KR20230136624A

KR20230136624A - 소세포 폐암의 치료를 위한 옥사비시클로헵탄

Info

Publication number: KR20230136624A
Application number: KR1020237027666A
Authority: KR
Inventors: 라비 살기아; 존 에스. 코바흐
Original assignee: 릭스트 바이오테크놀로지, 인코포레이티드
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2023-09-26
Also published as: EP4281063A1; JP2024504586A; AU2021421147A1; WO2022159150A1; CN116710093A; IL303047A; TW202245768A; US20230065158A1; AU2021421147A9; CA3208466A1

Abstract

본 발명은 SCLC를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 PP2A 억제제 및 임의적으로 1종 이상의 항암제를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

소세포 폐암의 치료를 위한 옥사비시클로헵탄

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 2021년 1월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/139,047을 우선권으로 주장하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

본 발명은 포스파타제 2A (PP2A)의 억제를 필요로 하는 대상체에서 PP2A를 억제하는데 유용한 방법에 관한 것이다.

단백질 포스파타제 2A (PP2A)는 ATM/ATR-의존성 및 -비의존성 반응 경로 둘 다의 수많은 단백질을 탈인산화하는 편재하는 세린/트레오닌 포스파타제이다 (Mumby, M. 2007). PP2A의 약리학적 억제는 이전에 다양한 신호전달 단백질, 예컨대 p53, γH2AX, PLK1 및 Akt의 구성적 인산화를 통해 암 세포를 방사선-매개 DNA 손상에 대해 민감하게 만들어, 세포 주기 탈조절, DNA 복구 억제, 및 아폽토시스를 일으키는 것으로 제시된 바 있다 (Wei, D. et al. 2013).

블리스터 비틀 추출물 (밀라브리스(Mylabris))의 주요 활성 성분인 칸타리딘은 PP2A의 강력한 억제제인 것으로 제시된 바 있는 전통 한의학으로부터 유래된 화합물이다 (Efferth, T. et al. 2005). 칸타리딘이 이전에 간종의 치료를 위해 사용되었고, 다중약물-내성 백혈병 세포주에 대한 효능을 나타내었지만 (Efferth, T. et al. 2002), 그의 심각한 독성은 그의 임상적 유용성을 제한한다. LB-100 (즉, (3-[(4-메틸피페라진-1-일)카르보닐]-7-옥사비시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복실산])은 유의하게 적은 독성을 갖는 칸타리딘의 소분자 유도체이다. 이전의 전임상 연구는 LB-100이 교모세포종 (GBM), 전이성 크롬친화세포종, 및 췌장암에 대한 테모졸로미드, 독소루비신, 및 방사선 요법의 세포독성 효과를 증강시킬 수 있음을 제시한 바 있다 (Wei, D. et al. 2013; Lu, J. et al. 2009; Zhang, C. et al. 2010; Martiniova, L. et al. 2011). LB-100은 또한 고형 종양의 치료를 위해 도세탁셀과 조합되어 1상 연구를 진행 중이다 (Chung, V. 2013).

2017년도에 전 세계적으로 백만 명이 넘는 사람들이 폐암으로 사망하였고, 소세포 암종은 모든 폐암의 대략 15%를 차지한다. 이중 또는 삼중 약물 요법 조합에도, "광범위 질환" (ED-SCLC, 환자의 70%)을 갖는 소세포 폐 암종 (SCLC)에 대한 중간 생존은 대략 9개월에 불과하며, 전체 5년 생존은 대략 5%로 유지된다. PP2A는 SCLC 세포에서 편재하여 발현되지만, SCLC에서 그의 잠재적인 관련성은 대부분 알려지지 않았다. 단백질 포스파타제 2A (PP2A)는 폐암 및 B 세포-유래된 백혈병을 비롯한 광범위한 암 아형에서 주요 종양 단백질, 예컨대 c-Myc 및 Bcr-Abl의 조절에 관여하는 포스파타제이다. 따라서, SCLC, 특히 ED-SCLC를 앓고 있는 환자를 위한 개선된 치료가 여전히 필요하다. 본 발명은 LB-100이 단독으로 또는 1종 이상의 항암제와 조합되어 SCLC, 예를 들어 ED-SCLC를 앓고 있는 환자를 치료하는데 유용하다는 인식을 포함한다.

본 발명은, 특히, 소세포 폐 암종 (SCLC)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 하기 구조의 화합물 (본원에서 LB-100로 언급됨) (즉, (3-[(4-메틸피페라진-1-일)카르보닐]-7-옥사비시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복실산]):

또는 그의 제약상 허용가능한 염, 쯔비터 이온, 또는 에스테르를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 SCLC를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, LB-100을 1종 이상의 항암제와 조합하여 투여하는 것을 포함하며, 여기서 양은 함께 사용될 때 대상체를 치료하는데 효과적인 것인 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 SCLC를 앓고 있고 1종 이상의 항암제를 제공받고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, LB-100의 부재 하에 투여되는 1종 이상의 항암제에 비해 치료를 증강시키는데 효과적인 양의 LB-100을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 항암제는 카르보플라틴, 에토포시드, 및 아테졸리주맙으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 항암제는 카르보플라틴, 에토포시드, 및 아테졸리주맙이다.

일부 실시양태에서, SCLC는 비치료된 광범위 병기 SCLC (ED-SCLC)이다.

도 1은 SCLC 종양 및 세포에서 PP2A-A 발현에 대한 LB-100의 효과를 도시한다. (A) 산포도는 종양 샘플에서 PP2A-A 서브유닛의 상향조절을 제시한다. 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정은 정상 및 SCLC 샘플 사이의 비교를 이용하였다. (B) PP2A에 대한 IHC는 TMA 조직 섹션에 대해 수행되었고, 영상은 3D-히스테크(3D-Histech) 파노라믹 스캔(PANNORAMIC SCAN) 전체 슬라이드 스캐너 (쓰리디-히스테크, 헝가리 부다페스트)를 사용하여 4x 또는 20x에서 캡쳐되었다. PP2A 서브유닛 A는 정상 폐 및 종양 조직의 세포질 및 핵을 양성으로 면역염색하였지만, 종양 조직에서 고도로 상향조절되었다. TMA는 정상 (n=24) 및 종양 (n=79) 코어에서 0 (염색 없음/단백질 발현 없음) 내지 3+ (강한 염색/높은 단백질 발현)의 척도로 평점되었다. (C) 평균 PP2A 서브유닛 염색의 요약 막대 그래프. 정상 및 종양 코어의 IHC 염색 강도. 정상 및 종양 조직 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (p<0.001). (D) PP2A 서브유닛 A 및 C의 발현을 비교하기 위해, 7가지 SCLC 세포주 및 HBEC 3KT (비-악성 세포주)로부터의 세포 용해물을 웨스턴 블롯팅에 적용하였다. (E) PP2A 활성은 칸타리딘 (10 μM) 및 LB-100 (5 μM)에 24시간 노출 후 세린/트레오닌 포스파타제 활성 검정 (밀리포어(Millipore))을 이용하여 결정되었다. (F) 삽도는 H524 세포에서 PP2A 서브유닛 Aα의 감소 뿐만 아니라, PP2A 서브유닛 Aα 녹다운으로 인한 세포 증식의 억제를 제시하였다 (p<0.5) (n=3). LB-100은 단독으로 또는 카르보플라틴과 조합되어 SCLC 세포에서 증식 및 콜로니 형성을 억제하였다. 세포 카운팅 키트-8 검정은 세포 H524 및 H69 세포 생존력을 검출하였다. (G, H) 세포를 LB-100, 카르보플라틴 및 에토포시드로 단일 처리로서 또는 일정한 비로 조합하여 처리하였다. 조합 지수 (CI)는 LB-100과 카르보플라틴 및 에토포시드 사이의 상승작용을 확인하기 위해 추-탈라레이(Chou-Talalay) 방법을 이용하여 계산되었다 (컴퓨신(CompuSyn) 소프트웨어: www.combosyn.com). 그래프는 세포에 대한 % 생존력의 평균 + SEM을 나타낸다 (n=3). 콜로니 형성 검정을 이용하여 H524 (I) 및 H69 (J) 세포가 콜로니를 형성하는 능력을 카운팅하였다. 각각 H524 및 H69를 사용하는 2가지 검정에 대한 약물 농도가 나열된다: LB-100 (2.5 μM; 20 μM), 카르보플라틴 (4 μM; 20 μM), 에토포시드 (3 μM; 30 μM), LB-100/카르보플라틴 (2.5&4 μM; 20&20 μM) 및 LB-100/에토포시드 (2.5&3 μM; 20&30 μM). 4x에서 콜로니의 대표적인 영상은 그래프 아래에 제시되어 있다 (n=2). *p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001. 실험은 3회 반복되었고, 대표적인 데이터가 제시되어 있다.
도 2는 H446 스페로이드 성장에 대한 LB-100의 효과를 도시한다. (A) 1 및 9일차에 H446 세포의 단일 스페로이드의 형태학. 스페로이드는 계속 성장하고, H&E 염색이 나타난다. (B) LB-100 처리에 대한 반응으로 스페로이드의 성장은 인큐사이트(IncuCyte) 라이브 세포 분석 시스템에 의해 기록되었다. (C) LB100의 세포독성 효과는 녹색 형광에서 LB-100 및 인큐사이트 세포독성 시약의 존재 하에 인큐사이트 라이브 세포 분석 시스템에 의해 기록되었다. H446 스페로이드 형태학 및 성장에 대한 LB-100, 카르보플라틴, 에토포시드, 및 약물 조합물의 효과. (D) LB-100, 카르보플라틴, 에토포시드 및 조합 처리에 의해 H&E-염색된 H446 스페로이드의 대표적인 영상. 축척 막대 100 μm. (E, G) LB100 및 카르보플라틴 단독 또는 조합의 효과는 인큐사이트 라이브 세포 시스템을 사용하여 70시간 동안 모니터링되었다. 스페로이드의 크기에 대한 LB-100, 카르보플라틴 또는 약물 조합물의 최대 유의한 억제 효과는 70시간 시점에서 관찰되었다. (F, H) LB-100 및 에토포시드 단독 또는 조합의 효과는 인큐사이트 라이브 세포 시스템을 사용하여 72시간 동안 모니터링되었다. 스페로이드의 크기에 대한 LB-100, 카르보플라틴 또는 약물 조합물의 최대 유의한 억제 효과는 70 및 72시간 시점에서 관찰되었다 (n=3). *, p<0.05; **, p<0.01.
도 3은 HUVEC 단층을 통한 SCLC 세포 침윤을 도시한다. (A, B) H524/H69 세포가 전기 기질-임피던스 감지 시스템을 이용하여 전면생장 HUVEC 단층을 방해하는 능력의 그래픽 표현. 화살표는 세포가 첨가된 시점을 나타낸다. 삽도는 20시간의 약물 처리 후 각각의 그룹에 대한 평균 값 및 SD를 제시한다. 처리 후, 세포 생존력은 오토 T4 세포 카운터 (넥셀롬 셀로미터(Nexcelom Cellometer))를 사용하여 카운팅하였다. 세포 생존력은 약물-처리된 그룹의 경우 90-95%였다 (n=2). 약물 조합물 (LB100/카르보플라틴)에 비해 대조군 (비처리된 세포)의 경우 p< 0.001 (***). 전세포 Pt 축적. SCLC 세포에 의한 백금 흡수에 대한 LB-100 효과의 그래픽 표현. 세포를 LB-100 (H524 - 5μM; H69 - 20μM)으로 밤새 전처리한 다음, 카르보플라틴으로 1 또는 4시간 동안 처리하였다 (H524 - 10μM; H69 - 30μM). 전세포 펠렛은 백금 (Pt) 측정을 위해 사용되었다. 값은 총 단백질 농도에 대해 정규화된다. (C, D) 패널은 각각의 그룹에 대한 Pt 축적의 평균 값 및 SD를 제시한다. 약물 조합물은 H524 및 H69 세포에서 Pt 농도를 유의하게 증가시켰다. 대조군 및 LB-100 샘플에서 Pt 농도는 검출 한계 미만이었다 (n=3, 기술적 반복). H524 및 H69 세포에서 PP2A 발현 및 아폽토시스 조절성 단백질에 대한 LB-100의 효과. 세포를 지정된 농도의 LB-100, 카르보플라틴 및 조합물로 72시간 동안 처리하였다. (E) H524 및 H69 세포에서 PP2A 서브유닛의 발현의 대표적인 웨스턴 블롯 (WB) 패널 (n=3). (F) γ-H2AX, 카스파제 3 및 PARP1 절단 활성의 단백질 인산화는 약물 처리 후 H524 및 H69 세포에서 WB에 의해 분석되었다 (n=3). 대표적인 WB 패널은 처리 후 H524 및 H69 세포에서 γ-H2AX 인산화의 유의한 증가 및 카스파제 3 및 PARP 1 절단 활성의 증강을 제시하였다. 범-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다 (n=3).
도 4는 H524 세포의 LB-100 처리 후 팸진(PamGene) PTK 및 STK의 리액톰 경로 분석, 및 Biolog 표현형 마이크로어레이를 도시한다. (A) 신호 전달 및 대사 경로에 대해 유의한 변화가 관찰되었다. (B) 마이크로어레이 분석은 LB100으로 20 μM 처리에 의한 밤샘 처리가 탄소 기질 공급원의 활용을 억제하였음을 제시하였다. 표는 LB-100에 의해 영향을 받는 10가지 탄소 공급원을 포함하였다 (n=3). (C) LB-100은 H69 세포에 의한 2가지 탄소 기질 활용을 유의하게 억제하였다. LB-100에 비해 대조군 (비처리된 세포)의 경우 P < 0.001 (***). (D) 암플렉스 레드(Amplex Red) 글루코스/옥시다제 검정 키트를 사용하여 세포 배양 배지에서의 글루코스 수준을 측정하였다. 글루코스 수준은 LB-100 (20 μM)으로 처리된 세포로부터의 세포 배양 배지에서 유의하게 더 높았다. 글루코스 농도는 초기 배지에서 검출하였고, 100%로서 카운팅되었다. 초기 글루코스 배지 농도로부터 글루코스의 최종 배지 수준을 차감하여 세포를 갖는 배지에서의 글루코스 %를 산출하였다 (n=3). MET 인산화에 대한 LB-100의 효과. (E) H524 및 H69 세포를 밤새 LB-100 (H524 - 5 μM 및 H69 - 20 μM)으로 처리한 후, 10분 내에 100 ng/ml HGF로 자극하였다. pMET 및 총 MET 항체에 의한 WB 분석을 위해 세포를 수집하고 용해시켰다. 범-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다 (n=3). (F) H524 세포 용해물 (대조군, LB-100, 카르보플라틴 및 조합물 (LB-100/카르보플라틴)을 웨스턴 블롯에 의해 분석하여, Ser985 및 Tyr1234/1235에서 MET의 인산화 상태를 점검하였다. 액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다 (n=3).
도 5는 SCLC 세포에서 세포 에너지 표현형에 대한 LB-100의 효과를 도시한다. (A) LB100 처리 (2.5 μM)는 H524 세포에서 대사 전환을 유도하였다. 세포 에너지 표현형은 XF 세포 에너지 표현형 리포터 생성기를 이용하여 수득되었다. 빈 사각형은 기준선 에너지 표현형을 나타내고, 채워진 사각형은 올리고마이신/FCCP 주사 후 스트레스 받은 에너지 표현형을 나타낸다. (B, C) 대조군 (청색 원) 및 LB-100 (오렌지색 원) H524 세포에서 OCR 및 ECAR은 시간 경과에 따라 측정되었다. (n=2, 각각의 연구 참여자에 대한 6개의 상이한 웰). (D) H69 세포 에너지 표현형에 대한 LB-100 (10 μM)의 효과. (E, F) H69 세포에서 OCR 및 ECAR에 대한 미토콘드리아 스트레스 인자의 효과. 청색 원은 대조군을 나타내고, 오렌지색 원은 LB-100 처리를 제시한다. (n=2, 6회의 기술적 반복).
도 6은 SCLC 세포에서 ATP 생성률을 도시한다. (A) H524 세포를 LB100 (2.5 μM), 카르보플라틴 (4 μM), 또는 조합물로 처리하고, ATP 생성률은 애질런트(Agilent) 시호스(Seahorse) XF 실시간 ATP 비율 검정을 이용하여 측정하였다. mitoATP (미토콘드리아) 및 glycoATP (당분해) 비율은 약물 처리의 부재 및 존재 하에 H524 세포에서 평가되었다. 모든 약물 처리는 mitoATP (상단, 청색) 및 glycoATP (하단, 적색) 생성률을 유의하게 감소시켰다. (B) H524 세포의 에너지 맵. LB-100 및 약물 조합물 이후, 세포는 당분해가 덜해지기 시작했다. (C 내지 E) 애질런트 시호스 XF pH 센서 프로브는 유리 양성자의 농도 변화를 측정하며, 이는 세포외 산성화율 (ECAR)에 상응한다. 실시간 ATP 비율 검정은 모든 공급원으로부터 세포외 산성화를 검출하는 개선된 계측치인 양성자 유출률 (PER)을 포함한다. LB-100은 기저 조건 하에 및 산화성 인산화 올리고마이신 (1.5 μM) 및 안티마이신 (0.5 μM)/로테논 (0.5 μM)의 특이적 억제제의 2회 주사 후 PER을 극적으로 감소시켰다. (F) H69 세포를 LB-100 (10 μM), 카르보플라틴 (10 μM), 또는 LB100/카르보플라틴의 조합물로 처리하였다. 세포에서 ATP 수준은 애질런트 시호스 XF 실시간 ATP 비율 검정을 이용하여 측정하였다. LB-100, 카르보플라틴 및 조합물은 mitoATP를 유의하게 감소시켰다. (G) H69 세포의 에너지 맵. (H 내지 J) 기저 및 올리고마이신 및 안티마이신/로테논 주사의 당분해로부터 LB100 처리 후 H69 세포성 양성자 유출률. (n=2, 6회의 기술적 반복).
도 7은 LB100 및 아테졸리주맙의 존재 하에 H446 스페로이드에서 T 세포 침윤의 결과를 도시한다. (A) H446 스페로이드 분해에 대한 활성화된 T 세포의 효과의 개략도. 시점 0에서, 96 웰 플레이트에서 단일 스페로이드를 LB-100, 아테졸리주맙 및 T 세포로 처리하였다. 비드는 2가지 작용 신호 CD3 및 CD28에 의한 생체내 T 세포 활성화를 모방한다. 인큐사이트® 라이브 세포 분석 시스템은 스페로이드 영상화를 위해 사용되었다. 우측 패널은 LB-100, 아테졸리주맙 및 활성화된 T 세포와 함께 48시간 인큐베이션 후 스페로이드 변성을 나타낸다. (B, C) 자동화된 영상 분석은 계측치 (0h -μm, 48h -mm) 및 스페로이드 영역 (황색- 명시야 마스크)을 제공한다. 칼럼 막대는 0시간째에 스페로이드의 평균 값을 나타낸다. 명시야 마스크에서 대표적인 영상. (D, E) T 세포의 존재 하에 48시간 LB-100 및 아테졸리주맙 처리 후 H446 스페로이드 세포 분포의 측정. 영상은 H446 세포로 덮힌 영역을 나타낸다. (F) 대조군 및 처리 그룹에서 동일한 H446 스페로이드의 순차적인 영상. 축척 막대 400 μm. (G) 48시간 처리 후 H446 스페로이드의 CD3 항체에 의한 H&E 및 면역조직화학 염색 (IHC). 축척 막대 50 μm. 처리 전에, 5x10³ 세포를 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 시딩하고, 3일 동안 성장시켰다.
도 8은 H69 세포 마우스 이종이식편에 대한 LB-100 단독 및 카르보플라틴과의 조합의 활성의 결과를 도시한다. 종양 크기 (A) 및 체중 (B)을 측정하였다. LB-100 (*p < 0.05), 카르보플라틴 (***p < 0.001) 및 이들의 조합물 (***p < 0.001)을 i.p. 주사를 통해 전달한 후 종양 성장의 억제. P 값은 비히클 그룹과 비교하여 유의한 차이를 제시한다. C. 비히클 및 약물-처리된 그룹으로부터의 종양 영상. D. 종양 질량은 실험 종료 시에 측정하였다. 비히클 그룹과 비교하여, LB-100 또는 카르보플라틴 단독, 또는 LB-100과 카르보플라틴의 조합물은 종양 질량을 유의하게 감소시켰다. E. 칼럼은 카르보플라틴 및 LB-100/카르보플라틴으로 처리한 마우스 종양에서 총 백금 (Pt) 농도를 제시한다 (기술적 반복으로서 n=3). Pt 질량은 종양 총 질량에 대해 정규화되었다. 통계적 분석은 터키(Tukey) 사후 검정과 함께 ANOVA를 이용하여 수행하였다 (*p < 0.05), 카르보플라틴 (**p < 0.01).
도 9는 H&E 염색을 통한 특정 마우스 종양의 평가를 도시한다. 마우스 종양의 H&E 염색 (A)은 조밀한 핵 염색 및 높은 수의 유사분열 세포를 제시하였다. LB100 또는 카르보플라틴에 의한 처리는 종양 조직에서 괴사 면적을 증가시켰고, 조합된 처리는 더 적은 종양 세포를 함유하였다. PP2A A, pMET, CD31 (혈관신생의 경우) 및 Ki-67 (세포 증식의 경우) 항체에 의한 IHC 염색은 조합된 처리에 의해 종양 섹션에서 염색 강도의 감소를 나타내었다. 종양 섹션의 대표적인 영상은 각각의 그룹에 대해 제시되어 있다. 축척 막대 100 μm.
도 10은 I상 임상 실험 연구 다이어그램을 도시한다.

본원에서 하기에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본 발명은 소세포 폐 암종 (SCLC)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의 하기 구조의 PP2A 억제제 (본원에서 "LB-100"로도 지칭됨) (즉, (3-[(4-메틸피페라진-1-일)카르보닐]-7-옥사비시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복실산]):

또는 그의 제약상 허용가능한 염, 쯔비터 이온, 또는 에스테르를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. LB-100의 제조 방법은 적어도 US 7,998,957 B2 및 US 8,426,444 B2에서 확인할 수 있다.

단백질 포스파타제 2A (PP2A)는 폐암 및 다른 암 유형에서 종양 단백질, 예컨대 c-MYC 및 BCR-ABL의 주요 조절에 관여하는 마스터 종양 억제자인 편재하는 세린/트레오닌 포스파타제이다. 이는 광범위한 세포 조절 기능, 예컨대 세포 생존, 아폽토시스, 유사분열, 및 DNA-손상 반응을 갖는다 (13). 이전의 연구 및 더 최근의 I상 임상 실험은 PP2A 억제가 잠재적으로 종양을 방사선 및 화학요법에 대해 민감화시킬 수 있음을 제시하였다 (14). 진행된 고형 종양에서 LB-100의 I상 임상 실험에서, LB-100은 내약성이 양호하였고, 20명 환자 중 10명이 안정한 질환을 달성하였다 (15). PP2A의 편재성을 고려할 때, LB-100의 억제는 다중 하류 효과를 가질 가능성이 있다. 전임상 연구는 LB-100에 의한 PP2A 억제가 DNA-손상 반응의 하향조절 (16-18) 세포 주기 체크포인트의 폐기 (16, 19), HIF 의존성 종양 혈관신생의 증가 (20), 및 N-CoR 복합체 형성의 억제에 의한 세포 분화의 유도 (16)를 일으킬 수 있음을 나타낸다.

더욱이, [Xiao et al. 2018]은 PP2A가 글루코스 탄소 활용을 당분해에서 펜토스 포스페이트 경로 (PPP)로 재지정하여 산화 스트레스로부터 구제함을 제시하였고, PP2A 및 G6PD의 소분자 억제에 의해 효율적으로 표적화될 수 있는 광범위한 B 세포 악성종양에서 PPP의 게이트키퍼 기능을 밝혀내었다 (21).

상기 기재된 바와 같이, LB-100 (3-(4메틸피페라진-카르보닐)-7-옥살로비시클로[2.2.1]헵탄-2-카르복실산; NSC D753810)은 단백질 포스파타제 2A (PP2A)의 소분자 (MW 268) 억제제이며, 단백질 포스파타제 1 (PP1)에 비해 PP2A를 약 80배 더 효율적으로 억제한다. 화합물은 시험관내 및 생체내에서 단일 작용제 활성을 갖는다. 비제한적인 이론에 따라, 강화 메카니즘은 비-특이적 DNA 손상제에 의해 유도된 세포 주기 및 유사분열 체크포인트를 억제하여, 휴면기 암 세포가 S 단계로 들어가서, 급성 DNA 손상에도 불구하고 계속 유사분열할 수 있게 하는 것으로 보인다 (22). 또한 비제한적인 이론에 따라, LB-100은 고용량에서 일시적인 가역적인 혈관 "누수"를 유도하는 혈관구조에 영향을 미치는 것으로 보인다. 그의 고유한 작용 메카니즘으로 인해, LB-100은 여러 암 유형의 치료에 유용할 뿐만 아니라, 새로운 유형의 신호 전달 조절제의 혁신 신약이 될 잠재성을 갖는다.

소세포 폐 암종

폐암은 전 세계적으로 암 사망의 주요 원인이며, 매년 백만 건의 새로운 사례가 발생한다. 소세포 폐암 (SCLC)은 흡연과 강하게 연관된 공격적인 형태의 암이다. 미국에서 2010년도에, 222,000 건의 새로운 폐암 사례가 진단되었고, 그 중 35,000 건이 SCLC였다 (미국 암 학회(American Cancer Society)). SCLC 환자의 중간 연령은 63세이고, 25% 초과는 70세가 넘는다 (1). 소세포 폐암은 비소세포 폐암 (NSCLC)과 비교하여 높은 전이 속도로 급속하게 성장하는 종양이다. 환자는 제한된 병기 질환 (LD-SCLC) 또는 광범위 병기 질환 (ED-SCLC)으로 구성되는 베테랑 투여 폐암 연구 그룹(Veterans Administration Lung Cancer Study Group)에 의해 개발된 2-병기 시스템에 따라 병기결정된다 (2). 제한된 병기 질환 SCLC는 허용가능한 방사선 범위 내의 단일 편측흉곽 영역에 국한된다. SCLC를 가진 환자의 대략 65% 내지 70%는 ED-SCLC를 나타내며, 이는 편측흉곽 영역을 넘어서 발견된다. ED-SCLC를 가진 비치료된 환자는 대략 5주의 중간 생존을 갖고; 화학요법으로 치료된 환자는 7 내지 11개월의 중간 생존을 갖는다 (3). ED-SCLC는 현재 관리 옵션에 의해 10% 미만의 2년 생존율을 갖는다.

조합 화학요법은 ED-SCLC를 가진 환자의 치료에 중점을 둔다. 2가지 이상의 약물의 생체내 상호작용이 종종 복잡하기 때문에, 의학 분야의 기술자는 이러한 요법과 연관된 문제를 이해할 것이다. 임의의 단일 약물의 효과는 그의 흡수, 분포, 대사 및 제거와 관련이 있다. 2가지 약물이 체내에 도입될 때, 각각의 약물은 다른 것의 흡수, 분포, 대사 및 제거에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 다른 것의 효과를 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 한 약물은 다른 1가지 이상의 약물을 제거하는 대사 경로에 관여하는 효소의 생성을 억제하거나, 활성화시키거나 또는 유도할 수 있다 (Guidance for Industry, 1999). 따라서, 2가지 이상의 약물이 동일한 상태를 치료하기 위해 투여될 때, 이러한 약물이 인간 대상체에서 다른 것의 치료 활성을 보완할지, 효과가 없을지 또는 방해할지 여부는 예측할 수 없다.

2가지 이상의 약물의 상호작용이 각각의 약물의 의도된 치료 활성에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 상호작용이 독성 대사물의 수준을 증가시킬 수 있다 (Guidance for Industry, 1999). 상호작용은 또한 각각의 약물의 부작용을 높이거나 또는 줄일 수 있다. 따라서, 질환의 치료를 위해 2가지 이상의 약물의 투여 시, 각각의 약물의 부정적인 부작용 프로파일에서 어떠한 변화가 발생할지 예측할 수 없다.

추가로, 2가지 이상의 약물 사이의 상호작용 효과가 언제 나타나기 시작할지 정확하게 예측하기가 어렵다. 예를 들어, 약물 사이의 대사 상호작용은 두번째 또는 추가의 약물의 초기 투여 시, 두 약물이 정상-상태 농도에 도달한 후, 또는 약물 중 하나의 중단 시 명백해질 수 있다 (Guidance for Industry, 1999).

SCLC의 맥락에서, 1970년대에 및 1980년대 초에, CAV (시클로포스파미드, 독소루비신, 및 빈크리스틴)는 가장 일반적으로 사용되는 조합 레지멘이었다. 1980년대 중반에, SCLC에서 활성 작용제로서 에토포시드가 발견되었고, 전임상 조사는 에토포시드와 시스플라틴 사이의 상승작용을 입증하였다. 무작위화 임상적 연구를 통해 이 조합이 독성이 적으면서 CAV만큼 효과적이었음이 확인되었다 (3).

몇몇 다른 작용제가 SCLC에서 활성을 갖는 것으로 제시되었고, 여러 연구에서 3-약물 레지멘을 표준 2-약물 레지멘과 비교하였고, 효능의 개선이 없었다. 노르웨이 폐암 연구 그룹(Norwegian Lung Cancer Study Group)에 의해 수행된 3상 실험은 LD-SCLC를 가진 214명 환자 및 ED-SCLC를 가진 222명 환자를 비롯하여 436명 환자를 무작위화하였다. 환자는 에토포시드 플러스 시스플라틴을 제공받거나 또는 시클로포스파미드, 에피루비신 및 빈크리스틴의 조합물 (CEV)을 제공받았다. ED-SCLC를 가진 환자에 대한 중간 생존은 에토포시드 플러스 시스플라틴 아암에서 8.4개월이었고 CEV 아암에서 6.5개월이었다 (p=0.21) (4).

2005년도에, 암 및 백혈병 그룹 B (CALGB: Cancer and Leukemia Group B)에 의해 수행된 3상 연구는 ED-SCLC를 가진 환자에서 파클리탁셀 및 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF)가 있는 및 없는 조합물 에토포시드/시스플라틴을 비교하였다 (5). 총 565명 환자를 무작위화하였다. 중간 무진행 생존 시간은 카르보플라틴/에토포시드/파클리탁셀을 제공받은 환자의 경우 6개월인 것과 비교하여 카르보플라틴/에토포시드 아암의 경우 5.9개월이었고, 중간 전체 생존은 에토포시드/시스플라틴 아암의 경우 9.9개월 및 파클리탁셀 아암의 경우 10.6개월이었다. 독성 사망은 파클리탁셀을 제공받지 않은 환자의 2.4%에서 발생하였고, 환자의 6.5%는 파클리탁셀로 치료되었다. 따라서, 에토포시드 및 시스플라틴에 파클리탁셀의 추가는 생존을 개선시키지 않았고, ED-SCLC를 가진 환자에서 허용 불가능한 독성과 연관이 있었다 (5).

ED-SCLC를 가진 환자에 대해 수행된 가장 큰 연구 중 하나로부터의 결과 또한 2005년도에 보고되었다. 이 연구는 토포테칸 플러스 시스플라틴 또는 표준 에토포시드 플러스 시스플라틴을 제공하도록 무작위화된 784명 환자를 포함하였고; 효능은 전체 반응률 (63% 대 69%), 진행까지의 시간 중간값 (24.1주 대 25.1주), 중간 생존 (39.3주 대 40.3주), 및 1년 생존율 (두 아암 모두 31.4%)에서 유사하게 보였다 (6).

더 최근에, III상 IMpower133 무작위화 이중-맹검 연구는 프로그래밍된 사멸 신호전달의 체크포인트 억제제 (아테졸리주맙)의 추가가 ED-SCLC를 가진 환자에서 화학요법을 개선시킬 수 있는지 여부를 평가하였다 (7). 총 201명 환자를 백금/에토포시드/아테졸리주맙 아암으로 무작위 배정하였고, 202명을 위약 아암으로 배정하였다. 중간 무진행 생존 시간은 백금/에토포시드/아테졸리주맙의 경우 5.2개월인 것과 비교하여 백금/에토포시드 아암의 경우 4.3개월이었다. 중간 전체 생존은 백금/에토포시드/아테졸리주맙 아암에서 12.3개월 및 위약 그룹에서 10.3개월이었다. 에토포시드 및 백금 화학요법에 면역요법의 추가는 전체 생존 및 무진행 생존을 개선시켰고, ED-SCLC를 가진 환자에서 허용 불가능한 독성과 연관이 없었다 (7). IMpower133은 최일선 ED-SCLC에서 치유 표준에 비해 전체 생존의 임상적으로 유의미한 개선을 제시하는 20년 내의 첫번째 연구로 고려된다.

카르보플라틴은 다양한 인간 고형 종양 (난소, 두경부, 비소세포 폐, 및 소세포 폐)에서 연구되었고, 객관적인 반응률은 10% 내지 85%였다. 이는 또한 난소암, NSCLC, 및 SCLC의 치료를 위해 수많은 다른 세포독성제와 조합되어 성공적으로 사용된 적이 있다 (8-10). SCLC를 가진 환자에서 카르보플라틴에 의한 2 및 3상 연구의 1992년도 검토에서는 카르보플라틴이 비치료된 SCLC에서 활성 작용제인 것으로 결정되었다 (11).

에토포시드와 조합된 백금-기반 요법 (카르보플라틴 또는 시스플라틴)은 ED-SCLC를 가진 환자에 대한 현재의 치유 표준이다. 그러나, 카르보플라틴은 더 적은 위장, 신장, 청각 및 신경학적 독성 뿐만 아니라, 더 용이한 투여와 같은 이점을 제공하기 때문에, 이는 종종 시스플라틴에 비해 바람직하다 (12).

1차 치료로서 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙

카르보플라틴은 더 유리한 독성 프로파일을 갖는 시스플라틴의 유사체이다 (Ruckdeschel 1994). 이는 DNA와 상호작용하여, 가닥내 및 가닥간 연결 둘 다를 형성한다. 가장 일반적으로 관찰되는 부작용에는 혈소판 감소증, 호중구 감소증, 백혈구 감소증, 및 빈혈이 포함된다. 다른 백금-함유 화합물과 마찬가지로, 카르보플라틴은 약물 투여 수분 내에 발생할 수 있는 아나필락시스-유형 반응, 예컨대 안면 부종, 천명, 빈맥, 및 저혈압을 유도할 수 있다. 이들 반응은 아드레날린, 코르티코스테로이드, 또는 안티히스타민에 의해 제어될 수 있다 (추가의 정보에 대해서는 패키지 삽입물 참조).

에토포시드는 세포가 유사분열을 들어가는 것을 방지함으로써 또는 이들을 유사분열 전 단계에서 파괴함으로써 시험관내에서 세포 증식 억제 활성을 나타내는 포도필로톡신의 반합성 유도체이다. 에토포시드는 DNA의 합성을 방해하고, 세포 주기의 후기 S-G2 단계에서 인간 림프모구성 세포를 정지시키는 것으로 보인다. 가장 일반적으로 관찰되는 부작용에는 백혈구 감소증 및 혈소판 감소증이 포함된다 (추가의 정보에 대해서는 패키지 삽입물 참조).

에토포시드는 SCLC, NSCLC, 악성 림프종, 및 고환 악성종양의 치료에서 다른 항신생물제와 조합되는 것으로 표시된다. 승인된 징후는 구체적인 국가에 따라 다를 수 있다. 에토포시드는 또한 두경부, 뇌, 방광, 자궁경부, 및 난소를 비롯한 여러 다른 유형의 암에 대한 임상 연구에서 사용된다.

아테졸리주맙은 프로그래밍된 사멸 수용체 1 리간드 (PD-L1)를 표적화하고 PD-L1과 그의 수용체인 프로그래밍된 사멸 수용체 1 (PD-1) 및 B7-1 (CD80으로도 공지됨) (둘 다 T 세포 상에서 발현된 억제성 수용체로서 기능함) 사이의 상호작용을 억제하는 인간화 이뮤노글로불린 (Ig) G1 모노클로날 항체이다. 정맥내 아테졸리주맙은 백금 기반 레지멘에 실패하였거나 또는 적합하지 않은 진행된 요로상피 암종을 가진 성인 환자의 치료를 위해 미국 및 유럽에서 승인되었다.(25, 26) 추가로, 베바시주맙, 파클리탁셀, 및 카르보플라틴과 조합된 아테졸리주맙은 EGFR 또는 ALK 게놈 종양 이상이 없는 전이성 NSCLC를 가진 성인 환자의 1차 치료를 위해 및 이전의 화학요법 후 국소적으로 진행된 및 전이성 NSCLC의 단독요법으로서 미국에서 승인되었다.(27) 최근에, 아테졸리주맙은 또한 종양이 PD-L1을 발현하는 절제 불가능한 국소적으로 진행된 또는 전이성 삼중 음성 유방암을 가진 환자에 대해 nab-파클리탁셀과 조합되어 미국에서 가속 승인을 받았다.(28) 최종적으로, 아테졸리주맙은 광범위 병기 소세포 폐암을 가진 성인 환자에서 카르보플라틴 및 에토포시드와 조합되어 1차 치료로서 승인되었고, 개선된 생존을 나타내었다 (중간 OS는 백금/에토포시드/아테졸리주맙 아암에서 12.3개월이고, 백금/에토포시드/위약에서 10.3개월임). ED-SCLC에서 에토포시드 및 백금 화학요법에 면역요법의 추가는 또한 무진행 생존을 개선시켰고, 허용 불가능한 독성과 연관이 없었다. (7) 아테졸리주맙에 의한 치료는 일반적으로 내약성이 양호하지만, 면역-관련 유해 사건 (irAE)과 연관이 있을 수 있다 (추가의 정보에 대해서는 패키지 삽입물 참조).

본 발명의 방법

본원에서 상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 LB-100이 SCLC를 앓고 있는 대상체의 치료에 유용하다는 놀라운 발견을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 SCLC를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, LB-100을 단독으로 또는 1종 이상의 항암제와 조합하여 투여하는 것을 포함하며, 여기서 양은 함께 사용될 때 대상체를 치료하는데 효과적인 것인 방법을 제공한다. 이러한 일부 실시양태에서, SCLC는 ED-SCLC이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 SCLC를 앓고 있고 1종 이상의 항암제를 제공받고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 LB-100의 부재 하에 투여되는 1종 이상의 항암제에 비해 치료를 증강시키는데 효과적인 양의 LB-100를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 일부 실시양태에서, SCLC는 ED-SCLC이다.

일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 항암제는 카르보플라틴, 에토포시드, 및 아테졸리주맙으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 항암제는 각각 카르보플라틴, 에토포시드, 및 아테졸리주맙이다.

일부 실시양태에서, LB-100의 양 및 1종 이상의 항암제의 양은 대상체에게 각각 주기적으로 투여된다. 이러한 예시적인 투여 방법은 본원에서 추가로 기재된다.

일부 실시양태에서, 1종 이상의 항암제는 LB-100의 투여와 동시에, 이전에 또는 이후에 독립적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 항암제는 LB-100의 투여 이후에 독립적으로 투여된다.

일부 실시양태에서, LB-100의 양 및 1종 이상의 추가의 항암제의 양은 함께 사용될 때 본원에서 추가로 기재된 바와 같이 대상체에서 암의 임상적 증상을 감소시키는데 효과적이다.

일부 실시양태에서, LB-100의 양은 대상체에서 암의 임상적 증상을 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, LB-100은 약 0.25 mg/m2 내지 약 3.10 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, LB-100은 약 0.83 mg/m2 내지 3.10 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, LB-100은 약 0.83 mg/m2 내지 약 2.33 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, LB-100은 약 0.83 mg/m2 내지 약 1.75 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, LB-100은 0.25 mg/m2, 0.5 mg/m2, 0.83 mg/m2, 1.25 mg/m2, 1.75 mg/m2, 2.33 mg/m2, 또는 3.10 mg/m2의 용량으로 투여된다.

일부 실시양태에서, LB-100은 0.83 mg/m2의 용량으로 투여된다.

일부 실시양태에서, LB-100은 1.25 mg/m2의 용량으로 투여된다.

일부 실시양태에서, LB-100은 1.75 mg/m2의 용량으로 투여된다.

일부 실시양태에서, LB-100은 2.33 mg/m2의 용량으로 투여된다.

일부 실시양태에서, LB-100은 3.10 mg/m2의 용량으로 투여된다.

일부 실시양태에서, LB-100은 3주마다 1, 2 또는 3일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, LB-100은 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 정맥내로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 약 0.83 mg/m2의 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 약 1.25 mg/m2의 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 약 1.75 mg/m2의 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 약 2.33 mg/m2의 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 약 3.10 mg/m2의 용량으로 투여된다.

이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 적어도 2 사이클 동안 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 약 0.83 mg/m2의 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 적어도 3 사이클 동안 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 약 0.83 mg/m2의 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 적어도 4 사이클 동안 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 약 0.83 mg/m2의 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 적어도 5 사이클 동안 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 약 0.83 mg/m2의 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, LB-100은 환자의 수명 동안 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 약 0.83 mg/m2의 용량으로 투여된다.

본원에서 상기에 추가로 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 항암제는 카르보플라틴을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 카르보플라틴은 약 AUC 5에 상응하는 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, 카르보플라틴은 약 AUC 5를 달성하는 용량으로 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, 카르보플라틴은 최대 약 750 mg/일의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 카르보플라틴은 그를 필요로 하는 대상체에게 치유 표준에 따른 양으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 카르보플라틴은 21일 사이클의 1일차에 투여된다. 일부 실시양태에서, 카르보플라틴은 적어도 4 사이클 동안 21일 사이클의 1일차에 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, 카르보플라틴은 정맥내로 투여된다.

본원에서 상기에 추가로 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 항암제는 아테졸리주맙을 포함한다. 이러한 일부 실시양태에서, 아테졸리주맙은 약 1200 mg/일의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 아테졸리주맙은 그를 필요로 하는 대상체에게 치유 표준에 따른 양으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 아테졸리주맙은 21일 사이클의 1일차에 투여된다. 일부 실시양태에서, 아테졸리주맙은 적어도 4 사이클 동안 21일 사이클의 1일차에 투여된다. 이러한 일부 실시양태에서, 아테졸리주맙은 정맥내로 투여된다.

본원에서 상기에 추가로 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서 1종 이상의 항암제는 에토포시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에토포시드는 약 100 mg/m²/일의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 에토포시드는 그를 필요로 하는 대상체에게 치유 표준에 따른 양으로 투여된다.

일부 실시양태에서, 에토포시드는 21일 사이클의 1일차, 2일차 및 3일차에 투여된다. 일부 실시양태에서, 에토포시드는 적어도 4 사이클 동안 21일 사이클의 1일차, 2일차 및 3일차에 투여된다. 일부 실시양태에서, 에토포시드는 정맥내로 투여된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 상기 기재된 임의의 양 및 투여 레지멘으로 LB-100을 아테졸리주맙, 카르보플라틴, 및 에토포시드와 조합하여 투여하는 방법을 제공한다. 이러한 일부 실시양태에서, 1종 이상의 항암제는 아테졸리주맙, 카르보플라틴, 및 에토포시드 각각을 포함하고, 동일한 날에 순차적으로 조합하여 투여할 때 투여 순서는 LB-100의 투여, 이어서 아테졸리주맙의 투여, 이어서 카르보플라틴의 투여, 이어서 에토포시드의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여 순서는 항암제 중 1종 이상을 투여하지 않고 유지된다.

일부 실시양태에서, 대상체는 LB-100 및 1종 이상의 항암제를 포함하는 적어도 1, 2, 3 또는 4 사이클 동안 치료된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 후속적으로 유지 치료를 받는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 유지 치료는 본원에서 상기 기재된 임의의 방법에 따라 투여되는 LB-100 및 아테졸리주맙을 포함한다.

일부 실시양태에서, SCLC를 앓고 있는 대상체는 SCLC에 대한 이전의 전신 화학요법, 면역요법, 생물학적, 호르몬 또는 조사용 요법을 받은 적이 없다.

일부 실시양태에서, SCLC를 앓고 있는 대상체는 NSCLC 또는 혼합 NSCLC 및 SCLC로 진단된 적이 없다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하기 위해 LB-100 및 적어도 1종의 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것인 방법을 제공한다.

임의의 상기 방법 또는 용도의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

임의의 상기 방법 또는 용도의 일부 실시양태에서, LB-100 및/또는 1종 이상의 추가의 항암제는 대상체에게 경구 또는 비경구로 투여된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "질환의 치료" 또는 "치료하는"은 질환, 또는 질환과 연관된 증상 또는 상태의 예방, 억제, 퇴행 또는 정체를 유도하는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에서 질환 진행 또는 질환 합병증의 "억제"는 대상체에서 질환 진행 및/또는 질환 합병증을 예방하거나 또는 감소시키는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 작용제의 "투여"는 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 방법 또는 전달 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 투여는 예를 들어 경구, 비경구, 복강내, 정맥내, 동맥내, 경피, 설하, 근육내, 직장, 협측, 비내, 리포좀에 의해, 흡입을 통해, 질내, 안구내, 국소 전달을 통해, 피하, 지방내, 관절내, 척수강내, 뇌실내, 심실내, 종양내, 대뇌 실질로 또는 뇌실질내로 수행될 수 있다.

수많은 통상적으로 사용되는 제약학적 담체를 사용하는 하기 전달 시스템이 사용될 수 있지만, 본 발명에 따른 조성물을 투여하기 위해 구상되는 여러 가능한 시스템을 대표할 뿐이다.

주사가능한 약물 전달 시스템에는 용액, 현탁액, 겔, 미세구 및 중합체성 주사제가 포함되며, 부형제, 예컨대 용해도 변경제 (예를 들어, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 수크로스) 및 중합체 (예를 들어, 폴리카프릴락톤 및 PLGA)를 포함할 수 있다.

다른 주사가능한 약물 전달 시스템에는 용액, 현탁액, 겔이 포함된다. 경구 전달 시스템에는 정제 및 캡슐이 포함된다. 이들은 부형제, 예컨대 결합제 (예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 다른 셀룰로스 물질 및 전분), 희석제 (예를 들어, 락토스 및 다른 당, 전분, 인산이칼슘 및 셀룰로스 물질), 붕해제 (예를 들어, 전분 중합체 및 셀룰로스 물질) 및 윤활제 (예를 들어, 스테아레이트 및 활석)를 함유할 수 있다.

이식가능한 시스템에는 막대 및 디스크가 포함되며, 부형제, 예컨대 PLGA 및 폴리카프릴락톤을 함유할 수 있다.

경구 전달 시스템에는 정제 및 캡슐이 포함된다. 이들은 부형제, 예컨대 결합제 (예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 다른 셀룰로스 물질 및 전분), 희석제 (예를 들어, 락토스 및 다른 당, 전분, 인산이칼슘 및 셀룰로스 물질), 붕해제 (예를 들어, 전분 중합체 및 셀룰로스 물질) 및 윤활제 (예를 들어, 스테아레이트 및 활석)을 함유할 수 있다.

경점막 전달 시스템에는 패치, 정제, 좌제, 패서리, 겔 및 크림이 포함되고, 부형제, 예컨대 가용화제 및 증진제 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, 담즙산염 및 아미노산), 및 다른 비히클 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 지방산 에스테르 및 유도체, 및 친수성 중합체, 예컨대 히드록시프로필메틸셀룰로스 및 히알루론산)을 함유할 수 있다.

피부 전달 시스템에는 예를 들어 수성 및 비수성 겔, 크림, 다중 에멀젼, 미세에멀젼, 리포솜, 연고, 수성 및 비수성 용액, 로션, 에어로졸, 탄화수소 베이스 및 분말이 포함되고, 부형제, 예컨대 가용화제, 침투 증진제 (예를 들어, 지방산, 지방산 에스테르, 지방 알콜 및 아미노산), 및 친수성 중합체 (예를 들어, 폴리카르보필 및 폴리비닐피롤리돈)를 함유할 수 있다. 한 실시양태에서, 제약상 허용가능한 담체는 리포솜 또는 경피 증진제이다.

재구성가능한 전달 시스템을 위한 용액, 현탁액 및 분말은 비히클, 예컨대 현탁화제 (예를 들어, 검, 잔탄, 셀룰로스 및 당), 보습제 (예를 들어, 소르비톨), 가용화제 (예를 들어, 에탄올, 물, PEG 및 프로필렌 글리콜), 계면활성제 (예를 들어, 나트륨 라우릴 술페이트, 스팬, 트윈, 및 세틸 피리딘), 보존제 및 항산화제 (예를 들어, 파라벤, 비타민 E 및 C, 및 아스코르브산), 고결 방제지, 코팅제, 및 킬레이팅제 (예를 들어, EDTA)를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용가능한 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 상응하게 과도한 유해 부작용 (예컨대 독성, 자극, 및 알레르기 반응)이 없이 인간 및/또는 동물에서 사용하기에 적합한 담체 또는 부형제를 지칭한다. 이는 대상체에게 본원의 화합물을 전달하기 위한 제약상 허용가능한 용매, 현탁화제 또는 비히클일 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용된 화합물은 염 형태일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "염"은 화합물의 산 또는 염기 염을 만들어서 변형된 본원의 화합물의 염이다. 감염 또는 질환을 치료하기 위해 사용되는 화합물의 경우, 염은 제약상 허용가능하다. 제약상 허용가능한 염의 예에는 염기성 잔기, 예컨대 아민의 광물 또는 유기 산 염; 산성 잔기, 예컨대 페놀의 알칼리 또는 유기 염이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 염은 유기 또는 무기 산을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 산 염은 클로라이드, 브로마이드, 술페이트, 니트레이트, 포스페이트, 술포네이트, 포르메이트, 타르트레이트, 말레에이트, 말레이트, 시트레이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 아스코르베이트 등이다. 페놀레이트 염은 알칼리 토금속 염, 나트륨, 칼륨 또는 리튬이다. 이와 관련하여 용어 "제약상 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 비교적 무독성인 무기 및 유기 산 또는 염기 부가 염을 지칭한다. 이들 염은 본 발명의 화합물의 최종 단리 및 정제 동안에 동일계 내에서, 또는 유리 염기 또는 유리 산 형태의 본 발명의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기 산 또는 염기와 별도로 반응시키고, 이렇게 형성된 염을 단리함으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염에는 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 술페이트, 비술페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 및 라우릴술포네이트 염 등이 포함된다. (예를 들어, [Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조).

본 발명은 본 발명의 방법의 화합물의 에스테르 또는 제약상 허용가능한 에스테르를 포함한다. 용어 "에스테르"에는 R-CO-OR' 기를 함유하는 화합물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. "R-CO-O" 부분은 본 발명의 모 화합물로부터 유래될 수 있다. "R'" 부분에는 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 아릴, 및 카르복시 알킬 기가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 본 발명의 방법의 화합물의 제약상 허용가능한 전구약물 에스테르를 포함한다. 본 발명의 화합물의 제약상 허용가능한 전구약물 에스테르는 가용매 분해에 의해 또는 약리학적 조건 하에 모 화합물의 유리 카르복실산으로 전환될 수 있는 에스테르 유도체이다. 전구약물의 예는 생체내에서 절단되어 본원의 화합물을 생성하는 알킬 에스테르이다.

달리 명시된 경우를 제외하고, 본 발명의 방법에서 사용된 화합물의 구조가 비대칭 탄소 원자를 포함하는 경우, 화합물이 라세미체, 라세미체 혼합물, 및 단리된 단일 거울상이성질체로서 발생하는 것으로 이해된다. 이들 화합물의 이러한 모든 이성질체 형태는 명시적으로 본 발명에 포함된다. 달리 명시된 경우를 제외하고, 각각의 입체발생 탄소는 R 또는 S 배열일 수 있다. 따라서, 달리 나타내지 않는다면, 이러한 비대칭으로부터 발생하는 이성질체 (예를 들어, 모든 거울상이성질체 및 부분입체이성질체)는 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 이성질체는 전형적인 분리 기술에 의해 및 입체화학적으로 제어된 합성에 의해, 예컨대 ["Enantiomers, Racemates and Resolutions" by J. Jacques, A. Collet and S. Wilen, Pub. John Wiley & Sons, NY, 1981]에 기재된 것에 의해 실질적으로 순수한 형태로 수득될 수 있다. 예를 들어, 분할은 키랄 칼럼 상에서 제조용 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.

화합물, 또는 그의 염, 쯔비터 이온 또는 에스테르는 임의적으로 적절한 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약상 허용가능한 조성물로 제공된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 밀리그램으로 측정된 작용제의 "양" 또는 "용량"은 약물 제품의 형태와 무관하게 약물 제품에 존재하는 작용제의 밀리그램을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 본 발명의 방식으로 사용될 때 합리적인 이익/위험 비에 상응하게 과도한 유해 부작용 (예컨대 독성, 자극, 또는 알레르기 반응)이 없이 원하는 치료 반응을 수득하는데 충분한 성분의 양을 지칭한다. 구체적인 유효량은 치료되는 특정한 상태, 환자의 신체 상태, 치료되는 포유동물의 유형, 치료의 지속기간, 병용 요법 (있는 경우)의 성질, 및 화합물 또는 그의 유도체의 사용되는 구체적인 제형 및 구조와 같은 인자에 따라 다를 것이다.

명세서에 범위가 주어지는 경우, 범위가 해당 범위 내의 모든 정수 및 그의 하위 범위를 포함하는 것으로 이해한다. 예를 들어, 77 내지 90%의 범위는 77, 78, 79, 80, 및 81% 등을 개시한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내의 의미를 갖는다. 일부 실시양태에서, 용어 "약"은 주어진 값의 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이내를 지칭한다.

파라미터 범위가 제공되는 경우, 해당 범위 내의 모든 정수 및 그의 1/10 또한 본 발명에 의해 제공되는 것으로 이해된다. 예를 들어, "0.2-5 mg/kg/일"은 0.2 mg/kg/일, 0.3 mg/kg/일, 0.4 mg/kg/일, 0.5 mg/kg/일, 0.6 mg/kg/일 등에서부터 최대 5.0 mg/kg/일을 개시한다.

상기 실시양태의 경우, 본원에 개시된 각각의 실시양태는 다른 개시된 각각의 실시양태에 적용되는 것으로 고려된다. 따라서, 본원에 기재된 다양한 요소의 모든 조합은 본 발명의 범주 내에 있다.

본 발명의 각각의 측면의 모든 특징은 필요한 부분만 약간 수정하여 다른 모든 측면에 적용된다.

본원에 기재된 발명을 보다 완전하게 이해할 수 있도록, 하기 실시예가 제공된다. 이들 실시예가 단지 예시의 목적을 위한 것이고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 됨을 이해해야 한다.

실시예

실시예 1. 소세포 폐암에서 치료 표적으로서 단백질 포스파타제 2A

본 연구에서, SCLC에서 PP2A를 LB100, 및 LB100/카르보플라틴으로 약리학적으로 억제하는 효과는 시험관내 및 생체내 모델을 이용하여 조사되었다. 추가로, SCLC 세포를 이용하여 생성된 3D 스페로이드의 형태학 및 온전성에 대해 면역요법과 조합된 LB100의 효과 또한 시험하였다. 종합하면, 결과는 화학요법 약물의 항-종양 효과가 SCLC에서 PP2A를 LB100 자체로 또는 화학요법 및 면역요법과 조합하여 차단함으로써 개선될 수 있음을 입증한다.

결과:

PP2A는 SCLC 종양 조직 및 세포주에서 상햐조절되고, PP2A의 녹다운은 이들 세포의 증식을 유의하게 약화시킨다.

PP2A 및 그의 서브유닛 A (PP2A-A) 및 C (PP2A-C)가 몇몇 SCLC 세포주에서 과발현된다는 것이 이전에 보고되었다 (5). 이는 GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27093186) 데이터세트 (GSE60052)의 생물정보학 분석에 의해 추가로 확인되었고, PP2A-A는 정상 폐와 비교하여 SCLC에서 유의하게 과발현되었다 (p=0.0144) (도 1A).

SCLC에서 PP2A의 발현 수준을 평가하기 위해, 본 발명자들은 PP2A-A에 특이적인 항체를 사용하여 면역조직화학 (IHC)에 적용된 조직 마이크로어레이 (TMA) 내에 함유된 인접한 정상 (n=24) 및 일차 SCLC 종양 (n=79) 코어를 비교하였다 (도 1B). TMA에 함유된 각각의 종양 및 정상 코어는 조직의 정체에 대해 맹검인 병리학자에 의해 독립적으로 평점되었다 (20, 21). PP2A-A 단백질은 대부분의 정상 코어에서 검출되지 않았지만 (0=79.17%, 1=16.67%, 2=4.16%), 종양 조직에서는 유의하게 상향조절되었다 (0=8.86%, 1=41.77, 2=40.5, 3=8.87) (도 1C). 종양 조직에서 PP2A에 대한 평균 병리학 점수 (1.45±0.088)는 정상 조직 (0.333±0.13)에 비해 유의하게 더 높았다 (p=0.001). 공개적으로 이용가능한 데이터 세트 및 TMA 결과 둘 다 PP2A-A 발현이 SCLC 종양 조직에서 유의하게 상향조절되었음을 제시하였다 (도 1A 내지 C). 종양 조직에서 과발현이 확인된 후, 다음으로 본 발명자들은 이전에 기재된 바와 같이 이뮤노블롯팅에 의해 다양한 SCLC 세포주에서 그들의 발현을 결정하였다 (22). 두 서브유닛 모두 대조군 HBEC 3KT 세포에 비해 H82, H526, H524, H446, H146, H345 및 H69를 비롯한 SCLC 세포주에서 상향조절되었다 (도 1D).

칸타리딘은 PP2A를 억제하는 것으로 공지된 LB100의 모 화합물이다. 따라서, 본 발명자들은 PP2A 억제가 SCLC 세포에서 관찰된 효과를 생성함을 입증하기 위해 양성 대조군으로서 칸타리딘을 사용하였다. 실제로, 칸타리딘 처리는 PP2A 활성을 거의 90% 감소시킨 반면에, LB100은 포스파타제 활성을 65%로 유의하게 억제하였다 (도 1E). 최종적으로, 본 발명자들은 H524 SCLC 세포에서 특이적 siRNA를 사용하여 PP2A 서브유닛 Aα를 녹다운시켰다. 스크램블 버전 (scRNA)은 대조군으로 사용되었다. 예상된 바와 같이, PP2A 녹다운은 PP2A 서브유닛 Aα 수준을 유의하게 감소시켰고, 이들 세포에서 세포 증식을 약화시켰다 (도 1F/삽도, 1F).

화학요법과 LB100의 조합은 상승작용을 일으켰다.

LB100, 카르보플라틴 및 에토포시드의 세포독성 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 6가지 SCLC 세포주를 다양한 농도의 각각의 약물로 72시간 동안 처리하였다. 시스플라틴에 민감성인 4가지 세포주 H82, H526, H524 및 H446에서, LB100은 세포 사멸이 비교적 더 높은 용량의 LB100 (IC50 ~20μM)에서 관찰되는 시스플라틴에 대해 내성인 2가지 다른 세포주 H146 및 H69와 비교하여 < 8 μM의 IC50 (표 A)으로 세포 사멸을 더 효과적으로 유도하였다.

표 A

SCLC 세포주의 세포독성 IC50 값

다음으로, 본 발명자들은 LB100 및 화학요법 약물 작용제, 카르보플라틴 및 에토포시드의 조합물로 SCLC 세포주를 처리하는 효과를 결정하였다. 약물 단독은 LB100에 민감성인 H524 SCLC 세포를 사멸시키는데 효과적이었다 (도 1G). 그러나, LB100이 카르보플라틴 또는 에토포시드와 조합되어 사용될 때 각각 0.534 및 0.532의 조합 지수 (CI) 값으로 세포 사멸이 유의하게 더 높았다 (도 1G). 유사한 상승작용이 H69 SCLC 세포의 경우에 나타났다. LB100/카르보플라틴 및 LB100/에토포시드는 각각 0.311 및 CI=0.646의 CI 값으로 LB100-내성 H69 세포를 사멸시켰다 (도 1H).

LB100 단독 및 카르보플라틴 및 에토포시드와 조합의 H524 및 H69 세포에 대한 세포독성 효과를 결정하기 위해, 본 발명자들은 또한 콜로니 형성 검정을 수행하였다. 단일 약물 (LB100, 카르보플라틴 또는 에토포시드) 또는 조합물 (LB100/카르보플라틴 및 LB100/에토포시드)로의 처리는 두 세포주에서 콜로니 형성을 유의하게 감소시켰다 (p < 0.0001; p <0.01) (도 1I 및 J). H524 세포에 의한 콜로니 형성이 LB100 단일 처리와 비교하여 두 약물 조합물 그룹 (LB100/카르보플라틴 및 LB100/에토포시드) 모두에서 극적으로 감소되었다. 그러나, H69 세포의 경우에, LB100 및 LB100/카르보플라틴 처리된 세포 사이에서만 유의한 차이가 관찰되었다 (도 1J). 따라서, 본 발명자들은 종양 미세환경을 보다 밀접하게 닮은 3D 세포 배양 모델을 이용하여 LB100의 효과를 조사하였다.

H446 스페로이드 성장에 대한 LB100의 효과를 시험하였다.

본 발명자들은 SCLC 세포에 의해 형성된 스페로이드에 대한 LB100 및 화학요법 약물의 효과를 추가로 조사하였다. 3가지 세포주 H524, H69 및 H446을 시험하였다. H524 및 H69 세포는 저부착 96 웰 플레이트에서 크고 부드러운 덩어리를 형성하였다. 세포외 매트릭스 성분 또는 마트리겔의 첨가없이 밤새 조밀한 스페로이드를 형성한 H446 세포를 영상화 및 조직학적 분석을 위해 사용하였다. 9일만에 형성된 300-500 μm의 스페로이드 (도 2A) 및 시험관내에서 형성된 스페로이드의 크기는 전이성 부위에서 형성된 종양과 비슷하였고, 여기서 세포는 저산소, 염증, pH 수준 변화, 및 종종 영양 결핍의 상태를 경험한다 (23). H446 스페로이드에 대한 LB100의 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 인큐사이트 라이브 세포 분석 시스템을 이용하여 기능적 변화를 실시간으로 기록하였다. 20 μM LB100로 처리되거나 또는 비처리된 H446 스페로이드는 72시간에 걸쳐 명시야 (BF)에서 녹색 형광을 사용하여 영상화하였다. 스페로이드의 크기는 시야에서 가장 큰 BF를 마스킹하는 자동화된 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 측정하였다 (스페로이드에 대한 무표지 실시간 라이브 세포 검정: 인큐사이트 명시야 분석). BF 분석은 LB100 처리 후 세포독성 염료 형광에서 스페로이드 수축 및 증가를 나타내었다 (도 2B 및 C). H&E 염색은 LB100, 카르보플라틴 단독, 및 조합물로 처리된 스페로이드에 대해 수행되었다. 처리 전에, 스페로이드는 조밀하고 둥근 형상을 가졌고 (도 2D - 대조군), 윤곽이 매우 명확하였다. 그러나, LB100, 카르보플라틴, 에토포시드, 또는 화학요법 약물과 LB100의 조합물로 72시간 처리는 스페로이드의 형태학을 유의하게 변화시켰다. 스페로이드는 LB100 처리에 의해 크기가 감소하였고 그들의 둥근 형상을 상실하였다. 카르보플라틴 및 에토포시드 처리는 스페로이드로부터 세포를 해리시켜, 그들 주위에 세포의 확산된 구름을 형성하였다. 카르보플라틴 또는 에토포시드와 LB100의 약물 조합물은 스페로이드 성장을 폐기시켰고, 스페로이드의 수를 현저히 감소시켰다 (도 2D). H446 스페로이드 성장에 대한 인큐사이트 BF 분석은 카르보플라틴과 조합된 LB100이 대조군 또는 LB100 단독 처리와 비교하여 단일 스페로이드 크기를 감소시켰음이 입증되었다 (도 2E 및 G). LB100 및 에토포시드에 의해 유사한 결과가 수득되었다 (도 2F 및 H). 이들 결과를 통해, 2D 배양물에서 본 발명자들의 관찰과 유사하게, 3D 스페로이드 모델에서 LB100 단독 및 카르보플라틴 또는 에토포시드와 조합의 효능을 확인하였다.

약물 조합물은 SCLC 세포 침윤을 억제하고, 카르보플라틴 흡수를 증가시키고, PP2A, DNA 손상 및 아폽토시스 조절성 단백질에 영향을 미쳤다.

세포 침윤에 대한 LB100의 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 SCLC 세포가 내피 세포 (EC)의 층을 통해 침범하는 능력을 시험하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 이전에 기재된 바와 같이 전기 기질-임피던스 감지 시스템 (어플라이드 바이오피직스, 미국 뉴욕주 트로이)을 사용하여 경내피 단층 저항을 측정하였다 (24). SCLC 세포가 부착하고 단층에 침범하기 시작함에 따라, 이 시스템은 내피 단층 저항을 연속적으로 측정한다. 저항의 감소는 종양 세포의 경내피 혈관외 유출을 통해 파괴된 내피 단층 장벽을 나타낸다. 비처리된 대조군 세포는 HUVEC 단층을 통해 고도로 침범하였다. 단일 약물 처리 (LB100 또는 카르보플라틴) 후, H524 세포는 이동 능력에서 변화를 나타내지 않았고 (% 변화 대조군 = 18.2+2; LB100 =16.9+2; 카르보플라틴 =18.2+0.4), H69 세포의 경우 상응하는 값은 대조군 =19.6+1.7; LB100 =12.3+0.92; 카르보플라틴 =14.9+1.24이었다 (도 3A 및 B). 그러나, 약물 조합물 처리는 비처리된 대조군 세포와 비교하여 HUVEC 단층을 통한 세포 이동 능력을 유의하게 감소시켰다 (p<0.001). 삽도는 20시간의 LB100 플러스 카르보플라틴 처리 후 H524 (10.6+1.2%) 및 H69 (6.6+1.2%)에 대한 HUVEC 장벽 파괴의 더 낮은 % 변화를 나타낸다 (p < 0.001). 이는 PP2A와 화학요법의 조합 억제가 잠재적으로 혈관을 통한 세포 이동성을 방해하고 침범을 예방할 수 있음을 시사한다.

LB100 및 카르보플라틴 또는 에토포시드의 조합물이 상승작용 효과를 나타내기 때문에, 본 발명자들은 약물들이 상승적으로 작용하는 메카니즘을 식별하기를 원하였다. 이를 위해, 백금 (Pt) 수준은 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICP-MS)을 이용하여 H524 및 H69 세포에서 측정되었다. 세포를 24시간 동안 LB100로 전처리한 후, 후속적으로 1 또는 4시간 동안 5 μM (H524 세포) 및 20 μM (H69 세포)의 카르보플라틴으로 처리하였다. 세포를 1시간 동안 카르보플라틴으로 처리는 대조군에 비해 두 세포주 모두에서 Pt 수준을 약간만 상승시켰다 (도 3C 및 D). 약물 조합물로 4시간 처리는 카르보플라틴 단독의 단일 처리와 비교하여 두 세포주 모두에서 Pt 수준을 유의하게 증가시켰고, 이는 LB100이 SCLC 세포에서 Pt의 흡수를 증강시켰고, 따라서 카르보플라틴의 프로-아폽토시스 효과를 촉진시켰음을 시사한다.

본 발명자들은 LB100 단독 및 카르보플라틴과 조합의 PP2A의 발현에 대한 효과를 실험하였다. 약물 처리는 H524 세포에서 PP2A 서브유닛 A의 발현을 크게 감소시켰다 (도 3E, 좌측 상부 패널). 그러나, H69 세포의 경우에는, 서브유닛 A 발현이 대조군 및 처리된 세포에서 동일하였다 (도 3E, 우측 상부 패널). 서브유닛 C의 발현은 또한 대조군 및 처리된 H524 및 H69 세포에서 변화되지 않았다 (도 3E, 중간 패널). 더욱이, LB100, 카르보플라틴 및 조합물 요법은 H524 및 H69 세포에서 아폽토시스의 DNA 손상 및 유도와 상관관계가 있는 마커인 히스톤 γ-H2AX의 인산화에 유의한 영향을 미쳤다 (도 3F). 추가로, 예비 형태의 절단에 의해 나타나는 바와 같이, 카스파제 3은 LB100 또는 카르보플라틴으로 단일 처리 뿐만 아니라, 조합물로 처리 후 H524 및 H69 세포에서 활성화되었다 (도 3F). 더욱이, PP2A의 조절장애는 PARP 활성을 유도하여, 세포 사멸을 초래하였다. 이와 함께, 이들 데이터는 백금 약물과 조합된 LB100에 의한 PP2A의 억제가 SCLC 세포에서 아폽토시스 신호전달을 유도하였음을 입증하였다.

H524 세포의 키노믹 프로파일에 대한 LB100의 효과를 탐구하였다.

LB100이 PP2A를 선택적으로 억제하기 때문에, 본 발명자들은 팸진 기술을 이용하여 세포성 세린/트레오닌 키나제 (STK)의 기능적 판독으로서 펩티드의 인산화를 검출하였다. 이 분석은 본 발명자들이 다양한 세포성 경로를 통한 단백질 인산화에 대한 LB100의 억제 효과를 조사할 수 있게 하였다. 5 및 10 μM 농도의 LB100이 특정 STK의 인산화를 유의하게 증가시킨 것으로 확인되었다 (n = 20). 놀랍게도, H524 세포를 5 μM 및 10 μM의 LB100로 처리하여 티로신 키나제 펩티드 인산화가 유의하게 감소되었다 (n = 52).

농축 분석을 위해 리액톰 소프트웨어를 이용하는 생물정보학 분석을 통해, 종양형성에 대한 LB100의 효과의 선험적 지식을 기반으로 하여 몇몇 경로가 특히 흥미로운 것으로 선택되었음이 밝혀졌다 (27-30). PP2A의 LB100-매개 억제는 신호 전달 및 대사 경로 둘 다에 강한 영향을 미쳤다 (도 4A). 신호 전달 경로의 더 면밀한 분석은 이전의 보고와 일치하게 (31, 32), LB100이 HGF-MET 신호전달에 영향을 미쳤다고 제시하였다. 또한, LB100은 또한 SCLC 세포에서 대사 신호전달을 표적화하였다.

H69 세포에서 대사 경로에 대한 LB100의 효과를 탐구하였다.

대사 신호전달에 대한 LB100의 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 BiOLOG (캘리포니아주 헤이워드) 표현형 마이크로어레이 기술을 이용하여 H69에 의한 탄소 공급원의 활용을 실험하였다. 이 검정을 이용하여, 본 발명자들은 94가지 탄소 공급원 및 산화환원 염료 테트라졸륨을 실험하여 기질 활용을 검출하였다. LB100은 대조군 (비처리됨) H69 세포와 비교하여 11가지 탄소 기질 (이는 5가지 그룹: 당 (L-소르보스, α-D-글루코스, D-만노스), 다당류 (글리코겐, D-글루쿠론산), 탄수화물 (덱스트린, 말토트리오스), 인산화된 화합물 (D,L-a-글리세롤 포스페이트) 및 아민 (아데노신, 이노신)으로 나뉘어질 수 있음)의 활용을 억제하였다 (도 4B). 이들 중에서, 동화작용성 생합성 반응에 중요한 3가지 기질, 즉, α-D-글루코스 (6배 초과) 및 글리코겐 (2.7배 초과)의 소모는 H69 세포에서 LB100 처리 후 유의하게 감소하였다 (도 4C). 추가로, LB100은 이들 세포에서 아데노신 및 이노신 기질 활용을 억제하였고, 이는 SCLC에서 퓨린성 신호전달에 대해 유의한 영향을 미칠 수 있다. 최종적으로, H69 세포에 의한 세포 배양 배지로부터 글루코스 흡수는 글루코스 옥시다제 검정을 이용하여 직접 측정하였고, 예상된 바와 같이 LB100로 처리 시 감소되는 것으로 나타났다. 세포가 있는 대조군 배지에서의 글루코스 수준은 세포가 없는 대조군 (100%)의 20% 미만이었다. LB100 처리는 세포가 없는 대조군과 비교하여 배지에서의 글루코스 소모를 65% 감소시켰다 (도 4D).

H524 및 H69 세포에서 MET 인산화에 대한 LB100의 효과를 탐구하였다.

팸진 키노믹 데이터는 잔기 1227 및 1239 사이에서 감소된 MET 펩티드 인산화를 제시하였다. 이 발견을 검증하기 위해, 본 발명자들은 H524 및 H69 세포 추출물로 웨스턴 블롯팅 실험을 수행하고, LB100 (각각 5 μM 및 20 μM)로 후속 처리하고, 인산화된 티로신 1234/1235를 특이적으로 검출하는 포스포-MET (pMET) 항체를 사용하여 HGF로 10분 동안 자극하였다. LB100으로 H524 세포의 전처리는 MET 기저 및 MET의 HGF 활성화된 인산화를 거의 폐기하였다 (도 4E, 좌측 패널). H69 세포에서, HGF 인산화 수준은 유의하게 감소하였고 (도 4E, 우측 패널), 이는 LB100에 의한 PP2A의 억제가 세포 생존력, 증식 및 이동성을 담당하는 HGF/MET 신호전달에 영향을 미침을 시사한다.

이전의 연구는 MET의 Ser985 인산화가 MET 키나제 활성을 부정적으로 조절한다는 것을 입증하였다 (33-35). 본 발명자들의 결과는 또한 LB100으로 또는 카르보플라틴과의 조합으로 H524 세포의 처리가 Ser985 인산화의 증가를 유도하였고, MET 티로신 인산화의 억제와 관련이 있었음을 제시하였다. 더욱이, LB100은 LB100/카르보플라틴 샘플에서 PP2A A의 발현을 감소시켰다 (도 4F). 이 발견은 LB100이 Tyr 1234/1235 MET 인산화를 감소시킨다는 팸진 키노믹 데이터와 상관관계가 있고, 이는 SCLC 세포에 대한 LB100의 주요 효과일 수 있다.

SCLC 세포의 미토콘드리아 및 당분해 기능에 대한 LB100의 효과를 탐구하였다.

다음으로, 본 발명자들은 시호스 XF 세포 에너지 표현형 시험을 이용하여 SCLC 세포에서 ATP 생성에 대한 LB100의 효과를 결정하였다. H524 및 H69 세포는 LB100의 IC50 용량의 절반 (각각 2.5 μM 및 10 μM)으로 전처리되었다. 약물 처리 후, 본 발명자들은 세포의 수를 카운팅하고, 판독으로서 트립판 블루 배제를 이용하여 생존력에 대해 그들을 실험하였다. 세포성 기저 산소 소모율 (OCR) 및 세포외 산성화율 (ECAR) 측정은 시호스 XF96 분석기에서 결정되었다. 이어서, H524 및 H69 세포를 1 μM의 올리고마이신 (산화성 인산화 (OxPhos의 억제제) 및 1 μM 카르보닐 시아니드 p-트리플루오로메톡시-페닐히드라존 (FCCP) (OxPhos의 탈커플링제)의 조합물로 스트레스를 가하였다. 올리고마이신이 미토콘드리아 ATP 생성을 억제하고, FCCP가 미토콘드리아에서 H+ 구배를 탈커플링함으로써 최대 산소 소모를 유도하기 때문에, 이들 두 스트레스 방법에 의해 실험한 실험 조건은 각각 SCLC 세포의 최대 당분해 능력 및 OxPhos 능력을 반영한다. 세포 대사 능력은 두 사건 모두를 포함하고, 에너지 수요의 급격한 증가에 대한 세포의 한계를 특징화한다. LB100은 H524 세포의 에너지 대사에 심각한 영향을 미쳤고; 그들의 기저 OCR은 비처리된 세포와 비교하여 4배 더 낮았다 (도 5A). LB100 처리는 또한 스트레스 받은 OCR 뿐만 아니라 기저 및 스트레스 받은 ECAR의 억제를 유도하였다 (도 5B 및 C). 이들 결과는 이들 세포에서 ATP 생성의 주요 공급원인 당분해 및 OxPhos 경로에 대한 LB100의 유의한 억제 효과를 입증하였다. 기저 OCR 및 ECAR에서 유의한 감소 또한 H69 세포에서 관찰되었다 (도 5D). 그러나, LB100으로 처리 시 이들 세포에서 스트레스 받은 OCR 및 ECAR의 유의한 감소는 없었다 (도 5E 및 F).

미토콘드리아 호흡 및 당분해로부터 ATP 생성에 대한 LB100 단독의 또는 카르보플라틴과 조합의 역할을 결정하기 위해, 본 발명자들은 애질런트 시호스 XF-96 실시간 ATP 비율 검정을 수행하였다. H524 세포에서, 총 ATP 생성률은 비처리된 세포과 비교하여 3가지 모든 그룹에서 73.7% (LB100), 36.3% (카르보플라틴) 및 63.7% (LB100/카르보플라틴)로 유의하게 감소하였다 (도 6A). 미토콘드리아 및 당분해 ATP 생성률은 또한 약물-처리된 세포에서 유의하게 더 낮았다. 중요하게는, LB100 및 LB100/카르보플라틴은 카르보플라틴 단독에 비해 미토콘드리아 ATP 및 당분해 ATP 생성을 억제하는데 더 효과적이었고, H524 세포의 에너지 표현형을 변화시켰다. 세포는 에너지 및 당분해가 덜하기 시작하는 경향이 있었다 (도 6B).

H524 세포의 당분해 대사에 대한 약물의 효과를 설명하기 위해, 본 발명자들은 양성자 유출률 (PER)을 분석하였다. PER은 총 산성화로부터 또는 (당분해 및 미토콘드리아 둘 다로부터) 세포외 매질로의 양성자 유출로부터 미토콘드리아 CO₂ 생성에 의해 생성된 산성화 (미토콘드리아-유래된 CO₂는 세포외 매질에서 부분적으로 수화되어, 당분해에 의해 기여되는 것보다 많은 추가의 세포외 산성화를 일으킬 수 있음)를 차감함으로써 계산된다. PER의 기저 값은 비처리된 세포와 비교하여 약물 처리 시 >50% 감소되었다 (도 6C). 올리고마이신, OxPhos 억제제, 및 안티마이신/로테논 (미토콘드리아 전자 수송의 억제제)의 제2 급성 주사의 존재 하에 PER의 측정은 LB100 처리 그룹에서 유의한 감소를 제시하였다. LB100 처리는 또한 당분해를 손상시켰고, 보상성 당분해 (안티마이신/로테논에 의한 OxPhos 억제 후 당분해를 증가시키는 세포의 능력)를 감소시켰다 (도 6D 및 E). 추가로, H69 세포에서 ATP 생성의 측정은 총 ATP 생성률이 LB100 그룹에서 54%, 카르보플라틴 그룹에서 12% 및 LB100/카르보플라틴 그룹에서 57% 감소하였다는 점에서 H524 세포와 동일한 경향을 제시하였다 (도 6F). 더욱이, LB100 및 LB100/카르보플라틴은 H69 세포에서 미토콘드리아 ATP 생성률을 유의하게 감소시켰고, H69 세포의 에너지 맵은 당분해 ATP 생성률이 비처리된 세포와 비교하여 약간 감소되었음을 제시하였다 (도 6G). LB100이 LB100-내성 세포에서 당분해 경로에 또한 영향을 미쳤음을 확인하기 위해, 본 발명자들은 이들 세포에서 PER을 측정하였다. PER의 기저 수준은 LB100 그룹에서 유의하게 억제되었다 (도 6H). 또한, LB100 처리는 미토콘드리아 전자 수송 억제제의 존재 하에 PER을 유의하게 억제하였다 (도 6I 및 J). LB100 단독 또는 카르보플라틴과의 조합은 H69 세포에서 손상된 당분해 대사 활성 및 제한된 산화성 능력을 유도하였다. 종합적으로, 이들 결과는 LB100 단독 또는 카르보플라틴과의 조합이 SCLC 세포의 대사 기능을 효과적으로 표적화하여, 세포 증식 및 이동을 감소시키고, 이들이 화학요법에 대해 만감하게 만들었음을 제시하였다.

LB100 및 아테졸리주맙은 CD8 ⁺ T 세포에서 3D에서 종양 세포의 인식을 증가시켰다.

체크포인트 억제제가 항암 면역 반응을 억제할 수 있고, PP2A 억제가 몇몇 암에서 항암 면역을 증강시키는 것으로 제시된 바 있기 때문에, 본 발명자들은 T 세포의 존재 하에 H446 스페로이드를 이용하여 3D 배양 시스템에서 LB100 및 아테졸리주맙의 조합물, 및 PD-L1을 표적화하는 인간화 IgG 항체를 평가하였다. 세포독성 CD8+ 세포는 방법에 기재된 프로토콜에 따라 건강한 공여자의 전혈, 버피 코트로부터 단리되었다. 도 7A는 처리 프로토콜을 제시하는 개략도를 함유한다. H446 스페로이드를 T 세포 및 활성화된 비드 및 LB100, 아테졸리주맙, 또는 LB100 및 아테졸리주맙의 조합물을 갖는 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 두고, 스페로이드는 저속-촬영 영상화를 이용하여 시각화하였다. 평균 스페로이드 직경은 300 내지 350μm이었고, 이들은 0시간째에 동일한 형태학을 가졌다 (도 7B 및 C). 스페로이드 생존을 48시간 동안 모니터링하였고, 그들의 직경을 위상차 영상으로부터 측정하였다. 세포 분포 직경은 대조군과 비교하여 아테졸리주맙/T 세포 및 LB100/아테졸리주맙/T 세포 그룹 후에 유의하게 증가하였다 (p < 0.001) (도 7D 및 E). LB100 단독은 스페로이드 변성에 대해 중간 정도의 영향을 미쳤다 (p < 0.01) (도 7D). LB100 또는 아테졸리주맙과 조합된 T 세포는 스페로이드 온전성에 영향을 미쳤다. 인큐사이트 저속-촬영 현미경으로부터의 명시야 영상은 0일차부터 스페로이드가 둥근 형상 및 잘 표현된 스페로이드 구조를 가졌음을 제시하였다 (도 7F). T 세포가 없는 LB100은 1일차 이후 스페로이드를 분해하기 시작했고, T 세포가 없는 아테졸리주맙은 스페로이드에 영향을 미치지 않았다. LB100, 아테졸리주맙, 및 두 약물 모두와 조합된 활성화된 T 세포는 죽은 세포의 배출을 유도하여, 스페로이드 코어에서 T 세포를 축적시켰고, 2일차에는 스페로이드 단편만이 영상에서 관찰되었다 (도 7F). CD3 항체를 사용하는 IHC는 3가지 그룹 LB100/T 세포, 아테졸리주맙/T 세포 및 LB100/아테졸리주맙/T 세포에서 종양 세포에서 T 세포 클러스터를 제시하였다. 조합 처리는 스페로이드의 피괴를 유도하고, 스페로이드에서 활성화된 T 세포의 침윤을 초래하여, 세포 해리, 스페로이드 형태학 상실, 및 세포의 세포독성 증가를 일으켰다. H&E 염색에서 T 세포 + 비드의 클러스터는 CD3 염색의 갈색 스폿과 일치하였다 (도 7G).

SCLC의 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 LB100의 효과를 탐구하였다.

시험관내 시스템에서 LB100, 카르보플라틴, 및 이들의 조합물의 효능을 입증한 후, 다음으로 본 발명자들은 SCLC의 이종이식편 마우스 모델을 이용하여 생체내에서 실험하였다. LB100, 또는 LB100 및 카르보플라틴의 조합물로의 처리는 종양 크기에서 통계적으로 유의한 감소를 일으켰다 (도 8A). 특히, 약물은 유의한 독성을 나타내지 않았고, 체중에 유의한 영향을 미치지 않았다 (도 8B). 그러나, LB100, 카르보플라틴, 및 이들의 조합물로의 처리는 비히클-처리된 그룹과 비교하여 종양 중량을 유의하게 감소시켰다 (도 8C). LB100/카르보플라틴은 비히클 그룹과 비교하여 일차 종양 성장을 89% 억제하였다. 결과는 약물 조합물이 종양 성장을 최대로 억제하였음을 입증하였다 (도 8D). 카르보플라틴 및 LB100/카르보플라틴으로 30일 처리 후 마우스 종양에서 Pt의 측정은 조합 처리 시 종양내 Pt 수준에서의 유의한 증가를 제시하였다 (도 8E). 종양의 IHC를 통해 pMET, pp2A A, CD31 및 Ki67 마커가 약물 조합물 그룹에서 낮게 염색되었음이 확인되었다 (도 9).

논의/결론:

본 연구는 LB100 단독 또는 화학요법 약물과의 조합이 SCLC에서 세포 증식 및 콜로니 형성을 억제하였음을 입증한다. 세포 증식에 대한 최대 억제 효과는 LB100 및 카르보플라틴의 조합물에 의해 관찰되었다. 추가로, 조합물은 종양 미세환경을 더욱 밀접하게 닮은 SCLC의 스페로이드 모델에서 효과적이었다. 이 약물 조합물은 또한 대조군 비처리된 세포와 비교하여 HUVEC 단층을 통한 SCLC 세포의 침범을 유의하게 억제하였다. LB100/카르보플라틴 조합물이 SCLC 이종이식편 마우스 모델에서 종양 크기 및 중량을 유의하게 감소시키는데 효과적이었다는 사실과 함께, 이들 결과는 SCLC에 대한 이 혁신적인 치료 옵션의 잠재성을 강조한다.

또한, LB100 처리는 SCLC 세포에서 HGF-유도된 MET 인산화를 억제하였다. 본 발명자들의 결과와 일치하게, PP2A는 S895의 탈인산화를 통해 MET 활성화를 조절하여 Y1234 및 Y1235의 자가인산화를 유도하여, 이로써 수용체를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다 (34). 이론에 구애되기를 바라지 않지만, MET의 HGF-유도된 인산화는 SCLC에서 상피에서 중간엽으로의 전이 (EMT)에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다 (22). 또한, MET/HGF 축은 폐암을 비롯한 다중 종양 유형에서 화학내성의 발달에 중요한 역할을 한다. NSCLC에서, MET 수용체의 활성화는 PI3K-AKT 경로의 활성화 및 아폽토시스-유도 인자의 하향조절을 통해 아폽토시스를 억제함으로써 화학내성을 유도하였다 (37). MET 억제제에 의한 이 과정의 차단은 시험관내 및 생체내에서 이들 세포를 화학요법에 대해 다시 민감화시켰다 (38). LB100이 MET의 리간드 활성화를 전복시킬 수 있다는 사실은 LB100이 SCLC 치료의 주요 장애물인 화학내성 또한 약화시킬 수 있음을 시사한다. c-MET는 또한 몇몇 암에서 대사 재프로그래밍에 관여하는 것으로 공지되어 있다 (39-42).

LB100 단독 또는 카르보플라틴과의 조합으로 PP2A 활성을 억제할 때 글루코스 흡수의 유의한 감소 뿐만 아니라 당분해 및 OxPhos가 관찰되었다. 추가로, 이들 세포의 당분해 능력 및 산화성 능력은 이들 처리 후에 감소되었다. 이론에 구애되기를 바라지 않지만, 이들 결과는 LB100 및 카르보플라틴 처리가 하이브리드 당분해/OxPhos 표현형의 역전을 유도하여, SCLC 세포를 화학 약물에 대해 민감화시킴을 시사한다. 증가된 ATP 생성은 화학내성을 일으키는 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송자의 증가된 활성과 연관이 있고 (45), 이는 상승된 ATP 수준이 ABC 수송자의 활성에 직접적인 영향을 미친다는 사실과 일치한다. 이론에 구애되기를 바라지 않지만, LB100에 의한 당분해, OxPhos 및 ATP 박탈의 억제는 유출 펌프의 기능을 약화시켜, 약물의 독성을 증가시키고, 약물 내성을 역전시킬 수 있다.

질량 분광법 데이터는 SCLC 세포 및 종양 조직에서 Pt 농도가 LB100 처리 후에 유의하게 증가되었음을 시사한다. 구리 유입/유출 수송자는 암에서 백금-기반 약물 흡수 및 내성에 중요한 역할을 하는 것으로 제안되었다 (46). 구리 수송자 1 (CTR1) 발현의 감소, 및 ABC 수송자, ATP 7A/7B 유출 수송자, 및 다중-약물 내성 단백질 MTB1의 증가가 여러 암에서 관찰된다 (47). 이론에 구애되기를 바라지 않지만, SCLC에서 관찰된 Pt 흡수 증가는 LB100에 대한 반응으로 구리 유입/유출 수송자 중 하나 이상의 변경된 발현 때문일 수 있다. 이 데이터와 일치하게, LB100 및 카르보플라틴의 조합물은 상승적으로 작용하여 SCLC 세포에서 DNA 손상 및 아폽토시스를 유도하였다.

본 발명자들은 PD- L1이 SCLC의 Rb^f/f/Trp53^f/f 마우스 모델로부터 유래된 신경 내분비 세포에서 과발현되고 (비공개 데이터), 활성화된 T 세포의 존재 하에 아테졸리주맙 및 LB100의 조합물이 스페로이드의 파괴를 유도하고, 스페로이드에서 활성화된 T 세포의 침윤을 초래하여, 세포 해리, 스페로이드 형태학 상실, 및 세포의 세포독성 증가를 일으켰음을 입증하였다.

따라서, 본 데이터는 LB100에 의한 PP2A의 폐기가 그의 다면 발현 효과, 종양유전자 MET의 활성, 에너지 생성, 및 수송자 발현의 변경을 통한 약물 흡수를 나타내어, 화학민감성을 증가시킴으로써, 세포 증식, 종양 성장 및 전이를 억제함을 나타낸다. 추가로, 본 데이터는 또한 LB100과 카르보플라틴 및 에토포시드의 조합이 LB100의 이들 다면 발현 효과를 증강시킬 수 있고, 면역요법과 LB100 처리의 조합이 H446 스페로이드의 증가된 T 세포 침윤을 유도하여 이들 스페로이드의 붕괴를 일으켰음을 나타낸다. 종합하면, 본 연구의 결과는 PP2A의 약리학적 표적화가 SCLC에 대해 실행가능한 전략인 것으로 보임을 시사한다.

물질 및 방법

조직 마이크로어레이

소세포 폐암 TMA는 유에스 바이오맥스 인크.(US Biomax Inc.) (메릴랜드주 록빌; LC818)로부터의 것이다. 면역조직화학 (IHC) 염색은 병리학/고형 종양 코어인 더 시티 오브 호프(The City of Hope)에서 PP2A A에 대한 항체 (CST, 캘리포니아주 시티 오브 인더스트리)를 사용하여 이전에 기재된 표준 기술 (49)을 이용하여 수행되었다. 간략히, 각각의 TMA는 0 내지 3의 척도로 2명의 독립적인 병리학자에 의해 검토 및 평점되었다: 0+, 염색 없음, 발현 없음; 1+, 약한 염색, 낮은 발현; 2+, 중간 정도의 염색, 중간 정도의 발현; 및 3+, 강한 염색, 높은 발현.

세포 배양 시약

현탁액 SCLC H524, H526, H82, H446, H69 및 H146 세포는 ATCC (버지니아주 마나사스)로부터 구입하고, 10% (v/v) 태아 소 혈청 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 (코닝 라이프 사이언스(Corning Life Science), 메사추사츠주 툭스베리) 및 L-글루타민으로 보충된 RPMI1640 (코닝 라이프 사이언스, 메사추사츠주 툭스베리)에서 37℃에서 5% CO2 하에 유지되었다. 세포주의 형태학을 일상적으로 모니터링하였고, 마이코플라즈마 검출 키트 (인비보젠(InvivoGen), 캘리포니아주 샌디에고)에 의해 마이코플라즈마에 대해 세포주를 일상적으로 시험하였다.

이뮤노블롯팅

전세포 용해물은 RIPA 용해 완충제을 사용하여 제조하였고, 단백질은 PP2A A, PP2A C, 포스포-히스톤 H2AX (S139), MET, pMet (Tyr 1234/1235), CST로부터의 절단된 카스파제 3 및 범-액틴 항체 (캘리포니아주 시티 오브 인더스트리), 절단된 PARP1 (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 텍사스주 달라스) 및 pMET (Ser985) (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 메사추세츠주 월섬)에 대해 특이적인 항체를 사용하여 이뮤노블롯팅에 의해 검출하였고, 이전에 기재된 바와 같이 사용되었다 (22).

세포 생존력 검정

특이적 세포독성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 이전에 기재된 바와 같이 세포 카운팅 키트-8 (도진도 몰레큘라 테크놀로지즈(Dojindo Molecular Technologies), 메릴랜드주 록빌)을 사용하였다 (50).

콜로니 형성

대략적으로, 0.3% 아가로스 중의 1x103 세포를 0.6% 아가로스 층 상에서 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 LB100, 카르보플라틴 또는 LB100/카르보플라틴의 존재 하에 3주 동안 성장시켜, 콜로니 형성을 관찰하였다. 콜로니를 4% 포름알데히드에서 고정시키고, 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 자이스 관측자 7 도립 현미경 (칼 자이스(Carl Zeiss), 독일 오베르코헨) 상에서 200 마이크로미터 단계 크기에 의해 5x 대물렌즈를 사용하여 타일형 명시야 영상의 Z-스택을 촬영하였다. 젠 블루(Zen Blue) v2.5 (칼 자이스 마이크로이미징(Carl Zeiss Microimaging))를 사용하여, 먼저 참조 슬라이스를 스티칭하여 스택을 가공한 다음, 디폴트 설정과 함께 확장된 깊이의 초점(Extended Depth of Focus) 모듈을 사용하여 Z-스택 정보를 단일 영상으로 압축하였다. 큐패쓰(QuPath) 0.1.3에서 포인트 도구 및 생성된 요약 측정을 사용하여 수동 카운팅을 생성된 타일형 영상에 대해 수행하였다 (51).

PP2A 포스파타제 활성 측정

PP2A 활성을 측정하기 위해 제조자의 프로토콜에 따라 PP2A 면역침강 Ser/Tre 포스파타제 검정 키트 (밀리포어, 캘리포니아주 테메큘라)를 사용하였다. 간략히, 8x106 H524 세포를 24시간 동안 LB100으로 처리하였다. 데이터는 대조군과 비교하여 PP2A 활성에 대한 백분율로 표시된다.

siPP2A subAα 형질감염

Ser/Thr 포스파타제 2A 조절성 서브유닛 A 알파 이소형 siRNA는 마이바이오소스(MyBioSource) (https://www.mybiosource.com/search/PPP2R1A-siRNA)로부터 구입하였다. jetPRIME 시약 (폴리플러스-트랜스펙션(Polyplus-transfection), 캘리포니아주 엘에이)을 사용하여 세포를 100 nM siRNA로 형질감염시켰다. siRNA 일시적인 형질감염은 항-PPP2R1A ab (마이바이오소스, 캘리포니아주 샌디에고)에 의해 검증하였다.

경내피 혈관외 유출 검정

SCLC 세포가 내피 세포 (EC) 층을 통해 침범하는 능력은 본 발명자들이 이전에 기재한 바와 같이 전기 기질-임피던스 감지 시스템 (어플라이드 바이오피직스(Applied Biophysics), 뉴욕주 트로이)을 이용하여 경내피 단층 내성 측정에 의해 정량화하였다 (24).

인큐사이트® 라이브 세포 분석 시스템 및 인큐사이트® 세포독성 시약에 의한 스페로이드 성장 및 세포독성의 모니터링

H446 세포를 10,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였고, 스페로이드가 형성되었다 (72시간). 이어서, 세포를 LB100, 카르보플라틴 또는 LB100/카르보플라틴으로 처리하였고, 스페로이드 성장의 동역학을 수득하였다. 인큐사이트 ZOOM 소프트웨어를 사용하여 스페로이드를 6일 동안 4시간마다 영상화하고 분석하였다.

ICP-MS 검정

샘플을 제조하고, 미리 세척된 테플론 비커 (PFA), 옵티마(Optima) 등급 시약 (피셔 케미컬(Fisher Chemical)) 및 18.2 MΩ 밀리-큐(Milli-Q) 물을 사용하여 이소토파리움 (캘리포니아 인스시튜트 오브 테크놀로지(California Institute of Technology))에서 Pt 농도에 대해 분석하였다. 먼저 세포 펠렛을 500 μl의 진한 HNO3에서 30분 동안 160℃에서 소화시킨 후, 완전히 건조시켰다. 마우스 종양을 1 mL의 진한 HNO3에서 30-45분 동안 120℃에서 주기적으로 탈기시키면서 소화시킨 후, 완전히 건조시켰다. 샘플을 실온으로 냉각시키고, 50:50 v/v 진한 HNO3:H2O2 (세포 펠렛의 경우 1 mL, 종양의 경우 2 mL)에 넣어서 유기 물질을 태워 제거하였다. 세포 펠렛을 고온의 플레이트에 160℃에서 밤새 두었다. 종양을 120℃에서 8시간 동안 주기적으로 탈기시키면서 가열하였다. 이어서, 모든 샘플을 완전히 증발시키고, 5 mL 3% v/v HNO₃에서 재구성하였다. 홀뮴(Holmium) (스펙스 세르티프렙 어슈어런스(Spex Certiprep Assurance), Lot # 24-80HOM)을 내부 표준으로 사용하였다. 2 ppb Ho를 갖는 3% v/v HNO3의 스톡 용액이 모든 샘플 및 표준 희석액에 대해 사용되었다. HNO3 + Ho 스톡 용액을 사용하여 세포주의 분취액을 20x 희석한 반면에, 종양 분취액은 동일한 스톡 용액을 사용하여 100x 희석하였다. 재현가능성을 입증하기 위해 생물학적 반복당 3회의 기술적 반복을 측정하였다. 모든 샘플을 iCAP RQ (써모피셔(ThermoFisher), 메사추세츠주 월섬) ICP-MS 및 SC-2 DX 자동샘플러 (엘리멘탈 사이언티픽(Elemental Scientific), 네브래스카주 오마하)를 사용하여 분석하였다. 분석하기 전에 표준 성능 검사를 통과하도록 장비 조정 파라미터 (예를 들어, 네불라이저 기체 흐름, 토치 정렬, 및 샘플 흡수율, 사중극자 이온 디플렉터)를 최적화하였다. Pt 표준 곡선 (0.001, 0.01, 0.1, 1.0 ppb, 스펙스 세르티프렙 어슈어런스, Lot # 24-140PTM)은 HNO3 스톡 용액을 사용하여 생성하였고, 샘플 보정을 위해 측정되었다. 각각의 분석의 경우, 백금 194 및 195 둘 다 뿐만 아니라 홀뮴 165를 측정하였다. 각각의 측정은 5회 스위프의 5회 주요 실행을 사용하였고, 각각의 스위프는 동위원소당 50 ms의 체류 시간을 사용하였다. 잔류 유기물이 농도 추정치에 영향을 미치지 않음을 보장하기 위해, 각각의 샘플을 2가지 상이한 콘 삽입물 (전형적으로 지질학적 샘플에 사용되는 하이 매트릭스(High Matrix) 삽입물, 및 생물학적 매트릭스에 권장되는 로버스트(Robust) 삽입물)을 사용하여 2가지 독립적인 세션 (상이한 날)에서 측정하였다. 두 데이터 세트 모두 불확실성 내에서 동일하다 (<± 2%). 백금 질량은 세포 펠렛의 경우 총 단백질 질량에 대해 및 마우스 샘플의 경우 종양 질량에 대해 정규화되었다.

팸진의 마이크로어레이 검정을 이용하는 키나제 활성 프로파일링

H524 세포를 LB100으로 5시간 동안 처리하여, 단백질 티로신 및 세린/트레오닌 키나제 활성에 대한 약물의 효과를 시험하였다. 팸칩(PamChip)을 사용하여 티로신 키놈 (단백질 티로신 키나제 - PTK) 또는 세린/트레오닌 키놈 (세린/트레오닌 키나제 - STK)으로부터 상류 키나제의 활성을 포착하였다. 두 팸칩 모두 144개의 펩티드를 함유하고, 각각은 12-15개의 아미노산으로 구성되었으며, 1개 이상의 인산화 부위를 갖는다. PTK 및 STK 팸진 검정은 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 샘플은 고처리량 스크리닝 코어 (시티 오브 호프, 캘리포니아주 두아르테)에 의해 팸스테이션(PamStation)® 12 (팸진, 네덜란드 스헤르토헨보스) 상에서 3회 실행되었다. 영상 정량화 및 데이터 가공은 이볼브(Evolve) 및 바이오네비게이터(BioNavigator) 소프트웨어 패키지 (팸진)에 의해 수행되었다. 적어도 하나의 약물 농도에 대해 비처리된 대조군에 비해 유의한 (t 검정 p< 0.05) 로그 배수 변화를 갖는 각각의 칩 상의 펩티드는 경로 농축 분석을 이용하여 분석되었다 (http://reactome.org).

BiOLOG 대사 검정

표현형 마이크로어레이 (PM)는 보편적인 리포터로서 세포 호흡을 이용하여 특허받은 산화환원 화학을 이용한다. 이들 검정은 잠재적으로 대사체학 스크리닝으로부터 수득된 데이터를 뒷받침하는 자연적인 적합성을 제공한다. 산화환원 검정은 표현형의 증폭 및 정밀한 정량화 둘 다를 제공한다. 산화환원 염료 혼합물은 거의 임의의 유형의 동물 세포주 또는 일차 세포에서 사용될 수 있는 수용성 무독성 테트라졸륨 시약을 함유한다 (52). Biolog (미국 캘리포니아주 헤이워드) 검정에서 사용된 염료는 시험되는 세포에 존재하는 다양한 이화 경로로부터 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 환원 형태 (NADH) 생성의 출력을 측정한다. 세포 성장이 검정 웰에서 배지에 의해 지원되는 경우, 활발하게 대사하는 세포는 테트라졸륨 염료를 환원시킨다. 염료의 환원은 웰에서 색상을 형성하고, 표현형은 "양성"으로 간주된다. 대사가 방해를 받거나 또는 성장이 불량한 경우, 표현형은 "약한 양성" 또는 "음성"이며, 웰에서 색상이 거의 또는 전혀 형성되지 않는다. 이 비색 산화환원 검정은 상이한 기질에 의해 생성된 대사율에 대한 처리 효과의 검사를 가능하게 하고, 따라서 대사체학 스크리닝을 통한 대사 출력의 검사와 조합하기 위한 우수한 기술이다.

글루코스 흡수 검정

글루코스 소모는 제조자의 지침에 따라 비색 글루코스 검정 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스바드)에 의해 결정되었다. 간략히, 세포를 100 mm 플레이트에 2x106 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 48시간의 세포 배양 후, 배지의 상청액을 수집하여, 글루코스 검출에 적용하였다. 글루코스의 흡수는 100%로 간주되는 세포 배양 배지에서의 초기 글루코스 농도와 비교하여 결정되었다.

세포 에너지 표현형 및 실시간 ATP 비율

세포 에너지 표현형 및 실시간 ATP 검정을 위해 시호스 XF96 장비 (애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하였다. 세포 에너지 표현형 검정은 기저 및 스트레스 받은 수준에서 미토콘드리아 호흡 및 당분해을 측정한다. 실시간 ATP 측정은 당분해 및 미토콘드리아로부터 ATP 생성률을 측정한다. 실험 전에, 세포를 18시간 동안 LB100으로 처리하였다. 처리한 다음 날, 세포를 세척하고, 셀-탁(Cell-Tak)으로 처리된 96 웰 플레이트에서 웰당 5x104의 밀도로 시딩하였다. 플레이트를 원심분리하여 세포 부착을 용이하게 하고, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 두 검정 모두 제조자의 지침에 따라 수행되었다. 데이터 분석은 웨이브 데스크탑(Wave Desctop) 2.6 소프트웨어 (애질런트, 캘리포니아주 산타 클라라)에 의해 수행되었다.

약물 및 T 세포에 의한 스페로이드의 라이브 영상화

물질 및 방법에 기재된 바와 같이 H446을 생성한 후 (인큐사이트® 라이브 세포 분석 시스템 및 인큐사이트® 세포독성 시약을 사용하여 스페로이드 성장 및 세포독성의 모니터링), T 세포 및 약물과 함께 인큐베이션하였다. T 세포의 존재 하에 LB100 및 아테졸리주맙의 효과를 인큐사이트 3D 다중-종양 스페로이드 검정에 의해 모니터링하였다.

피하 H69 세포 마우스 이종이식편에서 종양 성장에 대한 LB100의 효과

동물 연구는 시티 오브 호프 국립 의료 센터 동물 관리 및 사용 위원회(City of Hope National Medical Center Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 수행되었다. 무흉선 누드 마우스 (5-6주령)는 NCI (메릴랜드주 프레데릭)로부터 구입하였다. 100 μl의 PBS 및 100 μl의 마트리겔 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 캘리포니아주 산 호세)에 현탁된 H69 세포 (2x106)를 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 성장은 캘리퍼로 2차원으로 측정하였고, 표면 종양이 보일 때 (45-50 mm2), 마우스를 다음과 같이 4가지 그룹으로 무작위화하였다: 30일 동안 비히클 (PBS, i.p. 주 3회), LB100 (0.25 mg/kg, i.p. 주 3회), 카르보플라틴 (50 mg/kg, i.p. 주 2회) 및 약물 조합물 (LB100/카르보플라틴 i.p.). 연구 종료 시, 마우스를 CO2 질식 후, 경추 분리에 의해 안락사시켰다. 종양 조직을 절제하고, 칭량하고, 후속적으로 10% 완충된 포르말린에 고정하고, 조직학적 분석을 위해 파라핀에 매립하였다.

통계적 분석

통계적 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 8을 사용하여 수행하였다. 2가지 샘플 그룹을 독립표본 2측 스튜던트(Student) t 검정에 의해 비교하였다. 2가지 초과의 그룹의 데이터는 일원 ANOVA에 이어 터키 다중 비교 검정에 의해 분석하였다. p < 0.05의 값은 유의한 것으로 간주되었고, 다음과 같이 표시되었다: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 그래프는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SE)를 나타낸다.

실시예 2. 비치료된 광범위 병기 소세포 폐 암종에서 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙과 조합된 LB-100의 Ib상 개방-표지 연구

연구 근거: 2017년도에 전 세계적으로 100만 명이 넘는 사람들이 폐암으로 사망하였고, 소세포 암종은 모든 폐암의 대략 15%를 차지한다. 심지어 이중 또는 삼중 약물 요법 조합에도, "광범위 질환"을 갖는 SCLC (ED-SCLC, 환자의 70%)에 대한 중간 생존은 대략 9개월에 불과하고, 전체 5년 생존은 대략 5%로 유지되었다. PP2A는 SCLC 세포에서 편재하여 발현되지만 (비공개 데이터), SCLC에서 그의 잠재적인 관련성은 거의 알려지지 않고 있다. 단백질 포스파타제 2A (PP2A)는 폐암 및 B 세포-유래된 백혈병을 비롯한 광범위한 암 아형에서 주요 종양 단백질, 예컨대 c-Myc 및 Bcr-Abl의 조절에 관여하는 포스파타제이다. LB-100은 수많은 전임상 모델에서 효능을 나타낸 PP2A의 강력하고 선택적인 길항제이다. 권장된 II상 용량 (RP2D)을 결정하기 위해 ED-SCLC에 대한 치유 표준인 LB-100과 카르보플라틴, 에토포시드 및 아테졸리주맙의 조합물을 치료 나이브 환자에서 평가하였다.

목표: 이는 SCLC에 대한 전신 요법으로 이전에 치료를 받은 적이 없는 광범위 병기 질환 SCLC를 가진 대상체에 대한 Ib상 개방 표지 연구이다. Ib상 연구는 전통적인 3+3 설계를 이용하여 LB-100의 증량하는 용량에서 3가지 그룹에 들어가는 18명의 평가가능한 환자 (최대 30명)가 등록할 것으로 예상되는 단일 아암 연구이다. 환자는 4 사이클 동안 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙에 의한 유도 요법을 제공받을 것이다. 각각의 사이클은 3주 (21일)로 정의된다. 이어서, 환자는 LB-100 및 아테졸리주맙에 의한 유지를 진행할 것이다. 질환 진행이 없이 연구 요법을 중단한 환자는 질환 진행, 사망, 또는 연구 종료시까지 6-8주마다 RECIST v1.1 (부록 B) 지침을 이용하여 종양 반응에 대해 계속 평가될 것이다. 일차 종점은 광범위 병기 소세포 폐 암종을 가진 환자에서 LB-100 + 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙의 권장된 II상 용량 (RP2D)을 결정하는 것이다.

목적: 이 연구의 일차 목적은 광범위 병기 소세포 폐암 (ED-SCLC)을 가진 치료 나이브 환자에서 카르보플라틴, 에토포시드 및 아테졸리주맙의 표준 용량과 조합되어 제공될 때 LB-100의 권장된 II상 용량 (RP2D)을 결정하는 것이다.

연구의 이차 목적은 다음과 같다:

ㆍ 무진행 생존 (PFS)

ㆍ 객관적인 반응률 (ORR)

ㆍ 전체 생존 (OS)

ㆍ 전체 반응의 지속기간 (DOR)

ㆍ 안전성/유해 사건

연구의 탐구 목적은 다음과 같다:

ㆍ LB-100 및 에토포시드의 약동학 (PK)

ㆍ LB-100 및 질환 상태와 관련된 바이오마커 뿐만 아니라, 임상적 결과와의 그들의 상관관계

연구 설계:

용량 증량: I상 용량-발견은 제1 사이클 DLT를 기반으로 하여 최대 허용 용량 (MTD)을 결정하기 위해 전통적인 3+3을 이용할 것이다. LB-100의 최대 4가지 용량 수준을 탐구할 것이다. 권장된 II상 용량 (RP2D)의 결정은 용량 수정, 후속적인 사이클에서 유해 사건, 임상적 활성 및 상관관계 연구를 추가로 고려하여 MTD를 기반으로 할 것이다 (그리고 MTD를 초과하지 않을 것임).

확장된 코호트: RP2D의 내약성을 확인하고 효능에 대한 예비 데이터를 수득하는데 도움이 되도록, 12명 환자가 제안된 RP2D에서 치료될 때까지 추가의 환자를 등록할 것이다.

일차 및 이차 종점:

일차 종점:

- CTCAE 버전 5.0에 의해 평가되는 바와 같이 제1 사이클 동안에 DLT를 사용하여 조합물의 권장된 II상 용량 (RP2D)을 결정한다

이차 종점:

- RECIST v1.1에 의한 객관적인 반응률 (ORR)

- RECIST v1.1에 의한 전체 반응의 지속기간

- CTCAE 버전 5.0에 의해 평가되는 안전성 및 유해 사건

- RECIST v1.1에 의해 정의되는 무진행 생존 (PFS)

- 연구 등록일로부터 임의의 원인으로 인한 사망일까지의 시간으로 정의되는 전체 생존. 데이터 컷오프 날짜에 아직 살아있는 환자의 경우, OS 시간은 환자의 마지막 연락 날짜에서 검열될 것이다 (중단 후 환자에 대한 마지막 연락은 사망 상태에서 마지막으로 알려진 생존 날짜임).

샘플 크기/축적/연구 지속기간:

샘플 크기: 최소=14, 최대=30, 예상=18

추정 축적 지속기간: 1-1.5년

추정 연구 지속기간: 18-24개월

추정 참여자 지속기간: 6개월

약식 적격성 기준:

주요 포함 기준:

ㆍ 베테랑 투여 폐 연구 그룹 (VALG) 병기결정 시스템에 따라 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 광범위 병기 질환 소세포 폐 암종

ㆍ 고형 종양의 반응 평가 기준 (RECIST)에 의해 정의되는 측정가능한 질환

ㆍ SCLC에 대한 이전의 전신 화학요법, 면역요법, 생물학적, 호르몬 또는 조사용 요법이 없었음

ㆍ 하기를 포함하는 적절한 혈액학적 및 장기 기능:

혈액학: 절대 호중구 (분절형 및 띠형) 카운트 (ANC) ≥1.5x10/L, 혈소판 ≥100x10/L, 및 헤모글로빈 ≥9 g/dL

간: 빌리루빈 ≤1.5배 정상 상한치 (ULN)는 등록될 수 있고, 알칼리성 포스파타제 (AP), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) ≤3.0배 ULN (AP, AST, 및 ALT ≤5배 ULN은 간이 종양과 관련이 있는 경우에 허용가능함).

신장: 콕크로프트(Cockcroft) 및 골트(Gault) 공식을 기반으로 하여 계산된 크레아티닌 클리어런스 (CrCl) ≥60 mL/min

ㆍ 스크리닝 당시 적어도 18세

ㆍ 적어도 12주의 추정 수명

주요 배제 기준:

ㆍ 조사용 제품, 또는 약물 또는 기기의 비승인된 사용과 관련된 임상 실험에 현재 등록되었거나 또는 그로부터 마지막 30일 내에 중단되었거나, 또는 이 연구와 과학적으로 또는 의학적으로 양립될 수 없다고 판단되는 임의의 다른 유형의 의학 연구에 동시에 등록되었음

ㆍ NSCLC 또는 혼합 NSCLC 및 SCLC의 진단

ㆍ SCLC, 자궁경부의 상피내 암종, 또는 비흑색종 피부암 이외의 악성종양이 이전에 없음, 단, 이전에 악성종양이 진단되었고, 연구 시작 전 5년 이상 동안 결정적으로 치료되었으며, 후속 재발의 증거가 없는 경우. 낮은 등급 (글리슨(Gleason) 점수 ≤6=등급 그룹 1) 국소 전립선암의 병력을 가진 환자는 연구 시작 전 5년 미만에 진단된 경우에도 적격할 것이다

ㆍ 조사자의 의견에 따라 환자가 프로토콜을 준수하는 능력을 손상시키는 심각한 동반 전신 장애

ㆍ 전신 항생제의 사용을 필요로 하는, 스크리닝 동안에 활동성 또는 진행 중인 감염

ㆍ 심각한 심장 상태, 예컨대 6개월 이내의 심근 경색, 협심증, 또는 뉴욕 심장 위원회(New York Heart Association) 분류 III 또는 IV에 의해 정의되는 심장 질환

ㆍ 중추신경계 (CNS) 전이 또는 연수막 암종증의 임상적 증거, 이전에 치료된 CNS 전이를 가진 개체가 무증상이고, 연구 약물의 제1 투약 전 1주 동안 스테로이드 의약을 필요로 하지 않았으며, 연구 약물의 제1 투약 2주 전에 방사선을 완료한 경우는 제외함

ㆍ 실험과 연관되어 제공된 임의의 작용제에 대해 공지된 또는 의심되는 알레르기

ㆍ 임신 또는 수유 중인 여성

ㆍ 면역억제제를 필요로 하지 않는 졍증/경미한 자가면역 질환 (예컨대 체표면적의 10% 미만의 습진, 및 안정한 인슐린에 대한 장기 제1형 진성 당뇨병)을 비롯한 자가면역 질환의 병력.

ㆍ 공지된 B형 간염 또는 C형 간염

ㆍ 공지된 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 양성

ㆍ 전신 코르티코스테로이드 또는 다른 면역억제성 의약에 의한 치료. 만성 폐쇄성 폐 질환에 대한 흡입용 코르티코스테로이드, 기립성 저혈압을 가진 환자에 대한 미네랄로코르티코이드 (예를 들어, 플루드로코르티손), 및 부신 기능부전에 대한 저용량 보충 코르티코스테로이드의 사용은 허용된다.

ㆍ 연구 전 28일 내에 약독화 생백신의 투여

ㆍ 반복적인 배액 절차 (월 1회 이상의 빈도)를 필요로 하는 제어되지 않는 흉막 삼출, 심낭 삼출, 또는 복수. 유치 카테터를 가진 환자는 내약성이다.

ㆍ 제어되지 않는 또는 증상성 고칼슘혈증 (> 1.5 mmol/L 이온화된 칼슘 또는 칼슘 > 12 mg/dL 또는 보정된 혈청 칼슘 > ULN). 연구 시작 전에 데노수맙을 제공받고 있는 환자는 그의 사용을 중단하고, 연구 중에 그를 비스포스포네이트로 대체할 의향과 자격이 있어야 한다.

ㆍ 특발성 폐 섬유증, 기질화 폐렴 (예를 들어, 폐쇄성 모세기관지염), 약물-유도된 폐렴, 특발성 폐렴의 병력, 또는 흉부 CT 스캔의 스크리닝 시 활동성 폐렴의 증거. 방사선 분야에서 방사선 폐렴 (섬유증)의 병력은 허용된다.

ㆍ 이전의 동종이계 골수 이식 또는 고형 장기 이식.

ㆍ 3개의 EKG 중 2개에서 QTcF (프리데리시아(Fridericia) 보정 공식) > 470.

ㆍ 선천성 긴 QT 증후군의 진단

ㆍ 연구 약물의 제1 투약 전 7일 내에, QT 간격을 연장시키는 것으로 공지되고/거나 토르사드 드 포인트의 위험과 연관이 있는 의약에 의한 치료.

ㆍ 연구 약물의 제1 투약 전 7일 내에 CYP450 기질에 의한 치료.

ㆍ 연구 약물의 제1 투약 전 7일 내에 신장독성 화합물에 의한 치료.

ㆍ 연구 약물의 제1 투약 전 7일 내에 와파린에 의한 치료.

ㆍ 연구 약물의 제1 투약 전 7일 내에 에토포시드 클리어런스를 증가시킬 수 있는 항간질제 의약 (페니토인, 페노바르비탈, 카르바마제핀, 및 발프로산을 비롯하여 이에 제한되지는 않음)에 의한 치료.

ㆍ 연구 약물의 제1 투약 전 7일 내에 강한 P-당단백질 억제제에 의한 치료.

ㆍ 조사자의 의견에 따라, 연구의 안전성 모니터링 요건을 준수할 수 없는 대상체.

조사용 제품 용량 및 투여

1 사이클은 21일이다. 환자는 4 사이클의 유도 LB-100 + 아테졸리주맙/카르보플라틴/에토포시드를 제공받은 다음, 아테졸리주맙 + LB-100에 의한 유지를 진행할 것이다.

LB-100: 15분에 걸쳐 배정된 용량 (0.83, 1.25, 1.75, 2.33 또는 3.10 mg/m2)의 정맥내 (IV), 유도 및 유지 동안에 각각의 사이클의 1일차 & 3일차에 먼저 제공됨. 다른 약물은 LB-100 주입의 종료 1시간 후에 제공되어야 한다.

아테졸리주맙: LB-100 이후 1,200 mg IV, 유도 및 유지 동안에 각각의 사이클의 1일차에. 60 (± 15)분에 걸쳐 주입됨 (제1 주입의 경우임, 후속적인 주입의 경우에는 환자 내약성에 따라 30 [± 10]분으로 단축됨), LB-100 이후 제공됨.

카르보플라틴: 아테졸리주맙 이후 30-60분에 걸쳐 5 AUC IV, 유도 동안에 각각의 사이클의 1일차에.

에토포시드: 100 mg/m2 IV, 유도 동안에 마지막으로 제공됨 (각각의 사이클의 1일차에 카르보플라틴 이후, 각각의 사이클의 2일차에 단독으로, 각각의 사이클의 3일차에 LB-100 이후). 60분에 걸쳐 주입됨.

치료 개요: 주사용 생리 식염수 50 mL에 희석된 LB-100의 이 Ib상 연구는 광범위 병기 소세포 폐암을 가진 환자에서 15분에 걸쳐 외래 환자 클리닉에서 정맥내로 투여될 것이다. 환자는 용량 수준 1에서 시작하는 증량하는 용량에서 각각의 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 15 +/- 5분에 걸쳐 50 mL의 생리 식염수 (0.9%)에 희석된 LB-100의 정맥내 주입을 제공받을 것이다 (표 5.1 참조). LB-100을 먼저 제공받아야 하고, 다른 약물의 시작 1시간 전에 종료되어야 한다. 다음 코호트에서 용량 증량에 대한 결정이 이루어지기 전에, 각각의 용량 수준에서 3명의 모든 환자는 21일차에 (및 사이클 2의 시작 전 임의의 지연) 재방문을 통해 제한 독성의 증거에 대해 평가될 것이다. MTD는 (시험되는 가장 높은 용량에서 환자의 ≥33%가 DLT를 갖지 않는다면) DLT가 환자의 ≥33%에서 나타나는 것보다 낮으며 적어도 6명 환자가 치료받은 가장 높은 용량 수준으로 정의된다.

연구는 표준 3+3 환자 용량 증량 설계를 기반으로 한다. 3가지 가능한 용량 증량 (및 필요한 경우 1가지 가능한 감량 수준)이 있을 것으로 계획된다. 따라서, 용량 발견 동안에 최대 24명 환자가 등록할 것이고, 증량/감량 동안에 예상된 샘플 크기는 12명이다 (RP2D에서 12명 환자를 달성하기 위한 추가의 환자는 총 18명 환자의 예상된 샘플 크기 및 최대 30명을 따를 것임).

DLT (용량-제한 독성)에 대해 평가할 수 없는 모든 환자는 교체될 것이다. 독성과는 무관한 이유로 부적절한 후속 평가가 수행된 환자와 마찬가지로, DLT 없이 계획된 용량을 제공받지 않은 환자는 평가 불가능한 것으로 간주될 것이다. 환자는 최대 3의 코호트에 등록될 것이다. 0/3 환자가 조합에서 기인한 DLT를 갖는 경우, 다음 3명 환자는 다음 용량 수준으로 치료될 것이다. DLT 치료가 1/3 환자에서 발생하는 경우, 추가 3명 환자 (총 6명)가 동일한 용량 수준으로 치료될 것이다. 확장된 용량 수준에서 치료에서 기인하는 추가의 DLT가 관찰되지 않는다면 (즉, 1/6이 DLT를 가짐), LB-100 용량은 다음 수준으로 증량될 것이다. 2명 이상의 환자 (즉, 2/6)가 DLT를 갖는다면, 해당 용량보다 하나 낮은 수준이 시험될 것이다.

2명 이상의 환자가 주어진 용량 수준에서 DLT를 갖거나 또는 가장 높은 용량 수준이 시험되자마자 용량 증량이 종료될 것이다. 환자 내에서 용량 증량은 없을 것이다.

MTD는 적어도 6명 환자가 해당 용량으로 치료되었고, 독성 평가에 대해 평가가능할 때, 요법의 제1 사이클 동안에 DLT를 가진 환자가 없거나 1명만 있는 것인 시험된 가장 높은 LB-100 용량으로 정의된다. MTD는 가장 높은 용량이 안전하다고 간주되지 않는다면 2명 환자가 치료에서 기인한 DLT를 가졌던 가장 낮은 시험된 용량보다 하나 낮은 용량 수준이다. 이들 규칙 외에도, 모든 용량 수정 및 이후의 사이클 독성은 증량 또는 확장 전에 검토될 것이고, 결정은 더 보수적으로 수정할 수 있다 (예를 들어, 표준 규칙이 증량시킨다고 명시하는 경우에는 증량시키지 않거나, 또는 표준 규칙이 용량을 확장한다고 명시하는 경우에는 감량시킴).

요법의 중단을 필요로 하는 임의의 중증 면역-관련 사례 또한 요법의 사이클과는 무관하게 DSMC에 의한 검토를 촉구할 것이다.

용량 수준: 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 LB-100, 카르보플라틴/아테졸리주맙/에토포시드의 표준 용량 전에 증량하는 용량

표 1.

LB-100: LB-100은 정맥내 투여를 위해 멸균 용액으로 공급된다. LB-100은 -20℃에서 (범위: -25℃ 내지 -10℃) 보관된다. 각각의 바이알은 1 mg/mL 농도의 LB-100을 10 mL 함유한다. 멸균 시린지에서 적절한 용량을 뽑아 내서, 50 mL의 생리 식염수 (0.9%)에 첨가하고, 1일차에 아테졸리주맙의 투여 전에 및 3일차에 에토포시드의 투여 전에 15 +/- 5분에 걸쳐 주입하였다. 생리 식염수에서 희석 후, LB-100은 4시간 내에 투여되어야 한다.

카르보플라틴: 카르보플라틴은 정맥내 주사에 의한 투여를 위해 50 mg, 150 mg 및 450 mg의 카르보플라틴을 함유하는 단일-용량 바이알로 이용가능한 멸균 동결건조 분말로서 공급된다. 각각의 바이알은 동일한 중량부의 카르보플라틴 및 만니톨을 함유한다. 사용하기 직전에, 각각의 바이알의 내용물은 하기 스케줄에 따라 주사용 멸균수, USP, 물 중 5% 덱스트로스, 또는 0.9% 염화나트륨 주사, USP로 재구성되어야 한다 (표 2):

표 2.

이들 희석액은 모두 10 mg/mL의 카르보플라틴 농도를 생성한다. 카르보플라틴은 물 중 5% 덱스트로스 또는 0.9% 염화나트륨 주사, USP (NS)에 의해 0.5 mg/mL만큼 낮은 농도로 추가로 희석될 수 있다.

VP-16 (에토포시드): 100 mg의 VP-16은 주사를 위해 멸균 다중 용량 바이알에서 5 mL의 용액으로 공급된다. 황색 투명한 용액의 pH는 3-4이다. 각각의 mL는 20 mg VP-16, 2 mg 시트르산, 30 mg 벤질 알콜, 80 mg 폴리소르베이트 80/tween 80, 650 mg 폴리에틸렌 글리콜 300 및 30.5% (v/v) 알콜을 함유한다. VP-16은 5% 덱스트로스 주사, USP 또는 0.9% 염화나트륨 주사, USP에 의해 사용하기 전에 희석되어야 한다. 침전이 일어나기 전까지의 시간은 농도에 따라 좌우되지만, 0.2 mg/mL의 농도에서 실온에서 96시간 동안 안정하고, 0.4 mg/mL에서 48시간 동안 안정하다.

아테졸리주맙 (테센트리크(Tecentriq)): 아테졸리주맙은 하나의 1200 mg/20 mL 단일-용량 바이알 (NDC 50242-917-01)을 함유하는 카톤으로서 공급되는 정맥내 주입을 위한 멸균의 보존제-무함유의 무색 내지 약간 황색의 용액이다. 바이알은 빛으로부터 보호하기 위해 원래의 카톤에서 2℃ 내지 8℃ (36℉ 내지 46℉)에서 냉장 보관된다. 냉동시키지 않아야 한다. 흔들지 않아야 한다.

연구 약물 스케줄, 용량, 경로 및 시기: 유도기는 4 사이클 (사이클 1-4)이다. 유지기는 사이클 5 이후이다.

표 3.

요법의 계획된 지속기간: 연구 치료의 제1 투약 전 4주 내에, 기준선 종양 측정(들)을 각각의 환자에 대해 수행할 것이다. 기준선에서: 두부, 흉부, 복부, 골반 및 뼈의 컴퓨터 단층촬영 (CT) [또는 자기 공명 영상 (MRI)], 및/또는 PET 스캔. 초음파는 종양 측정 방법으로 허용되지 않을 것이다. 기준선에서 이용된 동일한 방법이 종양 평가를 위해 일관되게 이용되어야 하고, 질환 진행까지 6-8주마다 반복될 것이다. 반응의 확인은 첫번째 반응 증거로부터 4주 이상 발생할 것이다. 뼈 및/또는 PET 스캔은 조사자의 재량에 따라 반복될 수 있지만, 기준선에서 뼈 병변이 존재한 경우에는 완전 반응 (CR)을 확인하기 위해 반복되어야 한다.

허용 불가능한 독성, 질환 진행, 병발성 질병, 또는 5.3에 나열된 기준 중 하나가 중단을 요구하지 않는다면, 환자는 연구 요법을 계속 제공받을 수 있다.

합리적인 이유로, 조사자 또는 후원자가 이 연구를 연구적으로 종료할 수 있다. 종료에 대한 서면 통지가 필요하다.

종료를 정당화할 수 있는 조건에는 다음이 포함되지만 그로 제한되지 않는다:

ㆍ 연구에 등록한 환자에 대한 예상치 못한 유의한 또는 허용 불가능한 위험의 발견.

ㆍ 조사자가 허용가능한 속도로 환자를 진입시키는데 실패함.

ㆍ 프로토콜 요건에 대한 불충분한 준수 (불이행).

ㆍ 평가가능한 및/또는 완전한 데이터의 부족.

ㆍ 약물의 개발 계획을 수정하려는 결정.

ㆍ 약물 개발을 유보하거나 또는 중단하기로 하는 후원자 측의 결정.

예기치 않은 위험 이외의 이유로 인해 실험이 중단되는 경우, 약물을 현재 제공받고 있고 치료로부터 이익을 얻고 있는 환자는 치료를 계속 제공받을 수 있다.

중단 후 기간: 각각의 등록된 환자는 30일 안전성 추적 기간을 가질 것이고, 이는 연구 약물의 마지막 투약 30일 후에 발생할 것이다. 조사 기관은 일상적인 임상 실무에 따라 환자를 계속 모니터링할 것이다. 치료를 완료하거나 또는 질환 진행이 없이 중단하는 환자는 RECIST v1.1 지침 (Eisenhauer et al. 2009, 부록 B)을 이용하여 질환 진행, 사망, 또는 연구 종료 중 먼저 발생하는 때가지 6-8주마다 종양 반응에 대해 계속 평가될 것이다. 환자가 새로운 요법을 시작한 후에 진행이 발생한 경우에도, 처음 문서화된 질환 진행 날짜가 CRF에 기록되어야 한다. 생존에 대한 모니터링 또한 매월 진행 후에 계속될 수 있다. 질환 진행, 사망 및 임의의 중단 후 전신 요법, 방사선요법, 또는 수술적 개입의 날짜와 무관하게 연구 종료 날짜까지 정보를 수집할 것이다.

치료로부터 제거에 대한 기준: 등록에 대한 기준을 명시적으로 따라야 한다. 등록 기준을 충족하지 않은 환자가 부적절하게 등록된 경우, 릭스테 바이오테크놀로지 홀딩스, 인크(Lixte Biotechnology Holdings, Inc)와 연락해야 한다. 또한, 환자는 하기 상황에서 연구 약물 및 연구를 중단할 것이다:

ㆍ 조사용 제품과 관련된 임의의 다른 임상 실험에 등록, 또는 이 연구와 과학적으로 또는 의학적으로 양립될 수 없다고 판단되는 임의의 다른 유형의 의학 연구에 등록.

ㆍ 조사자/의사 결정

o 조사자/의사는 환자가 연구 또는 연구 약물을 철회해야 한다고 결정한다.

o 환자가 임의의 이유로 연구 징후의 치료에 효과적인 것으로 입증된 또 다른 치료제에 의한 치료를 필요로 하는 경우, 연구 약물의 중단은 새로운 작용제를 도입하기 전에 발생한다.

ㆍ 환자 결정

o 환자 [또는 환자의 지정인 (예를 들어, 부모 또는 법적 보호자)]는 연구 또는 연구 약물을 철회하도록 요청한다.

ㆍ 후원자 결정

o 조사자 또는 DSMB 또는 후원자는 적용가능한 법률, 규제 및 양호한 임상적 실무에 부합하는 의학적, 안전성, 조절성, 또는 다른 이유로 연구를 중단시키거나 또는 환자가 연구에 참여하는 것을 중단시킨다.

ㆍ 환자는 연구 절차 및/또는 치료를 상당히 준주하지 않는다

ㆍ 환자는 질환 진행의 증거를 갖는다

ㆍ 허용 불가능한 독성

ㆍ 환자는 임신했거나, 또는 적절한 피임법을 사용하는데 실패한다 (임신 가능성이 있는 환자의 경우).

대상체 추적: 단기 안전성 추적 기간은 연구 약물의 마지막 투약 1일 후에 시작하고, 30일 동안 지속된다. 모든 AE는 연구 약물의 마지막 투약으로부터 최소 30일 동안 보고되어야 한다. 장기 추적 기간은 환자가 사이클 4를 완료하였거나 또는 연구 약물을 중단한 후에 시작되고, 질환 진행 또는 사망시까지 계속된다. 환자는 진행 후 생존에 대해 계속 추적될 수 있다. 연구는 최종 분석을 위해 데이터 컷오프 날짜 및 데이터 잠금 후에 완료된 것으로 간주될 것이다. 통계적 분석은 연구 완료 후에 수행될 것이다.

수행될 임상적 관찰 및 시험

- 효능: CT/PET/MRI 스캔

- 안전성: CTCAE 5.0에 의한 유해 사건 (AE)/심각한 유해 사건 (SAE), 임상 화학, 혈액학

- 생물분석: 혈장 LB-100, 엔도탈, 및 에토포시드 농도를 측정하기 위한 혈액 샘플

- 약동학: LB-100 및 에토포시드 노출

약식 통계적 고려사항

안전성: 적어도 1회 용량의 연구 약물을 제공받은 모든 환자는 안전성 및 독성에 대해 평가될 것이다. 안전성 분석은 하기를 포함할 것이다: 유해 사건 비율의 요약 (모든 사건 및 연구 약물-관련 사건 포함), 모든 심각한 유해 사건 (SAE), 연구 중 사망, 연구 약물의 마지막 투약 30일 내에 사망, 및 유해 사건으로 인한 연구 약물의 중단; 최대 CTCAE 5.0 등급에 의해 실험실 및 비실험실 유해 사건 및 연구 약물과의 관련성을 분류하는 목록 및 빈도 표.

확장된 코호트: RP2D에서 12명 환자가 RP2D의 선택을 확인하는데 도움이 될 것이다. 확장 코호트 동안에, 초기 RP2D에서 30% 초과의 환자가 DLT를 경험하는 경우, 연구는 축적을 보류할 것이다 (축적은 비-DLT 또는 다른 안전성 고려사항에 대한 PI의 재량에 따라 보류될 수도 있음). 12명 환자에 의해, 10%의 실제 빈도로 발생하는 임의의 심각한 치료-관련 유해 사건은 72%의 확률로 적어도 한 번 관찰될 것이고, 20%의 실제 빈도를 갖는 임의의 이러한 AE는 93%의 확률로 적어도 한 번 관찰될 것이다. DLT 비율은 최대 14%의 표준 오차로 추정될 수 있다.

금지: 암의 치료를 위해 의도된 임의의 동반 요법은 보건 당국에 의해 승인된 것이건 또는 실험적이건 간에 연구 치료를 시작하기 전 다양한 기간 동안, 및 질환 진행이 문서화되고 환자가 연구 치료를 중단할 때까지 연구 치료 동안에 금지된다. 여기에는 화학요법, 호르몬 요법, 면역요법, 방사선요법, 조사용 작용제, 또는 약초 요법 (달리 명시되지 않는다면)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.

하기 의약은 달리 명시되지 않는다면 연구 동안에 금지된다:

ㆍ 전통적인 약초 의약, 그들의 사용은 독성을 유발하거나 또는 그의 평가를 혼동시킬 있는 예기치 않은 약물-약물 상호작용을 일으킬 수 있기 때문임

ㆍ 데노수맙; 등록 전에 데노수맙을 제공받고 있는 환자는 연구 동안에 비스포스포네이트를 대신 제공받을 의향 및 자격이 있어야 한다

ㆍ 제1 연구 약물 전 28일 내에, 치료 동안에, 또는 아테졸리주맙의 마지막 투약 후 90일 내에 임의의 약독화 생백신 (예를 들어, 플루미스트(FluMist)^®)

ㆍ 조영제에 의한 CT 스캔이 금기인 환자 (즉, 조영제 알레르기 또는 손상된 신장 클리어런스를 가진 환자)에 대한 사전 투약으로 스테로이드의 사용; 이러한 환자에서는, 흉부의 비-조영제 CT 스캔 및 복부 및 골반의 비-조영제 CT 스캔 또는 MRI가 수행되어야 한다

ㆍ QT 간격을 연장시키는 것으로 공지되고/거나 하기 위험과 연관이 있는 의약

토르사드 드 포인트.

ㆍ CYP450 기질 (부록 F 참조).

ㆍ 신장독성 화합물.

ㆍ 와파린.

ㆍ 에토포시드 클리어런스를 증가시킬 수 있는 항간질제 의약 (페니토인, 페노바르비탈, 카르바마제핀, 및 발프로산을 비롯하여 이에 제한되지는 않음).

ㆍ 강한 P-당단백질 억제제

용량-제한 독성 (DLT)의 정의: NCI 유해 사건에 대한 일반 용어 기준 (CTCAE) 버전 5.0을 이용하여 독성을 등급화할 것이다. 섹션 5.5에 따라 GCSF는 사이클 1에서 허용되지 않으며, 그것이 발생할 수 있는 독성을 억제할 수 있기 때문이다. 프로토콜 편차가 발생하고, 환자가 사이클 1에서 GCSF를 제공받는 경우, 이들은 DLT에 대해 평가 불가능한 것으로 간주될 것이고, 이들이 사이클 1에서 DLT를 경험하지 않는다면 교체될 것이다. DLT는 제1 치료 사이클에 발생하는 임의의 하기 유해 사건으로 정의되고, 연구 치료와 관련하여 가능한 것, 개연적인 것 또는 확실한 것으로 간주된다:

ㆍ 최대 항구토제 요법에도 불구하고 등급 3 이상의 오심/구토.

ㆍ 임의의 등급 4 (면역-관련 유해 사건 (irAE)

ㆍ 최대 지사제 요법에도 불구하고 등급 3 이상의 설사.

ㆍ 임의의 ≥ 등급 3 결장염 (감염성 병인은 배제되어야 하고, 내시경 검증이 강력히 권장됨)

ㆍ 지속기간과 무관하게 임의의 등급 3 또는 4 비감염성 폐렴

ㆍ 최대 보완 치료의 개시 3일 내에 ≤ 등급 1로 해결되지 않는 임의의 등급 2 폐렴

ㆍ 전신 코르티코스테로이드를 비롯한 최적의 의학적 관리에도 불구하고 사건 개시 후 3일 내에 등급 2로 하향되지 않거나 또는 14일 내에 ≤ 등급 1 또는 기준선으로 하향되지 않는, 결장염 또는 폐렴을 제외한 임의의 등급 3 irAE

ㆍ AST 또는 ALT ≥ 3X ULN 및 총 빌리루빈 > 2X ULN의 동시 상승

ㆍ AST 또는 ALT > 8X ULN 또는 총 빌리루빈 > 3X ULN, 무증상일지라도, 간 전이의 명확한 진행 또는 또 다른 명확하게 확인가능한 병인과 관련이 없는 경우.

ㆍ 5일 초과의 지속기간 동안 관찰되는 등급 4 호중구 감소증, 또는 임의의 지속기간의 열과 연관이 있고 패혈증이 발생한 등급 3 호중구 감소증, 또는 > 7일 지속되는 등급 3 호중구 감소증.

ㆍ 등급 4 혈소판 감소증, 또는 임상적으로 유의한 출혈을 갖는 등급 3 혈소판 감소증, 또는 > 7일 지속되는 등급 3 혈소판 감소증.

ㆍ 등급 4 빈혈.

ㆍ 임의의 ≥ 등급 3 AE, 하기 나열된 예외는 제외됨:

o ≤ 7일 지속되는 등급 3 피로

o 임상적으로 유의한 것으로 간주되지 않고 72시간 내에 등급 2 이하로 되돌아 오는, ALT 또는 AST 이외의 등급 3 실험실 이상

o 전신 코르티코스테로이드 요법 및/또는 호르몬 대체 요법과 함께 또는 없이 관리되고 대상체가 무증상인 등급 3 내분비 장애 (갑상선, 뇌하수체, 및/또는 부신 기능부전)

o 국소 항종양 반응에서 기인하는 등급 3 염증 반응 (예를 들어, 전이성 질환, 림프절 등의 부위에서 염증 반응)

o 임의의 AE 등급의 동시 백반증 또는 탈모

o 적절한 임상적 관리에 의해 6시간 내에 해결되는 등급 3 주입-관련 반응 (처음 발생이고, 스테로이드 예방이 없음)

o 등급 3 또는 4 림프구 감소증

유해 사건에 대한 용량 지연/수정

용량 수정: 이 실험에 대한 대부분의 치료 관련 독성이 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙에 의해 유발될 것으로 예상된다. 골수 억제, 주로 호중구 감소증이 빈번하게 발생하고; 일반적인 비-혈액학적 독성에는 피로, 오심, 구토, 및 점막염이 포함된다. 대조적으로, LB-100은 내약성이 양호할 것으로 예상되고; I상에서 관찰된 몇몇 독성은 카르보플라틴, 에토포시드 및 아테졸리주맙의 공지된 독성 프로파일과 중복되었다. 따라서, 하기 일반적인 용량 수정 규칙이 LB-100 치료 아암의 환자에 대해 이용될 것이다:

사이클의 개시가 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙 독성으로 인해 지연되는 경우, LB-100 또한 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙과 동시에 시작되도록 지연될 것이다.

아테졸리주맙이 보류되는 경우, LB-100 또한 잠재적인 면역조절제이기 때문에 보류되어야 한다

독성이 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙에서 전형적이고 용량 감소를 필요로 하는 경우, LB-100의 용량은 감소되어야 한다.

독성이 구체적으로 1 또는 2가지 작용제 (카르보플라틴, 에토포시드, 아테졸리주맙)에서 기인하는 경우, 기인된 작용제의 용량이 감소될 것이고; 그렇지 않으면 3가지 모든 약물의 용량이 감소되어야 한다.

독성으로 인해 28일 넘게 치료 지연을 필요로 하는 환자는 연구를 중단할 것이다. 스테로이드를 점점 줄이는 경우에는 예외가 주어진다. 환자가 유해 사건을 치료하기 위해 스테로이드를 점점 줄여야 하는 경우, 스테로이드를 중단하거나 또는 프레드니손 용량 (또는 등가의 용량) ≤ 10 mg/일로 감소할 때까지, 아테졸리주맙을 보류해야 한다.

카르보플라틴/에토포시드 용량 수정: 카르보플라틴 및 에토포시드의 2회 용량 감소가 허용된다. 용량 감소를 필요로 하는 환자는 재증량을 갖지 않을 것이다. 등급 3/4 독성이 2회 용량 감소 후에 재발하는 경우, 문제가 되는 작용제 또는 작용제들을 중단할 것이다. 카르보플라틴, 에토포시드 및 아테졸리주맙이 독성으로 인해 중단되어야 하는 경우, LB-100 또한 중단될 것이다. 독성으로 인해 28일 넘게 치료 지연을 필요로 하는 환자는 연구를 중단할 것이다. 카르보플라틴 및 에토포시드에 대한 용량 감소는 표 4에 제시되어 있다.

표 4. 카르보플라틴 & 에토포시드에 대한 용량 감소

혈액학적 독성: 용량 조정은 각각의 사이클의 1일차에 (+/- 2일) 측정된 혈구 카운트를 기반으로 할 것이다. 용량 수정 없음은 최저 카운트를 기반으로 할 것이다. 하기 표 5를 참조한다.

표 5. 카르보플라틴에 대한 및 혈액학적 독성에 대한 용량 조정

^a ANC ≥1500/μL 및 혈소판 ≥ 100,000/μL가 될 때까지 적어도 매주 카운트를 점검한 다음, 1일차 용량을 진행한다

^b 감염이 적절하게 치료되고 혈구 카운트가 ANC ≥1500/μL 및 혈소판 ≥100,000/μL가 될 때까지 투약을 지연한다

비-혈액학적 독성: 등급 3 또는 4 비-혈액학적 독성이 발생하는 경우:

ㆍ 모든 약물에 의한 치료를 지연한다

ㆍ 약물 또는 약물들이 독성을 생성하는 것에 대해 평가한다

ㆍ 독성이 ≤ 등급 1로 해결될 때까지 적어도 주 1회 환자를 재평가한다

ㆍ 문제가 되는 작용제 또는 작용제들의 용량을 한 용량 수준만큼 감소시킨다

ㆍ 독성이 비가역적이거나 또는 3주 치료 지연 후 ≤ 등급 1로 해결되지 않는 경우, 환자는 연구로부터 제거되어야 한다

ㆍ 임의의 사이클을 시작하기 전에 크레아티닌 클리어런스 (콕크로프트 및 골트 공식)가 ≥45 mL/min이어야 한다.

아테졸리주맙 용량 보류 : 아테졸리주맙에 대한 용량 감소가 없을 것이지만, 환자는 투여를 보류해야 하는 유해 사건을 경험하는 경우 마지막 투약 이후 최대 4주 동안 아테졸리주맙에 의한 치료를 일시적으로 유보할 수 있다. 스테로이드를 점점 줄이는 경우에는 예외가 주어진다. 환자가 유해 사건을 치료하기 위해 스테로이드를 점점 줄여야 하는 경우, 스테로이드를 중단하거나 또는 프레드니손 용량 (또는 등가의 용량) ≤ 10 mg/일로 감소할 때까지, 아테졸리주맙을 보류할 수 있다.

아테졸리주맙-특이적 유해 사건의 관리: 추가의 시험, 예컨대 자가면역 혈청학 또는 생검을 이용하여 가능한 면역학적 병인을 결정해야 한다. 면역조절제에 의해 관찰된 대부분의 면역-매개 유해 사건이 경증이고 자가 제한적이긴 하지만, 이러한 사건은 잠재적인 주요 합병증을 피하기 위해 조기에 인식되고 즉시 치료되어야 한다. 아테졸리주맙의 중단은 즉각적인 치료 효과를 갖지 않을 수 있고, 중증 사례의 경우, 면역-매개 독성은 국소 코르티코스테로이드, 전신 코르티코스테로이드 또는 다른 면역억제제에 의한 급성 관리를 필요로 할 수 있다.

표 6. 유해 사건

전신 면역 활성화 : 전신 면역 활성화는 과도한 면역 반응을 특징으로 하는 드문 상태이다. 아테졸리주맙의 작용 메카니즘을 고려할 때, 전신 면역 활성화는 잠재적인 위험으로 간주된다. 전신 면역 활성화는 대안적인 병인의 부재 하에 아테졸리주맙 투여 후 패혈증-유사 증후군이 발달한 환자에 대한 감별 진단에 포함되어야 하며, 초기 평가에는 다음이 포함된다:

ㆍ 말초 도말을 갖는 CBC

ㆍ PT, PTT, 피브리노겐, 및 D-이량체

ㆍ 페리틴

ㆍ 트리글리세리드

ㆍ AST, ALT, 및 총 빌리루빈

ㆍ LDH

ㆍ 완전 신경학적 및 복부 검사 (간비종대에 대한 평가)

LB-100 용량 수정: LB-100의 2회 용량 감소가 허용된다. 재증량은 조사자의 재량에 따라 한 번 허용된다. LB-100이 21일 넘게 지연된 환자는 연구 요법을 중단해야 한다. LB-100에서 기인한 등급 3/4 독성이 이전의 2회 용량 감소 후에 발생하면, LB-100을 중단할 것이다. 치료로부터 이익을 얻고 있는 환자는 카르보플라틴/에토포시드/아테졸리주맙을 계속할 수 있다. LB-100의 용량 감소는 표 7에 요약되어 있다.

표 7. LB-100 용량 수준

혈액학적 독성: 골수 억제는 LB-100에 의해 드물게 발생할 수 있다. 따라서, 등급 3/4 골수 억제가 발생하면, 첫번째 발생의 경우 카르보플라틴 및 에토포시드의 용량이 감소될 것이지만, LB-100은 동일하게 유지될 것이다. 등급 3/4 골수 억제의 두번째 발생의 경우에는 LB-100이 감소될 것이다. 자가면역 혈구 감소가 발생하는 경우에는, 아테졸리주맙이 지연되거나 또는 중단될 것이다. I상 실험에서 보고된 주목할 만한 유해 사건이 없었고, 본 발명자들은 용량 감소 또는 중단을 기대하지 않는다.

비-혈액학적 독성: LB-100에서 기인한 비-혈액학적 독성은 표 8에 요약된 바와 같이 관리되어야 한다.

표 8. LB-100의 용량 조정

*탈모, 및 임상적으로 무의미한 실험실 이상은 임상적으로 유의한 것으로 간주되지 않는 것들의 예이다

약동학 연구 : LB-100, 그의 주요 대사물 엔도탈의 약동학 (PK) 측정을 위한 혈장을 표 9에 제시된 샘플 스케줄에 따라 모든 환자에서 수집할 것이다. 샘플링 스케줄은 LB-100이 에토포시드 이전에 제공될 때 (1일차) 및 에토포시드와 함께 제공될 때 (3일차) LB-100 및 엔도탈 PK의 결정을 허용한다. 에토포시드 PK는 또한 단독 (2일차) 및 LB-100과의 조합 (3일차) 둘 다에서 확장된 MTD 코호트의 환자에서 평가될 것이다. LB-100 및 엔도탈의 측정을 위해, 5 mL의 정맥 혈액을 냉장된 헤파린 수집 튜브 (나트륨 또는 리튬)로 채혈하고, 혈장이 분리될 때까지 얼음 상에 두었다. 0.5N NaOH를 함유하는 적절하게 표지된 폴리프로필렌 튜브 (1.8-2 mL 저온 바이알)로 혈장을 분취할 것이다 (2개의 분취액). 모든 1.0 mL의 혈장 분취액에 대해 0.1 mL의 0.5N NaOH가 첨가되어야 한다. 샘플을 운반할 때까지 -70℃에서 보관할 것이다. 에토포시드의 측정을 위해, 표 9에 나타낸 시간에 추가 4 mL의 정맥 혈액을 EDTA-함유 수집 튜브로 채혈할 것이다. 혈장을 분리하고, 적절하게 표지된 저온 바이알에 분취하고, 후속적인 배치 분석을 위해 < -70℃에서 보관할 때까지 튜브를 얼음 상에서 유지할 것이다.

표 9. 약동학 샘플

*에토포시드 PK에 대한 샘플은 확장된 MTD 코호트에 등록한 환자에서만 수집될 것이다.

약동학 데이터 분석 : 관련 이차 PK 파라미터를 도출하기 위해 비-구획 및 구획 방법 둘 다를 이용하여 혈장 PK 데이터를 분석할 것이다. 비-구획 PK 방법을 이용하여 LB-100 및 그의 주요 대사물 엔도탈에 대한 파라미터 (예를 들어 C_max, T_max t_1/2, AUC_0-t, 및 CL)를 결정할 것이다. 에토포시드 데이터의 구획 PK 분석은 ADAPT 5 소프트웨어 (유에스씨 바이오메디컬 시뮬레이션즈 리소스(USC Biomedical Simulations Resource), 캘리포니아주 로스 앤젤레스)를 이용하여 수행될 것이고, 이차 PK 파라미터 (예를 들어 CL_sys, V_d, t_1/2, AUC_0-∞)는 각각 개별적으로 결정될 것이다. 각각의 약물 및 대사물에 대한 개별 비-구획 및 구획 PK 파라미터가 요약될 것이고, 안전성 및 효능 둘 다에 대한 잠재적인 노출-반응 관계가 평가될 것이다.

결과 : 첫번째 연구 대상체에 대한 결과는 다음과 같다. 부분적인 객관적인 반응 (47%)은 LB-100의 용량 수준 1에서 제2 사이클 후에 기록되었고 (0.83 mg/m2 1일차 & 3일차), 이 반응은 유도 요법의 제4 및 마지막 사이클 후에 측정가능한 종양의 58% 감소로 개선되었다. 독성은 용량을 제한하지 않았고, LB-100이 없는 표준 3가지 약물 조합물에 대해 예상된 것보다 크지 않다. 아테졸리주맙 및 LB-100에 의한 유지 요법이 예상된다.

본 발명자들이 본 발명의 수많은 실시양태를 기재하였지만, 본 발명자들의 기본 실시예가 본 발명의 화합물 및 방법을 이용하는 다른 실시양태를 제공하도록 변경될 수 있음이 자명하다. 따라서, 본 발명의 범주가 예시적으로 제시된 구체적인 실시양태에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 정의되어야 함을 이해할 것이다.

Claims

소세포 폐암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 유효량의
(a) 하기 구조를 갖는 화합물:

또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르, (b) 아테졸리주맙, 및 (c) 에토포시드 또는 카르보플라틴을 투여하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 대상체에게 에토포시드 및 카르보플라틴을 투여하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 아테졸리주맙 및 에토포시드, 또는 아테졸리주맙 및 카르보플라틴이 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 아테졸리주맙, 에토포시드 및 카르보플라틴이 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르가 약 0.83 mg/m²/일의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르가 약 1.25 mg/m²/일의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르가 약 1.75 mg/m²/일의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르가 약 2.33 mg/m²/일의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르가 약 3.10 mg/m²/일의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르가 21일 사이클의 1일차 및 3일차에 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 카르보플라틴을 투여하는 것을 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 카르보플라틴이 약 AUC 5에 상응하는 용량으로 투여되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 카르보플라틴이 약 AUC 5를 달성하는 용량으로 투여되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 카르보플라틴이 최대 약 750 mg/일의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 카르보플라틴이 21일 사이클의 1일차에 투여되는 것인 방법.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 카르보플라틴이 적어도 4 사이클 동안 투여되는 것인 방법.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 카르보플라틴이 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 카르보플라틴이 30-60분에 걸쳐 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 아테졸리주맙이 약 1200 mg/일의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 아테졸리주맙이 21일 사이클의 1일차에 투여되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 아테졸리주맙이 적어도 4 사이클 동안 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 아테졸리주맙이 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제23항에 있어서, 아테졸리주맙이 30-60분에 걸쳐 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 에토포시드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
제25항에 있어서, 에토포시드가 약 100 mg/m²/일의 용량으로 투여되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 에토포시드가 21일 사이클의 1일차, 2일차 및 3일차에 투여되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 에토포시드가 적어도 4 사이클 동안 투여되는 것인 방법.
제28항에 있어서, 에토포시드가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
제29항에 있어서, 에토포시드가 60분에 걸쳐 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 에스테르, 이어서 아테졸리주맙, 이어서 카르보플라틴, 이어서 에토포시드의 투여 순서로 투여하는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 소세포 폐암이 광범위 병기 질환 소세포 폐암 (ED-SCLC)인 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 SCLC에 대한 이전의 전신 화학요법, 면역요법, 생물학적, 호르몬 또는 조사용 요법을 받지 않았던 것인 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 NSCLC 또는 혼합 NSCLC 및 SCLC로 진단된 적이 없는 것인 방법.