CN111454971B

CN111454971B - 一种提高手性胺转化率的方法

Info

Publication number: CN111454971B
Application number: CN202010209530.2A
Authority: CN
Inventors: 宋浩; 赵妍淑; 张金华
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2040-03-23
Also published as: CN111454971A

Abstract

本发明公开了一种提高手性胺转化率的方法，包括：合成和扩增含酶切位点的优化后的ArR‑ωTA核苷酸序列，构建p2A4‑ArR‑ωTA、p2A4‑FA和p2A4‑ldh，FA为表达甲酸乙酰转移酶的基因，分别导入大肠杆菌，得到重组菌1、FA和6；发酵，得到重组菌1、FA和6发酵液；离心，得到重组菌1、FA和6发酵液沉淀；分别制成FA粗酶液和ldh粗酶液；将重组菌1发酵液沉淀用PBS重悬，加PLP、NAD⁺，反应；再加FA粗酶液、ldh粗酶液、甲酸脱氢酶、D‑丙氨酸、底物酮和CoA，加助溶剂，反应，终止，萃取，干燥。本发明的方法去除副产物丙酮酸，提高手性胺的转化率。加甲酸脱氢酶回收辅因子还原型辅酶Ⅰ。

Description

一种提高手性胺转化率的方法

技术领域

本发明属于化学领域，特别是涉及一种提高手性胺转化率的方法。

背景技术

近年来，对映体纯胺在化学、制药和农用化学工业中起着至关重要的作用。手性胺被广泛用于治疗药物，例如神经科药物，心血管药物，降压药，抗感染药和疫苗。目前，化学法、生物拆分法和生物不对称合成法是制备手性胺的主要方法。不对称合成法因其对环境的污染小，理论收率可达100％而成为研究的热点。在利用转氨酶不对称合成手性胺过程中，转氨反应为可逆反应并且副产物丙酮酸会阻碍反应往产生胺的方向进行。目前主要利用乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶偶联体系消除副产物丙酮酸的抑制作用并且使辅因子再生，从而提高手性胺的转化率。在利用转氨酶不对称合成手性胺的反应中，还没有人通过甲酸乙酰转移酶和乳酸脱氢酶偶联体系来提高手性胺的转化率报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高手性胺转化率的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种提高手性胺转化率的方法，包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增：

从NCBI数据库获得来源于节杆菌属的(R)-选择型ω转氨酶的氨基酸序列，所述(R)-选择型ω转氨酶简称：ArR-ωTA；所述ArR-ωTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述ArR-ωTA的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的ArR-ωTA核苷酸序列；

在优化后的ArR-ωTA核苷酸序列前、后分别加入XbaI限制性酶切位点和HindIII限制性酶切位点，得到含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列，所述含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)获得的含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列连接到p2A4载体中得到p2A4-ArR-ωTA；将表达甲酸乙酰转移酶的核苷酸序列用FA表示，将FA连接到p2A4载体中，得到p2A4-FA；将ldh的核苷酸序列连接到p2A4载体中，得到p2A4-ldh；

所述p2A4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

所述ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)将p2A4-ArR-ωTA；p2A4-FA；p2A4-ldh分别导入大肠杆菌(E.coli MG1655)中，得到重组菌1，重组菌FA和重组菌6；

(4)将重组菌1、重组菌FA和重组菌6分别发酵，得到重组菌1发酵液、重组菌FA发酵液和重组菌6发酵液；

(5)分别将步骤(4)获得的发酵液，离心收集沉淀，洗涤，得到重组菌1发酵液沉淀、重组菌FA发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀；

(6)分别将步骤(5)获得的重组菌FA发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀分别用PBS重悬细胞并进行超声破碎处理；得到FA粗酶液和ldh粗酶液；

(7)将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀(ArR-ωTA全细胞)用PBS重悬，得混合液，取混合液加入PLP、NAD⁺，在25℃-40℃，180-220rpm下反应20-40分钟；再加入FA粗酶液、ldh粗酶液、甲酸脱氢酶、D-丙氨酸、底物酮和CoA，得到反应液，加入助溶剂，在25℃-40℃，180-220rpm下反应12-24小时，加入NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

所述FA为ybiw、pflB、pflD或tdcE，所述ybiw的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，pflB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，pflD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，tdcE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

步骤(7)优选为：将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用pH＝7.5浓度为100mM的PBS重悬，得混合液，所述PBS的体积为步骤(4)获得的重组菌1发酵液体积的1/7,按比例，取1mL混合液，加入终浓度为1.5mM的PLP、终浓度为1mM的NAD⁺，在25℃-40℃，180-220rpm下反应20-40分钟；再加入10U的FA粗酶液、10U的ldh粗酶液、10U的甲酸脱氢酶、终浓度250mM的D-丙氨酸、终浓度25mM底物酮和终浓度0.1mM的CoA，得到反应液，加入反应液体积15％-60％的助溶剂DMSO，在25℃-40℃，180-220rpm下反应12-24小时，加入终浓度10M的NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取两次，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

酮优选为2-戊酮、环己酮或苄基丙酮，还可以选用其它的酮。

本发明的优点：

相比于已经报道的通过一种途径消除副产物丙酮酸的方法，本发明的方法去除副产物丙酮酸，能够提高手性胺的转化率。同时引入甲酸脱氢酶可以用来回收辅因子还原型辅酶Ⅰ。

附图说明

图1为ArR-ωTA/TdcE/FDH/LDH偶联体系。

图2为ybiw、pflB、pflD、tdcE酶活。

图3为2-戊酮、苄基丙酮、环己酮在ArR-ωTA/TdcE/FDH/LDH偶联体系的转化率。

具体实施方式

PLP：磷酸吡哆醛

NAD⁺：辅酶Ⅰ

CoA：辅酶A

NADH：还原型辅酶Ⅰ

DMSO:二甲基亚砜

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

设计引物ybiw-F和ybiw-R，通过PCR从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出ybiw；

设计引物pflB-F和pflB-R，通过PCR从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出pflB；

设计引物pflD-F和pflD-R，通过PCR从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出pflD；

设计引物tdcE-F和tdcE-R，通过PCR从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出tdcE；

设计引物ldh-F和ldh-R，通过PCR从大肠杆菌MG1655的基因组DNA扩增出ldh；

ybiw的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

pflB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

pflD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

tdcE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，

ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，

ybiw-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，ybiw-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，

pflB-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，pflB-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，

pflD-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，pflD-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，

tdcE-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，tdcE-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，

ldh-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，ldh-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

实施例1

一种提高手性胺转化率的方法，包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增：

(2)将步骤(1)获得的含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列连接到p2A4载体中得到p2A4-ArR-ωTA；将表达甲酸乙酰转移酶(FA为tdcE)的核苷酸序列用tdcE表示，将tdcE连接到p2A4载体中，得到p2A4-tdcE；将ldh的核苷酸序列连接到p2A4载体中，得到p2A4-ldh；

所述p2A4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

(3)将p2A4-ArR-ωTA；p2A4-tdcE；p2A4-ldh分别导入大肠杆菌(E.coli MG1655)中，得到重组菌1，重组菌5和重组菌6；

(4)将重组菌1、重组菌5和重组菌6分别发酵，得到重组菌1发酵液、重组菌5发酵液和重组菌6发酵液；

发酵过程：

将重组菌1、重组菌5和重组菌6，分别在含有(100μg/ml氨苄青霉素)的TB液体加葡萄糖的培养基(1升TB液体培养基中加10克葡萄糖)中培养，37℃和220rpm下培养12小时；将培养物以1:100比例转接入含有50mLTB培养基的250mL摇瓶中，并在37℃下生长。当600nm处的光密度(OD600)达到约0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1mM，并在25℃和200rpm下生长16小时。

(5)分别将步骤(4)获得的发酵液，4℃和6500rpm离心收集沉淀，沉淀用0.01M PBS(pH＝7.5)洗涤洗涤，得到重组菌1发酵液沉淀、重组菌5发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀；

(6)分别将步骤(5)获得的重组菌5发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀用PBS(100mM，PH＝7.5，)重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟；得到重组菌5粗酶液(即：tdcE粗酶液)和ldh粗酶液；

(7)将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用pH＝7.5浓度为100mM的PBS重悬，得混合液，所述PBS的体积为步骤(4)获得的重组菌1发酵液体积的1/7,取1mL混合液，加入终浓度为1.5mM的PLP、终浓度为1mM的NAD⁺，在30℃，180rpm下反应30分钟；再加入10U的tdcE粗酶液、10U的ldh粗酶液、10U的甲酸脱氢酶、终浓度250mM的D-丙氨酸、终浓度25mM底物2-戊酮和终浓度0.1mM的CoA，得到反应液，加入反应液体积30％的助溶剂DMSO，在30℃，180rpm下反应24小时，加入终浓度10M的NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取两次，每次加入500μL，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

气相色谱检测，色谱柱为TG-5MS色谱柱(30m×0.32mm×0.25μm；Thermo FisherScientific)。条件为：进样器温度：250℃；恒定流量1.8毫升/分钟；温度程序40℃/保持2分钟；80℃/速率5℃/分钟/保持2分钟；250℃/速率20℃/分钟/保持10分钟。

见图1、图2和图3。

用苄基丙酮、环己酮分别替代本实施例中的2-戊酮，其它同本实施例，其相应的在ArR-ωTA/TdcE/FDH/LDH偶联体系的转化率见图3。

实施例2

一种提高手性胺转化率的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例1步骤(1)；

(2)用ybiw替找实施例1中的tdcE，其它同实施例1步骤(2)；

(3)将p2A4-ArR-ωTA；p2A4-ybiw；p2A4-ldh分别导入大肠杆菌(E.coli MG1655)中，得到重组菌1，重组菌2和重组菌6；

(4)将重组菌1、重组菌2和重组菌6分别发酵，得到重组菌1发酵液、重组菌2发酵液和重组菌6发酵液；

发酵过程同实施例1；

(5)分别将步骤(4)获得的发酵液，4℃和6500rpm离心收集沉淀，沉淀用0.01M PBS(pH＝7.5)洗涤洗涤，得到重组菌1发酵液沉淀、重组菌2发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀；

(6)分别将步骤(5)获得的重组菌2发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀分别用PBS(100mM，PH＝7.5，)重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟；得到重组菌2粗酶液(即：ybiw粗酶液)和ldh粗酶液；

(7)将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用pH＝7.5浓度为100mM的PBS重悬，得混合液，所述PBS的体积为步骤(4)获得的重组菌1发酵液体积的1/7,取1mL混合液，加入终浓度为1.5mM的PLP、终浓度为1mM的NAD⁺，在40℃，180rpm下反应40分钟；再加入10U的ybiw粗酶液、10U的ldh粗酶液、10U的甲酸脱氢酶、终浓度250mM的D-丙氨酸、终浓度25mM底物环己酮和终浓度0.1mM的CoA，得到反应液，加入反应液体积15％的助溶剂DMSO，在40℃，180rpm下反应12小时，加入终浓度10M的NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取两次，每次加入500μL，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

实施例3

一种提高手性胺转化率的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例1步骤(1)；

(2)用pflB替找实施例1中的tdcE，其它同实施例1步骤(2)；

(3)将p2A4-ArR-ωTA；p2A4-pflB；p2A4-ldh分别导入大肠杆菌(E.coli MG1655)中，得到重组菌1，重组菌3和重组菌6；

(4)将重组菌1、重组菌3和重组菌6分别发酵，得到重组菌1发酵液、重组菌3发酵液和重组菌6发酵液；

发酵过程同实施例1；

(5)分别将步骤(4)获得的发酵液，4℃和6500rpm离心收集沉淀，沉淀用0.01M PBS(pH＝7.5)洗涤洗涤，得到重组菌1发酵液沉淀、重组菌3发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀；

(6)分别将步骤(5)获得的重组菌3发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀分别用PBS(100mM，PH＝7.5，)重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟；得到重组菌3粗酶液(即：pflB粗酶液)和ldh粗酶液；

(7)将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用pH＝7.5浓度为100mM的PBS重悬，得混合液，所述PBS的体积为步骤(4)获得的重组菌1发酵液体积的1/7,取1mL混合液，加入终浓度为1.5mM的PLP、终浓度为1mM的NAD⁺，在40℃，220rpm下反应20分钟；再加入10U的pflB粗酶液、10U的ldh粗酶液、10U的甲酸脱氢酶、终浓度250mM的D-丙氨酸、终浓度25mM底物苄基丙酮和终浓度0.1mM的CoA，得到反应液，加入反应液体积60％的助溶剂DMSO，在40℃，220rpm下反应12小时，加入终浓度10M的NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取两次，每次加入500μL，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

实施例4

一种提高手性胺转化率的方法，包括如下步骤：

(1)同实施例1步骤(1)；

(2)用pflD替找实施例1中的tdcE，其它同实施例1步骤(2)；

(3)将p2A4-ArR-ωTA；p2A4-pflD；p2A4-ldh分别导入大肠杆菌(E.coli MG1655)中，得到重组菌1，重组菌4和重组菌6；

(4)将重组菌1、重组菌4和重组菌6分别发酵，得到重组菌1发酵液、重组菌4发酵液和重组菌6发酵液；

发酵过程同实施例1；

(5)分别将步骤(4)获得的发酵液，4℃和6500rpm离心收集沉淀，沉淀用0.01M PBS(pH＝7.5)洗涤洗涤，得到重组菌1发酵液沉淀、重组菌4发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀；

(6)分别将步骤(5)获得的重组菌4发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀分别用PBS(100mM，PH＝7.5，)重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟；得到重组菌4粗酶液(即：pflD粗酶液)和ldh粗酶液；

(7)将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用pH＝7.5浓度为100mM的PBS重悬，得混合液，所述PBS的体积为步骤(4)获得的重组菌1发酵液体积的1/7,取1mL混合液，加入终浓度为1.5mM的PLP、终浓度为1mM的NAD⁺，在25℃，180rpm下反应40分钟；再加入10U的pflD粗酶液、10U的ldh粗酶液、10U的甲酸脱氢酶、终浓度250mM的D-丙氨酸、终浓度25mM底物2-戊酮和终浓度0.1mM的CoA，得到反应液，加入反应液体积15％的助溶剂DMSO，在25℃，180rpm下反应12小时，加入终浓度10M的NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取两次，每次加入500μL，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种提高手性胺转化率的方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 节杆菌属(Arthrobacter sp.)

<400> 1

Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Ser Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr

1 5 10 15

Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro

35 40 45

Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Tyr Leu His Ser Asp

50 55 60

Val Thr Tyr Thr Val Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu

65 70 75 80

Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Ile

85 90 95

Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu

100 105 110

Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Phe Val Ser Val Ser Ile Thr

115 120 125

Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Gly Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg

130 135 140

Pro Gln Val Tyr Met Tyr Ala Val Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe

145 150 155 160

Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg

165 170 175

Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp

180 185 190

Gly Asp Leu Ile Arg Ala Val Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu

195 200 205

Ala Pro Leu Leu Leu Asp Gly Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Ser Gly

210 215 220

Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg

225 230 235 240

Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu

245 250 255

Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Leu Ala Glu Leu

260 265 270

Leu Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Thr Thr Ala Gly Gly Val Trp

275 280 285

Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly

290 295 300

Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu

305 310 315 320

Ser Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr

325 330

<210> 2

<211> 1001

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatggctt tctctgctga cacctctgaa atcgtttaca cccacgacac cggtctggac 60

tacatcacct actctgacta cgaactggac ccggctaacc cgctggctgg tggtgctgct 120

tggatcgaag gtgctttcgt tccgccgtct gaagctcgta tctctatctt cgaccagggt 180

tacctgcact ctgacgttac ctacaccgtt ttccacgttt ggaacggtaa cgctttccgt 240

ctggacgacc acatcgaacg tctgttctct aacgctgaat ctatgcgtat catcccgccg 300

ctgacccagg acgaagttaa agaaatcgct ctggaactgg ttgctaaaac cgaactgcgt 360

gaagcgtttg tatctgtaag catcacccgt ggttactctt ctaccccggg tgaacgtgac 420

atcaccaaac accgtccgca ggtttacatg tacgctgttc cgtaccagtg gatcgttccg 480

ttcgaccgta tccgtgacgg tgttcacgct atggttgctc agtctgttcg tcgtaccccg 540

cgttcttcta tcgacccgca ggttaaaaac ttccagtggg gtgacctgat ccgtgctgtt 600

caggaaaccc acgacagggg cttcgaagct ccgctcctgc tggacggtga cggtctgctg 660

gctgaaggtt ctggtttcaa cgttgttgtt atcaaagacg gtgttgttcg ttctccgggt 720

cgtgctgctc tgccgggtat cacccgtaaa accgttctgg aaatcgctga atctctgggt 780

cacgaagcta tcctggctga catcaccctg gctgaactgc tggacgctga cgaagttctg 840

ggttgcacca cagctggcgg tgtctggccg ttcgtctctg ttgacggtaa cccgatctct 900

gacggtgttc cgggtccggt tacccagtct atcatccgtc gttactggga actgaacgtt 960

gaatcttctt ctctgctgac cccggttcag tactaaagct t 1001

<210> 3

<211> 2454

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

ggaattccat atgatgacca cactgaaact ggacacgctc agcgaccgca ttaaagcgca 60

caaaaatgcg ctggtgcata ttgtgaaacc gccagtctgt accgagcgcg cgcagcacta 120

taccgagatg tatcaacaac atctcgataa gccgatcccg gtacgtcgcg cgctggcact 180

ggcgcatcac ctggcgaatc gcaccatctg gatcaaacac gatgagttga tcattggcaa 240

ccaggcaagc gaagttcgcg ccgcgccgat cttcccggaa tatactgtct cgtggatcga 300

aaaagagatt gatgatctgg cagatcgtcc cggtgctggc tttgcggtga gcgaagagaa 360

caaacgcgtt ctgcatgaag tgtgcccgtg gtggcgcggt cagaccgtac aggatcgctg 420

ctacggcatg tttaccgatg agcaaaaagg tctgctggcg accggaatca ttaaagcgga 480

aggcaatatg acctccggcg atgcgcacct ggcggtgaat ttcccgctgc tgctggaaaa 540

agggcttgat ggtctgcgcg aggaagtagc ggaacgtcgc tcgcgcatca acctgacggt 600

gctggaagat ttacacggtg agcaattcct gaaagcgatt gatatcgtgc tggtggcagt 660

cagtgaacac attgaacgtt tcgctgccct ggcgcgtgaa atggccgcga ccgaaacccg 720

cgaaagccgt cgcgatgaac tgctggcgat ggcagaaaac tgcgatctta tcgcccacca 780

gccgccgcag actttctggc aggcgctgca actgtgttac ttcatccagt tgattttgca 840

gatcgaatct aacggtcact cagtatcgtt tggtcgtatg gaccagtatc tctacccgta 900

ctatcgccgc gacgttgaac tcaaccagac gctggatcgc gaacacgcca tcgagatgct 960

gcatagctgc tggctgaaac tgctggaagt gaacaagatc cgctccggct cacactcaaa 1020

agcctctgcg ggaagtccgc tgtatcagaa cgtcactatt ggcgggcaaa atctggttga 1080

tggtcaacca atggacgcgg tgaatccact ctcttacgcg atcctcgaat cctgcggtcg 1140

cctgcgttcc actcagccta acctcagcgt gcgttaccat gcaggaatga gcaacgattt 1200

cctcgacgcc tgcgtacagg tgatccgttg cggcttcggg atgccggcgt tcaacaacga 1260

cgaaatcgtg atcccggaat ttattaaact cggtattgaa ccgcaggacg cttatgacta 1320

cgcagcgatt ggttgtatag aaaccgccgt cggtggcaaa tggggctatc gctgtaccgg 1380

catgagcttt atcaacttcg cccgcgtgat gctggcggcg ctggaaggcg ggcatgatgc 1440

caccagcggc aaagtgttcc tgccacaaga aaaagcgttg tcggcaggta acttcaacaa 1500

cttcgatgaa gtgatggacg cgtgggatac gcaaatccgt tactacaccc gcaaatcaat 1560

cgaaatcgaa tatgtcgtcg acaccatgct ggaagagaac gtgcacgata ttctctgctc 1620

ggcgctggtg gatgactgta ttgagcgagc gaaaagtatc aagcaaggcg gcgcgaaata 1680

tgactgggtt tctggcctgc aggtcggcat tgccaacctc ggcaacagcc tggcggcagt 1740

gaagaaactg gtgtttgaac aaggtgcgat tggtcagcaa cagcttgctg ccgcactggc 1800

agatgacttc gacggcctga ctcacgagca gctgcgtcag cggctgatta acggtgcgcc 1860

gaagtacggc aacgacgatg atactgtcga tacgctgctg gctcgcgctt atcagaccta 1920

tatcgacgaa ctgaaacagt accataatcc gcgctacggt cgtggtccgg ttggcggcaa 1980

ctattacgcg ggtacgtcat caatctccgc taacgtaccg tttggcgcgc agactatggc 2040

aacaccggac gggcgtaaag cccacacccc gctggcagaa ggcgcaagcc cggcctccgg 2100

tactgaccat cttggcccta ctgcggtcat tggctcagtg ggtaaactgc ctacggcagc 2160

gattctcggc ggcgtgttgc tcaaccagaa actgaatccg gcaacgctgg agaacgaatc 2220

tgacaagcag aaactgatga tcctgctgcg taccttcttt gaagtgcata aaggctggca 2280

tattcagtac aacatcgttt cccgcgaaac gctgctggat gcgaaaaaac atcccgatca 2340

gtatcgcgat ctggtagtgc gtgtcgcggg ctattccgcg ttcttcaccg cgctctctcc 2400

agacgctcag gacgatatca tcgcccgtac tgaacatatg ctgtaaacta gtcc 2454

<210> 4

<211> 2322

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

ggaattccat atgcatcacc atcatcacca catgtccgag cttaatgaaa agttagccac 60

agcctgggaa ggttttacca aaggtgactg gcagaatgaa gtaaacgtcc gtgacttcat 120

tcagaaaaac tacactccgt acgagggtga cgagtccttc ctggctggcg ctactgaagc 180

gaccaccacc ctgtgggaca aagtaatgga aggcgttaaa ctggaaaacc gcactcacgc 240

gccagttgac tttgacaccg ctgttgcttc caccatcacc tctcacgacg ctggctacat 300

caacaagcag cttgagaaaa tcgttggtct gcagactgaa gctccgctga aacgtgctct 360

tatcccgttc ggtggtatca aaatgatcga aggttcctgc aaagcgtaca accgcgaact 420

ggatccgatg atcaaaaaaa tcttcactga ataccgtaaa actcacaacc agggcgtgtt 480

cgacgtttac actccggaca tcctgcgttg ccgtaaatct ggtgttctga ccggtctgcc 540

agatgcatat ggccgtggcc gtatcatcgg tgactaccgt cgcgttgcgc tgtacggtat 600

cgactacctg atgaaagaca aactggcaca gttcacttct ctgcaggctg atctggaaaa 660

cggcgtaaac ctggaacaga ctatccgtct gcgcgaagaa atcgctgaac agcaccgcgc 720

tctgggtcag atgaaagaaa tggctgcgaa atacggctac gacatctctg gtccggctac 780

caacgctcag gaagctatcc agtggactta cttcggctac ctggctgctg ttaagtctca 840

gaacggtgct gcaatgtcct tcggtcgtac ctccaccttc ctggatgtgt acatcgaacg 900

tgacctgaaa gctggcaaga tcaccgaaca agaagcgcag gaaatggttg accacctggt 960

catgaaactg cgtatggttc gcttcctgcg tactccggaa tacgatgaac tgttctctgg 1020

cgacccgatc tgggcaaccg aatctatcgg tggtatgggc ctcgacggtc gtaccctggt 1080

taccaaaaac agcttccgtt tcctgaacac cctgtacacc atgggtccgt ctccggaacc 1140

gaacatgacc attctgtggt ctgaaaaact gccgctgaac ttcaagaaat tcgccgctaa 1200

agtgtccatc gacacctctt ctctgcagta tgagaacgat gacctgatgc gtccggactt 1260

caacaacgat gactacgcta ttgcttgctg cgtaagcccg atgatcgttg gtaaacaaat 1320

gcagttcttc ggtgcgcgtg caaacctggc gaaaaccatg ctgtacgcaa tcaacggcgg 1380

cgttgacgaa aaactgaaaa tgcaggttgg tccgaagtct gaaccgatca aaggcgatgt 1440

cctgaactat gatgaagtga tggagcgcat ggatcacttc atggactggc tggctaaaca 1500

gtacatcact gcactgaaca tcatccacta catgcacgac aagtacagct acgaagcctc 1560

tctgatggcg ctgcacgacc gtgacgttat ccgcaccatg gcgtgtggta tcgctggtct 1620

gtccgttgct gctgactccc tgtctgcaat caaatatgcg aaagttaaac cgattcgtga 1680

cgaagacggt ctggctatcg acttcgaaat cgaaggcgaa tacccgcagt ttggtaacaa 1740

tgatccgcgt gtagatgacc tggctgttga cctggtagaa cgtttcatga agaaaattca 1800

gaaactgcac acctaccgtg acgctatccc gactcagtct gttctgacca tcacttctaa 1860

cgttgtgtat ggtaagaaaa cgggtaacac cccagacggt cgtcgtgctg gcgcgccgtt 1920

cggaccgggt gctaacccga tgcacggtcg tgaccagaaa ggtgcagtag cctctctgac 1980

ttccgttgct aaactgccgt ttgcttacgc taaagatggt atctcctaca ccttctctat 2040

cgttccgaac gcactgggta aagacgacga agttcgtaag accaacctgg ctggtctgat 2100

ggatggttac ttccaccacg aagcatccat cgaaggtggt cagcacctga acgttaacgt 2160

gatgaaccgt gaaatgctgc tcgacgcgat ggaaaacccg gaaaaatatc cgcagctgac 2220

catccgtgta tctggctacg cagtacgttt caactcgctg actaaagaac agcagcagga 2280

cgttattact cgtaccttca ctcaatctat gtaaactagt cc 2322

<210> 5

<211> 2319

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

ggaattccat atgatgacga atcgtatctc tcgcctcaaa actgcactgt ttgccaatac 60

ccgtgaaatc tcgctggagc gggcgctgct ttataccgcc agccatcggc aaaccgaagg 120

cgaaccggtg atattgcgcc gggcgaaagc aacagcgtat atccttgaac atgttgaaat 180

ttcgattcgt gatgaagaac tgattgccgg taaccgcacc gtaaaaccgc gcgccgggat 240

tatgtcgccg gaaatggacc cttactggct gctgaaagag ctggatcaat tcccgacgcg 300

tccgcaggac cgctttgcta tcagcgaaga agataaacgt atctaccgtg aagagttgtt 360

cccgtactgg gaaaaacgtt cgatgaaaga tttcatcaac gggcagatga cagatgaagt 420

aaaagccgcg accaacacgc agattttcag catcaaccag acggataaag gccaggggca 480

cattattatt gattacccac gcctgttgaa tcacgggctg ggtgagctgg tggcacagat 540

gcagcaacat tgtcagcaac agccggagaa tcacttttat caggccgcgt tgttactgct 600

ggaagcctcg cagaaacaca ttttgcgtta cgccgaactg gcggaaacga tggcggcaaa 660

ctgcacagat gcccagcgtc gcgaagagct gctgactatt gcagagatct cccgccataa 720

cgcgcaacat aagccgcaga cgttctggca ggcgtgccag ttattctggt acatgaacat 780

cattctgcaa tacgaatcca acgccagttc gctatcgttg gggcgcttcg accagtatat 840

gttgccgttc tatcagacat cattaaccca gggcgaagat gcggcgttcc tgaaagaact 900

gctcgaatct ttatgggtga aatgcaacga catcgtgctg ttgcgctcca ccagtagcgc 960

gcgttatttc gccggtttcc cgaccggcta taccgcactg ctcggcgggt taaccgagaa 1020

cggacgtagc gcggtgaacg tgctttcgtt cctttgcctt gacgcctatc aaagcgtgca 1080

attaccgcaa ccgaacctcg gcgtgcgcac taacgccttg atcgacacgc cgttcctgat 1140

gaaaaccgcc gaaaccattc gcttcggtac cggtattccg caaatcttta acgatgaagt 1200

ggtggtgcca gcgttcctca accgtggcgt ttcgctggaa gatgcgcgcg actattccgt 1260

agtgggctgt gtggaattat ctattcccgg cagaacctac ggcttgcatg acatcgcgat 1320

gtttaatctg ctgaaagtga tggaaatctg cctgcatgaa aatgaaggca atgctgcgct 1380

gacttatgaa ggtttactgg agcagatccg cgccaagatc agccactaca tcaccctgat 1440

ggttgagggc agcaatattt gtgatatcgg ccatcgcgac tgggcacctg taccgctgct 1500

ctcatcgttt atcagcgatt gtctggaaaa aggccgcgat attaccgatg gcggcgcgcg 1560

ttataacttc tccggcgtac aggggatcgg tatcgccaac ctgagcgatt ctctccatgc 1620

gttgaaaggg atggtttttg agcaacagcg tttaagtttt gacgaattgc tgtcggtatt 1680

aaaagccaac ttcgcaacgc cagaaggcga aaaagtccgc gctcgcttaa ttaaccgctt 1740

cgagaaatac ggtaacgata tcgacgaggt ggataacatc agcgccgaac tgttgcgcca 1800

ctactgcaaa gaagtggaaa aataccagaa cccgcgcggc ggctacttca cgccgggatc 1860

gtataccgtt tctgctcacg tcccgttggg atcggtggtt ggcgcgacgc cagacggtcg 1920

ttttgccgga gaacagctgg cagacggcgg cttgtcaccc atgctgggcc aggacgcaca 1980

agggccaaca gcggtactga agtcagtcag taagctcgat aacacgctgc tgtctaacgg 2040

tacgttgctg aacgtgaaat tcactccggc gaccctggaa ggtgaagcag gattacgcaa 2100

actggccgac ttcttacggg cgtttaccca gcttaagtta caacatattc agtttaacgt 2160

ggtgaacgcc gacacgttgc gggaagcgca acagcgccca caagattatg ccgggctggt 2220

ggtgcgcgtt gccggataca gcgccttctt tgtcgaactg tcgaaggaga tccaggatga 2280

catcatccgc cggacagcgc atcagctgta aactagtcc 2319

<210> 6

<211> 2316

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

ggaattccat atgatgaagg tagatattga taccagcgat aagctgtacg ccgacgcatg 60

gcttggcttt aaaggtacgg actggaaaaa cgaaattaat gtccgcgatt ttattcaaca 120

taactataca ccgtatgaag gcgatgaatc tttcctcgcc gaagcgacgc ctgccaccac 180

ggaattgtgg gaaaaagtaa tggaaggcat ccgtatcgaa aatgcaaccc acgcgccggt 240

tgatttcgat accaatattg ccaccacaat taccgctcat gatgcgggat atattaacca 300

gccgctggaa aaaattgttg gcctgcaaac ggatgcgccg ttgaaacgtg cgctacaccc 360

gttcggtggc attaatatga ttaaaagttc attccacgcc tatggccgag aaatggacag 420

tgaatttgaa tatctgttta ccgatctgcg taaaacccat aaccagggcg tatttgatgt 480

ttactcaccg gatatgctgc gctgccgtaa atctggcgtg ctgaccggtt taccagatgg 540

ctatggccgt gggcgcatta tcggtgacta tcgccgcgta gcgctgtatg gcatcagtta 600

tctggtacgt gaacgcgaac tgcaatttgc cgatctccag tctcgtctgg aaaaaggcga 660

ggatctggaa gccaccatcc gtctgcgtga ggagctggca gagcatcgtc atgcgctgtt 720

gcagattcag gaaatggcgg cgaaatatgg ctttgatatc tctcgcccgg cgcagaatgc 780

gcaggaagcg gtgcagtggc tctacttcgc ttatctggcg gcagtgaaat cgcaaaatgg 840

cggcgcgatg tcgctgggcc gcacggcatc gttcctcgat atctacattg agcgcgactt 900

taaagctggc gtactcaatg agcagcaggc acaggaactg atcgatcact tcatcatgaa 960

gatccgtatg gtacgcttcc tgcgtacacc ggaatttgat tcgctgttct ccggcgaccc 1020

aatctgggcg acggaagtga tcggcgggat ggggctggac ggtcgtacgc tggtgaccaa 1080

aaactccttc cgctatttgc acaccctgca cactatgggg ccggcaccgg aacctaacct 1140

gaccattctt tggtcggaag aattaccgat tgccttcaaa aaatatgccg cgcaggtgtc 1200

gatcgtcacc tcttccttgc agtatgaaaa tgacgatctg atgcgtactg acttcaacag 1260

cgacgattac gcgattgcct gctgcgtcag cccaatggtg attggtaagc aaatgcagtt 1320

ctttggtgca cgcgctaacc tggcgaaaac gctgctctac gcaattaacg gcggggtgga 1380

cgagaagctg aagattcagg tcgggccgaa aacagcaccg ctgatggacg acgtgctgga 1440

ttacgacaaa gtgatggaca gcctcgatca cttcatggac tggctggcgg tgcagtacat 1500

cagcgcgctg aatatcattc actacatgca cgacaagtac agctacgaag cttcgctgat 1560

ggcgctgcac gatcgtgatg tctatcgcac tatggcatgc ggcatcgcgg gcctgtcggt 1620

ggcgacggac tccctgtctg ccatcaaata tgcccgcgtg aaaccaatcc gtgacgaaaa 1680

cggcctggcg gtggactttg aaatcgacgg tgaatatccg cagtacggca acaacgacga 1740

gcgcgtagac agcattgcct gcgacctggt tgaacgcttt atgaagaaaa ttaaagcgct 1800

gccaacctat cgcaacgccg tccctaccca gtcgattctg actatcactt ctaacgtggt 1860

gtacggccag aaaaccggta atacgccgga cggtcgtcgc gccggaacac cgttcgcgcc 1920

gggcgctaac ccgatgcatg gtcgtgaccg caaaggtgcc gtggcctcat tgacgtcggt 1980

ggcgaaactg ccgttcacct acgccaaaga tgggatctcg tacaccttct caatcgttcc 2040

tgcggcgctg ggcaaagaag atccagtacg taaaaccaac cttgtcggcc tgctggatgg 2100

gtatttccac cacgaagcgg atgtcgaagg cggtcaacac ctcaacgtca acgtaatgaa 2160

tcgggaaatg ctgctggatg ccatcgagca cccggaaaaa tatcctaacc tgacaatccg 2220

tgtctctggc tacgccgtgc gcttcaacgc actgacccgt gaacagcaac aggatgttat 2280

ttcacgtacc tttacccagg cgctctgaac tagtcc 2316

<210> 7

<211> 990

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60

gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120

actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180

ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240

aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300

gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360

caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420

actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480

cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540

gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600

atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660

gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720

caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780

gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840

ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900

gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960

ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaattccat atgatgacca cac 23

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggactagttt acagcatatg ttcagtacgg 30

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaattccat atgtccgagc tta 23

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggactagtta catagattga gtgaagg 27

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaattccat atgacgaatc gtatc 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggactagtta cagctgatgc gct 23

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggccgtccat atgaaggtag atattga 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggactagttc agagcgcctg ggtaa 25

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggaattccat atgatgaaac tcgc 24

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

actagtttaa accagttcgt tcggg 25

<210> 18

<211> 2167

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggatccttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 60

gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 120

tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca 180

ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 240

ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 300

ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 360

aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 420

cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 480

gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 540

ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaagct 600

tgaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 660

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 720

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 780

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 840

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 900

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 960

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 1020

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 1080

cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 1140

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 1200

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 1260

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 1320

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 1380

ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 1440

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 1500

ataacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 1560

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 1620

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 1680

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 1740

atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 1800

taaaaatagg cgtatcacga ggcagaattt cagataaaaa aaatccttag ctttcgctaa 1860

ggatgatttc tggaattcgc ggccgcttct agagtactag tagcggccgc tgcagtccgg 1920

caaaaaaggg caaggtgtca ccaccctgcc ctttttcttt aaaaccgaaa agattacttc 1980

gcgttatgca ggcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 2040

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 2100

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 2160

tggcgtt 2167

Claims

1.一种提高手性胺转化率的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增：

所述p2A4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

所述ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)将p2A4-ArR-ωTA；p2A4-FA；p2A4-ldh分别导入大肠杆菌中，得到重组菌1，重组菌FA和重组菌6；

(6)分别将步骤(5)获得的重组菌FA发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀用PBS重悬细胞并进行超声破碎处理；得到FA粗酶液和ldh粗酶液；

(7)将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用PBS重悬，得混合液，取混合液加入PLP、NAD⁺，在25℃-40℃，180-220rpm下反应20-40分钟；再加入FA粗酶液、ldh粗酶液、甲酸脱氢酶、D-丙氨酸、底物酮和CoA，得到反应液，加入助溶剂，在25℃-40℃，180-220rpm下反应12-24小时，加入NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

2.根据权利要求1所述的一种提高手性胺转化率的方法，其特征是所述FA为ybiw、pflB、pflD或tdcE，所述ybiw的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，pflB的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，pflD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，tdcE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1所述的一种提高手性胺转化率的方法，其特征是所述步骤(7)为：将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用pH＝7.5浓度为100mM的PBS重悬，得混合液，所述PBS的体积为步骤(4)获得的重组菌1发酵液体积的1/7,按比例，取1mL混合液，加入终浓度为1.5mM的PLP、终浓度为1mM的NAD⁺，在25℃-40℃，180-220rpm下反应20-40分钟；再加入10U的FA粗酶液、10U的ldh粗酶液、10U的甲酸脱氢酶、终浓度250mM的D-丙氨酸、终浓度25mM底物酮和终浓度0.1mM的CoA，得到反应液，加入反应液体积15％-60％的助溶剂DMSO，在25℃-40℃，180-220rpm下反应12-24小时，加入终浓度10M的NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取两次，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

4.根据权利要求1或3所述的一种提高手性胺转化率的方法，其特征是所述酮为2-戊酮、环己酮或苄基丙酮。