CN114113287A - 一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法 - Google Patents

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CN114113287A CN202210084225.4A CN202210084225A CN114113287A CN 114113287 A CN114113287 A CN 114113287A CN 202210084225 A CN202210084225 A CN 202210084225A CN 114113287 A CN114113287 A CN 114113287A
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Abstract

本发明公开了一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法。本发明针对目前血清蛋白质组样品制备方法的局限性，建立了基于表面亲水与疏水性材料混合的磁性纳米材料，利用纳米颗粒‑蛋白在溶液中接触所形成在的“蛋白冠”，实现了对血清蛋白的非浓度依赖性富集，结合高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS）与优化建立的数据非依赖型质谱扫描模式，实现了对血清蛋白质组的深度覆盖与精准定量检测。

Description

一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法，属于蛋白质组分析领域。
背景技术
血清样品是来源稳定，生物信息丰富的重要临床样本。而蛋白质是生命活动或生物功能的直接执行者，因此血清样品中的大分子蛋白质的丰度变化，可以间接灵敏的反映生物体内脏器的疾病状态，目前血清样品是临床上首选的生物标志物来源之一。然而血清样品也是分析难度最高的样品，血清中的白蛋白含量约占血清全部蛋白总质量的50%，血清中丰度最高的22种蛋白丰度占所有血清蛋白丰度总和的99%，目前预测血清中的蛋白种类超过1万种，浓度动态范围超过10个数量级，传统的基于质谱的血清蛋白质组研究中，质谱会反复检测这些高丰度蛋白，导致可能成为潜在生物标志物的低丰度蛋白很难被检测到。目前通用的血清蛋白质组检测策略是采用亲和富集的方法去除血清中的白蛋白、IgG等高丰度蛋白，或通过质谱检测前的色谱多级分馏模式，来降低血清蛋白样品的复杂度，提高中低丰度血清蛋白的质谱检测效率。但高丰度蛋白在血清中是一类重要的载体，血清中非常多的蛋白都会与高丰度蛋白结合来实现转运或者发挥生物功能。因此血清高丰度蛋白去除的同时，很多与其结合的中低丰度蛋白也会被同时损失掉，影响血清中蛋白定量结果的真实性与准确性。利用色谱多级分流可以降低血清样品复杂度，降低血清样品的动态范围，但也会显著增加质谱检测的扫描时间，更重要的是多级分流导致样品变异度增加，定量准确性降低，无法应用于规模化、高通量的临床蛋白质组分析。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种血清蛋白制备方法。
本发明所提供的血清蛋白制备方法，包括如下步骤：
（1）将血清样品低温低速离心，弃去沉淀，保留上清液；
（2）向步骤（1）所得上清液中加入稀释缓冲液；
（3）向步骤（2）所得的样品溶液中加入表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒，孵育反应，磁性分离收集磁性纳米颗粒；
（4）向步骤（3）所得磁性纳米颗粒中加入消化缓冲液，反应；
（5）向步骤（4）所得体系中加入胰蛋白酶，酶解得到血清蛋白质组样品。
上述方法步骤（1）中，所述低温低速离心的温度可为2~8℃，优选4℃；离心力可为500~2000 RCF，优选1000 RCF或1500 RCF；离心时间可为10~20分钟，优选15或10分钟；
步骤（2）中，所述稀释缓冲液可为PBS缓冲液，所述稀释缓冲液与上清液等体积混合；
步骤（3）中，所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒为表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒；
所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒的粒径可为50~200nm；
所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒中，亲水性颗粒与疏水性颗粒的质量比可为10~5:1，优选10:1；
所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒的用量为10~50µg/µl所述血清样品；
所述表面亲水与疏水性改性的混合磁性纳米颗粒可根据现有方法进行制备，也可根据下述方法进行制备：
a）高温热分解法制备Fe3O4磁性纳米颗粒，步骤如下：
在1.46 g 三氯化铁、3.6 g 乙酸钠、0.4 g 柠檬酸钠加入15 m L乙二醇和 45 mL二乙二醇，得到 Fe3+分散液，分散液加入反应釜，反应釜设置温度为200 ℃，反应时间为 10h，反应釜冷却至室温，磁性纳米颗粒用磁铁收集，用乙醇与去离子水连续洗涤，最后将磁性纳米颗粒分散于去离子水中，即得到 Fe3O4 磁性纳米颗粒分散液；
b）制备 Fe3O4@SiO2 磁性纳米颗粒，步骤如下：
取 1.2 g Fe3O4 磁性纳米颗粒分散于 740 mL混合溶剂 (乙醇: 水体积比 = 25 :12)中，加入 12 mL的氨水，超声搅拌30分钟；将8 mL的正硅酸乙酯溶解于50mL的乙醇中，超声后，使用注射器缓慢滴加完后，超声反应 6小时，温度保持在 35°C 以下，反应完成后，Fe3O4@SiO2 磁性纳米颗粒用磁铁收集，用乙醇与水连续洗涤，最后将Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒分散于去离子水中，即得到Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒分散液；
c）制备甲基丙烯酰胺葡萄糖单体（GMA-G），步骤如下：取 1 mL 甲基丙烯酸缩水甘油酯与适量 0.2 M 硫酸混合反应后，加入 10 mmol/L 高碘酸钠，用锡箔纸包裹避光反应4 小时，称取 1.1 g 氨基葡萄糖盐酸溶于 20 mL 甲醇中磁力搅拌器搅拌6 小时生成淡黄色溶液，将高碘酸钠处理后的甲基丙烯酸缩水甘油酯反应液逐滴加入此淡黄色溶液中搅拌过夜，氮气吹干至 4 mL，4 ℃保存待用；
d）制备表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒，步骤如下：利用原子转移自由基聚合法（ATRP）在Fe3O4@SiO2引发聚合反应，将亲水/疏水单体聚合在Fe3O4@SiO2表面，即得：将ATRP反应引发剂3-（2-bromoisobutyramido） propyl(triethoxy)silane）溶解在95%乙醇中，使其终浓度为 74 mg/ml，引发剂和Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒混合，室温反应 6小时，用甲醇清洗掉剩余引发剂后，加入 ATRP 反应液（0.015 mol/L N,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯三胺, 0.001 mol/L CuCl2, 0.01 mol/L CuCl, 和 2 mol/L 亲水的GMA-G/苯乙烯）封口， 60 ℃震摇反应 4-6 小时，聚合反应结束后，用甲醇清洗去除剩余反应液，磁性分离收集管底部的棕色沉淀即为表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒。
所述孵育反应的条件可为：25~37℃下孵育反应5~10分钟；
上述方法步骤（3）和（4）之间还可进一步包括：采用清洗缓冲液重悬磁性纳米颗粒得到重悬液，涡旋震荡清洗后，将所述重悬液磁性分离后去除上清，保留沉淀磁性纳米颗粒的操作；
其中，所述清洗缓冲液可为100mM PBS缓冲液（pH值为7~8）；
所述涡旋震荡清洗的条件如下：
离心力为800~1200 rpm，28~37℃，时间为1~5分钟；
上述方法步骤（4）中，所述消化缓冲液包含能破坏二硫键的还原剂以及烷基化巯基的烷基化试剂；
具体地，所述消化缓冲液含有n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（n-Dodecyl β-D-maltoside，DDM），还原试剂及烷基化试剂；
其中，所述还原试剂可为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或β巯基乙醇；
所述烷基化试剂可为碘乙酰胺或氯乙酰胺；
更具体地，所述消化缓冲液为含有0.05~1%（溶解0.05-1g的物质在100ml的消化缓冲液中）n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、10~20mM三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)和30~45mM氯乙酰氨 (2-Chloroacetamide，CAA)的50-100 mM碳酸氢铵缓冲液（Ammonium bicarbonate,ABC）或三乙基碳酸氢铵缓冲液（Triethylammoniumbicarbonate ，TEAB），pH值为8.0~8.5；
所述消化缓冲液的加入量20-50ul /25µl所述血清样品；
所述反应的温度可为45~95℃，具体可为60-95℃，时间可为10-60分钟，具体可为10~45分钟；
步骤（5）中，待步骤（4）所得体系冷却至室温后向其中加入胰蛋白酶；
所述胰蛋白酶为测序级的胰蛋白酶，
所述胰蛋白酶的加入量为10~100ng/µl所述血清样品；
所述酶解的条件可为：温度为25~37℃，时间为6~16小时。
上述方法在酶解后还可进一步包括对酶解后体系脱盐的操作，步骤如下：向步骤（5）所得体系中加入20%的三氟乙酸（20ul纯三氟乙酸加入到80ul的水后配成的溶液），离心，吸取上清，低温冷冻干燥，脱盐，即得血清蛋白质组样品。
其中，三氟乙酸的加入量为使得体系中三氟乙酸的终体积浓度为1%；
所述离心的条件可为：4℃，14000g离心10-15分钟；
所述脱盐为使用反相C18脱盐柱进行脱盐。
本发明方法简化了血清蛋白的制备方法，提高了血清蛋白质谱检测的定性深度与定量准确度，可用于高通量、深度血清蛋白质组检测。
本发明提供的血清蛋白质组样品可用于血清中低丰度蛋白的质谱深度覆盖检测。
本发明另一目的是提供一种血清蛋白质组样品的质谱检测方法。
本发明所提供的血清蛋白质组样品的质谱检测方法，包括如下步骤：
按照上述方法制备血清蛋白质组样品；
采用多肽反相色谱进行分离，采用高场非对称波形离子迁移谱进行质谱鉴定；
其中，使用Thermo Fisher的Easy1200液相串联Orbitrap Exploris 480质谱进行数据非依赖型采集；
液相条件为：使用柱长25 cm的C18反相色谱柱（内径75 µm，粒径1.9 µm，Dr.MaischGmbH company）；
流动相A为0.1%（v/v） 甲酸（formic acid，FA）水溶液，流动相B为0.1%（v/v） FA80%（v/v） 乙腈溶液（甲酸占整个B相溶液的体积比为1:1000，即流动相B为0.1%的 FA乙腈水溶液（4:5，v/v），流速为600nl/min；
洗脱梯度如下：0-8min，7-12% B；8-60min，12-30% B；60-65min，65-84% B；84-85min，42-95% B 及 85-90min，95% B。
质谱鉴定为数据非依赖型采集模式，扫描方式为正离子扫描模式，一级质谱采用Orbitrap检测，分辨率12,000/30,000@ m/z 200，最大注入时间为 20 ms，扫描范围为 m/z200~2000，最大离子注入时间为Auto，目标AGC设为1 000%，归一化碎裂能量为 32%，FAIMS补偿电压设置为-45V 或者-65V 或者-45V-65V；每次采集的 DIA 隔离窗口为2-3Th，隔离窗口数目为 40-60，每次 （Gas-phase fractionation, GPF）覆盖120 Th的m/z范围，分别进行CV-45V和CV-65V的GPF-DIA数据采集，归一化碎裂能量为32％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明针对目前血清蛋白质组样品制备方法的局限性，建立了基于表面亲水与疏水性材料混合的磁性纳米材料，利用纳米颗粒-蛋白在溶液中接触所形成在的“蛋白冠”，实现了对血清蛋白的非浓度依赖性富集，结合高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS）与优化建立的数据非依赖型质谱扫描模式，实现了对血清蛋白质组的深度覆盖与精准定量检测。
附图说明
图1为本发明方法与商业化去高丰度试剂对人血清样品处理后的电泳图。
图2为本发明方法处理人血清样品后的质谱检测结果中蛋白的浓度分布。
图3为本发明方法处理人血清样品经不同质谱数据采集方法得到的蛋白定量值变异系数分布。
图4为本发明方法处理的10例人血清样品，经不同质谱数据采集方法检测后的空缺值分布统计。
图5 为本发明方法处理的同1例血清样品6次质谱DIA重复检测后的蛋白定量强度分布。
图6为本发明方法处理的同1例血清样品6次重复质谱DIA检测后的蛋白定量值相关性分布统计。
图7为本发明方法处理的9例不同人血清样品，经两次质谱DIA数据采集方法检测后的蛋白定量值变异系数值分布柱状图。
图8为本发明方法处理的9例不同人血清样品，经两次质谱DIA数据采集方法检测后的蛋白定量比值分布箱式图。
图9为本发明方法处理的人血清样品在不同质谱DIA数据采集时间时，血清蛋白/多肽鉴定数量的统计柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所采用的表面亲水与疏水性改性的混合磁性纳米颗粒根据下述方法进行制备：
a）高温热分解法制备Fe3O4磁性纳米颗粒，步骤如下：
在1.46 g 三氯化铁、3.6 g 乙酸钠、0.4 g 柠檬酸钠加入15 m L乙二醇和 45 mL二乙二醇，得到 Fe3+分散液，分散液加入反应釜，反应釜设置温度为200 ℃，反应时间为 10h，反应釜冷却至室温，磁性纳米颗粒用磁铁收集，用乙醇与去离子水连续洗涤，最后将磁性纳米颗粒分散于去离子水中，即得到 Fe3O4 磁性纳米颗粒分散液；
b）制备 Fe3O4@SiO2 磁性纳米颗粒，步骤如下：
取 1.2 g Fe3O4 磁性纳米颗粒分散于 740 m L混合溶剂 (乙醇: 水体积比 = 25 :12)中，加入 12 mL的氨水，超声搅拌30分钟；将8 mL的正硅酸乙酯溶解于50mL的乙醇中，超声后，使用注射器缓慢滴加完后，超声反应 6小时，温度保持在 35°C 以下，反应完成后，Fe3O4@SiO2 磁性纳米颗粒用磁铁收集，用乙醇与水连续洗涤，最后将磁性纳米颗粒分散于去离子水中，即得到Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒分散液；
c）制备甲基丙烯酰胺葡萄糖单体（GMA-G），步骤如下：取 1 mL 7.3 mol/L甲基丙烯酸缩水甘油酯与0.2 M 硫酸混合反应后，加入 5 µl 10 mmol/L 的高碘酸钠，用锡箔纸包裹避光反应 4 小时，称取 1.1 g 氨基葡萄糖盐酸溶于 20 mL 甲醇中磁力搅拌器搅拌6小时生成淡黄色溶液，将高碘酸钠处理后的甲基丙烯酸缩水甘油酯反应液逐滴加入此淡黄色溶液中搅拌过夜，氮气吹干至 4 mL，4 ℃保存待用；
d）制备表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒，步骤如下：利用原子转移自由基聚合法（ATRP）在Fe3O4@SiO2引发聚合反应，将亲水与疏水单体聚合在Fe3O4@SiO2表面，即得：将ATRP反应引发剂3-（2-bromoisobutyramido） propyl(triethoxy)silane）溶解在95%乙醇中，使其终浓度为 74 mg/ml 2 ml体积引发剂乙醇溶液和100mg Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒混合，室温反应 6小时，用甲醇清洗掉剩余引发剂后，加入 1ml体积的ATRP 反应液（0.015 mol/L N,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯三胺, 0.001 mol/L CuCl2, 0.01 mol/LCuCl, 和 2 mol/L 亲水的GMA-G/苯乙烯）封口， 60 ℃震摇反应 4 h小时，聚合反应结束后，用甲醇清洗去除剩余反应液，磁性分离收集管底部的棕色沉淀即为表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒。
所得表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒的粒径分别为200—400 nm、200—350 nm。
本发明提供了一种血清蛋白质组的样本制备方法，包括如下步骤：
（1）将血清样品低温低速离心后去除底部颗粒及不溶物，保留上清；
血清为25µl至1000µl，低温为2~8℃，优选4℃，离心力为500~2000 RCF，优选1000RCF，离心时间为10~20分钟，优选15分钟；
（2）将上清使用PBS缓冲液等体积稀释后，加入表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒，37℃孵育5~10分钟，表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒为表面葡聚糖修饰的亲水磁性纳米颗粒与表面聚苯乙烯修饰的疏水性磁性纳米颗粒，共计1.25mg，质量比为10:1；
（3）将混有纳米颗粒的血清磁性分离后，去除上清后，底部沉淀使用清洗缓冲液清洗，涡旋震荡清洗。将清洗磁性分离去除上清。涡旋清洗时间1~5分钟，清洗强度800-1200rpm，优选2 分钟，1200 rpm。
清洗缓冲液为100mM PBS缓冲液(pH=7.4)，加入清洗缓冲液后涡旋震荡2分钟，优选2次；
（4）在上述沉淀物中加入消化缓冲液，高温反应一定时间后，加入测序级胰蛋白酶，37℃旋转混合过夜，制备得到血清蛋白质组样品。
消化缓冲液为含有1%DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，DDM）的40mM TEAB缓冲液(pH8.5)，还含有还原试剂二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，烷基化试剂碘乙酰胺或氯乙酰胺，高温为45~95℃，优选三(2-羧乙基)膦与氯乙酰胺，95℃反应10分钟。
本发明进一步对血清蛋白进行了液相-质谱分离及检测，检测可按下面的方法进行：包括在多肽反相色谱、高场非对称波形离子迁移谱的分离、质谱鉴定，在线分离-质谱分析为液相色谱-质谱联用鉴定，分离使用柱长25cm的C18反相色谱柱（内径 75µm），填料直径1.9µm），质谱鉴定为质谱数据非依赖型采集模式。
实施例1、血清蛋白质组的制备
（1）从冰箱中取25μl血清于室温解冻，4℃、1500 RCF离心10分钟，去除底部细胞、颗粒沉淀后将上清转移至新管。
（2）上清中加入25μl PBS缓冲液，再加入1.25 mg混合纳米颗粒（亲水与疏水性混合的磁性纳米材料以质量比 10：1混合）在37℃旋转孵育10min。
（3）孵育完成后磁性分离5分钟去掉上清溶液，沉淀用200μl PBS涡旋震荡清洗2分钟，磁性分离5分钟去掉上清溶液。
（4）加入20 μl 1% DDM，10 mM TECP，40mM CAA的100 mM TEAB的消化缓冲液(pH8.5)，95℃反应10分钟，加入测序级胰蛋白酶1ug，37℃反应16小时。
（5）向步骤（4）的体系中加入20%TFA（体积分数）使溶液中TFA终浓度为1%，冰上放置10分钟，4℃，14000RCF离心10分钟，转移上清至新的EP管中后低温冷冻干燥、脱盐即可进行后续质谱分析检测。
实施例2、血清蛋白质组的质谱检测
血清蛋白质组样品的制备方法同实施例1。
采用10μl的上样缓冲液（0.1％（v/v）甲酸）溶解，然后取2μl质谱检测，利用ThermoScientific的纳升级液相色谱串联高分辨质谱 (nLC-Easy1200- OrbitrapExploris 480)进行数据采集。
纳升液相色谱预柱及分析柱规格如下：
预柱：3µm粒径C18填料，2cm×150µm内径（填料为Dr.Maisch GmbH公司）。
分析柱（分离柱）：1.9µm粒径 C18填料，25cm×75µm内径（填料为Dr.Maisch GmbH公司）。
流动相A为0.1% （v/v）体积比（1000ul的水中加入1ul的甲酸）甲酸（formic acid，FA）水溶液，流动相B为0.1%（v/v） FA 80% （v/v）乙腈溶液，流速为600nl/min。
肽分离洗脱梯度如下：0-8min，7-12% B；8-60min，12-30% B；60-65min，65-84% B；84-85min，42-95% B；85-90min，95% B。
质谱鉴定为数据非依赖型采集模式，扫描方式为正离子扫描模式，一级质谱采用Orbitrap检测，分辨率12,000/30,000@ m/z 200，最大注入时间为 20 ms，扫描范围为 m/z200~2000，最大离子注入时间为Auto，目标AGC设为1 000%，归一化碎裂能量为 32%，FAIMS补偿电压设置为-45V 或者-65V 或者-45V-65V；每次采集的 DIA 隔离窗口为2-3Th，隔离窗口数目为 40-60，每次 （Gas-phase fractionation, GPF）覆盖120 Th的m/z范围，分别进行CV-45V和CV-65V的GPF-DIA数据采集，归一化碎裂能量为32％。
所得质谱数据利用Spectronaut软件，版本号 15.2 21089.50606，进行DIA数据检索。在Spectronaut软件模板中对数据库搜索的各项参数进行设定：“Protein Database”选用Uniprot数据库的human蛋白质序列数据库（下载日期2021.11.20，数据库蛋白条目为20375）；在“Enzymes/cleavage rule”中勾选Trypsin；在“Digest Type”中勾选Specific；在“Missed Cleavages”中勾选2；在“Precursor Mass Tolerance”中填 20ppm；在“Variable Modifications”中勾选Acetyl(Protein N-term)、Oxidation(M)；在“FixedModifications”中勾选Carbamidomethyl(C)。其它参数按软件默认设置”。
表1的血清蛋白质组质谱鉴定结果表明，实施例2的质谱鉴定方法结合实施例1的样本制备过程，可以实现血清蛋白质组的深度覆盖研究，其结果与不处理的血清及两种常用商业化血清高丰度蛋白去除方法相比，可以达到更深的鉴定规模。
表1 实施例2质谱鉴定的血清蛋白数量
Figure 702603DEST_PATH_IMAGE001
图1为采用商品化去高丰度试剂柱（赛默飞世尔HSA/Immunoglobulin去除小柱/安捷伦多重亲和Human 14去除小柱）与本发明方法制备的血清蛋白质组样品的电泳图，其中，泳道M：为蛋白分子量marker，泳道NP：经本发明方法处理的血清样品取20µg蛋白上样，泳道Top2：Thermo Fisher HSA/Immunoglobulin去除小柱处理的样品取20µg蛋白上样, 泳道Top14：Agilent Human 14去除小柱处理的样品取20µg蛋白上样, 泳道plasma：未经处理的人血清样品20µg蛋白上样。可以看出，本发明可以在短时间完成血清/血浆中低丰度蛋白的富集，并且在SDS-PAGE胶上的高丰度去除效果与商业化试剂无任何明显区别。图2为使用本发明方法（NP）处理血清样品后，可以显著提高血清中低丰度蛋白的鉴定深度，处理后的血清样品中低丰度蛋白鉴定数量明显增多，鉴定到的血清蛋白丰度范围明显改善。图3为本发明方法中采用数据非依赖(Data Independent Acquisition，DIA)的质谱采集模式结合高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS），与传统数据依赖型采集方式(Data dependentAcquisition，DDA)相比，显著降低了同一样品多次鉴定后的蛋白定量变异系数值，提高了蛋白定量的准确度，图4为使用本发明方法（NP）处理血清样品及发展的血清蛋白质谱采集方法结合高场非对称波形离子迁移谱，实现了血清蛋白的深度覆盖并且蛋白定量空缺值少于传统的质谱数据依赖型采集方法。图5为使用本发明方法（NP）处理血清样品及发展的血清蛋白质谱采集方法多次重复血清蛋白检测实验中，血清蛋白定量值分布趋势相同。图6为使用本发明方法（NP）处理血清样品及发展的血清蛋白质谱采集方法多次重复血清蛋白检测实验中，蛋白定量相关性均大于90%。图7为使用本发明方法（NP）处理不同人血清样品，2次质谱重复检测血清蛋白，同一人的血清蛋白定量变异系数均大于70%，表明该方法在扩大样本量后仍能保持良好的定量准确性。图8为使用本发明方法（NP）处理不同人血清样品，2次重复血清蛋白质谱检测中，同一人的所有蛋白定量比值分布中位数均维持在1左右，表明所有血清蛋白的定量准确性良好。图9为使用本发明方法（NP）处理血清样品结合质谱DIA检测，延长质谱扫描时间，可以显著提高血清蛋白的鉴定深度。
由上述分析结果可以看出，在血清蛋白质组检测中，新方法具有高通量、深度定性、定量血清/血浆蛋白质组的特点，并且质谱检测时间短（每个血样的检测时间为90分钟，而现有血清样本处理技术实现同等蛋白鉴定规模需要多溜分色谱分离，共需要12~24的质谱检测机时）。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.一种血清蛋白制备方法，包括如下步骤：
（1）将血清样品低温低速离心，弃去沉淀，保留上清液；
（2）向步骤（1）所得上清液中加入稀释缓冲液；
（3）向步骤（2）所得的样品溶液中加入表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒，孵育反应，磁性分离收集磁性纳米颗粒；
（4）向步骤（3）所得磁性纳米颗粒中加入消化缓冲液，反应；
（5）向步骤（4）所得体系中加入胰蛋白酶，酶解得到血清蛋白质组样品；
步骤（3）中，所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒为表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述低温低速离心的温度为2~8℃；离心力为500~2000 RCF；离心时间为10~20分钟；
步骤（2）中，所述稀释缓冲液为PBS缓冲液，所述稀释缓冲液与上清液等体积混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒的粒径为50~200nm；
所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒中，亲水性颗粒与疏水性颗粒的质量比为10~5:1；
所述表面亲水与疏水改性的混合磁性纳米颗粒的用量为10~50µg/µl所述血清样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面亲水与疏水性改性的混合磁性纳米颗粒根据下述方法进行制备：
高温热分解法制备Fe3O4磁性纳米颗粒，
b）制备 Fe3O4@SiO2 磁性纳米颗粒，
c）制备甲基丙烯酰胺葡萄糖单体，
d）制备表面葡聚糖/聚苯乙烯修饰的磁性纳米颗粒，即表面亲水与疏水性改性的混合磁性纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孵育反应的条件为：25~37℃下孵育反应5~10分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述消化缓冲液包含能破坏二硫键的还原剂以及烷基化巯基的烷基化试剂；
所述消化缓冲液含有n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷，还原试剂及烷基化试剂；
其中，所述还原试剂为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦或β巯基乙醇；
所述烷基化试剂为碘乙酰胺或氯乙酰胺；
所述消化缓冲液的加入量20-50ul /25µl所述血清样品；
所述反应的温度为45~95℃，时间为10-60分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，待步骤（4）所得体系冷却至室温后向其中加入胰蛋白酶；
所述胰蛋白酶的加入量为10~100ng/µl所述血清样品；
所述酶解的条件为：温度为25~37℃，时间为6~16小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在酶解后还进一步包括对酶解后体系脱盐的操作，步骤如下：向步骤（5）所得体系中加入20%的三氟乙酸，离心，吸取上清，低温冷冻干燥，脱盐，即得血清蛋白质组样品；
其中，三氟乙酸的加入量使得体系中三氟乙酸的终浓度为1%。
9.一种血清蛋白质组样品的质谱检测方法，包括如下步骤：
按照权利要求1-8中任一项所述方法制备血清蛋白质组样品；
采用多肽反相色谱进行分离，采用高场非对称波形离子迁移谱进行质谱鉴定；
其中，使用Thermo Fisher的Easy1200液相串联Orbitrap Exploris 480质谱进行数据非依赖型采集。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
液相条件为：使用柱长25 cm的C18反相色谱柱；
流动相A为0.1% 甲酸水溶液，流动相B为0.1% 甲酸 80% 乙腈溶液，流速为600nl/min；
洗脱梯度如下：0-8min，7-12% B；8-60min，12-30% B；60-65min，65-84% B；84-85min，42-95% B and 85-90min，95% B；
质谱鉴定为数据非依赖型采集模式，扫描方式为正离子扫描模式，一级质谱采用Orbitrap检测，分辨率12,000/30,000@ m/z 200，最大注入时间为 20 ms，扫描范围为 m/z200~2000，最大离子注入时间为Auto，目标AGC设为1 000%，归一化碎裂能量为 32%，FAIMS补偿电压设置为-45V 或者-65V 或者-45V-65V；每次采集的 DIA 隔离窗口为2-3Th，隔离窗口数目为 40-60，每次覆盖120 Th的m/z范围，分别进行CV-45V和CV-65V的GPF-DIA数据采集，归一化碎裂能量为32％。
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