JP2023551279A - 顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ｆｓｈｄ）を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）又は肉腫を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び／又は予防するための生成物、方法、及び使用が本明細書に開示される。より具体的には、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）の発現を阻害又は下方制御するためのＲＮＡ干渉ベースの生成物、方法、及び使用が本明細書に開示される。更により具体的には、本開示は、ＤＵＸ４の発現を阻害又は下方制御するためのＵ７ＤＵＸ４アンチセンス配列を含む核酸、並びに細胞における及び／又はＦＳＨＤ若しくはがんを含むがこれらに限定されない筋ジストロフィー若しくはがんを有する対象の細胞におけるＤＵＸ４発現を阻害又は下方制御するために当該アンチセンス配列を使用する方法を提供する。【選択図】なし

Description

政府権益の声明
本発明は、米国国立衛生研究所からの付与番号ＡＲ０７０６０４の下で政府の支援とともに行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。

配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：５６０６１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：１３，６７１バイト、作成日：２０２１年１１月２３日）を含み、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。

本開示は、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）又は肉腫を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィー又はがんの治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、ＦＳＨＤ又は肉腫を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び／又は予防するためのＲＮＡ干渉ベースの生成物、方法、及び使用を提供する。具体的には、本開示は、二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害又は下方制御するための生成物及び方法を提供する。より具体的には、本開示は、ＤＵＸ４の発現を阻害又は下方制御するためのＵ７小核ＲＮＡ（Ｕ７ｓｎＲＮＡ）、及び当該Ｕ７ｓｎＲＮＡを使用して、細胞において、及び／又は筋ジストロフィー若しくはがんを有するか若しくは有するリスクにある対象において、ＤＵＸ４の発現を阻害又は下方制御する方法を提供する。

筋ジストロフィー（ＭＤ）は、遺伝性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱及び変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期又は小児期に発症するが、他は中年以降まで出現し得ない。障害は、筋力低下の分布及び程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、並びに遺伝形式の点で異なる。

顔面肩甲上腕ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、なかでも最も一般的に遺伝する筋ジストロフィーであり、８７万人にも影響を及ぼすと推定されている。ＦＳＨＤの症状の古典的な説明には、顔、肩帯、及び腕における進行性の筋力低下が含まれるが、疾患は、胴体及び下肢の筋肉を含む、より広範囲に現れ得る。可変性はまた個人内に一般的に認められ、非対称的な衰弱が一般的である。発症年齢は幼児期から成人期までの範囲であり得、通常は疾患の重症度に関連しており、より早い発症は、多くの場合より重度の筋力低下に関連する。ＦＳＨＤを有するほとんどの患者は、通常の寿命を有するが、呼吸不全が発生する可能性があり、疾患が衰弱させ得、罹患した個人の約２５％がその５０歳代までに車椅子に依存することになり得、より重症な疾患形態では更に早いが、一方、他は生涯歩行を維持する。

ＦＳＨＤは、二重ホメオボックス４遺伝子（ＤＵＸ４）の異常な発現によって引き起こされ、骨格筋にとって有毒な転写因子を産生する。ＤＵＸ４は、通常、ヒトの発達の４細胞期の期間中に機能するが、その後、おそらく精巣及び多分胸腺を除いて、基本的に他の全ての組織で抑制される。ＦＳＨＤを有する人々の骨格筋では、特定の遺伝的及びエピジェネティック因子が同時にＤＵＸ４脱抑制を可能にし、次いでそれが、分化異常、酸化ストレス、炎症性浸潤、細胞死、及び筋萎縮に関与するものを含む、いくつかの異常な遺伝子発現カスケードを開始する。

ＦＳＨＤ分野における進歩にもかかわらず、ＦＳＨＤのために承認された治療法はまだなく、治療開発はこの分野で依然として重大な要求であり続けている。前臨床試験においてＡＡＶベクターによって送達されたＲＮＡｉベースの遺伝子療法を使用するＤＵＸ４サイレンシングの安全性及び有効性が、既に示されている（非特許文献１）。非常に少量のＤＵＸ４タンパク質でさえ筋細胞に有毒であり得るため、患者の筋肉におけるＤＵＸ４サイレンシングを最大化するのに役立つ代替メカニズムを、単独で又は組み合わせ療法で使用することができる追加のＤＵＸ４サイレンシング戦略を開発することが重要である。

ＦＳＨＤはＤＵＸ４脱抑制から生じるため、療法への最も直接的な経路には、筋肉におけるＤＵＸ４を阻害することが含まれる。Ｕ７小核ＲＮＡ（Ｕ７ｓｎＲＮＡ）による遺伝子制御は、ＤＵＸ４を阻害する１つの強力なアプローチである。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、ＲＮＡ分子であり、小核リボ核タンパク質複合体（Ｕ７ｓｎＲＮＰ）の構成要素であり、ヒストンプレｍＲＮＡプロセシングに必要とされる。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターが、Ｕ７ｓｎＲＮＡを筋肉に送達するために使用されてきている。ＡＡＶは、例えば遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養における細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させて、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくり***する細胞及び非***性細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の存続期間にわたって持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部の約４．３ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の一部又は全てが、外来ＤＮＡで置き換えられ得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した耐久性のあるウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥さえされ得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性ではない。

ＦＳＨＤを含むが、これに限定されない筋ジストロフィーを治療するための生成物及び方法に対する当該技術分野での必要性が依然として存在する。本開示は、筋細胞におけるＤＵＸ４発現を阻害するためのＵ７小核ＲＮＡ（Ｕ７ｓｎＲＮＡ）アプローチを提供する。

Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ８，１２１－１３０（２０１８）

本開示は、ＤＵＸ４発現を阻害するための、並びに筋ジストロフィーを治療、改善、進行を遅延、及び／又は予防するための、生成物、方法、及び使用を提供する。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。

本開示は、ＤＵＸ４発現を阻害するように設計される核酸、核酸を含むウイルスベクター、核酸及びベクターを含む組成物及びキット、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害及び／又は発現に干渉するためにこれらの生成物を使用するための方法、並びに筋ジストロフィーに罹患している対象を治療するための方法を提供する。

本開示は、Ｕ７二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）アンチセンスリボ核酸（ａｓＲＮＡ）をコードする核酸を提供し、核酸は、（ａ）配列番号１～１８のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号１～１８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は（ｃ）（ａ）及び／若しくは（ｂ）のヌクレオチド配列の組み合わせを含む。

本開示は、配列番号１９～３６のいずれか１つに示されるＤＵＸ４標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＵ７二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号１９～３６のいずれか１つに示されるＤＵＸ４標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＵ７二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列の組み合わせを含む、核酸を提供する。

いくつかの態様において、本開示の核酸は、プロモーターの制御下にあり、したがって、プロモーターヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＣＭＶプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの更なる態様において、筋肉特異的プロモーターは、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、又はＣＫ１プロモーターである。

いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか又はそれらのいずれか１つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターを含む。いくつかの態様において、１つ以上の核酸は、単一ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターと組み合わされる。いくつかの態様において、ナノ粒子は、リポソーム又はミセルである。

いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸又は本開示の核酸の組み合わせを含む、ベクターを含む。本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び／又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示の核酸を送達する。そのため、いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか１つ又はそれらの組み合わせを含む、ベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はウイルスベクターである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、ｒＡＡＶ１１、ｒＡＡＶ１２、ｒＡＡＶ１３、ｒＡＡＶ－ａｎｃ８０、ｒＡＡＶｒｈ．７４、ｒＡＡＶｒｈ．８、ｒＡＡＶｒｈ．１０、又はｒＡＡＶ－Ｂ１である。いくつかの態様において、ＡＡＶは、ｒＡＡＶ－９である。

本開示は、（ａ）本明細書に記載される核酸、若しくはかかる核酸の組み合わせ、（ｂ）本明細書に記載されるナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本明細書に記載されるウイルスベクター、又は（ｄ）本明細書に記載される組成物、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。

本開示は、細胞を、（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、と接触させることを含む、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害及び／又は発現に干渉する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は、対象中にある。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。

本開示は、対象に、有効量の（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、を投与することを含む、筋ジストロフィーを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。

本開示は、対象に、有効量の（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、を投与することを含む、がんを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、がんは、肉腫である。

本開示は、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害するための医薬品の調製のための、（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、細胞は、対象中にある。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。

本開示は、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害するための、（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、細胞は、対象中にある。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。

本開示は、筋ジストロフィーを治療又は改善するための医薬品の調製のための、（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、の使用を提供する。

本開示は、筋ジストロフィーを治療又は改善するための、（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、ＦＳＨＤである。

本開示は、がんを治療又は改善するための医薬品の調製のための、（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、がんは、肉腫である。

本開示は、がんを治療又は改善するための、（ａ）本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、（ｂ）本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、（ｃ）本開示のウイルスベクター、又は（ｄ）本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、がんは、肉腫である。

本開示はまた、本開示の核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、ベクター、ウイルスベクター、組成物、又は医薬品が、筋肉内注射、経皮輸送、又は血流への注入のために製剤化される、方法及び使用を提供する。

本開示の更なる態様及び利点は、図面と併せて得られる、以下の詳細な説明のレビューから、当業者には明らかであろう。しかしながら、詳細な説明（図面及び特定の実施例を含む）は、開示される主題の実施形態を示すが、例示としてのみ与えられ、それは本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるためである。

図１Ａ～Ｄは、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡが、ＨＥＫ２９３細胞をＤＵＸ４媒介性死から保護することを示す。図１Ａは、安定化ヘアピン－ループ、Ｓｍ結合領域、及びＤＵＸ４プレｍＲＮＡ上の標的部位に相補的なアンチセンス配列からなるＵ７－ｓｎＲＮＡ構造を示す（配列について表１を参照）。図１Ｂは、ＤＵＸ４ｍＲＮＡの異なる部分を標的とする１８個のＵ７－ａｓＤＵＸ４構築物の概略図である。ＡＴＧは、開始コドンを示す。エクソン１（Ｅｘ１）には、ＤＵＸ４オープンリーディングフレーム全体が含まれ、Ｅｘ２及びＥｘ３には、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が含まれる。＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、ＡＮＯＶＡ。三重測定で行ったＮ＝３の独立した実験。図１Ｃは、アポトーシスに関するカスパーゼ－３／７アッセイの結果を示す。全てのＤＵＸ４標的化Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡ構築物は、配列６で処理された細胞を除いて、カスパーゼ－３／７活性を有意に低下させた。試験した１８個の構築物のうち１４個が、カスパーゼ－３／７活性を５０％超低下させた（例外は、１、２、６、及び１８だった）。相対的に最も低いカスパーゼ－３／７活性（ＤＵＸ４のみでトランスフェクションした細胞における活性に対して正規化した）を有する細胞を、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－３（３４±１２）、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－４（２６±７）、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－７（３６±８）、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－１１（３０±３）、及びＵ７－ａｓＤＵＸ４－１６（３３±６）で処理した。図１Ｄは、細胞生存率が、ＤＵＸ４単独でトランスフェクトしたものと比較して、全てのＵ７－ａｓＤＵＸ４処理した細胞において有意に増加したことを示し、それぞれＵ７－ａｓＤＵＸ４－７（９４．８％±４．９）、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－８（８４．７％±３．８）、及びＵ７－ａｓＤＵＸ４－４（７８．５％±８．４）を有し、生存細胞の最も高いパーセンテージを示した（Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した実験）。 図２Ａ～Ｈは、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡが、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において過剰発現したＤＵＸ４ｍＲＮＡを有意に低下させたことを示す。ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイ：ＤＵＸ４ｍＲＮＡシグナルは、トランスフェクトした細胞において、褐色の点状ドットとして現れた（図２Ａ～Ｄ）。図２Ａは、ＣＭＶ．ＤＵＸ４及びＤＵＸ４非標的化Ｕ７対照プラスミドで同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で検出された多量のＤＵＸ４シグナルを示す。ＣＭＶ．ＤＵＸ４と、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－４（図２Ｂ）、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－７（図２Ｃ）、及びＵ７－ａｓＤＵＸ４－８（図２Ｄ）プラスミドと、によるＨＥＫ２９３細胞の同時トランスフェクション後の褐色ＤＵＸ４シグナルの低下。図２Ｅは、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＵＸ４プローブによるバックグラウンドシグナルを示す。図２Ｆは、ハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＢが全てのＨＥＫ２９３細胞で検出され、アッセイの陽性対照として機能したことを示す。図２Ｇは、細菌遺伝子ｄａｐＢプローブを、ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイの陰性対照として使用したことを示す。図２Ｈは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ定量化が、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡ４、７、及び８を共発現するＤＵＸ４トランスフェクトした細胞において、ＤＵＸ４陽性シグナルを有意に低下させたことを示したことを示す。４０×対物レンズ。スケールバー、５０ミクロン。定量化は、参照文献３０に記載されているように実施した（開示の最後の引用を参照）。２つの代表的な顕微鏡視野を３つの独立した実験からカウントし、各ポイントは１つの視野の定量化を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ。 図３Ａ～Ｅは、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡが、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＤＵＸ４タンパク質産生を低下させることを示す。図３Ａは、Ｃ末端Ｖ５エピトープタグを含有する全長ＤＵＸ４発現構築物の概略図を示す。１４個のアミノ酸であるＶ５タグをコードする４２ｂｐのＤＮＡ配列は、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－４標的部位を破壊した。エクソン１（Ｅｘ１）の黒色バーは、ＤＮＡ結合ホメオドメイン１及び２（ＨＯＸ１及びＨＯＸ２）を示すが、縮尺されていない。イントロン１及び２は、_∨シンボルとして示される。図３Ｂは、ＣＭＶ．ＤＵＸ４－Ｖ５とともに同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の抗Ｖ５免疫蛍光染色を示し、ＤＵＸ４－Ｖ５シグナルは、赤色蛍光として現れる。Ｂｌｕｅ ＤＡＰＩ染色（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）は、ＨＥＫ２９３核を示す。Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－７及びＵ７－ａｓＤＵＸ４－８構築物は、非標的化Ｕ７－ｓｎＲＮＡで処理された細胞と比較して、ＤＵＸ４－Ｖ５タンパク質染色を減少させた。Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－４配列は、他のアッセイで機能的だったが、図３Ａに示されるように、Ｖ５タグによるその結合部位の破壊のために、ＤＵＸ４－Ｖ５タンパク質発現を低下させなかった。４０×対物レンズ。スケールバー、５０ミクロン。図３Ｃは、ウェスタンブロットアッセイに使用されたＭｙｃ－ＤＵＸ４－ｆｌ構築物、及びＤＵＸ４のリードＵ７－ａｓＤＵＸ４標的化によるＤＵＸ４阻害の考えられるメカニズムを示す（文脈で考察される）。ＤＵＸ４－ｓは、Ｃ末端トランス活性化ドメインを欠く、ＤＵＸ４の非毒性の可能性のあるアイソフォームである。図３Ｄは、ウェスタンブロット結果が、非標的化Ｕ７－ｓｎＲＮＡでトランスフェクトしたものと比較して、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４処理された細胞における低下したＤＵＸ４タンパク質を実証したことを示す。２つのバンドである５２ｋＤａ及び６０ｋＤａは、ＣＭＶ．ｍｙｃ－ＤＵＸ４トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞抽出物に対して抗Ｍｙｃ抗体を使用した後にウェスタンブロットで現れた。６０ｋＤａタンパク質バンドは、トランスフェクトしていない細胞で検出され、おおよそ内因性Ｍｙｃタンパク質のサイズで移動した。先に観察された免疫蛍光、細胞死、及びＲＮＡｓｃｏｐｅの結果と一致して、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡは、非標的化対照と比較して、トランスフェクトしたＤＵＸ４発現を低下させた。ウェスタンブロットを、３つの独立した実験（図６に示される生ブロット）からのタンパク質抽出物を使用して３回行った。チューブリンを正規化物質として使用した。図３Ｅは、図３Ｄのウェスタンブロットの定量化を示す。ＤＵＸ４タンパク質シグナル強度は、非標的化対照と比較したとき、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－４（８７．４％±９．８）及びＵ７－ａｓＤＵＸ４－８（８４．７％±１３．５）を用いて処理した細胞で有意に減少した。Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－５及び－７は、類似のスプライス接合部位を標的にし、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－６は、イントロン１ＳＤ部位を標的にする。これらの３つの構築物を試験して、それらのうちのいずれが、全長ＤＵＸ４ｍＲＮＡの正しいスプライシングを変更することによってＤＵＸ４－ｓ産生を誘導することができるか決定した。ＤＵＸ４短タンパク質バンド（２２ｋＤａ）は、ウェスタンブロットアッセイを使用して検出されなかった。＊＊Ｐ≦０．０１、ＡＮＯＶＡ、Ｎ＝３の独立した実験、各実験はそのそれぞれの非標的対照に正規化し、それを１００％ＤＵＸ４発現に設定した。 図４Ａ～Ｉは、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４構築物が、ＦＳＨＤ患者由来の筋管における内因性ＤＵＸ４及びＤＵＸ４関連バイオマーカーを低下させることを示す。図４Ａは、ＦＳＨＤ１５Ａ筋管が、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４で処理された細胞と比較して、高い量のＤＵＸ４ｍＲＮＡシグナルを実証したことを示す。図４Ａのパネルの矢印は、ＤＵＸ４陽性の例が褐色のシグナルを表すことを示す。ＦＳＨＤ１５Ａ筋管におけるＤＵＸ４発現は、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－４（図４Ｂ）、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－７（図４Ｃ）、及びＵ７－ａｓＤＵＸ４－８（図４Ｄ）でトランスフェクトされた１５Ａ細胞において減少したか、又は存在しなかった。図４Ｅは、ＤＵＸ４プローブを使用したＲＮＡｓｃｏｐｅ染色の陰性対照として機能した、影響を受けていない１５Ｖ筋管において非常に弱いシグナルが存在するか又は存在しないことを示す。図４Ｆは、ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイのためのハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＢ陽性対照で染色された１５Ａ筋管を示す。図１Ｇは、アッセイの陰性対照として機能した、細菌ｄａｐＢ遺伝子プローブで染色された１５Ａ筋管を示す。１００×対物レンズ。スケールバー、２０ミクロン。図１Ｈは、参照文献３０に記載されているように行われた、ＤＵＸ４ＲＮＡｓｃｏｐｅシグナルの定量化を示す。３～４つの代表的な顕微鏡視野を３つの独立した実験からカウントし、各ポイントは１つの視野の定量化を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ。ＤＵＸ４シグナルは、未処理の影響を受けた１５Ａ試料と比較して、影響を受けなかった１５Ｖ細胞、同様にリードＵ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡプラスミドでトランスフェクトした影響を受けた１５Ａ細胞に、存在しなかったか、又は非常に低かった。＊＊Ｐ≦０．０１、ＡＮＯＶＡ。図４Ｉは、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４配列によるＤＵＸ４活性化バイオマーカーのノックダウンを示す。プロットは、非標的化ｓｎＲＮＡでトランスフェクトした対照と比較して、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４処理したＦＳＨＤ１５Ａ筋管におけるＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ１２、ＭＢＤ３Ｌ２、及びＴＲＩＭ４３の有意な減少を示す。三重測定又はいくつかの場合に二重測定で行ったＮ＝４の独立した実験。＊＊Ｐ≦０．０１、ＡＮＯＶＡ。 図５Ａ～Ｃは、Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｅ Ｆｉｎｄｅｒ３．１ Ｔｏｏｌからの予測を使用して、ＤＵＸ４プレｍＲＮＡで予測されたスプライス部位及びスプライスエンハンサー／サイレンサー部位を示す。図５Ａは、予測されたスプライスモチーフ（図５Ｂ～Ｃ）と重複するＵ７－ａｓＤＵＸ４結合部位位置を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図６Ａ～Ｃは、生ウェスタンブロット１（図６Ａ）、２（図６Ｂ）、及び３（図６Ｃ）を示す。 同上。 同上。 ＤＵＸ４－ｓが、ネステッドＲＴ－ＰＣＲで検出されなかったことを示す。ｃＤＮＡ合成は、既に報告されているオリゴ－ｄＴアダプタープライマー（Ｇｉｅｓｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ２０１８；３（２２）：ｅ１２３５３８）を用いてプライミングした。３μｌのｃＤＮＡ産物を第１のＰＣＲ反応の鋳型として使用し、次いでこの産物を第２のＰＣＲラウンドで１／１０希釈した。ＤＵＸ４－ｓについて予想された５６９ｂｐバンドは、陽性対照（ＤＵＸ４－ｓトランスフェクトした細胞）でのみ認められ、他の試料には存在しなかった。この実験を、ＤＵＸ４トランスフェクトしたＨＥＫ２９３及び１５ＡヒトＦＳＨＤ筋管において少なくとも４回繰り返した。ＤＮＡラダー、ＴｒａｃｋＩｔ １Ｋｂ、及びＤＮＡラダー。１．５％アガロースゲル。

ヒト１５Ｖ ＦＳＨＤ筋芽細胞が、ＣＭＶ．ＧＦＰプラスミドで効率的にトランスフェクトされることを示す。この実験は、ヒト筋芽細胞を使用して、Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラスミドトランスフェクションを介したＤＵＸ４阻害の有効性を試験することができることを確証するために行われた。 図９は、インビボでの使用のためのＲＮＡｓｃｏｐｅプローブの開発を示す。ＲＮＡｓｃｏｐｅプローブは、ＤＵＸ４及び５つのＤＵＸ４活性化バイオマーカーであるＭＢＤ３Ｌ２、ＰＲＡＭＥＦ１２、ＬＥＵＴＸ、ＺＳＣＡＮ４、及びＴＲＩＭ４３を検出するように設計された。図９の上部パネルは、ＤＵＸ４プラスミドトランスフェクトしたＨＥＫ２９３（褐色染色）を使用したインビトロでのプローブの最適化を示す。下部パネルは、ＦＳＨＤ患者筋生検からの連続切片におけるＤＵＸ４及びＴＲＩＭ４３シグナルの共局在化を示す。矢印は、シグナルを示す。文字ａ、ｂ、ｃは、連続切片の位置合わせに役立つ。ＤＵＸ４プローブからの明白なシグナルは、２０例の試料のうち１１例で、ＴＲＩＭ４３は、２０例の試料のうち１３例で特定されている。２例の試料は、明らかなＤＵＸ４シグナルを伴わないＴＲＩＭ４３を有し、一方、７例の試料は、ＤＵＸ４又はＴＲＩＭ４３シグナルを示さなかった。これらの結果は、ＤＵＸ４が、ＦＳＨＤ患者生検からの全ての筋核に均一には見出されないことを実証する。これらの結果はまた、ＲＮＡｓｃｏｐｅが、臨床使用のための転帰尺度として使用することができる患者の試料において、インビボでＤＵＸ４ｍＲＮＡを検出するために使用することができることを実証する。

本開示は、筋肉中の二重ホメオボックスタンパク質４（ＤＵＸ４）の発現が、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィーを引き起こすことが知られているため、ＤＵＸ４タンパク質産生を抑制又は阻害することによって転写後のＤＵＸ４遺伝子発現を果たす新規戦略を提供する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の生成物及び方法は、ＦＳＨＤを治療、改善、進行の遅延、及び／又は予防する際に使用される。

ＤＵＸ４遺伝子は、約４５ｋＤＡのタンパク質をコードする（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＵＢＸ２（ＤＵＸ４＿ＨＵＭＡＮ）を参照）。ＤＵＸ４遺伝子の脱抑制は、ＦＳＨＤの疾患発症に関与する。脱抑圧は、２つの既知の機構：Ｄ４Ｚ４反復収縮、又はクロマチン変更遺伝子であるＳＭＣＨＤ１若しくはＤＮＭＴ３Ｂにおける変異、を通して発生し得る。前者では、非罹患対象では、Ｄ４Ｚ４配列は１１～１００反復で構成されるが、ＦＳＨＤ１患者では、配列は１～１０反復に減少する（ＰｕｂＭｅｄ：１９３２０６５６）。いずれの状態も、染色体４ｑ３５でＤＮＡ低メチル化を引き起こし得、それによって、ＤＵＸ４発現を許す染色体環境を生じる。

ＤＵＸ４は、体細胞組織においてエピジェネティックに抑制されるＤ４Ｚ４マクロサテライト反復に位置する。ＦＳＨＤ１におけるＤ４Ｚ４クロマチン弛緩は、ＤＵＸ４の非効率的なエピジェネティック抑制及び骨格筋核のサブセットにおけるＤＵＸ４タンパク質発現の多様化パターンをもたらす。骨格筋におけるＤＵＸ４の異所性発現は、幹細胞及び生殖細胞遺伝子の発現を活性化し、体細胞で過剰発現すると、ＤＵＸ４は最終的に細胞死をもたらし得る。

各Ｄ４Ｚ４反復単位は、２つのホメオボックスをコードするオープンリーディングフレーム（ＤＵＸ４と名付けられた）を有し、反復配列及びＯＲＦは他の哺乳動物で保存されている。コードされたタンパク質は、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ１２、ＴＲＩＭ４３、及びＭＢＤ３Ｌ２を含むＦＳＨＤ疾患バイオマーカーであると考えられるいくつかを含む、多くの遺伝子の転写活性化因子として機能することが報告されている（ＰＭＩＤ：２４８６１５５１）。マクロサテライト反復の収縮は、常染色体優性ＦＳＨＤを引き起こす。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。

本開示のいくつかの実施形態において、ＤＵＸ４核酸及びタンパク質が提供される。いくつかの態様において、ヒトＤＵＸ４をコードする核酸は、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列で示される。いくつかの態様において、ヒトＤＵＸ４のアミノ酸配列は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列で示される。様々な態様において、本開示の方法はまた、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列のアイソフォーム及びバリアントも標的とする。いくつかの態様において、バリアントは、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。いくつかの態様において、本開示の方法は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸のアイソフォーム及びバリアントを標的とする。いくつかの態様において、バリアントは、配列番号３８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、及び７０％の同一性を含む。

現在、ＦＳＨＤのための治療はなく、筋ジストロフィーの中でのその相対的多数にもかかわらず、ＦＳＨＤ標的化翻訳の試験はほとんど公表されてきていない。いくつかのＦＳＨＤ候補遺伝子が特定されているが、最近の多くの試験は、ＦＳＨＤ発症の主な寄与因子が、転写因子をコードするアポトーシス促進性ＤＵＸ４遺伝子であることを裏付けている。したがって、ごく簡単にいうと、ＤＵＸ４過剰発現が、ＦＳＨＤの根底にある主要な病原性損傷である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２４，１４０５－１４１１、Ａｎｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）８、Ｌｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ１２、Ｈｉｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２４，５２７－５３５、ＤｅＳｉｍｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ Ａｄｖ５，１２、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１７，１６５０９－１６５１５、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）、上記、Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．Ｓｅｐ；３７４（３）：４８９－４９８）。

いくつかの実施形態において、本開示は、アンチセンス転写物とも称されるアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、天然アンチセンス転写物、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスＲＮＡは、それがハイブリダイゼーションするタンパク質コードメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的であり、それによってタンパク質へのその翻訳を遮断する、一本鎖ＲＮＡである。ａｓＲＮＡの主な機能は、遺伝子発現を制御することである。アンチセンスＲＮＡはまた、本明細書に記載されるように合成的に産生され得、ＤＵＸ４発現を下方制御する際に使用される。

本開示は、Ｕ７アンチセンス（ａｓ）ＤＵＸ４ｓｎＲＮＡを使用することによってＤＵＸ４ノックダウン又はサイレンシングを達成するための新規構築物及び方法を提供する。Ｕ７－ａｓ ｓｎＲＮＡは、核で転写され、次に細胞質に輸出され、そこでＳｍ及びＬｓｍタンパク質とともに組み立てられる。組み立てられたＵ７－ｓｎＲＮＰは、細胞質に残るか、又は核に輸入されて戻され得る。核では、それらはスプライシング機構に関連しているが、細胞質では、それらはＰ ｂｏｄｙに関連し、通常、ｍＲＮＡ転換において機能する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）．ＰＮＡＳ１０４（２８），１１６５５－１１６５９）。同様に、ｍＲＮＡは核及び細胞質の両方で検出することができ、それらは核内で転写及び成熟され、その後、翻訳のために細胞質に輸送される。

いくつかの実施形態において、本開示は、筋肉における毒性ＤＵＸ４遺伝子の発現を下方制御又は阻害することによってＦＳＨＤを治療する遺伝子療法アプローチを提供する。全長ＤＵＸ４遺伝子産物は、細胞死及び筋肉毒性を引き起こし、したがって、本明細書に記載のＦＳＨＤ療法は、全長ＤＵＸ４発現を阻害するように設計される。本明細書に記載されるいくつかの態様において、ＤＵＸ４阻害は、Ｕ７－ｓｎＲＮＡアンチセンス発現カセット（Ｕ７－ａｓＤＵＸ４と呼ばれる）を使用して達成される。これらの非コードＲＮＡは、ＤＵＸ４開始コドン、スプライス部位、又はポリアデニル化シグナルをマスキングすることによって、全長ＤＵＸ４プレｍＲＮＡの産生又は成熟を阻害するように設計された。Ｕ７－ａｓＤＵＸ４構築物は、３つの主な特徴：１つの末端における安定したヘアピン構造と、Ｓｍタンパク質に対する結合部位と、目的の任意の遺伝子、例えば、ＤＵＸ４を標的とするように改変することができるアンチセンス領域と、を有する。

本明細書において特定されるいくつかの構築物は、エクソン１／イントロン１接合部（すなわち、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－４及び－７）、又はＤＵＸ４ポリＡシグナル（ＰＡＳ）（すなわち、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－８）を標的にする。ＤＵＸ４ＰＡＳに結合するアンチセンス配列の使用は、化学的に合成されたＡＳＯを使用して既に実証されており、インビトロ及びインビボでＤＵＸ４及びＤＵＸ４活性化バイオマーカーを低下させることが示されている（Ｖａｎｄｅｒｐｌａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ６，ｅ２６８２０、Ｍａｒｓｏｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２５，１４６８－１４７８、Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２４，１４０５－１４１１、Ａｎｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）８）が、スプライス接合部を標的にすることは、新規アプローチである。本明細書に記載されるＵ７－ａｓＤＵＸ４配列は、独自で新規であり、Ｓｍタンパク質及びＬｓｍタンパク質を動員する追加の配列を組み込み、プロモーターからインビボで発現されるため、ＡＳＯとは異なる。ポリアデニル化は、新生ｍＲＮＡを安定化させ、翻訳のために核孔を通る細胞質までのｍＲＮＡ通過を調整するために必要とされる重要なプロセスである。化学的に合成されたＤＮＡベースのＡＳＯは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成し、標的転写産物に対してＲＮＡｓｅ Ｈを活性化することによって作用し得るが、それはまた、ＤＵＸ４ＰＡＳと塩基対形成するように設計された公開されたＡＳＯ配列が、シグナルをマスキングし、ポリアデニル化を防止することによって作用することができ、それによってＤＵＸ４ｍＲＮＡ不安定化をもたらす可能性がある。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＤＵＸ４を標的として、ＤＵＸ４の発現を阻害するＵ７ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（Ｕ７－ａｓＤＵＸ４）を提供する。本開示は、本明細書に記載の様々なヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる様々な核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、本質的にヌクレオチド配列からなる。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列からなる。

そのため、いくつかの態様において、本開示は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を防止及び阻害するために阻害性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。阻害性ＲＮＡは、ＤＵＸ４の発現を阻害する、アンチセンス配列を含む。配列番号１～１８に示される配列は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を防止及び阻害するＵ７ｓｎＲＮＡをコードするＤＮＡ配列である。

いくつかの態様において、「Ｕ７－ａｓＤＵＸ４」という用語は、配列番号１～１８のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を意味するように、本明細書で互換的に使用される。いくつかの他の態様において、本開示は、配列番号１９～３６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４配列を標的とする、ＤＵＸ４アンチセンス、例えば、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。

いくつかの態様において、「Ｕ７－ａｓＤＵＸ４」という用語は、配列番号１９～３６のいずれか１つに示される二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＵ７ＤＵＸ４アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列を意味するように本明細書で互換的に使用される。

したがって、いくつかの態様において、本開示は、（１）配列番号１～１８に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含む核酸、又は配列番号１～１８に示される配列のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含む核酸、及び（２）配列番号１９～３６に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを標的とするｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を含む。

いくつかの態様において、本開示は、Ｕ７プロモーターの制御下で、配列番号１～１８に示される配列のうちのいずれか１つを含むヌクレオチド配列、又は配列番号１～１８に示される配列のいずれか１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含む核酸を含む。いくつかの態様において、本開示は、筋肉特異的プロモーターを含むが、これに限定されない別のプロモーターの制御下で、配列番号１～１８に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか１つを含む核酸を含む。

したがって、いくつかの態様において、本開示は、Ｕ７プロモーターの制御下で、配列番号１９～３６に示される標的配列のうちのいずれか１つに結合するｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本開示は、筋肉特異的プロモーターを含むがこれに限定されない別のプロモーターの制御下で、配列番号１９～３６に示される標的配列のうちのいずれか１つに結合するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

本明細書に記載のＤＵＸ４のｓｎＲＮＡ標的化に使用される例示的なヌクレオチド配列には、以下の表１に特定されるものが含まれるが、これらに限定されない。これらのヌクレオチド配列の様々な特性が、以下の表２に示される。

上記で表１及び２に記載のＤＮＡヌクレオチド配列は、（１）ＤＵＸ４を標的とするためのＲＮＡアンチセンス配列をコードするか、又は（２）ＤＵＸ４ｓｎＲＮＡにおける標的配列部位である。

いくつかの態様において、本開示は、ＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害又は発現に干渉するｓｎＲＮＡ又はＵ－ＲＮＡを提供する。いくつかの態様において、ｓｎＲＮＡは、ヒト又はネズミＵ７プロモーター、すなわち、Ｕ７ｓｎＲＮＡによって、又はその制御下で駆動される。いくつかの態様において、ｓｎＲＮＡは、例えば、組織特異的プロモーター又は筋肉特異的プロモーターを含むが、これらに限定されない、任意の他のプロモーターの制御下にある。

いくつかの実施形態において、本開示の生成物及び方法は、ＤＵＸ４発現を下方制御又は阻害するために、通常Ｕ－ＲＮＡとも称される小核リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）をコードする核酸を含む。ｓｎＲＮＡは、真核生物細胞内の細胞核のスプライシングスペックル及びカハール体内に見出される小ＲＮＡ分子のクラスである。小核ＲＮＡは、特定のタンパク質のセットに関連付けられ、複合体は、小核リボ核タンパク質（しばしば「スナープ」と発音されるｓｎＲＮＰ）と称される。各ｓｎＲＮＰ粒子は、ｓｎＲＮＡ成分及びいくつかのｓｎＲＮＰ特異的タンパク質（核タンパク質のファミリーであるＳｍタンパク質を含む）からなる。ｓｎＲＮＡは、それらの関連するタンパク質と一緒に、プレｍＲＮＡ基質上の特定の配列に結合するリボ核タンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）を形成する。これらは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのいずれかによって転写される。ｓｎＲＮＡは、多くの場合、共通の配列特徴及びＲＮＡ結合ＬＳｍタンパク質などの関連するタンパク質因子の両方に基づいて、２つのクラスに分類される。ＳｍクラスのｓｎＲＮＡとして知られる第１のクラスは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ４ａｔａｃ、Ｕ５、Ｕ７、Ｕ１１、及びＵ１２で構成される。ＳｍクラスのｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。第２のクラスは、ＬｓｍクラスのｓｎＲＮＡとして知られ、Ｕ６及びＵ６ａｔａｃで構成される。ＬｓｍクラスのｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され、ＳｍクラスのｓｎＲＮＡとは対照的に、核から決して離れない。いくつかの態様において、本開示は、ＤＵＸ４アンチセンス配列の送達のためのＵ７ｓｎＲＮＡを含むＡＡＶベクターの産生及び投与を含む。

いくつかの態様において、本開示は、Ｕ７ｓｎＲＮＡ分子を使用して、遺伝子発現を阻害、ノックダウン、又はそれに干渉する。Ｕ７ｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンプレｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与するが、いくつかの態様において、スプライシング調節のための汎用ツールに、又は細胞内で連続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとして、変換される（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０６（５７０２）：１７９６－９（２００４））。野生型Ｕ７Ｓｍ結合部位を、スプライセオソームｓｎＲＮＡに由来するコンセンサス配列で置き換えることによって、得られるＲＮＡは、スプライセオソームｓｎＲＮＡに見出される７つのＳｍタンパク質と組み立てられる（図７）。その結果、このＵ７Ｓｍ ＯＰＴ ＲＮＡは、より効率的に核質内に蓄積し、ヒストンプレｍＲＮＡ切断をもはや媒介しないが、依然としてヒストンプレｍＲＮＡに結合し、野生型Ｕ７ｓｎＲＮＰの競合阻害物質として作用することができる。ヒストン下流エレメントに結合する配列を、スプライシング基質における特定の標的に相補的なもので更に置き換えることによって、特定のスプライシング事象を調節することができるＵ７ｓｎＲＮＡを作製することが可能である。Ｕ７誘導体を使用する利点は、アンチセンス配列が、小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体に埋め込まれることである。更に、遺伝子療法ベクターに埋め込まれると、これらの小ＲＮＡは、単回注入後に標的細胞内で永久的に発現することができる［Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２８；９５（９）：４９２９－３４（１９９８）、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３；３０６（５７０２）：１７９６－９（２００４）、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２，（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。ＣＵＧ反復の発現を変化させるためのＵ７の使用は、ＤＭ１患者細胞株においてインビトロで試験されており［Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１）：８５－７（２０１１）］、ＣＵＧ反復を標的とするＵ７ＲＮＡは、ＤＵＸ４関連病巣の減少した量及び異常なスプライシングパターンの修正をもたらすことが示されているが、しかしながら、このアプローチは、レンチウイルスに基づいており、インビボでそれ以上決して追及されなかった。ＡＡＶアプローチを使用した神経筋障害におけるＵ７ｓｎＲＮＡシステムの可能性は、インビボで調査されてきている（ＡＡＶ．Ｕ７）［Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２８；９５（９）：４９２９－３４（１９９８）、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３；３０６（５７０２）：１７９６－９（２００４）、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．３１（２）：１３６－４２（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。

Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンプレｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与するが、スプライシング調節のための汎用ツールとして、又は細胞内で連続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとしても使用される。Ｕ７誘導体を使用する１つの利点は、アンチセンス配列が、小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体に埋め込まれることである。更に、遺伝子療法ベクターに埋め込まれると、これらの小ＲＮＡは、単回注入後に標的細胞内で恒久的に発現することができる。

いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか、又はそれらのいずれか１つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターを含む。いくつかの態様において、１つ以上の核酸は、単一ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターに組み合わされる。いくつかの態様において、ナノ粒子は、リポソーム又はミセルである。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される核酸のうちのいずれか、又は核酸のうちのいずれかの組み合わせを含むベクターを含む。本開示の実施形態は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び／又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示の核酸を送達する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び／又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなどのウイルスベクター）を利用して、本明細書に開示の核酸又は核酸の組み合わせを送達する。

いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、一本鎖ＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶである。

したがって、いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１（すなわち、ＡＡＶ１逆末端反復（ＩＴＲ）及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ２（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ３（すなわち、ＡＡＶ３ＩＴＲ及びＡＡＶ３カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ４（すなわち、ＡＡＶ４ＩＴＲ及びＡＡＶ４カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ５（すなわち、ＡＡＶ５ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ６（すなわち、ＡＡＶ６ＩＴＲ及びＡＡＶ６カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ７（すなわち、ＡＡＶ７ＩＴＲ及びＡＡＶ７カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ８（すなわち、ＡＡＶ８ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ９（すなわち、ＡＡＶ９ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ７４（すなわち、ＡＡＶｒｈ７４ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．８（すなわち、ＡＡＶｒｈ．８ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１１（すなわち、ＡＡＶ１１ＩＴＲ及びＡＡＶ１１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１２（すなわち、ＡＡＶ１２ＩＴＲ及びＡＡＶ１２カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ１３（すなわち、ＡＡＶ１３ＩＴＲ及びＡＡＶ１３カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、又はＡＡＶ－Ｂ１などのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

したがって、本開示のいくつかの実施形態は、配列番号１～１８のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列、又は本明細書の詳細な説明で開示される配列番号１～１８のうちのいずれかに示される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むそのバリアントを含む、核酸を含むｒＡＡＶゲノムを含む。加えて、本開示のいくつかの実施形態は、本明細書の詳細な説明で開示される、配列番号１９～３６のうちのいずれかに示される標的配列に結合するヌクレオチド配列を含む、核酸を含むｒＡＡＶゲノムを含む。

ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、逆位末端反復（ＩＴＲ）に１４５ヌクレオチドを含む長さが約４．７ｋｂである。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され、ＡＡＶ３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９で提供され、ＡＡＶ４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供されて、ＡＡＶ７及びＡＡＶ８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され（ＡＡＶ８に関連する米国特許第７，２８２，１９９号及び同第７，７９０，４４９号も参照）、ＡＡＶ９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、ＡＡＶ１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供され、ＡＡＶ１２ゲノムは、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００８ Ｆｅｂ；８２（３）：１３９９－４０６で提供され、ＡＡＶ１３ゲノムは、Ｊ Ｖｉｒｏｌ２００８；８２：８９１１で提供される。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的マップ位置でｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７位及び２２２７位）と結合した、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムを複製するために最終的に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。代替的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５位に配置される。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）にレビューされている。

ＡＡＶは、例えば遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養での細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させて、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を与える。更に、ＡＡＶは、ゆっくり***する細胞及び非***性細胞で形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の存続期間にわたって持続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にする、プラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部の約４．７ｋｂのゲノム（複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）のいくつか又は全てが、外来ＤＮＡで置き換えられ得る。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑強なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性ではない。

いくつかの実施形態において、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む、本開示のＤＮＡプラスミドが提供される。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子へのｒＡＡＶゲノムの組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）による感染を許容できる細胞に移される。パッケージングされるべきＡＡＶゲノムと、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ヘルパーウイルス機能とを細胞に提供するｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、単一細胞（本明細書においてパッケージング細胞として示される）内に存在する以下の構成要素：ｒＡＡＶゲノムと、ｒＡＡＶゲノムから離れた（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ヘルパーウイルス機能と、を必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来することができる任意のＡＡＶ血清型からであり得、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、及びＡＡＶ－Ｂ１を含むが、これらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からであり得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来することができる、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、及びＡＡＶ－Ｂ１を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型からである。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシドバリアントを有するｒＡＡＶも、本開示に含まれる。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記のように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。同族構成要素の使用が具体的に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、本開示の組換えＡＡＶゲノムは、ポリヌクレオチド配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲ、例えば、プレｍＲＮＡ内の主要なエクソン定義要素に結合する１つ以上のアンチセンス配列を含む。そのため、いくつかの実施形態において、本開示のｒＡＡＶゲノムは、例えば、１つ以上のＤＵＸ４アンチセンス配列をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）、Ｄａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＬＬＣ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）などの商業的プロバイダーが、カスタム阻害性ＲＮＡ分子を作製する。加えて、市販のキットが、ＳＩＬＥＮＣＥＲ（商標）ｓｉＲＮＡ構築キット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）又はｐｓｉＲＮＡシステム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのカスタムｓｉＲＮＡ分子を生成するために利用可能である。

したがって、いくつかの実施形態において、本開示の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのＤＵＸ４標的化ポリヌクレオチド構築物に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｓｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、又は標的配列に結合するように設計されたｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＤＵＸ４を標的とする他のポリヌクレオチド構築物とともに投与される。

様々な態様において、プロモーターを使用して、組織特異的発現を可能にする。いくつかの態様において、ｓｎＲＮＡは、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ＣＫ１プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、アルファ－ミオシン重鎖エンハンサー－／ＭＣＫエンハンサー－プロモーター（ＭＨＣＫ７）、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、又はデスミンなどのプロモーターを含むが、これらに限定されない様々なプロモーター下で発現される。ｒＡＡＶゲノムにおけるＡＡＶ ＤＮＡは、組換えウイルスが由来することができる、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、及びＡＡＶ－Ｂ１を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型からであり得る。上記に示されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、偽型ＡＡＶであり、１つのＡＡＶ血清型からのＩＴＲ及び異なるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を含有する。いくつかの実施形態において、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／９（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／８（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、偽型ＡＡＶは、ＡＡＶ２／１（すなわち、ＡＡＶ２ＩＴＲ及びＡＡＶ１カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ）である。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ａｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ．８、又はＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、又はＡＡＶ－Ｂ１からの１つ以上のカプシドタンパク質のキメラを含有するカプシドタンパク質などの組換えカプシドタンパク質を含有する。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシドバリアントを有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記に示されるように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。

いくつかの実施形態において、パッケージング細胞が提供される。パッケージング細胞は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての構成要素を安定して発現する細胞株を有するために作製される。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を除去することによって作製される。これらは、治療用遺伝子によって置き換えられる。ベクター粒子を産生するためには、パッケージング細胞が不可欠である。パッケージング細胞株は、カプシド産生及びベクターのビリオン成熟に必要な全てのウイルスタンパク質を提供する。そのため、パッケージング細胞株は、それらがｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するように作製される。レトロウイルスＤＮＡベクターに所望の遺伝子を挿入し、適切なパッケージング細胞株を維持した後、レトロウイルスベクターを調製することは、今や簡単なことである。

例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノムと、ｒＡＡＶゲノムから離れたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーと、を含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれか又はベクターのうちのいずれかを、希釈剤、賦形剤、又は緩衝剤と組み合わせて含む、組成物を含む。

したがって、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての構成要素を安定して発現する細胞株を生じるパッケージング細胞を作製する方法が提供される。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノムと、ｒＡＡＶゲノムから離れたＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーと、を含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム並びに／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。

ｒＡＡＶ産生の一般的原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）にレビューされている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第Ｎｏ．５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５８，５９５号、及びＭｃＣａｒｔｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１６（１０）：１６４８－１６５６（２００８）に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書のこれらの部分を特に強調している。様々なタイプのｒＡＡＶの産生及び使用が具体的に企図され、例示される。そのため、組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）が本明細書に提供される。いくつかの態様において、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡが存在しない。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、組換え直鎖ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）、又は組換え自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。

そのため、本開示は、いくつかの実施形態において、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同族２９３株）などの、安定して形質転換されたがん細胞である。別の実施形態において、パッケージング細胞は、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）などの形質転換されたがん細胞ではない細胞である。

いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によって精製される。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号及びＷＯ９８／０９６５７に開示されている。

いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるような、核酸又はベクター、例えばウイルスベクターなどを含む組成物又は複数の組成物を提供する。そのため、本明細書に記載の送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物が提供される。様々な態様において、かかる組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。様々な態様において、かかる組成物はまた、希釈剤、賦形剤、及び／又はアジュバントなどの他の成分を含む。許容される担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、若しくは他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギニン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、並びに／又はツイーン、プルロニック、若しくはポリエチルグリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。

いくつかの態様において、核酸は、送達のためにベクターに導入される。いくつかの態様において、送達のためのベクターは、ＡＡＶ又はｒＡＡＶである。そのため、本開示の実施形態は、（ｉ）配列番号１～１８のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号１～１８のうちのいずれかに示される配列と少なくとも約９０％の配列同一性を含むそのバリアント、又は（ｉｉ）配列番号１９～３６のうちのいずれかに示されるＤＵＸ４標的配列に結合するＤＵＸ４ａｓＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む、ｒＡＡＶゲノムを含む。

いくつかの他の態様において、核酸は、非ベクター化送達を介して細胞に導入される。そのため、実施形態において、本開示は、ＤＵＸ４ａｓＲＮＡをコードする核酸の非ベクター化送達を含む。いくつかの態様において、この文脈では、核酸と複合体を形成し、細胞外及び細胞内ヌクレアーゼからそれらを保護することができる合成担体は、ウイルスベクターの代替物である。本開示は、かかる非ベクター化送達を含む。本開示はまた、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを単独又は組み合わせで含む組成物を含む。

滅菌注射可能溶液は、ｒＡＡＶを必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分とともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方式、治療目標、個体、及び標的にされる細胞型に応じて異なり、当該技術分野で標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、ｍｌ当たり約１×１０^６個、約１×１０^７個、約１×１０^８個、約１×１０^９個、約１×１０^１０個、約１×１０^１１個、約１×１０^１２個、約１×１０^１３～約１×１０^１４個、又はそれを超えるＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表され得る（例えば、それぞれ、１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、及び１×１０^１４ｖｇ）。

したがって、いくつかの態様において、本開示は、細胞又は対象に、（ｉ）配列番号１～１８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１～１８に示される配列のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含む、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４アンチセンスをコードするポリヌクレオチド、及び／あるいは（ｉｉ）配列番号１９～３６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４配列を標的とするＵ７－ａｓＤＵＸ４アンチセンスをコードするポリヌクレオチドを含む、任意の１つ以上の核酸を送達する方法を提供する。

いくつかの態様において、方法は、細胞又は対象に、（ｉ）配列番号１～１８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１～１８に示される配列のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含む、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４アンチセンスをコードするポリヌクレオチド、及び／あるいは（ｉｉ）配列番号１９～３６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４配列を標的とするＵ７－ａｓＤＵＸ４アンチセンスをコードするポリヌクレオチドを含む、任意の１つ以上の核酸を含むＡＡＶを投与することを含む。

更に別の態様において、本開示は、細胞又は対象におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を減少させるか、又は機能的ＤＵＸ４の発現を減少させる方法を提供し、方法は、細胞又は対象を、（ｉ）配列番号１～１８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号１～１８に示される配列のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を含むそのバリアントを含む、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４アンチセンスをコードするポリヌクレオチド、及び／あるいは（ｉｉ）配列番号１９～３６のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むＤＵＸ４配列を標的とするＵ７－ａｓＤＵＸ４アンチセンスをコードするポリヌクレオチドを含む、任意の１つ以上の核酸と接触させることを含む。

いくつかの態様において、方法は、１つ以上のＡＡＶベクターで核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、方法は、核酸を非ベクター化送達で細胞に送達することを含む。

いくつかの態様において、ＤＵＸ４の発現又は機能的ＤＵＸ４の発現は、本明細書に提供される方法によって、細胞又は対象において、少なくとも又は約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％減少する。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるＵ７－ａｓＤＵＸ４アンチセンス構築物をコードする核酸の送達のためのＡＡＶ形質導入細胞を提供する。インビボ又はインビトロで、標的細胞をｒＡＡＶで形質導入する方法が、本開示に含まれる。方法は、有効用量又は有効複数用量の本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（ヒトなど）を含む対象に投与するステップを含む。用量が筋ジストロフィーの発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が筋ジストロフィーの発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態において、有効用量は、治療される筋ジストロフィーに関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除又は低減）し、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防し、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、筋ジストロフィーの寛解（部分若しくは完全）をもたらし、かつ／又は生存を延長する用量である。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、ＦＳＨＤである。

併用療法も本開示によって企図される。本明細書に使用される併用は、同時治療又は連続治療を含む。本開示の方法と、標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイド及び／又は免疫抑制剤）、又は他の阻害性ＲＮＡ構築物との組み合わせは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１３／０１６３５２号に開示されるものなどの他の療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。

有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、鼻孔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、治療される疾患状態、及びＤＵＸ４を発現する細胞などの標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合され得る。いくつかの実施形態において、投与経路は、筋肉内である。いくつかの実施形態において、投与経路は、静脈内である。

いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与には、筋肉、血流、中枢神経系への注入、及び／又は脳若しくは他の器官への直接注入が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝化生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与することができる担体又は他の成分について既知の制限はない（だが、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の手段では避けるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を実施に使用することができる。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

筋肉内注射を目的のために、セサミ油若しくはピーナッツ油などのアジュバント溶液、又は水性プロピレングリコール溶液、並びに滅菌水溶液を用いることができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水又はグルコースで等張にすることができる。遊離酸（ＤＮＡが酸性リン酸基を含む）又は薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に得ることができる。

注射可能な使用に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器での使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保存の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。いくつかの態様において、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。

いくつかの態様において、製剤は、安定剤を含む。「安定剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じるものなどの有害な条件から製剤を保護し、かつ／又は安定状態で製剤の安定性若しくは有効期間を延長させる物質又は賦形剤を指す。安定剤の例としては、スクロース、ラクトース、及びマンノースなどの糖、マンニトールなどの糖アルコール、グリシン又はグルタミン酸などのアミノ酸、並びにヒト血清アルブミン又はゼラチンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの態様において、製剤は、抗微生物保存剤を含む。「抗微生物保存剤」という用語は、使用されるバイアル又は容器の反復穿刺時に導入され得る微生物の増殖を阻害する組成物に添加される任意の物質を指す。抗微生物保存剤の例としては、チメロサール、２－フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、及びフェノールなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。

「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるＤＵＸ４ｍｉＲＮＡの発現をもたらす、本開示の複製欠損ｒＡＡＶを介する、インビボ又はインビトロのいずれかでのレシピエント細胞への本明細書に記載の核酸のうちの１つ以上の投与／送達を指すために使用される。

一態様において、ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで実行される。一実施形態において、所望の標的細胞は、対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。代替的に、同系又は異種の細胞が、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じない場合に使用することができる。

対象への形質導入及び形質導入した細胞の再導入のために好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態において、細胞は、例えば適切な培地中で、ｒＡＡＶを細胞と組み合わせることによってインビトロで形質導入され、サザンブロット及び／若しくはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、又は選択可能なマーカーを使用して、目的のＤＮＡを有するこれらの細胞についてスクリーニングする。次いで、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注入による、又は例えばカテーテルを使用した平滑筋及び心筋への注入によるなど、様々な技術によって対象に導入することができる。

本開示は、ＤＵＸ４の発現を下方制御又は阻害するように設計されたマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡを含む、有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔をおいて投与される用量）のｒＡＡＶを、細胞又はそれを必要とする対象に投与する方法を提供する。いくつかの態様において、有効用量は、したがって、治療的に有効な用量である。

いくつかの実施形態において、投与されるｒＡＡＶの用量又は有効用量は、約１．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１６ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、１．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇはまた、１．０Ｅ１０ｖｇ／ｋｇで示され、これは単に科学的表記を示す代替的な方法である。同様に、１０^１１は、Ｅ１１と同等である、などである。いくつかの態様において、投与されるｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶの用量は、約１．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１０ 約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約２．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約４．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約６．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約７．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約８．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約９．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約１．０×１０^１６ｖｇ／ｋｇである。

いくつかの態様において、用量は、約１．０×１０^１１ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０^１５ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、用量は、約１．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約５．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、用量は、約２．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～約４．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。いくつかの態様において、用量は、約３．０×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。

いくつかの態様において、初回用量の後に、第２のより多い用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、第２の同じ用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、１つ以上のより少ない用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、同じ用量又はより多い用量である複数の用量が続く。

インビボ又はインビトロで、標的細胞を送達ビヒクル（例えば、ｒＡＡＶ）で形質導入する方法が企図される。本開示のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＤＵＸ４アンチセンス配列の持続した発現をもたらす。そのため、いくつかの態様において、本開示は、プレｍＲＮＡにおける主要なエクソン定義要素に結合するアンチセンス配列を発現するｒＡＡＶ及びｒＡＡＶを投与／送達する方法を提供し、スプライセオソームによる特定のエクソンの認識を阻害し、対象に成熟ＲＮＡからの標的エクソンの排除をもたらす。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。これらの方法は、細胞及び組織（筋肉などの組織を含むが、これらに限定されない）を本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶで形質導入することを含む。形質導入は、細胞特異的制御要素を含む遺伝子カセットを用いて実行され得る。「形質導入」という用語は、例として、標的細胞によるＤＵＸ４の減少した発現又は発現の阻害をもたらす本明細書に記載の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボ又はインビトロのいずれかでの標的細胞へのアンチセンス配列、例えばＵ７－ａｓＤＵＸ４を含むｕ７ｓｎＲＮＡの投与／送達を指す。

インビボ方法は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を含む組成物の有効用量又は有効複数用量を、それを必要とする対象（ヒト対象を含む）に投与するステップを含む。そのため、有効用量（又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔をおいて投与される用量）の本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする患者に投与する方法が提供される。用量又は複数用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量又は複数用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除又は低減）し、障害／疾患状態への進行を遅延若しくは防止し、障害／疾患状態の進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、障害／疾患状態の寛解（部分若しくは完全）をもたらし、かつ／又は生存を延長する用量である。

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、筋ジストロフィー（ＭＤ）などの疾患を治療、改善、又は予防する際に使用される。様々な態様において、かかるＭＤは、ＦＳＨＤである。ＦＳＨＤは、なかでも最も一般的に遺伝する筋ジストロフィーであり、８７万人にも影響を及ぼすと推定されている。ＦＳＨＤの症状の古典的な説明には、顔、肩帯、及び腕における進行性の筋力低下が含まれるが、疾患は、胴体及び下肢の筋肉を含む、より広範囲に現れ得る。可変性はまた個人内に一般的に認められ、非対称的な衰弱が一般的である。発症年齢は幼児期から成人期までの範囲であり得、通常は疾患の重症度に関連しており、より早い発症は、多くの場合より重度の筋力低下に関連する。ＦＳＨＤを有するほとんどの患者は、通常の寿命を有するが、呼吸不全が発生する可能性があり、疾患が衰弱させ得、罹患した個人の約２５％がその５０歳代までに車椅子に依存することになり得、より重症な疾患形態では更に早いが、一方、他は生涯歩行を維持する。

ＦＳＨＤは、二重ホメオボックス４遺伝子（ＤＵＸ４）の異常な発現によって引き起こされ、骨格筋にとって有毒な転写因子を産生する。ＤＵＸ４は、通常、ヒトの発達の２細胞期の期間中に機能するが、その後、おそらく精巣を除いて、基本的に他の全ての組織で抑制される。ＦＳＨＤを有する人々の骨格筋では、特定の遺伝的及びエピジェネティック因子が同時にＤＵＸ４脱抑制を可能にし、次いでそれが、分化異常、酸化ストレス、炎症性浸潤、細胞死、及び筋萎縮に関与するものを含む、いくつかの異常な遺伝子発現カスケードを開始する。

病理学的ＦＳＨＤを有することが知られている家族では、本開示の方法は、様々な態様において、疾患を予防する方法であり、それらは疾患の発症前に実行される。他の様々な態様において、本開示の方法は、診断後に実行され、したがって、疾患を治療又は改善する方法である。

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、がんなどの疾患を治療、改善、又は予防する際に使用される。ＤＵＸ４は、いくつかのがんタイプで活性化されることが示されており、それは腫瘍細胞を免疫系からマスキングするように機能する（Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ２０１９ Ｓｅｐ ９；５０（５）：６５８－７１）。例えば、ＤＵＸ４タンパク質融合は、横紋筋肉腫及びユーイング肉腫などのがんを引き起こすことが知られている。ＣＩＣ－ＤＵＸ４遺伝子融合は、肉腫を誘発し、肉腫転移を駆動する（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１７ Ｊｕｎ １；７７（１１）：２９２７－２９３７、Ｏｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９；１２９（８）：３４０１－３４０６）。そのため、本明細書に記載の核酸、ｒＡＡＶ、及び組成物は、がんの治療、改善、又は予防においてＤＵＸ４発現を阻害する際に使用される。

分子的、生化学的、組織学的、及び機能的な転帰尺度は、ＤＵＸ４遺伝子及びタンパク質の発現を減少させ、ＦＳＨＤなどの筋ジストロフィーを治療することにおける、本明細書に開示される生成物及び方法の治療有効性を実証する。転帰尺度は、例えば、Ｄｙｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，４^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ１（２００５）のチャプター３２、３５、及び４３、並びにＢｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６０２：３４７－３９３（２０１０）に記載されている。転帰尺度には、罹患した組織におけるＤＵＸ４ｍＲＮＡ又はタンパク質の低下又は除去が挙げられるが、これらに限定されない。細胞におけるＤＵＸ４の発現の欠如及び／又はＤＵＸ４の発現の下方制御は、改善を決定するためにｒＡＡＶ投与の前及び後の筋生検において、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、ウェスタンブロット、免疫蛍光、又は免疫組織化学を含むが、これらに限定されない当該技術分野において既知の方法によって、ＤＵＸ４タンパク質のレベルを測定することによって検出される。

いくつかの実施形態において、対象の細胞におけるＤＵＸ４遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルは、アンチセンスｓｎＲＮＡ構築物又はベクター、例えば、ｒＡＡＶの投与前のＤＵＸ４遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルと比較して、アンチセンスｓｎＲＮＡ構築物又はアンチセンスｓｎＲＮＡ構築物を含むベクター、例えば、ｒＡＡＶの投与後に減少する。いくつかの態様において、ＤＵＸ４の発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、又は少なくとも約１００％超減少する。様々な態様において、改善した筋力、改善した筋機能、及び／又は改善した可動性及びスタミナは、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、又は少なくとも約１００％超改善を示す。

他の転帰尺度には、治療の前及び後の対象における血清クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）のレベルを測定することが含まれる。増加したＣＫレベルは、筋肉損傷の特徴である。筋ジストロフィー患者では、ＣＫレベルは正常範囲（出生以来、正常レベルの１０～１００倍）を超えて有意に増加する。上昇したＣＫレベルが血液試料中に認められる場合、それは通常、筋肉が筋ジストロフィー又は炎症などのいくつかの異常なプロセスによって崩壊されていることを意味する。そのため、本開示の方法による治療における肯定的な治療転帰は、ｒＡＡＶの投与前の血清クレアチニンキナーゼのレベルと比較して、ｒＡＡＶの投与後の血清クレアチニンキナーゼのレベルの低下である。

他の転帰尺度には、治療後の対象において、筋力の改善、筋機能の改善、可動性の改善、スタミナの改善、又はそれらの２つ以上の組み合わせが存在するかを決定するために測定することが含まれる。かかる転帰尺度は、対象における筋ジストロフィーの進行を決定する上で重要であり、当該技術分野で既知の様々な検査によって測定される。これらの検査のいくつかには、６分間歩行検査、立ち上がり時間検査、昇り４ステップ検査、昇り降り４ステップ検査、ノーススター歩行評価（ＮＳＡＡ）検査、１０メートル時限検査、１００メートル時限検査、ハンドヘルド筋力測定（ＨＨＤ）検査、時限アップアンドゴー検査、粗大運動サブ検査スケール（Ｂａｙｌｅｙ－ＩＩＩ）スコア、最大随意等尺性収縮検査（ＭＶＩＣＴ）、又はそれらの２つ以上の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

併用療法も本開示に含まれる。本明細書に使用される併用は、同時治療及び連続治療の両方を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医学的治療及び支持療法との組み合わせは、グルココルチコイドなどの療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。全てのタイプのグルココルチコイドが、本明細書に開示の併用療法における使用のために含まれる。かかるグルココルチコイドには、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、デフラザコート、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、及びトリアムシノロンが含まれるが、これらに限定されない。

本開示に含まれる他の併用療法は、本明細書に記載される、Ｕ７－ｓｎＲＮＡと、他のＵ７－ｓｎＲＮＡとの組み合わせ、又はｍｉＲＮＡベースの遺伝子療法、ＤＵＸ４発現の小分子阻害剤、ＲＮＡｉを介してＤＵＸ４を阻害するオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｓｅ Ｈ若しくはエクソンスキッピング機構との組み合わせ、Ｕ７－ｓｎＲＮＡプラス理論的ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子療法アプローチである。

有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、鼻孔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。いくつかの態様において、有効用量は、全身投与経路、すなわち、全身投与によって送達される。全身投与は、体全体が影響を受けるような循環系への投与の経路である。かかる全身投与は、様々な態様において、経腸投与（胃腸管を通した薬物の吸収）又は非経口投与（一般に、注射、注入、又は移植を介して）を介して行われる。様々な態様において、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様において、有効用量は、静脈内及び／若しくは筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。いくつかの態様において、有効用量は、順番に、又は連続して送達される。いくつかの態様において、有効用量は、同時に送達される。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、様々な態様において、治療される疾患又は障害の状況又は状態、対象の状況、状態、又は年齢、並びに核酸又はタンパク質を発現すべき標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合される。

特に、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の実際の投与は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を動物の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与には、筋肉、血流、及び／又は直接的な神経系若しくは肝臓への注入が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝化生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与することができる担体又は他の成分について既知の制限はない（だが、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の手段では避けるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが神経細胞などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示の実施に使用することができる。送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に既知の標準的な技術に容易に得ることができる。

注射可能な使用に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保存の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。

滅菌注射可能溶液は、ｒＡＡＶを必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分とともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

「治療すること」は、筋肉消耗、筋力低下、筋緊張症、骨格筋の問題、網膜の異常、股関節の脱力、顔の脱力、腹部筋力低下、関節及び脊髄の異常、下肢の脱力、肩の脱力、聴力喪失、筋肉炎症、及び非対称的な衰弱を含むが、これらに限定されない、筋ジストロフィーの１つ以上の症状を改善又は阻害することを含む。

有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、鼻孔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。いくつかの態様において、有効用量は、全身投与経路、すなわち、全身投与によって送達される。全身投与は、体全体が影響を受けるような循環系への投与の経路である。かかる全身投与は、様々な態様において、経腸投与（胃腸管を通した薬物の吸収）又は非経口投与（一般に、注射、注入、又は移植を介して）を介して行われる。様々な態様において、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様において、有効用量は、静脈内及び／若しくは筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。いくつかの態様において、有効用量は、順番に、又は連続して送達される。いくつかの態様において、有効用量は、同時に送達される。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ構成要素（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路及び血清型は、様々な態様において、治療される疾患又は障害の状況又は状態、対象の状況、状態、又は年齢、並びに核酸又はタンパク質を発現すべき標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択及び／又は適合される。

特に、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の実際の投与は、送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）を動物の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与には、筋肉、血流、及び／又は直接的な神経系若しくは肝臓への注入が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝化生理食塩水中にｒＡＡＶを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与することができる担体又は他の成分について既知の制限はない（だが、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の手段では避けるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが神経細胞などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を実施に使用することができる。送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。

送達ビヒクル（ｒＡＡＶなど）の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に既知の標準的な技術に容易に得ることができる。

注射可能な使用に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保存の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。

滅菌注射可能溶液は、ｒＡＡＶを必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分とともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。

本開示はまた、本開示の核酸、ベクター、又は組成物を含むか、又は本開示のプロセスに従って製造された、キットを提供する。本開示の文脈において、「キット」という用語は、２つ以上の構成要素を意味し、そのうちの１つは、本開示の核酸、ベクター、又は組成物に対応し、他は、容器、レシピエント、説明書、又は他のものに対応する。したがって、キットは、様々な態様において、特定の目標を達成するのに十分な一連の製品であり、単一のユニットとして販売することができる。

キットは、本開示の核酸、ベクター、又は組成物を投与のための適切な投与量（上記参照）で含有する、任意の適切な形状、サイズ、及び材料の１つ以上のレシピエント（バイアル、アンプル、容器、注射器、ボトル、バッグなど）を含み得る。キットは追加的に、使用のための指示若しくは説明書（例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態で）、核酸、ベクター、若しくは組成物を投与するための注射器、ポンプ、注入器など手段、核酸、ベクター、若しくは組成物を再構成するための手段、及び／又は核酸、ベクター、若しくは組成物を希釈するための手段を含み得る。

いくつかの態様において、キットは、キットに提供される試薬の使用を説明するラベル及び／又は説明書を含む。キットはまた、本明細書に記載の方法で使用される組成物のうちの１つ以上を送達するためのカテーテル、注射器、又は他の送達デバイスを任意選択的に含む。

本発明はまた、単回用量の投与単位のための、又は複数回用量のためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、単一チャンバ型及び複数チャンバ型のプレフィルドシリンジを含むキットを提供する。

本文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせが本文書の同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に認められない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上記で具体的に言及される変形よりもいくらか範囲が狭い本開示の全ての実施形態を含む。属として記載される本開示の態様に関して、全ての個々の種は、本開示の別個の態様とみなされる。「ａ」又は「ａｎ」で記載又は特許請求される本開示の態様に関して、これらの用語は、文脈がより限定された意味を明確に必要としない限り、「１つ以上」を意味することを理解されたい。

特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連における全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載の本開示の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、又は定型的な実験を超えることなく使用して確認することができるであろう。かかる等価物は、本開示によって包含されることが意図される。

本明細書で使用される「及び／又は」という用語はいつでも、「及び」、「又は」、及び「当該用語によって接続された要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。しかしながら、それはまた、具体的な数字を含み、例えば、約１０は１０を含む。

本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈で別段の要求がない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という単語、並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含めることを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。本明細書で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」という用語は、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」若しくは「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」という用語で、又は本明細書でときどき使用される場合、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」という用語で置き換えることができる。

本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素に指定されていないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を与えない材料又はステップを除外しない。

本明細書の各例では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれで置き換えられ得る。

本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、及び物質などに限定されず、そのため変化することができることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、特許請求の範囲によってのみ定義される、本開示の主題の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書の本文全体で引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書などを含む）は、上記又は下記にかかわらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた材料が本明細書と一致しないか、又は矛盾する範囲では、本明細書は、いかなるかかる材料にも優先する。

本開示及びその利点のより良い理解は、例示的な目的のためのみに提供される以下の実施例から得られるであろう。実施例は、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示的な目的のみのためのものであり、それらの観点から様々な修正又は変更が当業者に示唆されるが、本出願の趣旨及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。

本開示の追加の態様及び詳細は、限定するのではなく例示的であることが意図されている以下の実施例から明らかであろう。
実施例１
材料及び方法
ＤＵＸ４標的化Ｕ７－ｓｎＲＮＡの設計
Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＨｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１プログラム（ｈｔｔｐ－ｃｏｌｏｎ－ｓｌａｓｈ－ｓｌａｓｈ－ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ－ｓｌａｓｈ－ＨＳＦ－ｓｌａｓｈ）を使用して、ＤＵＸ４エクソン１（コード配列）の末端及び非翻訳エクソン１及び２内の潜在的なスプライスアクセプター（ＳＡ）、スプライスドナー（ＳＤ）、及びスプライスエンハンサー部位を予測した。ＤＵＸ４に対するＵ７－ｓｎＲＮＡ（Ｕ７－ａｓＤＵＸ４と呼ばれる）を設計するために、ＣｐＧの数が最も少ない１８のハイスコア標的部位及び１つの非標的領域を選択した（表１）。予測された標的外適合を、ヒトゲノムデータベース（ｈｔｔｐｓ ｃｏｌｏｎ－ｓｌａｓｈ－ｓｌａｓｈ－ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に対する各配列を使用して、ＢＬＡＳＴによって決定した。マウスＵ７プロモーターを含有する全てのＵ７－ａｓＤＵＸ４の発現カセットを合成し、ｐＵＣＩＤＴプラスミド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）にクローニングした。配列はまた、逆相補性塩基対形成を介してＤＵＸ４開始コドン及びポリＡシグナルに結合するように設計された（表１）。非標的化対照ｓｎＲＮＡアンチセンス配列は、５’－ＧＴＣＡＴＧＴＣＧＣＧＴＧＣＣＣＣＧＧＴＧＧＴＣＧＡＣＡＣＧＴＣＧＧ－３’（配列番号４３）である。

細胞培養
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ_２中３７℃で培養した。ヒトＦＳＨＤ患者に由来する影響化及び無影響化不死化ヒト筋芽細胞、及び無影響化の比較の１５Ａｂｉｃ及び１５Ｖｂｉｃ（４０，６０）を、１６％Ｍｅｄｉｕｍ１９９、２０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、３０ｎｇ／ｍｌ硫酸亜鉛、１．４ｍｇ／ｍｌビタミンＢ１２、５５ｎｇ／ｍｌデキサメタゾン、２．５ｎｇ／ｍｌヒト成長因子、１０ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞成長因子、及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭ培地中で拡張させた。細胞を筋芽細胞として維持し、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びＲＮＡｓｃｏｐｅによるＤＵＸ４及びＤＵＸ４活性バイオマーカースクリーニングのために分化させた。筋芽細胞を筋管に分化させるために、トランスフェクトした筋芽細胞を、収集前に最大７日間、１５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、及び１％抗生物質／アンチマイコバイオティックスを補充した、４：１のＤＭＥＭ：Ｍｅｄｉｕｍ１９９からなる分化培地に切り替えた。

生存率アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞（細胞２５０，０００個／ウェル）を、全長ＤＵＸ４プレｍＲＮＡ（ＤＵＸ４－ｆｌ）がサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｆｌ）から転写された発現プラスミドで、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ ｓｎＲＮＡ又は非標的化Ｕ７－ｓｎＲＮＡのいずれかを発現するプラスミドと一緒に、プロトコルを使用して１：６の比率で共トランスフェクトした（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。細胞を、トランスフェクションの４８時間後にトリプシン処理し、１ｍｌの増殖培地に収集した。自動細胞計数を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）細胞計数チャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して行った。結果を、血球計数器及びトリパンブルー染色を使用した従来の細胞計数で確認した。３つの独立した実験を行い、データは、群当たりの全細胞数の平均±ＳＥＭとして報告した。

細胞死アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞（細胞４２，０００個／ウェル）を、トランスフェクションの１６時間前に、９６ウェルプレートに播種した。翌朝、細胞を、ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｆｌ及びＵ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡ又は非標的化Ｕ７－ｓｎＲＮＡ発現プラスミドと、１：６のモル比で共トランスフェクトした（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。細胞死を、トランスフェクションの４８時間後にＡｐｏ－ＯＮＥ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、蛍光プレートリーダ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して測定した。３回の個々のアッセイを三重測定（ｎ＝３）で行い、実験ごとにデータを平均化し、ＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｆｌのみでトランスフェクトした対照アッセイと比較して、平均カスパーゼ活性±ＳＥＭとして報告した。

ウェスタンブロットアッセイ
この実験では、ＤＵＸ４発現プラスミドを、エピトープタグ（ＤＵＸ４Ｎ末端に融合されたｍｙｃエピトープタグを含有するＣＭＶ．Ｍｙｃ－ＤＵＸ４－ｆｌ、又はＣＭＶ－ＤＵＸ４－ｆｌ）の有り及び無しで使用した。ＨＥＫ２９３細胞を、１：６の比率のＤＵＸ４：Ｕ７ａｓＤＵＸ４発現プラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有するカクテルを補充したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００）に溶解した。タンパク質濃度をローリータンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定した。各総タンパク質試料の２５μｇを、１２％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで展開させた。タンパク質を、半乾燥移動法を介してＰＶＤＦ膜に移し、次いで、５％の脱脂乳でブロッキングし、一次モノクローナルマウス抗ＤＵＸ４（１：５００、Ｐ４Ｈ２、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、マウス抗Ｍｙｃ（Ｒ９５１２５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、又はウサギポリクローナル抗αチューブリン抗体（１：１，０００、ａｂ１５２４６、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、複数回の洗浄後、ブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化ヤギ抗マウス又はヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１００，０００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて室温で１時間探査した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）中で短時間インキュベーションした後、相対的なタンパク質バンドをＸ線フィルムで現像した。タンパク質定量は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ、ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）によって評価した。

免疫蛍光染色
処理した細胞及び未処理細胞におけるＶ５エピトープタグＤＵＸ４タンパク質の細胞内局在を、Ｖ５免疫蛍光染色を用いて視覚化した（Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ６９，５４０－５５２。このプラスミドは、コード配列及び３’ＵＴＲ配列からなる全長ＤＵＸ４配列を担持したが、フレーム内のカルボキシ末端Ｖ５エピトープ融合とともにＤＵＸ４タンパク質を発現するように操作された。トランスフェクションの２０時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２０分間固定し、非特異的抗原を、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を補充したＰＢＳ中の５％ＢＳＡでブロッキングした。細胞を、ウサギポリクローナル抗Ｖ５一次抗体（１：２，５００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９１１６）中、４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ－５９４二次抗体（１：２，５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートし、ＤＡＰＩ含有Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入メディウム（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で封入した。

ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイ及び定量化
ＨＥＫ２９３で過剰発現したＤＵＸ４を検出する。ＲＮＡｓｃｏｐｅ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを使用して、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｆｌ及びＵ７．ａｓＤＵＸ４発現プラスミド（１：６比）の共トランスフェクション後のＤＵＸ４ｍＲＮＡレベルを測定した。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの１６時間前にウェル当たり細胞１２０，０００個の密度で２４ウェルプレートにおけるガラスカバースリップに三重測定で播種した。翌朝、７０％密集に達したとき、細胞を２５０ｎｇのＣＭＶ．ＤＵＸ４－ｆｌ発現プラスミド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－２０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、製造業者の説明書に従って共トランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、ＲＮＡｓｃｏｐｅ染色を製造業者の説明書に従って行った（以下に詳述する）。

ヒトＦＳＨＤ筋管における内因性ＤＵＸ４を検出する。標的化内因性ＤＵＸ４ｍＲＮＡに対するＵ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡの特異性を決定するために、１５Ａｂｉｃ ＦＳＨＤ筋芽細胞（１５Ａ、細胞５００，０００個／反応）を、エレクトロポレーション（Ｌｏｎｚａ，ＶＶＰＤ－１００１）を介してＵ７－ａｓＤＵＸ４発現プラスミドでトランスフェクトし、次いで、最大７日間、筋管に分化させた。ＲＮＡｓｃｏｐｅ染色を、既に報告されているように行った（Ａｍｉｎｉ Ｃｈｅｒｍａｈｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＲＮＡ２５，１２１１－１２１７）。細胞を４％ＰＦＡに固定し、エタノール勾配で脱水化／再水和化した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、過酸化水素処理によって遮断した。プロテアーゼＩＩＩを添加して、ＲＮＡｓｃｏｐｅプローブのために固定した細胞の透過性を増加させた。細胞を、ＤＵＸ４特異的ＲＮＡｓｃｏｐｅプローブ（ＡＣＤＢｉｏ、カタログＮｏ．４９８５４１）又は陽性対照ハウスキーピングペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）及び陰性対照細菌遺伝子であるジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）を検出するプローブで処理した。プローブインキュベーション後、細胞を、ＲＮＡｓｃｏｐｅ２．５ＨＤ Ａｓｓａｙ Ｂｒｏｗｎを製造業者のプロトコル（ＡＣＤＢｉｏ）に従って使用して、いくつかのシグナル増幅ステップで処理した。５０％ＧｉｌｌのヘマトキシリンＩ（カタログＮｏ．ＨＸＧＨＥ１ＬＴ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、細胞を室温で２分間対比染色し、続いて数回洗浄した。封入後、オリンパスＤＰ７１顕微鏡を使用して画像をキャプチャした。ＤＵＸ４ＲＮＡｓｃｏｐｅシグナルを、既に報告されているようにＩｍａｇｅＪ－Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して定量化した（３０）。

ＤＵＸ４バイオマーカーの定量的リアルタイムＰＣＲ分析
１５Ａ ＦＳＨＤ筋芽細胞を、本明細書でＲＮＡｓｃｏｐｅセクションに記載されるようにトランスフェクトし、筋管に分化させた。ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、総ＲＮＡ含有量を抽出し、収率をＮａｎｏｄｒｏｐによって測定した。次いで、単離したＲＮＡをＤｎａｓｅ処理し（ＤＮＡ－Ｆｒｅｅ、Ａｍｂｉｏｎ、ＴＸ）、ランダムヘキサマープライマーを使用した大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを作製した。次いで、その後のｃＤＮＡ試料を、事前に設計したＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＰＲＡＭＥＦ１２、ＺＳＣＡＮ４（ＤＵＸ４活性のバイオマーカー）、及びヒトＲＰＬ１３Ａ対照プライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＴａｑｍａｎアッセイの鋳型として使用した。全てのデータは、非標的化Ｕ７－ｓｎＲＮＡトランスフェクトした細胞に対して正規化した。データは、各バイオマーカーについて、三重測定で行った２つの独立した実験から得た。

統計解析
全ての統計分析（カスパーゼ３／７アッセイ、細胞生存率アッセイ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ定量化、ウェスタンブロット、ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で、示された統計検定を使用して行われた。

実施例２
ＤＵＸ４標的化Ｕ７－ｓｎＲＮＡは、アポトーシスを低下させ、同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３の生存率を増加させる。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２０，１２１２－１２２１）及びβ－サラセミア（Ｎｕａｌｋａｅｗ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｓｃｉ Ｒｅｐ９，７６７２）に対する可能性のある治療として、変異したエクソンのスキッピングを誘導するために、組換えＵ７－ｓｎＲＮＡが以前に開発された。これらの試験では、Ｕ７－ｓｎＲＮＡを使用して、エクソン全体をスキッピングすることによってフレームシフトした遺伝子の発現を回復させた。対照的に、この試験の目的は、Ｕ７－ｓｎＲＮＡを使用して、ＤＵＸ４プレｍＲＮＡの成熟に干渉するか、又は翻訳開始を阻害することによって、新規遺伝子サイレンシング戦略を開発することだった（Ｂｉｆｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２５，２０３８－２０５２、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｍｅｄ２０，９９２－１０００）。

これを行うために、スプライスドナー（ＳＤ）、スプライスアクセプター（ＳＡ）、及びスプライスエンハンサー（ＳＥ）配列、又はＤＵＸ４エクソン３におけるポリアデニル化シグナル（ＰＡＳ）を標的とする組換えＵ７－ｓｎＲＮＡを開発した（図１Ａ～Ｂ）。加えて、全長ＤＵＸ４開始コドンの上に配置され、翻訳に干渉する可能性がある２つの構築物（９及び１０）を作製した。これらのＤＵＸ４標的化Ｕ７－ｓｎＲＮＡ（Ｕ７－ａｓＤＵＸ４と称される）の構造が図１Ａにされ、特異性の重要な特徴は、ＤＵＸ４プレｍＲＮＡの様々な領域と塩基対形成するように改変されたアンチセンス配列である。正しいスプライシングに干渉するための有効な配列を選択するために、Ｈｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒツール（図５Ａ～Ｃ）を使用して、３つのＤＵＸ４エクソン全てで、並びにイントロン１及び２内で、潜在的なＳＤ、ＳＡ、及びＳＥ部位を予測した。次いで、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４は、最高スコア部位を標的にするように設計された（図１Ｂ）。ポリＡシグナル又は開始コドンを標的とするこれらのＵ７－ａｓＤＵＸ４では、アンチセンス配列が、ＤＵＸ４ｍＲＮＡ上の同族部位の完全な網羅を提供することを確実にした。全てのＵ７－ａｓＤＵＸ４配列及びそれらの重要な特徴が、本明細書に表１及び２にまとめて示される。

ＨＥＫ２９３細胞は、通常、検出可能なＤＵＸ４を発現しないが、ＣＭＶ．ＤＵＸ４発現プラスミドによるトランスフェクション後、ＤＵＸ４誘導性細胞死に感受性である。したがって、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４発現プラスミドの有効性は、最初に、カスパーゼ－３／７を使用してアポトーシス細胞死を測定すること、及び同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における転帰尺度としての細胞生存率アッセイによって評価した。１８個のＵ７－ａｓＤＵＸ４配列を設計し、構築物を作製して試験した。これら１８個の構築物のうち、１３個は、共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞死を有意に減少させ（５０％）、生存率を増加させた（５０％）（図１Ｃ～Ｄ）。最も効果的なＵ７－ａｓＤＵＸ４は、エクソン１－イントロン１接合部又はポリＡシグナル（ＰＡＳ）を標的とする構築物４、７、及び８だった。これらの構築物は、カスパーゼ－３／７活性をそれぞれ７５±７％、６０±９％、及び５０±８％減少させ、ＤＵＸ４のみ（１９．１±１．６％）又は非標的Ｕ７－ｓｎＲＮＡを用いたＤＵＸ４（２３．３±０．５％）と比較して、他のＵ７－ａｓＤＵＸ４よりも生存率をそれぞれ７８．５±８．４％、９４．８±４．９％、及び８４．８±３．８％有意に増加させた（図１Ｃ～Ｄ）。それらの優れた保護特性のために、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４構築物４、７及び８は、リード候補配列であるように思われた。

実施例３
Ｕ７－ａｓＤＵＸ４は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＤＵＸ４発現を有意に減少させる。

Ｕ７－ａｓＤＵＸ４プラスミドで処理した試料におけるＤＵＸ４関連細胞死結果の低下は、これらの配列が、全長ＤＵＸ４遺伝子発現を阻害するように操作されたことを示唆した。ＨＥＫ２９３細胞で過剰発現したＤＵＸ４ｍＲＮＡを標的とし、それを減少させると思われるリードＵ７－ａｓＤＵＸ４配列の特異性を調査するために、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを最初に使用して、同時トランスフェクトした細胞におけるＤＵＸ４ｍＲＮＡを検出した。固定した細胞を、ＤＵＸ４を標的とするプローブ、対照転写産物、又は陰性対照試薬とともにインキュベートし、次いで、ハイブリダイゼーションした標的ｍＲＮＡを褐色に染色するジアミノベンジジン（ＤＡＢ）試薬で処理した。以前に報告されたように（Ａｍｉｎｉ Ｃｈｅｒｍａｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＲＮＡ２５，１２１１－１２１７）、ＤＵＸ４発現プラスミドのみでトランスフェクトされた細胞は、ＤＵＸ４プローブとともにインキュベートされたとき、豊富な、クモ様の褐色シグナル、並びに死と一致する比較的低い細胞密度を示した（図２Ａ）。対照的に、ＤＵＸ４プローブシグナルは、ＤＵＸ４及び本発明者らの３つのリードＵ７－ａｓＤＵＸ４と同時トランスフェクトされた細胞では、有意に減少した（図２Ｂ～Ｄ）。具体的には、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４処理したウェルでは、依然としてＤＵＸ４シグナルを示した細胞において、有意に少ないＤＵＸ４陽性細胞、及び／又は強度の低下したＤＵＸ４染色だった（図２Ｂ～Ｄ）。トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞ではＤＵＸ４シグナルが認められず（図２Ｅ）、一方、豊富なシグナルが、ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイにおける陽性対照であるペプチジルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）遺伝子に対するプローブで染色された細胞で明らかであり（図２Ｆ）、陽性対照及び陰性対照は予想されたように機能した。細胞死からのある程度の保護を提供したＤＵＸ４ノックダウン（図１Ｄ）と一致して、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４プラスミドでトランスフェクトされたウェルは、「ＤＵＸ４のみ」でトランスフェクトされた試料と比較して、より高い細胞密度を有した。

実施例４
Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡは、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における全長ＤＵＸ４タンパク質を減少させる
全長ＤＵＸ４ｍＲＮＡノックダウンを確認するために、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４がＤＵＸ４タンパク質発現を抑制する効率を決定した。これを行うために、細胞は、３つのリードＵ７－ａｓＤＵＸ４構築物、又は非標的化対照で、ＣＭＶ．ＤＵＸ４発現プラスミドとともに同時トランスフェクトされた細胞だった。タンパク質の検出を容易にするために、Ｖ５エピトープタグ（ＣＭＶ．ＤＵＸ４．Ｖ５－ｆｌ）のフレーム内ＣＯＯＨ末端融合物を含有する全長ＤＵＸ４構築物を使用した（図３Ａ）。ＤＵＸ４タンパク質を検出するために、細胞を、Ｖ５タグに対する蛍光標識抗体で染色した。非標的化対照Ｕ７－ｓｎＲＮＡを受けた細胞と比較して、低下したＤＵＸ４．Ｖ５シグナルが、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４配列７又は８で同時トランスフェクトした細胞で観察された（図３Ｂ）。興味深いことに、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４－４は、その結合部位がＶ５エピトープタグによって破壊されたとき、ＤＵＸ４．Ｖ５タンパク質レベルに影響を与えず、それによって特異性の偶発的な対照として機能した。

リードＵ７－ｓｎＲＮＡによるＤＵＸ４タンパク質ノックダウンを更に確認するために、同様の同時トランスフェクション実験をＨＥＫ２９３細胞で実行したが、ウェスタンブロットを使用して結果を測定した。加えて、Ｃ末端Ｖ５タグがＵ７－ａｓＤＵＸ４－４結合部位を破壊したため、異なるＤＵＸ４発現構築物をこの一連の実験に利用した。具体的には、アミノ末端のフレーム内ｍｙｃエピトープタグを含有するＣＭＶ．ＤＵＸ４発現プラスミドを作製した（図３Ｃ）。この構築物は、エクソン１の３’末端付近で全長ＤＵＸ４ｍＲＮＡ ＳＤ／ＳＡをマスキングするように設計されたＵ７－ａｓＤＵＸ４配列が、スプライシングを偏らせて切断された無毒性のＤＵＸ４－ｓタンパク質アイソフォームを産生するか決定することを可能にすると推論された（図３Ｃ）（Ｓｎｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ６，ｅ１００１１８１）。Ｍｙｃ．ＤＵＸ４を発現するプラスミドと、エクソン１／イントロン１接合部付近で塩基対形成するように設計された、３つのリード構築物並びに配列５及び６を含む、５つの異なるＵ７－ａｓＤＵＸ４構築物と、で同時トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質抽出物を使用してウェスタンブロッティングを実行した。ｍｙｃ－エピトープ抗体を使用して、全長Ｍｙｃ－ＤＵＸ４タンパク質バンド（５２ｋＤａ）が、全てのトランスフェクトされた細胞で検出された。更に、全ての試料は、内因性ｃ－ｍｙｃタンパク質のサイズ（約６０ｋＤａ）で移動した、より大きな非ＤＵＸ４タンパク質を含有した。前の実験と一致して、リード構築物であるＵ７－ａｓＤＵＸ４配列４、７、及び８は、ＤＵＸ４タンパク質を８７．４％±９．８％ＳＥＭ、６５．９％±１５％ＳＥＭ、及び８４．７％±１３．５％ＳＥＭで有意に減少させた（ｎ＝３の独立した実験、図３Ｄ～Ｅ及び６Ａ～Ｂ）。ＤＵＸ４－ｓ産生の証拠はウェスタンブロットによって検出されず（予測サイズ２２ｋＤａ）、ＤＵＸ４スプライス部位をマスキングするように設計されたＵ７－ａｓＤＵＸ４配列（４、５、６、及び７）による全長ＤＵＸ４遺伝子発現の減少は、ＤＵＸ４－ｓアイソフォームに有利なようにスプライシングパターンをシフトさせることによって機能しなかったことを示唆した。同様に、より短いＤＵＸ４－ｓ転写産物の証拠は、３’ＲＡＣＥ ＲＴ－ＰＣＲを使用して認められなかった（図７）。これらのウェスタンブロットにおける非特異的な上部バンドは、可変的な発現を示した。ＤＵＸ４は、Ｍｙｃを活性化することが示されているため、それがＭｙｃである場合、ＤＵＸ４レベルを変化させることは、その上部バンドの存在量に影響を与える可能性がある（Ｓｈａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ１３，ｅ１００６６５８）。しかしながら、これらの実験における残留ＤＵＸ４とＭｙｃ存在量との間に強い相関は観察されなかった。

実施例５
Ｕ７－ａｓＤＵＸ４は、ＦＳＨＤ患者からの筋管における内因性ＤＵＸ４発現を有意に減少させる
ＨＥＫ２９３における試験からの結果は、いくつかのＵ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡが全長ＤＵＸ４発現を減少させ、過剰発現モデルにおいて細胞死から保護することができることを示唆した。そのため、ＦＳＨＤ患者の筋管中の内因性ＤＵＸ４ｍＲＮＡを減少させるリードＵ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡ構築物（４、７、及び８）の能力を、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して評価した。ＲＮＡｓｃｏｐｅは、ＦＳＨＤ筋管中のＤＵＸ４を検出するために既に使用されてきている（Ａｍｉｎｉ Ｃｈｅｒｍａｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＲＮＡ２５，１２１１－１２１７）。以前の報告と一致して、ＤＵＸ４染色は、任意の所与の時点で、わずかな割合の細胞にのみ存在したことが認められた。重要なことに、人工ＤＵＸ４標的化マイクロＲＮＡ（ｍｉ４０５）の送達後のＤＵＸ４ノックダウンを定量することができた（Ａｍｉｎｉ Ｃｈｅｒｍａｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）上記、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２１，４４１９－４４３０）。したがって、ＲＮＡｓｃｏｐｅを使用して、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡが、ヒトＦＳＨＤ患者に由来する筋管中の内因性ＤＵＸ４シグナルを低下させることができるか決定し、それによってこのアプローチの潜在的な転写可能性を裏付けた。これを行うために、典型的には約５０～７０％のトランスフェクション効率をもたらすエレクトロポレーションを使用してＦＳＨＤ筋細胞をトランスフェクトした（図８）。前の結果と一致して、トランスフェクトされていない１５Ａ ＦＳＨＤ筋管は、褐色のＤＵＸ４シグナルを示したが、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４配列４、７、及び８でトランスフェクトされたものは、ＲＮＡｓｃｏｐｅシグナルを有意に低下させた（図４Ａ～Ｈ）。これらの結果は、これら３つのＵ７－ａｓＤＵＸ４構築物（すなわち、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４配列４、７、及び８）が、ＦＳＨＤ筋細胞における内因性ＤＵＸ４ｍＲＮＡの不安定化及び分解に影響を及ぼすことができることを確証する。

実施例６
Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡは、ＦＳＨＤ筋管におけるＤＵＸ４活性化バイオマーカー発現を減少させる
前向きなＦＳＨＤ療法の出現に伴い、ＦＳＨＤ分野では、治療有効性を確立するために使用することができる臨床転帰尺度及びバイオマーカーを開発する必要性が生じた（ＬｏＲｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｌ１９，２２４、Ｍｕｌ ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ８９，２０５７－２０６５、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２８，４７６－４８６、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２９，１０３０－１０４３）。ＤＵＸ４発現は、前向き薬物又は遺伝子療法による標的関与の最も直接的な尺度であるが、ＦＳＨＤ筋生検において検出することは困難であり、比較的少ない。そのため、ヒト筋生検におけるＤＵＸ４発現は現在、ＦＳＨＤ臨床試験の信頼できる転帰尺度ではなく、いくつかのグループは現在、ＤＵＸ４発現の間接尺度としてＤＵＸ４活性化バイオマーカーを検査することに変えている。少なくとも６７個の異なる遺伝子が、ＤＵＸ４結合部位を有する調節領域を含有し、ＤＵＸ４発現時に一貫して活性化される。しかしながら、最近の試験は、一連の全体を表すために少数のバイオマーカーのみが必要であることを示唆している（Ｒｉｃｋａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２４，５９０１－５９１４、Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２３，５３４２－５３５２、Ｅｉｄａｈｌ（２０１６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２５，４５７７－４５８９、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ２２，３８－５１、Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ（２０１６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２５，４４１９－４４３１、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２８，１０６４－１０７５）。そのため、４つのバイオマーカー、すなわち、ＺＳＣＡＮ４、ＰＲＡＭＥＦ１２、ＴＲＩＭ４３、及びＭＢＤ３Ｌ２が、ＤＵＸ４標的遺伝子及びＦＳＨＤ疾患バイオマーカーとして確立されており、ＦＳＨＤ細胞と健常対照細胞との間で一貫して示差的な発現を示しているため、この試験ではそれらが選択された（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２３，５３４２－５３５２、Ｅｉｄａｈｌ（２０１６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２５，４５７７－４５８９、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２４，１４０５－１４１１、Ｌｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ１２．、Ａｍｉｎｉ Ｃｈｅｒｍａｈｉｎｉ（２０１９）ＲＮＡ２５，１２１１－１２１７．）。したがって、ＦＳＨＤ患者細胞におけるこれらのＤＵＸ４活性化バイオマーカーを抑制するいくつかのＵ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡの能力を試験した。

これを行うために、１５Ａ ＦＳＨＤ患者筋芽細胞を、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡ－４、－７、及び－８、並びに非標的化対照でトランスフェクトした。次いで、細胞を７日間、筋管に分化させ、定量的ＲＴ－ＰＣＲを実行して、ＤＵＸ４活性化ヒトバイオマーカーであるＴＲＩＭ４３、ＭＢＤ３Ｌ２、ＰＲＡＭＥＦ１２、及びＺＳＣＡＮ４の発現を測定した。４つのバイオマーカー全ての発現が、未処理の１５Ａ筋管中に存在し、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４処理した１５Ａ細胞中で有意に減少した（図４Ｉ）。

同時トランスフェクトされた細胞及びＦＳＨＤ患者由来の筋管の両方において、ＤＵＸ４及びＤＵＸ４関連結果を有意に低下させたいくつかのＵ７－ａｓＤＵＸ４構築物が特定された。これらの実験は、ＦＳＨＤの治療のための新規アプローチとして新規組換えＵ７－ａｓＤＵＸ４を使用した、ＤＵＸ４サイレンシングの概念実証を提供する。このインビボでのアプローチをＦＳＨＤマウスモデルに移すことが実行されている。

実施例７
Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡは、ＦＳＨＤのマウスモデルにおけるＤＵＸ４活性化バイオマーカーの発現を減少させる
本開示のＡＡＶ．Ｕ７－ａｓＤＵＸ４を、新しいＦＳＨＤマウスモデル、例えば、重度のＦＳＨＤのタモキシフェン誘導性ＤＵＸ４（ＴＩＣ－ＤＵＸ４）マウスモデル（Ｇｉｅｓｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１８；３（２２））、又はＦＳＨＤマウスの任意の他のマウスモデルに、筋肉内（ＩＭ）又は静脈内（ＩＶ）注入した。動物は、尾静脈又は筋肉内を介して、ｍｉ４０５、ｍｉ４０５Ｈ、若しくはｍｉＬａｃＺ配列を担持するＡＡＶ６ベクターの３×１０Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ、８×１０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ、若しくは３×１０Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの粒子、又は生理食塩水を受ける。

動物は無作為化し、盲検方式で注入し、それによって２人の操作者を必要とし、第１の者は盲検を設定して、送達のためのベクターを希釈し、第２の者は動物に注射して転帰尺度を行う。ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスの公表された特性評価で行われた検定力分析に基づき、群当たりＮ＝２０の動物が、転帰尺度を試験するのに十分な検定力を提供した。しかしながら、ヒトと同様に、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウスは可変表現型を示し得、そのため高い検定力試験を確実にし、減少を防ぐため、各用量及び時点について、Ｎは２６（Ｎ＝１３の雄及び１３の雌）に増加させる。

いくつかの試験では、動物は以下のように２群に無作為に分けられる。
急性ＦＳＨＤモデル。経口胃管を介してタモキシフェン（週当たり１回５ｍｇ／ｋｇを１０週間）又はヒマワリ油ビヒクルで処理した、ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウス又はＷＴマウス。

慢性ＦＳＨＤモデル。ＴＩＣ－ＤＵＸ４マウス又はＷＴマウスは未誘発のままであり、転帰尺度を行う前に９ヶ月間加齢させることができる。
４、８、１２、１６、２０、及び２４週後、Ｗｆｄｃ３又はＴｒｉｍ３６などのＤＵＸ４バイオマーカーの発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、又はｄｄＰＣＲによって測定する。

ＤＵＸ４バイオマーカー発現のレベルの低下が、未処理マウスの筋肉のレベルと比較して、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４で処理したマウスの筋肉で観察される。
実施例８
Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡは、ＦＳＨＤのマウスモデルにおける筋肉中の内因性ＤＵＸ４発現を減少させる
本開示のＡＡＶ．Ｕ７－ａｓＤＵＸ４を、新しいＦＳＨＤマウスモデル（ＴＩＣ－ＤＵＸ４）又はＦＳＨＤマウスの任意の他のマウスモデルに、筋肉内（ＩＭ）又は静脈内（ＩＶ）で注入する。４、８、１２、１６、２０、及び２４週後、ＤＵＸ４ｍＲＮＡの発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、又はｄｄＰＣＲによって測定する。組織病理学分析及び分子分析のために、前脛骨筋、腓腹筋、三頭筋、二頭筋、四頭筋、及び横隔膜を含むいくつかの筋肉を収集する。絶対筋力及び比筋力の測定は、腓腹筋で実行される。筋力測定は、筋肉組織病理学の完全性に負に影響を及ぼす可能性があるため（すなわち、イメージングについてそれらを非公表品質にする）、群ごとにいくつかの余分なマウスを任意選択的に注入して、組織病理学的分析のための質の高い画像を確実にする。

ＤＵＸ４ｍＲＮＡのレベルの低下が、未処理マウスの筋肉のレベルと比較して、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４で処理したマウスの筋肉で観察される。
実施例９
Ｕ７－ａｓＤＵＸ４ｓｎＲＮＡは、筋肉における内因性ＤＵＸ４発現を減少させる
本開示のＡＡＶ．Ｕ７－ａｓＤＵＸ４を、ＦＳＨＤに罹患している患者に、筋肉内（ＩＭ）又は静脈内（ＩＶ）で注入する。治療前、並びに治療の４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、及び５２週後、患者の筋肉中のＤＵＸ４ｍＲＮＡの発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｓｃｏｐｅ、又はｄｄＰＣＲによって生検筋肉中で測定する。

ＤＵＸ４ｍＲＮＡのレベルの低下が、治療前の同じ患者の筋肉中のＤＵＸ４ｍＲＮＡのレベルと比較して、Ｕ７－ａｓＤＵＸ４で治療した患者の筋肉中に観察される。ＦＳＨＤ疾患症状の改善も観察される。

前述の説明は、理解の明確さのためだけに与えられ、本発明の範囲内の修正は、当業者には明らかであり得るため、不必要な制限がそこから理解されるべきではない。
本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈で別段の要求がない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という単語、並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含めることを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。

本明細書全体にわたって、組成物が成分又は材料を含むと記載される場合、別段の記載がない限り、組成物は、列挙された成分又は材料の任意の組み合わせから本質的になるか、又はそれらからなることもできることが企図される。同様に、方法が特定のステップを含むと記載される場合、別途記載されない限り、方法はまた、列挙されたステップの任意の組み合わせから本質的になるか、又はそれらからなることができることが企図される。本明細書に例示的に開示される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又はステップが存在せずに適切に行われ得る。

本明細書に開示される方法の実施、及びその個々のステップは、マニュアルで、かつ／又は電子装置の支援若しくはそれによって提供される自動化を用いて、行うことができる。プロセスが特定の実施形態を参照して記載されているが、当業者であれば、方法に関連する行為を行う他の方法を使用し得ることを容易に理解するであろう。例えば、ステップの様々な順序は、別途記載されていない限り、本方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく変更され得る。加えて、個々のステップのうちのいくつかは、組み合わせるか、省略するか、又は更に追加のステップに細分化することができる。

本明細書に引用される全ての特許、刊行物、及び参考文献は、参照により完全に組み込まれる。本開示と組み込まれた特許、刊行物、及び参考文献との間に矛盾がある場合、本開示が優先されるべきである。付番を伴う本明細書に言及される参考文献は、本明細書に以下に示されるように、全引用文献とともに提供される。

参考文献
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６．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｇ．，Ｄｏｒａｉｓ，Ｊ．Ａ．，Ｇｒｏｗ，Ｅ．Ｊ．，Ｗｈｉｄｄｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｌｉｍ，Ｊ．Ｗ．，Ｗｉｋｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｐｆｌｕｅｇｅｒ，Ｃ．，Ｅｍｅｒｙ，Ｂ．Ｒ．，Ｗｉｌｃｏｘ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ＤＵＸ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＤＵＸ４ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｌｅａｖａｇｅ－ｓｔａｇｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ＭＥＲＶＬ／ＨＥＲＶＬ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４９，９２５－９３４．
７．Ｗｈｉｄｄｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｌａｎｇｆｏｒｄ，Ａ．Ｔ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ Ｔａｐｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｊ．（２０１７）．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＤＵＸ４－ｆａｍｉｌｙ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ４９，９３５－９４０．
８．Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ，Ｄ．，Ｘｕ，Ｚ．，Ｇａｎｇ，Ｅ．Ｊ．，Ｇａｌｉｎｄｏ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｍ．，Ｓｉｍｓｅｋ，Ｔ．，Ｇａｒｎｅｒ，Ｈ．Ｒ．，Ａｇｈａ－Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｓ．，Ｔａｓｓｉｎ，Ａ．，Ｃｏｐｐｅｅ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ａｎ ｉｓｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ＤＵＸ４－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＦＳＨＤ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ．ＥＭＢＯ Ｊ２７，２７６６－２７７９．
９．Ｄｉｘｉｔ，Ｍ．，Ａｎｓｓｅａｕ，Ｅ．，Ｔａｓｓｉｎ，Ａ．，Ｗｉｎｏｋｕｒ，Ｓ．，Ｓｈｉ，Ｒ．，Ｑｉａｎ，Ｈ．，Ｓａｕｖａｇｅ，Ｓ．，Ｍａｔｔｅｏｔｔｉ，Ｃ．，ｖａｎ Ａｃｋｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｌｅｏ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．ＤＵＸ４，ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＰＩＴＸ１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４，１８１５７－１８１６２．
１０．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｇａｒｗｉｃｋ，Ｓ．Ｅ．，Ｍｅｉ，Ｗ．，Ｂｅｌａｙｅｗ，Ａ．，Ｃｏｐｐｅｅ，Ｆ．，Ｌａｄｎｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｇｕｔｔｒｉｄｇｅ，Ｄ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，ａｎｄ Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｑ．（２０１１）．ＤＵＸ４，ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ｃａｕｓｅｓ ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｙｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ６９，５４０－５５２．
１１．Ｇｉｅｓｉｇｅ，Ｃ．Ｒ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｈｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｎ．，Ｅｉｄａｈｌ，Ｊ．Ｏ．，Ｓａａｄ，Ｎ．Ｙ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｐｙｎｅ，Ｎ．Ｋ．，Ａｌ－Ｋｈａｒｓａｎ，Ｍ．，Ｒａｓｈｎｏｎｅｊａｄ，Ａ．，Ｃｈｅｒｍａｈｉｎｉ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＴＩＣ－ＤＵＸ４ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＦＳＨＤ．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ３．
１２．Ｋｏｗａｌｊｏｗ，Ｖ．，Ｍａｒｃｏｗｙｃｚ，Ａ．，Ａｎｓｓｅａｕ，Ｅ．，Ｃｏｎｄｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｓａｕｖａｇｅ，Ｓ．，Ｍａｔｔｅｏｔｔｉ，Ｃ．，Ａｒｉａｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｏｎａ，Ｅ．Ｄ．，Ｎｕｎｅｚ，Ｎ．Ｇ．，Ｌｅｏ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｔｈｅ ＤＵＸ４ ｇｅｎｅ ａｔ ｔｈｅ ＦＳＨＤ１Ａ ｌｏｃｕｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ１７，６１１－６２３．
１３．Ｓｎｉｄｅｒ，Ｌ．，Ａｓａｗａｃｈａｉｃｈａｒｎ，Ａ．，Ｔｙｌｅｒ，Ａ．Ｅ．，Ｇｅｎｇ，Ｌ．Ｎ．，Ｐｅｔｅｋ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｖｅｓ，Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．，Ｌｅｍｍｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｗｉｎｏｋｕｒ，Ｓ．Ｔ．，Ｔａｗｉｌ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．ＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ，ｍｉＲＮＡ－ｓｉｚｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ｄ４Ｚ４ ｕｎｉｔｓ：ｎｅｗ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ１８，２４１４－２４３０．
１４．Ｓｎｉｄｅｒ，Ｌ．，Ｇｅｎｇ，Ｌ．Ｎ．，Ｌｅｍｍｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｋｙｂａ，Ｍ．，Ｗａｒｅ，Ｃ．Ｂ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｔａｗｉｌ，Ｒ．，Ｆｉｌｉｐｐｏｖａ，Ｇ．Ｎ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｔａｐｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｅｄ ｇｅｎｅ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ６，ｅ１００１１８１．
１５．Ｓｈａｄｌｅ，Ｓ．Ｃ．，Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｗ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｅ．，Ｃｏｎｅｒｌｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｍｏｒｅｌｌｏ，Ｔ．Ｄ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ Ｔａｐｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｊ．（２０１７）．ＤＵＸ４－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｓＲＮＡ ａｎｄ ＭＹＣ ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ１３，ｅ１００６６５８．
１６．Ｄｍｉｔｒｉｅｖ，Ｐ．，Ｂｏｕ Ｓａａｄａ，Ｙ．，Ｄｉｂ，Ｃ．，Ａｎｓｓｅａｕ，Ｅ．，Ｂａｒａｔ，Ａ．，Ｈａｍａｄｅ，Ａ．，Ｄｅｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｒｏｂｅｒｔ，Ｔ．，Ｌａｚａｒ，Ｖ．，Ｌｏｕｚａｄａ，Ｒ．Ａ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．ＤＵＸ４－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ａｂｅｒｒａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ＦＳＨＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ９９，２４４－２５８．
１７．Ｒｉｃｋａｒｄ，Ａ．Ｍ．，Ｐｅｔｅｋ，Ｌ．Ｍ．，ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．（２０１５）．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＤＵＸ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＦＳＨＤ ｍｙｏｔｕｂｅｓ ｉｓ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｃａｕｓｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２４，５９０１－５９１４．
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１９．Ｙａｏ，Ｚ．，Ｓｎｉｄｅｒ，Ｌ．，Ｂａｌｏｇ，Ｊ．，Ｌｅｍｍｅｒｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｔａｗｉｌ，Ｒ．，ａｎｄ Ｔａｐｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｊ．（２０１４）．ＤＵＸ４－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ ＦＳＨＤ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２３，５３４２－５３５２．
２０．Ｅｉｄａｈｌ，Ｊ．Ｏ．，Ｇｉｅｓｉｇｅ，Ｃ．Ｒ．，Ｄｏｍｉｒｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｇｕｃｋｅｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｇａｒｗｉｃｋ－Ｃｏｐｐｅｎｓ，Ｓ．Ｅ．，Ｌａｂｈａｒｔ，Ｐ．，ａｎｄ Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｑ．（２０１６）．Ｍｏｕｓｅ Ｄｕｘ ｉｓ ｍｙｏｔｏｘｉｃ ａｎｄ ｓｈａｒｅｓ ｐａｒｔｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｐａｒａｌｏｇ ＤＵＸ４．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２５，４５７７－４５８９．
２１．Ｌｙｌｅ，Ｒ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｔ．Ｊ．，Ｃｌａｒｋ，Ｌ．Ｎ．，ａｎｄ Ｈｅｗｉｔｔ，Ｊ．Ｅ．（１９９５）．Ｔｈｅ ＦＳＨＤ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ，Ｄ４Ｚ４，ｉｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ａ ｄｉｓｐｅｒｓｅｄ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｏｍｅｏｂｏｘ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ，ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ ａｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｒｏｃｅｎｔｒｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２８，３８９－３９７．
２２．Ｇａｂｒｉｅｌｓ，Ｊ．，Ｂｅｃｋｅｒｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｄｉｎｇ，Ｈ．，Ｄｅ Ｖｒｉｅｓｅ，Ａ．，Ｐｌａｉｓａｎｃｅ，Ｓ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｐａｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｗ．，Ｆｒａｎｔｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｈｅｗｉｔｔ，Ｊ．Ｅ．，Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｅｌｅｔｅｄ Ｄ４Ｚ４ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ＦＳＨＤ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｉｎ ｅａｃｈ３．３ ｋｂ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｇｅｎｅ２３６，２５－３２．
２３．Ｍａｒｓｏｌｌｉｅｒ，Ａ．Ｃ．，Ｃｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｌ．，Ｍａｒｉｏｔ，Ｖ．，Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ，Ｌ．，Ｖｏｉｔ，Ｔ．，Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｇ．，ａｎｄ Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘ，Ｊ．（２０１６）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ３’ ｅｎｄ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２５，１４６８－１４７８．
２４．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｉｎｇ，Ｏ．Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｎ．Ｐ．，Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｃ．，Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｂ．Ｍ．，Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｊｒ．，ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｒ．（２０１６）．Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ＤＵＸ４ Ｔｏｗａｒｄ Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２４，１４０５－１４１１．
２５．Ａｎｓｓｅａｕ，Ｅ．，Ｖａｎｄｅｒｐｌａｎｃｋ，Ｃ．，Ｗａｕｔｅｒｓ，Ａ．，Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｑ．，Ｃｏｐｐｅｅ，Ｆ．，ａｎｄ Ｂｅｌａｙｅｗ，Ａ．（２０１７）．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｕｓｅｄ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ＦａｃｉｏｓＳｃａｐｕｌｏＨｕｍｅｒａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＦＳＨＤ）．Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）８．
２６．Ｌｅｋ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｗｏｏｄｍａｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，ＤｅＳｉｍｏｎｅ，Ａ．Ｍ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｈｏ，Ｖ．，Ｃｏｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｍｅａｄ，Ｌ．，Ｋｏｄａｎｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａｐｐｌｙｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｃｒｅｅｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ１２．
２７．Ｈｉｍｅｄａ，Ｃ．Ｌ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｉ．，ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｌ．（２０１６）．ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｔｈｅ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｔ Ｄ４Ｚ４ ａｎｄ Ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ＤＵＸ４－ｆｌ ｉｎ ＦＳＨ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２４，５２７－５３５．
２８．ＤｅＳｉｍｏｎｅ，Ａ．Ｍ．，Ｌｅｓｚｙｋ，Ｊ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｊｒ．（２０１９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｐａｔｈｗａｙ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉ Ａｄｖ ５，ｅａａｗ７０９９．
２９．Ｌｉｍ，Ｋ．Ｒ．Ｑ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｒ．，Ｅｃｈｉｇｏｙａ，Ｙ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ａ．，Ｋｈａｗａｊａ，Ｈ．，Ｓｅｎ Ｃｈａｎｄｒａ，Ｓ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＵＸ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＬＮＡ ｇａｐｍｅｒｓ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１７，１６５０９－１６５１５．
３０．Ａｍｉｎｉ Ｃｈｅｒｍａｈｉｎｉ，Ｇ．，Ｒａｓｈｎｏｎｅｊａｄ，Ａ．，ａｎｄ Ｈａｒｐｅｒ，Ｓ．Ｑ．（２０１９）．ＲＮＡｓｃｏｐｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＤＵＸ４ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＲＮＡ２５，１２１１－１２１７．
３１．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｓａａｄ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｙｎｅ，Ｎ．Ｋ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｅｉｄａｈｌ，Ｊ．Ｏ．，Ｄｏｍｉｒｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｄ．Ａ．，Ｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．，Ｓａｈｅｎｋ，Ｚ．，Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＦＳＨＤ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ８，１２１－１３０．
３２．Ｖｅｒｍａ，Ａ．（２０１８）．Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｎｎ Ｉｎｄｉａｎ Ａｃａｄ Ｎｅｕｒｏｌ２１，３－８．
３３．Ｉｄｅｕｅ，Ｔ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｓ．，Ｎａｇａｎｕｍａ，Ｔ．，Ｔａｎｉｇａｗａ，Ａ．，Ｎａｔｓｕｍｅ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．（２０１２）．Ｕ７ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ－ａｒｒｅｓｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９，５６９３－５６９８．
３４．Ｓｃｈｕｍｐｅｒｌｉ，Ｄ．，ａｎｄ Ｐｉｌｌａｉ，Ｒ．Ｓ．（２００４）．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉａｌ Ｓｍ ｃｏｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ７ ｓｎＲＮＰ：ｆａｒ－ｒｅａｃｈｉｎｇ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ６１，２５６０－２５７０．
３５．Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ，Ａ．，Ｂａｂｂｓ，Ａ．，ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｅ．（２００９）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｏｎ－ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｕ７ｓｎＲＮＡ ｃａｒｒｙｉｎｇ ａ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＤＭＤ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ１７，１２３４－１２４０．
３６．Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ，Ａ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ｂａｂｂｓ，Ａ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｖ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｌ．，ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，Ｋ．Ｅ．（２０１２）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｕ７ｓｎＲＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｅｘｏｎ－ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２０，１２１２－１２２１．
３７．Ｎｕａｌｋａｅｗ，Ｔ．，Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，Ｎ．，Ｈｏｎｇｅｎｇ，Ｓ．，Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ，Ｓ．，Ｋｏｌｅ，Ｒ．，ａｎｄ Ｓｖａｓｔｉ，Ｓ．（２０１９）．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｅｃｔ ｂｅｔａ（ＩＶＳ２－６５４）－ｇｌｏｂｉｎ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ＨｂＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｕ７ｓｎＲＮＡ ｉｎ ｂｅｔａ－ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ／ＨｂＥ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ９，７６７２．
３８．Ｂｉｆｅｒｉ，Ｍ．Ｇ．，Ｃｏｈｅｎ－Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ，Ｍ．，Ｃａｐｐｅｌｌｅｔｔｏ，Ａ．，Ｇｉｒｏｕｘ，Ｂ．，Ｒｏｄａ，Ｍ．，Ａｓｔｏｒｄ，Ｓ．，Ｍａｒａｉｓ，Ｔ．，Ｂｏｓ，Ｃ．，Ｖｏｉｔ，Ｔ．，Ｆｅｒｒｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ａ Ｎｅｗ ＡＡＶ１０－Ｕ７－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｌｏｎｇｓ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ＡＬＳ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ２５，２０３８－２０５２．
３９．Ｗｅｉｎ，Ｎ．，Ｖｕｌｉｎ，Ａ．，Ｆａｌｚａｒａｎｏ，Ｍ．Ｓ．，Ｓｚｉｇｙａｒｔｏ，Ｃ．Ａ．，Ｍａｉｔｉ，Ｂ．，Ｆｉｎｄｌａｙ，Ａ．，Ｈｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｎ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．，Ｂａｋｔｈａｖａｃｈａｌｕ，Ｂ．，Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ＤＭＤ ｅｘｏｎ５ ＩＲＥＳ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ ｔｈａｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ２０，９９２－１０００．
４０．Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｉ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｒａｈｉｍｏｖ，Ｆ．，Ｈｏｍｍａ，Ｓ．，Ａｒａｓｈｉｒｏ，Ｐ．，Ｂｅｅｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｋｉｎｇ，Ｏ．Ｄ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｂ．，Ｋｕｎｋｅｌ，Ｌ．Ｍ．，Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｆａｍｉｌｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ＤＵＸ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２１，４４１９－４４３０．
４１．ＬｏＲｕｓｓｏ，Ｓ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｎ．Ｅ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｍ．Ｐ．，Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｃａｒｒａｒｏ，Ｅ．，Ｈｉｇｇｓ，Ｋ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．，Ｍｕｌ，Ｋ．，Ｓａｃｃｏｎｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｒｅａｄｉｎｅｓｓ ｔｏ ｓｏｌｖｅ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ＦＳＨＤ（ＲｅＳｏｌｖｅ）：ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ，ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｍｕｌｔｉ－ｃｅｎｔｅｒ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｌ１９，２２４．
４２．Ｍｕｌ，Ｋ．，Ｖｉｎｃｅｎｔｅｎ，Ｓ．Ｃ．Ｃ．，Ｖｏｅｒｍａｎｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｌｅｍｍｅｒｓ，Ｒ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｐａｄｂｅｒｇ，Ｇ．Ｗ．，Ｈｏｒｌｉｎｇｓ，Ｃ．Ｇ．Ｃ．，ａｎｄ ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｂ．Ｇ．Ｍ．（２０１７）．Ａｄｄｉｎｇ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｕｓｃｌｅ ＭＲＩ ｔｏ ｔｈｅ ＦＳＨＤ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｔｏｏｌｂｏｘ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ８９，２０５７－２０６５．
４３．Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｈ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｈａｗ，Ｄ．，Ｓｎｉｄｅｒ，Ｌ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｕｄｅｃｈ，Ｃ．Ｂ．，Ｐｏｌｉａｃｈｉｋ，Ｓ．Ｌ．，Ｇｏｖｅ，Ｎ．Ｅ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．ＭＲＩ－ｉｎｆｏｒｍｅｄ ｍｕｓｃｌｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ＭＲＩ ｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＤＵＸ４ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＦＳＨＤ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２８，４７６－４８６．
４４．Ｗｏｎｇ，Ｃ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｈ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｈａｗ，Ｄ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｅ．，Ｂｕｄｅｃｈ，Ｃ．Ｂ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｌｅｍｍｅｒｓ，Ｒ．，Ｓｔａｔｌａｎｄ，Ｊ．Ｍ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｆ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＦＳＨＤ ｍｕｓｃｌｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２９，１０３０－１０４３．
４５．Ｇｅｎｇ，Ｌ．Ｎ．，Ｙａｏ，Ｚ．，Ｓｎｉｄｅｒ，Ｌ．，Ｆｏｎｇ，Ａ．Ｐ．，Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ｎ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｍ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｒｕｚｚｏ，Ｗ．Ｌ．，Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｔａｗｉｌ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．ＤＵＸ４ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｇｅｎｅｓ，ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ２２，３８－５１．
４６．Ｊａｇａｎｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｓｈａｄｌｅ，Ｓ．Ｃ．，Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｒ．，Ｓｎｉｄｅｒ，Ｌ．，Ｔａｗｉｌ，Ｒ．Ｎ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｒ．Ｋ．，ａｎｄ Ｔａｐｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｊ．（２０１６）．Ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ ＤＵＸ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＦＳＨＤ ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２５，４４１９－４４３１．
４７．ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ，Ａ．，Ｍａｈｆｏｕｚ，Ａ．，Ｋｌｏｅｔ，Ｓ．Ｌ．，Ｂａｌｏｇ，Ｊ．，ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｂ．Ｇ．Ｍ．，Ｔａｗｉｌ，Ｒ．，Ｔａｐｓｃｏｔｔ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａａｒｅｌ，Ｓ．Ｍ．（２０１９）．Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｔｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２８，１０６４－１０７５．
４８．Ｓｈａｒｍａ，Ｖ．，Ｈａｒａｆｕｊｉ，Ｎ．，Ｂｅｌａｙｅｗ，Ａ．，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｗ．（２０１３）．ＤＵＸ４ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ Ｃ２Ｃ１２ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ８，ｅ６４６９１．
４９．Ｒｏｊａｓ，Ｌ．Ａ．，Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｅ．，Ａｃｃｏｒｓｉ，Ａ．，Ｍａｇｌｉｏ，Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｎ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ａ．，Ｋａｚｍｉｒｓｋｉ，Ｓ．，Ｒａｈｌ，Ｐ．，Ｔａｗｉｌ，Ｒ．，Ｃａｄａｖｉｄ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｐ３８α Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＵＸ４ ｉｎ ａ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．３７４（３）：４８９－４９８．
５０．Ｗｅｉｎ，Ｎ．，Ｖｕｌｉｎ，Ａ．，Ｆｉｎｄｌａｙ，Ａ．Ｒ．，Ｇｕｍｉｅｎｎｙ，Ｆ．，Ｈｕａｎｇ，Ｎ．，Ｗｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ｋ．Ｍ．（２０１７）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｅｘｏｎ Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＤＭＤ Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓ４，１９９－２０７．
５１．Ｖｏｉｔ，Ｔ．，Ｔｏｐａｌｏｇｌｕ，Ｈ．，Ｓｔｒａｕｂ，Ｖ．，Ｍｕｎｔｏｎｉ，Ｆ．，Ｄｅｃｏｎｉｎｃｋ，Ｎ．，Ｃａｍｐｉｏｎ，Ｇ．，Ｄｅ Ｋｉｍｐｅ，Ｓ．Ｊ．，Ｅａｇｌｅ，Ｍ．，Ｇｕｇｌｉｅｒｉ，Ｍ．，Ｈｏｏｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄｒｉｓａｐｅｒｓｅｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＥＭＡＮＤ ＩＩ）：ａｎ ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｈａｓｅ２ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ１３，９８７－９９６．
５２．Ｋｉｎａｌｉ，Ｍ．，Ａｒｅｃｈａｖａｌａ－Ｇｏｍｅｚａ，Ｖ．，Ｆｅｎｇ，Ｌ．，Ｃｉｒａｋ，Ｓ．，Ｈｕｎｔ，Ｄ．，Ａｄｋｉｎ，Ｃ．，Ｇｕｇｌｉｅｒｉ，Ｍ．，Ａｓｈｔｏｎ，Ｅ．，Ａｂｂｓ，Ｓ．，Ｎｉｈｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｌｏｃａｌ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ＡＶＩ－４６５８ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｐｒｏｏｆ－ｏｆ－ｃｏｎｃｅｐｔ ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ８，９１８－９２８．
５３．Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｏｅｍａｎｓ，Ｎ．，Ｌｏｗｅｓ，Ｌ．Ｐ．，Ａｌｆａｎｏ，Ｌ．Ｎ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｋ．，Ｓｈａｏ，Ｊ．，Ｋａｙｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｍｅｒｃｕｒｉ，Ｅ．，Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ Ｓｔｕｄｙ，Ｇ．，ａｎｄ Ｔｅｌｅｔｈｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｄ．Ｉ．Ｎ．（２０１６）．Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ ｖｅｒｓｕｓ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｎ ａｍｂｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ７９，２５７－２７１．
５４．Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｓ．Ｔ．，Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｅ．Ｍ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｄ．，Ｐａｎｄｅｙ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃ．Ｆ．，Ｄｉｒｋｓｅｎ，Ｒ．Ｔ．，ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．（２０１６）．Ｄｍｐｋ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｒ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ ｃａｒｄｉａｃ ｏｒ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２５，４３２８－４３３８．
５５．Ａｏｋｉ，Ｙ．，Ｎａｇａｔａ，Ｔ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ａ．，Ｗｏｏｄ，Ｍ．Ｊ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｔ．，ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．（２０１３）．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＰＭＯ ｉｎｔｏ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｙｏｔｕｂｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ｉｎ ｌａｍｉｎｉｎ－ａｌｐｈａ２ ｃｈａｉｎ－ｎｕｌｌ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｉｃｅ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ２２，４９１４－４９２８．
５６．Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ，Ｈ．，ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｃ．，ｖａｎ Ｋｕｉｋ，Ｐ．，Ｈｅｕｖｅｌｍａｎｓ，Ｎ．，Ｓａｂａｔｅｌｌｉ，Ｐ．，Ｒｉｍｅｓｓｉ，Ｐ．，Ｂｒａｇｈｅｔｔａ，Ｐ．，ｖａｎ Ｏｍｍｅｎ，Ｇ．Ｊ．，ｄｅ Ｋｉｍｐｅ，Ｓ．，Ｆｅｒｌｉｎｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ＰＫ ａｎｄ ＰＤ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ＲＮＡ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ１８，１２１０－１２１７．
５７．Ｓｈｉｍｉｚｕ－Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｋｏｍａｋｉ，Ｈ．，Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．，ａｎｄ Ａｏｋｉ，Ｙ．（２０１９）．Ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｊ Ｐｅｒｓ Ｍｅｄ９．
５８．Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｂａｒｒｉｇａ，Ａ．，Ｋｒａｎｚｅｎ，Ｊ．，Ｃｒｏｅｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｂｉｊｌ，Ｓ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ，Ｗ．Ｊ．，ｖａｎ Ｋｅｓｓｅｌ，Ｉ．Ｄ．，ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｂ．Ｇ．，ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｊ．Ｃ．，Ｗｉｅｒｉｎｇａ，Ｂ．，Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｉｎ ｍｙｏｔｏｎｉｃ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ１：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１０，ｅ０１２１５５６．
５９．Ｂｒｕｎ，Ｃ．，Ｓｕｔｅｒ，Ｄ．，Ｐａｕｌｉ，Ｃ．，Ｄｕｎａｎｔ，Ｐ．，Ｌｏｃｈｍｕｌｌｅｒ，Ｈ．，Ｂｕｒｇｕｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｕｍｐｅｒｌｉ，Ｄ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓ，Ｊ．（２００３）．Ｕ７ｓｎＲＮＡｓ ｉｎｄｕｃｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ ｂｙ ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ６０，５５７－５６６．
６０．Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｇ．，Ｒａｈｉｍｏｖ，Ｆ．，Ｋｉｎｇ，Ｏ．Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｒｏｂｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｒ．，Ｓｈａｙ，Ｊ．Ｗ．，Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｊｒ．，ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｗ．Ｅ．（２０１３）．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＤＵＸ４ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２０，６７１－６７８．
６１．Ｌｉｕ，Ｊ．，ａｎｄ Ｇａｌｌ，Ｊ．Ｇ．（２００７）．Ｕ ｂｏｄｉｅｓ ａｒｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎ ｕｒｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ Ｐ ｂｏｄｉｅｓ．ＰＮＡＳ１０４（２８），１１６５５－１１６５９．
本開示は、本開示の実施のための特定の方式を含むように見出されるか、又は提案される特定の実施形態に関して記載されている。本開示の様々な修正及び変形は、本開示の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本開示は、特定の実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本開示の方法は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、関連分野の当業者には明らかである方法を実行するための記載された方式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。

Claims (28)

1. Ｕ７二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）アンチセンスリボ核酸（ａｓＲＮＡ）をコードする核酸であって、
   （ａ）配列番号１～１８のうちのいずれか１つに示される配列と少なくとも９０％の同一性を含むヌクレオチド配列、
   （ｂ）配列番号１～１８のうちのいずれか１つに示されるヌクレオチド配列、又は
   （ｃ）（ａ）及び／若しくは（ｂ）の前記ヌクレオチド配列の組み合わせ、を含む、核酸。
2. 核酸であって、配列番号１９～３６のうちのいずれか１つに示される二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）標的ヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の組み合わせに特異的にハイブリダイズするＵ７ＤＵＸ４アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
3. プロモーターヌクレオチド配列を更に含む、請求項１又は２に記載の核酸。
4. 前記プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｕ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｈ１プロモーター、最小ＣＭＶプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＥＦ１－アルファプロモーター、最小ＥＦ１－アルファプロモーター、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである、請求項３に記載の核酸。
5. 前記筋肉特異的プロモーターが、ｕｎｃ４５ｂプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、最小ＭＣＫプロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ７プロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、又はＣＫ１プロモーターである、請求項４に記載の核酸。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸又はそれらのいずれか１つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクター。
7. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
8. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項７に記載のウイルスベクター。
9. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶである、請求項７又は８に記載のウイルスベクター。
10. 前記ＡＡＶが、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いている、請求項９に記載のウイルスベクター。
11. 前記ＡＡＶが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）又は自己相補的組換えＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項９又は１０に記載のウイルスベクター。
12. 前記ＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、ｒＡＡＶ１１、ｒＡＡＶ１２、ｒＡＡＶ１３、ｒＡＡＶ－ａｎｃ８０、ｒＡＡＶｒｈ．７４、ｒＡＡＶｒｈ．８、ｒＡＡＶｒｈ．１０、又はｒＡＡＶ－Ｂ１である、請求項９～１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
13. 前記ＡＡＶが、ｒＡＡＶ－９である、請求項９～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
14. 組成物であって、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又は
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクターと、
    薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
15. 細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害及び／又はそれに干渉する方法であって、前記細胞を、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、と接触させることを含む、方法。
16. 筋ジストロフィーを有する対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、を投与することを含む、方法。
17. 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項１６に記載の方法。
18. がんを有する対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、を投与することを含む、方法。
19. 前記がんが、肉腫である、請求項１８に記載の方法。
20. 使用であって、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害するための医薬品の調製のための、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、
    の使用。
21. 使用であって、細胞における二重ホメオボックス４（ＤＵＸ４）遺伝子の発現を阻害するための、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、
    の使用。
22. 使用であって、筋ジストロフィーを治療又は改善するための医薬品の調製のための、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、
    の使用。
23. 使用であって、筋ジストロフィーを治療又は改善するための、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、
    の使用。
24. 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕筋ジストロフィーである、請求項２２又は２３に記載の使用。
25. 使用であって、がんを治療又は改善するための医薬品の調製のための、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、
    の使用。
26. 使用であって、がんを治療又は改善するための、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、
    の使用。
27. 前記がんが、肉腫である、請求項２５又は２６に記載の使用。
28. 前記核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、ベクター、組成物、又は医薬品が、筋肉内注射、経皮輸送、又は血流への注入のために製剤化される、
    （ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸、
    （ｂ）請求項６に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
    （ｃ）請求項７～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター、
    （ｄ）請求項１４に記載の組成物、
    （ｅ）請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法、又は
    （ｅ）請求項２０～２７のいずれか一項の記載の使用。