함께 인큐베이션하여 입자 패널의 독특한(distinct) 입자 유형에 상응하는 복수의 독특한 생체분자(biomolecule) 코로나를 형성하는 단계;
입자 패널을 샘플 중의 미결합 단백질로부터 자성적으로 분리하여 복수의 독특한 생체분자 코로나의 단백질을 풍부화하는 단계; 및
복수의 독특한 생체분자 코로나를 검정하여 풍부화된 단백질을 확인하는 단계를 포함한다.
일부 측면으로, 검정은 1 내지 20,000개의 단백질 그룹을 확인할 수 있다. 추가의 측면으로, 검정은 1000 내지 10,000개의 단백질 그룹을 확인할 수 있다. 추가의 측면으로, 검정은 1,000 내지 5,000개의 단백질 그룹을 확인할 수 있다. 또한 추가의 측면으로, 검정은 1,200 내지 2,200개의 단백질 그룹을 확인할 수 있다. 일부 측면으로, 단백질 그룹은 7개 아미노산 잔기의 최소 길이를 가지는 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 추가에서, 검정은 1,000 내지 10,00개의 단백질을 확인할 수 있다. 또한 일부 추가에서, 검정은 1,800 내지 5,00개의 단백질을 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 샘플은 복수의 샘플을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 샘플은 적어도 2개 이상의 공간적으로 분리된 샘플을 포함한다. 추가의 구체예에서, 인큐베이션은 적어도 2개 이상의 공간적으로 분리된 샘플을 동시에 입자 패널과 접촉시키는 것을 포한한다. 추가의 구체예에서, 자성적으로 분리하는 것은 복수의 샘플의 적어도 2개 이상의 공간적으로 분리된 샘플에서 동시에 미결합 단백질로부터 입자 패널을 자성적으로 분리하는 것을 포함한다. 추가의 구체예에서, 검정은 복수의 독특한 생체분자 코로나를 검정하여 적어도 2개 이상의 공간적으로 분리된 샘플에서 동시에 단백질을 확인하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 본원에 기술된 방법을 반복하는 것을 추가로 포함하는데, 반복될 때, 인큐베이션, 분리, 및 검정은 입자 패널의 각각의 입자 유형에 대한 적어도 3회 전체 검정 복제물로부터의 펩타이드 질량 분석 특징을 비교함으로써 측정되는 바, 20% 이하의 퍼센트 분위수 표준화된(quantile normalize) 변동 계수 (QNCV)를 유발한다. 일부 구체예에서, 반복될 때, 인큐베이션, 분리, 및 검정은 입자 패널의 각각의 입자 유형에 대한 적어도 3회 전체 검정 복제물로부터의 펩타이드 질량 분석 특징을 비교함으로써 측정되는 바, 10% 이하의 퍼센트 분위수 표준화된 변동 계수 (QNCV)를 유발한다. 일부 구체예에서, 검정은 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10의 동적 범위(dynamic range)에 걸쳐 단백질을 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 미결합 단백질로부터 입자 패널을 자성적으로 분리한 후 적어도 1회 또는 적어도 2회 입자 패널을 세척하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 검정 후에 방법은 복수의 독특한 생체분자 코로나에서 단백질을 용해시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 복수의 독특한 생체분자 코로나에서 단백질을 소화시켜서 소화된 펩타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 소화된 펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 검정은 샘플 중의 단백질을 확인하기 위해 질량 분석을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 검정은 약 2 내지 약 4시간 내에 수행된다. 일부 구체예에서, 방법은 약 1 내지 약 20시간 내에 수행된다. 일부 구체예에서, 방법은 약 2 내지 약 10시간 내에 수행된다. 일부 구체예에서, 방법은 약 4 내지 약 6시간 내에 수행된다. 일부 구체예에서, 분리에는 약 30분 이하, 약 15분 이하, 약 10분 이하, 약 5분 이하, 또는 약 2분 이하가 걸린다. 일부 구체예에서, 복수의 샘플은 적어도 10개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 50개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 100개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 150개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 200개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 250개의 공간적으로 분리된 샘플, 또는 적어도 300개의 공간적으로 분리된 샘플을 포함한다. 추가의 구체예에서, 복수의 샘플은 적어도 96개의 샘플을 포함한다.
일부 구체예에서, 입자 패널은 적어도 2개의 독특한 입자 유형, 적어도 3개의 독특한 입자 유형, 적어도 4개의 독특한 입자 유형, 적어도 5개의 독특한 입자 유형, 적어도 6개의 독특한 입자 유형, 적어도 7개의 독특한 입자 유형, 적어도 8개의 독특한 입자 유형, 적어도 9개의 독특한 입자 유형, 적어도 10개의 독특한 입자 유형, 적어도 11개의 독특한 입자 유형, 적어도 12개의 독특한 입자 유형, 적어도 13개의 독특한 입자 유형, 적어도 14개의 독특한 입자 유형, 적어도 15개의 독특한 입자 유형, 적어도 20개의 독특한 입자 유형, 적어도 25 입자 유형, 또는 적어도 30개의 독특한 입자 유형을 포함한다. 추가의 구체예에서, 입자 패널은 적어도 10개의 독특한 입자 유형을 포함한다. 추가의 구체예에서, 적어도 2개의 공간적으로 분리된 샘플은 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하다.
일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성을 공유하고 적어도 하나의 물리화학적 특성만큼 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형과 제2 독특한 입자 유형은 상이하다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하고 적어도 2개의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형과 제2 독특한 입자 유형은 상이하다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성을 공유하고 적어도 2개의 물리화학적 특성만큼 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형과 제2 독특한 입자 유형은 상이하다.
일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하고 적어도 하나의 물리화학적 특성만큼 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형과 제2 독특한 입자 유형은 상이하다. 추가의 구체예에서, 물리화학적 특성은 크기, 전하, 코어 물질, 쉘 물질, 다공도, 또는 표면 소수성을 포함한다. 추가의 구체예에서, 크기는 동적 광산란, SEM, TEM, 또는 이것들의 임의의 조합에 의해 측정되는 직경 또는 반경이다.
일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 카르복실레이트 물질을 포함하고, 제1 독특한 입자는 마이크로입자이며, 제2 독특한 입자 유형은 나노입자이다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 0 mV 내지 -50 mV의 표면 전하를 포함하고, 제1 독특한 입자 유형은 200 nm 미만의 직경을 가지며, 제2 독특한 입자 유형은 200 nm보다 큰 직경을 가진다.
일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 100 내지 400 nm의 직경을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 가지며, 제2 독특한 입자 유형은 중성 표면 전하를 가진다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 나노입자이고, 제1 독특한 입자 유형은 -20 mV 미만의 표면 전하를 가지며 제2 독특한 입자 유형은 -20 mV보다 큰 표면 전하를 가진다.
일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 마이크로입자이고, 제1 독특한 입자 유형은 음의 표면 전하를 가지며, 제2 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 가진다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 음전하 나노입자의 하위세트를 포함하며, 하위세트의 각각의 입자는 저어도 하나의 표면 화학 그룹만큼 상이하다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형, 제2 입자, 및 제3 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형, 제2 독특한 입자 유형, 및 제3 독특한 입자 유형은 산화철 코어, 중합체 쉘을 포함하고, 직경이 약 500 nm 미만이며, 제1 독특한 입자 유형은 음전하를 포함하고, 제2 독특한 입자 유형은 양전하를 포함하며, 제3 독특한 입자 유형은 중성 전하를 포함하고, 직경은 동적 광산란에 의해 측정되는 바 평균 직경이다. 추가의 구체예에서, 제1 독특한 입자 유형은 실리카 코팅을 포함하며, 제2 독특한 입자 유형은 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필)메타크릴아미드) (PDMAPMA) 코팅을 포함하고, 제3 독특한 입자 유형은 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA) 코팅을 포함한다.
일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 나노입자이다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 마이크로입자이다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 초상자성 산화철 입자이다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 각각의 입자는 산화철 물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 산화철 코어를 가진다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 폴리스티렌 코어에 삽입된 산화철 결정을 가진다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 각각의 독특한 입자 유형은 초상자성 산화철 입자이다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 각각의 독특한 입자 유형은 산화철 코어를 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 각각의 하나의 독특한 입자 유형은 폴리스티렌 코어에 삽입된 산화철 결정을 가진다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 카르복실화된 중합체, 아민화된 중합체, 양쪽이온성 중합체, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 한 입자 유형은 실리카 쉘 코팅을 가진 산화철 코어를 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 한 입자 유형은 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA) 코팅을 가진 산화철 코어를 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 한 입자 유형은 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA) 코팅을 가진 산화철 코어를 포함한다.
일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 음의 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 중성 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 표 10으로부터 선택된 하나 이상의 독특한 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 표 10으로부터 선택된 2개 이상의 독특한 입자 유형, 3개 이상의 독특한 입자 유형, 4개 이상의 독특한 입자 유형, 5개 이상의 독특한 입자 유형, 6개 이상의 독특한 입자 유형, 7개 이상의 독특한 입자 유형, 8개 이상의 독특한 입자 유형, 9개 이상의 독특한 입자 유형, 또는 전부 10개의 독특한 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 표 12로부터 선택된 하나 이상의 독특한 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 표 12로부터 선택된 2개 이상의 독특한 입자 유형, 3개 이상의 독특한 입자 유형, 4개 이상의 독특한 입자 유형, 5개 이상의 독특한 입자 유형, 6개 이상의 독특한 입자 유형, 7개 이상의 독특한 입자 유형, 8개 이상의 독특한 입자 유형, 9개 이상의 독특한 입자 유형, 또는 전부 10개의 독특한 입자 유형을 포함한다.
다양한 측면으로, 본 개시는 2가지 이상의 물리화학적 특성이 상이한 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형을 포함하는 조성물을 제공하며, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 하위세트는 2개 이상의 물리화학적 특성의 물리화학적 특성을 공유하고 하위세트의 그러한 입자 유형은 단백질에 결합한다.
일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10의 동적 범위에 걸쳐 단백질 생물학적 샘플로부터 단백질을 흡착한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 생물학적 샘플로부터 1 내지 20,000개의 단백질 그룹을 흡착할 수 있다. 일부 측면으로, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 생물학적 샘플로부터 1,000 내지 10,000개의 단백질 그룹을 흡착할 수 있다. 추가의 측면으로, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 생물학적 샘플로부터 1,000 내지 5,000개의 단백질 그룹을 흡착할 수 있다. 추가의 측면으로, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 생물학적 샘플로부터 1,200 내지 2,200개의 단백질 그룹을 흡착할 수 있다. 또한 추가의 측면으로, 단백질 그룹은 7개 아미노산 잔기의 최소 길이를 가지는 펩타이드 서열을 포함한다. 일부 측면으로, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 단백질 생물학적 샘플로부터 1 내지 20,000개의 단백질을 흡착할 수 있다. 추가의 측면으로, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 생물학적 샘플로부터 1,000 내지 10,000개의 단백질을 흡착할 수 있다. 또한 추가의 측면으로, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 단백질 생물학적 샘플로부터 1,800 내지 5,000개의 단백질을 흡착할 수 있다
일부 구체예에서, 조성물은 적어도 4개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 5개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 6개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 7개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 8개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 9개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 10개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 11개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 12개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 13개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 14개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 15개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 20개의 독특한 자성 입자 유형, 또는 적어도 30개의 독특한 자성 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 적어도 10개의 독특한 자성 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형과 제2 독특한 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하고 적어도 2개의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 상이하다.
일부 구체예에서, 조성물은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하고 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 상이하다. 일부 구체예에서, 물리화학적 특성은 크기, 전하, 코어 물질, 쉘 물질, 다공도, 또는 표면 소수성을 포함한다. 추가의 구체예에서, 크기는 동적 광산란, SEM, TEM, 또는 이것들의 임의의 조합에 의해 측정되는 직경 또는 반경이다.
일부 구체예에서, 조성물은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 카르복실레이트 물질을 포함하고, 제1 독특한 입자는 마이크로입자이며, 제2 독특한 입자 유형은 나노입자이다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 0 mV 내지 -50 mV의 표면 전하를 포함하고, 제1 독특한 입자 유형은 200 nm 미만의 직경을 가지며, 제2 독특한 입자 유형은 200 nm보다 큰 직경을 가진다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 100 내지 400 nm의 직경을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 가지며, 제2 독특한 입자 유형은 중성 표면 전하를 가진다.
일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 나노입자이고, 제1 독특한 입자 유형은 -20 mV 미만의 표면 전하를 가지며 제2 독특한 입자 유형은 -20 mV보다 큰 표면 전하를 가진다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 마이크로입자이고, 제1 독특한 입자 유형은 음의 표면 전하를 가지며, 제2 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 가진다. 일부 구체예에서, 조성물은 음전하의 나노입자의 하위세트를 포함하며, 하위세트의 각각의 입자 유형은 적어도 하나의 표면 화학 그룹이 상이하다. 일부 구체예에서, 조성물은 제1 독특한 입자 유형, 제2 독특한 입자 유형, 및 제3 독특한 입자 유형을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형, 제2 독특한 입자 유형, 및 제3 독특한 입자 유형은 산화철 코어, 중합체 쉘을 포함하고, 직경이 약 500 nm 미만이며 제1 독특한 입자 유형은 음전하를 포함하고, 제2 독특한 입자 유형은 양전하를 포함하며, 제3 독특한 입자 유형은 중성 전하를 포함하고, 직경은 동적 광산란에 의해 측정되는 바 평균 직경이다. 추가의 구체예에서, 제1 독특한 입자 유형은 실리카 코팅을 포함하며, 제2 독특한 입자 유형은 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA) 코팅을 포함하고, 제3 독특한 입자 유형은 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA) 코팅을 포함한다..
일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 나노입자를 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 마이크로입자를 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형 중 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 초상자성 산화철 입자이다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형 중 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 산화철 물질을 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형 중 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 산화철 코어를 가진다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형 중 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 폴리스티렌 코어에 삽입된 산화철 결정을 가진다.
일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 각각의 독특한 입자 유형은 초상자성 산화철 입자이다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 각각의 독특한 입자 유형은 산화철 코어를 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 각각 하나의 독특한 입자 유형은 폴리스티렌 코어에 삽입된 산화철 결정을 가진다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 중합체 코팅을 포함한다.
일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 카르복실화된 중합체, 아민화된 중합체, 양쪽이온성 중합체, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 실리카 쉘 코팅이 있는 산화철 코어를 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA) 코팅이 있는 산화철 코어를 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA) 코팅이 있는 산화철 코어를 포함한다.
일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 음의 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 양의 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 중성 표면 전하를 포함한다.
일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 표 10의 하나 이상의 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 표 10으로부터 선택된 2개 이상의 독특한 입자 유형, 3개 이상의 독특한 입자 유형, 4개 이상의 독특한 입자 유형, 5개 이상의 독특한 입자 유형, 6개 이상의 독특한 입자 유형, 7개 이상의 독특한 입자 유형, 8개 이상의 독특한 입자 유형, 9개 이상의 독특한 입자 유형, 또는 전부 10개의 독특한 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 표 12의 하나 이상의 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 표 12로부터 선택된 2개 이상의 독특한 입자 유형, 3개 이상의개의 독특한 입자 유형, 4개 이상의 독특한 입자 유형, 5개 이상의 독특한 입자 유형, 6개 이상의 독특한 입자 유형, 7개 이상의 독특한 입자 유형, 8개 이상의 독특한 입자 유형, 9개 이상의 독특한 입자 유형, 또는 전부 10개의 독특한 입자 유형을 포함한다.
일부 측면으로, 본 개시는 생물학적 샘플을 복수의 나노입자를 포함하는 패널에 노출시키고, 그로써 복수의 단백질 코로나를 생성시키는 단계; 복수의 단백질 코로나로부터 단백질체 데이터를 생성하는 단계; 복수의 단백질 코로나의 단백질 프로파일을 측정하는 단계; 및 단백질 프로파일을 생물학적 상태에 연관시키는 단계를 포함하며, 여기서 패널은 적어도 2개의 상이한 나노입자를 포함하는 것인, 대상체로부터의 샘플의 생물학적 상태를 측정하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 패널은 적어도 3개의 상이한 나노입자를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 단백질 프로파일을 생물학적 상태에 적어도 90% 정확도로 연관시킨다. 일부 구체예에서, 복수의 나노입자는 적어도 하나의 산화철 나노입자를 포함한다.
일부 측면으로, 본 개시는 적어도 3개의 상이한 물리화학적 특성을 가지는 복수의 나노입자를 선택하는 단게를 포함하는, 단백질 코로나 분석을 위한 패널을 선택하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하, 표면 화학, 크기, 및 형태로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하를 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 개시는 복수의 입자 유형을 포함하는 패널을 샘플과 함께 인큐베이션하여 복수의 단백질 코로나를 형성하는 단계; 복수의 단백질 코로나를 소화시켜서 단백질체 데이터를 정량화함으로써 샘플 중의 단백질을 확인하는 단계를 포함하는, 샘플 중의 단백질을 확인하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 샘플은 대상체로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 방법은 확인 단계로부터 샘플의 단백질 프로파일을 측정하는 단계 및 대상체의 생물학적 상태에 단백질 프로파일을 연관시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 복수의 단백질 코로나를 소화시킴으로써 단백질체 데이터를 생성하는 단계; 복수의 단백질 코로나의 단백질 프로파일을 측정하는 단계; 및 단백질 프로파일을 생물학적 상태와 연관시키는 단계에 의해 대상체로부터의 샘플의 생물학적 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 패널은 적어도 2개의 상이한 나노입자를 포함한다. 일부 구체예에서, 연관 단계는 훈련된 분류기에 의해 수행된다.
일부 구체예에서, 패널은 적어도 3개의 상이한 입자 유형, 적어도 4개의 상이한 입자 유형, 적어도 5개의 상이한 입자 유형, 적어도 6개의 상이한 입자 유형, 적어도 7개의 상이한 입자 유형, 적어도 8개의 상이한 입자 유형, 적어도 9개의 상이한 입자 유형, 적어도 10개의 상이한 입자 유형, 적어도 11개의 상이한 입자 유형, 적어도 12개의 상이한 입자 유형, 적어도 13개의 상이한 입자 유형, 적어도 14개의 상이한 입자 유형, 적어도 15개의 상이한 입자, 또는 적어도 20개의 상이한 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 패널은 적어도 4개의 상이한 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 패널의 적어도 한 입자 유형은 패널의 제2 입자와 상이한 물리적 특징을 포함한다. 일부 구체예에서, 물리적 특징은 크기, 다분산 지수, 표면 전하, 또는 형태이다. 일부 구체예에서, 패널의 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 크기는 10 nm 내지 500 nm이다.
일부 구체예에서, 패널의 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 다분산 지수는 0.01 내지 0.25이다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 형태는 구형, 콜로이드형, 정사각형, 막대형, 와이어형, 원추형, 피라미드형, 또는 직사각형을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 표면 전하는 양의 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 표면 전하는 음의 표면 전하를 포함한다.
일부 구체예에서, 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 표면 전하는 중성 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 패널의 제2 입자 유형과 상이한 화학적 특징을 포함한다. 일부 구체예에서, 화학적 특징은 표면 기능성 화학 그룹이다. 일부 구체예에서, 기능성 화학 그룹은 아민 또는 카르복실레이트이다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 중합체, 지질, 또는 금속을 포함하는 물질로 만들어진다.
추가의 구체예에서, 중합체는 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 다가 무수물, 폴리하이드록시산, 폴리프로필푸머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 또는 폴리아민, 폴리알킬렌 글리콜 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)), 폴리에스테르 (예컨대, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA), 폴리락트산, 또는 폴리카프로락톤), 또는 둘 이상의 중합체의 공중합체를 포함한다.
추가의 구체예에서, 지질은 다이올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드 및 다이아실글리세롤, 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 및 다이올레오일포스파티딜세린 (DOPS), 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤 (POPG), 레시틴, 리소레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 난 포스파티딜콜린 (EPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤 (POPG), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민 (SOPE), 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 다이세틸포스페이트, 또는 콜레스테롤을 포함한다.
일부 구체예에서, 금속은 금, 은, 구리, 니켈, 코발트, 팔라듐, 백금, 이리듐, 오스뮴, 로듐, 루테늄, 레늄, 바나듐, 크로뮴, 망간, 니오븀, 몰리브데늄, 텅스텐, 탄탈룸, 철, 또는 카드뮴을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 폴리에틸렌 글리콜로 표면 기능화된다. 일부 구체예에서, 방법은 단백질 프로파일을 생물학적 상태에 적어도 70% 정확도, 적어도 75% 정확도, 적어도 80% 정확도, 적어도 85% 정확도, 적어도 90% 정확도, 적어도 92% 정확도, 적어도 95% 정확도, 적어도 96% 정확도, 적어도 97% 정확도, 적어도 98% 정확도, 적어도 99% 정확도, 또는 100% 정확도로 연관시킨다. 일부 구체예에서, 방법은 단백질 프로파일을 생물학적 상태에 적어도 70% 민감도, 적어도 75% 민감도, 적어도 80% 민감도, 적어도 85% 민감도, 적어도 90% 민감도, 적어도 92% 민감도, 적어도 95% 민감도, 적어도 96% 민감도, 적어도 97% 민감도, 적어도 98% 민감도, 적어도 99% 민감도, 또는 100% 민감도로 연관시킨다.
일부 구체예에서, 방법은 단백질 프로파일을 생물학적 상태에 적어도 70% 특이성, 적어도 75% 특이성, 적어도 80% 특이성, 적어도 85% 특이성, 적어도 90% 특이성, 적어도 92% 특이성, 적어도 95% 특이성, 적어도 96% 특이성, 적어도 97% 특이성, 적어도 98% 특이성, 적어도 99% 특이성, 또는 100% 특이성으로 연관시킨다. 일부 구체예에서, 방법은 적어도 100개의 특유한 단백질, 적어도 200개의 특유한 단백질, 적어도 300개의 특유한 단백질, 적어도 400개의 특유한 단백질, 적어도 500개의 특유한 단백질, 적어도 600개의 특유한 단백질, 적어도 700개의 특유한 단백질, 적어도 800개의 특유한 단백질, 적어도 900개의 특유한 단백질, 적어도 1000개의 특유한 단백질, 적어도 1100개의 특유한 단백질, 적어도 1200개의 특유한 단백질, 적어도 1300개의 특유한 단백질, 적어도 1400개의 특유한 단백질, 적어도 1500개의 특유한 단백질, 적어도 1600개의 특유한 단백질, 적어도 1700개의 특유한 단백질, 적어도 1800개의 특유한 단백질, 적어도 1900개의 특유한 단백질, 또는 적어도 2000개의 특유한 단백질을 확인한다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 산화철 나노입자를 포함한다. 추가의 구체예에서, 샘플은 생체유체이다. 또한 추가의 구체예에서, 생체유체는 혈장, 혈청, CSF, 소변, 눈물, 또는 타액을 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 개시는 적어도 3개의 상이한 물리화학적 특성을 가진 복수의 입자 유형을 선택하는 단계를 포함하는, 단백질 코로나 분석을 위한 패널을 선택하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하, 표면 화학, 크기, 및 형태로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가의 구체예에서, 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하를 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 개시는 입자 패널을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 패널은 복수의 입자 유형을 포함하고 복수의 입자 유형은 적어도 3개의 상이한 물리화학적 특성을 포함한다. 일부 구체예에서, 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하, 표면 화학, 크기, 및 형태로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가의 구체예에서, 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하를 포함한다.
다양한 구체예에서, 본 개시는 상기 기술된 패널 중 임의의 하나를 포함하는 시스템을 제공한다.
다양한 구체예에서, 본 개시는 패널을 포함하는 시스템을 제공하며, 여기서 패널은 복수의 입자 유형을 포함한다.. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형은 적어도 3개의 상이한 물리화학적 특성을 포함한다. 일부 구체예에서, 패널은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 적어도 12개의 상이한 입자 유형을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형은 샘플로부터 복수의 단백질을 흡착하여 복수의 단백질 코로나를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 단백질 코로나는 소화되어 단백질 프로파일이 측정된다. 일부 구체예에서, 단백질 프로파일은 훈련된 분류기를 사용하여 생물학적 상태와 연관된다.
일부 측면으로, 샘플은 생물학적 샘플이다. 추가의 측면으로, 생물학적 샘플은 혈장, 혈청, CSF, 소변, 눈물, 세포 용해물, 조직 용해물, 세포 균등화물, 조직 균등화물, 유두 흡인물, 대변 샘플, 활액 및 전혈, 또는 타액이다. 일부 측면으로, 샘플은 비-생물학적 샘플이다. 추가의 측면으로, 비-생물학적 샘플은 물, 우유, 용매, 또는 균등화된 샘플이다.
참조에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 별개의 출판물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 참조에 의해 본원에 포함된다.
발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 특허 또는 출원 파일은 적어도 하나의 칼라로 작성된 도면을 함유한다. 칼라 도면(들)이 있는 이 특허 또는 특허 출원 공보의 복사물은 요청 및 필요한 비용의 지불시에 관청에 의해 제공될 것이다. 본 발명의 특징 및 장점의 더 나은 이해는 그 안에서 발명의 원리가 활용되는 예시적인 구체예를 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부되는 도면을 참조로 얻어질 것이다:
도 1은 자성 입자 (MP)에 대한 표면 화학의 예를 도시한다. 일부 경우에, 자성 입자는 자성 코어 나노입자 (MNP)일 수 있다.
도 2A는 입자 상에서의 단백질 코로나의 형성을 도시한다. 단백질 코로나의 프로파일은 단백질-입자, 단백질-단백질, 및 단백질 농도 인자에 의존한다. 도 2B는 3개의 상이한 입자 상에서의 단백질 코로나의 형성을 도시한다. 일부 경우에, 입자는 나노입자일 수 있다. 입자의 특성은 상이한 단백질 코로나 프로파일을 초래한다.
도 3은 입자 유형의 여러 예 및 입자 표변이 기능화될 수 있는 여러 방법을 도시한다. 일부 경우에, 입자는 나노입자일 수 있다.
도 4는 남아 있는 용액으로부터의 초상자성 산화철 나노입자 (SPION)의 분리를 도시한다. 좌측 사진에서 예시된 것과 같이, SPION은 바이알의 측면에 자석을 적용하기 전 또는 적용하는 동시에, 유리 바이알의 검은색, 불투명한 용액으로서 보이는 용액에 분산된다. 바이알의 측면에 자석을 적용하고 30초 내에, 우측 사진에서 자석 옆의 어두운색 입자의 축적 및 용액의 투명도의 증가에 의해 예시된 것과 같이, SPION은 용액으로부터 분리된다. 우측 이미지에 나타낸 분리된 용액을 흔들었을 때, 입자는 5초 내에 좌측 이미지에 나타낸 분산된 상태로 복귀된다. SPION은 빠른 반응을 보인다.
도 5는 단백질체 데이터의 생성 과정 및 패널 선택을 위한 과정의 예를 제공한다.
도 6은 입자의 상이한 속성의 여러 예 및 입자의 특성화 방법을 도시한다.
도 7은 동적 광산란에 의해 특성화되는 바 나노입자의 크기 분포의 예이다. 도 7은 둘 다 산화철 코어를 가진 2개의 입자 유형: SP-002 (페놀-포름알데하이드 코팅된 입자) 및 SP-010 (카르복실레이트, PAA 코팅된 입자)의 동적 광산란 오버레이를 도시한다. 동적 광산란은 또한 마이크로입자를 포함한, 더 큰 크기의 입자의 크기 분포를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
도 8A 및 도 8B는 코로나 형성 전에 상이한 기능화가 있는 나노입자의 특성화를 도시한다. 도 8A는 SP-002 (페놀-포름알데하이드 코팅된 입자)의 투과 전자 현미경 (TEM)을 도시한다. 도 8B는 SP-339 (폴리스티렌 카르복실 입자)의 TEM을 도시한다. TEM은 또한 마이크로입자를 포함한, 더 큰 크기의 입자를 특성화하기 위해 사용될 수 있다.
도 9는 SP-333 (카르복실레이트), SP-339 (폴리스티렌 카르복실레이트), SP-356 (실리카 아미노), SP-374 (실리카 실란올), HX-20 (SP-003) (실리카 코팅된), HX-42 (SP-006) (실리카 코팅된, 아민), 및 HX-74 (SP-007) (PDMPAPMA 코팅된 (다이메틸아민)을 포함한 다양한 나노입자에 대한 Fe 2p/3 스펙트럼을 도시한다. 스펙트럼은 입자 표면의 화학적 핑거프린트 (표면 상의 다양한 요소의 %를 측정함)를 제공하는 XPS (X-선 광전자 분광법)로부터 얻어졌다. XPS는 또한 마이크로입자를 포함한, 더 큰 크기의 입자의 스펙트럼을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
도 10은 단백질체 분석을 위한 본 개시의 과정의 예를 도시한다. 예시된 과정은 몇 시간 내에 동시에 다중 샘플 전체에서 실행될 수 있는 고처리량 및 자동화를 위해 최적화된다. 과정은 입자-매트릭스 회합, 입자 세척 (3회), 단백질 코로나의 형성, 플레이트내 소화, 및 질량 분석을 포함한다. 과정을 사용하면, 96개 샘플 배치당 단지 4 내지 6시간이 걸릴 수 있다. 전형적으로, 한 번에 하나의 입자 유형이 샘플과 인큐베이션된다.
도 11은 1개 입자 유형으로부터 12개 입자 유형 범위의 패널 크기에 대한 단백질 카운트 (코로나 분석으로부터 확인된 단백질의 수)를 도시한다. 패널의 각각의 입자는 염기 물질, 표면 기능화, 및/도는 물리적 특성 (예컨대, 크기 또는 모양)에서 특유할 수 있다. 건강한 대상체의 풀(pool)을 나타내는 단일 풀링된(pooled) 혈장이 사용되었다. 카운트는 약 2시간 질량 분석 (MS) 실행에서 12개 입자 유형의 패널 전체에서 관찰된 특유한 단백질의 수이다. 1318개의 단백질이 12개 입자 유형의 패널로 확인되었다. 본원에서 사용되는 바, 질량 분석에 의해 확인된 "특징"은 보유 시간과 m/z (질량 대 전하 비율)의 특정 조합에서의 신호를 포함하며, 여기서 각 특징은 관련된 강도를 가진다. 일부 특징은 확인을 위한 제2 질량 분석법 분석 (MS2)에서 추가로 단편화된다.
도 12는 여러 날에 걸쳐 혈장에서 인큐베이션된 후 다중 입자 유형의 겔 전기영동 분석을 나타낸다. 각각의 개별 검정은 전형적으로 약 1시간 동안 실행되지만, 검정 정밀성(assay precision)을 입증하기 위하여 3개의 상이한 날에, 상이한 작동자에 의해 삼중 측정이 이루어졌다. 좌측에서 우측으로, 겔은 사다리, SP-339 (폴리스티렌 카르복실)의 3개의 연속 칼럼, SP-374 (실리카 실란올)의 3개의 연속 칼럼, DNA 사다리, 및 HX56 (SP-007) (실리카 아미노)의 3개의 연속 칼럼을 보여준다.
도 13은 한 입자 유형 (SP-339, 폴리스티렌 카르복실)에 대한 3개의 별도의 검정에 걸친 단백질 확인에 대한 질량 분석법 분석을 도시한다. 3개의 별도의 검정에 걸쳐 180개의 단백질이 일반적으로 확인되었다.
도 14A 및 도 14B는 대조군과 비교하여 스파이크된 단백질에 대한 농도 반응을 도시한다. 농도에 따른 스파이크 변화. 내인성 단백질 대조군은 농도에 따라 변화하지 않았다. 도 14A는 CRP의 스파이크 회복 실험으로부터의 데이터를 도시한다. 단백질은 4개의 수준: 2X, 5X, 10X, 및 100X에서 스파이크되었다. HX-42 (SP-006) (좌측) 및 HX-97 (우측, SP-007과 동일함)이 사용되었다. 도 14B는 스파이크 및 대조군에 대한 반응 기울기(response slope)를 도시한다. 회귀 모델로부터의 기울기는 MS ~ 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 데이터에 적합하다.
도 15는 패널 선택을 위해 입자 유형을 평가하기 위한 비교 연구를 도시한다. 56개의 혈청 샘플이 28명의 질환에 걸린 대상체 및 28명의 대조군 대상체로부터 얻어졌다. 대조군 대상체는 편향을 감소시키기 위하여 질환에 걸린 대상체에 대해 연령- 및 성별로 매칭되었다. 연구는 큰 차이를 가진 그룹간 입자 유형을 평가하기 위해 사용되었고, 그들이 연령 및 성별로 매칭된 것을 나타낸다. 도 16A에서 나타낸 것과 같이, 7개의 입자가 연구에 사용되었다.
도 16A는 SP-339, HX74 (SP-007), SP-356, SP-333, HX20 (SP-003), SP-364, 및 HX42 (SP-006)를 포함한, 7개의 입자 유형의 패널을 사용하는 샘플 (28개의 질환 대비 28개의 대조군)의 비교를 도시한다. 14,481개의 여과된 MS 특징이 비교되었고 120개 (0.8%)가 상이하였다. 도 16B는 도 16A의 SP-339로부터의 상단 히트를 도시한다. 검출된 차이는 샘플 유형 사이를 구별하고 궁극적으로 질환 대 건강을 정의하는 분류기를 구축하는 코로나의 능력을 확인시켜준다.
도 17A는 건강한 및 암 환자로부터의 샘플의 수집, 샘플로부터 혈장의 분리, 단백질 코로나를 형성하기 위한 미코팅 리포솜과의 인큐베이션, 및 선택된 혈장 단백질의 풍부화를 포함한, 본 출원의 과정의 개략도를 도시한다. 샘플 중의 단백질은 독특한 입자 유형 상에 형성된 독특한 생체분자 코로나의 단백질을 풍부화하기 위하여 독특한 입자 유형을 가진 입자-유형 패널을 사용하여 검정되었다. 단백질 코로나 형성은 입자의 물리화학적 특성에 특이적이다. 도 17B는 3-입자 유형 패널에 대한 본 개시의 구체예로의 코로나 분석, 프로테오그래프(Proteograph)를 도시한다. 혈장은 45명의 대상체 (교모세포종, 폐암, 수막종, 골수종, 및 췌장암을 포함한 5가지 암의 각각으로부터 8개, 및 5개의 건강한 대조군)로부터 수집되었다. 코로나 분석의 출력인 프로테오그래프는 3-입자 유형 패널의 각각의 입자에 대해 생성되었다. 랜덤 포리스트 모델(Random forest model)은 1000 회기의 교차 검증의 각각에서 구축되었다. 이것은 강력한 코로나 분석 신호에 대한 강력한 증거를 제공하였다. 초기 탐색 분석은 3개 입자의 조합으로부터 검출된 단백질 상에서의 주요 구성요소 분석 (PCA)을 통해서 실시되었다.
도 18A 및 도 18B는 초기 단계 암은 증상이 나타나기 전 최대 8년 전까지 분리될 수 있음을 도시한다. 골레스탄 코호트 (Golestan Cohort)는 2004년과 2008년 사이에 50,000명의 건강한 대상체를 등록하였다. 도 18A에서 나타낸 것과 같이, 등록된 저장 혈장(banked plasma)이 테스트되었다. 등록 후 8년 후에, 대략 1000명의 환자가 암이 발병되었다. 도 18B는 도 18A로부터의 저장 혈장의 분류를 도시한다. 등록일로부터의 저장 혈장의 코로나 분석은 조사된 15명의 대상체 중 15명에 대해 (3개 암에 대해 각각 5명의 환자) 암을 정확하게 분류하였다.
도 19는 95%의 전체 정확도로 프로테오그래프로의 3-입자 코로나 분석을 사용하는 5개 암의 강력한 분류를 도시한다. 데이터는 입자 유형 다양성을 추가하는 것이 성능을 증가시키는 것을 보여준다. (pH 7.4에서) 표면에 음성, 중성, 및 양성 순 전하를 가진 3가지 상이한 리포좀이 사용되었다.
도 20은 입자 바이오센서 생성의 스케일링의 예를 도시한다. 플랫폼은 다중 검정 및 샘플 전체에서 사용될 수 있다.
도 21은 본 개시의 입자 유형의 예를 도시한다. 입자 유형은 나노입자 (NP) 및 마이크로입자를 포함할 수 있다.
도 22A-B는 입자 단백질 코로나의 형성의 개략도 (도 22A), 및 다중 입자 유형 단백질 코로나 접근법 및 혈장 단백질 분석을 위한 질량 분석을 토대로 한, 본 개시의 구체예, 프로테오그래프 플랫폼 작업흐름 (도 22B)을 도시한다. 도 22A는 3개의 독특한 입자 유형 (도면의 중앙에 도시됨, 상단, 중간, 및 바닥의 구형은 3개의 독특한 입자 유형을 나타냄)을 도시하며, 각각은 서로 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하여, 입자 표면 상에 상이한 단백질 코로나 조성물의 형성으로 이어진다. 도 22B는 프로테오그래프로의 코로나 분석 작업흐름을 도시하며, (1) 입자-혈장 인큐베이션 및 단백질 코로나 형성; (2) 자석에 의한 입자 단백질 코로나 정제; (3) 코로나 단백질의 소화; 및 (4) 질량 분석법 분석을 포함한다.
도 23은 각각 다음의 방법: 주사 전자 현미경 (SEM, 이미지의 제2열), 동적 광산란 (DLS, 그래프의 제3열), 투과 전자 현미경 (TEM, 이미지의 제4열), 고해상도 투과 전자 현미경 (HRTEM, 제5열), 및 X-선 광전자 분광법 (XPS, 제6열)에 의한, 가장 좌측의 제1열에 도시한 3개의 초상자성 산화철 나노입자 (SPION): 상부로부터 바닥으로, 실리카-코팅된 SPION (SP-003), 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA)-코팅된 SPION (SP-007), 및 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA)-코팅된 SPION (SP-011)의 특성화를 도시한다. DLS는 각 입자 유형의 3개의 복제물을 보여준다. HRTEM 사진은 각각 개별 SP-003, SP-007, 및 SP-011 입자 유형의 표면에서 기록되었고, 화살표는 입자 표면 상의 비정질 SiO2 (상단 HRTEM 이미지) 코팅 및 비정질 SiO2/중합체 코팅 (중간 및 바닥 HRTEM 이미지)의 영역을 가리킨다.
도 24는 Keshishian 등으로부터 편집된 데이터베이스 (Mol Cell Proteomics. 2015 Sep;14(9):2375-93. doi: 10.1074/mcp.M114.046813. Epub 2015 Feb 27.)(상단 패널)에 대한 비교에 의한 순 혈장 대 SP-003, SP-007, 및 SP-011 입자 상에서 관찰된 단백질에 대한 동적 범위를 도시한다.
도 25는 동일한 단백질의 공개된 농도에 대한 입자 코로나 단백질 대 혈장 단백질의 최대 세기의 상관관계를 도시한다.
도 26은 동일한 혈장 샘플을 사용하는 3개의 복제물에 의해 입증되는 바 각각의 입자 유형 (SP-003, SP-007, 및 SP-011)에 대한 단백질 코로나 세기의 재현성을 도시한다.
도 27은 SP-007 입자를 사용하는 비-소세포 폐암 (NSCLC) 파일럿 연구에서의 변화된 특징을 도시한다. 7가지 MS 특징이 4기 NSCLC를 가진 28명의 대상체 (관련된 동반질환 및 치료 효과가 있음)와 28명의 연령- 및 성별-매칭된, 외관상 건강한 대상체 사이에서 통계학적으로, 유의하게 상이한 것으로서 확인되었다. 바닥의 표는 5개의 공지된 단백질 및 2개의 미지의 단백질을 포함한, 상당히 상이한 7개의 단백질의 목록이다. 만약 펩타이드-스펙트럼 매치가 특징과 관련된 MS2 데이터에 대해 만들어졌다면, 그 펩타이드 서열 (및 전하)뿐만 아니라 잠재적인 모 단백질이 표시된다; 만약 MS2 매치가 특징과 관련되지 않았다면, 펩타이드 및 단백질은 모두 "알 수 없음"으로서 표시된다.
도 28A는 SPION 코어의 합성에 대한 개략도를 도시한다.
도 28B는 실리카-코팅된 SPION (SP-003)의 합성에 대한 개략도를 도시한다.
도 28C는 비닐 기 기능화된 SPION의 합성에 대한 개략도를 도시한다.
도 28D는 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA)-코팅된 SPION (SP-007)의 합성에 대한 개략도를 도시한다.
도 28E는 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA)-코팅된 SPION (SP-011)의 합성에 대한 개략도를 도시한다.
도 29는 56-샘플 NSCLC 비교 연구에 대한 존재-여과된, 군집 품질-여과된, 중앙값-표준화된 MS 특징 강도의 분포를 도시한다. 각각의 선은 질환에 걸린 샘플 또는 대조군 샘플에 대한 log2 특징 강도의 밀도를 나타낸다. 밀도는 y-축 상에 0.00부터 0.15까지 표시되고, log2 특징 강도는 x-축 상에 15부터 35까지 표시된다. 약 0.13 내지 약 0.17의 범위의 밀도를 가지며, 약 28의 log2 특징 강도 가까이에 위치한 최고 피크에서, 2개의 최고 자취는 대조군 샘플에 상응하며, 최저 자취는 질환에 걸린 샘플에 상응한다. 나머지 대조군 및 질환에 걸린 자취는 최고 자취와 최저 자취 사이에 분포된다. 약 20 log2 특징 강도 및 약 23 log2 특징 강도에서 발생하는 2개의 어깨 피크(shoulder peak)에서, 2개의 최고 자취는 대조군 자취이며 2개의 최저 자취는 20 log2 특징 강도 피크에서의 대조군 자취이며, 최고 자취는 23 log2 특징 강도에서의 질환에 걸린 자취이다.
도 30은 4개의 상이한 펩타이드에 대한 스파이크-회복 실험에서 SP-007 나노입자 상의 C-반응성 단백질 (CRP)의 측정의 정확도를 도시한다.
도 31은 스파이크-회복 실험에서 안지오게닌의 펩타이드 특징에 대한 측정의 정확도를 도시한다.
도 32는 스파이크-회복 실험에서 S10A8의 펩타이드 특징에 대한 측정의 정확도를 도시한다.
도 33은 스파이크-회복 실험에서 S10A9의 펩타이드 특징에 대한 측정의 정확도를 도시한다.
도 34는 스파이크-회복 실험에서 C-반응성 단백질 (CRP)의 펩타이드 특징에 대한 측정의 정확도를 도시한다.
도 35는 스파이크-회복 실험에서 단백질 특징에 대한 측정의 정확도를 도시한다.
도 36은 MS 강도의 5,304-혈장 단백질 데이터베이스에 대한 10개의 독특한 입자 유형의 입자 패널의 매칭 및 적용범위(coverage)를 도시한다. 데이터베이스 단백질에 대한 순위 강도는 상부 패널("데이터베이스")에 제시되며, 단순 혈장 MS 평가로부터의 단백질에 대한 강도는 제2 패널 ("혈장")에 제시되고 최적의 10-입자 유형 패널에 대한 강도는 나머지 패널들에 제시된다. 혈장 단백질 강도 데이터베이스는 Keshishian et al. (2015). Multiplexed, Quantitative Workflow for Sensitive Biomarker Discovery in Plasma Yields Novel Candidates for Early Myocardial Injury. Molecular & Cellular Proteomics, 14(9), 2375-2393으로부터 유래된다.
도 37은 본원에서 개시된 패널에 포함될 수 있는 다양한 입자 유형을 도시한다.
도 37A는 중공 자성 입자의 개략도를 도시한다.
도 37B는 소수성 포켓(hydrophobic pocket)을 가진 입자의 개략도를 도시한다.
도 37C는 쉘-요크(yolk) SPION 마이크로겔 하이브리드 입자의 개략도를 도시한다.
도 38은 Mol. Cells 2019, 42(5), 386-396으로부터 적응된, 단백질 및/또는 펩타이드를 포획하기 위해 조작된 입자 표면의 개략도를 도시한다.
상세한 설명
본원에는 간단하고 높은 처리량 방식으로 샘플 중의 펩타이드 및 단백질을 검정하기 위한 조성물 및 그것의 사용 방법이 개시된다. 본 개시는 샘플로부터의 단백질을 독특한 입자 유형의 표면 상에 형성된 독특한 생체분자 코로나 쪽으로 풍부화하는, 다수의 독특한 입자 유형의 입자 패널을 제공한다. 본원에 개시된 입자 패널은 수 시간 안에 넓은 동적 범위에 걸쳐 수천 개의 단백질을 검출하기 위한 코로나 분석 방법에 사용될 수 있다.
현재, 임상 진단을 위해 오늘날 사용 중인 단백질-기반 바이오마커는 소수이고, 마커의 확장을 위해 혈장 단백질체를 분석하기 위한 광범위한 노력에도 불구하고, 상대적으로 소수의 새로운 후보가 임상적으로 유용한 테스트로서 허용되었다. 혈장 단백질체는 >10,000개의 단백질 및 잠재적으로 10배 이상의 농도 범위 (mg/mL부터 pg/mL까지)를 가진 10배 이상의 단백질 동형(isoform)을 함유한다. 이들 속성은 단백질 분석 작업 (예컨대 복사물- 또는 증폭-메커니즘)을 위한 편리한 분자 도구의 결핍과 조합되어, 혈장 단백질체의 포괄적인 연구를 예외적으로 어렵게 만든다. 생물학적 샘플 중의 단백질의 넓은 동적 범위를 극복하기 위한 접근법은 여전히 수천 개의 특유한 단백질 및 심지어 더 많은 단백질 변이체의 배경에 대한 왕성한 확인 및 정량화를 위한 것이다. 그러나, 확증 및 복제에 대한 강력한 전망을 가진 적절한 크기의 연구를 허용하기 위하여 충분한 처리량 및 실제 비용 프로파일을 가진 방식으로 전체 혈장 농도 범위에 걸쳐 단백질을 동시에 측정할 수 있는 기존의 기술은 없다. 이들 도전은 질환의 단백질-기반 바이오마커의 발견을 제한할뿐만 아니라 게놈 변이체의 단백질유전체학 및 단백질 주석달기의 더 빠른 채택에 대한 병목이 되었다. 질량 분석법 (MS) 접근법의 진보는 개선된 데이터 분석의 개발과 함께 깊고 넓은 단백질체 분석을 위한 도구를 제공하였다. 실질적으로 저풍부성 단백질의 검출을 개선하기 위한 여러 시도, 예컨대 고도로 풍부한 단백질의 고갈, 혈장 분획화, 펩타이드 분획화, 및 등압 표지화(isobaric labeling)가 만들어졌다. 그러나, 현재 접근법은 꽤 복잡하고 시간-소모적이며 (여러 날 내지 주), 그로써 단백질 적용범위의 깊이와 샘플 처리량 사이의 균형을 필요로 한다. 따라서, 단백질체에서 이용 가능한 정보의 실체의 포괄적이고 신속한 분석을 위한 간단하고 강력한 전략이 충족되지 않은 필요성으로 남아 있다.
추가적으로, 질환이 조기에 진단될 수록, 질환이 치료되거나 성공적으로 관리되어 환자에 대한 더 나은 진단으로 이어질 가능성이 더 많다. 질환이 조기에 치료될 때, 질환으로부터의 문제를 방지하거나 지연시키는 것이 가능할 수 있고 환자의 생명을 연장시키거나 및/또는 삶의 질을 포함한, 환자에 대한 결과를 개선시킬 수 있다. 암의 조기 진단은 많은 유형의 암이 그것의 초기 단계에서 성공적으로 치료될 수 있기 때문에 중요하다. 예를 들어, 유방, 난소, 및 폐 암의 조기 진단 및 치료 후 5년 생존율은 질환이 가장 진행된 단계에서 진단된 환자의 경우 각각 15%, 5%, 및 10%에 비교하여, 90%, 90%, 및 70%이다. 암 세포가 그것이 기원하는 조직을 이탈한 후에는, 이용 가능한 확립된 치료제를 사용하는 성공적인 치료는 거의 불가능해진다. 비록 암의 경고 사인을 인식하고 즉각적인 조치를 취하는 것이 조기 진단으로 이어질 수 있지만, 대부분의 암 (예컨대, 폐암)은 암세포가 이미 주변 조직을 침습하여 신체 전체로 전이된 후에야 비로소 증상을 나타낸다. 예를 들어, 유방, 폐, 결장, 및 난소 암을 가진 환자의 60% 이상이 그들의 암이 검출된 시점까지 감춰진 또는 심지어 전이성 콜로니를 가지고 있다. 그러므로, 암의 조기 검출을 위한 효과적인 접근법의 개발에 대한 필요가 긴급하다. 그러한 접근법은 다양한 단계에서 암을 확인하기 위한 민감도 및 테스트되는 사람이 암이 없을 때 음성 결과를 제공하는 특이성을 가져야 한다. 암의 조기 검출을 위한 방법을 개발하기 위한 광범위한 노력이 있었다; 대다수의 위험 요소 및 바이오마커가 도입되긴 하였지만, 광범위한 암의 조기 검출을 위한 광범위하게 관련된 플랫폼은 아직 찾기 힘들다. 다양한 유형의 암이 혈장의 조성을 변화시킬 수 있기 때문에 -심지어 초기 단계에서도- 조기 검출을 위한 한 가지 유망한 접근법은 바이오마커에 대한 분자 혈액 분석이다. 비록 이런 전략이 이미 몇몇 암에 대해 실시되긴 하였지만 (전립선 암에 대한 PSA처럼), 대다수의 암의 조기 검출을 위한 특정 바이오마커는 아직 없다. 그러한 암 (예컨대, 폐암)의 경우, 규정된 후보 순환 바이오마커 중 어느 것도 임상적으로 확인되지 않았으며, 매우 소수가 후기 단계 임상 개발에 도달하였다. 그러므로, 매우 초기 단계에 암뿐만 아니라 다른 질환을 검출하는 본 출원인의 능력을 개선하기 위한 신규한 접근법에 대한 필요성이 긴급하다.
매우 초기 단계에 특정 질환돠 관련된 단백질을 검출하기 위해 사용될 수 있는, 샘플 중의 단백질을 검출하기 위한 고처리량, 간단한 검정에 대한 필요를 충족하기 위하여, 본 개시는 간단하고, 신속하며, 고처리량 방식으로 샘플 (예컨대, 혈장과 같은 복잡한, 생물학적 샘플) 중의 펩타이드 및 단백질에 대해 검정하기 위한 입자 패널 및 상기 입자 패널의 사용 방법을 제공한다. 특히, 본 개시는 샘플로부터의 단백질을 독특한 입자 유형의 표면 상에 형성된 독특한 생체분자 코로나 쪽으로 풍부화하는, 다수의 독특한 입자 유형의 입자 패널을 제공한다. 본원에 개시된 입자 패널에 포함된 입자 유형은 편향되지 않은 양식으로 광범위한 동적 범위를 가로질러 대다수의 단백질에 대한 풍부화에 특히 잘 맞는다. 본 개시의 입자 패널에 포함되기 위해 선택된 입자 유형의 조합은 그것들의 물리화학적 특성 (예컨대, 크기, 표면 전하, 코어 물질, 쉘 물질, 표면 화학, 다공도, 형태, 및 다른 특성들)이 다르다. 그러나, 입자 유형은 또한 여러 상기 물리화학적 특성을 공유할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 입자 패널은 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형을 포함할 수 있고, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 2개의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이하다. 중요하게, 입자 패널의 제1 입자 유형과 제2 입자 유형 사이의 적어도 하나의 물리화학적 특성의 변동은, 상응하는 독특한 입자 유형 상에 형성되는 독특한 코로나의 형성으로 이어질 수 있다. 그로써, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 입자 패널에 포함되기 위한 입자 유형의 선택은 샘플 (예컨대, 혈장) 중의 광범위한 동적 범위를 가로질러 풍부화될 수 있는 대다수의 단백질을 가능하게 한다.
본 개시의 입자 패널은 복잡한 생물학적 샘플에서 인큐베이션 후 쉽게 분리될 수 있도록 허용하는, 자성 특성을 가진 입자 유형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시는 특유한 자성 특성을 가지며 자기 공명 영상 (MRI)에서 생물분자, 약물 전달 및 조영제를 쉽게 분리할 수 있는 초상자성 산화철 나노입자 (SPION)를 제공한다. 초상자성 입자는 산화철만의 코어 (예컨대, 산화철 코어)를 가질 수 있거나 또는 폴리스티렌 코어에 내재된 작은 산화철 결정을 가질 수 있다.
본 개시는 SPION의 합성을 위해 개발된 방법을 제공한다. 예에서, 비극성 용매 중의 올레산 철의 열적 분해는 작은 크기 (보통 < 30 nm)의 높은 결정도를 가진 단분산성 자성 나노결정을 합성하기 위해 사용될 수 있다. 그런 나노결정은 소수성이며 리간드 교환 또는 화학적 변형을 통해 수성 상으로 전달될 필요가 있다. 이런 방법을 사용하여 생성된 SPION은 생체의학적 용도에 대한 필요조건(들)을 충족시킬 수 있다. 용매 열법(solvothermal method)은 에틸렌 글리콜을 사용한 염화철 (III)의 환원에 의해 SPION을 합성하는 또 다른 방법이다. 고도로 수 분산성인 SPMNP는 시트레이트, 폴리아크릴산 (PAA) 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 친수성 리간드를 사용하는 변형된 용매 열적 접근법에 의해 합성될 수 있다. 입자 표면은 스토버 과정(Stober process)을 통해 작용기를 가지는 상이한 실란으로 추가로 변형될 수 있다. 표면 기능성은 또한 SPMNP@중합체 복합 입자를 형성하기 위한 계면활성제-없이 시딩된 에멀션 중합을 통한 손쉬운 방법에 의해 이루어질 수 있다.
본 개시는 대규모, 고처리량, 효율적인, 및 비용-효과적인 단백질체 프로파일링 및 기계 학습(machine learning)을 위한 조성물, 시스템, 및 그것들의 사용 방법을 제공한다. 본원에는 독특한 입자 유형 상에 형성된 독특한 생체분자 코로나에서 단백질을 풍부화하기 위하여 독특한 입자 유형을 가진 입자 패널을 사용하여 샘플 중의 단백질을 검정하기 위한 확장 가능한 병렬 단백질 확인 및 정량화 기술이 개시된다. 본원에서 사용되는 "생체분자 코로나(생체분자 corona)"는 용어 "단백질 코로나"와 상호교환적으로 언급하여 사용될 수 있고 입자가 샘플 (예컨대 혈장)과 접촉된 후에 입자의 표면 상에 단백질 층이 형성되는 것을 나타낸다. 이 방법은 코로나 분석으로서 또는, 일부 예에서, 다중 입자 유형 단백질 코로나 전략을 질량 분석 (MS)과 조합한 "프로테오그래프" 분석 (도 22에 도시됨)으로서 상호교환적으로 언급될 수 있다. 본원에 개시된 입자 패널에 포함된 입자 유형은 초상자성일 수 있고, 그로써 샘플 중의 입자의 인큐베이션 후에, 샘플 중의 미결합 단백질 (코로나를 형성하기 위해 입자 표면 위로 흡착되지 않은 단백질)로부터 신속하게 분리되거나 격리될 수 있다.
지금까지, 입자는 데이터를 혼란스럽게 하고 재현성 및 정확도가 부족한 단백질 코로나의 단백질을 가공하는 단계들 (예컨대, 코로나 단백질을 유리 혈장 단백질로부터 분리하기 위한 원심분리 또는 막 여과 및 입자로부터 느슨하게 부착된 입자를 제거하기 위한 세척)로 인해 고처리량 번역 단백질체 분석에 대해 특성화가 잘 이루어져 있지 않았다. 본원에 개시된 코로나 분석 (예컨대, "프로테오그래프") 방법은 중복되지만 독특한 입자 유형 단백질 코로나를, 대규모 효율적인 단백질체 프로파일링 및 기계 학습에의 잠재적 사용을 위해 예를 들어, 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS)과 통합시킬 수 있다. 입자 유형 플랫폼은 편향되지 않을 수 있고 (예컨대, 예정된 분석물에 제한되지 않음), MS 데이터 획득 플랫폼은 분석물 측정의 관점에서 편향되지 않을 수 있으며, 둘 다 자동화가 쉽게 될 수 있다. 단백질 코로나로서 언급되는, 혈장과의 접촉시 입자 표면 상에서 단백질 층의 형성 (도 22A)은 단백질을 확인하는 방법으로서 본원에 개시된다. 코로나 단백질의 조성 및 양은 입자 유형의 물리화학적 특성에 따라 좌우될 수 있고, 이들 조작된 특성의 변화는 정체성 및/또는 양의 관점에서 코로나의 재현 가능하게 상이한 단백질을 초래할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 입자는 초상자성 산화철 나노입자 (SPION)일 수 있다. SPION은 독특한 표면 화학을 가지도록 합성됨으로써 다른 것과 구별될 수 있다. 일부 구체예에서, 상이한 표면 화학의 SPION은 그것의 단백질 코로나 상에 형성된 단백질의 분석에서 조합될 수 있다. SPION, 다른 입자 유형, 또는 그것들의 조합은 샘플의 단백질체 분석에 사용될 수 있는 입자 유형의 패널로 조합될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에는 미결합 단백질로부터 자석에 의해 쉽게 분리될 수 있고, 단백질 코로나의 형성을 위해 합성되고 사용된, 독특한 표면 화학을 가진 3개의 입자 유형의 패널이 개시된다. 각각의 입자 유형은 높은 및 낮은 풍부성의 단백질을 모두 포획함으로써 특유한 단백질 코로나 패턴을 재현 가능하게 생성할 수 있다. 예를 들면, 적어도 3개의 입자 유형으로부터 생성된 독특한 단백질체 프로파일을 통합함으로써, 단일 풀링된 대장암 (CRC) 혈장 샘플의 1,500개 이상의 단백질이 확인될 수 있고, 그 중 많은 것이 FDA-허가된/승인된 바이오마커일 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서 3개의 입자 유형의 스크린이 1,500개 이상의 단백질을 검출할 수 있고, 그 중 65개가 FDA-허가된/승인된 바이오마커이다.
일부 구체예에서, 프로테오그래프 (도 22B)를 사용한 코로나 분석 작업흐름은 MS 분석을 위해 96개의 코로나 샘플의 배치를 제조하기 위해 약 4-6시간이 걸릴 수 있다. CRC 풀에서 단백질 확인은 각각 약 1시간 실행으로 분석된 단지 3개의 총 MS 분획을 사용하여 실시될 수 있고, 따라서 총 약 3시간의 MS 시간이 걸린다.
일부 구체예에서, 3개의 독특한 입자 유형은 입자 유형 코로나 전략을 사용하기 위하여 본원에 개시된 조성물, 시스템, 및 방법을 사용하지 않는 500개 미만의 단백질과 대조적으로, 샘플 준비 및 LC-MS를 포함하여 8시간 이내에 단일 풀링된 혈장으로부터 1,500개를 넘는 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
코로나 분석 기술은 질환을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 입자 및 그것의 사용 방법은 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자 및 연령- 및 성별-매치된 건강한 대상체로부터의 혈청 샘플을 분석하기 위해 사용될 수 있다. MS 특징은 NSCLC 샘플과 대조군 샘플 사이를 식별할 수 있는 알려진 및 신규한 특징을 포함한 이 플랫폼을 사용하여 발견될 수 있다. 그러므로, 코로나 분석 플랫폼 기술은 더 크고 보다 더 강력한 확인 및 복제 연구일 수 있다. 더욱이, 고처리량 및 비편향 단백질체 샘플링에 대한 코로나 분석의 특유한 특성은 게놈 데이터의 주석달기 및 기계 학습 분류 방법의 적용을 가능하게 할 수 있다. 본원에 기술된 다중 입자 유형 단백질 코로나-기반 플랫폼 기술은 바이오마커 발견 및 확인을 위해 더 큰 규모의 연구를 가능하게 하는, 효율적이고 포괄적인 단백질체 프로파일링을 용이하게 할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 조성물 및 그것의 사용 방법은 증가하는 농도의 참조용 C-반응성 단백질 (CRP)의 혈장 샘플에의 첨가, 및 입자 코로나 대 스파이크된 혈장에서 CRP 수준에 대한 0.9의 기울기 (95% CI 0.81-0.98)를 보이는, 후속되는 단백질 코로나에서 CRP 수준의 검출에 의해 입증되는 바, 높은 검정 정확도를 나타낸다. 일부 구체예에서, 검정 복제물에서 플랫폼의 중앙 정밀도는 3개의 독특한 입자 유형 단백질 코로나로부터 취한 8,738개의 측정된 MS 특징 전체에서 약 24 CV%일 수 있다.
독특한 표면 화학을 가진 SPION은 단일 풀링된 혈장 샘플의 단백질 코로나 분석에 대해 적용될 수 있다. 예를 들면, 본 개시에서처럼, 결과적으로 생성된 단백질체 데이터는 입자 패널의 증가하는 수의 입자 유형은 더 많은 단배길 (특히 저풍부성의 단백질)의 확인을 초래할 수 있다. 더 많은 독특한 입자 유형의 첨가는 심지어 더 넓고 더 깊은 단백질체 프로파일링으로 이어질 수 있다. 본원에 개시된 입자의 조성물 및 상기 상이한 입자 유형을 포함하는 입자 유형의 패널은 유전자 서열분석에서 상이한 수준의 적용범위에 유사하게 패널의 입자의 수 및 유형을 다르게 함으로써 상이한 수준의 깊이 및 폭에서 단백질체를 프로파일링하기 위해 조정될 수 있다.
본원에 개시된 다중-입자 유형 단백질 코로나-기반 검정은 혈장 단백질체 분석에 대해 여러 가지 동등하게 중요한 특징을 보였다. 보통 시간 소모적인 고갈 및 분획화 작업흐름을 포함하는 종래의 단백질체 기법과 비교하여, 본원에 개시된 조성물 및 사용 방법은 그런 복잡한 작업흐름을 피할 수 있고 훨씬 더 빨라질 수 있다. 특히, 코로나 분석 검정은 활발하게 자동화될 수 있고, 그로써 추가로 정밀성을 증가시키며, 예를 들어, 96-웰 플레이트 형식으로 샘플 분석에 필요한 시간의 양을 감소시킬 수 있다. 코로나 분석 플랫폼은 샘플 간 차이를 민감하게 측정할 수 있는 한편, 그런 비교의 동적 범위를 감소시킴으로써, 보다 많은 비교가 관찰되는 것을 가능하게 한다. 코로나 분석 기술은 예정된 세트의 단백질을 표적화하지 않으면서 새로운 바이오마커를 확인할 수 있다. 코로나 분석 플랫폼의 확장성 및 효율은 큰 단백질체 연구에 사용될 수 있어서, 질환 및 생물학적 메커니즘의 심층 이해로 이어질 수 있다. 예를 들어, 단백질체 데이터를 다중 데이터 세트에 부가하고, 기계 학습 분석을 수행함으로써, 신규한 분류, 예컨대 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 변이체, DNA 메틸화 패턴의 변화 및 스플라이스 변이체가 생성될 수 있고 현재 잘 이해되지 않는 콘텍스트 게놈 질환 정보에 포함시킬 수 있다. 추가적으로, 기술은 상이한 질환에 대한 새로운 바이오마커의 발견을 촉진할 수 있는, 단백질체의 신속하고, 정확하며 정밀한 프로파일링을 위해 뇌척수액, 세포 용해물, 및 심지어 조직 균등화물과 같은 다른 생물학적 유체에도 확장될 수 있다.
초상자성 나노입자 (SPMNP) 또는 초상자성 산화철 입자 (SPION)의 제조 방법은 본원에 개시된다. 이들 입자 및 그것의 구현예는 단백질 코로나 검정에 사용될 수 있다.
본 개시의 방법 및 시스템은 샘플 제조 및 MS 데이터 획득을 단순화함으로써 단백질체 분석을 개선시킬 수 있다. 방법 및 시스템은 약 0.25일 내에 약 5 단계로 샘플 제조를 수행하며 샘플 당 약 0.5일 내에 약 12개 분획에 대한 MS 데이터를 획득한다.
본 개시는 단백질에 대한 샘플을 검정하기 위한 조성물 및 그것의 사용 방법을 제공한다. 본원에 기술된 조성물은 하나 또는 하나 이상의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널을 포함한다. 본원에 기술된 입자 패널은 단일 패널의 입자 유형의 수 및 입자 유형의 다양성이 달라질 수 있다. 예를 들어, 패널의 입자는 크기, 다분산성, 형상 및 형태, 표면 전하, 표면 화학 및 기능화, 및 베이스 물질을 기반으로 달라질 수 있다. 패널은 단백질 및 단백질 농도에 대해 분석될 샘플과 함께 인큐베이션될 수 있다. 샘플 중의 단백질은 입자 패널의 상이한 입자 유형의 표면에 흡착되어 단백질 코로나를 형성한다. 입자 패널의 특정 입자 유형에 흡착되는 정확한 단백질 및 단백질 농도는 상기 입자 유형의 조성물, 크기, 및 표면 전하에 따라 좌우될 수 있다. 그러므로, 패널의 각각의 입자 유형은 상이한 세트의 단백질 흡착, 특정 단백질의 상이한 농도, 또는 이것들의 조합으로 인해 상이한 단백질 코로나를 가질 수 있다. 패널의 각각의 입자 유형은 상호 배타적인 단백질 코로나를 가질 수 있거나 또는 중복되는 단백질 코로나를 가질 수 있다. 중복되는 단백질 코로나는 단백질 정체성, 단백질 농도, 또는 둘 다에서 중복될 수 있다.
본 개시는 또한 샘플 유형에 따라 패널에 포함시키기 위해 입자 유형을 선택하기 위한 방법을 제공한다. 패널에 포함된 입자 유형은 매우 풍부한 단백질의 제거를 위해 최적화된 입자의 조합일 수 있다. 입자 유형은 또한 패널에 포함되기 위해 관심의 특정 단백질을 흡착하기 위해 선택되는 것과 일치한다. 입자는 나노입자일 수 있다. 입자는 마이크로입자일 수 있다. 입자는 나노입자 및 마이크로입자의 조합일 수 있다.
본 개시는 생물학적 샘플 (예컨대, 혈장 샘플) 중의 단백질의 넓은 적용범위를 나타내는 입자 패널의 선택 방법을 제공한다. 입자는 조합 접근법을 사용하여 입자 패널에 포함되기 위해 선택된다. 광범위한 물리화학적 특성을 가진 입자가 선택되는데, 예를 들어, 입자는 크기, 표면 전하, 코어 물질, 쉘 물질, 표면 화학, 다공도, 형태, 및 다른 특성이 다를 수 있다. 그러나, 입자는 또한 상기 물리화학적 특성 중 여러 개를 공유할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 입자 패널은 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형을 포함할 수 있고, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 2개의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이하다. 본원에 개시된 입자 패널은 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형을 포함할 수 있고, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 2개의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이하다. 본원에 개시된 입자 패널은 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형을 포함할 수 있고, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이하다. 물리화학적 특성의 비제한적인 예로는 크기, 전하, 코어 물질, 쉘 물질, 다공도, 또는 표면 소수성을 들 수 있다. 중요하게, 입자 패널의 제1 입자 유형과 제2 입자 유형 사이의 적어도 하나의 물리화학적 특성의 변동은 상응하는 독특한 입자 유형 상에 형성되는 독특한 코로나의 형성으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 전하가 다른 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 각각 상이한 단백질, 상이한 농도의 동일한 단백질, 또는 두 상이한 단백질 및 상이한 농도의 동일한 단백질 전부를 흡착할 수 있다. 그러므로, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 독특한 생체분자 코로나를 가질 것이다. 크기는 이런 결과를 산출하기 위해 달라질 수 있는 물리화학적 특성의 한 예이다. 하나 또는 하나 이상의 물리화학적 특성 (예컨대, 크기, 전하, 코어 물질, 쉘 물질, 다공도, 또는 표면 소수성, 또는 이것들의 임의의 조합)은 독특한 생체분자 코로나를 유발하기 위해 달라질 수 있다. 패널에 대한 입자 유형의 선택을 위한 다른 최적화 파라미터로는 임의의 특정 주석 세트, 예를 들어 상호작용체(interactome), 분비단백질체(secretome), FDA 마커, 임상적으로 관련된 유전자 다형성을 가진 단백질을 들 수 있다. 표 10 및 표 12에서 나타낸 것과 같이, 이들 입자 중 하나 이상이 나노입자지만, 상이한 중합체 코팅으로 만들어진다. 다른 예로서, 표 10 및 표 12의 하나 이상의 입자는 유사한 표면 전하 및 유사한 크기를 공유하지만 상이한 물질로 만들어진다. 또 다른 예로서, 표 10 및 표 12의 하나 이상의 입자는 다공성 표면을 나타낸다. 또 다른 예로서, 표 10 및 표 12의 하나 이상의 입자는 비다공성 표면을 나타낸다. 또 다른 예로서, 표 10 및 표 12의 하나 이상의 입자는 카르복실레이트 코팅된 표면을 나타낸다. 또 다른 예로서, 표 10 및 표 12의 하나 이상의 입자는 아민 코팅된 표면을 나타낸다. 입자 패널에 있을 수 있는 입자 및 입자 유형의 많은 조합의 전부로, 본원에 개시된 입자 패널이 비편향된 방식으로 광범위한 동적 범위에 걸쳐 샘플 (예컨대, 혈장 샘플) 중의 대다수의 단백질 (예컨대, 혈장 단백질)을 확인할 수 있고, 고수준의 재생성 (예컨대, <20%의 분위수 표준화된 변동 계수)으로 샘플 중의 단백질을 검정하는 방법에 사용될 수 있는 것은 놀랍고 예상 밖의 일이다.
본 개시는 100개 이상의 상이한 표면 화학 및 50개 이상의 다양한 물리적 특성을 가진 200개 이상의 독특한 입자 유형을 제공한다. 특히, 23개 이상의 입자 유형이 샘플 중의 단백질을 검정하는 방법에 사용하기 위해 특성화되었다. 이들 입자 유형의 각각은 관심의 특정 단백질을 최적으로 검정하기 위해 또는 관심의 질환에 대한 바이오마커를 확인하기 위해 설계된 패널의 다FMS 입자 유형과 조합될 수 있다. 패널은 임의의 수의 이들 입자 유형 또는 입자 유형의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 본원에 개시된 다양한 입자 유형은 물리화학적 특성을 변하시키면서 광범위한 단백질을 검정 및 검출할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시는 샘플 중의 단백질을 확인하는 방법을 제공하며, 방법은: 복수의 입자 유형을 포함하는 패널을 샘플과 인큐베이션하여 복수의 단백질 코로나를 형성하는 단계; 복수의 단백질 코로나를 소화시켜서 단백질체 데이터를 생성하는 단계; 및 단백질체 데이터를 정량화함으로써 샘플 중의 단백질을 확인하는 단계를 포함한다.
입자 물질
본원에 개시된 입자 패널은 다양한 상이한 물질로 만들어진 입자 유형을 포함할 수 있다. 패널은 샘플 중의 광범위한 단백질을 확인하기 위하여, 또는 관심의 특정 단백질 또는 단백질 세트를 선택적으로 검정하기 위하여특정 유형의 입자와 조립될 수 있다. 입자 유형으로는, 예를 들어, 나노입자 (NP), 마이크로입자, 자성 입자 (MP), 자성 나노입자 (MNP), 초상자성 산화철 나노입자 (SPION), 또는 초상자성 나노입자 (SPMNPs)를 들 수 있다. 본원에 기술된 입자는 자성 입자일 수 있다. 본원의 자성 입자는 초상자성 입자 (SPMP), 초상자성 나노입자 (SPMNP), 초상자성 산화철 입자 (SPIOP), 또는 초상자성 산화철 나노입자 (SPION)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, SPMNP는 SPION일 수 있다. 자기(Magnetism)가 입자에 그래프팅된 산화철 코어 또는 산화철 결정을 통해 부여될 수 있다. 일부 경우에, 본 발명자들은 본원에서 자성 입자인 SPMNP를 언급한다. SPMNP는 또한 SPMP로 합성될 수 있다.
입자는 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 예를 들어, 입자는 중합체, 지질, 금속, 실리카, 단백질, 핵산, 소분자, 또는 큰 분자로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 본 개시와 일치하는 입자 물질로는 금속, 금속 산화물, 자성 물질, 중합체, 및 지질을 들 수 있다. 금속 물질의 예로는 금, 은, 구리, 니켈, 코발트, 팔라듐, 백금, 이리듐, 오스뮴, 로듐, 루테늄, 레늄, 바나듐, 크로뮴, 망간, 니오븀, 몰리브데늄, 텅스텐, 탄탈룸, 철 및 카드뮴, 또는 US7749299에서 기술된 임의의 다른 물질 중 임의의 하나 또는 임의의 조합을 들 수 있다. 금속 산화물 입자는 산화철 입자 또는 산화 티타늄 입자일 수 있다. 자성 입자는 산화철 나노입자일 수 있다.
중합체의 예로는 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 다가 무수물, 폴리하이드록시산, 폴리프로필푸머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 또는 폴리아민, 폴리알킬렌 글리콜 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)), 폴리에스테르 (예컨대, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA), 폴리락트산, 또는 폴리카프로락톤), 폴리스티렌, 또는 둘 이상의 중합체의 공중합체, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 (예컨대, PEG)과 폴리에스테르 (예컨대, PLGA)의 공중합체 중 임의의 하나 또는 임의의 조합을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체는 지질-종결된 폴리알킬렌 글리콜 및 폴리에스테르, 또는 US9549901 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 임의의 다른 물질이다.
본 개시의 입자를 형성하기 위해 사용될 수 있는 지질의 예로는 양이온성, 음이온성, 및 중성 전하 지질을 들 수 있다. 예를 들어, 입자는 다이올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드 및 다이아실글리세롤, 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 및 다이올레오일포스파티딜세린 (DOPS), 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤 (POPG), 레시틴, 리소레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 난(egg) 포스파티딜콜린 (EPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤 (POPG), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민 (SOPE), 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 다이세틸포스페이트, 및 콜레스테롤, 또는 US9445994 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 열거된 임의의 다른 물질 중 임의의 하나 또는 임의의 조합으로 만들어질 수 있다.
본원에 개시된 입자 패널은 특히 샘플에 존재하는 특정 크기의 단백질을 샘플화하할 수 있는 특정 입자 유형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 입자 패널은 도 37A에서 나타낸 것과 같이, 중공 자성 입자를 포함할 수 있다. 중공 자성 입자는 중공 코어를 가진 나노입자를 포함하며, 여기서 나노입자 쉘은 더 작은 일차 산화철 결정으로 만들어진다. 중공 자성 입자는 Cheng, Wei, et al. ("One-step synthesis of of superparamagnetic monodisperse porous Fe3O4 hollow and core-shell spheres." Journal of Materials Chemistry 20.9 (2010): 1799-1805, 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 기술된 것과 같이, FeCl3, 시트레이트, 폴리아크릴아미드 또는 폴리아크릴산 나트륨, 및 우레아의 열수 처리를 기반으로 오토클레이브 반응에 의해 합성될 수 있다. 더 작은 일차 산화철 결정으로 만들어진 나노입자 쉘은 다공성이어서, 크기 배제 효과를 통해 나노입자의 표면 상에 단백질 코로나의 생성을 가능하게 한다. 결합 표면은 주로 기공 내부에 있을 수 있어서, 큰 단백질이 입자로 확산되어 결합하는 것을 방지한다. 일부 경우에, 큰 단백질은 또한 외부에 결합되어 전체 코로나에 포함될 수 있지만, 이들 중공 입자는 더 큰 것보다는 더 작은 단백질을 풍부화할 수 있다. 이들 중공 자성 입자는 본원에서 기술된 임의의 입자 패널에 포함될 수 있고 또한 미결합 단백질로부터 자석을 사용하여 쉽게 분리된다.
또 다른 예로서, 입자 패널은 도 37B에서 나타낸 것과 같은 소수성 포켓을 가진 나노입자를 포함할 수 있다. 소수성 포켓을 가진 나노입자는 샘플에 존재하는 특정 용해도의 분자 또는 단백질 (예컨대, 난용성 단백질)을 샘플화하는 데 특히 적합한다. 소수성 포켓을 가진 나노입자는 초상자성 산화철 코어의 구조를 가지며 추가적으로 중합체 코팅을 가진다. 소수성 포켓을 가진 나노입자는 본원의 다른 곳에서 기술되는 것과 같이, SPION 코어 합성을 위한 오토클레이브 반응과, 이어서 폴리(글리시딜 메타크릴레이트) 코팅을 합성하기 위한 유리 라디칼 중합을 사용하여 합성될 수 있다. 이것에 이어 소수성 아민, 예컨대 벤질 아민 모이어티로의 표면의 합성-후 변형이 추가로 이어질 수 있다. 이들 소수성 포켓을 가진 나노입자는 특히 대사체학을 위해 소분자를 포획하기에 아주 적합하다. 나노입자의 기공 크기는 단지 소분자만이 소수성 포켓과 상호작용하도록 단백질을 배제하기 위해 조절될 수 있다. 일부 구체예에서, 기공 크기는 합성 중에 조정될 수 있다. 예를 들어, 합성은 다공성을 생성하기 위해 입자를 팽윤시키는 것을 포함할 수 있고 팽윤 정도는 기공 크기에 영향을 줄 수 있다. 또 다른 예로서, 부식 기법이 보다 고형의 표면을 가진 입자 유형에서 상이한 기공을 파내기 위해 사용될 수 있다. 단백질 표적은 또한 소수성 포켓을 가진 나노입자를 사용하여 샘플화될 수 있다.
또 다른 예에서, 입자 패널은 도 37C에서 나타낸 것과 같이, 쉘-요크 SPION 마이크로겔 하이브리드 나노입자를 포함할 수 있다. 쉘-요크 SPION 마이크로겔 하이브리드 나노입자는 SPION 외부 및 마이크로겔 내부의 구조를 가진다. 쉘-요크 SPION 마이크로겔 하이브리드 나노입자는 Cheng, Wei, et al. ("One-step synthesis of of superparamagnetic monodisperse porous Fe3O4 hollow and core-shell spheres." Journal of Materials Chemistry 20.9 (2010): 1799-1805) 및 Zou et al. ("Facile synthesis of highly water-dispersible and monodispersed Fe3O4 hollow microspheres and their application in water treatment." RSC Advances 3.45 (2013): 23327-23334)에서 기술된 것과 같이, FeCl3, 시트레이트, 폴리아크릴아미드 또는 폴리아크릴산 나트륨, 및 우레아의 열수 처리를 기반으로 한 오토클레이브 반응을 사용하여 합성될 수 있다. 합성의 제2 단계에서, 하이드로겔은 중공 나노입자 내부에서 형성된다.
또 다른 예에서, 입자 패널은 단백질 및/또는 펩타이드를 포획하기 위하여 조작된 입자 표면을 포함할 수 있다. 단백질의 일차 층은 비공유적으로 또는 공유적으로 입자 표면 상에서 초기 코로나를 형성할 수 있다. 입자 표면과의 직접적인 비공유 상호작용은 이온 결합, 소수성 결합, 및 수소 결합을 포함할 수 있다. 추가적으로, 작은 화학적 실체로 초기에 변형될 수 있는 이들 입자는 일차 단백질 코로나의 형성 후에 혈장의 다른 단백질에 결합할 수 있다. 입자의 표면에 존재하는 화학적 변형의 조절은 입자 표면과 샘플 중의 펩타이드 및/또는 단백질 사이의 비공유 상호작용을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 용액 상 조성 (예컨대, pH)은 입자와 샘플 중의 펩타이드 및/또는 단백질 사이의 비공유 상호작용을 조정하기 위해 조절될 수 있다. 단백질 및/또는 펩타이드의 입자 표면에의 공유 커플링은 반응성 기 (예컨대, NHS 에스테르, 말레이미드, 카르복실레이트, 등)를 입자 표면에 도입함으로써 수행될 수 있다. 그러므로, NHS-에스테르 포함 입자는 용액 중의 하나 이상의 단백질을 샘플화하는 데 특히 적합할 수 있다. 대안으로, 복합 혼합물에서 단백질을 샘플화하여 그것과 결합할 수 있는 커플링 시약은 광개시 반응성 기(photoinitiated reactant group)일 수 있고, 그것은 주어진 파장 (예컨대 UV) 및 세기의 광자에 노출된 후에만 단백질과 반응할 수 있다. 상기 광개시 반응성 기로 기능화된 입자를 활용하는 장점으로는, 한정하는 것은 아니지만, (1) 입자의 세척 단계 중에 단백질의 손실 및/또는 고친화도 단백질에 의한 대체로 인한 단백질의 손실 없이 일차 단백질 코로나에 고정, (2) 공유 결합이 결합 과정 중 언제든지 확립될 수 있기 때문에 중간 결합 친화도를 가진 단백질 포획, (3) 평형 상태에서 초래되는 것보다 더 넓은 범위의 표면 생성, 및 (4) 결합을 위해 (혈장 대신) 규정된 단백질 혼합물을 사용함으로써 특정 단백질 화학양론을 가진 표면 생성을 들 수 있다. 규정된 단백질 혼합물은 재조합에 의해 얻어지거나 제조된 또는 분리된 후 규정된 화학양론과 혼합된, 단백질의 임의의 합성에 의해 유래된 또는 정제된 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용에 대한 관심의 특정 단백질 (예컨대, 유비퀴틴)의 경우, 규정된 단백질 혼합물은 그 단백질의 간단한 용액일 수 있다. 또 다른 예로서, 규정된 단백질 혼합물은 관심의 특정 부류로부터 정제된 또는 풍부화된 세트의 단백질 (예컨대, 글리코실화된 단백질)일 수 있다. 입자는 또한 클릭-화학 반응 쌍(click-chemistry reaction pair)의 절반으로 기능화되도록 변형될 수 있고 샘플 중의 비천연 점 돌연변이된 단백질은 클릭-화학 반응 쌍의 다른 절반과 아미노산을 함유한다. 샘플 중의 입자 및 다른 단백질은 클릭-화학 반응 쌍의 절반으로 기능화될 수 있고 샘플 중의 비천연 점 돌연변이된 단백질은 클릭-화학 반응 쌍의 다른 절반과 아미노산을 함유한다. 화학적 촉매 (예컨대, 구리) 또는 빛 (예컨대, 광개시된 클릭 화학 시약)의 존재 하에, 반응이 수행되어 샘플 중의 비천연 점 돌연변이된 단백질에 대한 입자의 결합 및/또는 샘플 중의 비천연 점 돌연변이된 단백질 및 샘플 중의 다른 단백질의 결합으로 이어진다. 예를 들어, 방법은 샘플에서 풍부화된 돌연변이된 단백질을 함유할 수 있는 단백질의 간단한 용액으로 시작할 수 있다. 이들 시스템의 주요 장점은 입자 표면이 화학양론, 단백질/표면 방향, 및 단백질/단백질 방향과 관련하여 조작될 수 있다는 것이다. 이것은 본원의 다른 곳에 기술된 검정 단계 (예컨대, 광범위한 세척)를 견딜 수 있는 내구성 표면의 조작을 가능하게 한다. 예를 들어, 단백질 서열에 관심의 위치에서 특정 비천연 아미노산을 가진 단백질이 Lee et al. (Mol Cells. 2019 May 31;42(5):386-396. doi: 10.14348/molcells.2019.0078.)에서 기술된 것과 같이 도입될 수 있다. 단백질에 도입된 비천연 아미노산은 입자 표면에서 클릭-화학 쌍의 절반과 반응할 수 있는 클릭-화학 쌍의 다른 절반을 가질 수 있다. 이런 방식으로, 이들 변형된 단백질은 코로나를 형성하기 위하여 입자 표면에 단백질이 무작위로 흡착되기보다는, 특정한 방향으로 입자 표면에 결합할 수 있다. 결과는 입자 유형의 표면에 형성되는 코로나가 제어되는 특정 3-D 방향으로 조작된 단백질로 조정될 수 있다는 것이다. 이런 동일한 일반적인 방법론이 입자 유형의 표면에 단백질 복합체를 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 여기서, 복합체의 하나 이상의 하위단위가 함께 공유 연결되도록 변형된 후 합성의 제2 단계에서 또는 상이한 화학을 사용하여, 입자 표면 변형 과정에서 나중에 수행될 수 있는 과정인 입자 유형의 표면에 연결될 수 있다. 개략도는 도 38에서 도시된다. 단백질 및/또는 펩타이드를 비공유적으로 또는 공유적으로 포획하기 위해 조작된 표면을 가지는 입자는 또한 SPION 또는 중합체-변형된 SPION 입자일 수 있고, 그것은 용매 열법을 통한 표준 SPION 합성, 리간드 교환 과정, 실리카 코팅 과정, 및/또는 특정 시약 커플링 전략의 활성화 또는 설치를 포함한 다양한 방법으로 합성될 수 있다. 이들 시스템의 장점은 바이오-표면 생성, 상호작용체의 탐색, 및 지정된 코로나 어셈블리를 포함한다.
또 다른 예로서, 입자 패널은 히스톤 포획을 위해 기능화된 입자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이들 입자는 음이온성일 수 있다. 추가적으로, 또는 대안으로, 검정 조건은 샘플 중의 히스톤을 풍부화하기 위해 최적화될 수 있고 표지화 기법은 히스톤 및 번역-후 변형에 대한 질량 분석 검출을 개선하기 위해 최적화될 수 있다. 히스톤 포획을 이한 이들 기능화된 입자는 중합체, 실리카, 표적 리간드, 및/또는 이것들의 임의의 조합으로 만들어질 수 있다. 기능화된 입자는 용매 열법을 통한 표준 SPION 합성, 리간드 교환 과정, 표면-개시된 중합을 포함한 다양한 접근법을 사용하여 합성될 수 있다. 음이온성 입자 표면은 폴리카르복실레이트와 같은 중합체, 덴드라이머, 분지된 리간드, 또는 카르복실레이트 유도체, 및/또는 설파닐아미드산과 같은 다양할 리간드로 표면을 기능화함으로써 합성될 수 있다. 검정 조건의 최적화는 약 9의 pH로 결합 용액을 완충하는 것을 포함할 수 있다. 많은 단백질이 이 pH에서 음이온성 표면에 대해 감소된 결합을 나타낼 수 있는 한편, 히스톤은 약 11의 pI (예컨대, H4_Human pI ~11.3, H3_Human pI ~11)를 가지는 일차 서열을 가진 염기성 단백질이고, 이것은 거의 완전하에 양전하로 남아 있을 것이다. 그 결과로서, 염기성 pH 조건 하에서, 히스톤은 이온 결합을 통해 입자 표면과 강력하게 상호작용할 수 있고, 그로써, 입자 표면 상에서 선택적으로 풍부화될 수 있다. 추가적으로, 히스톤은 입자 표면을 히스톤 결합 단백질로 변형시킴으로써 입자 표면 상에서 선택적으로 풍부화될 수 있다. 그러므로, 히스톤 단백질 코로나는 본원에 개시된 입자를 사용하여 얻어질 수 있다. 최적화 표지화 방법론은 질량 분석 데이터의 해석을 단순화하는 것을 도울 수 있고 번역-후 변형 (PTM) 확인 및 배정의 개선을 허용한다. 히스톤 상에서의 번역-후 변형의 유형, 위치, 및 점유가 상이하고 유전자 발현을 조절하는 것을 도울 수 있기 때문에, 이들 입자는 샘플 중의 히스톤을 선택적으로 풍부화하는 데 유용할 수 있고 PTM의 정보를 얻을 수 있으며, 그로써 샘플 중의 유전자가 어떻게 조절되는지에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이것은 결국 유전자 발현의 조절이 비정상적인 다양한 질환 상태를 알려주는 것을 도울 수 있다.
본 개시와 일치하는 입자 유형의 예가 도 21 및 하기 표 1에 제시된다.
입자 유형
P# 설명
HX-13 또는 SP-001 카르복실레이트 (시트레이트)
HX-19 또는 SP-002 페놀-포름알데하이드 수지 코팅됨
HX-31 또는 SP-004 폴리스티렌 코팅됨
HX-38 또는 SP-005 카르복실화된 폴리(스티렌-코-메타크릴산), P(St-co-MAA))
HX-42 또는 SP-006 N-(3-트라이메톡시실릴프로필)다이에틸렌트라이아민 코팅됨
HX-57 또는 SP-008 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실산 코팅됨
HX-58 또는 SP-009 비닐벤질트라이메틸암모늄 클로라이드 (PVBTMAC) 코팅됨
HX-59 또는 SP-010 카르복실화된, 폴리(아크릴산), PAA
SP-333 카르복실레이트 마이크로입자, 계면활성제 없음
SP-339 폴리스티렌 카르복실 기능화됨
SP-341 카르복실산, 150 nm
SP-347 실리카 코팅됨, 200 nm
SP-348 카르복실산
SP-353 아미노 표면 마이크로입자, 0.4-0.6 μm
SP-356 실리카 아미노 기능화된 마이크로입자, 0.1-0.39 μm
SP-363 제파민 표면, 0.1-0.39 μm
SP-364 폴리스티렌 마이크로입자, 2.0-2.9 μm
SP-365 실리카
SP-369 카르복실화된 원래의 코팅, 50 nm
SP-373 덱스트란 기반 코팅, 0.13 μm
SP-374 더 낮은 산성으로 실리카 실란올 코팅됨
HX-20 또는 SP-003 실리카-코팅된 초상자성 산화철 NP (SPION)
HX-56 또는 SP-007 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA)-코팅된 SPION
HX-86 또는 SP-011 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA)-코팅된 SPION
입자의 특성
본 개시와 일치하는 입자는 광범위한 크기에서 생체유체에서 인큐베이션된 후 단백질 코로나를 형성하는 방법에서 만들어지고 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 입자는 적어도 10 nm, 적어도 100 nm, 적어도 200 nm, 적어도 300 nm, 적어도 400 nm, 적어도 500 nm, 적어도 600 nm, 적어도 700 nm, 적어도 800 nm, 적어도 900 nm, 적어도 1000 nm, 적어도 1100 nm, 적어도 1200 nm, 적어도 1300 nm, 적어도 1400 nm, 적어도 1500 nm, 적어도 1600 nm, 적어도 1700 nm, 적어도 1800 nm, 적어도 1900 nm, 적어도 2000 nm, 적어도 2100 nm, 적어도 2200 nm, 적어도 2300 nm, 적어도 2400 nm, 적어도 2500 nm, 적어도 2600 nm, 적어도 2700 nm, 적어도 2800 nm, 적어도 2900 nm, 적어도 3000 nm, 적어도 3100 nm, 적어도 3200 nm, 적어도 3300 nm, 적어도 3400 nm, 적어도 3500 nm, 적어도 3600 nm, 적어도 3700 nm, 적어도 3800 nm, 적어도 3900 nm, 적어도 4000 nm, 적어도 4100 nm, 적어도 4200 nm, 적어도 4300 nm, 적어도 4400 nm, 적어도 4500 nm, 적어도 4600 nm, 적어도 4700 nm, 적어도 4800 nm, 적어도 4900 nm, 적어도 5000 nm, 적어도 5100 nm, 적어도 5200 nm, 적어도 5300 nm, 적어도 5400 nm, 적어도 5500 nm, 적어도 5600 nm, 적어도 5700 nm, 적어도 5800 nm, 적어도 5900 nm, 적어도 6000 nm, 적어도 6100 nm, 적어도 6200 nm, 적어도 6300 nm, 적어도 6400 nm, 적어도 6500 nm, 적어도 6600 nm, 적어도 6700 nm, 적어도 6800 nm, 적어도 6900 nm, 적어도 7000 nm, 적어도 7100 nm, 적어도 7200 nm, 적어도 7300 nm, 적어도 7400 nm, 적어도 7500 nm, 적어도 7600 nm, 적어도 7700 nm, 적어도 7800 nm, 적어도 7900 nm, 적어도 8000 nm, 적어도 8100 nm, 적어도 8200 nm, 적어도 8300 nm, 적어도 8400 nm, 적어도 8500 nm, 적어도 8600 nm, 적어도 8700 nm, 적어도 8800 nm, 적어도 8900 nm, 적어도 9000 nm, 적어도 9100 nm, 적어도 9200 nm, 적어도 9300 nm, 적어도 9400 nm, 적어도 9500 nm, 적어도 9600 nm, 적어도 9700 nm, 적어도 9800 nm, 적어도 9900 nm, 적어도 10000 nm 또는 10 nm 내지 50 nm, 50 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 150 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 350 nm, 350 nm 내지 400 nm, 400 nm 내지 450 nm, 450 nm 내지 500 nm, 500 nm 내지 550 nm, 550 nm 내지 600 nm, 600 nm 내지 650 nm, 650 nm 내지 700 nm, 700 nm 내지 750 nm, 750 nm 내지 800 nm, 800 nm 내지 850 nm, 850 nm 내지 900 nm, 100 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 400 nm, 250 nm 내지 450 nm, 300 nm 내지 500 nm, 350 nm 내지 550 nm, 400 nm 내지 600 nm, 450 nm 내지 650 nm, 500 nm 내지 700 nm, 550 nm 내지 750 nm, 600 nm 내지 800 nm, 650 nm 내지 850 nm, 700 nm 내지 900 nm, 또는 10 nm 내지 900 nm, 10 내지 100 nm, 100 내지 200 nm, 200 내지 300 nm, 300 내지 400 nm, 400 내지 500 nm, 500 내지 600 nm, 600 내지 700 nm, 700 내지 800 nm, 800 내지 900 nm, 900 내지 1000 nm, 1000 내지 1100 nm, 1100 내지 1200 nm, 1200 내지 1300 nm, 1300 내지 1400 nm, 1400 내지 1500 nm, 1500 내지 1600 nm, 1600 내지 1700 nm, 1700 내지 1800 nm, 1800 내지 1900 nm, 1900 내지 2000 nm, 2000 내지 2100 nm, 2100 내지 2200 nm, 2200 내지 2300 nm, 2300 내지 2400 nm, 2400 내지 2500 nm, 2500 내지 2600 nm, 2600 내지 2700 nm, 2700 내지 2800 nm, 2800 내지 2900 nm, 2900 내지 3000 nm, 3000 내지 3100 nm, 3100 내지 3200 nm, 3200 내지 3300 nm, 3300 내지 3400 nm, 3400 내지 3500 nm, 3500 내지 3600 nm, 3600 내지 3700 nm, 3700 내지 3800 nm, 3800 내지 3900 nm, 3900 내지 4000 nm, 4000 내지 4100 nm, 4100 내지 4200 nm, 4200 내지 4300 nm, 4300 내지 4400 nm, 4400 내지 4500 nm, 4500 내지 4600 nm, 4600 내지 4700 nm, 4700 내지 4800 nm, 4800 내지 4900 nm, 4900 내지 5000 nm, 5000 내지 5100 nm, 5100 내지 5200 nm, 5200 내지 5300 nm, 5300 내지 5400 nm, 5400 내지 5500 nm, 5500 내지 5600 nm, 5600 내지 5700 nm, 5700 내지 5800 nm, 5800 내지 5900 nm, 5900 내지 6000 nm, 6000 내지 6100 nm, 6100 내지 6200 nm, 6200 내지 6300 nm, 6300 내지 6400 nm, 6400 내지 6500 nm, 6500 내지 6600 nm, 6600 내지 6700 nm, 6700 내지 6800 nm, 6800 내지 6900 nm, 6900 내지 7000 nm, 7000 내지 7100 nm, 7100 내지 7200 nm, 7200 내지 7300 nm, 7300 내지 7400 nm, 7400 내지 7500 nm, 7500 내지 7600 nm, 7600 내지 7700 nm, 7700 내지 7800 nm, 7800 내지 7900 nm, 7900 내지 8000 nm, 8000 내지 8100 nm, 8100 내지 8200 nm, 8200 내지 8300 nm, 8300 내지 8400 nm, 8400 내지 8500 nm, 8500 내지 8600 nm, 8600 내지 8700 nm, 8700 내지 8800 nm, 8800 내지 8900 nm, 8900 내지 9000 nm, 9000 내지 9100 nm, 9100 내지 9200 nm, 9200 내지 9300 nm, 9300 내지 9400 nm, 9400 내지 9500 nm, 9500 내지 9600 nm, 9600 내지 9700 nm, 9700 내지 9800 nm, 9800 내지 9900 nm, 9900 내지 10000 nm의 직경을 가질 수 있다. 직경은 동적 광산란 (DLS)에 의해 크기의 간접 척도로서 측정될 수 있다. DLS 측정은 '강도-가중' 평균일 수 있고, 이것은 평균이 그것으로부터 반경의 6제곱으로 가중될 수 있게 계산되는 크기 분포를 의미한다. 이것은 본원에서 'z-평균' 또는 '강도-평균'으로서 언급될 수 있다.
대안으로, 본원에 개시된 입자는 적어도 10 nm, 적어도 100 nm, 적어도 200 nm, 적어도 300 nm, 적어도 400 nm, 적어도 500 nm, 적어도 600 nm, 적어도 700 nm, 적어도 800 nm, 적어도 900 nm, 적어도 1000 nm, 적어도 1100 nm, 적어도 1200 nm, 적어도 1300 nm, 적어도 1400 nm, 적어도 1500 nm, 적어도 1600 nm, 적어도 1700 nm, 적어도 1800 nm, 적어도 1900 nm, 적어도 2000 nm, 적어도 2100 nm, 적어도 2200 nm, 적어도 2300 nm, 적어도 2400 nm, 적어도 2500 nm, 적어도 2600 nm, 적어도 2700 nm, 적어도 2800 nm, 적어도 2900 nm, 적어도 3000 nm, 적어도 3100 nm, 적어도 3200 nm, 적어도 3300 nm, 적어도 3400 nm, 적어도 3500 nm, 적어도 3600 nm, 적어도 3700 nm, 적어도 3800 nm, 적어도 3900 nm, 적어도 4000 nm, 적어도 4100 nm, 적어도 4200 nm, 적어도 4300 nm, 적어도 4400 nm, 적어도 4500 nm, 적어도 4600 nm, 적어도 4700 nm, 적어도 4800 nm, 적어도 4900 nm, 적어도 5000 nm, 적어도 5100 nm, 적어도 5200 nm, 적어도 5300 nm, 적어도 5400 nm, 적어도 5500 nm, 적어도 5600 nm, 적어도 5700 nm, 적어도 5800 nm, 적어도 5900 nm, 적어도 6000 nm, 적어도 6100 nm, 적어도 6200 nm, 적어도 6300 nm, 적어도 6400 nm, 적어도 6500 nm, 적어도 6600 nm, 적어도 6700 nm, 적어도 6800 nm, 적어도 6900 nm, 적어도 7000 nm, 적어도 7100 nm, 적어도 7200 nm, 적어도 7300 nm, 적어도 7400 nm, 적어도 7500 nm, 적어도 7600 nm, 적어도 7700 nm, 적어도 7800 nm, 적어도 7900 nm, 적어도 8000 nm, 적어도 8100 nm, 적어도 8200 nm, 적어도 8300 nm, 적어도 8400 nm, 적어도 8500 nm, 적어도 8600 nm, 적어도 8700 nm, 적어도 8800 nm, 적어도 8900 nm, 적어도 9000 nm, 적어도 9100 nm, 적어도 9200 nm, 적어도 9300 nm, 적어도 9400 nm, 적어도 9500 nm, 적어도 9600 nm, 적어도 9700 nm, 적어도 9800 nm, 적어도 9900 nm, 적어도 10000 nm 또는 10 nm 내지 50 nm, 50 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 150 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 350 nm, 350 nm 내지 400 nm, 400 nm 내지 450 nm, 450 nm 내지 500 nm, 500 nm 내지 550 nm, 550 nm 내지 600 nm, 600 nm 내지 650 nm, 650 nm 내지 700 nm, 700 nm 내지 750 nm, 750 nm 내지 800 nm, 800 nm 내지 850 nm, 850 nm 내지 900 nm, 100 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 400 nm, 250 nm 내지 450 nm, 300 nm 내지 500 nm, 350 nm 내지 550 nm, 400 nm 내지 600 nm, 450 nm 내지 650 nm, 500 nm 내지 700 nm, 550 nm 내지 750 nm, 600 nm 내지 800 nm, 650 nm 내지 850 nm, 700 nm 내지 900 nm, 또는 10 nm 내지 900 nm, 10 내지 100 nm, 100 내지 200 nm, 200 내지 300 nm, 300 내지 400 nm, 400 내지 500 nm, 500 내지 600 nm, 600 내지 700 nm, 700 내지 800 nm, 800 내지 900 nm, 900 내지 1000 nm, 1000 내지 1100 nm, 1100 내지 1200 nm, 1200 내지 1300 nm, 1300 내지 1400 nm, 1400 내지 1500 nm, 1500 내지 1600 nm, 1600 내지 1700 nm, 1700 내지 1800 nm, 1800 내지 1900 nm, 1900 내지 2000 nm, 2000 내지 2100 nm, 2100 내지 2200 nm, 2200 내지 2300 nm, 2300 내지 2400 nm, 2400 내지 2500 nm, 2500 내지 2600 nm, 2600 내지 2700 nm, 2700 내지 2800 nm, 2800 내지 2900 nm, 2900 내지 3000 nm, 3000 내지 3100 nm, 3100 내지 3200 nm, 3200 내지 3300 nm, 3300 내지 3400 nm, 3400 내지 3500 nm, 3500 내지 3600 nm, 3600 내지 3700 nm, 3700 내지 3800 nm, 3800 내지 3900 nm, 3900 내지 4000 nm, 4000 내지 4100 nm, 4100 내지 4200 nm, 4200 내지 4300 nm, 4300 내지 4400 nm, 4400 내지 4500 nm, 4500 내지 4600 nm, 4600 내지 4700 nm, 4700 내지 4800 nm, 4800 내지 4900 nm, 4900 내지 5000 nm, 5000 내지 5100 nm, 5100 내지 5200 nm, 5200 내지 5300 nm, 5300 내지 5400 nm, 5400 내지 5500 nm, 5500 내지 5600 nm, 5600 내지 5700 nm, 5700 내지 5800 nm, 5800 내지 5900 nm, 5900 내지 6000 nm, 6000 내지 6100 nm, 6100 내지 6200 nm, 6200 내지 6300 nm, 6300 내지 6400 nm, 6400 내지 6500 nm, 6500 내지 6600 nm, 6600 내지 6700 nm, 6700 내지 6800 nm, 6800 내지 6900 nm, 6900 내지 7000 nm, 7000 내지 7100 nm, 7100 내지 7200 nm, 7200 내지 7300 nm, 7300 내지 7400 nm, 7400 내지 7500 nm, 7500 내지 7600 nm, 7600 내지 7700 nm, 7700 내지 7800 nm, 7800 내지 7900 nm, 7900 내지 8000 nm, 8000 내지 8100 nm, 8100 내지 8200 nm, 8200 내지 8300 nm, 8300 내지 8400 nm, 8400 내지 8500 nm, 8500 내지 8600 nm, 8600 내지 8700 nm, 8700 내지 8800 nm, 8800 내지 8900 nm, 8900 내지 9000 nm, 9000 내지 9100 nm, 9100 내지 9200 nm, 9200 내지 9300 nm, 9300 내지 9400 nm, 9400 내지 9500 nm, 9500 내지 9600 nm, 9600 내지 9700 nm, 9700 내지 9800 nm, 9800 내지 9900 nm, 9900 내지 10000 nm의 반경을 가질 수 있다.
특정 예에서, 본원에 개시된 입자는 100 nm 내지 400 nm의 직경을 가진다. 다른 예에서, 본원에 개시된 입자는 100 nm 내지 400 nm의 반경을 가진다. 입자 크기는 많은 기법, 예컨대 동적 광산란 또는 전자 현미경 (예컨대, SEM, TEM)에 의해 측정될 수 있다. 본원에 개시된 입자는 나노입자 또는 마이크로입자일 수 있다.
추가적으로, 입자는 균일한 크기 분포 또는 이질적인 크기 분포를 가질 수 있다. 동적 광산란과 같은 기법에 의해 측정될 수 있는 다분산 지수 (PDI)는 크기 분포의 척도이다. 낮은 PDI는 보다 균일한 크기 분포를 나타내고 높은 PDI는 보다 이질적인 크기 분포를 나타낸다. 예를 들어, 본원에 개시된 입자는 0.5 미만, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 0.15 미만, 또는 0.1 미만의 PDI를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 입자는 0.1 미만의 PDI를 가진다.
본원에 개시된 입자는 다양한 상이한 표면 전하를 가질 수 있다. 입자는 음전하, 양전하, 또는 중성 전하일 수 있다. 일부 구체예에서, 입자는 -500 mV 내지 -450 mV, -450 mV 내지 -400 mV, -400 mV 내지 -350 mV, -350 mV 내지 -300 mV, -300 mV 내지 -250 mV, -250 mV 내지 -200 mV, -200 mV 내지 -150 mV, -150 mV 내지 -100 mV, -100 mV 내지 -90 mV, -90 mV 내지 -80 mV, -80 mV 내지 -70 mV, -70 mV 내지 -60 mV, -60 mV 내지 -50 mV, -50 mV 내지 -40 mV, -40 mV 내지 -30 mV, -30 mV 내지 -20 mV, -20 mV 내지 -10 mV, -10 mV 내지 0 mV, 0 mV 내지 10 mV, 10 mV 내지 20 mV, 20 mV 내지 30 mV, 30 mV 내지 40 mV, 40 mV 내지 50 mV, 50 mV 내지 60 mV, 60 mV 내지 70 mV, 70 mV 내지 80 mV, 80 mV 내지 90 mV, 90 mV 내지 100 mV, 100 mV 내지 110 mV, 110 mV 내지 120 mV, 120 mV 내지 130 mV, 130 mV 내지 140 mV, 140 mV 내지 150 mV, 150 mV 내지 200 mV, 200 mV 내지 250 mV, 250 mV 내지 300 mV, 300 mV 내지 350 mV, 350 mV 내지 400 mV, 400 mV 내지 450 mV, 450 mV 내지 500 mV, -500 mv 내지 -400 mV, -400 mv 내지 -300 mV, -300 mv 내지 -200 mV, -200 mv 내지 -100 mV, -100 mv 내지 0 mV, 0 mv 내지 100 mV, 100 mv 내지 200 mV, 200 mv 내지 300 mV, 300 mv 내지 400 mV, 또는 400 mv 내지 500 mV의 표면 전하를 가진다. 특정 예에서, 본원에 개시된 입자는 -60 mV 내지 60 mV의 표면 전하를 가진다.
다양한 입자 형태가 본 개시의 패널의 입자 유형과 일치한다. 예를 들어, 입자는 구셩, 콜로이드상, 큐브 형상, 사각형, 막대형, 와이어형, 원추형, 피라미드형, 및 직사각형일 수 있다. 본 개시의 입자는 고체 입자, 다공성 입자, 또는 메조 다공성 입자일 수 있다. 입자는 작은 표면적 또는 큰 표면적을 가질 수 있다. 입자는 외부 장에 대한 반응으로 자기를 측정하는 SQUID에 의해 측정될 수 있는 다양한 자성 특성을 가질 수 있다. 일부 경우에, 입자는 코어-쉘 또는 요크-쉘 구조를 가진다.
입자 패널
본원에 개시된 입자 패널은 본원에 기술된 프로테오그래프 작업흐름을 사용하여 많은 단백질, 펩타이드, 또는 단백질 기를 확인하기 위해 사용될 수 있다 (입자 패널 중의 독특한 입자 유형에 상응하는 독특한 생체분자 코로나의 MS 분석). 본원에 개시되는 바, 특징 강도는 샘플의 질량 분석 실행으로부터 질량 대 전하 비율 대비 강도의 도표에서 볼 수 있는 별개의 스파이크 ("특징")의 강도를 나타낸다. 이들 특징은 펩타이드 및/또는 단백질의 가변적으로 이온화된 단편에 상응할 수 있다. 본원에 기술된 데이터 분석 방법을 사용하여, 특징 강도는 단백질 그룹으로 분류될 수 있다. 단백질 그룹은 공유된 펩타이드 서열에 의해 확인되는 둘 이상의 단백질을 나타낸다. 대안으로, 단백질 그룹은 특유한 확인 서열을 사용하여 확인되는 한 단백질을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 만약 샘플에, 2개의 단백질 (단백질 1: XYZZX 및 단백질 2: XYZYZ) 사이에 공유되는 펩타이드 서열이 검정된다면, 단백질 그룹은 2개의 구성원 (단백질 1 및 단백질 2)을 가지는 "XYZ 단백질 그룹"일 수 있을 것이다. 대안으로, 만약 펩타이드 서열이 단일 단백질 (단백질 1)에 대해 특유하다면, 단백질 그룹은 한 구성원 (단백질 1)을 가지는 "ZZX" 단백질 그룹일 수 있을 것이다. 각각의 단백질 그룹은 하나 이상의 펩타이드 서열에 의해 지지될 수 있다. 본 개시에 따라 검출되거나 확인된 단백질은 샘플에서 검출된 (예컨대, 질량 분석을 사용하여 검출된 다른 단백질에 비해 독특한) 독특한 단백질을 나타내는 것일 수 있다. 그러므로, 입자 패널의 독특한 입자 유형에 상응하는 독특한 코로나에 존재하는 단백질의 분석은 높은 수의 특징 강도를 유발한다. 이 수는 특징 강도가 독특한 펩타이드로 프로세싱됨에 따라 감소하며, 독특한 펩타이드가 독특한 단백질로 프로세싱됨에 따라 추가로 감소하며, 펩타이드가 단백질 그룹 (독특한 펩타이드 서열을 공유하는 둘 이상의 단백질)으로 그룹화됨에 따라 추가로 감소한다.
본원에 개시된 입자 패널은 적어도 적어도 100개의 단백질, 적어도 200개의 단백질, 적어도 300개의 단백질, 적어도 400개의 단백질, 적어도 500개의 단백질, 적어도 600개의 단백질, 적어도 700개의 단백질, 적어도 800개의 단백질, 적어도 900개의 단백질, 적어도 1000개의 단백질, 적어도 1100개의 단백질, 적어도 1200개의 단백질, 적어도 1300개의 단백질, 적어도 1400개의 단백질, 적어도 1500개의 단백질, 적어도 1600개의 단백질, 적어도 1700개의 단백질, 적어도 1800개의 단백질, 적어도 1900개의 단백질, 적어도 2000개의 단백질, 적어도 2100개의 단백질, 적어도 2200개의 단백질, 적어도 2300개의 단백질, 적어도 2400개의 단백질, 적어도 2500개의 단백질, 적어도 2600개의 단백질, 적어도 2700개의 단백질, 적어도 2800개의 단백질, 적어도 2900개의 단백질, 적어도 3000개의 단백질, 적어도 3100개의 단백질, 적어도 3200개의 단백질, 적어도 3300개의 단백질, 적어도 3400개의 단백질, 적어도 3500개의 단백질, 적어도 3600개의 단백질, 적어도 3700개의 단백질, 적어도 3800개의 단백질, 적어도 3900개의 단백질, 적어도 4000개의 단백질, 적어도 4100개의 단백질, 적어도 4200개의 단백질, 적어도 4300개의 단백질, 적어도 4400개의 단백질, 적어도 4500개의 단백질, 적어도 4600개의 단백질, 적어도 4700개의 단백질, 적어도 4800개의 단백질, 적어도 4900개의 단백질, 적어도 5000개의 단백질, 적어도 10000개의 단백질, 적어도 20000개의 단백질, 적어도 50000개의 단백질, 적어도 100000개의 단백질, 100 내지 5000개의 단백질, 200 내지 4700개의 단백질, 300 내지 4400개의 단백질, 400 내지 4100개의 단백질, 500 내지 3800개의 단백질, 600 내지 3500개의 단백질, 700 내지 3200개의 단백질, 800 내지 2900개의 단백질, 900 내지 2600개의 단백질, 1000 내지 2300개의 단백질, 1000 내지 3000개의 단백질, 3000 내지 4000개의 단백질, 4000 내지 5000개의 단백질, 5000 내지 6000개의 단백질, 6000 내지 7000개의 단백질, 7000 내지 8000개의 단백질, 8000 내지 9000개의 단백질, 9000 내지 10000개의 단백질, 10000 내지 11000개의 단백질, 11000 내지 12000개의 단백질, 12000 내지 13000개의 단백질, 13000 내지 14000개의 단백질, 14000 내지 15000개의 단백질, 15000 내지 16000개의 단백질, 16000 내지 17000개의 단백질, 17000 내지 18000개의 단백질, 18000 내지 19000개의 단백질, 19000 내지 20000개의 단백질, 20000 내지 25000개의 단백질, 25000 내지 30000개의 단백질, 10000 내지 20000개의 단백질, 10000 내지 50000개의 단백질, 20000 내지 100000개의 단백질, 2000 내지 20000개의 단백질, 1800 내지 20000개의 단백질, 또는 10000 내지 100000개의 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 입자 패널은 적어도 적어도 100개의 단백질 그룹, 적어도 200개의 단백질 그룹, 적어도 300개의 단백질 그룹, 적어도 400개의 단백질 그룹, 적어도 500개의 단백질 그룹, 적어도 600개의 단백질 그룹, 적어도 700개의 단백질 그룹, 적어도 800개의 단백질 그룹, 적어도 900개의 단백질 그룹, 적어도 1000개의 단백질 그룹, 적어도 1100개의 단백질 그룹, 적어도 1200개의 단백질 그룹, 적어도 1300개의 단백질 그룹, 적어도 1400개의 단백질 그룹, 적어도 1500개의 단백질 그룹, 적어도 1600개의 단백질 그룹, 적어도 1700개의 단백질 그룹, 적어도 1800개의 단백질 그룹, 적어도 1900 개의단백질 그룹, 적어도 2000개의 단백질 그룹, 적어도 2100개의 단백질 그룹, 적어도 2200개의 단백질 그룹, 적어도 2300개의 단백질 그룹, 적어도 2400개의 단백질 그룹, 적어도 2500개의 단백질 그룹, 적어도 2600개의 단백질 그룹, 적어도 2700개의 단백질 그룹, 적어도 2800개의 단백질 그룹, 적어도 2900개의 단백질 그룹, 적어도 3000개의 단백질 그룹, 적어도 3100개의 단백질 그룹, 적어도 3200개의 단백질 그룹, 적어도 3300개의 단백질 그룹, 적어도 3400개의 단백질 그룹, 적어도 3500개의 단백질 그룹, 적어도 3600개의 단백질 그룹, 적어도 3700개의 단백질 그룹, 적어도 3800개의 단백질 그룹, 적어도 3900개의 단백질 그룹, 적어도 4000개의 단백질 그룹, 적어도 4100개의 단백질 그룹, 적어도 4200개의 단백질 그룹, 적어도 4300개의 단백질 그룹, 적어도 4400개의 단백질 그룹, 적어도 4500개의 단백질 그룹, 적어도 4600개의 단백질 그룹, 적어도 4700개의 단백질 그룹, 적어도 4800개의 단백질 그룹, 적어도 4900개의 단백질 그룹, 적어도 5000개의 단백질 그룹, 적어도 10000개의 단백질 그룹, 적어도 20000개의 단백질 그룹, 적어도 100000개의 단백질 그룹, 100 내지 5000개의 단백질 그룹, 200 내지 4700개의 단백질 그룹, 300 내지 4400개의 단백질 그룹, 400 내지 4100개의 단백질 그룹, 500 내지 3800개의 단백질 그룹, 600 내지 3500개의 단백질 그룹, 700 내지 3200개의 단백질 그룹, 800 내지 2900개의 단백질 그룹, 900 내지 2600개의 단백질 그룹, 1000 내지 2300개의 단백질 그룹, 1000 내지 3000개의 단백질 그룹, 3000 내지 4000개의 단백질 그룹, 4000 내지 5000개의 단백질 그룹, 5000 내지 6000개의 단백질 그룹, 6000 내지 7000개의 단백질 그룹, 7000 내지 8000개의 단백질 그룹, 8000 내지 9000개의 단백질 그룹, 9000 내지 10000개의 단백질 그룹, 10000 내지 11000개의 단백질 그룹, 11000 내지 12000개의 단백질 그룹, 12000 내지 13000개의 단백질 그룹, 13000 내지 14000개의 단백질 그룹, 14000 내지 15000개의 단백질 그룹, 15000 내지 16000개의 단백질 그룹, 16000 내지 17000개의 단백질 그룹, 17000 내지 18000개의 단백질 그룹, 18000 내지 19000개의 단백질 그룹, 19000 내지 20000개의 단백질 그룹, 20000 내지 25000개의 단백질 그룹, 25000 내지 30000개의 단백질 그룹, 10000 내지 20000개의 단백질 그룹, 10000 내지 50000개의 단백질 그룹, 20000 내지 100000개의 단백질 그룹, 2000 내지 20000개의 단백질 그룹, 1800 내지 20000개의 단백질 그룹, 또는 10000 내지 100000개의 단백질 그룹을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 입자 패널은 광범위한 동적 범위에 걸쳐, 본원에 개시된 독특한 단백질, 및/또는 본원에 개시된 임의의 특정 단백질의 수를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 독특한 입자 유형을 포함하는 본원에 개시된 입자 패널은 단백질이 샘플 (예컨대, 혈장 샘플)에 존재하는 전체 동적 범위에 걸쳐, 프로테오그래프 작업흐름을 사용하여 확인될 수 있는, 샘플 중의 단백질을 풍부화할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 2의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 3의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 4의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 5의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 6의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 7의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 8의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 9의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 10의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 11의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 12의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 13의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 14의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 15의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 적어도 20의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 2 내지 100의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 2 내지 20의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 2 내지 10의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 2 내지 5의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 5 내지 10의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 풍부하게 하고 확인한다.
본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 단일 단백질 또는 단백질 그룹을 풍부하게 하고 확인한다. 일부 구체예에서, 단일 단백질 또는 단백질 그룹은 상이한 번역-후 변형을 가지는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 입자 패널의 제1 입자 유형은 제1 번역-후 변형을 가지는 단백질 또는 단백질 그룹을 풍부하게 할 수 있고, 입자 패널의 제2 입자 유형은 제2 번역-후 변형을 가지는 동일한 단백질 또는 동일한 단백질 그룹을 풍부하게 할 수 있으며, 입자 패널의 제3 입자 유형은 번역-후 변형이 없는 동일한 단백질 또는 동일한 단백질 그룹을 풍부하게 할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 수의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널은, 단일 단백질 또는 단백질 그룹의 상이한 도메인, 서열, 또는 에피토프에 결합함으로써 단일 단백질 또는 단백질 그룹을 풍부하게 하고 확인한다. 예를 들어, 입자 패널의 제1 입자 유형은 단백질 또는 단백질 그룹의 제1 도메인에 결합함으로써 단백질 또는 단백질 그룹을 풍부하게 할 수 있고, 입자 패널의 제2 입자 유형은 단백질 또는 단백질 그룹의 제2 도메인에 결합함으로써 동일한 단백질 또는 동일한 단백질 그룹을 풍부하게 할 수 있다.
일부 구체예에서, 입자 패널은 하나 이상의 입자 유형을 가질 수 있다. 패널의 입자 유형의 수를 증가시키는 것은 주어진 샘플에서 확인될 수 있는 단백질의 수를 증가시키기 위한 방법일 수 있다. 패널 크기를 증가시키는 방법이 어떻게 확인된 단백질의 수를 증가시킬 수 있는지의 예는 도 11에 도시된다. 예를 들어, 도 11에서 나타낸 것과 같이, 한 입자 유형의 패널 크기는 419개의 특유한 단백질을 확인하였고, 2개의 입자 유형의 패널 크기는 588개의 단백질을 확인하였으며, 3개의 입자 유형의 패널 크기는 727개의 단백질을 확인하였고, 4개의 입자 유형의 패널 크기는 844개의 단백질을 확인하였으며, 5개의 입자 유형의 패널 크기는 934개의 단백질을 확인하였고, 6개의 입자 유형의 패널 크기는 1008개의 단백질을 확인하였으며, 7개의 입자 유형의 패널 크기는 1075개의 단백질을 확인하였고, 8개의 입자 유형의 패널 크기는 1133개의 단백질을 확인하였으며, 9개의 입자 유형의 패널 크기는 1184개의 단백질을 확인하였고, 10개의 입자 유형의 패널 크기는 1230개의 단백질을 확인하였으며, 11개의 입자 유형의 패널 크기는 1275개의 단백질을 확인하였고, 그리고 12개의 입자 유형의 패널 크기는 1318개의 단백질을 확인하였다. 입자 유형은 나노입자 유형을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 한 입자 유형의 패널 크기는 200 내지 600개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 2개의 입자 유형의 패널 크기는 300 내지 700개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 3개의 입자 유형의 패널 크기는 500 내지 900개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 4개의 입자 유형의 패널 크기는 600 내지 1000개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 5개의 입자 유형의 패널 크기는 700 내지 1100개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 6개의 입자 유형의 패널 크기는 800 내지 1200개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 7개의 입자 유형의 패널 크기는 850 내지 1250개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 8개의 입자 유형의 패널 크기는 900 내지 1300개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 9개의 입자 유형의 패널 크기는 950 내지 1350개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 10개의 입자 유형의 패널 크기는 1000 내지 1400개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 11개의 입자 유형의 패널 크기는 1050 내지 1450개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 12개의 입자 유형의 패널 크기는 1100 내지 1500개의 특유한 단백질을 확인할 수 있다. 입자 유형은 나노입자 유형을 포함할 수 있다.
본 개시는 100개 이상의 상이한 표면 화학, 및 50개 이상의 다양한 물리적 특성을 가진 200개 이상의 독특한 입자 유형을 제공한다. 독특한 입자 유형은 제1 입자 유형과 제2 입자 유형 간에 상이한 적어도 하나의 물리화학적 특성을 포함한다. 예를 들어, 본 개시는 적어도 2개의 독특한 입자 유형, 적어도 3개의 독특한 입자 유형, 적어도 4개의 독특한 입자 유형, 적어도 5개의 독특한 입자 유형, 적어도 6개의 독특한 입자 유형, 적어도 7개의 독특한 입자 유형, 적어도 8개의 독특한 입자 유형, 적어도 9개의 독특한 입자 유형, 적어도 10개의 독특한 입자 유형, 적어도 11개의 독특한 입자 유형, 적어도 12개의 독특한 입자 유형, 적어도 13개의 독특한 입자 유형, 적어도 14개의 독특한 입자 유형, 적어도 15개의 독특한 입자 유형, 적어도 20개의 독특한 입자 유형, 적어도 25개의 독특한 입자 유형, 적어도 30개의 독특한 입자 유형, 적어도 35개의 독특한 입자 유형, 적어도 40개의 독특한 입자 유형, 적어도 45개의 독특한 입자 유형, 적어도 50개의 독특한 입자 유형, 적어도 100개의 독특한 입자 유형, 적어도 150개의 독특한 입자 유형, 적어도 200개의 독특한 입자 유형, 적어도 250개의 독특한 입자 유형, 적어도 300개의 독특한 입자 유형, 적어도 350개의 독특한 입자 유형, 적어도 400개의 독특한 입자 유형, 적어도 450개의 독특한 입자 유형, 적어도 500개의 독특한 입자 유형, 2 내지 500개의 독특한 입자 유형, 2 내지 5개의 독특한 입자 유형, 5 내지 10개의 독특한 입자 유형, 10 내지 15개의 독특한 입자 유형, 15 내지 20개의 독특한 입자 유형, 20 내지 40개의 독특한 입자 유형, 40 내지 60개의 독특한 입자 유형, 60 내지 80개의 독특한 입자 유형, 80 내지 100개의 독특한 입자 유형, 100 내지 500개의 독특한 입자 유형, 4 내지 15개의 독특한 입자 유형, 또는 2 내지 20개의 독특한 입자 유형을 가지는 입자 패널을 제공한다. 입자 유형은 나노입자 유형을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시는 적어도 1개의 독특한 입자 유형, 적어도 2개의 독특한 입자 유형, 적어도 3개의 독특한 입자 유형, 적어도 4개의 독특한 입자 유형, 적어도 5개의 독특한 입자 유형, 적어도 6개의 독특한 입자 유형, 적어도 7개의 독특한 입자 유형, 적어도 8개의 독특한 입자 유형, 적어도 9개의 독특한 입자 유형, 적어도 10개의 독특한 입자 유형, 적어도 11개의 독특한 입자 유형, 적어도 12개의 독특한 입자 유형, 적어도 13개의 독특한 입자 유형, 적어도 14개의 독특한 입자 유형, 적어도 15개의 독특한 입자 유형, 적어도 16개의 독특한 입자 유형, 적어도 17개의 독특한 입자 유형, 적어도 18개의 독특한 입자 유형, 적어도 19개의 독특한 입자 유형, 적어도 20개의 독특한 입자 유형, 적어도 25개의 독특한 입자 유형, 적어도 30개의 독특한 입자 유형, 적어도 35개의 독특한 입자 유형, 적어도 40개의 독특한 입자 유형, 적어도 45개의 독특한 입자 유형, 적어도 50개의 독특한 입자 유형, 적어도 55개의 독특한 입자 유형, 적어도 60개의 독특한 입자 유형, 적어도 65개의 독특한 입자 유형, 적어도 70개의 독특한 입자 유형, 적어도 75개의 독특한 입자 유형, 적어도 80개의 독특한 입자 유형, 적어도 85개의 독특한 입자 유형, 적어도 90개의 독특한 입자 유형, 적어도 95개의 독특한 입자 유형, 적어도 100개의 독특한 입자 유형, 1 내지 5개의 독특한 입자 유형, 5 내지 10개의 독특한 입자 유형, 10 내지 15개의 독특한 입자 유형, 15 내지 20개의 독특한 입자 유형, 20 내지 25개의 독특한 입자 유형, 25 내지 30개의 독특한 입자 유형, 30 내지 35개의 독특한 입자 유형, 35 내지 40개의 독특한 입자 유형, 40 내지 45개의 독특한 입자 유형, 45 내지 50개의 독특한 입자 유형, 50 내지 55개의 독특한 입자 유형, 55 내지 60개의 독특한 입자 유형, 60 내지 65개의 독특한 입자 유형, 65 내지 70개의 독특한 입자 유형, 70 내지 75개의 독특한 입자 유형, 75 내지 80개의 독특한 입자 유형, 80 내지 85개의 독특한 입자 유형, 85 내지 90개의 독특한 입자 유형, 90 내지 95개의 독특한 입자 유형, 95 내지 100개의 독특한 입자 유형, 1 내지 100개의 독특한 입자 유형, 20 내지 40개의 독특한 입자 유형, 5 내지 10개의 독특한 입자 유형, 3 내지 7개의 독특한 입자 유형, 2 내지 10개의 독특한 입자 유형, 6 내지 15개의 독특한 입자 유형, 또는 10 내지 20개의 독특한 입자 유형의 패널 크기를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 3 내지 10개의 입자 유형의 패널 크기를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 4 내지 11개의 독특한 입자 유형의 패널 크기를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 5 내지 15개의 독특한 입자 유형의 패널 크기를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 5 내지 15개의 독특한 입자 유형의 패널 크기를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 8 내지 12개의 독특한 입자 유형의 패널 크기를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 9 내지 13개의 독특한 입자 유형의 패널 크기를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 10개의 독특한 입자 유형의 패널 크기를 제공한다. 입자 유형은 나노입자 유형을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 개시는 적어도 2개의 독특한 입자 유형, 적어도 3개의 상이한 표면 화학, 적어도 4개의 상이한 표면 화학, 적어도 5개의 상이한 표면 화학, 적어도 6개의 상이한 표면 화학, 적어도 7개의 상이한 표면 화학, 적어도 8개의 상이한 표면 화학, 적어도 9개의 상이한 표면 화학, 적어도 10개의 상이한 표면 화학, 적어도 11개의 상이한 표면 화학, 적어도 12개의 상이한 표면 화학, 적어도 13개의 상이한 표면 화학, 적어도 14개의 상이한 표면 화학, 적어도 15개의 상이한 표면 화학, 적어도 20개의 상이한 표면 화학, 적어도 25개의 상이한 표면 화학, 적어도 30개의 상이한 표면 화학, 적어도 35개의 상이한 표면 화학, 적어도 40개의 상이한 표면 화학, 적어도 45개의 상이한 표면 화학, 적어도 50개의 상이한 표면 화학, 적어도 100개의 상이한 표면 화학, 적어도 150개의 상이한 표면 화학, 적어도 200개의 상이한 표면 화학, 적어도 250개의 상이한 표면 화학, 적어도 300개의 상이한 표면 화학, 적어도 350개의 상이한 표면 화학, 적어도 400개의 상이한 표면 화학, 적어도 450개의 상이한 표면 화학, 적어도 500개의 상이한 표면 화학, 2 내지 500개의 상이한 표면 화학, 2 내지 5개의 상이한 표면 화학, 5 내지 10개의 상이한 표면 화학, 10 내지 15개의 상이한 표면 화학, 15 내지 20개의 상이한 표면 화학, 20 내지 40개의 상이한 표면 화학, 40 내지 60개의 상이한 표면 화학, 60 내지 80개의 상이한 표면 화학, 80 내지 100개의 상이한 표면 화학, 100 내지 500개의 상이한 표면 화학, 4 내지 15개의 상이한 표면 화학, 또는 2 내지 20개의 상이한 표면 화학을 가지는 입자 패널을 제공한다.
본 개시는 적어도 2개의 상이한 표면 화학, 적어도 3개의 상이한 표면 화학, 적어도 4개의 상이한 표면 화학, 적어도 5개의 상이한 표면 화학, 적어도 6개의 상이한 표면 화학, 적어도 7개의 상이한 표면 화학, 적어도 8개의 상이한 표면 화학, 적어도 9개의 상이한 표면 화학, 적어도 10개의 상이한 표면 화학, 적어도 11개의 상이한 표면 화학, 적어도 12개의 상이한 표면 화학, 적어도 13개의 상이한 표면 화학, 적어도 14개의 상이한 표면 화학, 적어도 15개의 상이한 표면 화학, 적어도 20개의 상이한 표면 화학, 적어도 25개의 상이한 표면 화학, 적어도 30개의 상이한 표면 화학, 적어도 35개의 상이한 표면 화학, 적어도 40개의 상이한 표면 화학, 적어도 45개의 상이한 표면 화학, 적어도 50개의 상이한 표면 화학, 적어도 100개의 상이한 표면 화학, 적어도 150개의 상이한 표면 화학, 적어도 200개의 상이한 표면 화학, 적어도 250개의 상이한 표면 화학, 적어도 300개의 상이한 표면 화학, 적어도 350개의 상이한 표면 화학, 적어도 400개의 상이한 표면 화학, 적어도 450개의 상이한 표면 화학, 적어도 500개의 상이한 표면 화학, 2 내지 500개의 상이한 표면 화학, 2 내지 5개의 상이한 표면 화학, 5 내지 10개의 상이한 표면 화학, 10 내지 15개의 상이한 표면 화학, 15 내지 20개의 상이한 표면 화학, 20 내지 40개의 상이한 표면 화학, 40 내지 60개의 상이한 표면 화학, 60 내지 80개의 상이한 표면 화학, 80 내지 100개의 상이한 표면 화학, 100 내지 500개의 상이한 표면 화학, 4 내지 15개의 상이한 표면 화학, 또는 2 내지 20개의 상이한 표면 화학을 가지는 입자 패널을 제공한다.
본 개시는 적어도 2개의 상이한 물리적 특성, 적어도 3개의 상이한 물리적 특성, 적어도 4개의 상이한 물리적 특성, 적어도 5개의 상이한 물리적 특성, 적어도 6개의 상이한 물리적 특성, 적어도 7개의 상이한 물리적 특성, 적어도 8개의 상이한 물리적 특성, 적어도 9개의 상이한 물리적 특성, 적어도 10개의 상이한 물리적 특성, 적어도 11개의 상이한 물리적 특성, 적어도 12개의 상이한 물리적 특성, 적어도 13개의 상이한 물리적 특성, 적어도 14개의 상이한 물리적 특성, 적어도 15개의 상이한 물리적 특성, 적어도 20개의 상이한 물리적 특성, 적어도 25개의 상이한 물리적 특성, 적어도 30개의 상이한 물리적 특성, 적어도 35개의 상이한 물리적 특성, 적어도 40개의 상이한 물리적 특성, 적어도 45개의 상이한 물리적 특성, 적어도 50개의 상이한 물리적 특성, 적어도 100개의 상이한 물리적 특성, 적어도 150개의 상이한 물리적 특성, 적어도 200개의 상이한 물리적 특성, 적어도 250개의 상이한 물리적 특성, 적어도 300개의 상이한 물리적 특성, 적어도 350개의 상이한 물리적 특성, 적어도 400개의 상이한 물리적 특성, 적어도 450개의 상이한 물리적 특성, 적어도 500개의 상이한 물리적 특성, 2 내지 500개의 상이한 물리적 특성, 2 내지 5개의 상이한 물리적 특성, 5 내지 10개의 상이한 물리적 특성, 10 내지 15개의 상이한 물리적 특성, 15 내지 20개의 상이한 물리적 특성, 20 내지 40개의 상이한 물리적 특성, 40 내지 60개의 상이한 물리적 특성, 60 내지 80개의 상이한 물리적 특성, 80 내지 100개의 상이한 물리적 특성, 100 내지 500개의 상이한 물리적 특성, 4 내지 15개의 상이한 물리적 특성, 또는 2 내지 20개의 상이한 물리적 특성을 가지는 입자 패널을 제공한다.
일부 구체예에서, 단백질을 최적으로 확인하고 바이오마커를 질환과 연관시키는 패널은 표 1에서 기술된 입자 유형으로부터 선택된 패널을 포함한다. 예를 들어, 단백질을 최적으로 확인하고 바이오마커를 질환과 연관시키는 패널은 SP-339, HX74, SP-356, SP-333, HX20, SP-374, HX42, SP-003, SP-007, 및 SP-011을 포함하는 패널을 포함한다. 샘플 중의 높은 숫자의 단백질 (예컨대, 1500보다 큰 수의 단백질)을 확인하기에 특히 적합한 입자 패널은 검정에서 5 내지 10개의 독특한 입자 유형을 포함한다. 입자 패널에 포함된 독특한 입자 유형의 수는 특정 응용 (예컨대, 특정 하위세트의 단백질의 검출 또는 특정 질환과 관련된 마커 그룹의 검출)에 대해 조정될 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질을 최적으로 확인하고 바이오마커를 질환과 연관시키는 물리화학적으로 독특한 입자 유형을 가진 패널은 실리카-코팅된 SPION, 아크릴아미드-기반 SPION, 및 아크릴레이트-기반 SPION을 포함한다. 예를 들어, 단백질 코로나를 통해 풍부한 단백질체 데이터에 대한 정보를 생성하고, 높은 민감도 및 특이성으로 바이오마커 및 질환과 연관될 수 있는 본원에 개시된 입자의 패널은 실리카-코팅된 SPION (SP-003), 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA)-코팅된 SPION (SP-007), 및 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA)-코팅된 SPION (SP-011)을 포함한다.
일부 구체예에서, 샘플 제조 및 LC-MS를 포함한, 단일 풀링된 혈장으로부터의 전체 검정 시간은 약 8시간일 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플 제조 및 LC-MS를 포함한, 단일 풀링된 혈장으로부터의 전체 검정 시간은 약 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 적어도 9시간, 적어도 10시간, 20시간 미만, 19시간 미만, 18시간 미만, 17시간 미만, 16시간 미만, 15시간 미만, 14시간 미만, 13시간 미만, 12시간 미만, 11시간 미만, 10시간 미만, 9시간 미만, 8시간 미만, 7시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 적어도 5분 내지 10분, 적어도 10분 내지 20분, 적어도 20분 내지 30분, 적어도 30분 내지 40분, 적어도 40분 내지 50분, 적어도 50분 내지 60분, 적어도 1시간 내지 1.5시간, 적어도 1.5시간 내지 2시간, 적어도 2시간 내지 2.5시간, 적어도 2.5시간 내지 3시간, 적어도 3시간 내지 3.5시간, 적어도 3.5시간 내지 4시간, 적어도 4시간 내지 4.5시간, 적어도 4.5시간 내지 5시간, 적어도 5시간 내지 5.5시간, 적어도 5.5시간 내지 6시간, 적어도 6시간 내지 6.5시간, 적어도 6.5시간 내지 7시간, 적어도 7시간 내지 7.5시간, 적어도 7.5시간 내지 8시간, 적어도 8시간 내지 8.5시간, 적어도 8.5시간 내지 9시간, 적어도 9시간 내지 9.5시간, 또는 적어도 9.5시간 내지 10시간일 수 있다.
초기 단계 검출
본원에 기술된 패널 및 그것의 사용 방법은 특정 질환 상태와 일치하는, 대상체로부터의 샘플 중의 마커의 검출에 사용될 수 있다. 도 18A 및 도 18B에서 나타낸 것과 같이, 초기 단계 암은 증상이 발생하기 전 최대 8년 전에 분리될 수 있다. 골레스탄 코호트는 2004년과 2008년 사이에 50,000명의 건강한 대상체를 등록시켰다. 도 18A에서 나타낸 것과 같이, 등록시로부터 저장된 혈장이 테스트되었다. 등록 후 8년 후에, 대략 1000명의 환자가 암이 발생하였다. 도 18B는 주요 구성요소 분석에 의해 분류된, 저장된 혈장으로부터의 3가지 암, 뇌, 폐 및 췌장암의 분류를 도시한다. 여기서, 코로나 결과는 3개의 주요 구성요소 축에 대해 도표화되어, 3가지 독특한 통계 집단을 보여준다. 등록일로부터의 저장된 혈장의 코로나 분석 (복수의 단백질을 프로파일링하기 위해 다중 특성의 측정을 포함함)은 조사된 15명의 대상체 중 15명에 대해 정확하게 암을 분류하였다 (3가지 암에 대해 각각 5명의 환자). 일부 구체예에서, 본 개시의 패널은 그 질환 상태의 증상이 발생하기 전 최대 1년 전, 최대 2년 전, 최대 3년 전, 최대 4년 전, 최대 5년 전, 최대 6년 전, 최대 7년 전, 최대 8년 전, 최대 9년 전, 최대 10년 전, 최대 15년 전, 최대 20년 전, 또는 최대 25년 전에 질환을 진단하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시의 패널은 주어진 샘플에서 광범위한 질환 상태를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 패널은 암을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 암은 뇌암, 폐암, 췌장암, 교모세포종, 흑색종, 골수종, 또는 췌장암일 수 있다. 이들 암에 대한 코로나 분석 신호는 도 17B 및 도 18에 도시된다.
본 개시의 패널은 추가적으로 다른 암, 예컨대 https://www.cancer.gov/types에서 열거된 암 중 임의의 하나, 이를테면 다음을 검출하기 위해 사용될 수 있다: 림프모세포성 백혈병 (ALL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 청소년의 암; 부신피질 암종; 유년기 부신피질 암종; 유년기 특이한 암; AIDS-관련 암; 카포시 육종 (연조직 육종); AIDS-관련 림프종 (림프종); 일차 중추신경계 림프종 (림프종); 항문암; 맹장암 - 위장 유암종(carcinoid tumor) 참조; 성상세포종, 유년기 (뇌암); 비정형 기형/횡문근 종양, 유년기, 중추신경계 (뇌암); 피부의 기저 세포 암종 - 피부암 참조; 담관암; 방광암; 유년기 방광암 ; 골암 (유잉 육종 및 골육종 및 악성 섬유성 조직세포종 포함); 뇌 종양; 유방암; 유년기 유방암; 기관지 종양, 유년기; 버킷 림프종 - 비-호지킨 림프종 참조; 유암종 (위장); 유년기 유암종; 알 수 없는 원발성 암종; 알 수 없는 원발성 유년기 암종; 심장 (심장) 종양, 유년기; 중추신경계; 비정형 기형/횡문근 종양, 유년기 (뇌암); 배아 종양, 유년기 (뇌암); 생식 세포 종양, 유년기 (뇌암); 원발성 중추신경계 림프종; 자궁경부암; 유년기 자궁경부암; 유년기 암; 유년기 암, 특이한; 담관암종 - 담관암 참조; 척삭종, 유년기; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 만성 골수성 백혈병 (CML); 만성 골수증식성 신생물; 대장암; 유년기 대장암; 두개인두종, 유년기 (뇌암); 피부 t-세포 림프종 - 림프종 (균상 식육종 및 세자리 증후군) 참조; 제자리 유관 암종 (DCIS) - 유방암 참조; 배아 종양, 중추신경계, 유년기 (뇌암); 자궁내막암 (자궁암); 상의세포종, 유년기 (뇌암); 식도암; 유년기 식도암; 감각신경모세포종 (두경부암); 유잉 육종 (골암); 두개외 생식 세포 종양, 유년기; 생식선외 생식 세포 종양; 안암; 유년기 안내 흑색종; 안내 흑색종; 망막모세포종; 나팔관 암; 뼈의 섬유성 조직세포종, 악성종양, 및 골육종; 담낭암; 위 (위) 암; 유년기 위 (위) 암; 위장 유암종; 위장 간질 종양 (GIST) (연조직 육종); 유년기 위장 간질 종양; 생식 세포 종양; 유년기 중추신경계 생식 세포 종양 (뇌암); 유년기 두개외 생식 세포 종양; 생식선외 생식 세포 종양; 난소 생식 세포 종양; 고환암; 임신 융모 질환; 털세포 백혈병; 두경부암; 심장 종양, 유년기; 간세포 (간) 암; 조직세포증, 랑게르한스 세포; 호지킨 림프종; 하인두암 (두경부암); 안내 흑색종; 유년기 안내 흑색종; 섬세포 종양, 췌장 신경내분비 종양; 카포시 육종 (연조직 육종); 신장 (신장 세포) 암; 랑게르한스 세포 조직세포증; 후두암 (두경부암); 백혈병; 입술 및 구강 암 (두경부암); 간암; 폐암 (비-소세포 및 소세포); 유년기 폐암; 림프종; 남성 유방암; 뼈의 악성 섬유성 조직세포종 및 골육종; 흑색종; 유년기 흑색종; 흑색종, 안내 (눈); 유년기 안내 흑색종; 머클 세포 암종 (피부암); 중피종, 악성; 유년기 중피종; 전이성 암; 잠복 원발성이 있는 전이성 편평 경부 암 (두경부암); 너트 유전자 변화가 있는 정중선 암종(midline tract carcinoma with nut gene changes); 구강암 (두경부암); 다중 내분비 신생물 증후군; 다발성 골수종/혈장 세포 신생물; 균상 식육종 (림프종); 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물; 골수성 백혈병, 만성 (cml); 골수성 백혈병, 급성 (AML); 골수증식성 신생물, 만성; 비강 및 부비동암 (두경부암); 비인두암 (두경부암); 신경모세포종; 비-호지킨 림프종; 비-소세포 폐암; 구강암, 입술 및 구강 암 및 구인두암 (두경부암); 골육종 및 뼈의 악성 섬유성 조직세포종; 난소암; 유년기 난소암; 췌장암; 유년기 췌장암; 췌장 신경내분비 종양 (섬세포 종양); 유두종증 (유년기 후두); 부신경절종(paraganglioma); 유년기 부신경절종; 부비동 및 비강암 (두경부암); 부갑상선암; 페니스암; 인두암 (두경부암); 갈색세포종(pheochromocytoma); 유년기 갈색세포종; 뇌하수체 종양; 혈장 세포 신생물/다발성 골수종; 흉막폐모세포종; 임신 및 유방암; 원발성 중추신경계 (CNS) 림프종; 원발성 복막암; 전립선암; 직장암; 재발 암; 신장 세포 (신장) 암; 망막모세포종; 횡문근육종, 유년기 (연조직 육종); 침샘 암 (두경부암); 육종; 유년기 횡문근육종 (연조직 육종); 유년기 혈관 종양 (연조직 육종); 유잉 육종 (골암); 카포시 육종 (연조직 육종); 골육종 (골암); 연조직 육종; 자궁 육종; 세자리 증후군 (림프종); 피부암; 유년기 피부암; 소세포 폐암; 소장암; 연조직 육종; 피부의 편평 세포 암종 - 피부암 참조; 잠복 원발성이 있는 편평 경부암, 전이성 (두경부암); 위 (위) 암; 유년기 위 (위) 암; t-세포 림프종, 피부 - 림프종 (균상 식육종 및 세자리 증후군) 참조; 고환암; 유년기 고환암; 후두암 (두경부암); 비인두암; 구인두암; 하인두암; 흉선종 및 흉선 암종; 갑상선암; 신장 골반 및 요관의 이행 세포 암 (신장 (신장 세포) 암); 알 수 없는 원발성 암종; 알 수 없는 원발성 유년기 암; 유년기의 특이한 암; 요관 및 신장 골반, 이행 세포 암 (신장 (신장 세포) 암; 요도암; 자궁암, 자궁내막; 자궁 육종; 질암; 유년기 질암; 혈관 종양 (연조직 육종); 외음부암; 빌름 종양 및 기타 유년기 신장 종양; 또는 젊은 성년기 암. 추가로, 본 개시의 입자 패널은 다른 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 다발성 경화증을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
샘플
본 개시의 패널은 단백질 코로나로부터 단백질체 데이터를 생성하고 계속해서 본원에서 기술된 임의의 생물학적 상태와 연관시킬 수 있다. 본 개시와 일치하는 샘플은 대상체로부터의 생물학적 샘플을 포함한다. 대상체는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. 생물학적 샘플 생체유체일 수 있다. 예를 들어, 생체유체는 혈장, 혈청, CSF, 소변, 눈물, 세포 용해물, 조직 용해물, 세포 균등화물, 조직 균등화물, 유두 흡인물, 대변 샘플, 활액 및 전혈, 또는 타액일 수 있다. 샘플은 또한 비-생물학적 샘플, 예컨대 물, 우유, 용매, 또는 유동 상태로 균등화된 어떤 것일 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 복수의 단백질 또는 단백질체 데이터를 함유할 수 있고, 그것은 단백질이 패널의 다양한 입자 유형의 표면에 흡착되고 단백질 코로나의 후속적인 소화 후에 분석될 수 있다. 단백질체 데이터는 핵산, 펩타이드, 또는 단백질을 포함할 수 있다. 본원에서 임의의 샘플은 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 분석될 수 있는 많은 상이한 분석물을 함유할 수 있다. 분석물은 단백질, 펩타이드, 소분자, 핵산, 대사산물, 또는 입자 유형의 표면에 잠재적으로 결합하거나 상호작용할 수 있는 임의의 분자일 수 있다.
본원에는 다중-오믹스 분석(multi-omic analysis)을 위한 조성물 및 방법이 개시된다. "다중-오믹스(들)" 또는 "다중오믹스(들)"은 대규모로 생체분자를 분석하기 위한 분석적 접근법을 나타낼 수 있고, 여기서 데이터 세트는 다중 옴(ome), 예컨대 단백질체, 게놈, 전사체, 지질체, 및 대사체이다. 다중-오믹스 데이터의 비제한적인 예로는 단백질체 데이터, 게놈 데이터, 지질체 데이터, 글리코믹 데이터, 전사체 데이터, 또는 대사체 데이터를 들 수 있다. "생체분자 코로나"의 "생체분자"는 생물학적 유기체에 의해 생성될 수 있는, 또는 생물학적 유기체에 존재하는 임의의 분자 또는 생물학적 구성요소를 나타낼 수 있다. 생체분자의 비제한적인 예로는 단백질 (단백질 코로나), 폴리펩타이드, 다당류, 당, 지질, 리포단백질, 대사산물, 올리고뉴클레오타이드, 핵산 (DNA, RNA, 마이크로 RNA, 플라스미드, 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산), 대사체, 뿐만 아니라 일차 대사산물, 이차 대사산물과 같은 소분자, 및 다른 천연 생성물, 또는 이것들의 임의의 조합을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 생체분자는 단백질, 핵산, 지질, 및 대사체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 본 개시의 샘플은 복수의 샘플일 수 었다. 복수의 샘플 중 적어도 2개의 샘플은 공간적으로 분리될 수 있다. 공간적으로 분리된이란 별도의 부피로 함유된 샘플을 나타낸다. 예를 들어, 공간적으로 분리된 샘플은 플레이트 또는 별도의 튜브의 별도의 웰에 있는 샘플을 나타낼 수 있다. 공간적으로 분리된 샘플은 플레이트 또는 별도의 튜브의 별도의 웰에 있고 동일한 기기 상에서 함께 분석되는 샘플을 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시는 복수의 샘플, 예컨대 적어도 2개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 5개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 10개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 15개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 20개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 25개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 30개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 35개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 40개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 45개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 50개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 55개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 60개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 65개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 70개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 75개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 80개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 85개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 90개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 95개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 96개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 100개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 120개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 140개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 160개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 180개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 200개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 220개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 240개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 260개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 280개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 300개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 320개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 340개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 360개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 380개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 400개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 420개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 440개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 460개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 480개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 500개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 600개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 700개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 800개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 900개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1000개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1100개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1200개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1300개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1400개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1500개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1600개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1700개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1800개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 1900개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 2000개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 5000개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 10000개의 공간적으로 분리된 샘플, 2 내지 10개의 공간적으로 분리된 샘플, 2 내지 100개의 공간적으로 분리된 샘플, 2 내지 200개의 공간적으로 분리된 샘플, 2 내지 300개의 공간적으로 분리된 샘플, 50 내지 150개의 공간적으로 분리된 샘플, 10 내지 20개의 공간적으로 분리된 샘플, 20 내지 30개의 공간적으로 분리된 샘플, 30 내지 40개의 공간적으로 분리된 샘플, 40 내지 50개의 공간적으로 분리된 샘플, 50 내지 60개의 공간적으로 분리된 샘플, 60 내지 70개의 공간적으로 분리된 샘플, 70 내지 80개의 공간적으로 분리된 샘플, 80 내지 90개의 공간적으로 분리된 샘플, 90 내지 100개의 공간적으로 분리된 샘플, 100 내지 150개의 공간적으로 분리된 샘플, 150 내지 200개의 공간적으로 분리된 샘플, 200 내지 250개의 공간적으로 분리된 샘플, 250 내지 300개의 공간적으로 분리된 샘플, 300 내지 350개의 공간적으로 분리된 샘플, 350 내지 400개의 공간적으로 분리된 샘플, 400 내지 450개의 공간적으로 분리된 샘플, 450 내지 500개의 공간적으로 분리된 샘플, 500 내지 600개의 공간적으로 분리된 샘플, 600 내지 700개의 공간적으로 분리된 샘플, 700 내지 800개의 공간적으로 분리된 샘플, 800 내지 900개의 공간적으로 분리된 샘플, 900 내지 1000개의 공간적으로 분리된 샘플, 1000 내지 2000개의 공간적으로 분리된 샘플, 2000 내지 3000개의 공간적으로 분리된 샘플, 3000 내지 4000개의 공간적으로 분리된 샘플, 4000 내지 5000개의 공간적으로 분리된 샘플, 5000 내지 6000개의 공간적으로 분리된 샘플, 6000 내지 7000개의 공간적으로 분리된 샘플, 7000 내지 8000개의 공간적으로 분리된 샘플, 8000 내지 9000개의 공간적으로 분리된 샘플, 또는 9000 내지 10000개의 공간적으로 분리된 샘플을 분석하는 것과 부합할 수 있는 입자 패널 및 그것의 사용 방법을 제공한다.
본원에 개시된 방법은 하나 또는 하나 이상의 샘플로부터 (복수의 입자 유형을 가지는) 입자 패널을 분리하는 단계를 포함한다. 초상자성인 입자 유형을 가지는 입자 패널은 자성을 사용하여 샘플로부터 신속하게 분리되거나 격리될 수 있다. 더욱이, 공간적으로 분리된 다중 샘플은 나란히 처리될 수 있다. 그로써, 본원에 개시된 방법은 자석을 사용함으로써 복수의 공간적으로 분리된 패널의 미결합 단백질로부터 입자 패널을 동시에 분리하거나 격리하는 것을 제공한다. 예를 들어, 입자 패널은 복수의 공간적으로 분리된 샘플과 함께 인큐베이션될 수 잇고, 여기서 각각의 공간적으로 분리된 샘플은 웰 플레이트 (예컨대, 96-웰 플레이트)의 웰에 있다. 인큐베이션 후에, 웰 플레이트의 각각의 웰에 있는 입자 패널은 자석 위에 전체 플레이트를 놓음으로써 공간적으로 분리된 샘플에 존재하는 미결합 단백질로부터 분리될 수 있다. 이것은 동시에 입자 패널의 초상자성 입자를 끌어 내린다. 각 웰의 상층액은 미결합 단백질을 제거하기 위해 제거될 수 있다. 이들 단계 (인큐베이션, 자석을 사용하여 끌어 내림)는 입자를 효과적으로 세척하기 위해 반복될 수 있고, 그로써 샘플에 존재할 수 있는 배경 미결합 단백질을 제거할 수 있다. 이것은 한 예이지만, 기술분야에 숙련된 사람은 초상자성 입자가 하나 또는 하나 이상의 공간적으로 분리된 샘플로부터 동시에 신속하게 분리되는 수많은 다른 시나리오를 상상할 수 있을 것이다.
일부 구체예에서, 본 개시의 패널은 입자의 표면 상에 형성된 코로나의 소화를 통해 단백질체 데이터를 처리함으로써 생물학적 샘플 중의 특정 단백질의 확인 및 측정을 제공한다. 확인되고 측정될 수 있는 단백질의 예로는 매우 풍부한 단백질, 중간 풍부한 단백질, 및 풍부함이 낮은 단백질을 들 수 있다. 풍부함이 낮은 단백질은 샘플에 약 10 ng/mL 이하의 농도로 존재할 수 있다. 풍부함이 높은 단백질은 샘플에 약 10 μg/mL 이상의 농도로 존재할 수 있다. 중간 풍부함의 단백질은 샘플에 약 10 ng/mL 내지 약 10 μg/mL의 농도로 존재할 수 있다. 고도로 풍부한 단백질의 예로는 알부민, IgG 및 혈장의 질량의 95%에 기여하는 풍부함의 상위 14개 단백질을 들 수 있다. 추가적으로, 종래의 고갈 칼럼을 사용하여 정제될 수 있는 임의의 단백질은 본원에 개시된 입자 패널을 사용하여 샘플에서 직접 검출될 수 있다. 단백질의 예는 Keshishian et al. (Mol Cell Proteomics. 2015 Sep;14(9):2375-93. doi: 10.1074/mcp.M114.046813. Epub 2015 Feb 27.), Farr et al. (J Proteome Res. 2014 Jan 3;13(1):60-75. doi: 10.1021/pr4010037. Epub 2013 Dec 6.), 또는 Pernemalm et al. (Expert Rev Proteomics. 2014 Aug;11(4):431-48. doi: 10.1586/14789450.2014.901157. Epub 2014 Mar 24.)에서와 같이 공개된 데이터베이스에서 열거된 임의의 단백질일 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 입자 패널을 사용하여 측정되고 확인될 수 있는 단백질의 예로는 알부민, IgG, 라이소자임, CEA, HER-2/neu, 방광 종양 항원, 티로글로불린, 알파-피토단백질, PSA, CA125, CA19.9, CA 15.3, 렙틴, 프로락틴, 오스테오폰틴, IGF-II, CD98, 패신(fascin), sPigR, 14-3-3 에타, 트로포닌 I, B-형 나트륨이뇨 펩타이드, BRCA1, c-Myc, IL-6, 피브리노겐. EGFR, 가스트린, PH, G-CSF, 데스민. NSE, FSH, VEGF, P21, PCNA, 칼시토닌, PR, CA125, LH, 소마토스타틴. S100, 인슐린. 알파-프로락틴, ACTH, Bcl-2, ER 알파, Ki-67, p53, 카텝신 D, 베타 카테닌. VWF, CD15, k-ras, 카스파제 3, EPN, CD10, FAS, BRCA2. CD30L, CD30, CGA, CRP, 프로트롬빈, CD44, APEX, 트랜스페린, GM-CSF, E-캐드헤린, IL-2, Bax, IFN-감마, 베타-2-MG, TNF 알파, c-erbB-2, 트립신, 사이클린 D1, MG B, XBP-1, HG-1, YKL-40, S-감마, NESP-55, 네트린-1, 게미닌(geminin), GADD45A, CDK-6, CCL21, BrMS1, 17베타HDI, PDGFRA, Pcaf, CCL5, MMP3, 클라우딘-4, 및 클라우딘-3을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 입자 패널을 사용하여 측정되고 확인될 수 있는 단백질의 다른 예는 관심의 특정 질환 적응증 (예컨대, 전립선암, 폐암, 또는 알츠하이머병)
분석 방법
샘플의 단백질체 데이터는 많은 상이한 분석적 기법을 사용하여 확인, 측정, 및 정량화될 수 있다. 예를 들어, 단백질체 데이터는 SDS-PAGE 또는 임의의 겔-기반 분리 기법을 사용하여 분석될 수 있다. 펩타이드 및 단백질은 또한 면역검정, 예컨대 ELISA를 사용하여 확인, 측정, 및 정량화될 수 있다. 대안으로, 단백질체 데이터는 질량 분석법, 고성능 액체 크로마토그래피, LC-MS/MS, 에드만 분해(Edman Degradation), 면역친화성 기법, EP3548652, WO2019083856, WO2019133892 (이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 방법, 및 다른 단백질 분리 기법을 사용하여 확인, 측정, 및 정량화될 수 있다.
컴퓨터 제어 시스템
본 개시는 개시의 방법을 실행하도록 프로그래밍된 컴퓨터 제어 시스템을 제공한다. 이 측정, 분석 또는 통계학적 분류는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 다른 것들 중에서도, 광범위한 감독 및 비감독 데이터 분석 및 계층적 군집 분석 (HCA)과 같은 군집화 접근법, 주요 구성요소 분석 (PCA), 부분 최소 제곱 판별 분석 (PLSDA), 기계 학습 (또한 랜덤 포리스트로서 알려져 있음), 로지스틱 회귀, 정결정 나무(decision trees), 서포트 벡터 머신 (SVM), k-최근접 이웃(k-nearest neighbors), 나이브 베이즈(naive bayes), 선형 회귀, 다항 회귀, 회귀를 위한 SVM, K-평균 클러스터링, 및 은닉 마르코프 모델(hidden Markov models)을 포함한, 기술분야에 알려져 있는 방법들에 의해 실행된다. 컴퓨터 시스템은 본 개시의 단백질 세트 또는 단백질 코로나를 분석하는 다양한 측면, 예컨대, 예를 들어, 생물학적 상태와 관련된 단백질을 측정하기 위하여 개별 생체분자 코로나 사이에서 공통되는 패턴이 가진 통계학적 유의성을 측정하기 위하여 여러 샘플의 생체분자 코로나를 비교/분석하는 것을 수행할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 상이한 단백질 세트 또는 단백질 코로나 (예컨대, 단백질 코로나의 조성의 특징)를 검출하고 구별하기 위한 분류기를 개발하기 위해 사용될 수 있다. 현재 개시된 센서 어레이로부터 수집된 데이터는 기계 학습 알고리즘, 특히 환자로부터의 어레이 측정을 수용하고 각 환자로부터의 특정 생체분자 코로나 조성을 출력시키는 알고리즘을 훈련하기 위해 사용될 수 있다. 알고리즘을 훈련하기 전에, 어레이로부터의 미가공(raw) 데이터는 개별 변수의 변동성을 감소시키기 위하여 먼저 노이즈가 제거될 수 있다.
기계 학습은 학습 데이터 세트를 경험한 후 새롭고, 볼 수 없는 예/과제에 대해 정확하게 수행하는 학습 기계의 능력으로서 일반화될 수 있다. 기계 학습은 다음의 개념 및 방법을 포함할 수 있다. 감독 학습 개념으로는 AODE: 인공 신경 네트워크(network), 예컨대 역전파(Backpropagation), 오토인코더(Autoencoder), 호프필드(Hopfield) 네트워크, 볼츠만(Boltzmann) 기계, 제한된 볼츠만 기계, 및 스파이킹 신경 네트워크; 베이즈 통계(Bayesian statistics), 예컨대 베이즈 네트워크 및 베이즈 지식 베이스; 사례-기반 추론; 가우스 과정 회귀; 유전자 발현 프로그래밍; 데이터 취급의 그룹 방법 (GMDH); 유도 논리 프로그래밍; 상황-기반 학습; 게으른 학습; 학습 오토마타(Learning Automata); 학습 벡터 양자화; 로지스틱 모델 트리(Logistic Model Tree); 최소 메시지 길이 (결정 나무, 결정 그래프, 등), 예컨대 최근접 이웃 알고리즘 및 유추적 모델링; 아마도 대략적으로 정확한 학습 (PAC) 학습; 리플 다운 규칙, 지식 획득 방법론; 기호 기계 학습 알고리즘; 서포트 벡터 머신; 랜덤 포리스트; 분류 앙상블, 예컨대 부트스트랩 응집(Bootstrap aggregating)(배깅(bagging)) 및 부스팅 (메타-알고리즘); 서수 분류; 정보 퍼지 네트워크 (IFN); 조건부 무작위장; ANOVA; 선형 분류기, 예컨대 피셔 선형 판별, 선형 회귀, 로지스틱 회쉬, 다항 로지스틱 회귀, 나이브 베이즈 분류기, 퍼셉트론, 서포트 벡터 머신; 2차 분류기; k-최근접 이웃; 부스팅; 결정 나무, 예컨대 C4.5, 랜덤 포리스트, ID3, CART, SLIQ SPRINT; 베이즈 네트워크, 예컨대 나이브 베이즈; 및 은닉 마르코프 모델을 들 수 있다. 비감독 학습 개념으로는 예외-최대화 알고리즘; 벡터 양자화; 생성 지형도(Generative topographic map); 정보 병목 방법; 인공 신경 네트워크, 예컨대 자가-조직도; 연관 규칙 학습, 예컨대, Apriori 알고리즘, Eclat 알고리즘, 및 FPgrowth 알고리즘; 계층적 클러스터링, 예컨대 단일연결 클러스터링 및 개념적 클러스터링; 클러스터 분석, 예컨대, K-평균 알고리즘, 퍼지 클러스터링, DBSCAN, 및 OPTICS 알고리즘; 및 이상치 검출(Outlier Detection), 예컨대 국소적 이상치 요인을 들 수 있다. 반-감독 학습 개념으로는 생성 모델; 저밀도 분리; 그래프-기반 방법; 및 공동 훈련을 들 수 있다. 강화 학습 개념으로는 시간차 학습; Q-학습; 학습 오토마타; 및 SARSA를 들 수 있다. 심층학습 개념으로는 심층 신뢰망; 심층 볼츠만 기계; 심층 합성곱 신경망(Convolutional neural network); 심층 재발 신경망; 및 계층적 시간 기억을 들 수 있다. 컴퓨터 시스템은 본원에 기술된 방법을 실행하기 위해 적응될 수 있다. 시스템은 본원에 기술된 방법을 실행하도록 프로그래밍된 중앙 컴퓨터 서버를 포함한다. 서버는 단일 코어 프로세서(processor)일 수 있는 중앙 처리 장치 (CPU, 또한 "프로세서"), 다중 코어 프로세서, 또는 병렬 프로세싱을 위한 복수의 프로세서를 포함한다. 서버는 또한 메모리 (예컨대, 랜덤 액세스 메모리, 읽기 전용 메모리, 플래시 메모리); 전자 저장 장치 (예컨대 하드 디스크); 하나 이상의 다른 시스템과의 커뮤니케이션을 위한 커뮤니케이션 인터페이스 (예컨대, 네트워크 어댑터); 및 캐시, 기타 메모리, 데이터 저장, 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함 할 수 있는 주변 장치를 포함할 수 있다. 메모리 저장 장치, 인터페이스, 및 주변 장치는 커뮤니케이션 버스 (고체 라인), 예컨대 마더보드를 통해 프로세서와 통신된다. 저장 장치는 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 장치일 수 있다. 서버는 커뮤니케이션 인터페이스의 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크")에 작동 가능하게 결합된다. 네트워크는 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 인터넷과 통신되는 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 통신 또는 데이터망일 수 있다. 네트워크는 일부 경우에, 서버의 도움으로, 피어투피어(peer-to-peer) 네트워크를 실행할 수 있고, 이것은 서버에 연결된 장치가 클라이언트 또는 서버로서 행동하도록 할 수 있다.
저장 장치는 파일, 예컨대 대상체 보고서, 및/또는 개체에 대한 데이터와의 통신, 또는 본 개시와 관련된 데이터의 임의의 측면을 저장할 수 있다.
컴퓨터 서버는 네트워크를 통해 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신할 수 있다. 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템은, 예를 들어, 개인용 컴퓨터, 랩톱(laptop), 태블릿, 전화기, 스마트 폰, 또는 개인용 디지털 보조기일 수 있다.
일부 적용에서 컴퓨터 시스템은 단일 서버를 포함한다. 다른 상황에서, 시스템은 인터넷, 엑스트라넷 및/또는 인터넷을 통해 서로 통신하는 다중 서버를 포함한다.
서버는 본원에 제공된 측정 데이터 또는 데이터베이스, 대상체로부터의 환자 정보, 예컨대, 예를 들면 병력, 가족력, 인구 통계 데이터 및/또는 특정 적용에 잠재적으로 관련된 다른 임상 또는 개인 정보를 저장하기 위해 적응될 수 있다. 그러한 정보는 저장 장치 또는 서버 상에 저장될 수 있고 그러한 데이터는 네트워크를 통해 전송될 수 있다.
본원에 기술된 방법은 서버의 전자 저장 위치 상에, 예컨대, 예를 들면 메모리 상에, 또는 전자 저장 장치에 저장된 기계 (또는 컴퓨터 프로세서) 실행 가능한 코드 (또는 소프트웨어)에 의해 실행될 수 있다. 사용 중에, 코드는 프로세서에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 코드는 프로세서에 의해 바로 액세스되도록 저장 장치로부터 검색되고 메모리 상에 저장될 수 있다. 일부 상황에서, 전자 저장 장치는 배제되고, 기계-실행 가능한 명령이 메모리 상에 저장된다. 대안으로, 코드는 제2 컴퓨터 시스템 상에서 실행될 수 있다.
본원에서 제공된 시스템 및 방법의 측면, 예컨대 서버는 프로그래밍에서 구현될 수 있다. 기술의 다양한 측면은 전형적으로 기계 판독 가능한 매체의 한 유형에서 수행되거나 구현되는 기계 (또는 프로세서) 실행 가능한 코드 및/또는 관련 데이터 형태의 "제품" 또는 "제조 물픔"으로서 여겨질 수 잇다. 기계-실행 가능한 코드는 전자 저장 장치, 예컨대 메모리 (예컨대, 판독-전용 메모리, 무작위-액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크 상에 저장될 수 있다. "저장"형 매체는 소프트웨어 프로그래밍을 위해 언제든지 비-일시적 저장(non-transitory storage)을 제공할 수 있는, 컴퓨터, 프로세서 등, 또는 그것의 관련된 모듈, 예컨대 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등의 임의의 또는 모든 유형의 메모리를 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다양한 다른 통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 그러한 통신은, 예를 들어, 한 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 것으로, 예를 들어, 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터로부터 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 그러므로, 소프트웨어 요소를 내장할 수 있는 또 다른 유형의 매체로는, 유선 및 광 유선 네트워크 및 다양한 무선 링크를 통해, 예컨대 국지적 장치간 물리적 인터페이스를 가로질러 사용되는 것과 같은 광학, 전기, 및 전자기파를 들 수 있다. 그러한 파, 예컨대 광학 링크, 등과 같은 유선 또는 무선 파를 전달하는 물리적 요소는 또한 소프트웨어를 내장하는 매체로서 간주될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비-일시적인, 유형의 "저장" 매체에 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능한 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는 데 참여하는 모든 매체를 나타낼 수 있다.
본원에서 기술된 컴퓨터 시스템은 본원에 기술된 임의의 알고리즘 또는 알고리즘-기반 방법을 수행하기 위하여 컴퓨터-실행 가능한 코드를 포함할 수 있다. 일부 적용에서 본원에 기술된 알고리즘은 적어도 하나의 데이터베이스로 구성된 메모리 장치를 사용할 것이다.
본 개시와 관련된 데이터는 수신자에 의해 수신 및/또는 리뷰를 위해 네트워크 또는 연결을 통해 전송될 수 있다. 수신자는 보고서가 관련된 대상체; 또는 그것의 간병인, 예컨대, 건강 관리 제공자, 관리자, 기타 건강 관리 전문가, 또는 다른 간병인; 분석을 수행하거나 및/또는 주문한 사람 또는 실체일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 수신자는 또한 그러한 보고서를 저장하기 위한 국지적 또는 원격 시스템 (예컨대 "클라우드 컴퓨팅" 아키텍처의 서버 또는 다른 시스템)일 수 있다. 한 구체예에서, 컴퓨터-판독 가능한 매체는 본원에 기술된 방법을 사용하여 생물학적 샘플의 분석 결과의 전송에 적합한 매체를 포함한다.
본원에 제공된 시스템 및 방법의 측면은 프로그래밍에 내장될 수 있다. 기술의 다양한 측면은 전형적으로 기계 판독 가능한 매체의 유형에서 수행되거나 내장된 기계 (또는 프로세서) 실행 가능한 코드 및/또는 관련된 데이터의 형태의 "제품" 또는 "제조 물품"으로서 여겨질 수 있다. 기계 실행 가능한 코드는 전자 저장 장치, 예컨대 메모리 (예컨대, 판독-전용 메모리, 무작위-액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크 상에 저장될 수 있다. "저장"형 매체는 소프트웨어 프로그래밍을 위해 언제든지 비-일시적 저장을 제공할 수 있는, 컴퓨터, 프로세서 등, 또는 그것의 관련된 모듈, 예컨대 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등의 임의의 또는 모든 유형의 메모리를 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다양한 다른 통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 그러한 통신은, 예를 들어, 한 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 것으로, 예를 들어, 관리 서버 또는 호스트 컴퓨터로부터 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 그러므로, 소프트웨어 요소를 내장할 수 있는 또 다른 유형의 매체로는, 유선 및 광 유선 네트워크 및 다양한 무선 링크를 통해, 예컨대 국지적 장치간 물리적 인터페이스를 가로질러 사용되는 것과 같은 광학, 전기, 및 전자기파를 들 수 있다. 그러한 파, 예컨대 유선 또는 무선 링크, 광학 링크, 등을 전달하는 물리적 요소는 또한 소프트웨어를 내장하는 매체로서 간주될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비-일시적인, 유형의 "저장" 매체에 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능한 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는 데 참여하는 모든 매체를 나타낼 수 있다.
그러므로, 기계 판독 가능한 매체, 예컨대 컴퓨터-실행 가능한 코드는 한정하는 것은 아니지만, 유형의 저장 매체, 반송파(carrier wave) 매체 또는 물리적 전송 매체를 포함한, 많은 형태를 취할 수 있다. 비-휘발성 저장 매체로는, 예를 들어, 모든 컴퓨터(들) 등의 임의의 저장 장치가, 예컨대 도면에 도시된 데이터베이스 등을 실행하기 위해 사용될 수 있는 광학 또는 자성 디스크를 들 수 있다. 휘발성 저장 매체로는 동적 메모리, 예컨대 그러한 컴퓨터 플랫폼의 주 메모리를 들 수 있다. 유형의 전송 매체로는 공축 케이블; 컴퓨터 시스템 내에서 버스를 포함하는 와이어를 포함하여, 구리 와이어 및 섬유 광학을 들 수 있다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 라디오 주파수 (RF) 및 적외선 (IR) 데이터 전송 중에 생성되는 것과 같은 음향 또는 광파의 형태를 취할 수 있다. 그러므로 컴퓨터-판독 가능한 매체의 일반적인 형태로는 예를 들어: 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자성 테이프, 임의의 다른 자성 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 페이퍼 테이프, 구멍 패턴이 있는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 데이터 또는 명령을 운반하는 반송파, 그러한 반송파를 운반하는 케이블 또는 링크, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독해낼 수 있는 임의의 다른 매체를 들 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 매체의 이들 형태 중 많은 것이 실행을 위해 하나 이상의 명령의 하나 이상의 순서를 프로세서에 운반하는 데 관여할 수 있다.
기계 학습을 사용하는 단백질 코로나의 분류
질환 또는 장애 및/또는 질환 상태와 관련된 단백질 세트를 측정하는 방법은 적어도 2개의 샘플의 코로나의 분석을 포함한다. 이런 측정, 분석 또는 통계학적 분류는 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 다른 것들 중에서도 광범위한 감독 및 비감독 데이터 분석, 기계 학습, 심층 학습, 및 계층적 클러스터 분석 (HCA)을 포함한 클러스터링 접근법, 주요 구성요소 분석 (PCA), 부분 최소 제곱 판별 분석 (PLS-DA), 랜덤 포리스트, 로지스틱 회귀, 정결정 나무, 서포트 벡터 머신 (SVM), k-최근접 이웃, 나이브 베이즈, 선형 회귀, 다항 회귀, 회귀를 위한 SVM, K-평균 클러스터링, 및 은닉 마르코프 모델을 포함한, 기술분야에 알려져 있는 방법들에 의해 실행된다. 달리 말하면, 각 샘플의 코로나의 단백질은 서로 비교/분석되어 어떤 패턴이 질환 또는 장애 또는 질환 상태와 연관된 단백질 세트를 측정하기 위해 개별 코로나 간에 일반적인 것인지가 통계학적 유의성으로 측정된다.
일반적으로, 기계 학습 알고리즘은 보기를 기술하는 입력 특징을 기반으로 보기에 부류 표지를 정확하게 할당하는 모델을 구성하기 위해 사용된다. 일부 경우에 본원에 기술된 방법에 대해 기계 학습 및/또는 심층 학습 접근법을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 기계 학습은 단백질 코로나를 다양한 질환 상태와 연관시키기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 질환 없음, 질환에 대한 전구체, 초기 또는 후기 단계의 질환을 가짐, 등). 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 기계 학습 알고리즘이 단백질 코로나에 의해 검출되고 얻어진 데이터 및 그것으로부터 유래된 단백질 세트를 분석하기 위해 발명의 방법과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 기계 학습은 대상체가 암의 전단계이거나, 암이거나 또는 암이 없거나 발병하지 않는 것인지를 측정하는 것뿐만 아니라, 암의 유형을 구별하기 위해 본원에 기술된 센서 어레이와 결합될 수 있다.
번호가 매겨진 구체예
다음의 구체예는 본원에 개시된 특징의 조합의 비제한적인 순열을 나타낸다. 특징의 조합의 다른 순열 또한 고려된다. 특히, 이들 번호가 매겨진 구체예의 각각은 그것들이 열거되는 순서와 관계없이, 모든 이전의 또는 후속되는 번호의 구체예에 종속되거나 관련되는 것으로서 고려된다. 1. 샘플에서 단백질을 확인하는 방법으로서, 방법은: 복수의 입자 유형을 포함하는 패널을 샘플과 함께 인큐베이션하여 복수의 단백질 코로나를 형성하는 단계; 복수의 단백질 코로나를 소화시켜서 단백질체 데이터를 생성하는 단계; 및 단백질체 데이터를 정량화함으로써 샘플 중의 단백질을 확인하는 단계를 포함하는 방법. 2. 샘플이 대상체로부터 유래되는 것인, 구체예 1의 방법. 3. 방법이 확인 단계로부터 샘플의 단백질 프로파일을 측정하는 단계 및 단백질 프로파일을 대상체의 생물학적 상태와 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 구체예 2의 방법. 4. 방법이 복수의 단백질 코로나를 소화시킴으로써 단백질체 데이터를 생성하는 단계; 복수의 단백질 코로나의 단백질 프로파일을 측정하는 단계; 및 단백질 프로파일을 생물학적 상태와 연관시키는 단계에 의해 대상체로부터의 샘플의 생물학적 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 패널을 적어도 2개의 상이한 입자 유형을 포함하는 것인, 구체예 1의 방법. 5. 연관 단계는 훈련된 분류기에 의해 수행되는 것인, 구체예 4의 방법. 6. 패널이 적어도 3개의 상이한 입자 유형, 적어도 4개의 상이한 입자 유형, 적어도 5개의 상이한 입자 유형, 적어도 6개의 상이한 입자 유형, 적어도 7개의 상이한 입자 유형, 적어도 8개의 상이한 입자 유형, 적어도 9개의 상이한 입자 유형, 적어도 10개의 상이한 입자 유형, 적어도 11개의 상이한 입자 유형, 적어도 12개의 상이한 입자 유형, 적어도 13개의 상이한 입자 유형, 적어도 14개의 상이한 입자 유형, 적어도 15개의 상이한 입자, 또는 적어도 20개의 상이한 입자 유형을 포함하는 것인, 구체예 1 내지 5 중 어느 하나의 방법. 7. 패널이 적어도 4개의 상이한 입자 유형을 포함하는 것인, 구체예 1 내지 6 중 어느 하나의 방법. 8. 패널의 적어도 한 입자 유형이 패널의 제2 입자 유형과 상이한 물리적 특징을 포함하는 것인, 구체예 1 내지 7 중 어느 하나의 방법. 9. 물리적 특징은 크기, 다분산 지수, 표면 전하, 또는 형태인 것인, 구체예 8의 방법. 10. 패널의 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 크기는 10 nm 내지 500 nm인 것인, 구체예 1 내지 9 중 어느 하나의 방법. 11. 패널의 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 다분산 지수는 0.01 내지 0.25인 것인, 구체예 1 내지 10 중 어느 하나의 방법. 12. 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 형태는 구형, 콜로이드상, 사각형, 막대형, 와이어형, 원추형, 피라미드형, 또는 직사각형을 포함하는 것인, 구체예 1 내지 11 중 어느 하나의 방법. 13. 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 표면 전하는 양의 표면 전하를 포함하는 것인, 구체예 1 내지 12 중 어느 하나의 방법. 14. 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 표면 전하는 음의 표면 전하를 포함하는 것인, 구체예 1 내지 12 중 어느 하나의 방법. 15. 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형의 표면 전하는 중성 표면 전하를 포함하는 것인, 구체예 1 내지 12 중 어느 하나의 방법. 16. 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 패널의 제2 입자 유형과 상이한 화학적 특징을 포함하는 것인, 구체예 1 내지 15 중 어느 하나의 방법. 17. 화학적 특징을 표면 기능성 화학 그룹인 것인, 구체예 16의 방법. 18. 기능성 화학 그룹은 아민 또는 카르복실레이트인 것인, 구체예 17의 방법. 19. 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 중합체, 지질, 또는 금속, 실리카, 단백질, 핵산, 소분자, 또는 큰 분자를 포함하는 물질로 만들어지는 것인, 구체예 1 내지 18 중 어느 하나의 방법. 20. 중합체는 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 다가 무수물, 폴리하이드록시산, 폴리프로필푸머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 또는 폴리아민, 폴리알킬렌 글리콜 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)), 폴리에스테르 (예컨대, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA), 폴리락트산, 또는 폴리카프로락톤), 폴리스티렌, 또는 둘 이상의 중합체의 공중합체를 포함하는 것인, 구체예 19의 방법. 21. 지질은 다이올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드 및 다이아실글리세롤, 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 및 다이올레오일포스파티딜세린 (DOPS), 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤 (POPG), 레시틴, 리소레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 난 포스파티딜콜린 (EPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤 (POPG), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민 (SOPE), 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 다이세틸포스페이트, 또는 콜레스테롤을 포함하는 것인, 구체예 19의 방법. 22. 금속은 금, 은, 구리, 니켈, 코발트, 팔라듐, 백금, 이리듐, 오스뮴, 로듐, 루테늄, 레늄, 바나듐, 크로뮴, 망간, 니오븀, 몰리브데늄, 텅스텐, 탄탈룸, 철, 또는 카드뮴, 티타늄, 또는 금을 포함하는 것인, 구체예 19의 방법. 23. 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 다가 무수물, 폴리하이드록시산, 폴리프로필푸머레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 또는 폴리아민, 폴리알킬렌 글리콜 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)), 폴리에스테르 (예컨대, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA), 폴리락트산, 또는 폴리카프로락톤), 폴리스티렌을 포함하는 중합체, 또는 둘 이상의 중합체 폴리에틸렌 글리콜의 공중합체로 기능화되는 것인, 구체예 1 내지 22 중 어느 하나의 방법. 24. 방법은 단백질 프로파일을 생물학적 상태에 적어도 70% 정확도, 적어도 75% 정확도, 적어도 80% 정확도, 적어도 85% 정확도, 적어도 90% 정확도, 적어도 92% 정확도, 적어도 95% 정확도, 적어도 96% 정확도, 적어도 97% 정확도, 적어도 98% 정확도, 적어도 99% 정확도, 또는 100% 정확도로 연관시키는 것인, 구체예 3 내지 23 중 어느 하나의 방법. 25. 방법은 단백질 프로파일을 생물학적 상태에 적어도 70% 민감도, 적어도 75% 민감도, 적어도 80% 민감도, 적어도 85% 민감도, 적어도 90% 민감도, 적어도 92% 민감도, 적어도 95% 민감도, 적어도 96% 민감도, 적어도 97% 민감도, 적어도 98% 민감도, 적어도 99% 민감도, 또는 100% 민감도로 연관시키는 것인, 구체예 3 내지 24 중 어느 하나의 방법. 26. 방법은 단백질 프로파일을 생물학적 상태에 적어도 70% 특이성, 적어도 75% 특이성, 적어도 80% 특이성, 적어도 85% 특이성, 적어도 90% 특이성, 적어도 92% 특이성, 적어도 95% 특이성, 적어도 96% 특이성, 적어도 97% 특이성, 적어도 98% 특이성, 적어도 99% 특이성, 또는 100% 특이성으로 연관시키는 것인, 구체예 3 내지 25 중 어느 하나의 방법. 27. 방법은 적어도 100개의 특유한 단백질, 적어도 200개의 특유한 단백질, 적어도 300개의 특유한 단백질, 적어도 400개의 특유한 단백질, 적어도 500개의 특유한 단백질, 적어도 600개의 특유한 단백질, 적어도 700개의 특유한 단백질, 적어도 800개의 특유한 단백질, 적어도 900개의 특유한 단백질, 적어도 1000개의 특유한 단백질, 적어도 1100개의 특유한 단백질, 적어도 1200개의 특유한 단백질, 적어도 1300개의 특유한 단백질, 적어도 1400개의 특유한 단백질, 적어도 1500개의 특유한 단백질, 적어도 1600개의 특유한 단백질, 적어도 1700개의 특유한 단백질, 적어도 1800개의 특유한 단백질, 적어도 1900개의 특유한 단백질, 또는 적어도 2000개의 특유한 단백질을 확인하는 것인, 구체예 1 내지 26 중 어느 하나의 방법. 28. 복수의 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 초상자성 산화철 나노입자를 포함하는 것인, 구체예 1 내지 27 중 어느 하나의 방법. 29. 샘플은 생체유체인 것인, 구체예 1 내지 28 중 어느 하나의 방법. 30. 생체유체는 혈장, 혈청, CSF, 소변, 눈물, 또는 타액을 포함하는 것인, 구체예 29의 방법. 31. 적어도 3개의 상이한 물리화학적 특성을 가지는 복수의 입자 유형을 선택하는 단계를 포함하는, 단백질 코로나 분석을 위한 패널의 선택 방법. 32. 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하, 표면 화학, 크기, 및 형태로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 구체예 31의 방법. 33. 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하를 포함하는 것인, 구체예 32의 방법. 34. 입자의 패널을 포함하는 조성물로서, 패널은 복수의 입자 유형을 포함하고 복수의 입자 유형은 적어도 3개의 상이한 물리화학적 특성을 포함하는 것인 조성물. 35. 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하, 표면 화학, 크기, 및 형태로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 구체예 35의 방법. 36. 상이한 물리화학적 특성은 표면 전하를 포함하는 것인, 구체예 36의 조성물. 37. 구체예 1 내지 34 중 어느 하나의 패널을 포함하는 시스템. 38. 패널을 포함하는 시스템으로서, 패널은 복수의 입자 유형을 포함하는 것인 시스템. 39. 복수의 입자 유형은 적어도 3개의 상이한 물리화학적 특성을 포함하는 것인, 구체예 38의 시스템. 40. 패널은 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 또는 적어도 12개의 상이한 입자 유형을 포함하는 것인, 구체예 38의 시스템. 41. 복수의 입자 유형은 샘플로부터의 복수의 단백질을 흡착하여 복수의 단백질 코로나를 형성할 수 있는 것인 구체예 38의 시스템. 42. 복수의 단백질 코로나는 소화되어 단백질 프로파일이 측저오디는 것인, 구체예 41의 시스템. 43. 단백질 프로파일은 훈련된 분류기를 사용하여 생물학적 상태와 연관되는 것인, 구체예 42의 시스템.
실시예
다음의 실시예는 본 개시의 일부 측면을 한층 더 기술하기 위해 포함되며, 발명의 범주를 제한하기 위해 사용되지 않아야 한다.
실시예 1
SPMNP 또는 초상자성 산화철 나노입자 (SPION)의 합성
SPMNP 또는 SPION은 문헌의 방법 (Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5875 - 5879 & Langmuir 2012, 28, 3271 - 3278)을 따름으로써 알칼리 공급원으로서 아세트산 나트륨 (NaOAc) 및 정전기 안정화제로서 시트르산 삼나트륨 (Na3Cit)의 존재 하에 용매열법 반응을 통해 200℃에서 FeCl3의 에틸렌 글리콜 (EG)로의 환원에 의해 합성하였다. 과량의 EG는 용매 및 환원제 둘 다로서 작용하였다.
출발 물질: 염화철 (III) 6수화물 (FeCl3 · 6H2O), MW 270.30, CAS# 10025-77-1; 아세트산 나트륨 (NaOAc), MW 82.03, CAS# 127-09-3; 시트르산 삼나트륨 2수화물 (Na3Cit · 2H2O), MW 294.10, CA# 6132-04-3; 에틸렌 글리콜 (EG), MW 62.07, CAS# 107-21-1.
용매열법 반응을 통한 Fe3O4 나노입자에 대한 과정:
(1) 전형적으로, FeCl3 (0.65 g, 4.0 mmol) 및 시트르산 나트륨 (0.20 g, 0.68 mmol)을 먼저 EG (20 mL)에 용해시키고, 그런 후, 아세트산 나트륨 (1.20 g, 14.6 mmol)을 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 160℃에서 격렬하게 교반한 후 테플론-라이닝 스테인레스 강철 오토클레이브 (50 mL 용량)에서 밀봉하였다. (2) 오토클레이브를 200℃에서 가열하여 12시간 동안 유지한 후, 실온으로 냉각되도록 놓아두었다. (3) 검은색 생성물을 자석에 의해 분리하여 탈이온수로 5회를 초과하여 세척하였다. (4) 최종 Fe3O4 나노입자 생성물을 검은색 분말이 되도록 60℃의 진공에서 12시간 동안 건조시키거나 냉동 건조시켰다. Fe3O4@SiO2 코어/쉘 콜로이드를 다음 문헌의 방법에 의해 변형된 Stober 과정을 통해 제조하였다 (J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 28 - 29 & J. Mater. Chem. B, 2013, 1, 4684 - 4691).
출발 물질: 용매열법 반응을 통해 합성된 Fe3O4 나노입자; 테트라에틸 오르토실리케이트 (TEOS), MW 208.33, CAS# 78-10-4; 암모니아 용액 25%; 브롬화 세트리모늄 (CTAB), MW 364.45, CAS# 57-09-0; (3-아미노프로필)트라이에톡시실란 (APTES), MW 221.37, CAS# 919-30-2.
Fe3O4@SiO2 코어/쉘 나노입자에 대한 과정:
(1) 초상자성 Fe3O4 NP를 이전에 보고된 용매열법 반응을 따라 합성하였다 (Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5875 - 5879 & Langmuir 2012, 28, 3271 - 3278). 그런 후 얻어진 Fe3O4 나노입자를 사용하여 2-단계 코팅 과정을 통해 고도로 아민화된 초상자성 메조다공성(mesoporous) 복합 나노입자를 제조하였다. (2) 간단히 설명하면, 0.08 g의 Fe3O4 나노입자를 에탄올 (50 mL), 탈이온수 (1 mL), 및 농축 암모니아 수성 용액 (1.7 mL, 25 중량%)의 혼합물에 균일하게 분산시킨 후, TEOS (140 μL)를 첨가하였다. 40℃에서 6시간 동안 교반한 후, 비정질 실리카 코팅된 초상자성 나노입자 (Fe3O4@SiO2로 표시함)를 얻었고 물로 5회 세척하였다. (3) 그런 후, Fe3O4@SiO2 나노입자를 염기-촉매된 졸-겔 실리칸 반응을 통해 CTAB를 주형으로서 사용함으로써 고도로 아민화된 메조다공성 실리카 쉘로 코팅하였다. 전형적으로, 상기 제조된 Fe3O4@SiO2 나노입자 (5 mg)를 CTAB (0.08 g), 에틸 아세테이트 (0.7 mL), 탈이온수 (113 mL), 및 농축 암모니아 (2.42 mL, 25 중량%)를 함유하는 혼합 용액에 분산시켰다. TEOS (0.18 mL) 및 APTES (0.22 mL)를 300 rpm의 교반 속도로 분산액에 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 반응시킨 후, 생성물을 자석으로 수집하고 각각 물과 에탄올로 반복하여 세척하였다.
(4) 기공-발생 주형 (CTAB)을 제거하기 위하여, 합성된 대로의 물질을 에탄올 (60 mL)로 옮기고 60℃에서 3시간 동안 계속 교반하였다. 계면활성제 추출 단계를 2회 반복하여 CTAB의 제거를 확실하게 하였댜. 주형-제거된 생성물을 에탄올로 2회 세척하여 샌드위치 구조의 고도로 아민화된 초상자성 메조다공성 복합 나노입자 (Fe3O4@SiO2@mSiO2-NH2)를 얻었다.
Fe3O4@중합체 복합 나노입자를 계면활성제-없는 시딩 에멀션 중합 (Langmuir 2012, 28, 3271 - 3278)을 통해 합성하였다.
Fe3O4 나노입자를 용매열법 반응을 통해 합성하였다.
출발 물질: 용매열법 반응을 통해 합성된 Fe3O4 나노입자; 테트라에틸 오르토실리케이트 (TEOS), MW 208.33, CAS# 78-10-4; 3-(트라이메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트 (MPS), MW 248.35, CAS# 2530-85-0; 암모니아 용액 25%; 다이비닐벤젠(DVB), MW 130.19, CAS# 1321-74-0; 스티렌 (St), MW 104.15, CAS# 100-42-5; 메타크릴산 (MAA), MW 86.09, CAS# 79-41-4; 과황산 암모늄 (APS), MW 228.20, CAS# 7727-54-0.
Fe3O4@중합체 코어-쉘 나노입자에 대한 과정:
(1) SPION을 이전에 보고된 용매열법 반응을 따라 합성하였다 (Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5875 - 5879 & Langmuir 2012, 28, 3271 - 3278). (2) Fe3O4@MPS를 변형된 Stober 과정을 통해 제조하였다. 전형적으로, 1 g의 Fe3O4 나노입자를 에탄올 (50 mL), 탈이온수 (2 mL), 및 농축 암모니아 수성 용액 (2 mL, 25 중량%)의 혼합물에 균일하고 분산시키고, 이어서 TEOS (200 μL) 및 MPS (2 mL)를 첨가하였다. 70℃에서 24시간 동안 교반한 후, MPS 코팅된 초상자성 NP를 얻었고 물로 5회 세척하고 냉동 건조시켜서 진갈색 분말을 얻어 -20℃에서 저장하였다. (3) Fe3O4@중합체 나노입자를 계면활성제-없는 시딩 에멀션 중합을 통해 합성하였다. 전형적으로, 100 mg의 Fe3O4@MPS를 125 mL의 탈이온수에 균일하게 분산시켰다. N2로 30분 동안 기포를 발생시킨 후, 2 mL의 St, 0.2 mL의 DVB 및 0.4 mL의 MAA를 Fe3O4@MPS 현탁액에 첨가하였다. 5 mL의 0.2 g의 NaOH 및 40 mg의 APS 수성 용액을 첨가한 후, 결과적으로 얻어진 혼합물을 75℃로 밤새 가열하였다. (4) 냉각시킨 후, Fe3O4@P(St-코-MAA)를 얻었고 물로 5회 세척하고 냉동 건조시켜서 진갈색 분말을 얻었다.
실시예 2
입자 유형의 빌딩 패널
이 실시예는 입자 유형의 빌딩 패널을 기술한다. 약 170개의 총 입자 유형을 포함하는 입자 라이브러리를 구성하였다. 각각의 입자 유형에 대해, 각 입자를 생물학적 샘플과 함께 인큐베이션함으로써 생체분자 코로나를 제조하였다. 단백질 코로나로부터의 단백질체 데이터를, 전기영동을 기반으로 한 정성 분석 및 질량 분석 데이터 및 히트 맵을 기반으로 한 정량 분석을 포함하여, 각 입자 유형에 대해 분석하였다.입자 및 코로나 특성을 기반으로 특정 입자 유형을 선택함으로써 패널을 구성하였다. 입자 유형이 혈장 샘플 중의 단백질에 대해 갖는 범위의 폭을 토대로 입자 패널에 대한 입자 유형을 선택하였다. 도 5는 단백질체 데이터를 생성하는 과정 및 패널 선택에 대한 과정을 도시한다. 도 6에서 나타낸 것과 같이, 입자 특성은 다른 특성에 더불어, 크기/기하학, 전하, 표면 기능성, 자성을 포함한다. 이들 특성의 각각은 입자 유형을 패널에 첨가하기 전 그것의 전체적인 특성화에서 다양한 테스트에 의해 검정될 수 있다. 도 7에서 나타낸 것과 같이, 동적 광산란을 사용하여 2개의 입자 유형: SP-002 (페놀-포름알데하이드 코팅 입자) 및 SP-010 (카르복실레이트, PAA 코팅 입자)의 크기 분포를 특성화하였다. 도 8에서 나타낸 것과 같이, TEM을 사용하여 SP-002 (페놀-포름알데하이드 코팅 입자) (도 8A) 및 SP-339 (폴리스티렌 카르복실 입자) (도 8B)를 포함한 2개의 입자 유형의 크기 및 형태를 특성화하였다. 도 9에서 나타낸 것과 같이, XPS를 사용하여 SP-333 (카르복실레이트), SP-339 (폴리스티렌 카르복실레이트), SP-356 (실리카 아미노), SP-374 (실리카 실란올), HX-20 (실리카 코팅됨), HX-42 (실리카 코팅됨, 아민), 및 HX-74 (PDMPAPMA 코팅됨 (다이메틸아민)를 포함한, 다양한 입자 유형의 표면에 존재하는 화학 그룹을 분석할 수 있다.
실시예 3
독특한 표면 화학을 가진 산화철 NP의 합성 및 특성화
이 실시예는 독특한 표면 화학을 가진 산화철 NP의 합성 및 특성화를 기술한다. 유리 혈장 단백질로부터 입자 단백질 코로나를 분리하고 느슨하게 부착된 단백질을 입자로부터 세척해내기 위하여 반복된 원심분리 또는 막 여과에 대한 필요성 없이, 그러나 또한 그것을 견딜 수 있는, 쉽게 분리될 수 있는 강력한 입자에 대한 필요성을 해결하기 위하여, 단백질 코로나 형성을 위한 초상자성 산화철 NP (SPION)를 개발하였다 (도 23, 상단). 산화철 입자 코어는 자석을 사용하여 30초 미만에 혈장 용액으로부터 입자의 신속한 분리를 용이하게 하였다 (도 4). 이것은 LC-MS/MS 분석을 위해 입자 단백질 코로나의 추출에 필요한 시간을 극적으로 감소시켰다. 더욱이, SPION은 상이한 표면 화학으로 강력하게 변형되어서, 보다 광범위하게 단백질체에 대한 정보를 알아내기 위한 단백질 코로나의 독특한 패턴의 생성을 용이하게 하였다.
상이한 표면 기능화를 가진 3개의 SPION (SP-003, SP-007, 및 SP-011)을 합성하였다 (도 28). SP-003을 테트라에틸 오르토실리케이트 (TEOS)를 사용하여 변형된 Stober 과정에 의해 박층 실리카로 코팅하였다. 폴리(다이메틸 아미노프로필 메타크릴아미드) (PDMAPMA)-코팅된 SPION (SP-007) 및 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)-코팅된 SPION (SP-011)의 합성을 위해, 산화철 입자 코어를 먼저 TEOS 및 3-(트라이메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트를 사용하여 변형된 Stober 과정에 의해 비닐기로 변형시켰다. 다음으로, SP-007 및 SP-011을 제조하기 위하여 각각 N-[3-(다이메틸아미노)프로필] 메타크릴아미드 및 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트를 사용한 유리 라디칼 중합에 의해 비닐기-기능화된 SPION을 표면 변형시켰다.
3개의 SPION을 산란 전자 현미경 (SEM), 동적 광산란 (DLS), 투과 전자 현미경 (TEM), 고해상도 TEM (HRTEM), 및 X-선 광전자 분광법 (XPS)을 포함한 다양한 기법을 사용하여 특성화하여 SPION의 크기, 형태, 및 표면 특성을 평가하였다 (도 23). DLS 측정의 결과는 SP-003, SP-007, 및 SP-011이 각각 약 233 nm, 약 283 nm, 및 약 238 nm의 평균 크기를 가진 것을 보였다. 이것은 3개 SPION이 전부 200 nm 내지 300 nm 범위의 크기의 구형 및 반구형 형태를 가진 것을 나타낸 SEM 측정과 일치하였다. SPION의 표면 전하를 제타 전위 (ζ) 분석에 의해 평가하였고, pH 7.4에서 SP-003, SP-007, 및 SP-011에 대해 각각 -36.9 mV, +25.8 mV, 및 -0.4 mV의 ζ-전위 값을 나타냈다 (표 2-4).
DLS에 의해 측정된, SP-003 SPION의 입자 직경 및 제타 전위
측정 횟수 Z-평균 크기 PDI 제타 전위 (mV)
1 233.8 0.053 -36.4
2 235.3 0.039 -36.8
3 230.4 0.055 -37.4
평균 233.2 nm 0.05 -36.9 mV
DLS에 의해 측정된, SP-007 SPION의 입자 직경 및 제타 전위
측정 횟수 Z-평균 크기 PDI 제타 전위 (mV)
1 284.4 0.049 25.7
2 286.1 0.119 25.9
3 279.7 0.113 25.9
평균 283.4 nm 0.09 +25.8 mV
DLS에 의해 측정된, SP-011 SPION의 입자 직경 및 제타 전위
측정 횟수 Z-평균 크기 PDI 제타 전위 (mV)
1 236.5 0.207 0.08
2 238.9 0.198 -0.67
3 237.6 0.201 -0.74
평균 237.7 nm 0.2 -0.4 mV
이것은 SP-003, SP-007, 및 SP-011이 음성, 양성, 및 중성 표면을 가졌고, 그것은 도 23의 개략도에서 나타낸 것과 같이 각 입자의 표면을 변형하기 위해 사용된 코팅 기능성의 전하와 일치한 것을 나타냈다. 코팅의 두께를 HRTEM을 사용하여 평가하였다. SP-003의 경우, 완전한 비정질 쉘을 두께가 10 nm보다 큰 산화철 코어 주변에서 관찰하였다 (도 23, 5열 상단). SP-007 및 SP-011의 경우, 상대적으로 얇은 (<10 nm) 비정질 특징이 입자 표면에서 관찰되었다 (도 23의 화살표; 5열, 중간 및 바닥). 더불어, XPS를 표면 분석을 위해 수행하였고, 그것은 HRTEM 이미지와 함께, 입자의 각각의 기능성 그룹으로의 성공적인 코팅을 확인시켰다.
실시예 4
패널을 사용한 단백질의 검출 및 단백질 프로파일과 암과의 연관성
이 실시예는 패널을 사용한 단백질의 검출 및 단백질 프로파일과 암과의 연관성을 기술한다. 입자 패널은 다양한 표면 전하 (음이온성 (DOPG (1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-fl'-rac-글리세롤))), 양이온성 (DOTAP (1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄프로판)-DOPE (다이올레오일포스파티딜에탄올아민)), 및 중성 (콜레스테롤을 가진 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC))를 가진 3개의 상이한 교차 반응성 리포좀을 포함한다.
도 17A는 건강한 및 암환자로부터의 샘플의 수집, 샘플로부터 혈장의 분리, 단백질 코로나를 형성하기 위한 미코팅 리포좀과의 인큐베이션, 및 선택된 혈장 단백질의 풍부화를 포함하는 본 출원의 과정을 개략적으로 도시한다. 단백질 코로나 형성은 입자의 물리화학적 특성을 토대로 상이할 수 있다. 도 17B는 3-입자 유형 패널에 대한 코로나 분석 신호를 도시한다. 혈장을 45명의 대상체 (교모세포종, 폐암, 수막종, 골수종, 및 췌장암을 포함한 5개 암의 각각으로부터 8명, 및 5명의 건강한 대조군)로부터 수집하였다. 코로나 분석을 3-입자 유형 패널의 각각의 입자에 대해 생성하였다. 랜덤 포리스트 모델을 1000 라운드의 교차 확인의 각각에서 구성하였다. 강력한 코로나 분석 신호에 대한 강력한 증거가 있다. 초기 탐색 분석을 PCA를 통해 시행하였다. 도 18A 및 도 18B는 초기 단계 암이 증상이 발생하기 전 최대 8년 전에 분리될 수 있음을 보여준다. 골레스탄 코호트는 2004년과 2008년 사이에 50,000명의 건강한 대상체를 등록시켰다. 도 18A에서 나타낸 것과 같이, 등록시로부터 저장된 혈장을 테스트하였다. 등록 후 8년 후에, 대략 1000명의 환자가 암이 발생하였다. 도 18B는 저장된 혈장의 분류를 도시한다. 등록일로부터의 저장 혈장의 코로나 분석은 조사된 15명의 대상체 중 15명에 대해 (3개 암에 대해 각각 5명의 환자) 암을 정확하게 분류하였다. 도 19는 95%의 전체 정확도로 3-입자 유형 코로나 분석을 사용하는 5개 암의 강력한 분류를 도시한다. 데이터는 입자 유형 다양성을 추가하는 것이 성능을 증가시키는 것을 보여준다. (pH 7.4에서) 표면에 음성, 중성, 및 양성 순 전하를 가진 3가지 상이한 리포좀을 사용하였다.
실시예 5
코로나 분석 작업흐름에 의한 신속하고 심층적인 단백질체 분석
이 실시예는 코로나 분석 작업흐름에 의한 신속하고 심층적인 단백질체 분석을 기술한다. 혈장 단백질체의 분석을 위해 다중-입자 유형 단백질 코로나 분석 플랫폼 (도 22B)을 평가하기 위하여, SPION을 8명의 대장암 (CRC) 암 대상체로부터 조합한 풀링된 혈장 샘플로 테스트하였다. 이들 3개의 입자 유형의 각각을 먼저 혈장 샘플과 약 1시간 동안 약 37℃에서 코로나 형성을 위해 인큐베이션한 후, 미결합 단백질로부터 입자의 자석-기반 정제를 수행하였다 (3회 동안 사이클당 6분씩). 그런 후 입자 상에 결합된 단백질을 용해시키고, 소화시키고, 정제하고 용출시켰다; MS 분석 전에 이들 단계는 함께 약 2-4시간 걸린다. 특히, 이 제조 작업흐름은 96개의 코로나 샘플의 배치에 대해 총 약 4-6시간만이 필요하였다.
MS 분석 및 데이터 처리 후에, 결과적으로 얻어진 MS2 펩타이드-스펙트럼 매치 (PSM)를 사용하여 각 입자 유형 코로나에 존재하는 단백질을 확인하였다. 병행하여, 단백질을 또한 순수 혈장 샘플로부터 직접, 입자 코로나 형성 없이 검출하였다. 샘플로부터 확인된 단백질을 MS 측정된 또는 추론된 혈장 단백질 농도의 편집된 데이터베이스와 비교하여, 관찰된 단백질 대 공개된 단백질 농도의 데이터베이스 값을 도표화함으로써 입자 코로나 또는 혈장에 의한 적용범위의 깊이 및 정도를 조사하였다 (도 24). 먼저, 가장 풍부한 단백질로부터 가장 풍부하지 않은 단백질 순으로 거의 11차 크기를 커버하는 데이터베이스로부터의 1,255개의 단백질을 도표화하였다. 실험적으로 평가한 샘플 (순 혈장 대비 SP-003/SP-007/SP-011 입자 코로나)의 각각에 대해, 데이터베이스에 매칭시킨 단백질을 유사하게 도표화하였다. 도 24에서 알 수 있는 것과 같이, 데이터베이스-매칭된 단백질에 대한 농도 범위에 의해 규정된 측정된 혈장 단백질체의 동적 범위는 순 혈장의 경우에 대한 것 (40 mg/mL 내지 1.2 ng/mL)보다 입자 코로나의 경우 2-배 더 컸고 (예컨대, SP-007의 경우 40 mg/mL 내지 0.54 ng/mL), 100 ng/mL 아래로 존재하는 풍부함이 낮은 (입자의 경우 842 및 순 혈장의 경우 84) 단백질의 수는 10-배 증가하였다. 입자 상에서 검출된 최저 단백질보다 낮은 농도를 가지는 데이터베이스에서 주석이 달린 단백질은 단지 12개였다. 더불어, 입자 유형 코로나의 각각에 대한 특유한 단백질의 총 수 (약 1,000)는 표 5에서 분명하게 입증되는 바, 순 혈장에 대해 관찰된 것 (<500)보다 더 크다 (>2배).
SP-003, SP-007, 및 SP-011 입자 대비 순 혈장에 의해 확인된 단백질의 적용범위
그룹 총 단백질 데이터베이스에 대한 매칭 데이터베이스의 분율
혈장 492 272 0.55
SP-003 1062 387 0.36
SP-007 991 383 0.39
SP-011 1062 393 0.37
더불어, 문헌 MS 편집과 비교하여 이전에 관찰되지 않았던 단백질의 분율은 순 혈장 (45%)과 비교하여 입자의 경우 더 컸다 (61-64%). 달리 말하면, 공개된 데이터베이스에서 이전 MS 농도로 주석이 달리지 않은 단백질이 순 혈장에서 관찰된 것보다 더 많이 입자 코로나에서 확인되었다. 데이터베이스와 중복되는 입자 단백질 확인의 도표는 상이한 입자 유형이 혈장 단백질의 차등 하위세트를 선택하는 것을 확인해준다. 이것은 코로나의 단백질 조성을 주로 결정하는 3개의 SPION 입자 유형의 상이한 표면 특성으로 인한 것일 수 있다.
측정된 동적 범위를 압축하는 입자의 능력을 평가하기 위해, 측정된 및 확인 된 단백질 특징 강도를 동일한 단백질의 농도에 대해 공개된 값과 비교하였다. 먼저, 각 단백질에 대해 결과적으로 얻어진 펩타이드 특징 (도 24에서 제시됨)을 단백질에 대해 모든 가능한 특징의 최대 MA-측정 강도로 선택하고 (정확한 단일 동위원소 피크 값에 대해 OpenMS MS 데이터 처리 도구를 사용함), 그런 후 강도를 그 동일한 단백질에 대한 공개된 풍부함 수준에 반해 모델화하였다 (도 25). 회귀 모델 기울기와 측정된 데이터의 강도 범위를 비교함으로써, 입자 코로나는, 도 24와 유사하게, 더 낮은 풍부함 (측정 또는 보고됨)에서 혈장보다 많은 단백질을 함유한다. 그런 측정된 값의 동적 범위를 혈장 측정과 비교하여 입자 측정에 대해 압축하였다 (회귀 모델의 기울기가 감소함). 이것은 입자가 단백질의 절대 농도, 그것의 입자에 대한 결합 친화도, 및 그것의 인접한 단백질과의 상호작용의 조합에 기인할 수 있는, 혈장의 원래의 동적 범위와 비교하여 결과적으로 얻어진 코로나의 풍부함에 대한 측정된 동적 범위를 효과적으로 압축할 수 있다는 이전의 관찰과 일치하였다. 상기 결과는 모두 다중-입자 유형 단백질 코로나 전략이 광범위한 스펙트럼의 혈장 단백질, 특히 종래의 단백질체 기법에 의해 신속한 검출이 어려운 풍부함이 낮은 것들의 확인을 용이하게 하였음을 나타낸다.
입자 코로나 MS 검정을 사용하여 단백질 확인의 견고함을 평가하기 위하여, 동일한 풀링된 CRC 혈장 샘플로부터 개별 단백질 코로나 샘플을 생성하기 위한 3개의 입자 유형 패널을 사용하여 전체-검정 삼중복제를 수행하였다. 임의의 하나로부터 2개의 모든 그룹, 3개의 단일 그룹에 이르는 범위의 입자 유형의 각각의 조합에 대해, 조합에 의해 열거된 특유한 단백질의 수를 표 6에 제시한다.
SP-003, SP-007 및 SP-011 입자의 조합으로부터의 단백질 적용범위의 요약
입자 유형 조합 단독 하나 임의의 하나 전부 3개
SP-003 1058 ± 27.8 1313 844
SP-007 961 ± 87.4 1277 660
SP-011 1022 ± 37.8 1249 821
SP-003:SP-007 1412 ± 18.9 1816 1052
SP-003:SP-011 1272 ± 22.5 1595 973
SP-007:SP-011 1372 ± 27.3 1746 1026
SP-003:SP-007:SP-011 1576 ± 14.5 2030 1150
'단독 하나' 열에서, 단백질 수는 3개의 복제물의 각각을 독립적으로 사용하여 개발한 후 모든 조합 수에 대해 평균 및 표준 편차를 구하였다. 알 수 있는 것과 같이, 입자 패널의 입자 유형의 수가 증가했을 때 더 많은 단백질을 발견하였고, 3개 입자 유형의 그룹에 의해 1,500개를 넘는 특유한 단백질이 발견되었다 (그 중 65개는 하기 표 7에서 열거되는 것과 같이 FDA-허가된/승인된 바이오마커임). "임의의 하나' 복제물 열에서, 단백질 수는 입자 유형 복제물 단백질 목록의 결합을 사용하여 개발되었다. '전부 3개' 복제물 열에서, 단백질 수는 입자 유형 복제물 단백질 목록의 교차점을 사용하여 개발되었다. 확인된 단백질의 입자 복제물 중복의 추가 척도로서, 세트 유사성에 대한 메트릭인 쟈카드 지수(Jaccard Index)를 각 쌍별 비교를 위해 계산하였다. SP-003, SP-007, 및 SP-011에 대한 값은 각각 0.74 ± 0.018, 0.65 ± 0.078, 및 0.76 ± 0.019 (평균 ± sd)였다. 주어진 MS 샘플에서 단백질 함량의 계산은 MS2 데이터 수집의 확률론적 본성의 영향을 받으며 샘플 내에서 나타난 또는 샘플간에 공통적으로 공유된 단백질의 과소계산을 나타낼 수 있다. 공유된 MS1 특징에 대한 PSM 맵핑은 이런 조직을 경감시킬 수 있는 한 접근법을 나타내며 미래의 분석을 위해 개발될 것이다.
FDA-허가된/승인된 바이오마커
UP_승인 UP_명칭 부류
P02647 APOA1_HUMAN 입자
P00747 PLMN_HUMAN 입자
P02671 FIBA_HUMAN 입자
P02675 FIBB_HUMAN 입자
P04114 APOB_HUMAN 입자
P02775 CXCL7_HUMAN 입자
P02768 ALBU_HUMAN 입자
P02679 FIBG_HUMAN 입자
P0C0L4 CO4A_HUMAN 입자
P0C0L5 CO4B_HUMAN 입자
P61626 LYSC_HUMAN 입자
P0DOY2 IGLC2_HUMAN 입자
P01024 CO3_HUMAN 입자
P08519 APOA_HUMAN 입자
P04075 ALDOA_HUMAN 입자
P00738 HPT_HUMAN 입자
P00736 C1R_HUMAN 입자
P00488 F13A_HUMAN 입자
P02765 FETUA_HUMAN 입자
P01023 A2MG_HUMAN 입자
P61769 B2MG_HUMAN 입자
P01009 A1AT_HUMAN 입자
P01834 IGKC_HUMAN 입자
P00751 CFAB_HUMAN 입자
P02746 C1QB_HUMAN 입자
P07225 PROS_HUMAN 입자
P02751 FINC_HUMAN 입자
P00450 CERU_HUMAN 입자
P02747 C1QC_HUMAN 입자
P01031 CO5_HUMAN 입자
P05155 IC1_HUMAN 입자
P09871 C1S_HUMAN 입자
P02790 HEMO_HUMAN 입자
P02745 C1QA_HUMAN 입자
P01034 CYTC_HUMAN 입자
P08697 A2AP_HUMAN 입자
P02741 CRP_HUMAN 입자
P17936 IBP3_HUMAN 입자
P01008 ANT3_HUMAN 입자
P04278 SHBG_HUMAN 입자
P19652 A1AG2_HUMAN 입자
P02787 TRFE_HUMAN 입자
P02786 TFR1_HUMAN 입자
P02763 A1AG1_HUMAN 입자
P04275 VWF_HUMAN 입자
P07195 LDHB_HUMAN 입자
P00338 LDHA_HUMAN 입자
P30613 KPYR_HUMAN 입자
P02766 TTHY_HUMAN 입자
P09972 ALDOC_HUMAN 입자
O75874 IDHC_HUMAN 입자
P06858 LIPL_HUMAN 입자
P05164 PERM_HUMAN 입자
P05121 PAI1_HUMAN 입자
P00740 FA9_HUMAN 입자
P05543 THBG_HUMAN 입자
P04070 PROC_HUMAN 입자
P08833 IBP1_HUMAN 입자
P00742 FA10_HUMAN 입자
P07477 TRY1_HUMAN 입자
P07478 TRY2_HUMAN 입자
P02753 RET4_HUMAN 입자
P43251 BTD_HUMAN 입자
P24666 PPAC_HUMAN 입자
P05160 F13B_HUMAN 입자
P01023 A2MG_HUMAN 혈장
P02768 ALBU_HUMAN 혈장
P02671 FIBA_HUMAN 혈장
P01008 ANT3_HUMAN 혈장
P01024 CO3_HUMAN 혈장
P00450 CERU_HUMAN 혈장
P02775 CXCL7_HUMAN 혈장
P02787 TRFE_HUMAN 혈장
P08697 A2AP_HUMAN 혈장
P01031 CO5_HUMAN 혈장
P0C0L4 CO4A_HUMAN 혈장
P0C0L5 CO4B_HUMAN 혈장
P01009 A1AT_HUMAN 혈장
P00736 C1R_HUMAN 혈장
P02647 APOA1_HUMAN 혈장
P02751 FINC_HUMAN 혈장
P09871 C1S_HUMAN 혈장
P00738 HPT_HUMAN 혈장
P04114 APOB_HUMAN 혈장
P00740 FA9_HUMAN 혈장
P0DOY2 IGLC2_HUMAN 혈장
P02675 FIBB_HUMAN 혈장
P00751 CFAB_HUMAN 혈장
P05543 THBG_HUMAN 혈장
P02679 FIBG_HUMAN 혈장
P02790 HEMO_HUMAN 혈장
P05155 IC1_HUMAN 혈장
P02765 FETUA_HUMAN 혈장
P61769 B2MG_HUMAN 혈장
P01834 IGKC_HUMAN 혈장
P07225 PROS_HUMAN 혈장
P00338 LDHA_HUMAN 혈장
P07195 LDHB_HUMAN 혈장
P00488 F13A_HUMAN 혈장
P19652 A1AG2_HUMAN 혈장
P00747 PLMN_HUMAN 혈장
P02747 C1QC_HUMAN 혈장
P08519 APOA_HUMAN 혈장
P43251 BTD_HUMAN 혈장
P02763 A1AG1_HUMAN 혈장
P02741 CRP_HUMAN 혈장
P04275 VWF_HUMAN 혈장
P02746 C1QB_HUMAN 혈장
P17936 IBP3_HUMAN 혈장
P02745 C1QA_HUMAN 혈장
P00742 FA10_HUMAN 혈장
P04075 ALDOA_HUMAN 혈장
P01034 CYTC_HUMAN 혈장
P05160 F13B_HUMAN 혈장
P02753 RET4_HUMAN 혈장
P04070 PROC_HUMAN 혈장
P06744 G6PI_HUMAN 혈장
P02766 TTHY_HUMAN 혈장
P61626 LYSC_HUMAN 혈장
P05062 ALDOB_HUMAN 혈장
P06276 CHLE_HUMAN 혈장
P04278 SHBG_HUMAN 혈장
P02786 TFR1_HUMAN 혈장
동적 범위. 3-입자 유형 패널을 광범위한 동적 범위의 단백질 농도를 가로질러 샘플 중의 단백질을 검정하는 능력에 대해 평가하였다. 질량 분석에 의해 확인된 단백질에 상응하는 특징 강도를 동일한 농도에서 동일한 단백질에 대한 다른 검정에 의해 측정된 값과 비교하였다. 질량 분석 분석 및 데이터 처리 후에, MS2 펩타이드-스펙트럼 매치 (PSM)를 사용하여 입자 패널의 독특한 입자 유형의 코로나에 존재하는 펩타이드 및 회합된 단백질을 확인하였다. 병행하여, 펩타이드를 또한 프로테오그래프 작업흐름을 통한 코로나 분석을 위한 3-입자 유형 패널을 사용하지 않고 직접 혈장 샘플에서 검출하였다. 정확한 단일동위원소 피크 값에 대한 OpenMS MS 데이터 처리 도구를 사용하여 측정되는 바, 모든 관찰된 특징의 최대 MS-측정된 강도를 가지는 결과적으로 얻어지는 펩타이드 특징을 각 단백질에 대해 선택하였다. 그런 후 MS-측정된 강도를 동일한 단백질에 대한 비슷한 공개된 풍부함 수준에 반해 모델화하였다. 도 25는 다른 방법을 사용하여 측정된 동일한 단백질의 혈장 단백질 및 농도에 비해 3-입자 유형 패널의 각 입자 유형에 대해 독특한 나노입자 유형으로부터의 독특한 코로나의 단백질의 최대 강도 사이의 상관관계를 도시한다. 회귀 모델 기울기 및 측정된 데이터의 강도 범위에 의해 나타난 것과 같이, 입자 코로나는 혈장보다 낮은 풍부함에서 더 많은 단백질 히트를 함유하였다. 추가적으로, 그런 측정된 값들의 동적 범위를, 회귀 모델의 감소된 기울기에 의해 나타난 것과 같이, 혈장 측정과 비교하여 입자 측정에 대해 압축하였고, 입자가 혈장에서와 비교하여 코로나에서의 단백질 풍부함의 측정된 동적 범위를 효과적으로 압축하였음을 보여주었다. 이것은 절대 단백질 농도, 입자에 대한 단백질 결합 친화도, 및 인접한 단백질과의 단백질 상호작용의 조합에 기인한 것일 수 있다. 이들 결과는 독특한 입자 유형에 상응하는 독특한 코로나의 단백질의 풍부함에 대해 다중-입자 유형 패널을 사용하는 본원에 개시된 방법이 광범위한 스펙트럼의 혈장 단백질, 특히 종래의 단백질체 기법에 의해서는 신속한 검출이 어려운 낮은 풍부함의 단백질의 확인을 용이하게 했음을 나타낸다.
실시예 6
코로나 분석 검정의 정밀도
이 실시예는 코로나 분석 검정의 정밀도를 기술한다. 검정의 반복성 및 재현성의 척도인 정밀도를 동일한 조건 하의 다중 측정을 비교하고 개별 측정간 가변성을 측정함으로써 평가하였다. 입자 단백질 코로나 분석 프로테오그래프 작업흐름의 재현성을 조사하기 위하여, 펩타이드 MS 특징 강도를 추출하여 3개의 입자 유형의 각각에 대한 3개의 전체 검정 복제물로부터 비교하였다. 각 복제물에 대한 미가공 MS 파일을 프로그램의 openMS 제품군으로부터의 msconvert.exe 유틸리티를 사용하여 표준, 상호교환 가능한 MS 파일 형식인 mzML 형식으로 전환하였다. 또한 openMS 처리 파이프라인을 사용하여, MS1 특징을 미가공 데이터로부터 추출하여 중복하는 보유 시간 및 mz 값에 의해 그룹별로 정렬하였다. 3개의 복제물의 각각으로부터의 특징을 함유한 그룹을 선택하고, 클러스터링 알고리즘의 품질 점수를 토대로 하위 십분위를 제거하기 위해 여과하였다 (특징 그룹의 90%는 후속 정밀도 분석을 위해 보류함). SP-003, SP-007, 및 SP-011 나노입자의 경우, 각각 총 2,744, 2,785, 및 3,209개의 클러스터링된 특징 그룹을 정밀도 분석에 사용하였다. 이들 특징 그룹에 대한 각각의 복제물에 대한 로그-변환된 미가공 강도의 분포를 도 26에서 도표화하며 표지된 패널에 각 입자 유형의 값을 나타냈다. 도 26에서 나타낸 것과 같이, 각 입자 유형에 대한 특징 데이터는 고도로 재현 가능하였고 이런 재현성은 고강도 및 저강도 특징 둘 다에 걸쳐 일치하였다.
미가공 데이터의 시각적 검사를 뛰어넘는, 성능의 보다 정량적인 평가를 위하여, 그룹 특징 강도의 분위수 표준화 후에 입자 코로나의 전체 정밀도를 추정하였다. 이런 표준화 방법은 모든 비교된 분포가 동일해야 한다는 가정을 토대로 하고 따라서 각각의 비교된 분포에 대해 강도를 조정한다. 이런 가정은 입자 유형 자체의 물리적 특징의 재현성이 주어지고 이들 입자의 별도의 분석 (예컨대, X-선 광전자 분광법, 고해상도 투과 전자 현미경, 및 다른 분석 방법을 사용함)으로부터 타당하다. 표준화된 값으로, 표준 편차를 평가하고 변동 계수 (CV)를 로그-처리된 데이터의 적절한 변환을 사용하여 측정하였다. 각각의 입자에 대해, 중앙 CV (분위수 표준화된 CV의 퍼센트 또는 QNCV%)를 표 8에 제시한다. 이 결과는 입자-측정된 단백질 MS 특징 강도가 타당한 작은 연구에서 상대적으로 작은 차이를 검출하기 위해 관찰된 수천 개의 MS 특징 강도 전체에서 충분한 정밀도를 가진 것을 입증한다. 예를 들어, 25%의 CV가 주어지면, 본페로니-보정 유의성으로 2-배 변화를 검출할 수 있는 검정력은 대략 100%였다.
입자 코로나의 전체 정밀도를 분위수 표준화를 사용하여 그룹 특징 강도를 표준화함으로써 추정하였고, 이것은 모든 비교된 분포는 동일해야 한다는 사전 가정을 만들고 각각의 비교된 분포에 대한 강도를 적절하게 조정한다. 표준화된 값으로, 표준 편차를 평가하였고 변동 계수 (CV)를 로그-처리된 데이터의 적절한 변환을 사용하여 측정하였다. 각각의 입자 유형에 대해, 중앙 CV (분위수 표준화된 CV의 퍼센트 또는 QNCV%)를 표 8에 제시한다. 낮은 변동 계수 (CV)는 고도의 검정 정밀도를 나타냈다.
입자 단백질 코로나-기반 프로테오그래프 작업흐름의 정밀도 평가를 위한 중앙 QNCV%
입자 중앙 QNCV% 카운트
SP-003 23 2744
SP-007 29 2785
SP-011 20 3209
이 결과는 입자-측정된 단백질 MS 특징 강도가 타당한 작은 연구에서 상대적으로 작은 차이를 검출하기 위해 관찰된 수천 개의 MS 특징 강도 전체에서 충분한 정밀도를 가졌음을 입증하였다.
실시예 7
코로나 분석 검정의 정확도
이 실시예는 코로나 분석 검정의 정확도를 기술한다. 방법의 정확도는 바이오마커 발견 및 확증 연구에서 샘플 그룹간 진정한 차이를 검출하기 위해 충분히 강력해야 한다. 코로나 분석 검정의 정확도를 코로나 분석 검정 결과를 다른 방법에 의해 얻어진 결과와 비교함으로써 측정하였다. 코로나 분석 검정의 정확도를 평가하기 위하여, SP-007 나노입자를 사용하여 스파이크 회복 연구를 수행하였다. C-반응성 단백질 (CRP)을 그것의 내인성 수준의 측정을 토대로 분석에 대해 선택하였다. CRP에 대한 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)-측정된 내인성 혈장 수준을 사용하여, 공지된 양의 정제된 단백질 (방법 참조)을 스파이킹하여 테스트 가능한 다수의 내인성 수준을 이루었다. 스파이킹 후 CRP 수준을, 1x (스파이킹되지 않음), 2x, 5x, 10x, 및 100x 샘플에 대해 각각 4.11, 7.10, 11.5, 22.0, 및 215.0 μg/mL인 것으로 ELISA에 의하여 실험적으로 측정하였다. 추출한 MS1 특징 강도를 SP-007 입자 상에서 MS에 의해 검출된 4개의 표시된 CRP 트립신 펩타이드 대 CRP 농도에 대해 도표화하였다 (도 14A). 도 30은 또한 4개의 상이한 펩타이드에 대한 스파이크-회복 실험에서 SP-007 입자 상의 CRP 단백질에 대한 측정의 정확도를 보여준다. MS1 특징 강도는 CRP의 스파이킹되지 않은 1x 농도에서 펩타이드 중 2개에 대해 검출할 수 없다. 피팅 라인은 주어진 특징의 스파이크 강도를 사용하는 선형 모델이었다.
전부 4개의 CRP 트립신 펩타이드에 회귀 모델을 피팅하는 것은 코로나 MS 신호 강도의 반응 대비 ELISA 혈장 수준에 대해, 완벽한 분석 성능인 것으로 간주될 수 있을 1의 기울기에 밀접한 0.9의 기울기 (95% CI 0.81 - 0.98)를 초래하였다. 대조적으로, 1,308개의 다른 (스파이킹되지 않은) MS 특징에 대패 피팅된 유사한 회귀 모델이 5개의 혈장 샘플 중 적어도 4개에서 확인되었고, 그것들에 대해 관련된 MS 특징으로부터의 신호는 샘플을 가로질러 달라지지 않아야 하고, -0.086 (95% CI -0.1 - -0.068)의 기울기를 가졌다. 이들 결과는 샘플간 차이를 정확하게 기술하는 그 입자 유형의 능력이 비슷한 연구에서 잠재적인 마커를 정량화하기 위한 유용한 도구를 제공할 것임을 나타냈다. 만약 단백질 수준이 일부 요인으로 인해 샘플 중에서 변화한다면, 본원에 개시된 방법은 입자 패널의 입자 유형에 결합된 단백질의 유사한 수준 변화를 검출할 것이고, 이것은 임의의 주어진 검정에서 효과적일 존재하는 입자 유형의 중요한 특성이다. 더욱이, 스파이킹된-단백질 펩타이드 특징의 반응은 또한 적절한 보정으로, 입자 단백질 코로나 방법이 바로 그 상대적 정량화와는 반대로 절대 분석물 수준을 특정하기 위해 사용될 수 있을 것임을 시사한다.
실시예 8
NSCLC 샘플 및 건강한 대조군의 단백질체 분석.
이 실시예는 NSCLC 샘플 및 건강한 대조군의 단백질체 분석을 기술한다. 코로나 분석 플랫폼의 잠재적 유용성을 입증하기 위하여, 플랫폼의 능력을 단일 입자 유형, SP-007, 및 56명의 대상체 (4기 NDCLC인 28명 및 28명의 연령- 및 성별-매칭된 대조군)로부터의 혈청 샘플을 사용하여 평가하여 그룹간 차이를 관찰하였다. 선택된 대상체 샘플은 그룹간 상이한 잠재적 MS 특징을 확인하기 위한 타당하게 균형잡힌 연구를 나타냈다. 대상체의 연령 및 성별 특징을 표 6에 요약하며 질환 상태 및 동반 질환을 포함한 대상체 주석에 대한 전체 데이터를 표 9에 편집한다.
혈청 샘플이 얻어진 환자에 대한 성별 및 연령 정보
부류 성별 평균 연령 Sd 연령 수
대조군 여성 71.1 7.7 19
남성 72.4 11.1 9
질환 여성 70.7 7.5 19
남성 15.6 13.6 9
MS1 특징의 수집 및 여과 후 그것의 강도의 log2 변환 후에, 데이터세트를 부류와 관계 없이 중앙값으로 조정하였다.
도 29는 모든 56명의 대상체 데이터베이스에 대해 표준화된 강도 분포를 보인다. NSCLC 대 대조군 연구로부터의 전부 56개의 샘플 MS 미가공 데이터 파일을 OpenMS 파이프라인 스크립트에 의해 처리하여 MS1 특징 및 그것의 강도를 추출하였고 그것들을 명시된 내성 내에서 중복하는 mz 및 RT 값을 토대로 특징 그룹으로 모았다. 1) 비교 팔의 적어도 하나로부터의 그룹에서 특징의 적어도 50% 존재를 가지고 2) 25번째 백분위수를 초과하는 특징 그룹 클러스터 품질을 가진 그런 특징 그룹만을 유지하였다. 유지된 특징을 부류와 관계 없이 중앙값 표준화하였고 후속 일변량 분석 비교에 사용하였다. 분포 검사에서 이상점은 없었고 모든 데이터세트를 일변량 분석을 위해 유지하였다.
검사에 의해 어떠한 이상점 데이터세트가 있는 것으로 나타나지 않았다. 부류간 특징 그룹 강도의 일변량 비교를 비-파라미터, 윌콕슨 테스트 (양측)로 수행하였다. 비교를 위해 그 결과의 p-값을 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 테스트를 위해 교정하였다. 0.05의 조정된 p-값 컷오프를 사용하여, 총 7개의 특징 그룹은 도 27에서 요약된 것과 같이, 통계학적 유의성을 입증하였다.
NSCLC-질환 및 대조군 그룹 사이에서 차등적으로 풍부한 것으로서 확인된 전부 5개의 단백질은 실제로 NSCLC 자체가 아니라면 이전에 암에 연루되었다. PON1, 또는 파라사나제(paraoxanase)-1은 위험 요인으로서 상대적으로 공통된 작은 대립유전자 변이체 (Q192R)의 포함을 포함하여 폐암에서 복잡한 패턴을 가지고 있다. 단백질 수준에서, PON1은 폐 선암종에서 완만하게 감소된다. SAA1은 MS-관련 연구에서 NSCLC에서 과다발현되는 것으로 밝혀진 급성 단계 단백질이고, 확인된 펩타이드는 질환에 걸린 대상체에서 5.4-배 증가하는 것으로 나타났다. 매트리좀(matrisome) 인자 테낙신 C (TENA)는 원발성 폐 종양에서 증가되고 정상 조직과 비교하여 림프절 전이와 관련된 것으로 나타났으며, 관련된 MS 특징은 이 연구에서 2배 증가한 것으로 나타났다. 신경 세포 부착 분자 1 (NCAM1)은 폐 신경내분비 종양을 진단하기 위한 마커로서 작용한다. FIBA 펩타이드를 폐암의 진행성 진행과 관련이 있는 증가된 수준으로 MS 분석에 의해 확인하였다. 특히 주의할 것은 대조군과 질환에 걸린 대상체 사이에서 차이를 보이는 2개의 알 수 없는 특징, Group2 및 Group7이다. Group2는 56명의 대상체 중 54명에게서 나타났고 질환에 걸린 대상체에서 완만한 33% 감소가 있었다. Group7은 질환에 걸린 대상체에서만 나타났다 (부류의 28명의 구성원 중 14명에서). 이들 결과는 상이한 질환 상태에 대해 알고 있는 및 알 수 없는 마커를 확인하는 것을 보조하는 입자 코로나의 잠재적 유용성을 입증하였다.
실시예 9
샘플 중의 단백질을 검정하기 위한 입자 패널
이 실시예는 샘플 중의 단백질을 검정하기 위한 10-입자 유형 입자 패널을 예시한다. 표 10에 제시된 이 입자 패널은 크기, 전하, 및 중합체 코팅이 상이한 10개의 독특한 입자 유형을 포함한다. 이 입자 패널의 모든 입자 유형은 초상자성이다. 하기 제시한 패널을 샘플 중의 단백질을 검정하기 위하여 사용하였다.
10개의 입자 유형 입자 패널
입자 ID 입자 설명 평균 DLS 직경(nm) 평균 제타 전위 (mV)
SP-003 두꺼운 실리카 코팅된 SPION 262 -36.9
SP-006 N-(3-트라이메톡시실릴프로필)다이에틸렌트라이아민 코팅됨 232 20.9
SP-007 PDMAPMA-코팅된 SPION 259 25.8
SP-010 카르복실화된, PAA 366 -47.9
SP-353 아미노 표면 마이크로입자, 0.4-0.6 μm 606 27.2
SP-333 카르복실레이트 마이크로입자,
계면활성제 없음		 1300 -28.5
SP-339 폴리스티렌 카르복실 기능화됨 410 -31.4
SP-347 실리카 코팅됨, 200 nm 281 -21.8
SP-365 실리카 231 -39.0
SP-373 덱스트란 기반 코팅, 0.13 μm 169 -0.5
V1 패널의 단백질 적용범위. 임상 샘플 세트에서 다중 샘플 전체에서 볼 수 있는 총 단백질 그룹 적용범위를 평가하기 위하여, 16명의 개인으로부터의 혈장 샘플을 표 10에 제시한 10개의 독특한 입자 유형의 패널에 대해 본원에 기술된 샘플 제조, MS 데이터 획득 및 MS 데이터 분석 방법을 사용하여 평가하고 VI 패널로 언급하였다. 비-소세포 폐 암종 (NSCLC) 환자와 건강한 개체의 혼합 (각각 n = 8명)을 사용하여 본원에 기술된 방법을 사용하는 분석 및 확인을 위해 건강한 및 암 세포 둘 다에 존재하는 단백질 및 단백질 그룹의 다양한 세트를 제공한다. 1% FDR (단백질 및 펩타이드) 비율에서, 총 2,009개의 단백질 그룹을 효율적으로 확인하였다. 비교를 위해, 이전에 언급된 공개된 연구에서, 4,500개의 단백질 그룹을 완료하기까지 수 주가 걸릴 수 있는, 70개 이상의 단계 및 샘플당 30개 이상의 MS 분획으로 구성된 복잡한 작업흐름으로 16개의 개별 혈장 샘플 전체에서 검출하였다.
실시예 10
단백질 검정을 위한 10-입자 유형 입자 패널
이 실시예는 본원에서 기술된 것과 같이, 생체분자 코로나 분석을 사용하여 단백질을 검정하는 방법을 위한 10-입자 유형 입자 패널의 개발을 예시한다.
입자 스크리닝. 안내된 입자 첨가를 통해 그것의 적용범위를 확장시키는 코로나 분석 플랫폼의 능력을 입증하기 위하여, 독특한 물리화학적 특성을 가진 43개의 입자 유형으로부터의 생체분자 코로나를 본원에 개시된 3-입자 유형 입자 패널과 유사한 방식으로 스크리닝하였다.
스크리닝용 입자
입자 유형 입자 설명 DLS 직경 (nm) DLS PDI 제타 전위 (mV)
SP-001 카르복실화된 시트레이트 코팅됨 374 0.23 -34.0
SP-002 페놀-포름알데하이드 수지 코팅됨 335 0.39 -29.0
SP-003 실리카 코팅된 SPION 233 0.05 -36.9
SP-004 폴리스티렌 코팅됨 411 0.32 -45.7
SP-005 카르복실레이트 폴리(스티렌-코-메타크릴산) 247 0.19 -36.5
SP-006 N-(3-트라이메톡시실릴프로필)다이에틸렌트라이아민 코팅됨 232 0.30 20.9
SP-007 PDMAPMA-코팅된 SPION 283 0.09 25.8
SP-008 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실산 코팅됨 426 0.43 -34.5
SP-009 PVBTMAC 코팅됨 229 0.11 35.9
SP-010 카르복실화된, 폴리아크릴산 366 0.23 -47.9
SP-016 산화 티타늄 (IV) 코팅됨 1623 0.92 -32.1
SP-019 페닐보론산 코팅됨 305 0.44 -36.4
SP-047 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-벤질아민) 코팅됨 1255 0.54 18.1
SP-060 말레이미드 베이스 표면 302 0.15 -40.8
SP-064 폴리(N-[3-(다이메틸아미노)프로필]메타크릴아미드-코-[2-(메타크릴로일옥시)에틸]다이메틸-(3-설포프로필)암모늄 하이드록사이드, P(DMAPMA-co-SBMA) 코팅됨 302 0.25 27.7
SP-065 변형된 무작위 30개 뉴클레오타이드 ssDNA 364 0.21 -43.5
SP-066 더 작은 크기의 카르복실화된 시트레이트 코팅됨 210 0.25 -35.3
SP-369 카르복실화된, 원래의 코팅, 50 nm 104 0.15 -31.5
SP-373 덱스트란 기반 코팅, 0.13 μm 169 0.07 -0.6
SP-374 더 낮은 산성을 가진 실리카 실란올 코팅됨 225 0.11 -25.6
SP-389 BioMag®플러스 맥아 아글루티닌 코팅된 마이크로입자 3514 0.97 -21.6
SP-390 올레산-친수성/소수성 표면 98 0.10 -38.0
SP-391 희토류 도핑된 인 입자 130 0.15 -16.0
SP-392 산화 가돌리늄 나노분말 코팅됨 1199 0.82 -4.9
SP-393 친-올리고뉴클레오타이드 Apostle MiniMaxTM 자성 나노입자 614 0.23 -41.9
SP-394 아지드 그룹 코팅된 산화철 나노입자, 30 nm 64 0.11 -17.0
SP-397 DEAE 전분 코팅됨 99 0.18 13.6
SP-398 폴리(말레산-코-올레핀) 양친매성 코팅 393 0.31 -27.8
SP-399 폴리비닐 알코올 코팅됨 163 0.10 -8.9
SP-300 폴리(4-비닐피리딘) (P4VP) 코팅됨 177 0.21 -19.3
SP-301 폴리-다이알릴다이메틸아민 코팅됨, 강력한 음이온 교환기 114 0.14 24.6
SP-305 아민 작은 클러스터 75 0.17 -9.5
SP-406 붕소화된 나노분말 표면 491 0.45 -40.7
SP-413 나노트랩 블루 VSA CS 자성 다공성 표면 3500 0.77 -3.0
SP-333 카르복실레이트 마이크로입자, 계면활성제 없음 1348 0.66 -28.5
SP-339 폴리스티렌 카르복실 기능화됨 410 0.03 -31.4
SP-341 카르복실산, 150 nm 154 0.10 -26.0
SP-347 실리카 코팅됨, 200 nm 281 0.18 -21.8
SP-353 아미노 표면 마이크로입자, 0.4-0.6 μm 1723 0.75 31.4
SP-356 실리카 아미노 기능화된 마이크로입자, 0.1-0.39 μm 2634 0.62 19.8
SP-363 제파민, 0.1-0.39 μm 253 0.13 -35.4
SP-364 폴리스티렌 마이크로입자, 2.0-2.9 μm 3176 0.96 -55.9
SP-365 실리카 231 0.02 -39.0
43개의 입자 유형을 방법 단원에서 기술한 것과 같이, 6개의 조건을 사용하여 평가하였고, 가장 최적 조건을 총 확인된 단백질 수를 토대로 최상의 조합을 선택하기 위한 이차 분석에 사용하였다. 43-입자 유형 스크리닝을, 생물학적 샘플을 가로지르는 플랫폼 확인을 입증하기 위하여, 3-입자 유형 입자 패널에 대해 사용한 CRC 풀과 상이한, 건강한 및 폐암 환자의 혈장 풀을 사용하여 수행하였다. 풀링된 샘플을 사용하여 단백질 다양성을 증가시켰다. 엄격한 기준을 사용하여 패널 선택 및 최적화를 위한 잠재적 단백질을 확인하였다. 최대 잠재력 평가를 위해, 단백질은 "확인된" 것으로 계수되기 위하여 3개의 전체 검정 복제물의 각각에서 적어도 하나의 펩타이드-스펙트럼-매치 (PSM; 1% 허위 발견률 (FDR))에 의해 표시되어야 한다. 가장 큰 수의 개별적인 특유한 Uniprot 식별자를 가진 패널을 10-입자 유형 입자 패널에 대해 선택하였다.
10-입자 유형 입자 패널의 단백질 적용범위. 본원에 개시된 데이터는 제공된 입자 패널이 많은 생물학적 샘플을 가로질러 단백질체 함량의 변화를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 입자 패널은 높은 정밀도 및 정확도를 가지며 알고 있는 단백질에 대한 특정 리간드를 필요로 하지 않은 비편향 접근법을 취하는 방법을 제공한다. 그러므로, 이들 패널은 특히 바이오마커 발견에 잘 맞는다. 10-입자 유형 패널을 사용하는 혈장 단백질 적용범위의 폭 및 깊이를 조사하였다. MS-유래 혈장 단백질 강도 (농도와 매우 밀접한 관련이 있음)의 데이터베이스 (n = 5,304)를 사용하여, 10-입자 유형 패널의 적용범위를 단순 혈장의 MS 평가 (입자-기반 샘플화 없이 동일한 혈장 샘플의 직접적인 MS 분석)에 의해 얻어진 적용범위에 대해서뿐만 아니라 전체 크기의 데이터베이스에 대해 비교하였다. 도 36은 10개의 독특한 입자 유형의 입자 패널의 MS 강도의 5,304개의 혈장 단백질 데이터베이스와의 매칭 및 적용범위를 보여준다. 데이터베이스 단백질에 대한 순위가 매겨진 강도는 상부 패널에서 보이고 ("데이터베이스"), 단순 혈장 MS 평가로부터의 단백질에 대한 강도는 제2 패널 ("혈장")에서 보이며, 최적의 10-입자 패널에 대한 강도는 나머지 패널에서 보인다. 혈장 단백질 강도 데이터베이스는 Keshishian et al. (2015). Multiplexed, Quantitative Workflow for Sensitive Biomarker Discovery in Plasma Yields Novel Candidates for Early Myocardial Injury. Molecular & Cellular Proteomics, 14(9), 2375-2393으로부터 유래된다. 도 36에 도시한 그 결과는 도 26에 도시된 정밀도 실험에서 사용된, 상기 기술된 3개의 독특한 입자 유형의 입자 패널에 대해 도시된 결과를 확인시켜주고 확장시킨다. 10개의 독특한 입자 유형의 입자 패널은 단순 혈장에 대한 268개 단백질 대비 1,598개 단백질을 확인하였다. 나아가, 각각의 개별 입자 유형은 단순 혈장의 직접적인 MS 분석보다 실질적으로 더 많은 단백질을 검출하였다. 단순 혈장에 대한 MS 분석과 달리, 10개의 독특한 입자 유형의 입자 패널은 혈장 단백질의 농도의 전체 스펙트럼을 집중조사하였다. 다르게 말하면, 단순 혈장 샘플로부터 확인된 단백질이 고강도 단백질 (즉, 풍부함이 더 높은 단백질)을 향해 치우쳐 있지만, 10개의 독특한 입자 유형의 입자 패널로부터 확인된 단백질은 데이터베이스의 농도의 동적 범위에서 8자릿수 이상 확장되었다. 데이터베이스의 21개 단백질만이 10개의 독특한 입자 유형의 입자 패널로부터 매칭된 최저 단백질보다 더 낮은 강도를 가졌다. 도 36에서 입증되는 것과 같이, 10개의 독특한 입자 유형의 입자 패널은 혈장의 광범위한 단백질 농도를 가로질러 높은 정밀도, 정확도, 및 넓은 적용범위를 입증하였고, 대다수의 생물학적 샘플을 가로질로 병행하여 넓은 규모의, 비편향된 단백질체 분석을 가능하게 하며, 오늘날 게놈 데이터 획득에서 가능한 비용 및 속도를 매치시킬 수 있다.
10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널의 정밀도. 이 실시예는 10개의 독특한 나노입자 유형을 포함하는 입자 패널에 대한 입자 코로나의 재현성을 기술한다. 입자를 분석하여 10개의 독특한 나노입자 유형을 포함하는 입자 패널의 각 입자 유형에 대한 복제물 실행간 각각의 특징 그룹의 변동 계수 (CV)를 측정하였다. 낮은 CV는 복제물 실행간 높은 정밀도 및 재현성을 나타냈다. 데이터를 소프트웨어 프로그램 OpenMS를 사용하여 처리하고 3개 복제물의 각각으로부터 관찰된 전구체 특징을 함유한 특징 그룹을 유지하였다. 데이터의 바닥 5%는 클러스터링 알고리즘의 품질 점수를 토대로 통계 이상점을 제거하기 위해 제거하였다. 그룹 특징 강도를 중앙 표준화하고, 각 입자 유형의 코로나의 전체 정밀도를 추정하였다. 각 주입에 대한 전체 중앙 강도가 동일하게 유지되도록 표준화를 수행하고, 강도를, 예를 들어, 기기 반응의 전체적인 차이로 인한 강도 이동을 설명하기 위해 각각의 비교된 분포에 대해 조정하였다. 기기 반응의 차이는 X-선 광전자 분광법, 고해상도 투과 전자 현미경, 및 다른 분석 방법을 포함한 다양한 분석 방법에서 발생할 수 있다. 각각의 특징 그룹의 변동 계수 (cv)의 표준화된 값을 그런 후 10개의 독특한 나노입자 유형을 포함하는 입자 패널의 각각의 입자 유형에 대해 평가하였다. 표 12는 10개의 독특한 입자 유형의 최적화된 패널을 제시한다.
10개의 입자 유형 입자 패널
입자 유형 입자 설명
SP-333 카르복실레이트 마이크로입자, 계면활성제 없음
SP-339 폴리스티렌 카르복실 기능화됨
SP-347 실리카 코팅됨, 200 nm
SP-365 실리카
SP-373 덱스트란 기반 코팅, 0.13 μm
SP-390 올레산- 친수성/소수성 표면
SP-406 붕소화된 나노분말 표면
SP-007 PDMAPMA-코팅된 SPION
SP-047 폴리(글리시딜 메타크릴레이트-벤질아민) 코팅됨
SP-064 폴리(N-[3-(다이메틸아미노)프로필]메타크릴아미드-코-[2-(메타크릴로일옥시)에틸]다이메틸-(3-설포프로필)암모늄 하이드록사이드, P(DMAPMA-코-SBMA) 코팅됨
표 13은 특징, 펩타이드 및 단백질에 대해 10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 혈장 및 입자 패널에 대한 단백질 코로나-기반 프로테오그래프 작업흐름의 정밀도 평가를 위한 분위수 표준화된 CV의 중앙 퍼센트 (QNCV%)를 보여준다. 1% 펩타이드 및 1% 단백질 허위 발견률 (FDR)을 적용하였다. 데이터를 MaxLFQ 분석 소프트웨어를 사용하여 처리하고, 각 단백질 그룹이 모든 복제물에서 적어도 하나의 펩타이드 비율-수 및 검출을 갖는 조건을 적용하여, 정밀도 분석에 사용되는 그룹 수를 감소시켰다. 10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널의 각각의 입자 유형에 대해, 분위수 표준화된 CV의 퍼센트 또는 QNCV%를 포함한, 중앙 CV를 표 13에 제시한다. 특징, 펩타이드, 및 단백질에 대해 확인 가능한 특징 그룹을 정렬시키기 위하여 유사한 분석을 MaxQuant를 사용하여 펩타이드 및 단백질 수준에서 수행하였다 (표 13). 확인 가능한 특징의 수는 펩타이드가 다수의 특징을 포함할 수 있고 단백질의 다수의 펩타이드를 포함할 수 있기 때문에, 특징으로부터 펩타이드로, 또 단백질로 감소한다. 이 나노입자 패널은 1% 허위 발견률 (FDR)로 1,184개의 단백질 그룹을 검출하였다.
10개의 독특한 나노입자 유형을 포함하는 입자 패널에 대한 중앙 QNCV%
특징 (OpenMS) 펩타이드 (MaxQuant) 단백질 (MaxQuant)
입자 # 특징 중앙 CV # 펩타이드 중앙 CV # 단백질 중앙 CV
혈장 2141 22.5 976 22.7 162 17.1
SP-333 2163 17.2 1192 20.5 250 18.2
SP-339 2330 19.4 1406 20.8 296 17.9
SP-347 2792 15.4 2105 19.9 469 16.4
SP-365 2322 17.9 1867 22.4 447 18.4
SP-373 2796 27.1 2091 30.3 479 25.5
SP-390 2267 29.3 1265 25.8 216 19.1
SP-406 3823 28.7 1947 30.8 410 28.3
SP-007 2351 21.1 1292 21.5 250 17.1
SP-047 2233 36.5 1176 35.7 279 30.8
SP-064 2984 20.2 2112 23.3 433 19.3
변동 계수 (CV)를 독립적으로 특징, 펩타이드 및 단백질 수준에서 조사하였다. 특징, 펩타이드, 및 단백질 CV의 분석은 검정 정밀도의 보완 관점을 제공한다. OpenMS 및 MaxQuant 소프트웨어 엔진을 특징, 펩타이드, 및 단백질 매칭에 사용하였다. MaxQuant를 FDR과의 단백질 그룹화에 사용하였다. OpenMS를 사용하여 X!Tandem 매칭 도구를 사용하는 펩타이드-스펙트럼-매칭 (PSM)을 수행하였다. MaxQuant를 구성하여 Andromeda 알고리즘을 사용하였다. 펩타이드 CV 및 단백질 CV를 사용하여 생물학적 변수로 사용하기 위한 플랫폼의 정밀도를 평가하였다. 평균 CV는 펩타이드 크기가 증가함에 따라 감소하여서, 평균 CV는 단백질에 대한 것보다 펩타이드에 대해 더 낮았다. 입자는 혈장에 유사한 CV를 유지하는 한편, 입자는 혈장보다 더 높은 특징, 펩타이드, 및 단백질의 발생을 보인다. 특히, 임의의 주어진 입자 유형의 입자에 대한 단백질의 수는 혈장보다 높은 한편 (평균: 218% 더 높음, 범위: 133% - 296% 더 높음) 비슷한 CV를 유지하였다 (입자 및 혈장에 대해 각각 21.1% 대 17.1%). 나아가, 입자 유형의 패널은 1,184개의 단백질을 확인한 한편 혈장 단독의 경우 162개의 단백질만을 확인하였다.
10개의 독특한 나노입자 유형을 포함하는 입자 패널의 정확도. 10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 입자 패널이 바이오마커 발견 및 확인 연구에서 샘플의 그룹간 실제 차이를 검출하는 정확도를 평가하였다. 정확도를 나노입자 유형 SP-007, 및 C-반응성 단백질 (CRP)의 존재 하에 스파이크 회복 데이터를 측정함으로써 측정하였다. 스파이크 회복 데이터를 3개의 입자 유형 (SP-006, SP-339, SP-374)의 각각과 조합된 3개의 추가 폴리펩타이드 (S100A8/9, 및 안지오게닌) 중 하나의 존재 하에 추가로 측정하였다. 공지된 양의 각 폴리펩타이드를, 10의 인자씩 증가시키는 상이한 농도 (예컨대, 1X, 2X, 5X, 10X, 및 100X)에서 스파이킹하였다. 각 폴리펩타이드의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 유래된 펩타이드 및 단백질 강도를 ELISA 단백질 농도에 대해 도표화하였다. 펩타이드 강도를 클러스터 내에서 적어도 하나의 트깅에 할당된 표적 단백질 MS2 ID를 가지는 군집된 특징 그룹을 찾기 위해 OpenMS MS1/MS2 파이프라인을 사용하여 유도하였다. 상부 스파이크 수준에 대해 적어도 하나의 복제물에서 표시되는 클러스터 그룹만을 분석에 사용하였다. 단백질 강도를 MaxQuant 소프트웨어를 사용하여 유도하였다. 각각의 단백질에 대한 강도 값을 요약하였고 최대 농도가 2가 되도록 데이터를 규모화하였다. MS 데이터세트를 각 스파이크 농도 (예컨대, 1X, 2X, 5X, 10X, 및 100X)에 대해 삼중으로 수행하여, 15개의 개별 단백질 또는 펩타이드 측정을 제공하였다. 모든 입자 유형 또는 입자 유형 복제물에서 모든 펩타이드가 검출되지는 않았다. MS 데이터세트의 결과를 도 31-34에 도시한다. 도 31은 스파이크-회복 실험에서 안지오게닌의 펩타이드 특징 측정의 정확도를 나타낸다. 도 32는 스파이크-회복 실험에서 S10A8의 펩타이드 특징 측정의 정확도를 나타낸다. 도 33은 스파이크-회복 실험에서 S10A9의 펩타이드 특징 측정의 정확도를 나타낸다. 도 34는 스파이크-회복 실험에서 CRP의 펩타이드 특징 측정의 정확도를 나타낸다. 피팅 라인은 각 특징의 스파이크 강도에 대한 선형 피트이다.
도 31-34는 안지오게닌, S10A8, S10A9, 및 CRP 각각의 펩타이드 특징 측정의 정확도를 측정하기 이한 3개의 스파이크 회복 실험의 결과를 예시한다. 데이터는 펩타이드 (평균 r2는 0.81임) 및 단백질 (평균 r2는 0.97임)에 대한 개별 측정 사이에 고도의 상관관계를 입증하였다. 모든 단백질을 가로질러 평균 기울기는 1.06이다. 표 14는 비교당 r2 상관관계 및 또한 단백질당 평균 r2 상관관계를 보여주었다. 20개의 펩타이드 중에서, 2개만이 2개의 상이한 입자 유형에 대한 ELISA 검정 사이에 상관관계가 없는 것을 보였는데, 한 펩타이드는 2개의 전하 상태로 나타났다. 수차는 펩타이드 크기가 증가함에 따라 감소하여서, 수차의 빈도는 단백질에 대해서보다 펩타이드에 대해 더 낮았다. 2개의 상이한 입자에 대한 ELISA와의 상관관계를 보이지 않은 2개의 펩타이드는 다른 입자 유형에서 ELISA에 대한 고도의 상관관계를 보였다. 문제의 펩타이드를, 예를 들어 전하 도용을 통해 그것의 신호를 가리는 다른 펩타이드와 함께 공-용출시킬 수 있다.
표 14는 코로나 분석 또는 ELISA에 의해 측정되는 바 단백질 강도에 대한 회귀 피트를 요약하여 제공한다. 개별 입자 유형에 대해 값을 제시하고 입자 유형당 4회 반복값을 평균화하였다. 코로나 분석에 의해 측정된 바, 단백질 농도는 농도 범위 및 입자 유형 범위를 가로질러 일치하였다. 표 14에서 나타낸 것과 같이, 단백질 측정은 높은 r2 값 (평균 0.97, 개별 입자를 가로지르는 범위 0.92 - 1.0; 입자를 가로질러 평균화된 범위 0.94 - 0.99)에 의해 제시된 바와 같이, 꽤 상관이 있었다. ELISA에 의해 측정된 4개의 단백질을 가로지르는 이런 일치하는 행동은 코로나 분석 검정의 정확도를 예시한다.
단백질 강도 회귀 피트의 요약.
단백질 입자 유형 교차점 기울기 r_sq adj_r_sq 교차점 기울기 r_sq adj_r_sq
ANG SP-006 0.16 1.05 0.94 0.91 0.30 0.96 0.97 0.95
ANG SP-007 0.75 0.78 0.93 0.90
ANG SP-339 0.05 1.05 1.00 1.00
ANG SP-374 0.23 0.98 0.99 0.99
CRP SP-006 -0.24 0.96 1.00 1.00 -0.85 1.22 0.99 0.99
CRP SP-007 -0.48 1.07 0.99 0.99
CRP SP-339 -1.08 1.31 0.99 0.98
CRP SP-374 -1.60 1.54 NA NA
S100A8 SP-006 -0.12 1.02 1.00 1.00 0.03 0.98 0.97 0.95
S100A8 SP-007 -0.20 1.12 0.92 0.89
S100A8 SP-339 0.34 0.81 0.99 0.98
S100A8 SP-374 0.10 0.96 0.96 0.95
S100A9 SP-006 -0.56 1.34 0.90 0.87 -0.09 1.06 0.94 0.92
S100A9 SP-007 -0.44 1.27 0.93 0.91
S100A9 SP-339 0.51 0.68 0.98 0.97
S100A9 SP-374 0.11 0.96 0.95 0.93
다른 플랫폼과의 비교. 패널의 각각의 단백질 유형에 상응하는 독특한 코로나에서 단백질을 풍부화하기 위한 다중-입자 유형 패널을 사용하는 본원에 개시된 방법 (예컨대, 프로테오그래프 작업흐름을 사용하는 코로나 분석)은 단백질체에서 단백질 확인의 넓고 편향되지 않은 적용범위를 제공한다. 단백질체의 넓은 적용범위를 시도하는 다른 방법은 다중 분획화 단계, 복잡한 작업흐름을 필요로 하고, 본원에 제공된 방법에 비교하여 느리다. 다른 방법은 본원에 개시된 방법의 폭 및 공정성이 부족하고 본원에서 현재 개시된 단백질 검정 방법과 비교된다.
Geyer 등 (Cell Systems 2016)은 신속한 샷건(shotgun) 단백질체 접근법을 이용하였고 검정당 평균 284개의 단백질 그룹 및 모든 복제물에 걸쳐 321개의 단백질 그룹을 생성하였다. 평가는 대략 1,000개의 단백질 그룹을 생성한 분획화를 포함한 더 느린, 여러 날의 프로토콜을 이용하였다. 복제물은 엄청난 비용 및 시간 요구조건의 가능성으로 인해 수행하지 않았고, 따라서 변동을 측정할 수 없었다.
Geyer는 321개의 단백질 그룹을 생성하기 위해 짧은 실행을 사용하였고, 각 단백질의 CV를 측정하였다. Geyer에 의해 평가된 321개의 그룹 및 10개의 입자 유형 패널에 의해 확인된 1,184개의 단백질 그룹은 두 방법 간에 공통적으로 88개의 단백질 그룹을 포함하였다. 단백질 그룹이 검출된 펩타이드를 토대로 상이하게 조합될 수 있는 다수의 관련된 단백질을 포함할 수 있기 때문에, 88개의 공통 단백질 그룹의 확인은 예상 외로 높은 것이다.
88개의 공통된 단백질 그룹에 대해, Geyer 등으로부터의 데이터를 분석하고, 12.1%의 중앙 CV를 측정하였다. 대조적으로, 프로테오그래프에 의해 분석된 동일한 88개의 공통된 단백질 그룹은 단지 7.2%의 낮은 CV를 가졌다. 그러므로, 다중-입자 유형 패널 및 프로테오그래프 작업흐름을 사용하는 본 코로나 분석 방법은 Geyer 등의 방법보다 개선된 정밀도를 제공하였다. 추가적으로, Geyer 등의 평가는 4개 단백질에 대해 0.99의 검정 정확도를 나타내는 r2를 나타냈다. 유사하게, 프로테오그래프 검정은 0.97의 r2를 나타냈다.
Geyer 등은 시험관내 진단 검정의 경우 일반적으로 사용되는 컷오프인 20% 미만의 CV를 가지는 단백질 그룹의 수를 추가로 평가하였다. 입자 패널 방법은 20% 미만의 CV를 가지는 761개의 단백질 그룹을 검출하였고, 그것은 Geyer 등에 의해 확인된 수보다 3.7배 높았다. Mann 박사 (Niu et al, 2019)에 의한 추가의 평가는 20% 미만의 CV를 가지는 272개의 단백질 그룹을 검출하였고, 그것은 다중 입자 유형 패널 및 본원에 개시된 그것의 사용 방법에 의해 확인된 수보다 2.8배 낮았다.
Bruderer 등은 Biognosys 플랫폼에 의해 생성된 데이터를 사용하여 단백질 그룹 CV를 평가하였다 (Bruderer et al, 2019). 이 평가는 465개의 단백질을 확인하였는데, 465개의 단백질은 5.2%의 중앙 CV를 가졌고 그 단백질들 중 404개는 20% 미만의 CV를 가졌다. 대조적으로, 본원에 개시된 방법을 사용하여 확인된 1,184개의 단백질로부터의 최상 465개 단백질은 4.7%의 중앙 CV를 가졌고 프로테오그래프에 의해 확인된 1,184개의 단백질 중 761개가 20% 미만의 CV를 가졌다.
Geyer 등, Niu 등, 및 Bruderer 등의 평가와 비교하여, 본 발명의 입자 패널은 다른 화인 방법을 능가하는, CV 한계값을 충족시키는 단백질의 수뿐만 아니라 단백질의 동등한 수에 대해 개선된 CV를 제공하였다. 본원에 개시된 방법은 추가적으로 다른 방법, 예컨대 표적화된 질량 분석 및 다른 분석물 특이적 시약 (예컨대, Olink)에 비해 감소된 편향을 가진다. 그러한 접근법은 소수의 사전-선택된 단백질을 측정함으로써, 단백질 패널 선택 과정 중에 편향이 도입된다. 그 결과로서, 이들 접근법은 프로테오그래프에 의해 확인된 단백질과 비교하여 그것의 패널 상에 단백질에 대한 낮은 CV 및 높은 r2를 가지며 패널 상의 단백질을 검출하는 것에 제한된다.
실시예 11
입자 합성을 위한 물질 및 방법
이 실시예는 입자 합성을 위한 물질 및 방법을 기술한다.
물질 . 염화철 (III) 6수화물 ACS, 아세트산 나트륨 (무수 ACS), 에틸렌 글리콜, 수산화 암모늄 28~30%, 과황산 암모늄 (APS) (≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade), 에탄올 (시약 알코올 ACS) 및 메탄올 (≥99.8% ACS)을 VWR사로부터 구입하였다. N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 (99%)를 EMD Millipore사로부터 구입하였다. 시트르산 삼나트륨 2수화물 (ACS 시약, ≥99.0%), 테트라에틸 오르토실리케이트 (TEOS) (시약 등급, 98%), 3-(트라이메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트 (MPS) (98%) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트 (OEGMA, 평균 Mn 500, 억제제로서 100 ppm MEHQ, 억제제로서 200 ppm BHT를 함유함)를 Sigma-Aldrich사로부터 구입하였다. 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산) (ACVA, 98%, 농도 약 18% 물) 및 다이비닐벤젠(DVB, 80%, 이성질체의 혼합물)을 Alfa Aesar사로부터 구입하여 실리카 칼럼을 짧게 통과시킴으로써 정제하여 억제제를 제거하였다. N-(3-다이메틸아미노프로필)메타크릴아미드 (DMAPMA)를 TCI사로부터 구입하여 실리카 칼럼을 짧게 통과시킴으로써 정제하여 억제제를 제거하였다. 인간 C-반응성 단백질 (CRP)을 측정하기 위한 ELISA 키트를 R&D Systems (Minneapolis, MN)사로부터 구입하였다. 인간 혈청으로부터 정제된 인간 CRP 단백질은 Sigma Aldrich사로부터 유래하였다.
초상자성 산화철 나노입자 (SPION)-기반 SP-003, SP-007, 및 SP-011의 합성. 산화철 코어를 용매열법 반응을 통해 합성하였다 (도 28A-E, 상단 (도 28A)) (Liu, J., et al. Highly water-dispersible biocompatible magnetite particles with low cytotoxicity stabilized by citrate groups. Angew Chem Int Ed Engl 48, 5875-5879 (2009); Xu, S., et al. Toward designer magnetite/polystyrene colloidal composite microspheres with controllable nanostructures and desirable surface functionalities. Langmuir 28, 3271-3278 (2012)). 전형적으로, 약 26.4 g의 염화철 (III) 6수화물을 약 220 mL의 에틸렌 글리콜에 약 160℃에서 약 10분 동안 혼합 하에 용해시켰다. 그런 후 약 8.5 g의 시트르산 삼나트륨 2수화물 및 약 29.6 g의 아세트산 나트륨 무수물을 첨가하고 추가로 약 15분 동안 약 160℃에서 혼합함으로써 완전히 용해시켰다. 그런 후 용액을 테플론-라이닝 스테인레스 강철 오토클레이브 (300 mL 용량)에 밀봉하고 약 200℃로 약 12시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 검은색 상자성 생성물을 자석에 의해 분리하고 탈이온수로 3~5회 세척하였다. 최종 생성물을 추후 사용을 위해 검은색 분말로 냉동 건조시켰다.
실리카-코팅된 산화철 나노입자 (SP-003)를 앞서 보고된 것과 같이 변형된 Stober 과정을 통해 제조하였다 (도 28B)(Deng, Y., Qi, D., Deng, C., Zhang, X. & Zhao, D. Superparamagnetic high-magnetization microspheres with an Fe3O4@SiO2 core and perpendicularly aligned mesoporous SiO2 shell for removal of microcystins. J Am Chem Soc 130, 28-29 (2008); Teng, Z.G., et al. Superparamagnetic high-magnetization composite spheres with highly aminated ordered mesoporous silica shell for biomedical applications. J Mater Chem B 1, 4684-4691 (2013)). 전형적으로, 약 1 g의 SPION을 에탄올 (약 400 mL), 탈이온수 (약 10 mL), 및 농축 암모니아 수용액 (약 10 mL, 28~30 중량%)의 혼합물에 균일하게 분산시키고, 이어서 TEOS (약 2 mL)를 첨가하였다. 약 70℃에서 약 6시간 동안 교반한 후, 비정질 실리카 코팅된 SPION (Fe3O4@SiO2로서 표시됨)을 얻었고 메탄올로 3회 및 추가로 물로 3회 세척하고 최종 생성물을 분말로 냉동 건조시켰다.
SP-007 (PDMAPMA-변형된 SPION) 및 SP-011 (PEG-변형된 SPION)을 제조하기 위하여, 비닐기 기능화된 SPION (Fe3O4@MPS로서 표시됨)을 먼저 이전에 보고된 것과 같이 변형된 Stober 과정을 통해 제조하였다 (도 28C) (Crutchfield, C.A., Thomas, S.N., Sokoll, L.J. & Chan, D.W. Advances in mass spectrometry-based clinical biomarker discovery. Clin Proteomics 13, 1 (2016)). 간단히 설명하면, 약 1 g의 SPION을 에탄올 (약 400 mL), 탈이온수 (약 10 mL), 및 농축 암모니아 수용액 (약 10 mL, 28~30 중량%)의 혼합물에 소용돌이 (또는 초음파처리)의 도움 하에 균일하게 분산시키고, 이어서 TEOS (약 2 mL)를 첨가하였다. 약 70℃에서 약 6시간 동안 교반 한 후, 약 2 mL의 3-(트라이메톡시실릴)프로필 메타크릴레이트를 반응 혼합물에 첨가호고 약 70℃에서 밤새 교반하였다. 비닐 기능화된 SPION을 얻었고 3회 메탄오롤 및 추가로 3회 물로 세척하고 최종 생성물을 분말로 냉동 건조시켰다. 다음에, 폴리(다이메틸 아미노프로필 메타크릴아미드) (PDMAPMA)-코팅된 SPION (Fe3O4@PDMAPMA로서 표시됨, 도 28D의 SP-007)의 합성을 위해, 약 100 mg의 Fe3O4@MPS를 약 125 mL의 탈이온수에 균일하게 분산시켰다. N2로 약 30분 동안 기포를 발생시킨 후, 약 2 g의 N-[3-(다이메틸아미노)프로필] 메타크릴아미드 (DMAPMA) 및 약 0.2 g의 다이비닐벤젠(DVB)을 Fe3O4@MPS 현탁액에 N2 보호 하에 첨가하였다. 결과적으로 얻어진 혼합물을 약 75℃로 가열한 후, 약 5 mL 탈이온수 중의 약 40 mg의 과황산 암모늄 (APS)을 첨가하고 약 75℃에서 밤새 교반하였다. 냉각시킨 후, Fe3O4@PDMAPMA를 자석으로 분리하여 물로 3-5회 세척하였다. 최종 생성물을 진갈색 분말로 냉동 건조시켰다. 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)-코팅된 SPION (Fe3O4@PEGOMA로 표시됨, 도 28E의 SP-011)의 합성을 위하여, 약 100 mg의 Fe3O4@MPS를 약 125 mL의 탈이온수에 균일하게 분산시켰다. N2로 약 30분 동안 기포를 발생시킨 후, 약 2 g의 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트 (OEGMA, 평균 Mn 500) 및 약 50 mg의 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 (MBA)를 Fe3O4@MPS 현탁액에 N2 보호 하에 첨가하였다. 결과적으로 얻어진 혼합물을 약 75℃로 가열한 후, 약 5 mL 에탄올 중의 약 50 mg의 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산) (ACVA)을 첨가하고 약 75℃에서 밤새 교반하였다. 냉각시킨 후, Fe3O4@POEGMA를 자석으로 분리하여 물로 3-5회 세척하였다. 최종 생성물을 진갈색 분말로 냉동 건조시켰다.
실시예 12
환자 샘플
이 실시예는 본 개시에서 사용된 환자 샘플을 기술한다. 8개의 연령- 및 성별-매칭된 대조군을 포함한 8개의 대장암 (CRC) 혈장 샘플 세트를 BioIVT (Westbury, NY)사로부터 구입하였다. 연령 및 성별 매칭된 28개의 대조군을 포함한 28개의 비-소세포 폐암 (NSCLC) 혈청 샘플 세트를 또한 BioIVT사로부터 얻었다. CRC/NSCLC 환자 샘플 및 대조군에 관련된 상세한 정보를 표 15 및 표 16에 제시한다.
NSCLC 및 대조군
부류 연령 성별 진단 의약
질환 53 여성 비소세포 폐암 (NSCLC) 알림타 800mg/카보플라틴 760mg, 애드빌 200mg, 컴파진 10mg, 덱사메타손 4mg, 디클로페낙 나트륨 50mg, 다이사트클로민 10mg, 엽산 1mg, 락툴로스 10g/15ml, 란소프라졸 30mg, 멀티비타민, 옥시코돈 5mg, 레글란 10mg, 비타민 C 1000mg, 비타민 D2 50000iu
질환 64 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 비타민 B 결핍증, 고혈압 (HTN), 고지혈증 옵디보, 알렌드론산 나트륨 10mg, 알레그라 알러지 180mg, 아노로 엘립타 62.5mcg-25mcg, 아스피린 81mg, 비스톨릭 5mg, 칼슘 및 D 500mg-200iu, 컴파진 10mg, 크레스토 40mg, 딜라우디드 1200mg, 엠라 2.5%-2.5%, 에리트로마이신 5mg, 어유 340 mg-1000mg, 플로나즈 알레르기 이완제 50mcg, 하이드로모르폰 4mg, 이소소르비드 일질산염 60mg, 레보티록신 75mcg, 리시노프릴 20mg, 의료용 대마초, 멀티비타민 9mg-철분 15ml, 뉴론틴 300mg, 니트로, 옥시코돈 5mg, 플라빅스 75mg, 프로토닉스 20mg, 유니솜 25mg, 벤톨린 90 mcg, 비타민 D3 5000iu, 자낙스 1mg
질환 73 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 공복 혈당 장애 (IFG), 폐 결절 카보플라틴/파클리탁셀, 아세트아미노펜 325mg, 멀티비타민 1000mg, 심발타 60mg, 엘리퀴스 5mg, 구아이페네신 100mg/5ml, 뉴론틴 300mg, 신스로이드 100mcg, 조프란 8mg
질환 75 여성 비소세포 폐암, 기흉 오시메르티닙, 콜라세 100mg, 플로니제 50mcg, 조프란 8mg, 레스타시스 0.05%, 노르코 5mg-325mg, 메게이스 400mg/10ml, 타그리소 80mg
질환 65 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 제2형 당뇨병, 다발성 경화증 세르티닙 150mg, 시프로 500mg, 엑세드린 500mg, 라식스 40mg, 글리메피리드 4mg, 라모트리진 200mg, 메트포르민 1000mg, 나프록센 500mg, 조프란 8mg, 사방형 철분 142mg
질환 94 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 빈혈 (CKD), 만성 신장 질환 (CKD), 고지혈증 (HLD), 전립선암 키트루다 100mg/4ml, 베타메타손 다이프로피오네이트 0.05%, 엘리퀴스 2.5mg, 플루드로코르티손 0.1mg, 엽산 1mg, 로모틸 2.5mg-0.025mg, 미도드린 10mg, 오메가 Q, 프레드니손 5mg, 라니티딘 150mg, 심바스타틴 40mg
질환 65 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 고혈압 (HTN) 아테놀롤 50mg, 비오틴 2500mcg, 멜라토닌 3mg, 모메타손 0.1%, 비타민 D3 1000iu, 조프란 8mg
질환 79 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 제2형 당뇨병, 고콜레스테롤혈증, 폐기종 암로디핀 5mg, 아목시실린 875mg, 에스트라다이올 0.01%, 엽산 1mg, 자누비아 100mg, 리도카인/프릴로카인 2.5%, 로사르탄 HCL 50mg, 니트로푸란토인 100mg, 판토프라졸 20mg, 심바스타틴 40mg, 비뇨기 통증 완화제 95mg, 조프란 8mg, 겜시타빈, 카보플라틴
질환 57 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐 종괴, 우폐 하엽의 원발성 선암종, 뇌 전이, 저칼륨혈증 카보플라틴/에토포시드, 노바스크 10mg, 로텐신 HCT 20mg-12.5mg, 셀렉사 20mg, 마이셀렉스 10mg, 라식스 20mg, 노르코 7.5mg-325mg, 마그네슘 400mg, 멜라토닌 젤리 2.5mg, 메트포르민 750mg, 미코스타틴 100,000iu/mL, 조프란 8mg, 염화 칼륨 20mEq, 컴파진 10mg
질환 63 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 고혈압 (HTN), 고콜레스테롤혈증, 위식도 역류성 질환 (GERD), 게실염, 갑상선 질환, 관절병증, 광산 각화증 알림타, 카보플라틴, 칼슘-비타민 D, 폴바이트 1mg, 케프라 500mg, 신스로이드 125mcg, 프릴로섹 20mg, 조프란 8mg, 컴파진 10mg, 조코 40mg
질환 77 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 고혈압 (HTN), 골수이형성 증후군, 빈혈 (철), 갑상성 기능 저하증, 전립선암, 서맥 싱귤레어 10mg, 메클리진 HCL 25mg, 자렐토 20mg, 신스로이드 125mcg, 미랄락스 17g, 리도카인 5%, 아뉴이티 엘립타 100mcg, 메디프로 비건 초콜릿 23.28oz, 엑소스 촉매, 피콜린산 아연 15mg, 알부테롤 황산염 90mcg, 비타민 B12/엽산 500mcg/400mcg
질환 70 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 고혈압 (HTN), 적혈구 증가증, 왼쪽 하단 말단 부종, 왼쪽 하단 말단의 봉와직염 알림타/카보플라틴/키트루다/뉴라스타, 데카드론 4mg, 브레오 엘립타 200mcg/25mcg, 폴바이트 1mg, 라식스 40mg, 뉴론틴 300mg, 엠라, 제스트릴 5mg, 마술 구강세정제, 글루코파지 500mg, 알리브 220mg, 조프란 8mg, 염화 칼륨 10meq, 프로에어 HFA 108mcg, 스피리바 18mcg, 발트렉스 1000mg
질환 70 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 고혈압 (HTN), 제2형 당뇨병 탁소텔 75mg-사이람자 10mg-뉴라스타, 아티반 0.5mg, 베이사글라 100iu/mL, 덱사메타손 4mg, 엘리퀴스 5mg, 펜타닐 25mcg, 엽산 1mg, 글리메피리드 2mg, 하이드로클로로티아지드 12.5mg, 로라제팜 0.5mg, 마그네슘 300mg, 메트포르민 1000mg, 멀티비타민 9mg 철분/15mL, 옥시코돈 5mg, 트라마돌 50mg, 트라조돈 50mg, 비타민 D3 2000iu
질환 78 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 갑상성 기능 저하증 엽산 1mg, 라식스 20mg, 아타락스 25mg, 하이드록시진 25mg, 클로르-콘 10meq, 엠라, 메틸프레드니솔론 4mg, 조프란 8mg, 신스로이드 100mcg, 케날로그 0.025%
질환 68 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 백혈구 증가증, 고칼슘혈증, 천식, 주요 우울 장애, 갑상성 기능 저하증, 고지혈증, 제2형 당뇨병 아브락산 100mg, 프로크리트 40000iu, 아스피린 325mg, 베나드릴 25mg, 칼슘 500mg, 클로피도그렐 75mg, 코데인-구아이페네신 10mg-100mg/5ml, 이모디움 2mg, 철분 325mg, 클로르-콘 20meq, 라식스 20mg, 레보티록신 50mcg, 메트포르민 500mg, 나이아신 500mg, 온단세트론 8mg, 프로벤틸 90mcg, 스피리바 18mcg, 심비코트 160mcg-4.5mcg, 타이레놀 500mg, 자낙스 0.5mg, 졸피뎀 10mg
질환 78 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 림프절염, 고혈압 (HTN), 고지혈증, 심방 세동 (AF), 좌측 주 기관지의 악성 신생물 엑스지바 120mg, 키트루다, 아트로바스타틴 40mg, 디곡신 125mcg, 푸로세미드 40mg, 렉사프로 20mg, 메드롤 4mg, 메트로프롤롤 타르트레이트 100mg, 남자릭 21mg-10mg, 녹실란 500mg, 비타민 D2 50000iu, 와파린 2mg
질환 79 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 범혈구 감소증, 간경변, 대상포진, 신경통, 신경염, 본태성 원발성 고혈압 페라헴 Non-ESRD, 암로디핀 5mg, 아스피린 81mg, 아테놀롤 50mg, 베이어 아스피린 325mg, 칼슘/비타민 D3 1250mg, 칼트레이트/비타민 D3 1500mg, 카르티아 XT 180mg, 크레스토 20mg, 듀라지소 25mcg, 엘리퀴스 5mg, 엽산 1mg, 가바펜틴 300mg, 옥시코돈/아세트아미노펜 5mg/325mg, 페르코세트 5mg/325mg, 프레드니손 1mg, 프로크리트 40000iu/ml, 테살론 페를레 100mg, 비타민 D2 50000iu
질환 79 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 전립선암, 면역 혈소판 감소성 자반증, HTN, 고지혈증 옥타감 액체 10%, 칼슘 600mg, 디곡신 125mcg, 엽산 400mcg, 메트로프롤롤 타르트레이트 25mg, 프로바이오틱, 로수바스타틴 10mg
질환 54 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 제2형 당뇨병, 고혈압 (HTN) 펨브롤리주맙, 덱사메타손 4mg, 글리피지드 5mg, 하이드로코돈-아세트아미노펜 10mg-325mg, 이프라트로피움 브로마이드 17mcg, 란투스, 리시노프릴 10mg, 메트포르민 500mg, 프라바스타틴 나트륨 40mg
질환 69 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 좌측 무릎의 일측 원발성 골관절염, 본태성 원발성 고혈압, 제2형 당뇨병 알록시 0.25mg/5ml, 카르디젬 120mg, 크레스토 20mg, 디곡신 250mcg, 엘리퀴스 5mg, 푸로세미드 20mg, 글루코사민 콘드로이틴 플러스 375mg/100mg/36mg/54mg, 메트포르민 ER 750mg, 염화 칼륨 ER 10meq, 조프란 8mg
질환 81 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 혈관성 치매, 고혈압 (HTN), 지질 질환 이프라트로피움 알부테롤 0.5mg/3mg, 메토프롤롤 50mg, 쿠마딘 7.5mg, 아트로바스타틴 80mg, 로베녹스 80mg/0.8ml, 매게이스 ES 625mg/5ml, 렉사프로 10mg
질환 70 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 빈혈 (항신생물 화학요법), 특발성 혈소판 감소증 (ITP), 좌상엽의 악성 신생물, 비타민 B12 결핍증, 엽산 결핍증, 천식, 제2형 당뇨병, 고지혈증 (HLD), 고혈압 (HTN), 고콜레스테롤혈증 엔플레이트, 프로크리트 40,000iu, 알림타 500mg, 황산 제1철 325mg, 엽산 1mg, 메드롤 4mg, 메트포르민 500mg, 심바스타틴 40mg, 투도르자 프레세어 400mcg
질환 76 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 빈혈 (철분 결핍), 공복 혈당 장애(IFG) 비오틴 300mcg, 클레오신 1%, 페노피브레이트 160mg, 플로나제 50mcg, 메드롤 4mg, 라니티딘 150mg, 타그리소 80mg, 타르세바 150mg, 벤톨린 HFA 90mcg, 비타민 D2 50000iu
질환 91 남성 비소세포 폐암 (NSCLC), 빈혈 (철분 결핍), 갑상성 기능 저하증, HTN 클로트리마졸 1%, 덱스트란, 디곡신 125mcg, 푸로세미드 20mg, 하이드로코돈-호마트로핀 5mg-1.5mg/5ml, 라식스 20mg, 레보티록신 25mcg, 메토프롤롤 석시네이트 25mg, 미라클 구강세정제, 뮤시넥스 30mg-600mg, 나이스타틴 100000iu, 오메프라졸 20mg, 옥시코돈 20mg, 프라바스타틴 10mg, 프레드니손 10mg, 프로에어 90mcg, 프록토-메드 2.5%, 릴리스토 150mg, 염화 나트륨 1g
질환 69 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 빈혈 (철분 결핍), 비타민 B12 결핍증, T-세포 전림프구성 백혈병, 고혈압 (HTN) 아티반 0.5mg, 트라조돈 50mg
질환 65 여성 비소세포 폐암 (NSCLC), 만성 폐쇄성 폐 질환 (폐기종), 심혈관 질환, 골다공증 덱사메타손 4mg, 엠라 2.5%, 로페라미드 2mg, 로라제팜 1mg, 나이스타틴 100000iu/ml, 온단세트론 4mg, 오라비그 50mg, 심비코트 160mcg/4.5mcg, 벤톨린 HFA 90mcg, 나벨빈 30mg
질환 77 여성 비소세포 폐암 (NSCLC) 아바스틴 15mg/kg, 알림타 500mg/카보플라틴/뉴라스타 텐 알림타 500mg, 아스피린 81mg, 챈틱스 1mg, 덱사메타손 4mg, 엽산 1mg, 인스타플렉스, 메트포르민 500mg, 퀴나프릴 40mg, 심바스타틴 20mg, 비타민 D3 2000iu, 조프란 8mg
질환 85 여성 비소세포 폐암 (NSCLC) 알레티닙
대조군 53 여성 정상적인 공여자 없음
대조군 64 여성 정상적인 공여자 없음
대조군 67 여성 정상적인 공여자, 고콜레스테롤혈증 아트로바스타틴 40mg
대조군 72 여성 정상적인 공여자 없음
대조군 73 여성 정상적인 공여자, 골관절염 (OA) 프롤리아, 아시펙스 20mg
대조군 87 남성 정상적인 공여자, 열이 있는 공여자 비타민 B 복합체, 아연 50ml, 알카 셀처, 비타민 B6, 비타민 B1, 비타민 B12, 펩신 40mg
대조군 65 여성 정상적인 공여자, 고콜레스테롤혈증 없음
대조군 80 여성 정상적인 공여자 없음
대조군 57 남성 정상적인 공여자 멀티비타민
대조군 63 여성 정상적인 공여자 없음
대조군 75 남성 정상적인 공여자, 고혈압 (HTN) 리시노프릴 2.5mg
대조군 70 여성 정상적인 공여자 없음
대조군 70 여성 정상적인 공여자 멀티비타민 1000mg
대조군 77 여성 정상적인 공여자 리피토르 20mg, 프레바시드 20mg
대조군 68 여성 정상적인 공여자, 고혈압 (HTN) 리시노프릴 10mg
대조군 73 남성 정상적인 공여자 탐술로신 HCL, 피나스테리드 5mg
대조군 81 여성 정상적인 공여자 노바스크, 디트로판
대조군 77 남성 정상적인 공여자, 백내장, 진행성 청각 상실, 고혈압 (HTN), 고콜레스테롤혈증 리피토르 20mg, 트리코르 145mg, 메토프롤롤 50mg, 오메프라졸 20mg, 아스피린 80mg
대조군 56 남성 정상적인 공여자 넥시움 60mg, 조코 40mg
대조군 64 남성 정상적인 공여자 프로토닉스 40mg, 아시프린 325mg
대조군 80 남성 정상적인 공여자 비타민 D, 리피토르, 아스피린 81mg
대조군 73 여성 정상적인 공여자, 알레르기성 비염 알레그라 180mg
대조군 77 여성 정상적인 공여자 없음
대조군 83 남성 정상적인 공여자 없음
대조군 68 여성 정상적인 공여자 로사르탄 50mg, 리피토르 20mg
대조군 66 여성 정상적인 공여자, 고혈압 (HTN) 리시노프릴 10mg
대조군 78 여성 정상적인 공여자 리피토르 10mg, 토프롤 50mg, 암비엔 10mg
대조군 86 여성 정상적인 공여자, 고혈압 (HTN) 암로디핀 2.5mg, 비타민 B
CRC 및 대조군
부류 연령 성별 진단
질환 74 여성 대장암
질환 41 남성 대장암
질환 57 남성 대장암, 빈혈 (철분 결핍), 제2형 당뇨병
질환 78 남성 대장암, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 고혈압 (HTN), 제2형 당뇨병, 관절염
질환 60 여성 대장암, CKD, 철분 결핍, RLS, 결장 암종, 우측 난소 암종, 불안
질환 37 남성 대장암, 발기 부전, 혈소판 감소증
질환 68 여성 대장암, 주요 우울 장애 (MDD), 제2형 당뇨병, 막힌 탈장, 복벽 탈장, 발성 장애, 고콜레스테롤혈증, 저지질혈증, 고혈압 (HTN), 편두통, 비만, 당뇨병성 다발신경병증, 역류성 식도염, 부종, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 대장균 균혈증, 경막 하혈종, 간 농양
질환 60 여성 대장암, 직장암, 제1형 당뇨병, 고혈압 (HTN), 갑상선 기능 저하증
대조군 75 여성 정상적인 공여자
대조군 42 남성 정상적인 공여자
대조군 56 남성 정상적인 공여자
대조군 78 남성 정상적인 공여자
대조군 58 여성 정상적인 공여자
대조군 36 남성 정상적인 공여자
대조군 68 여성 정상적인 공여자
대조군 59 여성 정상적인 공여자
실시예 13
입자 유형의 물리화학적 특성의 특성화.
이 실시예는 다양한 기법에 의한 입자 물리화학적 특성의 특성화를 기술한다. 동적 광산란 (DLS) 및 제타 전위를 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) 상에서 수행하였다. 테스트 전에 입자를 물에 10 mg/mL로 약 10분의 배스 초음파를 사용하여 현탁하였다. 그런 후 샘플을 DLS 및 제타 전위 둘 다의 측정을 위해 각각의 완충액에 대략 0.02 중량%로 희석하였다. DLS를 약 25℃의 물에서 일회용 폴리스티렌 반마이크로 큐벳 (VWR, Randor, PA, USA)에서 약 1분의 온도 평형 시간으로, 173°의 후방산란 모드로 633 nm 레이저로 수행하였고 약 1분의 3회 실행으로부터의 평균으로 구성되었다. DLS 결과를 누적 방법을 사용하여 분석하였다. 제타 전위를 약 25℃의 일회용 접힌 모세관 셀 (Malvern Instruments, PN DTS1070)에서 약 1분의 평형 시간으로 5% pH 7.4 PBS (Gibco, PN 10010-023, USA)에서 측정하였다. 측정 사이에 1분을 유지하고, 최소 10회 실행 및 최대 100회 실행을 포함한 자동 측정 기간으로 3회 측정을 수행하였다. Smoluchowski 모델을 사용하여 전기영동 이동성으로부터 제타 전위를 측정하였다.
주사 전자 현미경 (SEM)을 FEI Helios 600 Dual-Beam FIB-SEM을 사용함으로써 수행하였다. 입자의 수성 분산액을 약 10분 초음파처리에 의해 탈이온수에 재현탁된 무게를 측정한 입자 분말로부터 약 10 mg/mL의 농도로 제조하였다. 그런 후, 샘플을 메탄올 (Fisher 제품)에 의해 4배로 희석하여 직접 전자 현미경에 사용한 물/메탄올 중의 분산액을 만들었다. SEM 기질을 Ted Pella로부터 Si 웨이퍼 상에 약 6 μL의 입자 샘플을 드롭-캐스팅(drop-casting)에 의해 제조한 후, 액적을 측정 전 약 24시간 동안 진공 데시케이터에서 완전히 건조시켰다.
300kV의 가속 전압을 가진 Titan 80-300 투과 전자 현미경 (TEM)을 저- 및 고해상도 TEM 측정에 모두 사용하였다. TEM 그리드를 약 2 μL의 입자 분산액을 물-메탄올 혼합물 (25-75 부피/부피%)에 약 0.25 mg/mL의 최종 농도로 드롭-캐스팅함으로써 제조한 후 TEM 분석 전에 진공 데시케이터에서 약 24시간 동안 건조시켰다. 모든 측정을 Ted Pella사로부터의 레이시 홀리(lacey holey) TEM 그리드 상에서 수행하였다.
X-선 광전자 분광법 (XPS)을 PHI VersaProbe 및 ThermoScientific ESCALAB 250e III를 사용함으로써 수행하였다. XPS 분석을 측정 전 건조 하에 밀봉되고 저장을 유지한 입자 미세 분말 상에서 수행하였다. 물질을 분석을 위해 균일한 표면을 이루기 위해 탄소 테이프 상에 장착시켰다. 단색성 Al K-알파 X-선 공급원 (50 W 및 15 kV)을 140 eV의 통과 에너지로 200 μm2 주사 면적에 걸쳐 사용하였고, 모든 결합 에너지를 284.8 eV에서의 C-C 피크를 참조하였다. 조사용 스캔 및 고해상도 스캔 둘 다를 수행하여 관심의 원소를 상세하게 평가하였다. 각 원소의 원자 농도를 샘플 상의 2개의 상이한 위치로부터의 결과를 평균화함으로써 상대적인 원자 민감도 계수에 의해 보정된 원소 광방출 특징의 통합 강도로부터 측정하였다. 일부 경우에, 균일성을 평가하기 위하여 4개 이상의 위치를 평균화하였다.
실시예 14
단백질 코로나 제조 및 단백질체 분석
이 실시예는 단백질 코로나 제조 및 단백질체 분석을 기술한다. 혈장 and 혈청 샘플을 0.05% CHAPS를 포함한 TE 완충액 (10 mM Tris, 1 mM 2나트륨 EDTA, 150 mM KCl)으로 구성된 희석 완충액에 1:5로 희석하였다. 입자 분말을 약 10분 동안 탈이온수에서 초음파처리한 후 약 2-3초 동안 와동시킴으로써 재구성하였다. 단백질 코로나를 만들기 위하여, 약 100 μL의 입자 현탁액 (SP-003, 5 mg/ml;　SP-007,　2.5 mg/ml;　SP-011, 10 mg/ml)을 미세적정 플레이트에서 약 100 μL의 희석된 생물학적 샘플과 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고 37℃에서 약 1시간 동안 300 rpm에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 자성 콜렉션의 상부에 약 5분 동안 놓아두어 나노입자를 펠릿화하였다. 상층액 중의 미결합 단백질을 피펫으로 제거하였다. 단백질 코로나를 자성을 분리하면서 추가로 약 200 μL의 희석 완충액으로 3회 세척하였다. 10개의 입자 유형 입자 패널 스크리닝에 대해, 평가된 5개의 추가적인 검정 조건은 다음 중 어느 하나를 예외로 상기 설명과 동일하였다. 첫째, 원래의 입자 농도의 50%인 저농도의 입자를 평가하였다 (예상된 펩타이드 수율에 따라, 각 입자에 대해 2.5-15 mg/ml의 범위). 제2 및 제3 검정 변화에 대해, 낮은 및 높은 입자 농도를 전부 완충액에 혈장을 희석하기보다는, 희석되지 않은, 순수한 혈장을 사용하여 실행하였다. 제4 및 제5 검정 변화에 대해, 낮은 및 높은 입자 농도를 전부 희석 및 세정 둘 다를 위해 pH 5 시트레이트 완충액을 사용하여 실행하였다.
나노입자 상에 결합된 단백질을 소화시키기 위하여, 트립신 소화 키트 (iST 96X, PreOmics, Germany)를 제공된 프로토콜을 따라 사용하였다. 간단히 설명하면, 약 50 μL의 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 약 95℃에서 약 10분 동안 교반하면서 가열하였다. 플레이트를 실온으로 냉각시킨 후, 트립신 소화 완충액을 첨가하고 플레이트를 약 37℃에서 약 3시간 동안 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 소화 과정을 중단 완충액으로 중단시켰다. 상층액을 나노입자로부터 자성 콜렉터에 의해 분리하고 추가로 키트에 포함된 펩타이드 세정 카트리지에 의해 세정하였다. 펩타이드를 약 75 μL의 용출 완충액으로 2회 용출하고 조합하였다. 펩타이드 농도를 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)사로부터의 정량적 열량측정 펩타이드 검정 키트에 의해 측정하였다.
다음으로, 펩타이드 용출물을 동결건조하고 0.1% TFA로 재구성하였다. 각 샘플로부터의 2 μg 부분표본을 Thermo Fisher Scientific사로부터의 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량 분석기에 연결된 Waters NanoAcquity HPLC 시스템을 포함한 나노 LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 펩타이드를 트래핑 칼럼 상에 로딩하고 75 μm 분석 칼럼 상에서 350 nL/분으로 용출하고; 두 칼럼을 Phenomenex (Torrance, CA)사로부터의 Luna C18 수지로 패킹하였다. 질량 분석기를 데이터-의존 방식으로 작동시켰고, MS 및 MS/MS는 Orbitrap에서 각각 60,000 FWHM 해상도 및 15,000 FWHM 해상도에서 수행하였다. 기기를 MS 및 MS/MS에 대해 3초 사이클로 실행시켰다.
실시예 15
질량 분석 데이터 분석
이 실시예는 질량 분석 데이터 분석 방법을 기술한다. 획득한 MS 데이터 파일을 OpenMS 도구 모음을 사용하여 처리하였다. 이들 도구에는 MS1 특징 확인 및 강도 추출을 위해, MS 데이터세트 실행 시간 정렬 및 특징-그룹 클러스터링을 위해, 그리고 X!Tandem 검색 엔진과의 MS2 스펙트럼 데이터베이스 매칭을 위해 공급업체 기기 미가공 파일을 mzML 파일로 전환시키기 위한 모듈 및 파이프라인 스크립트가 포함된다. 스펙트럼-데이터베이스 검색 중에, 전구체 이온 및 단편 이온 매칭 내성을 각각 10 및 30 ppm으로 설정하였다. 고정된, 카르바미도메틸 (C), 및 가변적인, 아세틸 (N-말단) 및 산화 (M)에 대한 디폴트 설정에 수정이 가능하였다. UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 서열 데이터베이스 (등록일, 2019. 1. 27)를 검색에 사용하였고 펩타이드 스펙트럼 매치 (PSM)를 1% FDR에서 표준 역서열 디코이 데이터베이스 전략을 사용하여 점수를 매겼다. PSM을 사용하여, 각각의 입자 유형 복제물에 대한 단백질 목록을 주어진 입자 유형 복제물의 열거된 단백질 목록에 단백질을 첨가하기 위한 충분한 증거로서 단일 PSM을 사용하여 편집하였다. 더불어, 하나 이상의 단백질에 매칭된 PSM은 주어진 입자 유형 복제물의 열거된 단백질 목록에 모든 가능한 단백질을 첨가하였다. 비록 이런 단백질 열거에 대한 한계값이 허용적이고, 가능하게는 거짓-양성 (더 높은 민감도, 더 낮은 특이성)을 포함하지만, 2개 이상의 펩타이드 (적어도 하나의 특유한 펩타이드를 포함함)의 더 엄격한 테스트는 거짓-음성 (더 낮은 민감도, 더 높은 특이성)을 가지는 반대되는 문제로 시달리게 된다. 공지된 펩타이드의 정량적 분석을 위해, 관례적인 R 스크립트를 사용하여 mz 및 보유 시간에 대해 각각 1일 및 30초 내성으로 위치상의 중복을 토대로, MS2 PSM을 특징 그룹에 배정하였다. 하나 이상의 PSM이 이전에 명시된 허용도 내에서 초기에 MA1 특징에 대해 맵핑되는 경우에, MS1 특징에 가장 가까운 (MS 데이터세트 내에서) 또는 MS1 특징 클러스터의 중심에 가장 가까운 (MS 데이터세트 사이에서) PSM을 사용하였다. 모든 MS2가 MS1 특징 그룹 클러스터에 배정되지 않았고, 모든 MS1 특징 그룹 클러스터가 배정된 MS2를 갖지 않았다는 것이 주지되어야 하며; 이 구역에서 맵핑 및 후속 펩타이드 특징 확인을 개선하기 위한 작업이 계속된다.
실시예 16
단백질 그룹의 확인
이 실시예는 질량 분석에 의한 단백질 그룹의 확인 방법을 기술한다. 단백질 그룹-수준 분석을 위해, 단백질 그룹 수준에서의 MS 데이터를 다음과 같이 수행하였다. MS 미가공 파일을 MaxQuant (v. 1.6.7(49) 및 Andromeda(50)로 처리하고, 표준 세팅을 사용하여 UniProtKB 인간 FASTA 데이터베이스 (UP000005640, 74,349 포워드 엔트리; 2019년 8월부터의 버전)에 대해 MS/MS 스펙트럼을 조사하였다. 효소 소화 특이성을 트립신으로 설정하여 N-말단의 프롤린으로의 절단 및 최대 2개의 잘못된 절단을 허용하였다. 최소 펩타이드 길이를 7개 아미노산으로 설정하고 최대 펩타이드 질량을 4,600 Da으로 설정하였다. 메티오닌 산화 및 단백질 N-말단 아세틸화를 가변적인 변형으로 구성하고, 시스테인의 카르바미도메틸화를 고정된 변형으로서 설정하였다. MaxQuant는 전구체 이온 질량 정확도를 시간-의존성 재보정 알고리즘에 의해 개선하고 각각의 펩타이드에 대한 개별 질량 허용도를 규정한다. 허용된 초기 최대 전구체 질량 허용도는 첫 번째 검색 중에 20 ppm이었고 주요 검색에서는 4.5 ppm이었다. MS/MS 질량 허용도를 20 ppm으로 설정하였다. 분석을 위해, 1%의 허위 발견률 (FDR) 컷오프를 펩타이드 및 단백질 수준에 적용하였다 (단백질그룹.text 표에서, 모든 단백질 그룹은 그것의 상응하는 q-값으로 기록됨). "실행간 매치"는 가능하지 않았다. 확인의 수는 적어도 하나의 레이저(razor) 펩타이드를 필요로 하는 단백질 강도를 토대로 계수하였다 (1%보다 낮은 q-값을 가진 단백질만 계수함). MaxLFQ 표준화된 단백질 강도 (requiring 적어도 1의 펩타이드 비율 카운트를 필요로 함)를 미가공 출력으로 기록하고 CV 정밀도 분석에 대해서만 사용하였다. 식별될 수 있었던 펩타이드를 그것의 자체 단백질 그룹으로 분류하였고 특유한 펩타이드를 토대로 식별할 수 없었던 단백질을 단백질 그룹에 모았다. 나아가, 단백질을 MaxQuant에 포함된 공통 오염물의 목록에 대해 여과하였다. 부위 변형에 의해서만 확인된 단백질을 분석으로부터 엄격하게 배제하였다.
실시예 17
스파이크 회복
이 실시예는 C-반응성 단백질 (CRP)의 스파이크 회복 실험 방법을 기술한다. 풀링된 건강한 혈장 샘플 중의 CRP의 기준선 농도를 제조자-제시 프로토콜에 따라 상기 기술된 것과 같이 (물질) ELISA 키트로 측정하였다. CRP의 스톡 용액 및 적절한 희석을 제조하고 동일한 풀링된 혈장 샘플에 스파이킹하여 CRP에 대한 기준선, 내인성 농도의 2x, 5x, 10x, 및 100x인 최종 농도를 만들었다. 풀링된 혈장에 첨가하는 부피는 총 샘플 부피의 10%였다. 스파이크 대조군을 동일한 부피의 완충액을 풀링된 혈장 샘플에 첨가함으로써 만들었다. 스파이크된 샘플의 농도를 다시 ELISA에 의해 측정하여 각각의 스파이킹 수준에서의 CRP 수준을 확인하였다. 샘플을 사용하여 상기 결과에서 기술된 것과 같이 입자 코로나 측정 정확도를 평가하였다.
실시예 18
NSCLC 샘플 및 건강한 대조군의 단백질체 분석
이 실시예는 NSCLC 샘플 및 건강한 대조군의 단백질체 분석을 기술한다. 28명의 4기 NSCLC 및 28명의 연령- 및 성별-매칭된 대조군의 56명의 대상체로부터의 혈철 샘플을 상업적으로 구입하였고 SP-007 나노입자 코로나 형성으로 평가하였다 (샘플 획득 및 코로나 형성 및 처리에 대해 상기 참조). 각각의 코로나에 대한 MS 스펙트럼 데이터를 기술한 것과 같이 수집하고 미가공 데이터를 상기에서 기술한 것과 같이 처리하였다 (MS 데이터 분석). 19,214개 그룹의 특징을 확인하였고 56명의 대상체 샘플 전체에서 추출하였는데, 그룹 크기 범위는 1 (단지 하나의 샘플에서의 단독 특징, n = 6,249 또는 데이터의 0.29%)부터 56 (모든 샘플에 존재하는 특징, n = 450 또는 데이터의 12%)이었다. 클러스터링 알고리즘은 데이터 세트 간 그룹으로 특징 그룹화의 공간적 균일성과 관련된 '그룹_품질' 메트릭(metric)을 계산한다. 그런 후 그룹 크기에 의해 분할된, 그룹의 바닥 분위수를 저-품질 점수의 분포의 왜곡된 본성으로 인해 고려대상으로부터 제거하여 15,967개의 그룹을 남겼다. 분석 전 추가의 필터로서, 질환 또는 대조군 부류 중 적어도 하나의 적어도 50%에 존재하는 특징을 가진 그런 그룹만을 이월시켜서 분석에 대해 2,507개의 특징 그룹 세트를 남겼다.
펩타이드 및 단백질 실체를 다음과 같이 특징 그룹에 배정하였다. MS2 PSM 및 MS1 특징 그룹을 상기 기술된 것과 같이 함께 배정하였다 (MS 데이터 분석). 19,249개의 원래의 특징 그룹의 25%를 이 접근법을 사용하여 펩타이드 서열과 연관시켰다. 배정된 펩타이드 서열이 있거나 없는 모든 특징 그룹을 그룹간 일변량 통계 비교를 통해 수행하였다.
실시예 19
통계 분석
이 실시예는 본원에 개시된 데이터의 통계 분석을 기술한다. 통계학적 분석 및 시각화를 적절한 패키지가 있는 R (v3.5.2)을 사용하여 수행하였다 (R: 통계 컴퓨팅을 위한 언어 및 환경. 통계 컴퓨팅을 위한 R 기초, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/).
본 발명의 바람직한 구체예가 본원에서 제시되고 기술되었지만, 그러한 구체예는 단지 예로서 제공된 것임이 기술분야의 숙련된 사람들에게는 명백할 것이다. 수많은 변동, 변화, 및 치환이 이제 발명으로부터 벗어나지 않으면서 기술분야의 숙련된 사람들에게 발생할 것이다. 본원에 기술된 발명의 구체예에 대한 다양한 대안이 발명을 실시하는 데에 사용될 수 있는 것이 이해되어야 한다. 다음의 청구범위가 발명의 범주를 규정하고 이들 청구범위의 범주 내에 있는 방법 및 구조 및 그것들의 동등물이 그로써 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (114)

  1. 샘플 중의 단백질을 확인하는 방법으로서, 방법은:
    입자 패널을 샘플과 함께 인큐베이션하여 입자 패널의 독특한 입자 유형에 상응하는 복수의 독특한 생체분자 코로나를 형성하는 단계;
    입자 패널을 샘플 중의 미결합 단백질로부터 자성적으로 분리하여 복수의 독특한 생체분자 코로나의 단백질을 풍부화하는 단계; 및
    복수의 독특한 생체분자 코로나를 검정하여 풍부화된 단백질을 확인하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 검정 단계는 1 내지 20,000개의 단백질 그룹을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 검정 단계는 1000 내지 10,000개의 단백질 그룹을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계는 1,000 내지 5,000개의 단백질 그룹을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계는 1,200 내지 2,200개의 단백질 그룹을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 그룹은 7개의 아미노산 잔기의 최소 길이를 가지는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계는 1,000 내지 10,000개의 단백질을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계는 1,800 내지 5,000개의 단백질을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 복수의 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 복수의 샘플은 적어도 2개 이상의 공간적으로 분리된 샘플을 포하하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 2개 이상의 공간적으로 분리된 샘플을 동시에 입자 패널과 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 자성적으로 분리하는 단계는 동시에 복수의 샘플의 적어도 2개 이상의 공간적으로 분리된 샘플에서 미결합 단백질로부터 입자 패널을 자성적으로 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계는 적어도 2개 이상의 공간적으로 분리된 샘플에서 단백질을 확인하기 위하여 복수의 독특한 생체분자 코로나를 동시에 검정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법을 반복하는 것을 추가로 포함하며, 반복할 때, 인큐베이션, 분리, 및 검정 단계는 입자 패널의 각각의 입자 유형에 대한 적어도 3개의 전체-검정 복제물로부터의 펩타이드 질량 분석 특징을 비교함으로써 측정되는 바, 20% 이하의 퍼센트 분위수 표준화된 변동 계수 (QNCV)를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 반복될 때, 인큐베이션, 분리, 및 검정 단계는 입자 패널의 각각의 입자 유형에 대한 적어도 3개의 전체-검정 복제물로부터의 펩타이드 질량 분석 특징을 비교함으로써 측정되는 바, 10% 이하의 퍼센트 분위수 표준화된 변동 계수 (QNCV)를 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계는 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10의 동적 범위에 걸쳐 단백질을 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널을 미결합 단백질로부터 자성저으로 분리한 후에 입자 패널을 적어도 1회 또는 적어도 2회 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계 후에 방법은 복수의 독특한 생체분자 코로나의 단백질을 용해시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 복수의 독특한 생체분자 코로나의 단백질을 소화시켜서 소화된 펩타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 소화된 펩타이드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계는 샘플 중의 단백질을 확인하기 위하여 질량 분석을 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 검정 단계는 약 2 내지 약 4시간 내에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 약 1 내지 약 20시간 내에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 약 2 내지 약 10시간 내에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 약 4 내지 약 6시간 내에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 단계는 약 30분 이하, 약 15분 이하, 약 10분 이하, 약 5분 이하, 또는 약 2분 이하가 걸리는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제3항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 샘플은 적어도 10개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 50개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 100개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 150개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 200개의 공간적으로 분리된 샘플, 적어도 250개의 공간적으로 분리된 샘플, 또는 적어도 300개의 공간적으로 분리된 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 복수의 샘플은 적어도 96개의 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 적어도 2개의 독특한 입자 유형, 적어도 3개의 독특한 입자 유형, 적어도 4개의 독특한 입자 유형, 적어도 5개의 독특한 입자 유형, 적어도 6개의 독특한 입자 유형, 적어도 7개의 독특한 입자 유형, 적어도 8개의 독특한 입자 유형, 적어도 9개의 독특한 입자 유형, 적어도 10개의 독특한 입자 유형, 적어도 11개의 독특한 입자 유형, 적어도 12개의 독특한 입자 유형, 적어도 13개의 독특한 입자 유형, 적어도 14개의 독특한 입자 유형, 적어도 15개의 독특한 입자 유형, 적어도 20개의 독특한 입자 유형, 적어도 25 입자 유형, 또는 적어도 30개의 독특한 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 입자 패널은 적어도 10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제10항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 공간적으로 분리된 샘플은 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 2개의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 2개의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 물리화학적 특성은 크기, 전하, 코어 물질, 쉘 물질, 다공도, 또는 표면 소수성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 크기는 동적 광산란, SEM, TEM, 또는 이것들의 임의의 조합에 의해 측정되는 바, 직경 또는 반경인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 카르복실레이트 물질을 포함하며, 제1 독특한 입자는 마이크로입자이고, 제2 독특한 입자 유형은 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 0 mV 내지 -50 mV의 표면 전하를 포함하며, 제1 독특한 입자 유형은 200 nm 미만의 직경을 가지고, 제2 독특한 입자 유형은 200 nm보다 큰 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 100 내지 400 nm의 직경을 포함하며, 제1 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 가지고, 제2 독특한 입자 유형은 중성 표면 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 나노입자이며, 제1 독특한 입자 유형은 -20 mV 미만의 표면 전하를 가지고 제2 독특한 입자 유형은 -20 mV보다 큰 표면 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 마이크로입자이며, 제1 독특한 입자 유형은 음의 표면 전하를 가지고, 제2 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 음전하의 나노입자의 하위세트를 포함하며, 하위세트의 각 입자는 적어도 하나의 표면 화학 그룹이 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형, 제2 입자, 및 제3 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형, 제2 독특한 입자 유형, 및 제3 독특한 입자 유형은 산화철 코어, 중합체 쉘을 포함하며, 직경이 약 500 nm 미만이고 제1 독특한 입자 유형은 음전하를 포함하며, 제2 독특한 입자 유형은 양전하를 포함하고, 제3 독특한 입자 유형은 중성 전하를 포함하며, 직경은 동적 광산란에 의해 측정되는 바 평균 직경인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 제1 독특한 입자 유형은 실리카 코팅을 포함하고, 제2 독특한 입자 유형은 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA)코팅을 포함하며, 제3 독특한 입자 유형은 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA) 코팅을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 마이크로입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 초상자성 산화철 입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 각각의 입자는 산화철 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 산화철 코어를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 폴리스티렌 코어에 내재된 산화철 결정을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 각각의 독특한 입자 유형은 초상자성 산화철 입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 각각의 독특한 입자 유형은 산화철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 각각 하나의 독특한 입자 유형은 폴리스티렌 코어에 내재된 산화철 결정을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 카르복실화된 중합체, 아민화된 중합체, 양쪽이온성 중합체, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 한 입자 유형은 실리카 쉘 코팅을 가진 산화철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 한 입자 유형은 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA) 코팅을 가진 산화철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 한 입자 유형은 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA) 코팅을 가진 산화철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 음의 표면 전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 중성 표면 전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 표 10으로부터 선택된 하나 이상의 독특한 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 표 10으로부터 선택된 2개 이상의 독특한 입자 유형, 3개 이상의 독특한 입자 유형, 4개 이상의 독특한 입자 유형, 5개 이상의 독특한 입자 유형, 6개 이상의 독특한 입자 유형, 7개 이상의 독특한 입자 유형, 8개 이상의 독특한 입자 유형, 9개 이상의 독특한 입자 유형, 또는 전부 10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 표 12로부터 선택된 하나 이상의 독특한 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 표 12로부터 선택된 2개 이상의 독특한 입자 유형, 3개 이상의 독특한 입자 유형, 4개 이상의 독특한 입자 유형, 5개 이상의 독특한 입자 유형, 6개 이상의 독특한 입자 유형, 7개 이상의 독특한 입자 유형, 8개 이상의 독특한 입자 유형, 9개 이상의 독특한 입자 유형, 또는 전부 10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 둘 이상의 물리화학적 특성이 상이한, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형을 포함하는 조성물로서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 하위세트는 둘 이상의 물리화학적 특성의 물리화학적 특성을 공유하며 하위세트의 그러한 입자 유형은 상이한 단백질에 결합하는 것인 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10의 동적 범위에 걸쳐 샘플로부터의 단백질을 흡착하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 샘플로부터 1 내지 20,000개의 단백질 그룹을 흡착할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 샘플로부터 1,000 내지 10,000개의 단백질 그룹을 흡착할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 샘플로부터 1,000 내지 5,000개의 단백질 그룹을 흡착할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  71. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 샘플로부터 1,200 내지 2,200개의 단백질 그룹을 흡착할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 그룹은 7개의 아미노산 잔기의 최소 길이를 가지는 펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  73. 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 샘플로부터 1 내지 20,000개의 단백질을 흡착할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 샘플로부터 1,000 내지 10,000개의 단백질을 흡착할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  75. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 샘플로부터 1,800 내지 5,000개의 단백질을 흡착할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  76. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 적어도 4개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 5개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 6개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 7개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 8개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 9개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 10개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 11개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 12개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 13개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 14개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 15개의 독특한 자성 입자 유형, 적어도 20개의 독특한 자성 입자 유형, 또는 적어도 30개의 독특한 자성 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 조성물은 적어도 10개의 독특한 자성 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  78. 제66항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 2개의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  79. 제66항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 적어도 2개의 물리화학적 특성을 공유하며 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하여서, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  80. 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 물리화학적 특성은 크기, 전하, 코어 물질, 쉘 물질, 다공도, 또는 표면 소수성을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 크기는 동적 광산란, SEM, TEM, 또는 이것들의 임의의 조합에 의해 측정되는 바, 직경 또는 반경인 것을 특징으로 하는 조성물.
  82. 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형 카르복실레이트 물질을 포함하며, 제1 독특한 입자는 마이크로입자이고, 제2 독특한 입자 유형은 나노입자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  83. 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 0 mV 내지 -50 mV의 표면 전하를 가지며, 제1 독특한 입자 유형은 200 nm 미만의 직경을 가지고, 제2 독특한 입자 유형은 200 nm보다 큰 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  84. 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 100 내지 400 nm의 직경을 가지며, 제1 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 가지고, 제2 독특한 입자 유형은 중성 표면 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  85. 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 나노입자이며, 제1 독특한 입자 유형은 -20 mV 미만의 표면 전하를 가지고 제2 독특한 입자 유형은 -20 mV보다 큰 표면 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  86. 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형 및 제2 독특한 입자 유형은 마이크로입자이며, 제1 독특한 입자 유형은 음의 표면 전하를 가지고, 제2 독특한 입자 유형은 양의 표면 전하를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  87. 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 음전하의 나노입자의 하위세트를 포함하며, 하위세트의 각각의 입자 유형은 적어도 하나의 표면 화학 그룹이 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
  88. 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 제1 독특한 입자 유형, 제2 독특한 입자 유형, 및 제3 독특한 입자 유형을 포함하고, 제1 독특한 입자 유형, 제2 독특한 입자 유형, 및 제3 독특한 입자 유형은 산화철 코어, 중합체 쉘을 포함하며, 직경이 약 500 nm 미만이고 제1 독특한 입자 유형은 음전하를 포함하며, 제2 독특한 입자 유형은 양전하를 포함하고, 제3 독특한 입자 유형은 중성 전하를 포함하며, 직경은 동적 광산란에 의해 측정되는 바 평균 직경인 것을 특징으로 하는 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 제1 독특한 입자 유형은 실리카 코팅을 포함하고, 제2 독특한 입자 유형은 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA) 코팅을 포함하며, 제3 독특한 입자 유형은 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA) 코팅을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  90. 제66항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  91. 제66항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 마이크로입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  92. 제66항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 초상자성 산화철 입자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  93. 제66항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 산화철 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  94. 제66항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 산화철 코어를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  95. 제66항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 하나의 독특한 입자 유형은 폴리스티렌 코어에 내재된 산화철 결정을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  96. 제66항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 각각의 독특한 입자 유형은 초상자성 산화철 입자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  97. 제66항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 각각의 독특한 입자 유형은 산화철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  98. 제66항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 각각 하나의 독특한 입자 유형은 폴리스티렌 코어에 내재된 산화철 결정을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  99. 제66항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 중합체 코팅을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  100. 제66항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 카르복실화된 중합체, 아민화된 중합체, 양쪽이온성 중합체, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  101. 제66항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 실리카 쉘 코팅을 가진 산화철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  102. 제66항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA) 코팅을 가진 산화철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  103. 제66항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA) 코팅을 가진 산화철 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  104. 제66항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 음의 표면 전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  105. 제66항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 양의 표면 전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  106. 제66항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형의 적어도 한 입자 유형은 중성 표면 전하를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  107. 제66항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 표 10의 하나 이상의 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  108. 제66항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 표 10으로부터 선택된 2개 이상의 독특한 입자 유형, 3개 이상의 독특한 입자 유형, 4개 이상의 독특한 입자 유형, 5개 이상의 독특한 입자 유형, 6개 이상의 독특한 입자 유형, 7개 이상의 독특한 입자 유형, 8개 이상의 독특한 입자 유형, 9개 이상의 독특한 입자 유형, 또는 전부 10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  109. 제66항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이상의 독특한 자성 입자 유형은 표 12의 하나 이상의 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  110. 제66항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 패널은 표 12로부터 선택된 2개 이상의 독특한 입자 유형, 3개 이상의 독특한 입자 유형, 4개 이상의 독특한 입자 유형, 5개 이상의 독특한 입자 유형, 6개 이상의 독특한 입자 유형, 7개 이상의 독특한 입자 유형, 8개 이상의 독특한 입자 유형, 9개 이상의 독특한 입자 유형, 또는 전부 10개의 독특한 입자 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  111. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법 또는 제67항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물에 있어서, 샘플은 생물학적 샘플인, 방법 또는 조성물.
  112. 제111항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈장, 혈청, CSF, 소변, 눈물, 세포 용해물, 조직 용해물, 세포 균등화물, 조직 균등화물, 유두 흡인물, 대변 샘플, 활액 및 전혈, 또는 타액인 것을 특징으로 하는 방법.
  113. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항의 방법 또는 제67항 내지 제110항 중 어느 한 항의 조성물에 있어서, 샘플은 비-생물학적 샘플인, 방법 또는 조성물.
  114. 제113항에 있어서, 비-생물학적 샘플은 물, 우유, 용매, 또는 균등화된 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3877400A4 (en) 2018-11-07 2022-09-07 Seer, Inc. COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS FOR CROWN PROTEIN ANALYSIS AND THEIR USES
CA3131402A1 (en) * 2019-03-26 2020-10-01 Xiaoyan Zhao Compositions, methods and systems for protein corona analysis from biofluids and uses thereof
CN117169534A (zh) 2019-08-05 2023-12-05 禧尔公司 用于样品制备、数据生成和蛋白质冠分析的***和方法
GB2603051B (en) 2020-01-30 2023-04-26 Prognomiq Inc Lung biomarkers and methods of use thereof
US20230324401A1 (en) * 2020-07-20 2023-10-12 Seer, Inc. Particles and methods of assaying
GB202012434D0 (en) * 2020-08-10 2020-09-23 Univ Manchester Multiomic analysis of nanoparticle-coronas
JP2023540904A (ja) * 2020-08-25 2023-09-27 シアー， インコーポレイテッド タンパク質および核酸をアッセイするための組成物および方法
CN117580584A (zh) * 2021-04-29 2024-02-20 禧尔公司 用于富集特定蛋白质子集的肽修饰纳米颗粒
WO2023141580A2 (en) * 2022-01-20 2023-07-27 Seer, Inc. Particles and methods of assaying
CN114113287A (zh) * 2022-01-25 2022-03-01 北京青莲百奥生物科技有限公司 一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法
CN114791466A (zh) * 2022-03-10 2022-07-26 中国中医科学院中药研究所 一种基于蛋白冠的血清高丰度蛋白去除方法
WO2023245075A2 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 Seer, Inc. Systems and methods for biomolecule assays
GB2620799A (en) * 2022-07-22 2024-01-24 Life Tech As Particles

Family Cites Families (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5498545A (en) 1994-07-21 1996-03-12 Vestal; Marvin L. Mass spectrometer system and method for matrix-assisted laser desorption measurements
US6361944B1 (en) 1996-07-29 2002-03-26 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US5928952A (en) 1997-11-05 1999-07-27 Zymark Corporation Scheduled system and method for processing chemical products
US6406921B1 (en) 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
US6413780B1 (en) 1998-10-14 2002-07-02 Abbott Laboratories Structure and method for performing a determination of an item of interest in a sample
WO2000029829A1 (en) 1998-11-16 2000-05-25 California Institute Of Technology Simultaneous determination of equilibrium and kinetic properties
US20050148101A1 (en) 1999-01-23 2005-07-07 Bamdad Cynthia C. Interaction of colloid-immobilized species with species on non-colloidal structures
US20020009394A1 (en) 1999-04-02 2002-01-24 Hubert Koster Automated process line
US6969615B2 (en) 1999-07-26 2005-11-29 20/20 Genesystems, Inc. Methods, devices, arrays and kits for detecting and analyzing biomolecules
DE60117556T2 (de) 2000-06-21 2006-11-02 Bioarray Solutions Ltd. Multianalytische molekularanalyse durch verwendung anwendungsspezifischer zufallspartikelarrays
US20050053999A1 (en) 2000-11-14 2005-03-10 Gough David A. Method for predicting G-protein coupled receptor-ligand interactions
US6649419B1 (en) * 2000-11-28 2003-11-18 Large Scale Proteomics Corp. Method and apparatus for protein manipulation
US6780602B2 (en) 2001-11-01 2004-08-24 Microbiosystems, Limited Partnership Taxonomic identification of pathogenic microorganisms and their toxic proteins
CA2483445C (en) 2002-04-26 2011-04-19 Abbott Laboratories Structure and method for handling magnetic particles in biological assays
JP4587954B2 (ja) 2002-07-24 2010-11-24 バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド タンパク質相互作用相違マッピング
WO2004027379A2 (en) 2002-09-20 2004-04-01 Novus Molecular, Inc. Methods and devices for active bioassay
AU2004258218B2 (en) * 2003-07-18 2009-05-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for multi-analyte detection
EP1580559B1 (en) * 2004-03-23 2013-12-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the variance between analyte concentrations taken from complex sample mixtures
CN101073002B (zh) 2004-09-15 2012-08-08 英特基因有限公司 微流体装置
DE102004051785B4 (de) 2004-10-25 2008-04-24 Bruker Daltonik Gmbh Proteinprofile mit Luft-MALDI
US9002652B1 (en) 2005-01-27 2015-04-07 Institute For Systems Biology Methods for identifying and using organ-specific proteins in blood
EP1871726A2 (en) 2005-03-23 2008-01-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Diverse chemical libraries bound to small particles with paramagnetic properties
JP4841618B2 (ja) 2005-03-23 2011-12-21 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド タンパク質を精製するための方法
US9588124B2 (en) 2005-05-11 2017-03-07 Georgia Tech Research Corporation Shape tunable plasmonic nanoparticles
AU2006249340A1 (en) 2005-05-26 2006-11-30 Ensemble Discovery Corportion Biodetection by nucleic acid-templated chemistry
GB0514910D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
US9267937B2 (en) 2005-12-15 2016-02-23 Massachusetts Institute Of Technology System for screening particles
CA2821426A1 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Abbott Laboratories Methods and marker combinations for screening for predisposition to lung cancer
US9347945B2 (en) 2005-12-22 2016-05-24 Abbott Molecular Inc. Methods and marker combinations for screening for predisposition to lung cancer
CN100374857C (zh) * 2006-01-26 2008-03-12 复旦大学 快速富集痕量多肽或蛋白质并实现鉴定的方法
WO2008030631A2 (en) 2006-02-03 2008-03-13 Microchip Biotechnologies, Inc. Microfluidic devices
CA2641851A1 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Eric Hans Vermaas Method for sequencing a polynucleotide template
EP1882948A2 (de) 2006-07-28 2008-01-30 Qiagen GmbH Vorrichtung zur Probenverarbeitung
WO2008025016A2 (en) 2006-08-25 2008-02-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for high-throughput, minimally-invasive radiation biodosimetry
WO2008083323A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Invitrogen Corporation Detection apparatus
US7815803B2 (en) 2007-06-14 2010-10-19 Roche Diagnostics Operations, Inc. Preparation of samples for LC-MS/MS using magnetic particles
WO2009044900A1 (ja) 2007-10-05 2009-04-09 Hokkaido University 糖鎖自動前処理装置
CN101896605A (zh) 2007-10-12 2010-11-24 普罗诺塔股份有限公司 适体在蛋白质组学中的用途
US8021891B2 (en) 2007-11-28 2011-09-20 University Of Massachusetts Methods and compositions for protein detection using nanoparticle-fluorescent polymer complexes
US20100291224A1 (en) 2008-01-03 2010-11-18 Yen Wah Tong Nanostructures, methods of preparing and uses thereof
KR20110030415A (ko) 2008-01-22 2011-03-23 인터젠엑스 인크. 만능 샘플 제조 시스템 및 집적 분석 시스템에서의 용도
KR101039629B1 (ko) 2008-05-22 2011-06-08 성균관대학교산학협력단 생체물질의 검출방법, 생체물질 검출용 칩의 제조방법 및생물질 검출용 칩
WO2010042555A2 (en) 2008-10-06 2010-04-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Particles with multiple functionalized surface domains
WO2010078601A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 The Regents Of The University Of California High throughput biomolecule separation and analysis
WO2010089138A1 (en) * 2009-02-09 2010-08-12 Caprotec Bioanalytics Gmbh Devices, systems and methods for separating magnetic particles
DK3290530T3 (da) 2009-02-18 2020-12-07 Streck Inc Konservering af cellefrie nukleinsyrer
WO2010097785A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 University College Dublin, National University Of Ireland, Dublin A method for the selective concentration of a specific low abundance biomolecule
EP2443459B1 (en) 2009-06-19 2018-12-26 The Arizona Board of Regents, A Body Corporate Of the State of Arizona acting for and on behalf Of Arizona State University Compound arrays for sample profiling
WO2011059721A1 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Tethys Bioscience, Inc. Protein and lipid biomarkers providing consistent improvement to the prediction of type 2 diabetes
EP2524219A4 (en) 2010-01-14 2013-08-07 Univ Central Florida Res Found METHODS OF DETECTION AND ANALYSIS OF BIOMOLECULES AND BIOMOLECULE COMPLEXES (BMC) AND THEIR USE FOR MEDICAL RESEARCH AND DIAGNOSIS
EP2534265A4 (en) 2010-02-10 2013-09-11 Univ California SALIVARY BIOMARKERS FOR THE DETECTION OF LUNG CANCER
AU2011263546B2 (en) 2010-06-10 2015-01-22 Midatech Limited Peptide-carrying nanoparticles
US9549901B2 (en) 2010-09-03 2017-01-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lipid-polymer hybrid particles
US9329176B2 (en) 2010-11-18 2016-05-03 Academia Sinica Glycopeptide-functionalized nanoparticles arrays for capturing and detecting biomolecules
US10144950B2 (en) 2011-01-31 2018-12-04 Roche Sequencing Solutions, Inc. Methods of identifying multiple epitopes in cells
GB201103726D0 (en) 2011-03-04 2011-04-20 Immunovia Ab Method, array and use thereof
US20130058923A1 (en) 2011-08-03 2013-03-07 Qun Huo Biomolecular interactions and interaction products as biomarkers for detection, diagnosis, prognosis and predicting therapeutic responses of human diseases
BR112014002975A2 (pt) 2011-08-08 2017-03-01 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings S A R L composições de biomarcador e métodos
US10444245B2 (en) 2012-05-24 2019-10-15 Vib Vzw Trapping mammalian protein-protein complexes in virus-like particles utilizing HIV-1 GAG-bait fusion proteins
CN102798658A (zh) * 2012-07-20 2012-11-28 浙江大学 血清中低丰度低分子量蛋白的分析方法
EP2880475B1 (en) 2012-07-30 2023-10-18 3M Innovative Properties Company UV STABLE ASSEMBLIES COMPRISING MULTI-LAYER OPTICAL FILMs
US20140194315A1 (en) 2013-01-08 2014-07-10 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Methods and compositions for rapid functional analysis of gene variants
US20170074869A1 (en) 2014-02-07 2017-03-16 European Molecular Biology Laboratory Proteomic sample preparation using paramagnetic beads
ES2676553T3 (es) 2014-03-26 2018-07-20 F. Hoffmann-La Roche Ag IGFBP7 para el diagnóstico de la disfunción diastólica
EP2957912A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 University College Dublin A method of labelling a target molecule forming part of a corona of molecules on a surface of a nanosized object
WO2016061201A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nanoparticles and methods of use
CN105771942B (zh) * 2014-12-26 2018-06-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种磁性纳米材料及其制备与应用
TWI547693B (zh) 2015-05-07 2016-09-01 希華晶體科技股份有限公司 感測方法及感測晶片
US10900975B2 (en) 2015-05-12 2021-01-26 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Systems and methods of epitope binning and antibody profiling
CN105126736A (zh) * 2015-07-23 2015-12-09 江苏大学 环氧基磁性纳米硅球的制备方法及其应用
US11474102B2 (en) 2015-11-23 2022-10-18 Massachusetts Institute Of Technology Protein corona phase molecular recognition
WO2017100697A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The General Hospital Corporation Dextran nanoparticles for macrophage specific imaging and therapy
CN106268707B (zh) * 2016-08-11 2018-08-28 北京蛋白质组研究中心 一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法
GB201615128D0 (en) 2016-09-06 2016-10-19 Univ Manchester Methods
CN106432644B (zh) * 2016-09-23 2018-09-07 河南中医药大学 一种亲水型聚合物功能化磁性纳米微球及其制备方法和应用
EP4365597A2 (en) 2016-12-01 2024-05-08 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods of assaying proteins
DE202017007364U1 (de) 2016-12-16 2021-02-11 The Brigham And Women's Hospital Inc. Anordnung markierter Sensorelemente zum Erfassen unterschiedlicher Proteine, die unterschiedliche Sensorelemente binden
US20210072255A1 (en) 2016-12-16 2021-03-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. System and method for protein corona sensor array for early detection of diseases
EP4372383A2 (en) 2017-10-23 2024-05-22 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods and systems for protein identification
CN107991277B (zh) * 2017-11-27 2020-10-16 陕西中药研究所(陕西医药信息中心) 五羟色胺-磁性微粒复合物及富集唾液酸化糖蛋白的方法
JP7458678B2 (ja) 2017-12-29 2024-04-01 ノーティラス・サブシディアリー・インコーポレイテッド タンパク質同定のためのデコーディングアプローチ方法
EP3877400A4 (en) 2018-11-07 2022-09-07 Seer, Inc. COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS FOR CROWN PROTEIN ANALYSIS AND THEIR USES
CA3131402A1 (en) 2019-03-26 2020-10-01 Xiaoyan Zhao Compositions, methods and systems for protein corona analysis from biofluids and uses thereof
CN117169534A (zh) 2019-08-05 2023-12-05 禧尔公司 用于样品制备、数据生成和蛋白质冠分析的***和方法
WO2021087407A1 (en) 2019-11-02 2021-05-06 Seer, Inc. Systems for protein corona analysis
US20230324401A1 (en) 2020-07-20 2023-10-12 Seer, Inc. Particles and methods of assaying

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