KR20230137443A

KR20230137443A - 거울상 선택성으로 뒤집힌 ω-트랜스아미나제 돌연변이체의 구성 및 적용

Info

Publication number: KR20230137443A
Application number: KR1020237029776A
Authority: KR
Inventors: 슈앙준 린; 치 리우; 지신 덩; 팅팅 후앙
Original assignee: 제지앙 아펠로아 강유 파마슈티칼 씨오.,엘티디.; 아펠로아 파마슈티컬 씨오.,엘티디.
Priority date: 2021-02-05
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2023-10-04
Also published as: BR112023015759A2; CL2023002311A1; EP4289946A1; MX2023009213A; WO2022166838A1; CN117043323A

Abstract

본 발명은 SEQ ID NO: 13에 기재된 서열에서 아미노산 돌연변이의 서열을 갖는 트랜스아미나제 돌연변이체를 제공한다. 또한 해당 단백질 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 기재된 것과 같고, 해당 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 기재된 것과 같은 거울상 선택성으로 뒤집힌 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 제공하며; 또한 상기 뉴클레오티드 서열을 운반하는 플라스미드, ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 발현하는 유전자 조작 박테리아 및 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체가 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

거울상 선택성으로 뒤집힌 ω-트랜스아미나제 돌연변이체의 구성 및 적용

본 발명은 2021년 2월 5일 중국 특허청에 출원된 출원번호 202110162624.3, 발명 명칭 '거울상 선택성으로 뒤집힌 ω-트랜스아미나제 돌연변이체의 구성 및 응용' 및 2021년 5월 24일 중국 특허청에 출원된 출원번호 202110567238.2, 발명 명칭 '효소 캐스케이드 반응을 이용한 (1R, 2R)-AMPP의 합성 방법'에 대한 중국 특허 출원에 우선권을 요구하며, 그 모든 내용은 인용을 통해 본 발명에 포함된다.

본 발명은 효소 공학 분야에 관한 것으로, 트랜스아미나아제 돌연변이체의 구성 및 적용에 관한 것으로, 특히 거울상 선택성으로 뒤집힌 ω-트랜스아미나아제 돌연변이체의 구성 및 적용에 관한 것이다.

트랜스아미나제는 α-트랜스아미나제와 ω-트랜스아미나제 두 가지 유형으로 나뉜다. α-트랜스아미나제는 I형, III형 및 IV형 아족을 포함하며 아미노기 전이반응 촉매 시 기질 케톤의 α-카르복실산에 의존한다. 반면 II형 아족에 속하는 ω-트랜스아미나제는 기질 케톤의 α-카르복실산에 의존하지 않으며, 다양한 지방족 케톤 및 방향족 케톤의 비대칭 아미노기 전이반응에 광범위하게 사용되어 입체 특이성 아민을 생성한다. 그 중 ATA117 은 널리 사용되는 ω-트랜스아미나아제 중 하나다. 2008년 Wolfgang Kroutil 연구팀은 ATA117이 4-페닐-2-뷰타논과 같은 일련의 방향족 케톤과 옥탄온과 같은 지방족 케톤을 효율적으로 촉매하여 ee≥99%인 R-구성 아민을 생산할 수 있다고 보고했다. 2010년 Wolfgang Kroutil 연구팀은 ATA117이 유기 셀레늄 아세토페논을 촉매하여 입체 특이성 R-p-셀레늄 페닐에틸아민을 생성할 수 있다고 보고했는데, 팔라듐 촉매제인 키랄 리간드이다. 같은 해 GregoryJ. Hughes 연구팀은 ATA117을 여러 차례 효소 진화시켜 ATA-117-Rd11 돌연변이체를 얻었으며, 이 돌연변이체는 큰 입체 장해 기질인 시타글립틴 전구체 케톤의 촉매 작용을 효과적으로 수행했다. 반면 Yu-GuoZheng 연구팀은 2020년 ATA-117-Rd11 돌연변이체를 활용하여 촉매 생산한 입체 특이성 L-글루포시네이트 생성물, ee>99%, 80kg의 반응 전구체를 24 시간 동안 70 kg의 L-글루포시네이트 생성물로 전환했다. 요약하면, ω-트랜스아미나아제 ATA117 은 기질 스펙트럼이 비교적 광범위하여 다양한 기질을 효과적으로 촉매함으로써 입체 특이성 아민을 생산할 수 있다.

ω-트랜스아미나제는 입체 특이성 아민을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 오르토 키랄 중심에 대해 특정 거울상 선택성을 가진다. 2009년 Wolfgang Kroutil 연구팀은 ω트랜스아미나제 ATA117로 라세미 알데히드 기질을 광학분할하여 R-4-페닐기-2-피롤리돈을 얻었다고 보고했다. ATA117 은 알데히드 오르토의 카이랄 중심에 대해 거울상 선택성을 가지며, 공용매 및 pH의 최적화를 통해 아미노기전 생성물의 ee는 68%에 도달할 수 있다. 2013년 Vicente Gotor 연구팀이 라세미 α-알킬기-β-케톤에스테르에 대한 24 개 상용 S-및 R-트랜스아미나제의 광학분할을 조사한 결과, 촉매 효율은 높지만 부분 입체 선택성은 좋지 않은 것으로 나타났다. 2014년 Wolfgang Kroutil 연구팀이 슈드모나스속, 아르트로박터속, 아스페르질루스 테레우스 및 하이포모나스에서 추출한 ω-트랜스아미나제의 라세미 2-페닐 프로피온알데히드 및 파라-메타-오르토 메틸과 메톡시로 치환된 2-페닐 프로피온알데히드에 대한 광학분할을 조사한 결과, 이러한 트랜스아미나제가 오르토 키랄 중심에 대해 보이는 입체 선택성은 ee(R)= 76-98%인 것으로 나타났다. 2018 년 Wolfgang Kroutil 연구팀은 아르트로박터KNK168, 아스페르질루스테레우스, 필라멘트 모양의 곰팡이 푸사리움, 하이포모나스, 네오사르토리야 피쉐리, 바실러스 메가테리움 및 기타 출처에서 ω-트랜스아미나제에 의한 라세미 지방족 알데히드의 광학분할을 조사하였고, 한 단계의 아미노기 전이반응을 통해 높은 입체 선택성을 갖는 항간질 약물 브리바라세탐 및 프레가발린을 얻었다. 그중, 하이포모나스에서 추출한 ω-트랜스아미나제는 1 단계 광학분할을 통해 ee가 92%에 달하는 높은 입체 선택성을 지닌 R-브리바라세탐 키랄 중간체를 얻을 수 있었다. Wolfgang Kroutil 연구팀은 필라멘트 모양의 곰팡이 푸사리움에서 추출한 ω-트랜스아미나제 및 ArRmut11 돌연변이체를 기반으로 몇 개의 아미노산 부위를 돌연변이시켰다. 이때 생성된 돌연변이체는 라세미 지방족 알데히드와 S-프레가발린의 합성을 촉매하는데, 이들의 ee는 각각 76%와 80%에 도달할 수 있다. 2019년 Iva nLavandera 연구팀은 일련의 상업용 트랜스아미나제와 바실러스 메가테리움에서 추출한 트랜스아미나제 및 그 돌연변이체의 라세미 α-알킬기-β-케토아미드 기질에 대한 광학분할 상황을 보고했다. 그중, 상업용 R 트랜스아미나제가 이러한 기질에 대해 가장 높은 촉매 효율 및 입체 선택성을 가졌으며, 부분 입체 선택성 de는 96%에 달했다. 반면 바실러스 메가테리움에서 추출한 트랜스아미나제와 그 돌연변이체는 일부 기질만 치환할 수 있고 부분 입체 선택성이 상대적으로 낮았다. 종합해보면 대부분의 보고서에서는 다른 종에서 추출한 ω-트랜스아미나제를 스크리닝하여 알데히드 기질의 오르토 키랄 중심에 대한 높은 입체 선택성을 얻을 수 있는 반면, 상업용 트랜스아미나제를 스크리닝하면 α-알킬기-β-케토아미드와 같은 케톤 기질의 오르토 키랄 중심에 대해 높은 입체 선택성을 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 그러나 키랄 방향족 하이드록시케톤 화합물에 대한 ω-트랜스아미노 효소의 거울상 선택성에 관한 문헌 보고는 아직 없다.

따라서 이 분야의 기술자들에게 어떻게 키랄 방향족 하이드록시케톤 화합물에 대한 높은 거울상 선택성을 갖는 ω-트랜스아미나제를 제공하여 이를 (1R,2R)-아미노디올 생성물의 광학분할 합성에 적용할 것인지는 시급히 해결해야 할 문제이다.

현재 키랄 방향족 하이드록시케톤 화합물에 대한 높은 거울상 선택성을 갖는 ω-트랜스아미나제를 제공하여 이를 (1R,2R)-아미노디올 생성물의 광학분할 합성에 적용하는 방법은 시급히 해결해야 할 문제이다.

[1]. 일종의 트랜스아미나제 돌연변이체. 여기서, 상기 트랜스아미나제 돌연변이체는 SEQ ID NO: 13에 열거된 서열에서 아미노산 돌연변이된 서열을 가지며, 상기 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 아래 어느 하나의 돌연변이다:

V69F, V69G, V69A, V69L, V69I, V69P, V69M, V69W, V69S, V69Q, V69T, V69C, V69N, V69Y, V69D, V69E, V69K, V69R, V69H, V69A+F122G, V69A+F122A, V69A+F122L, V69A+F122I, V69A+F122V, V69A+F122P, V69A+F122M, V69A+F122W, V69A+F122S, V69A+F122Q, V69A+F122T, V69A+F122C, V69A+F122N, V69A+F122Y, V69A+F122D, V69A+F122E, V69A+F122K, V69A+F122R, V69A+F122H, V69A+F122C+I157F, V69A+F122C+I157G, V69A+F122C+I157A, V69A+F122C+I157L, V69A+F122C+I157I, V69A+F122C+I157V, V69A+F122C+I157P, V69A+F122C+I157M, V69A+F122C+I157W, V69A+F122C+I157S, V69A+F122C+I157Q, V69A+F122C+I157T, V69A+F122C+I157C, V69A+F122C+I157N, V69A+F122C+I157Y, V69A+F122C+I157D, V69A+F122C+I157E, V69A+F122C+I157K, V69A+F122C+I157R, V69A+F122C+I157H, V69A+F122C+I157H+F225G, V69A+F122C+I157H+F225A, V69A+F122C+I157H+F225L, V69A+F122C+I157H+F225I, V69A+F122C+I157H+F225V, V69A+F122C+I157H+F225P, V69A+F122C+I157H+F225M, V69A+F122C+I157H+F225W, V69A+F122C+I157H+F225S, V69A+F122C+I157H+F225Q, V69A+F122C+I157H+F225T, V69A+F122C+I157H+F225C, V69A+F122C+I157H+F225N, V69A+F122C+I157H+F225Y, V69A+F122C+I157H+F225D, V69A+F122C+I157H+F225E, V69A+F122C+I157H+F225K, V69A+F122C+I157H+F225R, V69A+F122C+I157H+F225H.

[2] [1]에서 서술한 트랜스아미나제 돌연변이체에 따라 거울상 선택성으로 뒤집힌 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체. 여기서, 상기 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체의 단백질 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1와 같다.

[3]. [2]에서 서술한 트랜스아미나제 돌연변이체. 여기서, 상기 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체는 ω-트랜스아미나제 ATA117의 아미노산 서열의 반복 포화 돌연변이에 의해 생성되고, 상기 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이는 위치 N1의 발린, 위치 N2의 페닐알라닌, 위치 N3의 이소류신 및 위치 N4의 페닐알라닌 중 적어도 하나의 돌연변이를 가진다.

[4]. [3]에서 서술한 트랜스아미나제 돌연변이체. 여기서, 위치 N1의 발린은 알라닌으로 돌연변이되고, 위치 N2의 페닐알라닌은 시스테인으로 돌연변이되며, 위치 N3의 이소류신은 히스티딘으로 돌연변이되고, 위치 N4의 페닐알라닌은 히스티딘으로 돌연변이된다.

[5]. 일종의 DNA 뉴클레오티드 서열. 여기서, 상기 DNA 뉴클레오티드 서열은 [1] 내지 [4] 중 어느 한 항목에서 서술한 트랜스아미나제 돌연변이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

[6]. [5]에서 서술한 일종의 DNA 뉴클레오티드 서열. 여기서, 상기 DNA 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2와 같다.

[7]. [6]에서 서술한 DNA 뉴클레오티드 서열을 운반하는 플라스미드이다.

[8]. 일종의 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 발현하는 유전자 조작 박테리아. 여기서, 상기 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체의 단백질 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1와 같다.

[9]. [8]에서 서술한 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이를 발현하는 유전자 조작 박테리아를 구성하는 방법으로 A1, ATA117 코드를 가진 유전자의 재조합 플라스미드를 주형으로 사용하는 단계; A2, 돌연변이를 포함하는 프라이머를 설계 및 합성하는 단계; A3, 역 PCR로 전체 플라스미드를 증폭하는 단계; A4, PCR 생성물을 발현 숙주로 변환하는 단계를 포함한다.

[10]. [9]에서 서술한 일종의 ω-트랜스아미나제ATA117 돌연변이체를 발현하는 유전자 조작 박테리아를 구성하는 방법. 여기서, 상기 발현 숙주는E.coli BL21(DE3)이다.

[11].[1] 내지 [4] 중 어느 한 항목에서 서술한 트랜스아미나제 돌연변이체에 기반한 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐페닐프로판의 제조 방법: 상기 트랜스아미나제 돌연변이체 순수 단백질을 촉매제로 완충시스템에서 라세미 1,3-디하이드록시-1-메틸설포닐프로피오케논을 촉매하고, 광학분할을 통해 높은 입체 선택성 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노기-1-p-메틸설포닐페닐프로판을 얻는다.

또한, 상기 기술적 문제를 해결하기 위해 본 발명은 半합리적 설계에 기반하여 ω-트랜스아미나제 ATA117를 분자 개조하고, 유전자 반복포화와 돌연변이 방법을 결합하여 상응하는 돌연변이체를 얻었다.

본 발명의 제1측면은, SEQ ID NO: 13에 나열된 서열 중 아미노산 돌연변이가 발생하는 서열을 갖는 트랜스아미나제 돌연변이체를 제공한다. 여기서 발생한 아미노산 돌연변이는 아래 어느 하나의 돌연변이를 포함한다:

본 발명의 제2측면은, 일종의 거울상 선택성으로 뒤집힌 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 제공하며, 해당 돌연변이체의 단백질 아미노산 서열은SEQ ID NO: 1에 열거된(SEQ ID NO: 13 서열 기반 아미노산 돌연변이 V69A+F122C+I157H+F225) 바와 같다.

SEQ ID NO: 1의 구체적인 서열은 아래와 같다:

MAFSADTSEI VYTHDTGLDY ITYSDYELDP ANPLAGGAAW IEGAFVPPSE ARISIFDQGY 60

LHSDVTYTAF HVWNGNAFRL DDHIERLFSN AESMRIIPPL TQDEVKEIAL ELVAKTELRE 120

ACVSVSITRG YSSTPGERDI TKHRPQVYMY AVPYQWHVPF DRIRDGVHAM VAQSVRRTPR 180

SSIDPQVKNF QWGDLIRAVQ ETHDRGFEAP LLLDGDGLLA EGSGHNVVVI KDGVVRSPGR 240

AALPGITRKT VLEIAESLGH EAILADITLA ELLDADEVLG CTTAGGVWPF VSVDGNPISD 300

GVPGPVTQSI IRRYWELNVE SSSLLTPVQY 330

또한, 돌연변이체는 ATA117의 아미노산 서열이 반복적인 포화와 돌연변이에 의해 생성되고, 위치 N1의 발린, 위치 N2의 페닐알라닌, 위치 N3의 이소류신, 및 위치 N4의 페닐알라닌 중 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다.

또한, 위치 N1의 발린은 알라닌으로 돌연변이된다.

또한, 위치 N2의 페닐알라닌은 시스테인으로 돌연변이된다.

또한, 위치 N3의 이소류신은 히스티딘으로 돌연변이된다.

또한, 위치 N4의 페닐알라닌은 히스티딘으로 돌연변이된다.

또한, 돌연변이체는 라세미된 p-메틸설포닐 페닐 디하이드록시 케톤(도 1의 화학식 1')에 대해 비교적 높은 R-거울상 선택성을 가진다.

본 발명의 제3측면은, 해당 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA를 제공한다.

또한, DNA의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 표시된 것과 같다.

SEQ ID NO: 2의 구체적인 서열은 아래와 같다:

atggcattta gcgcggatac cagcgaaatc gtctataccc acgataccgg tctggattac 60

atcacctaca gcgattacga actggatccg gcaaatccgt tagcaggcgg cgcagcttgg 120

attgaaggcg catttgttcc gccgtctgaa gcgcgtatta gcatcttcga tcagggctat 180

ctgcatagcg acgttaccta taccgcattc cacgtttgga acggtaacgc atttcgtctg 240

gacgatcaca tcgaacgtct gttcagcaac gccgaaagta tgcgtattat tccgccgctg 300

acccaagacg aagtcaaaga aatcgcgctg gaactggttg caaaaaccga actgcgcgaa 360

gcgtgtgtta gcgttagcat tacccgcggt tatagtagta ccccgggcga acgcgatatt 420

accaaacatc gtccgcaggt ctacatgtac gctgttccgt accagtggca tgttccgttt 480

gatcgtattc gcgacggcgt tcacgcaatg gttgcacaga gcgtgcgtcg taccccgcgt 540

agcagcatcg atccgcaggt caaaaacttc cagtggggcg atttaattcg cgcagttcag 600

gaaacccacg atcgcggttt tgaagcaccg ttactgttag acggcgacgg tttactggca 660

gaaggtagcg gccataacgt cgtcgtcatt aaagatgggg ttgttcgttc tccgggtcgt 720

gcagcattac cgggtattac ccgcaaaacc gttctggaaa ttgcggaatc cctgggtcat 780

gaagcgattc tggcggatat taccttagcg gaactgctgg acgcagacga agttttaggt 840

tgtaccaccg ctggcggcgt ttggccgttt gttagcgttg acggcaatcc gattagcgat 900

ggtgttccgg gtccggttac ccaaagcatt attcgtcgct actgggagct gaacgttgaa 960

agtagcagcc tgttaacccc ggttcagtat taa 993

본 발명의 제4 측면은, 상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 플라스미드를 제공한다.

또한, ω-트랜스아미나제 ATA117 유전자 암호를 운반하는 재조합 플라스미드는 Synbio Technologies Co. Ltd.에서 ATA117 유전자를 합성한 다음, 효소 절단하여 pRSFduet-1 벡터 sal I/HindIII 효소 절단 부위에 연결 삽입하여 수득한다.

본 발명의 제5 측면은, ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이를 발현하는 유전자 조작 박테리아를 제공한다.

또한, 유전자 조작 박테리아를 구성하는 방법은 A1, ATA117 코드를 가진 유전자의 재조합 플라스미드를 주형으로 사용하는 단계; A2, 돌연변이를 포함하는 프라이머를 설계 및 합성하는 단계; A3, 역 PCR로 전체 플라스미드를 증폭하는 단계 및 A4, PCR 생성물을 발현 숙주로 변환하는 단계를 포함한다.

또한, 발현 숙주는 E.coli BL21(DE3) 이다.

본 발명의 제6측면은, ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체에 의해 (1R,2R)-1,3-디히드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판 (도 1의 화학식 2b)을 제조하는 방법을 제공한다: ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체 순수 단백질을 촉매제로 완충시스템에서 라세미 1,3-디하이드록시-1-p-메틸설포닐 프로피오페논 (도 1의 화학식1')을 촉매하고, 광학분할을 통해 높은 입체 선택성 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판 (도1의 화학식 2b)을 얻는다.

또한, 완충시스템은 단일 수상 시스템이다.

본 발명에서 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판은 (1R,2R)-2-아미노기-1-(4-(메틸설포닐)페닐)프로판-1,3-디올로도 칭할 수 있으며 약칭은 (1R,2R)-AMPP이다.

1. 본 발명에서 얻은 ATA117_ACHH 돌연변이체는 방향족 하이드록시케톤 화합물의 오르토-키랄 중심에 대해 비교적 높은 R-선택성을 가지며, 이는 키랄 하이드록시케톤 화합물에 대한 ω-트랜스아미나제의 거울상 선택성에 관한 연구를 보완한다.

2. 돌연변이체 ATA117_ACHH은 라세미 하이드록시케톤에 대한 광학분할로 높은 입체 선택성을 지닌 (1R,2R)-아미노 알코올을 얻을 수 있다. (1R,2R)-아미노 알코올 다양한 약물 중간체, 예컨데 티암페니콜, 플로르페니콜 및 슈도에페드린과 같은 키랄 중간체이다. 따라서, 상기 돌연변이체는 키랄 약물 중간체의 합성에 사용될 가능성이 있다.

3. 야생형 ATA117은 키랄 1,3-디하이드록시-1-p-메틸설포닐 피논아세톤1에 대한 거울상 이성질체 비율이 8.5E(S)인 반면, ATA117_ACHH 돌연변이체의 거울상 이성질체 비율은 11.7E(R)이다. 본 발명에서 수득한 돌연변이체는 키랄 (1R,2R)-아미노디올 생성물 합성에 적용할 수 있는 토대를 마련했다.

도 1은 화합물(화학식 1')에 대한 ATA117_ACHH 돌연변이체의 광학분할 개략도이다.
도 2는 ATA117_ACHH 돌연변이체 단백질 광학분할 라세미 기질(화학식 1')과 화학식 2a 및 화학식 2b의 합성에 대한 전환율 개략도이다.
도 3은 ATA117_ACHH 돌연변이체 단백질 광학분할 라세미 기질 (화학식 1')과 화학식 2a 및 화학식 2b의 합성에 대한 입체 선택성 개략도이다.
도 4는 C18 칼럼 조건에서 메틸설포닐 벤젤알데히드를 기질로 하는 반응 생성물의 액상이다.
도 5는 키랄 액상 조건에서 메틸설포닐 벤젤알데히드를 기질로 하는 트레오 반응 생성물의 액상 다이어그램이다.
도 6은 반응 생성물 (1R,2R)-AMPP의 수소 스펙트럼이다.
도 7은 반응 생성물 (1R,2R)-AMPP의 탄소 스펙트럼이다.
도 8은 C18 컬럼 조건하에서 벤젤알데히드를 기질로 하는 반응 생성물의 액상 다이어그램, 즉 효소 캐스케이드로 촉매된 벤젤알데히드 반응 생성물의 고성능 액상 크로마토그래피이다. 여기서, A는 효소 캐스케이드 반응 생성물의 HPLC 크로마토그래피이고; B는 (1R,2R)-페닐세리놀의 표준물질이며; C는 트레오 및 에리트로 생성물의 혼합물의 표준물질이다.
도 9는 C18 컬럼 조건하에서 p-톨루알데히드를 기질로 하는 반응 생성물의 액체 크리마토그래피, 즉 효소 캐스케이드로 촉매된 p-톨루알데히드 반응 생성물의 고성능 액체 크로마토그래피이다. 여기서, A는 효소 캐스케이드 생성물의 HPLC 크로마토그래피이고; B는 (1R,2R)-p-메틸 페닐세리놀의 표준물질이며; C는 트레오와 에리트로 생성물의 혼합 표준물질이다.

다음은 구체적인 실시예와 함께 데이터를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 예시할 뿐이며 어떠한 방식으로도 발명의 범위를 제한하지 않는다는 점을 이해해야 한다.

본 발명에 기술된 생물학적 재료 출처 대한 일반적인 설명은:

(1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판은 황스융신바이오테크유한회사(黃石永信生物科技有限公司)에서 구매했다. 일반 액체 크로마토그래피 컬럼 C18(4.6×250mm, 입자 크기 5μm) 은 페이뤄먼과학기구회사(菲羅門科學儀器公司) 제품이다; 키랄 액체 크로마토그래피 칼럼 IG(4.6 × 250mm, 입자 크기 5μm)는 다사이루약물키랄기술유한회사(大賽藥物手性技術有限公司) 제품이다.

본 명세서에서, 메폭시, 메탄설포닐 및 메탄설포닐기는 동일한 화학 구조를 나타낸다.

실시예1. 반복되는 포화 돌연변이

VN-F：agcgacgttacctataccnnkttccacgtttggaacggtaacgca （SEQ ID NO: 3）

VN-R：accgttccaaacgtggaamnnggtataggtaacgtcgctatgcag （SEQ ID NO: 4）

FN-F：accgaactgcgcgaagcgnnkgttagcgttagcattacccgcggt （SEQ ID NO: 5）

FN-R：ggtaatgctaacgctaacmnncgcttcgcgcagttcggtttttgc （SEQ ID NO: 6）

IN-F: gctgttccgtaccagtggnnkgttccgtttgatcgtattcgcgac （SEQ ID NO: 7）

IN-R: aatacgatcaaacggaacmnnccactggtacggaacagcgtacat （SEQ ID NO: 8）

FN-F: ctggcagaaggtagcggcnnkaacgtcgtcgtcattaaagatggg （SEQ ID NO: 9）

FN-R: tttaatgacgacgacgttmnngccgctaccttctgccagtaaacc （SEQ ID NO: 10）

여기서 n은 a, t, c 및 g의 임의의 염기를 나타내고, k는 t 또는 g 염기를 나타내고, m은 a 또는 c 염기를 나타내며, 해당 축퇴 코돈은 20 개의 무작위 아미노산을 암호화할 수 있다.

(1) 재조합 플라스미드 pRSFduet-1-ATA117은 주형으로 사용하고, VN-F 및 VN-R은 프라이머로 사용하며, PhantaMax 중합효소 (Vazyme에서 구매)를 사용하여 PCR 증폭(95℃ 5min； 95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 5min，34개 순환； 72℃ 10min)을 진행한다. PCR 생성물은 FD-DpnI 소화 (30℃ 인큐베이터, 6h) 경과 후 E.coliBL21(DE3) 수용성 세포로 직접 변형된다. 소생액을 충분히 불어넣어 고르게 혼합하고 약 1/8의 소생액을 카나마이신 내성 LB 플레이트에 코팅하고 37℃에서 12-16h 배양하여 재조합 하위 라이브러리를 얻는다.

(2) 상기 희석 플레이트 위의 모든 단일 콜로니 (약 40개)를 골라 카나마이신 내성 LB 배지에서 37℃로 7-8h 배양한다. 배양액의 일부는 시퀀싱에 사용하고, 나머지 배양액은 잠시 4℃의 냉장고에 넣어 단기 보관한다. 시퀀싱이 정확한 형질전환체 배양액을 1%의 접종량으로 카나마이신-내성 5mL LB 배양 배지를 담은 신선한 24 웰 플레이트로 옮기고 37℃에서 3h 배양한 후, 0.2mM IPTG 유도제를 첨가하여 20℃에서 15h 배양하여 재조합 유전자의 효율적인 발현을 유도하고, 재조합 세포를 4,000rpm에서 원심분리하여 박테리아를 수집하고, -80℃에서 저장한다. 동일한 유도 방법으로 PRSFduet-1-ATA117 재조합 박테리아를 대조군으로 구한다.

(3) 수득한 재조합 박테리아를 50mM Tris-Cl(pH = 7.5) 현탁액 300㎕에 첨가하고, 초음파로 분쇄하고, 저온 원심분리하고, 상청액은 라세미 1,3-디히드록시-1-p-메틸설포닌 프로피오페논 촉매에 사용한다.

(4) (3)의 상기 반응 생성물을 사용하여 C18 컬럼의 부분 입체 선택성을 측정하며, 액상 분석 조건은 실시예2에 기재된 바와 같다. 실험 결과 ATA117/VN 포화 돌연변이체에서 ATA117 돌연변이체의 S-하이드록시케톤에 대한 기질 선택성이 야생형 ATA117보다 현저히 낮았으므로 ATA117_A를 다음 라운드 FN 포화 돌연변이 주형으로 선택한다. 돌연변이체의 구성, 발현, 반응 및 검출 방법은 전술한 바와 같다. 실험 결과 ATA117_A/FN 포화 돌연변이체에서 키랄 하이드록시케톤 기질에 대한 ATA117_AC 돌연변이의 선택성이 역전되었으므로 ATA117_AC를 다음 라운드 IN 포화 돌연변이 주형으로 선택한다. IN 포화 돌연변이는 후 FN 돌연변이를 반복하였고, R-하이드록시케톤 기질에 대한 높은 선택성을 갖는 돌연변이체 ATA117_ACHH를 최종적으로 수득한다.

실시예2. 트랜스아미나제의 발현 및 정제

트랜스아미나제의 발현 및 정제 방법은, LB 고체 배지에서 재조합 플라스미드를 함유한 대장균군 E.coli BL21(DE3)의 단일 콜로니를 수집하여, 40ml의 LB 액체 배지(50㎍/ml의 카나마이신 항생제 함유)에 접종하고, 37℃, 220rpm에서 밤새 배양한다. 7.5 ml의 박테리아 배양액을 500ml의 액체 LB 배지를 포함하는 2L 쉐이크 플라스크에 옮기고, 2병을 접종한 다음 OD600 이 0.6-0.8에 도달할 때까지 37 ℃ 및 220 rpm에서 배양하고, 0.2mM IPTG를 첨가하여 유도, 20℃, 200rp에서 15h 유도 배양한다. 1L의 발효액을 수집하고, 5,000rpm에서 20분간 원심분리로 세포를 수집하며, 수집한 세포를 30mL의 니켈 컬럼 결합 완충액에 재현탁하고 얼음물 혼합물에 넣는다.

실시예3. ATA117 및 그 돌연변이체의 거울상 선택성 테스트

반응 시스템 총 100 μl(50mM Tris-Clbuffer, pH7.5), 2mM 라세미 1,3-디하이드록시-1-p-메틸설피논 프로피오케논, 2mM PLP， 200mM D-Ala， 5μM ATA117， 20μM ATA117_A， 20μM ATA117_AC， 40μM ATA117_ACH， 40μM ATA117_ACHH은 30℃에서 1h 반응하고, 반응이 끝나면 200μl 메탄올을 추가하여 반응을 종료한다. 앨리전트 액체상을 사용하여 시료를 분석한다. C18 컬럼(4.6×150mm, 입자 크기 3μm), 컬럼 온도 30℃， 224nm， 0.5ml/min， A상：H2O(10mM KH2PO4， pH=8.5)， B상: 아세토니트릴. 크로마토그래피 조건은 표 1에 표시된 것과 같다:

[표 1] 크로마토그래피 조건

(1S,2R)-및 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-1-p-메틸설포닐 프로피오페논 아민화 생성물의 보류 시간은 각각 13.2분 및 14.1분이었다. de=(RR-SR)/(RR+SR)，E=ln[1-c×(1+de)]/ln[1-c×(1-de)]. 여기서, RR 및 SR은 (1R,2R)-및 (1S,2R)-1,3-디하이드록시-1-p-메틸설포닐 페닐프로판 아민화 생성물의 농도를 나타내고, c는 라세미 1,3-디하이드록시-1-p-메틸설포닐 페닐프로판의 전환율을 나타낸다.

테스트 결과는 표 2와 같다:

[표 2] ATA117 및 그 돌연변이체의 거울상 이성질체 비율(E)

De는 부분 입체 이성질체 초과값을 나타낸다.

실시예4. ATA117_ACHH를 응용한 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판의 합성

반응 시스템은 총 100μl(100mM Tris-Cl buffer, pH 7.5)， 25μM ATA117_ACHH 순수 단백질, 5Mm 라세미 1,3-디하이드록시-1-p-메틸설포닐 프로피오케논， 2mM PLP， 200mM D-Ala， 10mM NADH， 90U/ml LDH， 200mM 포도당， 30U/ml GDH로 구성되었으며, 30℃에서 15min，30min，1h，2h，3h，4h，반응 후 메탄올을 추가하여 반응을 종료한다. 반응 생성물은 우선 보통 액상 컬럼으로 분리하고, 부분 입체 이성질체의 선택성을 조사하며 분석 방법은 상기와 같다. (에리트로)-및 (트레오)-1,3-디하이드록시-1-p-메틸설포닐 페닐프로파논 아민화 생성물(즉, 1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판)의 보류 시간은 각각 13.2 및 14.1 분이다. 액상의 피크에 따라, (트레오)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판 시료를 수집하고 농축한 다음 키랄 액상 컬럼으로 한단계 더 원심분리하여 거울상 이성질체의 선택성을 조사한다. 거울상 이성질체 분석 조건은 키랄 컬럼 IG컬럼, 컬럼 온도 25℃, 0.5 ml/min, 224nm이고; 크로마토그래피 조건은 순수 메탄올 (0.1% 디에틸아민 함유), 15분이다. (1R,2R)-및(1S,2S)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판의 체류 시간은 각각 5.6min 및 9.4min이었다. ee=[(RR-SS)/(RR SS)]×100%이다. 여기서, RR (화학식2b) 및 SS는 (1R,2R)-및 (1S,2S)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판을 나타낸다. ATA117_ACHH 돌연변이체 단백질과 (1R,2R)-1,3-디하이드 록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판(화학식2b)의 합성 촉매 전환율 및 입체선택성 개략도는 도 2와 도 3에 표시된 것과 같다.

실시예5. ATA117_ACHH 및 기타 돌연변이체를 이용한 (1R,2R)-AMPP 및 그 유도체의 합성

(1R,2R)-AMPP 및 그의 유도체의 합성 방법은, 벤즈알데히드 유도체를 기질로 사용하여 대장균군 트랜스케톨라제 돌연변이체의 작용 하에 아미노기 전이반응을 진행하고 화학식2에 표시된 반응 생성물을 수득한다. 이어서 화학식2에 표시된 화합물을 기질로 사용하여 트랜스아미나제 ATA117 돌연변이의 작용하에 아미노기 전이반응을 수행한다. 아미노기 공여체는 D-알라닌, D-글리신, D-발린, D-류신, D-이소류신, D-메티오닌, D-프롤린, D-트립토판, D-세린, D-타이로신, D-시스테인, D-페닐알라닌, D-아스파라긴, D-글루타민, D-트레오닌, D-아스파르트산, D-글루타민산, D-라이신, D-아르기닌, D-히스티딘 또는 이소프로필아민으로 화학식 3에 표시된 (1R,2R)-AMPP 및 그 유도체와 합성하였다.

이와 관련된 반응식은 아래와 같다:

이하 상기 방법을 상세히 설명한다:

1단계: 대장균으로부터 트랜스케톨라제 돌연변이체의 발현 및 정체

SEQ ID NO: 12에 표시된 서열에서 상기 아미노산 돌연변이가 발생한 뉴클레오티드 서열을 벡터 pET28a에 도입하고, 숙주 E.coliBL21 에 도입한다; 이어 LB 고체 배지에서 재조합 플라스미드를 함유하는 대장균군 E.coli BL21의 단일 콜로니를 선택하고, 40ml LB 액체 배지(50μg/ml 카나마이신 항생제 함유)에 접종하여, 37℃, 220rpm에서 밤새 배양한다; 10ml 박테리아 배양액을 500ml 액체 LB 배지를 포함하는 2L 쉐이크 플라스크에 옮긴 다음 2병을 접종하고, 37℃, 220rpm에서 OD600이 0.6-0.8에 도달할 때까지 계속 배양하고, 0.2mM IPTG를 첨가하여 유도, 30℃, 200rpm에서 5h 유도 배양한다.

배양이 완료되면 1L의 발효액을 수집하고, 5000rpm에서 20분간 원심분리로 세포를 수집하며, 수집한 세포를 30 mL의 니켈 컬럼 결합 완충액에 재현탁하고 얼음물 혼합물에 넣어 초음파 분쇄를 한다. 초음파 분쇄 조건은 작동 5s, 멈춤 10s로 총 30min 진행한다.

분쇄 처리를 거친 혼합물을 12,000rpm에서 30min 원심분리하고, 상청액을 0.22㎛ 필터로 여과한다. 이어서, 여과된 시료를 니켈 컬럼 결합 완충액으로 미리 평형화된 2 ml의 니켈 충전재에 로딩하고, 컬럼 부피의 20배인 50mM 이미다졸 용출 완충액으로 불순물 단백질을 세척한 다음, 5ml 250mM 이미다졸 용출 완충액으로 표적 단백질을 용출하고, 시료를 각 튜브에 500㎕씩 나눈다. 각 튜브의 단백질 농도를 측정하고, 농도가 더 높은 몇 개 튜브의 단백질액을 합하여 2.5ml로 희석하거나 농축한 다음, 시료를 글리세롤 완충액으로 평형화된 탈염 컬럼으로 옮긴다. 단백질 용액을 건조시킨 후 3.5ml 글리세롤 완충액을 첨가하여 단백질을 용출시킴으로써 대장균 케톨전이효소 돌연변이체의 순수 단백질을 얻는다.

단계 1에서, 단백질 농도 측정은 Thermo Scientific Nanodrop 8000-type 검출기를 사용하여 280nm에서의 흡광도 E를 검출하고, 표적 단백질 농도는 몰 흡광 계수에 따라 환산하여 구한다. 즉, 단백질 농도 (mg/mL)는 E/몰 흡광 계수, 재조합 효소의 몰 소광 계수는 소프트웨어 Vector NTI 예측을 통해 구한다.

2단계: 트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체의 발현 및 정제

SEQ ID NO: 14에 표시된 서열에 아미노산 돌연변이가 발생한 뉴클레오티드 서열을 벡터 pRSFDuet에 도입하고, 숙주 E.coli BL21를 도입한다. 이어서, LB 고체 배지에서 재조합 플라스미드를 함유한 대장균군 E.coli BL21의 단일 콜로니를 선택하고, 40ml LB 액체 배지(50μg/ml 카나마이신 항생제 함유)에 접종하고, 37℃, 220rpm에서 밤새 배양한다. 10ml의 박테리아 배양액을 500ml의 액체 LB 배지를 포함하는 2L 쉐이크 플라스크로 옮겨 2병을 접종하고, OD600 이 0.6-0.8에 도달할 때까지 37℃, 220 rpm에서 계속 배양하고, 0.2mM IPTG를 첨가하여 유도, 20℃, 200rpm에서 15h 유도 배양한다.

배양 종료 후, 1L의 발효액을 수집하고 5,000rpm에서 20min 원심분리로 세포를 수집하며, 30 mL의 니켈 칼럼 결합 완충액에서 재현탁하고, 얼음물 혼합물에 넣어 초음파 분쇄한다. 초음파 분쇄 조건은 작동5s, 멈춤 10s로 총 30min 진행한다.

분쇄 처리를 거친 혼합물을 12,000rpm에서 30min 원심분리하고, 상청액을 0.22㎛ 필터로 여과한다. 이어서, 여과된 시료를 니켈 컬럼 결합 완충액으로 미리 평형화된 2ml의 니켈 충전재에 로딩하고, 컬럼 부피의 20배인 50mM 용출 완충액으로 불순물 당백질을 세척한 다음, 5 ㎖ 250mM 이미다졸 용출 완충액으로 표적 단백질을 용출하고, 시료를 각 튜브에 500 ㎕씩 나눈다. 트랜스아미나제가 보조 인자 PLP과 결합하기 때문에 노란색으로 나타난다. 짙은 노란색 단백질액이 담긴 여러 튜브를 결합하고 단백질 용액을 2.5ml로 희석하거나 농축한 다음, 시료를 글리세롤 완충액으로 평형화된 색채분석 컬럼으로 옮긴다. 단백질 용액을 건조시킨 후, 3.5ml 글리세롤 완충 용액을 첨가하여 단백질을 용출시킴으로써 트랜스아미나제 돌연변이체 순수 단백질을 수득한다.

3 단계: (1R,2R)-AMPP 및 그 유도체 합성

100mM를 함유한 Tris-HCl buffer(pH 7.5)에 10mM 벤즈알데히드 유도체, 30mM 하이드록시피루베이트(LiHPA, 트랜스케톤 공여체), 4.8mM 티아민 피로포스페이트 (TPP, 트랜스케톤 반응 보조 인자), 18 mMMMgCl2 (트랜스케톤 반응 금속 이온), 100μM 대장균군 트랜스케톤 돌연변이를 첨가하여 50μl에 첨가하여 25 ℃에서 1-3h 반응시킨다.

상기 반응 시스템에 100mM Tris-HCl buffer(pH 7.5), 200mM D-Ala, D-글리신, D-발린, D-류신, D-이소류신, D-메티오닌, D-프롤린, D-트립토판, D-세린, D-타이로신, D-시스테인, D-페닐알라닌, D-아스파라긴, D-트레오닌, D-아스파르트산, D-글루타민산, D-라이신, D-아르기닌, D-히스티딘 또는 이소프로필아민(트랜스아민화 공여체), 2mM 피리독살인산(PLP, 아미노기 전이반응 보조 인자), 50μM 트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 첨가하여 반응 시스템을 100μl로 확장하고, 25 ℃에서 3-6h 반응시켜 (1R,2R)-AMPP 및 그 유도체를 얻는다.

[표 3] 효소 캐스케이드 반응 생성물의 전환율 및 입체 선택성

실험 그룹	기질	아미노기 공여체	대장균 트랜스케톨라제	트랜스아미나제	전환율	De	ee
1	P-메틸설포닐 벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y	V69A+F122C+I157H	***	*	*****
2	P-메틸설포닐 벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y+F434Y	V69A+F122C+I157H	***	***	*****
3	P-메틸설포닐 벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y+F434Y+L466H	V69A+F122C	***	***	*****
4	P-메틸설포닐 벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y+F434Y+L466H	V69A+F122C+I157H	***	****	*****
5	P-메틸설포닐 벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y+F434Y+L466H	V69A+F122C+I157H+F225H	***	****	*****
6	P-메틸설포닐 벤즈알데히드	이소프로필아민	H26Y+F434Y	V69A+F122C+I157H	***	***	*****
7	P-메틸설포닐 벤즈알데히드	이소프로필아민	H26Y+F434Y+L466H	V69A+F122C+I157H	***	****	*****
8	벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y+F434Y	V69A+F122C+I157H	**	***	*****
9	벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y+F434Y+L466F	V69A+F122C+I157H+F225H	**	****	*****
10	벤즈알데히드	이소프로필아민	H26Y+F434Y	V69A+F122C+I157H	**	***	*****
11	벤즈알데히드	이소프로필아민	H26Y+F434Y+L466F	V69A+F122C+I157H	**	****	*****
12	P-메틸 벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y+F434Y	V69A+F122C+I157H	**	***	*****
13	P-메틸 벤즈알데히드	D-알라닌	H26Y+F434Y+L466F	V69A+F122C+I157H+F225H	**	****	*****
14	P-메틸 벤즈알데히드	이소프로필아민	H26Y+F434Y	V69A+F122C+I157H	**	***	*****
15	P-메틸 벤즈알데히드	이소프로필아민	H26Y+F434Y+L466F	V69A+F122C+I157H	**	****	*****

전환율이 0-40%인 *, 전환율이 40-60%인 **, 전환율이 60-80%인 ** *, 전환율이> 80%인 * * * * 이다.

de가 0-40%인 *, de가 40-70%인 **, de가 70-90%인 **, de가> 90%인 ****이다.

ee가 0-40%인 *, ee가 40-70%인 **, ee가 70-90%인 ***, ee가 90-99%인 ****, ee가> 99%인 *****이다.

본 발명의 추가 반응 생성물은 Agilent 1200형 액체 크로마토그래프 검측하며, 구체적인 검출 방법은 C18 컬럼(4.6×150mm, 입자 크기 3㎛), 칼럼 온도 30℃, 0.5ml/min, A상: H2O(10 mM KH2PO4, pH=8.5), B상: 아세토니트릴을 포함한다.

[표 4] 액체 크로마토그래피의 크로마토그래피 조건

도 4는 C18 컬럼 조건에서 p-메틸설포닐 벤즈알데히드를 기질로 하는 반응 생성물의 액상 다이어그램이다. 도 4에서, 상단은 (에리트로)-p-메틸설포닐 페닐세리놀과 (트레오)-p-메틸설포닐 페닐세리놀 표준 물질의 액상 다이어그램이며, 중간은 (1R,2R)-p-메틸설포닐 페닐세리놀, 최하단은 실험그룹 5 가 얻은 반응 생성물이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 실험군5에서 제조한 물질은 주로 트레오이며, 공식 de=[(트레오-에리트로)/(트레오+에리트로)]×100％에 의하여 de>90%를 얻는다. 여기서, 에리트로와 트레오는 (에리트로)- 및 (트레오)-P-메틸설폰닐 페닐세리놀을 나타낸다.

액상의 피크에 따라, (트레오)-p-메틸설포닐 페닐세리놀의 생성물을 수집하고 농축한 뒤 키랄 액체상 컬럼으로 추가 원심분리하여 생성물의 거울상 선택성을 조사한다. 거울상 이성질체 분석 조건은 키랄 컬럼 IG 컬럼, 컬럼 온도 25℃, 0.5 ml/min, 224nm이고, 크로마토그래피 조건은 순수 메탄올(0.1% 디에틸아민 함유), 15분이다. 도 5는 키랄 액상 컬럼 조건에서 (에리트로)-p-메틸설포닐 페닐세리놀 생성물의 액상도이다. 도 5의 상단은 에리트로+트레오 표준 물질 대조, 두 번째 라인은 트레오 표준 물질 대조, 세 번째 라인은 (1R,2R)-p-메틸설포닐 페닐세리놀 표준 물질 대조, 네 번째이자 마지막 라인은 반응 생성물 (트레오)-p-메틸설포닐 페닐세리놀이다. 도 5에서 도시한 바와 같이, (1R,2R)-및 (1S,2S)-p-메틸설포닐 페닐세리놀의 보류 시간은 각각 5.6분 및 9.4 분이고, 공식 ee =[(RR-SS)/(RR+SS)]×100%에 따라 계산한 ee 값은 99% 보다 크다. 여기서, RR 및 SS는 (1R,2R)- 및 (1S,2S)-p-메탄설포닐 페닐세리놀을 나타낸다.

도 6 은 반응 생성물 (1R,2R)-AMPP의 수소 스펙트럼이고, 도 7 은 반응 생성물 (1R,2R)-AMPP의 탄소 스펙트럼이다. 도 6, 도 7 및 도 4, 도5의 표준 물질 대조를 통해 본 발명이 (1R,2R)-AMPP를 합성하고, de 값 및 ee 값과 결합했으며, 본 발명에서 제공하는 방법으로 제조된 (1R,2R)-AMPP의 입체선택성이 높음을 알 수 있다.

도 8은 C18 컬럼 조건에서 벤즈알데히드를 기질로 갖는 실험군9 반응 생성물의 액상 다이어그램이다. 도 8에서, 상단은 실험군9가 얻은 반응 생성물이고, 중간은 (1R,2R)-페닐세리놀의 표준 물질, 하단은 (에리트로)-페닐세리놀과 (트레오)-페닐세리놀 표준 물질이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 실험군9에서 제조한 물질은 주로 트레오이며, 공식 de=[(트레오-에리트로)/(트레오+에리트로]×100％에 의하여 de>90%를 얻는다. 여기서, 에리트로와 트레오는 (에리트로)- 및 (트레오)-페닐세리놀을 나타낸다.

도 9는 C18 컬럼 조건에서 p-톨루알데히드를 기질로 갖는 실험군13 반응 생성물의 액상 다이어그램이다. 도 9에서, 상단는 실험군13이 얻은 반응 생성물이고, 하단은 (트레오)-P-메틸 페닐세리놀 표준 물질이다. 도 9에서 도시한 바와 같이, 실험군13이 제조한 물질이 주로 얻은 산물은 에리트로이며, 공식 de=[(트레오-에리트로)/(트레오+에리트로)]×100％에 의하여 de>90%를 얻는다. 여기서, 에리트로와 트레오는 (에리트로)- 및 (트레오)-P-메틸 페닐세리놀을 나타낸다.

대장균군 트랜스케톨라제의 아미노산 서열（SEQ ID NO:11）

1 MSSRKELANA IRALSMDAVQ KAKSGHPGAP MGMADIAEVL WRDFLKHNPQ NPSWADRDRF

61 VLSNGHGSML IYSLLHLTGY DLPMEELKNF RQLHSKTPGH PEVGYTAGVE TTTGPLGQGI

121 ANAVGMAIAE KTLAAQFNRP GHDIVDHYTY AFMGDGCMME GISHEVCSLA GTLKLGKLIA

181 FYDDNGISID GHVEGWFTDD TAMRFEAYGW HVIRDIDGHD AASIKRAVEE ARAVTDKPSL

241 LMCKTIIGFG SPNKAGTHDS HGAPLGDAEI ALTREQLGWK YAPFEIPSEI YAQWDAKEAG

301 QAKESAWNEK FAAYAKAYPQ EAAEFTRRMK GEMPSDFDAK AKEFIAKLQA NPAKIASRKA

361 SQNAIEAFGP LLPEFLGGSA DLAPYNLTLW SGSKAINEDA AGNYIHYGVR EFGMTAIANG

421 ISLHGGFLPY TSTFLMFVEY ARNAVRMAAL MKQRQVMVYT HDSIGLGETG PTHQPVEQVA

481 SLRVTPNMST WRPCDQVESA VAWKYGVERQ DGPTALILSQ QNLAQQERTE EQLANIARGG

541 YVLKDCAGQP ELIFIATGSE VELAVAAYEK LTAEGVKARV VSMPSTDAFD KQDAAYRESV

601 LPKAVTARVA VEAGIADYWY KYVGLNGAIV GMTTFGESAP AELLFEEFGF TVDNVVAKAK

661 ELL

대장균군 트랜스케톨라제의 뉴클레오티드 서열（SEQ ID NO:11）

atgtcctcacgtaaagagcttgccaatgctattcgtgcgctgagcatggacgcagtacagaaagccaaatccggtcacccgggtgcccctatgggtatggctgacattgccgaagtcctgtggcgtgatttcctgaaacacaacccgcagaatccgtcctgggctgaccgtgaccgcttcgtgctgtccaacggccacggctccatgctgatctacagcctgctgcacctcaccggttacgatctgccgatggaagaactgaaaaacttccgtcagctgcactctaaaactccgggtcacccggaagtgggttacaccgctggtgtggaaaccaccaccggtccgctgggtcagggtattgccaacgcagtcggtatggcgattgcagaaaaaacgctggcggcgcagtttaaccgtccgggccacgacattgtcgaccactacacctacgccttcatgggcgacggctgcatgatggaaggcatctcccacgaagtttgctctctggcgggtacgctgaagctgggtaaactgattgcattctacgatgacaacggtatttctatcgatggtcacgttgaaggctggttcaccgacgacaccgcaatgcgtttcgaagcttacggctggcacgttattcgcgacatcgacggtcatgacgcggcatctatcaaacgcgcagtagaagaagcgcgcgcagtgactgacaaaccttccctgctgatgtgcaaaaccatcatcggtttcggttccccgaacaaagccggtacccacgactcccacggtgcgccgctgggcgacgctgaaattgccctgacccgcgaacaactgggctggaaatatgcgccgttcgaaatcccgtctgaaatctatgctcagtgggatgcgaaagaagcaggccaggcgaaagaatccgcatggaacgagaaattcgctgcttacgcgaaagcttatccgcaggaagccgctgaatttacccgccgtatgaaaggcgaaatgccgtctgacttcgacgctaaagcgaaagagttcatcgctaaactgcaggctaatccggcgaaaatcgccagccgtaaagcgtctcagaatgctatcgaagcgttcggtccgctgttgccggaattcctcggcggttctgctgacctggcgccgtataacctgaccctgtggtctggttctaaagcaatcaacgaagatgctgcgggtaactacatccactacggtgttcgcgagttcggtatgaccgcgattgctaacggtatctccctgcacggtggcttcctgccgtacacctccaccttcctgatgttcgtggaatacgcacgtaacgccgtacgtatggctgcgctgatgaaacagcgtcaggtgatggtttacacccacgactccatcggtctgggcgaaaccggcccgactcaccagccggttgagcaggtcgcttctctgcgcgtaaccccgaacatgtctacatggcgtccgtgtgaccaggttgaatccgcggtcgcgtggaaatacggtgttgagcgtcaggacggcccgaccgcactgatcctctcccaacagaacctggcgcagcaggaacgaactgaagagcaactggcaaacatcgcgcgcggtggttatgtgctgaaagactgcgccggtcagccggaactgattttcatcgctaccggttcagaagttgaactggctgttgctgcctacgaaaaactgactgccgaaggcgtgaaagcgcgcgtggtgtccatgccgtctaccgacgcatttgacaagcaggatgctgcttaccgtgaatccgtactgccgaaagcggttactgcacgcgttgctgtagaagcgggtattgctgactactggtacaagtatgttggcctgaacggtgctatcgtcggtatgaccaccttcggtgaatctgctccggcagagctgctgtttgaagagttcggcttcactgttgataacgttgttgcgaaagcaaaagaactgctgtaa

트랜스아미나제 ATA117의 아미노산 서열（SEQ ID NO: 13）

1 MAFSADTSEI VYTHDTGLDY ITYSDYELDP ANPLAGGAAW IEGAFVPPSE ARISIFDQGY

61 LHSDVTYTVF HVWNGNAFRL DDHIERLFSN AESMRIIPPL TQDEVKEIAL ELVAKTELRE

121 AFVSVSITRG YSSTPGERDI TKHRPQVYMY AVPYQWIVPF DRIRDGVHAM VAQSVRRTPR

181 SSIDPQVKNF QWGDLIRAVQ ETHDRGFEAP LLLDGDGLLA EGSGFNVVVI KDGVVRSPGR

241 AALPGITRKT VLEIAESLGH EAILADITLA ELLDADEVLG CTTAGGVWPF VSVDGNPISD

301 GVPGPVTQSI IRRYWELNVE SSSLLTPVQY

트랜스아미나제 ATA117의 뉴클레오티드 서열

atggcatttagcgcggataccagcgaaatcgtctatacccacgataccggtctggattacatcacctacagcgattacgaactggatccggcaaatccgttagcaggcggcgcagcttggattgaaggcgcatttgttccgccgtctgaagcgcgtattagcatcttcgatcagggctatctgcatagcgacgttacctataccgtcttccacgtttggaacggtaacgcatttcgtctggacgatcacatcgaacgtctgttcagcaacgccgaaagtatgcgtattattccgccgctgacccaagacgaagtcaaagaaatcgcgctggaactggttgcaaaaaccgaactgcgcgaagcgtttgttagcgttagcattacccgcggttatagtagtaccccgggcgaacgcgatattaccaaacatcgtccgcaggtctacatgtacgctgttccgtaccagtggatcgttccgtttgatcgtattcgcgacggcgttcacgcaatggttgcacagagcgtgcgtcgtaccccgcgtagcagcatcgatccgcaggtcaaaaacttccagtggggcgatttaattcgcgcagttcaggaaacccacgatcgcggttttgaagcaccgttactgttagacggcgacggtttactggcagaaggtagcggctttaacgtcgtcgtcattaaagatggggttgttcgttctccgggtcgtgcagcattaccgggtattacccgcaaaaccgttctggaaattgcggaatccctgggtcatgaagcgattctggcggatattaccttagcggaactgctggacgcagacgaagttttaggttgtaccaccgctggcggcgtttggccgtttgttagcgttgacggcaatccgattagcgatggtgttccgggtccggttacccaaagcattattcgtcgctactgggagctgaacgttgaaagtagcagcctgttaaccccggttcagtat

본 발명이 상기와 같이 바람직한 실시예로 개시되었으나, 이는 본 발명을 제한하려는 것은 아니며, 이 기술에 익숙한 사람이라면 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변경 및 수정을 할 수 있으므로, 본 발명의 보호 범위는 청구항에 의해 정의되어야 한다.

<110> ZHEJIANG APELOA KANGYU PHARMACEUTICAL CO., LTD. APELOA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> CONSTRUCTION AND APPLICATIONS OF ENATIOSELECTIVE FLIPPED w-TRANSAMINASE MUTANT <130> 23IP08002CN <150> CN202110162624.3 <151> 2021-02-05 <150> CN202110567238.2 <151> 2021-05-24 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ATA117_ACHH amino acid sequence <400> 1 Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Ser Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr 1 5 10 15 Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn 20 25 30 Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro 35 40 45 Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Tyr Leu His Ser Asp 50 55 60 Val Thr Tyr Thr Ala Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu 65 70 75 80 Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Ile 85 90 95 Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu 100 105 110 Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Cys Val Ser Val Ser Ile Thr 115 120 125 Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Gly Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg 130 135 140 Pro Gln Val Tyr Met Tyr Ala Val Pro Tyr Gln Trp His Val Pro Phe 145 150 155 160 Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg 165 170 175 Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp 180 185 190 Gly Asp Leu Ile Arg Ala Val Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu 195 200 205 Ala Pro Leu Leu Leu Asp Gly Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Ser Gly 210 215 220 His Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg 225 230 235 240 Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu 245 250 255 Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Leu Ala Glu Leu 260 265 270 Leu Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Thr Thr Ala Gly Gly Val Trp 275 280 285 Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly 290 295 300 Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu 305 310 315 320 Ser Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr 325 330 <210> 2 <211> 993 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATA117_ACHH nucleotide sequence <400> 2 atggcattta gcgcggatac cagcgaaatc gtctataccc acgataccgg tctggattac 60 atcacctaca gcgattacga actggatccg gcaaatccgt tagcaggcgg cgcagcttgg 120 attgaaggcg catttgttcc gccgtctgaa gcgcgtatta gcatcttcga tcagggctat 180 ctgcatagcg acgttaccta taccgcattc cacgtttgga acggtaacgc atttcgtctg 240 gacgatcaca tcgaacgtct gttcagcaac gccgaaagta tgcgtattat tccgccgctg 300 acccaagacg aagtcaaaga aatcgcgctg gaactggttg caaaaaccga actgcgcgaa 360 gcgtgtgtta gcgttagcat tacccgcggt tatagtagta ccccgggcga acgcgatatt 420 accaaacatc gtccgcaggt ctacatgtac gctgttccgt accagtggca tgttccgttt 480 gatcgtattc gcgacggcgt tcacgcaatg gttgcacaga gcgtgcgtcg taccccgcgt 540 agcagcatcg atccgcaggt caaaaacttc cagtggggcg atttaattcg cgcagttcag 600 gaaacccacg atcgcggttt tgaagcaccg ttactgttag acggcgacgg tttactggca 660 gaaggtagcg gccataacgt cgtcgtcatt aaagatgggg ttgttcgttc tccgggtcgt 720 gcagcattac cgggtattac ccgcaaaacc gttctggaaa ttgcggaatc cctgggtcat 780 gaagcgattc tggcggatat taccttagcg gaactgctgg acgcagacga agttttaggt 840 tgtaccaccg ctggcggcgt ttggccgttt gttagcgttg acggcaatcc gattagcgat 900 ggtgttccgg gtccggttac ccaaagcatt attcgtcgct actgggagct gaacgttgaa 960 agtagcagcc tgttaacccc ggttcagtat taa 993 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VN-F <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> k is t or g <400> 3 agcgacgtta cctataccnn kttccacgtt tggaacggta acgca 45 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VN-R <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is a, c, g or t <400> 4 accgttccaa acgtggaamn nggtataggt aacgtcgcta tgcag 45 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN-F <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> k is t or g <400> 5 accgaactgc gcgaagcgnn kgttagcgtt agcattaccc gcggt 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN-R <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is a, c, g or t <400> 6 ggtaatgcta acgctaacmn ncgcttcgcg cagttcggtt tttgc 45 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IN-F <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> k is t or g <400> 7 gctgttccgt accagtggnn kgttccgttt gatcgtattc gcgac 45 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IN-R <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is a, c, g or t <400> 8 aatacgatca aacggaacmn nccactggta cggaacagcg tacat 45 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN-F <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> k is t or g <400> 9 ctggcagaag gtagcggcnn kaacgtcgtc gtcattaaag atggg 45 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN-R <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> n is a, c, g or t <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is a, c, g or t <400> 10 tttaatgacg acgacgttmn ngccgctacc ttctgccagt aaacc 45 <210> 11 <211> 663 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Escherichia coli transketolase <400> 11 Met Ser Ser Arg Lys Glu Leu Ala Asn Ala Ile Arg Ala Leu Ser Met 1 5 10 15 Asp Ala Val Gln Lys Ala Lys Ser Gly His Pro Gly Ala Pro Met Gly 20 25 30 Met Ala Asp Ile Ala Glu Val Leu Trp Arg Asp Phe Leu Lys His Asn 35 40 45 Pro Gln Asn Pro Ser Trp Ala Asp Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Asn 50 55 60 Gly His Gly Ser Met Leu Ile Tyr Ser Leu Leu His Leu Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Asp Leu Pro Met Glu Glu Leu Lys Asn Phe Arg Gln Leu His Ser Lys 85 90 95 Thr Pro Gly His Pro Glu Val Gly Tyr Thr Ala Gly Val Glu Thr Thr 100 105 110 Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Asn Ala Val Gly Met Ala Ile 115 120 125 Ala Glu Lys Thr Leu Ala Ala Gln Phe Asn Arg Pro Gly His Asp Ile 130 135 140 Val Asp His Tyr Thr Tyr Ala Phe Met Gly Asp Gly Cys Met Met Glu 145 150 155 160 Gly Ile Ser His Glu Val Cys Ser Leu Ala Gly Thr Leu Lys Leu Gly 165 170 175 Lys Leu Ile Ala Phe Tyr Asp Asp Asn Gly Ile Ser Ile Asp Gly His 180 185 190 Val Glu Gly Trp Phe Thr Asp Asp Thr Ala Met Arg Phe Glu Ala Tyr 195 200 205 Gly Trp His Val Ile Arg Asp Ile Asp Gly His Asp Ala Ala Ser Ile 210 215 220 Lys Arg Ala Val Glu Glu Ala Arg Ala Val Thr Asp Lys Pro Ser Leu 225 230 235 240 Leu Met Cys Lys Thr Ile Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Lys Ala Gly 245 250 255 Thr His Asp Ser His Gly Ala Pro Leu Gly Asp Ala Glu Ile Ala Leu 260 265 270 Thr Arg Glu Gln Leu Gly Trp Lys Tyr Ala Pro Phe Glu Ile Pro Ser 275 280 285 Glu Ile Tyr Ala Gln Trp Asp Ala Lys Glu Ala Gly Gln Ala Lys Glu 290 295 300 Ser Ala Trp Asn Glu Lys Phe Ala Ala Tyr Ala Lys Ala Tyr Pro Gln 305 310 315 320 Glu Ala Ala Glu Phe Thr Arg Arg Met Lys Gly Glu Met Pro Ser Asp 325 330 335 Phe Asp Ala Lys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Lys Leu Gln Ala Asn Pro 340 345 350 Ala Lys Ile Ala Ser Arg Lys Ala Ser Gln Asn Ala Ile Glu Ala Phe 355 360 365 Gly Pro Leu Leu Pro Glu Phe Leu Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Pro 370 375 380 Tyr Asn Leu Thr Leu Trp Ser Gly Ser Lys Ala Ile Asn Glu Asp Ala 385 390 395 400 Ala Gly Asn Tyr Ile His Tyr Gly Val Arg Glu Phe Gly Met Thr Ala 405 410 415 Ile Ala Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Phe Leu Pro Tyr Thr Ser 420 425 430 Thr Phe Leu Met Phe Val Glu Tyr Ala Arg Asn Ala Val Arg Met Ala 435 440 445 Ala Leu Met Lys Gln Arg Gln Val Met Val Tyr Thr His Asp Ser Ile 450 455 460 Gly Leu Gly Glu Thr Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Gln Val Ala 465 470 475 480 Ser Leu Arg Val Thr Pro Asn Met Ser Thr Trp Arg Pro Cys Asp Gln 485 490 495 Val Glu Ser Ala Val Ala Trp Lys Tyr Gly Val Glu Arg Gln Asp Gly 500 505 510 Pro Thr Ala Leu Ile Leu Ser Gln Gln Asn Leu Ala Gln Gln Glu Arg 515 520 525 Thr Glu Glu Gln Leu Ala Asn Ile Ala Arg Gly Gly Tyr Val Leu Lys 530 535 540 Asp Cys Ala Gly Gln Pro Glu Leu Ile Phe Ile Ala Thr Gly Ser Glu 545 550 555 560 Val Glu Leu Ala Val Ala Ala Tyr Glu Lys Leu Thr Ala Glu Gly Val 565 570 575 Lys Ala Arg Val Val Ser Met Pro Ser Thr Asp Ala Phe Asp Lys Gln 580 585 590 Asp Ala Ala Tyr Arg Glu Ser Val Leu Pro Lys Ala Val Thr Ala Arg 595 600 605 Val Ala Val Glu Ala Gly Ile Ala Asp Tyr Trp Tyr Lys Tyr Val Gly 610 615 620 Leu Asn Gly Ala Ile Val Gly Met Thr Thr Phe Gly Glu Ser Ala Pro 625 630 635 640 Ala Glu Leu Leu Phe Glu Glu Phe Gly Phe Thr Val Asp Asn Val Val 645 650 655 Ala Lys Ala Lys Glu Leu Leu 660 <210> 12 <211> 1992 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of E. coli transketolase <400> 12 atgtcctcac gtaaagagct tgccaatgct attcgtgcgc tgagcatgga cgcagtacag 60 aaagccaaat ccggtcaccc gggtgcccct atgggtatgg ctgacattgc cgaagtcctg 120 tggcgtgatt tcctgaaaca caacccgcag aatccgtcct gggctgaccg tgaccgcttc 180 gtgctgtcca acggccacgg ctccatgctg atctacagcc tgctgcacct caccggttac 240 gatctgccga tggaagaact gaaaaacttc cgtcagctgc actctaaaac tccgggtcac 300 ccggaagtgg gttacaccgc tggtgtggaa accaccaccg gtccgctggg tcagggtatt 360 gccaacgcag tcggtatggc gattgcagaa aaaacgctgg cggcgcagtt taaccgtccg 420 ggccacgaca ttgtcgacca ctacacctac gccttcatgg gcgacggctg catgatggaa 480 ggcatctccc acgaagtttg ctctctggcg ggtacgctga agctgggtaa actgattgca 540 ttctacgatg acaacggtat ttctatcgat ggtcacgttg aaggctggtt caccgacgac 600 accgcaatgc gtttcgaagc ttacggctgg cacgttattc gcgacatcga cggtcatgac 660 gcggcatcta tcaaacgcgc agtagaagaa gcgcgcgcag tgactgacaa accttccctg 720 ctgatgtgca aaaccatcat cggtttcggt tccccgaaca aagccggtac ccacgactcc 780 cacggtgcgc cgctgggcga cgctgaaatt gccctgaccc gcgaacaact gggctggaaa 840 tatgcgccgt tcgaaatccc gtctgaaatc tatgctcagt gggatgcgaa agaagcaggc 900 caggcgaaag aatccgcatg gaacgagaaa ttcgctgctt acgcgaaagc ttatccgcag 960 gaagccgctg aatttacccg ccgtatgaaa ggcgaaatgc cgtctgactt cgacgctaaa 1020 gcgaaagagt tcatcgctaa actgcaggct aatccggcga aaatcgccag ccgtaaagcg 1080 tctcagaatg ctatcgaagc gttcggtccg ctgttgccgg aattcctcgg cggttctgct 1140 gacctggcgc cgtataacct gaccctgtgg tctggttcta aagcaatcaa cgaagatgct 1200 gcgggtaact acatccacta cggtgttcgc gagttcggta tgaccgcgat tgctaacggt 1260 atctccctgc acggtggctt cctgccgtac acctccacct tcctgatgtt cgtggaatac 1320 gcacgtaacg ccgtacgtat ggctgcgctg atgaaacagc gtcaggtgat ggtttacacc 1380 cacgactcca tcggtctggg cgaaaccggc ccgactcacc agccggttga gcaggtcgct 1440 tctctgcgcg taaccccgaa catgtctaca tggcgtccgt gtgaccaggt tgaatccgcg 1500 gtcgcgtgga aatacggtgt tgagcgtcag gacggcccga ccgcactgat cctctcccaa 1560 cagaacctgg cgcagcagga acgaactgaa gagcaactgg caaacatcgc gcgcggtggt 1620 tatgtgctga aagactgcgc cggtcagccg gaactgattt tcatcgctac cggttcagaa 1680 gttgaactgg ctgttgctgc ctacgaaaaa ctgactgccg aaggcgtgaa agcgcgcgtg 1740 gtgtccatgc cgtctaccga cgcatttgac aagcaggatg ctgcttaccg tgaatccgta 1800 ctgccgaaag cggttactgc acgcgttgct gtagaagcgg gtattgctga ctactggtac 1860 aagtatgttg gcctgaacgg tgctatcgtc ggtatgacca ccttcggtga atctgctccg 1920 gcagagctgc tgtttgaaga gttcggcttc actgttgata acgttgttgc gaaagcaaaa 1980 gaactgctgt aa 1992 <210> 13 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the transaminase ATA117 <400> 13 Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Ser Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr 1 5 10 15 Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn 20 25 30 Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro 35 40 45 Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Tyr Leu His Ser Asp 50 55 60 Val Thr Tyr Thr Val Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu 65 70 75 80 Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Ile 85 90 95 Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu 100 105 110 Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Phe Val Ser Val Ser Ile Thr 115 120 125 Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Gly Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg 130 135 140 Pro Gln Val Tyr Met Tyr Ala Val Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe 145 150 155 160 Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg 165 170 175 Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp 180 185 190 Gly Asp Leu Ile Arg Ala Val Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu 195 200 205 Ala Pro Leu Leu Leu Asp Gly Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Ser Gly 210 215 220 Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg 225 230 235 240 Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu 245 250 255 Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Leu Ala Glu Leu 260 265 270 Leu Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Thr Thr Ala Gly Gly Val Trp 275 280 285 Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly 290 295 300 Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu 305 310 315 320 Ser Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr 325 330 <210> 14 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the transaminase ATA117 <400> 14 atggcattta gcgcggatac cagcgaaatc gtctataccc acgataccgg tctggattac 60 atcacctaca gcgattacga actggatccg gcaaatccgt tagcaggcgg cgcagcttgg 120 attgaaggcg catttgttcc gccgtctgaa gcgcgtatta gcatcttcga tcagggctat 180 ctgcatagcg acgttaccta taccgtcttc cacgtttgga acggtaacgc atttcgtctg 240 gacgatcaca tcgaacgtct gttcagcaac gccgaaagta tgcgtattat tccgccgctg 300 acccaagacg aagtcaaaga aatcgcgctg gaactggttg caaaaaccga actgcgcgaa 360 gcgtttgtta gcgttagcat tacccgcggt tatagtagta ccccgggcga acgcgatatt 420 accaaacatc gtccgcaggt ctacatgtac gctgttccgt accagtggat cgttccgttt 480 gatcgtattc gcgacggcgt tcacgcaatg gttgcacaga gcgtgcgtcg taccccgcgt 540 agcagcatcg atccgcaggt caaaaacttc cagtggggcg atttaattcg cgcagttcag 600 gaaacccacg atcgcggttt tgaagcaccg ttactgttag acggcgacgg tttactggca 660 gaaggtagcg gctttaacgt cgtcgtcatt aaagatgggg ttgttcgttc tccgggtcgt 720 gcagcattac cgggtattac ccgcaaaacc gttctggaaa ttgcggaatc cctgggtcat 780 gaagcgattc tggcggatat taccttagcg gaactgctgg acgcagacga agttttaggt 840 tgtaccaccg ctggcggcgt ttggccgttt gttagcgttg acggcaatcc gattagcgat 900 ggtgttccgg gtccggttac ccaaagcatt attcgtcgct actgggagct gaacgttgaa 960 agtagcagcc tgttaacccc ggttcagtat 990

Claims

ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체의 단백질 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1인 것을 특징으로 하는 거울상 선택성으로 뒤집힌 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체.
청구항 1에 있어서, 상기 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체의 아미노산 서열이 반복 포화 돌연변이에 의해 생성되고, 상기 ω-트랜스아미나제 ATA117이 위치 N1에서 발린, 위치 N2에서 페닐알라닌, 위치 N3에서 이소류신 및 위치 N4에서 페닐알라닌 중 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 ω-트랜스 아미나제 ATA117 돌연변이체.
청구항 2에 있어서, 위치 N1의 발린이 알라닌으로 돌연변이되고, 위치 N2의 페닐알라닌이 시스테인으로 돌연변이되며, 위치 N3의 이소류신이 히스티딘으로 돌연변이 되고, 위치 N4의 페닐알라닌이 히스티딘으로 돌연변이되는 것을 특징으로 하는 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체.
청구항 2의 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 뉴클레오티드 서열.
청구항 4에 있어서, 상기 DNA 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 2와도 같은 것을 특징으로 하는 DNA 뉴클레오티드 서열.
청구항 5항에서 서술한 DNA 뉴클레오티드 서열을 운반하는 플라스미드.
ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체의 단백질 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1와 같은 것을 특징으로 하는 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 발현하는 유전자 조작 박테리아.
A1, ATA117 코드를 가진 유전자의 재조합 플라스미드를 주형으로 사용하는 단계;
A2. 돌연변이를 포함하는 프라이머를 설계 및 합성하는 단계;
A3. 역 PCR로 전체 플라스미드 증폭하는 단계;
A4. PCR 생성물을 발현 숙주로 변환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 7에 따른 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 발현하는 유전자 조작 박테리아의 구성 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 발현 숙주가 E.coli BL21(DE3)인 것을 특징으로 하는 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 발현하는 유전자 조작 박테리아의 구성 방법.
청구항 1에서 서술한 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체를 기반으로, 상기 ω-트랜스아미나제 ATA117 돌연변이체 순수 단백질을 촉매제로 사용하여 완충 시스템에서 라세미 1,3-디하이드록시-1-p-메틸설포닐 페닐프로파논1을 촉매하고, 광학분할을 통해 높은 입체 선택성 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸 폰실페닐프로판2b를 구하는 (1R,2R)-1,3-디하이드록시-2-아미노-1-p-메틸설포닐 페닐프로판 2b 제조 방법.
상기 트랜스아미나제 돌연변이체는 SEQ ID NO: 13에 표시된 서열에서 아미노산 돌연변이가 발생하는 서열을 가지고, 상기 아미노산 돌연변이가 발생하는 부위는 다음가 같은 임의의 조합 돌연변이 부위인 것을 특징으로 하는 트랜스아미나제 돌연변이체:
V69F， V69G， V69A， V69L， V69I， V69P， V69M， V69W， V69S， V69Q， V69T， V69C， V69N， V69Y， V69D， V69E， V69K， V69R， V69H， V69A+F122G， V69A+F122A， V69A+F122L， V69A+F122I， V69A+F122V， V69A+F122P， V69A+F122M， V69A+F122W， V69A+F122S， V69A+F122Q， V69A+F122T， V69A+F122C， V69A+F122N， V69A+F122Y， V69A+F122D， V69A+F122E， V69A+F122K， V69A+F122R， V69A+F122H， V69A+F122C+I157F， V69A+F122C+I157G， V69A+F122C+I157A， V69A+F122C+I157L， V69A+F122C+I157I， V69A+F122C+I157V， V69A+F122C+I157P， V69A+F122C+I157M， V69A+F122C+I157W， V69A+F122C+I157S， V69A+F122C+I157Q， V69A+F122C+I157T， V69A+F122C+I157C， V69A+F122C+I157N， V69A+F122C+I157Y， V69A+F122C+I157D， V69A+F122C+I157E， V69A+F122C+I157K， V69A+F122C+I157R， V69A+F122C+I157H， V69A+F122C+I157H+F225G， V69A+F122C+I157H+F225A， V69A+F122C+I157H+F225L， V69A+F122C+I157H+F225I， V69A+F122C+I157H+F225V， V69A+F122C+I157H+F225P， V69A+F122C+I157H+F225M， V69A+F122C+I157H+F225W， V69A+F122C+I157H+F225S， V69A+F122C+I157H+F225Q， V69A+F122C+I157H+F225T， V69A+F122C+I157H+F225C， V69A+F122C+I157H+F225N， V69A+F122C+I157H+F225Y， V69A+F122C+I157H+F225D， V69A+F122C+I157H+F225E，V69A+F122C+I157H+F225K, V69A+F122C+I157H+F225R, V69A+F122C+I157H+F225H.