JP2023530255A - 末梢神経再生を促進するためのｃｘｃｌ１３結合分子の使用 - Google Patents

Abstract

加齢依存性の神経再生能衰退を経験している対象において、末梢神経損傷後の感覚ニューロンの軸索再生およびニューロンの機能的回復を促進する方法を、本明細書において提供する。本方法は、それを必要とする対象へ、CXCL13と特異的に結合する有効量の単離された結合分子を投与する工程を含む。TIFF2023530255000006.tif139170

Description

背景
老齢人口の拡大に伴い、神経系の軸索損傷の発生が増加している（DeVivo,M.J.,and Chen,Y.(2011).Archives of Physical Medicine and Rehabilitation 92,332-338（非特許文献1）；Singh et al.,(2014).Clinical Epidemiology 6,309（非特許文献2））。残念ながら、軸索再生能および修復過程は、加齢と共に衰退するため、機能的回復が弱まり、長期的な能力障害が増加する（Nagano,A.(1998).Journal of Orthopaedic Science 3,71-80（非特許文献3）；Pestronk et al.,(1980).Experimental Neurology 70,65-82（非特許文献4）；Tanaka and deF.Webster,(1991).Journal of Comparative Neurology 308,180-187（非特許文献5）；Vaughan,1992.Journal of Comparative Neurology,323,219-237（非特許文献6）；Verdu et al.,(2000).Journal of the Peripheral Nervous System 5,191-208（非特許文献7））。

この加齢依存性の再生能衰退の細胞的および分子的な機序に関する理解は、極めて乏しい。シュワン細胞（SC）の脱分化および活性化の、加齢に関連した障害が、損傷を負った末梢神経系（PNS）の軸索再成長を制限して、感覚および運動の回復を損なうことを、研究は示している（Kang and Lichtman,(2013).Journal of Neuroscience 33,19480-19491（非特許文献8）；Painter et al.,(2014).Neuron 83,331-343（非特許文献9））。中枢神経系においては、脊髄損傷後、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（phosphatase and tensine homolog）（PTEN）の欠失と、それに伴うmTORシグナル伝達の増加が、皮質脊髄路の加齢依存性軸索再生能減衰を部分的にのみ制限する（Geoffroy et al.,(2016).Cell Reports 15,238-246（非特許文献10））。これらの研究は、損傷後の加齢依存性の分子的変化を支える分子機序の一部を解明したが、加齢は、それ自体、全ての組織において細胞シグナル伝達、代謝、免疫、遺伝子制御、およびタンパク質翻訳の著しい修飾をもたらして、ホメオスタシスに影響を与え、疾患の素因を与える（Barzilai et al.,(2012).Diabetes 61,1315-1322（非特許文献11）；Lardenoije et al.,(2015).Progress in Neurobiology 131,21-64（非特許文献12）；Pomatto and Davies,(2017).The Journal of Physiology 595,7275-7309（非特許文献13）；Taylor and Dillin,(2011).Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 3,a004440（非特許文献14）；Weiskopf et al.,(2009).Transplant International 22,1041-1050（非特許文献15））。

従って、ニューロンにおける加齢依存的な制御を駆動する因子、および軸索再生の調節におけるそれらの因子の役割を決定して、末梢神経系損傷の処置のため、そのような因子を標的とする治療を開発することができるようにする必要がある。

分野
本発明は、加齢依存性の再生能衰退を有する対象における末梢神経再生の促進のための、CXCL13を中和する結合分子、例えば、抗体およびその抗原結合性断片の使用に関する。

DeVivo,M.J.,and Chen,Y.(2011).Archives of Physical Medicine and Rehabilitation 92,332-338 Singh et al.,(2014).Clinical Epidemiology 6,309 Nagano,A.(1998).Journal of Orthopaedic Science 3,71-80 Pestronk et al.,(1980).Experimental Neurology 70,65-82 Tanaka and deF.Webster,(1991).Journal of Comparative Neurology 308,180-187 Vaughan,1992.Journal of Comparative Neurology,323,219-237 Verdu et al.,(2000).Journal of the Peripheral Nervous System 5,191-208 Kang and Lichtman,(2013).Journal of Neuroscience 33,19480-19491 Painter et al.,(2014).Neuron 83,331-343 Geoffroy et al.,(2016).Cell Reports 15,238-246 Barzilai et al.,(2012).Diabetes 61,1315-1322 Lardenoije et al.,(2015).Progress in Neurobiology 131,21-64 Pomatto and Davies,(2017).The Journal of Physiology 595,7275-7309 Taylor and Dillin,(2011).Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 3,a004440 Weiskopf et al.,(2009).Transplant International 22,1041-1050

開示の概要
加齢依存性の再生能衰退を有する対象において末梢神経再生を促進するためにCXCL13結合分子を使用する方法が、本明細書に開示される。本明細書において例示される開示の局面によると、CXCL13と特異的に結合し、CXCL13の効果を阻害し、抑制し、防止し、逆転させ、または減速させる、有効量の単離された結合分子を、対象へ投与する工程を含む、末梢神経損傷および加齢依存性の再生能衰退を有する対象における末梢神経再生を改善する方法が、提供される。

CXCL13と特異的に結合する有効量の抗体またはその抗原結合性断片を対象へ投与する工程を含む、加齢依存性の再生能衰退を有する対象における損傷を負った末梢神経の神経再生を促進する方法が、提供される。本法のある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片は、CXCL13活性を阻害する。本法のある特定の態様において、阻害されるCXCL13活性は、損傷を負った末梢神経の後根神経節（DRG）へのCXCR5+CD8+T細胞の動員である。本法のある特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合性断片は、CXCL13とその受容体との相互作用を阻害する。本法のある特定の態様において、CXCL13受容体はCXCR5である。本法のある特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合性断片は、Mab 5378、MAb 5261、MAb5080、MAb 1476、3D2、3C9、MAb 5091、MAb 1758、またはMAb 0745からなる群より選択される基準モノクローナル抗体のCXCL13との特異的結合を競合的に阻害する。前述の方法のいずれか1つのある特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合性断片は、Mab 5378、MAb 5261、MAb 5080、MAb 1476、3D2、3C9、MAb 5091、MAb 1758、またはMAb 0745からなる群より選択される基準モノクローナル抗体と同じCXCL13エピトープと特異的に結合する。本法のある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片は、（A）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:26、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；（B）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:27、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；（C）それぞれSEQ ID NO:19、22、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:28、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；または（D）それぞれSEQ ID NO:20、23、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:29、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVLを含む。ある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片のVHおよびVLは、（i）それぞれSEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7；（ii）それぞれSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9；（iii）それぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11；（iv）それぞれSEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:12；（v）それぞれSEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15；ならびに（vi）それぞれSEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17からなる群より選択されるVHおよびVLの配列と同一のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様において、単離された結合分子は、MAb 5261、MAb 5091、またはMAb 1476、MAb 1758である。前述の方法のいずれか1つのある特定の態様において、損傷を負った末梢神経は、坐骨神経、腓骨神経、脊髄副神経、および腕神経叢からなる群より選択される。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、本法は、損傷を負った神経の完全もしくは部分的な再生、表皮組織の神経再支配、または損傷を負った神経の神経学的機能の完全もしくは部分的な回復、またはそれらの組み合わせをもたらす。

CXCL13と特異的に結合する有効量の単離された抗体またはその抗原結合性断片を対象へ投与する工程を含む、加齢依存性の再生能衰退および末梢神経損傷を有する対象における末梢神経損傷の処置の方法が提供される。本法のある態様において、末梢神経損傷は、末梢神経の圧迫、伸展、または切断の結果である。本法のある特定の態様において、末梢神経損傷は、坐骨神経、腕神経叢、腓骨神経、または脊髄副神経の損傷である。方法のある特定の態様において、末梢神経損傷は坐骨神経損傷である。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片は、CXCL13とその受容体との相互作用を阻害する。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、受容体はCXCR5である。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片は、（A）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:26、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；（B）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:27、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；（C）それぞれSEQ ID NO:19、22、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:28、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；または（D）それぞれSEQ ID NO:20、23、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:29、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVLを含む。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片のVHおよびVLは、（i）それぞれSEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7；（ii）それぞれSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9；（iii）それぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11；（iv）それぞれSEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:12；（v）それぞれSEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15；ならびに（vi）それぞれSEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17からなる群より選択されるVHおよびVLの配列と同一のアミノ酸配列を含む。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、単離された結合分子は、Mab 5378、MAb 5261、MAb5080、MAb1476、MAb 5091、MAb 1758、3D2、および3C9からなる群より選択される基準モノクローナル抗体のCXCL13との特異的結合を競合的に阻害するヒト抗体またはヒト化抗体である。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、単離された結合分子は、MAb 5261、MAb 5091、MAb 1476、またはMAb 1758である。

CXCL13と特異的に結合する有効量の単離された抗体またはその抗原結合性断片を対象へ投与する工程を含む、それを必要とする対象における加齢依存性の再生能衰退を逆転させる方法が提供される。本法のある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片は、CXCL13とその受容体との相互作用を阻害する。本法のある特定の態様において、受容体はCXR5である。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合性断片は、Mab 5378、MAb 5261、MAb5080、MAb1476、MAb 5091、MAb 1748、3D2、および3C9からなる群より選択される基準モノクローナル抗体のCXCL13との特異的結合を競合的に阻害する。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片は、（A）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:26、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；（B）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:27、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；（C）それぞれSEQ ID NO:19、22、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:28、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；または（D）それぞれSEQ ID NO:20、23、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:29、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVLを含む。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、該抗体またはその抗原結合性断片のVHおよびVLは、（i）それぞれSEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7；（ii）それぞれSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9；（iii）それぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11；（iv）それぞれSEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:12；（v）それぞれSEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15；ならびに（vi）それぞれSEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17からなる群より選択されるVHおよびVLの配列と同一のアミノ酸配列を含む。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、単離された結合分子は、MAb 5261、MAb 5091、MAb 1476、またはMAb 1758である。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、対象は末梢神経損傷を有する。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、末梢損傷は、坐骨神経損傷、腕神経叢損傷、脊髄副神経損傷、または腓骨神経損傷である。前述の方法のいずれかのある特定の態様において、末梢神経損傷は坐骨神経損傷である。

図1A～Eは、加齢が、坐骨神経損傷前後の後根神経節（DRG）におけるケモカイン/サイトカインおよび適応免疫のエンリッチメントを誘導することを示す。図1Aは、坐骨神経損傷（SNI）若齢マウス、SNI老齢マウスからのタンパク質-タンパク質ネットワークにおいて、シャム若齢マウスと比べてディファレンシャルに発現された（DE）サイトカインの倍率変化（fold change）を示すヒートマップである。図1Bは、坐骨挫滅損傷の3日後の若齢マウスおよび老齢マウスの坐骨神経の縦切片のSCG10免疫染色である。図1Cは、若齢マウスおよび老齢マウスからの近位挫滅部位に対して正規化されたSCG10強度を示す（N＝5、事後シダック検定による二元配置分散分析、^**P＜0.01；^****P＜0.0001）。図1D、シャム若齢と比較された正規化された蛍光強度の倍率変化によって示されたCXCL13発現の定量化（N＝4、事後チューキー検定による一元配置分散分析、^****P＜0.0001）。図1E、坐骨DRGからのCXCL13 ELISA（N＝3、事後チューキー検定による一元配置分散分析、^****P＜0.0001）。 図2A～Dは、CXCL13が、老齢後根神経節（DRG）において増強されるCXCR5+CD8 T細胞の走化性因子であることを示す。図2A：坐骨DRGにおけるカウントビーズに対して正規化されたCXCR5+CD8+T細胞数の定量化（N＝3、対応のないスチューデントt検定、^*P＜0.05）。 図2B：坐骨DRGにおける全T細胞に対するCXCR5+CD8+Tの百分率（N＝3、対応のないスチューデントt検定、^*P＜0.05）。 図2C：坐骨神経損傷の3日後の若齢および老齢のDRGにおけるCXCR5+CD8+T細胞数の定量化（N＝4、対応のないスチューデントt検定、^****P＜0.0001）。 図2D：神経損傷の3日後のCXCR5およびCD8について免疫染色された若齢および老齢のDRG切片からの全CD8 T細胞に対するCXCR5+CD8+T細胞の百分率（N＝3、対応のないスチューデントt検定、^***P＜0.001）。 図3A～Cは、CD8 T細胞が老齢坐骨神経の軸索再生を妨げることを証明する。図3A：対照IgGまたは抗CD8モノクローナル抗体の後の、挫滅損傷の3日後の老化マウスの坐骨神経の縦切片のSCG10免疫染色。破線は近位挫滅部位を示す。スケールバー：500μm。図3B：対照IgG（N＝6）または抗CD8（N＝6）モノクローナル抗体によって処置された老齢マウスにおける近位挫滅部位に対して正規化されたSCG10強度（事後シダック検定による二元配置分散分析、^*P＜0.05、^***P＜0.001）。図3C、対照IgGまたは抗CD8モノクローナル抗体の後の、坐骨神経損傷の3日後の坐骨DRG切片におけるCD8 T細胞の数の定量化（N＝3、対応のないスチューデントt検定を使用、^****P＜0.0001）。 図4A～Gは、MHC-1発現が、老齢DRGにおいて誘導されること、そして坐骨神経損傷後のマウスにおける変性衰退に必要とされることを証明する。図4A：若齢または老齢のマウスに由来する坐骨神経損傷の前または3日後の坐骨DRGにおけるMHC-IおよびTuj1についての共免疫染色ならびにDAPI。MHC-Iの正規化された蛍光強度の倍率変化（N＝3、事後チューキー検定による一元配置分散分析、^*P＜0.05）。図4B：若齢または老齢のマウスに由来する坐骨DRGにおける細胞表面MHC-I発現を示す抗原提示（AP）DRGニューロンの百分率（N＝3、事後チューキー検定による一元配置分散分析、^****P＜0.0001）。図4C：AAVウイルス粒子によって送達されるルシフェラーゼレポーターを含む二重ベクタードキシサイクリン誘導性免疫回避GAr系の線形図。図4D：実験スキーム。図4E：老齢マウスにおける、AAV-rtTAまたはAAV-Gar-rtTの感染後の、坐骨神経損傷の3日後の、DRG切片におけるMHC-Iおよび切断型カスパーゼ3の正規化された蛍光強度の変化（N＝6、事後シダック検定による二元配置分散分析、^****P＜0.0001）。図4F：AAV-rtTAまたはAAV-GAr-rtTAを感染させた老齢マウスにおける近位挫滅部位に対して正規化されたSCG10強度（N＝6、事後シダック検定による二元配置分散分析、^***P＜0.001、^****P＜0.0001）。図4G：SCG10強度が近位損傷部位と比較して50％に低下する挫滅部位からの距離によって示される再生指数（N＝5、対応のないスチューデントt検定を使用、^**P＜0.01）。 図5A～L：CXCL13の中和の効果を証明する。図5A：坐骨神経挫滅後の抗CXCL13抗体の慢性投与による感覚機能査定の手法の概要。図5B：若齢マウスおよび老齢マウスにおける坐骨神経損傷（SNI）の3日後の対照IgGまたは抗CXCL13モノクローナル抗体からの縦坐骨神経切片のSCG10免疫染色。破線は近位損傷部位を示す。スケールバー：100μm。図5C：IgGまたは抗CXCL13モノクローナル抗体によって処置された若齢または老齢のマウスからの近位挫滅部位に対して正規化されたSCG10強度（N＝6、事後シダック検定による二元配置分散分析、^*P（ボールド）＜0.05、^**P（ボールド）＜0.01、IgG-Y対IgG-O；^*P（黒）＜0.05、^**P（黒）＜0.01、抗CXCL13-Y対IgG-O；^*P（灰色）＜0.05、抗CXCL13-O対IgG-O）。図5D：老齢マウスにおける坐骨神経損傷の3日後のDRGに由来するCXCR5+B細胞、CD8+T細胞、およびCD4+T細胞の数のFACS定量化（N＝3、事後シダック検定による二元配置分散分析、^**P＜0.01、^***P＜0.001、^****P＜0.0001）。図5E：片側坐骨神経挫滅後のフォンフライフィラメントによる刺激後の後肢の肢退避閾値（paw withdrawal threshold）の測定による機械感受性（N（IgG-Y）＝10、N（抗CXCL13-Y）＝10、N（IgG-O）＝11、N（抗CXCL13-O）＝10；事後シダック検定による二元配置分散分析、^**P＜0.01、^****P＜0.0001、IgG-Y対IgG-O；$P＜0.05、$$$$$P＜0.0001、抗CXCL13-Y対IgG-O；##P＜0.01、####P＜0.0001、抗CXCL13-O対IgG-O）。図5F：ハーグレイブス（Hargreaves）試験による熱感受性分析は、片側坐骨神経挫滅後の後肢の肢退避潜時を測定する（N＝10、事後シダック検定による二元配置分散分析、^***P＜0.001、^****P＜0.0001、IgG-Y対IgG-O；$P＜0.05、$$$$$P＜0.0001、抗CXCL13-Y対IgG-O；####P＜0.0001、抗CXCL13-O対IgG-O）。図5G：対照IgGまたは抗CXCL13抗体によって処置された老齢マウスにおける片側坐骨神経挫滅後の後肢に貼られた粘着テープに触れるまでの潜時によって測定された感覚反応（N＝10、事後シダック検定による二元配置分散分析、^**P＜0.01）。図5H：対照IgGまたは抗CXCL13抗体によって処置された老齢マウスにおける片側坐骨神経挫滅後の後肢に貼られた粘着テープを除去するまでの潜時によって測定された感覚反応（N＝10、事後シダック検定による二元配置分散分析、^**P＜0.01）。図5I：対照IgGまたは抗CXCL13抗体によって処置された老齢マウスにおける片側坐骨神経挫滅後の後肢に貼られた粘着テープに触れるまでの潜時によって測定された感覚反応（N＝10、事後シダック検定による二元配置分散分析、^**＜0.01）。図5J：対照IgGまたは抗CXCL13抗体によって処置された老齢マウスにおける片側坐骨神経挫後の後肢に貼られた粘着テープを除去するまでの潜時によって測定された感覚反応（N＝10、事後シダック検査による二元配置分散分析、^**＜0.01）。図5K：DAPIによって対比染色されたPGP9.5免疫染色は、坐骨神経挫滅の18日後の後肢指間皮膚の表皮神経支配を示す。破線は表皮と真皮の境界を示す。スケールバー：500μm。図5L：IgGまたは抗CXCL13抗体の後の、指間皮膚1mm当たりの表皮内神経線維（IENF）の数の定量化（N＝6、事後チューキー検定による一元配置分散分析、^*P＜0.5、^**P＜0.01、^****P＜0.0001）。 図5-1の説明を参照のこと。

詳細な説明
I.定義
「a」または「an」という用語が付いた実体は、その実体の1つまたは複数をさし；例えば、「抗CXCL13抗体（an anti-CXCL13 antibody）」は、1つまたは複数の抗CXCL13抗体を表すと理解される。従って、「a」（または「an」）、「1つまたは複数」、および「少なくとも1つ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され得る。さらに、「および/または」は、本明細書において使用される場合、他のものを含むか、または含まない、2つの指定された特色または成分の各々の具体的な開示として解釈されるべきである。従って、本明細書において「Aおよび/またはB」などの語句において使用される「および/または」という用語は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」（単独）、および「B」（単独）を含むものとする。同様に、「A、B、および/またはC」などの語句において使用される「および/または」という用語は、以下の態様の各々を包含するものとする：A、B、およびC；A、B、またはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（単独）；B（単独）；ならびにC（単独）。

「神経再生」という用語は、神経の組織、細胞、または細胞産物の再成長または修復をさす。そのような機序は、新しいニューロン、膠、軸索、髄鞘、またはシナプスの生成を含み得る。神経再生は、関与する機能的機序によって、特に、修復の程度および速度に関して、末梢神経系（PNS）と中枢神経系（CNS）とで異なる。末梢再生において起こる過程は、ウォラー変性、軸索再生/成長、および神経再支配という主要な事象に分けられ得る。軸索が傷害された時、遠位セグメントは、ウォラー変性を受けて、髄鞘を失う。近位セグメントは、アポトーシスによって死滅するか、または修復の試みである、染色質溶解反応、即ち、神経細胞の（染色質などの）色素親和性材料の溶解および分解を受けるかのいずれかであり得る。末梢再生において起こる事象は、神経損傷の軸に関して起こる。近位断端とは、ニューロン細胞体にまだ付着している、損傷を負ったニューロンの端をさし、再生する部分である。遠位断端とは、軸索の端にまだ付着している、損傷を負ったニューロンの端をさし、変性するが、その区域に残るニューロンの部分であり、そこに向かって再生軸索が成長する。

本明細書において使用されるように、「末梢神経」という用語は、脊髄から分岐し、身体の全ての部分に拡がるいくつかの神経のうちの1つをさす。中枢神経系とは異なり、末梢神経系の神経再生は、より一般的である。

本明細書において使用されるように、「末梢神経損傷」という用語は、脳および脊髄（中枢神経系）をヒトの身体全体に接続する、末梢神経系の43対の運動神経および感覚神経のうちの1つまたは複数に対する損傷をさす。末梢神経の損傷は、一般的に、断裂（神経組織の切断または***）：重度打撲（挫傷）；手術中の周辺組織に対する損傷；伸展（牽引）；薬物注射による損傷；および電気的損傷によって引き起こされる。末梢神経損傷の症状は、傷害された神経のタイプ（運動、感覚、または自律）によって異なる。運動神経は、意識的に調節される全ての筋肉の運動を支配し、例えば、歩行、物の把持、または発話のために使用される。感覚神経は、切傷からの軽い触覚、温度感覚、または痛覚などの情報を伝達する。自律神経は、呼吸、食物の消化、ならびに心臓および腺の機能などの、動物が意識的に調節しない活動を制御するため、器官を支配する。末梢神経は、感覚、運動、および運動協調の機能を支配する。それらは脆弱であり、容易に傷害され得る。一般的な末梢神経損傷の非限定的な例には、腕神経叢、坐骨神経、腓骨神経、および脊髄副神経の損傷が含まれる。

「坐骨神経」という用語は、仙骨神経叢の下部から始まり、股関節を通って下肢を下行する、ヒトおよびその他の脊椎動物の主要な末梢神経をさす。坐骨（sciatic）神経は、坐骨（ischiatic）神経とも呼ばれる。それは、ヒトの身体の中で最も長く最も広い単一の神経であり、脚の上部から足まで後側を走っている。

「坐骨神経損傷」という用語は、神経に対する外傷（例えば、圧迫、伸展、または切断）による損傷を含む、坐骨神経の傷害をさす。このタイプの損傷は、ある程度の筋力の喪失および感覚の改変を引き起こし得る。坐骨神経損傷の原因は、脊髄性または非脊髄性または医原性でもあり得、（変性骨障害、外傷、炎症性疾患による）脊柱管狭窄；脊椎すべり症；脊柱管の成長（例えば、膿瘍）；神経を圧迫するか、もしくは傷害する非脊髄性の原因、例えば、梨状筋症候群、妊娠、腰髄神経根障害、脚の外傷、骨盤神経もしくは坐骨神経の腫瘍によるもの、または健康診断、手技、もしくは処置によって引き起こされるものを含むが、これらに限定されるわけではない。

「脊髄副神経損傷」という用語は、脳に起因する12の脳神経の11番目である脊髄副神経に対する傷害をさす。脊髄副神経は、頸部の2組の筋肉（頭部を傾けたり回転させたりすることを可能にする胸鎖乳突筋、およびいくつかの動き、例えば、肩をすくめたり肩甲骨を動かすことを可能にする僧帽筋）を機能させる。脊髄副神経は、外傷によって傷害されることもあるし、または手術中に外科医が頸部のリンパ節もしくは頸静脈を手術する時に傷害されることもある。症状は、肩の疼痛、肩甲骨の外向きの「翼状化」、および僧帽筋の衰弱または萎縮である。

「腕神経叢損傷」という用語は、脊髄から肩、腕、および手にシグナルを送る神経のネットワークである腕神経叢の損傷をさす。腕神経叢損傷は、これらの神経が、伸展された時、圧迫された時、または最も深刻な場合、脊髄から引き裂かれるか、もしくは引き離された時に起こる。より重度の損傷の症状には、手、腕、または肩のある特定の筋肉の衰弱または使用不能、肩および手を含む腕の運動および感覚の完全な欠如、ならびに重度の疼痛が含まれ得る。腕神経叢損傷の一般的な原因には、コンタクトスポーツによる損傷、難産、外傷、および腫瘍、ならびに/または化学療法が含まれる。

「腓骨神経」という用語は、坐骨神経から分岐し、脚の前面および側面ならびに足の上部に感覚を与える一般的な腓骨神経をさす。この神経は、足首およびつま先を上方に持ち上げる脚の筋肉も支配する。腓骨神経の損傷は、痺れ、刺痛、疼痛、衰弱、および下垂足と呼ばれる歩行異常を引き起こし得る。腓骨神経は、膝関節脱臼、膝または脚の骨折、膝または股関節の置換術、脚の腓骨神経の圧迫、および神経鞘腫瘍または神経嚢胞による腓骨神経の圧迫を含む、外傷および神経圧迫によって損傷を負い得る。

本明細書において使用されるように、「後根神経節」（DRG）という用語は、一次体性感覚ニューロンの細胞体を表す脊髄神経の後根の肥大をさす。DRGは、感覚機能を担い；末梢神経系から中枢神経系（脊髄、脳）へ神経シグナルを伝達する。DRG自体は、脊髄神経細胞を含有する結節である。一次ニューロンとして公知の感覚ニューロンの細胞体が、後根神経節に位置している。

「治療的に有効な量」という用語は、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機低分子、またはその他の薬物の、対象または哺乳動物における状態または障害を「処置」するために有効な量をさす。坐骨神経損傷などの末梢神経の傷害または損傷の場合、薬物の治療的に有効な量は、例えば、神経幹/前駆細胞の増殖、分化、遊走、および/もしくは生存の増加；神経細胞の減少の低下、遅延、もしくは中止；神経細胞の低下の阻害、例えば、抑制、遅延、防止、中止、もしくは逆転；神経細胞の数、密度、および/もしくは濃度の増加；神経細胞の形態もしくは機能の変化；または神経細胞間の相互作用の変化；神経損傷に関連する症状のうちの1つもしくは複数、例えば、疼痛の、ある程度の軽減；生活の質の改善；またはそのような効果の組み合わせによって、神経再生能衰退を有する対象において、神経損傷後の感覚ニューロンの軸索再生、表皮神経支配、およびニューロンの機能的回復を促進することができる。

「処置すること」または「処置」または「処置する」または「緩和すること」または「緩和する」などの用語は、（1）損傷を負った神経の診断された病理学的状態を治癒させ、減速させ、その症状を和らげ、逆転させ、かつ/またはその進行を停止させる治療的措置、および（2）末梢神経の再生を防止し、かつ/または遅らせる予防的もしくは防止的な措置の両方をさす。従って、処置を必要とする者には、末梢神経損傷を既に有する者；および末梢神経損傷（例えば、坐骨神経損傷）を経験しやすい者が含まれる。有益な、または所望の臨床結果には、検出可能であってもよいし、検出不可能であってもよい、症状の緩和、損傷を負った神経組織の程度の減少、神経損傷の状態の安定化（即ち、無増悪）、損傷進行の遅延または減速、神経傷害の寛解または緩和、および損傷を負った神経の（部分的であってもよいし、完全であってもよい）再生が含まれるが、これらに限定されるわけではない。処置を必要とする者には、末梢神経損傷を既に有する者、または末梢神経損傷を有すると推測される者が含まれ、末梢神経損傷、例えば、坐骨神経痛を有しやすい者、または状態もしくは損傷もしくはさらなる損傷を防止すべき者も含まれる。具体的には、処置を必要とする者には、神経再生機能の加齢依存的な衰退を経験している動物が含まれる。

「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、治療が望まれる任意の対象、具体的には、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、競技動物、またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ（cattle）、ウシ（cows）、クマ等が含まれる。

本明細書において使用されるように、「抗CXCL13抗体の投与から恩恵を受けるであろう対象」および「処置を必要とする動物」などの語句には、例えば、（例えば、診断手法のための）CXCL13ポリペプチドのレベルの検出のために使用される抗CXCL13抗体もしくはその他のCXCL13結合分子の投与から、かつ/または抗CXCL13抗体もしくはその他のCXCL13結合分子による、末梢神経に影響を与える病理学的状態の処置、即ち、緩和もしくは防止から、恩恵を受けるであろう、哺乳動物対象などの対象が含まれる。そのような対象には、神経損傷後の神経学的回復を促進する天然に存在する神経再生過程の、加齢依存的な衰退を経験している動物が含まれる。

本明細書において使用されるように、「加齢依存性の再生能衰退」または「加齢依存性の軸索再生能衰退」という用語は、軸索再生能および軸索修復過程が加齢と共に衰退する、加齢過程に関連する、動物における天然に存在する状態をさす。対象が加齢依存性の再生能衰退によって影響を受けているか否かは、対象の年齢、全体的な健康状態、神経傷害の程度の観察、およびその修復に必要な時間等を決定することによって、医療専門家によって査定され得る。加齢依存性の再生能衰退を有する対象は、その対象の他の生理学的または遺伝的な形質に依って、任意の暦年齢であり得る。任意のそのような対象は、末梢神経損傷のための本明細書に記載される処置から恩恵を受けるであろう。

本開示の「結合分子」または「抗原結合分子」とは、最も広義に、抗原決定基と特異的に結合する分子をさす。1つの態様において、結合分子は、（BCA-1とも呼ばれる）CXCL13と特異的に結合する。もう1つの態様において、本開示の結合分子は、抗体またはその抗原結合性断片、例えば、抗CXCL13抗体である。もう1つの態様において、本開示の結合分子は、抗体分子の少なくとも1つの重鎖または軽鎖のCDRを含む。もう1つの態様において、本開示の結合分子は、1つまたは複数の抗体分子に由来する少なくとも2つのCDRを含む。もう1つの態様において、本開示の結合分子は、1つまたは複数の抗体分子に由来する少なくとも3つのCDRを含む。もう1つの態様において、本開示の結合分子は、1つまたは複数の抗体分子に由来する少なくとも4つのCDRを含む。もう1つの態様において、本開示の結合分子は、1つまたは複数の抗体分子に由来する少なくとも5つのCDRを含む。もう1つの態様において、本開示の結合分子は、1つまたは複数の抗体分子に由来する少なくとも6つのCDRを含む。ある特定の態様において、CDRのうちの1つまたは複数は、MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、3D2、3C9、MAb 1758、MAb 5091、またはMAb 0745に由来する。例示的な抗CXCL13抗体は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第9,963,504号に開示されている。

「阻害する」には、本明細書において使用されるように、例えば、結合、活性、機能、相互作用、またはその他の測定可能な特色の、部分的または完全な阻止が含まれ得る。

本開示は、抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくはその誘導体を対象へ投与する工程を含む、加齢依存性の神経再生能衰退を経験している対象、例えば、老齢対象、または医療提供者によってそのように診断された対象において、末梢神経損傷後の感覚ニューロンの軸索再生、表皮神経支配、および/またはニューロンの機能的回復を促進する方法に関する。天然に存在する抗体などのフルサイズの抗体に特に言及しない限り、「抗CXCL13抗体」という用語には、フルサイズの抗体、およびそのような抗体の抗原結合性断片、バリアント、類似体、または誘導体、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子、または抗体分子に類似した様式で抗原と結合する組換えの抗体分子もしくは断片が包含される。

本明細書において使用されるように、「ヒト」または「完全ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリから単離された抗体、または、下記の、例えば、Kucherlapatiらによる米国特許第5,939,598号に記載されている、内在性免疫グロブリンを発現しない、1つもしくは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックの動物から単離された抗体が含まれる。「ヒト」または「完全ヒト」抗体には、重鎖の可変ドメインを少なくとも含むか、または重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む抗体も含まれ、ここで、可変ドメインはヒト免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列を有する。

「ヒト」または「完全ヒト」抗体には、本明細書に記載される抗体分子（例えば、VH領域および/またはVL領域）の（誘導体を含む）バリアントを含み、それから本質的になり、またはそれからなる、前記の「ヒト」または「完全ヒト」抗体であって、抗体またはその断片が、CXCL13ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントと免疫特異的に結合するものも含まれる。アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびPCR媒介変異誘発を含むが、これらに限定されるわけではない、当業者に公知の標準的な技術が、ヒト抗CXCL13抗体をコードするヌクレオチド配列に、変異を導入するために使用され得る。ある特定の態様において、（誘導体を含む）バリアントは、基準のVH領域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL領域、VLCDR1、VLCDR2、またはVLCDR3と比べて、50未満のアミノ酸置換、40未満のアミノ酸置換、30未満のアミノ酸置換、25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換、または2未満のアミノ酸置換をコードする。

ある特定の態様において、アミノ酸置換は、以下にさらに記述される保存的アミノ酸置換である。あるいは、例えば、飽和変異誘発によって、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに変異を導入し、活性（例えば、CXCL13ポリペプチド、例えば、ヒトCXCL13、マウスCXCL13、またはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方と結合する能力）を保持する変異体を同定するため、得られた変異体を生物学的活性についてスクリーニングすることができる。「ヒト」または「完全ヒト」抗体のそのようなバリアント（またはその誘導体）は、「最適化」または「抗原結合のために最適化」されたヒト抗体または完全ヒト抗体とも呼ばれ、抗原に対する改善された親和性を有する抗体を含む。

「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。抗体または免疫グロブリンは、重鎖の可変ドメインを少なくとも含み、通常、重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Harlow et al.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(2nd ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照すること。

本明細書において使用されるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別され得る、ポリペプチドの様々な広いクラスを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、その中にいくつかのサブクラス（例えば、γ1～γ4）があることを理解するであろう。抗体の「クラス」を、それぞれ、IgG、IgM、IgA IgG、またはIgEと決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等は、よく特徴決定されており、機能的特殊化を付与することが公知である。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾バージョンは、本開示を考慮すれば、当業者に容易に識別可能であり、従って、本開示の範囲内にある。全ての免疫グロブリンクラスが、明らかに本開示の範囲内にあるが、以下の記述は、一般に、免疫グロブリン分子のIgGクラスに関する。IgGに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量およそ23,000ダルトンの2本の同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量53,000～70,000の2本の同一の重鎖ポリペプチドとを含む。4本の鎖は、典型的には、ジスルフィド結合によって「Y」字形に接合されており、軽鎖は、重鎖を挟み、「Y」の開口部から始まり、可変領域を通って続いている。

軽鎖は、カッパまたはラムダ（K、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合し得る。ハイブリドーマ、B細胞、または遺伝子組換え宿主細胞のいずれかによって免疫グロブリンが生成される時、一般に、軽鎖および重鎖は、相互に共有結合しており、2つの重鎖の「テール」部分は、共有結合性のジスルフィド結合または非共有結合性の結合によって相互に結合している。重鎖において、アミノ酸配列は、Y字形の分岐した末端にあるN末端から、各鎖の一番下のC末端まで続いている。

軽鎖および重鎖の両方が、構造的かつ機能的に相同な領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、軽鎖（VLまたはVK）部分および重鎖（VH）部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、軽鎖（CL）および重鎖（CH1、CH2、またはCH3）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動、Fc受容体結合、補体結合等の重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるにつれて増加する。N末端部分は可変領域であり、C末端部分には定常領域があり；CH3ドメインおよびCLドメインは、実際、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。

上に示されたように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それと特異的に結合することを可能にする。即ち、抗体のVLドメインおよびVHドメイン、またはこれらの可変ドメインの相補性決定領域（CDR）のサブセットが組み合わされて、三次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Yの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、VH鎖およびVL鎖の各々にある3つのCDRによって定義される。いくつかの例において、例えば、ラクダ科の種に由来する、またはラクダ科の免疫グロブリンに基づき組み換えられた、ある特定の免疫グロブリン分子は、軽鎖を含まず、重鎖のみからなることができる。例えば、Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)を参照すること。

天然に存在する抗体において、各抗原結合ドメインに存在する6つの「相補性決定領域」または「CDR」は、抗体が水性環境でその三次元配置をとる際に抗原結合ドメインを形成するよう、特異的に位置付けられたアミノ酸の短い非連続の配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる抗原結合ドメインの残りのアミノ酸は、より少ない分子間可変性を示す。フレームワーク領域は、主に、βシートコンフォメーションをとり、CDRは、βシート構造を接続するループを形成し、いくつかの場合、βシート構造の一部を形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性の相互作用によって、CDRの正しい方向への位置付けを提供する足場を形成するよう作用する。位置付けられたCDRによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を定義する。この相補的な表面は、抗体の同族エピトープとの非共有結合性の結合を促進する。CDRおよびフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸は、正確に定義されているため、当業者によって、任意の所定の重鎖または軽鎖の可変ドメインについて容易に同定され得る（下記を参照すること）。

ある用語に、当技術分野において使用されており、かつ/または受け入れられている2つ以上の定義がある場合、その用語の定義は、本明細書において使用されるように、明示的に否定されない限り、そのような意味を全て含むものとする。具体的な例は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域に見出される非連続の抗原結合部位を記載するための「相補性決定領域」（「CDR」）という用語の使用である。この特定の領域は、参照により本明細書に組み入れられるKabat et al.(1983)U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Protein of Immunological Interest"およびChothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)によって記載されており、この定義には、相互に比較された時、オーバーラップするアミノ酸残基またはアミノ酸残基サブセットが含まれる。にも関わらず、抗体またはそのバリアントのCDRに言及するための、いずれかの定義の適用は、本明細書において定義され、使用される用語の範囲内にあるものとする。上記引用の参考文献の各々によって定義されるCDRを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表1に記載される。特定のCDRを包含する正確な残基数は、CDRの配列およびサイズに依って変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列があれば、どの残基が特定のCDRを構成するかをルーチンに決定することができる。

表1中の全てのCDR定義のナンバリングは、Kabatらによって記載されたナンバリング規則に従う（下記を参照すること）。

（表１）

¹表1中の全てのCDR定義のナンバリングは、Kabatらによって記載されたナンバリング規則に従う（下記を参照すること）。

抗体可変ドメインは、例えば、IMGT情報システム（www://imgt.cines.fr/）（IMGT（登録商標）/V-Quest）を使用して、CDRを含む可変領域セグメントを同定するため、分析されてもよい（例えば、Brochet et al.,Nucl.Acids Res.,36:W503-508,2008を参照すること）。

Kabatらは、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のためのナンバリングシステムも定義した。当業者は、配列自体を超えた実験データに頼ることなく、この「Kabatナンバリング」のシステムを、任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書において使用されるように、「Kabatナンバリング」とは、Kabat et al.(1983)U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"によって記載されたナンバリングシステムをさす。特に明記されない限り、本開示の抗CXCL13抗体またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体における特定のアミノ酸残基位置のナンバリングの言及は、Kabatナンバリングシステムによる。

本開示の抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab'およびF(ab')₂、Fd、Fv、単鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、VLドメインもしくはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリーによって作製された断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Id）抗体（例えば、本明細書に開示される抗CXCL13抗体に対する抗Id抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ScFv分子は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2等）、またはサブクラスのものであり得る。

本明細書において使用されるように、「重鎖部分」という用語には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。ある特定の態様において、重鎖部分を含むポリペプチドは、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ（例えば、ヒンジ領域の上部、中央部、および/もしくは下部）ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、またはそれらのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも1つを含む。例えば、本開示において使用するための結合ポリペプチドには、CH1ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびCH2ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメインおよびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖；CH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖、またはCH1ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含むポリペプチド鎖が含まれ得る。もう1つの態様において、本開示のポリペプチドには、CH3ドメインを含むポリペプチド鎖が含まれる。さらに、本開示において使用するための結合ポリペプチドは、CH2ドメインの少なくとも一部分（例えば、CH2ドメインの全部または一部）を欠いていてもよい。前記のように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、天然に存在する免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるよう、修飾されていてもよいことが、当業者によって理解されるであろう。

本明細書に開示されるある特定の抗CXCL13抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体において、多量体の1つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、その多量体の第2のポリペプチド鎖のものと同一である。あるいは、本開示の重鎖部分含有モノマーは、同一ではない。例えば、各モノマーが、異なる標的結合部位を含み、例えば、二重特異性抗体を形成していてもよい。

本明細書に開示される方法において使用するための結合分子の重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、IgG1分子に由来するCH1ドメインと、IgG3分子に由来するヒンジ領域とを含み得る。もう1つの例において、重鎖部分は、部分的にIgG1分子に由来し、部分的にIgG3分子に由来するヒンジ領域を含み得る。もう1つの例において、重鎖部分は、部分的にIgG1分子に由来し、部分的にIgG4分子に由来するキメラヒンジを含み得る。

本明細書において使用されるように、「軽鎖部分」という用語には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列、例えば、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖が含まれる。いくつかの態様において、軽鎖部分は、VLドメインまたはCLドメインのうちの少なくとも1つを含む。

CXCL13は、CXCケモカインファミリーに属する小さいケモカインである。それは、B-1サブセットおよびB-2サブセットの両方に属するB細胞に対して選択的に走化性であり、ケモカイン受容体CXCR5と相互作用することによって、その効果を誘発する（Legler DF,Loetscher M,Roos RS,Clark-Lewis I,Baggiolini M,Moser B(February 1998).J.Exp.Med.187(4):655-60；Ansel KM,Harris RB,Cyster JG(January 2002).Immunity.16(1):67-76）。CXCL13およびその受容体CXCR5は、リンパ組織の濾胞内のB細胞の編成を調節する（Ansel KM,Ngo VN,Hyman PL,Luther SA,Forster R,Sedgwick JD,Browning JL,Lipp M,Cyster JG(July 2000.Nature.406(6793):309-14）。CXCL13は、ヒトの肝臓、脾臓、リンパ節、および腸に高発現している（Legler DF,Loetscher M,Roos RS,Clark-Lewis I,Baggiolini M,Moser B(February 1998).J.Exp.Med.187(4):655-60）。本明細書に記載されるように、CXCL13は、ある特定の状況において、CXCR5発現Tリンパ球、具体的には、CD8+Tリンパ球に対しても走化性であり得る。

本明細書に開示される抗CXCL13抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、それらが認識し、または特異的に結合する、本明細書に開示される抗原、例えば、標的ポリペプチド（例えば、CXCL13）のエピトープまたは一部分に関して記載され、または特定され得る。標的ポリペプチドの、抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する部分が、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含み得るが、典型的には、少なくとも2つのエピトープを含み、抗原のサイズ、コンフォメーション、およびタイプに依って、任意の数のエピトープを含み得る。さらに、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、非ポリペプチド要素であってもよいし、またはそれを含んでいてもよく、例えば、エピトープは、炭水化物側鎖を含み得ることに注意すべきである。

抗体のためのペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約4～5アミノ酸であると考えられている。ペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも7個、少なくとも9個、または少なくとも約15～約30個のアミノ酸を含有し得る。CDRは、三次形態の抗原性ペプチドまたは抗原性ポリペプチドを認識することができるため、エピトープを構成するアミノ酸は、連続している必要はなく、いくつかの場合、同じペプチド鎖上にさえない。本開示の抗CXCL13抗体によって認識されるペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、CXCL13の少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、または約15～約30個の連続または非連続のアミノ酸の配列を含有することができる。

「特異的に結合する」とは、一般に、抗体が抗原結合ドメインを介してエピトープと結合すること、そして結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によると、抗体は、ランダムな無関係のエピトープと結合するより容易に、抗原結合ドメインを介して、あるエピトープと結合する時、そのエピトープと「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書において、ある特定の抗体が、ある特定のエピトープと結合するための相対親和性を形容するために使用される。例えば、抗体「A」は、抗体「B」より、所定のエピトープに対して高い特異性を有することができ、または抗体「A」は、関連するエピトープ「D」に対してそれが有する特異性より高い特異性で、エピトープ「C」と結合することができる。

「優先的に結合する」とは、抗体が、関連する、類似した、相同な、または類似のエピトープと結合するより容易に、あるエピトープと特異的に結合することを意味する。従って、所定のエピトープと「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が、関連するエピトープと交差反応し得るとしても、関連するエピトープより、そのエピトープと結合する可能性が高い。

非限定的な例として、抗体は、第2のエピトープに対する抗体の解離定数（K_D）より低いK_Dで第1のエピトープと結合する場合、第1のエピトープと優先的に結合する。もう1つの非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のK_Dより少なくとも1桁低い親和性で第1のエピトープと結合する場合、第1の抗原と優先的に結合する。もう1つの非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のK_Dより少なくとも2桁低い親和性で第1のエピトープと結合する場合、第1のエピトープと優先的に結合する。

もう1つの非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のオフレート（k(off)）より低いk(off)で第1のエピトープと結合する場合、第1のエピトープと優先的に結合する。もう1つの非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のk(off)より少なくとも1桁低い親和性で第1のエピトープと結合する場合、第1のエピトープと優先的に結合する。もう1つの非限定的な例において、抗体は、第2のエピトープに対する抗体のk(off)より少なくとも2桁低い親和性で第1のエピトープと結合する場合、第1のエピトープと優先的に結合する。本明細書に開示される抗体、または抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、5×10^-2sec^-1、10^-2sec^-1、5×10^-3sec^-1、または10^-3sec^-1以下のオフレート（k(off)）で、本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、CXCL13、例えば、ヒトCXCL13、マウスCXCL13、もしくはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方）またはその断片もしくはバリアントと結合する。いくつかの態様において、本開示の抗体は、5×10^-4sec^-1、10^-4sec^-1、5×10^-5sec^-1、または10^-5sec^-1、5×10^-6sec^-1、10^-6sec^-1、5×10^-7sec^-1、または10^-7sec^-1以下のオフレート（k(off)）で、本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、CXCL13、例えば、ヒトCXCL13、マウスCXCL13、もしくはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方）またはその断片もしくはバリアントと結合すると言える。

ある特定の態様において、本明細書に開示される抗体、または抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、10³M^-1sec^-1、5×10³M^-1sec^-1、10⁴M^-1sec^-1、または5×10⁴M^-1sec^-1以上のオンレート（k(on)）で、本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、CXCL13、例えば、ヒトCXCL13、マウスCXCL13、もしくはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方）またはその断片もしくはバリアントと結合する。いくつかの態様において、本開示の抗体は、10⁵M^-1sec^-1、5×10⁵M^-1sec^-1、10⁶M^-1sec^-1、または5×10⁶M^-1sec^-1、または10⁷M^-1sec^-1以上のオンレート（k(on)）で、本明細書に開示される標的ポリペプチド（例えば、CXCL13、例えば、ヒトCXCL13、マウスCXCL13、もしくはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方）またはその断片もしくはバリアントと結合する。

抗体は、基準抗体の所定のエピトープとの結合を、ある程度、阻止する程度に、そのエピトープと優先的に結合する場合、基準抗体のそのエピトープとの結合を競合的に阻害すると言われる。競合的阻害は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ELISAアッセイによって決定され得る。抗体は、少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、または少なくとも50％、基準抗体の所定のエピトープとの結合を競合的に阻害すると言える。

本明細書において使用されるように、「親和性」という用語は、個々のエピトープと免疫グロブリン分子のCDRとの結合の強さの尺度をさす。例えば、Harlow et al.(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.)の27～28頁を参照すること。本明細書において使用されるように、「アビディティ」という用語は、免疫グロブリン集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性、即ち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的結合強度をさす。例えば、Harlowの29～34頁を参照すること。アビディティは、集団内の個々の免疫グロブリン分子と特定のエピトープとの親和性に関連し、かつ免疫グロブリンと抗原との結合価にも関連している。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーなどの高度に反復的なエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高いアビディティを有するものであろう。

本開示の抗CXCL13抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、交差反応性に関しても記載され、または特定され得る。本明細書において使用されるように、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な抗体の、第2の抗原と反応する能力をさし；2つの異なる抗原性物質の間の関連性の尺度である。従って、抗体は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープと結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導エピトープと同じ相補的な構造的特色のうちの多くを含有し、いくつかの場合、実際、最初のものよりよく適合し得る。

例えば、ある特定の抗体は、基準エピトープと関連しているが同一ではないエピトープ、例えば、（当技術分野において公知の、本明細書に記載される方法を使用して計算される）少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも55％、および少なくとも50％の同一性を有するエピトープと結合するという点で、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、基準エピトープに対して（当技術分野において公知の、本明細書に記載される方法を使用して計算される）95％未満、90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満、および50％未満の同一性を有するエピトープと結合しない場合、交差反応性をほとんどまたは全く有しないと言える。抗体は、ある特定のエピトープの任意の他の類似体、オルソログ、または相同体と結合しない場合、そのエピトープに対して「高度に特異的」であると見なされ得る。

本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、本開示のポリペプチド、例えば、CXCL13、例えば、ヒトCXCL13、マウスCXCL13、またはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方に対する結合親和性に関しても記載され、または特定され得る。例示的な結合親和性には、5×10^-2M、10^-2M、5×10^-3M、10^-3M、5×10^-4M、10^-4M、5×10^-5M、10^-5M、5×10^-6M、10^-6M、5×10^-7M、10^-7M、5×10^-8M、10^-8M、5×10^-9M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^-13M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M、または10^-15M未満の解離定数またはKdを有するものが含まれる。1つの態様において、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、約5×10^-9M～約5×10^-10M未満のKdでヒトCXCL13と結合し、例えば、抗体はMAb 5261であり、Kdは約5×10^-9M以下である。もう1つの態様において、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、約5×10^-7M～約9×10^-9M未満のKdでマウスCXCL13と結合し、例えば、抗体はMAb 5261であり、Kdは約8×10^-9M以下である。例えば、米国特許第9,963,504号を参照すること。

本明細書において使用されるように、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性の領域または部位が、第1の種から得られ、または由来し、（完全であってもよいし、部分的であってもよいし、もしくは本開示に従って修飾されていてもよい）定常領域が、第2の種から得られる、任意の抗体を意味するものとする。いくつかの態様において、標的と結合する領域または部位は、非ヒト起源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域は、ヒトである。

本明細書において使用されるように、「組換え抗体」という用語は、重鎖もしくは軽鎖の一方または両方の可変ドメインが、既知の特異性を有する抗体に由来する1つまたは複数のCDRの少なくとも部分的な置換によって、そして必要に応じて、部分的なフレームワーク領域の置換および配列変化によって改変された抗体をさす。CDRは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらには同じサブクラスの抗体に由来し得るが、CDRは、異なるクラスの抗体、例えば、異なる種に由来する抗体に由来することが想定される。既知の特異性を有する非ヒト抗体に由来する1つまたは複数の「ドナー」CDRが、ヒトの重鎖または軽鎖のフレームワーク領域に移植された組換え抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と呼ばれる。ある特定の態様において、ある可変ドメインの抗原結合能をもう1つの可変ドメインに移すためには、全てのCDRを、ドナー可変ドメインに由来する完全なCDRに置換する必要はない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を移すことのみが必要であり得る。

ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方の可変ドメインのフレームワーク領域は、ヒト起源の残基のみを含んでいてよく、その場合、ヒト化抗体のこれらのフレームワーク領域は「完全ヒトフレームワーク領域」と呼ばれることが、さらに認識される。あるいは、CXCL13抗原との適切な結合を維持するか、または結合を増強することが必要である場合、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその両方の可変ドメインのヒトフレームワーク領域の対応する位置において、ドナー可変ドメインのフレームワーク領域の1つまたは複数の残基を組み換えることができる。従って、このように組み換えられたヒトフレームワーク領域は、ヒトフレームワーク残基とドナーフレームワーク残基との混合物を含み、本明細書において「部分ヒトフレームワーク領域」と呼ばれる。

例えば、抗CXCL13抗体のヒト化は、Winterらの方法（Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988)）に従って、げっ歯類または変異型げっ歯類のCDRまたはCDR配列をヒト抗CXCL13抗体の対応する配列に置換することによって本質的に実施され得る。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,225,539号；第5,585,089号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,859,205号も参照すること。得られたヒト化抗CXCL13抗体は、ヒト化抗体の重鎖および/または軽鎖の可変ドメインの完全ヒトフレームワーク領域に、少なくとも1つのげっ歯類または変異型げっ歯類のCDRを含むであろう。いくつかの状況において、ヒト化抗CXCL13抗体の1つまたは複数の可変ドメインのフレームワーク領域の残基は、対応する非ヒト（例えば、げっ歯類）残基に置換され（例えば、米国特許第5,585,089号；第5,693,761号；第5,693,762号；および第6,180,370号を参照すること）、その場合、得られたヒト化抗CXCL13抗体は、重鎖および/または軽鎖の可変ドメインに部分ヒトフレームワーク領域を含むであろう。

さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するため（例えば、所望の親和性を得るため）なされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、CDRの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものも含むであろう。さらなる詳細については、参照により本明細書に組み入れられるJones et al.,Nature 331:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；およびPresta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)を参照すること。従って、そのような「ヒト化」抗体には、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が、非ヒト種に由来する対応する配列に置換されている抗体が含まれ得る。実際、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのCDR残基が、そして、おそらく、いくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の類似部位に由来する残基に置換されているヒト抗体である。例えば、米国特許第5,225,539号；第5,585,089号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,859,205を参照すること。ヒト化抗体、および予定された抗原に対する改善された親和性を有するヒト化抗体を作製する技術が、開示されている、米国特許第6,180,370号および国際公開番号WO01/27160も参照すること。

II.標的ポリペプチドの説明
CXCL13は、Bリンパ球（およびT細胞のサブセット）の遊走を促進することが本明細書において示される小さいケモカインであり（図2A、2B、および5D）、それは、バーキットリンパ腫受容体1（BLR-1）を発現する細胞へのカルシウム流入およびBLR-1を発現する細胞の走化性を刺激することによると考えられる。従って、それは、Bリンパ球の嚢胞へのホーミングにおいて機能することができる。

本明細書において使用されるように、「CXCL13」および「CXCL13ポリペプチド」という用語は、交換可能に使用される。ある特定の態様において、CXCL13には、フルサイズのCXCL13ポリペプチドまたはその断片、またはCXCL13バリアントポリペプチドが含まれ得、ここで、CXCL13の断片またはCXCL13バリアントポリペプチドは、フルサイズのCXCL13の機能的特性の一部または全部を保持する。ヒトCXCL13のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列（それぞれ、SEQ ID NO:1および2）は、記載されている（例えば、Legler,et.al.,J.Exp.Med.187(4):655-660(1998)を参照すること）。マウスCXCL13のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列（それぞれ、SEQ ID NO:3および4）は、記載されている（例えば、Gunn,et.al.,Nature 391(6669):799-803(1998)を参照すること）。さらに、SEQ ID NO:5に示されるカニクイザルCXCL13ポリペプチド配列が記載されている。

III.軸索再生
若齢哺乳動物において、軸索は、末梢神経損傷後に容易に再生する。細胞体から切り離された軸索の遠位部分は、ウォラー変性を受ける。この活発な過程は、軸索の断片化および崩壊をもたらす。破片は、膠細胞、例えば、シュワン細胞、およびマクロファージによって除去される。次いで、近位軸索が再生し、標的を神経再支配し、機能の回復を可能にすることができる。しかしながら、軸索修復過程および軸索再生能は、加齢過程と共に衰退する。加齢は、末梢神経系（PNS）のいくつかの形態学的特色および機能的特色に深く影響する。老齢動物においては、損傷後のウォラー変性が遅延し、マクロファージに蓄積される髄鞘の残骸が、若齢動物より大きくなる。高齢対象においては、若齢対象より、シュワン細胞と再生軸索との相互作用に時間がかかり、反応性シュワン細胞および標的器官によって分泌される栄養因子および刺激（tropic）因子の量が少なくなる。老齢動物においては、軸索再生の速度が遅くなり、再生軸索の密度が減少する。加齢は、再生された線維の終末および側枝の出芽の低下を決定して、標的神経再支配および機能的回復の能力をさらに制限する。これらの加齢に関連した変化は、年齢と共に直線的に進行するのではなく；軸索再生および神経再支配の能力は、生涯を通して維持されるが、加齢と共に遅延し、効果が低くなる傾向がある（E Verdu,et al.,J Peripher.Nerv Syst.2000 Dec;5(4):191-208；Fenrich K.et al,Can J Neurol Sci.2004 May;31(2):142-56）。これらの観察は、加齢が、損傷特異的な細胞シグナルと組み合わされた時、ニューロンを再生不能にする、独特の分子機序および細胞機序の発生をもたらすことを示唆している。

この仮説を検証するため、本発明者らは、坐骨後根神経節（DRG）においてRNAseq実験を実施し、それによって、坐骨神経損傷の前後の両方で、免疫およびサイトカイン/ケモカインシグナル伝達経路の加齢依存的なエンリッチメントを示した。主な加齢関連分子サインは、T細胞の活性化およびシグナル伝達の増加によって表された。機序的には、リンホトキシンを含む炎症性サイトカインの加齢依存性の増加が、DRGにおいてNFκB（活性化B細胞の核内因子κ軽鎖エンハンサー）を活性化し、それが、ケモカインCXCL13をアップレギュレートし、それが、次に、MHC-Iの発現によって抗原提示細胞（APC）として作用するニューロンの近位にCXCR5+CD8+T細胞を動員することが見出された。活性化されたCD8⁺T細胞は、次に、pAKTおよびpS6のカスパーゼ3依存的な低下を介して、再生シグナルを阻害することによって、感覚DRGニューロンの軸索再生を抑制する。驚くべきことに、インビボの抗体によって媒介される特異的CD8+T細胞枯渇またはCXCL13中和は、感覚ニューロンの軸索再生を若齢のレベル以上に回復させて、機能的回復を促進することが示された。これらの結果は、軸索再生能を制限する独特の機序が高齢対象に存在することを示しており、高齢対象において観察される再生能衰退に対抗し、末梢神経損傷、例えば、坐骨神経損傷の後の修復を促進するため、抗体によって媒介されるニューロン-免疫細胞コミュニケーションの操作が、臨床的に使用され得ることを示している。

IV.抗CXCL13抗体
CXCL13と結合する抗体は、当技術分野において記載されている。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるU.S.9,963,504を参照すること。CXCL13と結合する市販の抗体、例えば、ラット抗マウスMAb 470（R&D Systems）およびマウス抗ヒトMAb 801（R&D Systems）も、当技術分野において開示されている。他の抗CXCL13結合分子は、例えば、米国特許出願US2008/0227704およびUS2008/0199481、ならびにPCT公開番号WO2020057540A1に開示されている。

本開示の抗体には、抗CXCL13抗体、またはCXCL13と結合するその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体、例えば、MAb 5261（ヒト）、MAb 5378（マウス定常領域を有するMab 5261のVHおよびVL）、MAb 5080（Mab 5261のヒト化親抗体）、MAb 1476（3D2のVHおよびVLを有し、ヒト定常領域を有するキメラ抗体）、3D2（5261および5080の親マウスモノクローナル抗体）、MAb 5091（ヒト）、3C9（マウスモノクローナル抗体）、MAb 1758（ヒト化3C9）、またはMAb 0745（3C9ハイブリドーマ）が含まれる。ある特定の態様において、抗CXCL13抗体は、ヒトCXCL13、霊長類CXCL13、マウスCXCL13、またはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方と結合する。ある特定の態様において、本開示の抗CXCL13抗体はヒト化である。他の態様において、抗CXCL13抗体は、CXCL13とその受容体、例えば、CXCR5との結合を阻止する。ある特定の態様において、本開示の抗CXCL13抗体は、MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、3D2、3C9、MAb 1758、MAb 0745、MAb 5091、またはそれらの抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体である。

本開示は、一般に、加齢依存性の神経再生能衰退を経験している対象における末梢神経損傷後の感覚ニューロンの軸索再生、表皮神経支配、および該ニューロンの機能的回復を促進する方法に関する。本法は、CXCL13と特異的に結合する単離された結合分子、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体を、有効量、対象へ投与する工程を含む。ある特定の態様において、抗体は、CXCL13とその受容体CXCR5との相互作用を阻止する。これらの特性を有する抗体は、本明細書において提供される方法において使用され得る。使用され得る抗体には、参照により本明細書に組み入れられるUS 9,963,504に完全に記載されているMAb、MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、MAb 3D2、MAb 3C9、MAb 0745、MAb 5091、またはMAb 1758が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

ある特定の態様において、本明細書において提供される方法において使用するための抗CXCL13抗体は、ヒトCXCL13もしくはマウスCXCL13、またはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方と結合する。前記抗体のいずれかと同じエピトープと結合する抗体、および/または前記抗体のいずれかを競合的に阻害する抗体も、有用である。ある特定の態様において、抗原結合分子は、MAb 5261およびMAb 5378と同じCXCL13エピトープと特異的に結合する。MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、MAb 3D2、MAb 3C9、MAb 745、MAb 5091、およびMAb 1758の可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列は、以下の表2に示される。相補性決定領域（CDR）には下線が引かれている。CDR配列も、以下の表3に示される。

（表２）CXCL13抗体可変ドメイン

（表３）

1つの態様において、本開示は、基準抗体、例えば、MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、MAb 5091、MAb 1758、3D2、または3C9と同じCXCL13エピトープと特異的に結合する、単離された結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、および誘導体を提供する。もう1つの態様において、本開示は、CXCL13と特異的に結合し、基準抗体、例えば、MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、MAb 5091、MAb 1758、3D2、または3C9の、CXCL13、例えば、ヒトCXCL13、霊長類CXCL13、マウスCXCL13、またはヒトCXCL13およびマウスCXCL13の両方との特異的結合を競合的に阻害する、単離された結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。

ある特定の態様において、本開示の結合分子は、基準抗CXCL13抗体分子のアミノ酸配列と少なくとも約80％、約85％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、または約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらなる態様において、結合分子は、基準抗体と少なくとも約96％、約97％、約98％、約99％、または100％の配列同一性を共有する。ある特定の態様において、基準抗体は、MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、MAb 5091、MAb 1758、3D2、または3C9である。

ある特定の態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VHドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VHドメインのCDRのうちの少なくとも1つは、SEQ ID NO:6、8、10、12、14、または16のCDR1、CDR2、またはCDR3と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VHドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VHドメインのCDRのうちの少なくとも1つは、SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、または25と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VHドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VHドメインは、SEQ ID NO:6、8、10、12、14、または16と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VHドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VHドメインのCDRのうちの少なくとも1つは、SEQ ID NO:6、8、10、12、14、または16のCDR1、CDR2、またはCDR3と、1個、2個、3個、4個、または5個の保存的アミノ酸置換を除き、同一であるアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VHドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VHドメインのCDRのうちの少なくとも1つは、SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、または25と、1個、2個、3個、4個、または5個の保存的アミノ酸置換を除き、同一であるアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、SEQ ID NO:6、8、10、12、14、または16と少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または100％同一であるアミノ酸配列を有するVHドメインを含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、コードされたVHドメインを含む抗CXCL13抗体は、特異的に、または優先的に、CXCL13と結合する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VLドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VLドメインのCDRのうちの少なくとも1つは、SEQ ID NO:7、9、11、13、15、または17のCDR1、CDR2、またはCDR3と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VLドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VLドメインのCDRのうちの少なくとも1つは、SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33、または34と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VLドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VLドメインは、SEQ ID NO:7、9、11、13、15、または17と少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または同一であるアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VLドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VLドメインのCDRのうちの少なくとも1つは、SEQ ID NO:7、9、11、13、15、または17のCDR1、CDR2またはCDR3と、1個、2個、3個、4個、または5個の保存的アミノ酸置換を除き、同一のアミノ酸配列を有する。

もう1つの態様において、本開示は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VLドメイン）を含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を提供し、ここで、VLドメインのCDRのうちの少なくとも1つは、SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33、または34と、1個、2個、3個、4個、または5個の保存的アミノ酸置換を除き、同一のアミノ酸配列を有する。

さらなる態様において、本開示は、SEQ ID NO:7、9、11、13、15、または17と、少なくとも約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、または100％同一であるアミノ酸配列を有するVLドメインを含み、それから本質的になり、またはそれからなる単離された抗体またはその抗原結合性断片を含み、ここで、コードされたVLドメインを含む抗CXCL13抗体は、特異的に、または優先的に、CXCL13と結合する。

本開示の抗CXCL13抗体の適当な生物活性バリアントは、本開示の方法において使用され得る。そのようなバリアントは、親抗CXCL13抗体の所望の結合特性を保持するであろう。抗体バリアントを作製する方法は、一般に、当技術分野において利用可能である。

V.治療用抗CXCL13抗体を使用した処置方法
リンパ系ケモカインCXCL13は、濾胞性樹状細胞（FDC）およびマクロファージによって発現される。多様な免疫細胞（例えば、B細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、活性化直後のT細胞）に見出される受容体CXCR5を介して、CXCL13は、免疫系ホメオスタシスの維持、リンパ系器官形成、白血球輸送、および走化性の遊走、ならびに二次リンパ組織（例えば、胚中心）の発達に必要な細胞内変化を誘導する。CXCL13およびその受容体CXCR5の過剰発現は、多様な自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症（例えば、Corcione et al.,PNAS 101(30):11064-11069(2004)；Serafini et al.,Brain Pathol.14:164-174(2004)；Magliozzi et al.,Brain 130:1089-1104(2007)を参照すること）、関節炎、例えば、関節リウマチ（例えば、Rioja et al.,Arthritis & Rheumatism 58(8):2257-2267(2008)；Shi et al.,J.Immuno.166:650-655(2001)；Schmutz et al.,Arthritis Restearch and Therapy 7:R217-R229(2005)；Hjelmstrom et al.,J.Leukocyte Bio.69:331-339(2001)を参照すること）、慢性胃炎（例えば、Hjelmstrom et al.；Mazzucchelli et al.,Brain 130:1089-1104(2007)を参照すること）、胃リンパ腫（例えば、id.；Nobutani et al.,FEMS Immunol Med Microbiol 60:156-164(2010)を参照すること）、移植片拒絶（例えば、Steinmetz et al.,Kidney International 67:1616-1621(2005)を参照すること）、シェーグレン症候群（SS）（例えば、Barone et al.,J.Immuno.180:5130-5140(2008)；Hjelmstrom et al.を参照すること）、全身性エリテマトーデス（SLE）（例えば、Steinmetz et al.,Lee et al.,J.Rheum.37(1):45-52(2010)；Schiffer et al.,J.Immun.171:489-497(2003)を参照すること）、C型肝炎ウイルス感染における活動性混合型クリオグロブリン血症性（MC）血管炎（例えば、Sansonno et al.,Blood 112(5):1620-1627(2008)を参照すること）、若年性皮膚筋炎（例えば、de Padilla et al.,Arthritis & Rheumatism 60(4):1160-1172(2009)を参照すること）、および重症筋無力症（例えば、Matsumoto et al.,J.Immuno.176:5100-5107(2006)；Meraouna et al.,Blood 108(2):432-440(2006)；Saito et al.,J.Neuroimmunol 170:172-178(2005)を参照すること）、およびある特定の癌（例えば、バーキットリンパ腫（例えば、Forster et al.,Blood 84:830-840(1994)；Forster et al.,Cell 87:1037-1047(1996)を参照すること）、非ホジキンリンパ腫（例えば、Trentin et al.,Ann.Rev.Immunol.6:251-81(1988)；Gong et al.,J.Immunol.174:817-826(2005)；Hamaguchi et al.,J.Immunol.174:4389-4399(2005)を参照すること）、癌腫（例えば、結腸および膵臓）（例えば、Gunther et al.,Int.J.Cancer 116:726-733(2005)；Meijer et al.,Cancer Res.66:9576-9582(2006)を参照すること）、乳癌（例えば、Panse et al.,British Journal of Cancer 99:930-938(2008)を参照すること）、慢性リンパ性白血病（CLL）（例えば、Burkle et al.,Blood 110:3316-3325(2007)を参照すること）、および前立腺癌（例えば、Singh et al.,Cancer Letters 283(1):29-35(2009)を参照すること）に関連付けられている。

従来、CXCL13のニューロン発現がT細胞シグナル伝達経路の加齢依存性エンリッチメントと関連していることは知られていなかった。本開示は、炎症性サイトカインリンホトキシンがNFκBを活性化し、それがCXCL13のニューロン発現を誘導し、それが、次に、MHC-1を発現するDRGニューロンの近位にCXCR5⁺CD8⁺T細胞を動員することを証明する。CD8+T細胞は、カスパーゼ3活性化を介して再生シグナルpAKTおよびpS6を阻害することによって、感覚DRGニューロンの軸索再生を抑制することが、本明細書に示される。抗CXCL13結合分子による中和は、CXCR5⁺CD8⁺T細胞のDRGへの動員を防止し、それによって、加齢依存性の再生能衰退を逆転させ、坐骨神経損傷などの末梢神経損傷の後の神経生物学的回復を促進することが、本明細書において示される。

本開示のある特定の方法は、坐骨神経損傷などの末梢神経損傷の後の加齢依存性の軸索再生能衰退を有する対象における末梢神経再生を促進するための、抗CXCL13結合分子、例えば、抗体（その抗原結合性断片、バリアント、および誘導体を含む）の使用に関する。

以下の記述は、本開示の抗CXCL13抗体による、診断方法、および軸索再生を促進するための末梢神経の処置に言及するが、本明細書に記載される方法は、本開示の抗CXCL13抗体の所望の特性を保持し、例えば、CXCL13、例えば、ヒトCXCL13、霊長類CXCL13、もしくはマウスCXCL13、またはヒトCXCL13およびマウスCXCL13と特異的に結合することができ、CXCL13中和活性、例えば、CXCL13のCXCR5との結合を阻止する活性を有する、これらの抗CXCL13抗体の抗原結合性断片、バリアント、および誘導体にも適用可能である。

1つの態様において、処置は、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合性断片の、患者への適用もしくは投与、または抗CXCL13結合分子の、患者から単離された組織もしくは細胞株への適用もしくは投与を含み、ここで、患者は、加齢依存性の軸索再生能衰退を有するか、または有すると推測され、かつ坐骨神経損傷などの末梢神経の損傷、傷害、もしくは末梢神経損傷の素因を有するか、または有すると推測される。もう1つの態様において、処置は、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体もしくはその抗原結合性断片を含む薬学的組成物の、患者への適用もしくは投与、または抗CXCL13結合分子を含む薬学的組成物の、患者から単離された組織もしくは細胞株への適用もしくは投与も含むものとし、ここで、患者は、加齢依存性の軸索再生能衰退を有するか、または有すると推測され、かつ坐骨神経損傷などの末梢神経損傷、もしくは末梢神経損傷の素因を有するか、または有すると推測される。

本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその結合断片は、末梢神経損傷、または軸索再生を必要とする状態の処置のために有用である。例えば、少なくとも1つの抗CXCL13抗体による治療は、加齢依存性の軸索再生能衰退を有する患者において、軸索再生に関して有益である生理学的応答を引き起こす。

1つの態様において、本開示は、医薬として使用するための、または医薬の製造のための、具体的には、坐骨神経損傷などの末梢神経損傷の処置または予防において使用するための、本開示による抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその結合断片に関する。ある特定の態様において、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片、例えば、MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、3D2、または3C9は、末梢神経損傷および加齢依存性の軸索再生能衰退を有する患者において、軸索再生を促進するために使用される。

末梢神経損傷後の軸索再生の促進のための、抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその結合断片の有効性は、動物モデルを使用して示され得る。例えば、末梢神経損傷の処置のための本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片の有効性は、坐骨神経損傷の動物モデル、例えば、本明細書において以下に記載されるように坐骨神経「挫滅」を受け、本開示の抗CXCL13結合分子によって処置されるマウスを使用して示され得る。腕神経叢損傷、脊髄副神経損傷、および腓骨神経損傷などの他の末梢神経損傷の動物モデルも、当業者に公知である。

本開示の方法によると、本明細書の他の箇所において定義される少なくとも1つの抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片が、末梢神経の損傷または傷害に関する正の治療的応答を促進するために使用される。末梢神経損傷に関する「正の治療的応答」とは、神経再生に関連する損傷を負った組織の改善および/または損傷に関連する症状の改善を意味する。即ち、再生効果、加齢依存性の再生能衰退の逆転、表皮神経再支配、損傷を負った神経の神経学的機能の回復、および/または関連する疼痛の低下、筋力低下、刺痛、感覚の喪失等の、神経損傷に関連する1つもしくは複数の症状の減少が、観察され得る。従って、例えば、損傷を負った組織の改善は、完全応答として特徴付けられ得る。「完全応答」とは、神経学的機能の回復、および関連する疼痛、刺痛、または損傷のその他の副作用の欠如を意味する。あるいは、損傷の改善は、部分応答であるとして大別され得る。「部分応答」とは、関連する疼痛の減少、いくらかの表皮神経支配および神経再生、筋力の改善、ならびに神経学的機能の少なくとも部分的な回復を意図する。

1つの態様において、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体または抗原結合性断片は、坐骨神経の損傷または傷害を処置するために使用される。坐骨神経は、脚の後部に位置しており、大腿、下肢、および足底に感覚を与える。坐骨神経は、膝および下肢の筋肉に接続されており、それらに供給するため、神経に対する極度の傷害は、膝の衰弱、膝屈曲困難、足屈曲困難、および/または足の運動の衰弱を引き起こし得る。また、反射異常を引き起こすこともあり、触れた時に、膝または脚が適切に反応しないことがある。患者は、坐骨神経傷害の結果として、極度の疼痛または刺痛を経験し得る。

坐骨神経傷害は、（骨盤骨折もしくはその他の骨盤損傷などの）損傷；椎間板ヘルニア；変性椎間板疾患；脊柱管狭窄；または腫瘍を含む多くの因子によって引き起こされ得る。坐骨神経の傷害によって、患者は、片脚または両脚に疼痛、刺痛、または灼熱感を経験し得る。疼痛は、片脚、または脚、腰、腓腹、もしくは足底の片側に局所的である場合もあるし、両脚に疼痛が存在する場合もある。坐骨神経の傷害が極度である時、患者は、脚を動かすことができなくなり得る。神経が傷害された時、疼痛は、徐々に始まり、次第に悪化し得る。

「坐骨神経痛」とは、坐骨神経が傷害された時に起こる症状をさすために使用される用語である。独立した医学的状態ではなく、坐骨神経の傷害を経験した患者が片脚または両脚に経験する痺れ、疼痛、刺痛、または衰弱の総称である。

本開示の抗CXCL13モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、例えば、MAb 5261またはMab 5378を使用したCXCL13の中和は、いくつかの異なる機序、例えば、CXCL13とその受容体との相互作用の阻止、または坐骨神経のDRGへのCXCR5+CD8+T細胞のホーミングの阻止を通して、坐骨神経痛の重症度を低下させることができる。

1つの態様において、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体または抗原結合性断片は、加齢依存性の再生能衰退を有する対象における脊髄副神経の物理的損傷を処置するために使用される。脊髄副神経の損傷は、肩の鈍痛および軽度の疼痛、運動時の疼痛の増加、三角筋の領域における痺れ、影響を受けた腕の運動困難、長期の損傷における三角筋の疲労、ならびに影響を受けた肩の衰弱をもたらし得る。

本開示の抗CXCL13モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、例えば、MAb 5378またはMAb 5261を使用したCXCL13の中和は、本明細書に記載される1つまたは複数の機序、例えば、CXCL13とその受容体との相互作用の阻止、または脊髄副神経のDRGへのCXCR5+CD8+T細胞のホーミングの阻止を通して、脊髄副神経損傷の重症度を低下させ、または傷害された神経組織を再生させることができる。

1つの態様において、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体または抗原結合性断片は、本明細書に記載される1つまたは複数の機序、例えば、CXCL13とその受容体との相互作用の阻止、または腕神経叢ネットワークのDRGへのCXCR5+CD8+T細胞のホーミングの阻止を通して、加齢依存性の再生能衰退を有する対象における腕神経叢損傷を処置するため、例えば、腕神経叢の傷害された神経組織を再生させるため、使用される。腕神経叢は、第5、第6、第7、および第8の頸椎神経（C5～C8）ならびに第1胸椎神経（T1）に由来し、胸、肩、腕、および手の筋肉および皮膚を神経支配している。腕神経叢損傷は、四肢の最も重度の神経損傷である。神経傷害の位置に基づき、腕神経叢損傷は、腕の一部に影響を与えることもあるし、全体に影響を与えることもある。例えば、筋皮膚神経傷害は、肘屈筋を衰弱させ、正中神経傷害は、近位前腕の疼痛を引き起こし、尺骨神経の麻痺は、握力低下および指の痺れを引き起こす（Lorei,Matthew P.;Hershman,Elliott B.(1993)."Peripheral Nerve Injuries in Athletes".Sports Medicine.16(2):130-47）。いくつかの場合、これらの損傷は、これらの肢の使用を制限し、疼痛を引き起こす。損傷は、しばしば、腕の衰弱、反射低下、および対応する感覚障害を引き起こす。

本開示の抗CXCL13モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片、例えば、MAb 5378またはMAb 5261を使用したCXCL13の中和は、いくつかの異なる機序、例えば、CXCL13とその受容体との相互作用の阻止、または腕神経叢のDRGへのCXCR5+CD8+T細胞のホーミングの阻止を通して、腕神経叢損傷を有する対象における再生能衰退を逆転させ、それによって、損傷を負った神経組織を再生させ、関連する疼痛および筋力低下の重症度を低下させるか、またはそれらを排除することができる。

もう1つの態様において、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体または抗原結合性断片は、本明細書に記載される1つまたは複数の機序、例えば、CXCL13とその受容体との相互作用の阻止、または腓骨神経のDRGへのCXCR5+CD8+T細胞のホーミングの阻止を通して、加齢依存性の再生能衰退を有する対象における腓骨神経損傷を処置するため、例えば、腓骨神経の傷害された神経組織を再生させるため、使用される。腓骨神経障害としても公知の腓骨神経損傷は、下肢の前面およびまたは側面の痺れまたは刺痛、損傷を負った区域および周辺区域の感受性の減少、足の上方および外側への屈曲の衰弱、歩行時に床から離れるほど十分に足を上げることができない状態（下垂足）をもたらし、またはスラッピングゲイト（slapping gait）を引き起こし得る。

本明細書に記載される処置に対する臨床応答は、スクリーニング技術、例えば、磁気共鳴画像（MRI）スキャン、MRI神経記録、電気診断検査、X線画像、コンピュータ断層撮影（CT）スキャン、フローサイトメトリー、または蛍光標示式細胞分取器（FACS）分析、組織学、肉眼的病理学、および血液化学を使用して査定され得、ELISA、RIA、クロマトグラフィ等によって検出可能な変化を含むが、これらに限定されるわけではない。これらの正の治療応答に加えて、抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片による治療を受けた対象は、損傷に関連する症状の改善という有益な効果を経験し得る。

本開示のさらなる態様は、臨床検査手法の一部としての組織中のタンパク質レベルの診断的モニタリングのための、例えば、対象が本明細書に記載される処置から恩恵を受けることができるか否かを決定するための、または所定の処置計画の有効性を決定するための、抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片の使用である。例えば、対象における、例えば、特定のDRGまたはその近傍の組織における、CXCL13レベルの検出は、抗CXCL13抗体を検出可能物質とカップリングすることによって容易にされ得る。検出可能物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光性材料、発光性材料、生物発光性材料、および放射性材料が含まれる。適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適当な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが含まれ；適当な蛍光性材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれ；発光性材料の例には、ルミノールが含まれ；生物発光性材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ；適当な放射性材料の例には、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、または³Hが含まれる。

VI.薬学的組成物および投与方法
本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体を調製し、それを必要とする対象へ投与する方法は、当業者に周知であり、または当業者によって容易に決定される。抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入、または局所であり得る。非経口という用語には、本明細書において使用されるように、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣への投与が含まれる。これらの投与形態は、全て、本開示の範囲内にあると明確に企図されるが、投与のための形態の例は、注射用溶液、具体的には、静脈内、腹腔内、または動脈内への注射または点滴のための溶液であろう。一般的に、注射用の適当な薬学的組成物は、緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）を含み、任意で、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含み得る。しかしながら、本明細書中の教示に適合する他の方法において、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体を、末梢神経損傷の部位へ直接送達し、それによって、損傷を負った組織の治療剤への曝露を増加させることもできる。

本明細書に記述されるように、本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、末梢神経系（PNS）傷害、例えば、損傷を負った末梢神経、例えば、損傷を負った坐骨神経のインビボ処置のため、薬学的に有効な量、投与され得る。これに関して、本開示の開示された結合分子は、投与を容易にし、活性薬剤の安定性を促進するように製剤化されることが理解されるであろう。ある特定の態様において、本開示による薬学的組成物は、薬学的に許容される非毒性の無菌担体、例えば、生理食塩水、非毒性の緩衝剤、保存剤等を含む。本願の目的のため、コンジュゲートまたは非コンジュゲートの抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体の薬学的に有効な量とは、標的への効果的な結合を達成し、恩恵、例えば、傷害された神経の再生、周囲の表皮の神経支配、神経学的機能の回復を達成し、かつ/または末梢神経損傷の症状、例えば、疼痛もしくは刺痛を改善し、または組織中のCXCL13のレベルを検出するため、十分な量を意味するものとする。

本開示において使用される薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ロウ、ポリエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂を含む。

非経口投与用の調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体には、例えば、水、アルコール/水性の溶液、乳濁液、または懸濁液、例えば、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。本開示において、薬学的に許容される担体には、0.01～0.1M、例えば、0.05Mリン酸緩衝液または0.8％生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるわけではない。他の一般的な非経口媒質には、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または不揮発性油が含まれる。静脈内媒質には、体液および栄養素の補充剤、電解質補充剤、例えば、リンゲルデキストロースベースのもの等が含まれる。保存剤およびその他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等も存在し得る。

より具体的には、注射可能な使用に適した薬学的組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。そのような場合、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。それは、製造および保管の条件の下で安定しているべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されていてよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。本明細書に開示される治療方法において使用するために適当な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)16th ed.(1980)に記載されている。

微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。例えば、製剤は、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含み得る。注射可能組成物の吸収の長期化は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。

いずれの場合にも、無菌注射可能溶液は、活性化合物（例えば、単独の、または他の活性薬剤と組み合わせられた、抗CXCL13抗体、または抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体）を、必要に応じて、本明細書に列挙される成分のうちの1つまたは組み合わせと共に、適切な溶媒に、必要な量で組み込み、続いて、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、基本の分散媒および前記において列挙されたもののうち必要とされる他の成分を含有する無菌の媒質に組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製の方法は、事前に無菌濾過されたその溶液から、活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥であり得る。注射用調製物は、当技術分野において公知の方法に従って、加工され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ、またはバイアルなどの容器に充填され、無菌条件下で密封される。さらに、調製物は、米国特許出願第09/259,337号に記載されているもののようなキットの形態にパッケージングされ、販売され得る。そのような製品は、関連する組成物が、特定のタイプの末梢神経の傷害もしくは損傷に罹患しているか、またはその素因を有する対象を処置するために有用であることを示すラベルまたはパッケージインサートを有し得る。

非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入、または初回ボーラス用量に続く1つまたは複数の維持用量であり得る。これらの組成物は、特定の固定または可変の間隔で、例えば、1日1回、または「必要に応じて」投与され得る。

本開示において使用されるある特定の薬学的組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液を含む、許容される剤形で経口投与され得る。ある特定の薬学的組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。そのような組成物は、ベンジルアルコールもしくはその他の適当な保存剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、および/またはその他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を利用して、生理食塩水溶液として調製され得る。

単一剤形を作製するため、担体材料と組み合わせられ得る、抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体の量は、処置される宿主および特定の投与様式に依って変動する。組成物は、単回投与されてもよいし、複数回投与されてもよいし、または注入によって確立された期間にわたり投与されてもよい。投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的な応答）を提供するためにも、調整され得る。

本開示の範囲に一致して、本開示の抗CXCL13抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、治療効果を生じるのに十分な量で、前述の処置方法に従って、ヒトまたはその他の動物へ投与され得る。本開示の抗CXCL13抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、公知の技術に従って、本開示の抗体、例えば、MAb 5261またはMAb 5378を従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって調製された従来の剤形で、そのようなヒトまたはその他の動物へ投与され得る。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特徴は、それと組み合わせられる活性成分の量、投与経路、およびその他の周知の変数によって規定されることが、当業者によって認識されるであろう。本開示の抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体のうちの1種または複数種を含むカクテルが特に有効であることが判明し得ることを、当業者はさらに理解するであろう。

「治療的に有効な用量もしくは量」または「有効量」とは、投与された時に、処置される末梢神経損傷を有する患者の処置に関して正の治療的応答をもたらす、抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片の量を意味する。

末梢神経損傷の処置のための、本開示の組成物の治療的に有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物療法、処置が予防的であるか治療的であるか、対象の年齢、および処置前に対象において検出されたCXCL13のレベルを含む、多くの異なる因子に依って変動する。一般的に、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置され得る。処置の投与量は、安全性および有効性を最適化するため、当業者に公知のルーチンの方法を使用して滴定され得る。

投与される少なくとも1つの抗CXCL13結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合性断片の量は、本開示の開示があれば、過度の実験法なしに、当業者によって容易に決定される。少なくとも1つの抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、その抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体の投与様式およびそれぞれの量に影響を与える因子には、損傷の重症度、損傷の部位、傷害された末梢神経、損傷の履歴、ならびに治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康状態、および身体状態、例えば、対象において検出されたCXCL13のレベルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。同様に、投与される抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体の量は、投与様式、および対象がこの薬剤の単回投与を受けるか複数回投与を受けるかに依存するであろう。

本開示は、末梢神経損傷、例えば、坐骨神経損傷を処置するための医薬の製造における、抗CXCL13結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体の使用も提供する。

IX.診断
本開示は、対象が抗CXCL13結合分子による処置から恩恵を受けるか否か、例えば、対象が加齢依存性の神経再生能衰退を経験しているか否かを決定するための、対象における末梢神経損傷の診断のために有用な方法をさらに提供する。本法は、例えば、坐骨神経損傷などの末梢神経損傷を有するか、または有すると推測される個体に由来する、損傷を負った末梢神経のDRGもしくはその近傍の組織、またはその他の細胞もしくは体液において、CXCL13タンパク質または転写物の発現レベルを測定する工程、および測定された発現レベルを、若齢対象の正常な組織または体液における標準CXCL13発現レベルと比較する工程を含み、ここで、標準と比較された試料における発現レベルの増加は、対象が本明細書に開示される抗CXCL13抗体による処置から恩恵を受けるであろうことを示す。ある特定の態様において、本開示の抗CXCL13抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、および誘導体、例えば、MAb 5261、MAb 5378、MAb 5080、MAb 1476、3D2、または3C9は、加齢依存性の神経再生能衰退の存在の診断において使用される。

本開示の抗CXCL13抗体、ならびにその抗原結合性断片、バリアント、および誘導体は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して、生物学的試料中のCXCL13タンパク質レベルをアッセイするために使用され得る（例えば、Jalkanen,et al.,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkanen et al.,J.Cell Biol.105:3087-3096(1987)を参照すること）。CXCL13タンパク質発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法には、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、PCR技術等が含まれる。適当なアッセイは、本明細書中の他の箇所に、より詳細に記載される。

「CXCL13ポリペプチドの発現レベルをアッセイする」とは、第1の生物学的試料の中のCXCL13ポリペプチドのレベルを、直接的に（例えば、絶対タンパク質レベルを決定し、もしくは推定することによって）または相対的に（例えば、第2の生物学的試料の中の関連ポリペプチドレベルと比較することによって）定性的または定量的に測定し、または推定することを意図する。1つの態様において、第1の生物学的試料の中のCXCL13ポリペプチド発現レベルは、測定され、または推定され、標準CXCL13ポリペプチドレベルと比較され、ここで、標準は、加齢依存性の再生能衰退を有しない若齢個体から得られた生物学的試料から得られるか、または加齢依存性の神経再生能衰退を有しない若齢個体集団からのレベルを平均化することによって決定される。当技術分野において理解されるように、「標準」CXCL13ポリペプチドレベルが既知になった後は、比較のための標準として、それを繰り返し使用することができる。本明細書において使用されるように、「若齢個体」という用語は、暦年齢、および全体的な健康状態または遺伝学などのその他の基準に基づき、医療提供者によって決定される任意表記である。ある特定の態様において、「若齢個体」は、例えば、40歳未満または35歳未満、例えば、20～35歳の対象であり得る。

「生物学的試料」とは、CXCL13を発現する可能性のある個体、細胞株、組織培養物、またはその他の細胞起源から得られた任意の生物学的試料を意味する。哺乳動物から組織生検材料および体液を得る方法は、当技術分野において周知である。

上記引用の全ての参考文献および本明細書において引用された全ての参考文献が、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

以下の実施例は、限定のためではなく、例示のため、提供される。

実施例1.実験材料および方法
以下の材料、方法、およびプロトコルを、以下の実施例において適用した。

マウス
8～10週齢の野生型C57/BL6Jマウスは、Charles Riverから得られ、老齢マウス（20～22ヶ月齢）は、Charles RiverまたはJucker's laboratory,HIH（Tuebingen）のいずれかから供給された。B57/BL6の遺伝的背景を有するOT Iマウスは、Botto's laboratory,Imperial Collegeによって提供された。全ての動物手法が、UK Animals Scientific Procedures Act(1986)に従って実行され、Imperial College Londonの倫理委員会によって承認された。

DRG細胞培養
24穴プレートにおいて、無菌15mmカバーガラスを、H₂Oで希釈された0.003％ポリ-L-オルニチン（Sigma）によって37℃で1時間コーティングした。水で3回洗浄した後、カバーガラスを、PBS（Invitrogen）で調製された1μg/mlラミニン（Millipore）によって室温で3時間コーティングした。PBSでの2回の洗浄工程の後、ウェルにDMEMを充填し、細胞播種まで37℃に置いた。DRGを解剖し、氷上のハンクス平衡塩溶液（HBSS）（Invitrogen）に回収した。次いで、HBSSを除去し、5分毎にチューブを軽く叩きながら、37℃の水浴中で40分間、500μlの消化溶液（5mg/mlディスパーゼII（Sigma）、DMEM（Invitrogen）中の2.5mg/mlコラゲナーゼII型（Worthington））に交換した。消化後、800rpmでの2分間の遠心分離によって、DRGを回収し、温かいDRG培地（DMEM/F12（Invitrogen）、1×B27（Invitrogen）、10％ウシ胎仔血清（FBS）（Sigma））で1回洗浄した。次いで、DRGを、1mlの温かいDRG培地に再懸濁させ、ファイアポリッシュされたSigmacote（Sigma）でコーティングされたガラスピペットによる15回のピペッティングによって破砕した。未解離組織を100μmセルストレーナー（BD Falcon）で濾過し、血球計数器によって明視野顕微鏡下で細胞を計数した。細胞計数後、細胞をスピンダウンし、温かいDRG培養培地（DMEM/F12（Invitrogen）、1×B27（Invitrogen）、1％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Invitrogen））に再懸濁させ、播種した（1ウェル当たり4000細胞）。DRG細胞を37℃で5％CO₂中で24時間培養した。

DRG神経突起伸長分析
技術的3回反復および生物学的3回反復によって、各条件について少なくとも100個の細胞（ランダムに選択されたカバーガラス1枚当たり5つの視野）を用いて、Neurolucidaソフトウェア（MBF Bioscience）を使用することによって、培養されたDRG細胞の平均神経突起長を測定した。

免疫細胞化学
培養されたDRG細胞を、1×PBS中の氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）（Sigma）によって氷上で30分間固定し、1×PBSで3回洗浄した。細胞を、1×PBS、0.1％トリトンX、5％正常ヤギ血清（Abcam）で、室温で1時間ブロッキングした後、一次抗体を含む1×PBS、0.1％トリトンX、2％正常ヤギ血清と共に4℃で一晩インキュベートした。次いで、細胞を1×PBSで3回洗浄し、二次抗体を含む1×PBS、0.1％トリトンと共に暗所で室温で2時間インキュベートした。細胞を1×PBSで3回洗浄し、4-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、Molecular Probes、1:5000）を含む1×PBS、0.1％トリトンXと共に10分間インキュベートした後、PBSで2回洗浄した。細胞を下向きにカバーガラスをスライドに移し、Antifade封入剤（Vectashield、H-1000）によって封入した。

坐骨神経挫滅
以前に記載されたプロトコルに従って、坐骨神経に挫滅を与えた（Bauder and Ferguson,(2012).JoVE(Journal of Visualized Experiments),e3606）。1L/min酸素中の2％イソフルランによってマウスを深麻酔下に置き、鎮痛のため、0.1mg/kgブプレノルフィンおよび5mg/kgリマダイル（rimadyl）を皮下（s.c.）注射した。正中線を横切って皮膚を切開し、筋膜面を開き、大殿筋と大腿二頭筋の前頭（anterior head）との間を小さくより深く切開することによって、坐骨神経を露出させた。

3つの束が連続して並んでいる露出した神経の近位側を、超微細止血鉗子（Fine Science Tools、13020-12）の下顎部（bottom jaw）の先端から1.5mmに配置した。神経伸展なしに、鉗子の3回のクリックで、30秒間、神経に挫滅を与えた。次いで、皮膚を縫合クリップで閉じた。

マウスには、術後3日間、s.c.注射によって、0.1mg/kgブプレノルフィンを1日2回投与し、5mg/kgリマダイルを毎日投与した。損傷なしに神経を露出させるシャム手術を実施した。

RNAの調製および配列決定
シャムまたは坐骨神経損傷の24時間後に、若齢または老齢の坐骨DRG組織全体に由来するRNAを使用して、RNA配列決定を実施した。具体的には、1試料当たり1匹のマウスから坐骨DRGを解剖し、RNAlater安定化溶液（ThermoFisher）で保存した。組織をRNaseフリーマイクロペッスルで均質化し、製造業者のプロトコルに従い、RNeasyキット（Qiagen）を使用してRNAを抽出した。DNAを除去するため、RNaseフリーDNaseセット（Qiagen）によって、オンカラムDNase消化を15分間実施した。RNAの濃度および純度を、Agilent2100 Bioanalyzer（Agilent）を使用して測定した。RNAインテグリティナンバー（integrity number）（RIN）が7.5を超えるRNAをライブラリ調製に使用した。ライブラリは、TruSeq mRNA Sample Preparationキット（Illumina）を使用して、Ospedale San Raffaele（Milan）で調製され、Illumina HiSeq 2500、100サイクル、ペアエンドシーケンシングを使用して配列決定された。

生物情報学的分析
FDR（偽発見率）補正P値は、Benjamini-Hochberg（BH）補正によって実行された。データセット内の全ての発現遺伝子をバックグラウンドとして用いて、DAVID v6.7（Huang et al.,Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.Nature Protoc.2009;4(1):44-57；Huang et al.,Bioinformatics enrichment tools:paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.Nucleic Acids Res.2009）を使用して、3つの比較（それぞれ、SNI若齢、シャム高齢、SNI高齢と、シャム若齢との比較）のディファレンシャルに発現された（DE）遺伝子（FDR＜0.05）を、遺伝子オントロジー（GO）およびKEGGパスウェイについて分析した。アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方について、FDR＜0.01によって、GOおよびKEGGパスウェイのカテゴリを選択した。ベン（Venn）図を、Biovennを使用して生成した（BioVenn - a web application for the comparison and visualization of biological lists using area-proportional Venn diagrams,T.Hulsen,J.de Vlieg and W.Alkema,BMC Genomics 2008,9(1):488）。GOおよびKEGGパスウェイから収集された免疫応答に関与するSNI高齢対シャム若齢からのディファレンシャルにアップレギュレートされた遺伝子を、STRINGによって確立されたタンパク質-タンパク質ネットワークについて分析した（Szklarczyk et al.,STRING v11:protein-protein association networks with increased coverage,supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets,Nucleic Acids Res.2019）。実験およびデータベースのアクティブな相互作用ソース、および必要とされる最低相互作用スコアの最も高い信頼度を使用して、ストリンジェントな基準を選択した。ネットワークは、Cytoscapeによって可視化された（Shannon et al.,Cytoscape:a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks,Genome Research 2003 Nov;13(11):2498-504）。

CXCL13 ELISAアッセイ
シャムまたは坐骨神経損傷の3日後に1試料当たり2匹の若齢または老齢のマウスから解剖された坐骨DRGを収集し、プロテアーゼ阻害剤（Roche）を含むマウスCXCL13 ELISAキット（ThermoFisher）から供給された150μLアッセイ希釈液Aにおいて均質化した。均質化後、Triton X-100を最終濃度1％で添加した。試料を液体窒素で凍結させ、解凍した後、破片を除去するため、10,000×gで5分間、遠心分離した。タンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイキット（ThermoFisher）を使用して定量化し、100μLの細胞溶解物を、製造業者のプロトコルに従って、マウスCXCL13 ELISAキットを使用して、CXCL13 ELISAアッセイに使用した。CXCL13 ELISA測定値は、450nmに設定されたELISAプレートリーダーで吸光度を測定し、マイクロプレートの光学的欠陥を補正するため、550nmの値を差し引くことによって得られた。細胞溶解物中のCXCL13濃度は、標準曲線に従って計算された。

免疫組織化学
腹腔内（i.p.）注射を介して、ケタミン/キシラジン混合物（最大80mg/kg体重のケタミンおよび10mg/kg体重のキシラジン）によって、マウスを深麻酔下に置き、5ml/minの流速で、20mlの氷冷PBS、続いて、4％PFAで経心灌流した。後肢のDRG、坐骨神経、または無毛の皮膚を切り出し、氷上で4％PFAで2時間後固定し、30％ショ糖（Sigma）に3日間移した後、OCT化合物（Tissue-Tek）で包埋した。DRGを10μmに、坐骨神経を12μmに、指間足蹠を30μmに、クライオスタット（Leica）によって、皮膚表面に対して垂直に切片化した。切片を、10％正常ヤギ血清または正常ロバ血清（Abcam）および0.3％Triton X-100を含むPBSを含有するブロッキング溶液で室温で1時間処理し、4℃で一晩、一次抗体によって染色した。一次抗体は、抗Tuj1（1:500、Novus、NB100-1612）、抗CXCL13（10μg/ml、R&D SYSTEMS、AF470）、抗ニューロフィラメント200（1:100、Sigma、N4142）、抗CGRP（1:200、Abcam、ab36001）、Alexa Fluor 488コンジュゲートGS-IB4（1:100、ThermoFisher、121411）、抗SCG10（1:500、NOVUS、NBP1-49461）、抗CD8（1:100、ThermoFisher、14-0081-82）、抗CD3（1:100、Abcam、ab16669）、抗CXCR5（1:100、Abcam、ab133706）、抗CD68（1:200、Abcam、ab125212）、抗B220（1:100、Biolegend、103228）、抗MHC-I（1:100、Abcam、ab15681）、抗活性カスパーゼ3（1:200、Cell Signaling、#9664）、抗リン酸化AKT（1:200、Cell Signaling、#4060）、抗リン酸化S6（1:200、Cell Signaling、#5364）、抗パーフォリン（1:100、NOVUS、NBP1-97512）、抗グランザイムB（1:100、Abcam、ab4059）、抗PGP9.5（1:200、Proteintech、14730-1-AP）、抗リン酸化NFκB2（1:100、Abcam、ab194919）、抗ルシフェラーゼ（1:200、Fitzgerald、70R-12141）、抗GFP（1:500、Abcam、ab13970）であった。切片を1×PBSで3回洗浄した後、Alexa Fluor 488ヤギ抗ニワトリ、Alexa Fluor 488ロバ抗ニワトリ、Alexa Fluor 488ヤギ抗ラット、Alexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ、Alexa Fluor 568ロバ抗ヤギ、Alexa Fluor 568ヤギ抗ウサギ（1:1000、ThermoFisher）によって、室温で2時間、二次抗体インキュベーションを行った。次に、切片を、DAPI（Molecular Probes、1:5000）で室温で15分間染色し、Antifade封入剤（Vectashield、H-1000）で封入した。DRGは、20倍の倍率を使用して、Nikon Eclipse TE2000顕微鏡によって画像化された。坐骨神経（20倍の倍率）および表皮（オイルレンズで40倍の倍率）は、Leica TCS SP8共焦点レーザー走査型顕微鏡によって画像化された。

免疫染色の定量化
ImageJソフトウェア（National Institute of Health、USA）によって任意蛍光強度を測定し、バックグラウンドの強度を除外した後、対照群に対して正規化された蛍光強度によって相対倍率変化を計算した。切断カスパーゼ3、パーフォリン、およびグランザイムBの発現について陽性と示された細胞は、バックグラウンドより少なくとも2倍高い蛍光強度を示した。SCG10で染色された坐骨神経の縦切片を、軸索再生について分析した。神経に沿ってSCG10の任意強度を測定し、挫滅の近位部位から0.5mm毎の強度の百分率を定量化した。強度が50％レベルに低下する近位損傷部位からの距離を計算することによって、再生指数も評価した。表皮神経再支配については、皮膚の矢状切片からのPGP9.5染色によって示される表皮内神経線維（IENF）の単位体積当たりの数を測定した。

フローサイトメトリー
インビボでの細胞特徴決定のため、若齢または老齢の未処置動物または坐骨神経損傷動物に、3μgの抗CD45-APC（I3/2.3、Biolegend）を、3分間、静脈内（i.v.）注射した。深麻酔後に、それぞれ、2mM EDTAおよびRPMI-1640培地（ThermoFisher）を含む10ml PBSに、末梢血またはDRGを収集した。RTでの5分間の300gでの遠心分離によって血球を回収し、赤血球を1×RBC溶解緩衝液（Biolegend）を使用して溶解した。細胞をPBSで3回洗浄し、凝集塊を除去するため、70μmセルストレーナー（Corning）で濾過し、染色のため、新鮮なFACS緩衝液（0.5％BSA、2mM EDTAを含むPBS）に再懸濁させた。DRGを1×PBSで1回洗浄し、消化緩衝液（0.5mg/ml CLSPA（Worthington、#LS005273）、7.5μg/ml DNase I（Roche、#10104159001）を含むRPMI-1640）によって、37℃で30分間、解離させた。消化後、DRG組織を分散させ、単一細胞懸濁液を収集するため、70μmセルストレーナーで濾過し、洗浄緩衝液（5％FBSを含むRPMI-1640）で洗浄した。遠心分離後、ペレットを、DNase溶液（250μg/ml DNase I、1×DNase緩衝液（1.21g/L Tris Base、0.5 g/L MgCl2、および0.073g/L CaCl2を含むRPMI-1640溶液））に、RTで30分間、再懸濁させた。細胞を染色のためFACS緩衝液で洗浄した。

血液およびDRG試料から単離された細胞を、Fc受容体をブロッキングするため、100μl体積の106細胞当たり1.0μgのTruStain FcX抗マウスCD16/32抗体（Biolegend）で、氷上で10分間、処理し、Brilliant Stain緩衝液（BD Horizon）を含むFACS緩衝液で染色した。以下の抗マウス抗体を抗原に対して使用した：Pacific Blueコンジュゲート抗CD45（30-F11、Biolegend、2μg/ml）、FITCコンジュゲート抗CD62L（MEL-14、Biolegend、5μg/ml）、Brilliant Violet 605コンジュゲート抗CD19（6D5、Biolegend、1μg/ml）、Brilliant Violet 711コンジュゲート抗CD8（53-6.7、Biolegend、2μg/ml）、Brilliant Violet 785コンジュゲート抗TCRβ（H57-597、Biolegend、2μg/ml）、APCコンジュゲート抗CD4（RM4.5、BD、2μg/ml）、APC/CY7コンジュゲート抗CD44（IM7、Biolegend、2μg/ml）、PE/CY7コンジュゲート抗CD69（H1.2F3、ThermoFisher、2μg/ml）、ビオチンコンジュゲート抗CXCR5（SPRCL5、ThermoFisher、5μg/ml）、FITCコンジュゲート抗CD11b（M1/70、ThermoFisher、2.5μg/ml）、APCコンジュゲート抗F4/80（T45-2342、BD、2μg/ml）。死細胞を染色から除外するため、LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stainキット（ThermoFisher）も使用した。細胞を、カクテル抗体で、4℃で暗所で20分間、染色し、洗浄後、2μg/mlのPE-ストレプトアビジン（Biolegend）で、4℃で20分間、染色した。Fluorescence Minus One（FMO）およびPE-ストレプトアビジン染色対照をゲーティング境界のために使用した。細胞取得前の抗CXCR5脱落を最小限に抑えるため、染色された細胞を、IC固定緩衝液（ThermoFisher）で、RTで20分間、直ちに固定した。細胞をPBSで洗浄し、FACS緩衝液に再懸濁させた。フローサイトメーターLSR II（BD Biosciences）による細胞取得前に、20μlのPrecision Count Beads（Biolegend、424902）を各試料に添加した。

細胞枯渇実験
インビボのCD8 T細胞を枯渇させるため、22～24ヶ月齢のマウスに、坐骨神経挫滅損傷前の1週間に、1日おきに3回、200μgのInVivoMAbラットIgG2bアイソタイプ対照（LTF-2、BioXcell、BE0090）またはInVivoMAb抗マウスCD8α（YTS 169.4、BioXcell、BE0117）を注射した。坐骨神経挫滅の後、動物が麻酔から完全に回復した時に、1回の追加の注射を実施した。神経損傷の3日後に、DRGおよび神経を解剖し、続いて、FACS、免疫染色、または再生アッセイを行った。CD4 T細胞の枯渇は、InvivoMAb抗マウスCD4（YTS 191、BioXcell、BE0119）およびラットIgG2bのアイソタイプ対照を使用して、CD8 T細胞枯渇のために使用されたのと同じ計画によって実施された。B細胞の枯渇は、以前に記載された戦略に従って実施された（Keren et al.,2011）。150μgのInvivoMAb抗マウスCD19（1D3、BioXcell、BE0150）、150μgのInvivoMAb抗マウスB220（RA3.3A1/6.1、BioXcell、BE0067）、150μgのInvivoMAb抗マウスCD22（Cy34.1、BioXcell、BE0011）の抗体カクテルを老齢マウスにi.p.注射した。48時間後、二次抗体InvivoMAb抗ラットカッパ（MAR18.5、BioXcell、BE0122）を、マウス1匹当たり150μgの用量で、マウスに注射した。全ての注射を、坐骨神経損傷前の1週間に2回、損傷の翌日にもう1回、実施した。ラットIgG2a（2A3、BioXcell、BE0089）、ポリクローナルラットIgG（BioXcell、BE0094）、マウスIgG1（MOPC-21、BioXcell、BE0083）、およびマウスIgG2a（C1.18.4、BioXcell、BE0085）を使用して、使用された抗体と同じアイソタイプの対照IgGを注射した。

CXCL13中和
DRGエクスビボ培養のため、若齢マウスおよび老齢マウスを、1週間に3回、30mg/kgの対照IgGまたは抗CXCL13抗体（抗CXCL13モノクローナル抗体（mAb 5378-41）および対照IgG2a（mAb 2510））によってi.p.処理した後、DRG解剖および初代細胞培養を行った。単離されたDRG細胞を5％CO₂中で37℃で24時間インキュベートした後、神経突起伸長測定を行った。インビボでのCXCL13中和のため、坐骨神経挫滅の4時間後および3日目の屠殺まで毎日、30mg/kgの対照IgGまたは抗CXCL13抗体を、若齢または老齢マウスにi.p.注射した。慢性神経再生研究のため、30mg/kgの対照IgGまたは抗CXCL13抗体を、損傷の4時間後から、動物を屠殺するまで、週3回、i.p.注射した。

行動査定
坐骨神経挫滅および対照IgGまたは抗CXCL13抗体の慢性投与を受けたマウスを、行動査定に使用した。坐骨神経および後肢の左側に損傷を与え、査定した。行動評価に参加した研究者には、群および処置が知らされなかった。

機械感受性試験
マウスを、順応のため、試験チャンバーに30分間置いた後、行動査定を開始した。機械感受性は、0.4g～4gの範囲の較正されたフォンフライフィラメントによって左後肢の足底表面をプロービングすることによって決定された。基線に戻るのに十分な時間を感覚受容器に与えるため、各トライアルの間隔は少なくとも30秒であった。迅速な後肢退避を陽性反応と見なした。各マウスについて5回のトライアルを実行し、3回の陽性退避反応からの潜時の値を平均化した。閾値は、モノフィラメントの力の最低レベルに設定された。

熱感受性試験
熱感受性については、以前に記載されたように、ハーグリーブス試験を実施した（Chen et al.,(2014).Nature Communications 5,5331;Hargreaves et al.,(1988).Pain 32,77-88）。簡単に説明すると、マウスをガラスの床に置き、プラスチックチャンバーで分離した。順応させるため、マウスに30分間与えた。熱刺激（赤外線放射源、強度＝50）を後肢の足底表面の下に、10秒未満、注意深く置いた。後肢退避時間を自動的に記録した。各肢に対して5回のトライアルを行い、最長および最短の退避時間を含め、平均値を計算した。

粘着物除去
小さい粘着刺激（1/4インチの丸い粘着ラベル）をマウスの左後肢に置き、両前肢または口で最初に触れるまでの時間、および粘着物を完全に除去するまでの時間を記録した。神経損傷前の1週間に、マウス1匹につき毎日10分間のトレーニングを実施した。各マウスは3回のトライアルを受けた。全ての試験が、動物のホームケージにおいて盲検的に実施された。

統計分析
特記しない限り、データは、Graphpad Prism 8.0（Graphpad Software Inc.,La Jolla,CA）によって統計的に分析され、平均値±SEMとして表された。2つの群についての統計的比較は、対応のないスチューデントt検定を使用して分析された。複数の群は、事後チューキー補正による一元配置分散分析（ANOVA）、またはチューキーもしくはシダックの検定による二元配置分散分析を使用して分析された。統計的有意性をp＜0.05と見なした。

実施例2.神経損傷後の遺伝子発現に対する加齢の効果：ニューロンCXCL13は老齢DRGにおいて上昇する
後根神経節（DRG）における遺伝子発現に対する加齢の効果を、神経損傷前（シャム）および神経損傷後の8～10週齢（若齢）マウスおよび20～22週齢（老齢）マウスから得られた坐骨DRGからのRNA配列決定（RNA seq）によって査定した。X匹の若齢マウスおよび老齢マウスの坐骨神経に、鉗子で神経に圧迫を加えることによって、挫滅を与えた。各マウスは、前記のように、坐骨神経に、ほぼ同じ時点で、損傷またはシャム処置を受けた。24時間後、坐骨神経損傷（SNI）またはシャム損傷の部位付近のDRGを取り出し、そこからRNAを抽出し、配列決定した。DRGからの遺伝子発現の変化を、若齢シャム動物における基線発現と比較して、老齢シャム、SNI後の若齢および老齢において査定した。有意にディファレンシャルに発現された（DE）遺伝子（FDR＜0.05）を、機能的分類のため、遺伝子オントロジー（GO）およびKEGGによって分析した。典型的には、神経新生、神経伝達物質、イオン輸送、G共役シグナル伝達、およびシグナル伝達に関与する、若齢動物においてSNI後にアップレギュレートされたGOクラスは、SNI後を含め、老齢DRGにおいてはディファレンシャルにエンリッチされ得なかった（データは示されない）。しかしながら、GO分析による最も顕著な所見は、老齢DRGが、SNIの前後の両方で、T細胞シグナル伝達および部分的なB細胞シグナル伝達を含む適応免疫応答について極めて有意なエンリッチメントを示したことであった。KEGG分析は、免疫応答およびシグナル伝達ならびにサイトカイン/ケモカインシグナル伝達の年齢および損傷に関連する顕著な変化の存在をさらに強調した。損傷後の老齢DRGにおけるDE遺伝子の大部分（66.6％のアップレギュレーション、65％のダウンレギュレーション）が、加齢依存性であった。

免疫応答の顕著な加齢依存性制御が公知であるため、免疫応答に関与する転写物を分析した。分析は、CXCL13が、坐骨神経損傷の前後の両方で、加齢に関連して、群を抜いて最も顕著にアップレギュレートされる遺伝子であることを示した。CXCL13ケモカイン受容体CXCR5の発現も、老齢DRGにおいて有意に増強され（図1A）、このことから、CXCL13/CXCR5シグナル伝達軸の存在が示唆された。坐骨神経挫滅の3日後のDRGにおけるニューロン特異的成長関連タンパク質であるSCG10の発現および局在、ならびに挫滅部位の近くにおける染色の強度の測定は、若齢動物と比較した、老齢における再生の低下を示した（図1B、C）。抗CXCL13免疫染色は、坐骨神経損傷の前および3日後の両方で、老齢坐骨DRGニューロンにおけるCXCL13発現の有意な増加を示した（図1Dおよび1Eおよび1F）。

実施例3.CXCL13受容体CXCR5を発現するCD8⁺T細胞は老齢DRGにおいて上昇する
CXCL13のインビボニューロン発現がCXCR5+T細胞を誘引するか否かを決定するため、若齢マウスの坐骨神経にAAV-GFPまたはAAV-CXCL13-GFPを感染させることによって、DRGニューロンにおいてCXCL13を過剰発現させた。感染の6週間後、それぞれ、MHC-Iの提示を誘導し、血液関門透過性を有利にするため、インターフェロンγ（IFNγ）およびマンニトールを全身送達し、その直後に坐骨神経挫滅を実施し、損傷後3日目の坐骨DRGにおいてFACSによってCXCR5+T細胞を測定した（データは示されない）。興味深いことに、CXCR5+CD8+T細胞は、GFP対照と比較して、CXCL13過剰発現DRGにおいて有意に増加することが見出された（図2AおよびB）。

CXCL13はCXCR5陽性のB細胞およびT細胞の走化性因子であるため、DRG内のCD8+T細胞の局在および免疫表現型を査定した。免疫染色は、CXCR5+CD8+T細胞の数が、若齢と比較して老齢坐骨DRGにおいて有意に多いこと（図2C）、坐骨損傷の3日後に、若齢DRGと比較して、老齢において、全CD8+T細胞に対する百分率としてのCXCR5+CD8+T細胞の頻度が増加することを示した（図2D）。これらのデータは、CXCL13のニューロン発現の増強および坐骨神経損傷後のDRG内に局在するCXCR5+CD8+T細胞の数の増加の両方に、加齢が関連していることを示している。これらのデータは、老齢DRGの組織微小環境が、神経損傷後、若齢と有意に異なることを証明している。

実施例4.CD8+T細胞は、坐骨神経損傷後の加齢依存性の再生能衰退と選択的に関連しており；ニューロンMHC-1は、老齢DRGにおいて誘導され、坐骨神経損傷後の加齢依存性の再生能衰退において重要な役割を果たす
CD8 T細胞が老齢坐骨DRGニューロンの軸索再生を損なうか否かの分析を行った。坐骨神経挫滅の1週間前に老齢マウスに全身的にi.p.注射された抗CD8モノクローナル抗体を使用して、CD8 T細胞の枯渇を実施し、一方、対照動物は、正常アイソタイプ一致IgGを受容した。SCG10陽性坐骨神経軸索の分析は、抗CD8モノクローナル抗体が、神経再生を有意に促進すること（図3A～B）、免疫蛍光分析によって示されたように、DRG内のCD8 T細胞の有意な低下をもたらすことを示した（図3C）。全く対照的に、同じ実験的損傷モデルにおいて、抗CD4モノクローナル抗体によるCD4 T細胞の枯渇またはモノクローナル抗CD19/抗B220/抗CD22抗体によるB細胞の枯渇は、坐骨神経損傷後の加齢依存性の再生能衰退を改変しなかった（示されない）。

これらのデータは、老齢動物におけるSNI後の再生能衰退にCD8+T細胞が関与していることを直接かつ選択的に示す。

RNAseqデータは、主要組織適合遺伝子複合体クラスI（MHC-I）の加齢依存性エンリッチメントを明らかにした。MHC-Iは、T細胞受容体（TCR）と会合した後に、CD8 T細胞を活性化するために、細胞膜上に抗原性ペプチドを提示するため、抗原提示細胞（APC）によって発現される（Zinkernagel,(2002).European Journal of Immunology 32,2385-2392）。DRGにおけるMHC-Iについての免疫染色は、坐骨神経損傷の前後に、老齢DRGニューロンにおけるMHC-Iの発現の増加を示した（図4A）。しかしながら、SNIは、ニューロン細胞表面上のMHC-I局在によって示唆されるように、抗原提示可能なDRGニューロンの百分率の有意な増加と関連していた（図4B）。

次の工程は、MHC-I依存性ペプチド提示が、坐骨神経損傷後の老齢における軸索再生能衰退において重要な役割を果たすか否かを示すことであった。この目的のため、CD8 T細胞免疫応答を回避する、MHC-I抗原提示を阻害するウイルスによってコードされたペプチド配列GArを、老齢マウスの坐骨DRGにおいて発現させるため、AAVベースのアプローチを使用した（Zaldumbide and Hoeben,(2008).Biotechnology Letters 32,749-754）。GArは、ルシフェラーゼレポーターによるテトラサイクリン/ドキシサイクリン誘導性発現に応答するリバーステトラサイクリントランスアクチベーター（rtTA）と連結されていた（図4C、D）（Burnside et al.,(2018).Brain 141,2362-2381;Hoyng et al.,(2014).Gene therapy 21,549-557;Zaldumbide et al.,(2010).Biotechnology Letters 32,749-754）。具体的には、坐骨神経に、5週間、等量のAAV-ルシフェラーゼとAAV-GAr-rtTAまたは対照AAV-rtTAとの混合物を両側注射し、その後、1週間、ドキシサイクリンをi.p.投与した。次に、坐骨神経挫滅損傷を実施し、3日後に動物を屠殺した。MHC-Iおよび切断カスパーゼ3の発現は、対照AAV-rtTAと比較して、AAV-GAr-rtTA後のルシフェラーゼ陽性DRGニューロンにおいて有意に低下した（図4E）。SCG10免疫染色によって測定された坐骨神経索再生は、AAV-GAr-rtTA感染時に有意に増強された（図4F、G）。

総合すると、これらのデータは、CD8+T細胞およびニューロンMHC-Iが、SNI後の加齢依存性の再生能衰退において重要な役割を果たすことを示唆している。

実施例5.CXCL13中和は、加齢依存性の再生能衰退を逆転させ、坐骨神経損傷後の神経学的機能的回復を促進する
CXCL13の中和が老齢動物における軸索再生、表皮神経支配、および機能的回復を促進するか否かを、図5Aの模式図に概説された戦略を使用して調査した。最初の実験において、CXCL13に対するモノクローナル抗体または対照IgGを、坐骨神経挫滅損傷後に3日間、毎日、若齢マウスまたは老齢マウスに前記のように腹腔内注射した。軸索再生を、前記のように抗SCG10免疫染色によって測定した。抗CXCL13抗体は、加齢依存性の再生障害を阻止し、若齢における軸索再生に対しては効果を及ぼさなかった（図5B～C）。CXCL13中和は、老齢DRGにおけるCXCR5+T細胞およびB細胞の数を有意に低下させた（図5D）。別の実験において、機能的回復に対する抗CXCL13抗体の長期送達を試験した。前記のように、CXCL13に対するモノクローナル抗体または対照IgGを、損傷の4時間後から開始して、5週間以上にわたり、週3回、若齢動物または老齢動物に送達した。フォンフライによって機械刺激に対する反応を測定し、テープ除去試験によって接触に対する反応を測定し、ハーグリーブスによって熱侵害受容に対する反応を測定する、マルチモーダル感覚査定を実施した（図5A）。データ分析は、老齢マウスの回復が若齢と比較して有意に遅いことを示し、そして、重要なことに、CXCL13中和が、老齢マウスにおいて選択的に調査された感覚モダリティの全てにおいて、老齢マウスの回復の有意な加速を誘導することを示した（図5E～J）。CXCL13中和が表皮神経支配の改善をもたらすか否かを、抗CXCL13または対照IgGの送達後の若齢マウスおよび老齢マウスの両方における、坐骨神経損傷の18日後の後肢の無毛指間区域からのPGP 9.5免疫染色によって測定した。CXCL13中和は、老齢マウスにおいて有意な表皮神経支配を促進することが見出された（図5K、L）。

これらのデータは、CXCL13拮抗が、熱感受性および機械受容の両方において機能的回復をもたらすことを示している。

総合すると、これらのデータは、CXCL13中和が、老齢動物における軸索再生、表皮神経再支配、および機能的回復を促進することを示している。

Claims (32)

1. 加齢依存性の再生能衰退を有する対象における末梢神経損傷の処置において使用するための、CXCL13と特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
2. CXCL13活性を阻害する、請求項1記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
3. 阻害されるCXCL13活性が、損傷を負った末梢神経の後根神経節（DRG）へのCXCR5+CD8+T細胞の動員である、請求項2記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
4. CXCL13とその受容体との相互作用を阻害する、請求項1記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
5. CXCL13受容体がCXCR5である、請求項4記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
6. Mab 5378、MAb 5261、MAb5080、MAb1476、3D2、3C9、MAb 5091、MAb 1758、またはMAb 0745からなる群より選択される基準モノクローナル抗体のCXCL13との特異的結合を競合的に阻害する、請求項1～5のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
7. Mab 5378、MAb 5261、MAb5080、MAb1476、3D2、3C9、MAb 5091、MAb 1758、またはMAb 0745からなる群より選択される基準モノクローナル抗体と同じCXCL13エピトープと特異的に結合する、請求項1～5のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
8. （A）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:26、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；
   （B）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:27、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；
   （C）それぞれSEQ ID NO:19、22、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:28、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；または
   （D）それぞれSEQ ID NO:20、23、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:29、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL
   を含む、請求項1～5のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
9. 前記抗体またはその抗原結合性断片のVHおよびVLが、（i）それぞれSEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7；（ii）それぞれSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9；（iii）それぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11；（iv）それぞれSEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13；（v）それぞれSEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15；ならびに（vi）それぞれSEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17からなる群より選択されるVHおよびVLの配列と同一のアミノ酸配列を含む、請求項1～5のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
10. MAb 5261、MAb 5091、MAb 1476、MAb 1758である、請求項1～5のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
11. 末梢神経損傷が、坐骨神経損傷、腓骨神経損傷、脊髄副神経損傷、および腕神経叢損傷からなる群より選択される、請求項1～10のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
12. 前記使用が、損傷を負った神経の完全もしくは部分的な再生、表皮組織の神経再支配、または損傷を負った神経の神経学的機能の完全もしくは部分的な回復、またはそれらの組み合わせをもたらす、請求項11記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
13. 加齢依存性の再生能衰退および末梢神経損傷を有する対象における末梢神経損傷の処置において使用するための、CXCL13と特異的に結合する有効量の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
14. 末梢神経損傷が末梢神経の圧迫、伸展、または切断の結果である、請求項13記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
15. 末梢神経損傷が坐骨神経、腕神経叢、腓骨神経、または脊髄副神経の損傷である、請求項13または14記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
16. 末梢神経損傷が坐骨神経損傷である、請求項15記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
17. CXCL13とその受容体との相互作用を阻害する、請求項13～16のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
18. 受容体がCXCR5である、請求項17記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
19. （A）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:26、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；
    （B）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:27、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；
    （C）それぞれSEQ ID NO:19、22、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:28、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；または
    （D）それぞれSEQ ID NO:20、23、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:29、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL
    を含む、請求項13～18のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
20. 前記抗体またはその抗原結合性断片のVHおよびVLが、（i）SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7；（ii）それぞれSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9；（iii）それぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11；（iv）それぞれSEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13；（v）それぞれSEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15；ならびに（vi）それぞれSEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17からなる群より選択されるVHおよびVLの配列と同一のアミノ酸配列を含む、請求項13～18のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
21. Mab 5378、MAb 5261、MAb5080、MAb1476、MAb 5091、MAb 1758、3D2、および3C9からなる群より選択される基準モノクローナル抗体のCXCL13との特異的結合を競合的に阻害するヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項13～18のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
22. MAb 5261、MAb 5091、MAb 1476、またはMAb 1758である、請求項21記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
23. それを必要とする対象における加齢依存性の再生能衰退の処置において使用するための、CXCL13と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片。
24. CXCL13とその受容体との相互作用を阻害する、請求項23記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
25. 受容体がCXR5である、請求項24記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
26. 前記単離された抗体またはその抗原結合性断片が、Mab 5378、MAb 5261、MAb5080、MAb1476、MAb 5091、MAb 1748、3D2、および3C9からなる群より選択される基準モノクローナル抗体のCXCL13との特異的結合を競合的に阻害する、請求項23～25のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
27. （A）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:26、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；
    （B）それぞれSEQ ID NO:18、21、および24に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:27、30、および33に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；
    （C）それぞれSEQ ID NO:19、22、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:28、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL；または
    （D）それぞれSEQ ID NO:20、23、および25に記載の重鎖相補性決定領域1（VH-CDR1）、VH-CDR2、およびVH-CDR3のアミノ酸配列を含むVH；ならびに、それぞれSEQ ID NO:29、31、および34に記載の軽鎖相補性決定領域1（VL-CDR1）、VL-CDR2、およびVL-CDR3のアミノ酸配列を含むVL
    を含む、請求項23～26のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
28. 前記抗体またはその抗原結合性断片のVHおよびVLが、（i）SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7；（ii）それぞれSEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:9；（iii）それぞれSEQ ID NO:10およびSEQ ID NO:11；（iv）それぞれSEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:13；（v）それぞれSEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:15；ならびに（vi）それぞれSEQ ID NO:16およびSEQ ID NO:17からなる群より選択されるVHおよびVLの配列と同一のアミノ酸配列を含む、請求項23～26のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
29. 前記単離された抗体またはその抗原結合性断片がMAb 5261、またはMAb 5091、Man 1476、またはMAb 1758である、請求項23～28のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
30. 対象が末梢神経損傷を有する、請求項23～29のいずれか一項記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
31. 末梢損傷が坐骨神経損傷、腕神経叢損傷、脊髄副神経損傷、または腓骨神経損傷である、請求項30記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。
32. 末梢神経損傷が坐骨神経損傷である、請求項31記載の使用のための抗体またはその抗原結合性断片。

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