CN111206058B - 一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法。本发明中，具有聚羟基脂肪酸酯生产能力的海神单胞菌能够利用乙酸或丁酸为碳源，在无需灭菌的开放条件下，积累大量的聚羟基脂肪酸酯，聚酯所占细菌干重的比例最高可达69％，以丁酸为碳源的得率最高可达理论得率的40％。该方法以丁酸或乙酸这两种不常见的碳源生产聚羟基脂肪酸酯，发酵过程无需灭菌，能够降低聚羟基脂肪酸酯的发酵成本，具有较大的经济优势和良好的工业应用前景。

Description

一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯的方法，更具体涉及一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，简称PHA)是一种微生物在生长代谢不平衡条件下在细胞内合成的一种高分子聚合物，主要作为碳源和能源的储存物质，在营养匮乏时可以被微生物重新分解利用。PHA有着与石油来源的塑料材料类似的材料学性质，同时具有许多石油来源的塑料材料缺少的优良性能，例如生物可再生性、生物可降解性、生物相容性等等。多年以来，PHA的合成和利用引起了科学界和工业界的广泛关注。人们在降低PHA的生产成本、合成具有新的单体组成和结构的PHA材料、开发多种PHA的高附加值应用等方面开展了许多研究工作，取得了一系列重要的研究成果。
目前，PHA的生产成本仍然居高不下，限制了其大规模工业化生产和应用。利用较为廉价的底物替代工业发酵中广泛应用的葡萄糖等碳源，有助于降低发酵原料对粮食作物的依赖，解决与人争粮、与粮争地的难题，具有重要的意义。包括乙酸和丁酸在内的挥发性脂肪酸，能够由微生物转化各种生物质废弃物制备，近年来被认为是一种具有良好应用前景的发酵原料。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用乙酸或丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的方法。
本发明要求保护海神单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用。
具体的，所用底物为非糖原料或挥发性脂肪酸；更具体可为丁酸或乙酸。
本发明还要求保护一种制备聚羟基脂肪酸酯的方法，该方法包括：
以前述底物，发酵培养海神单胞菌，得到所述聚羟基脂肪酸酯。
上述方法中，在发酵起始时刻所述底物在体系中的浓度为10-20g/L。
具体的，在发酵起始时刻所述丁酸在体系中的浓度为10g/L。
在发酵起始时刻所述乙酸在体系中的浓度为20g/L。
在发酵初始时刻，含有所述海神单胞菌的体系的OD600值为0.05-0.25；具体为0.1；
所述发酵初始时刻，即将所述种子液接种至发酵培养基后的初始时刻；
所述发酵培养步骤中，发酵温度为37℃；
溶氧为10-50％；具体为30％；
搅拌速率为200-800rpm；
发酵时间为36-60h；更具体为48h；
pH值为7-9；具体为8；
空气的通气量为1-5L/min；具体为3L/min。
所述发酵为液态发酵；
所述发酵培养为开放培养；所述开放培养具体为开口揺瓶或在封口膜包覆不灭菌的环境(如揺瓶)中或在培养基和发酵罐体不灭菌且通入无需过滤除菌的空气的发酵罐中培养；
所述发酵中，发酵体系由种子液、培养基和所述底物组成；
所述种子液提供的有效成分为所述海神单胞菌；
所述种子液的培养为无菌操作培养；
所述培养基为液态培养基；具体为可用于所述海神单胞菌培养的任意培养基；
更具体可为如下比例组成的液体TYS培养基：蛋白胨5g，酵母粉1g，用人工海水定容至1L；
其中，所述人工海水由如下各比例的组分组成：氯化钠27.5g，氯化钾0.7g，六水合氯化镁5.4g，七水合硫酸镁6.8g，氯化钙1.05g，碳酸氢钠0.2g，用去离子水定容至1L即得。
所述种子液可按照如下方法制得：
a、菌种活化
取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至TYS培养基平板，37℃培养12-24h；
b、一级种子液
从完成所述步骤a的平板上挑取接单菌落，接种于液体TYS培养基，37℃，200rpm振荡培养10-12h，得到一级种子液；
c、二级种子液
取所述一级种子液，按照1％的接种量，接种于液体TYS培养基，添加10g/L乙酸或10g/L丁酸为碳源，37℃，200rpm振荡培养10-12h，得到二级种子液。
本发明中，所述聚羟基脂肪酸酯具体可为聚-3-羟基丁酸酯、3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯或3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯；所述3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚酯为由3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚而得的酯；所述3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚酯为由3-羟基丁酸和4-羟基丁酸共聚而得的酯。
本发明所述海神单胞菌Neptunomonas concharum，分离自海洋环境，能够在NaCl浓度25-50g/L条件下良好生长。不同于普通海洋微生物较低的最适生长温度，N.concharumJCM17730能够在普通工业发酵的30-37℃条件下良好生长。不同于大肠杆菌、乳酸菌、谷氨酸棒状杆菌和酿酒酵母等常见的发酵工业菌种，N.concharum JCM17730对葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类碳源利用程度微弱，但能利用乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸为碳源进行快速生长。
本发明中，具有聚羟基脂肪酸酯生产能力的海神单胞菌能够利用乙酸或丁酸为碳源，在无需灭菌的开放条件下，积累大量的聚羟基脂肪酸酯，聚酯所占细菌干重的比例最高可达69％，以丁酸为碳源的得率最高可达理论得率的40％。该方法以乙酸或丁酸这两种不常见的碳源生产聚羟基脂肪酸酯，发酵过程无需灭菌，能够降低聚羟基脂肪酸酯的发酵成本，具有较大的经济优势和良好的工业应用前景。
附图说明
图1为以海神单胞菌利用丁酸生产聚羟基脂肪酸酯的发酵罐培养。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。聚羟基脂肪酸酯标品购于Sigma-Aldrich，货号为403121，产品名称为聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)，其中聚-3-羟基丁酸含量为88mol％。下述实施例所用海神单胞菌Neptunomonas concharum，可由日本微生物菌种保藏中心(Japan Collection of Microorganisms)购买获得，代表菌株保存于日本微生物菌种保藏中心(Japan Collection of Microorganisms)，保存编号是JCM17730。
实施例中制备种子液的方法如下：
a、菌种活化
取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至TYS培养基平板，37℃培养12-24h；
b、一级种子液
从完成所述步骤a的平板上挑取接单菌落，接种于液体TYS培养基，37℃，200rpm振荡培养10-12h，得到一级种子液；
c、二级种子液
取所述一级种子液，按照1％的接种量，接种于液体TYS培养基，添加10g/L乙酸或10g/L丁酸为碳源，37℃，200rpm振荡培养10-12h，得到二级种子液。
实施例中冷冻干燥的方法：
以乙酸或者丁酸作为碳源进行发酵后，取30ml发酵液，8000rpm离心10min，弃上清液后用去离子水重悬菌体，进行洗涤，再次8000rpm离心10min，收集菌体，进行冷冻干燥(将装有洗涤后菌体沉淀的离心管置于-20℃冷冻1h，再放入冷冻真空干燥仪中冻干8-12h)，得到冷冻干燥产物；
实施例中细胞干重以每升发酵液中的细胞干重计量。细胞干重的单位为g/L。细胞干重(cell dry weight，简称CDW)＝(进行冷冻干燥后的离心管的重量-原空离心管的重量)÷0.03；进行冷冻干燥后的离心管的重量和原空离心管的重量，单位均为g；0.03代表取发酵液体积为0.03L。
实施例中菌体聚羟基脂肪酸酯含量的检测方法：冷冻干燥产物进行酯化反应，然后通过气相色谱法测定单体含量。
酯化反应：取50mg冷冻干燥产物于酯化管中，加入2mL氯仿和2mL酯化液(该酯化液为在500ml甲醇中加入15ml浓硫酸与1g苯甲酸而得)混匀，加盖密闭，100℃高温中酯化4h；冷却至室温后，加入1mL去离子水，用旋涡振荡器充分振荡混匀，静置分层；待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相1μL进行气相色谱分析。
取20mg的聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)，采用同样的方法进行酯化反应后作为标准样品。
气相色谱分析参数：使用HP 6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-5毛细管柱，柱长30m，内径320μm，固定相为25nm厚的苯基甲基聚硅氧烷；检测器为火焰离子化检测器(Flameionization detector，FID)；用高纯氮气作为载气，氢气作为燃气，空气为助燃气。
气相色谱分析的条件如下：
(1)柱温：80℃开始，停留1.5min；30℃/min的速率升温到140℃，停留0min；
40℃/min的速率升温到220℃，停留1min。总计时间为6.5min。
(2)柱压：10psi开始，停留1.5min；2.5psi/min的速率升压到20psi，停留0.5min。(psi为压力单位，即磅/平方英寸，1psi＝6.89476kPa)
(3)进样口：温度为200℃，使用分流模式，分流比为30。
(4)检测器：温度为220℃，氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min。
使用安捷伦公司的微量进样器，进样量为1μL，采用内标法对聚合物进行定量分析，根据峰面积定量。
气相色谱检测时，将冻干细胞样品与聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)标准品进行对比，冻干细胞样品中含有标准品中3-羟基丁酸位置的峰。同时，取冻干细胞样品加入氯仿溶液，100℃烘箱中保持4h，冷却后取氯仿相，加入6倍体积的乙醇，有白色沉淀析出；取析出的沉淀，采用上述步骤进行酯化反应和气相色谱检测，出峰位置与标准品中3-羟基丁酸相同。这表明，菌体中积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯。
聚合物含量定义为聚合物对细胞干重的比值，聚合物产量＝聚合物含量×细胞干重。
下述实施例中，按照如下方法通过高效液相色谱对丁酸进行定量检测。
具体条件如下：
仪器：岛津公司Essentia LC系列HPLC仪，配有DGU-20A脱气机，LC-16送液泵，SIL-16型自动进样器，RID-20A检测器。
色谱条件：Bio-Rad
Figure BDA0002398202570000051
HPX-87H(7.8×300mm)；流速0.50mL/min；柱温55℃；流动相为7mM硫酸水溶液。
检测方法：
取0、1、2、3、4、5g/L的丁酸标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号B103500)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的丁酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同浓度为横坐标，绘制标准曲线。
取2mL的发酵液，于12000rpm离心10min，将其发酵上清液转移到新的离心管内，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测。
将待测样品发酵上清液的丁酸色谱峰面积代入上述标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的丁酸含量。
下述实施例中，在发酵初始时刻，含有海神单胞菌的体系的OD600值均为0.1。
实施例1、以海神单胞菌利用乙酸生产聚羟基脂肪酸酯(摇瓶培养)
一、以海神单胞菌利用乙酸生产聚羟基脂肪酸酯
1、无菌操作制备海神单胞菌种子液
(1)菌种活化
取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至TYS培养基平板，37℃培养12-24h。
(2)一级种子
从完成步骤(1)的平板上挑取接单菌落，接种于液体TYS培养基，37℃，200rpm振荡培养10-12h。
(3)二级种子
取步骤(2)得到的一级种子液，按照1％的接种量，接种于液体TYS培养基，添加10g/L乙酸为碳源，37℃，200rpm振荡培养10-12h。
2、配置液体TYS培养基，添加乙酸至终浓度20g/L，调pH为7。
另按照与上相同步骤，设置如下对照：
将乙酸替换为丙酸，浓度替换为10g/L；
3、将步骤1(3)得到的种子液，按照8％的接种量(也即二级种子液4ml，培养基46ml)，接种于含有20g/L乙酸的液体TYS培养基，使用250ml摇瓶，总装液量为50ml，37℃、200rpm培养40-48h，制成发酵液。
另按照与上相同步骤，设置如下对照：
将乙酸替换为丙酸，浓度替换为10g/L；
4、取30ml发酵液，置于50ml体积的离心管中进行8000rpm离心10min，弃上清后用去离子水重悬清洗菌体，再次于8000rpm离心10min，弃上清液后，将菌体在-20℃下放置1h，再进行真空冷冻干燥8-12h，得到冻干后的菌体。加入发酵液之前和冻干后准确称取离心管的重量，计算细胞干重。
5、将冻干后的菌体转移至已知质量的酯化管中，称取转移的菌体干重，加入2mL酯化液(按体积百分含量为3％将浓硫酸溶于甲醇中，得到硫酸-甲醇溶液，再按照终浓度为1g/L将苯甲酸作为内标加入硫酸-甲醇溶液中，得到酯化液)、2mL氯仿，加盖密闭，100℃烘箱中反应4h；冷却至室温后，加入1mL去离子水，充分振荡，静置分层；待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相，进行气相色谱分析；
使用安捷伦公司的微量进样器，进样量为1μL，采用内标法对聚合物进行定量分析，根据峰面积定量。
聚合物含量定义为聚合物对细胞干重的比值，聚合物产量＝聚合物含量×细胞干重。
通过计算，得到乙酸为底物时，细胞干重为3.95g/L，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，产量为1.62g/L。
作为对照，以丙酸为底物时，细胞干重为1.96g/L，没有聚酯产生。
二、TYS乙酸培养基不接种的开放培养
1、配置液体TYS培养基，添加乙酸至终浓度20g/L，调pH为7。不接种任何微生物，使用250ml摇瓶，总装液量为50ml，37℃、200rpm培养40-48h，制成发酵液。
2、由于未接种，但在开放条件下有杂菌生长，按照上述一的方法，检测杂菌培养的细胞干重和聚羟基脂肪酸酯产量。
结果发现，细胞干重为0.17g/L，没有检测到聚羟基脂肪酸酯的积累。由此说明，以20g/L的乙酸为碳源，一般微生物很少生长，杂菌的生物量很低。
三、海神单胞菌在无乙酸条件下的摇瓶培养实验
1、按照上述一的方法，将发酵用的培养基替换为不添加乙酸的TYS培养基(与TYS乙酸培养基的区别仅在于组分中不含有乙酸)，其他步骤均不变。
2、检测细胞干重和聚羟基脂肪酸酯的积累，结果表明，海神单胞菌在无乙酸条件下的摇瓶培养后，细胞干重为1.12g/L，没有检测到聚羟基脂肪酸酯的积累。
由此可见，仅由TYS培养基中的蛋白胨与酵母提取物不足以保证海神单胞菌生产聚羟基脂肪酸酯，同时，在不灭菌条件下发酵，应该有杂菌生长。
实施例2、以海神单胞菌利用丁酸生产聚羟基脂肪酸酯(摇瓶培养)
一、以海神单胞菌利用丁酸生产聚羟基脂肪酸酯
1、无菌操作制备海神单胞菌种子液
(1)菌种活化
取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至TYS培养基平板，37℃培养12-24h。
(2)一级种子
从完成步骤(1)的平板上挑取接单菌落，接种于液体TYS培养基，37℃，200rpm振荡培养10-12h。
(3)二级种子
取步骤(2)得到的一级种子液，按照1％的接种量，接种于液体TYS培养基，添加10g/L丁酸为碳源，37℃，200rpm振荡培养10-12h。
2、配置液体TYS培养基，添加丁酸至终浓度10g/L，调pH为7。
3、将步骤1(3)得到的种子液，按照8％的接种量，接种于含有丁酸的液体TYS培养基，使用250ml摇瓶，总装液量为50ml，37℃、200rpm培养40-48h，制成发酵液。
4、取30ml发酵液，置于50ml体积的离心管中进行8000rpm离心10min，弃上清后用去离子水重悬清洗菌体，再次于8000rpm离心10min，弃上清液后，将菌体在-20℃下放置1h，再进行真空冷冻干燥8-12h，得到冻干后的菌体。加入发酵液之前和冻干后准确称取离心管的重量，计算细胞干重。
5、将冻干后的菌体转移至已知质量的酯化管中，称取转移的菌体干重，加入2mL酯化液(按体积百分含量为3％将浓硫酸溶于甲醇中，得到硫酸-甲醇溶液，再按照终浓度为1g/L将苯甲酸作为内标加入硫酸-甲醇溶液中，得到酯化液)、2mL氯仿，加盖密闭，100℃烘箱中反应4h；冷却至室温后，加入1mL去离子水，充分振荡，静置分层；待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相，进行气相色谱分析；
使用安捷伦公司的微量进样器，进样量为1μL，采用内标法对聚合物进行定量分析，根据峰面积定量。
聚合物含量定义为聚合物对细胞干重的比值，聚合物产量＝聚合物含量×细胞干重。
通过计算，得到丁酸为底物时，细胞干重为5.01g/L，细胞内积累的聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯，产量为3.49g/L，占细胞干重的69％。由此可见，丁酸相对乙酸，能够获得更高的细胞干重和聚羟基脂肪酸酯产量。经计算，以丁酸为碳源合成聚-3-羟基丁酸酯的理论最高得率为0.98g聚-3-羟基丁酸酯/g丁酸，该实施例所得实际得率达到了理论得率的40％。
二、TYS丁酸培养基不接种的开放培养
1、配置液体TYS培养基，添加丁酸至终浓度20g/L，调pH为7。不接种任何微生物，使用250ml摇瓶，总装液量为50ml，37℃、200rpm培养40-48h，制成发酵液。
2、由于未接种，但在开放条件下有杂菌生长，按照上述一的方法，检测杂菌培养的细胞干重和聚羟基脂肪酸酯产量。
结果发现，细胞干重为0.06g/L，没有检测到聚羟基脂肪酸酯的积累。由此说明，以10g/L的丁酸为碳源，一般微生物很少生长，杂菌的生物量很低。
实施例3、以海神单胞菌利用丁酸生产聚羟基脂肪酸酯(发酵罐培养)
一、以海神单胞菌利用丁酸生产聚羟基脂肪酸酯
1、无菌操作制备海神单胞菌种子液
(1)菌种活化
取保存于-80℃冰箱的菌种甘油管，划线接种至TYS培养基平板，37℃培养12-24h。
(2)一级种子
从完成步骤(1)的平板上挑取接单菌落，接种于液体TYS培养基，37℃，200rpm振荡培养10-12h。
(3)二级种子
取步骤(2)得到的一级种子液，按照1％的接种量，接种于液体TYS培养基，添加10g/L丁酸为碳源，37℃，200rpm振荡培养10-12h。发酵罐培养所需的二级种子液共300ml。
2、制作2700ml TYS培养基，加入丁酸至终浓度为10g/L。将培养基加入容积为5L的发酵罐(百伦生物，型号为BLBIO-5GJ-2)中。
3、将300ml二级种子液加入发酵罐中，使其发酵体系为3L，发酵温度37℃，通过关联搅拌速率保持溶氧为30％，搅拌速率为400-800rpm，利用6M氢氧化钠和3M盐酸调节pH值，在pH值为8的条件连续发酵培养，空气的通气量为3L/min。每4h取样50ml留存，以备检测细胞干重和聚羟基脂肪酸酯产量，同时实时检测丁酸量，并补充丁酸，发酵52h。
5、取30ml发酵液，置于50ml体积的离心管中进行8000rpm离心10min，弃上清后用去离子水重悬清洗菌体，再次于8000rpm离心10min，弃上清液后，将菌体在-20℃下放置1h，再进行真空冷冻干燥8-12h，得到冻干后的菌体。加入发酵液之前和冻干后准确称取离心管的重量，计算细胞干重。
6、将冻干后的菌体转移至已知质量的酯化管中，称取转移的菌体干重，加入2mL酯化液(按体积百分含量为3％将浓硫酸溶于甲醇中，得到硫酸-甲醇溶液，再按照终浓度为1g/L将苯甲酸作为内标加入硫酸-甲醇溶液中，得到酯化液)、2mL氯仿，加盖密闭，100℃烘箱中反应4h；冷却至室温后，加入1mL去离子水，充分振荡，静置分层；待氯仿相与水相完全分离后，取氯仿相，进行气相色谱分析；
7、使用安捷伦公司的微量进样器，进样量为1μL，采用内标法对聚合物进行定量分析，根据峰面积定量。
8、聚合物含量定义为聚合物对细胞干重的比值，聚合物产量＝聚合物含量×细胞干重。
结果表明(图1)，发酵48h，细胞干重和聚羟基脂肪酸酯的产量达到最高，细胞干重为35.07g/L，细胞内积累的聚酯为聚-3-羟基丁酸酯，产量为15.51g/L，发酵消耗的丁酸总量为54.17g/L，发酵得率为0.29g聚-3-羟基丁酸酯/g丁酸。经计算，以丁酸为碳源合成聚-3-羟基丁酸酯的理论最高得率为0.98g聚-3-羟基丁酸酯/g丁酸，该实施例所得实际得率达到了理论得率的30％。

Claims (11)

1.海神单胞菌在制备聚羟基脂肪酸酯中的应用；
所述海神单胞菌的保存编号为JCM17730；
所述底物为乙酸或丁酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯。
3.一种制备聚羟基脂肪酸酯的方法，包括：
以乙酸或丁酸为底物，发酵培养海神单胞菌，得到所述聚羟基脂肪酸酯；
所述海神单胞菌的保存编号为JCM17730。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在发酵起始时刻所述底物在体系中的浓度为10-20g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在发酵起始时刻所述丁酸在体系中的浓度为10g/L。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在发酵起始时刻所述乙酸在体系中的浓度为20g/L。
7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：在发酵初始时刻，含有所述海神单胞菌的体系的OD600值为0.05-0.25；
所述发酵培养步骤中，发酵温度为37℃；
溶氧为10-50%；
发酵时间为36-60h；
pH值为7-9；
空气的通气量为1-5L/min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在发酵初始时刻，含有所述海神单胞菌的体系的OD600值为0.1；
所述发酵培养步骤中，所述溶氧为30%；
所述发酵时间为48h；
所述pH值为8；
所述空气的通气量为3 L/min。
9.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养为开放培养；
所述发酵中，发酵体系由种子液、培养基和所述底物组成；
所述种子液提供的有效成分为所述海神单胞菌。
10.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述种子液的培养为无菌操作培养。
11.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述聚羟基脂肪酸酯为聚-3-羟基丁酸酯。
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