KR20230135593A - 면역 세포를 형질도입하는 방법 - Google Patents
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Abstract
T 세포와 같은 면역 세포를 레트로바이러스 벡터로 형질도입하여 외인성 유전자 산물, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 개선된 방법이 본원에 제공된다. 형질도입 효율을 증가시켜 외인성 유전자 산물을 발현하는 집단에서 면역 세포의 백분율을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 연관된 세포, 세포 집단, 조성물 및 사용 방법도 제공된다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 28일에 출원된 미국 가출원 제63/142,730호; 및 2022년 1월 24일에 출원된 미국 가출원 제63/302,225호에 대한 우선권을 주장하며, 둘 모두의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
기술 분야
본 개시는 T 세포와 같은 면역 세포를 레트로바이러스 벡터로 형질도입하여 키메라 항원 수용체(CAR) 유전자 산물과 같은 유전자 산물을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
입양 세포 요법에서, 자가 및 동종이계 면역 세포는 세포가 새로운 치료 기능을 수행할 수 있게 하는 합성 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 면역 세포는 항원 인식 모이어티 및 T 세포 활성화 도메인으로 이루어진 융합 단백질인 키메라 항원 수용체("CAR")를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. CAR을 함유하는 조작된 면역 세포, 예를 들어, CAR-T 세포("CAR-T")는 항원 특이성 및 암세포와 같은 표적 세포를 인식하고 살해하는 유지되거나 강화된 능력을 갖는다. 면역 세포는 CAR을 암호화하는 핵산이 바이러스 벡터를 통해 면역 세포 내로 도입되는 형질도입에 의해 조작될 수 있다. CAR T 면역 요법을 위한 면역 세포를 형질도입하는 종래의 방법, 특히 제조 규모로 동종이계 면역 세포를 형질도입하는 방법은 비효율적일 수 있고, 일관성 없는 결과를 생성할 수 있고, 처리 비용 및 복잡성을 증가시키는 시약을 일반적으로 사용할 수 있다.
따라서, 면역 세포 형질도입 효율이 강하고도 일관되면서, 현재의 방법보다 더 간단하고 더 저렴하게 CAR-T 세포를 생산하는 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
외인성 유전자 산물을 발현하는 세포의 백분율이 더 높은 유전적으로 변형된 면역 세포 집단을 제공하는 바이러스 벡터를 면역 세포에 형질도입하는 개선된 방법, 더 높은 백분율의 외인성 유전자 산물 양성 세포를 포함하는 세포 집단, 및 개시된 방법을 사용하여 제조된 세포 집단을 이용하는 치료 방법이 본원에 기술된다. 또한, 기술된 방법은 외인성 유전자 산물을 발현하는 세포의 백분율이 생산 런마다 더 일관된 유전적으로 변형된 세포 집단, 및/또는 더 저렴하고 덜 복잡한 형질도입 방법을 제공한다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체를 사용하는 동종이계 세포 요법(예를 들어, 동종이계 CAR-T 세포 요법)에 유용한 세포의 제조에 사용될 수 있는 T 세포 레트로바이러스 벡터의 형질도입에 특히 적합한 방법이 본원에 기술된다.
일 양태에서, 레트로바이러스 벡터로 세포 집단을 형질도입하는 방법이 제공되며, 여기서, 벡터는 세포에 외인성인 핵산을 포함하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: a) T 림프구, 헬퍼 T 세포, 종양 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, 말초 혈액 림프구, 말초 혈액 단핵 세포, 수지상 세포, 또는 자연 살해 세포 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세포 집단을 선택하는 단계; 및 b) 시작 pH 범위가 7.0 내지 7.9인 시작 pH의 세포 배양 배지에서 선택된 세포 집단을 레트로바이러스 벡터와 함께 배양하고, 형질도입 배양 단계의 적어도 첫 1시간 동안 시작 pH 범위를 시작 pH 범위에서 유지시켜 외인성 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물을 발현하는 세포를 포함하는 형질도입된 세포 집단을 생성하는 단계.
일 구현예에서, 형질도입 방법의 시작 pH는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22 또는 24시간 동안 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위에서 유지된다. 일부 구현예에서, 시작 pH는 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 내지 약 168시간 이하 동안 시작 pH 범위에서 유지된다.
일부 구현예에서, 시작 pH는 형질도입 배양 단계의 종료까지 시작 pH 범위에서 유지된다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 36, 48, 72 또는 96시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, pH는 수동적으로 조절된다. 일부 구현예에서, pH는 바이오리액터로 능동적으로 조절된다.
일부 구현예에서, 본 개시의 형질도입 방법은 선택된 세포 집단을 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 내지 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225 또는 약 250의 MOI로 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, MOI는 형질도입 절차에서 총 표적 세포 수에 대한 기능적 바이러스 입자의 비율이다. 일부 구현예에서, 형질도입 절차에 첨가될 기능성 바이러스 입자의 역가는 qPCR에 의해 결정된다.
본 개시의 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 단클론 항체, 자살 폴리펩티드, 유도성 "온" 또는 "가속기" 스위치 또는 조절 스위치, 예를 들어, 이량체화 도메인에 특이적인 에피토프를 암호화한다.
일부 구현예에서, 선택된 세포 집단은 용기에서 배양되고, 여기서 용기는 세포 배양 플레이트, 세포 배양 딥 웰 플레이트, 세포 스택, 조절된 바이오리액터, 진탕 플라스크 또는 가스 투과성 백이다. 터일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 선택된 세포 집단 및 레트로바이러스 벡터를 약 0.75 리터 내지 약 250 리터 부피의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 선택된 세포 집단 및 레트로바이러스 벡터를 약 0.5 리터 내지 약 10 리터의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용된 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 형질도입된 세포 집단의 적어도 35% 내지 95%, 40% 내지 95%, 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 70% 내지 95%는 형질도입 배양 단계의 개시 후 3 내지 18일차에 외인성 핵산 유전자 산물을 발현한다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포 집단의 적어도 35% 내지 95%, 40% 내지 95%, 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 70% 내지 95%는 형질도입 배양 단계의 개시 후 7 내지 18일차에 외인성 핵산 유전자 산물을 발현한다.
일부 구현예에서, 세포 배양 배지는, 형질도입 배양 단계 동안, 피브로넥틴, 피브로넥틴 유도체, 폴리브렌 또는 레트로넥틴(RetroNectin)® 시약과 같은 공동 국소화 제제를 임의로 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 배양 배지는, 형질도입 배양 단계 동안 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체와 같은 공동 국소화 제제, 예를 들어, 레트로넥틴® 시약을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 형질도입 배양 단계 동안 공동 국소화 제제를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란과 같은 다중 양이온은 형질도입 전 또는 형질도입 도중에 세포 배양 배지에 첨가되지 않는다.
일부 구현예에서, 선택된 세포 집단은 세포는 동종이계 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 선택된 세포 집단은 세포는 자가 세포 집단이다.
일 양태에서, 제1 및 제2 세포 집단을 형질도입하는 방법이 제공되며, 여기서 제1 및 제2 세포 집단은 동일한 본 개시의 방법에 의해 형질도입되고, 이에 의해 제1 및 제2 형질도입된 세포 집단에서 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는 형질도입된 세포 집단의 백분율은 2% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 또는 20% 내지 30%를 초과하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 형질도입된 세포 집단을 제공하며, 여기서 형질도입된 세포 집단의 세포는 동일한 본 개시의 방법에 의해 형질도입된 세포와 비교하여 감소된 벡터 카피 수를 포함하고, 여기서 동일한 방법의 형질도입 배양 단계의 시작 pH는 7.0 미만이다.
본 개시의 일 양태에서, 세포독성 T 세포 집단을 레트로바이러스 벡터로 형질도입하는 방법이 제공되며, 여기서 벡터는 세포독성 T 세포에 외인성인 핵산을 포함하고, 상기 방법은: 시작 pH 범위 7.0 내지 7.9의 시작 pH에서 레트로바이러스 벡터와 함께 세포독성 T 세포 집단을 배양하는 단계; 및 형질도입 배양 단계의 적어도 첫 1시간 동안 시작 pH를 시작 pH 범위에서 유지하여 외인성 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물을 발현하는 세포를 포함하는 형질도입된 세포독성 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 세포 배양 배지는 공동 국소화 제제를 포함하지 않는다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 시작 pH는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24시간 동안 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위에서 유지된다. 일부 구현예에서, 세포독성 T 세포 배양 배지의 시작 pH는 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 내지 약 168시간 이하 동안 시작 pH 범위에서 유지된다.
본 양태의 일부 구현예에서, 세포독성 T 세포 배양 배지의 시작 pH는 형질도입 배양 단계의 종료까지시작 pH 범위에서 유지된다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 36, 48, 72 또는 96시간 동안 수행된다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, pH는 수동적으로 조절된다. 일부 구현예에서, pH는 능동적으로 조절된다.
일부 구현예에서, 세포독성 T 세포 배양 배지는 형질도입 배양 단계 동안, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체와 같은 공동 국소화 제제, 예를 들어 레트로넥틴®을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란과 같은 다중 양이온은 형질도입 전 또는 도중에 세포독성 T 세포 배양 배지에 첨가되지 않는다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 세포독성 T 세포 집단은 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 내지 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225 또는 약 250의 MOI로 배양한다. 일부 구현예에서, MOI는 형질도입 절차에서 세포독성 T 세포의 총 수에 대한 기능적 바이러스 입자의 비율이다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 단클론 항체, 자살 폴리펩티드, 유도성 "온" 또는 "가속기" 스위치 또는 조절 스위치 (예: 이량체화 도메인)에 특이적인 에피토프를 암호화한다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 세포독성 T 세포 집단은 용기에서 배양되며, 여기서 용기는 세포 배양 플레이트, 세포 배양 딥 웰 플레이트, 세포 스택, 조절된 바이오리액터, 진탕 플라스크 또는 가스 투과성 백이다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 세포독성 T 세포 집단 및 레트로바이러스 벡터를 약 0.75 리터 내지 약 250 리터 부피의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 형질도입된 세포독성 T 세포 집단의 적어도 40% 내지 95%, 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 70% 내지 95%는 형질도입 배양 단계의 개시 후 3 내지 18일차에 외인성 핵산 유전자 산물을 발현한다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포독성 T세포 집단의 적어도 40% 내지 95%, 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 70% 내지 95%는 형질도입 배양 단계의 개시 후 7 내지 18일차에 외인성 핵산 유전자 산물을 발현한다.
일부 구현예에서, 형질도입될 세포독성 T 세포 집단은 동종이계 세포독성 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 형질도입될 세포독성 T 세포 집단은 자가 세포독성 T 세포 집단이다.
본 개시의 일 양태에서, 제1 및 제2 세포독성 T 세포 집단을 형질도입하는 방법이 제공되며, 여기서 제1 및 제2 세포독성 T 세포 집단은 동일한 본 개시의 방법에 의해 형질도입되고, 이에 의해 제1 및 제2 형질도입된 세포독성 T 세포 집단에서 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는 형질도입된 세포독성 T 세포 집단의 백분율은 2% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 또는 20% 내지 30%를 초과하지 않는다.
본 개시의 일 양태에서, 레트로바이러스 벡터로 말초 혈액 단핵 세포 집단을 형질도입하는 방법이 제공되며, 여기서 벡터는 말초 혈액 단핵 세포에 외인성인 핵산을 포함하고, 상기 방법은: 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위 시작 pH에서 레트로바이러스 벡터로 말초 혈액 단핵 세포 집단을 배양하는 단계; 및 형질도입 배양 단계의 적어도 첫 1시간 동안 시작 pH를 시작 pH 범위에서 유지하여 외인성 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물을 발현하는 세포를 포함하는 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 세포 배양 배지는 공동 국소화 제제를 포함하지 않는다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 시작 pH는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24시간 동안 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위에서 유지된다. 일부 구현예에서, 시작 pH는 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 내지 약 168시간 이하 동안 시작 pH 범위에서 유지된다.
본 양태의 일부 구현예에서, 시작 pH는 형질도입 배양 단계의 종료까지 시작 pH 범위에서 유지된다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 36, 48, 72 또는 96시간 동안 수행된다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, pH는 수동적으로 조절된다. 일부 구현예에서, pH는 능동적으로 조절된다.
일부 구현예에서, 말초 혈액 단핵 세포 배양 배지는, 형질도입 배양 단계 동안 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체와 같은 공동 국소화 제제, 예를 들어, 레트로넥틴®을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란과 같은 다중 양이온은 형질도입 전 또는 형질도입 도중에 말초 혈액 단핵 세포 배양 배지에 첨가되지 않는다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 말초 혈액 단핵 세포 집단은 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 내지 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225 또는 약 250의 MOI로 배양한다. 일부 구현예에서, MOI는 형질도입 절차에서 말초 혈액 단핵 세포의 총 수에 대한 기능적 바이러스 입자의 비율이다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 단클론 항체, 자살 폴리펩티드, 유도성 "온" 또는 "가속기" 스위치 또는 조절 스위치 (예: 이량체화 도메인)에 특이적인 에피토프를 암호화한다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 말초 혈액 단핵 세포 집단은 용기에서 배양되며, 여기서 용기는 세포 배양 플레이트, 세포 배양 딥 웰 플레이트, 세포 스택, 조절된 바이오리액터, 진탕 플라스크 또는 가스 투과성 백이다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 말초 혈액 단핵 세포 집단 및 레트로바이러스 벡터를 약 0.75 리터 내지 약 250 리터 부피의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 본 양태의 방법에 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단의 적어도 40% 내지 95%, 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 70% 내지 95%는 형질도입 배양 단계의 개시 후 3 내지 18일차에 외인성 핵산 유전자 산물을 발현한다. 일부 구현예에서, 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단의 적어도 40% 내지 95%, 50% 내지 95%, 60% 내지 95%, 70% 내지 95%는 형질도입 배양 단계의 개시 후 7 내지 18일차에 외인성 핵산 유전자 산물을 발현한다.
일부 구현예에서, 형질도입될 말초 혈액 단핵 세포 집단은 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 형질도입될 말초 혈액 단핵 세포 집단은 자가 말초 혈액 단핵 세포 집단이다.
본 개시의 일 양태에서, 제1 및 제2 말초 혈액 단핵 세포 집단을 형질도입하는 방법이 제공되며, 여기서 제1 및 제2 말초 혈액 단핵 세포 집단은 본 개시의 동일한 방법에 의해 형질도입되고, 이에 의해 제1 및 제2 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단에서 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단의 백분율은 2% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 또는 20% 내지 30%를 초과하지 않는다.
본 개시의 일 양태에서, 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 T 세포 집단을 레트로바이러스 벡터로 형질도입하는 방법이 제공되며, 여기서 벡터는 유래된 T 세포에 대해 외인성인 핵산을 포함하고, 상기 방법은 다음을 포함한다: 시작 pH 범위 7.0 내지 7.9의 시작 pH에서 유래된 T 세포 집단을 레트로로바이러스 벡터와 함께 배양하는 단계; 및 형질도입 배양 단계의 적어도 첫 1시간 동안 시작 pH를 시작 pH 범위에서 유지하여 외인성 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물을 발현하는 세포를 포함하는 형질도입된 유래된 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 세포 배양 배지는 공동 국소화제를 포함하지 않는다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 시작 pH는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22 또는 24시간 동안 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위에서 유지된다. 일부 구현예에서, 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 T 세포 집단에 대한 배양 배지의 시작 pH는 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 내지 약 168시간 이하 동안 시작 pH 범위에서 유지된다.
본 양태의 일부 구현예에서, 유래된 T 세포 배양 배지의 시작 pH는 형질도입 배양 단계의 종료까지 시작 pH 범위에서 유지된다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 36, 48, 72 또는 96시간 동안 수행된다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 유래된 T 세포 배양 배지의 pH는 수동적으로 조절된다. 일부 구현예에서, pH는 능동적으로 조절된다.
본 발명의 본 양태의 일부 구현예에서, 유래된 T 세포 배양 배지는 형질도입 배양 단계 동안, 예를 들어, 레트로넥틴®과 같은, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체와 같은 공동 국소화 제제를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란과 같은 다중 양이온은 형질도입 전 또는 형질도입 도중에 유래된 T 세포 배양 배지에 첨가되지 않는다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 유래된 T 세포 집단은 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 내지 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225 또는 약 250의 MOI로 배양한다. 일부 구현예에서, MOI는 형질도입 절차에서 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 T 세포의 총 수에 대한 기능적 바이러스 입자의 비율이다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 단클론 항체, 자살 폴리펩티드, 유도성 "온" 또는 "가속기" 스위치 또는 조절 스위치 (예: 이량체화 도메인)에 특이적인 에피토프를 암호화한다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 유래된 T 세포 집단은 용기에서 배양되며, 여기서 용기는 세포 배양 플레이트, 세포 배양 딥 웰 플레이트, 세포 스택, 조절된 바이오리액터, 진탕 플라스크 또는 가스 투과성 백이다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계는 유래된 T 세포 집단 및 레트로바이러스 벡터를 약 0.5 리터 부피 내지 약 10 리터 부피의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본 개시의 본 양태의 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계 개시 후 3 내지 18일차에, 형질도입된 유래 T 세포 집단의 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 또는 약 70% 내지 약 95%가 외인성 핵산 유전자 산물을 발현한다. 일부 구현예에서, 형질도입 배양 단계 개시 후 7 내지 18일차에, 형질도입된 유래 T 세포 집단의 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 또는 약 70% 내지 약 95%가 외인성 핵산 유전자 산물을 발현한다.
일부 구현예에서, 형질도입될 유래된 T 세포 집단은 동종이계 유래된 T 세포 집단이다. 일부 구현예에서, 형질도입될 유래된 T 세포 집단은 자가 유래된 T 세포 집단이다.
본 개시의 일 양태에서, 제1 및 제2 유래 T 세포 집단을 형질도입하는 방법이 제공되며, 여기서 제1 및 제2 유래 T 세포 집단은 본 개시의 동일한 방법에 의해 형질도입되고, 이에 의해 제1 및 제2 형질도입된 유래 T 세포 집단에서 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는 형질도입된 유래 T 세포 집단의 백분율은 2% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 또는 20% 내지 30%를 초과하지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 개시의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 세포가 제공된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 개시의 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 세포 집단이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 세포 또는 세포 집단을 포함하는 치료 조성물이 제공된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 세포, 세포 집단 또는 치료 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공된다.
도 1은 단리된 PBMC로부터 T 세포를 단리하고, 활성화하고, 형질도입하고, 형질도입하고, 증식하고, 수확하기 위한 예시적인 프로토콜을 도시한다.
도 2a 및 2b는, ANOVA 분석에 의해 결정했을 때, 연구 11일차에, 세포가 7.1의 pH에서 형질도입되면(도 2a) 생존 CAR+ T 세포의 평균 백분율이 81.28587 또는 pH 6.6에서 형질도입되면 23.0387(도 2b)임을 보여준다.
도 2c는 생존성 CAR+ T 세포의 백분율에 대한 pH, 렌티바이러스 벡터(v/v)% (LVV로 표시됨), 레트로넥틴® 시약 농도(μg/mL)(RN으로 표시됨), 및 용기 유형의 주요 효과 및 이원 상호작용에 대한 p-값을 보여준다.
도 3은 연구의 7일차 및 14일차에 CAR+ T 세포(수직 축)의 백분율에 대해, 7.2 + 0.1의 pH로 수행된 1, 2, 4, 6 및 8시간 형질도입 시간(수평 축)의 효과를 보여준다.
도 2a 및 2b는, ANOVA 분석에 의해 결정했을 때, 연구 11일차에, 세포가 7.1의 pH에서 형질도입되면(도 2a) 생존 CAR+ T 세포의 평균 백분율이 81.28587 또는 pH 6.6에서 형질도입되면 23.0387(도 2b)임을 보여준다.
도 2c는 생존성 CAR+ T 세포의 백분율에 대한 pH, 렌티바이러스 벡터(v/v)% (LVV로 표시됨), 레트로넥틴® 시약 농도(μg/mL)(RN으로 표시됨), 및 용기 유형의 주요 효과 및 이원 상호작용에 대한 p-값을 보여준다.
도 3은 연구의 7일차 및 14일차에 CAR+ T 세포(수직 축)의 백분율에 대해, 7.2 + 0.1의 pH로 수행된 1, 2, 4, 6 및 8시간 형질도입 시간(수평 축)의 효과를 보여준다.
본원에 제공된 것은, 처리 비용 및 복잡도를 감소시키면서, 형질도입 효율을 증가시키고/시키거나 생산 런 사이의 외인성 핵산 발현 수준의 일관성을 개선하는 면역 세포, 특히 T 세포를 형질도입하기 위한 개선된 방법이다.
전형적인 생체 외 방법인 본원에 제공된 예시적인 방법은, 유전적으로 변형된 T 세포를 생산하기 위해 활성화된 T 세포를 레트로바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 형질도입하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 형질도입 단계는 공동 국소화 제제 없이 수행될 수 있다. 추가의 예시적인 구현예에서, 형질도입 단계는 6.9 내지 7.8의 pH, 또는 7.0 내지 7.9의 pH에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 농축시켜 활성화 단계에서 사용될 수 있는 T 세포를 포함하는 PBMC를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 예시적인 구현예에서, 이러한 방법은 유전적으로 변형된 T 세포를 증식시키는 단계를 포함할 수 있다. 추가의 예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 T 세포에서 내인성 유전자를 파괴하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법의 예시적인 구현예에서, T 세포는 활성화되고, 형질도입되고, 통상적으로 증식될 수 있다. 예시적인 구현예에서의 이러한 T 세포는 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
정의
본 개시에서 사용된 용어는 당업계에서 표준이지만, 청구범위의 의미에 대한 명확성 및 명확성을 보장하기 위해 특정 용어의 정의가 본원에 제공된다. 단위, 접두어 및 기호는 SI 허용 양식으로 표시할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우, 이의 분획(예를 들어, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 절 제목은 조직적 목적만을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 달리 명시적으로 제공되는 경우를 제외하고, 다음의 용어 각각은 아래에 명시된 의미를 갖는다. 추가적인 정의는 본 개시 전체에 걸쳐 제시된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "하나" 또는 "하나"는 "적어도 하나 이상의"를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 수치와 관련하여 사용되는 용어 "약"은 당업자에게 익숙하고 허용 가능한 정확성의 간격을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 정확도 간격은 ±0.15%이다.
용어 "활성화" 또는 "활성화된"은 검출 가능한 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극된 면역 세포, 예를 들어 T 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생성 및 검출 가능 효과기 기능과 연관될 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는 무엇보다도, 세포 분열을 겪고 있는 T 세포를 지칭한다. T 세포 활성화는 CD57, PD1, CD107a, CD25, CD137, CD69, 및/또는 CD71을 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 바이오마커의 증가된 T 세포 발현을 특징으로 할 수 있다.
용어 "투여"는 당업자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 체계 중 어느 하나를 사용하여, 대상체에게 제제를 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 T 세포에 대한 예시적인 투여 경로는, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에 사용되는 "비경구 투여"라는 문구는, 장내 및 국소 투여 이외의, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 림프구내, 병변내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 및 생체 내 전기천공을 포함한다. 투여는 또한, 예를 들어, 한 번, 복수의 횟수 및/또는 한 번 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
용어 "동종이계"는 하나의 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭하며, 그런 다음 이는 동일한 종의 다른 개체에 도입된다(예를 들어, 동종이계 T 세포 이식 또는 요법).
용어 "항체"(Ab)는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함할 수 있다. 각각의 H 사슬은 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개 또는 4개의 불변 도메인, CH1, CH2 CH3, 및/또는 CH4를 포함할 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 불변 도메인, CL을 포함할 수 있다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존된 영역과 산재된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 용어 "항체"는, 예로서, 자연 발생 및 비-자연 발생 Ab; 단클론 및 다클론 Ab; 이중특이적 항체; 소형 항체; 도메인 항체; 키메라 및 인간화 Ab; 인간 또는 비인간 Ab; 완전 합성 Ab(때로는 "항체 모방체"로 지칭됨); 카멜리드 항체; 항체 융합(때로는 "항체 접합체"로 지칭됨) 및 단쇄 Ab를 포함한다. 비인간 Ab는 인간에서 면역원성을 감소시키기 위한 재조합 방법에 의해 인간화될 수 있다.
본원에서 사용된 "면역글로불린"은 IgA, 분비성 IgA, IgG 및 IgM을 포함하지만 이에 한정되지 않는 일반적으로 알려진 이소형 중 임의의 하나로부터 유래될 수 있다. IgG 서브클래스는 또한 당업계에 공지되어 있으며, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 Ab 클래스 또는 서브클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
용어 "자가"는 나중에 재도입될 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 예를 들어, 조작된 자가 세포 요법(eACTTM)은 공여자, 예를 들어, 환자로부터 림프구를 수집하는 것을 수반하며, 그런 다음, 이는 예를 들어 CAR 작제물을 발현하도록 조작되고, 이어서 동일한 공여자, 예를 들어, 환자에게 다시 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공국소화 제제"는 바이러스 벡터 또는 입자, 예를 들어, 표적 세포, 예를 들어, T 세포와 같은 면역 세포와의 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 입자의 공동-국소화를 촉진하는 시약을 지칭하며, 예를 들어, 레트로넥틴® 시약과 같은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제조 규모 형질도입 부피"는 500 mL 내지 5 리터의 부피를 지칭한다.
용어 "감염의 다중성"(이하 "MOI")은 형질도입 절차와 같은 절차의 배지에서 감염 표적, 예를 들어, 세포와 같은 바이러스 입자와 같은 감염원의 비율을 지칭한다. 일부 구현예에서, MOI는 형질도입 절차 동안 표적 세포의 총 수에 첨가된 기능적 바이러스 입자의 수와 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 절차에 첨가된 기능성 바이러스 입자의 수는 기능성 바이러스 입자의 역가를 확인함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 기능성 바이러스 입자의 역가는 qPCR을 사용하여 당업계에 공지된 기술을 사용하여 안정적으로 형질도입된 표준 세포주에서 세포당 통합된 핵산 바이러스 카피의 수를 결정함으로써 결정된다. 예를 들어, Paugh, B.S.,등. Sci Rep 11, 389 (2021)을 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 레트로바이러스 입자이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 렌티바이러스 입자이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, pH 대조군은 능동적(예: 피드백 조절을 통해 생물 반응기에서 세포 배양 pH를 연속적으로 조절되는 경우) 또는 수동적 (예: 조직 배양 인큐베이터에서 완충된 세포 배양 배지 및 CO2%를 조절함으로써 배양 개시 시 세포 배양 pH를 조절하여 미리 결정된 pH를 달성하고 추가로 조절되지 않는 경우)일 수 있다.
용어 "선택적" 또는 "특이적" 및 연관된 유도체는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. CD19 항원 결합 도메인은 제2 표적에 결합하는 것보다 더 단단히 하나의 표적에 결합할 때 선택적이거나 특이인 것으로 지칭된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 벡터 카피 수("VCN")는 세포 당 벡터 카피, 예를 들어, 바이러스 벡터 카피의 수를 지칭한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "바이러스 벡터" 및 "레트로바이러스 벡터"는 레트로바이러스로부터 유래되고 형질도입을 통해 유전 물질을 세포 내로 전달하는데 사용되는 임의의 형태의 핵산을 나타낸다. 용어는 DNA 및 RNA와 같은 바이러스 벡터 핵산, 이들 핵산의 캡슐화된 형태, 및 바이러스 벡터 핵산이 포장되어 있는 바이러스 입자를 포함한다.
면역 세포
본원에서 기술된 면역 세포의 시험관 내 조작 또는 유전적 변형 전에, 세포는 대상체로부터 수득될 수 있다. 면역 세포는 동종이계 또는 자가 공급원 대상체로부터(즉, 건강한 공여자 또는 환자로부터) 수득될 수 있다.
면역 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 비제한적인 공급원으로부터 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자에게 이용 가능하고 공지된 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 건강한 공여자, 암으로 진단된 환자 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 상이한 표현형 특성을 나타내는 혼합된 세포 집단의 일부일 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 그리고 감염 부위, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직 및 종양으로부터의 조직을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, T 세포는 FICOLLTM 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액으로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도성 다능성 줄기 세포, iPSC, 조혈 줄기 세포, 및 간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. iPS 세포 및 다른 유형의 줄기 세포는 불멸 세포주를 배양하거나 환자로부터 직접 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 유도 만능 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포를 단리, 발생 및/또는 배양하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 본 개시를 실시하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 재프로그램화된 T 세포로부터 유래된 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)이다. 일부 구현예에서, 원재료는 T 세포 또는 비-T 세포로부터 유래된 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)일 수 있다. 원재료는 대안적으로 B 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포 단리체, 조혈 전구 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 또는 임의의 다른 체세포 유형 유래의 임의의 다른 세포일 수 있다.
혈액 채취
일부 구현예에서, 조작될 T 세포는 PBMC로부터 수득된다. 일부 구현예에서, PBMC는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 대상체로부터 수집되거나 수득될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 혈액은 정맥천자 또는 혈액 및/또는 PBMC의 샘플이 채취되는 임의의 다른 혈액 채취 방법에 의해 채취될 수 있다.
일부 구현예에서, PBMC는 성분채집술에 의해 개체의 순환 혈액으로부터 수득될 수 있다. 성분채집술 제품은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일부 구현예에서, 성분채집술, 특히 백혈구성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척되어 혈장 분획을 제거하고, 후속 프로세스를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 놓일 수 있다.
T 세포 농축
특정 구현예에서, T 세포는, 예를 들어 PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리를 사용하여, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 PBMC로부터 단리된다. T 세포(예를 들어, CD28+, CD4+, CDS+, CD45RA-, CD45RO+, CDS+, CD62-, CD95-, CD95+, IL2R +, IL2R -, CCR7+, CCR7-, CDL-, CD62L+, 및 이들의 조합)의 특이적 하위 집단은 당업계에 공지된 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 일 실시예에서, T 세포의 하위 집단은 CD45RA+, CD95-, IL-2R -, CCR7+, CD62L+이다. 일 실시예에서, T 세포의 하위 집단은 CD45RA+, CD95+, IL-2R +, CCR7+, CD62L+이다. 일 실시예에서, T 세포의 하위 집단은 CD45RO+, CD95+, IL-2R +, CCR7+, CD62L+이다. 일 실시예에서, T 세포의 하위 집단은 CD45RO+, CD95+, IL-2R +, CCR7-, CD62L-이다. 일 실시예에서, T 세포의 하위 집단은 CD45RA+, CD95+, IL-2R +, CCR7-, CD62L-이다. 예를 들어, 음성 선별에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성으로 선별된 세포에 대해 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 하나의 방법은 음성 자기 면역 부착성 또는 유세포 계측법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이며, 이는 음성으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커를 대상으로 한 단클론 항체의 칵테일을 사용한다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부하게 하기 위해, 단클론 항체 칵테일은 일반적으로 CD14, CD20, CDI lb, CD16, HLA- DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 유세포 계측법 및 세포 분류는 또한 본 개시의 방법 및 실시예에서 사용하기 위해 관심 세포 집단을 단리하는데 사용될 수 있다.
PBMC는 유전자 변형, 예를 들어, CAR의 도입을 위해 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 직접 사용될 수 있다. PBMC는 NK 세포 또는 NKT 세포와 같은 다른 세포독성 림프구를 추가로 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 개시된 키메라 항원 수용체의 코딩 서열을 운반하는 발현 벡터는 인간 공여자 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포 집단에 도입될 수 있다. 발현 벡터를 운반하는 성공적으로 형질도입된 T 세포는 유세포 계측법을 사용하여 분류되어 CD3 양성 T 세포를 단리한 후, 항-CD3 항체 및 IL-2 또는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여, 세포 활성화에 더하여 T 세포를 발현하는 이들 CAR의 수를 증가시키기 위해 추가로 증식될 수 있다.
특정 구현예에서, PBMC를 단리한 후, T 림프구를 추가로 단리할 수 있고, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 모두는 유전적 변형 및/또는 증식 전 또는 후에 미처리, 기억 및 효과기 T 세포 하위 집단으로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ 세포는 이들 유형의 CD8+ 세포 각각과 연관된 특징적인 세포 표면 항원을 식별함으로써 미처리, 줄기 세포 기억, 중추 기억, 및 효과기 세포로 추가로 분류된다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및 CD127을 포함하고, 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 줄기 세포 기억 T 세포는 CD45RO-, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중추 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 효과기 T 세포는 CD62L, CCR7, CD28 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B 및 퍼포린에 대해 양성이다.
특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 하위 집단으로 추가로 분류된다. 예를 들어, CD4+ T 헬퍼 세포는 특징적인 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별함으로써 미처리, 중추 기억, 및 효과기 세포로 분류될 수 있다.
세포 활성화 및 증식
본 개시의 면역 세포는 면역 세포의 유전적 변형 전 또는 후에 활성화되고 증식될 수 있다. 도 1은 본 개시의 면역 세포를 활성화, 형질도입, 형질감염 및 증식하는 데 사용될 수 있는 예시적인 프로토콜을 도시한다. 일 구현예에서, T 세포의 시험관 내 형질도입, 형질감염, 배양 및/또는 증식은 태아 송아지 혈청 및 태아 소 혈청과 같은 비인간 동물 유래 산물의 부재 하에 수행된다.
대체로, 본 개시의 조작된 면역 세포는, 예를 들어, T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하도록 T 세포의 표면 상에서 CD3 TCR 복합체 및 공자극 분자를 자극하는 제제와 세포를 접촉시킴으로써 증식될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 아이오노포어 A23187, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 피토헤마글루티닌(PHA)과 같은 유사분열성 렉틴과 같은 화학물질이 T 세포에 대한 활성화 신호하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단은, 예를 들어, OKT3 항체와 같은 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 아이오노포어와 함께 단백질 키나아제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해, 시험관 내에서 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상에서 부속 분자의 공동자극을 위해, 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서 항-CD3 항체(예: OKT3 항체) 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체는 플라스틱 또는 자성 비드와 같은 비드 또는 플레이트 또는 다른 기판 상에 배치될 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은, 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFb, 및 TNF를 포함하는 증식 및 생존에 필요한 인자, 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 기타 첨가제를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는, 이에 제한되지는 않으나, 계면활성제, 플라스마산염, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 포함한다. 배지는 추가 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 추가된 RPMI 1640, AlM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, Optimizer가 포함될 수 있으며, 혈청이 없거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트의 적절한 양 및/또는 T 세포(예를 들어, IL-7 및/또는 IL-15)의 성장 및 증식에 충분한 사이토카인(들)의 양으로 충진될 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되고, 대상체에게 주입될 세포의 배양에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37°C) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2)에서 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 세포는 조직 또는 세포와 공동 배양함으로써 증식될 수 있다. 세포는 또한 생체 내에서, 예를 들어 세포를 대상체에게 투여한 후 대상체의 혈액 내에서 증식될 수 있다.
T 세포 배양에 적합한 조건은, 혈청(예를 들어, 소태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFb, 및 TNF를 포함하는 증식 및 생존에 필요한 인자, 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 기타 첨가제를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는, 이에 제한되지는 않으나, 계면활성제, 플라스마산염, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 포함한다. 배지는 추가 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 추가된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, Optimizer가 포함될 수 있으며, 혈청이 없거나 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 정의된 호르몬 세트의 적절한 양 및/또는 T 세포(예를 들어, IL-7 및/또는 IL-15)의 성장 및 증식에 충분한 사이토카인(들)의 양으로 충진될 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양에만 포함되고, 대상체에게 주입될 세포의 배양에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지원하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37°C) 및 대기(예를 들어, 공기 + 5% CO2)에서 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 세포는 조직 또는 세포와 공동 배양함으로써 증식될 수 있다. 세포는 또한 생체 내에서, 예를 들어 세포를 대상체에게 투여한 후 대상체의 혈액 내에서 증식될 수 있다.
T 세포를 활성화하고 증식시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제6,905,874호; 미국 특허 제6,867,041호; 미국 특허 제6,797,514호; 및 WO2012/079000(이들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨)에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여, 활성화되고 자극되어 배양 보조 세포 및 적절한 항체 및 사이토카인으로 증식할 수 있다. 대체로, 이러한 방법은 IL-2와 같은 적절한 사이토카인을 갖는 배양 배지에서 PBMC 또는 단리된 T 세포를 플라스틱 또는 자성 비드 또는 기타 표면에 부착된 자극 분자 및 항-CD3 및 항-CD28 항체와 같은 공자극 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 동일한 비드에 부착된 항-CD3 및 항-CD28 항체는 "대리" 항원 제시 세포(APC)로서 기능한다. 일 실시예는 Dynabeads® 시스템으로, 인간 T 세포의 생리학적 활성화를 위한 CD3/CD28 활성화제/자극제 시스템이다. 다른 구현예에서, T 세포는, 미국 특허 제6,040,177호; 미국 특허 제5,827,642호; 및 WO2012129514(이들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로서 통합됨)에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여, 활성화되고 자극되어 배양 보조 세포 및 적절한 항체 및 사이토카인으로 증식할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는, 예를 들어, Miltenyi Biotec Inc(Auburn, California)에서 TransActTM T 세포 시약으로서 제공하는 바와 같은, CD3 및 CD28에 결합하는 항체 및/또는 이의 단편을 포함하는 항-CD3/28 나노미터 스케일 매트릭스로 활성화 및 증식된다(예를 들어, 카탈로그 번호 200-076-202 MACS GMP T 세포 Transact-CRR, 카탈로그 번호 130-019-011 연구용 MACS GMP T 세포 Transact 참조).
형질도입
본 개시의 방법에 의해 생산되는 PBMC 및 T 세포를 포함하는 면역 세포를 유전적으로 변형시키기 위한 방법이 본원에 제공된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, T 세포는 외인성 유전자 산물을 발현하도록 T 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 복제 불능 레트로바이러스 벡터와 생체 외 접촉된다. 일부 구현예에서, 외인성 유전자 산물은 CAR이다.
일부 구현예에서, 외인성 유전자 산물은 단클론 항체, 자살 폴리펩티드, 유도성 카스파제-9 (U.S. Appl. 2011/0286980) 또는 티미딘 키나아제 또는 "오프" 스위치와 같은 유도성 "온" 또는 "가속기" 스위치에 특이적인(즉, 특이적으로 인식되는) 에피토프이다. 예시적인 mAb-특이적 에피토프는 국제 특허 공개 WO2016/120216호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 외인성 유전자 산물은 RQR8과 같은 R 에피토프이다. 예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 WO2013153391A를 참조한다. 리툭시맙은 CAR 면역 세포의 표면에서 발현될 때 R 에피토프에 결합하여, CAR 면역 세포를 용해시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 유전자 산물은 이량체화 도메인과 같은 조절 스위치이다.
일부 구현예에서, 형질도입은 활성화 단계가 배지 중 어느 하나를 제거하지 않고 수행되는 동일한 용기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 수집된 혈액 샘플로부터 농축되고 단리된 PBMC와 같은 혈액 세포는 가스 투과성 백에서 활성화되고, 그런 다음 동일한 가스 투과성 백 내의 레트로바이러스 입자와 접촉될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 혈액 세포는 레트로바이러스 벡터와 접촉하기 전에 호중구를 포함하는 과립구로부터 분리되고, 단리되고/되거나 정제된다. 추가의 예시적인 구현예에서 복제 불가능한 재조합 렌티바이러스 입자일 수 있는 레트로바이러스 벡터는 활성화된 PBMC를 함유하는 동일한 가스 투과성 백 내로 도입되어 형질도입 반응 혼합물을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 활성화 단계 동안 형질도입 반응 혼합물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 활성화 단계 후에 형질도입 반응 혼합물에 첨가된다. 일부 구현예에서, 형질도입 단계와 선행 또는 동시에 수행되든지 간에, 활성화 단계는 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 또는 156시간 이하 동안 수행된다. 도 1은 예시적인 CAR T 세포 생산 프로토콜에서 잠재적 형질도입 시점을 도시한다. 배지는 본원에서 더 상세히 개시된 바와 같은 사이토카인을 포함하는 보충제 및 염기 배지를 포함하여, T 세포를 생체 외에서 배양하기 위해 당업계에 공지된 것과 같은, 형질도입 동안 일반적으로 존재한다(예를 들어, 전술한 활성화 및 증식 설명을 참조).
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터가 T 세포에 첨가될 때 시작되는 형질도입 반응은 23 내지 39°C에서, 일부 예시적인 구현예에서는 37°C에서 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 반응은 37 내지 39°C에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 반응은 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10.0% CO2에서 인큐베이션된다. 형질도입 반응은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 25, 24, 36, 48시간에서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 72 또는 96시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 형질도입 반응은 시작 pH 범위의 pH에서 1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 1 내지 6, 1 내지 7, 1 내지 8, 1 내지 9, 1 내지 10, 4 내지 12, 4 내지 14, 4 내지 16, 4 내지 18, 4 내지 20, 4 내지 24, 4 내지 26, 4 내지 28, 4 내지 30, 4 내지 32, 4 내지 36, 4 내지 38, 4 내지 40, 4 내지 42, 4 내지 44, 4 내지 46, 4 내지 48, 또는 4 내지 72 시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 반응 pH는, 예를 들어 배지 완충제(예: 중탄산나트륨 및/또는 HEPES) 및 인큐베이터 pCO2를 조절하여 배양 개시 시 원하는 pH(예컨대, 7.0 초과의 pH)를 허용함으로써 수동적으로 조절되어, 7.0 이상과 같은 목표 pH를 달성한다. 일부 구현예에서, 형질도입 반응 pH는, 예를 들어, CO2 가스 첨가를 통해 배양 pH를 연속적으로 (능동적으로) 조절함으로써 pH를 유지하는 pH 피드백 조절 루프를 갖는 온라인 pH 측정을 갖는 바이오리액터를 사용함으로써 능동적으로 조절된다.
일부 구현예에서, T 세포는 감염 다중성(MOI)으로 지칭되는, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 입자 대 세포의 상이한 비율로 형질도입될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 내지 500 사이의 MOI(플라크 형성 단위/세포)를 사용하여 형질도입된다. 일부 구현예에서, T 세포는 0.25, 0.50, 1.0, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200의 MOI로 형질도입한다. 일부 구현예에서, T 세포는 약 1 내지 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50의 MOI로 형질도입된다. 일부 구현예에서, T 세포는 1 내지 20의 MOI로 형질도입된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서, T 세포의 25% 내지 90%는 외인성 유전자 산물을 발현하고, 일부 구현예에서는, 형질도입된 T 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85% 내지 90%가 외인성 유전자 산물을 발현한다.
일부 구현예에서, 외인성 유전자 산물을 발현하는 형질도입된 T 세포의 백분율은 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%, 보다 구체적으로는 적어도 40%,45%, 50%, 55%, 60% 65%, 70%, 75%, 또는 80%, 보다 구체적으로는 적어도 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80%일 수 있다. 일부 구현예에서, 표시된 외인성 유전자 산물 발현 수준은, 레트로바이러스 벡터가 형질도입 반응 동안 세포와 처음 접촉한 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일, 특히 3~10일차에 달성된다.
일부 구현예에서, 형질도입 반응은 0.25 내지 250, 0.25 내지 7.5, 0.375 내지 7.5, 0.5 내지 5, 또는 0.7 내지 4.0 리터의 형질도입 배양 배지의 부피로 발생한다. 일부 구현예에서, 형질도입 반응은 적어도 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 50, 100, 150, 200, 또는 250 리터의 형질도입 배양 배지의 부피로 발생한다. 일부 구현예에서, 형질도입 반응은 약 0.25, 약 0.50, 약 0.60, 또는 약 0.75, 약 0.8, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 7.5, 약 8.0, 또는 약 10.0 리터의 형질도입 배양 배지의 부피로 발생한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포에 외인성인 핵산을 포함하는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은 CAR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 AAV 벡터이다.
CAR을 발현하기 위해 형질도입될 세포는 동종이계 또는 자가 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, T 세포의 시험관 내 형질도입, 배양 및/또는 증식은 태아 송아지 혈청 및 태아 소 혈청과 같은 비인간 동물 유래 산물의 부재 하에 수행된다.
일부 구현예에서, 형질도입 반응 세포 집단은 1시간 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 24, 또는 48시간 동안 인큐베이션되고, 시작 pH 범위의 pH에서 7.8 이하 또는 7.9 이하, 적어도 5, 10, 20, 30, 50, 100, 150, 또는 200의 MOI에서, CAR을 암호화하는 레트로바이러스 벡터를 가지고 인큐베이션 하며, 여기서 적어도 레트로바이러스 벡터가 형질도입 반응 동안 세포와 처음 접촉한 후 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9일 또는 10일차까지 T 세포의 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85%가 CAR을 발현한다.
유전자 파괴
동종이계 CAR T 요법, 또는 AlloCARTM를 제조하는 프로세스는 건강한 공여자로부터 건강한, 선택된, 스크리닝되고 시험된 T 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 동종이계 T 세포는 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 위험을 감소시키고 동종이계 거부 반응을 예방하기 위한 유전자 편집물이다. 일부 구현예에서, 선택된 T 세포 수용체 유전자(예: TCRa 또는 TCRb)는 GvHD를 피하기 위해 녹아웃된다. CD52 유전자는 또한 CAR T 산물이 항-CD52 항체 치료에 내성을 갖도록 녹아웃될 수 있다. 따라서, 항-CD52 항체 치료는 숙주 면역계를 림프구로 억제하고 CAR T가 생착된 상태로 유지되어 완전한 치료 효과를 달성하도록 하는 데 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 항-CD52 항체는 알렘투주맙을 포함할 수 있다(CHEMBL 1201587, ChemIDplus:216503-57-0; DB00087; 또한 US 5,846,534 참조, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 통합됨). 다음으로, T 세포는 혈액 또는 고형 종양에서 발현되는 특정 세포 표면 단백질을 인식하는 CAR을 발현하도록 조작된다. 이어서, 조작된 T 세포는 정제 단계를 거치고, 최종적으로 바이알에 동결 보존된다.
자가 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법을 제조하는 과정에서는 환자 자신의 세포(예를 들어, T 세포를 포함하는 백혈구)를 수집하고, 세포 표면에 발현되는 표적 항원을 인식하는 CAR를 발현하도록 T 세포를 유전적으로 조작하는 것을 포함한다. 이후, 조작된 세포를 동결 보존하고, 이어서 다음 조작을 위해 세포를 제거한 환자에게 투여한다.
일부 구현예에서, 단리된 면역 세포는 내인성 TCRa 및/또는 CD52의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 편집 기술(예를 들어, CRISPR/Cas9, CRISPR/CAS 12, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALEN®, 메가탈, 메가뉴클레아제)을 사용하여 유전적으로 변형되어 내인성 단백질(예를 들어, TCRa 및/또는 CD52)의 발현을 감소시키거나 제거한다. 일부 구현예에서, 방법은 DNA 말단 효소를 통해 하나 이상의 효소를 도입할 수 있는 유전자를 파괴하거나 불활성화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 메가TAL 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALE-뉴클레아제/TALEN), 또는 CRIPR(예를 들어, Cas9, Cas12 또는 CAS14) 엔도뉴클레아제일 수 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 전기천공, 초음파형성, 바이오리스틱스(예를 들어, Gene Gun), 지질 형질감염, 중합체 형질감염, 나노입자, 또는 다중총을 사용하여 핵산 벡터에 의해 형질감염된다. 일부 구현예에서, 단리된 면역 세포는 내인성 TCRa 및/또는 CD52의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 유전적으로 변형된다.
증식 및 고갈
본원에 개시된 방법의 예시적인 구현예에서, 형질도입된 T 세포는 전술한 활성화 및 증식 설명에 일반적으로 기술된 바와 같이 수확 전에 증식될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포는 표적 내인성 유전자를 녹아웃하기 위해 추가로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포는, 예를 들어, TCR을 발현하는 세포에 대해 원하지 않는 세포 유형이 고갈ab된다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 일부 구현예에서, 형질도입된 세포는 고갈 전에 또는 고갈 후에 증식될 수 있다.
유세포 계측법은 세포 집단 내에서 T 세포 수용체 양성 세포와 같은 특정 세포 유형을 고갈시키는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 유세포 계측법은 주로 광학 수단으로 세포의 구성 요소 또는 구조적 특징을 정량화하는 방법이다. 상이한 세포 유형은 구조적 특징을 정량화함으로써 구별될 수 있기 때문에, 유세포 계측법 및 세포 분류를 사용해 혼합물 내에서 상이한 표현형의 세포를 계수하고 분류할 수 있다.
유세포 계측법 분석은 두 가지 주요 단계를 포함한다: 1) 선택된 세포 유형을 하나 이상의 표지된 마커로 표지하는 단계, 및 2) 집단에서의 총 세포 수에 대한 표지된 세포의 수를 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 세포 유형을 표지하는 방법은 T 세포 수용체와 같은 특정 세포 유형에 의해 발현된 마커에 표지된 항체를 결합하는 단계를 포함한다. 항체는 형광 화합물로 직접 표지되거나, 예를 들어 제1 항체를 인식하는 형광 표지된 제2 항체를 사용하여 간접적으로 표지될 수 있다.
일부 구현예에서, CAR을 발현하는 T 세포를 분류하는 데 사용되는 방법은 자기 활성화 세포 분류(MACS)이다. 자기 활성화 세포 분류(MACS)는 초 상자성 나노입자 및 컬럼을 사용하여 표면 항원(CD 분자)에 따라 다양한 세포 집단을 분리하는 방법이다. MACS는 순수 세포 집단을 수득하는 데 사용될 수 있다.
단일 세포 현탁액 중의 세포는 마이크로비드로 자기적으로 표지될 수 있다. 샘플을 세포 친화적인 코팅으로 덮여 있는 강자성 구체로 구성된 컬럼에 도포하여, 세포를 신속하고 안전하게 분리할 수 있다. 표지되지 않은 세포는 통과하는 반면, 자기 표지된 세포는 컬럼 내에 유지된다. 관류는 표지되지 않은 세포 분획으로서 수집될 수 있다. 세척 단계 후, 컬럼을 분리기로부터 제거하고, 자기 표지된 세포를 컬럼으로부터 용리시킨다.
T 세포와 같은 특정 세포 집단의 정제에 대한 상세한 프로토콜은 Basu S 등 (2010) (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41): 1546)(여기에 전체 참조로 통합됨)에서 찾을 수 있다.
제형 및 동결보존
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 먼저 배양 배지로부터 수확된 후, 치료 유효량으로 투여하기에 적합한 배지 및 용기 시스템("약학적으로 허용 가능한" 담체)에서 세포를 세척 및 농축함으로써 제형화된다. 적절한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제형, 통상적으로 생리식염수, NormosolTM R(Abbott) 또는 Plasma-LyteTM A(Baxter)일 수 있지만, 물 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락트산이 또한 사용될 수 있다. 주입 매질은 인간 혈청 알부민으로 보충될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 조작된 면역 세포, 예를 들어, CAR을 발현하는 T 세포는 수확, 세척 및 농축된 다음 CryoStor® CSl0, CryoStor® CS2 또는 CryoStor® CS5(BioLife Solutions)와 같은 적절한 동결보존 배지에서 미리 결정된 세포 농도로 동결보존된다. 표준 절차는 인간 대상체에서 사용하기 위한 보관 및/또는 준비를 위해 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 조작된 면역 세포의 동결보존을 위해 사용된다. 필요한 경우, 동결 보존된 조작된 면역 세포는 해동, 성장 및 증식하여 더 많은 세포를 생산할 수 있다.
키메라 항원 수용체
본원에서 사용되는 바와 같이, 키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원(예를 들어, 암세포 상의 표적 항원)을 특이적으로 인식하는 단백질이다. 표적 항원에 결합될 경우, CAR은 면역 세포를 활성화시켜 그 항원(예를 들어, 암 세포)을 가진 세포를 공격하고 파괴할 수 있다. CAR은 또한 그들의 효능을 증가시키기 위해 공자극 또는 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, Finney 등의 Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797, Song 등, Blood 119:696-706(2012); Kalos 등, Sci. Transl. Med. 3:95(2011); Porter 등, N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011), 및 Gross 등, Annu.Rev. Pharmacol. Toxicol., 56:59-83(2016); 미국 특허 제7,741,465호 및 제6,319,494호 참조.
본원에서 기술된 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하되, 세포외 도메인은 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 CAR은 신호 서열, 항원 결합 도메인, 힌지 및 막관통 영역, 및 하나 이상의 연속적인 신호 전달 도메인과 같은 5'에서 3'까지의 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 안전 스위치 및/또는 하나 이상의 단클론 항체 특이적 에피토프를 추가로 포함한다. 예를 들어, WO2016/120216 참조.
항원 결합 도메인
전술한 바와 같이, 본원에서 기술된 CAR은 항원 결합 도메인을 포함한다. 본원에서 사용된 "항원 결합 도메인"은 특정 표적 항원에 결합하는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 특정 구현예에서, 항원 결합 도메인의 폴리펩티드 구조는 항체를 기반으로 한다. 항원 결합 도메인은 면역학적으로 기능적 단편인 항체 결합 영역을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 항원 결합 도메인의 "면역학적 기능적 단편"(또는 "단편")은 전장 사슬에 존재하는 아미노산의 적어도 일부가 결여되어 있지만 표적 항원에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 (그 부분이 어떻게 수득되거나 합성되는지에 관계없이) 포함하는 항원 결합 도메인의 종이다. 이러한 단편은 표적 항원에 결합한다는 점에서 생물학적으로 활성이고, 주어진 에피토프에 결합하기 위해 온전한 항체를 포함하는 다른 항원 결합 도메인과 경쟁할 수 있다. 면역학적 기능성 단편은, scFv 단편, Fab 단편(Fab', F(ab')2, 등), 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR"), 디아바디(동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은, 짧은 펩티드 링커를 통해 연결된, 경쇄 가변 도메인과 동일한 폴리펩티드 상의 중쇄 가변 도메인), 도메인 항체, 2가 항원 결합 도메인(2개의 항원 결합 부위를 포함함), 다중특이적 항원 결합 도메인, 및 단쇄 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 단편은 인간, 마우스, 랫트, 낙타류 또는 토끼를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 항체의 전장 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 하나 이상의 상보성 결합 영역(CDR)을 포함하고, 일부 구현예에서는 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 부분을 포함한다. 이들 단편은 재조합 DNA 기술로 생산될 수 있거나, 온전한 항체를 포함하는 항원 결합 도메인의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 이의 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 이상을 포함하는 이의 단편 항체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 경쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 중쇄 CDR CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단쇄 가변 단편(scFv)이다.
각각의 프레임워크에 대한 아미노산의 할당, CDR, 및 가변 도메인은 통상적으로 Kabat 넘버링(예를 들어, Kabat 등, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. 1991 참조), Chothia 넘버링(예를 들어, Chothia & Lesk, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani 등, (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia 등, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano 등, (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; 및 미국 특허 제7,709,226호 참조), 접촉 넘버링, 또는 AbM 방식(Antibody Modeling program, Oxford Molecular)의 번호 부여 체계를 따른다.
항원 결합 도메인(예를 들어, CDR, VH 및/또는 VL의 변이체), 예를 들어, 항원 결합 도메인 서열의 아미노산 서열과 각각 적어도 70 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 95 내지 97%, 97 내지 99%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄 또한 본 개시의 범위 내에 있다. 일부 경우, 이러한 분자는 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하는 반면, 다른 경우, 변이체 형태는 2개의 가변 경쇄 및 2개의 가변 중쇄(또는 이의 하위 부분)를 함유한다. 당업자는 공지된 기술을 사용하여 본원에서 제시된 바와 같은 항원 결합 도메인의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 일부 특정 구현예에서, 당업자는 활성에 중요한 것으로 여겨지지 않는 영역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않고 변경될 수 있는 분자의 적절한 영역을 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 scFv이다. 일부 구현예에서, 항원-선택적 CAR은 리더 또는 신호 펩티드를 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항원 결합 도메인은 비-단백질 성분을 포함할 수 있다.
본 개시의 방법 및 조성물에서 CAR에 사용하기에 적합한 항원 결합 도메인은 다양한 항원 결합 특이성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 표적 세포에 의해 발현되는(합성되는) 항원 상에 존재하는 에피토프에 특이적이다. 일 실시예에서, 표적 세포는 암 세포 관련 항원이다. 암 세포 관련 항원은 예를 들어, 유방암 세포, B 세포 림프종, 호지킨 림프종 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종, 폐암 세포(예를 들어, 소세포 폐암 세포), 비호지킨 B 세포 림프종(B-NHL) 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 중피종 세포, 폐암 세포(예를 들어, 소세포 폐암 세포), 흑색종 세포, 만성 림프구성 백혈병 세포, 급성 림프구성 백혈병 세포, 신경아세포종 세포, 신경교종, 교아세포종, 수모세포종, 결장암 세포, 등과 관련된 항원일 수 있다. 암 세포 관련 항원은 비암성 세포에 의해서도 발현될 수 있다.
키메라 결합 항원이 결합할 수 있는 항원의 비제한적인 예는, 예를 들어, CD19, CD20, CD38, CD30, ERBB2, CA125, MUC-1, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), CD44 표면 접착 분자, 메소텔린, 암배아 항원(CEA), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VHM2), 고 분자량 흑생종 관련 항원(HMW-MAA), MAGE-A1, IL-13R-a2, GD2, Ax1, Ror2, 및 BCMA이 있다. 클라우딘 및 이의 이소형 등.
힌지 도메인
본 개시의 CAR의 세포외 도메인은 "힌지" 도메인(또는 힌지 영역)을 포함할 수 있다. 이 용어는 CAR 내의 막관통 도메인을 CAR 내의 세포외 항원 결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 특히, 힌지 도메인은 세포외 항원 결합 도메인에 대한 더 많은 유연성 및 접근성을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 최대 300개의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서는 10 내지 100개의 아미노산, 또는 일부 구현예에서는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 도메인은 자연적으로 발생하는 분자의 전부 또는 일부, 예를 들어, CD8, CD4, CD28, 4-lBB, 또는 IgG의 세포외 영역의 전부 또는 일부(특히, IgG의 힌지 영역; 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, 또는 이의 단편과 같은 면역글로불린 계통의 일부 또는 전부를 함유할 수 있음), 또는 항체 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다.
대안적으로, 힌지 도메인은 자연적으로 발생하는 서열에 상응하는 합성 서열이거나, 완전히 합성된 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 인간 CD8a 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)의 일부이다. 또 다른 특정 구현예에서, 전술한 힌지 및 막관통 도메인은 인간 CD8a 사슬의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기술된 CAR의 힌지 도메인은 CD8a, CD28, IgGl, IgG4, PD-1 또는 FcyRIIIa 분자의 하위 서열, 특히 CD8a, CD28, IgGl, IgG4, PD-1 또는 FcyRIIIa 분자 중 어느 하나의 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지 도메인은 인간 CD8a 힌지, 인간 IgGl 힌지, 인간 IgG4, 인간 PD-1 또는 인간 FcyRIIIa 힌지를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR은 scFv, CD8a 인간 힌지 및 막 통과 도메인을 포함한다.
막관통 도메인
본 개시의 CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막관통 도메인으로 설계된다. 이는 유사하게 CAR의 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 일부 경우, 막관통 도메인은, 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 짧은 링커는 CAR의 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인 중 어느 하나 또는 일부 사이에 결합을 형성할 수 있다. 본원에 개시된 CAR에 대한 적절한 막관통 도메인은 (a) 림프구 세포(예를 들어, 제한 없이, T 헬퍼(Th) 세포와 같은 CD4+ 세포, 세포독성 T(Tc) 세포와 같은 CD8+ 세포, T 조절(Treg) 세포, 또는 자연 살해(NK) 세포)와 같은 면역 세포의 표면에서 발현될 수 있는 능력을 가지며/ 갖거나 (b) 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 유도하기 위해 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다.
막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 개시에서 특정적으로 사용되는 막관통 영역은, CD28, CD8, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 예정사멸-I (PD-1), 유도성 T 세포 공자극제(ICOS), 림프구 기능 연관 항원-I(LFA-1, CD1-la/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276(B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fe 감마 수용체, MHC 부류 1분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(Signaling Lymphocytic Activation Molecules, SLAM 단백질), 활성 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDl00(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다(이들로 이루어지거나 이에 상응할 수 있다).
비제한적인 예로서, 막관통 영역은 T 세포 수용체, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드, IL-2 수용체 p55(사슬), p75(P사슬) 또는 y 사슬, Fe 수용체의 서브유닛 사슬, 특히 Fey 수용체 III 또는 CD 단백질로부터 유래되거나, 이의 일부일 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성 도메인일 수 있고, 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전술한 막관통 도메인은 인간 CD8a 사슬(예를 들어, NP_001139345.1)로부터 유래된다.
세포내 도메인
본 개시의 CAR의 세포내(세포질) 도메인은 CAR(예: 신호 I/활성화 및/또는 신호 2/시뮬레이션)을 포함하는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 제공할 수 있다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, CAR에 사용하기 위한 활성화 세포내 신호 전달 도메인은, 예를 들어, 제한 없이, 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 및 공수용체의 세포질 서열일 수 있고, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열일 수 있다.
적절한 (예를 들어, 활성화시키는) 세포내 도메인은, CD3 zeta, CD28, OX-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, 예정사멸-I (PD-1), 유도성 T 세포 공자극제(ICOS), 림프구 기능 연관 항원-I(LFA-1, CD1-la/CD18), CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD247, CD276(B7-H3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fe 감마 수용체, MHC 부류 1분자, TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(Signaling Lymphocytic Activation Molecules, SLAM 단백질), 활성 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1e, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDl00(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래된 (또는 이에 상응하는) 신호 전달 도메인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
세포내 도메인은, 전술한 활성화 도메인 이외에, 공자극 신호 전달 도메인(본원에서 공자극 분자로 상호 교환 가능하게 지칭됨)을 통합하여 이의 효능을 증가시킬 수 있다. 공자극 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 활성화 분자에 의해 제공되는 일차 신호 이외의 추가적인 신호를 제공할 수 있다.
본 개시의 범위 내의 적절한 공자극 도메인은, 예를 들어, CD28, OX40, 4-1BB/CD137, CD2, CD3(알파, 베타, 델타, 엡실론, 감마, 제타), CD4, CDS, CD7, CD9, CD16, CD22, CD27, CD30, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, PD-1, ICOS, 림프구 기능 연관 항원-I(LFA-1)(CDI 1a/CD18), CD247, CD276(B7-H3), LIGHT(종양 괴사 인자 슈퍼패밀리 구성원 14; TNFSF14), NKG2C, Ig 알파(CD79a), DAP-10, Fc 감마 수용체, MHC 부류 I 분자, TNFR, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM(LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL-2R 베타, IL-2R 감마, IL-7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1-1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1-1a, LFA-1, ITGAM, CD1-1b, ITGAX, CD1-1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CDl00(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 리간드, 또는 이의 단편, 또는 이의 조합으로부터 유래될 수 있다(또는 상응할 수 있다). 위에 열거되지 않은 추가적인 공자극 분자 또는 이의 단편 또한 본 개시의 범위 내에 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 4-1BB/CD137 도메인을 그 자체로서 포함하거나 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 4-1BB/CD137의 완전한 천연 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001552.2에 기술되어 있다. 완전한 천연 4-1BB/CD137 핵산 서열은 NCBI 참조 서열: NM 001561.5에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 CD28 도메인을 그 자체로서 포함하거나 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 완전한 CD28의 천연 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열: NP_006130.1에 기술되어 있다. 완전한 천연 CD28 핵산 서열은 NCBI 참조 서열: NM_006139. l에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, CAR의 세포내/세포질 도메인은 CD3 제타 도메인을 그 자체로서 포함하거나 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 도메인(들)과 조합되도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 CD31 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 도메인은 CD3 제타 사슬 부분 및 공자극 신호전달 분자의 부분을 포함할 수 있다. CAR의 세포내 신호 전달 부분 내의 세포내 신호 전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다.
핵산 및 발현 벡터 제조
CAR을 암호화하는 핵산 및 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제조하는 방법이 본원에 제공된다.
본 개시에 따른 폴리뉴클레오티드, 및 벡터를 제조하는 데에는 다양한 공지된 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 작제물 및 조작된 면역 세포를 제조하기 위한 특정 방법은 공개 WO2015/120096에 기술되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
CAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 발현 벡터에 존재할 수 있다. CAR이 2개의 별도의 폴리펩티드를 포함하는 경우, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 별도의 벡터에서 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 선택성 마커, 복제 기점, 및 벡터의 복제 및/또는 유지보수를 제공하는 다른 특징을 포함할 수 있다. 적절한 발현 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 벡터 등을 포함한다.
폴리뉴클레오티드의 클로닝을 위해, 표현 벡터를 숙주 세포(단리된 숙주 세포) 내로 도입하여 벡터 자체의 복제를 허용함으로써 그 안에 함유된 폴리뉴클레오티드의 복사를 증폭시킬 수 있다. 클로닝 벡터는 복제 기점, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 및 선택성 마커를 포함하되 이에 한정되지 않는 서열 성분을 함유할 수 있다. 이들 요소는 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어, 복제 기점은 숙주 세포에서 벡터의 자율 복제를 촉진하기 위해 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 개시는 본원에서 기술된 항원 결합 도메인 중 어느 하나를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시는 CAR을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 이를 제조하는 방법이 본원에서 제공된다.
특정 구현예에서, 본 개시는 본원에서 제공된 표현 벡터를 함유하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 벡터를 함유하는 숙주 세포는 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 클로닝에 유용할 수 있다. 적절한 숙주 세포는 원핵 세포, 진균 세포, 효모 세포, 또는 포유류 세포와 같은 더 높은 진핵 세포, 보다 구체적으로 인간 세포를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
벡터는, 제한 없이, DEAE-덱스트란 매개 전달, 인산칼슘 침전물 방법, 양이온성 지질 매개 전달, 리포좀 매개 형질감염, 전기천공, 미세투과성 충돌, 수용체 매개 유전자 전달, 폴리리신, 히스톤, 키토산, 및 펩티드에 의해 매개되는 전달을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 관심 벡터의 발현에 대한 세포의 바이러스 형질감염 및 형질전환을 위한 표준 방법은 당업계에 공지되어 있다. 추가의 구현예에서, 상이한 발현 벡터의 혼합물은 면역 효과기 세포의 공여자 집단을 유전적으로 변형시키는 데 사용될 수 있으며, 여기에서 각각의 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 상이한 CAR을 암호화한다. 생성된 형질도입된 면역 효과기 세포는 조작된 세포의 혼합 집단을 형성하고, 조작된 세포의 비율은 둘 이상의 상이한 CAR을 발현한다.
레트로바이러스 입자 제조
본원에 개시된 예시적인 구현예에서, 형질도입 방법은, 조작된 T 세포와 같은 형질도입된, 조작된 면역 세포를 생성하기 위해 하나 이상의 핵산을 포함하는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자로 T 세포와 같은 면역 세포를 형질도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 형질도입된 T 세포에서 발현되는 하나 이상의 단백질, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화할 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 T 세포 및/또는 NK 세포를 형질도입하는데 사용된 레트로바이러스 입자는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 레트로바이러스 입자는 유전자 전달을 위한 일반적인 도구이다(Miller, Nature (1992) 357:455-460). 일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 알파레트로바이러스 속, 베타레트로바이러스 속, 감마레트로바이러스 속, 델타레트로바이러스 속, 엡실론레트로바이러스 속, 렌티바이러스 속, 또는 스푸마바이러스 속으로부터 유래될 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 사용하기에 적합한 많은 레트로바이러스가 있다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 Coffin 등의 ("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763)에서 확인할 수 있다. 일부 레트로바이러스의 게놈 구조에 대한 세부 사항은 당업계에서 확인할 수 있다. 예로서, HIV에 대한 세부 사항은 NCBI Genbank(즉, Genome 수탁 번호 AF033819)에서 찾을 수 있다.
예시적인 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 속으로부터의 재조합 레트로바이러스로부터 유래될 수 있고 복제 불능 재조합 렌티바이러스 입자일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 레트로바이러스는 HIV, SIV, 또는 FIV로부터 유래될 수 있다. 추가의 예시적인 구현예에서, 재조합 레트로바이러스는 렌티바이러스 속의 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 제조에 특이적인 배지에서 배양물로 성장될 수 있다. 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자를 성장시키기 위한 임의의 적절한 성장 배지 및/또는 보충제는 본원에 기술된 방법에 따라 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자 접종물에 사용될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 레트로바이러스 입자는 이어서 형질도입 침지 동안 배지에 첨가될 수 있다.
복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자는 당업계에 공지된 방법에 따라 포유류 세포주를 사용하여 생산될 수 있다. 적합한 포유류 세포는 일차 세포 및 불멸화 세포주를 포함한다. 적절한 포유류 세포주는 인간 세포주를 포함할 수 있다. 적절한 포유류 세포주에는 HeLa 세포(예: American Type Culture Collection(ATCC) 번호 CCL-2), CHO 세포(예: ATCC 번호 CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 세포(예: ATCC 번호 CRL-1573), Vero 세포, NIH 3T3 세포(예: ATCC 번호 CRL-1658), Huh-7 세포, BHK 세포(예: ATCC 번호 CCL1O), PC12 세포(ATCC 번호 CRL1721) , COS 세포, COS-7 세포(ATCC 번호 CRL1651), 인간 배아 신장(HEK) 세포(ATCC 번호 CRL1573), HLHepG2 세포, Hut-78, Jurkat, HL-60, NK 세포주(예: NKL) , NK92 및 YTS) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 세포는 불멸화 세포주가 아니라, 개체 또는 생체 외 세포로부터 수득된 세포(예를 들어, 일차 세포)이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 개체로부터 수득된 면역 세포이다. 다른 실시예로서, 세포는 개체로부터 수득된 줄기 세포 또는 전구 세포이다.
조작된 면역 세포
본 개시의 조작된 면역 세포는 동종이계 또는 자가일 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 T 세포(예를 들어, 염증성 T 림프구 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구(Treg), 헬퍼 T 림프구, 종양 침윤 림프구(TIL)), 자연 살해 T 세포(NKT), TCR 발현 세포, 수지상 세포, 살상 수지상 세포, 비만 세포, 또는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 림프구 및 CD8+ T 림프구 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 군으로부터 유래될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 T 세포이다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 감마 델타 T 세포이다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 대식세포이다. 일부 예시적인 구현예에서, 조작된 면역 세포는 자연 살해(NK) 세포이다.
전술한 바와 같이, 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 예를 들어 줄기 세포로부터 유래될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 비-인간 배아 줄기 세포, 보다 구체적으로, 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 전능성 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 말초 혈액으로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 골수로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 제대혈로부터 수득되거나 제조된다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포이다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 기술된 방법으로 생성된 CAR를 발현하는 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 기술된 방법으로 생성된 CAR를 발현하는 세포독성 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 기술된 방법으로 생성된 CAR를 발현하는 조절 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 본원에서 기술된 방법으로 생성된 CAR를 발현하는 헬퍼 T 림프구이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 조작된 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 상이한 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 동일한 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다.
또한, 전술한 방법 중 어느 하나에 따라 형질전환된 면역 세포(예를 들어, T 세포)로부터 수득된 세포주가 본원에서 제공된다. 또한, 면역억제 치료에 내성을 갖는 변형된 세포가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 단리된 세포는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 CAR 집단을 포함하되, 각각의 CAR은 동일한 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시에 따른 조작된 면역 세포는 하나 이상의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 조작된 면역 세포는, CD52, DLL3, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCRa 및 TCRb로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 파괴되거나 불활성화된 유전자를 포함하고/하거나, CAR, 다쇄 CAR 및/또는 pTa 이식유전자를 발현한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 다쇄 CAR을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시에 따른 단리된 세포는 다음과 같이 이루어진 군으로부터 선택된 두개의 파괴되거나 비활성화된 유전자를 포함한다: CD52 및 GR, CD52 및 TCRa, CDR52 및 TCRb, GR 및 TCRa, GR 및 TCRb, TCRa 및 TCRb, PD-1 및 TCRa, PD-1 및 TCRb, CTLA-4 및 TCRa, CTLA-4 및 TCRb, LAG3 및 TCRa, LAG3 및 TCRb, TIM3 및 TCRa, Tim3 및 TCRb, BTLA 및 TCRa, BTLA 및 TCRb, BY55 및 TCRa, BY55 및 TCRb, TIGIT 및 TCRa, TIGIT 및 TCRb, B7H5 및 TCRa, B7H5 및 TCRb, 및 TCRb, SIGLEC l0 및 TCRa, SIGLEC l0 및 TCRb, 2B4 및 TCRa, 2B4 및 TCRb 및/또는 CAR, 다중 사슬 CAR 및 pTa 형질 전환 유전자를 발현한다.
일부 구현예에서, TCR은 TCRa 유전자 및/또는 TCRP 유전자(들)를 파괴하거나 불활성화시킴으로써 본 개시에 따른 세포에서 기능하지 않게 된다. 일부 구현예에서, 개체로부터 유래된 변형된 세포를 수득하는 방법이 제공되며, 여기에서 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 신호 전달 경로와 독립적으로 증식할 수 있다. MHC 신호 전달 경로와 독립적으로 증식할 수 있고, 이러한 방법에 의해 수득될 수 있는 변형된 세포는 본 개시의 범위에 포함된다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 하나 이상의 화학요법 약물에 내성이 있도록 조작된다. 화학요법 약물은, 예를 들어, 퓨린 뉴클레오티드 유사체(PNA)일 수 있으므로, 면역 세포를 입양 면역요법과 화학요법을 병용하는 암 치료에 적합하게 한다. 예시적인 PNA는, 예를 들어, 클로파라빈, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및 시타라빈을 단독으로 또는 조합하여 포함한다. PNA는 데옥시시티딘 키나아제(dCK)에 의해 모노-, 디-, 및 트리-포스페이트 PNA로 대사된다. 이들의 트리포스페이트 형태는 DNA 합성을 위해 ATP와 경쟁하고, 세포자멸-유도제로서 작용하며, 트리뉴클레오티드 생산에 관여하는 리보뉴클레오티드 환원효소(RNR)의 강력한 억제제이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 단리된 세포 또는 세포주는 pTa 또는 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 세포 또는 세포주는 TCRa 유전자를 파괴하거나 불활성화시킴으로써 추가로 유전적으로 변형될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 개시는 또한 CAR 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, CAR은 플라스미드 벡터를 통해 이식유전자로서 면역 세포 내에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는, 예를 들어, 벡터를 수용한 세포의 식별 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 함유할 수도 있다.
일부 구현예에서, 세포는 전기천공, 초음파형성, 바이오리스틱스(예를 들어, Gene Gun), 지질 형질감염, 중합체 형질감염, 나노입자, 또는 다중총으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 본 개시의 핵산 벡터에 의해 형질감염된다. 일부 구현예에서, 세포는 본 개시의 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다.
치료 방법
암을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 T 세포 매개 면역 반응을 생성하는 것에 관한 것으로서, 대상체에게 본 출원의 조작된 면역 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 매개 면역 반응은 표적 세포 또는 세포들에 대해 유도된다. 일부 구현예에서, 조작된 면역 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 종양 세포이다. 일부 양태에서, 본 개시는 악성 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함하며, 방법은 본원에서 기술된 적어도 하나의 단리된 항원 결합 도메인의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시는 악성 종양을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 포함하며, 방법은 적어도 하나의 면역 세포의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 면역 세포는 적어도 하나의 키메라 항원 수용체, 및/또는 본원에서 기술된 단리된 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체는 고형 종양, 또는 림프종 또는 백혈병과 같은 혈액 악성 종양을 갖는다. 일부 구현예에서, 암은 대상체의 골수에 존재한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 자가 면역 세포, 예를 들어, 자가 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 동종이계 면역 세포, 예를 들어, 동종이계 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 이종 면역 세포, 예를 들어, 이종 T 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 생체 외에서 형질감염 및/또는 형질도입된다. 본원에서 사용되는 용어 "시험관 내 세포"는 생체 외에서 배양되는 임의의 세포를 지칭한다. 치료제(예를 들어, 조작된 CAR T 세포)의 "치료적 유효량", "유효 투여량", "유효량", 또는 "치료적 유효 투여량"은, 단독으로 사용되거나 다른 치료제와 병용될 경우, 질환의 발병으로부터 대상체를 보호하거나, 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속 시간의 증가로 입증되는 질환 퇴행을 촉진하거나, 질환으로 인한 장애 또는 손상을 예방하는 임의의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하는 치료제의 능력은, 예를 들어, 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서, 또는 시험관 내 분석에서 제제의 활성을 분석함으로써, 당업자(예: 의사 또는 임상의)에게 공지된 다양한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 상호 교환적으로 사용되며, 인간 대상체뿐만 아니라 공식적으로 진단된 장애를 가진 대상체, 공식적으로 인식된 장애를 갖지 않은 대상체, 의학적 치료를 받는 대상체, 장애를 발달시킬 위험이 있는 대상체 등을 포함한다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 처치, 예방적 치료, 및 대상체가 장애 또는 다른 위험 인자를 발생시킬 위험을 감소시키는 개시를 포함한다. 치료는 장애의 완전한 치유를 필요로 하지 않으며, 증상 또는 기저 위험 인자를 감소시키는 구현예를 포함한다. 용어 "예방"은 이벤트의 가능성을 100% 제거할 것을 요구하지 않는다. 오히려, 이는 화합물 또는 방법의 존재 시에 이벤트의 발생 가능성이 감소되었음을 나타낸다.
조성물 중 세포의 목적하는 치료 총량은 적어도 2개의 세포(예를 들어, 적어도 1개의 CD8+ T 세포 및 적어도 1개의 CD4+ T 세포, 또는 2개의 CD8+ T 세포 또는 2개의 CD4+ T 세포)이거나, 보다 일반적으로 102개 세포보다 크고, 최대 106개이며, 최대 108개 또는 109개 세포까지 포함되고, 1010개 세포 또는 1012 개 이상일 수 있다. 세포의 수는 조성물이 의도되는 목적하는 용도, 및 그 안에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 목적하는 세포의 밀도는 통상적으로 106 세포/ml 초과이며, 일반적으로 107 세포/ml 초과, 일반적으로 108 세포/ml 이상이다. 임상적으로 관련된 면역 세포의 수는 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 또는 1012개의 세포와 누적적으로 동일하거나 이를 초과하는 다수의 주입으로 배분될 수 있다. 본 개시의 일부 양태에서, 특히 주입된 모든 세포가 특정 표적 항원으로 리디렉팅될 것이므로, 106/킬로그램(환자당 106 내지 1011개) 범위의 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. CAR 치료는 이들 범위 내의 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다.
세포는 치료를 받는 환자에 대해 자가, 동종, 또는 이종일 수 있다.
일부 구현예에서, CAR T 세포의 치료적 유효량은, 약 1 X 105 세포/kg, 약 2 X 105 세포/kg, 약 3 X 105 세포/kg, 약 4 X 105 세포/kg, 약 5 X 105 세포/kg, 약 6 X 105 세포/kg, 약 7 X 105 세포/kg, 약 8 X 105 세포/kg, 약 9 X 105 세포/kg, 2 X 106 세포/kg, 약 3 X 106 세포/kg, 약 4 X 106 세포/kg, 약 5 X 106 세포/kg, 약 6 X 106 세포/kg, 약 7 X 106 세포/kg, 약 8 X 106 세포/kg, 약 9 X 106 세포/kg, 약 1 X 107 세포/kg, 약 2 X 107 세포/kg, 약 3 X 107 세포/kg, 약 4 X 107 세포/kg, 약 5 X 107 세포/kg, 약 6 X 107 세포/kg, 약 7 X 107 세포/kg, 약 8 X 107 세포/kg, 또는 약 9 X 107 세포/kg이다.
일부 구현예에서, CAR +/CAR-T + 세포에 대한 표적 투여량은 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 세포/kg, 예를 들어 약 1 x 106 세포/kg, 약 1 x 107 세포/kg, 약 1 x 108 세포/kg, 약 1 x 109 세포/kg 또는 약 1 x 1010 세포/kg의 범위이다. 이러한 범위의 초과 및 미만의 투여량이 특정 대상체에게 적절할 수 있고, 필요에 따라 의료 제공자에 의해 적절한 투여량 레벨이 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 개시에 따라 세포의 다중 투여량이 제공될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 추가적인 활성제를 더 포함한다.
본 개시의 CAR 발현 세포 집단은 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 조합하여 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 본 개시의 약학적 조성물은, 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본원에서 기술된 바와 같은 T 세포와 같은 CAR 발현 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등과 같은 완충제; 포도당, 만노오스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 글리신; 항산화제와 같은 폴리펩티드 또는 아미노산; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물은 바람직하게는 정맥 내 투여용으로 제형화될 수 있다.
약학적 조성물(용액, 현탁액 등)은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수와 같은 멸균 희석제, 식염수, 링거 용액, 바람직하게는 등장성 염화나트륨과 같은 생리식염수, 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노- 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 아세테이트와 같은 완충제, 시트르산염 또는 인산염, 및 염화 나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장성 조절을 위한 제제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 투여 바이알에 봉입될 수 있다. 치료학적 개시를 위해 바람직하게는, 주사 가능한 약학적 조성물은 멸균된다.
방법은 본원에서 제공된 조작된 세포를 투여하는 단계 이전에 하나 이상의 화학 요법제를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 화학요법제는 림프고갈(전처치) 화학요법제이다. 예를 들어, T 세포 요법을 필요로 하는 환자를 조절하는 방법은 환자에게 시클로포스파미드의 특정 유용한 투여량(200 mg/m2/일 내지 2000 mg/m2/일, 약 100 mg/m2/일 내지 2000 mg/m2/일; 예를 들어, 약 100 mg/m2/일, 약 200 mg/m2/일, 약 300 mg/m2/일, 약 400 mg/m2/일, 약 500 mg/m2/일, 약 600 mg/m2/일, 약 700 mg/m2/일, 약 800 mg/m2/일, 약 900 mg/m2/일, 약 1000 mg/m2/일, 약 1500 mg/m2/일, 또는 약 2000 mg/m2/일) 및 플루다라빈의 특정 투여량(20 mg/m2/일 내지 900 mg/m2/일, 약 10 mg/m2/일 내지 약 900 mg/m2/일; 예를 들어, 약 10 mg/m2/일, 약 20 mg/m2/일, 약 30 mg/m2/일, 약 40 mg/m2/일, 약 40 mg/m2/일, 약 50 mg/m2/일, 약 60 mg/m2/일, 약 70 mg/m2/일, 약 80 mg/m2/일, 약 9020 mg/m2/일, 약 100 mg/m2/일, 약 500 mg/m2/일, 또는 약 900 mg/m2/일)을 투여하는 단계를 포함한다. 예시적인 투여 요법은, 조작된 T 세포의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계 이전에, 약 30 mg/m2/일의 플루다라빈을 투여하는 단계와 조합하거나 그 이전 또는 그 이후에, 약 300 mg/m2/일의 시클로포스파미드를 환자에게 3일 동안 매일 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 특히 본원에서 제공된 조작된 세포가 CD52의 표면 발현을 제거하거나 최소화하도록 유전자 편집된 경우, 림프구고갈은 알렘투주맙과 같은 항-CD52 항체의 투여를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, CD52 항체는 약 1 내지 20 mg/일 IV, 예를 들어, 13 mg/일 IV의 투여량으로 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 동안 또는 그 이상 투여된다.
항체는 림프구고갈 요법의 다른 요소(예를 들어, 시클로포스파미드 및/또는 플루다라빈)의 투여와 조합하거나, 그 이전 또는 그 이후에 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 항원 결합 도메인, 형질도입된(또는 달리 조작된) 세포 및 화학요법제는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기에 효과적인 양으로 각각 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에서 개시된 CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물은 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예는, 티오테파 및 시클로포스파미드(CYTOXAN??)와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸올로멜라민 계를 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 염화물, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로우레아; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신 , 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항대사물질; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-부신제; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드(예를 들어, 파클리탁셀(TAXOL??, Bristol-Myers Squibb) 및 독세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RF S2000; 디플루오로메틸오미틴(DMFO); Targretin??(벡사로텐), Panretin??, (알리트레티노인)과 같은 레티노산 유도체; ONT AK??(데닐류킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 본 정의에는, 예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LYl 17018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)을 포함하는 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 전술한 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체와 같은, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제가 포함된다. 적절한 경우, CHOP(즉, 시클로포스파미드(Cytoxan®)), 독소루비신(히드록시독소루비신), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 프레드니손을 포함하되 이에 한정되지 않는 화학요법제의 조합이 또한 투여된다.
일부 구현예에서, 화학요법제는 조작된 세포, 폴리펩티드, 또는 핵산의 투여와 동시에 투여되거나 투여 후 1주일 이내에 투여된다. 다른 구현예에서, 화학요법제는 조작된 세포, 폴리펩티드 또는 핵산의 투여 후 1 내지 7일, 1주 내지 4주, 또는 1주 내지 1개월, 1주 내지 2개월, 1주 내지 3개월, 1주 내지 6개월, 1주 내지 9개월, 또는 1주 내지 12개월에 투여된다. 다른 구현예에서, 화학요법제는 세포, 폴리펩티드 또는 핵산을 투여하기 적어도 1개월 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 2개 이상의 화학요법제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다양한 추가적인 치료제가 본원에서 기술된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 유용한 추가 치료제는 니볼루맙(Opdivo®), 펨브롤리주맙(Keytruda®), 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 및 아테졸리주맙과 같은 PD-1 억제제를 포함한다. 본 개시와 조합하여 사용하기에 적합한 추가 치료제는, 이브루티닙(Imbruvica®), 오파투무맙(Arzerra®, 리툭시맙(Rituxan®), 베바시주맙(Avastin®), 트라스투주맙(Herceptin®), 트라스투주맙 엠탄신(KADCYLA®), 이마티닙(Gleevec®), 세툭시맙(Erbitux®, 파니투무맙)(Vectibix®), 카투막소맙, 이브리투모맙, 오파투무맙, 토시투모맙, 브렌툭시맙, 알렘투주맙, 겜투주맙, 엘로티닙, 게피티닙, 반데타닙, 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, 엑시티닙, 마시티닙, 파조파닙, 수니티닙, 소라페닙, 토세라닙, 레스타우르티닙, 엑시티닙, 세디라닙, 렌티바티닙, 닌테다닙, 파조파닙, 레고라페닙, 세막사닙, 소라페닙, 수니티닙, 티보자닙, 토세라닙, 반데타닙, 엔트렉티닙, 카보잔티닙, 이마티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 포나티닙, 라도티닙, 보수티닙, 레스타우르티닙, 룩소리티닙, 파크리티닙, 코비메티닙, 셀루메티닙, 트라메티닙, 비니메티닙, 알렉티닙, 세리티닙, 크리조티닙, 애플리버셉트, 아디포티드, 데닐류킨 디프티톡스, 에베롤리무스 및 템시로리무스와 같은 mTOR 억제제, 소니데깁 및 비스모데깁과 같은 고슴도치 억제제, CDK 억제제(팔보시클립)와 같은 CDK 억제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, CAR 발현 면역 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성을 예방하거나 감소시키기 위한 치료 요법과 함께 투여될 수 있다. 사이토카인 방출 증후군(CRS) 또는 신경독성을 예방하기 위한 치료 요법은 렌질루맙, 토실리주맙, 심방 나트륨이뇨 펩티드(ANP), 아나킨라, iNOS 억제제(예를 들어, L-NIL 또는 1400W)를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, CAR-함유 면역 세포를 포함하는 조성물은 항염증제와 함께 투여될 수 있다. 항염증제 또는 약물은 스테로이드 및 글루코코르티코이드(베타메타손, 부데소니드, 덱사메타손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손, 에틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론을 포함함), 아스피린, 이부프로펜, 나프록센, 메토트렉세이트, 술파살라진, 레플루노미드, 항-TNF 약물, 시클로포스파미드 및 미코페놀레이트를 포함하는 비스테로이드성 항염증제(NSAIDS)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 NSAID는 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, Cox-2 억제제, 및 시알레이트를 포함한다. 예시적인 진통제는 프로포르시펜 염산염의 아세트아미노펜, 옥시코돈, 트라마돌을 포함한다. 예시적인 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 또는 프레드니손을 포함한다. 예시적인 생물학적 반응 조절제는 세포 표면 마커(예를 들어, CD4, CDS 등), TNF 길항제(예를 들어, 에타너셉트(ENBREL®), 아달리무맙(HUMIRA®) 및 인플릭시맙(REMICADE®))와 같은 사이토카인 억제제, 케모카인 억제제 및 접착 분자 억제제에 대해 유도되는 분자를 포함한다. 생물학적 반응 조절제는 단클론 항체뿐만 아니라 분자의 재조합 형태 또한 포함한다. 예시적인 DMARD는 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 페니실라민, 레플루노미드, 술파살라진, 히드록시클로로퀸, 금(경구(아우라노핀) 및 근육내) 및 미노시클린을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 기술된 조성물은 사이토카인과 함께 투여된다. 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인은, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로렐락신; 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자(HGF); 섬유아세포 성장 인자(FGF); 프로락틴; 태반 락토겐; 뮐러관-억제 물질; 마우스 성선 자극 호르몬-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-베타와 같은 신경 성장 인자(NGF); 혈소판 성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자 I 및 II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-알파, 베타, 및 감마와 같은 인터페론, 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-l 알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21와 같은 인터루킨(IL); TNF-알파 또는 TNF-베타와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양으로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.
키트 및 제조 물품
본 개시는 본원에 제공된 방법을 사용하여 CAR을 발현하는 면역 세포 중 어느 하나를 포함하는 키트, 및 이의 약학적 조성물을 제공한다. 키트의 일 구현예에서, 조작된 CAR 세포는 CryoStor® CS10, CryoStor® CS2 또는 CryoStor® CS5(BioLife Solutions)와 같은 적절한 배지에서 동결된다.
일부 예시적인 구현예에서, 본 개시의 키트는 림프고갈 요법 및 CAR-T 요법의 구성요소로서 대상체에게 투여하기 위한 동종이계 CAR 발현 T 세포 및 CD52 항체를 포함한다. 본 개시는 또한 본원에서 기술된 치료 조성물 또는 키트 중 어느 하나를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품의 예는 바이알(예를 들어, CAR을 발현하는 면역 세포를 포함하는 밀봉된 바이알)을 포함한다.
실시예
실시예 1: 면역 세포 전달 효율에 대한 프로세스 요인의 효과
생존 CAR 1+ 면역 세포의 백분율에 대한 MOI, 성장 배지 pH, 레트로넥틴® 농도 및 배양 용기의 효과
PBMC 채취
공여자 혈액을 채취하고 성분채집으로 그의 성분 별로 분리하였다. 그런 다음, PBMC를 GE Ficoll®-플라크(밀도 1.077 g/mL) 단계 구배에 걸쳐 농축시키고, 5% DMSO를 포함하는 완충액에 동결보존하였다.
활성화
0일차에, Ficoll® 단리된 동결 인간 PBMC를 해동하고 X-VIVOTM 15 배양 배지(Lonza Biosciences) + 10% 인간 혈청(Gemini Bio Products, Sacramento, CA)을 포함하는 세척 배지로 1회 세척하였다. 그런 다음, 세포를 5% 인간 혈청을 갖는 X-VIVOTM 15 배양 배지(Lonza Biosciences)(Gemini Bio Products, Sacramento, CA)를 포함하는 배양 배지(본원에서 성장 배지로도 지칭됨)에서 배양하고, 37°C 및 5% CO2에서 표준 가습 조직 배양 배양기에서 밤새 인큐베이션하였다. 1일차에, 세포를 세척 배지로 세척하고, 계수하고, mL 당 1.5 x 106의 세포 밀도로 배양 배지에 재현탁하고, 1:10의 부피 희석으로 T Cell TransActTM 중합체 나노매트릭스(Miltenyi Biotec)와 혼합하였다. 재조합 인간 IL-2(Miltenyi Biotec)를 100 U/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 그런 다음, T 세포를 4일차까지 표준 가습된 조직 배양 배양기에서 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
형질도입 및 증식
4일차에, 세포를 세척하고, 1 x 106/mL의 세포 밀도로 재조합 인간 IL-2(Miltenyi Biotec)를 함유하는 배양 배지에 재현탁시켰다. 아래 표 1에 기술된 시험 조건 하에서 렌티바이러스 벡터(LVV #1831P, Lentigen Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)로 CAR 1(1560 뉴클레오티드)을 암호화하는 세포로 형질도입하고, 6일차까지 표준 가습 조직 배양 배양기에서 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 6일차에, 형질도입된 세포를 배양하여 세포 집단을 증식시켰다.
시험군 | LVV (v/v)% | MOI*** | 성장배지pH | 레트로넥틴®시약농도(μg/mL) | 배양용기 |
1 | 0.25 | 7.25 | 7.4 | 45 | 백 |
2 | 10 | 290 | 7 | 45 | 백 |
3 | 5 | 145 | 7 | 22.5 | 백 |
4 | 0.25 | 7.25 | 6.6 | 22.5 | 백 |
5 | 5 | 145 | 7 | 22.5 | 백 |
6 | 5 | 145 | 7.4 | 0 | 백 |
7 | 10 | 290 | 6.6 | 0 | 백 |
8 | 0.25 | 7.25 | 6.6 | 45 | 웰 |
9 | 10 | 290 | 7.4 | 45 | 웰 |
10 | 10 | 290 | 6.6 | 45 | 웰 |
11 | 5 | 145 | 7 | 22.5 | 웰 |
12 | 10 | 290 | 7.4 | 0 | 웰 |
13 | 0.25 | 7.25 | 7.4 | 0 | 웰 |
14 | 0.25 | 7.25 | 6.6 | 0 | 웰 |
*배양 백은 MACS Cell 분화 백 -100(Miltenyi Biotec)이다.
**플레이트는 6 웰 배양 플레이트이다(Corning, Inc.)
***두 번째 컬럼에서 계산됨 LVV (v/v)%
형질도입 효율 평가
8일차 및 11일차에, 형질도입 효율 및 세포 생존율을 유세포 분석에 의해 확인하였다. 형질도입 전, 형질도입 중 또는 형질도입 후에 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란을 첨가하지 않았다. 각각의 시험 그룹에 대해, 세포 샘플을 세척하고 둘베코 인산염 완충 식염수("DPBS")에 재현탁시켰다. 각각 상이한 항체 패널을 포함하는 2개의 항체/염색 칵테일을 상업적으로 이용 가능한 항체/염색 조합을 사용하여 제조하였다.
각각의 시험 그룹 샘플로부터 약 1 x 106 개의 세포를 항체/염색 칵테일 중 하나의 분취물과 함께 FACS 튜브에 첨가하였다. 그런 다음, FACS 튜브를 25°C에서 어두운 곳에서 25+ 5분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 2회 세척하고 1% 파라포름알데히드("PFA")에 재현탁한 다음, LSRFortesa 세포 계측기(BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey)에 의해 처리하고, 생성된 데이터를 FlowJo 소프트웨어 버전 10(FlowJo, LLC., Ashland, Oregon)을 사용하여 분석하였다.
아래 표 2는 연구의 8일차 및 11일차에 각 시험 그룹에 대한 생존 CAR+ T 세포의 %를 제공한다.
시험군 | 8일차 | 11일차 |
1 | 22.6 | 42.9 |
2 | 46.7 | 73.4 |
3 | 48 | 76.4 |
4 | 10.8 | 32.7 |
5 | 42.6 | 75.8 |
6 | 56.1 | 66 |
7 | 13.4 | 25.7 |
8 | 12.7 | 21.6 |
9 | 52.7 | 69.6 |
10 | 26.2 | 43.8 |
11 | 52 | 65.6 |
12 | 53.6 | 65.3 |
13 | 14.8 | 22.7 |
14 | 10 | 18.3 |
제조 프로세스 인자들; 렌티바이러스 벡터(v/v)%, 성장 배지 pH, 레트로넥틴® 시약 농도 및 배양 용기가 형질도입 효율에 미치는 효과가 도 2에 도시되어 있다. 주 효과 및 상호작용의 유의성은 JMP®14 소프트웨어(SAS Institute, Inc., Cary, N.C.)를 사용하여 < 0.05로 설정된 확률 값(p-값) 임계값을 갖는 분산 분석(ANOVA)에 의해 결정하였다. 7.0 이상의 pH에서 세포를 형질도입하는 것은 더 낮은 pH에서 세포를 형질도입하는 것보다 더 큰 백분율의 생존 CAR+ 세포를 초래하였는데(도 2a 참조), 이는 더 낮은 백분율의 생존 CAR+ 세포를 초래하였다(도 2b 참조). 주요 효과 및 이원 상호작용에 대한 P-값을 도 2c에 나타냈다.
도 2는 놀랍게도, 레트로넥틴® 시약(Takara Bio USA)의 농도는 CAR 형질도입 효율에 상당한 효과를 미치지 않는다. 오히려, pH는 MOI 및 형질도입 용기로 시험한 모든 인자의 형질도입 효율에 가장 유의한 효과를 미치며, 이는 형질도입 효율에도 기여한다.
B. 생존 CAR-2+ 면역 세포의 백분율에 대한 성장 배지 pH 및 레트로넥틴® 농도의 효과
PBMC를 수집하고, 활성화시키고, (JMP" 14 소프트웨어, D-최적 설계를 사용하여) 상기 실시예 1A에 기술된 방법에 의해 CAR-2(약 1500 뉴클레오티드)를 형질도입하여 생존 CAR-2+ T 세포%에 대한 pH 및 레트로넥틴® 농도의 효과를 평가하였다.
형질도입 효율 평가
15일차에, 상기 실시예 1A에 기술된 바와 같이 유세포 계측법에 의해 형질도입 효율 및 세포 생존율을 확인하였다. 주 효과 및 상호작용의 유의성은 JMP 14 소프트웨어(SAS Institute, Inc., Cary, N.C.)를 사용하여 < 0.05로 설정된 확률 값(p-값) 임계값을 갖는 분산 분석(ANOVA)에 의해 결정하고 모델링하였다. 표 3에 표시된 레트로넥틴® 농도 및 배지 pH 수준에서, 레트로넥틴® 및 배지 pH가 생존 CAR+ T 세포%에 미치는 주요 효과를 평가하기 위해 48의 MOI에서 JMP® 14 ANOVA 소프트웨어를 사용하여 생존 CAR+ T 세포% 결과를 시뮬레이션하였다. 결과는 표 3의 최우측 열에 표시되어 있다.
성장 배지 pH | 레트로넥틴®시약농도(μg/cm2) | 생존CAR+ T 세포 |
7.3 | 0 | 70.8 |
7.3 | 15 | 79.8 |
6.7 | 0 | 50.1 |
6.7 | 15 | 55.5 |
표 3은 레트로넥틴® 시약을 사용하거나 사용하지 않고 pH 7.3에서 T 세포를 형질도입한 경우 레트로넥틴® 시약을 사용하거나 사용하지 않고 6.7의 낮은 pH에서 T 세포를 형질도입한 경우보다 생존 CAR+ 세포의 비율이 더 높았음을 보여준다. 놀랍게도, 레트로넥틴® 시약 농도는 CAR 형질도입 효율에 가장 큰 효과를 미치지 않는다. 형질도입 동안 매질 pH는 형질도입 효율에 가장 큰 효과를 미친다.
실시예 2: 벡터 통합 형질도입 시간 과정
0일차에, PBMC(상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 수집됨)를 2L 가스 투과성 백(XuriTM Cell bag TM, GE Lifesciences, Inc.)에서 해동시켰다. 5% 인간 혈청(Gemini Bio Products, Sacramento, CA), IL-2 및 글루타민을 추가로 포함하는 X-VIVOTM 15 배양 배지(Lonza Biosciences)에서 1.5 x 106 세포/mL의 농도로, TransActTM 중합체 나노 매트릭스(Miltenyi Biotec)를 1:10의 부피 희석으로 첨가하여 세포를 활성화시켰다. 세포를 37°C의 파동 생물반응기에서 배양하였다.
2일차에, CAR-2(1500 뉴클레오티드)를 암호화하는 1% (v/v) 렌티바이러스 벡터(LVV #1831P, Lentigen Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)를 7.2 + 0.1의 pH로 세포 배양물에 첨가하였다. 생성된 형질도입 반응 혼합물을 37°C에서 8시간 동안 배양하였다. 형질도입 동안 레트로넥틴®은 사용되지 않았다. 또한, 형질도입 전, 형질도입 동안 또는 형질도입 후에 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란을 첨가하지 않았다.
렌티바이러스 벡터를 세포에 도입한 후 1, 2, 4, 6 및 8시간차에 배양 배지로부터 세포 샘플을 취하였다. 각각의 세포 샘플을 1 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 배양 배지에서 원심분리, 세척 및 재현탁하고, G-Rex® 세포 배양 시스템(Wilson Wolf Corporation, Saint Paul, 미네소타)에서 제조자의 지침에 따라 14일 동안 40 mL의 부피로 배양하였다.
상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 유세포 계측법에 의해 7일차 및 14일차에 CAR+ 세포 백분율을 결정하였다.
결과가 도 3에 도시되어 있다. 도면에 도시된 바와 같이, CAR+ 세포%는 7일차와 비교하여 14일차의 모든 형질도입 시점에 대해 더 높다. 또한, 14일차에, CAR+ 세포%의 증가는 형질도입의 4시간 후에 느려지기 시작하고 형질도입의 6 내지 8시간에서 정체되기 시작한다.
실시예 3: 제조 규모 면역 세포 형질도입
CAR-1을 발현하는 T 세포에 대한 14회의 제조 규모 런을 수행하였다. 런 7~14는 아래에 기술된 바와 같이 수행하였다. 런 1~6은 아래에 기술된 바와 같이 수행하였는데, 단, 형질도입 단계는 7.2 미만의 pH에서 수행되었다.
PBMC 채취, 활성화 및 형질도입
PBMC(상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 채취됨)를 인간 혈청을 포함하는 배지에서 가스 투과성 백 내에서 해동하고 37°C 및 5% CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
그런 다음, PBMC를 세척하고, 5% 인간 혈청, IL-2, 글루타민, CD3 및 CD28 자극 시약을 포함하는 배지에 재현탁하고, 37°C 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
활성화된 세포를 배지로 세척하여 활성화 시약을 제거하고 배양 배지에 재현탁하였다. 배양된 배지는 5% 인간 혈청, IL-2 및 글루타민을 포함하였다. 세포를 배양 배지 내로 도입하기 전에, CO2를 배양 배지로부터 제거하여 7.2 이상의 pH를 달성하였다. 세포를 1 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 가스 투과성 백에 담긴 배양 배지의 제조 규모 부피(제조 규모 형질도입 부피)에 재현탁하였다. 렌티바이러스 벡터(LVV #1831P, Lentigen Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)로 CAR-1을 암호화하는 벡터를 10% LVV(V/V)로 세포 현탁액에 첨가하였다 생성된 형질도입 반응 혼합물을 37°C 및 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 형질도입 동안 레트로넥틴®은 사용되지 않았다. 또한, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란을 형질도입에 첨가하지 않았다.
증식
세포를 추가로 전기천공하여 표적 유전자를 파괴한 다음, 관류파 바이오리액터에서 총 1 리터의 배양 배지로 증식시켰다. 유전자 발현이 파괴된 T 세포를 선별하기 위해 18일차에 T 세포의 농축을 수행하였다.
CAR 발현 및 세포 생존율
19일차에, CAR 발현 및 세포 생존력을 상기 실시예 1A에 기술된 바와 같이 유세포 계측법으로 평가하였으며, 하기 표 4에 기술되어 있다.
배지 pH <7.1 | 배지pH >7.1 |
||
생존CAR T 세포 | 생존CAR T 세포 | ||
런# | 런# | ||
1 | 55.1 | 7 | 76.6 |
2 | 34.3 | 8 | 76.6 |
3 | 36.6 | 9 | 70.7 |
4 | 62.3 | 10 | 65.9 |
5 | 26 | 11 | 60.1 |
6 | 21.8 | 12 | 48.5 |
13 | 42.8 | ||
14 | 56.5 | ||
평균 | 39.4 | 평균 | 62.2 |
표준편차 | 16.1 | 표준편차 | 12.5 |
*표준 편차
표 4는 7.1 초과의 pH에서 형질도입된 세포가 7.1 미만의 pH에서 형질도입된 세포와 비교하여 더 높은 백분율의 생존 CAR 발현 세포를 가짐을 보여준다. 또한, 표는 7.1 초과의 pH에서 세포를 형질도입하는 것이 7.1 미만의 pH에서 형질도입된 세포와 비교하여, 생존 CAR 발현 세포의 백분율이 런마다 더 일관되게 초래되었음을 보여준다.
Claims (82)
- 레트로바이러스 벡터로 세포 집단을 형질도입하는 방법으로서, 상기 벡터는 세포에 외인성인 핵산을 포함하고, 상기 방법은:
a) 상기 세포 집단을 선택하는 단계로서, 상기 선택된 세포 집단은 T 림프구, 헬퍼 T 세포, 종양 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, 말초 혈액 림프구, 말초 혈액 단핵 세포, 수지상 세포, 또는 자연 살해 세포 또는 이들의 혼합물을 포함하고; 및
b) 시작 pH 범위가 7.0 내지 7.9인 시작 pH의 세포 배양 배지에서 상기 선택된 세포 집단을 상기 레트로바이러스와 함께 배양하고, 상기 형질도입 배양 단계의 적어도 첫 1시간 동안 상기 시작 pH를 상기 시작 pH 범위에서 유지하여 상기 외인성 핵산에 의해 암호화된 유전자 산물을 발현하는 세포를 포함하는 형질도입된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 시작 pH는 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 내지 약 168시간 이하 동안 상기 시작 pH 범위 내에 유지되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시작 pH는 상기 형질도입 배양 단계의 종료까지 약 7.0 초과로 유지되는, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계는 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 동안 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 공동 국소화 제제를 포함하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체를 포함하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 세포 집단은 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 내지 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225 또는 약 250의 MOI로 배양하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화하는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 세포 집단은 용기에서 배양되고, 여기서 상기 용기는 세포 배양 플레이트, 세포 배양 딥 웰 플레이트, 세포 스택, 조절된 바이오리액터, 진탕 플라스크 또는 가스 투과성 백인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계는 상기 선택된 세포 집단 및 상기 레트로바이러스 벡터를 약 0.5 리터 부피 내지 약 10 리터 부피의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계의 개시 후 약 3 내지 약 18일차에, 상기 형질도입된 세포 집단의 적어도 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 또는 약 70% 내지 약 95%가 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계의 개시 후 약 7 내지 약 18일차에, 상기 형질도입된 세포 집단의 적어도 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 또는 약 70% 내지 약 95%가 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작 pH 범위는 수동적으로 유지되는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작 pH 범위는 능동적으로 유지되는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 세포 집단은 동종이계 세포 집단인, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 세포 집단은 자가 세포 집단인, 방법.
- 제1 및 제2 세포 집단을 형질도입하는 방법으로서, 상기 제1 및 제2 세포 집단은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 동일한 방법에 의해 형질도입되고, 여기서 제1 및 제2 형질도입된 세포 집단에서 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는 상기 형질도입된 세포 집단의 백분율이 약 2% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 20% 내지 약 30%를 초과하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 양이온은 상기 세포 배양 배지에 첨가되지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란은 상기 배양 배지에 첨가되지 않는, 방법.
- 레트로바이러스 벡터로 세포독성 T 세포 집단을 형질도입하는 방법으로서, 상기 벡터는 상기 세포독성 T 세포에 대해 외인성인 핵산을 포함하고, 상기 방법은: 시작 pH 범위 7.0 내지 7.9의 시작 pH에서 상기 레트로바이러스 벡터로 상기 세포독성 T 세포 집단을 배양하는 단계; 및 상기 형질도입 배양 단계의 적어도 첫 1시간 동안 상기 시작 pH 범위에서 상기 시작 pH를 유지하여 상기 외인성 핵산에 의해 암호화된 상기 유전자 산물을 발현하는 세포를 포함하는 형질도입된 세포독성 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 세포 배양 배지는 공동 국소화 제제를 포함하지 않는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 시작 pH는 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위에서 적어도 약 1, 약 2, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 내지 약 168시간 이하로 유지되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 시작 pH는 상기 형질도입 배양 단계의 종료까지 상기 시작 pH 범위에서 유지되는, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계는 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 동안 수행되는, 방법.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공동 국소화 제제는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체인, 방법.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 T 세포 집단은 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 내지 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225 또는 약 250의 MOI로 배양하는, 방법.
- 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화하는, 방법.
- 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 T 세포 집단은 용기에서 배양되고, 여기서 상기 용기는 세포 배양 플레이트, 세포 배양 딥 웰 플레이트, 세포 스택, 조절된 바이오리액터, 진탕 플라스크 또는 가스 투과성 백인, 방법.
- 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
- 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계는 상기 세포독성 T 세포 집단 및 상기 레트로바이러스 벡터를 약 0.5 리터 부피 내지 약 10 리터 부피의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계의 개시 후 3 내지 18일차에 형질도입된 상기 세포독성 T 세포 집단의 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 또는 약 70% 내지 약 95%가 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는, 방법.
- 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계의 개시 후 7 내지 18일차에 상기 형질도입된 세포독성 T 세포 집단의 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 또는 약 70% 내지 약 95%가 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는, 방법.
- 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작 pH 범위는 수동적으로 유지되는, 방법.
- 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작 pH 범위는 능동적으로 유지되는, 방법.
- 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 T 세포 집단은 동종이계 세포독성 T 세포 집단인, 방법.
- 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 T 세포 집단은 자가 세포독성 T 세포 집단인, 방법.
- 제1 및 제2 세포독성 T 세포 집단을 형질도입하는 방법으로서, 상기 제1 및 제2 세포독성 T세포 집단은 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항의 동일한 상기 방법에 의해 형질도입되고, 여기서 상기 제1 및 제2 형질도입된 세포독성 T세포 집단에서 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는 상기 형질도입된 세포독성 T세포 집단의 백분율이 약 2% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 20% 내지 약 30%를 초과하지 않는, 방법.
- 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 양이온은 상기 세포 배양 배지에 첨가되지 않는, 방법.
- 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란은 상기 배양 배지에 첨가되지 않는, 방법.
- 레트로바이러스 벡터로 말초 혈액 단핵 세포 집단을 형질도입하는 방법으로서, 상기 벡터는 상기 말초 혈액 단핵 세포에 외인성인 핵산을 포함하고, 상기 방법은: 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위 시작 pH에서 상기 레트로바이러스 벡터로 상기 말초 혈액 단핵 세포 집단을 배양하는 단계; 및 상기 형질도입 배양 단계의 적어도 첫 1시간 동안 상기 시작 pH 범위에서 상기 시작 pH를 유지하여, 상기 외인성 핵산에 의해 암호화된 상기 유전자 산물을 발현하는 세포를 포함하는 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포 배양 배지는 공동 국소화 제제를 포함하지 않는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 시작 pH는 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위에서 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 내지 약 168시간 이하로 유지되는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 시작 pH는 상기 형질도입 배양 단계의 종료까지 상기 시작 pH 범위에서 유지되는, 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계는 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 동안 수행되는, 방법.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공동 국소화 제제는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체인, 방법.
- 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포 집단은 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 내지 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225,또는 약 250의 MOI로 배양하는, 방법.
- 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화하는, 방법.
- 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포 집단은 용기에서 배양되고, 여기서 상기 용기는 세포 배양 플레이트, 세포 배양 딥 웰 플레이트, 세포 스택, 조절된 바이오리액터, 진탕 플라스크 또는 가스 투과성 백인, 방법.
- 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
- 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계는 상기 말초 혈액 단핵 세포 집단 및 상기 레트로바이러스 벡터를 약 0.5 리터 부피 내지 약 10 리터의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계의 개시 후 3 내지 18일차에 상기 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단의 적어도 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 및 약 70% 내지 약 95%가 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는, 방법.
- 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계의 개시 후 7 내지 18일차에 상기 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단의 적어도 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 및 약 70% 내지 약 95%가 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는, 방법.
- 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작 pH 범위는 수동적으로 유지되는, 방법.
- 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작 pH 범위는 능동적으로 유지되는, 방법.
- 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포 집단은 동종이계 말초 혈액 단핵 세포 집단인, 방법.
- 제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵 세포 집단은 자가 말초 혈액 단핵 세포 집단인, 방법.
- 제1 및 제2 말초 혈액 단핵 세포 집단을 형질도입하는 방법으로서, 상기 제1 및 제2 말초 혈액 단핵 세포 집단은 제40항 내지 제55항 중 어느 한 항의 동일한 방법에 의해 형질도입되고, 여기서 상기 제1 및 제2 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단에서 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는 상기 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 집단의 백분율이 약 2% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 20% 내지 약 30%를 초과하지 않는, 방법.
- 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 양이온은 상기 세포 배양 배지에 첨가되지 않는, 방법.
- 제40항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란은 상기 배양 배지에 첨가되지 않는, 방법.
- 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 T 세포 집단을 레트로바이러스 벡터로 형질도입하는 방법에서, 상기 벡터는 상기 유래된 T 세포에 외인성인 핵산을 포함하고, 상기 방법은: 시작 pH 범위 7.0 내지 7.9의 시작 pH에서 유래된 상기 T 세포 집단을 상기 레트로바이러스 벡터와 함께 배양하는 단계; 및 상기 형질도입 배양 단계의 적어도 첫 1시간 동안 상기 시작 pH 범위에서 상기 시작 pH를 유지하여 상기 외인성 핵산에 의해 암호화된 상기 유전자 산물을 발현하는 세포를 포함하는 형질도입된 유래된 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 세포 배양 배지는 공동 국소화 제제를 포함하지 않는, 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 시작 pH는 7.0 내지 7.9의 시작 pH 범위에서 적어도 약 1, 약 2, 약 6, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 내지 약 168시간 이하로 유지되는, 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 시작 pH는 상기 형질도입 배양 단계의 종료까지 상기 시작 pH 범위에서 유지되는, 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계는 적어도 약 1, 약 2, 약 4, 약 6, 약 8, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 약 36, 약 48, 약 72 또는 약 96시간 동안 수행되는, 방법.
- 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공동 국소화 제제는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유도체인, 방법.
- 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유래된 T 세포 집단은 약 0.25, 약 0.5, 약 1, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 내지 약 55, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 약 200, 약 225 또는 약 250의 MOI로 배양하는, 방법.
- 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화하는, 방법.
- 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유래된 T 세포 집단은 용기에서 배양되고, 용기는 세포 배양 플레이트, 세포 배양 딥 웰 플레이트, 세포 스택, 조절된 바이오리액터, 진탕 플라스크 또는 가스 투과성 백인, 방법.
- 제59항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
- 제59항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계는 유래된 T 세포 집단 및 레트로바이러스 벡터를 약 0.5 리터 부피 내지 약 10 리터 부피의 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제59항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계 개시 후 3 내지 18일차에 형질도입된 유래 T 세포 집단의 적어도 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 및 약 70% 내지 약 95%가 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는, 방법.
- 제59항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 배양 단계 개시 후 7 내지 18일차에 형질도입된 유래 T 세포 집단의 적어도 약 35% 내지 약 95%, 약 40% 내지 약 95%, 약 50% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 95%, 및 약 70% 내지 약 95%가 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는, 방법.
- 제59항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작 pH 범위는 수동적으로 유지되는, 방법.
- 제59항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시작 pH 범위는 능동적으로 유지되는, 방법.
- 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유래된 T 세포 집단은 동종이계 유래된 T 세포 집단인, 방법.
- 제59항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유래된 T 세포 집단은 자가 유래된 T 세포 집단인, 방법.
- 제1 및 제2 유래 T 세포 집단을 형질도입하는 방법으로서, 상기 제1 및 제2 유래 T 세포 집단은 제59항 내지 제74항 중 어느 한 항의 동일한 방법에 의해 형질도입되고, 여기서 상기 제1 및 제2 형질도입된 유래 T 세포 집단에서 상기 외인성 핵산 유전자 산물을 발현하는 상기 형질도입된 T 세포 집단의 백분율은 2% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20% 또는 20% 내지 30%를 초과하지 않는, 방법.
- 제59항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 양이온은 상기 세포 배양 배지에 첨가되지 않는, 방법.
- 제59항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리브렌, 프로타민 설페이트 또는 DEAE-덱스트란은 상기 배양 배지에 첨가되지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 세포.
- 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 유전적으로 변형된 세포 집단.
- 제78항 또는 제79항의 상기 세포 또는 상기 세포 집단을 포함하는 치료 조성물.
- 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포를 치료적 유효량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 제80항에 따른 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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