KR20230135375A - 랄스토니아 유트로파 균주를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법 - Google Patents
랄스토니아 유트로파 균주를 이용한 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 균주를 이용하여 3HHx(3-hydroxyhexanoate)를 높은 비율로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs)를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 3HHx를 고비율로 함유하는 삼원 공중합체 P의 산업적 생산에 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 3HHx를 고비율로 함유하는 삼원 공중합체 P의 산업적 생산에 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 균주를 이용하여 3HHx(3-hydroxyhexanoate)를 높은 비율로 함유하는 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs)를 생산하는 방법에 관한 것이다.
폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs)는 특정 영양소가 제한된 조건(예컨대, 인, 질소, 산소 또는 미량 원소의 부족) 또는 탄소 공급이 과도할 때 박테리아가 축적하여 탄소와 에너지를 저장하는 재생 가능하고 생분해성을 갖는 생체 고분자이다. PHA는 고분자의 반복단위 구조에 따라 여러 유형으로 분류되며, 3HB(3-hydroxybutyrate), 3HV(3-hydroxyvalerate), 3HHx(3-hydroxyhexanoate)와 같이 포함하는 단량체에 따라 다른 특성을 가지고 있다. 일반적으로 자연적으로 발생하는 대부분의 PHA 과립에는 3HB만 포함되어 있어 가공 및 플라스틱 용도에 적합하지 않다. 그러나, 공중합체(copolymers) 또는 삼원 공중합체(terpolymers)의 경우에는 더 낮은 융점과 더 높은 유연성을 가져, 석유 유래 플라스틱과 더 유사하다. 또한, PHA는 생분해성이고 살아있는 세포나 조직에 독성 또는 부정적인 영향을 미치지 않기 때문에 다양한 의료 분야에 적용할 수 있으며, 기존 제품과의 혼합재 및 복합재는 항암 또는 항염증 효과와 같은 추가적인 특성을 나타내기도 한다.
잘 알려진 PHA 생성 박테리아 중 하나인 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)는 건조 세포 중량의 최대 80%까지 PHA를 축적할 수 있다. 그러나 야생형 균주는 3HB 단량체만 합성할 수 있어, 많은 이전 연구에서 다양한 단량체를 함유하는 PHA를 생산하기 위해 다른 기질들을 사용하여 R. eutropha의 배양을 시도해왔다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 R. eutropha로부터 PHA로서 3HB, 3HV 및 3HHx를 함유하는 삼원 공중합체 P를 생산하기 위해 예의 노력한 결과, 동유(Tung oil)를 탄소원으로 하여 재조합 R. eutropha 균주인 R. eutropha Re2133/pCB81 균주(Jeon JM, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 5461-5469.)에서 3HHx를 고비율로 함유하는 삼원 공중합체 P를 생산할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs) 생산 균주를 동유를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, PHA 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 총 배지 부피에 대하여 동유를 0.5 내지 3%(v/v)로 포함하는, PHA 생산 균주 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 총 배지 부피에 대하여 동유를 0.5 내지 3%(v/v)로 포함하는, PHA 생산 균주 배양용 배지 조성물; 상기 배지 조성물에서 배양된 PHA 생산 균주의 배양액; 또는 상기 배지 조성물에서 배양된 PHA 생산 균주를 포함하는, PHA 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 본 발명의 방법으로 생산된 PHA를 포함하는, 필름을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs) 생산 균주를 동유를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, PHA 생산 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "동유(Tung oil)"는 차이나 우드 오일 트리(China wood oil tree) 또는 버니시아 포르디(Vernicia fordii)라고도 하는 동유 나무(Tung oil tree)의 씨앗에서 생산되는 기름을 의미한다. 동유의 거의 80%는 백본에 공액 이중 결합(conjugated double bonds)이 있는 α-엘레오스테아르산(α-eleostearic acid) ((9Z,11E,13E)-octadeca-9,11,13-trienoic acid)으로 이루어져 있다. 따라서 동유는 아마인유, 들깨유와 같이 요오드가가 비슷한 다른 식물성 기름에 비해 건조 시간이 더 빠르며, 바니시 및 잉크 생산에서 고품질 및 고속 건성유로 사용되어 왔다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 배지는 동유를 포함할 수 있다. 상기 배지는 총 배지 부피에 대하여 동유를 0.5 내지 3%(v/v)로 포함하는 것일 수 있다. 일예로, 상기 동유는 총 배지 부피에 대해 약 0.5 내지 3%(v/v), 약 1 내지 0.5%(v/v)로 첨가될 수 있고, 구체적으로 약 2%(v/v)로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 발명의 균주는 PHA 생산능을 갖는 균주일 수 있다.
본 발명의 균주는 PHA를 생산할 수 있는 균주라면 특별히 제한되지 않으며, 자연적으로 phaB1, phaB2, phaB3 또는 phaC1를 가지고 있지 않거나, phaC2Ra, phaA 또는 phaJ1Pa를 가지고 있거나, PHA 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 phaB1, phaB2, phaB3 또는 phaC1를 가지고 있거나, phaC2Ra, phaA 또는 phaJ1Pa을 가지고 있지 않거나, PHA 생산능이 없는 모균주에 i) phaB1, phaB2, phaB3, phaC1 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손; 및 ii) phaC2Ra, phaA, phaJ1Pa 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나, 및/또는 PHA 생산능이 부여된 미생물 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
하나의 예로, 본 발명의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 PHA를 생산하는 미생물에 i) phaB1, phaB2, phaB3, phaC1 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손되고, ii) phaC2Ra, phaA, phaJ1Pa 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 PHA 생산능이 부여된 재조합 균주일 수 있다. 상기 PHA 생산능이 부여된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 비변형 미생물 (즉, phaC2Ra, phaA 또는 phaJ1Pa을 발현하지 않거나, phaB1, phaB2, phaB3 또는 phaC1를 발현하는 미생물)에 비하여 PHA 생산능이 증가된 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 단백질이 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 발명에 있어서, PHA 생산 균주는 일예로, 랄스토니아 속 균주(Ralstonia sp.)일 수 있고, 다른 일예로, 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 PHA 생산 균주는 유전적으로 조작된 재조합 균주일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 재조합 균주는 i) phaB1, phaB2, phaB3, phaC1 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손되고; ii) phaC2Ra, phaA, phaJ1Pa 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 랄스토니아 유트로파 균주일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 랄스토니아 유트로파 균주, phaB1, phaB2, phaB3, phaC1, phaC2Ra, phaA 및 phaJ1Pa에 대해서는 이전 연구(Jeon JM, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 5461-5469.)를 참고할 수 있다.
본 발명에서 용어, "폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs)"는 특정 영양소가 제한된 조건(예컨대, 인, 질소, 산소 또는 미량 원소의 부족) 또는 탄소 공급이 과도할 때 박테리아가 축적하여 탄소와 에너지를 저장하는 재생 가능하고 생분해성을 갖는 생체 고분자이다. PHA는 고분자의 반복단위 구조에 따라 여러 유형으로 분류되며, 3HB(3-hydroxybutyrate), 3HV(3-hydroxyvalerate), 3HHx(3-hydroxyhexanoate)와 같이 포함하는 단량체에 따라 다른 특성을 가지고 있다. 일반적으로 자연적으로 발생하는 대부분의 PHA 과립에는 3HB만 포함되어 있어 가공 및 플라스틱 용도에 적합하지 않다. 그러나, 공중합체(copolymers) 또는 삼원 공중합체(terpolymers)의 경우에는 더 낮은 융점과 더 높은 유연성을 가져, 석유 유래 플라스틱과 더 유사하다. 또한, PHA는 생분해성이고 살아있는 세포나 조직에 독성 또는 부정적인 영향을 미치지 않기 때문에 다양한 의료 분야에 적용할 수 있으며, 기존 제품과의 혼합재 및 복합재는 항암 또는 항염증 효과와 같은 추가적인 특성을 나타내기도 한다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 PHA는 3HB(3-hydroxybutyrate), 3HV(3-hydroxyvalerate) 및 3HHx(3-hydroxyhexanoate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단량체를 포함할 수 있고, 일예로 3HB, 3HV 및 3HHx 중 선택되는 어느 둘 이상을 포함하는 공중합체(copolymers)일 수 있으며, 다른 일예로 3HB, 3HV 및 3HHx을 포함하는 삼원 공중합체(terpolymers)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 삼원 공중합체는 삼원 공중합체 P와 혼용될 수 있다.
하나의 예로, 본 발명의 방법으로 생산된 PHA는 3HB, 3HV 및 3HHx을 포함하는 삼원 공중합체 P로서, 3HHx 단량체를 약 43 mol% 이상, 약 44 mol% 이상, 약 45 mol% 이상으로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 건은 아니나, 구체적으로 약 45 mol% 내지 70 mol%로 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 예로, 본 발명의 방법으로 생산된 PHA는 3HB 단량체를 약 20 mol% 이상, 약 30 mol% 이상, 약 40 mol% 이상으로 포함할 수 있고, 구체적으로 약 40 mol% 내지 55 mol%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 예로, 본 발명의 방법으로 생산된 PHA는 3HV 단량체를 약 0.1 mol% 이상, 약 0.5 mol% 이상, 약 1 mol% 이상으로 포함할 수 있고, 구체적으로 약 1 mol% 내지 10 mol%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 본 발명의 배지는 동유 및/또는 효모 추출물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배지에서 PHA 생산 균주를 배양할 경우 HHx를 45 mol% 이상의 고함량으로 포함하는 PHA를 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 탄소 공급원으로 과당을 함유하는 배지에서 배양한 재조합 랄스토니아 유트로파 균주로부터 PHA로서 HHx(hydroxyhexanoate)는 함유하지 않고 다량의 3HB(3-hydroxybutyrate) 및 소량의 3HV(3-hydroxyvalerate)를 함유하는 삼원 공중합체(terpolymers) P(99.3 mol% 3HB-co-0.7 mol% 3HV)가 생산되었으나, 동유를 함유한 배지에서 배양한 균주에서는 PHA로서 다량의 HHx(HHx 함량 45mol% 이상) 및 3HB를 함유하고 소량의 3HV를 함유하는 삼원 공중합체 P가 생산되었다. 동유가 단일 탄소원으로 사용될 때 생산된 PHA에서 HHx 몰 분율은 전체 PHA의 거의 50%를 차지하였다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 동유의 농도는 총 배지 부피의 2%(v/v)로 고정하고, 총 배지 부피의 0.1%(v/v) 농도로 고정된 다양한 질소 공급원(효모 추출물, 카제인(casein), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), NH4NO3, (NH4)2SO4, NH4Cl)을 배지에 첨가하여 세포 성장 및 PHA 생산을 비교한 결과, 효모 추출물 사용시 세포 성장 및 PHA 생산이 가장 우수하였으며(도 2a), 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.2%(v/v))의 효모 추출물에서 PHA 생산량을 분석한 결과, 0.05%(v/v) 효모 추출물이 배지에 첨가되었을 때 HHx의 몰 분율은 최대 61%이었고, 효모 추출물의 농도가 0.1%(v/v)에서 0.2%(v/v)로 증가함에 따라 총 PHA 생산은 0.506 g/L에서 1.013 g/L로 두 배로 증가한 반면, HHx의 비율은 55%에서 48%로 감소하였다. 따라서, 건조 세포 중량(dry cell weigh, DCW) 및 PHA 함량을 기준으로 0.2% 농도의 효모 추출물에서 세포 성장(2.22g DCW/L) 및 PHA 생산(1.01g/L)이 우수한 것을 확인하였다(도 2b,c).
본 발명의 또 다른 일 구현예에서, PHA 생산에 대해 최적화된 배지(동유를 2%(v/v), 및 효모 추출물을 0.2%(v/v) 농도로 첨가한 배지)에서 R. eutropha Re2133/pCB81 균주를 96시간 동안 배양한 결과, 96시간에 최대 PHA(0.68g/L) 및 세포 바이오매스(1.65g/L)가 측정되었다(도 3a,b). 가장 높은 HHx 몰 분율은 48시간 후 61.9 mol%였으며, HHx의 비율은 시간이 지남에 따라 감소하여 96시간 후에 삼원 공중합체 P(53 mol% 3HB-co-2 mol% 3HV-co-45 mol% HHx)를 생성하였다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에서, PHA 생산을 배치 발효를 통해 스케일업(scale-up)한 결과, 균주는 5.37g/L의 DCW 및 1.09g/L의 PHA를 생산했으며, 96시간 후에 20.4%의 PHA 함량을 나타내었다(도 6a). PHA의 몰분율을 분석한 결과, HHx 고함유 삼원 공중합체 P(44 mol% 3HB-co-10 mol% 3HV-co-46 mol% HHx)가 생성되었으며, 스케일업 과정에서도 높은 비율의 HHx가 유지되었다(도 6b).
상기 결과로부터, 동유 및 효모 추출물을 배지에 특정 농도로 첨가함으로써 재조합 R. eutropha Re2133/pCB81 균주에서 3HHx를 45 mol% 이상의 고비율로 함유하는 삼원 공중합체 P를 생산할 수 있음을 확인하였다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 생산된 PHA의 HHx 함량은 45 mol% 이상으로, 종래 R. eutropha 균주에서 보고된 것 중 가장 높다. 이전 보고에 따르면, R. eutropha 균주에서 생산된 PHA의 HHx 함량은 22 mol%(Bhatia SK, Bioprocess Biosyst. Eng. 2017, 41, 229-235.), 23.3 mol%(Budde CF, Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, 2847-2854.; Riedel SLS, Biotechnol. Bioeng. 2011, 109, 74-83.)로 보고되었으며, 최대 42% 3HHx 단량체를 포함하는 PHA(Jeon JM, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 5461-5469.)가 보고되었을 뿐이다.
이에, 본 발명은 동유를 배지에 첨가하여 PHA 생산 균주를 배양할 경우, 이전 보고된 PHA의 HHx 함량 대비 현저히 높은 HHx 함량을 갖는 PHA를 생산할 수 있음을 최초로 확인한 것에 의의가 있다.
본 발명에서, 용어 "배양"은 본 발명의 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "배지"는 본 발명의 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 발명의 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 탄소원으로는 동유; 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 탄소원은 동유일 수 있으며, 상기 동유는 총 배지 부피에 대해 약 0.5 내지 3%(v/v), 약 1 내지 0.5%(v/v)로 첨가될 수 있고, 구체적으로 약 2%(v/v)로 첨가될 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 동유를 상기 농도 범위를 초과하여 첨가할 경우, 생산된 PHA 내 HHx 함량이 감소할 수 있고, 상기 농도 범위 미만으로 첨가할 경우 균주 성장이 잘 이루어지지 않을 수 있다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 질소원은 효모 추출물일 수 있으며, 상기 효모 추출물은 총 배지 부피에 대해 약 0.05 내지 0.5%(v/v), 약 0.1 내지 0.4%(v/v)로 첨가될 수 있고, 구체적으로 약 0.2%(v/v)로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 효모 추출물을 상기 농도 범위를 초과하여 첨가할 경우, 생산된 PHA 내 HHx 함량이 감소할 수 있고, 상기 농도 범위 미만으로 첨가할 경우 균주 성장이 잘 이루어지지 않을 수 있다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 배지는 탄소원으로써 동유 및 질소원으로써 효모 추출물을 특정 농도로 포함하며, 상기 배지에 PHA 생산 균주를 배양할 경우 HHx를 고함량으로 포함하는 PHA를 생산할 수 있다.
또한, 본 발명의 균주의 배양 중에 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 염산, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 멸균 실리콘 오일, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 배양에서 배양온도는 20 내지 40℃, 구체적으로는 25 내지 37℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 배양에 의하여 생산된 PHA는 배지 중으로 분비되거나, 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 발명의 PHA 생산 방법은, 본 발명의 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은, 상기 배양된 배지 또는 균주로부터 PHA를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 회수는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 PHA를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 PHA를 회수할 수 있다.
또한, 본 발명의 PHA 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 PHA 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 총 배지 부피에 대하여 동유를 0.5 내지 3%(v/v)로 포함하는, PHA 생산 균주 배양용 배지 조성물을 제공한다.
상기 동유, PHA, 균주, 배지 등은 전술한 바와 같다.
상기 배지 조성물은 동유를 총 배지 부피에 대해 약 0.5 내지 3%(v/v), 약 1 내지 0.5%(v/v)로 포함할 수 있고, 구체적으로 약 2%(v/v)로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배지 조성물은 효모 추출물을 총 배지 부피에 대해 약 0.05 내지 0.5%(v/v), 약 0.1 내지 0.4%(v/v)로 포함할 수 있고, 구체적으로 약 0.2%(v/v)로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 배지 조성물은 추가로 PHA 생산 균주의 성장, PHA 생산능 및 상기 균주로부터 생산된 PHA 내 3HHx 함량을 증대시킬 수 있을 구성을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 총 배지 부피에 대하여 동유를 0.5 내지 3%(v/v)로 포함하는, PHA 생산 균주 배양용 배지 조성물; 상기 배지 조성물에서 배양된 PHA 생산 균주의 배양액; 또는 상기 배지 조성물에서 배양된 PHA 생산 균주를 포함하는, PHA 생산용 조성물을 제공한다.
상기 동유, PHA, 균주, 배지 조성물 등은 전술한 바와 같다.
상기 조성물은 본 발명의 배지 조성물, 배양된 PHA 생산 균주의 배양액; 또는 상기 배양된 PHA 생산 균주를 포함하며, 추가로 상기 PHA 생산 균주의 성장, PHA 생산능, 상기 균주로부터 생산된 PHA 내 3HHx 함량을 증대시킬 수 있을 구성을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 방법으로 생산된 PHA를 포함하는 필름을 제공한다.
상기 PHA는 전술한 바와 같다.
본 발명의 필름에 포함된 PHA는 3HHx 단량체를 약 43 mol% 이상, 약 44 mol% 이상, 약 45 mol% 이상으로 포함할 수 있고, 구체적으로 약 45 mol% 내지 70 mol%로 포함하는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 PHA에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 필름 제조방법은,
a) PHA 생산 균주의 배양액으로부터 세포 펠렛을 수집하는 단계;
b) 상기 수집한 펠렛을 세척하고 건조하는 단계; 및
c) 건조된 세포를 유기용매를 이용하여 분획한 후 유기용매를 증발시키는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 a) 단계의 PHA 생산 균주는 재조합 랄스토니아 유트로파 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 b) 단계는 수집한 펠렛을 탈이온수 또는 n-헥산으로 세척하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 c) 단계의 유기용매는 클로로포름일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는, 재조합 랄스토니아 유트로파 균주 배양액을 원심분리하고 세포 펠렛을 수집한 후, 펠렛을 탈이온수 또는 n-헥산으로 세척하고 동결건조한 뒤 건조된 세포를 클로로포름에서 추출 및 분획하고 클로로포름 용액을 증발시켜 제조하였다(실시에 4).
본 발명의 필름은 항산화 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 항산화 활성은 필름 표면에 잔류하는 동유에 의해 발휘되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 펠렛을 n-헥산 또는 탈이온수로 세척하여 제조한 PHA 필름의 항산화 활성을 확인한 결과, 각각 41.02% 및 51.71% 상대적 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내는 것을 확인하였으며(도 5b), 아스코르브산 대비 최대 39.9%의 산화 방지제 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 5d).
이를 통해, PHA 필름 표면에 잔류 동유가 존재할 경우 항산화능을 갖는 기능성 바이오 플라스틱으로 적용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 3HHx(3-hydroxyhexanoate)를 고비율로 함유하는 삼원 공중합체 P의 산업적 생산에 적용할 수 있다.
도 1은 동유를 첨가한 PHA 생산 배지에서 배양한 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) Re2133/pCB81 균주의 (a) 세포 성장, (b) 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs) 생산 및 (c) PHA 몰 분율을 나타낸 도이다. 약어: 3HB, 3-hydroxybutyrate; 3HV, 3-hydroxyvalerate; DCW, 건조 세포 중량; HHx, 3-hydroxyhexanoate; OD, 광학 밀도.
도 2는 PHA 생산 배지에서 질소 공급원의 최적화를 나타낸 도이다. (a) 다양한 질소 공급원의 존재 하에서 세포 성장 및 PHA 생산을 비교한 결과, (b) PHA 생산 및 (c) PHA 몰 분율에 대한 효모 추출물 농도의 효과.
도 3은 동유를 첨가한 PHA 생산 배지에서 배양한 R. eutropha Re2133/pCB81 균주에서의 시간 경과에 따른 삼원 공중합체 P 생산 모니터링 결과를 나타낸 도이다. (a) 바이오매스, PHA 축적 및 (b) PHA 단량체 조성.
도 4는 PHA 필름의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. (a) 과당을 탄소원으로 사용하여 생성된 PHA 필름의 표면. (b) 동유를 탄소원으로 사용하고 n-헥산으로 2회 세척하여 제조한 PHA 필름의 표면, (c) 동유를 탄소원으로 사용하고 n-헥산으로 1회 세척하여 제조한 PHA 필름의 표면, (d) 동유를 탄소원으로 사용하고 탈이온수로 2회 세척하여 제조한 PHA 필름의 표면 및 (e) 잔류 동유로 인한 필름 간의 색상 차이.
도 5는 포스포몰리브덴(Phosphomolybdenum) 분석으로 분석한 (a) 동유 및 (b) 잔류 동유를 포함하는 PHA 필름의 상대 DPPH 라디칼 소거 활성 및 (c) 동유 및 (d) 잔류 동유를 포함하는 PHA 필름의 상대적 항산화 활성. 약어: DW, 탈이온수.
도 6은 회분식 발효에서 탄소원으로 동유을 사용하여 PHA를 생산한 결과이다. (a) 바이오매스, PHA 축적 및 (b) PHA 단량체 조성물.
도 2는 PHA 생산 배지에서 질소 공급원의 최적화를 나타낸 도이다. (a) 다양한 질소 공급원의 존재 하에서 세포 성장 및 PHA 생산을 비교한 결과, (b) PHA 생산 및 (c) PHA 몰 분율에 대한 효모 추출물 농도의 효과.
도 3은 동유를 첨가한 PHA 생산 배지에서 배양한 R. eutropha Re2133/pCB81 균주에서의 시간 경과에 따른 삼원 공중합체 P 생산 모니터링 결과를 나타낸 도이다. (a) 바이오매스, PHA 축적 및 (b) PHA 단량체 조성.
도 4는 PHA 필름의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. (a) 과당을 탄소원으로 사용하여 생성된 PHA 필름의 표면. (b) 동유를 탄소원으로 사용하고 n-헥산으로 2회 세척하여 제조한 PHA 필름의 표면, (c) 동유를 탄소원으로 사용하고 n-헥산으로 1회 세척하여 제조한 PHA 필름의 표면, (d) 동유를 탄소원으로 사용하고 탈이온수로 2회 세척하여 제조한 PHA 필름의 표면 및 (e) 잔류 동유로 인한 필름 간의 색상 차이.
도 5는 포스포몰리브덴(Phosphomolybdenum) 분석으로 분석한 (a) 동유 및 (b) 잔류 동유를 포함하는 PHA 필름의 상대 DPPH 라디칼 소거 활성 및 (c) 동유 및 (d) 잔류 동유를 포함하는 PHA 필름의 상대적 항산화 활성. 약어: DW, 탈이온수.
도 6은 회분식 발효에서 탄소원으로 동유을 사용하여 PHA를 생산한 결과이다. (a) 바이오매스, PHA 축적 및 (b) PHA 단량체 조성물.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 동유(Tung oil)를 탄소원으로 포함하는 배지에서의 재조합 랄스토니아 유트로파(
Ralstonia eutropha
) 균주의 세포 성장 및 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates, PHAs) 생산
동유를 탄소원으로 포함하는 배지에서 재조합 R. eutropha 균주를 배양하기 위해, 먼저 균주에 대한 동유의 독성 여부를 조사하였다.
구체적으로, 시딩 배지를 제조하기 위해, 여과된 동유(Tung oil, Liberon, F&H International, 광주)를 0.5 또는 1%(v/v) 농도로 첨가한, 200μg/mL 카나마이신(kanamycin) 및 10μg/mL 젠타마이신(gentamicin)이 보충된 3mL의 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 R. eutropha Re2133/pCB81 균주(△phaB1, △phaB2, △phaB3, △phaC1, 및 phaC2Ra-phaA-phaJ1Pa, 합성 PHA 오페론을 포함하는 pBBR1MCS-2 포함) (Jeon JM, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 5461-5469.)를 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하고 멸균수로 2회 세척한 다음 0.5 또는 1%(v/v)의 동유를 함유하는 5mL의 TSB 배지에 접종하였다. 세포 성장은 초기 값 0.05에서 시작하여 72시간 동안 배양하였으며, 24, 48, 72시간 마다 595 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 대조군으로 동일 균주를 동유를 첨가하지 않은 TSB 배지에서 배양하였다.
그 결과, 동유가 첨가된 배지 및 동유가 첨가되지 않은 배지에서의 세포 성장은 24시간까지 유사하였으나, 48시간 이후에는 동유가 포함된 배지에서의 광학 밀도가 동유가 포함되지 않은 배지보다 더 높았다(도 1a).
이에 따라, 배지에 최대 1%까지 첨가된 동유는 세포 성장을 억제하지 않음을 알 수 있다.
다음으로, 동유 첨가 여부에 따른 PHA 생산량을 확인하기 위해 배지에 첨가되는 탄소원 농도를 총 배지 부피의 2%(v/v)로 고정하고, 과당, 과당과 동유 또는 동유를 함유한 M9 최소 배지에서 재조합 R. eutropha 균주를 배양하여 PHA 생산량을 비교하였다.
구체적으로, 전술한 바와 같이 시딩 배지를 준비한 다음, 세포를 탄소원 2%(v/v) (2% 과당, 1% 과당과 1% 동유, 및 2% 동유) 및 효모 추출물 0.1%(w/v)을 포함하는 5mL의 M9 최소 배지에 0.1%(v/v)로 접종하고 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양에 따른 균주 성장 및 PHA 생산량은 이전 방법(Bhatia SK, Bioprocess Biosyst. Eng. 2017, 41, 229-235.)에 따라 분석하였다.
그 결과, 균주 성장과 PHA 생산은 과당을 함유한 배지에서보다 동유를 함유한 배지에서 더 높았다(도 1b, c). 구체적으로, 탄소 공급원으로 과당을 함유하는 배지에서 배양한 균주로부터 PHA로서 HHx(hydroxyhexanoate)는 함유하지 않고 다량의 3HB(3-hydroxybutyrate) 및 소량의 3HV(3-hydroxyvalerate)를 함유하는 삼원 공중합체(terpolymers) P(99.3 mol% 3HB-co-0.7 mol% 3HV)가 생산되었으나, 동유를 함유한 배지에서 배양한 균주에서는 PHA로서 다량의 HHx(HHx 함량 45mol% 이상) 및 3HB를 함유하고 소량의 3HV를 함유하는 삼원 공중합체 P가 생산되었다. 동유가 단일 탄소원으로 사용될 때 생산된 PHA에서 HHx 몰 분율은 전체 PHA의 거의 50%를 차지하였다.
이에 따라, 동유를 탄소원으로 하는 배지를 사용할 경우 R. eutropha Re2133/pCB81 균주에서 HHx 함량이 45mol% 이상인 삼원 공중합체 P를 생산할 수 있음을 알 수 있다. 상기 실시예에서 확인된 PHA의 HHx 함량은 종래 야생형 및 재조합 R. eutropha 균주에서 보고된 것 중 가장 높았다.
실시예 2. PHA 생산을 위한 배지 최적화
세포 성장과 PHA 축적은 사용된 질소 공급원에 의해 영향을 받을 수 있으므로, R. eutropha Re2133/pCB81 균주에서 PHA 생산을 위한 최적의 배지 조건을 확인하기 위해, 동유의 농도는 총 배지 부피의 2%(v/v)로 고정하고, 총 배지 부피의 0.1%(v/v) 농도로 고정된 다양한 질소 공급원을 배지에 첨가하여 세포 성장 및 PHA 생산을 비교하였다.
구체적으로, M9 최소 배지에 탄소원으로 동유를 2%(v/v) 농도로 첨가하고, 질소원으로 효모 추출물, 카제인(casein), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), NH4NO3, (NH4)2SO4, NH4Cl를 0.1%(v/v) 농도로 각각 첨가한 후 30℃에서 72시간 동안 진탕 인큐베이터(200rpm)에서 배양하여 PHA 생산량을 분석하였다.
그 결과, 다른 질소 공급원에 비해 효모 추출물 사용시 세포 성장 및 PHA 생산이 가장 우수하였다(도 2a).
다음으로, 전술한 바와 동일한 방법으로 다양한 농도의 효모 추출물에서 PHA 생산량을 분석하였다.
그 결과, HHx의 몰 분율은 0.05%(v/v) 효모 추출물이 배지에 첨가되었을 때 최대 61%이었으며, 효모 추출물의 농도가 0.1%(v/v)에서 0.2%(v/v)로 증가함에 따라 총 PHA 생산은 0.506 g/L에서 1.013 g/L로 두 배로 증가한 반면, HHx의 비율은 55%에서 48%로 감소하였다.
따라서, 건조 세포 중량(dry cell weigh, DCW) 및 PHA 함량을 기준으로 0.2% 농도의 효모 추출물에서 세포 성장(2.22g DCW/L) 및 PHA 생산(1.01g/L)이 가장 우수한 것으로 결정하였다(도 2b,c).
다음으로, 상기에서 도출된 최적 조건에서 R. eutropha RE2133/pCB81 균주에서의 배양 시간에 따른 PHA 생산을 모니터링하기 위해, 동유를 2%(v/v), 및 효모 추출물을 0.2%(v/v) 농도로 첨가한 M9 최소 배지에서 R. eutropha Re2133/pCB81 균주를 96시간 동안 배양하였다.
그 결과, PHA는 24시간 후에 축적되기 시작하였고, 96시간에 최대 PHA(0.68g/L) 및 세포 바이오매스(1.65g/L)가 측정되었다(도 3a,b). 가장 높은 HHx 몰 분율은 48시간 후 61.9 mol%였으며, HHx의 비율은 시간이 지남에 따라 감소하여 96시간 후에 삼원 공중합체 P(53 mol% 3HB-co-2 mol% 3HV-co-45 mol% HHx)를 생성하였다.
실시예 3. 배양 전후에 따른 동유의 지방산 조성 변화 분석
상기 실시예 2의 최적 배지 조건에서 R. eutropha Re2133/pCB81 균주를 96시간 동안의 배양 전후에 따른 동유의 지방산 조성 변화를 GC-MS 분석하였다. 동유의 지방산 조성은 피크 면적을 기준으로 계산하였다.
구체적으로, 동유를 클로로포름으로 희석하여 1%(v/v) 용액을 수득한 후, 유도체화(derivatization)를 위해 약한 알칼리성 가메탄올분해(Mild alkaline methanolysis)를 수행하였다. 메탄올 분해를 위해 메탄올 0.5mL, 톨루엔(toluene) 0.5mL 및 0.3M methanolic-KOH 1mL를 시료에 첨가한 후 37℃에서 15분 동안 배양하였다. 그런 다음, 헥산 2mL, 1M-아세트산 0.3mL, 물 2mL를 첨가하고 볼텍싱하여 용액 상부에 분리된 헥산층을 수득하였다. 헥산층을 깨끗한 유리관으로 옮기고 질소가스 증발기로 헥산을 증발시켰다. 시료를 클로로포름 1mL을 첨가하여 재현탁하고, Na2SO4를 첨가하여 잔류물을 제거한 후 0.2 μm PVDF 필터로 여과하여 깨끗한 붕규산 바이알(borosilicate vial)로 옮겼다. 이를 용융 실리카 모세관(Elite-5ms, 30m, 0.25mm, 내경 0.25μm 필름)이 장착된 GC-MS 컬럼(Calrus 500, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 분석하였으며, 지방산에 대한 선형 온도 구배(120℃에서 5분 유지, 6℃/분으로 200℃까지 증가, 2℃/분으로 220℃까지 증가, 10℃/분으로 300℃까지 증가)를 적용하였다. 인젝터 포트(injector port) 온도는 210℃로 설정되었다. 질량 스펙트럼은 70 eV에서 전자 충격 이온화(via electron impact ionization)를 통해 수득하였고 스캔 스펙트럼은 45-400 m/z 범위 내에서 얻었다. 선택된 이온 모드는 주요 제품의 검출 및 단편화에 사용되었다. 배양 후 배지에 잔류하는 동유는 헥산을 이용한 액-액 추출(liquid-liquid extraction)을 통해 회수하고 이전 방법(Choi TR, Bioprocess Biosyst. Eng. 2020, 43, 909-918.)에 따라 분석하였다.
그 결과, 배양 전 동유는 83.97% α-엘레오스테아르산(α-eleostearic acid) ((9Z,11E,13E)-octadeca-9,11,13-trienoic acid), 7.69% 올레산, 6.25% 리놀레산 및 2.09% 팔미트산을 함유하였다(표 1). 또한, 배양 후 배지에 잔류하는 동유의 지방산 조성을 분석하여 동유 성분의 변화를 확인한 결과, 지방산 중 상대적인 α-엘레오스테아르산의 비율은 배양후 83.97%에서 59.21%로 유의하게 감소하여, 다른 지방산에 비해 α-엘레오스테아르산의 소비량이 더 많음을 확인하였다.
실시예 4. PHA 필름 제작
상기 실시예 2의 최적 배지 조건에서 수행된 96시간 동안의 배양 후 수득한 PHA을 필름 형태로 제작하고, 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscopy, SEM) 분석하였다.
먼저, PHA 필름을 제작하기 위해 R. eutropha Re2133/pCB81 균주를 250mL 배플(baffled) 플라스크에서 200μg/mL 카나마이신 및 10μg/mL 젠타마이신이 보충되고, 2% 동유 또는 과당 및 0.2% 효모 추출물을 함유하는 M9 최소 배지 100mL에서 72시간 동안 배양하였다. 배양액 50mL을 원심분리하고 세포 펠렛을 수집하였다. 펠렛을 탈이온수 또는 n-헥산으로 2회 세척하고 동결건조하였다. 건조된 세포를 클로로포름 40mL에 담그고 60℃에서 16시간 동안 추출하였다. 증류수 10mL를 가한 후 원심분리를 통해 고분자 클로로포름 분획을 모았다. 정제된 용매를 흄 후드에서 실온건조시키고, 클로로포름을 증발시켜 PHA 필름을 수득하였다.
PHA 필름을 SEM 분석하기 위해 금으로 코팅한 다음 TM3030Plus 탁상현미경(Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석하였다. SEM 이미지는 5kV의 가속 전압에서 수득하였다.
그 결과, 과당을 탄소원으로 사용하는 균주로부터 생산된 PHA의 필름은 대부분 3HB 단량체로 구성되어 있으며 표면이 거칠고 다공성인 반면, 동유를 탄소원으로 사용하는 균주로부터 생산된 삼원 공중합체 P(53 mol% 3HB-co-2 mol% 3HV-co-45 mol% HHx)의 필름은 부드럽고 매끄러운 표면을 나타내었다(도 4a, b).
또한, SEM을 사용하여 관찰한 결과, n-헥산으로 1회 세척한 PHA 필름 표면에서 여러 개의 덩어리가 관찰되었으며(도 4c), 탈이온수로 2회 세척한 PHA 필름 표면에서도 많은 덩어리가 관찰되어, 상대적으로 많은 양의 동유가 잔류함을 확인하였다(도 4d). 그러나, n-헥산으로 2회 세척한 샘플의 경우 표면이 매우 매끄럽고 덩어리가 거의 없었다(도 4b). 즉, 동유를 n-헥산 또는 탈이온수로 세척함에 따라 잔류 동유의 양에 차이가 나타났으며, 잔류 동유의 양에 따라 PHA 필름의 색상(도 4e)에 차이가 나타났다.
실시예 5. PHA 필름의 항산화 활성 분석
동유에 약 80% 이상으로 함유된 α-엘레오스테아르산(표 1)은 항산화 활성을 갖는 물질로 알려져 있으므로(Zhang T, J. Nat. Med. 2012, 66, 77-84.), 동유 및 상기 실시예 4에서 펠렛을 n-헥산 또는 탈이온수로 세척하여 제조한 PHA 필름의 항산화 활성을 확인하였다.
먼저, 동유의 항산화 활성을 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 라디칼 소거법을 이용하여 평가하기 위해 다양한 농도의 동유(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1%)와 PHA 필름 0.01g을 메탄올에서 0.01mM의 DPPH 0.5mL와 혼합하였다. 혼합된 시료를 암실에서 30분간 배양하고 Gemini XPS 및 EM Microplate Readers(Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다. DPPH에 대한 상대적 소거 활성은 아스코르브산(Ascorbic acid)을 표준 물질로 하여 항산화 활성을 비교함으로써 도출하였다.
그 결과, 동유 농도가 증가함에 따라 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였으며, 1% 농도의 동유는 강력한 항산화제인 아스코르브산 대비 83.7%의 상대적 항산화 활성을 보였다(도 5a).
또한, 상기 실시예 4에서 펠렛을 n-헥산 또는 탈이온수로 세척하여 제조한 PHA 필름의 항산화 활성을 확인한 결과, 필름은 4시간 후 각각 41.02% 및 51.71% 상대적 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었다(도 5b).
다음으로, 포스포몰리브덴(Phosphomolybdenum) 분석법을 이용하여 Mo6+가 Mo5+로 환원된 후 산성 pH에서 포스포몰리브덴 착물을 형성하는 것을 기반으로 동유 및 PHA 필름의 산화 방지제 활성을 조사하였다.
구체적으로, 다양한 농도의 동유(0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1%)와 PHA 필름 0.01g을 1mL의 몰리브덴산 시약(증류수에 0.6M 황산, 4mM 몰리브덴산 암모늄(ammonium molybdate), 28mM 인산 나트륨(sodium phosphate)를 포함)으로 처리하였다. 37℃에서 배양 후 Gemini XPS 및 EM Microplate Readers(Molecular devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 695nm에서 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 반응 혼합물의 흡수 증가는 항산화 활성을 나타내며, 아스코르브산을 양성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 동유의 항산화 활성이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다(도 5c).
또한, PHA 필름의 경우 아스코르브산 대비 96시간 후 최대 39.9%의 산화 방지제 활성을 나타내었다(도 5d).
이를 통해, PHA 필름 표면에 잔류 동유가 존재할 경우 항산화능을 갖는 기능성 바이오 플라스틱으로 적용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 6. PHA의 분자량 분석
상기 실시예 4에서 동유 또는 과당을 탄소원으로 하여 제조된 PHA 필름의 분자량 및 분자량 분포를 겔 투과 크로마토그래피(YL Chromass, Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였다.
구체적으로, 각 PHA 필름을 클로로포름에 용해시키고 0.2 μm 주사기 필터(Chromdisc, Seoul, Korea)로 여과하였다. 이동상으로 35℃ 클로로포름(1mL/분)을 사용하는, 루프(isocratic pump) 인젝터(Rheodyne 7725i), 이중 헤드가 있는 등용매 펌프(isocratic pump) (YL9112), 컬럼 오븐(YL9131), 컬럼(Shodex, K-805, 8.0 I.D. Х 300 mm, Shodex, K-804, 8.0 I.D. Х 300 mm) 및 굴절률 검출기(refractive index detector) (YL9170)를 포함하는 HPLC 장비에 각 시료 60μL를 주입하였다. 데이터는 YL HPLC용 YL-Clarity 소프트웨어(YL Chromass, Seoul, Korea)를 사용하여 분석하였으며, 분자량은 5000~2,000,000g/mol 범위의 폴리스티렌 표준을 사용하여 결정하였다.
PHA의 수평균분자량(Mn) 및 중량평균분자량(Mw)을 폴리스티렌 표준을 기준으로 분석한 결과, 과당을 탄소원으로 하여 배양한 균주로부터 생산된 삼원 공중합체 P(99.3 mol% 3HB-co-0.7 mol% 3HV)의 분자량은 360.3 Х 103(PDI: 2.6), 동유를 탄소원으로 하여 배양한 균주로부터 생산된 삼원 공중합체 P(53 mol% 3HB-co-2 mol% 3HV-co-45 mol% HHx)의 분자량은 280.7 Х 103(PDI: 1.8)이었다(표 2).
실시예 7. 배치 발효
PHA 생산에 동유를 탄소원으로서 적용할 수 있는지를 확인하기 위해 배치 발효를 수행하였다.
구체적으로, 배양을 위한 접종물을 준비하기 위해 R. eutropha Re2133/pCB81 균주를 200μg/mL 카나마이신 및 10μg/mL 젠타마이신이 보충된 TSB 배지에서 밤새 배양한 다음, 2% 동유 및 0.2% 효모 추출물을 함유하는 50mL의 M9 최소 배지 플라스크 시딩 배양물에 접종하였다. 이를 밤새 배양한 후, 배양된 세포 0.1%(v/v)를 400mL의 2%(v/v), 및 효모 추출물을 0.2%(v/v) 농도로 첨가한 M9 최소 배지가 들어 있는 각 발효 용기에 접종하였다. 배양 중 배양물의 온도는 30℃, 공기는 5 vvm, pH는 0.1N의 HCl과 NaOH를 이용하여 6.8±0.1로 유지하였다. 400 rpm의 속도로 교반하여 배양하였으며, 멸균 실리콘 오일 LG 50을 소포제로 사용하였다.
그 결과, 회분식 발효에서 균주는 5.37g/L의 DCW 및 1.09g/L의 PHA를 생산했으며, 96시간 후에 20.4%의 PHA 함량을 나타내었다(도 6a).
PHA의 몰분율을 분석한 결과, HHx 고함유 삼원 공중합체 P(44 mol% 3HB-co-10 mol% 3HV-co-46 mol% HHx)가 생성되었으며, 스케일업(scale-up) 과정에서도 높은 비율의 HHx가 유지되었다(도 6b).
상기 실시예의 결과로부터, 동유를 탄소원으로 배지에 첨가함으로써 재조합 R. eutropha Re2133/pCB81 균주에서 3HHx를 고비율로 함유하는 삼원 공중합체 P를 생산할 수 있음을 확인하여, 3HHx를 고비율로 함유하는 삼원 공중합체 P의 산업적 생산에 적용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (14)
- 폴리하이드록시알카노에이트(Polyhydroxyalkanoates) 생산 균주를 동유를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 생산 균주는 랄스토니아 속 균주(Ralstonia sp.)인 것인, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 랄스토니아 속 균주는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)인 것인, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 랄스토니아 유트로파는 i) phaB1, phaB2, phaB3, phaC1 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 결손되고; ii) phaC2Ra, phaA, phaJ1Pa 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 균주인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배지는 총 배지 부피에 대하여 동유를 0.5 내지 3%(v/v)로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배지는 총 배지 부피에 대하여 효모 추출물을 0.05 내지 0.5%(v/v)로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법으로 생산된 폴리하이드록시알카노에이트는 3HB(3-hydroxybutyrate), 3HV(3-hydroxyvalerate) 및 3HHx(3-hydroxyhexanoate)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단량체를 포함하는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 방법으로 생산된 폴리하이드록시알카노에이트는 3HHx 단량체를 45 mol% 내지 70 mol%로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 배양된 배지 및 균주로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 총 배지 부피에 대하여 동유를 0.5 내지 3%(v/v)로 포함하는, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 균주 배양용 배지 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 배지 조성물은 총 배지 부피에 대하여 효모 추출물을 0.05 내지 0.5%(v/v)로 포함하는 것인, 조성물.
- 총 배지 부피에 대하여 동유를 0.5 내지 3%(v/v)로 포함하는, 폴리하이드록시알카노에이트 생산 균주 배양용 배지 조성물; 상기 배지 조성물에서 배양된 폴리하이드록시알카노에이트 생산 균주의 배양액; 또는 상기 배지 조성물에서 배양된 폴리하이드록시알카노에이트 생산 균주를 포함하는, 폴리하이드록시알카노에이트 생산용 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 폴리하이드록시알카노에이트를 포함하는, 필름.
- 제13항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 3HHx 단량체를 45 mol% 내지 70 mol%로 포함하는 것인, 필름.
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